CN108283001A - 包含κ和λ轻链的抗原结合多肽构建体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本文提供了包含至少两个不同异二聚体的多特异性抗原结合多肽构建体，每个异二聚体包含重链和轻链。至少一个异二聚体包含含有λ轻链的Fab区并且至少一个异二聚体包含含有κ轻链的Fab区。形成所述抗原结合多肽构建体的免疫球蛋白重链和轻链中的一个或多个包含促进所述重链和轻链之间的正确配对以形成所需的多特异性抗原结合多肽构建体的氨基酸修饰。所述氨基酸修饰可以位于CH1和/或CL结构域、VH和/或VL结构域或其组合中。
Description
序列表
本申请包含序列表，其已经通过电子方式以ASCII格式提交并以引用的方式在此整体并入。所述ASCII拷贝创建于2015年12月1日，命名为0966216，且大小为20.0字节。
发明背景
双特异性抗体能够结合两个不同的表位，并且通常基于两种不同的单特异性亲本抗体的免疫球蛋白重链和轻链来制备。结合两个不同表位或抗原的能力使得双特异性抗体成为治疗应用中具有吸引力的工具，其中一个益处是在治疗疾病时靶向多于一种抗原或表位。然而，高效地产生形式类似于天然存在的抗体的双特异性抗体可能是困难的，因为抗体重链已经进化成以相对混杂的方式结合抗体轻链。由于这种混杂的配对，双特异性抗体的两个不同重链和两个不同轻链的相伴表达自然导致重链-轻链配对的混乱。这种混乱仍然是产生双特异性治疗剂的一个重要挑战，因为均匀配对是良好的可制造性和生物功效的基本要求。
已经描述了制备形式类似于天然存在的抗体的双特异性抗体的一些方法。然而，这些方法是针对以下情况而开发和例证：其中用于制备双特异性抗体的亲本抗体都具有κ基因家族的轻链。
尽管大多数已知的治疗性抗体(以及因此潜在的亲本抗体)具有κ轻链，但也有一些具有λ轻链。κ和λ轻链在结构和序列上彼此都不同。
用于从两个亲本抗体产生形式类似于天然存在的抗体的双特异性抗体的各种方法的综述可见于Klein等人，(2012)mAbs 4：6，1-11中。国际专利申请号PCT/EP2011/056388(WO 2011/131746)描述了用于产生异二聚体蛋白质的体外方法，其中不对称突变被引入两种单特异性起始蛋白质的CH3区中以驱动在还原条件下温育时两种单特异性IgG4抗体或IgG4样抗体之间的定向“Fab臂”或“半分子”交换。
美国专利公开号2009/0182127(Novo Nordisk，Inc.)描述了通过修饰轻链-重链对的Fc界面处和CH1:CL界面处的氨基酸残基以降低一对的轻链与另一对的重链相互作用的能力来产生双特异性抗体。国际专利公开号WO2014/081955(Amgen)和WO2014/150973(Eli Lilly)描述了λ轻链中的可能被修饰以驱动期望的配对特异性的氨基酸残基。这些出版物均未描述可用于从具有κ轻链的一个亲本抗体和具有λ轻链的另一个亲本抗体制备双特异性抗体的互补氨基酸修饰。国际专利公开号WO2012/131555(Glenmark)描述了用TCR(T细胞受体)结构域界面代替抗体的重链和λ轻链之间的界面。
发明概述
本公开提供了包含免疫球蛋白λ轻链和免疫球蛋白κ轻链的多特异性抗原结合多肽。在一个方面，所述抗原结合多肽是包含第一异二聚体和第二异二聚体的构建体。在一个实施方案中，第一异二聚体(H1L1)包含形成特异性结合第一抗原的第一Fab区的第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和免疫球蛋白λ轻链多肽序列(L1)；并且第二异二聚体(H2L2)包含形成特异性结合第二抗原的第二Fab区的第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和免疫球蛋白κ轻链多肽序列(L2)。在一些实施方案中，H1不同于H2。在一些实施方案中，H1和H2包含重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域1(CH1结构域)。在一个实施方案中，L1包含λ轻链可变(VL-λ)结构域和λ轻链恒定(CL-λ)结构域。在一个实施方案中，L2包含κ轻链可变(VL-κ)结构域和κ轻链恒定(CL-κ)结构域。在一些实施方案中，与相应的野生型H1、H2、L1和L2多肽序列相比，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰促进H1与L1而非L2优先配对，和/或促进H2与L2而非L1优先配对。在一些实施方案中，氨基酸修饰不引入新的半胱氨酸残基。在一个实施方案中，氨基酸修饰不去除天然存在的半胱氨酸残基。
在一些实施方案中，当H1、H2、L1和L2在细胞或哺乳动物细胞中共表达时，或当H1、H2、L1和L2在无细胞表达系统中共表达时，或当H1和L1在(第一)细胞中产生并且H2和L2在第二(例如不同的)细胞中产生并且两个细胞的产物通过氧化还原产生方法混合时，或当H1和L1在第一无细胞表达系统中产生并且H2和L2在第二(例如不同的)无细胞表达系统中产生并且两个无细胞表达系统的产物混合时，所述构建体包含促进H1与L1而非L2优先配对和/或促进H2与L2而非L1优先配对的氨基酸修饰。
在构建体的一些实施方案中，每个异二聚体包含单一Fab。
在本文所述的抗原结合多肽构建体的一些实施方案中：
a.H2包含位置143处的氨基酸取代；L2包含位置124处的氨基酸取代；并且
i.H1包含位置186或179处的氨基酸取代；且L1包含位置180处的氨基酸取代；
ii.H1包含位置186处的氨基酸取代；且L1包含位置133处的氨基酸取代；
iii.H1包含位置143处的氨基酸取代；且L1包含位置133处的氨基酸取代；或
iv.H1包含位置188处的氨基酸取代；且L1包含位置178处的氨基酸取代；
b.H1包含位置143处的氨基酸取代；L1包含位置131处的氨基酸取代；并且
i.H2包含位置186或124和186处的氨基酸取代；且L2包含位置133、或133和160、或124和133、或176和180处的氨基酸取代；或
ii.H2包含位置188处的氨基酸取代；且L2包含位置131处的氨基酸取代；
iii.H2包含位置143处的氨基酸取代；且L2包含位置124和133、或124和133和180处的氨基酸取代；
c.H1包含位置143处的氨基酸取代；L1包含位置131处的氨基酸取代；并且
i.H2包含位置124和186、或124和179、或188处的氨基酸取代；且L2包含位置176和178、或176和180、或131处的氨基酸取代；或
ii.H2包含位置143和188、或143、或124和143处的氨基酸取代；且L2包含位置124和176和178、或124和178、或124和180、或124和176和180、或124、或124和176处的氨基酸取代；
d.H1包含位置179、186、143和/或188处的氨基酸取代；L1包含位置180、133和/或176和178处的氨基酸取代；H2包含位置143处的氨基酸取代；且L2包含位置131和/或124处的氨基酸取代；
e.H1包含位置39处的氨基酸取代或不包含促进优先配对的氨基酸取代；L1包含位置38处的氨基酸取代或不包含促进优先配对的氨基酸取代；H2包含位置39处的氨基酸取代；且L2包含位置38处的氨基酸取代；
f.H1包含位置143处的氨基酸取代；L1包含位置131处的氨基酸取代；并且
i.H2包含位置188或124和186处的氨基酸取代；且L2包含位置176和178、或176和180、或131处的氨基酸取代；或
ii.H2包含位置143或186处的氨基酸取代；且L2包含位置124和133、或124和133和180处的氨基酸取代；
g.H1包含位置188处的氨基酸取代；L1包含位置176和178或178处的氨基酸取代；并且
i.H2包含位置177和188处的氨基酸取代；且L2包含位置176和178处的氨基酸取代；或
ii.H2包含位置186或124或124和179处的氨基酸取代；且L2包含位置176或131和176处的氨基酸取代；
h.H1包含位置186处的氨基酸取代；L1包含位置133处的氨基酸取代；并且
i.H2包含位置188处的氨基酸取代；且L2包含位置131处的氨基酸取代；或
ii.H2包含位置177和188处的氨基酸取代；且L2包含位置176和178处的氨基酸取代；或
H1包含位置124和190处的氨基酸取代；L1包含位置135处的氨基酸取代；H2包含位置124或188处的氨基酸取代；且L2包含位置176或176和178处的氨基酸取代；
i.H1包含位置177和188处的氨基酸取代；L1包含位置176和178处的氨基酸取代；并且
a.H2包含位置188处的氨基酸取代；且L2包含位置176和178或131处的氨基酸取代；
b.H2包含位置186处的氨基酸取代；且L2包含位置133、或124和160和180处的氨基酸取代；
c.H2包含位置124、或124和179、或124和186处的氨基酸取代；且L2包含位置176、或176和178、或176和180处的氨基酸取代；或
d.H2包含位置143处的氨基酸取代；且L2包含位置133、或124和133处的氨基酸取代；
j.H1包含位置188处的氨基酸取代；L1包含位置178处的氨基酸取代；H2包含位置124或188处的氨基酸取代；且L2包含位置176和178、或176和180、或176处的氨基酸取代；
k.或H1包含位置145和188处的氨基酸取代；L1包含位置178处的氨基酸取代；且H2包含位置124和/或188处的氨基酸取代；且L2包含位置124、133和178中的一个或多个处的氨基酸取代；
l.H1包含位置174、179或186处的氨基酸取代；L1包含位置176或180处的氨基酸取代；H2包含位置143或190处的氨基酸取代；且L2包含位置131、135或124处的氨基酸取代；或
m.H1包含位置174处的氨基酸取代；L1包含位置176处的氨基酸取代；H2包含位置190处的氨基酸取代；且L2不包含促进优先配对的氨基酸取代或包含位置135处的氨基酸取代；
n.H1包含位置143和190处的氨基酸取代；L1包含位置133处包的氨基酸取代；H2包含位置124处的氨基酸取代；且L2包含位置131和135处的氨基酸取代；
o.H1包含位置143和/或186处的氨基酸取代；L1包含位置133处的氨基酸取代；H2包含位置124处的氨基酸取代；且L2包含位置131处的氨基酸取代；
p.H1包含位置143和179处的氨基酸取代；L1包含位置124和178处的氨基酸取代；H2包含位置186处的氨基酸取代；且L2包含位置178和180，或160和180处的氨基酸取代；
q.H1包含位置143处的氨基酸取代；L1包含位置124处的氨基酸取代；H2包含位置179或186处的氨基酸取代；且L2包含位置124和160和180处的氨基酸取代；
r.H1包含位置186处的氨基酸取代；L1包含位置180或178和180处的氨基酸取代；H2包含位置143和/或179处的氨基酸取代；且L2包含位置124和178、或131处的氨基酸取代；
s.H1包含位置179处的氨基酸取代；L1包含位置180处的氨基酸取代；H2包含位置143处的氨基酸取代；且L2包含位置124处的氨基酸取代；
t.H1包含位置143或186处的氨基酸取代；L1包含位置180处的氨基酸取代或不包含促进优先配对的氨基酸取代；H2包含位置143和145处的氨基酸取代；且L2包含位置124处的氨基酸取代；
u.H1不包含促进优先配对的氨基酸取代；L1包含位置135处的氨基酸取代；H2包含位置139处的氨基酸取代；且L2包含位置116处的氨基酸取代；
v.H1不包含促进优先配对的氨基酸取代或包含位置45处的氨基酸取代；L1不包含促进优先配对的氨基酸取代；H2包含位置45处的氨基酸取代；且L2包含位置44处的氨基酸取代；
w.H1包含位置139处的氨基酸取代；L1包含位置116处的氨基酸取代；H2不包含促进优先配对的氨基酸取代；且L2包含位置135处的氨基酸取代；或
x.H1包含位置124处的氨基酸取代；L1包含位置176处的氨基酸取代；H2包含位置124处的氨基酸取代；且L2包含位置176处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，第一Fab区对第一抗原的亲和力在由相应的野生型H1和L1多肽序列形成的Fab区对第一抗原的亲和力的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30、35、40、45、50或100倍以内，且/或第二Fab区对第二抗原的亲和力在由相应的野生型H2和L2多肽序列形成的Fab区对第二抗原的亲和力的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30、35、40、45、50或100倍以内。
在一些实施方案中，第一Fab区的熔融温度(Tm)与由相应的野生型H1和L1多肽序列形成的Fab区对第一抗原的Tm相差在约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20℃以内，且/或第二Fab区的熔融温度(Tm)与由相应的野生型H2和L2多肽序列形成的Fab区对第二抗原的Tm相差在约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20℃以内。
在抗原结合多肽构建体的一些实施方案中：
a.H1和L1是野生型多肽序列，并且H2和L2各自包含至少一个氨基酸修饰；
b.H1、L1和H2中的一个或多个包含至少一个氨基酸修饰，并且L2是野生型多肽序列；
c.H1、L1和L2中的一个或多个包含至少一个氨基酸修饰，并且H2是野生型多肽序列；
d.H1、H2和L2中的一个或多个包含至少一个氨基酸修饰，并且L1是野生型多肽序列；
e.L1、H2和L2中的一个或多个包含至少一个氨基酸修饰，并且H1是野生型多肽序列；或
f.H1、L1、H2和L2各自包含至少一个氨基酸修饰。
在一些实施方案中，所述氨基酸修饰位于：
a.H1和H2的CH1结构域、L1的CL-λ结构域和L2的CL-κ结构域；或
b.H1和H2的CH1和VH结构域、L1的CL-λ结构域和VL-λ结构域以及L2的CL-κ结构域和VL-κ结构域。
在一些实施方案中，所述氨基酸修饰位于：
a.H1的CH1结构域、H2的CH1结构域、L1的CL-λ结构域和L2的CL-κ结构域中的至少两个；
b.H1和H2的CH1和VH结构域、L1的CL-λ结构域和VL-λ结构域以及L2的CL-κ结构域和VL-κ结构域中的至少两个；或
c.H1的VH结构域、H2的VH结构域、L1的VL-λ结构域和L2的VL-κ结构域中的至少两个。
在一些实施方案中，H1、L1、H2和/或L2包含位于Fab区中的至少1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸突变。在一些实施方案中，H1、H2、L1和L2中的至少一个包含至少一个恒定结构域和/或至少一个可变结构域的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1，或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，以使得H1L1或H2L2中的至少一个的相对配对相对于野生型大至少约10％，并且另一个的相对配对在野生型的约10％内或相对于野生型大至少约10％。
在一些实施方案中，氨基酸修饰促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1，或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2，其中H1L1∶H1L2的比率为至少40∶60，并且H2L2∶H2L1的比率为至少60∶40；或者氨基酸修饰促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1，或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2，其中H2L2∶H2L1的比率为至少40∶60，并且H1L1∶H1L2的比率为至少60∶40。
在一些实施方案中，第一Fab区的热稳定性与由相应的野生型H1和L1多肽序列形成的Fab区的Tm相差在约0、1、2或3℃以内。在一些实施方案中，第二Fab区的热稳定性与由相应的野生型H2和L2多肽序列形成的Fab区的Tm相差在约0、1、2或3℃以内。
在一些实施方案中，氨基酸修饰选自由表4A或4B中所示的唯一标识符Mab设计组组成的组。在一些实施方案中，氨基酸修饰选自由表10-A1至10-A12中的一个或多个中所示的唯一标识符Mab设计组组成的组。在一些实施方案中，氨基酸修饰选自由表10-B1至10-B10中的任意一个中所示的唯一标识符Mab设计组组成的组。
在一些实施方案中，所述构建体进一步包含具有两个Fc多肽的二聚体Fc，每个Fc多肽包含CH3结构域序列并且通过或不通过接头与第一Fab区和第二Fab区中的一个偶联。在一些实施方案中，Fc是人Fc、人IgG1Fc、人IgA Fc、人IgG Fc、人IgD Fc、人IgE Fc、人IgMFc、人IgG2 Fc、人IgG3 Fc或人IgG4 Fc。在一个实施方案中，相较于野生型，Fc包含在CH3结构域序列的至少一个中的促进异二聚体Fc形成的一个或多个修饰。
在一些实施方案中，Fc包括：
i)具有第一Fc多肽中的修饰L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T366L_K392M_T394W的异二聚体IgG1 Fc；
ii)具有第一Fc多肽中的修饰L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T366L_K392L_T394W的异二聚体IgG1 Fc；
iii)具有第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_K392L_T394W的异二聚体IgG1 Fc：
iv)具有第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_K392M_T394W的异二聚体IgG1 Fc；或
v)具有第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_N390R_K392M_T394W的异二聚体IgG1 Fc。
在一些实施方案中，Fc还包含至少一个CH2结构域序列。在一个实施方案中，Fc包含一个或多个修饰以促进Fc-γ受体的选择性结合、减少或消除与Fc-γ受体的结合或促进与FcRn的结合。
在一些实施方案中，当H1、L1、H2和L2共表达时，通过H1L1和H2L2配对之和测量的总正确配对量与相应的在Fab区中不具有促进优先配对的氨基酸取代的H1、L1、H2和L2多肽链的配对相比的变化大于约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；或由所产生的双特异性抗体的量(表示为所产生的非半抗体种类的百分比)测量的总正确配对量与相应的在Fab区中不具有促进优先配对的氨基酸取代的H1、L1、H2和L2多肽链的配对相比的变化大于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％；或由所产生的双特异性抗体的量(表示为所产生的所有种类的百分比)测量的总正确配对量与相应的在Fab区中不具有促进优先配对的氨基酸取代的H1、L1、H2和L2多肽链的配对相比的变化大于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。
在一些实施方案中，接头包括一个或多个多肽接头、一个或多个抗体铰链区或一个或多个IgG1铰链区。在一个实施方案中，与野生型多肽接头相比，一个或多个多肽接头包含一个或多个修饰。
在一些实施方案中，氨基酸修饰包括氨基酸取代。
在一些实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个的序列衍生自人序列或人源化序列。
在一些实施方案中，本文所述的构建体与治疗剂或药物缀合。
在另一方面，本公开提供了编码本文所述构建体的分离的重组多核苷酸或分离的重组多核苷酸组。在一些实施方案中，提供了载体或载体组，其包含本文所述的多核苷酸或多核苷酸组中的一个或多个。在一些实施方案中，所述载体或载体组中的至少一个载体为多顺反子结构。
在另一方面，本公开提供了包含本文所述的多核苷酸或多核苷酸组，或载体或载体组的分离的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述分离的细胞经本文所述的载体或载体组稳定转染或瞬时转染。
在另一方面，提供了包含本文所述的抗原结合多肽构建体的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含选自由以下组成的组的一种或多种物质：缓冲剂、抗氧化剂、低分子量分子、药物、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂质、螯合剂、稳定剂和赋形剂。
在另一方面，描述了一种制备本文所述的构建体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(a)获得包含编码抗原结合多肽构建体的多核苷酸或多核苷酸组的宿主细胞；
(b)在允许表达抗原结合多肽构建体的条件下，在宿主细胞培养物中培养宿主细胞；以及
(c)从宿主细胞培养物中收集抗原结合多肽构建体。
在一些实施方案中，用本文所述的多核苷酸或多核苷酸组瞬时转染或稳定转染宿主细胞。
在另一方面，提供了一种计算机可读存储介质。在一些实施方案中，计算机可读存储介质存储包含代表第一异二聚体和/或第二异二聚体中的互补氨基酸修饰的数据的数据集，所述第一异二聚体包含第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白λ轻链多肽序列(L1)；所述第二异二聚体包含第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白κ轻链多肽序列(L2)。在一些实施方案中，存储在数据集中的H1和H2多肽序列包含至少重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)并且彼此不同。在一些实施方案中，存储在数据集中的L1和L2多肽序列包含至少轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)。在一些实施方案中，存储在数据集中的互补氨基酸修饰促进H1与L1而非L2优先配对，并且促进H2与L2而非L1优先配对。在一些实施方案中，数据集包括代表表4A或表4B中列出的那些修饰或那些修饰的子集的数据。在一些实施方案中，数据集包括代表表10-A1至10-A12或表10-B1至10-B10中的一个或多个中列出的那些修饰或那些修饰的子集的数据。
在另一方面，描述了一种产生双特异性抗原结合多肽构建体的方法。在一些实施方案中，通过所述方法产生的双特异性抗原结合多肽构建体包含：
a.包含第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白λ轻链多肽序列(L1)的第一异二聚体；和
b.包含第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白κ轻链多肽序列(L2)的第二异二聚体。
在一些实施方案中，通过所述方法产生的H1和H2多肽序列包含至少重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)并且彼此不同。在一些实施方案中，通过所述方法产生的L1和L2多肽序列包含轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)。在一些实施方案中，通过所述方法产生的H1、L1、H2和L2多肽序列中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以及促进H2与L2而非L1优先配对的氨基酸修饰。
在一些实施方案中，产生双特异性抗原结合多肽构建体的方法包括：
a.将来自本文所述的数据集的一个或多个互补氨基酸修饰引入H1、L1、H2和/或L2中；以及
b.在宿主细胞中共表达H1、L1、H2和L2以产生包含双特异性抗原结合多肽构建体的表达产物。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括测定表达产物中双特异性抗原结合多肽构建体相对于其它多肽产物的量，以选择相较于由野生型H1、L1、H2和L2的共表达产生的表达产物中的双特异性抗原结合多肽构建体的量提供增加量的双特异性抗原结合多肽构建体的优选的互补氨基酸修饰子集。在一些实施方案中，双特异性抗原结合多肽构建体以相较于其它多肽产物的大于70％的纯度产生。在一些实施方案中，通过所述方法产生的构建体包含Fc，所述Fc包含至少两个CH3结构域序列，并且所述Fc经由或不经由一个或多个接头偶联至第一异二聚体和第二异二聚体。在一些实施方案中，Fc是异二聚体Fc，其包含促进异二聚体Fc而非同二聚体Fc形成的一个或多个氨基酸修饰。
在用于产生双特异性抗原结合多肽构建体的方法的一些实施方案中，当H1、L1、H2和L2共表达时，通过H1L1％和H2L2％之和测量的总正确配对量与相应的在Fab区中不具有促进优先配对的氨基酸取代的H1、L1、H2和L2多肽链的配对相比的变化大于约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；或由所产生的双特异性抗体的量(表示为所产生的非半抗体种类的百分比)测量的总正确配对量与相应的在Fab区中不具有促进优先配对的氨基酸取代的H1、L1、H2和L2多肽链的配对相比的变化大于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％；或由所产生的双特异性抗体的量(表示为所产生的所有种类的百分比)测量的总正确配对量与相应的在Fab区中不具有促进优先配对的氨基酸取代的H1、L1、H2和L2多肽链的配对相比的变化大于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。
附图简述
图1描绘了针对可变结构域和恒定结构域进行的D3H44、帕妥珠单抗和CAT-2200重链和轻链氨基酸序列与人种系序列的比对。通过直接查询IMGT/GENE-DB(http://www.imgt.org/genedb/query)获得每个结构域、种系和等位基因的翻译蛋白质序列。使用IMGT/DomainGapAlign(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi)来确定最接近的基因/等位基因。通过BoxShade(http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)以0.8的截止值识别共有序列。具有黑色阴影的氨基酸残基代表氨基酸序列同一性，而具有灰色阴影的氨基酸残基代表氨基酸序列相似性。按照如Lefranc M.-P.等人，″IMGT unique numbering for immunoglobulin and Tcell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains″Dev.Comp.Immunol.，2005，29，185-203以及Lefranc，M.-P.、Pommié，C.、Ruiz，M.、Giudicelli，V.、Foulquier，E.、Truong，L.、Thouvenin-Contet，V.和Lefranc，G.“IMGTunique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains andIg superfamily V-like domains”Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)中所述的IMGT定义进行图1中每个结构域的氨基酸分配。图1A描绘了与人IGHV和IGHJ种系亚群(针对每个基因和等位基因显示一个代表性序列)比对的帕妥珠单抗和D3H44可变重链(VH)结构域。最接近帕妥珠单抗IGHV和IGHJ的基因和等位基因序列分别为X92218|IGHV3-66*01和J00256|IGHJ4*01。最接近D3H44 IGHV和IGHJ的基因和等位基因序列分别为X92218|IGHV3-66*01和J00256|IGHJ4*01。图1B描绘了与人κIGKV和IGKJ种系亚群(针对每个基因和等位基因显示一个代表性序列)比对的帕妥珠单抗和D3H44可变轻链(VL)结构域。最接近帕妥珠单抗IGKV和IGKJ的基因和等位基因序列分别为Y14865|IGKV1-NL1*01和J00242|IGKJ2*01。最接近D3H44 IGKV和IGKJ的基因和等位基因序列分别为X59315|IGKV1-39*01和J00242|IGKJ1*01。图1C描绘了与人CH1 IGHG种系亚群比对的帕妥珠单抗和D3H44恒定重链1(CH1)结构域。最接近帕妥珠单抗和D3H44 IGHG的基因和等位基因序列是J00228|IGHG1*01。图1D描绘了与人κIGKC种系亚群比对的帕妥珠单抗和D3H44恒定轻链(CL)结构域。最接近帕妥珠单抗和D3H44 IGKC的基因和等位基因序列是J00241|IGKC*01。图1E描绘了与人IGHV和IGHJ种系亚群(针对每个基因和等位基因显示一个代表性序列)比对的CAT-2200 VH结构域。最接近CAT-2200 IGHV和IGHJ的基因和等位基因序列分别为M99660|IGHV3-23*01和J00256|IGHJ4*01。图1F描绘了与人λIGLV和IGLJ种系亚群(针对每个基因和等位基因显示一个代表性序列)比对的CAT-2200 VL结构域。最接近CAT-2200 IGLV和IGLJ的基因和等位基因序列分别为Z73673|IGLV6-57*01和M15641|IGLJ2*01。图1G描绘了与人CH1 IGHG种系亚群比对的CAT-2200 CH1结构域。最接近CAT-2200 IGHG的基因和等位基因序列是J00228|IGHG1*01。图1H描绘了与人λIGLC种系亚群比对的CAT-2200 CL结构域。最接近CAT-2200 IGLC的基因和等位基因序列是J00253|IGLC2*01。
图2描绘了用于识别界面残基和对具有优先重链-轻链配对的设计进行计算机建模的流程图。
图3描绘了D3H44(PDB ID 1JPT)和CAT-2200(PDB-ID 2VXS)的恒定结构域之间的3D结构比对。图3A例示了κ和λ轻链在与各自的重链对齐时彼此之间的典型构象差异。图3B呈现图3A中所示模型的轻链界面(已去除重链)的视图，以进一步例示构象差异。虚线箭头指向重链和轻链之间的界面处的二级结构元件的构象重排。
图4示出了对于形成双特异性抗体的工程改造要求以及量化重链轻链(H-L)对所需的测定要求的高级原理概述。通过合理地工程改造(通过引入特定的氨基酸突变)两个独特重链与其独特的同源轻链的优先配对，可以实现工程改造具有高纯度的双特异性抗体(即很少有或不存在错配的H-L缔合)的设计目标。这个过程如图所示；这里H1已被工程改造成与L1(用打钩符号表示)而不是L2(用“X”表示)优先配对。同样地，H2已被工程改造成与L2而不是L1优先配对。H1L1和H2L2异二聚体上的箭头表示这些H-L对之间被促进的配对，而H1L2和H2L1异二聚体上的箭头表示后两种H-L对之间的配对被破坏。促进优先配对的设计的实验筛选需要能够同时量化H1L1:HIL2和H2L2:H2L1的测定。通过假设每个双特异性Fab臂可以独立地被工程改造，可以简化这些测定要求。在这种情况下，该测定只需要量化H1L1:H1L2或H2L2:H2L1，而不是同时量化。
图5提供了描绘如何标记重链和轻链以及如何测定优先配对的示意图。在该示意图中，圆形边界表示被3个构建体(一个重链和两个独特轻链)转染的细胞。表达产物从细胞分泌并且上清液(SPNT)通过检测装置(在这个例子中为SPR芯片)的上方。基于检测与竞争重链配对的两个轻链融合的两个不同的标签，可以获得重链与两个轻链的优先配对的定量评估。
图6描绘了基于每个设计的两个LCCA结果的性能过滤标准。这些性能过滤标准被用来鉴定K-L设计库和K-K衍生的K-L设计库。为了被包括在内，一个设计应该包含位于中性区(中性区被定义为40∶60和60∶40 配对∶错配比之间的区域)上方的阳性LCCA结果，而另一个LCCA必须高于中性区的下限(40∶60 配对∶错配比)。方案A和B代表通过过滤标准的设计。注意到方案B被纳入的原因在于：H2L2:H2L1 LCCA高于中性区，而H1L1:H1L2 LCCA位于中性区内(不低于中性区)。方案C代表一个被滤除的设计，其中两个LCCA结果均为阳性，但都不在中性区的上方。方案D和E代表因为至少一个LCCA结果低于中性区而被过滤除的设计，即使另一个LCCA高于中性区(参见方案D)。还包括了H1L1和H2L2名称颠倒的设计。该图的这种描述假设野生型配对比为50∶50。
图7描绘了由设计强度＝ΔH1∶L1∶L2_标量+ΔH2∶L2∶L1_标量所定义的所选K-L设计以及K-K衍生的K-L设计(基于表4A和4B中的Mab设计组的LCCA数据)的性能。该度量标准是设计层面的总体配对成功的一个指标。
图8描绘了当两个不同的轻链与两个不同的重链在细胞中共表达时可以预期的潜在的重链相关产物。
图9描绘了使用本文提供的Mab设计组文库制备双特异性抗原结合多肽构建体的一般方法。
图10描绘了按设计群组汇总在SMCA中测试的所有K-L设计在三种双特异性系统中的性能的最小值-最大值箱线图。图10A示出了通过总双特异性计算测量的性能(Δ双特异性％)。图10B示出了通过总配对计算测量的性能(Δ配对％)。
图11描绘了按照可转移性群组汇总K-L设计和K-K衍生的K-L设计在每个双特异性系统中的性能的最小值-最大值箱线图；“kl 3/3”表示可以在全部3个双特异性系统中转移的K-L设计；“kl 3/3+2/3”表示可以在至少2个双特异性系统中转移的K-L设计；并且“k1全部”表示所有测试的K-L设计。同样地，“kk 3/3”表示可以在全部3个双特异性系统中转移的K-K衍生的K-L设计，“kk 3/3+2/3”表示可以在至少2个双特异性系统中转移的K-K衍生的K-L设计，并且“kk全部”表示所有测试的K-K衍生的K-L设计；所呈现的结果是基于总双特异性计算(Δ双特异性％)。
图12描绘了使用Mab设计组3972(SMCA设计ID；在三个双特异性系统中的每一个中)产生的双特异性抗体和每个系统的野生型亲本抗体的DSC传感图。图12A描绘了野生型CAT-2200 mAb(深灰色)、野生型帕妥珠单抗mAb(中灰色)和设计3972 CAT-2200/帕妥珠单抗SMCA(浅灰色)；图12B描绘了野生型CAT-2200 mAb(深灰色)、野生型SGN-CD19a mAb(中灰色)和设计3972CAT-2200/SGN-CD19a SMCA(浅灰色)；图12C描绘了野生型SGN-CD19a mAb(深灰色)、野生型CR8071 mAb(中灰色)和设计3972CR8071/SGN-CD19a SMCA(浅灰色)。
图13描绘了汇总Mab设计的氨基酸取代对测试Fab的Tm的影响的最小值-最大值箱线图。结果被报告为相较于野生型的Fab Tm变化，并针对其中测量了Tm的所有设计(“全部”)示出，并按互补位分开。
图14描绘了汇总Mab设计的氨基酸取代对测试的Fab对抗原亲和力的影响的最小值-最大值箱线图。结果被报告为双特异性抗体的合适Fab的log(KD)与野生型的差异(-(log(KD_变体)-log(KD_野生型))。结果是针对其中测量了亲和力的所有设计(“全部”)示出，并按互补位分开。
图15描绘了通过蛋白A和制备型SEC纯化的双特异性抗体以及亲本抗体的UPLC-SEC特征。图15A示出了野生型亲本CAT-2200 mAb；图15B示出了野生型亲本CR8071 mAb；图15C示出了野生型亲本SGN-CD19a mAb；图15D示出了野生型亲本帕妥珠单抗mAb；图15E示出了使用设计3972 CAT-2200/帕妥珠单抗SMCA产生的双特异性抗体；图15F示出了使用设计3972 CAT-2200/SGN-CD19a SMCA产生的双特异性抗体；且图15G示出了使用设计3972CR8071/SGN-CD19a SMCA产生的双特异性抗体。
图16描绘了在未通过SMCA评估相应的野生型双特异性构建体的情况下，针对在SMCA中测试的设计选择用于计算“相对于野生型的总配对量的变化”和“相对于野生型的总双特异性的变化”的野生型参考值的过程。图16A示出了针对三个双特异性系统中的每一个选择用于“总配对”(“％H1L1和％H2L2配对”)的野生型参考值的过程；图16B示出了针对三个双特异性系统中的每一个选择用于“总双特异性”(“H1L1_H2L2和H1L2_H2L1**”)的野生型参考值的过程。
具体实施方式
本文提供了工程改造的抗体(在本文中也称为多特异性抗原结合多肽构建体)，其可以包含具有配对形成第一Fab区的第一免疫球蛋白重链(H1)和免疫球蛋白λ轻链(L1)的第一异二聚体(H1L1)，以及具有配对形成第二Fab区的免疫球蛋白重链(H2)和免疫球蛋白κ轻链(L2)的第二异二聚体(H2L2)。第一Fab区通常结合第一抗原，并且第二Fab区通常结合第二抗原。在一些实施方案中，第一和第二抗原彼此不同。H1与H2不同。所述免疫球蛋白重链和轻链中的一个或多个经工程改造以包含当正确配对的重链和轻链共表达或共同产生时促进正确配对的重链和轻链(H1L1或H2L2)优先配对的氨基酸修饰。更具体地说，所述氨基酸修饰促进每条重链与正确轻链之间的优先配对，以使得第一异二聚体的重链(H1)可以优先与L1而不是L2配对，并且第二异二聚体的重链(H2)可以优先与L2而不是L1配对。结果，H1、L1、H2和L2多肽的共表达可以允许产生具有减少的或有限错配的正确配对的双特异性抗体，从而减少所产生的错配种类的数目和量并潜在地提高可制造性。在一个实施方案中，Fab区中的氨基酸修饰与Fc区中促进异二聚体Fc区形成的氨基酸修饰配对，从而进一步减少错配重链的量。与由野生型H1和L1或H2和L2多肽形成的异二聚体相比，氨基酸修饰不显著影响正确配对的异二聚体的热稳定性或每个正确配对的异二聚体对抗原的结合亲和力。
本文还提供了制备上述多特异性抗原结合多肽构建体的方法。
定义
除非另有规定，否则本文所使用的所有技术和科科学术语具有如要求保护的主题所属的领域的技术人员通常所理解的相同含义。如果本文中的术语有多种定义，以本部分中的定义为准。当对URL或其它这种标识符或地址进行引用时，应该理解这种标识符可以变化且互联网上的具体信息可以变化不定，但通过搜索互联网可以发现等价的信息。对其进行的引用证明了这些信息的可用性和公共传播性。
应该了解，上文一般的描述及下文的详细描述仅为示例性和说明性，且不限制要求保护的任何主体。在本申请中，除非另外明确陈述，否则使用单数包括复数。
在本说明书中，除非另外指明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应该被理解为包括所列举范围内的任何整数值，并且在适当时包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)。如本文所使用，除非另外指明，否则″约″意指所指示的范围、值、序列或结构的±1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。应该理解，除非另外说明或由上下文指定，否则如本文所使用的术语″一个(a/an)″是指所列举的组分中的“一个或多个”。替代物(例如，″或″)的使用应被理解为意指所述替代物中的任一者、两者或其任何组合。如本文所使用，术语″包括″和″包含″同义地使用。另外，应该理解，衍生自本文所描述的结构和取代物的不同组合的个别单链多肽或免疫球蛋白构建体由本申请公开，其公开程度就如同单独地阐述了每个单链多肽或异二聚体。因此，选择具体组分以形成个别单链多肽或异二聚体是在本公开的范围内。
本文所用的章节标题仅出于组织性目的，并且不应被视为限制所描述的主体。本申请中引用的所有文献或文献的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、手册和论文，均据此出于任何目的以引用的方式明确地整体并入本文。
应该理解，本文所描述的方法和组合物不限于本文所描述的特定方法、方案、细胞系、构建体和试剂，并且因此可以变化。还应该理解，本文所使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的而不意图限制本文所描述的方法和组合物的范围，所述范围将仅受所附权利要求书限制。
本文提及的所有出版物和专利出于描述和公开例如在所述出版物中描述的构建体和方法的目的以引用的方式整体并入本文，所述构建体和方法可以结合本文所描述的方法、组合物和化合物一起使用。本文所讨论的出版物仅仅是为了其在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。本文的任何内容都不应解释为承认由于先前发明或出于任何其它原因而使本文所描述的发明者无权先于该公开。
在本申请中，氨基酸名称和原子名称(例如N、O、C等)是按照由蛋白质数据库(PDB)(www.pdb.org)所定义来使用，该蛋白质数据库是基于IUPAC命名法(IUPAC Nomenclatureand Symbolism for Amino Acids and Peptides(残基名称、原子名称等)、Eur.J.Biochem.，138，9-37(1984)连同其在Eur.J.Biochem.，152，1(1985)中的修正。术语“氨基酸残基”主要意指包含在选自由以下20种天然存在的氨基酸组成的组中的氨基酸残基：丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(He或I)、赖氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、缬氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)残基。
术语″多肽″、″肽″和″蛋白质″在本文中可以互换地用来指氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于对肽的描述和对蛋白质的描述，并且反之亦然。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物，以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然编码的氨基酸的氨基酸聚合物。如本文所使用，所述术语涵盖包括全长蛋白质在内的任何长度的氨基酸链，其中氨基酸残基通过共价肽键相连接。
术语“核苷酸序列”或“核酸序列”意图指示两个或更多个核苷酸分子的连续片段。核苷酸序列的来源可以是基因组、cDNA、RNA、半合成或合成或其任何组合。
″细胞″、″宿主细胞″、″细胞系″和″细胞培养物″在本文中可互换使用，并且所有这类术语应被理解为包括由细胞的生长或培养所产生的后代。″转化″和″转染″可互换地用来指将核酸序列引入细胞中的过程。
术语″氨基酸″是指天然存在的和非天然存在的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有经过修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经过修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。提及氨基酸包括例如天然存在的蛋白质L-氨基酸；D-氨基酸；化学修饰的氨基酸，例如氨基酸变体和衍生物；天然存在的非蛋白质氨基酸，例如丙氨酸、鸟氨酸等；以及具有本领域已知的氨基酸的特性的化学合成化合物。非天然存在的氨基酸的实例包括但不限于N-甲基氨基酸(例如-甲基丙氨酸)、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(例如，2-氨基-组氨酸、羟基-组氨酸、高组氨酸)、在侧链中具有额外亚甲基的氨基酸(″高″氨基酸)和其中侧链中的羧酸官能团被磺酸基团置换的氨基酸(例如，半胱氨酸)。将非天然氨基酸(包括合成的非天然氨基酸、取代的氨基酸或一个或多个D-氨基酸)并入本文所述的抗原结合多肽构建体的蛋白质中可以是以多种不同的方式有利的。含有D-氨基酸的肽等与含有L-氨基酸的对应物相比展现出增加的体外或体内稳定性。因此，当需要或要求更高的细胞内稳定性时，构建并入D-氨基酸的肽等可以是特别有用的。更具体地说，D-肽等对内源性肽酶和蛋白酶有抗性，从而在需要改善的分子生物利用度和延长的体内寿命时，提供这类特性。另外，无法有效加工D-肽等以用于向T辅助细胞的II类主要组织相容性复合物限制呈递，并且因此不太可能诱导完整生物体中的体液免疫反应。
在本文中，氨基酸被表示为其通常已知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号。同样地，核苷酸可以被表示为其通常公认的单字母代码。
″保守修饰的变体″适用于氨基酸和核酸序列两者。就特定核酸序列来说，″保守修饰的变体″是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或如果核酸不编码氨基酸序列时，则是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何特定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每一个位置处，可以在不改变所编码的多肽的情况下将密码子更改为所描述的相应密码子中的任一个。这类核酸变异是″沉默变异″，其为保守修饰变异中的一种。本文中编码多肽的每一个核酸序列还描述了该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域的普通技术人员将认识到核酸中的每个密码子(除了通常为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常为色氨酸的唯一密码子的TGG以外)均可被修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异均隐含在每个所描述的序列中。
关于氨基酸序列，本领域的普通技术人员将认识到改变、添加或缺失所编码序列中的单一氨基酸或一小比例氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加是″保守修饰的变体″，其中所述改变导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加或氨基酸被化学上类似的氨基酸取代。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域的普通技术人员已知的。这些保守修饰的变体附加于并且不排除本发明的多态变体、种间同源物和等位基因。
提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域的普通技术人员已知的。以下八组各自包含可以被视为彼此的保守取代的氨基酸：
丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；和
丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
(参见例如Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W HFreeman&Co.；第2版(1993年12月))。
在两种或更多种核酸或多肽序列的情况下，术语″相同″或″同一性″百分比是指两个或更多个序列或子序列相同。当比较和比对序列在比较窗口或指定区域内的最大对应性(如使用以下序列比较算法(或本领域普通技术人员可利用的其它算法)中的一种或通过手动比对和目视检查测量)时，如果所述序列具有一定百分比氨基酸残基或核苷酸相同(即在指定区域内具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性)，则它们是“大体上相同的”或“大体上类似的”。此定义还涉及测试序列的互补序列。同一性可以存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区域上，或长度为75至100个氨基酸或核苷酸的区域上，或在没有明确说明的情况下可以存在于多核苷酸或多肽的整个序列上。编码本文所述的抗原结合多肽构建体的多肽的多核苷酸(包括来自非人类物种的同源物)可以通过包括以下步骤的方法获得：在严格杂交条件下使用具有本文所述的抗原结合多肽构建体的多核苷酸序列或其片段的标记探针筛选文库；以及分离含有所述多核苷酸序列的全长cDNA和基因组克隆。此类杂交技术是熟练的技术人员所熟知的。
适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的实例是BLASTTM和BLASTTM2.0算法，其分别描述于Altschul等人(Nuc.Acids Res.25：3389-402，1977)和Altschul等人(J.Mol.Biol.215：403-10，1990)中。用于执行BLASTTM分析的软件可从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得(参见互联网www.ncbi.nlm.nih.gov)。对于核苷酸序列，使用参数M(针对一对匹配残基的奖励得分；始终＞0)和N(针对错配残基的罚分；始终＜0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当出现以下情况时，停止命中字串在每个方向上的延伸：累计比对分数从其达到的最大值下降达数量X；由于一个或多个计负分的残基比对的累积，累积分数为变为零或低于零；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)的算法参数的实例是字长(W)＝11、期望值(E)＝10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序的算法参数的实例是字长3、期望值(E)10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1989)。
如果多肽的衍生物或变体的氨基酸序列与来自原始肽的长度为100个氨基酸的序列具有至少50％的同一性，则所述衍生物或变体被称为与所述肽具有“同源性”或是“同源的”。在某些实施方案中，所述衍生物或变体与所述肽或所述肽的具有与所述衍生物相同数目的氨基酸残基的片段的衍生物或变体至少75％相同。在某些实施方案中，所述衍生物或变体与所述肽或所述肽的具有与所述衍生物相同数目的氨基酸残基的片段的衍生物或变体至少85％相同。在某些实施方案中，所述衍生物的氨基酸序列与所述肽或所述肽的与所述衍生物具有相同数目的氨基酸残基的片段至少90％相同。在一些实施方案中，所述衍生物的氨基酸序列与所述肽或所述肽的与所述衍生物具有相同数目的氨基酸残基的片段至少95％相同。在某些实施方案中，所述衍生物或变体与所述肽或所述肽的与所述衍生物具有相同数目的氨基酸残基的片段的衍生物或变体至少99％相同。
如本文中所用，“分离的”多肽或构建体意指已从其天然细胞培养环境的组分中鉴定并且分离和/或回收的构建体或多肽。其天然环境的污染物组分是通常将会干扰异多聚体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。
在某些实施方案中，如本文中所用，“分离的”抗原结合多肽构建体描述已从其天然细胞培养环境的组分中鉴定并且分离和/或回收的抗原结合多肽构建体。例如，本文所述的分离的双特异性抗原结合多肽构建体包含异二聚体对或“分离的”异二聚体对，其包括已从其天然细胞培养环境的组分中鉴定并且分离和/或回收的异二聚体或异二聚体对。其天然环境的污染物组分是将会干扰异二聚体或抗原结合多肽构建体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。
异二聚体和抗原结合多肽构建体可以纯化至大体上同质性。短语“大体上同质的”、“大体上同质的形式”和“大体上同质性”用于表示正确配对的产物大体上不含源自非所需的多肽组合(例如同二聚体或错配的异二聚体)的副产物。在LCCA设计组(H1L1L2)的情况下，正确配对的产物是包含H1和L1的异二聚体(H1L1)。在LCCA设计组(H2L1L2)的情况下，正确配对的产物是包含H2和L2的异二聚体(H2L2)。在一个实施方案中，在表达H1、L1、H2和L2的双特异性抗原结合多肽构建体的情况下，正确配对的产物是包含正确配对的H1L1和H2L2的异二聚体对(H1L1H2L2)。在一些实施方案中，在表达H1、L1、H2和L2的双特异性抗原结合多肽构建体的情况下，正确配对的产物可以包括在至少一个Fab区中显示正确配对的其它产物，如例如H1L1H2L1或H1L2H2L2，或当产生“半抗体”时，包括H1L1或H2L2。就纯度而言，在一个实施方案中，大体上同质性意指完全错配的副产物的量不超过混合物中存在的所有种类的总LC-MS强度的20％，例如低于10％、低于5％、低于1％或低于0.5％，其中百分比反映来自质谱分析的结果。
除非本文明确不同地定义，否则由抗体技术领域中的技术人员所理解的术语各自被给予在本领域中所获得的含义。已知抗体具有可变区、铰链区和恒定结构域。免疫球蛋白结构和功能综述于例如Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，第14章(ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1988)。
如本文中所用，术语“抗体”和“免疫球蛋白”或“抗原结合多肽构建体”可互换使用。“抗原结合多肽构建体”是指大体上由一个或多个免疫球蛋白基因编码的特异性结合分析物(抗原)的多肽或其一个或多个片段。已识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、6、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其转而分别定义免疫球蛋白同种型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。此外，抗体可以属于多种亚型之一，例如，IgG可以属于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元由两对多肽链组成，每对具有一条免疫球蛋白“轻”链(约25kD)和一条免疫球蛋白“重”链(约50-70kD)。这种类型的免疫球蛋白或抗体结构单元被认为是“天然存在的”。术语“轻链”包括全长轻链及其具有足够可变结构域序列以赋予结合特异性的片段。全长轻链包含可变结构域VL和恒定结构域CL。轻链的可变结构域位于多肽的氨基末端。轻链包括κ链和λ链。术语“重链”包括全长重链及其具有足够可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长重链包含可变结构域VH和三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域位于多肽的氨基末端，而CH结构域位于羧基末端，其中CH3最接近多肽的羧基末端。重链可以是任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类)、IgA(包括IgA1和IgA2亚类)、IgM、IgD和IgE。术语“可变区”或“可变结构域”是指通常负责抗原识别的抗体的轻链和/或重链的一部分，通常包括重链(VH)中的约120至130个氨基末端氨基酸和轻链(VL)中的约100至110个氨基末端氨基酸。
“互补决定区”或“CDR”是有助于抗原结合特异性和亲和力的氨基酸序列。“框架”区(FR)可以帮助维持CDR的正确构象以促进抗原结合区和抗原之间的结合。结构上，框架区可位于抗体中的CDR之间。可变区通常显示由三个高变区(CDR)连接的相对保守的框架区(FR)的相同一般结构。来自每一对的两条链的CDR通常由框架区对齐，这可以使得能够结合特定的表位。从N端到C端，轻链和重链可变区通常都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。除非另外说明，否则每个结构域的氨基酸分配通常符合Kabat Sequences ofProteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987年和1991年))的定义。
“多特异性抗原结合多肽构建体”或“多特异性抗体”是靶向或结合多于一种不同的抗原或表位的抗原结合多肽构建体或抗体。“双特异性”、“双重特异性”或“双功能”抗原结合多肽构建体或抗体是靶向或结合两种不同抗原或表位的多特异性抗原结合多肽构建体种类。通常，双特异性抗原结合多肽构建体可以具有两个不同的抗原结合结构域。双特异性抗原结合多肽构建体或抗体的两个抗原结合结构域将结合两个不同的表位，所述表位可以位于相同或不同的分子靶标上。在一个实施方案中，双特异性抗原结合多肽构建体为天然存在的形式。换言之，双特异性抗原结合多肽构建体具有与天然存在的IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体相同的形式。
抗体重链与抗体轻链配对并且在一个或多个“界面”处相遇或接触。“界面”包括第一多肽中的一个或多个“接触”氨基酸残基，其与第二多肽的一个或多个“接触”氨基酸残基相互作用。例如，界面存在于二聚化Fc区的两个CH3结构域之间、重链的CH1结构域和轻链的CL结构域之间以及重链的VH结构域和轻链的VL结构域之间。“界面”可以衍生自IgG抗体，例如衍生自人IgG1抗体。
本文所使用的术语“氨基酸修饰”包括但不限于氨基酸插入、缺失、取代、化学修饰、物理修饰和重排。
免疫球蛋白重链和轻链的氨基酸残基可以根据几种惯例进行编号，包括Kabat(如Kabat和Wu，1991；Kabat等人，Sequences of proteins of immunological interest，第5版-US Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242，第647页(1991)中所述)；IMGT(如Lefranc，M.-P.等人，the international ImMunoGeneTicsinformationNucl.Acids Res，37，D1006-D1012(2009)和Lefranc，M.-P.，IMGT，the International ImMunoGeneTics Information System，Cold Spring HarbProtoc.2011年6月1日；2011(6)中所述)；1JPT(如Katja Faelber、Daniel Kirchhofer、Leonard Presta、Robert F Kelley、Yves A Muller，Theresolution crystalstructures of tissue factor in complex with humanized fab d3h44 and of freehumanized fab d3h44：revisiting the solvation of antigen combining sites 1，Journal of Molecular Biology，第313卷，第1期，第83-97页中所述)；以及EU(根据如提及EU抗体的编号的Kabat中的EU索引(Edelman等人，1969，Proc Natl Acad Sci USA 63：78-85))。除非另有说明，否则Kabat编号在本文中用于VH、CH1、CL和VL结构域。除非另有说明，否则EU编号在本文中用于CH3和CH2结构域和铰链区。表22A提供了显示使用IMGT、Kabat、1JPT和EU编号系统进行的IgG1重链多肽中选定位置的氨基酸编号的对应表。表22B提供了显示使用IMGT和Kabat编号系统进行的λ轻链多肽中选定位置的氨基酸编号的对应表。表22C提供了显示使用IMGT、1JPT和Kabat编号系统进行的κ轻链多肽中选定位置的氨基酸编号的对应表。
抗原结合多肽构建体
本文所述的抗原结合多肽构建体(即抗体)可以是多特异性的或双特异性的。多特异性抗原结合多肽构建体可以包含：至少第一异二聚体(H1L1)，其具有形成第一Fab区的第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和免疫球蛋白λ轻链多肽序列(L1)；以及至少第二异二聚体(H2L2)，其具有形成第二Fab区的免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和免疫球蛋白κ轻链多肽序列(L2)，其中H1和H2彼此不同。在一个实施方案中，双特异性抗原结合多肽构建体包含：第一异二聚体(H1L1)，其具有形成第一Fab区的第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和免疫球蛋白λ轻链多肽序列(L1)；以及第二异二聚体(H2L2)，其具有形成第二Fab区的免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和免疫球蛋白κ轻链多肽序列(L2)，其中H1和H2彼此不同。在一个实施方案中，每个异二聚体包含单个Fab区。本文所使用的术语“Fab区”是指由一个免疫球蛋白轻链多肽序列和一个免疫球蛋白重链多肽序列配对产生的区域，并且由免疫球蛋白重链多肽序列的VH和CH1结构域以及免疫球蛋白轻链多肽序列的VL和CL结构域组成。在一些实施方案中，第一Fab区结合第一抗原，并且第二Fab区结合第二抗原。第一和第二抗原可以是相同或不同的。所述免疫球蛋白重链和轻链中的一个或多个可以包含当重链和轻链共表达或共同产生时促进正确配对的重链和轻链优先配对的氨基酸修饰。
当抗原结合多肽构建体是双特异性抗原结合多肽构建体(即双特异性抗体)时，其也可以被称为“异二聚体对”。
为了说明起见，抗原结合多肽构建体的第一异二聚体被称为H1L1，并且包含与免疫球蛋白λ轻链多肽序列(L1)配对的第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)；而第二异二聚体被称为H2L2，并且包含与免疫球蛋白κ轻链多肽序列(L2)配对的第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)。然而，应该理解的是，这种命名是任意的，并且只是想具体说明一个异二聚体包含免疫球蛋白κ轻链，而另一个异二聚体包含免疫球蛋白λ轻链。第一异二聚体H1L1的Fab区在本文中也可以被称为“λFab”；而第二异二聚体H2L2的Fab区在本文中也可以被称为“κFab”。
亲本抗体
每个异二聚体的免疫球蛋白重链多肽序列(又称“重链”)和免疫球蛋白轻链多肽序列(又称“轻链”)可以从一种或多种亲本抗体获得，其中至少一种亲本抗体包含κ轻链，至少另一种亲本抗体包含λ轻链，并且促进优先配对的氨基酸修饰被工程改造至这些重链和轻链中。缺乏促进优先配对的氨基酸修饰的亲本免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链序列被称为野生型免疫球蛋白重链多肽序列、野生型免疫球蛋白κ轻链多肽序列和野生型免疫球蛋白λ轻链多肽序列。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体的异二聚体的重链和轻链是从两种亲本抗体获得。通常，两种亲本抗体彼此不同；然而，并不总是如此。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体是双特异性抗原结合多肽构建体，其中每个异二聚体获自不同的亲本抗体。在另一个实施方案中，抗原结合多肽构建体是双特异性抗原结合多肽构建体，其中两种亲本抗体结合相同的抗原，但靶向相同抗原上的不同表位。在一个实施方案中，至少一个亲本抗体是单特异性的，即仅能够结合一个表位。在另一个实施方案中，至少一个亲本抗体可以结合多于一个表位。
抗原结合多肽构建体的每个异二聚体的重链和轻链配对形成特异性结合与其所获自的亲本抗体相同的抗原的Fab区。例如，如果基于亲本抗体CAT-2200(含有λ轻链并结合IL-17A)和D3H44(含有κ轻链并结合组织因子)制备双特异性抗原结合多肽构建体，则一个异二聚体的重链和轻链将配对形成结合IL-17A的Fab区，并且第二异二聚体的重链和轻链将配对形成结合组织因子的Fab区。
亲本抗体可以从包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛、山羊或骆驼的物种获得。在一个实施方案中，亲本抗体可以从人或小鼠获得。
亲本抗体还可以包括使用标准单克隆抗体制备方案(如Kohler和Milstein(Nature，256：495-497，1975)所述的方案)从杂交瘤制备的那些抗体。
结合特定靶标的抗体还可以通过许多不同的策略(包括噬菌体展示、体外展示和其它方法)来鉴定。这些策略产生scFv形式、Fab形式或全长IgG形式的抗体。这些策略的综述见于William R.Strohl和Lila M.Strohl，Therapeutic Antibody Engineering(Woodhead Publishing series，Biomedicine No 11，ISBN 1 907568 37 9，2012年10月)的第4章。在一个实施方案中，亲本抗体包括通过噬菌体展示或体外展示鉴定的抗体。可以将以不同于Fab或全长IgG形式的形式鉴定的抗体转化成本领域已知的抗体。将scFv转化成Fab的方法在本领域中是公知的(参见例如Steinwand等人，Mabs 6：204-218，或Zuberbuhler等人，Protein Engineering，Design&Selection 22：169-174)。在一个实施方案中，最初鉴定为scFv，但其中scFv已被转化为Fab形式并工程改造为常规或天然存在的抗体形式的抗体也可以用作亲本抗体。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体的每个异二聚体的重链和轻链可以从人源化抗体形式的亲本抗体获得。人源化抗体可以通过用人抗体的互补决定区(CDR)取代衍生自非人类哺乳动物(例如小鼠)的抗体的CDR来获得。用于鉴定CDR的方法是本领域已知的(Kabat等人，Sequence of Proteins of Immunological Interest(1987)，NationalInstitute of Health，Bethesda，Md；Chothia等人，Nature(1989)342：877)。适用于该目的的一般基因重组技术也是已知的(参见欧洲专利申请公开号EP 125023；和WO 96/02576)。例如，可以通过已知的方法确定小鼠抗体的CDR，并且可以制备DNA以使其编码其中CDR与人抗体的框架区(FR)连接的抗体。然后可以利用使用常规表达载体的系统来产生人源化抗体。此类DNA可以通过PCR使用几种寡核苷酸作为引物来合成，所述寡核苷酸被设计成包括与CDR和FR区的末端重叠的部分(参见WO 98/13388中所述的方法)。选择经由CDR连接的人抗体FR，以使得CDR形成合适的抗原结合位点。如果需要，可以修饰抗体可变区的FR中的氨基酸，以便使重构的人抗体的CDR可以形成合适的抗原结合结构域(Sato，K.等人，CancerRes.(1993)53：851-856)。FR中的可修饰氨基酸残基包括通过非共价键直接与抗原结合的部分(Amit等人，Science(1986)233：747-53)、对CDR结构具有一定影响或作用的部分(Chothia等人，J.Mol.Biol.(1987)196：901-17)以及参与VH和VL之间的相互作用的部分(EP 239400)。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体的每个异二聚体的重链和轻链可以从嵌合抗体形式的亲本抗体获得。嵌合抗体是通过组合来自不同动物的序列制备的抗体。例如，可以通过将来自小鼠抗体的重链和轻链可变结构域与来自人抗体的重链和轻链恒定结构域组合来产生嵌合抗体。嵌合抗体可以通过已知方法来制备。为了获得此类嵌合抗体，例如，可以将编码抗体可变结构域的DNA与编码人抗体恒定结构域的核酸连接；可以将所得的连接产物插入表达载体中；并且可以将构建体导入宿主细胞以产生嵌合抗体。
异二聚体的重链和轻链可以从本领域中已知的许多亲本抗体获得。大多数抗体可以作为亲本抗体，条件是它们包含与免疫球蛋白轻链多肽序列配对形成结合抗原的Fab区的免疫球蛋白重链多肽序列。在一个实施方案中，至少一个亲本抗体是治疗性抗体，即用于治疗疾病的抗体。合适的包含κ轻链的治疗性抗体和其结合的抗原的非限制性实例确定于下表A中：
表A：示例性的包含κ轻链的治疗性抗体
合适的包含λ轻链的治疗性抗体和其结合的抗原的非限制性实例确定于下表B中：
表B：示例性的包含λ轻链的治疗性抗体
免疫球蛋白亚类
亲本抗体的免疫球蛋白重链属于以下类别：IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体的第一和第二异二聚体包含IgG重链。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体的第一和第二异二聚体包含IgG1重链。亲本抗体的免疫球蛋白轻链是κ轻链或λ轻链。
本文所述的抗原结合多肽构建体包含至少一个具有免疫球蛋白重链多肽序列和免疫球蛋白κ轻链多肽序列的异二聚体，以及至少另一个具有免疫球蛋白重链多肽序列和免疫球蛋白λ轻链多肽序列的异二聚体。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含一个具有IgG重链多肽序列和免疫球蛋白κ轻链多肽序列的异二聚体，以及另一个具有IgG重链多肽序列和免疫球蛋白λ轻链多肽序列的异二聚体。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有重链的异二聚体，所述重链具有选自VH结构域种系亚群IGHV1、IGHV2、IGHV3、IGHV4、IGHV5、IGHV6或IGHV7的VH结构域。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有重链的异二聚体，所述重链具有来自种系亚群IGHV3的VH结构域。在另一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有重链的异二聚体，所述重链具有选自J片段种系基因IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5或IGHJ6的J片段。在另一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有重链的异二聚体，所述重链具有来自种系亚群IGHJ4的J片段。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有重链的异二聚体，所述重链具有选自CH1结构域种系亚群IGHG1、IGHG2、IGHG3或IGHG4的CH1结构域。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有重链的异二聚体，所述重链具有来自种系亚群IGHG1的CH1结构域。
对于包含λ轻链多肽序列的异二聚体，λ轻链可以包含选自种系基因IGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6或IGLC7的CL-λ结构域。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有λ轻链的异二聚体，所述λ轻链包含来自种系亚群IGLC2的CL-λ结构域。λ轻链可以包含选自种系亚群IGLV1、IGLV2、IGLV3、IGLV4、IGLV5、IGLV6、IGLV7、IGLV8、IGLV9、IGLV10或IGLV11的VL-λ结构域。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有λ轻链的异二聚体，所述λ轻链具有来自种系亚群IGLV6的VL-λ结构域。在另一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有λ轻链的异二聚体，所述λ轻链具有选自J片段种系基因IGLJ1、IGLJ2、IGLJ3、IGLJ6或IGLJ7的λJ片段。在另一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有重链的异二聚体，所述重链具有来自种系亚群IGLJ2的λJ片段。
对于包含κ轻链多肽序列的异二聚体，κ轻链可以包含选自CL种系等位基因IGKC*01、IGKC*02、IGKC*03、IGKC*04或IGKC*05的CL-κ结构域。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有κ轻链的异二聚体，所述κ轻链包含来自种系亚群IGKC*01的CL-κ结构域。κ轻链可以包含选自种系亚群IGKV1、IGKV1D、IGKV2、IGKV3、IGKV4、IGKV5或IGKV6的VL-κ结构域。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有κ轻链的异二聚体，所述κ轻链具有来自种系亚群IGKV1的VL-κ结构域。在另一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有κ轻链的异二聚体，所述κ轻链具有选自J片段种系基因IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4或IGKJ5的J片段。在另一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有κ轻链的异二聚体，所述κ轻链具有来自种系亚群IGKJ1或IGKJ2的J片段。
免疫球蛋白重链通常包含至少一个可变(VH)结构域和三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体的第一异二聚体和第二异二聚体的每个重链包含VH结构域、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域。在另一个实施方案中，第一异二聚体和第二异二聚体的每个重链包含VH结构域、CH1结构域和CH3结构域。在另一个实施方案中，第一异二聚体和第二异二聚体的每个重链包含VH结构域和CH1结构域。免疫球蛋白轻链通常包含一个可变(VL)结构域和一个恒定(CL)结构域。在一个实施方案中，每个异二聚体的轻链包含VL结构域和CL结构域。
如上所述，在一些实施方案中，每个异二聚体的免疫球蛋白重链多肽序列和免疫球蛋白轻链多肽序列可以从已知的治疗性抗体或从结合各种靶分子或癌抗原的抗体获得。许多这样的分子的氨基酸和核苷酸序列是容易获得的(参见例如，GenBank登录号：AJ308087.1(人源化抗人组织因子抗体D3H44轻链可变区和CL结构域)；GenBank登录号：AJ308086.1(人源化抗人组织因子抗体D3H44重链可变区和CH1结构域)；GenBank登录号：HC359025.1(帕妥殊单抗Fab轻链基因模块)；GenBank登录号：HC359024.1(帕妥殊单抗Fab重链基因模块)；GenBank登录号：GM685465.1(抗体曲妥珠单抗(＝赫赛汀)-野生型；轻链)；GenBank登录号：GM685463.1(抗体曲妥珠单抗(＝赫赛汀)-野生型；重链)；GenBank登录号：GM685466.1(抗体曲妥珠单抗(＝赫赛汀)-GC优化轻链)；和GenBank登录号：GM685464.1(抗体曲妥珠单抗(＝赫赛汀)-GC优化重链)。上述每种多肽的序列自2012年11月28日起可从NCBI网站获得，并且每个序列都通过引用整体并入以用于所有目的。西妥昔单抗的氨基酸和核苷酸序列在本领域中也是已知的，参见例如由Canadian Institutes of HealthResearch、Alberta Innovates-Health Solutions，以及The Metabolomics InnovationCenter(TMIC)支持的Drug Bank网站，登录号为DB00002。
促进优先配对的氨基酸修饰
重链和轻链H1、L1、H2和L2中的一个或多个包含促进重链和轻链之间的优先配对的氨基酸修饰，所述氨基酸修饰被工程改造至亲本抗体的重链和轻链中。在一个实施方案中，重链和轻链H1、L1、H2和L2中的两个包含促进重链和轻链之间的优先配对的氨基酸修饰。在一个实施方案中，重链和轻链H1、L1、H2和L2中的三个包含促进重链和轻链之间的优先配对的氨基酸修饰。
在一些实施方案中，氨基酸修饰可以是不对称的，因为被修饰的氨基酸位置在H1和H2之间以及L1和L2之间不同。
在一个实施方案中，H2和L2包含促进重链和轻链之间的优先配对的氨基酸修饰，而H1和L1则不包含。在一个实施方案中，H1、L1和H2包含促进重链和轻链之间的优先配对的氨基酸修饰，而L2则不包含。在一个实施方案中，H1、H2和L2包含促进重链和轻链之间的优先配对的氨基酸修饰，而L1则不包含。在一个实施方案中，L1、H2和L2包含促进重链和轻链之间的优先配对的氨基酸修饰，而H1则不包含。
在一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰包括一个或多个氨基酸取代。当H1或H2与L1和L2共表达时，或当H1、L1、H2和L2共表达时，氨基酸修饰促进H1与L1以及H2与L2的优先配对。如上所述，为了说明起见，抗原结合多肽构建体的异二聚体将被确定如下：H1L1异二聚体包含λ轻链L1，并且H2L2异二聚体包含κ轻链L2。
如本文中所用，“Mab设计”或“Mab设计组”是指存在于一组H1、L1、H2和L2中的促进优先配对的一组特定氨基酸修饰，并且也被鉴定为H1L1H2L2。H1、L1、H2和L2中的一个或多个中的促进优先配对的氨基酸修饰被称作并呈现为Mab设计或Mab设计组(即H1L1H2L2)。Mab设计组首先作为LCCA设计组(即H1L1L2或H2L1L2)接受测试以确定配对特异性的强度，其中H1和H2分别与L1和L2共表达。
在一个实施方案中，可以对作为轻链和重链之间的界面的一部分的一个或多个氨基酸进行氨基酸修饰。在一个实施方案中，引入免疫球蛋白重链多肽序列和免疫球蛋白轻链多肽序列中的氨基酸修饰彼此互补。在重链与轻链界面处的互补性可以基于空间和疏水性接触、静电/电荷相互作用或这些与各种其它相互作用的组合来实现。蛋白质表面之间的互补性在文献中被广泛地描述为锁匙配合、杵进臼、突起和空腔，供体和受体等等，这些都暗示了两个相互作用表面之间的结构和化学匹配的性质。在一个实施方案中，所述异二聚体中的至少一个包含引入免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链中的氨基酸修饰，所述氨基酸修饰引入跨越轻链和重链的界面的新氢键。在一个实施方案中，所述异二聚体中的至少一个包含引入免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链中的氨基酸修饰，所述氨基酸修饰引入跨越轻链和重链的界面的新盐桥。
在一个实施方案中，Mab设计组的氨基酸修饰主要通过静电吸引和排斥来促进优先配对。在一个实施方案中，Mab设计组的氨基酸修饰主要通过空间机制促进优先配对。这些Mab设计包括在表4A、4B、7A和7B中，其中所选择的实例包括具有唯一标识符10771-11335、10771-11360、10780-11417的那些。在一个实施方案中，Mab设计组的氨基酸修饰利用空间和静电机制促进优先配对。
在一个实施方案中，H1、L1、H2和L2中的一个或多个包含氨基酸修饰，其中H1和L1不包括促进优先配对的氨基酸修饰，并且H2和L2各自包含促进优先配对的至少一个氨基酸修饰。在一个实施方案中，H1、L1、H2和L2中的一个或多个包含氨基酸修饰，其中H1、L1和H2中的一个或多个包含促进优先配对的至少一个氨基酸修饰，并且L2不包括促进优先配对的氨基酸修饰。在一个实施方案中，H1、L1、H2和L2中的一个或多个包含氨基酸修饰，其中H1、L1和L2中的一个或多个包含促进优先配对的至少一个氨基酸修饰，并且H2不包括促进优先配对的氨基酸修饰。在一个实施方案中，H1、L1、H2和L2中的一个或多个包含氨基酸修饰，其中H1、H2和L2中的一个或多个包含促进优先配对的至少一个氨基酸修饰，并且L1不包括促进优先配对的氨基酸修饰。在一个实施方案中，H1、L1、H2和L2中的一个或多个包含氨基酸修饰，其中L1、H2和L2中的一个或多个包含促进优先配对的至少一个氨基酸修饰，并且H1不包括促进优先配对的氨基酸修饰。在一个实施方案中，H1、L1、H2和L2中的一个或多个包含氨基酸修饰，其中L1、H2和L2中的每一个包含促进优先配对的至少一个氨基酸修饰。
氨基酸修饰可以位于H1、L1、H2和L2中的一个或多个的恒定结构域和/或可变结构域中。在一个实施方案中，氨基酸修饰可以位于H1和H2的CH1结构域、L1的CL-λ结构域和L2的CL-κ结构域中。在另一个实施方案中，氨基酸修饰可以位于H1和H2的CH1和VH结构域、L1的CL-λ和VL-λ结构域以及L2的CL-κ和VL-κ结构域中。在另一个实施方案中，氨基酸修饰可以位于H1和H2的VH结构域、L1的VL-λ结构域和L2的VL-κ结构域中。
在一个实施方案中，氨基酸修饰可以位于H1、L1、H2和L2中的一个或多个的框架区中。在一个实施方案中，氨基酸修饰限于如残基的Kabat编号所指示的可变(VH、VL)和恒定(CH1、CL)结构域的保守框架残基。例如，Almagro[Frontiers In Bioscience(2008)13：1619-1633]提供了基于Kabat、Chotia和IMGT编号方案的框架残基的定义。
每个Mab设计或Mab设计组中的氨基酸修饰数目可以变化。在一个实施方案中，H1包含0至8个氨基酸修饰、0至7个氨基酸修饰、0至6个氨基酸修饰、0至5个氨基酸修饰、0至4个氨基酸修饰、0至3个氨基酸修饰、0至2个氨基酸修饰、1个氨基酸修饰或不含氨基酸修饰。在一个实施方案中，L1包含0至8个氨基酸修饰、0至7个氨基酸修饰、0至6个氨基酸修饰、0至5个氨基酸修饰、0至4个氨基酸修饰、0至3个氨基酸修饰、0至2个氨基酸修饰、1个氨基酸修饰或不含氨基酸修饰。在一个实施方案中，H2包含0至8个氨基酸修饰、0至7个氨基酸修饰、0至6个氨基酸修饰、0至5个氨基酸修饰、0至4个氨基酸修饰、0至3个氨基酸修饰、0至2个氨基酸修饰、1个氨基酸修饰或不含氨基酸修饰。在一个实施方案中，L2包含0至8个氨基酸修饰、0至7个氨基酸修饰、0至6个氨基酸修饰、0至5个氨基酸修饰、0至4个氨基酸修饰、0至3个氨基酸修饰、0至2个氨基酸修饰、1个氨基酸修饰或不含氨基酸修饰。
在一个实施方案中，H1、L1、H2和L2中的氨基酸修饰的总数小于20、小于15、小于12、小于11、小于10、小于9、小于8、小于7、小于6、小于5、小于4或小于3。在一个实施方案中，H1、L1、H2和L2中的氨基酸修饰的总数为2。
在一个实施方案中，氨基酸修饰可以专门设计用于κ-λ系统，其中一个亲本抗体包含κ轻链多肽序列，并且一个亲本抗体包含λ轻链多肽序列。这样的氨基酸修饰或设计在本文中被称为K-L设计。此类氨基酸修饰或K-L设计的实例示出在表4A、表7A和表10-A1至10-A12中。
在另一个实施方案中，可以首先针对κ-κ系统(K-K设计，其中两个亲本抗体都包含κ轻链多肽序列)确定氨基酸修饰，并且随后将其运送到κ-λ系统。本领域技术人员将明白如何能够将这些设计运送到κ-λ系统。例如，可以比对κ和λ亲本抗体的重链和轻链以确定对应于K-K设计的等效λ轻链位置。然后可以修改等效λ轻链位置以符合K-K设计。这样的氨基酸修饰或设计在本文中被称为K-K衍生的K-L设计，并且可以分成以下几组：a)不需要改变设计并且在κ-κ系统中修饰的氨基酸残基与在κ-λ系统中修饰的氨基酸残基相同的那些；b)含有沉默修饰的那些，其中在κ-κ系统作出的至少一个修饰是在κ-λ系统中是不必要的，因为该修饰天然存在于λ轻链多肽序列中；c)在κ轻链多肽序列和λ轻链多肽序列中的相同相对位置处含有对至少一个氨基酸残基的氨基酸修饰的那些，但是该位置的起始氨基酸残基在κ和λ轻链多肽序列之间不同，导致在该位置产生相同的氨基酸修饰；和d)与κ-κ系统相比，在κ-λ系统中含有至少一个其它氨基酸修饰的那些。此类K-K衍生型K-L设计的实例提供在表4B、表7B和表10-B1至10-B10中。组a)的具体实例在表4B中用星号进行标记。组b)的一个具体实例由具有唯一标识符10689-10707的Mab设计组来展示。沉默修饰位于L1中(Q160E不存在于野生型λ中，因为在位置160处的残基是E而不是Q)。组c)的一个具体实例由具有唯一标识符10652-10734的Mab设计组来展示，其中在L1中，氨基酸残基124在野生型λ中为E且在野生型κ中为Q。组d)的一个具体实例由具有唯一标识符10684-10706的Mab设计组来展示，其包括氨基酸修饰K129T。
在一个实施方案中，H1、L1、H2和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以及促进H2与L2而非L1优先配对的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包含表4A、表4B、表7A、表7B、表10-A1至10-A12以及表10-B1至10-B10中提供的Mab设计组的保守氨基酸取代。
在一个实施方案中，氨基酸修饰不在相同设计内的免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链中引入新的半胱氨酸残基，也不去除天然存在的半胱氨酸残基。
H1、L1、H2和L2中促进优先配对的氨基酸修饰的组合一般称为设计。设计可以更具体地被称为“LCCA设计”(在H1、L1、L2或H2、L1、L2的情况下)或“Mab设计”(在H1、L1、H2、L2的情况下)。通常，LCCA设计是基于所需双特异性抗体的每个重链，用一个或多个特定的互补LCCA设计进行工程改造，并且因此通常以其中双特异性抗体的全部四个多肽链中的氨基酸修饰均被确定的形式呈现(参见例如，表4A和4B)。尽管可以始终鉴定特定的氨基酸取代，但应该理解，也可以考虑在每个氨基酸位置进行保守取代。
此外，为了说明起见，除非另有说明，否则H1L1异二聚体代表包含λ轻链的异二聚体，并且H2L2异二聚体代表包含κ轻链的异二聚体。最后，除非另有说明，否则根据Kabat编号系统对所有氨基酸残基或位置进行编号。
这些设计包含促进优先配对的互补氨基酸取代的驱动子(driver)组，并且还可以包含二次取代。二级取代可以起到优化驱动子组的性能的作用。
可以使用一个或多个驱动子组来促进优先配对。这些驱动子组可以单独使用或组合使用，以促进优先配对。在一个实施方案中，驱动子组是静电驱动子组，其中静电吸引和排斥被预期是促进优先配对的主要因素。例如，其中H1包含氨基酸取代186K，L1包含氨基酸取代133D，H2包含氨基酸取代188D，且L2包含氨基酸取代131K的设计可以通过静电机制促进优先配对。在整个实施例部分中可以发现静电驱动子的许多其它实例。在一个实施方案中，一个或多个静电驱动子组可以选自表C中所确定的那些：
表C：示例性静电驱动子组
在一个实施方案中，驱动子组是二硫键转向驱动子组，其可以起到不利于错配异二聚体中二硫键的形成的作用。这种类型的驱动子组的实例包括H1中的125R、L1中的122D、H2中的228D和L2中的121K。
在一个实施方案中，驱动子组可以是空间驱动子组，其可以用于促进正确配对的异二聚体之间的空间互补相互作用和错配异二聚体之间的空间不相容性。表D示出了空间驱动子组的非限制性实例，其中“-”表示不存在促进优先配对的氨基酸取代。
表D：示例性空间驱动子组
在一个实施方案中，驱动子组是可变设计驱动子组。这种可变设计驱动子组包含κ和/或λFab的可变结构域中促进优先配对的一个或多个氨基酸修饰。在一个实施方案中，可变设计驱动子组基于空间机制促进优先配对。在一个实施方案中，可变设计驱动子组基于静电机制促进优先配对。表E示出了可变设计驱动子组的非限制性实例，其中“一”表示该多肽中不存在促进优先配对的氨基酸修饰。
表E：示例性可变结构域驱动子组
| 驱动子 | H1 | L1 | H2 | L2 |
| 可变结构域(空间) | 45F | -- | 45A/P | 44F |
| 可变结构域(空间) | -- | -- | 45A/P | 44F |
| 可变结构域(静电) | 39K/R | 38E/D | 39E/D | 38K/R |
| 可变结构域(静电) | 39E/D | 38K/R | 39K/R | 38E/D |
| 可变结构域(静电) | -- | -- | 39E/D | 38R/K |
在一个实施方案中，可以将一个或多个非天然存在的二硫键工程改造至抗原结合多肽构建体的一个或两个异二聚体中。这种类型的氨基酸修饰的一个实例是其中重链包含122C取代并且κ轻链中包含配对的124C取代的氨基酸修饰。
为了优化设计的配对性能，可以在设计中包含二级取代。例如，二级取代可以用于：A)优化重链和正确配对的轻链之间的接触次数；B)提供有利于驱动子的环境；C)优化驱动子组的氢键网络；或D)为驱动子提供空间容纳。表F示出了这些类型的二级取代的非限制性实例，其中“Lk”表示κ轻链特异性取代，“Ll”表示λ轻链特异性取代。“L”表示κ或λ轻链中的轻链特异性取代，并且“H”表示重链特异性取代。
表F：示例性二级取代
抗原结合多肽构建体可以用对应于上述驱动子组和二级取代的氨基酸修饰的不同组合进行工程改造。下面描述了基于共同特征分组为群组的这些组合的非限制性具体实例。如本文所述，使用每个修饰位置之间的“_”来标识在单链中的多个位置处的氨基酸修饰的组合。例如，“124_186”表示位置124和186在所提及的多肽链中均被修饰。同样地，“124_133_180”表示位置124、133和180在所提及的多肽链中全部被修饰。
K-L群组1：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组1的氨基酸取代的组合，其中：
H1包含位置143处的氨基酸取代；L1包含位置131处的氨基酸取代；并且
a)H2包含位置188或124_186处的氨基酸取代，且L2包含位置176_178或176_180或131处的氨基酸取代；或
b)H2包含位置143或186处的氨基酸取代，且L2包含位置124_133或124_133_180处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，H1进一步包含位置125、145和179中的一个或多个处的氨基酸取代，L1进一步包含位置122、124和133中的一个或多个处的氨基酸取代，H2进一步包含位置228处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置121处的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组1的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置125_143_145处的氨基酸取代；L1包含位置122_124_131处的氨基酸取代；H2包含位置228处的氨基酸取代；且L2包含位置121_133处的氨基酸取代。在一些实施方案中，H1进一步包含位置179处的氨基酸取代，L1进一步包含位置133处的氨基酸取代，H2进一步包含位置124、143、186和188中的一个或多个处的氨基酸取代，且L2进一步包含位置124、131、176、178和180中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组1的氨基酸取代的组合，其中H1包含位置125_143_145或125_143_145_179处的氨基酸取代；L1包含位置122_124_131或122_124_131_133处的氨基酸取代；H2包含位置124_186_228、143_228、143_186_228、186_228或188_228处的氨基酸取代；且L2包含位置121_124_133、121_124_133_180、121_131_133_178、121_133_176_178或121_133_176_180处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组1的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代选自125R、145T、143D、143E、179E及其保守取代；L1中的氨基酸取代选自124Q、122D、131K、131R、133S及其保守取代；H2中的氨基酸取代选自228D、124R、143I、143R、186K、186R、188K及其保守取代；L2中的氨基酸取代选自124E、121K、131D、176D、178E、178F、180D、180E、133D、133G、133I及其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组1的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H1 | L1 |
| 125R_143D_145T | 122D_124Q_131K_133S |
| 125R_143E145T_179E | 122D_124Q_131R |
| 125R_143E_145T_179E | 122D_124Q_131K |
在一个实施方案中，H1包含125R_143E_145T_179E，并且L1包含122D_124Q_131R。在另一个实施方案中，H1包含125R_143E_145T且L1包含122D_124Q_131R。在进一步的实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组1的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H2 | L2 |
| 188K_228D | 121K_1331_176D_178E |
| 188K_228D | 121K_131D_133G_178F |
| 124R_186R_228D | 121K_133G_176D_180E |
| 124R_186R_228D | 121K_133G_176D_180E |
| 143R_228D | 121K_124E_133D_180D |
| 143R_228D | 121K_124E_133D |
| 143I_186K_228D | 121K_124E_133D |
| 186K_228D | 121K_124E_133D |
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含一个H1L1异二聚体和一个H2L2异二聚体的组合。在一个实施方案中，H1包含125R_143E_145T_179E，L1包含122D_124Q_131R，H2包含188K_228D，并且L2包含121K_133I_176D_178E。在另一个实施方案中，H1包含125R_143D_145T，L1包含122D_124Q_131R，H2包含143R_228D，并且L2包含121K_124E_133D。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组1的氨基酸取代的组合，该组合包含二硫键转向驱动子组。
在一个实施方案中，K-L群组1的氨基酸组合包含选自表F的一个或多个二级取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-A1中的一个或多个设计中所示的根据K-L群组1的氨基酸取代的组合。
K-L群组2：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组2的氨基酸取代的组合，其中：
H1包含位置143处的氨基酸取代；L1包含位置131处的氨基酸取代；并且
c)H2包含位置186或124_186处的氨基酸取代，且L2包含位置133或133_160或124_133或176_180处的氨基酸取代；或
d)H2包含位置188处的氨基酸取代；且L2包含位置131处的氨基酸取代；
e)H2包含位置143处的氨基酸取代；且L2包含位置124_133或124_133_180处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，H1进一步包含位置139、145、174和179中的一个或多个处的氨基酸取代，L1进一步包含位置116、124、133和176中的一个或多个处的氨基酸取代，H2进一步包含位置190、39和45中的一个或多个处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置135、178、38和44中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组2的氨基酸取代的组合，其中H1包含位置143_145处的氨基酸取代；L1包含位置131处的氨基酸取代；H2包含位置143或186或188处的氨基酸取代；且L2包含位置133处的氨基酸取代。在一些实施方案中，H1进一步包含位置139、174和179中的一个或多个处的氨基酸取代，L1进一步包含位置116、124、133和176中的一个或多个处的氨基酸取代，H2进一步包含位置124、190、39和45中的一个或多个处的氨基酸取代，且L2进一步包含位置124、131、135、160、176、178、180、38和44中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组2的氨基酸取代的组合，其中H1包含位置139_143_145、143_145、143_145_174或143_145_179处的氨基酸取代；L1包含位置116_124_131_176、124_131、124_131_133、124_131_133_176、131或131_133处的氨基酸取代；H2包含位置124_186_190、143、143_186、143_186_190、143_190、186、186_190、188、39_143或45_143处的氨基酸取代；且L2包含位置124_133、124_133_135、124_133_135_180、124_133_180、131_133_135_178、131_133_178、133、133_135_176_180、133_160、38_124_133或44_124_133处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组2的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代选自139W、143D、145T、174G、179E及其保守取代；L1中的氨基酸取代选自124Q、176F、116F、131K、131R、133S及其保守取代；H2中的氨基酸取代选自124R、143I、143K、143R、186K、188K、190F、39E、45P及其保守取代；L2中的氨基酸取代选自124E、131D、131E、133D、133G、135A、135W、160E、176D、178F、180D、180E、38R、44F及其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组2的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H1 | L1 |
| 139W_143D_145T | 124Q_131K_133S |
| 139W_143D_145T | 124Q_131R |
| 143D_145T | 124Q_131K |
| 143D_145T | 124Q_131K_133S |
| 143D_145T | 124Q_131R |
| 143D_145T | 131K |
| 143D_145T | 131K_133S |
| 143D_145T_174G | 116F_124Q_131R_176F |
| 143D_145T_174G | 124Q_131K_133S_176F |
| 143D_145T_174G | 116F_124Q_131K_176F |
| 143D_145T_179E | 124Q_131K |
| 143D_145T_179F | 124Q_131K_133S |
| 143D_145T_179E | 131K |
| 143D_145T_179E | 131K_133S |
在进一步的实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组2的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含一个H1L1异二聚体和一个H2L2异二聚体的组合。在一个实施方案中，H1L1异二聚体和H2L2异二聚体的组合是以下之一：
| H1 | L1 | H2 | L2 |
| 143D_145T | 124Q_131R | 188K | 131D_133G_178F |
| 143D_145T_174G | 116F_124Q_131R_176F | 143R_190F | 124E_133D_135A |
| 139W_143D_145T | 124Q_131R | 143R | 124E_133D_135W |
| 143D_145T | 124Q_131R | 143R | 124E_133D_180D |
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组2的氨基酸取代的组合，该组合具有空间1驱动子组、空间2驱动子组、可变结构域空间驱动子组或可变结构域静电驱动子组中的一个或多个。
在一个实施方案中，K-L群组2的氨基酸组合包含选自表F的一个或多个二级取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-A2中的一个或多个设计中所示的根据K-L群组2的氨基酸取代的组合。
K-L群组3：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组3的氨基酸取代的组合，其中：
H1包含位置143处的氨基酸取代；L1包含位置131处的氨基酸取代；并且
a)H2包含位置124_186或124_179或188处的氨基酸取代，且L2包含位置176_178或176_180或131处的氨基酸取代；或
b)H2包含位置143_188或143或124_143处的氨基酸取代，且L2包含位置124_176_178或124_178或124_180或124_176_180或124或124_176处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，H1进一步包含包含位置139、145、174和179中的一个或多个处的氨基酸取代，L1进一步包含位置116、124和176中的一个或多个处的氨基酸取代，H2进一步包含位置177、190、39和45中的一个或多个处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置133、135、178、38和44中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组3的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置143_145处的氨基酸取代；L1包含位置124_131处的氨基酸取代；H2包含位置143、124和188中的一个或多个处的氨基酸取代；且L2包含位置133或176_178处的氨基酸取代。在一些实施方案中，H1进一步包含位置139、174和179中的一个或多个处的氨基酸取代，L1进一步包含位置116或176处的氨基酸取代，H2进一步包含位置177、179、186、190、39和45中的一个或多个处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置124、131、135、180、38和44中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组3的氨基酸取代的组合，其中H1包含位置139_143_145、139_143_145_179、143_145、143_145_174_179或143_145_179处的氨基酸取代；L1包含位置116_124_131_176或124_131处的氨基酸取代；H2包含位置124_143、124_179、124_186、143、143_188、177_188、188、188_190、39_124_179或45_124_179处的氨基酸取代；且L2包含位置124_133、124_133_176、124_133_176_178、124_133_176_180、124_133_178、124_133_180、131_133_178、133_135_176_178、133_135_176_180、133_176_178、133_176_180、176_178、38_133_176_180或44_133_176_180处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组3的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代选自139W、174G、145T、143D、143E、179E及其保守取代；L1中的氨基酸取代选自116F、124Q、131K、131R、176F及其保守取代；H2中的氨基酸取代选自124R、143K、143R、177I、179K、186K、186R、188K、190F、39E、45P及其保守取代；L2中的氨基酸取代选自135A、135W、44F、124E、38R、131D、131E、176D、176E、178D、178E、178F、180D、180E、133D、133G、133I、133L及其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组3的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H1 | L1 |
| 139W_143D_145T | 124Q_131R |
| 139W_143E_145T_179E | 124Q_131K |
| 143D_145T | 124Q_131R |
| 143E_145T_179E | 124Q_131R |
| 143E_145T_174G_179E | 116F_124Q_131R_176F |
在进一步的实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组3的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H2 | L2 |
| 124R_179K | 133G_176D_178E |
| 124R_186K/R | 133G_176D_180E |
| 124R_186K/R | 133G_135W_176D_180E |
| 188K | 131D_133G_178F |
| 188K | 131E_133G_178F |
| 188K | 176E_178E |
| 188K | 133I_135W_176D_178F |
| 188K | 133I_176D_178E |
| 143R_188K | 124E_133D_176D_178D |
| 143R_188K | 124E_133D_176D_178E |
| 143R_188K | 124E_133D_178E |
| 143K/R | 124E_133D |
| 143K/R | 124E_133D_180D |
| 124R_143K | 124E_133G_176D_180E |
| 124R_143K | 124E_133G_176D |
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含一个H1L1异二聚体和一个H2L2异二聚体的组合。在一个实施方案中，H1L1异二聚体和H2L2异二聚体的组合是以下之一：
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组3的氨基酸取代的组合，该组合具有空间1驱动子组、空间2驱动子组、可变结构域空间驱动子组或可变结构域静电驱动子组中的一个或多个。
在一个实施方案中，K-L群组3的氨基酸组合包含选自表F的一个或多个二级取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-A3中的一个或多个设计中所示的根据K-L群组3的氨基酸取代的组合。
K-L群组4：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组4的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置188处的氨基酸取代；L1包含位置176_178或178处的氨基酸取代；并且
a)H2包含位置177_188处的氨基酸取代，且L2包含位置176_178处的氨基酸取代；或
b)H2包含位置186或124或124_179处的氨基酸取代，且L2包含位置176或131_176处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，H1进一步包含位置125、139和177中的一个或多个处的氨基酸取代，L1进一步包含位置122、129和133中的一个或多个处的氨基酸取代，H2进一步包含位置145、228、45和39中的一个或多个处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置135、44、38、121和133中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组4的氨基酸取代的组合，其中：H1不包含促进优先配对的氨基酸取代或包含位置188处的氨基酸取代；L1不包含促进优先配对的氨基酸取代或包含位置176_178处的氨基酸取代；H2包含位置188或186_188处的氨基酸取代；且L2包含位置176_178处的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组4的氨基酸取代的组合，其中：H1不包含促进优先配对的氨基酸取代或包含位置188处的氨基酸取代；L1不包含促进优先配对的氨基酸取代或包含位置178处的氨基酸取代；H2包含位置124、186、188中的一个或多个处的氨基酸取代；且L2包含位置176处的氨基酸取代。在一些实施方案中，H1进一步包含位置125、139和177中的一个或多个处的氨基酸取代，L1进一步包含位置122、129、133和176中的一个或多个处的氨基酸取代，H2进一步包含位置145、228、45、177、179和39中的一个或多个处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置135、44、38、121、131、178和133中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组4的氨基酸取代的组合，其中H1不包含促进优先配对的氨基酸取代或包含位置125_188、139_188、188或177_188处的氨基酸取代；L1不包含促进优先配对的氨基酸取代或包含位置129_176_178、129_178、122_129_176_178、176_178或133_176_178处的氨基酸取代；H2包含位置145_186、145_186_228、145_177_188、124、124_145_179、124_145_179_186_188、124_145_179_188、124_186_188、124_188、45_124_145_179、39_124_145_179或186_188处的氨基酸取代；且L2包含位置44_131_133_176、38_131_133_176、121_131_176、131_135_176、131_176、131_133_176、131_133_176_178、176、176_178、133_176或133_176_178处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组4的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代选自125R、139W、188A、188K和177I及其保守取代；L1中的氨基酸取代选自129T、122D、176A、176D、176E、133I、133L、178D、178E、178T和178W及其保守取代；H2中的氨基酸取代选自124E、145T、177D、179E、186E、186I、186L、188D、188W、228D、39E和45P及其保守取代；L2中的氨基酸取代选自121K、131K、131R、133A、133G、135W、176A、176K、176R、176V、178A、178K、178L、178R、38R和44F及其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组4的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H1 | L1 |
| 125R_188K | 122D_129T_176D_178T |
| 125R_188K | 122D_129T_176F_178F |
| 125R_188K | 129T_176D_178T |
| 125R_188K | 129T_176E_178E |
| 188K | 129T_176D_178T |
| 188K | 129T_176E_178E |
| 188K | 129T_178D |
| 188K | 129T_178E |
| 188K | 176D_178F |
| 188K | 176E_178E |
| 188K | 1331_176D_Y178E |
| - | - |
| 188A | 176A_178W |
| 177I_188K | 1331_176D_178E |
| 177I_188K | 133I_176E_178E |
| 177I_188K | 133L_176D_178E |
在进一步的实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组4的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H2 | L2 |
| 145T_186F | 131K_135W_176K |
| 145T_186E_228D | 131K_176K |
| 145T_186E_228D | 121K_131K_176K |
| 124E | 133G_176R |
| 124E | 133A_176K |
| 124F_186I_188W | 133G_176R_178A |
| 124E_188W | 133A_176K_178A |
| 124E_145T_179E | 131K_133G_176R |
| 124E_145T_179E | 131R_133G_176R |
| 124E_145T_179E_186I_188W | 131R_133G_176R_178A |
| 124E_145T_179E_188W | 131K_133G_176R_178A |
| 45P_L124E_145T_179E | 44F_131R_133G_176R |
| 39E_L124F_145T_179F | 38R_131R_133G_176R |
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含一个H1L1异二聚体和一个H2L2异二聚体的组合。在一个实施方案中，H1L1异二聚体和H2L2异二聚体的组合是以下之一：
| H1 | L1 | H2 | L2 |
| 188K | 176E_178E | 124E_145T_179E | 131R_133G_176R |
| 125R_188K | 122D_129T_176E_178E | 145T_186E_228D | 121K_131K_176K |
| 188K | 129T_178D | 145T_186E | 131K_176K |
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组4的氨基酸取代的组合，该组合具有静电驱动子组、二硫键转向驱动子组、空间3驱动子组、可变结构域空间驱动子组和可变结构域静电驱动子组中的一个或多个。
在一个实施方案中，K-L群组4的氨基酸组合包含选自表F的一个或多个二级取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-A4中的一个或多个设计中所示的根据K-L群组4的氨基酸取代的组合。
K-L群组5：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组5的氨基酸取代的组合，其中：
H1包含位置186处的氨基酸取代；L1包含位置133处的氨基酸取代；并且
a)H2包含位置188处的氨基酸取代，且L2包含位置131处的氨基酸取代；或
b)H2包含位置177_188处的氨基酸取代，且L2包含位置176_178处的氨基酸取代；或
其中H1包含位置124_190处的氨基酸取代；L1包含位置135处的氨基酸取代；H2包含位置124或188处的氨基酸取代，且L2包含位置176或176_178处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，H1进一步包含位置143和/或188处的氨基酸取代，L1进一步包含位置131和/或178处的氨基酸取代，H2进一步包含位置143和/或145处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置133和/或178处的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组5的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置186或124处的氨基酸取代；L1包含位置133和/或135处的氨基酸取代；H2包含位置188、177和124中的一个或多个处的氨基酸取代；且L2包含位置176和/或131处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，H1进一步包含位置143、188和190中的一个或多个处的氨基酸取代，L1进一步包含位置131和/或178处的氨基酸取代，H2进一步包含位置143和/或145处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置133和/或178处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组5的氨基酸取代的组合，其中H1包含位置124_190、143_186_188或186_188处的氨基酸取代；L1包含位置131_133_178、133_135、133_135_178、133_178或135_178处的氨基酸取代；H2包含位置124、143_188、145_177_188或177_188处的氨基酸取代；且L2包含位置131_176_178、131_178、133_176、133_176_178或176_178处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组5的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代选自124E、143S、186K、188T、190D、190E及其保守取代；L1中的氨基酸取代选自131S、133D、133I、135K、135R、178F、178T及其保守取代；H2中的氨基酸取代选自124R、143T、145T、177D、177I、188D、188K及其保守取代；L2中的氨基酸取代选自131K、133G、133L、176A、176D、176K、178E、178K、178R、178S及其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组5的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H1 | L1 |
| 186K_188T | 133D_178T |
| 186K_188T | 131S_133D_178T |
| 143S_186K_188T | 133D_178T |
| 124E_190E/D | 133I_135R_178F |
| 124E_190E/D | 133I_135K_178F |
| 124E_190E/D | 133I_135K |
| 124E_190E/D | 135K_178F |
在进一步的实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组5的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H2 | L2 |
| 145T_177D_188D | 176K_178K |
| 145T_177D_188D | 176K_178R |
| 124R | 133G_176D |
| 143T_188D | 131K_178S |
| 143T_188D | 131K_176A_178S |
| 177I_188K | 133L_176D_178E |
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含一个H1L1异二聚体和一个H2L2异二聚体的组合。在一个实施方案中，H1L1异二聚体和H2L2异二聚体的组合是这样一种组合，其中H1包含186K_188T，L1包含133D_178T，H2包含145T_177D_188D，且L2包含176K_178K。
在一个实施方案中，K-L群组5的氨基酸组合包含选自表F的一个或多个二级取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-A5中的一个或多个设计中所示的根据K-L群组5的氨基酸取代的组合。
K-L群组6：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组6的氨基酸取代的组合，其中：
H1包含位置177_188处的氨基酸取代；L1包含位置176_178处的氨基酸取代；并且
a)H2包含位置188处的氨基酸取代，且L2包含位置176_178或131处的氨基酸取代；
b)H2包含位置186处的氨基酸取代，且L2包含位置133或124_160_180处的氨基酸取代；
c)H2包含位置124或124_179或124_186处的氨基酸取代，且L2包含位置176或176_178或176_180处的氨基酸取代；或
d)H2包含位置143处的氨基酸取代，且L2包含位置133或124_133处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，H1进一步包含位置145和/或146处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置143和/或177中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组6的氨基酸取代的组合，其中：
H1包含位置177_188处的氨基酸取代；L1包含位置176_178处的氨基酸取代；且H2包含位置124、143、179、186和188中的一个或多个处的氨基酸取代；且L2包含位置133、176和178中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，H1进一步包含位置145和/或146处的氨基酸取代，H2进一步包含位置177处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置124、131、160和180中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组6的氨基酸取代的组合，其中H1包含位置145_177_188或146_177_188处的氨基酸取代；L1包含位置176_178处的氨基酸取代；H2包含位置124、124_179、124_186、143、143_186_188、177_188、179、186、186_188或188处的氨基酸取代；且L2包含位置124_133、124_160_176_178_180、124_160_180、131_133_178、133、133_176、133_176_178、133_176_180或176_178处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组6的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代选自145T、146T、177D、188D及其保守取代；L1中的氨基酸取代选自176K、178K、178L、178R及其保守取代；H2中的氨基酸取代选自124R、143K、143R、143S、177I、179K、186K、186R、188K、188T、188W及其保守取代；L2中的氨基酸取代选自124E、131D、131E、133D、133G、133I、133L、160E、176A、176D、176E、178A、178D、178E、178F、180E及其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组6的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H1 | L1 |
| 146T_177D_188D | 176K_178K |
| 145T_177D_188D | 176K_178L |
| 145T_177D_188D | 176K_178R |
在进一步的实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组6的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H2 | L2 |
| 124R | 133G_176D |
| 124R | 133G_176D_178D |
| 124R_179K | 133G_176D_180E |
| 124R_186R | 133G_176D_180E |
| 143K | 124E_133D |
| 143K | 133D |
| 179K or 186R | 124E_160E_180E |
| 186R_188W | 124E_160E_176A_178A_180E |
| 143S_186K_188T | 133D |
| 186K_188T | 133D |
| 188K | 131D_133G_178F |
| 188K | 131E_133G_178F |
| 188K | 176D_178E |
| 188K | 176E_178E |
| 177I_188K | 133I_176E_178E |
| 177I_188K | 133L_176D_178E |
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含一个H1L1异二聚体和一个H2L2异二聚体的组合。在一个实施方案中，H1L1异二聚体和H2L2异二聚体的组合是以下之一：
| H1 | L1 | H2 | L2 |
| 145T_177D_188D | 176K_178K | 124R | 133G_176D |
| 145T_177D_188D | 176K_178K | 143K | 124E_133D |
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组6的氨基酸取代的组合，该组合具有空间驱动子组。
在一个实施方案中，K-L群组6的氨基酸组合包含选自表F的一个或多个二级取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-A6中的一个或多个设计中所示的根据K-L群组6的氨基酸取代的组合。
K-L群组7：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组7的氨基酸取代的组合，其中：
H1包含位置188处的氨基酸取代；L1包含位置178处的氨基酸取代；H2包含位置124或188处的氨基酸取代；且L2包含位置176_178或176_180或176处的氨基酸取代。在一些实施方案中，H1进一步包含位置125、139、145和177中的一个或多个处的氨基酸取代，L1进一步包含位置122处的氨基酸取代，H2进一步包含位置143、177、179、186、228、39和45中的一个或多个处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置121、124、133、135、160、38和44中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组7的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置145_188处的氨基酸取代；L1包含位置178处的氨基酸取代；且H2包含位置124和/或188处的氨基酸取代；且L2包含位置124、133和178中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，H1进一步包含位置125、139和177中的一个或多个处的氨基酸取代，L1进一步包含位置122处的氨基酸取代，H2进一步包含位置143、177、179、186、228、39和45中的一个或多个处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置121、135、160、176、180、38和44中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组7的氨基酸取代的组合，其中H1包含位置125_145_188、139_145_188、145_177_188或145_188处的氨基酸取代；L1包含位置122_178或178处的氨基酸取代；H2包含位置124、124_143、124_179、124_186、124_186__228、124_188、124_228、143_188、177_188、179_188、186_188、188、188_228、39_124_179或45_124_179处的氨基酸取代；且L2包含位置121_133_176、121_133_176_180、121_176_178、124_133_176、124_133_176_178、124_133_176_178_180、124_133_176_180、124_133_178、124_160_176_178、124_160_176_178_180、124_176_178_180、124_176_180、133_135_176、133_135_176_180、133_176、133_176_178、133_176_180、135_176_178、176_178、38_133_176_180或44_133_176_180处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组7的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代选自125R、139W、145T、177T、188E及其保守取代；L1中的氨基酸取代选自122D、178K及其保守取代；H2中的氨基酸取代选自124K、124R、143K、143R、177I、179K、186R、188K、228D、39E、45P及其保守取代；L2中的氨基酸取代选自121K、124E、133D、133G、133L、135W、160E、176D、176E、178D、178E、180E、38R、44F及其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组7的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H1 | L1 |
| 125R_145T_188E | 122D_178K |
| 139W_145T_188E | 178K |
| 145T_188E | 178K |
| 145T_177T_188E | 178K |
在进一步的实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组7的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含一个H1L1异二聚体和一个H2L2异二聚体的组合。在一个实施方案中，H1L1异二聚体和H2L2异二聚体的组合是以下之一：
| H1 | L1 | H2 | L2 |
| 145T_188E | 178K | 143R_188K | 124E_133D_178E |
| 125R_145T_188E | 122D_178K | 188K_228D | 121K_176E_178E |
| 145T_188E | 178K | 124R | 133G_176D |
在一些实施方案中，K-L群组7的抗原结合多肽构建体包含氨基酸取代的组合，其具有选自二硫键转向驱动子组、空间2驱动子组和可变结构域驱动子组的一个或多个驱动子组。
在一个实施方案中，K-L群组7的氨基酸组合包含选自表F的一个或多个二级取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-A7中列出的一个或多个设计中所示的根据K-L群组7的氨基酸取代的组合。
K-L群组8：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组8的氨基酸取代的组合，其中：
H2包含位置143处的氨基酸取代；L2包含位置124处的氨基酸取代；并且
a)H1包含位置186或179处的氨基酸取代，且L1包含位置180处的氨基酸取代；
b)H1包含位置186处的氨基酸取代，且L1包含位置133处的氨基酸取代；
c)H1包含位置143处的氨基酸取代，且L1包含位置133处的氨基酸取代；或
d)H1包含位置188处的氨基酸取代，且L1包含位置178处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，H1进一步包含位置124、139、177和190中的一个或多个处的氨基酸取代，L1进一步包含位置129、131、135和176中的一个或多个处的氨基酸取代，H2进一步包含位置122、124、145、179、186、188、39和45中的一个或多个处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置129、133、135、160、176、178、38和44中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组8的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置143、186、179和/或188处的氨基酸取代；L1包含位置129和/或178处的氨基酸取代；H2包含位置143处的氨基酸取代；且L2包含位置124处的氨基酸取代。在一些实施方案中，H1进一步包含位置124、139、177和190中的一个或多个处的氨基酸取代，L1进一步包含位置131、133、135、176和180中的一个或多个处的氨基酸取代，H2进一步包含位置122、124、145、179、186、188、39和45中的一个或多个处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置129、133、135、160、176、178、38和44中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组8的氨基酸取代的组合，其中H1包含位置124_143、139_143、139_143_186、139_186、139_188、143、143_179、143_186、143_186_188、143_190、177_188、179、179_190、186或186_188、188处的氨基酸取代；L1包含位置129_131_133、129_133、129_133_135、129_133_135_180、129_133_178、129_133_180、129_176_178、129_176_178_180、129_178、129_178_180、129_180、133_176_178、133_178或176_178处的氨基酸取代；H2包含位置122_143_145、122_143_145_179、124_143_145、124_143_145_179、143_145、143_145_179、143_145_179_186_188、143_145_179_188、143_145_188、39_143_145_179或45_143_145_179处的氨基酸取代；且L2包含位置124_129_160_178、124_129_178、124_133_178、124_135_160_178、124_135_178、124_160_176_178、124_160_178、124_176_178、124_178、38_124_178或44_124_178处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组8的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代选自124K、139W、143A、143I、143K、143S、177I、179K、186K、186R、188K、188T、190K及其保守取代；L1中的氨基酸取代选自129T、131D、131E、133D、133L、133W、135S、176A、176D、176E、178D、178E、178T、178W、180E及其保守取代；H2中的氨基酸取代选自122C、124W、143E、145T、179E、186I、188L、188W、39E、45P及其保守取代；L2中的氨基酸取代选自124C、124K、124R、129K、133A、135W、160K、160R、176A、178R、38R、44F及其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组8的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
在进一步的实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组8的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H2 | L2 |
| 122C_143E_145T | 124C_160K_178R |
| 122C_143E_145T_179E | 124C_160K_178R |
| 124W_143E_145T | 124K_133A_178R |
| 124W_143E_145T_179E | 124K_133A_178R |
| 143E_145T | 124K_178R |
| 143E_145T | 124R_160K_178R |
| 143E_145T | 124R_129K_160K_178R |
| 143E_145T_179E | 124R_135W_160K_178R |
| 143E_145T_179E | 124R_135W_178R |
| 143E_145T_179E | 124R_160K_178R |
| 143E_145T_179E | 124R_160R_178R |
| 143E_145T_179E | 124R_129K_162K_178R |
| 143E_145T_179E | 124R_129K_178R |
| 143E_145T_179E | 124R_178R |
| 45P_143E_145T_179E | 44F_124K_178R |
| 45P_143E_145T_179E | 44F_124R_178R |
| 39E_143E_145T_179E | 38R_124K_178R |
| 39E_143E_145T_179E | 38R_124R_178R |
| 143E_145T_179E_186I_188W | 124R_176A_178R |
| 143E_145T_179E_186I_188W | 124R_160R_176A_178R |
| 143E_145T_179E_188L | 124K_178R |
| 143E_145T_179E_188L | 124R_160K_178R |
| 143E_145T_179E_188L | 124R_178R |
| 143E_145T_179E_188W | 124R_176A_178R |
| 143E_145T_188W | 124R_160R_176A_178R |
| 143E_145T_188L | 124R_178R |
| 143E_145T_188L | 124R_160K_178R |
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含一个H1L1异二聚体和一个H2L2异二聚体的组合。在一个实施方案中，H1L1异二聚体和H2L2异二聚体的组合是以下之一：
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组8的氨基酸取代的组合，该组合具有空间2驱动子组、空间3驱动子组、空间4驱动子组和可变结构域驱动子组中的一个或多个。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组8的氨基酸取代的组合，该组合引入非天然存在的二硫键。
在一个实施方案中，K-L群组8的氨基酸组合包含选自表F的一个或多个二级取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-A8中的一个或多个设计中所示的根据K-L群组8的氨基酸取代的组合。
K-L群组9：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组9的氨基酸取代的组合，其中：
H1包含位置179、186、143和/或188处的氨基酸取代；L1包含位置180、133和/或176_178处的氨基酸取代；H2包含位置143处的氨基酸取代；且L2包含位置131和/或124处的氨基酸取代。在一些实施方案中，H1进一步包含位置125处的氨基酸取代，L1进一步包含位置122或129处的氨基酸取代，H2进一步包含位置145、179和228中的一个或多个处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置121、129、135、160和178中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组9的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置125处的氨基酸取代；L1包含位置122_129处的氨基酸取代；H2包含位置145处的氨基酸取代；且L2包含位置121和/或124处的氨基酸取代。在一些实施方案中，H1进一步包含位置143、179、186和188中的一个或多个处的氨基酸取代，L1进一步包含位置133、176、178和180中的一个或多个处的氨基酸取代，H2进一步包含位置143、179和228中的一个或多个处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置129、131、135、160和178中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组9的氨基酸取代的组合，其中H1包含位置125_143、125_179、125_186或125_188处的氨基酸取代；L1包含位置122_129_133、122_129_176_178或122_129_180处的氨基酸取代；H2包含位置143_145、143_145_179、143_145_179_228、143_145_228或145_179_228处的氨基酸取代；且L2包含位置121_124_160_178、121_124_178、121_129_131、121_131、124_135_160_178或124_135_178处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组9的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代选自125R、143K、179K、186R、188K及其保守取代；L1中的氨基酸取代选自122D、129T、133D、176D、176E、178E、178T、180E及其保守取代；H2中的氨基酸取代选自143E、145T、179E、228D及其保守取代；L2中的氨基酸取代选自135W、124R、160K、121K、131K、129K、178R及其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组9的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H1 | L1 |
| 125R_143K | 122D_129T_133D |
| 125R_179K | 122D_129T_180E |
| 125R_186R | 122D_129T_180E |
| 125R_188K | 122D_129T_176D_178T |
| 125R_188K | 122D_129T_176E_178E |
在进一步的实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组9的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H2 | L2 |
| 143E_145T | 124R_135W_160K_178R |
| 143E_145T | 124R_135W_178R |
| 143E_145T_228D | 121K_124R_160K_178R |
| 143E_145T_228D | 121K_124R_178R |
| 145T_179E_228D | 121K_129K_131K |
| 145T_179E_228D | 121K_131K |
| 143E_145T_179E | 124R_135W_160K_178R |
| 143E_145T_179E | 124R_135W_160K_178R |
| 143E_145T_179E_228D | 121K_124R_178R |
| 143E_145T_179E_228D | 121K_124R_160K_178R |
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含一个H1L1异二聚体和一个H2L2异二聚体的组合。在一个实施方案中，H1L1异二聚体和H2L2异二聚体的组合是以下之一：
| H1 | L1 | H2 | L2 |
| 125R_179K | 122D_129T_180E | 143E_145T_228D | 121K_124R_178R |
| 125R_188K | 122D_129T_176E_178E | 143E_145T_179E_228D | 121K_124R_178R |
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组9的氨基酸取代的组合，该组合具有二硫键转向驱动子组。
在一个实施方案中，K-L群组9的氨基酸组合包含选自表F的一个或多个二级取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-A9中的一个或多个设计中所示的根据K-L群组9的氨基酸取代的组合。
K-L群组10：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组10的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置174、179或186处的氨基酸取代；L1包含位置176或180处的氨基酸取代；H2包含位置143或190处的氨基酸取代，且L2包含位置131、135或124处的氨基酸取代；或H1包含位置174处的氨基酸取代；L1包含位置176处的氨基酸取代；H2包含位置190处的氨基酸取代；且L2不包含促进优先配对的氨基酸取代或包含位置135处的氨基酸取代。在一些实施方案中，H1进一步包含位置143处的氨基酸取代，L1进一步包含位置116、129和133中的一个或多个处的氨基酸取代，H2进一步包含位置145、179和188中的一个或多个处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置133、160和178中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组10的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置174和/或186处的氨基酸取代；L1包含位置176和/或180处的氨基酸取代；H2包含位置145、190和/或188处的氨基酸取代；且L2包含位置135、131、178或133处的氨基酸取代或不包含促进优先配对的氨基酸取代。在一些实施方案中，H1进一步包含位置143和/或179中的一个或多个处的氨基酸取代，L1进一步包含位置116、129和133中的一个或多个处的氨基酸取代，H2进一步包含位置143和/或179处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置124和/或160处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组10的氨基酸取代的组合，其中H1包含位置143_174、174、174_179、174_186或186处的氨基酸取代；L1包含位置116_129_133_176、116_129_176_180、116_176、129_180或176处的氨基酸取代；H2包含位置143_145_179_188_190、143_145_179_190、143_145_190、143_190、145_179、145_179_188_190、188或190处的氨基酸取代；且L2包含位置124_135_160_178、124_135_178、131、131_135、133、135、135_178、178处的氨基酸取代或不包含促进优先配对的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组10的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代选自143K、174G、179K、186R及其保守取代；L1中的氨基酸取代选自116F、129T、133D、176F、180E及其保守取代；H2中的氨基酸取代选自143E、143I、145T、179E、188F、190F及其保守取代；L2中的氨基酸取代选自124K、124R、131K、133A、135A、160K、178F、178R及其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组10的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H1 | L1 |
| 143K_174G | 116F_129T_133D_176F |
| 186R | 129T_180F |
| 174G_179K | 116F_129T_176F_180E |
| 174G_186R | 116F_129T_176F_180E |
| 174G | 176F |
| 174G | 116F_176F |
在进一步的实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组10的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H2 | L2 |
| 145T_179E | 131K |
| 145T_179E_188F_190F | 131K_135A |
| 143I_190F | 135A |
| 143I_190F | - |
| 143I_190F | 178F |
| 188F | 133A |
| 190F | - |
| 190F | 135A |
| 190F | 135A_178F |
| 190F | 178F |
| 143E_145T_179E_188F_190F | 124K_135A_178R |
| 143E_145T_179E_190F | 124R_135A_178R |
| 143E_145T_179E_190F | 124K_135A_178R |
| 143E_145T_179E_190F | 124R_135A_160K_178R |
| 143E_145T_190F | 124R_135A_160K_178R |
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含一个H1L1异二聚体和一个H2L2异二聚体的组合。在一个实施方案中，H1L1异二聚体和H2L2异二聚体的组合是以下之一：
| H1 | L1 | H2 | L2 |
| 143K_174G | 116F_129T_133D_176F | 143E_145T_179E_190F | 124R_135A_178R |
| 174G_179K | 116F_129T_176F_180E | 143E_145T_179E_190F | 124K_135A_178R |
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组10的氨基酸取代的组合，该组合具有空间1驱动子组。
在一个实施方案中，K-L群组10的氨基酸组合包含选自表F的一个或多个二级取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-A10中的一个或多个设计中所示的根据K-L群组10的氨基酸取代的组合。
K-L群组11：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组11的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置143_190处的氨基酸取代；L1包含位置133处的氨基酸取代；H2包含位置124处的氨基酸取代；且L2包含位置131_135处的氨基酸取代。在一些实施方案中，H1进一步包含位置125处的氨基酸取代，L1进一步包含位置122、129和135中的一个或多个处的氨基酸取代，H2进一步包含位置139、145、190和228中的一个或多个处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置121处的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组11的氨基酸取代的组合，其中：
H1包含位置143_190处的氨基酸取代；L1包含位置129_133_135处的氨基酸取代；H2包含位置124_145处的氨基酸取代；且L2包含位置131_135处的氨基酸取代。在一些实施方案中，H1进一步包含位置125处的氨基酸取代，L1进一步包含位置122处的氨基酸取代，H2进一步包含位置139、190和228中的一个或多个处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置121处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组11的氨基酸取代的组合，其中H1包含位置125_143_190或143_190处的氨基酸取代；L1包含位置122_129_133_135或129_133_135处的氨基酸取代；H2包含位置124_139_145_190、124_139_145_190_228或124_145处的氨基酸取代；且L2包含位置121_131_135或131_135处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组11的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代选自125R、143K、190K及其保守取代；L1中的氨基酸取代选自122D、129T、133D、135S及其保守取代；H2中的氨基酸取代选自124E、139I、145T、190I、228D及其保守取代；L2中的氨基酸取代选自121K、131K、135K及其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组11的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H1 | L1 |
| 143K_190K | 129T_133D_135S |
| 125R_143K_190K | 122D_129T_133D_135S |
在进一步的实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组11的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H2 | L2 |
| 124E_139I_145T_190I | 131K_135K |
| 124E_139I_145T_190I | 131K_135K |
| 124E_139I_145T_190I_228D | 121K_131K_135K |
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含一个H1L1异二聚体和一个H2L2异二聚体的组合。在一个实施方案中，H1L1异二聚体和H2L2异二聚体的组合是这样一种组合，其中H1包含143K_190K，L1包含129T_133D_135S，H2包含124E_145T，且L2包含131K_135K。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组11的氨基酸取代的组合，该组合具有二硫键转向驱动子组。
在一个实施方案中，K-L群组11的氨基酸组合包含选自表F的一个或多个二级取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-A11中的一个或多个设计中所示的根据K-L群组11的氨基酸取代的组合。
K-L群组12：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组12的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置143和/或186处的氨基酸取代；L1包含位置133处的氨基酸取代；H2包含位置124处的氨基酸取代；且L2包含位置131处的氨基酸取代。在一些实施方案中，H1进一步包含位置124、125、139和188中的一个或多个处的氨基酸取代，L1进一步包含位置122、129、131和178中的一个或多个处的氨基酸取代，H2进一步包含位置143、145、179、186、188、228、39和45中的一个或多个处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置121、133、135、176、178、38和44中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组12的氨基酸取代的组合，其中H1包含位置124_143、125_143、125_143_186、125_186、125_186_188、139_143、139_143_186、139_186、139_186_188、143或186_188处的氨基酸取代；L1包含位置122_129_133、122_129_133_178、122_133_178、129_131_133、129_133、129_133_178或133_178处的氨基酸取代；H2包含位置124_143_145、124_145_179、124_145_179_186_188、124_145_179_188、124_145_179_228、124_145_186、39_124_145_179或45_124_145_179处的氨基酸取代；且L2包含位置121_131_133_176、131_133_135、131_133_135_176、131_133_135_178、131_133_176、131_133_176_178、38_131_133_176或44_131_133_176处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组12的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代选自124K、125R、139W、1431、143K、186K、188T及其保守取代；L1中的氨基酸取代选自122D、129T、131D、131E、133D、178T及其保守取代；H2中的氨基酸取代选自124E、143E、145T、179E、186E、1861、188W、228D、39E、45P及其保守取代；L2中的氨基酸取代选自121K、131K、131R、133G、133S、133T、135K、135W、176R、178A、178S、38R、44F及其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组12的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H1 | L1 |
| 143K | 129T_133D |
| 143K | 129T_131D_133D |
| 143K | 129T_131E_133D |
| 124K_143K | 129T_131D_133D |
| 124K_143K | 129T_131E_133D |
| 139W_143K | 129T_133D |
| 125R_143K | 122D_129T_133D |
| 125R_143I_186K | 122D_129T_133D_178T |
| 125R_186K | 122D_129T_133D_178T |
| 125R_186K_188T | 122D_133D_178T |
| 139W_143I_186K | 129T_133D_178T |
| 139W_186K | 129T_133D_178T |
| 139W_186K_188T | 133D_178T |
| 186K_188T | 133D_178T |
在进一步的实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-L群组12的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H2 | L2 |
| 124E_145T_179E | 121K_131R_133G_176R |
| 124E_145T_179E | 131K_133G_176R |
| 124E_145T_179E | 131K_133G_176R_178A |
| 124E_145T_179E | 131R_133G_135W_176R |
| 124E_145T_179E | 131R_133G_176R |
| 124E_145T_179E | 131R_133G_176R_178A |
| 124E_145T_186E | 131R_133S_135K |
| 124E_143E_145T | 131R_133T_135K_178S |
| 45P_124E_145T_179E | 44F_131R_133G_176R |
| 39E_124E_145T_179E | 38R_131R_133G_176R |
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含一个H1L1异二聚体和一个H2L2异二聚体的组合。在一个实施方案中，H1L1异二聚体和H2L2异二聚体的组合是以下之一：
| H1 | L1 | H2 | L2 |
| 143K | 129T_133D | 124E_145T_179E | 131R_133G_176R |
| 186K_188T | 133D_178T | 124E_145T_179E | 131R_133G_176R |
| 139W_143K | 129T_133D | 124E_145T_179E | 131R_133G_135W_176R |
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-L群组12的氨基酸取代的组合，该组合具有二硫键转向驱动子组、空间2驱动子组、空间3驱动子组、可变结构域静电驱动子组和可变结构域空间驱动子组中的一个或多个。
在一个实施方案中，K-L群组12的氨基酸组合包含选自表F的一个或多个二级取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-A12中的一个或多个设计中所示的根据K-L群组12的氨基酸取代的组合。
K-K群组1：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组1的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置143_179处的氨基酸取代；L1包含位置124_178处的氨基酸取代；H2包含位置186处的氨基酸取代；且L2包含位置178_180或160_180处的氨基酸取代。在一些实施方案中，H1进一步包含包含位置145处的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组1的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置143_145_179处的氨基酸取代；L1包含位置124_178处的氨基酸取代；H2包含位置186处的氨基酸取代；且L2包含位置180处的氨基酸取代。在一些实施方案中，L2进一步包含位置160和/或178处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组1的氨基酸取代的组合，其中H1包含位置143_145_179处的氨基酸取代；L1包含位置124_178处的氨基酸取代；H2包含位置186处的氨基酸取代；且L2包含位置178_180或160_180处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组1的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代选自143E、145T、179E及其保守取代；L1中的氨基酸取代选自124K、178R及其保守取代；H2中的氨基酸取代是186R或其保守取代；L2中的氨基酸取代选自160E、178E、180E及其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-K群组1的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组：H1包含143E_145T_179E且L1包含124K_178R。在另一个实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-K群组1的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组：H2包含124K_178R且L2包含178E_180E或160E_180E。在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含这些H1L1和H2L2异二聚体的组合。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-B1中所示的根据K-K群组1的氨基酸取代的组合。
K-K群组2：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组2的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置143处的氨基酸取代；L1包含位置124处的氨基酸取代；H2包含位置179或186处的氨基酸取代；且L2包含位置124_160_180处的氨基酸取代。在一些实施方案中，H1进一步包含位置145处的氨基酸取代，且/或H2进一步包含位置146处的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组2的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置143_145处的氨基酸取代；L1包含位置124处的氨基酸取代；H2包含位置179或186处的氨基酸取代；且L2包含位置124_160_180处的氨基酸取代。在一些实施方案中，H2进一步包含位置146处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组2的氨基酸取代的组合，其中H1包含位置143_145处的氨基酸取代；L1包含位置124处的氨基酸取代；H2包含位置186、179或146_179处的氨基酸取代；且L2包含位置124_160_180处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组2的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代选自143E、145T及其保守取代；L1中的氨基酸取代是124R或其保守取代；H2中的氨基酸取代选自186R、179K、146G及其保守取代；L2中的氨基酸取代选自124E、160E、180E及其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-K群组2的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组：H1包含143E_145T且L1包含124R。在另一个实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-K群组2的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组：H2包含186R、179K或146G_179K且L2包含124E_160E_180E。在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含一个H1L1异二聚体和一个H2L2异二聚体的组合。在一个实施方案中，H1L1异二聚体和H2L2异二聚体的组合是这样一种组合，其中H1包含143E_145T，L1包含124R，H2包含179K，且L2包含124E_160E_180E。
在一个实施方案中，K-K群组2的氨基酸组合包含选自表F的一个或多个二级取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-B2中的一个或多个设计中所示的根据K-K群组2的氨基酸取代的组合。
K-K群组3：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组3的氨基酸取代的组合，其中：
H1包含位置186处的氨基酸取代；L1包含位置180或178_180处的氨基酸取代；H2包含位置143和/或179处的氨基酸取代；且L2包含位置124_178或131处的氨基酸取代。在一些实施方案中，H2进一步包含位置145处的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组3的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置186处的氨基酸取代；L1包含位置180处的氨基酸取代；H2包含位置145处的氨基酸取代；且L2包含位置124或131处的氨基酸取代。在一些实施方案中，L1进一步包含位置178处的氨基酸取代，H2进一步包含位置143和/或179处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置178处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组3的氨基酸取代的组合，其中H1包含位置186处的氨基酸取代；L1包含位置180或178_180处的氨基酸取代；H2包含位置143_145、143_145_179或145_179处的氨基酸取代；且L2包含位置131或124_178处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组3的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代选自186R及其保守取代；L1中的氨基酸取代选自178E、180E及其保守取代；H2中的氨基酸取代选自143E、145T、179E及其保守取代；L2中的氨基酸取代选自124K、131K、178R及其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-K群组3的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组：H1包含186R且L1包含178E_180E或180E。在进一步的实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-K群组3的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H2 | L2 |
| 143E_145T_179E | 124K_178R |
| 143E_145T | - |
| 145T_179E | 131K |
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含一个H1L1异二聚体和一个H2L2异二聚体的组合。在一个实施方案中，H1L1异二聚体和H2L2异二聚体的组合是这样一种组合，其中H1包含186R，L1包含180E，H2包含143E_145T_179E，且L2包含124K_178R。
在一个实施方案中，K-K群组3的氨基酸组合包含选自表F的一个或多个二级取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-B3中的一个或多个设计中所示的根据K-K群组3的氨基酸取代的组合。
K-K群组4：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组4的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置179处的氨基酸取代；L1包含位置180处的氨基酸取代；H2包含位置143处的氨基酸取代；且L2包含位置124处的氨基酸取代。在一些实施方案中，H1进一步包含位置146处的氨基酸取代，H2进一步包含位置145处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置160和/或178处的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组4的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置179处的氨基酸取代；L1包含位置180处的氨基酸取代；H2包含位置143145处的氨基酸取代；且L2包含位置124处的氨基酸取代。在一些实施方案中，H1进一步包含位置146处的氨基酸取代，且/或L2进一步包含位置160和/或178处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组4的氨基酸取代的组合，其中H1包含位置146_179或179处的氨基酸取代；L1包含位置180处的氨基酸取代；H2包含位置143_145处的氨基酸取代；且L2包含位置124或124_160_178处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组4的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代选自146G、179K及其保守取代；L1中的氨基酸取代是180E或其保守取代；H2中的氨基酸取代选自143E、145T及其保守取代；L2中的氨基酸取代选自124R、160K、178R及其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-K群组4的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组：H1包含179K或146G_179K且L1包含180E。在进一步的实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-K群组4的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组：H2包含143E_145T且L2包含Q124R_Q160K_T178R或Q124R。在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含一个H1L1异二聚体和一个H2L2异二聚体的组合。在一个实施方案中，H1L1异二聚体和H2L2异二聚体的组合是这样一种组合，其中H1包含179K，L1包含180E，H2包含143E_145T，且L2包含124R_160K_178R。
在一个实施方案中，K-K群组4的氨基酸组合包含选自表F的一个或多个二级取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-B4中的一个或多个设计中所示的根据K-K群组4的氨基酸取代的组合。
K-K群组5：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组5的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置143或186处的氨基酸取代；L1包含位置180处的氨基酸取代或不包含促进优先配对的氨基酸取代；H2包含位置143_145处的氨基酸取代；且L2包含位置124处的氨基酸取代。在一些实施方案中，L2进一步包含位置160和/或178中的一个或多个处的氨基酸取代。在另一个实施方案中，L2包含位置124、124_178或124_160_178处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组5的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代选自186R、143R、143K及其保守取代；L1中的氨基酸取代是180E及其保守取代；H2中的氨基酸取代选自143E、145T及其保守取代；L2中的氨基酸取代选自124R、160K、178R及其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-K群组5的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H1 | L1 |
| 186R | 180E |
| 186R | - |
| 143R/K | - |
在进一步的实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-K群组5的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H2 | L2 |
| 143E_145T | 124R_160K_178R |
| 143E_145T | 124R |
| 143E_145T | 124K_178R |
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含一个H1L1异二聚体和一个H2L2异二聚体的组合。
在一个实施方案中，K-K群组5的氨基酸组合包含选自表F的一个或多个二级取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-B5中的一个或多个设计中所示的根据K-K群组5的氨基酸取代的组合。
K-K群组6：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组6的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置39处的氨基酸取代或不包含促进优先配对的氨基酸取代；L1包含位置38处的氨基酸取代或不包含促进优先配对的氨基酸取代；H2包含位置39处的氨基酸取代；且L2包含位置38处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组6的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代选自39D、39E、39K、39R及其保守取代；L1中的氨基酸取代选自38D、38E、38K、38R及其保守取代；H2中的氨基酸取代选自39D、39E、39K、39R及其保守取代；L2中的氨基酸取代选自38D、38E、38K、38R及其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-K群组6的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H1 | L1 |
| - | - |
| 39R | 38D/E |
| 39K | 38E/D |
| 39E | 38R/K |
| 39D | 38R |
在进一步的实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-K群组6的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：
| H2 | L2 |
| 39D | 38R/K |
| 39R | 38E/D |
| 39K | 38E |
| 39E | 38R/K |
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含一个H1L1异二聚体和一个H2L2异二聚体的组合。在一个实施方案中，H1L1异二聚体和H2L2异二聚体的组合是这样一种组合，其中H1包含39R，L1包含38E，H2包含39D，且L2包含38R。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-B6中的一个或多个设计中所示的根据K-K群组6的氨基酸取代的组合。在一个实施方案中，K-K群组6设计不是对应于LCCA唯一标识符10674-10749或10679-10744的设计。
K-K群组7：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组7的氨基酸取代的组合，其中：H1不包含促进优先配对的氨基酸取代；L1包含位置135处的氨基酸取代；H2包含位置139处的氨基酸取代；且L2包含位置116处的氨基酸取代。在一些实施方案中，L2进一步包含位置135处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组7的氨基酸取代的组合，其中L1中的氨基酸取代是135W或其保守取代；H2中的氨基酸取代是139W或其保守取代；且L2中的氨基酸取代选自116A、135V及其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-K群组7的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组：H1不包含促进优先配对的氨基酸取代，且L1包含135W。在另一个实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-K群组7的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组：H2包含139W且L2包含116A或116A_1335V。在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含一个H1L1异二聚体和一个H2L2异二聚体的组合。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-B7中的一个或另一个设计中所示的根据K-K群组7的氨基酸取代的组合。
K-K群组8：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组8的氨基酸取代的组合，其中：H1不包含促进优先配对的氨基酸取代或包含位置45处的氨基酸取代；L1不包含促进优先配对的氨基酸取代；H2包含位置45处的氨基酸取代；且L2包含位置44处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组8的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代是45F或其保守取代；H2中的氨基酸取代是45P、45A或其保守取代；L2中的氨基酸取代是44F或其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-K群组8的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组中的一个：H1不包含促进优先配对的氨基酸取代或包含45F，且L1不包含促进优先配对的氨基酸取代。在进一步的实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-K群组8的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组：H2包含45A或45P，且L2包含44F。在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含H1L1和H2L2异二聚体的组合，其中H1和L1不包含促进优先配对的氨基酸取代，H2包含45A且L2包含44F。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-B8中的一个或多个设计中所示的根据K-K群组8的氨基酸取代的组合。
K-K群组9：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组9的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置139处的氨基酸取代；L1包含位置116处的氨基酸取代；H2不包含促进优先配对的氨基酸取代；且L2包含位置135处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组9的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代是139W或其保守取代；L1中的氨基酸取代是116A或其保守取代；且L2中的氨基酸取代是135W或其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-K群组9的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组：H1包含139W且L1包含116A。在另一个实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-K群组9的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组：H2不包含促进优先配对的氨基酸取代，且L2包含135W。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-B9中所示的根据K-K群组9的氨基酸取代的组合。
K-K群组10：
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组10的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置124处的氨基酸取代；L1包含位置176处的氨基酸取代；H2包含位置124处的氨基酸取代；且L2包含位置176处的氨基酸取代。在一些实施方案中，L1和/或L2进一步包含位置133处的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组10的氨基酸取代的组合，其中：H1包含位置124处的氨基酸取代；L1包含位置133_176处的氨基酸取代；H2包含位置124处的氨基酸取代；且L2包含位置133_176处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含根据K-K群组10的氨基酸取代的组合，其中H1中的氨基酸取代是124E或其保守取代；L1中的氨基酸取代选自133G、176R或其保守取代；H2中的氨基酸取代是124R或其保守取代；L2中的氨基酸取代选自133G、176D或其保守取代。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-K群组10的氨基酸取代组合的H1L1异二聚体，其中该H1L1异二聚体包含以下氨基酸取代组：H1包含124E且L1包含133G_176R。在进一步的实施方案中，抗原结合多肽构建体具有包含根据K-K群组10的氨基酸取代组合的H2L2异二聚体，其中该H2L2异二聚体包含以下氨基酸取代组：H2包含124R，且L2包含133G_176D。在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含这些H1L1和H2L2异二聚体的组合。
在一个实施方案中，K-L群组9的氨基酸组合包含选自表F的一个或多个二级取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含如表10-B10中所示的根据K-K群组10的氨基酸取代的组合。
LCCA设计组中的优先配对
H1、L1、H2和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以及促进H2与L2而非L1优先配对的氨基酸修饰。通常，在不存在氨基酸修饰和任何天然存在的偏倚的情况下，当与两个不同野生型免疫球蛋白轻链序列(L1和L2)共表达时，野生型免疫球蛋白重链序列(H1)在统计上将与两个轻链同等地配对，以形成H1与L1配对(H1L1，正确配对)和H1与L2配对(H1L2，错配)的约50∶50混合物。同样地，如果野生型H2与野生型L1和L2共表达，则重链在统计上将与两个轻链同等地配对，以形成H2与L1配对(H2L1，错配)和H2与L2配对(H2L2，正确配对)的约50∶50混合物。术语“优先配对”在本文中用来描述免疫球蛋白重链多肽序列与一个免疫球蛋白轻链多肽序列而非另一个免疫球蛋白轻链多肽序列的配对特异性或配对偏好。在这种情况下，如果当H1与L1和L2共表达时，H1L1异二聚体的量大于H1L2异二聚体的量，则会在例如H1与L1之间发生优先配对。类似地，如果当H2与L1和L2共表达时，H2L2异二聚体的量大于H2L1异二聚体的量，则会在例如H2与L2之间发生优先配对。
然而，在一些情况下，在从亲本抗体获得的野生型重链和轻链多肽序列中观察到固有的配对偏倚。这种固有的配对偏倚可以在其中野生型亲本H1或H2与野生型亲本L1和L2共表达的LCCA设计组的情况下观察到，其中轻链之一与两个亲本抗体的重链优先配对。在一个实施方案中，当H1、L1、H2和L2中的一个或多个中的氨基酸修饰促进比相应野生型系统中发生的优先配对更多的优先配对时，优先配对发生。
优先配对的程度或设计强度是氨基酸修饰促进优先配对的能力的量度。优先配对的程度可以如本文别处和实施例中所述进行评估，并且是基于正确配对的异二聚体(即H1L1和H2L2)相较于错配的异二聚体(即H1L2和H2L1)的测量。优先配对的程度可以在其中一个重链与两个独特轻链共表达的LCCA设计组(H1L1L2或H2L1L2)或其中亲本抗体的重链和轻链共表达的Mab设计组(H1L1H2L2)的情况下进行评估。
以下实施方案涉及LCCA设计组的情况。在本节中的所有实施方案中，除非另有说明，术语“约”是指指定比例的±5％，并且优先配对是针对野生型进行比较。在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，其中H1L1∶H1L2的比率为至少约40∶60，并且H2L2∶H2L1的比率为至少约60∶40。在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，其中H2L2∶H2L1的比率为至少约40∶60，并且H1L1∶H1L2的比率为至少约60∶40。
在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，其中H1L1∶H1L2的比率为至少约40∶60，并且H2L2∶H2L1的比率为至少约65∶35。在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，其中H2L2∶H2L1的比率为至少约40∶60，并且H1L1∶H1L2的比率为至少约65∶35。
在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，其中H1L1∶H1L2的比率为至少约40∶60，并且H2L2∶H2L1的比率为至少约70∶30。在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，其中H2L2∶H2L1的比率为至少约40∶60，并且H1L1∶H1L2的比率为至少约70∶30。
在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，其中H1L1∶H1L2的比率为至少约40∶60，并且H2L2∶H2L1的比率为至少约75∶25。在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，其中H2L2∶H2L1的比率为至少约40∶60，并且H1L1∶H1L2的比率为至少约75∶25。
在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，其中H1L1∶H1L2的比率为至少约40∶60，并且H2L2∶H2L1的比率为至少约80∶20。在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，其中H2L2∶H2L1的比率为至少约40∶60，并且H1L1∶H1L2的比率为至少约80∶20。
在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，其中H1L1∶H1L2的比率为至少约40∶60，并且H2L2∶H2L1的比率为至少约85∶15。在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，其中H2L2∶H2L1的比率为至少约40∶60，并且H1L1∶H1L2的比率为至少约85∶15。
在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，其中H1L1∶H1L2的比率为至少约40∶60，并且H2L2∶H2L1的比率为至少约90∶10。在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，其中H2L2∶H2L1的比率为至少约40∶60，并且H1L1∶H1L2的比率为至少约90∶10。
在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，其中H1L1∶H1L2的比率为至少约40∶60，并且H2L2∶H2L1的比率为至少约95∶5。在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，其中H2L2∶H2L1的比率为至少约40∶60，并且H1L1∶H1L2的比率为至少约95∶5。
在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，其中H1L1∶H1L2的比率为至少约40∶60，并且H2L2∶H2L1的比率为至少约99∶1。在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，其中H2L2∶H2L1的比率为至少约40∶60，并且H1L1∶H1L2的比率为至少约99∶1。
在其它实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，以使得H1L1或H2L2的量大于约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一个实施方案中，如实施例中所述，通过LCCA测量优先配对。LCCA结果通常可预测在其中H1、L1、H2和L2共表达的Mab设计组(如下所述)中的优先配对的结果。
在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1，或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，以使得H1L1或H2L2中的至少一个的相对配对相对于野生型大至少约10％，并且另一个的相对配对在野生型的约10％的范围内或相对于野生型大至少约10％。
在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1，或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，以使得H1L1或H2L2中的至少一个的相对配对相对于野生型大至少约20％，并且另一个的相对配对在野生型的约10％的范围内或相对于野生型大至少约10％。
在一个实施方案中，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1，或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2的氨基酸修饰，以使得H1L1或H2L2中的至少一个的相对配对相对于野生型大至少约30％，并且另一个的相对配对在野生型的约10％的范围内或相对于野生型大至少约10％。
Mab设计组中的优先配对
优先配对还可以在Mab设计组中的情况中进行评估，其中H1、L1、H2和L2共表达并且H1、L1、H2和L2中的一个或多个包含促进H1与L1以及H2与L2优先配对以形成包含正确配对的第一异二聚体(H1L1)和正确配对的第二异二聚体(H2L2)的双特异性抗原结合多肽构建体的氨基酸修饰。在这种实施方案中，如图8所示，当两个不同的免疫球蛋白重链多肽序列与两个不同的免疫球蛋白轻链多肽序列共表达时，可以产生许多可能的产物，图8示出了其中十四种可能产物，其中仅有一种是所需的或正确配对的双特异性抗体H1L1H2L2(图8中的抗体种类A)。然而，在评估基于Mab设计组的重链和轻链之间的正确配对的情况下，一些附加产物也可以被认为就Fab区而言显示正确的配对，因为它们在Fab水平下包含正确配对的异二聚体(参见例如图8中的抗体种类E、H、K和M)。在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体的Fc部分包含促进异二聚体Fc形成的不对称氨基酸修饰。在这些实施方案中，预期种类E至J的数目和量会减少。
关于LCCA设计组，在其中所有四种免疫球蛋白多肽序列H1、L1、H2和L2共表达的Mab设计组的情况下，在一些情况下，可能存在固有的配对偏倚，导致轻链之一(L1或L2)优先与H1和H2两者配对。因此，当在双特异性抗原结合多肽构建体的情况下确定Mab设计的强度时，可能有必要评估相较于在相应的野生型亲本系统(没有Mab设计的氨基酸修饰的H1、L1、H2、L2多肽序列)中观察到的正确配对量，在Mab设计的氨基酸修饰的情况下得到的配对程度。因此，在一个实施方案中，如果正确配对的双特异性抗原结合多肽构建体的量大于在相应的野生型亲本系统中获得的正确配对的双特异性抗体的量，则认为Mab设计展现优先配对。或者，如果正确配对的双特异性抗原结合多肽构建体占总表达产物的百分比大于在相应的野生型亲本系统中获得的正确配对的双特异性抗体占总表达产物的百分比，则认为Mab设计展现优先配对。在一个实施方案中，总表达产物可以包括图8中的抗体种类A至N。在一个实施方案中，总表达产物可以仅为具有两个重链和两个轻链的抗体种类(图8中的抗体种类A至J)。在后一个实施方案中，优先配对被测量为总双特异性抗体的百分比，不包括半抗体(如图8中的种类K至N)。
在另一个实施方案中，如果在相应的野生型亲本系统中显示高度错配的双特异性抗原结合多肽构建体的异二聚体中的正确配对量增加，则认为Mab设计展现优先配对。在另一个实施方案中，如果H1和L1之间以及H2和L2之间的正确配对的总量大于在相应的野生型亲本系统中观察到的总量，则认为Mab设计展现优先配对。例如，参考图8，就H1L1而言，种类A、B、H、I和M将被认为是正确配对的，而就H2L2而言，种类A、C、E、F和K将被认为是正确配对的。在这个实施方案中，优先配对被测量为总配对的百分比。
在一个实施方案中，如本文中所述，通过SMCA测量优先配对。
在一些实施方案中，当由H1L1和H2L2配对之和测量的总正确配对量与相应的在Fab区中不具有促进优先配对的氨基酸取代的H1、L1、H2和L2多肽链的配对相比的变化大于约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％时，Mab设计被认为促进优先配对。
在一些实施方案中，当由所产生的双特异性抗体的量(表示为所产生的非半抗体种类的百分比)测量的总正确配对量与相应的在Fab区中不具有促进优先配对的氨基酸取代的H1、L1、H2和L2多肽链的配对相比的变化大于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％时，Mab设计被认为促进优先配对。
在一个实施方案中，当由所产生的双特异性抗体的量(表示为所产生的所有种类的百分比)测量的总正确配对量与相应的在Fab区中不具有促进优先配对的氨基酸取代的H1、L1、H2和L2多肽链的配对相比的变化大于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％时，Mab设计被认为促进优先配对。
Fab区的热稳定性
H1、L1、H2和L2多肽序列中的一个或多个中的氨基酸修饰促进H1与L1而非L2优先配对以及H2与L2而非L1优先配对，并且最小程度地影响抗原结合多肽构建体的每个异二聚体的热稳定性。通过测量由H1和L1或由H2和L2形成的Fab区的热稳定性，并将其与由相应的野生型H1和L1多肽序列形成的Fab区(野生型第一Fab区)或由相应的野生型H2和L2多肽序列形成的Fab区(野生型第二Fab区)的热稳定性进行比较来确定氨基酸修饰对每个异二聚体的影响。术语“相应的野生型H1和L1多肽序列”和“相应的野生型H2和L2多肽序列”意欲描述不具有如本文所述的促进优先配对的氨基酸修饰的相应的H1、L1、H2和L2多肽序列。
热稳定性可以通过本领域已知的和本文描述的多种方法测量，包括差示扫描量热法(DSC)或差示扫描荧光测定法(DSF)。后两种方法提供了以“熔融温度”或Tm表示的热稳定性量度。
在以下实施方案的情况下，术语“约”意指所列温度的±10％。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第一Fab区的Tm相差在约20℃以内的Tm的第一Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第一Fab区的Tm相差在约15℃以内的Tm的第一Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第一Fab区的Tm相差在约10℃以内的Tm的第一Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第一Fab区的Tm相差在约9℃以内的Tm的第一Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第一Fab区的Tm相差在约8℃以内的Tm的第一Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第一Fab区的Tm相差在约7℃以内的Tm的第一Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第一Fab区的Tm相差在约6℃以内的Tm的第一Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第一Fab区的Tm相差在约5℃以内的Tm的第一Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第一Fab区的Tm相差在约4℃以内的Tm的第一Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第一Fab区的Tm相差在约3℃以内的Tm的第一Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第一Fab区的Tm相差在约2℃以内的Tm的第一Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第一Fab区的Tm相差在约1℃以内的Tm的第一Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第一Fab区的Tm相同的Tm的第一Fab区。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第二Fab区的Tm相差在约20℃以内的Tm的第二Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第二Fab区的Tm相差在约15℃以内的Tm的第二Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第二Fab区的Tm相差在约10℃以内的Tm的第二Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第二Fab区的Tm相差在约9℃以内的Tm的第二Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第二Fab区的Tm相差在约8℃以内的Tm的第二Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第二Fab区的Tm相差在约7℃以内的Tm的第二Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第二Fab区的Tm相差在约6℃以内的Tm的第二Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第二Fab区的Tm相差在约5℃以内的Tm的第二Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第二Fab区的Tm相差在约4℃以内的Tm的第二Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第二Fab区的Tm相差在约3℃以内的Tm的第二Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第二Fab区的Tm相差在约2℃以内的Tm的第二Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第二Fab区的Tm相差在约1℃以内的Tm的第二Fab区。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含具有与相应的野生型第二Fab区的Tm相同的Tm的第二Fab区。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含第一异二聚体和第二异二聚体，其中第一Fab区的熔融温度(Tm)与由相应的野生型H1和L1多肽序列形成的对于第一抗原的Fab区(野生型第一Fab区)的Tm相差在约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20℃以内，且/或第二Fab区的熔融温度(Tm)与由相应的野生型H2和L2多肽序列形成的对于第二抗原的Fab区(野生型第二Fab区)的Tm相差在约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20℃以内。
此外，在一些实施方案中，第一或第二Fab区的Tm大于相应的野生型第一Fab或相应的野生型第二Fab的Tm。因此，在一个实施方案中，与相应的野生型第一Fab区或相应的野生型第二Fab区相比，第一或第二Fab区的Tm增加约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.5、5.0℃或更多。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含对应于K-L设计编号2979、3018、3041、3102、3898和/或3947的氨基酸取代。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含对应于K-L设计编号3025、3109、3113、3878、3890、3910、3931、3954、3967、4010和/或4040的氨基酸取代。
Fab区的抗原结合能力
H1、L1、H2和L2多肽序列中的一个或多个中的氨基酸修饰促进H1与L1而非L2优先配对以及H2与L2而非L1优先配对，并且最小程度地影响抗原结合多肽构建体的每个异二聚体与其抗原结合的能力。通过测量由H1和L1或由H2和L2形成的Fab区与其各自的抗原结合的能力，并将其与相应的野生型第一Fab区或相应的野生型第二Fab区与其各自的抗原结合的能力进行比较来确定氨基酸修饰对每个异二聚体的影响。
Fab区与其各自的抗原结合的能力可以通过本领域已知的许多方法来测量，其中一些方法描述于本文的其它地方。例如，表面等离振子共振(SPR)或全细胞结合测定可用于评估第一Fab区结合第一抗原的能力以及第二Fab区结合第二抗原的能力。后两种方法通过测定Fab区对其抗原的亲和力来测量Fab区与其各自的抗原结合的能力。
在一个实施方案中，第一Fab区对第一抗原的亲和力在野生型第一Fab区对第一抗原的亲和力的约100倍以内。在一个实施方案中，第一Fab区对第一抗原的亲和力在野生型第一Fab区对第一抗原的亲和力的约50倍以内。在一个实施方案中，第一Fab区对第一抗原的亲和力在野生型第一Fab区对第一抗原的亲和力的约40倍以内。在一个实施方案中，第一Fab区对第一抗原的亲和力在野生型第一Fab区对第一抗原的亲和力的约30倍以内。在一个实施方案中，第一Fab区对第一抗原的亲和力在野生型第一Fab区对第一抗原的亲和力的约20倍以内。在一个实施方案中，第一Fab区对第一抗原的亲和力在野生型第一Fab区对第一抗原的亲和力的约10倍以内。在一个实施方案中，第一Fab区对第一抗原的亲和力在野生型第一Fab区对第一抗原的亲和力的约9倍以内。在一个实施方案中，第一Fab区对第一抗原的亲和力在野生型第一Fab区对第一抗原的亲和力的约8倍以内。在一个实施方案中，第一Fab区对第一抗原的亲和力在野生型第一Fab区对第一抗原的亲和力的约7倍以内。在一个实施方案中，第一Fab区对第一抗原的亲和力在野生型第一Fab区对第一抗原的亲和力的约6倍以内。在一个实施方案中，第一Fab区对第一抗原的亲和力在野生型第一Fab区对第一抗原的亲和力的约5倍以内。在一个实施方案中，第一Fab区对第一抗原的亲和力在野生型第一Fab区对第一抗原的亲和力的4倍以内。在一个实施方案中，第一Fab区对第一抗原的亲和力在野生型第一Fab区对第一抗原的亲和力的约3倍以内。在一个实施方案中，第一Fab区对第一抗原的亲和力在野生型第一Fab区对第一抗原的亲和力的约2倍以内。在一个实施方案中，第一Fab区对第一抗原的亲和力与野生型第一Fab区对第一抗原的亲和力大致相同。
在一个实施方案中，第二Fab区对第二抗原的亲和力在野生型第二Fab区对第二抗原的亲和力的约100倍以内。在一个实施方案中，第二Fab区对第二抗原的亲和力在野生型第二Fab区对第二抗原的亲和力的约50倍以内。在一个实施方案中，第二Fab区对第二抗原的亲和力在野生型第二Fab区对第二抗原的亲和力的约40倍以内。在一个实施方案中，第二Fab区对第二抗原的亲和力在野生型第二Fab区对第二抗原的亲和力的约30倍以内。在一个实施方案中，第二Fab区对第二抗原的亲和力在野生型第二Fab区对第二抗原的亲和力的约20倍以内。在一个实施方案中，第二Fab区对第二抗原的亲和力在野生型第二Fab区对第二抗原的亲和力的约10倍以内。在一个实施方案中，第二Fab区对第二抗原的亲和力在野生型第二Fab区对第二抗原的亲和力的约9倍以内。在一个实施方案中，第二Fab区对第二抗原的亲和力在野生型第二Fab区对第二抗原的亲和力的约8倍以内。在一个实施方案中，第二Fab区对第二抗原的亲和力在野生型第二Fab区对第二抗原的亲和力的约7倍以内。在一个实施方案中，第二Fab区对第二抗原的亲和力在野生型第二Fab区对第二抗原的亲和力的约6倍以内。在一个实施方案中，第二Fab区对第二抗原的亲和力在野生型第二Fab区对第二抗原的亲和力的约5倍以内。在一个实施方案中，第二Fab区对第二抗原的亲和力在野生型第二Fab区对第二抗原的亲和力的4倍以内。在一个实施方案中，第二Fab区对第二抗原的亲和力在野生型第二Fab区对第二抗原的亲和力的约3倍以内。在一个实施方案中，第二Fab区对第二抗原的亲和力在野生型第二Fab区对第二抗原的亲和力的约2倍以内。在一个实施方案中，第二Fab区对第二抗原的亲和力与野生型第二Fab区对第二抗原的亲和力大致相同。
氨基酸修饰或设计组的可转移性
本文所述的氨基酸修饰或设计组可用于制备双特异性抗原结合多肽构建体，其中每个异二聚体的免疫球蛋白重链多肽序列和免疫球蛋白轻链多肽可以从一个或多个亲本抗体获得，其中至少一个亲本抗体包含κ轻链，并且至少另一个亲本抗体包含λ轻链。基于以下讨论，Mab设计组可以应用于大多数此类双特异性抗原结合多肽构建体。
免疫球蛋白重链和轻链间的界面中的VH:VL和CH1:CL界面残基是相对高度保守的(Padlan等人，1986，Mol.Immunol.23(9)：951-960)。这种由于进化限制而产生的这种序列保守性增加了在轻链和重链的组合配对期间将形成具有功能活性的抗体结合结构域的可能性。由于这种序列保守性，可以得出的结论是：可以将本文所描述并基于D3H44κFab和CAT-2200λFab的结构建模的驱动优先配对的Mab设计组转移到其它亲本抗体的κFab和λFab以驱动优先配对，因为该区域在不同抗体中展现出高度的序列保守性。此外，当确实存在序列差异时，这些差异通常位于CH1:CL界面的远端。对于CH1和CL结构域尤其如此。在一个实施方案中，本文所述的抗原结合多肽构建体包含异二聚体，其中κFab包含位于CL和/或CH1结构域中的促进优先配对的一个或多个氨基酸修饰。在一个实施方案中，本文所述的抗原结合多肽构建体包含异二聚体，其中λFab包含位于CL和/或CH1结构域中的促进优先配对的一个或多个氨基酸修饰。
然而，在抗原结合位点处，CDR(互补决定区)环残基(和长度)特别是CDR-H3存在一些序列可变性。因此，在一个实施方案中，本文所述的抗原结合多肽构建体包含异二聚体，其中当抗原结合位点的氨基酸序列明显不同于D3H44抗体的氨基酸序列时，κFab包含位于VH和/或VL结构域中的CDR环远端的一个或多个氨基酸修饰。在另一个实施方案中，本文所述的抗原结合多肽构建体包含异二聚体，其中当抗原结合位点的氨基酸序列明显不同于CAT-2200抗体的氨基酸序列时，λFab包含位于VH和/或VL结构域中的CDR环远端的促进优先配对的一个或多个氨基酸修饰。在另一个实施方案中，本文所述的抗原结合多肽构建体包含异二聚体，其中当抗原结合位点的氨基酸序列大体上类似于D3H44抗体的氨基酸序列时，κFab包含位于VH和/或VL结构域中的CDR环近端或远端的促进优先配对的一个或多个氨基酸修饰。在另一个实施方案中，本文所述的抗原结合多肽构建体包含异二聚体，其中当抗原结合位点的氨基酸序列大体上类似于CAT-2200抗体的氨基酸序列时，λFab包含位于VH和/或VL结构域中的CDR环近端或远端的促进优先配对的一个或多个氨基酸修饰。在一个实施方案中，本文所述的抗原结合多肽构建体包含异二聚体，其中κFab包含位于CL和/或CH1结构域中以及VH和/或VL结构域中的促进优先配对的一个或多个氨基酸修饰。在一个实施方案中，本文所述的抗原结合多肽构建体包含异二聚体，其中λFab包含位于CL和/或CH1结构域中以及VH和/或VL结构域中的促进优先配对的一个或多个氨基酸修饰。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体的H1、L1、H2和L2中的一个或多个中的氨基酸修饰可以促进其中一个亲本抗体的κFab是人或人源化IgG1/κ的抗原结合多肽构建体中的优先配对。此类亲本抗体的非限制性实例包括奥法木单抗(人)或曲妥珠单抗或贝伐单抗(人源化)。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体的H1、L1、H2和L2中的一个或多个中的氨基酸修饰可以促进其中一个亲本抗体的λFab是人或人源化IgG1/λ的抗原结合多肽构建体中的优先配对。此类人抗体的非限制性实例包括贝伐珠单抗或西法木单抗，而人源化抗体的实例是博尼替妥珠单抗。
在另一个实施方案中，本文所述的氨基酸修饰可利用常用的VH和VL亚群转移至抗体的免疫球蛋白重链和轻链。
在一个实施方案中，本文所述的氨基酸修饰可转移至具有接近种系的框架的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。此类抗体的实例包括奥滨尤妥珠单抗。
在一个实施方案中，本文所述的氨基酸修饰可转移至具有接近于针对重链和轻链对观察到的平均值的VH:VL结构域间角度的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。这种抗体的实例包括但不限于帕妥珠单抗。在另一个实施方案中，本文所述的氨基酸修饰可转移至具有典型CL和CH1结构域的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。此类抗体的合适实例包括但不限于曲妥珠单抗。
实施例、图式和表证明促进优先配对的氨基酸修饰(例如，在一个或多个包含可变区和恒定区的Fab片段内)可转移至其它免疫球蛋白重链和轻链，产生一个免疫球蛋白重链与两个免疫球蛋白轻链之一的优先配对的类似模式。
支架
抗原结合多肽构建体的异二聚体可以连接到支架上。支架可以是肽、多肽、聚合物、纳米颗粒或其它化学实体。抗原结合多肽构建体的异二聚体可以连接到支架的N端或C端，其中所述支架是多肽。在一个实施方案中，支架是白蛋白多肽。
在另一个实施方案中，支架是免疫球蛋白Fc(Fc)或其部分。在一些实施方案中，Fc包括至少一个或两个CH3结构域序列。在一些实施方案中，Fc还包括至少一个或两个CH2结构域序列。在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含通过或不通过一个或多个接头偶联至第一异二聚体和/或第二异二聚体的Fc。在一些实施方案中，Fc是人Fc。在一些实施方案中，Fc是人IgG或IgG1Fc。在一些实施方案中，Fc是异二聚体Fc。在一些实施方案中，Fc是单个多肽。在一些实施方案中，Fc是多个肽，例如两个多肽。
在一些实施方案中，Fc包含至少一个CH3结构域序列中的一个或多个氨基酸修饰。可以对免疫球蛋白Fc进行氨基酸修饰，以驱动异二聚体CH3结构域序列相对于同二聚体CH3结构域序列的优先配对。此类氨基酸修饰是本领域中已知的，并且包括例如描述于美国专利公开号2012/0149876中的那些。用于驱动异二聚体CH3结构域序列相对于同二聚体CH3序列的优先配对的替代策略包括例如“杵进臼”、具有离子相互作用的带电残基，并且还可以使用链交换工程改造的结构域(SEED)技术。后几种策略已经在本领域中进行了描述，并且在Klein等人(同上)中进行了综述。下面进一步讨论了Fc结构域。
在一些方面，Fc是描述于2011年11月4日提交的专利申请PCT/CA2011/001238或2012年11月2日提交的专利申请PCT/CA2012/050780中的Fc，这些申请的全部公开内容均出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
在一些方面，本文所述的抗原结合多肽构建体包含含有修饰的CH3结构域的异二聚体Fc，所述CH3结构域已经被不对称地修饰。该异二聚体Fc可以包含两个重链恒定结构域多肽：第一重链多肽和第二重链多肽，它们可以互换使用，条件是Fc包含一个第一重链多肽和一个第二重链多肽。通常，第一重链多肽包含第一CH3序列且第二重链多肽包含第二CH3序列。
包含以不对称方式引入的一个或多个氨基酸修饰的两个CH3序列通常在这两个CH3序列二聚化时产生异二聚体Fc，而不是同二聚体。如本文所使用，“不对称的氨基酸修饰”是指其中在第一CH3序列上的特定位置的氨基酸不同于在第二CH3序列上的相同位置的氨基酸，且第一和第二CH3序列优先配对形成异二聚体而不是同二聚体的任何修饰。这种异二聚化可以通过以下方式产生：在每个序列上的相同的相应氨基酸位置处仅修饰两个氨基酸之一；或在第一和第二CH3序列中的每个上的相同的相应位置处修饰每个序列上的氨基酸。异二聚体Fc的第一和第二CH3序列可以包含一个或多于一个不对称氨基酸修饰。
表X提供人IgG1 Fc序列的氨基酸序列，其对应于全长人IgG1重链的氨基酸231至447。CH3序列包括全长人IgG1重链的氨基酸341-447。
通常，Fc可以包括能够二聚化的两个连续重链序列(A和B)。在一些方面，Fc的一个或两个序列包含位于以下位置的一个或多个突变或修饰：L351、F405、Y407、T366、K392、T394、T350、S400和/或N390(使用EU编号)。在一些方面，Fc包括表X中所示的突变序列。在一些方面，Fc包括变体1 A-B的突变。在一些方面，Fc包括变体2 A-B的突变。在一些方面，Fc包括变体3 A-B的突变。在一些方面，Fc包括变体4 A-B的突变。在一些方面，Fc包括变体5A-B的突变。
在一些实施方案中，Fc可以包含在至少一个CH2结构域序列中的一个或多个氨基酸修饰。Fc的重链序列中的许多突变在本领域中已知用于选择性改变抗体Fc对不同Fcγ受体的亲和力。在一些实施方案中，Fc包含一个或多个修饰以改变Fc-γ受体与抗原结合多肽构建体的结合。
CH2结构域对应于表X中所示序列的氨基酸231-340。改变抗原结合多肽构建体的Fc与Fc-γ受体结合的能力的示例性非限制性氨基酸修饰列举如下：
S298A/E333A/K334A、S298A/E333A/K334A/K326A(Lu Y、Vernes JM、Chiang N等人，J Immunol Methods.2011年2月28日；365(1-2)：132-41)；F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L(Stavenhagen JB、Gorlatov S、Tuaillon N等人，Cancer Res.2007年9月15日；67(18)：8882-90；Nordstrom JL、Gorlatov S、Xhang W等人，Breast Cancer Res.2011年11月30日；13(6)：R123)；F243L(Stewart R、Thom G、Levens M等人，Protein Eng Des Sel.2011年9月；24(9)：671-8.)；S298A/E333A/K334A(ShieldsRL、Namenuk AK、Hong K等人，J Biol Chem.2001年3月2日；276(9)：6591-604)；S239D/I332E/A330L、S239D/I332E(Lazar GA、Dang W、Karki S等人，Proc Natl Acad SciUSA.2006年3月14日；103(11)：4005-10)；S239D/S267E、S267E/L328F(Chu SY、Vostiar I、Karki S等人，Mol Immunol.2008年9月；45(15)：3926-33)；S239D/D265S/S298A/I332E、S239E/S298A/K326A/A327H、G237F/S298A/A330L/I332E、S239D/I332E/S298A、S239D/K326E/A330L/I332E/S298A、G236A/S239D/D270L/I332E、S239E/S267E/H268D、L234F/S267E/N325L、G237F/V266L/S267D以及列于WO2011/120134和WO2011/120135(通过引用并入本文)中的其它突变。Therapeutic Antibody Engineering(William R.Strohl和LilaM.Strohl，Woodhead Publishing series，Biomedicine第11期，ISBN 1907568 37 9，2012年10月)在第283页上描述了影响Fc与Fc-γ受体的结合的其它Fc修饰。
改善效应功能的其它修饰
在一些实施方案中，可以修饰本文所述的抗原结合多肽构建体的Fc以改善其效应功能。此类修饰是本领域中已知的，并且包括无岩藻糖基化或抗体Fc部分对活化受体(主要为FCGR3a(针对ADCC)和C1q(针对CDC))的亲和力的工程改造。下表Y汇总了文献中报道的用于效应功能工程改造的多种设计。
因此，在一个实施方案中，本文所述的抗原结合多肽构建体可以包括二聚体Fc，其包含上表中所示的赋予改善的效应功能的一个或多个氨基酸修饰。在另一个实施方案中，可以使抗原结合多肽构建体无岩藻糖基化以改善效应功能。
FcRn结合和PK参数
如本领域中已知，结合至FcRn使内吞抗体从核内体再循环回到血流中(Raghavan等，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12：181-220；Ghetie等，2000，Annu Rev Immunol 18：739-766)。这个过程与由于全长分子的大尺寸而阻止肾过滤结合起来产生从1周至3周的有利的抗体血清半衰期。Fc结合至FcRn还在抗体运输中起关键作用。因此，在一个实施方案中，Fc包含改变或促进Fc结合FcRn的能力的一个或多个氨基酸修饰。
接头
本文所述的构建体可以包括本文所述的一个或多个异二聚体，其可操作地连接至本文所述的Fc。在一些方面，Fc通过或不通过一个或多个接头连接至一个或多个异二聚体。在一些方面，Fc直接连接至一个或多个异二聚体。在一些方面，Fc通过一个或多个接头连接至一个或多个异二聚体。在一些方面，Fc通过接头连接至每个异二聚体的重链。
在一些方面，一个或多个接头是一个或多个多肽接头。在一些方面，一个或多个接头包含一个或多个抗体铰链区。在一些方面，一个或多个接头包含一个或多个IgG1铰链区。
额外的可选修饰
在一个实施方案中，可以进一步修饰本文所述的抗原结合多肽构建体的免疫球蛋白重链和轻链(即通过各种类型的分子的共价连接)，以使得共价连接不干扰重链和轻链之间的优先配对，或影响异二聚体与其抗原结合的能力，或影响其稳定性。此类修饰包括例如但不限于糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团进行的衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配体或其它蛋白质的连接等。可以通过已知技术进行多种化学修饰中的任一种，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。
在另一个实施方案中，本文所述的抗原结合多肽构建体的免疫球蛋白重链和轻链可以(直接或间接)缀合至调节特定生物反应的治疗剂或药物部分。在某些实施方案中，抗原结合多肽构建体与药物(例如毒素、化学治疗剂、免疫调节剂或放射性同位素)缀合。制备ADC(抗体-药物缀合物或抗原结合多肽构建体药物缀合物)的几种方法在本领域中是已知的，并且描述于例如美国专利8,624,003(一锅法)、8,163,888(一步法)和5,208,020(两步法)。在一些实施方案中，药物选自美登素、奥瑞他汀(auristatin)、卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物。在其它实施方案中，药物是选自DM1和DM4的美登素。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体与细胞毒性剂缀合。如本文中所使用，术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu177)；化学治疗剂；和毒素，例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体。
治疗剂或药物部分不应该被理解为限于典型的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可以包括例如毒素，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、豹蛙抗瘤酶(Onconase)(或另一种细胞毒性RNA酶)、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板源性生长因子、组织血纤维蛋白溶酶原活化剂、凋亡剂(例如TNF-α、TNF-β、AIM I(参见国际公开号WO97/33899)、AIM II(参见国际公开号WO 97/34911)、Fas配体(Takahashi等人，1994，J.Immunol.，6：1567)和VEGI(参见国际公开号WO 99/23105))、血栓形成剂或抗血管生成剂(例如血管抑制素或内皮抑制素)；或生物反应调节剂，如例如淋巴因子(例如白血胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”))或生长因子(例如生长激素(“GH”))。此外，在一个替代实施方案中，抗原结合多肽构建体可以缀合至治疗部分，例如放射性物质或用于缀合放射性金属离子的大环螯合剂(参见上文的放射性物质的实例)。在某些实施方案中，大环螯合剂是可以通过接头分子连接至抗体的1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″-四乙酸(DOTA)。此类接头分子在本领域中是公知的，并且描述于Denardo等人，1998，Clin Cancer Res.4：2483；Peterson等人，1999，Bioconjug.Chem.10：553；和Zimmerman等人，1999，Nucl.Med.Biol.26：943中。
在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体的免疫球蛋白重链和轻链表达为包含标签以利于纯化和/或测试等的融合蛋白。如本文中所提及，“标签”是在蛋白质的C端、N端或内部提供的有助于蛋白质鉴定或纯化的任何添加的一系列氨基酸。合适的标签包括但不限于本领域技术人员已知的可用于纯化和/或测试的标签，例如白蛋白结合结构域(ABD)、His标签、FLAG标签、谷胱甘肽-S-转移酶、血凝素(HA)和麦芽糖结合蛋白。此类标记蛋白质还可以经工程改造以包含裂解位点，例如凝血酶、肠激酶或因子X裂解位点，以便于在纯化之前、期间或之后去除标签。
制备抗原结合多肽构建体的方法
如上所述，本文所述的抗原结合多肽构建体可以包含第一异二聚体和第二异二聚体，所述第一异二聚体包含具有至少VH和CH1结构域的免疫球蛋白重链或其片段以及具有VL结构域和CL结构域的免疫球蛋白λ轻链，并且所述第二异二聚体包含具有至少VH和CH1结构域的免疫球蛋白重链或其片段以及具有VL结构域和CL结构域的免疫球蛋白κ轻链。免疫球蛋白多肽序列经工程改造以并入如本文所述的促进优先配对的氨基酸修饰。因此，在双特异性抗原结合多肽构建体的情况下，通常存在构成该抗原结合多肽构建体的四个不同的多肽序列，即两个免疫球蛋白重链多肽序列或其片段以及两个免疫球蛋白轻链多肽序列。可以使用本领域中已知的重组DNA技术容易地制备抗原结合多肽构建体的免疫球蛋白重链多肽序列和免疫球蛋白轻链多肽序列。标准技术如例如描述于以下文献中的那些可用于重组核酸方法、核酸合成、细胞培养、转基因整合和重组蛋白表达：Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，第3版，2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，第2版，1989)；Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人，John Wileyand Sons，New York，第4版，1999)；以及Glick和Pastemak，Molecular Biotechnology：Principles and Applications of Recombinant DNA(ASM Press，Washington，D.C.，第2版，1998)。
构成抗原结合多肽构建体的亲本抗体的免疫球蛋白重链和轻链的多核苷酸和氨基酸序列是本领域中已知的，或可以使用核酸和/或蛋白质测序方法容易地确定。
因此，还提供了编码抗原结合多肽构建体的免疫球蛋白重链和轻链的多核苷酸或多核苷酸组。此类多核苷酸包括单链和双链形式的DNA和RNA以及相应的互补序列。DNA包括例如cDNA、基因组DNA、化学合成DNA、通过PCR扩增的DNA及其组合。多核苷酸包括全长基因或cDNA分子及其片段的组合。
编码本文所述的工程改造免疫球蛋白重链和轻链多肽的多核苷酸可以通过以下方式来制备：使用盒式或PCR诱变或本领域熟知的其它技术对编码所述多肽的DNA中的核苷酸进行位点特异性诱变，以产生编码所述工程改造的免疫球蛋白重链和轻链多肽的DNA，然后如本文所述在细胞培养物中表达重组DNA。然而，编码工程改造的免疫球蛋白重链和轻链多肽的多核苷酸还可以使用已确定的技术通过体外基因合成来制备。
本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，可以制备极大量的多核苷酸，其全部编码本文所述的工程改造的免疫球蛋白重链和轻链多肽。因此，在已经确定特定的氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以通过以不改变所编码的蛋白质的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的序列来制备任何数量的不同多核苷酸。
还提供了包含至少一种如上所述的多核苷酸的质粒、表达载体、转录或表达盒形式的表达系统和构建体。还提供了包含此类表达系统或构建体的宿主细胞。
通常，宿主细胞中使用的表达载体将含有用于质粒维持和用于外源核苷酸序列的克隆和表达的序列。在某些实施方案中，统称为“侧翼序列”的此类序列通常将包括以下核苷酸序列中的一个或多个：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码待表达的多肽的多核苷酸的多接头区以及选择标记元件。载体可以为多顺反子结构，即表达编码抗原结合多肽构建体的免疫球蛋白重链和轻链的两个或更多个多核苷酸；或抗原结合多肽构建体可以由一组载体表达，每个载体表达一个或多个多核苷酸。还可以使用包含多顺反子载体和包含编码免疫球蛋白重链和轻链之一的单个多核苷酸的载体的组合的一组载体来表达抗原结合多肽构建体。
在一些实施方案中，载体可以含有“标签”编码序列，即位于多肽编码序列的5′或3′端的寡核苷酸分子；该寡核苷酸序列编码polyHis(例如6His)，或另一种“标签”，例如有市售抗体存在的FLAG、HA(血凝素流感病毒)或myc。该标签通常在多肽表达后与多肽融合，并且可以作为用于亲和纯化或检测宿主细胞中的多肽的手段。亲和纯化可以例如通过使用标签的抗体作为亲和基质的柱色谱法完成。任选地，标签随后可以通过各种方法如肽酶裂解从纯化的多肽中去除。
载体通常含有被宿主生物体识别并可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的启动子。启动子是位于结构基因(通常为约100至1000bp)的起始密码子的上游(即5′端)并控制结构基因的转录的非转录序列。启动子通常被分为两类：诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子响应于培养条件的一些变化(例如含或不含营养物或温度变化)提高在其控制下的DNA的转录水平。另一方面，组成型启动子均匀地转录与其可操作地连接的基因，即对基因表达很少或没有控制。许多可被各种潜在宿主细胞识别的启动子是众所周知的。
适用于酵母宿主、细菌宿主和昆虫宿主的启动子在本领域中是众所周知的。酵母增强子有利地与酵母启动子一起使用。适用于哺乳动物宿主细胞的启动子是众所周知的，并且包括但不限于从诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、B型肝炎病毒和最优选猿猴病毒40(SV40)的病毒的基因组获得的启动子。其它合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热休克启动子和肌动蛋白启动子。
当载体被整合到宿主细胞基因组中时，所述载体可以含有一个或多个促进表达的元件。实例包括EASE元件(Aldrich等人，2003Biotechnol Prog.19：1433-38)和基质结合区(MAR)。MAR介导核染色质的结构组织，并且可以使整合的载体与“位置”效应隔离。因此，当载体用于产生稳定的转染子时，MAR特别有用。许多天然和合成的含MAR核酸在本领域中是已知的，例如美国专利号6,239,328、7,326,567、6,177,612、6,388,066、6,245,974、7,259,010、6,037,525、7,422,874、7,129,062。
在构建了载体并且已将多核苷酸插入载体中的合适位点之后，可以将完整的载体插入合适的宿主细胞中用于扩增和/或多肽表达。可以通过众所周知的方法(包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其它已知技术)将表达载体转化到选定的宿主细胞中。所选方法将部分取决于待使用的宿主细胞的类型。宿主细胞可以被瞬时转染或宿主细胞可以被稳定转染。这些方法和其它合适的方法是技术人员所熟知的，并且陈述于例如Sambrook等人，2001(同上)中。
就重组蛋白的长期高产量生产而言，通常优选稳定表达。例如，可以制备稳定地表达抗原结合多肽构建体的工程改造的重链和轻链的细胞系。不使用含有病毒复制起点的表达载体，可以用受合适的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择标记转化宿主细胞。在引入外源DNA或多核苷酸后，使工程改造的细胞在富集培养基中生长1至2天，然后转换到选择性培养基中。重组质粒中的选择标记赋予对该选择的抗性，并允许细胞稳定地将质粒整合到其染色体中并生长形成斑点，所述斑点继而可以被克隆并扩展到细胞系中。
可以使用多种选择系统，包括但不限于可分别用于tk-、hgprt-或aprt细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，Cell 11：223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska和Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：2026)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人，1980，Cell 22：817)基因。此外，抗代谢物抗性可以用作以下基因的选择基础：dhfr，其赋予甲氨蝶呤抗性(Wigler等人，1980，Natl.Acad.Sci.USA 77：3567；O′Hare等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527)；gpt，其赋予霉酚酸抗性(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072)；neo，其赋予氨基糖苷G-418抗性(Colberre-Garapin等人，1981，J.Mol.Biol.150：1)；以及hygro，其赋予潮霉素抗性(Santerre等人，1984，Gene 30：147)。
当在合适条件下培养时，宿主细胞产生抗原结合多肽构建体，其随后可以从培养基中收集(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)或直接从产生它的宿主细胞中收集(如果其未被分泌)。适当的宿主细胞的选择将取决于各种因素，例如所需的表达水平、获得活性所期望或所需的多肽修饰(例如糖基化或磷酸化)以及折叠成生物活性分子的方便性。宿主细胞可以是真核的或原核的。例如，在细菌系统中的表达将产生非糖基化产物，而在酵母中的表达将产生糖基化产物。可以使用具有用于基因产物的初级转录物的适当加工(例如糖基化和磷酸化)的细胞机制的真核宿主细胞。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域中所熟知的，并且包括但不限于可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，并且在本领域已知的表达系统中使用的任何细胞系可用于制备本文所述的重组多肽。通常，用包含编码抗原结合多肽构建体的DNA的重组表达载体转化宿主细胞。可以使用的宿主细胞有原核生物、酵母或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括昆虫细胞和已确定的哺乳动物来源的细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括猴肾细胞的COS-7株系(ATCC CRL 1651)(Gluzman等人，1981，Cell 23：175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物如在无血清培养基中生长的Veggie CHO和相关细胞系(Rasmussen等人，1998，Cytotechnology 28：31)、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系和衍生自非洲绿猴肾细胞系CV1(ATCC CCL 70)的CV1/EBNA细胞系(如McMahan等人，1991，EMBO J.10：2821所述)、人胚胎肾细胞(如293、293EBNA或MSR293)、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其它转化的灵长类动物细胞系、正常二倍体细胞、源自初生组织和初代外植体的体外培养的细胞株、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。或者，可以在诸如酵母等低等真核生物或在诸如细菌的原核生物中产生多肽。合适的酵母包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)菌株、假丝酵母(Candida)或能够表达异源多肽的任何酵母菌株。合适的细菌菌株包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或能够表达异源多肽的任何细菌菌株。
如果在酵母或细菌中产生抗原结合多肽构建体，可能需要修饰在其中产生的产物(例如通过合适位点的磷酸化或糖基化)，以获得功能性产物。这种共价连接可以使用已知的化学或酶方法完成。抗原结合多肽构建体还可以通过将多核苷酸组与一个或多个昆虫表达载体中的合适控制序列可操作地连接并使用昆虫表达系统来产生。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以作为试剂盒从例如Invitrogen，San Diego，Calif.，U.S.A购得(MaxBacTM试剂盒)，并且此类方法是本领域中众所周知的，如Summers和Smith，TexasAgricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)以及Luckow和Summers，Bio/Technology 6：47(1988)中所述。Pouwels等人(Cloning Vectors：A LaboratoryManual，Elsevier，New York，1985)描述了适用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的克隆和表达载体。
在某些实施方案中，无细胞蛋白表达系统可用于在不使用活细胞的情况下从多核苷酸组共表达多肽(例如，重链和轻链多肽)。因此，在溶液中提供将DNA转录成RNA并将RNA翻译成蛋白质所需的所有组分(例如核糖体、tRNA、酶、辅因子、氨基酸)以供体外使用。在某些实施方案中，体外表达需要(1)编码重链和轻链多肽的遗传模板(mRNA或DNA)和(2)含有必要的转录和翻译分子机制的反应溶液。在某些实施方案中，细胞提取物大体上提供反应溶液的组分，例如：用于mRNA转录的RNA聚合酶、用于多肽翻译的核糖体、tRNA、氨基酸、酶辅因子、能量源以及实现正确蛋白质折叠所必需的细胞组分。可以使用源自细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、人细胞或其组合的裂解物制备无细胞蛋白表达系统。此类细胞裂解物可以提供翻译所需的酶和结构单元的正确组成和比例。在一些实施方案中，去除细胞膜，仅留下细胞的胞质和细胞器组分。
在本领域中已知几种无细胞蛋白表达系统，如Carlson等人(2012)Biotechnol.Adv.30：1185-1194中所综述。例如，可获得基于原核或真核细胞的无细胞蛋白表达系统。无原核细胞表达系统的实例包括来自大肠杆菌的那些。基于来自例如兔网织红细胞、小麦胚芽和昆虫细胞的提取物，可以获得无真核细胞蛋白表达系统。此类无原核和真核细胞的蛋白表达系统可从诸如Roche、Invitrogen、Qiagen和Novagen的公司购得。本领域技术人员将能够容易地选择将会产生能够彼此配对的多肽(例如，重链和轻链多肽)的合适的无细胞蛋白表达系统。此外，无细胞蛋白表达系统还可以补充有伴侣(例如BiP)和异构酶(例如二硫化物异构酶)以提高IgG折叠的效率。
重链和轻链的共表达
如上所述，本文所述的抗原结合多肽构建体的工程改造的免疫球蛋白重链和轻链可以在哺乳动物细胞中共表达。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链在宿主细胞中共表达。因此，在双特异性抗原结合多肽构建体的情况下，两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链在宿主细胞中共表达。然而，不依赖于使用表达全部四个链的单一克隆或瞬时细胞系来产生双特异性抗原结合多肽构建体的替代方法也是本领域中已知的(Gramer等人(2013)mAbs 5，962；Strop等人(2012)J Mol Biol420，204.)。这些方法依靠的是参与形成双特异性抗体的两对轻链和重链在氧化还原条件下的制备后期臂交换(氧化还原制备)。在这种方法中，H1L1和H2L2异二聚体可以在两种不同的细胞系中表达以独立地产生两种异二聚体。随后，在选择的氧化还原条件下将两种异二聚体混合以实现两个独特重链H1和H2的再缔合，从而形成包含H1L1H2L2的双特异性抗原结合多肽构建体。
尽管优先配对主要是通过将Mab设计组氨基酸修饰引入免疫球蛋白重链和轻链多肽中来驱动，但是正确配对的异二聚体的量可以如实施例中所示通过改变编码每种多肽的多核苷酸彼此之间的比率来进一步优化。
抗原结合多肽构建体的测试
如上所述，抗原结合多肽构建体包含含有H1和L1的第一异二聚体以及含有H2和L2的第二异二聚体，其中L1是λ轻链，L2是κ轻链，并且H1和H2彼此不同。H1、L1、H2和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以及促进H2与L2而非L1优先配对的氨基酸修饰。H1L1异二聚体的第一Fab区和H2L2异二聚体的第二Fab区能够以类似于相应的野生型第一Fab区或野生型第二Fab区的亲和力与抗原结合。H1L1异二聚体的第一Fab区和H2L2异二聚体的第二Fab区还表现出与相应的野生型第一Fab区或野生型第二Fab区相当的热稳定性。
异二聚体对中的每个异二聚体对其各自抗原的亲和力可以如下所述进行测试。异二聚体对中的每个异二聚体的热稳定性也可以如下所述进行测试。
在一个实施方案中，一个重链与两个不同的轻链共表达(在如上所述的LCCA设计组中)，其中重链与两个轻链中的一个优先配对。在另一个实施方案中，两个独特的重链与两个独特的轻链共表达，其中每个重链与其中一个轻链优先配对。
测量优先配对的方法
优先配对的程度可以例如通过使用下文和在实施例中描述的方法进行评估。优先配对可以在LCCA设计组(H1L1L2或H2L1L2)或Mab设计组(H1L1H2L2)的情形下进行评估。
在一个实施方案中，可以使用轻链竞争测定(LCCA)来评估在LCCA设计组情形下的优先配对。2013年10月3日提交的共有专利申请PCT/US2013/063306描述了LCCA的各种实施方案，并且该申请出于所有目的通过引用整体并入本文。该方法允许定量分析共表达蛋白质的混合物中的重链与特定轻链的配对，并且可用于确定一个特定免疫球蛋白重链与两个免疫球蛋白轻链中的任一个在所述重链和轻链共表达时是否选择性缔合。该方法简述如下：在细胞中共表达至少一个重链和两个不同的轻链，其中重链与轻链的比率使得重链为限制性配对反应物。重链和轻链可以被标记以便于检测。可以从细胞中分离分泌的蛋白质，并将与重链结合的免疫球蛋白轻链多肽与其它分泌的蛋白质分离，以产生分离的重链配对部分。然后检测分离重链部分中的每个不同轻链的量，并分析分离重链部分中每个不同轻链的相对量以确定重链选择性地与轻链之一配对的能力。在实施例中提供了关于该方法的一个实施方案的更多详情。
在另一个实施方案中，在Mab设计组的情形下评估优先配对，其中H1、L1、H2和L2共表达。在该实施方案中，H1、L2、H2和L2中的一个或多个可以被标记以便于检测和分析。基于每个种类的分子量的差异，使用LCMS(液相色谱-质谱法)评估所得到的配对的重链和轻链的种类。还可以使用抗原活性分析来量化含有每个轻链的相对异二聚体群体，由此测量的结合程度(相对于对照)将被用于估算各个异二聚体群体。
热稳定性
异二聚体的热稳定性可以根据本领域已知的方法来确定。每个异二聚体的熔融温度表明其热稳定性。异二聚体的熔点可以使用诸如差示扫描量热法的技术来测量(Chen等人(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando等人(1999)Immunol Lett 68：47-52)。或者，异二聚体的热稳定性可以使用圆二色性来测量(Murray等人(2002)J.Chromatogr Sci 40：343-9)。
对抗原的亲和力
异二聚体对其各自抗原的结合亲和力和相互作用的解离速率可以根据本领域中熟知的方法通过竞争性结合测定来测定。竞争性结合测定的一个实例是放射免疫测定，其包括在渐增量的未标记抗原的存在下将标记抗原(例如3H或125I与目标分子(例如，本文所述的异二聚体)一起温育，以及检测与标记配体结合的分子。异二聚体对抗原的亲和力和结合解离速率可以通过Scatchard分析由饱和度数据确定。
本文所述的异二聚体的动力学参数还可以使用本领域中已知的基于表面等离振子共振(SPR)的测定(例如BIAcore动力学分析)来测定。关于基于SPR的技术的综述，参见Mullet等人，2000，Methods 22：77-91；Dong等人，2002，Review in Mol.Biotech.，82：303-23；Fivash等人，1998，Current Opinion in Biotechnology 9：97-101；Rich等人，2000，Current Opinion in Biotechnology 11：54-61。另外，在美国专利号6,373,577、6,289,286、5,322,798、5,341,215、6,268,125中描述的用于测量蛋白质-蛋白质相互作用的任何SPR仪器和基于SPR的方法都涵盖于本发明的方法中。如本领域中已知，FACS也可以用于测量亲和力。
药物组合物
本文还提供了包含本文所述的抗原结合多肽构建体的药物组合物。此类组合物包含治疗有效量的抗原结合多肽构建体和药学上可接受的载剂。在一个具体实施方案中，术语″药学上可接受的″意指由联邦或州政府的监管机构批准，或在美国药典(u.S.Pharmacopeia)或用于动物且更具体地说人的其它公认药典中列出。术语“载剂”是指伴随治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药物载剂可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载剂。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液体载剂，尤其是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。必要时，组合物还可以含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、散剂、持续释放制剂等形式。所述组合物可以用传统粘合剂和载剂(例如甘油三酯)配制成栓剂。口服制剂可以包含标准载剂，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于E.W.Martin的″Remington′s Pharmaceutical Sciences″中。此类组合物将包含治疗有效量的所述化合物(优选呈纯化形式)连同合适量的载剂，以便提供适于施用至患者的形式。制剂应该适合施用方式。
在某些实施方案中，将包含抗原结合多肽构建体的组合物根据常规程序配制成适于静脉内施用至人的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂(例如利诺卡因)以减轻注射部位的疼痛。一般来说，所述成分是单独或混合在一起以单位剂型(例如作为干燥冻干粉末或无水浓缩物)提供于指示活性剂的量的密闭容器(例如安瓿或药囊)中。在组合物要通过输注来施用的情况下，其可以用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶进行分配。在所述组合物通过注射施用的情况下，可以提供含注射用无菌水或盐水的安瓿以便可以在施用前混合各成分。
在某些实施方案中，本文所述的组合物被配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的那些盐，例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐；以及与阳离子形成的那些盐，例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等的盐。
可以通过标准临床技术来确定本文所描述的组合物的将有效治疗、抑制和预防与治疗性蛋白质的异常表达和/或活性相关的疾病或病症的量。另外，可以任选地采用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。待用于所述制剂中的精确剂量还将取决于施用途径和疾病或病症的严重性，并且应该根据从业人员的判断和每位患者的状况来决定。有效剂量是从源自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推得到。
抗原结合多肽构建体的用途
如上所述，本文所述的抗原结合多肽构建体是从亲本抗体获得，其中抗原结合多肽构建体的每个异二聚体对应于亲本抗体之一，并且已经被工程改造来并入促进构成异二聚体的免疫球蛋白重链和轻链的优先配对的氨基酸修饰。因此，本文所述的抗原结合多肽构建体可用于治疗或预防亲本抗体或亲本抗体的组合所用于的相同疾病、病症或感染。
在另一个实施方案中，本文所述的抗原结合多肽构建体还可以与本领域中已知的其它治疗剂组合用于治疗或预防癌症、自身免疫疾病、炎性病症或感染性疾病。在一个具体实施方案中，本文所述的抗原结合多肽构建体可以与单克隆或嵌合抗体、淋巴因子或造血生长因子(如例如IL-2、IL-3和IL-7)组合使用，以例如用于增加与分子相互作用的效应细胞的数量或活性，并增强免疫反应。本文所述的抗原结合多肽构建体还可以与用于治疗疾病、病症或感染的一种或多种药物(如例如抗癌剂、抗炎剂或抗病毒剂)组合使用。
使用Mab设计组文库产生双特异性抗体
在一个实施方案中，可以使用本文所述的Mab设计组来产生双特异性抗原结合多肽构建体。本文所述的Mab设计组可以以Mab设计组文库的形式使用，其中Mab设计组文库包含在促进优先配对以形成双特异性抗原结合多肽构建体方面显示效用的Mab设计组。在一个实施方案中，Mab设计组文库由表4A和表4B中所包括的Mab设计组表示。在一个实施方案中，Mab设计组文库由表10-A1至10-A12和表10-B1至10-B10中的一个或多个中的Mab设计组表示。在另一个实施方案中，Mab设计组文库由表10-A1至10-A12中的一个或多个表示。在一个实施方案中，Mab设计组文库由表10-B1、10-B2、10-B3、10-B4、10-B6、10-B8和10-B10中的一个或多个表示。如下所述，可以使用Mab设计组文库从两个亲本抗体(即Mab1和Mab2)开始产生抗原结合多肽构建体。为了说明起见，Mab1包含λFab并且包含免疫球蛋白重链多肽H1和免疫球蛋白轻链多肽L1，而Mab2包含κFab并且包含免疫球蛋白重链多肽H2和免疫球蛋白轻链多肽L2。
将Mab设计组文库的Mab设计组氨基酸修饰(H1L1H2L2)引入Mab1的免疫球蛋白重链和轻链(H1和L2)以及Mab2的免疫球蛋白重链和轻链(H2和L2)中。然后，共表达H1、L1、H2和L2，并测定正确配对的双特异性抗原结合多肽构建体的量。可以单独测试或筛选Mab设计组文库中的一个或多个Mab设计组，以确定哪个设计组提供所需量的双特异性抗原结合多肽构建体。如本文所述，可以进一步测试双特异性抗原结合多肽构建体的每个异二聚体，以评估每个异二聚体与抗原结合的能力或评估其热稳定性。可以评估的其它性质包括双特异性抗原结合多肽构建体相较于亲本抗体或亲本抗体的Fab区的溶解度、聚集度、结合(kon)和解离(koff)速率和耐受暴露于酸、碱、氧化作用、冻融循环、搅动、压力等的能力。后几种性质可以受目标抗体的互补决定区(CDR)影响，因此可以针对所产生的每个双特异性抗原结合多肽构建体进行测试。
在一些实施方案中，通过LCMS评估正确配对的双特异性抗原结合多肽构建体的量。在一些实施方案中，通过基于电荷的分离技术如毛细管等电聚焦(cIEF)技术或色谱技术来评估正确配对的双特异性抗原结合多肽构建体的量。图9示意性地示出了使用Mab设计组文库从Mab1和Mab2制备双特异性抗原结合多肽构建体的程序。
在一个实施方案中，Mab设计组文库被存储在计算机可读存储介质上以便于使用Mab设计组文库设计双特异性抗原结合多肽构建体。
计算机执行
在一个实施方案中，计算机包括耦接到芯片组的至少一个处理器。存储器、存储设备、键盘、图形适配器、定点设备和网络适配器也耦接到芯片组。显示器耦接到图形适配器。在一个实施方案中，芯片组的功能由存储控制器中心和I/O控制器中心提供。在另一个实施方案中，存储器直接耦接到处理器而不是芯片组。
存储设备是可以保存数据的任何设备，例如硬盘驱动器、光盘只读存储器(CD-ROM)、DVD或固态存储器设备。存储器保存由处理器使用的指令和数据。定点设备可以是鼠标、轨迹球或其它类型的定点设备，并且与键盘组合使用以将数据输入计算机系统中。图形适配器在显示器上显示图像和其它信息。网络适配器将计算机系统耦接至局域或广域网络。
如本领域中已知，计算机可以具有与先前描述的组件不同的和/或除这些组件以外的其它组件。另外，计算机可以缺少某些组件。而且，存储设备可以是本地的和/或远离计算机的(例如集成在存储区域网络(SAN)中)。
如本领域中已知，计算机适于执行用于提供本文所述的功能的计算机程序模块。如本文中所用，术语“模块”是指用于提供指定功能的计算机程序逻辑。因此，模块可以于硬件、固件和/或软件中实施。在一个实施方案中，程序模块被存储在存储设备上，载入存储器中，并由处理器执行。
应该理解的是，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且本领域技术人员将明了根据其所作的各种修改或变更，并且这些修改或变更将包括在本申请的精神和范围内以及随附权利要求的范围内。
实施例
以下是制备和使用本文所述的抗原结合多肽构建体的具体实施方案的实施例。这些实施例只是为了说明目的而提供并且无意以任何方式限制本公开的范围。已经做出努力来确保关于所用数字(例如，量、温度等)的精确度，但当然应该允许存在一些实验误差和偏差。
除非另有说明，否则本文所述的构建体和方法可以使用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法来制备和实施。这些技术在文献中有充分的解释。参见例如T.E.Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company，1993)；A.L.Lehninger，Biochemistry(Worth Publishers，Inc.，现行版)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编辑，Academic Press，Inc.)；Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton，Pennsylvania：MackPublishing Company，1990)；Carey和Sundberg，Advanced Organic Chemistry，第3版(Plenum Press)，A和B卷(1992)。
实施例
实施例1：Fab界面的分子建模和计算机引导的工程改造
使用结构引导和计算分子建模引导方法来产生用于制备双特异性抗体的κ-λ(K-L)设计文库，其中一个Fab具有κ轻链，且另一个Fab具有λ轻链(即κ-λ系统或K-L系统)。K-L设计文库包含在Fab的重链和轻链中具有氨基酸修饰的设计，所述氨基酸修饰在这些重链和轻链共表达时促进优先形成所需的双特异性抗体。K-L设计文库利用双特异性抗体中κ和λ轻链之间的内在差异，因此针对κ-λ系统进行了优化。K-L设计文库是通过研究代表性Fab的结构而产生，其中D3H44(抗组织因子抗体)作为含有κ轻链的代表性Fab(κFab)，而CAT-2200(抗IL-17A抗体)作为包含λ轻链的代表性Fab(λFab)，但该文库可以在其它双特异性K-L系统抗体或其片段的情形下用来鉴定在受关注抗体中表现出期望的配对特异性的设计。
代表性Fab基于表1中所示的标准进行选择。这些标准包括Fab是人的或人源化的、具有常用的VH和VL亚群并且包含最少的构架区突变。此外，进行具有可用的非冗余(90％序列同一性阈值)κ和λ结构的成对3D叠加(结构从RSCB PDB获得，RSCB PDB是由Rutgers大学(Camden，NJ)和圣地亚哥加利福尼亚大学(San Diego，CA)维护的数据库，参见互联网www.rcsb.org)。结合表1中描述的其它参数，使用VH-VL或CH1-CL的低H-L交叉结构域RMSD(均方根偏差)来选择κ和λ系统中的每一个的代表性结构。选择D3H44(PDB ID 1JPT)和CAT-2200(PDB ID 2VXS)作为代表性Fab后，使用双管齐下法(two-pronged approach)进行这些Fab界面的计算机结构分析以鉴定和理解对重链和轻链之间相互作用重要的残基。
首先，通过已知抗体的序列和结构比对，对Fab可变和恒定界面上的序列保守性进行全局分析。将来自各种抗体亚群的恒定结构域和可变结构域序列与D3H44和抗HER2抗体帕妥珠单抗(均含有κ轻链)和CAT-2200(含有λ轻链)的序列的比对示于图1中。图1A和图1E分别描绘比较代表性人VH种系亚群与D3H44/帕妥珠单抗和CAT-2200的比对。图1B描绘了比较D3H44/帕妥珠单抗与代表性人κVL种系亚群的比对。图1C和图1G分别描绘了比较人CH1等位基因序列与D3H44/帕妥珠单抗和CAT-2200的序列的比对。图1D描绘了比较D3H44/帕妥珠单抗与人κ等位基因序列的比对。图1F描绘了比较CAT-2200与代表性人λVL种系亚群的比对。图1H描绘了比较CAT-2200与人λ等位基因序列的比对。该分析揭示帕妥珠单抗和D3H44显示与κ恒定结构域和可变结构域种系的高度序列保守性，而CAT-2200显示与λ恒定结构域和可变结构域种系的高度序列保守性。这些比对还例示了重链和轻链的恒定结构域中的更高程度的保守性，使得恒定结构域界面中的设计更可能转移到其它抗体。
第二种方法涉及使用如图2所示的许多分子建模工具(例如ResidueContactsTM和AffinityDecompositionTM)分析D3H44和CAT-2200晶体结构界面。为了提高向其它抗体或片段的可转移性，该分析集中在序列保守性更高的恒定区(见图1)。这些分析用于确定代表性κFab(D3H44)和λFab(CAT-2200)结构之间热点位置(关键界面残基)的差异，如表2中所示。在CH1-CL(κ)和CH1-CL(λ)结构之间的恒定结构域中存在明显的构象差异。在CH1结构域上叠加可用的Fab结构表明CL(κ)结构采用非常相似的构象并形成紧密簇。然而，CL(λ)构象倾向于存在于两个不同的簇中：一个更接近κ取向(κ样簇)和另一个更不一致的取向(λ簇)。通过该分析，D3H44代表典型的κ结构，而CAT-2200代表典型的λ结构(λ簇)。图3使用D3H44和CAT-2200作为代表性结构例示了典型的恒定结构域κ-λ构象差异。这些差异似乎主要源于轻链恒定结构域相对于CH1结构域的刚体运动，这改变了κ恒定结构域中H-L界面的性质(当与λ系统相比时)。所确定的热点差异(表2)以及上述构象差异(图3)用作针对包含κFab和λFab的双特异性系统的H-L配对设计的工程改造的起点。表3A和表3B中提供了根据Kabat进行的亲本D3H44和CAT-2200序列中的氨基酸编号。
接下来，通过计算机模拟诱变和利用ZymepackTM堆积/建模，模拟和确定热点位置以及与3D晶体结构中受关注的热点相邻的位置处的潜在突变。ZymepackTM是一个软件套件，其在存在输入结构和一组突变的情况下将根据所提供的突变改变输入结构中的残基类型，并生成一个近似于突变蛋白的物理结构的新结构。此外，ZymepackTM通过计算各种定量指标来评估突变蛋白的特性。这些指标包括空间和静电互补性的度量，其可以与突变蛋白的稳定性、结合亲和力或异二聚体特异性相关。
通过利用界面差异，引入突变以促进所需的或优选的多肽链或异二聚体的选择性配对，同时阻碍形成不正确配对或错配的多肽链或异二聚体。例如，为了制备具有一个κFab和一个λFab的双特异性抗体，需要四个多肽链。κFab包含重链1(H1)和κ轻链1(L1)，而λFab包含重链2(H2)和λ轻链2(L2)。在这种情况下，所需的H-L对将是H1L1和H2L2，而不正确的配对将是H1L2和H2L1。请注意，此处的多肽链命名/编号是任意的。因此，确定了有利于配对的CH1-CL(κ)界面(H1L1)而非错配的CH1-CL(λ)界面(H1L2)的突变以及有利于配对的CH1-CL(λ)界面(H2L2)而非错配的CH1-CL(κ)界面(H2L1)的突变以在恒定结构域中产生κFab-λFab定制设计。使用包括ZymepackTM的计算方法，对空间互补性进行建模并且还基于能量因素如范德华分子堆积、空化效应和疏水基团的紧密接触进行计算。类似地，基于电荷之间的库仑相互作用、氢键和去溶剂效应，对静电相互作用能量进行建模和评估。模拟了优选的重链和轻链对模型H1L1和H2L2以及通过引入目标突变而获得的错配对模型H1L2和H2L1以计算相对空间和静电分数。这允许确定特定的突变组是否导致有利的能量，即优选的重链-轻链对相对于错配对具有更高的空间和/或静电互补性。计算出的空间和静电能量是与轻链和重链配对相关的自由能的组成部分。因此，更高的空间和静电互补性指示与所需对的配对相对于错配对的配对相关的更大的自由能变化。相对于错配对的空间罚分和/或静电排斥，更高的空间和/或静电互补性导致所需的重链和轻链的优先(选择性)配对。
实施例2：设计的选择和描述
当H-L异二聚体对中的一个含有κ轻链而另一个含有λ轻链时，使用实施例1中描述的方法来设计展现选择性或优先配对的重链-轻链异二聚体对(即H1L1和H2L2)。这些异二聚体被成对设计，称为“Mab设计”或“Mab设计组”，并且包括位于H1、L1、H2和L2链上的促进优先配对的一组氨基酸取代。Mab设计组最初像“LCCA设计”一样接受测试，其中Mab设计组的一个重链与Mab设计组的两个轻链(一个κ和一个λ)共表达，以评估相对配对。除非另有说明，否则使用如Kabat和Wu，1991；Kabat等人，Sequences of proteins of immunologicalinterest，第5版-US Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242，第647页(1991)中所述的Kabat编号系统，参考表3A和表3B(针对帕妥珠单抗和CAT-2200 Fab)确定所有实施例中描述的氨基酸取代。然而，作为参考，表22A、22B和22C提供了使用适用的IMGT、1JPT和EU编号系统确定重链、κ轻链和λ轻链中的选定氨基酸位置。
将Mab设计填充到D3H44和CAT-2200的分子模型上，并且如实施例1所述计算指标。然后，基于风险(将对稳定性以及免疫原性的影响降至最低)和影响(考虑所建议的驱动配对特异性的强度)选择最佳设计。然后通过轻链竞争测定(LCCA)测试最佳设计，以通过实验确定其配对特异性(参见实施例4)。虽然使用D3H44和CAT-2200作为代表性Fab鉴定了Mab设计，但是使用帕妥珠单抗作为κFab和CAT-2200作为λFab(帕妥珠单抗-CAT-2200 K-L系统)在K-L系统中测试了Mab设计。如图1C和图1D所示，D3H44和帕妥珠单抗在恒定结构域中具有相同的序列，从而允许两个系统之间的无缝互换。这些Mab设计被称为K-L设计。
在帕妥珠单抗/CAT-2200 K-L系统中还测试了第二组设计。这些设计是使用代表性设计提出的，所述代表性设计反映了来自国际专利申请号PCT/CA2013/050914(国际专利公开号WO2014/082179)的表30中描述的κ-κ(K-K)设计文库的设计作为起点的多样性。这些代表性K-K衍生的设计包括一个设计子集，这些设计或者在可能的情况下不加修改地移植到K-L系统中，或者通过视需要修饰氨基酸残基以考虑到κ和λ轻链之间的序列和结构差异来适应于κ-λ系统。这两种代表性的K-K衍生的设计都被称为K-K衍生的K-L设计。
如实施例4中所述，K-L设计和K-K衍生的K-L设计的配对特异性作为LCCA设计在κ-λ系统中通过LCCA进行实验评估。
实施例3：制备编码帕妥珠单抗IgG重链、帕妥珠单抗IgG轻链、CAT-2200 IgG重链和CAT-2200 IgG轻链的Fab构建体
如下制备抗HER2抗体帕妥珠单抗和抗IL17抗体CAT-2200的野生型Fab重链和轻链。将帕妥珠单抗Fab轻链(GenBank登录号HC359025.1，SEQ ID NO：2)和重链(GenBank登录号HC359024.1，SEQ ID NO：1)的蛋白质序列反向翻译成DNA，优化密码子以用于哺乳动物表达，并合成基因(分别为SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：7)。从PDB条目2VXS获取CAT-2200 Fab轻链(2VXS链L，SEQ ID NO：4)和重链(2VXS链H，SEQ ID NO：3)的蛋白质序列，反向翻译成DNA，优化密码子以用于哺乳动物表达，并合成基因(分别为SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：9)。这些抗体重链和轻链的多肽和DNA序列示于表3C中。
将由5′-EcoRI切割位点-HLA-A信号肽-HA或FLAG标签-轻链Ig克隆-‘TGA或TAA终止子′-BamH1切割位点-3′组成的轻链载体插入物连接到pTT5载体(Durocher Y等人，Nucl.Acids Res.2002；30，No.2 e9)中以产生轻链表达载体。对得到的轻链表达载体进行测序以确认编码DNA的正确阅读框和序列。同样地，由5′-EcoR1限制性位点-HLA-A信号肽-重链克隆(终止于T238；参见表3A)-ABD2-His6标签-TGA终止子-BamH1切割位点-3′组成的重链载体插入物连接到pTT5载体(ABD2＝白蛋白结合结构域蛋白的两个串联拷贝)中以产生重链表达载体。同样对得到的重链表达载体进行测序以确认编码DNA的正确阅读框和序列。通过基因合成或通过定点诱变产生含有Mab设计组的氨基酸取代的各种帕妥珠单抗或CAT-2200 Fab构建体(Braman J，Papworth C和Greener A.，Methods Mol.Biol.(1996)57：31-44)。
为了便于通过竞争测定-SPR筛选(LCCA)评估优先配对，重链和轻链分别在C端和N端被标记。ABD2-His6重链标签允许H-L复合物被捕获在抗His标签SPR芯片表面上，而FLAG和HA轻链标签允许对相对的L1和L2群体进行定量。
实施例4：通过轻链竞争测定(LCCA)评估设计的Fab异二聚体的优先配对
如实施例3中所述制备编码包含氨基酸修饰的呈Fab形式的CAT-2200和帕妥珠单抗IgG重链和轻链的构建体。使用轻链竞争测定(LCCA)测定所述构建体在LCCA设计组(H1、L1、L2或H2、L2、L1)的情况下优先配对以形成所需H-L异二聚体的能力。
LCCA量化一个重链对至少两个独特轻链(一个κ轻链和一个λ轻链)的相对配对，并且可以总结如下。为了测定λFab的配对特异性，将一个CAT-2200重链Fab构建体与一个CAT-2200轻链Fab构建体(用于配对的Fab产物H1L1)和一个帕妥珠单抗轻链Fab构建体(用于错配的Fab产物H1L2)共表达，并且由竞争测定-SPR筛选重复测定相对轻链配对特异性(H1L1:H1L2)两次。相反地，为了测定κFab的配对特异性，将一个帕妥珠单抗重链Fab构建体与一个帕妥珠单抗轻链Fab构建体(用于配对的Fab产物H2L2)和一个CAT-2200轻链Fab构建体(用于错配的Fab产物H2L1)共表达，并且由竞争测定-SPR筛选重复测定相对轻链配对特异性(H2L2:H2L1)两次。
通过以1∶1∶1(重量比)比率的H1∶L1∶L2或H2∶L2∶L1(其中重链为限制量)进行重链和轻链的相伴表达来进行LCCA测定。所形成的每个异二聚体(即H1L1和H1L2或H2L2和H2L1)的量如下所述进行测定：经由his标签下拉(pull-down)将重链结合到SPR芯片上，然后使用对HA和FLAG特异的标签的抗体来检测每个轻链标签(HA或FLAG)的量。随后，通过轻链竞争测定验证来确认选择的异二聚体命中，在验证中再次检查L1∶L2DNA比率为1∶1，同时保持重链的限制量。对于这些特定的κ-λ系统组合，轻链标签可以对野生型LCCA配对产生影响，导致与预期的中性50％∶50％比率有所偏差。出于这个原因，通过将帕妥珠单抗轻链与HA标签以及CAT-2200轻链与FLAG标签融合来选择与中性比率的偏差量最小的配置。代表该测定的设计的示意图示于图4中。图5描绘了如何标记重链和轻链以及如何评估优先配对。下面提供了LCCA的实验细节。
转染方法
如实施例3中所述制备的包含一个重链构建体和两个轻链构建体的LCCA设计如下被转染到CHO-3E7细胞中。在补充有4mM谷氨酰胺和0.1％KoliphorP188(Sigma#K4894)的FreeStyleTM F17培养基(Invitrogen目录号A-1383501)中在37℃下以1.7-2×106个细胞/ml的密度培养CHO-3E7细胞。使用PEI-pro(Polyplus转染号115-375)，以1∶2.5的DNA∶PEI比用总共2μg DNA转染2ml总体积。使用333ng的每条重链和每条轻链(即H1∶L1∶L2或H2∶L2∶L1＝1∶1∶1比率)、300ng AKTdd pTT22(含有组成性活性蛋白激酶B突变体的载体)和700ngssDNA(鲑鱼精子DNA)进行所有转染。加入DNA-PEI混合物24小时后，向细胞中添加0.5mM丙戊酸(最终浓度)和1％(重量/体积)胰蛋白胨(最终浓度)，然后将细胞转移至32℃下。在第7天，通过非还原型SDS-PAGE分析测试上清液中的表达，然后通过考马斯亮蓝染色以显现条带。
竞争测定SPR方法
使用位于每条轻链的N端的独特表位标签的SPR读出来评估LCCA设计中的重链与两个轻链中的每一个优先配对的程度。CAT-2200LC构建体含有FLAG标签，并且帕妥珠单抗LC构建体含有HA标签。
表面等离振子共振(SPR)物料。GLC传感芯片、Biorad ProteOn胺偶联试剂盒(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺(sNHS)和乙醇胺)和10mM乙酸钠缓冲液购自Bio-Rad Laboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON)。4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲剂、乙二胺四乙酸(EDTA)和NaCl购自Sigma-Aldrich(Oakville，ON)。10％Tween 20溶液购自Teknova(Hollister，CA)。
SPR生物传感器测定。所有表面等离振子共振测定均使用BioRad ProteOn XPR36仪器(Bio-Rad Laboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON))和PBST运行缓冲液(含有0.05％Tween20的PBS(Teknova Inc))在25℃的温度下进行。使用GLC传感芯片产生抗pentaHisTM捕获表面，所述传感芯片通过在分析物(水平)方向上以100μL/min注射标准BioRadsNHS/EDC溶液的1∶5稀释液140秒来激活。激活后，立即在分析物(垂直)方向上以25μL/min的流速注射抗penta HisTM抗体(Qiagen Inc.)在10mM NaOAc(pH 4.5)中的25μg/mL溶液，直至约3000个共振单位(RU)被固定。通过在分析物方向上以100μL/min注射1M乙醇胺140秒使剩余的活性基团淬灭，并且这也确保创建了用于空白参考的mock激活中间点(interspot)。
筛选与抗FLAG(Sigma Inc.)和抗HA(Roche Inc.)单克隆抗体结合的异二聚体分两个步骤进行：沿配体方向将异二聚体间接捕获到抗penta HisTM表面上，然后在分析物方向上进行抗FLAG和抗HA注射。首先，在配体方向上以100μL/min注射一次PBST 30秒以稳定基线。对于每个异二聚体捕获，将细胞培养基中未纯化的异二聚体在PBST中稀释至4％。以25μL/min的流速将1至5个异二聚体或对照(即含有100％HA-轻链或100％FLAG-轻链的对照)同时注射到各个配体通道中240秒，导致将约300至400个RU固定至抗penta His表面上的饱和异二聚体捕获。如果需要，第一个配体通道留空以用作空白对照。在该异二聚体捕获步骤之后，紧接着在分析物方向上进行两次缓冲液注射以稳定基线，然后将5nM抗FLAG和5nM抗HA各自以50μL/min重复注射120秒两次(具有180秒的解离阶段)，产生一组具有针对每个捕获的异二聚体的缓冲液参考的结合传感图。异二聚体通过100μL/min 0.85％磷酸的18秒脉冲再生18秒以准备用于下一注射循环的抗penta HisTM表面。对齐传感图并使用缓冲液空白注射和中间点进行双重参考，并使用ProteOn Manager软件v3.0分析得到的传感图。
数据分析和LCCA指标的描述
针对以H1L1H2L2形式存在的每个设计的优先配对评估通过两个互补的LCCA设计组(一个用于H1L1L2组合，且另一个用于H2L1L2组合)来进行。每个LCCA设计组都用“唯一标识符”(例如，10629或10695)表示。因此，每个Mab设计组(H1L1H2L2)由两个LCCA构成部分(例如10629-10695)的LCCA设计组编号确定。
在LCCA中测试每个Mab设计组的LCCA设计组(H1L1L2或H2L1L2)，并根据以下纳入标准确定目标设计组。如图6所示，为了被视为目标设计，设计必须包含至少一个位于中性区上方的阳性LCCA结果(大于60∶40的正确配对∶错配比)，而另一个互补LCCA必须高于中性区的下限(40∶60的正确配对∶错配比)。中性区被定义为使用H1-L1∶H1-L2和H2-L2∶H2-L1的归一化中值确定的40％∶60％和60％∶40％正确配对∶错配比之间的区域。例如，图6中的方案A和B代表通过纳入标准的设计。方案B被纳入的原因在于：H2L2:H2L1 LCCA高于中性区，而H1L1:H1L2 LCCA位于中性区内(不低于中性区)。方案C代表一种设计，其中两个LCCA结果均为阳性，但都不在中性区上方，因此未被纳入。方案D和E代表因为至少一个LCCA结果低于中性区，即使另一个LCCA高于中性区而被过滤除的设计(参见方案D)。表4A(K-L设计)和4B(K-K衍生的K-L设计)列出了满足这些标准的Mab设计组，而表5A和5B示出了这些设计的LCCA结果。在表4A和4B以及列出LCCA设计组或Mab设计组的氨基酸取代的所有后续表格中，表中不存在取代或“-”指示多肽链不包括促进优先配对的氨基酸取代。
每个LCCA设计组的性能用两个标量值ln(r1/f1)或ln(r2/f2)来描述，其中r1和r2分别对应于比率H1L1:H1L2和H2L2:H2L1的中值，并且f1和f2对应于比率H1L1:H1L2和H2L2:H2L1的相应中值。归一化的标量值是通过从设计中减去WT(野生型)系统的贡献而产生：ln(r1/f1)设计-ln(r1/f1)WT或ln(r2/f2)设计-ln(r2/f2)WT。对于野生型CAT-2200(HC)与CAT-2200(LC-FLAG)加帕妥珠单抗(LC-HA)的竞争结合，ln(r1/f1)WT＝-0.48。对于野生型帕妥珠单抗(HC)与帕妥珠单抗(LC-HA)加CAT-2200(LC-FLAG)的竞争结合，ln(r2/f2)WT＝0.66。此步骤有效地去除任何现有的野生型配对偏倚并使特异性相对于中性50％:50％L1:L2野生型系统归一化。这些值记录于表5A和5B的第2列和第5列中。
另外，归一化的标量值还被转换回H1L1:H1L2和H2L2:H2L1的纯归一化中值比率。这种转换将LCCA比率有效地归一化为100％，因为对于一些设计的Fab，观察到H1L1和H1L2或H2L2和H2L1的总量显著不同于100％。据信这种总轻链百分比的差异部分是由于在最初将异二聚体捕获到SPR芯片上期间发生了变化的非特异性结合。这些值记录于表5A和5B的第4列和第7列中。
此外，示出了设计的每个归一化LCCA(H1L1:H1L2和H2L2:H2L1实验)的标量范围以及正确配对的Fab异二聚体与错配Fab异二聚体的归一化比率的范围(该范围分别与L1和L2在归一化比率中的百分比相同)。对于由单次测量报告的结果，范围值被标记为NA(不适用)。这些值记录于表5A和5B的第3列和第6列中。
作为参考，表23提供配对：错配异二聚体％与相应的LCCA标量值之间的对应关系。
结果
在Mab设计组的情形下，LCCA结果示于表5A和5B中。表5A提供了与实施例2中描述的K-L设计有关的LCCA数据，而表5B提供了与也描述于实施例2中的K-K衍生的K-L设计有关的LCCA数据。应注意，所有LCCA实验均对含有位于恒定结构域(H/C233-L/C214，Kabat编号)中的链间Fab二硫键的构建体进行。
表4A列出了符合纳入标准的231个K-L设计。与这些设计有关的LCCA数据示于表5A中。表4B列出了符合纳入标准的44个K-K衍生的K-L设计，且表5B示出了与这些设计相关的LCCA数据。保持来自上述PCT申请号PCT/CA2013/050914中的表30的原始K-K设计文库与新κ-λ系统之间的100％同一性(即未加修改地移植)的设计在表4B中用星号(*)标示。表4B中的大部分设计仅在恒定区中具有氨基酸修饰，少数设计还在可变区中包含氨基酸修饰。提出这些设计以进一步提高配对特异性，同时也有利于转移至其它抗体系统。
设计强度可以被定义为特定设计的两个LCCA标量值之和。通过比较K-K衍生的K-L设计与K-L设计的设计强度，显然那些专门针对K-L系统定制的设计倾向于显示比转移至K-L系统中的K-K设计更好的配对特异性，如图7中所汇总。K-K衍生的K-L设计的中值设计强度为1.86，最大设计强度为3.53。K-L设计的中值设计强度为2.69，最大设计强度为5.23。
实施例5：扩大设计的Fab异二聚体用于生物物理表征
扩大如唯一标识符组(表4A和4B)中所示的正确配对的异二聚体H1L1或H2L2(通常扩大至20ml)并如下进行纯化以测试热稳定性和抗原结合。对于这些实验，在不含ABD2标签的情况下表达Fab的重链，而轻链与LCCA中所用的相同HA或FLAG标签一起表达。每个异二聚体的重链和轻链在CHO-3E7细胞的20ml培养物中表达。在补充有4mM谷氨酰胺和0.1％Koliphor P188(Sigma#K4894)的FreeStyleTM F17培养基(Invitrogen目录号A-1383501)中在37℃下以1.7-2×106个细胞/ml的密度培养CHO-3E7细胞。使用PEI-pro(Polyplus目录号115-375)，以1:2.5的DNA:PEI比率用总共20μg DNA转染20ml总体积。加入DNA-PEI混合物24小时后，向细胞中添加0.5mM丙戊酸(最终浓度)和1％(重量/体积)胰蛋白胨(最终浓度)，然后将细胞转移至32℃下。
转染后7天使细胞离心，并且如下所述，在4℃下，通过亲和捕获使用IgG-CH1CaptureSelectTM(Life TechnologiesTM，目录号：194-320-005)从上清液中纯化提取异二聚体。在平衡缓冲液(不含钙、镁和酚红的杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS；HyCloneTM#SH30028.02))中将上清液稀释至20-25％细胞培养上清液，然后与IgG-CH1CaptureSelectTM(也预先用平衡缓冲液平衡)一起伴随混合培养16小时。然后通过离心收集树脂，转移至96孔板中，并用平衡缓冲液洗涤三次。结合的样品用1至4倍床体积的洗脱缓冲液(100mM甘氨酸(pH 2.6))洗脱。通过离心将洗脱的样品收集到96孔UV透明接收板中，其中每个孔含有中和缓冲液：10％洗脱体积的1M Tris pH9.0。
纯化后，通过使用Caliper LabChip GXII(Perkin Elmer#760499)的非还原型高通量蛋白表达测定来评估异二聚体表达。程序按照HT Protein Express LabChip用户指南第2版LabChip GXII用户手册进行，并作出以下修改。将2μl或5μl异二聚体样品(浓度范围5-2000ng/μl)连同7μl HT Protein Express样品缓冲液(Perkin Elmer#760328)一起添加到96孔板(BioRad#HSP9601)的分散孔中。然后使异二聚体样品在70℃下变性15分钟。使用HT Protein Express Chip(Perkin Elmer#760499)和Ab-200测定设置操作LabChip仪器。使用后，用MilliQ水清洗芯片并储存在4℃下。
包含Mab设计组修饰对蛋白质表达没有显著影响。针对含有设计修饰的CAT-2200Fab获得的表达水平为0.45mg/20mL表达(SD为0.16mg)，而野生型Fab为0.64mg/20mL表达(SD为0.1mg)。具有设计修饰的帕妥珠单抗Fab的表达水平为0.39mg/20mL表达(SD为0.14mg)，而野生型Fab为0.4mg/20mL表达(SD为0.03mg)。Caliper分析显示与野生型Fab相当的纯度水平。
实施例6：设计的Fab异二聚体的抗原亲和力测量
评估CAT-2200 Fab异二聚体结合IL-17A和帕妥珠单抗Fab结合HER2-ECD的能力，以确定氨基酸取代是否对异二聚体结合抗原的能力有任何影响。如实施例5中所述制备Fab异二聚体。如下通过SPR测定每个Fab异二聚体对其抗原的亲和力。
SPR物料。GLC传感芯片、Biorad ProteOn胺偶联试剂盒(EDC、sNHS和乙醇胺)和10mM乙酸钠缓冲液购自Bio-Rad Laboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON)。含有0.05％Tween20的PBS运行缓冲液(PBST)购自Teknoca Inc.(Hollister，CA)。重组HER2蛋白购自eBioscience(San Diego，CA)。山羊多克隆抗人Fc抗体购自Jackson Immuno ResearchLaboratories Inc.(West Grove，PA)。重组人IL-17A购自R&D Systems(Mineapolis，MN)。
CAT-2200：Il-17A亲和力测定。所有表面等离振子共振测定均使用BioRadProteOn XPR36仪器(Bio-Rad Laboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON))和PBST运行缓冲液在25℃的温度下进行。使用GLC传感芯片产生IL-17A表面，所述传感芯片通过在配体(垂直)方向上以100μL/min注射标准BioRad sNHS/EDC溶液的1∶10稀释液140秒来激活。激活后，立即在配体(垂直)方向上以25μL/min的流速注射IL-17A在10mM NaOAc(pH 4.5)中的2μg/mL溶液，直至约50个共振单位(RU)被固定。通过同样在配体方向上以100μL/min注射1M乙醇胺140秒使剩余的活性基团淬灭。
通过沿分析物(水平)方向注射纯化的CAT-2200 Fab来筛选结合IL-17A的设计Fab。首先，在分析物(水平)方向上以100μL/min进行两次缓冲液注射30秒以稳定基线。以50μL/min将5种浓度的三倍稀释系列的每个CAT-2200设计Fab(60nM、20nM、6.7nM、2.2nM、0.74nM)与空白缓冲液对照同时注射120秒(具有15分钟的解离阶段)，产生一组具有缓冲液参考的结合传感图。解离SPR表面上的CAT-2200：IL-17A复合物，并且通过0.85％磷酸的两次持续18秒的100μL/min脉冲使IL-17A表面再生，以准备进行下一注射循环。对齐传感图并使用缓冲液空白注射和中间点进行双重参考，并使用ProteOn Manager软件v3.1分析得到的传感图。将经过双重参考的传感图拟合至Langmuir结合模型。
帕妥珠单抗：HER2亲和力测定。所有表面等离振子共振测定均使用BioRadProteOn XPR36仪器(Bio-Rad Laboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON))和PBST运行缓冲液在25℃的温度下进行。使用GLC传感芯片产生抗penta-HisTM抗体(Qiagen)捕获表面，所述传感芯片通过沿分析物(水平)方向以100μL/min注射标准BioRad sNHS/EDC溶液的1∶10稀释液140秒来激活。激活后，立即在配体(垂直)方向上以25μL/min的流速注射抗penta-His抗体在10mM NaOAc(pH 4.5)中的10μg/mL溶液，直至约3000个共振单位(RU)被固定。通过在分析物方向上以100μL/min注射1M乙醇胺140秒使剩余的活性基团淬灭，以确保创建了用于空白参考的mock激活的中间点。
筛选与HER2结合的设计Fab分两个步骤进行：沿配体方向将设计的Fab间接捕获到抗penta-HisTM抗体表面上，随后沿分析物方向同时注射5种浓度的纯化HER2抗原和用于双重参考的一个缓冲液空白。首先，沿配体方向以100μL/min进行一次缓冲液注射30秒以稳定基线。对于每个设计Fab的捕获，将设计的Fab在PBST中稀释至2μg/mL。将1至5个设计Fab或对照以25μL/min的流速同时注入各个配体通道中240秒。这导致在抗人Fc表面上捕获约400至600个RU。如果需要，第一个配体通道留空用作空白对照。在该捕获步骤之后，紧接着沿分析物方向进行两次缓冲液注射以稳定基线，然后以50μL/min同时注射100nM、33.3nM、11.1nM、3.7nM和0.41nM Her2以及缓冲液空白120秒(具有1200秒的解离阶段)。捕获抗体的表面通过0.85％磷酸的持续18秒的100μl/min脉冲再生以准备下一注射循环。对齐传感图并使用缓冲液空白注射和中间点进行双重参考，并使用ProteOn Manager软件v3.1分析得到的传感图。将双重参考的传感图拟合至1∶1结合模型。
结果。在设计对的情形下，设计的Fab异二聚体样品的抗原亲和力(KD)值报告于表6A(K-L设计)和表6B(K-K衍生的K-L设计)中。H1L1和H2L2 Fab的KD值包括在第2列和第4列(分别为H1L1CAT-2200 Fab异二聚体和H2L2帕妥珠单抗Fab异二聚体的KD)中，以及第3列和第5列(H1L1或H2L2 Fab异二聚体相较于其各自的野生型的KD变化)中。仅对显示至少100RU的Fab异二聚体捕获的Fab异二聚体样品测定KD值。用来与设计的异二聚体作比较的结合IL-17A的野生型CAT-2200的参考KD值是0.273nM。该值是基于轻链含有FLAG标签的野生型CAT-2200 Fab异二聚体的多次测量的中值。类似地，结合HER2的野生型帕妥珠单抗的参考KD值是8.055nM。该值是基于轻链含有HA标签的野生型帕妥珠单抗Fab异二聚体的多次测量的中值。在表6中，使用计算-(log(KD_设计)-log(KD_野生型))显示相对于野生型抗原结合亲和力的KD差异，这样使得正值表示Fab异二聚体的KD值与野生型抗原结合亲和力相比降低，而负值表示KD值增加。NB表示未检测到结合。请注意，一些Fab异二聚体缺乏KD测量值，且因此标记为未测定(ND)。在其中一些情况下，评估了Fab异二聚体，但是技术难点(例如SPR实验中的低Fab异二聚体捕获，即小于100RU)妨碍了KD值的准确测定
对于测试的大多数设计的Fab异二聚体，氨基酸取代对KD值几乎没有或没有影响。K-L设计文库中的三种设计(唯一标识符10881-11412、10883-11236和10888-11415)显示CAT-2200 Fab的KD降低超过5倍。在K-K衍生的K-L设计文库中，帕妥珠单抗Fab异二聚体中的一个(在唯一标识符中含有10724编码的设计)显示帕妥珠单抗的KD降低超过5倍。
实施例7：通过DSF测量设计的Fab异二聚体的热稳定性
使用差示扫描荧光法(DSF)来测量正确配对的异二聚体相较于野生型未修饰的重链-轻链对的热稳定性。尽管已知DSF是一种不太精确的用于测量熔融温度的方法，但是因为它是测量热稳定性的高通量方法且因此允许针对大量Fab异二聚体获得热稳定性的一些测量结果，所以在此使用该方法。如实施例5中所述制备Fab异二聚体。
通过DSF测量热稳定性
如下使用DSF测量设计的Fab异二聚体对的热稳定性。如实施例5中所述纯化每个异二聚体并在DPBS(杜氏磷酸盐缓冲盐水，HyClone目录号SH30028.02)中稀释至0.5mg/mL。对于大多数样品，通过将4μL Sypro Orange凝胶染色剂稀释到2ml DPBS中制备SyproOrange凝胶染色剂(Life Technologies目录号S-6650)的工作原液。通过向60μL稀释的Sypro Orange凝胶染色剂工作原液中添加14μL 0.5mg/mL蛋白质来制备DSF样品。然而，对于低于0.5mg/mL的蛋白质，通过将14μL未稀释的蛋白质添加到60μL Sypro Orange染料(在DPBS中稀释至1∶1500)的工作原液中来制备每个DSF样品。然后使用Rotor-Gene 6000 qPCR仪器(QiaGen Inc)对20μl等分试样重复进行DSF分析两次。每个样品使用1℃的间隔从30℃至94℃进行扫描，每个步骤之间平衡10秒，并在开始时等待30秒。使用增益为9的470nM激发滤波器和610nM发射滤波器。利用Rotor-Gene 6000软件分析数据，其中使用变性曲线一阶导数的最大值作为Tm。用类似的方法制备和分析剩余的DSF样品，其中以下方案修改不会改变测得的Tm值：1)通过将1μL Sypro Orange凝胶染色剂稀释到2ml DPBS中制备工作原液；2)分析30μl等分试样；以及3)使用的增益为10。
在Mab设计组的情形下，设计的Fab异二聚体样品的DSF结果报告于表6A(K-L设计)和表6B(K-K衍生的K-L设计)中。H1L1和H2L2 Fab的热稳定性包括在表6A和6B的第6列和第8列中(H1L1指代CAT-2200 Fab异二聚体且H2L2指代帕妥珠单抗Fab异二聚体)。对于进行了重复实验的Fab异二聚体，报告的Tm值是中值。设计的Fab异二聚体的Tm值与野生型Fab异二聚体的Tm值的比较报告在第7列(关于CAT-2200 H1L1)和第9列(关于帕妥珠单抗H2L2)中。含有FLAG标签的野生型CAT-2200 Fab构建体的中值Tm被确定为76.9℃。含有HA标签的野生型帕妥珠单抗Fab异二聚体的中值Tm被确定为82.4℃。鉴于在通过Mab设计组产生的大量Fab异二聚体的扩大程序中存在通量限制，通过对设计Fab异二聚体的子集进行取样来进行了DSF测量。因此，一些Fab异二聚体缺乏通过DSF测量的Tm值，并且因此标记为未测定(ND)。经测试的大多数设计显示出良好的热稳定性(在通常观察到的野生型Fab的预期Tm值的范围内)。在HC中含有突变K145T_V177D_S188D并且在λLC中含有突变S176K_Y178L或在κLC中含有突变S176K_T178L的设计Fab异二聚体对含有这些突变的Fab异二聚体的Tm值产生超过10℃的负面影响。
实施例8：通过DSC测量设计的Fab异二聚体的热稳定性
为了补充通过DSF进行的热稳定性测量，还使用更精确的差示扫描量热法(DSC)来测量正确配对的设计Fab异二聚体相较于野生型未修饰的重链-轻链对的热稳定性。如实施例5中所述制备Fab异二聚体。
通过DSC测量热稳定性
如下使用DSC测量设计的Fab异二聚体对的热稳定性。使用VP-Capillary DSC(GEHealthcare)对在PBS中的浓度主要为0.2mg/ml或0.4mg/ml的400μL纯化样品进行DSC分析。在每次DSC运行开始时，进行5次缓冲液空白注射以稳定基线，并且在每次样品注射前进行缓冲液注射以供参照。每个样品以60℃/hr的速率，在低反馈、8秒滤波器、5分钟preTstat和70psi氮气压力下从20℃到100℃进行扫描。使用Origin 7软件引用和分析得到的热谱图。
H1L1和H2L2 Fab的热稳定性包括在表6的第10列和第12列中(H1L1指代CAT-2200Fab异二聚体且H2L2指代帕妥珠单抗Fab异二聚体)。对于进行了重复实验的每个Fab异二聚体，报告的Tm值是中值。设计的Fab异二聚体的Tm值与野生型Fab异二聚体的Tm值的对比报告在第11列(针对CAT-2200 H1L1；野生型CAT-2200 Fab构建体含有FLAG标签，中值Tm为70.7℃)和第13列(针对帕妥珠单抗H2L2；野生型帕妥珠单抗Fab构建体含有HA标签，中值Tm为78.7℃)。鉴于DSC的高样品量要求和低通量性质，通过对设计的子集进行取样进行了测量。因此，一些Fab异二聚体缺乏通过DSC测量的Tm值，并且因此标记为未测定(ND)。通过DSC测定的所有设计的Fab异二聚体都显示出良好的热稳定性。由DSC得到的Tm值通常低于通过DSF观察到的值(实施例7)。
实施例9：设计优化
检查了分别如表5A和5B所示的K-L设计和K-K衍生的K-L设计在帕妥珠单抗/CAT-2200系统中的性能，以引导进一步理解这些设计驱动选择性配对的能力。该检查允许进行随后的设计优化循环以在可能时提高配对特异性和/或增加异二聚体的稳定性。设计优化包括在特定的取代氨基酸残基处修饰K-L设计和K-K衍生的K-L设计以评估在该残基处替换氨基酸取代、在其它氨基酸残基处添加氨基酸取代和/或去除特定残基处的氨基酸取代(即，将其转换回野生型残基)的影响。设计过程和设计选择如实施例1和2中所述进行，并且所得设计在帕妥珠单抗/CAT-2200 K-L系统中进行测试。
另一组K-L设计使用增加具有改善的配对特异性的设计的多样性的替代方法提出，其中将来自表4A和4B的选定恒定结构域设计以及前一段中描述的选定恒定结构域优化设计候选项与两个K-K可变结构域设计组合。两个K-K可变结构域设计包含在表4B中，并且具有唯一标识符10621-10733和10623-10745。这些设计本身并不促进强配对特异性，并且不影响抗原结合，但是已被证明当与κ-κ抗体系统中的某些Fab恒定结构域设计结合时改善配对特异性。这组额外的K-L设计也包括仅恒定结构域设计的组合，其中恒定结构域设计选自表4A、4B和前述段落中描述的候选优化设计。
最后，使用来自PCT申请号PCT/IB2015/054107的表5中描述的K-K设计文库的代表性设计作为起点提出另一组额外的K-K衍生的K-L设计，并在帕妥珠单抗/CAT-2200K-L系统中进行测试。如实施例2中所述，通过视需要修饰氨基酸残基以考虑到κ和λ轻链之间的序列和结构差异，使代表性K-K衍生的设计适应于κ-λ系统。
如实施例10中所述，通过LCCA在帕妥珠单抗-CAT-2200K-L系统中实验性地评估本实施例中描述的其它K-L设计和K-K衍生的K-L设计的配对特异性。
实施例10：设计Fab异二聚体的制备和其优先配对的LCCA评估
如实施例3中所述制备包含对应于Mab设计组的氨基酸取代的帕妥珠单抗和CAT-2200 Fab构建体。如实施例4中所述，所有LCCA实验均对含有位于恒定结构域(H/C233-L/C214，Kabat编号)中的链间Fab二硫键的构建体进行。为了评估由Mab设计组展现的优先配对，除了以下不同之处外，如实施例4中所述测量由相应的LCCA设计组展现的优先配对。
如实施例4中所述通过LCCA进行LCCA设计组中的优先配对的评估，但是以H1∶L1∶L2或H2∶L2∶L1为1∶1∶3(重量比)而非1∶1∶1的重链和轻链比进行转染，其中重链以限制量存在，并且错配的轻链过量存在。由于实施例9中描述的设计是表4A和4B中所述设计的优化版本或两种设计的组合(其中一些设计已经展现相对高的配对特异性)，所以这种特异性(如果达到的话)的进一步改善可能由于测定的限制而在LCCA中无法在1∶1∶1的H1∶L1∶L2或H2∶L2∶L1的情况下检测到。因此，为了检测特异性的提高，使用1∶1∶3而不是1∶1∶1的DNA比率。使用300ng H1、300ng L1和900ng L2(即H1∶L1∶L2或H2∶L2∶L1＝1∶1∶3的比率)、100ngAKTdd pTT22(含有组成性活性蛋白激酶B突变体的载体)和400ng ssDNA(鲑鱼精子DNA)进行所有转染。
数据分析和LCCA指标的描述
如下所述，使用实施例4中描述的分析的修改版本进行数据分析。
在LCCA中测试所有LCCA设计组，并根据以下纳入标准确定目标设计。为了被认为是目标设计，设计必须包含至少一个高于95％野生型标量置信区间的上限的阳性LCCA结果，而另一个互补LCCA必须高于95％野生型标量置信区间的下限。所有通过上述标准的设计都包含在表7A中确定的第二个K-L设计文库或表7B中确定的第二K-K衍生的K-L设计文库中。
表8A和表8B分别描述了在Mab设计的情形下获得的第二K-L设计文库和第二K-K衍生的K-L文库的LCCA数据。该实施例中的每个LCCA设计组的性能用两个标量值来描述，这两个标量值分别对应于H1L1∶H1L2比值(中值)和H2L2∶H2L1比值(中值)的自然对数。注意，这些标量值与实施例4中计算的标量值稍有不同，但同样用于评估优先配对。这些标量值报告在表8A(关于第二K-L设计文库)和表8B(关于第二K-K衍生的K-L文库)的第2列和第5列中。对于野生型CAT-2200(HC)与CAT-2200(LC-FLAG)加帕妥珠单抗(LC-HA)的竞争结合，95％标量置信区间为-3.24(下限)至-2.94(上限)。对于野生型帕妥珠单抗(HC)与帕妥珠单抗(LC-HA)加CAT-2200(LC-FLAG)的竞争结合，95％标量置信区间为-0.9(下限)至-0.6(上限)。
设计的每个LCCA(H1L1L2和H2L1L2实验)的标量范围示于表8A和8B的第3列和第6列中作为结果的可再现性的度量，并且代表针对该设计所测量的最高和最低标量值之间的差异。对于由单次测量报告的结果，范围值被标记为NA(不适用)。另外，标量值还被转换回H1L1∶H1L2和H2L2∶H2L1的纯中值比率。这种转换将LCCA比率有效地归一化为100％，因为在一些情况下观察到H1L1和H1L2或H2L2和H2L1的总量显著不同于100％。这些值记录于表8A和8B的第4列和第7列中。
结果
如上所述，在Mab设计组的情形下，LCCA结果示于表8A和8B中。表8A提供了与实施例9中描述的K-L设计有关的LCCA数据。151个K-L设计符合纳入标准，并且大部分设计仅在恒定区中具有氨基酸修饰，少数设计还在可变区中包含氨基酸修饰(参见表7A)。提出这些设计以进一步提高配对特异性和稳定性，同时也有利于转移至其它抗体系统。
表8B提供了与也描述于实施例9中的K-K衍生的K-L设计有关的LCCA数据。21个K-K衍生的K-L设计符合纳入标准。这些设计仅包括恒定结构域设计。
实施例11：扩大设计的Fab异二聚体用于生物物理表征
为了检查正确配对的异二聚体的生物物理特性，如实施例5中所述来扩大表7A和7B中所示的唯一标识符组中确定的所选正确配对的异二聚体H1L1或H2L2(设计的Fab)的制备，只不过进行50ml扩大而不是20ml。如实施例5中所述纯化表达的Fab，以测试热稳定性和抗原结合。对纯化方案进行了修改：将上清液在不经平衡缓冲液进行任何初始稀释的情况下与IgG-CH1 CaptureSelectTM树脂一起温育，并用4倍床体积的洗脱缓冲液洗脱结合的样品。
纯化后，如先前在实施例5中所示，通过使用Caliper LabChip GXII的非还原型和还原型高通量蛋白表达测定来评估异二聚体表达。
数据表明，在设计的Fab中包含Mab设计组修饰对蛋白质表达没有显著影响(通过纯化后产率判断得知)。设计的CAT-2200 Fab所获得的纯化后产率为1.3mg/50ml表达(SD为0.6)，而野生型Fab为1.9mg/50ml表达(SD为0.5)。设计的帕妥珠单抗Fab的制备产率为0.9mg/50ml表达(SD为0.4)，而野生型Fab为1.1mg/50ml表达(SD为0.2)。Caliper分析显示与野生型Fab相当的纯度(数据未示出)。许多设计的Fab在纯化后具有与其相关的沉淀物(在表9A和9B中用′*′标出)。以上提供的产率信息是在去除沉淀物后所测得。
实施例12：设计的Fab异二聚体的抗原亲和力测量
评估CAT-2200设计Fab异二聚体结合IL-17A和帕妥珠单抗设计Fab异二聚体结合HER2-ECD的能力，以确定氨基酸取代是否对异二聚体结合抗原的能力有任何影响。如实施例6所述评估抗原结合，不同之处在于CAT-2200设计Fab被以50μL/min注射120秒，并且解离阶段为600至800秒而不是900秒。此外，如实施例6所述筛选结合HER2的设计帕妥珠单抗Fab，但作出如下修改：对于每个Fab捕获，将Fab稀释至2.5μg/ml而不是2μg/ml，并且注射时间为120秒而不是240秒。所注射的最低HER2抗原浓度是1.23nM而不是0.41nM。浓缩系列的解离阶段是600秒而不是1200秒。
结果。在Mab设计对的情形下，设计的Fab异二聚体样品的抗原亲和力(KD)值报告于表9A(K-L设计)和表9B(K-K衍生的K-L设计)中。H1L1和H2L2 Fab的KD值包括在第2列和第4列(分别为H1L1CAT-2200 Fab异二聚体和H2L2帕妥珠单抗Fab异二聚体的KD)中，以及第3列和第5列(H1L1或H2L2 Fab异二聚体相较于其各自的野生型的KD变化)中。仅对显示至少100RU的Fab异二聚体捕获的Fab异二聚体样品测定KD值。用来与设计的异二聚体作比较的结合IL-17A的野生型CAT-2200 Fab的参考KD值是0.209nM。该值是基于轻链含有FLAG标签的野生型CAT-2200 Fab异二聚体的多次测量的中值并且与实施例6中报告的值没有显著不同。类似地，结合HER2的野生型帕妥珠单抗的参考KD值是7.8nM。该值也是基于轻链含有HA标签的野生型帕妥珠单抗Fab异二聚体的多次测量的中值并且与实施例6中报告的值没有显著不同。在表9A和9B中，使用计算-(log(KD_设计)-log(KD_野生型))显示相对于野生型抗原结合亲和力的KD差异，这样使得正值表示Fab异二聚体的KD值与野生型抗原结合亲和力相比降低，而负值表示KD值增加。如前所述，由于在通过Mab设计组产生的大量Fab异二聚体的扩大程序中存在通量限制，因此通过对设计Fab异二聚体的子集进行取样来进行SPR测量。因此，一些Fab异二聚体缺乏通过SPR测量的KD值，并且因此标记为未测定(ND)。对于测试的设计Fab异二聚体，氨基酸取代对KD值几乎没有或没有影响(在野生型的2倍以内)。
实施例13：通过DSF测量设计的Fab异二聚体的热稳定性
使用差示扫描荧光法(DSF)来测量正确配对的设计Fab异二聚体相较于野生型Fab的热稳定性。如实施例11中所述制备Fab异二聚体。
通过DSF测量热稳定性
如下使用DSF测量设计的Fab异二聚体的热稳定性。将每个纯化的异二聚体在DPBS(杜氏磷酸盐缓冲盐水，HyClone目录号SH30028.02)中稀释至0.67mg/mL。Sypro Orange凝胶染色剂(Life Technologies目录号S-6650)的工作原液通过在DPBS中的1∶1000稀释来制备。通过向15μL Sypro Orange凝胶染色剂工作原液中添加15μL 0.67mg/mL蛋白质来制备DSF样品。然而，对于浓度低于0.67mg/mL的蛋白质，通过将15μL未稀释的蛋白质添加到15μLSypro Orange染料的工作原液中来制备每个DSF样品。然后使用Rotor-Gene 6000 qPCR仪器(QiaGen Inc)对30μl等分试样进行DSF分析。每个样品使用1℃的间隔从30℃至94℃进行扫描，每个步骤之间平衡10秒，并在开始时等待30秒。使用增益为8的470nM激发滤波器和610nM发射滤波器。利用Rotor-Gene 6000软件分析数据，其中使用变性曲线一阶导数的最大值作为Tm。
在Mab设计组的情形下，设计的Fab异二聚体样品的DSF结果报告于表9A(K-L设计)和表9B(K-K衍生的K-L设计)中。H1L1和H2L2 Fab的热稳定性包括在表9A和9B的第6列和第8列中(H1L1指代CAT-2200 Fab异二聚体且H2L2指代帕妥珠单抗Fab异二聚体)。对于进行了重复实验的Fab异二聚体，报告的Tm值是中值。设计的Fab异二聚体的Tm值与野生型Fab异二聚体的Tm值的比较报告在第7列(关于CAT-2200 H1L1)和第9列(关于帕妥珠单抗H2L2)中。含有FLAG标签的野生型CAT-2200 Fab构建体的中值Tm被确定为77.0℃。含有HA标签的野生型帕妥珠单抗Fab异二聚体的中值Tm被确定为81.7℃。如前所述，通过对设计Fab异二聚体的子集取样进行了DSF测量，因此一些Fab异二聚体缺乏通过DSF测量的Tm值并标记为未测定(ND)。经测试的大多数设计显示出良好的热稳定性(与野生型相比，Tm降低最多4-5℃)，处在通常观察到的野生型Fab的预期Tm值的范围内，但具有如下不同之处。两个Fab异二聚体的κ轻链中的S131K_L135K突变结合κ重链中的L124E_K145T突变似乎对其Tm值产生大于10℃的不利影响。还值得注意的是，对于一些CAT-2200设计Fab，在DSC谱中观察到主Fab峰的肩(这些Fab在表9A和9B中用‘#’标记)。针对野生型CAT-2200 Fab也观察到这种特征。
实施例14：通过DSC测量设计的Fab异二聚体的热稳定性
为了补充通过DSF进行的热稳定性测量，还使用更精确的差示扫描量热法(DSC)来测量正确配对的设计Fab异二聚体相较于野生型未修饰的重链-轻链对的热稳定性。如实施例11中所述制备Fab异二聚体，并且如实施例8中所述通过DSC进行热稳定性测量。然而，对于样品浓度低于方案中所示浓度的Fab异二聚体，DSC在可用浓度下进行。
H1L1和H2L2 Fab的热稳定性测量结构示于表9A和9B的第10列和第12列中(H1L1指代CAT-2200 Fab异二聚体且H2L2指代帕妥珠单抗Fab异二聚体)。对于进行了重复实验的每个Fab异二聚体，报告的Tm值是中值。设计的Fab异二聚体的Tm值与野生型Fab异二聚体的Tm值的对比报告在第11列(针对CAT-2200 H1L1；野生型CAT-2200 Fab构建体含有FLAG标签，中值Tm为70.7℃)和第13列(针对帕妥珠单抗H2L2；野生型帕妥珠单抗Fab构建体含有HA标签，中值Tm为78.1℃)。鉴于DSC的高样品量要求和低通量性质，通过对经由DSF进行表征的设计子集取样进行了测量。因此，一些Fab异二聚体缺乏通过DSC测量的Tm值，并且因此标记为未测定(ND)。通过DSC测定的所有设计的Fab异二聚体都显示出良好的热稳定性(与野生型相比，Tm降低最多2-3℃)。由DSC得到的Tm值通常低于通过DSF观察到的值(实施例13)。尽管观察到设计的Fab与野生型Fab相比的绝对Tm差异取决于所用的方法，但无论DSF还是DSC，设计的Fab相对于野生型Fab的相对排序都是相同的，与所用的方法无关。
实施例15：设计聚类和代表性设计的选择
实施例2至14描述了K-L设计和K-K衍生的K-L设计的设计和测试。在LCCA中以Fab形式测试这些设计促进配对的能力，其中测定了每个LCCA设计组的一个重链与适当的轻链配对的能力。还评估了氨基酸取代对所得正确配对的异二聚体(一个重链和一个轻链)的稳定性和抗原结合的影响。
为了测试针对K-L设计和K-K衍生的K-L设计以LCCA形式(即，H1、L1和L2，或H2、L1和L2的共表达)获得的Mab设计组(H1L1H2L2)的优先配对结果在Mab设计组的多肽链共表达时(即，当H1、L1、H2和L2共表达时)是否也适用，选择了表4A、4B、7A、7B中描述的400多种设计中的代表性数量的设计，因为以这种方式测试所有设计是不可行的。代表性设计在被称为“SMCA”的测定中接受测试(详细描述于实施例16中)。
为了选择代表性设计，将表4A和表7A中确定的K-L设计(n＝404)组合并根据被取代的氨基酸残基位置的同一性进行聚类。在表7B中的K-K衍生的K-L设计与最初的K-K设计相比已经被显著修改的一些情况下，其也被包括在该K-L设计组中用于聚类。表10-A1至10-A12示出了针对K-L设计产生的群组1至12。同样地，还将表4B和表7B中报告的K-K衍生的K-L设计(n＝43)(不包括移至K-L设计组的那些设计)组合并进行聚类。表10-B1至10-B10示出了针对K-K衍生的K-L设计产生的群组1至10。如下所述选择来自每个群组的代表性设计。表11A(K-L设计)和11B(K-K衍生的K-L设计)中也包括了最终选定的代表性设计的集合，并且包括SMCA设计ID名称。
SMCA的代表性设计
代表性设计的选择是基于展现配对特异性并对抗原结合具有最小影响或没有影响的主要标准，同时还考虑了次要标准如设计稳定性、取代数量最小化以及与野生型相当的表达。考虑了两个Fab以及单独考虑每个Fab来评估最大配对特异性，其中一个Fab的配对不如异二聚体对中的另一个Fab，但仍然表现得比野生型配对好(如图6所示的方案A和B)。此外，群组内的多样性和群组中的设计数量进一步指导了所选的群组代表的类型和数量。
从群组1到12中共选择了33个代表性K-L设计用于SMCA形式的测试。同样地，从所鉴定的10个群组中的7个选择具有高至中平均LCCA性能值的7个K-K衍生的K-L设计。三个K-K衍生的K-L设计群组不包含满足代表标准(相对于例如LCCA性能标准或对抗原结合无影响等主要标准)的设计。
从每个群组中选择至少一个代表性设计。仅由一个代表性设计代表的群组包括K-L设计群组5和11，以及全部7个K-K衍生的K-L设计群组。其余群组具有不止一个代表性设计，因为这些群组为大群组(即群组2、3、4、6、7、8)和/或具有更多的设计亚多样性(次要群组)(即群组1、9、10、12)。虽然每个群组内的设计具有序列相似性，但一个群组内的次要群组具有至少一个不同的驱动子(氨基酸取代)。在表10-A1至10-A12和10-B1至10-B10中以粗体突出显示了每个群组的代表性设计。如本文别处所述，这些表中的“-”表示在该特定多肽链中不存在促进优先配对的氨基酸取代。
驱动子和二级取代
本文描述了具有被选代表的群组，重点是确定每个群组中如通过LCCA所评估促进所需配对特异性的“驱动子”或“驱动子组”(氨基酸位置和/或取代)。术语“驱动子组”是指促进优先配对的一组氨基酸位置和取代，而术语“驱动子”是指驱动子组内的单个位置/取代。然而，其它残基和取代有时与群组中的一个设计或一组设计相关联。这些残基和取代被称为“二级”取代，并且有时被包括在Mab设计组中以改善所使用的一个或多个驱动子组的性能。从机制上说，这些二级取代可以用于i)促进驱动子的空间容纳；ii)增加在重链和轻链之间的界面处的接触数量或取代在驱动子组位置处进行取代后丢失的接触；iii)优化基于驱动子组的氢键网络；和/或iv)创建有利于提高驱动子组性能的环境。这些机制中的一个或多个可用于/旨在改善每个群组中的驱动子的性能。
这些二级取代中的一些在几个群组中是共有的。例如，重链中的K145T取代被用于H1L1或H2L2中，以在带负电荷的一个或多个驱动子被设计在其附近时去除正电荷。在一些群组中，当带负电荷的一个或多个驱动子被设计在其附近时，λ轻链中的K129T取代有时被用来去除正电荷(例如K-L设计群组4和群组8-12)。此外，在一些群组中利用λ轻链中的E124Q取代来去除带正电荷的一个或多个驱动子附近的负电荷(例如K-L设计群组1-3)。在一些设计中，V133G取代主要应用于κ轻链中以在空间上容纳特定驱动子组(例如主要在K-L设计群组1、3、4、6、7、10、12和K-K衍生的K-L设计群组10中)。λ轻链中的Y178T被引入设计中用于相应H1L1中的特定驱动子组的空间容纳(例如K-L群组4、5、8和12)。轻链中的V133S被应用于目标为改善氢键网络的又一驱动子组中(例如K-L群组1、2和12)。
K-L设计群组的描述
对于群组1，选择了两个设计(13175-13486和13180-13515)来代表该群组，因为这些设计使用占据相似空间的类似静电驱动子(见表10-A1)。对于该群组的所有成员，使用了两个驱动子组的组合。第一静电驱动子组被设计为允许H1中的带负电荷取代(主要是L143D)与L1中的带正电荷取代(T131K/R)形成盐桥，而H2被设计为允许a)带正电荷的取代S188K或L124R_S186R与L2中的带负电荷取代(S176D_T178E或S176D_T180E)形成盐桥或b)在H2中的L143R或S186K与L2中的Q124E_V133D之间形成盐桥。增加了被称为“二硫键转向驱动子组”的第二静电驱动子组，以在H-L组装过程的早期阶段阻碍错配异二聚体中的H-L或异二聚体二硫键的形成。二硫键转向驱动子组使用H1(A125R)中的带正电荷取代、L1中的带负电荷取代(S122D)、H2中的带负电荷取代(K228D)和L2中的带正电荷取代(S121K)。这些氨基酸取代位于二硫键附近，远离K-L设计中大部分氨基酸取代所在的埋藏的(主)H-L界面。这两个驱动子组被设计成在优先配对的异二聚体中形成盐桥，而不匹配的配对将主要由于静电排斥而不受支持。
对于群组2，选择了四个代表性设计(13282-13484、13287-13494、13218-13482和10945-11377)以反映该群组中的多样性程度(见表10-A2)。该群组的所有成员均基于H1如同群组1第一静电驱动子组被类似地设计为允许带负电荷取代(L143D或L143D_Q179E)与L1中的带正电荷取代(T131K/R)形成盐桥，而H2被设计为允许a)带正电荷取代(S186K)与L2中的带负电荷取代(主要是V133D或V133D_Q160E)形成盐桥；b)S188K与L2的S131D/E配对；或c)L143R/K与L2的Q124E_V133D配对。除了静电驱动子组外，群组2的一些成员还包含空间驱动子组。使用了两个空间驱动子组，称为“空间1”和“空间2”。空间1驱动子组包括H1中的F174G，其被设计为与L1中的S176F或T116F_S176F空间互补；以及H2中的V190F就，其与L2中的L135A空间互补。空间2驱动子组包括与L1的野生型残基空间相容的H1中的A139W以及与L2的L135W空间相容的H2的野生型残基。因此，在这个群组中，H1L2和H2L1的错配配对将主要由于静电排斥或静电排斥和空间不相容的组合而不受支持。还有两个群组成员除了静电驱动子组以外还包含位于H2链中(Q39E或L45P)和L2链中(分别为Q38R或P44F)中的可变设计组分(“可变结构域驱动子组”)。对于这两个群组成员没有选择代表，但预计它们会改善配对。
对于群组3，选择了五个代表性设计(10931-11263、13221-13411、10987-11257、10983-11306和10947-11392)(见表10-A3)。该群组的成员使用与群组2中类似的H1(L143D或L143E_Q179E)和L1(T131R/K)中的静电驱动子组，但是H2L2的设计不同。H2L2的设计主要基于：a)H2的L124R_S186R/K或L124R_Q179K或S188K与L2的S176D_T178E或S176D_T180E配对；或b)H2的L143R_S188K与L2的Q124E_V133D_S176D_T178D/E配对，导致主要由于静电排斥而阻碍错配的配对。与在群组2中一样，除了静电驱动子组外，该群组中的一些成员还使用了空间1或空间2驱动子组。这种驱动子组的代表是13221-13411。该群组还包括除了静电驱动子组之外含有“可变结构域驱动子组”的两个设计。
针对群组4，选择了三个代表性设计(13335-13361、13209-13364和11100-11205)(见表10-A4)。该群组的大多数成员利用位于H1(S188K)和L1(S176E/D_Y178E)上的类似静电驱动子，并在H2L2对中具有一些变化：a)H2的V177D_S188D与L2的S176K_T178R/K配对；或b)H2的S186E或L124E或L124E_Q179E与L2的S176K/R或S131K/R_S176R/K配对，这将允许在优先配对的异二聚体中形成盐桥，而不匹配的配对将主要由于静电排斥而不受支持。除了，静电驱动子组，该群组的一些成员仅使用空间驱动子组，即空间3驱动子组，或者使用空间3驱动子组的一些组分。空间3驱动子组基于H1L1中的野生型残基或H1中的S188A和L1中的S176A_Y178W和被设计为与L2中的S176V或S176A_T178A空间互补的H2中的S188W或S186I/L_S188W。此外，除静电驱动子组之外，该群组的一些成员还包含二硫键转向驱动子组。另外，除了静电驱动子之外，少数群组成员还包含可变结构域驱动子组。
群组5由唯一标识符11066-11181代表(参见表10-A5)。该群组的所有成员都使用静电驱动子组。第一组静电驱动子是基于H1中的S186K和L1中的V133D的配对，以及H2中的S188D或V177D_S188D分别与L2中的S131K或S176K_T178R/K的配对。第二组驱动子具有逆向电荷定向，主要是H1中的L124E_V190D与L1中的L135K配对，和H2中的L124R或S188K与L2中的S176D或S176D_T178E配对。
对于群组6，选择了两个代表性设计(10808-11308和10814-11233)(见表10-A6)。该群组的所有成员都利用位于H1L1对中的类似静电驱动子组：H1的V177D_S188D和L1的S176K_Y178K/R，以及H2L2对中的更多样化的驱动子组，即a)H2的S188K与L2的S176E/D_T178E或S131D/E配对；b)H2的S186K/R与L2的V133D或Q124E_Q160E_T180E配对；c)H2的L124R或L124R_Q179K与L2的S176D或S176D_T178D或S176D_T180E配对；或d)H2的L143K/R与L2的V133D或Q124E_V133D配对。这些取代允许在优先配对的异二聚体中形成盐桥，而不匹配的配对将主要由于静电排斥而不受支持。
对于群组7，选择了三个设计(13167-13514、13263-13493和12878-11240)来代表该群组(见表10-A7)。所有群组成员都使用基于H1L1中的共同驱动子组(H1中的S188E和L1中的Y178K)的静电驱动子组，其中H2L2对具有一些驱动子组多样性：主要是H2的L124R或S188K(还与L143K或S186R或Q179K组合)，主要与L2的S176D/E_T178D/E或S176D/E_T180E(或与Q124E组合)配对。除了静电驱动子组之外，一些群组成员还包含二硫化物转向驱动子组、空间2驱动子组或可变结构域驱动子组。
对于群组8，选择了五个设计(13320-13370、12938-13469、13226-13434、11026-11270和13316-13451)来代表该群组(见表10-A7)。该群组的成员在H1L1静电对中具有更多变化，而H2L2对是基于H2中的L143E或L143E_Q179E驱动子(主要与L2中的Q124R/K_T178R或Q124R_Q160R/K_T178R驱动子配对)。H1L1驱动子的多样性如下：a)在H1中用作驱动子的S186R或Q179K主要与L1的S180E驱动子配对(H1中的S186K变化与L1中的V133D驱动子配对)；b)H1的L143K驱动子与L1的V133D或T131E/D_V133D配对；或c)H1的S188K主要与L1的S176D/E_Y178E配对。除了静电驱动子组之外，一些群组成员还包含空间2或空间3驱动子组或空间4驱动子组，该空间4驱动子组基于被工程改造为与L2中的V133A空间互补的H2中的L124W(作为后者设计的一部分，一些群组成员还使用H1中的L143A取代和L1中的V133W)。此外，少数群组成员除了静电组之外还包含可变结构域驱动子组(对此选择了一个代表)，或在H2的F122C和L2的Q124C之间含有工程改造的二硫键。
对于群组9，选择了两个代表性设计(13208-13455和13194-13427)(见表10-A9)。该群组的几乎所有成员都使用了两个静电驱动子组的组合。第一驱动子组主要由H1中的Q179K或S186R和L1中的S180E以及H2中的L143E或L143E_Q179E和L2中的S131K或Q124R_T178R或Q124R_Q160K_T178R组成，并且第二驱动子组是二硫化物转向驱动子组。
对于群组10，选择了两个代表性设计(13238-13463和13304-13466)(见表10-A10)。该群组的成员仅基于空间1驱动子，或基于空间1驱动子与群组9中使用的静电驱动子组的组合。
对于群组11，选择了一个代表性设计(13306-13375)(见表10-A11)。该群组的所有成员都基于以下驱动子利用静电取代来驱动异二聚体的优先配对：H1中的L143K_V190K和L1中的V133D以及H2中的L124E和L2中的S131K_L135K。
对于群组12，选择了三个代表性设计(13227-13383、11065-11206和11034-11204)(见表10-A12)。该群组的成员主要利用静电取代来驱动异二聚体的优先配对。这些包括H1中的L143K或S186K和L1中的V133D或T131D/E_V133D，以及H2中主要是L124E_Q179E和L2中的S131K/R_S176R。一些群组成员另外包括二硫键转向驱动子组、空间2驱动子组、空间3驱动子组或可变结构域驱动子组。
K-K衍生的K-L设计群组的描述
与K-L设计相比，在LCCA中测试了明显较少的K-K衍生的K-L设计组(n＝43)。因此，十个κ-κ移植群组中的每个都由单个设计代表。除了使用空间驱动子组的两个群组之外，大多数群组使用静电驱动子组。此外，两个群组仅由可变结构域中的设计组成，而其余的群组由恒定结构域设计组成。
群组1包括基于以下驱动子组的静电设计：H1中的L143E_Q179E、L1中的E124K_Y178R、H2中的S186R以及L2中的T178E_T180E或Q160E_T180E，并且由设计10657-10760代表。
群组2包括特征为H1中的L143E、L1中的E124R和H2中的S186R或Q179K、L2中的Q124E_Q160E_T180E的静电驱动子组(设计代表10652-10734)。
群组3包含H1中带正电荷的驱动子S186R(与L1中带负电荷的驱动子S180E互补)和H2中带负电荷的驱动子L143E或Q179E或其组合(主要与L2中带正电荷的驱动子Q124K_T178R互补)(设计代表10685-10726)。
群组4使用以下驱动子：H1中的Q179K、L1中的S180E以及H2中的L143E、L2中的Q124R或Q124R_Q160K_T178R(设计代表10665-10724)。
群组6的成员包含可变结构域设计，其基于一个臂中的Q39K/R和Q38E/D的静电对以及另一个臂中的Q38K/R和Q39E/D(在H1L1和H2L2臂中使用两种电荷对取向)(设计代表10681-10741)。
群组8的成员包括第二组可变结构域驱动子，其本质上是空间驱动子：H1中的野生型残基或L45F，其与L1中的野生型残基互补；和H2中的L45A/P，其与L2的P44F互补(设计代表10621-10733)。
群组10包括基于H1中的L124E、L1中的S176R以及H2中的L124R和L2中的S176D的单一设计(设计10640-10713)。
没有选择群组5、7和9的代表，因为它们不符合性能标准，例如相对于亲本Fab具有中等至强力驱动作用或对抗原结合没有影响。
实施例16：以双特异性抗体形式评估Mab设计组中的设计异二聚体的优先配对
实施例2至4以及实施例10证明了设计的Fab在LCCA设计(即H1、L1、L2或H2、L1、L2，其中一个重链与两个轻链以Fab形式共表达)的情形下优先配对的能力。在这个实施例中，评估Mab设计组(H1、L1、H2和L2)中的设计异二聚体以确定它们是否促进以双特异性抗体形式(即其中H1、L1、H2和L2共表达)进行的优先配对。除了Mab设计组的氨基酸取代之外，每个异二聚体的全长重链的Fc区被不对称地修饰，使得一个重链包含氨基酸取代T350V、L351Y、F405A和Y407V(A链)而另一个重链包含氨基酸取代T350V、T366L、K392L和T394W(B链)，其中Fc的氨基酸编号是按照EU编号系统。包括这些不对称Fc修饰是为了促进独特重链的异二聚化。
使用前述实施例中描述的CAT-2200和帕妥珠单抗抗体的组合以及CR8071(抗B型流感血凝素蛋白)抗体和SGN-CD19a(抗CD19)的组合，在3种双特异性系统中评估Mab组中的设计异二聚体在双特异性抗体的情况下促进优先配对的能力。测试的3种双特异性系统是：A)CAT-2200(具有λ轻链)/帕妥珠单抗(具有κ轻链)；B)CAT-2200(具有λ轻链)/SGN-CD19a(具有κ轻链)；和C)CR8071(具有λ轻链)/SGN-CD19a(具有κ轻链)。CAT-2200和CR8071是人抗体，而帕妥珠单抗和SGN-CD19a是人源化抗体。
测定形式(SMCA)
如下所述评估含有Mab设计组的氨基酸取代的异二聚体优先配对以形成正确配对的双特异性抗体的能力。该测定是基于共同表达四个链(来自一个抗体的H1和L1链与来自另一抗体的H2和L2链)并使用质谱法(LC-MS)检测正确形成的双特异性抗体的存在。图8提供了描绘四个起始多肽链和由这些起始多肽链在不存在异二聚体对的重链和轻链(在Fab和Fc区中)之间的优先配对的情况下共表达产生的潜在产物的示意图。两种独特的全长重链构建体与两种独特的轻链构建体共表达，产生十个可能的抗体种类(也称为Mab种类)：H1L1_H1L1、H1L2_H1L2、H1L1_H1L2、H2L1_H2L1、H2L2_H2L2、H2L1_H2L2、H1L1_H2L1、H1L2_H2L2、H1L2_H2L1和H1L1_H2L2。H1L1_H2L2种类是正确配对的双特异性抗体(见图8)。如图8所示，四种类型的半抗体(半Ab)种类也可能存在。当将修饰引入Fc区以促进独特重链的异二聚化时，潜在Mab种类的数量减少(即观察到较少的种类E至J)。在蛋白A(pA)纯化和去糖基化之后，使用LC-MS测定以正确配对的双特异性抗体种类H1L1_H2L2相对于其它种类的量表示的相对配对特异性。在可能的情况下，如果所有Mab种类和半Ab种类彼此相差至少50Da，则链不加标签。当质量差异排除了这种可能性时，为了使种类之间具有足够的质量差异，向轻链添加N端标签(HA或FLAG)，重点在于尽可能使用FLAG标签，因为有时观察到HA标签的裂解(在含有CR8071的构建体的情况下，仅使用FLAG标签)。
涉及双特异性抗体的H1、L1、H2和L2的表达以及对配对产物的后续分析的这种测定称为SMCA。
构建体的制备
如下制备编码包含根据设计的氨基酸修饰的CAT-2200、帕妥珠单抗、CR8071和SGN-CD19a IgG重链和轻链的构建体。如实施例3所述制备CAT-2200和帕妥珠单抗的轻链序列，而这些抗体的全长重链序列是通过以下方式产生：将编码部分铰链-CH2-CH3结构域并且经修饰以促进异二聚化的IgG1*01 DNA序列[SEQ ID NO：6]附接到Fab重链(含有铰链的一部分，并且不包括用于LCCA中的构建体的ABD2延伸；其制备描述于实施例3中)的CH1结构域的C端。如实施例3中所述，通过基因合成或通过定点诱变产生含有Mab设计组的氨基酸取代的构建体。值得注意的是，去除了典型的C端重链赖氨酸残基以防止由于C端赖氨酸剪切造成的LC-MS信号不均匀(Lawrence W.Dick Jr.等人，Biotechnol.Bioeng.(2008)100：1132-43)。
在表3C中示出了CR8071的重链Fab部分的基础DNA序列(SEQ ID NO：18)和轻链的DNA序列(SEQ ID NO：19)。CR8071Fab的重链(SEQ ID NO：14)和轻链(SEQ ID NO：15)氨基酸序列对应于PDB条目4FQJ(Fab CR8071和血凝素的复合物)中的氨基酸序列。在4FQJ的重链中进行了R222K取代以转变为最常见的IGHG1*01序列。
在表3C中示出了SGN-CD19a的重链Fab部分的基础DNA序列(SEQ ID NO：16)和轻链的DNA序列(SEQ ID NO：17)。SGN-CD19a序列对应于美国专利第8,242,252号中报告的SEQID NO：7和SEQ ID NO：17，并且作为SEQ ID NO：12(重链)和SEQ ID NO：13(轻链)被包括在本文中。
如上所述，在有或没有FLAG或HA标签的情况下制备Mab组中的一些设计异二聚体中的CAT-2200、CR8071、帕妥珠单抗和SGN-CD19a轻链序列，以便使种类之间具有充分的质量差异。如实施例3中所述制备带有标签的轻链。
还制备了这些构建体的野生型形式，以便评估每个系统中的自然偏倚，了解HA或FLAG标签对配对的潜在影响以及确定设计构建体对相对于野生型的优先配对的影响。
构建体的转染、表达和纯化
将编码每个双特异性抗体系统(野生型或具有对应于所测试的每个Mab设计组的氨基酸取代)的两个重链和两个轻链的构建体如下转染到CHO-3E7细胞中。在补充有4mM谷氨酰胺和0.1％Koliphor P188(Sigma#K4894)的FreeStyle(TM)F17培养基(Invitrogen目录号A-1383501)中在37℃下以1.7-2×106个细胞/ml的密度培养CHO-3E7细胞。使用PEI-max(Polysciences目录号24765-2)，用具有不同比率的H1∶H2∶L1∶L2的总共200μg DNA(由100μg抗体DNA和100μg GFP/AKT/填充DNA组成)以1∶4的DNA∶PEI比转染200ml总体积。加入DNA-PEI混合物24小时后，向细胞中添加0.5mM丙戊酸(最终浓度)和1％(重量/体积)胰蛋白胨N1(最终浓度)，然后将细胞转移至32℃下并在培养7天后收获。通过离心收获培养基并用Stericup 0.22μm过滤器(Millipore目录号SCGPU05RE)进行真空过滤。然后使用预先用PBSpH 7.4平衡的蛋白AMabSelect SuRe树脂(GE Healthcare#17-5438-02))纯化过滤的培养基。然后用PBS pH 7.4洗涤结合于树脂的抗体种类，并用100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 3.6)洗脱。通过使用Amicon ultra 15离心过滤器Ultracel 10K(Millipore#SCGP00525)离心，浓缩洗脱的抗体种类并在PBS pH 7.4中进行缓冲液交换。在去糖基化和LC-MS之前，通过Caliper评估得到的含有抗体种类的经蛋白A纯化的SMCA样品。
质谱法
在蛋白A纯化和非变性去糖基化之后，使用质谱法评估由Mab设计组在双特异性抗体的情形下驱动的异二聚体优先配对的程度。由于异二聚体仅含有Fc N-连接的聚糖，所以SMCA样品仅用一种酶N-糖苷酶F(PNGase-F)处理。纯化的样品如下用PNGaseF去糖基化：将在50mM Tris-HCl pH7.0中的0.2U PNGaseF/μg抗体在37℃下培养过夜(最终蛋白质浓度为0.5mg/mL)。去糖基化后，将样品储存在4℃下，然后进行LC-MS分析。
使用经由Ion Max电喷雾源(ThermoFisher)与LTQ-Orbitrap XL质谱仪(ThermoFisher Scientific)偶接的Agilent 1100 HPLC系统，通过完整LC-MS来分析去糖基化蛋白质样品。将样品(5μg)注射到2.1×30mm Poros R2反相柱(Applied Biosystems)上并使用以下梯度条件进行解析：0-3分钟：20％溶剂B；3-6分钟：20-90％溶剂B；6-7分钟：90-20％溶剂B；7-9分钟：20％溶剂B。溶剂A是脱气的0.1％甲酸水溶液，且溶剂B是脱气乙腈。流速为3mL/min。进行柱后分流以将100μL导入电喷雾界面。将柱加热至82.5℃并将溶剂柱前加热至80℃以改善蛋白质峰形。使用ThermoFisher Scientific的LTQ阳离子ESI校准溶液(咖啡因、MRFA和Ultramark 1621)对LTQ-Orbitrap XL进行校准，并使用CsI的10mg/mL溶液进行调整。锥孔电压(离子源碎裂设置(source fragmentation setting))为48V，FT分辨率为7,500，并且扫描范围为m/z 400-4,000。调整LTQ-Orbitrap XL以用于更大蛋白质(＞50kDa)的最佳检测。
将含有来自全尺寸抗体(m/z 2000-3800)和半抗体(m/z 1400-2000)的多电荷离子的范围使用仪器控制和数据分析软件MassLynx(Waters)的MaxEnt 1模块分别解卷积成分子量分布图。简而言之，首先在QualBrower(Xcalibur(Thermo Scientific)的光谱查看模块)中打开原始蛋白质LC-MS数据，并使用由Waters提供的文件转换程序Databridge将其转换为与MassLynx兼容。在MassLynx的Spectrum模块中查看转换的蛋白质谱，并使用MaxEnt 1解卷积。直接从所得分子量分布图确定每个样品中的每个抗体种类的量。
LC-MS结果的分析
总体而言，在大多数情况下，去糖基化处理使得能够鉴定通过LC-MS鉴定的所有可能的不同抗体种类。在许多情况下，每个抗体种类都由一个LC-MS峰表示。例外情况包括也可能对应于所需双特异性种类的侧峰(可能是加合物或前导肽裂解中的异质性)；然而，由于导致侧峰的种类的身份不明确，所以在对双特异性种类的贡献中没有考虑到这些侧峰。此外，基于LC-MS，所需的双特异性种类H1L1_H2L2通常无法通过实验与错配类型H1L2_H2L1区分开来。因此，当在表格中报告双特异性抗体含量时，不能完全排除该含量不包含这种类型的错配种类。然而，观察到的极低含量的种类如H1L2_H1L2和H2L1_H2L1以及H1L2和H2L1半抗体表明仅有少量(如果有的话)的错配种类污染双特异性种类的现象发生。
在野生型系统中评估自然偏倚和标签对配对的影响
作为第一步，对于测试的三个双特异性系统中的每一个，每个系统的亲本抗体的野生型(如果需要，轻链之一含有标签以用于提供种类之间的足够质量差异)未修饰的重链和轻链使用H1∶H2∶L1∶L2的不同DNA比率共表达，并鉴定和定量所得抗体种类。这允许在每个系统中鉴定任何固有的配对偏倚(或由标签的存在引入的偏倚)(例如，如果双特异性系统中的一个亲本抗体的轻链优先结合双特异性系统中的另一个亲本抗体的重链)，并且还允许确定提供最高量的双特异性抗体和最低量的半抗体的H1∶H2∶L1∶L2的DNA比率。选择DNA比率以补偿两个亲本抗体的重链和轻链之间的表达水平的自然差异和/或固有配对偏倚和/或标签对每个系统的影响。在测试的野生型双特异性系统A和B中，L2用FLAG标签标记。在双特异性系统C中，两条轻链均未被标记。
表12示出了该评估的结果。提供最高量的双特异性抗体和最低量的半抗体的H1∶H2∶L1∶L2的DNA比率对于系统A为10∶20∶24∶46，对于系统B为15∶15∶35∶35，且对于系统C为15∶15∶35∶35。应注意的是，在CAT-2200/帕妥珠单抗双特异性Ab系统(系统A)中，观察到帕妥珠单抗重链(H2)优先与CAT-2200轻链(L1)配对的偏倚。当考虑相等比率的重链1和重链2，但反向比率的轻链1和轻链2的数据时(例如，考虑表12中的H1∶H2∶L1∶L2中的8∶22∶17∶53和8∶22∶53∶17的反向L1∶L2 DNA比率)，这种偏倚是显而易见的。在H1∶H2∶L1∶L2＝8∶22∶53∶17的这些条件下，普遍的错配Mab种类H1L1_H2L1比在H1∶H2∶L1∶L2＝8∶22∶17∶53的情况下(其中普遍的错配种类H1L2_H2L2占约38.4％)多得多(79.6％)。这表明，当帕妥珠单抗轻链具有FLAG标签时，帕妥珠单抗重链似乎优先与该系统中的CAT-2200轻链配对。
在轻链之一上包含N端标签(HA或FLAG)的设计SMCA构建体指导类似的野生型SMCA构建体的制备，针对该构建体研究了标签对轻链与重链的配对能力的可能影响。表13示出了该实验的结果，并且表明在一些情况下，标签确实对轻链与重链的配对有影响。例如，就上述系统A案例(其中当帕妥珠单抗轻链含有FLAG标签时，帕妥珠单抗重链与CAT-2200轻链优先配对)而言，当CAT-2200轻链含有HA标签并且4个多肽链以相同的DNA比率表达时，观察到CAT-2200重链与帕妥珠单抗轻链的优先配对(参见表13，‘系统A，L1-HA’并比较具有10∶20∶24∶46的相同比率的‘系统A，L1-HA’与‘系统A，L2-FLAG’)。此外，对于SGN-CD19a/CAT-2200双特异性系统(系统B)，在包含FLAG标记的SGN-CD19a轻链的系统中的SGN-CD19a重链与CAT-2200轻链之间的错配程度比在同一系统的相同比率下的其它两种变型中大(表13，‘系统B，L1-FLAG’并对比具有15∶15∶35∶35的相同比率的‘系统B，L1-FLAG’与‘系统B，L2-FLAG和L2-HA’)。请注意，表13反映了进行的所有实验重复的累计数据，因此在一些情况下，种类百分比可能与表12中提供的初始评估阶段的数据不同。
为了测试每个双特异性系统内的40个代表性设计中的每一个，所使用的H1∶H2∶L1∶L2 DNA比率是来自相应的野生型双特异性系统的产生最高量双特异性Ab种类和最低量半Ab的比率。如上所述，对于CAT-2200/帕妥珠单抗系统，使用的比率为10∶20∶24∶46(H1∶H2∶L1∶L2)，其中H1和L1是指CAT-2200，而H2和L2是指帕妥珠单抗。对于SGN-CD19a/CAT-2200和SGN-CD19a/CR8071系统，使用的比率为15∶15∶35∶35(H1∶H2∶L1∶L2)。
优先配对产生双特异性抗体形式
测试的40个代表性设计的SMCA的结果显示在表14至17中。表14至17将Mab设计组称为“设计”，并且已用4位数标识。每个4位数对应于表10-A1至A12和表10-B1至10-B10中的Mab设计组唯一标识符(LCCA组唯一标识符)。表24提供了在SMCA中测试的设计与LCCA组唯一标识符之间的对应关系表。基于两种类型的计算进行了优先配对分析。第一种类型的计算在表中被标示为“H1L1和H2L2配对％”，并且代表在所有观察到的Mab种类和半Ab种类(包括可能只有一对正确配对臂的Mab种类)中H1和L1之间以及H2和L2之间的正确配对的量占总产物(H1L1_H2L2_和_H1L2_H2L1+H1L1_H1L1+H2L2_H2L2+H1L1+H2L2+0.5x(H1L1_H2L1+H1L1_H1L2+H1L2_H2L2+H2L1_H2L2))的百分比。这种计算被称为“总配对”计算。第二种类型的计算在表中被标示为“H1L1_H2L2和H1L2_H2L1**”，并且代表正确配对的双特异性抗体的量占观察到的所有Mab种类(即图8中的Mab种类A-J)的百分比(H1L1_H2L2_和_H1L2_H2L1/H1L1_H2L2_and_H1L2_H2L1+H1L1_H1L1+H2L2_H2L2+H1L1_H2L1+H1L2_H2L2+H1L1_H1L2+H2L1_H2L2+H1L2_H1L2+H2L1_H2L1))。这种计算被称为“总双特异性”计算。在该计算中不考虑半抗体，因为如果存在的话，可以通过制备型SEC或通过进一步的H1∶H2∶L1∶L2 DNA滴定来去除/最大程度地减少半抗体。表12表明DNA滴定在操纵表达的半抗体种类的百分比方面是有效的。在实施例18中证明了制备型SEC纯化在减少‘Fc链A’类型的半Ab的量方面的有效性。
为了考虑到在一些野生型双特异性系统中观察到的偏倚，如上所述，优先配对数据是以在相同的H1∶H2∶L1∶L2 DNA比率下与相应的野生型双特异性构建体的比较形式被报告。该比较被报告在“相对于野生型的H1L1和H2L2配对％的变化”(即相对于野生型的总配对量的变化)和“相对于野生型的H1L1_H2L2和H1L2_H2L1**的变化”(即相对于野生型的总双特异性量的变化)的列中。当未通过SMCA评估相应的野生型双特异性构建体时，与类似的野生型构建体进行了比较。这些情况由报告值旁边的指示。如下选择用于进行比较的类似野生型构建体。对于每个双特异性系统和构建体(含或不含标签)，获取来自每个DNA比率的重复SMCA实验的“H1L1_H2L2和H1L2_H2L1**”的中值和“H1L1和H2L2配对％”的平均值。取来自每个构建体内的任何比率的最大值，并使用所有构建体的中值来代表特定系统的野生型参照(见图16A和16B)。
表14和表15提供了经测试的代表性K-L设计的SMCA结果的汇总，其中根据“相对于野生型的H1L1和H2L2配对％的变化”(表14)或“相对于野生型的H1L1_H2L2和H1L2_H2L1**的变化”(表15)对设计进行分组。类似地，表16和17提供了经测试的代表性K-K衍生的K-L设计的SMCA结果的汇总，其中根据总配对变化(表16)或总双特异性变化(表17)的计算值对设计进行分类。
性能
使用总配对计算和总双特异性计算来评估每个代表性设计促进正确的重链和轻链优先配对的性能或能力。首先，在“相对于野生型的H1L1和H2L2配对％的变化”(相对于野生型的总配对量的变化)列中的正值表明Mab设计组能够促进优先配对。其次，在“相对于野生型的H1L1_H2L2和H1L2_H2L1**的变化”(相对于野生型的总双特异性量的变化)列中的正值也指示能够促进优先配对的Mab设计组。
与野生型相比，所有K-L设计和21个K-K衍生的K-L设计中的18个显示主要错配种类(H1L2_H2L2或H1L1_H2L1)的量减少，尽管在一些情况下不同错配种类的量相比于野生型是增加的。平均来说，K-L和K-K衍生的K-L设计在系统A中产生的相对于野生型的所需双特异性的增加(相对于野生型的总双特异性量的变化)最大(48.8％)，其次是在系统B(31.1％)和系统C(14.5％)中。平均来说，与野生型相比，所有测试的设计都导致半抗体的总量略微增加(从24.1％增加到27.9％)，但是将配对半抗体与错配半抗体的平均比率从1.5提高到6.9。
可转移性
测试了代表性Mab设计组在多个系统中促进优先配对的能力，以此作为这些设计的“可转移性”的度量。使用‘相对于野生型的总配对量的变化’的计算，33个K-L设计中的29个可以在全部3个测试系统中转移，并且3个设计可以在3个测试系统中的2个中转移(表14)。换句话说，这些设计显示“相对于野生型的配对变化”的正值。当使用‘相对于野生型的总双特异性量的变化’的计算测量优先配对时，33个K-L设计中的24个被确定为可以在全部3个系统中转移，并且8个设计可以在3个系统中的2个中转移(表15)。对于K-K衍生的K-L设计，使用‘相对于野生型的总配对量的变化’的计算，7个设计中的2个可以在全部3个系统中转移，并且4个设计可以在3个系统中的2个中转移(表16)。使用‘相对于野生型的总双特异性量的变化’的计算，7个设计中的1个可以在全部3个系统中转移，并且5个设计可以在3个系统中的2个中转移(表17)。当使用两种计算进行评估时，33个K-L设计中的23个和7个K-K衍生的K-L设计中的1个可以在全部3个测试系统中转移。
关于群组的性能，12个K-L群组中的9个中的所有设计根据‘相对于野生型的总配对量的变化’的计算可以在全部3个系统中转移，并且12个中的4个群组中的所有设计根据‘相对于野生型的总双特异性量的变化’的计算可以在全部3个系统中转移。使用这两种计算，群组kl-4、kl-9和kl-12内的所有设计都可以在全部3个系统中转移。图10示出了基于‘相对于野生型的总双特异性量的变化’的计算(图10A，双特异性％的变化)或基于‘相对于野生型的总配对量的变化’的计算(图10B，配对％的变化)来比较每个群组的代表性设计的性能的箱线图。对于K-K衍生的K-L群组，每个群组只有一个设计被测试，因此群组可转移性等同于上文讨论的设计可转移性。
总体而言，K-L设计能够比K-K衍生的K-L设计更有效地促进优先配对。图11示出了基于‘相对于野生型的总双特异性量的变化’的计算描绘K-L设计和K-K衍生的K-L设计在每个测试的系统中促进优先配对的能力的箱线图。例如，图11显示，与K-K衍生的K-L设计相比，K-L设计通常促进双特异性抗体量相对于野生型的更大增加(比较每个系统的“k1全部”值与“kk全部”值)。当只考虑可以在2个或更多个或全部3个系统中转移的设计时也是如此。
实施例17：对所选SMCA双特异性抗体和亲本Mab进行制备型尺寸排阻色谱(SEC)分析以用于生物物理表征
为了评估在实施例16中描述的SMCA中产生的双特异性抗体的生物物理特性，对通过蛋白A纯化的来自所测试的代表性设计子集的SMCA样品进行制备型SEC以去除半Ab种类。选择具有至少60％“H1L1_H2L2和H1L2_H2L1**”(总双特异性)的SMCA样品用于该步骤(总共36个样品)。为了完整性，还包括了一些不符合该截止值的SMCA样品。例如，如果特定设计的SMCA样品在所测试的三个双特异性系统中的两个中符合该截止值(SMCA样品符合该截止值，但在第三个系统中不符合)，则包括所有3个系统的SMCA样品。如下进行制备型SEC。使用Superdex 200 10/300 Increase(GE Healthcare)柱来分离SMCA样品中的抗体种类，该柱安装在配备有用于将样品注射到柱上的ALIAS Bio Cool自动取样器(Spark-Holland)的GEHealthcare25系统上。将在PBS pH 7.4(Hyclone DPBS/改良型，无钙、无镁，目录号SH-300028.02)中的SMCA样品(0.9ml)自动加载到填充有PBS的2ml环形管中。然后将样品自动注射到柱上并以1CV洗脱体积在0.5ml/min下解析。在OD280处监测到蛋白质洗脱并收集在0.5ml级分中。对于每个SMCA样品，汇集包含主峰的级分(通过Caliper评估级分)并如实施例19和20中所述进一步进行生物物理表征。
实施例18：通过制备型尺寸排阻色谱法去除半抗体
在实施例16中，注意到从根据‘总双特异性’计算进行的配对计算中排除了半Ab，因为所产生的半Ab的百分比可以通过DNA滴定来操纵，或者在‘Fc链A’类型的半Ab的情况下，这些半Ab还可以通过经蛋白A纯化的SMCA样品的制备型SEC纯化来去除/减至最少。为了证明“Fc链A半Ab”的去除，如实施例16中所述对来自实施例17的关于所有三个双特异性系统中的两个K-L设计的纯化SMCA样品进行LC-MS分析。所选的两个K-L设计是2901和3972(如表11A中所示)。结果示于表18中。
将表18中的LC-MS数据与表14中的经蛋白A纯化的SMCA样品的相应LC-MS数据进行比较，结果表明制备型SEC可以有效去除/最大程度地减少‘Fc链A’类型的半Ab种类(2901和3972中的H1L1)。在所有测试的样品中，所需双特异性抗体种类(H1L1_H2L2和H1L2_H2L1)的百分比提高以及“Fc链A”类型的半抗体种类(表18中的H1L1)的百分比减少。
实施例19：SMCA双特异性抗体的热稳定性。
在制备型SEC之后，测量通过制备型SEC纯化的SMCA双特异性抗体的热稳定性，并与亲本CAT-2200、帕妥珠单抗、CR8071和SGN-CD19a单克隆抗体进行比较，以确定氨基酸取代是否对热稳定性具有任何影响。
热稳定性测量
如下使用差示扫描量热法(DSC)测量所选双特异性异二聚体抗体和野生型对照的热稳定性。在进行制备型SEC处理后，使用VP-Capillary DSC(GE Healthcare)对在PBS中的浓度主要为0.4mg/ml的400μL样品进行DSC分析。在每次DSC运行开始时，进行5次缓冲液空白注射以稳定基线，并且在每次样品注射前进行缓冲液注射以供参照。每个样品以60℃/hr的速率，在低反馈、8秒滤波器、3分钟preTstat和70psi氮气压力从20℃到100℃进行扫描。使用Origin 7软件引用和分析得到的热谱图。
结果示于表20和表21中。用于计算表中报告的“Fab Tm与野生型的平均差异(℃)”的野生型Fab Tm值是从亲本抗体CAT-2200(71.2℃)、帕妥珠单抗(76.7℃)、CR8071(66.9℃，对应于主峰)和SGN-CD19a(91.0℃)的DSC热谱图获得。CR8071亲本抗体展现两个Fab转变。对于亲本抗体，观察到Fc的CH2和CH3结构域具有额外的热转变(分别在约71℃和82℃下)，其中这些转变不与Fab转变重叠(图12)。一些具有大量H2L2‘Fc链B’半抗体的设计在约60℃下展现出额外的热转变，这可能是由于非共价同二聚体的存在。在一些情况下，设计引起帕妥珠单抗Fab的Tm降低，从而导致这些样品中的CAT-2200Fab、帕妥珠单抗Fab和CH2峰的重叠(图12A，代表性设计3972)。同样地，许多设计使得SGN-CD19a Fab的Tm降低到导致与那些抗体中的CH3峰重叠的程度(图12B和12C，代表性设计3972)。这些重叠导致对贡献性Fab成分的Tm赋值产生一些模糊，因此表20和21中报告的Tm值被认为是近似值。有趣的是，包含设计的CR8071/SGN-CD19a双特异性抗体展现出单一CR8071 Fab转变，而不是在野生型双特异性抗体中观察到的两个转变(例如图12C)。
在所有测试的K-L设计中，所有系统中的Fab Tm与野生型的平均差异在6个设计中介于0℃和-1.5℃之间，在11个设计中介于-1.5℃和-3.0℃之间，以及在15个设计中介于-3.0℃和-4.5℃之间(表20)。在所有测试的K-K衍生的K-L设计中，平均差异在2个设计中介于0℃和-1.5℃之间，在1个设计中介于-1.5℃和-3.0℃之间，以及在1个设计中介于-3.0℃和-4.5℃之间(表21)。对于测试的所有设计，Fab Tm与野生型的平均差异对于CAT-2200为-0.9℃(STDEV＝1.4)，对于帕妥珠单抗为-4.6℃(STDEV＝1.6)，对于SGN-CD19a为-5.8℃(STDEV＝3.5)，并且对于CR8071为+1.1℃(STDEV＝0.8)。图13描绘了关于测试的设计、测试的所有设计(“全部”)或互补位(CAT-2200、帕妥珠单抗、CR8071或SGN-CD19a)的与亲本抗体相比的Fab Tm变化的箱线图。
实施例20：双特异性抗体的抗原亲和力测量
评估双特异性抗体结合适当抗原的能力，以确定氨基酸取代是否对抗原结合具有任何影响。如下通过SPR测定抗原结合亲和力。
SPR生物传感器测定
对于在Biacore T200上进行的研究：CM5 S系列传感芯片、Biacore胺偶联试剂盒(NHS、EDC和1M乙醇胺)和10mM乙酸钠缓冲液购自GE Healthcare Life Science(Mississauga，ON，Canada)。对于在Biorad ProteOn上进行的研究：GLC传感芯片、BioradProteOn胺偶联试剂盒(EDC、sNHS和乙醇胺)和10mM乙酸钠缓冲液购自Bio-RadLaboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON)。含有0.05％Tween20的PBS运行缓冲液(PBST)购自Teknova Inc.(Hollister，CA)。山羊多克隆抗人Fc抗体购自Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.(West Grove，PA)。抗原：His标记的重组人CD-19购自Abcam(Cambridge，UK)，且His标记的B型流感血凝素(B/Brisbane/60/2008)购自SinoBiological(中国北京)。重组Her2胞外结构域(ECD)蛋白购自eBioscience(San Diego，CA)。重组人IL-17A购自R&D Systems(Mineapolis，MN)。
使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)和PBST运行缓冲液(添加0.5M EDTA原液至3.4mM终浓度)，在25℃的温度下用抗原血凝素和CD-19进行表面等离振子体共振(SPR)测定。使用BioRad ProteOn XPR36仪器(Bio-Rad Laboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON))和PBST运行缓冲液，在25℃的温度下用抗原HER2 ECD和IL-17进行表面等离振子体共振测定。
SGN-CD19a：CD-19亲和力测定如下进行。筛选用于结合CD-19抗原的抗体(通过制备型SEC纯化的SMCA样品和OAA对照)分两个步骤进行：将His标记的CD-19间接捕获到抗HisIgG表面上，随后注射5种浓度的纯化抗体用于使用单循环动力学进行动力学分析。根据制造商的说明书，在CM5S系列传感芯片上通过将约12000RU的抗His IgG(His Capture Kit，GE Healthcare)胺偶联到活性和参照流动池上来制备抗His捕获表面。以10μl/min的流速在活性流动池上方注射10μg/ml CD-19持续60秒。通常，这导致在抗His IgG表面上捕获约250RU的CD-19。未在参照(空白)流动池上捕获CD-19。在捕获步骤之后以40μl/min在活性和参照流动池上方连续注射5种浓度的纯化抗体(200nM和2倍稀释，80nM和2倍稀释，或40nM和2倍稀释；取决于抗体)持续180秒(解离阶段为600秒)。捕获抗体的表面通过持续120秒的以30μl/min的10mM甘氨酸(pH 1.5)再生以准备用于下一注射循环的表面。对于每个分析物注射进行至少两次mock缓冲液注射并且用于参考。使用Biacore T200 BiaEvaluation软件3.0版分析得到的单循环动力学传感图，并拟合至1∶1结合模型。
CR8071：血凝素亲和力测定如下进行。将血凝素(HA)在10mM乙酸盐缓冲液(pH5.5)中稀释，并通过胺偶联直接固定到CM5 S系列传感芯片上。这产生约120-130RU的固定HA。将参考流动池留空(用乙醇胺封闭)以用作空白对照。在HA表面上方注射抗体以用于使用单循环动力学进行动力学分析。以50μl/min在活性和参照流动池上方连续注射五种浓度(40nM和2倍稀释)的纯化抗体(通过制备型SEC纯化的SMCA样品以及OAA对照)持续300秒(解离阶段为3600秒)。HA表面通过使用两次持续120秒的以30μl/min的10mM甘氨酸(pH 1.5)再生以准备用于下一注射循环的表面。对于每个分析物注射进行至少两次mock缓冲液注射以用于参考。使用Biacore T200 BiaEvaluation软件3.0版分析得到的单循环动力学传感图，并拟合至1∶1结合模型。
CAT-2200：IL-17亲和力测定如前文在实施例6中所述进行，但作出如下修改：测试的抗体是通过制备型SEC纯化的SMCA样品和OAA对照，而不是CAT-2200 Fab。对照抗体之一13612以10nM而不是60nM开始注射。
帕妥珠单抗：HER2亲和力测定如下进行。所有通道用25μg/ml山羊抗人IgG(Fcγ片段特异性(抗人Fc))水平固定。平均4058个共振单位(RU)被固定。使用GLC传感芯片产生抗人Fc抗体捕获表面，所述传感芯片通过沿分析物(水平)方向以100μl/min注射标准BioRadsNHS/EDC溶液的1∶10稀释液140秒来激活。激活后，立即沿分析物(水平)方向以25μl/min的流速注射抗人Fc抗体在10mM NaOAc(pH 4.5)中的25μg/ml溶液240秒，直至约4000个共振单位(RU)被固定。通过同样沿分析物方向以30μl/min持续3000s注射1M乙醇胺140秒使剩余的活性基团淬灭，以确保创建了用于空白参考的mock激活中间点。筛选与HER2结合的抗体分两个步骤进行：将抗体(通过制备型SEC纯化的SMCA样品以及OAA对照)沿配体方向间接捕获到抗人IgG(Fcγ片段特异性)表面上，随后沿分析物方向同时注射5种浓度的纯化HER2 ECD和用于双重参考的一个缓冲液空白。首先，沿配体方向以100μL/min进行一次缓冲液注射30秒以稳定基线。对于每个抗体捕获，将抗体在PBST中稀释至2μg/ml。将1至5个抗体或对照以25μl/min的流速同时注入各个配体通道中480秒。这导致在抗人Fc表面上捕获约800-1200个RU。如果需要，第一个配体通道留空以用作空白对照。在该捕获步骤之后，紧接着沿分析物方向进行一次缓冲液注射以稳定基线，然后以50μl/min同时注射100nM、33.3nM、11.1nM、3.7nM和0.41nM HER2以及缓冲液空白120秒(具有300秒解离阶段)。捕获抗体的表面通过0.85％磷酸的两次持续18秒的100μl/min脉冲再生以准备下一注射循环。对齐传感图并使用缓冲液空白注射和中间点进行双重参考，并使用ProteOn Manager软件v3.1分析得到的传感图。将经过双重参考的传感图拟合至Langmuir结合模型。
参照相应的OAA(单臂)野生型对照来评估异二聚体抗体的抗原亲和力。还获得了野生型双特异性抗体的抗原亲和力；然而，野生型双特异性抗体的SPR捕获可能是不均匀的(例如，涉及捕获错配的异二聚体)，从而干扰KD测定。此外，以含有存在于抗体中的相关轻链标签的OAA形式测量野生型亲和力。观察到标签的存在使得SGN-CD-19a对CD19的亲和力降低多达4-5倍(表19)。例如，在向轻链添加FLAG标签的情况下，所测得的SGN-CD-19a对CD19的结合亲和力从67.5nM降至224.5nM(表19)。因此，相对于野生型的亲和力变化的所有计算均使用匹配的标记野生型构建体的中值进行。
当测量与CD-19的结合时，一些抗体的传感图无法拟合至1∶1结合模型。在这些情况下，抗体含有大量易于同源二聚化的“Fc链B”半抗体，其引起亲和力效应并且遮盖了Fab结合行为。对于受影响的抗体，以OAA形式进一步评估结合亲和力。
大多数经测试的设计(36个设计对应于制备的96个双特异性抗体)表现出与相应的野生型相当的KD值(表20和21，图14)。与野生型相比，9个设计的Fab表现出降低2至3倍的亲和力，并且在一个设计的Fab中观察到亲和力降低4倍。在这10个Fab中，只有一个设计(#34)出现两次，并且10个受影响的Fab中的8个是CR8071。所有具有弹头的设计(warheadprosessing design)的log(KD)与野生型的平均差异(-(log KD_抗体-log KD_野生型))为0.003，标准偏差为0.187(例如，-0.3对应于亲和力降低2倍；-0.6对应于亲和力降低4倍)。这些结果汇总于图14中，其描绘了关于测试的设计、测试的所有设计(“全部”)或互补位(CAT-2200、帕妥珠单抗、CR8071或SGN-CD19a)的与亲本抗体相比的亲和力变化的箱线图。
实施例21：工程改造的双特异性抗体与亲本抗体相比的超高效液相色谱-尺寸排阻色谱(UPLC-SEC)特征
为了评估工程改造的双特异性抗体的质量，对如实施例17中所述由制备型SEC纯化的抗体进行UPLC-SEC。使用安装在具有PDA检测器的Waters Acquity UPLC系统上并被设定为30℃的Waters BEH200 SEC柱(2.5mL；4.6×150mm；不锈钢；1.7μm颗粒)进行UPLC-SEC。运行时间为7分钟，并且每次注射的总体积为2.8mL(含有PBS和0.02％Tween 20(pH 7.4)的运行缓冲液)，流速为0.4ml/min。通过在210-400nm范围内的UV吸光度监测洗脱，并且在280nm处提取色谱图。使用Empower 3软件进行峰积分。
图15A-D描绘了亲本抗体的UPLC-SEC特征，并且图15E-G描绘了对应于三种双特异性系统中的设计3972抗体的UPLC-SEC特征。在此使用示例性设计3972来证明具有高双特异性含量(＞80％)的设计/工程改造的双特异性抗体具有与亲本抗体相当的UPLC-SEC特征。对于此类工程改造的双特异性抗体，单体种类的中值百分比为95.2％(即检测到很少或没有高分子量种类)。
出于所有目的，在本说明书的正文中引用的所有参考文献、授权专利、专利申请和序列登录号(例如，Genbank登录号)通过引用整体并入本文。
表1：Fab模型标准
表2：D3H44(1JPT，含有κ轻链的典型Fab)和CAT-2200(2VXS，含有λ轻链的典型Fab)的重链和轻链的界面处的热点氨基酸位置(用星号标记)
表3A.D3H44、帕妥珠单抗和CAT-2200 Fab的重链氨基酸序列的Kabat编号
表3B.D3H44、帕妥珠单抗和CAT-2200的轻链氨基酸序列的Kabat编号
表3C.氨基酸和DNA序列
表8B：通过性能截止标准的来自第二K-K衍生K-L设计文库的K-K衍生K-L设计的LCCA结果
表23：配对种类％/错配种类％与LCCA标量值的对应关系表
表24：SMCA设计编号和对应的LCCA组唯一识别符
*设计与LCCA设计13304-13466相同，但L2中的Q124位置作为Q124K进行测试。
序列表
<110> Zymeworks Inc.
<120> 包含κ和λ轻链的抗原结合多肽构建体及其用途
<130> V810793WO
<140> 未指定
<141> 2016-10-07
<150> US 62/239,206
<151> 2015-10-08
<150> US 62/261,769
<151> 2015-12-01
<160> 20
<170> PatentIn 3.5 版
<210> 1
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成帕妥珠单抗重链Fab (结构域边界：VH；E1 -
S119，CH1；A120 - V217，铰链（局部）；E218 - T227)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr
225
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成帕妥珠单抗轻链(κ) (结构域边界：VL；
D1 - K107, CL；R108 - C214)
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 3
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成CAT-2200重链Fab (结构域边界：VH；E1 -
S118, CH1；A119 - V216, 铰链（局部）；E217 - T226)
<400> 3
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Ile His Gly Val Thr Arg Asn Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Gln Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr
225
<210> 4
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成CAT-2200轻链(λ) (结构域边界：VL；
N1 - L110, CL；G111 - S216)
<400> 4
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Ile Val
35 40 45
Ile Phe Ala Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Asp Pro
85 90 95
Tyr Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 5
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成IgG1 Fc (结构域边界：铰链（局部）；C1 - P5,
CH2；A6 - K115, CH3；G116 - K222)
<400> 5
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 6
<211> 666
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成IgG1 Fc
<400> 6
tgccctccct gtccagctcc agaactgctg ggaggaccta gcgtgttcct gtttccccct 60
aagccaaaag acactctgat gatttccagg actcccgagg tgacctgcgt ggtggtggac 120
gtgtctcacg aggaccccga agtgaagttc aactggtacg tggatggcgt ggaagtgcat 180
aatgctaaga caaaaccaag agaggaacag tacaactcca cttatcgcgt cgtgagcgtg 240
ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac gggaaggagt ataagtgcaa agtcagtaat 300
aaggccctgc ctgctccaat cgaaaaaacc atctctaagg ccaaaggcca gccaagggag 360
ccccaggtgt acacactgcc acccagcaga gacgaactga ccaagaacca ggtgtccctg 420
acatgtctgg tgaaaggctt ctatcctagt gatattgctg tggagtggga atcaaatgga 480
cagccagaga acaattacaa gaccacacct ccagtgctgg acagcgatgg cagcttcttc 540
ctgtattcca agctgacagt ggataaatct cgatggcagc aggggaacgt gtttagttgt 600
tcagtgatgc atgaagccct gcacaatcat tacactcaga agagcctgtc cctgtctccc 660
ggcaaa 666
<210> 7
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成帕妥珠单抗重链Fab
<400> 7
gaagtgcagc tggtcgaatc tggaggagga ctggtgcagc caggagggtc cctgcgcctg 60
tcttgcgccg ctagtggctt cacttttacc gactacacca tggattgggt gcgacaggca 120
cctggaaagg gcctggagtg ggtcgccgat gtgaacccaa atagcggagg ctccatctac 180
aaccagcggt tcaagggccg gttcaccctg tcagtggacc ggagcaaaaa caccctgtat 240
ctgcagatga atagcctgcg agccgaagat actgctgtgt actattgcgc ccggaatctg 300
gggccctcct tctactttga ctattggggg cagggaactc tggtcaccgt gagctccgcc 360
tccaccaagg gaccttctgt gttcccactg gctccctcta gtaaatccac atctggggga 420
actgcagccc tgggctgtct ggtgaaggac tacttcccag agcccgtcac agtgtcttgg 480
aacagtggcg ctctgacttc tggggtccac acctttcctg cagtgctgca gtcaagcggg 540
ctgtacagcc tgtcctctgt ggtcaccgtg ccaagttcaa gcctgggaac acagacttat 600
atctgcaacg tgaatcacaa gccatccaat acaaaagtcg acaagaaagt ggaacccaag 660
tcttgtgata aaacccatac a 681
<210> 8
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成帕妥珠单抗轻链(κ)
<400> 8
gatattcaga tgacccagtc cccaagctcc ctgagtgcct cagtgggcga ccgagtcacc 60
atcacatgca aggcttccca ggatgtgtct attggagtcg catggtacca gcagaagcca 120
ggcaaagcac ccaagctgct gatctatagc gcctcctacc ggtataccgg cgtgccctct 180
agattctctg gcagtgggtc aggaacagac tttactctga ccatctctag tctgcagcct 240
gaggatttcg ctacctacta ttgccagcag tactatatct acccatatac ctttggccag 300
gggacaaaag tggagatcaa gaggactgtg gccgctccct ccgtcttcat ttttccccct 360
tctgacgaac agctgaaaag tggcacagcc agcgtggtct gtctgctgaa caatttctac 420
cctcgcgaag ccaaagtgca gtggaaggtc gataacgctc tgcagagcgg caacagccag 480
gagtctgtga ctgaacagga cagtaaagat tcaacctata gcctgtcaag cacactgact 540
ctgagcaagg cagactacga gaagcacaaa gtgtatgcct gcgaagtcac acatcagggg 600
ctgtcctctc ctgtgactaa gagctttaac agaggagagt gt 642
<210> 9
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成CAT-2200重链Fab
<400> 9
gaggtgcagc tgctggaatc tggggggggc ctggtgcagc ctggggggtc cctgagactg 60
tcatgtgctg ccagcgggtt tactttcagc tcctacgcta tgtcctgggt gcgacaggca 120
cccgggaagg gactggagtg ggtctctgca atcagtgggt caggcgggag tacttactat 180
gccgacagcg tgaagggacg gttcactatc tcaagagata acagcaagaa caccctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agcagaagac acagccgtgt actattgcgc cagggatctg 300
atccacggag tcactcgcaa ttggggccag gggactctgg tgaccgtctc tagtgctagc 360
acaaaggggc cctctgtgtt tccactggcc ccctcaagca aaagcacatc cggaggaact 420
gcagctctgg gatgtctggt gaaggactac ttcccccagc ctgtgaccgt ctcttggaac 480
agtggagccc tgaccagcgg cgtgcacaca tttcctgctg tcctgcagtc ctctggcctg 540
tactccctga gttcagtggt cacagtgcct agctcctctc tggggaccca gacatatatt 600
tgcaacgtga atcataaacc aagcaacact aaggtcgaca agaaagtgga gcccaagagc 660
tgtgataaaa ctcatacc 678
<210> 10
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成CAT-2200轻链(λ)
<400> 10
aactttatgc tgactcagcc ccactccgtg tccgagagcc ctggcaaaac tgtgactatt 60
tcatgtaccc gatcatctgg aagcctggcc aactactatg tgcagtggta ccagcagagg 120
ccaggcagct cccccactat cgtgattttc gctaacaatc agcggccttc cggcgtccca 180
gacagatttt ccgggtctat cgattctagt tcaaatagtg catcactgac tatttccggg 240
ctgaagaccg aggacgaagc cgattactat tgccagacct acgaccccta ttctgtggtc 300
ttcggcgggg gaaccaagct gacagtgctg ggacagccaa aagcggcgcc cagtgtcaca 360
ctgtttcccc ctagctccga ggaactgcag gctaacaaag caacactggt gtgtctgatc 420
agcgacttct accctggagc tgtgactgtc gcctggaagg ctgattctag tccagtgaaa 480
gcaggcgtcg agaccacaac tccctctaag cagagtaaca acaagtacgc agcctcaagc 540
tatctgtcac tgaccccaga acagtggaag agccaccgga gctattcctg ccaggtcact 600
cacgaaggct ccactgtcga gaaaaccgtc gctcccaccg aatgttca 648
<210> 11
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成人IgG1 Fc序列231-447(EU编号)，无铰链
<400> 11
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 12
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成SGN-CD19a重链Fab (结构域边界：VH；
Q1-S120, CH1；A121-V218, 铰链（局部）；E219-T228)
<400> 12
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Met Glu Leu Trp Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr
225
<210> 13
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成SGN-CD19a轻链(κ) (结构域边界：VL；
E1-K106, CL；R107-C213)
<400> 13
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Val Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 14
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成CR8071重链Fab (结构域边界：VH；Q1-S125,
CH1；A126-V223, 铰链（局部）；E224-T233)
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Glu Ser
20 25 30
Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Gly Tyr Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Lys Asp Thr Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Tyr Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Val Gln Tyr Ser Gly Ser Tyr Leu Gly Ala Tyr Tyr Phe
100 105 110
Asp Tyr Trp Ser Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
225 230
<210> 15
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成CR8071轻链(λ) (结构域边界：VL；
Q1-L110，CL；R111-S216)
<400> 15
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Ser Tyr Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asp Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 16
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成SGN-CD19a重链Fab
<400> 16
caggtgacac tgagagaatc cggcccagcc ctggtgaagc ccactcagac cctgacactg 60
acttgcacct tctctgggtt ttccctgtct acaagtggga tgggagtggg atggatcagg 120
cagccacctg gaaaagccct ggagtggctg gctcacattt ggtgggacga tgacaagcgg 180
tacaacccag cactgaaaag cagactgaca atcagcaagg atacttccaa aaaccaggtg 240
gtcctgacaa tgactaatat ggaccccgtg gacacagccg cttactattg cgcccgcatg 300
gaactgtgga gctactattt cgactactgg gggcagggaa cactggtcac tgtgagctcc 360
gctagcacta aggggccttc cgtgtttcca ctggctccct ctagtaaatc cacctctgga 420
ggcacagctg cactgggatg tctggtgaag gattacttcc ctgaaccagt cacagtgagt 480
tggaactcag gggctctgac aagtggagtc catacttttc ccgcagtgct gcagtcaagc 540
ggactgtact ccctgtcctc tgtggtcacc gtgcctagtt caagcctggg cacccagaca 600
tatatctgca acgtgaatca caagccatca aatacaaaag tcgacaagaa agtggagccc 660
aagagctgtg ataaaactca tacc 684
<210> 17
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成SGN-CD19a轻链(κ)
<400> 17
gagatcgtgc tgacccagtc tccagccaca ctgtctctga gcccaggaga gagggccacc 60
ctgtcctgct ctgccagctc cagcgtgagc tacatgcact ggtatcagca gaagccagga 120
caggccccta ggctgctgat ctacgacacc agcaagctgg cctccggcat ccccgcaaga 180
ttcagcggct ccggctctgg cacagacttt accctgacaa tcagctccct ggagcctgag 240
gatttcgccg tgtactattg ttttcagggc agcgtgtatc cattcacctt tggccagggc 300
acaaagctgg agatcaagcg gacagtggcg gcgcccagtg tcttcatttt tccccctagc 360
gacgaacagc tgaagtctgg gacagccagt gtggtctgtc tgctgaacaa cttctaccct 420
agagaggcta aagtgcagtg gaaggtcgat aacgcactgc agtccggaaa ttctcaggag 480
agtgtgactg aacaggactc aaaagatagc acctattccc tgtcaagcac actgactctg 540
agcaaggccg actacgagaa gcataaagtg tatgcttgtg aagtcaccca ccaggggctg 600
agttcaccag tcacaaaatc attcaacaga ggggagtgc 639
<210> 18
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成CR8071重链Fab
<400> 18
caggtgcagc tggtccagtc cggggctgaa gtgaaaaaac ctggggcatc cgtgcgggtg 60
tcatgtcggg caagcgggta tatctttact gagtctggaa tcacctgggt gaggcaggct 120
cccggacagg gactggaatg gatgggatgg atttctggat acagtggcga cacaaagtat 180
gcacagaaac tgcagggccg cgtcaccatg acaaaggata cttcaaccac aactgcctac 240
atggagctgc ggagcctgag atatgacgat acagccgtgt actattgcgc ccgggacgtg 300
cagtacagcg ggtcctacct gggggcatac tacttcgatt actggtcacc tggaactctg 360
gtcaccgtct cttcagctag caccaagggc ccttctgtgt ttccactggc accctcaagc 420
aaaagcacct ccggaggaac agcagcactg ggatgtctgg tcaaggacta tttccccgag 480
cctgtgaccg tctcatggaa tagcggcgca ctgactagtg gggtgcacac ctttcccgcc 540
gtcctgcagt cctctgggct gtacagcctg agttcagtgg tcacagtgcc aagctcctct 600
ctgggaactc agacctatat ctgcaacgtc aatcataaac ccagcaacac aaaggtcgac 660
aagaaagtgg agcccaagag ctgtgataaa actcatacc 699
<210> 19
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成CR8071轻链(λ)
<400> 19
cagagcgtcc tgactcagcc tccctccgcc tccggaacac ctgggcagag agtgactatc 60
tcctgtagcg gatcaagctc aaacattgga accaactacg tgtattggta ccagcagttc 120
cccggcacag ctcctaagct gctgatctat cggagctacc agagaccaag cggggtcccc 180
gacaggtttt ctggcagtaa atcagggagc tccgccagcc tggctatttc cggcctgcag 240
tctgaggacg aagcagatta ctattgcgcc acctgggacg attccctgga tggatgggtc 300
ttcggcggcg gcacaaaact gaccgtcctg aggcagccaa aggcggcgcc cagtgtcaca 360
ctgtttcccc ctagctccga ggaactgcag gctaacaaag caacactggt gtgtctgatc 420
agcgacttct accctggagc tgtgactgtc gcctggaagg ctgattctag tccagtgaaa 480
gcaggcgtcg agaccacaac tccctctaag cagagtaaca acaagtacgc agcctcaagc 540
tatctgtcac tgaccccaga acagtggaag agccaccgga gctattcctg ccaggtcact 600
cacgaaggct ccactgtcga gaaaaccgtc gctcccaccg aatgttca 648
<210> 20
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成变体人IgG1 Fc序列231-447 (EU编号)，无铰链
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (120)..(120)
<223> Xaa是Thr或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (121)..(121)
<223> Xaa是Leu或Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (136)..(136)
<223> Xaa是Thr或Leu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (160)..(160)
<223> Xaa是Asn或Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (162)..(162)
<223> Xaa是Lys、Met或Leu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (164)..(164)
<223> Xaa是Thr或Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (170)..(170)
<223> Xaa是Ser或Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (175)..(175)
<223> Xaa是Phe或Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (177)..(177)
<223> Xaa是Tyr或Val
<400> 20
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Xaa Xaa Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Xaa Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Xaa
145 150 155 160
Tyr Xaa Thr Xaa Pro Pro Val Leu Asp Xaa Asp Gly Ser Phe Xaa Leu
165 170 175
Xaa Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
Claims (44)
1.一种抗原结合多肽构建体，其包含第一异二聚体和第二异二聚体，
所述第一异二聚体(H1L1)包含形成特异性结合第一抗原的第一Fab区的第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和免疫球蛋白λ轻链多肽序列(L1)；并且所述第二异二聚体(H2L2)包含形成特异性结合第二抗原的第二Fab区的第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和免疫球蛋白κ轻链多肽序列(L2)，
其中：
H1不同于H2，并且H1和H2各自包含重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域1(CH1结构域)；
L1包含λ轻链可变(VL-λ)结构域和λ轻链恒定(CL-λ)结构域，且L2包含κ轻链可变(VL-κ)结构域和κ轻链恒定(CL-κ)结构域；并且
与相应的野生型H1、H2、L1和L2多肽序列相比，H1、H2、L1和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对和/或促进H2与L2而非L1优先配对的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰不去除天然存在的半胱氨酸残基。
2.根据权利要求1所述的构建体，其中当H1、H2、L1和L2在细胞或哺乳动物细胞中共表达时，或当H1、H2、L1和L2在无细胞表达系统中共表达时，或当H1和L1在细胞中产生且H2和L2在不同的细胞中产生并且两个细胞的产物通过氧化还原产生方法混合时，或当H1和L1在无细胞表达系统中产生且H2和L2在不同的无细胞表达系统中产生并且两个无细胞表达系统的产物混合时，所述氨基酸修饰促进H1与L1而非L2优先配对和/或促进H2与L2而非L1优先配对。
3.根据权利要求1或2所述的抗原结合多肽构建体，其中每个异二聚体包含单个Fab。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗原结合多肽构建体，其中：
a.H2包含位置143处的氨基酸取代；L2包含位置124处的氨基酸取代；并且
i.H1包含位置186或179处的氨基酸取代；且L1包含位置180处的氨基酸取代；
ii.H1包含位置186处的氨基酸取代；且L1包含位置133处的氨基酸取代；
iii.H1包含位置143处的氨基酸取代；且L1包含位置133处的氨基酸取代；或
iv.H1包含位置188处的氨基酸取代；且L1包含位置178处的氨基酸取代；
b.H1包含位置143处的氨基酸取代；L1包含位置131处的氨基酸取代；并且
i.H2包含位置186或124_186处的氨基酸取代；且L2包含位置133或133_160或124_133或176_180处的氨基酸取代；或
ii.H2包含位置188处的氨基酸取代；且L2包含位置131处的氨基酸取代；
iii.H2包含位置143处的氨基酸取代；且L2包含位置124_133或124_133_180处的氨基酸取代；
c.H1包含位置143处的氨基酸取代；L1包含位置131处的氨基酸取代；并且
i.H2包含位置124_186或124_179或188处的氨基酸取代；且L2包含位置176_178或176_180或131处的氨基酸取代；或
ii.H2包含位置143_188或143或124_143处的氨基酸取代；且L2包含位置124_176_178或124_178或124_180或124_176_180或124或124_176处的氨基酸取代；
d.H1包含位置179、186、143和/或188处的氨基酸取代；L1包含位置180、133和/或176_178处的氨基酸取代；H2包含位置143处的氨基酸取代；且L2包含位置131和/或124处的氨基酸取代；
e.H1包含位置39处的氨基酸取代或不包含促进优先配对的氨基酸取代；L1包含位置38处的氨基酸取代或不包含促进优先配对的氨基酸取代；H2包含位置39处的氨基酸取代；且L2包含位置38处的氨基酸取代；
f.H1包含位置143处的氨基酸取代；L1包含位置131处的氨基酸取代；并且
i.H2包含位置188或124_186处的氨基酸取代；且L2包含位置176_178或176_180或131处的氨基酸取代；或
ii.H2包含位置143或186处的氨基酸取代；且L2包含位置124_133或124_133_180处的氨基酸取代；
g.H1包含位置188处的氨基酸取代；L1包含位置176_178或178处的氨基酸取代；并且
i.H2包含位置177_188处的氨基酸取代；且L2包含位置176_178处的氨基酸取代；或
ii.H2包含位置186或124或124_179处的氨基酸取代；且L2包含位置176或131_176处的氨基酸取代；
h.H1包含位置186处的氨基酸取代；L1包含位置133处的氨基酸取代；并且
i.H2包含位置188处的氨基酸取代；且L2包含位置131处的氨基酸取代；或
ii.H2包含位置177_188处的氨基酸取代；且L2包含位置176_178处的氨基酸取代；或
H1包含位置124_190处的氨基酸取代；L1包含位置135处的氨基酸取代；H2包含位置124或188处的氨基酸取代；且L2包含位置176或176_178处的氨基酸取代；
i.H1包含位置177_188处的氨基酸取代；L1包含位置176_178处的氨基酸取代；并且
i.H2包含位置188处的氨基酸取代；且L2包含位置176_178或131处的氨基酸取代；
ii.H2包含位置186处的氨基酸取代；且L2包含位置133或124_160_180处的氨基酸取代；
iii.H2包含位置124或124_179或124_186处的氨基酸取代；且L2包含位置176或176_178或176_180处的氨基酸取代；或
iv.H2包含位置143处的氨基酸取代；且L2包含位置133或124_133处的氨基酸取代；
j.H1包含位置188处的氨基酸取代；L1包含位置178处的氨基酸取代；H2包含位置124或188处的氨基酸取代；且L2包含位置176_178或176_180或176处的氨基酸取代；
k.或H1包含位置145_188处的氨基酸取代；L1包含位置178处的氨基酸取代；且H2包含位置124和/或188处的氨基酸取代；且L2包含位置124、133和178中的一个或多个处的氨基酸取代；
l.H1包含位置174、179或186处的氨基酸取代；L1包含位置176或180处的氨基酸取代；H2包含位置143或190处的氨基酸取代；且L2包含位置131、135或124处的氨基酸取代；或
m.H1包含位置174处的氨基酸取代；L1包含位置176处的氨基酸取代；H2包含位置190处的氨基酸取代；且L2不包含促进优先配对的氨基酸取代或包含位置135处的氨基酸取代；
n.H1包含位置143_190处的氨基酸取代；L1包含位置133处的氨基酸取代；H2包含位置124处的氨基酸取代；且L2包含位置131_135处的氨基酸取代；
o.H1包含位置143和/或186处的氨基酸取代；L1包含位置133处的氨基酸取代；H2包含位置124处的氨基酸取代；且L2包含位置131处的氨基酸取代；
p.H1包含位置143_179处的氨基酸取代；L1包含位置124_178处的氨基酸取代；H2包含位置186处的氨基酸取代；且L2包含位置178_180或160_180处的氨基酸取代；
q.H1包含位置143处的氨基酸取代；L1包含位置124处的氨基酸取代；H2包含位置179或186处的氨基酸取代；且L2包含位置124_160_180处的氨基酸取代；
r.H1包含位置186处的氨基酸取代；L1包含位置180或178_180处的氨基酸取代；H2包含位置143和/或179处的氨基酸取代；且L2包含位置124_178或131处的氨基酸取代；
s.H1包含位置179处的氨基酸取代；L1包含位置180处的氨基酸取代；H2包含位置143处的氨基酸取代；且L2包含位置124处的氨基酸取代；
t.H1包含位置143或186处的氨基酸取代；L1包含位置180处的氨基酸取代或不包含促进优先配对的氨基酸取代；H2包含位置143_145处的氨基酸取代；且L2包含位置124处的氨基酸取代；
u.H1不包含促进优先配对的氨基酸取代；L1包含位置135处的氨基酸取代；H2包含位置139处的氨基酸取代；且L2包含位置116处的氨基酸取代；
v.H1不包含促进优先配对的氨基酸取代或包含位置45处的氨基酸取代；L1不包含促进优先配对的氨基酸取代；H2包含位置45处的氨基酸取代；且L2包含位置44处的氨基酸取代；
w.H1包含位置139处的氨基酸取代；L1包含位置116处的氨基酸取代；H2不包含促进优先配对的氨基酸取代；且L2包含位置135处的氨基酸取代；或
x.H1包含位置124处的氨基酸取代；L1包含位置176处的氨基酸取代；H2包含位置124处的氨基酸取代；且L2包含位置176处的氨基酸取代。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗原结合多肽构建体，其中所述第一Fab区对所述第一抗原的亲和力在由相应的野生型H1和L1多肽序列形成的Fab区对所述第一抗原的亲和力的约100倍以内，且/或所述第二Fab区对所述第二抗原的亲和力在由相应的野生型H2和L2多肽序列形成的Fab区对所述第二抗原的亲和力的约100倍以内。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗原结合多肽构建体，其中所述第一Fab区的熔融温度(Tm)与由相应的野生型H1和L1多肽序列形成的Fab区对所述第一抗原的Tm相差在约20℃以内，且/或所述第二Fab区的熔融温度(Tm)与由相应的野生型H2和L2多肽序列形成的Fab区对所述第二抗原的Tm相差在约20℃以内。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗原结合多肽构建体，其中：
a.H1和L1是野生型多肽序列，并且H2和L2各自包含至少一个氨基酸修饰；
b.H1、L1和H2中的一个或多个包含至少一个氨基酸修饰，并且L2是野生型多肽序列；
c.H1、L1和L2中的一个或多个包含至少一个氨基酸修饰，并且H2是野生型多肽序列；
d.H1、H2和L2中的一个或多个包含至少一个氨基酸修饰，并且L1是野生型多肽序列；
e.L1、H2和L2中的一个或多个包含至少一个氨基酸修饰，并且H1是野生型多肽序列；或
f.H1、L1、H2和L2各自包含至少一个氨基酸修饰。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗原结合多肽构建体，其中所述氨基酸修饰位于：
a.H1的CH1结构域、H2的CH1结构域、L1的CL-λ结构域和L2的CL-κ结构域中的至少两个；
b.H1和H2的CH1和VH结构域、L1的CL-λ结构域和VL-λ结构域以及L2的CL-κ结构域和VL-κ结构域中的至少两个；或
c.H1的VH结构域、H2的VH结构域、L1的VL-λ结构域和L2的VL-κ结构域中的至少两个。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的构建体，其中H1、L1、H2和/或L2各自包含位于所述Fab区中的至少1个氨基酸修饰。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的构建体，其中H1、H2、L1和L2中的至少一个包含至少一个恒定结构域和/或至少一个可变结构域的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的构建体，其中所述氨基酸修饰促进H1与L1而非L2优先配对以形成H1L1，或促进H2与L2而非L1优先配对以形成H2L2，以使得H1L1或H2L2中的至少一个的相对配对相对于野生型大至少约10％，并且另一个的相对配对在野生型的约10％内或相对于野生型大至少约10％。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的构建体，其中所述第一Fab区的热稳定性与由相应的野生型H1和L1多肽序列形成的Fab区的Tm相差在约0、1、2或3℃以内，且/或所述第二Fab区的热稳定性与由相应的野生型H2和L2多肽序列形成的Fab区的Tm相差在约0、1、2或3℃以内。
13.根据权利要求1至3中任一项所述的构建体，其中所述氨基酸修饰选自由表10-A1至10-A12中的一个或多个中所示的唯一标识符Mab设计组所组成的组。
14.根据权利要求1至3中任一项所述的构建体，其中所述氨基酸修饰选自由表10-B1至10-B10中的任意一个中所示的唯一标识符Mab设计组所组成的组。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的构建体，其中所述构建体进一步包含具有两个Fc多肽的二聚体Fc，每个Fc多肽包含CH3结构域序列并且通过或不通过接头与所述第一Fab区和第二Fab区中的一个偶联。
16.根据权利要求15所述的构建体，其中所述Fc是人Fc、人IgG1 Fc、人IgA Fc、人IgGFc、人IgD Fc、人IgE Fc、人IgM Fc、人IgG2 Fc、人IgG3 Fc或人IgG4 Fc。
17.根据权利要求15或16所述的构建体，其中相较于野生型，所述Fc包含在所述CH3结构域序列的至少一个中的促进异二聚体Fc形成的一个或多个修饰。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的构建体，其中所述Fc包括：
i)具有第一Fc多肽中的修饰L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T366L_K392M_T394W的异二聚体IgG1 Fc；
ii)具有第一Fc多肽中的修饰L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T366L_K392L_T394W的异二聚体IgG1 Fc；
iii)具有第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_K392L_T394W的异二聚体IgG1 Fc；
iv)具有第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_K392M_T394W的异二聚体IgG1 Fc；或
v)具有第一Fc多肽中修饰T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_N390R_K392M_T394W的异二聚体IgG1 Fc。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的构建体，其中所述Fc还包含至少一个CH2结构域序列。
20.根据权利要求19所述的构建体，其中当H1、L1、H2和L2共表达时，
a)由H1L1和H2L2配对之和测量的总正确配对量与相应的在所述Fab区中不具有促进优先配对的氨基酸取代的H1、L1、H2和L2多肽链的配对相比的变化大于约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；
b)由所产生的双特异性抗体的量(表示为所产生的非半抗体种类的百分比)测量的总正确配对量与相应的在所述Fab区中不具有促进优先配对的氨基酸取代的H1、L1、H2和L2多肽链的配对相比的变化大于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％；或
c)由所产生的双特异性抗体的量(表示为所产生的所有种类的百分比)测量的总正确配对量与相应的在所述Fab区中不具有促进优先配对的氨基酸取代的H1、L1、H2和L2多肽链的配对相比的变化大于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。
21.根据权利要求20所述的构建体，其中所述Fc包含一个或多个修饰以促进Fc-γ受体的选择性结合、减少或消除与Fc-γ受体的结合或促进与FcRn的结合。
22.根据权利要求15至21中任一项所述的构建体，其中所述接头是一个或多个多肽接头。
23.根据权利要求22所述的构建体，其中所述接头包括一个或多个抗体铰链区。
24.根据权利要求23所述的构建体，其中所述接头包括一个或多个IgG1铰链区。
25.根据权利要求23或24所述的构建体，其中与野生型多肽接头相比，所述一个或多个多肽接头包含一个或多个修饰。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的构建体，其中所述氨基酸修饰是氨基酸取代。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的构建体，其中H1、H2、L1和L2中的每个的序列衍生自人序列或人源化序列。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的构建体，其与治疗剂或药物缀合。
29.一种多核苷酸或多核苷酸组，其编码根据权利要求1至27中任一项所述的构建体。
30.一种载体或载体组，其包含根据权利要求29所述的多核苷酸或多核苷酸组中的一个或多个。
31.根据权利要求30所述的载体或载体组，其中所述载体或所述载体组中的至少一个载体为多顺反子结构。
32.一种分离的细胞，其包含根据权利要求29所述的多核苷酸或多核苷酸组，或根据权利要求30或31所述的载体或载体组。
33.根据权利要求32所述的分离的细胞，其中所述细胞是酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
34.根据权利要求33所述的分离的细胞，其中所述细胞经根据权利要求30或31所述的载体或载体组稳定转染或瞬时转染。
35.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至28中任一项所述的抗原结合多肽构建体和药学上可接受的载体。
36.根据权利要求35所述的药物组合物，其进一步包含选自由以下组成的组的一种或多种物质：缓冲剂、抗氧化剂、低分子量分子、药物、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂质、螯合剂、稳定剂和赋形剂。
37.一种制备根据权利要求1至27中任一项所述的构建体的方法，其包括以下步骤：
d)获得包含编码所述抗原结合多肽构建体的多核苷酸或多核苷酸组的宿主细胞；
e)在允许表达所述抗原结合多肽构建体的条件下，在宿主细胞培养物中培养所述宿主细胞；以及
f)从所述宿主细胞培养物中收集所述抗原结合多肽构建体。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述宿主细胞经所述多核苷酸或多核苷酸组瞬时转染或稳定转染。
39.一种计算机可读存储介质，其存储
包含代表第一异二聚体和第二异二聚体中的互补氨基酸修饰的数据的数据集，所述第一异二聚体包含第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白λ轻链多肽序列(L1)；且所述第二异二聚体包含第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白κ轻链多肽序列(L2)，其中H1和H2各自包含至少重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)并且彼此不同；其中L1和L2各自包含至少轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)，其中所述互补氨基酸修饰促进H1与L1而非L2优先配对以及促进H2与L2而非L1优先配对，且其中所述数据集包括代表表10-A1至10-A12或表10-B1至10-B10中的一个或多个中所列的那些修饰或那些修饰的子集的数据。
40.一种产生双特异性抗原结合多肽构建体的方法，所述构建体包含：
a.包含第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白λ轻链多肽序列(L1)的第一异二聚体；和
b.包含第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白κ轻链多肽序列(L2)的第二异二聚体，
其中H1和H2各自包含至少重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)并且彼此不同；其中L1和L2各自包含轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)，且其中H1、L1、H2和L2中的一个或多个包含促进H1与L1而非L2优先配对以及促进H2与L2而非L1优先配对的氨基酸修饰，
所述方法包括：
a.将来自根据权利要求37所述的数据集的一个或多个互补氨基酸修饰引入H1、L1、H2和/或L2中；以及
b.在宿主细胞中共表达H1、L1、H2和L2以产生包含所述双特异性抗原结合多肽构建体的表达产物。
41.根据权利要求40所述的方法，其进一步包括测定所述表达产物中的所述双特异性抗原结合多肽构建体相对于其它多肽产物的量，以选择相较于由野生型H1、L1、H2和L2的共表达产生的表达产物中的双特异性抗原结合多肽构建体的量提供增加量的所述双特异性抗原结合多肽构建体的优选的互补氨基酸修饰子集。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述构建体包含Fc，所述Fc包含至少两个CH3结构域序列，且其中所述Fc经由或不经由一个或多个接头偶联至所述第一异二聚体和所述第二异二聚体。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述Fc是异二聚体Fc，其包含促进异二聚体Fc而非同二聚体Fc形成的一个或多个氨基酸修饰。
44.根据权利要求40至43中任一项所述的方法，其中当H1、L1、H2和L2共表达时，
a)由产生的H1L1％和H2L2％之和测量的总正确配对量与相应的在所述Fab区中不具有促进优先配对的氨基酸取代的H1、L1、H2和L2多肽链的配对相比的变化大于约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；
b)由所产生的双特异性抗体的量(表示为所产生的非半抗体种类的百分比)测量的总正确配对量与相应的在所述Fab区中不具有促进优先配对的氨基酸取代的H1、L1、H2和L2多肽链的配对相比的变化大于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％；或
c)由所产生的双特异性抗体的量(表示为所产生的所有种类的百分比)测量的总正确配对量与相应的在所述Fab区中不具有促进优先配对的氨基酸取代的H1、L1、H2和L2多肽链的配对相比的变化大于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。
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