JP2018535947A - カッパ及びラムダ軽鎖を含む抗原結合ポリペプチド構築物及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。2015年12月1日に作成された前記ASCIIコピーは、0966216と名付けられ、20.0バイトのサイズである。
a.H2は、143位にアミノ酸置換を含み;L2は、124位にアミノ酸置換を含み;及び
i.H1は、186または179位にアミノ酸置換を含み、及びL1は、180位にアミノ酸置換を含み;
ii.H1は、186位にアミノ酸置換を含み;L1は、133位にアミノ酸置換を含み;
iii.H1は、143位にアミノ酸置換を含み;L1は、133位にアミノ酸置換を含み;または
iv.H1は、188位にアミノ酸置換を含み;L1は、178位にアミノ酸置換を含み;
b.H1は、143位にアミノ酸置換を含み;L1は、131位にアミノ酸置換を含み;
i.H2は、186または124及び186位にアミノ酸置換を含み、L2は、133または133及び160または124及び133または176及び180;または
ii.H2は、188位にアミノ酸置換を含み;L2は、131位にアミノ酸置換を含み;
iii.H2は、143位にアミノ酸置換を含み;L2は、124及び133または124及び133及び180位にアミノ酸置換を含み;
c.H1は、143位にアミノ酸置換を含み;L1は、131位にアミノ酸置換を含み;
i.H2は、124及び186または124及び179または188位にアミノ酸置換を含み、L2は、176及び178または176及び180または131位にアミノ酸置換を含み;または
ii.H2は、143及び188または143または124及び143位にアミノ酸置換を含み;L2は、124及び176及び178または124及び178または124及び180または124及び176及び180、または124、または124及び176位にアミノ酸置換を含み;
d.H1は、179、186、143及び/または188位にアミノ酸置換を含み;L1は、180、133及び/または176及び178位にアミノ酸置換を含み;H2は、143位にアミノ酸置換を含み、L2は、131及び/または124位にアミノ酸置換を含み;
e.H1は、39位にアミノ酸置換を含み、または、優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まず;L1は、38位にアミノ酸置換を含み、または、優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まず;H2は、39位にアミノ酸置換を含み、L2は、38位にアミノ酸置換を含み;
f.H1は、143位にアミノ酸置換を含み;L1は、131位にアミノ酸置換を含み;
i.H2は、188または124及び186位にアミノ酸置換を含み、L2は、176及び178または176及び180または131位にアミノ酸置換を含み;または
ii.H2は、143または186位にアミノ酸置換を含み;L2は、124及び133または124及び133及び180位にアミノ酸置換を含み;
g.H1は、188位にアミノ酸置換を含み;L1は、176及び178または178位にアミノ酸置換を含み;及び
i.H2は、177及び188位にアミノ酸置換を含み、L2は、176及び178位にアミノ酸置換を含み;または
ii.H2は、186または124または124及び179位にアミノ酸置換を含み;L2は、176または131及び176位にアミノ酸置換を含み;
h.H1は、186位にアミノ酸置換を含み;L1は、133位にアミノ酸置換を含み;
i.H2は、188位にアミノ酸置換を含み、L2は、131位にアミノ酸置換を含み;または
ii.H2は、177及び188位にアミノ酸置換を含み;L2は、176及び178位にアミノ酸置換を含み;または
H1は、124及び190位にアミノ酸置換を含み;L1は、135位にアミノ酸置換を含み;H2は、124または188位にアミノ酸置換を含み、L2は、176または176及び178位にアミノ酸置換を含み;
i.H1は、177及び188位にアミノ酸置換を含み;L1は、176及び178位にアミノ酸置換を含み;及び
a.H2は、188位にアミノ酸置換を含み、L2は、176及び178または131位にアミノ酸置換を含み;
b.H2は、186位にアミノ酸置換を含み;L2は、133または124及び160及び180位にアミノ酸置換を含み;
c.H2は、124または124及び179または124及び186位にアミノ酸置換を含み;L2は、176または176及び178または176及び180位にアミノ酸置換を含み;または
d.H2は、143位にアミノ酸置換を含み;L2は、133または124及び133位にアミノ酸置換を含み;
j.H1は、188位にアミノ酸置換を含み;L1は、178位にアミノ酸置換を含み;H2は、124または188位にアミノ酸置換を含み;L2は、176及び178または176及び180または176位にアミノ酸置換を含み;
k.H1は、145及び188位にアミノ酸置換を含み;L1は、178位にアミノ酸置換を含み;H2は、124及び/または188位にアミノ酸置換を含み;L2は、124、133、及び178のうちの1つ以上にアミノ酸置換を含み;
l.H1は、174、179または186位にアミノ酸置換を含み;L1は、176または180位にアミノ酸置換を含み;H2は、143または190位にアミノ酸置換を含み、L2は、131、135または124位にアミノ酸置換を含み;または
m.H1は、174位にアミノ酸置換を含み;L1は、176位にアミノ酸置換を含み;H2は、190位にアミノ酸置換を含み;L2は、優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まず、または135位にアミノ酸置換を含み;
n.H1は、143及び190位にアミノ酸置換を含み;L1は、133位にアミノ酸置換を含み;H2は、124位にアミノ酸置換を含み;L2は、131及び135位にアミノ酸置換を含み;
o.H1は、143及び/または186位にアミノ酸置換を含み;L1は、133位にアミノ酸置換を含み;H2は、124位にアミノ酸置換を含み;L2は、131位にアミノ酸置換を含み;
p.H1は、143及び179位にアミノ酸置換を含み;L1は、124及び178位にアミノ酸置換を含み;H2は、186位にアミノ酸置換を含み、L2は、178及び180または160及び180位にアミノ酸置換を含み;
q.H1は、143位にアミノ酸置換を含み;L1は、124位にアミノ酸置換を含み;H2は、179または186位にアミノ酸置換を含み、L2は、124及び160及び180位にアミノ酸置換を含み;
r.H1は、186位にアミノ酸置換を含み;L1は、180または178及び180位にアミノ酸置換を含み;H2は、143及び/または179位にアミノ酸置換を含み、L2は、124及び178または131位にアミノ酸置換を含み;
s.H1は、179位にアミノ酸置換を含み;L1は、180位にアミノ酸置換を含み;H2は、143位にアミノ酸置換を含み、L2は、124位にアミノ酸置換を含み;
t.H1は、143または186位にアミノ酸置換を含み;L1は、180位にアミノ酸置換を含み、または優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まず;H2は、143及び145位にアミノ酸置換を含み、L2は、124位にアミノ酸置換を含み;
u.H1は、優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まず;L1は、135位にアミノ酸置換を含み;H2は、139位にアミノ酸置換を含み、L2は、116位にアミノ酸置換を含み;
v.H1は、優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まず、または45位にアミノ酸置換を含み;L1は、優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まず;H2は、45位にアミノ酸置換を含み、L2は、44位にアミノ酸置換を含み;
w.H1は、139位にアミノ酸置換を含み;L1は、116位にアミノ酸置換を含み;H2は、優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まず、L2は、135位にアミノ酸置換を含み;または
x.H1は、124位にアミノ酸置換を含み;L1は、176位にアミノ酸置換を含み;H2は、124位にアミノ酸置換を含み;L2は、176位にアミノ酸置換を含む。
a.H1及びL1は、野生型ポリペプチド配列であり、H2及びL2の各々は、少なくとも1つのアミノ酸修飾を含み;
b.H1、L1、及びH2のうちの1つ以上は、少なくとも1つのアミノ酸修飾を含み、L2は、野生型ポリペプチド配列であり;
c.H1、L1、及びL2のうちの1つ以上は、少なくとも1つのアミノ酸修飾を含み、H2は、野生型ポリペプチド配列であり;
d.H1、H2、及びL2のうちの1つ以上は、少なくとも1つのアミノ酸修飾を含み、L1は、野生型ポリペプチド配列であり;
e.L1、H2、及びL2のうちの1つ以上は、少なくとも1つのアミノ酸修飾を含み、H1は、野生型ポリペプチド配列であり;または
f.H1、L1、H2、及びL2の各々は、少なくとも1つのアミノ酸修飾を含む。
a.H1及びH2のCH1ドメイン、L1のCL−ラムダドメイン、及びL2のCL−カッパドメイン;または
b.H1及びH2のCH1及びVHドメイン、L1のCL−ラムダドメイン及びVL−ラムダドメイン、及びL2のCL−カッパドメイン及びVL−カッパドメイン中である。
a.H1のCH1ドメイン、H2のCH1ドメイン、L1のCL−ラムダドメイン、及びL2のCL−カッパドメインのうちの少なくとも2つ;
b.H1及びH2のCH1及びVHドメイン、L1のCL−ラムダドメイン及びVL−ラムダドメイン、及びL2のCL−カッパドメイン及びVL−カッパドメインのうちの少なくとも2つ、または
c.H1のVHドメイン、H2のVHドメイン、L1のVL−ラムダドメイン、及びL2のVL−カッパドメインのうちの少なくとも2つ中である。
i)第1のFcポリペプチド中に修飾L351Y_F405A_Y407V、及び第2のFcポリペプチド中に修飾T366L_K392M_T394Wを有するヘテロ二量体IgG1 Fc;
ii)第1のFcポリペプチド中に修飾L351Y_F405A_Y407V、及び第2のFcポリペプチド中の修飾T366L_K392L_T394Wを有するヘテロ二量体IgG1 Fc;
iii)第1のFcポリペプチド中の修飾T350V_L351Y_F405A_Y407V、及び第2のFcポリペプチド中の修飾T350V_T366L_K392L_T394Wを有するヘテロ二量体IgG1 Fc;
iv)第1のFcポリペプチド中の修飾T350V_L351Y_F405A_Y407V、及び第2のFcポリペプチド中の修飾T350V_T366L_K392M_T394Wを有するヘテロ二量体IgG1 Fc;または
v)第1のFcポリペプチド中の修飾T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V、及び第2のFcポリペプチド中の修飾T350V_T366L_N390R_K392M_T394Wを有するヘテロ二量体IgG1 Fcを含む。
(a)抗原結合ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドセットを含む宿主細胞を得る工程;
(b)抗原結合ポリペプチド構築物を発現させる条件下で宿主細胞培養物中の宿主細胞を培養する工程、及び
(c)宿主細胞培養物から抗原結合ポリペプチド構築物を収集する工程を含む。
a.第1の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列(H1)及び第1の免疫グロブリンラムダ軽鎖ポリペプチド配列(L1)を含む第1のヘテロ二量体;及び
b.第2の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列(H2)及び第2の免疫グロブリンカッパ軽鎖ポリペプチド配列(L2)を含む第2のヘテロ二量体を含む。
a.本明細書に記載されるデータセットからの1つ以上の相補的アミノ酸修飾をH1、L1、H2、及び/またはL2に導入すること;及び
b.宿主細胞中でH1、L1、H2、及びL2を同時発現し、二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物を含む発現産物を産生することを含む。
特に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術用語及び科学用語は、特許請求の範囲に記載の対象が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同様の意味を有する。本明細書の用語について複数の定義が存在する場合には、本項の定義が優先される。URLまたは他のこのような識別子またはアドレスで引用がなされている場合には、このような識別子は変化し得て、インターネット上の特定の情報は変更され得るが、同様の情報がインターネットの検索により見出され得ることが理解される。それに加えて、参考文献は、このような情報の利用可能性及び公的な普及を証明する。
アラニン(A)、グリシン(G);
アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
アルギニン(R)、リジン(K);
イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);及び
セリン(S)、トレオニン(T);
(例えば、Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W H Freeman & Co.;2nd edition(December 1993)を参照されたい。
本明細書に記載される抗原結合ポリペプチド構築物(すなわち、抗体)は、多重特異性または二重特異性であってもよい。多重特異性抗原結合ポリペプチド構築物は、第1のFab領域を形成する第1の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列(H1)及び免疫グロブリンラムダ軽鎖ポリペプチド配列(L1)を有する少なくとも1つの第1のヘテロ二量体(H1L1)と、第2のFab領域を形成する免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列(H2)及び免疫グロブリンカッパ軽鎖ポリペプチド配列(L2)を有する少なくとも1つの第2のヘテロ二量体(H2L2)を含み得、H1及びH2は互いに異なる。一実施形態において、二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物は、第1のFab領域を形成する第1の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列(H1)及び免疫グロブリンラムダ軽鎖ポリペプチド配列(L1)を有する第1のヘテロ二量体(H1L1)と、第2のFab領域を形成する免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列(H2)及び免疫グロブリンカッパ軽鎖ポリペプチド配列(L2)を有する第2のヘテロ二量体(H2L2)を含み、H1及びH2は互いに異なる。一実施形態において、各ヘテロ二量体は、単一Fab領域を含む。「Fab領域」という用語は、本明細書で使用される場合、1つの免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列と1つの免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド配列の対合から得られる領域を指し、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列のVH及びCH1ドメイン、及び免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド配列のVL及びCLドメインからなる。いくつかの実施形態において、第1のFab領域は、第1の抗原と結合し、第2のFab領域は、第2の抗原と結合する。第1及び第2の抗原は、同じであってもよく、または異なってもよい。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のうちの1つ以上は、同時発現または共生成される場合に、正しく対合された重鎖及び軽鎖の優先的対合を促進するアミノ酸修飾を含み得る。
各ヘテロ二量体の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列(「重鎖」とも呼ばれる)及び免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド配列(「軽鎖」とも呼ばれる)は、1つ以上の親抗体から得ることができ、少なくとも1つの親抗体は、カッパ軽鎖を含み、少なくとも1つの他の親抗体は、ラムダ軽鎖を含み、優先的対合を促進するアミノ酸修飾は、これらの重鎖及び軽鎖に遺伝子操作される。優先的対合を促進するアミノ酸修飾が欠如している親の免疫グロブリン重鎖配列及び免疫グロブリン軽鎖配列は、野生型の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列、野生型の免疫グロブリンカッパ軽鎖ポリペプチド配列、及び野生型の免疫グロブリンラムダ軽鎖ポリペプチド配列と呼ばれる。一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物のヘテロ二量体の重鎖及び軽鎖は、2つの親抗体から得られる。一般に、2つの親抗体は互いに異なる;しかしながら、これは必ずしも常にそうである必要はない。一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物であり、各ヘテロ二量体は、異なる親抗体から得られる。別の実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物であり、両方の親抗体は、同じ抗原と結合するが、同じ抗原上の異なるエピトープを標的にする。一実施形態において、少なくとも1つの親抗体は、単一特異性であり、すなわち、ただ1つのエピトープと結合し得る。別の実施形態において、少なくとも1つの親抗体は、1つを超えるエピトープと結合し得る。
親抗体の免疫グロブリン重鎖は、以下のクラス:IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4の範囲内である。一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物の第1及び第2のヘテロ二量体は、IgG重鎖を含む。一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物の第1及び第2のヘテロ二量体は、IgG1重鎖を含む。親抗体の免疫グロブリン軽鎖は、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のいずれかである。
重鎖及び軽鎖H1、L1、H2、及びL2のうちの1つ以上は、親抗体の重鎖及び軽鎖に遺伝子操作される重鎖と軽鎖の間の優先的対合を促進するアミノ酸修飾を含む。一実施形態において、重鎖及び軽鎖H1、L1、H2、及びL2のうちの2つは、重鎖と軽鎖の間の優先的対合を促進するアミノ酸修飾を含む。一実施形態において、重鎖及び軽鎖H1、L1、H2、及びL2のうちの3つは、重鎖と軽鎖の間の優先的対合を促進するアミノ酸修飾を含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Lクラスター1に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、
H1は、143位にアミノ酸置換を含み;L1は、131位にアミノ酸置換を含み;及び
a)H2は、188または124_186位にアミノ酸置換を含み、L2は、176_178または176_180または131位にアミノ酸置換を含み;または
b)H2は、143または186位にアミノ酸置換を含み;L2は、124_133または124_133_180位にアミノ酸置換を含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Lクラスター2に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、
H1は、143位にアミノ酸置換を含み;L1は、131位にアミノ酸置換を含み;及び
c)H2は、186または124_186位にアミノ酸置換を含み、L2は、133または133_160または124_133または176_180位にアミノ酸置換を含み;または
d)H2は、188位にアミノ酸置換を含み;L2は、131位にアミノ酸置換を含み;
e)H2は、143位にアミノ酸置換を含み;L2は、124_133または124_133_180位にアミノ酸置換を含む;
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Lクラスター3に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、
H1は、143位にアミノ酸置換を含み;L1は、131位にアミノ酸置換を含み;及び
a)H2は、124_186または124_179または188位にアミノ酸置換を含み、L2は、176_178または176_180または131位にアミノ酸置換を含み;または
b)H2は、143_188または143または124_143位にアミノ酸置換を含み;L2は、124_176_178または124_178または124_180または124_176_180、または124、または124_176位にアミノ酸置換を含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Lクラスター4に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、H1は、188位にアミノ酸置換を含み;L1は、176_178または178位にアミノ酸置換を含み;及び
a)H2は、177_188位にアミノ酸置換を含み、L2は、176_178位にアミノ酸置換を含み;または
b)H2は、186または124または124_179位にアミノ酸置換を含み;L2は、176または131_176位にアミノ酸置換を含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Lクラスター5に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、
H1は、186位にアミノ酸置換を含み;L1は、133位にアミノ酸置換を含み;及び
a)H2は、188位にアミノ酸置換を含み、L2は、131位にアミノ酸置換を含み;または
b)H2は、177_188位にアミノ酸置換を含み;L2は、176_178位にアミノ酸置換を含み;または
H1は、124_190位にアミノ酸置換を含み;L1は、135位にアミノ酸置換を含み;H2は、124または188位にアミノ酸置換を含み、L2は、176または176_178位にアミノ酸置換を含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Lクラスター6に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、
H1は、177_188位にアミノ酸置換を含み;L1は、176_178位にアミノ酸置換を含み;及び
a)H2は、188位にアミノ酸置換を含み、L2は、176_178または131位にアミノ酸置換を含み;
b)H2は、186位にアミノ酸置換を含み;L2は、133または124_160_180位にアミノ酸置換を含み;
c)H2は、124または124_179または124_186位にアミノ酸置換を含み;L2は、176または176_178または176_180位にアミノ酸置換を含み;または
d)H2は、143位にアミノ酸置換を含み;L2は、133または124_133位にアミノ酸置換を含む。
H1は、177_188位にアミノ酸置換を含み;L1は、176_178位にアミノ酸置換を含み;H2は、124、143、179、186、及び188位のうちの1つ以上にアミノ酸置換を含み、L2は、133、176、及び178位のうちの1つ以上にアミノ酸置換を含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Lクラスター7に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、
H1は、188位にアミノ酸置換を含み;L1は、178位にアミノ酸置換を含み;H2は、124または188位にアミノ酸置換を含み、L2は、176_178または176_180または176位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、H1は、125、139、145、及び177位のうちの1つ以上にアミノ酸置換をさらに含み、L1は、122位にアミノ酸置換をさらに含み、H2は、143、177、179、186、228、39、及び45位のうちの1つ以上にアミノ酸置換をさらに含み、及び/またはL2は、121、124、133、135、160、38、及び44位のうちの1つ以上にアミノ酸置換をさらに含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Lクラスター8に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、
H2は、143位にアミノ酸置換を含み;L2は、124位にアミノ酸置換を含み;及び
a)H1は、186または179位にアミノ酸置換を含み、L1は、180位にアミノ酸置換を含み;
b)H1は、186位にアミノ酸置換を含み;L1は、133位にアミノ酸置換を含み;
c)H1は、143位にアミノ酸置換を含み;L1は、133位にアミノ酸置換を含み;または
d)H1は、188位にアミノ酸置換を含み;L1は、178位にアミノ酸置換を含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Lクラスター9に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、
H1は、179、186、143及び/または188位にアミノ酸置換を含み;L1は、180、133及び/または176_178位にアミノ酸置換を含み;H2は、143位にアミノ酸置換を含み、L2は、131及び/または124位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、H1は、125位にアミノ酸置換をさらに含み、L1は、122または129位にアミノ酸置換をさらに含み、H2は、145、179及び228位のうちの1つ以上にアミノ酸置換をさらに含み、及び/またはL2は、121、129、135、160、及び178位のうちの1つ以上にアミノ酸置換をさらに含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Lクラスター10に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、H1は、174、179または186位にアミノ酸置換を含み;L1は、176または180位にアミノ酸置換を含み;H2は、143または190位にアミノ酸置換を含み、L2は、131、135または124位にアミノ酸置換を含み;またはH1は、174位にアミノ酸置換を含み;L1は、176位にアミノ酸置換を含み;H2は、190位にアミノ酸置換を含み;L2は、優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まない、または135位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、H1は、143位にアミノ酸置換をさらに含み、L1は、116、129及び133位のうちの1つ以上にアミノ酸置換をさらに含み、H2は、145、179、及び188位のうちの1つ以上にアミノ酸置換をさらに含み、及び/またはL2は、133、160及び178位のうちの1つ以上にアミノ酸置換をさらに含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Lクラスター11に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、H1は、143_190位にアミノ酸置換を含み;L1は、133位にアミノ酸置換を含み;H2は、124位にアミノ酸置換を含み、L2は、131_135位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、H1は、125位にアミノ酸置換をさらに含み、L1は、122、129及び135位のうちの1つ以上にアミノ酸置換をさらに含み、H2は、139、145、190、及び228位のうちの1つ以上にアミノ酸置換をさらに含み、及び/またはL2は、121位にアミノ酸置換をさらに含む。
H1は、143_190位にアミノ酸置換を含み;L1は、129_133_135位にアミノ酸置換を含み;H2は、124_145位にアミノ酸置換を含み、L2は、131_135位にアミノ酸置換を含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Lクラスター12に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、H1は、143及び/または186位にアミノ酸置換を含み;L1は、133位にアミノ酸置換を含み;H2は、124位にアミノ酸置換を含み、L2は、131位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、H1は、124、125、139、及び188位のうちの1つ以上にアミノ酸置換をさらに含み、L1は、122、129、131、及び178位のうちの1つ以上にアミノ酸置換をさらに含み、H2は、143、145、179、186、188、228、39、及び45位のうちの1つ以上にアミノ酸置換をさらに含み、及び/またはL2は、121、133、135、176、178、38、及び44位のうちの1つ以上にアミノ酸置換をさらに含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Kクラスター1に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、H1は、143_179位にアミノ酸置換を含み;L1は、124_178位にアミノ酸置換を含み;H2は、186位にアミノ酸置換を含み、L2は、178_180または160_180位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、H1は、145位にアミノ酸置換をさらに含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Kクラスター2に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、H1は、143位にアミノ酸置換を含み;L1は、124位にアミノ酸置換を含み;H2は、179または186位にアミノ酸置換を含み、L2は、124_160_180位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、H1は、145位にアミノ酸置換をさらに含み、及び/またはH2は、146位にアミノ酸置換をさらに含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Kクラスター3に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、
H1は、186位にアミノ酸置換を含み;L1は、180または178_180位にアミノ酸置換を含み;H2は、143及び/または179位にアミノ酸置換を含み、L2は、124_178または131位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、H2は、145位にアミノ酸置換をさらに含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Kクラスター4に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、H1は、179位にアミノ酸置換を含み;L1は、180位にアミノ酸置換を含み;H2は、143位にアミノ酸置換を含み、L2は、124位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、H1は、146位にアミノ酸置換をさらに含み、H2は、145位にアミノ酸置換をさらに含み、及び/またはL2は、160及び/または178位にアミノ酸置換をさらに含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Kクラスター5に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、H1は、143または186位にアミノ酸置換を含み;L1は、180位にアミノ酸置換を含む、または優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まない;H2は、143_145位にアミノ酸置換を含み、L2は、124位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、L2は、160及び/または178位のうちの1つ以上にアミノ酸置換をさらに含む。さらなる実施形態において、L2は、124、124_178または124_160_178位にアミノ酸置換を含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Kクラスター6に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、H1は、39位にアミノ酸置換を含む、または優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まない;L1は、38位にアミノ酸置換を含む、または優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まない;H2は、39位にアミノ酸置換を含み、L2は、38位にアミノ酸置換を含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Kクラスター7に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、H1は、優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まない;L1は、135位にアミノ酸置換を含み;H2は、139位にアミノ酸置換を含み、L2は、116位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、L2は、135位にアミノ酸置換をさらに含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Kクラスター8に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、H1は、優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まない、または45位にアミノ酸置換を含み;L1は、優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まない;H2は、45位にアミノ酸置換を含み、L2は、44位にアミノ酸置換を含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Kクラスター9に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、H1は、139位にアミノ酸置換を含み;L1は、116位にアミノ酸置換を含み;H2は、優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まず、L2は、135位にアミノ酸置換を含む。
一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、K−Kクラスター10に従ったアミノ酸置換の組み合わせを含み、H1は、124位にアミノ酸置換を含み;L1は、176位にアミノ酸置換を含み;H2は、124位にアミノ酸置換を含み、L2は、176位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、L1及び/またはL2は、133位にアミノ酸置換をさらに含む。
H1、L1、H2、及びL2のうちの1つ以上は、L2と比較してL1とH1の優先的対合を促進し、L1と比較してL2とH2の優先的対合を促進するアミノ酸修飾を含む。一般に、アミノ酸修飾及び任意の天然に生じるバイアスの不在下で、野生型の免疫グロブリン重鎖配列(H1)は、2つの異なる野生型の免疫グロブリン軽鎖配列(L1及びL2)と同時発現させる場合、両方の軽鎖と等しく統計的に対合し、おおよそ50:50の、L1と対合したH1(H1L1、正しく対合された)及びL2と対合したH1(H1L2、誤対合)の混合物をもたらす。同様に、野生型H2が、野生型L1及びL2と同時発現される場合、重鎖は、両方の軽鎖と等しく統計的に対合し、おおよそ50:50の、L1と対合したH2(H2L1、誤対合)及びL2と対合したH2(H2L2、正しく対合された)の混合物をもたらす。「優先的対合」という用語は、別の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド配列と比較して、1つの免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド配列と免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列の対合特異性または対合優先性を説明するために本明細書で使用される。この文脈において、例えば、H1をL1及びL2の両方と同時発現させる場合に、H1L1ヘテロ二量体の量がH1L2ヘテロ二量体の量よりも多い場合、優先的対合は、H1とL1との間で生じる。同様に、例えば、H2をL1及びL2の両方と同時発現させる場合に、H2L2ヘテロ二量体の量がH2L1ヘテロ二量体の量よりも多い場合、優先的対合は、H1とL1との間で生じる。
優先的対合は、H1、L1、H2、及びL2を同時発現させ、H1、L1、H2、及びL2のうちの1つ以上が、L1とH1の優先的対合を促進し、L2とH2の優先的対合を促進し、正しく対合された第1のヘテロ二量体(H1L1)と正しく対合された第2のヘテロ二量体(H2L2)を含む二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物を形成するアミノ酸修飾を含むMab設計セットの文脈において評価することもできる。この種の実施形態において、図8に示すように、2つの異なる免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列を2つの異なる免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド配列と同時発現させる場合、多くの可能性のある産物を得ることができ、そのうちの14個を図8に示し、そのうちのただ1つが、所望の、または正しく対合された二重特異性抗体H1L1H2L2(図8の抗体種A)である。しかしながら、Mab設計セットに基づいて重鎖と軽鎖の間の正しい対合を評価する文脈において、追加産物のいくつかは、Fabレベルで正しく対合されたヘテロ二量体を含むため(例えば、図8の抗体種E、H、K、及びMを参照)、Fab領域の文脈において正しい対合を示すとも考えられ得る。いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物のFc部分は、ヘテロ二量体Fcの形成を促進する非対称アミノ酸修飾を含む。これらの実施形態において、種E〜Jの数及び量は減少すると予想される。
H1、L1、H2、及びL2ポリペプチド配列のうちの1つ以上におけるアミノ酸修飾は、L2と比較してL1とH1の優先的対合を促進し、L1と比較してL2とH2の優先的対合を促進して、抗原結合ポリペプチド構築物の各ヘテロ二量体の熱安定性への影響を最小限にする。各ヘテロ二量体に対するアミノ酸修飾の効果は、H1及びL1によって形成されたFab領域またはH2及びL2によって形成されたFab領域の熱安定性を測定し、それを、対応する野生型のH1及びL1ポリペプチド配列によって形成されたFab領域(野生型の第1のFab領域)または対応する野生型のH2及びL2ポリペプチド配列によって形成されたFab領域(野生型の第2のFab領域)の熱安定性と比較することによって決定される。「対応する野生型のH1及びL1ポリペプチド配列」及び「対応する野生型のH2及びL2ポリペプチド配列」という用語は、本明細書に記載される優先的対合を促進するアミノ酸修飾を有しない、対応するH1、L1、H2、及びL2ポリペプチド配列を記載することを意味する。
H1、L1、H2、及びL2ポリペプチド配列のうちの1つ以上におけるアミノ酸修飾は、L2と比較してL1とH1の優先的対合を促進し、L1と比較してL2とH2の優先的対合を促進して、抗原結合ポリペプチド構築物の各ヘテロ二量体がその抗原と結合する能力への影響を最小限にする。各ヘテロ二量体に対するアミノ酸修飾の効果は、H1及びL1によって形成されたFab領域またはH2及びL2によって形成されたFab領域がそれぞれの抗原と結合する能力を測定し、それを、対応する野生型の第1のFab領域または対応する野生型の第2のFab領域がそれぞれの抗原と結合する能力と比較することによって決定される。
本明細書に記載されるアミノ酸修飾または設計セットを使用して、各ヘテロ二量体の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列及び免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドが、少なくとも1つの親抗体がカッパ軽鎖を含み、少なくとも1つの他の親抗体がラムダ軽鎖を含む1つ以上の親抗体から得ることができる二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物を調製することができる。以下の議論に基づいて、大多数のこのような二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物にMab設計セットを適用することができる。
抗原結合ポリペプチド構築物のヘテロ二量体は、足場に連結することができる。足場は、ペプチド、ポリペプチド、ポリマー、ナノ粒子、または他の化学物質であってもよい。抗原結合ポリペプチド構築物のヘテロ二量体は、ポリペプチドである足場のN末端またはC末端にいずれかに連結させてもよい。一実施形態において、足場は、アルブミンポリペプチドである。
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S239D/D265S/S298A/I332E、S239E/S298A/K326A/A327H、G237F/S298A/A330L/I332E、S239D/I332E/S298A、S239D/K326E/A330L/I332E/S298A、G236A/S239D/D270L/I332E、S239E/S267E/H268D、L234F/S267E/N325L、G237F/V266L/S267D、並びに参照によって本明細書に組み込まれるWO2011/120134及びWO2011/120135に列挙されている他の突然変異。Therapeutic Antibody Engineering(William R.Strohl and Lila M.Strohl,Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11,ISBN 1 907568 37 9,Oct 2012)は、FcのFc−γ受容体への結合に影響を及ぼすFcへの追加の修飾について283頁に記載されている。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗原結合ポリペプチド構築物のFcは、エフェクター機能を改善するための修飾であり得る。このような修飾は、当該技術分野で公知であり、それらには、無フコシル化、またはADCCのための受容体、主にFCGR3aの活性化及びCDCのためのC1qに向けてのFc部分の親和性の操作が含まれる。次の表Yに、エフェクター機能を操作するために文献において報告された様々な設計をまとめる。
当該技術分野で公知のとおり、FcRnへの結合は、細胞内取り込みされた抗体をエンドソームから血流へと戻して再循環させる(Raghavan et al.,1996,Annu Rev Cell Dev Biol 12:181−220;Ghetie et al.,2000,Annu Rev Immunol 18:739−766)。このプロセスは、全長分子のサイズが大きいことによる腎臓濾過の除外と結びついて、1〜3週間の範囲の好ましい抗体血清半減期をもたらす。FcRnへのFcの結合も、抗体輸送において重要な役割を果たす。従って、一実施形態において、Fcは、FcRnと結合するFcの能力を変更または促進する1つ以上のアミノ酸修飾を含む。
本明細書に記載される構築物は、本明細書に記載されるFcに機能的にカップリングされている本明細書に記載される1つ以上のヘテロ二量体を含み得る。いくつかの態様において、Fcは、1つ以上のリンカーを有してまたは有さずに、1つ以上のヘテロ二量体にカップリングされている。いくつかの態様において、Fcは、1つ以上のヘテロ二量体に直接カップリングされている。いくつかの態様において、Fcは、1つ以上のリンカーで1つ以上のヘテロ二量体にカップリングされている。いくつかの態様において、Fcは、リンカーによって、各ヘテロ二量体の重鎖にカップリングされている。
一実施形態において、本明細書に記載される抗原結合ポリペプチド構築物の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖は、共有結合が重鎖と軽鎖の間の優先的対合に干渉しないか、またはその抗原と結合するヘテロ二量体の能力に影響するか、またはその安定性に影響するように、さらに修飾され得る(すなわち、様々なタイプの分子の共有結合により)。このような修飾としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護/遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞内リガンドもしくは他のタンパク質への結合などが挙げられるが、これらに限定されない。多くの化学的修飾のいずれかは、特異的化学分解、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない、公知の技術により行われ得る。
上述のように、本明細書に記載される抗原結合ポリペプチド構築物は、第1のヘテロ二量体及び第2のヘテロ二量体を含み得る。第1のヘテロ二量体は、少なくともVH及びCH1ドメインを有する免疫グロブリン重鎖またはその断片、及びVLドメイン及びCLドメインを有する免疫グロブリンラムダ軽鎖を含み、第2のヘテロ二量体は、少なくともVH及びCH1ドメインを有する免疫グロブリン重鎖またはその断片、及びVLドメイン及びCLドメインを有する免疫グロブリンカッパ軽鎖を含む。免疫グロブリンポリペプチド配列は、本明細書に記載される優先的対合を促進するアミノ酸修飾を組み込むように遺伝子操作される。従って、二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物の場合には、典型的には、抗原結合ポリペプチド構築物を構成する2つの免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列またはそれらの断片、及び2つの免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド配列の4つの異なるポリペプチド配列が存在する。抗原結合ポリペプチド構築物の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列及び免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド配列は、当該技術分野で知られている組換えDNA技術を用いて容易に調製することができる。例えば、Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,3rd ed.,2001)、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2nd ed.,1989)、Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,John Wiley and Sons,New York,4th ed.,1999)、及びGlick and Pasternak,Molecular Biotechnology:Principles and Applications of Recombinant DNA(ASMPress,Washington,D.C.,2nd ed.,1998)において記載されるような標準技術は、組換え核酸法、核酸合成、細胞培養、導入遺伝子の組み込み、及び組換えタンパク質発現のために使用することができる。
本明細書に記載される抗原結合ポリペプチド構築物の遺伝子操作された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖は、上述のように、哺乳類細胞中で同時発現することができる。一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物の免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖は、宿主細胞中で同時発現される。従って、二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物の場合には、2つの免疫グロブリン重鎖及び2つの免疫グロブリン軽鎖は、宿主細胞中で同時発現される。しかし、4つの鎖全てを発現する単一のクローナルなまたは一過性細胞株のみの使用に依存しない二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物の別の生成方法が、当該技術分野でも知られている(Gramer,et al.(2013)mAbs 5,962,Strop et al.(2012)J Mol Biol 420,204.)。これらの方法は、二重特異性抗体の形成に関与している軽鎖及び重鎖の2つの対の、酸化還元条件下(レドックス生成)での生成後のアーム交換に依存する。このアプローチにおいて、H1L1及びH2L2ヘテロ二量体は、2つの異なる細胞株において発現されて、2つのヘテロ二量体を独立して生成することができる。続いて、2つのヘテロ二量体を選択酸化還元条件下で混合し、2つの固有の重鎖H1及びH2の再会合を達成し、H1L1H2L2を含む二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物を形成する。
上述のように、抗原結合ポリペプチド構築物は、H1及びL1を含む第1のヘテロ二量体、並びにH2及びL2を含む第2のヘテロ二量体を含み、L1は、ラムダ軽鎖であり、L2は、カッパ軽鎖であり、H1及びH2は、互いに異なる。H1、L1、H2、及びL2のうちの1つ以上は、L2と比較してL1とH1の優先的対合を促進し、L1と比較してL2とH2の優先的対合を促進するアミノ酸修飾を含む。H1L1ヘテロ二量体の第1のFab領域、及びH2L2ヘテロ二量体の第2のFab領域は、対応する野生型の第1のFab領域または野生型の第2のFab領域と類似の親和性を有する抗原と結合することができる。H1L1ヘテロ二量体の第1のFab領域、及びH2L2ヘテロ二量体の第2のFab領域は、対応する野生型の第1のFab領域または野生型の第2のFab領域のものに匹敵する熱安定性も示す。
優先的対合の程度は、例えば、下述の方法を用いることにより、及び実施例において評価することができる。優先的対合は、LCCA設計セット(H1L1L2、またはH2L1L2)またはMab設計セット(H1L1H2L2)の文脈において評価することができる。
ヘテロ二量体の熱安定性は、当該技術分野で公知の方法に従って決定することができる。各ヘテロ二量体の融解温度は、その熱安定性を示す。ヘテロ二量体の融点は、示差走査熱量測定のような技術を用いて測定することができる(Chen et al(2003)Pharm Res 20:1952−60;Ghirlando et al(1999)Immunol Lett 68:47−52)。あるいは、ヘテロ二量体の熱安定性は、円二色性を用いて測定することもできる(Murray et al.(2002)J.Chromatogr Sci 40:343−9)。
ヘテロ二量体のそれぞれの抗原への結合親和性、及び、相互作用のオフ・レート(off−rate)は、当該技術分野で周知の方法に従って競合的結合アッセイによって決定することができる。競合的結合アッセイの一例は、増大量の非標識抗体の存在下における標識抗原(本明細書に記載されるヘテロ二量体(例えば、3Hまたは125I)と対象となる分子)とのインキュベーション、及び標識リガンドと結合した分子の検出を含む、放射性イムノアッセイである。抗原に対するヘテロ二量体の親和性及び結合オフ・レートは、スキャッチャードプロット解析による飽和データから決定することができる。
また、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される抗原結合ポリペプチド構築物を含む薬学的組成物である。このような組成物は、治療的に有効量の抗原結合ポリペプチド構築物、及び薬学的に許容される担体を含む。特定の実施態様において、「薬学的に許容される」という用語は、連邦または州政府の監督官庁による承認、または米国薬局方、もしくは動物、さらに詳しくはヒトに用いるための一般に認識された他の薬局方に記載された承認を意味する。「担体」という用語は、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指し、これらと一緒に治療剤は投与され得る。そのような薬学的キャリアは、無菌性液体(例えば、水及び油)であり得、これらとしては、石油からなる油、動物油、植物油または合成由来の油(例えば、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油など)が挙げられるが、これらに限定されない。水は、薬学的組成物が静脈内に投与される場合に好ましい担体である。さらに、生理食塩水溶液及び水性デキストロース溶液及びグリセロール溶液もまた、液体担体として、特に、注射用溶液のために用いられ得る。適切な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。所望される場合、組成物はまた、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳化剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態を取り得る。この組成物は、坐剤として、伝統的な結合剤及び担体(例えば、トリグリセリド)とともに処方され得る。経口製剤は、標準的な担体(例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど)を含み得る。適切な薬学的担体の例は、E.W.Martinによる「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に記載されている。このような組成物は、治療的に有効量の化合物を、好ましくは精製された形態において、患者に対して適切な投与のための形態を提供するために適切な量の担体と共に含有する。この製剤は、投与の様式に適合されるべきである。
上述のように、本明細書に記載される抗原結合ポリペプチド構築物は、親抗体から得られ、ここで、抗原結合ポリペプチド構築物の各ヘテロ二量体は、親抗体の1つに対応し、ヘテロ二量体を構成する免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の優先的対合を促進するアミノ酸修飾を組み込むように遺伝子操作されている。従って、本明細書に記載される抗原結合ポリペプチド構築物は、親抗体または親抗体の組み合わせを使用する同じ疾患、障害、または感染の治療または予防のために使用され得る。
一実施形態において、本明細書に記載されるMab設計セットは、二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物を産生するために使用することができる。本明細書に記載されるMab設計セットは、Mab設計セットライブラリーの形態で利用することができ、Mab設計セットライブラリーは、二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物を形成するために優先的対合を促進する上で有用性を示すMab設計セットを含む。一実施形態において、Mab設計セットライブラリーは、表4A及び表4Bに含まれるMab設計セットによって表される。一実施形態において、Mab設計セットライブラリーは、表10−A1〜10−A12及び10−B1〜10−B10のうちの1つ以上におけるMab設計セットによって表される。別の実施形態において、Mab設計セットライブラリーは、表10−A1〜10−A12のうちの1つ以上によって表される。一実施形態において、Mab設計セットライブラリーは、表10−B1、10−B2、10−B3、10−B4、10−B6、10−B8、及び10−B10のうちの1つ以上によって表される。Mab設計セットライブラリーは、以下のように2つの親抗体(すなわち、Mab1及びMab2)から出発する抗原結合ポリペプチド構築物を産生するために使用することができる。説明のために、Mab1は、ラムダFabを含み、かつ、免疫グロブリン重鎖ポリペプチドH1及び免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドL1を含む一方、Mab2は、カッパFabを含み、かつ、免疫グロブリン重鎖ポリペプチドH2及び免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドL2を含む。
一実施形態において、コンピューターは、チップセットに連結された少なくとも1つのプロセッサーを含む。また、チップセットには、メモリー、記憶装置、キーボード、グラフィックアダプター、ポインティングデバイス、及びネットワークアダプターが連結されている。ディスプレイは、グラフィックアダプターに連結されている。一実施形態において、チップセットの機能性は、メモリコントローラーハブ及びI/Oコントローラーハブにより提供される。別の実施形態において、メモリーは、チップセットではなくプロセッサーに直接連結されている。
実施例
構造−及びコンピューター分子モデリング−ガイド付きのアプローチを使用して、一方のFabがカッパ軽鎖を有し、他方のFabがラムダ軽鎖を有する二重特異性抗体(すなわち、カッパ−ラムダ系、またはK−L系)を調製するためのカッパ−ラムダ(K−L)設計ライブラリーを生成した。K−L設計ライブラリーは、これらの重鎖及び軽鎖を同時発現させる場合に所望の二重特異性抗体の優先的形成を促進するFabの重鎖及び軽鎖においてアミノ酸修飾を有する設計を含む。K−L設計ライブラリーは、二重特異性抗体におけるカッパ及びラムダ軽鎖の間の固有の差を利用するため、カッパ−ラムダ系に対して最適化される。K−L設計ライブラリーは、代表的なFabの構造、カッパ軽鎖を含有する代表的なFab(カッパFab)としてD3H44(抗組織因子抗体)、及びラムダ軽鎖を含有する代表的なFab(ラムダFab)としてCAT−2200(抗IL−17A抗体)の構造を研究することによって生成したが、ライブラリーは、対象となる抗体において所望の対合特異性を示す設計を同定するために、他の二重特異性K−L系抗体またはその断片の文脈において使用することができる。
実施例1に記載のアプローチを使用して、H−Lヘテロ二量体対の一方がカッパ軽鎖を含有し、他方がラムダ軽鎖を含有する場合に選択的または優先的対合を示す重鎖−軽鎖ヘテロ二量体対(すなわち、H1L1及びH2L2)を設計する。ヘテロ二量体は、「Mab設計」または「Mab設計セット」と呼ばれる対で設計され、優先的対合を促進するH1、L1、H2、及びL2鎖上に一連のアミノ酸置換を含む。Mab設計セットは、相対的対合を評価するために、Mab設計セットの1つの重鎖を、Mab設計セットの2つの軽鎖、1つのカッパ及び1つのラムダと同時発現させる「LCCA設計」として最初に試験した。実施例を通じて記載されたアミノ酸置換は、特に指示されない限り、Kabat and Wu,1991;Kabat et al,Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition−US Department of Health and Human Services,NIH publication no.91−3242,p647(1991)に記載されるようなKabat番号付けシステムを用いて、(ペルツズマブ及びCAT−2200 Fabに対する)表3A及び表3Bを参照しながら同定した。しかしながら、参考のため、表22A、22B、及び22Cは、該当するIMGT、1JPT、及びEU番号付けシステムを用いて、重鎖、カッパ軽鎖、及びラムダ軽鎖中の選択されたアミノ酸位置の同定を提供する。
抗HER2抗体ペルツズマブ及び抗IL17抗体CAT−2200の野生型Fab重鎖及び軽鎖を、以下のように調製した。ペルツズマブFab軽鎖(GenBank受託番号HC359025.1、配列番号2)及び重鎖(GenBank受託番号HC359024.1、配列番号1)のタンパク質配列をDNAに逆翻訳し、哺乳動物発現のためにコドン最適化し、遺伝子を合成した(それぞれ、配列番号8及び7)。CAT−2200 Fab軽鎖(2VXS鎖L、配列番号4)及び重鎖(2VXS鎖H、配列番号3)のタンパク質配列をPDBエントリー2VXSから採取し、DNAに逆翻訳し、哺乳動物発現のためにコドン最適化し、遺伝子を合成した(それぞれ、配列番号10及び9)。これらの抗体重鎖及び軽鎖のポリペプチド及びDNA配列を表3Cに示す。
アミノ酸修飾を含むFab形式におけるCAT−2200及びペルツズマブIgG重鎖及び軽鎖をコードする構築物は、実施例3に記載されたように調製された。LCCA設計セット(H1、L1、L2またはH2、L2、L1)の文脈において、構築物が優先的に対合して、所望のH−Lヘテロ二量体を形成する能力は、軽鎖競合アッセイ(LCCA)を用いて決定された。
実施例3に記載されたように調製された1つの重鎖構築物及び2つの軽鎖構築物を含むLCCA設計を、以下のようにCHO−3E7細胞にトランスフェクトした。CHO−3E7細胞は、1.7〜2×106細胞/mlの密度で、4mMのグルタミン及び0.1% KoliphorP188(Sigma #K4894)を補充したFreeStyle(商標)F17培地(Invitrogenカタログ番号A−1383501)中で、37℃で培養した。2mlの総体積に対し、1:2.5のDNA:PEI比でPEI−pro(Polyplusトランスフェクション番号115−375)を用いて合計2μgのDNAをトランスフェクトした。全てのトランスフェクションは、333ngの各重鎖及び各軽鎖(すなわち、H1:L1:L2またはH2:L2:L1=1:1:1比)、300ngのAKTdd pTT22(構成的に活性なプロテインキナーゼB突然変異体を含有するベクター)、及び700ngのssDNA(サケ精子DNA)を用いて行った。DNA−PEI混合物を添加してから24時間後に、0.5mMのバルプロ酸(最終濃度)及び1%w/vトリプトン(最終濃度)を細胞に添加した後、細胞を32℃に移した。上清を、7日目に、非還元SDS−PAGE分析により発現について試験し、続いて、クマシーブルー染色により、バンドを可視化した。
LCCA設計における2つの軽鎖の各々への優先的な重鎖対合の程度は、各軽鎖のN末端に位置する固有のエピトープタグのSPRベースの読み出しを用いて評価した。CAT−2200 LC構築物は、FLAGタグを含有し、ペルツズマブLC構築物は、HAタグを含有する。
全ての表面プラズモン共鳴アッセイを、25℃の温度で、PBST泳動緩衝液(PBS Teknova Inc、0.05% Tween20を含む)を用いるBioRad ProteOn XPR36装置(Bio−Rad Laboratories(Canada)Ltd.(Mississauga,ON))を用いて実行した。抗ペンタHis(商標)捕捉表面を、分析物(水平)方向に100μL/分で140秒間注入された標準BioRad sNHS/EDC溶液の1:5希釈液により活性化されたGLCセンサーチップを用いて生成した。活性化の直後、10mMのNaOAc pH4.5中の抗ペンタHis(商標)抗体(Qiagen Inc.)の25μg/mLの溶液を、おおよそ3000共鳴単位(RU)が固定されるまで、25μL/分の流量で分析物(垂直)方向に注入した。分析物方向に100μL/分で1Mのエタノールアミンの140秒間の注入により、残りの活性基を急冷し、これはまた、モックでの活性化されたインタースポットがブランク参照のために作製されることを確保するものである。
H1L1H2L2形式で存在する、設計ごとの優先的対合の評価は、1つはH1L1L2組み合わせに対し、他方はH2L1L2組み合わせに対する2つの相補的なLCCA設計セットによって評価した。各LCCA設計セットは、「固有の識別子」(例えば、10629または10695)で示される。その結果、各Mab設計セット(H1L1H2L2)は、2つの構成LCCAのLCCA設計セット数(例えば、10629−10695)によって同定される。
LCCA結果は、Mab設計セットの文脈において表5A及び5Bに示す。表5Aは、実施例2に記載されるK−L設計に関するLCCAデータを提供する一方、表5Bは、実施例2にも記載されるK−K由来K−L設計に関するLCCAデータを提供する。全てのLCCA実験は、定常ドメイン(H/C233−L/C214、Kabat番号付け)に位置する鎖間Fabジスルフィド結合を含有する構築物で行われたことに留意されたい。
正しく対合されたヘテロ二量体H1L1またはH2L2は、固有の識別子セット(表4A及び4B)で示されるように、熱安定性及び抗原結合に関して試験するために、スケールアップされ(典型的には、20mlまで)、以下のように精製された。これらの実験では、Fabの重鎖をABD2タグ無しで発現させた一方、軽鎖をLCCAで使用した同じHAまたはFLAGタグで発現させた。各ヘテロ二量体の重鎖及び軽鎖をCHO−3E7細胞の20ml培養中で発現させた。CHO−3E7細胞は、1.7〜2×106細胞/mlの密度で、4mMのグルタミン及び0.1%KoliphorP188(Sigma #K4894)を補充したFreeStyle(商標)F17培地(Invitrogenカタログ番号A−1383501)中で、37℃で培養した。20mlの総体積に対し、1:2.5のDNA:PEI比でPEI−pro(Polyplusカタログ番号115−375)を用いて合計20μgのDNAをトランスフェクトした。DNA−PEI混合物を添加してから24時間後に、0.5mMのバルプロ酸(最終濃度)及び1%w/vトリプトン(最終濃度)を細胞に添加した後、細胞を32℃に移した。
CAT−2200 Fabヘテロ二量体がIL−17Aと結合し、ペルツズマブFabがHER2−ECDと結合する能力は、アミノ酸置換が、ヘテロ二量体が抗原と結合する能力に任意の効果を有したかどうかを判断するために評価した。Fabヘテロ二量体は、実施例5に記載されたように調製された。その抗原に対する各Fabヘテロ二量体の親和性は、以下のようにSPRによって決定した。
示差走査型蛍光測定(DSF)を使用して、野生型の非修飾の重鎖−軽鎖対のものと比較して、正しく対合されたヘテロ二量体の熱安定性を測定した。DSFは、融点を測定するにはあまり正確ではない方法であると知られているが、熱安定性を測定するためのハイスループット方法であることにより、熱安定性のいくつかの測定が、多数のFabヘテロ二量体について得ることができるため、ここで使用した。Fabヘテロ二量体は、実施例5に記載されたように調製された。
設計されたFabヘテロ二量体対の熱安定性は、以下のようにDSFを用いて測定した。各ヘテロ二量体は、実施例5に記載されるように精製し、DPBS(ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、HyCloneカタログ番号SH30028.02)中で0.5mg/mLに希釈した。試料の大部分では、シプロオレンジゲル染色(Life Technologiesカタログ番号S−6650)の作業原液は、4μLのシプロオレンジゲル染色を2mlのDPBSに希釈することによって調製された。14μLの0.5mg/mLタンパク質を60μLの希釈されたシプロオレンジゲル染色作業原液に添加することによって、DSF試料を調製した。しかしながら、0.5mg/mL未満であったタンパク質では、14μLの未希釈タンパク質を60μLのシプロオレンジ染料の作業原液(DPBS中で1:1500に希釈した)に添加することによって、各DSF試料を調製した。次に、DSF分析を、Rotor−Gene 6000 qPCR装置(QiaGen Inc)を用いて、20μlのアリコート上で重複して行った。各試料は、各ステップ間に10秒の平衡と開始時に30秒の待ち時間を有した1℃間隔を用いて30℃〜94℃で走査した。ゲイン9を有する470nMの励起フィルターと610nMの発光フィルターを使用した。変性曲線の一次導関数からの最大値をTmとして用いて、Rotor−Gene 6000ソフトウェアでデータを分析した。残りのDSF試料を、測定されたTm値を変更しない以下のプロトコル改変で同様に調製し、分析した:1)1μLのシプロオレンジゲル染色を2mlのDPBSに希釈することによって作業原液を調製した、2)30μlのアリコートを分析した、3)ゲイン10を使用した。
DSFによって熱安定性の測定を補完するため、示差走査熱量測定(DSC)のより正確な方法を使用して、野生型の非修飾重鎖−軽鎖対のものと比較して、正しく対合された設計Fabヘテロ二量体の熱安定性も測定した。Fabヘテロ二量体は、実施例5に記載されたように調製された。
設計されたFabヘテロ二量体対の熱安定性を、以下のように、DSCを用いて測定した。PBS中の0.2mg/mlまたは0.4mg/mLのいずれかの主濃度で精製した試料400μLを、VP−キャピラリーDSC(GE Healthcare)を用いて、DSC分析のために使用した。各DSC起動の開始時に、緩衝液ブランクの注入を5回行って、ベースラインを安定させ、参照用の各試料注入前には、緩衝液注入を設定した。各試料を、60℃/時の速度で20〜100℃、低フィードバックの、8秒間のフィルター、5分間のpreTstat、及び70psiの窒素圧で走査した。結果として得られたサーモグラムを参照し、Origin7ソフトウェアを使用して分析した。
ペルツズマブ/CAT−2200系におけるK−L設計及びK−K由来K−L設計の性能は、表5A及び5Bにそれぞれ示すように、設計が選択的対合をドライブする能力についてさらなる理解を導くために調べた。この調査により、その後のサイクルの設計最適化が、可能であれば、対合特異性を改善し、及び/またはヘテロ二量体の安定性を増すことが可能になった。設計最適化には、特定の置換アミノ酸残基での別のアミノ酸置換の効果を評価するためにその残基でのK−L設計及びK−K由来K−L設計の改変、追加のアミノ酸残基にアミノ酸置換を付加すること、及び/または特定の残基でアミノ酸置換を除去すること(すなわち、それを野生型残基に再変換すること)が含まれた。設計プロセス及び設計の選択は、実施例1及び2に記載されるように行い、得られた設計は、ペルツズマブ/CAT−2200 K−L系中で試験した。
Mab設計セットに対応するアミノ酸置換を含むペルツズマブ及びCAT−2200 Fab構築物は、実施例3に記載されたように調製された。実施例4に記載されるように、全てのLCCA実験は、定常ドメイン(H/C233−L/C214、Kabat番号付け)に位置する鎖間Fabジスルフィド結合を含有する構築物で行われた。Mab設計セットによって示された優先的対合を評価するために、対応するLCCA設計セットによって示された優先的対合は、以下の例外を除いて、実施例4に記載されるように測定された。
データ分析は、以下に記載されるように、実施例4に記載の分析の改変バージョンを用いて実行した。
上述のように、LCCA結果は、Mab設計セットの文脈において表8A及び8Bに示す。表8Aは、実施例9に記載のK−L設計に関するLCCAデータを提供する。選択基準を満たした151個のK−L設計、及び設計のほとんどは、定常領域中にのみアミノ酸修飾を有し、いくつかの設計は、可変領域中にもアミノ酸修飾を組み込んでいる(表7Aを参照)。これらの設計は、対合特異性及び安定性をさらにドライブすることを提案しながら、他の抗体系への移動可能性も好む。
正しく対合されたヘテロ二量体の生物物理学的特徴を調べるために、表7A及び7Bに示す固有の識別子セットで同定された、選択された正しく対合されたヘテロ二量体H1L1またはH2L2(設計されたFab)の調製は、20mlではなく50mlスケールアップを行ったことを除いて、実施例5に記載されるようにスケールアップした。発現されたFabは、熱安定性及び抗原結合について試験するために、実施例5に記載されるように精製された。精製プロトコルを改変して、平衡緩衝液中でいずれの初期希釈をせずにIgG−CH1 CaptureSelect(商標)で上清をインキュベートし、結合した試料の溶出を4ベッドボリュームの溶出緩衝液で行った。
CAT−2200設計されたFabヘテロ二量体がIL−17Aと結合し、ペルツズマブ設計されたFabヘテロ二量体がHER2−ECDと結合する能力は、アミノ酸置換が、ヘテロ二量体が抗原と結合する能力に任意の効果を有したかどうかを判断するために評価した。CAT−2200設計されたFabを、900秒の解離相ではなく600〜800秒の解離相をおいて、50μL/分で120秒間注入した以外は、抗原結合は、実施例6に記載されるように評価した。さらに、HER2と結合するための設計されたペルツズマブFabのスクリーニングは、以下の改変:Fab捕捉ごとに、Fabを240秒ではなく120秒の注入時間で2μg/mlではなく2.5μg/mlに希釈した以外は、実施例6に記載されるように行った。注入した最低のHER2抗原濃度は、0.41nMではなく1.23nMであった。濃度系列の解離相は、1200秒ではなく600秒であった。
示差走査型蛍光測定(DSF)を使用して、野生型Fabのものと比較して、正しく対合された設計Fabヘテロ二量体の熱安定性を測定した。Fabヘテロ二量体は、実施例11に記載されたように調製された。
設計されたFabヘテロ二量体の熱安定性は、以下のようにDSFを用いて測定した。精製された各ヘテロ二量体を、DPBS(ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、HyCloneカタログ番号SH30028.02)中で0.67mg/mLに希釈した。シプロオレンジゲル染色(Life Technologiesカタログ番号S−6650)の作業原液は、DPBS中で1:1000希釈によって調製された。15μLの0.67mg/mLタンパク質を15μLのシプロオレンジゲル染色作業原液に添加することによって、DSF試料を調製した。しかしながら、0.67mg/mL未満の濃度であったタンパク質では、15μLの未希釈タンパク質を15μLのシプロオレンジ染料の作業原液に添加することによって、各DSF試料を調製した。次に、DSF分析を、Rotor−Gene 6000 qPCR装置(QiaGen Inc)を用いて、30μlのアリコート上で行った。各試料は、各ステップ間に10秒の平衡と開始時に30秒の待ち時間を有した1℃間隔を用いて30℃〜94℃で走査した。ゲイン8を有する470nMの励起フィルターと610nMの発光フィルターを使用した。変性曲線の一次導関数からの最大値をTmとして用いて、Rotor−Gene 6000ソフトウェアでデータを分析した。
DSFによって熱安定性の測定を補完するため、示差走査熱量測定(DSC)のより正確な方法を使用して、野生型の非修飾重鎖−軽鎖対のものと比較して、正しく対合された設計Fabヘテロ二量体の熱安定性も測定した。Fabヘテロ二量体は、実施例11に記載されたように調製され、熱安定性は、実施例8に記載されるようにDSCによって測定された。しかしながら、プロトコルで示されたものより低い試料濃度を有したFabヘテロ二量体の場合、DSCは、利用可能な濃度で行った。
実施例2〜14は、K−L設計及びK−K由来K−L設計の設計及び試験について記載した。これらの設計が対合を促進する能力は、各LCCA設計セットの1つの重鎖が適切な軽鎖と対合する能力を決定したFab形式において、LCCAで試験した。結果として得られた正しく対合されたヘテロ二量体(1つの重鎖及び1つの軽鎖)の安定性及び抗原結合に対するアミノ酸置換の効果についても評価した。
代表的な設計は、対合特異性を示し、かつ、抗原結合にほとんどまたは全く影響を与えない、並びに設計安定性などの二次基準を考慮し、野生型の発現に匹敵する置換数を最小化する一次基準に基づいて選択された。最大の対合特異性は、一方のFab対合がヘテロ二量体対における他方のFabよりも不十分であるが、野生型対合よりも良いことが実証された両方のFab並びに各Fabを個別に考慮して評価した(図6に示すようにシナリオA及びB)。加えて、クラスター内の多様性、及びクラスターにおける設計の数が、選択された代表的なクラスターのタイプ及び数をさらに導いた。
LCCAにより評価されたように、各クラスターにおいて所望の対合特異性を促進した「ドライバー」または「ドライバーセット」(アミノ酸位置及び/または置換)を同定することに重点を置いて、代表的なものを選択したクラスターをここに記載した。「ドライバーセット」という用語は、優先的対合を促進する一連のアミノ酸位置及び置換を指すが、「ドライバー」という用語は、ドライバーセット内の単一の位置/置換を指す。しかしながら、他の残基及び置換は、クラスターにおける設計または設計セットと時には関連していた。これらの残基及び置換は、「二次」置換と呼ばれ、Mab設計セットに時々含まれ、使用したドライバーセットまたは複数のドライバーセットの性能を改善した。機構的に、これらの二次置換は、i)ドライバーの立体適応を促進し、ii)重鎖と軽鎖の間の接続部分で、ドライバーセット位置での置換時に欠失した接点の数を増加させて、または接点を置換し、iii)ドライバーセットに基づいて、水素結合ネットワークを最適化し、及び/または、iv)ドライバーセットの性能改善を助長する環境を作るように作用し得る。これらの機構のうちの1つ以上は、各クラスターにおけるドライバーの性能を改善するために使用することができ、または改善することを意図する。
クラスター1の場合、2つの設計(13175−13486及び13180−13515)を選択して、同様のスペースを占有する類似の静電ドライバー利用したこれらの設計としてクラスターを表した(表10−A1を参照)。このクラスターの全てのメンバーの場合、2つのドライバーセットの組み合わせを利用した。第1の静電ドライバーセットは、H1中の負に帯電した置換(主にL143D)が、L1中の正に帯電した置換(T131K/R)と塩橋を形成することができるように設計された一方、H2は、a)正に帯電した置換S188KまたはL124R_S186Rが、L2中の負に帯電した置換(S176D_T178EまたはS176D_T180E)と塩橋を形成することができる、またはb)H2中のL143RまたはS186KとL2中のQ124E_V133Dの間に塩橋を形成することができるように設計された。「ジスルフィドステアリングドライバーセット」と言われる第2の静電ドライバーセットを添加して、H−L組立プロセスの初期段階における誤対合ヘテロ二量体中のH−Lまたはヘテロ二量体ジスルフィド結合の形成を嫌った。ジスルフィドステアリングドライバーセットは、H1中の正に帯電した置換(A125R)、L1中の負に帯電した置換(S122D)、H2中の負に帯電した置換(K228D)、及びL2中の正に帯電した置換(S121K)を使用した。これらのアミノ酸置換は、K−L設計におけるアミノ酸置換の大部分が位置する埋められた(主)H−L接続部分から離れて、ジスルフィド結合の近傍に位置する。2つのドライバーセットは、優先的に対合されたヘテロ二量体において塩橋を形成するように設計された一方、ミスマッチ対は、主に静電反発により嫌われる。
著しく少ないK−K由来K−L設計セットを、K−L設計と比較して、LCCAで試験した(n=43)。従って、10個のカッパ−カッパポートされたクラスターの各々は、単一設計によって表された。クラスターのほとんどは、立体ドライバーセットを利用した2つを除いて、静電ドライバーセットを利用した。さらに、2つのクラスターは、可変ドメインのみにおける設計からなった一方、残りのクラスターは、定常ドメイン設計からなった。
実施例2〜4及び10は、LCCA設計(すなわち、1つの重鎖を、Fab形式における2つの軽鎖と同時発現させた、H1、L1、L2、またはH2、L1、L2)の文脈において、設計されたFabが優先的に対合する能力を示した。この実施例では、Mab設計セット(H1、L1、H2、L2)で設計されたヘテロ二量体を評価して、二重特異性抗体形式(すなわち、H1、L1、H2、及びL2を同時発現させる)において優先的対合を促進したかどうかを判定した。Mab設計セットのアミノ酸置換に加えて、各ヘテロ二量体の完全長重鎖のFc領域は、一方の重鎖がアミノ酸置換T350V、L351Y、F405A、及びY407V(鎖A)を含み、他方の重鎖がアミノ酸置換T350V、T366L、K392L、及びT394W(鎖B)を含むように非対称的に修飾された(Fcのアミノ酸番号付けは、EU番号付けシステムに従っている)。これらの非対称Fc修飾は、固有の重鎖のヘテロ二量体化を促進するために含んだ。
Mab設計セットのアミノ酸置換を含有するヘテロ二量体が優先的に対合して、正しく対合された二重特異性抗体を形成する能力は、下述のように評価された。このアッセイは、4つの鎖(一方の抗体からH1及びL1鎖と、他方の抗体からH2及びL2鎖)を同時発現させることと、正しく形成された二重特異性抗体の存在を、質量分析(LC−MS)を用いて検出することに基づいている。図8は、4つの出発ポリペプチド鎖と、ヘテロ二量体対の(Fab及びFc領域の両方における)重鎖と軽鎖との間の優先的対合の不在下で、これらの出発ポリペプチド鎖の同時発現から得られる可能性のある産物とを示す概略図を提供する。2つの固有の完全長重鎖構築物は、2つの固有の軽鎖構築物と同時発現され、10の可能な抗体種(Mab種とも呼ばれる):H1L1_H1L1、H1L2_H1L2、H1L1_H1L2、H2L1_H2L1、H2L2_H2L2、H2L1_H2L2、H1L1_H2L1、H1L2_H2L2、H1L2_H2L1、及びH1L1_H2L2を得た。H1L1_H2L2種は、正しく対合された二重特異性抗体である(図8を参照)。図8に示すように、4つのタイプのハーフ抗体(ハーフAb)種も可能であった。固有の重鎖のヘテロ二量体化を促進するために修飾をFc領域に導入する場合、可能性のあるMab種の数は減少する(すなわち、種E〜Jはそれほど観察されない)。正しく対合された二重特異性抗体種H1L1_H2L2対他の種の量の観点における相対的な対合特異性は、タンパク質A(pA)精製及び脱グリコシル化後に、LC−MSを用いて決定された。可能であれば、鎖はタグ付けされないままであり、全てのMab種及び半Ab種が互いに少なくとも50Da異なるものとする。質量差がこの可能性を妨げる場合には、HAタグの切断が時々観察される際に、可能であれば、FLAGタグの使用を強調して、種間の十分な質量の差別化を提供するために、N末端タグ(HAまたはFLAG)を軽鎖に添加した(CR8071を含有する構築物の場合には、FLAGタグのみを使用した)。
設計に従ってアミノ酸修飾を含むCAT−2200、ペルツズマブ、CR8071及びSGN−CD19aのIgGの重鎖及び軽鎖をコードする構築物を、以下のように調製した。CAT−2200及びペルツズマブ軽鎖配列は、実施例3に記載されたように調製されたが、部分ヒンジ−CH2−CH3ドメイン[配列番号6]をコードし、ヘテロ二量体化を促進するように修飾されたIgG1*01DNA配列を、実施例3に記載される(ヒンジの部分を含有し、LCCAにおける構築物で使用したABD2伸長を除外する)Fab重鎖調製物のCH1ドメインのC末端上に付加することによって、これらの抗体の完全長重鎖配列を作製した。Mab設計セットのアミノ酸置換を含有する構築物は、実施例3で述べたように、遺伝子合成または部位特異的突然変異誘発のいずれかによって生成した。ただし、C末端リジンのクリッピングによるLC−MSシグナルの不均質を防ぐために、標準的なC末端重鎖リジン残基を除去した(Lawrence W.Dick Jr.et al.,Biotechnol.Bioeng.(2008)100:1132−43)。
試験した各Mab設計セットに対応する野生型またはアミノ酸置換のいずれかの、各二重特異性抗体系の2つの重鎖及び2つの軽鎖をコードする構築物を、以下のようにCHO−3E7細胞にトランスフェクトした。CHO−3E7細胞は、1.7〜2×106細胞/mlの密度で、4mMのグルタミン及び0.1% Koliphor P188(Sigma #K4894)を補充したFreeStyle(商標)F17培地(Invitrogenカタログ番号A−1383501)中で、37℃で培養した。200mlの総体積に対し、1:4のDNA:PEI比でPEI−max(Polysciencesカタログ番号24765−2)を用いて、H1:H2:L1:L2の比を変化させて、(100μgの抗体DNA、及び100μgのGFP/AKT/スタファーDNAからなる)合計200μgのDNAをトランスフェクトした。DNA−PEI混合物を添加してから24時間後に、0.5mMのバルプロ酸(最終濃度)及び1%w/vトリプトンN1(最終濃度)を細胞に添加した後、細胞を32℃に移し、収穫前に7日間インキュベートした。培養培地を遠心分離によって収穫し、Stericupの0.22μmフィルター(Milliporeカタログ番号SCGPU05RE)を用いて真空濾過した。その後、濾過した培養培地を、PBS pH7.4で予め平衡化されたプロテインA MabSelect SuRe樹脂(GE Healthcare #17−5438−02)を用いて精製した。次に、樹脂と結合した抗体種をPBS pH7.4で洗浄し、100mMのクエン酸ナトリウム緩衝液pH3.6で溶出した。溶出した抗体種を濃縮し、Amicon ultra 15遠心分離フィルターUltracel 10K(Millipore #SCGP00525)を用いて、遠心分離によってPBS pH7.4中でバッファー交換した。結果として得られた、抗体種を含有するプロテインA精製されたSMCA試料を、脱グリコシル化及びLC−MS前にキャリパーによって評価した。
二重特異性抗体の文脈において、Mab設計セットによりドライブされたヘテロ二量体の優先的対合の程度を、プロテインAでの精製及び非変性の脱グリコシル化後、質量分析を用いて評価した。ヘテロ二量体は、Fc N結合グリカンのみを含有したため、SMCA試料を、ただ1つの酵素、N−グリコシダーゼF(PNGase−F)で処理した。精製した試料を以下のようにPNGaseFで脱グリコシル化した:50mMのTris−HCl pH7.0中、0.2U PNGaseF/μgの抗体を、37℃で一晩インキュベートし、最終タンパク質濃度は、0.5mg/mLであった。脱グリコシル化後、LC−MS分析前に試料を4℃で保存した。
全体として、ほとんどの場合、脱グリコシル化処理は、LC−MSによって同定された可能な異なる抗体種の全てを同定する能力をもたらした。多くの場合、各抗体種は、単一のLC−MSピークによって表された。例外としては、所望の二重特異性種に対応する可能性が高い側ピーク(おそらく付加物またはリーダーペプチドの切断における異質性)を含んだが;しかしながら、側ピークをもたらす種の同一性は明確ではなかったため、これらの側ピークは、二重特異性種に寄与するとは考えなかった。さらに、所望の二重特異性種、H1L1_H2L2は、LC−MSに基づいて、誤対合タイプ、H1L2_H2L1から実験的に区別することが一般的にできない。従って、二重特異性抗体含有量を表に報告する場合、このタイプの誤対合種を含有しないことを完全に排除することはできない。しかしながら、H1L2_H1L2及びH2L1_H2L1、並びにH1L2及びH2L1ハーフ抗体などの種で観察された非常に低い含有量は、誤対合種による二重特異性種の、あるとすれば、ごくわずかな汚染が発生したことを示す。
第1ステップとして、試験した3つの二重特異性系ごとに、系ごとの親抗体の野生型(種間の十分な質量分化のために、必要に応じて、タグを含有する軽鎖のうちの1つ)の、非修飾重鎖及び軽鎖を、H1:H2:L1:L2の種々のDNA比を用いて同時発現させ、結果として得られた抗体種を同定し、定量化した。これにより、(例えば、二重特異性系における一方の親抗体の軽鎖が、二重特異性系における他方の親抗体の重鎖と優先的に結合する場合に)各系における任意の固有の対合バイアス(またはタグの存在によって導入されたもの)を同定することができ、最低量のハーフAbsと共に最高量の二重特異性抗体をもたらしたH1:H2:L1:L2のDNA比を同定することもできた。DNA比は、発現レベルの天然の差、及び/または2つの親抗体の重鎖と軽鎖の間の固有の対合バイアス、及び/または系ごとの影響を補償するために選択した。試験した野生型二重特異性系A及びBでは、L2は、FLAGタグとタグ付けされた。二重特異性系Cでは、軽鎖のいずれもタグ付けなかった。
試験した40個の代表的な設計によるSMCAの結果を表14〜17に示す。表14〜17は、「設計」としてMab設計セットを指し、4桁の数字で識別されている。各4桁の数字は、表10−A1〜A12及び10−B1〜10−B10におけるMab設計セット固有の識別子(LCCAセット固有の識別子)に対応する。表24は、SMCAで試験した設計と、LCCAセット固有の識別子の間の対応表を提供する。優先的対合の分析は、2つのタイプの計算に基づいて行った。第1タイプの計算は、表において「%H1L1及び%H2L2対合」と記載され、総産物のパーセンテージとして、1つの正しく対合されたアームのみを有していたかもしれないMab種(H1L1_H2L2_及び_H1L2_H2L1+H1L1_H1L1+H2L2_H2L2+H1L1+H2L2+0.5×(H1L1_H2L1+H1L1_H1L2+H1L2_H2L2+H2L1_H2L2))を含む、観察された全てのMab種及びハーフAb種にわたるH1とL1、及びH2とL2の間の正しい対合の量を表す。この計算は、「総対合」計算と呼ばれる。第2タイプの計算は、表において「H1L1_H2L2及びH1L2_H2L1**」と記載され、観察された全てのMab種(すなわち、図8のMab種A〜J)(H1L1_H2L2_及び_H1L2_H2L1/(H1L1_H2L2_及び_H1L2_H2L1+H1L1_H1L1+H2L2_H2L2+H1L1_H2L1+H1L2_H2L2+H1L1_H1L2+H2L1_H2L2+H1L2_H1L2+H2L1_H2L1))のパーセンテージとして、正しく対合された二重特異性抗体の量を表す。この計算は、「総二重特異性」計算と呼ばれる。ハーフ抗体は、存在する場合、分取SECによって、またはさらなるH1:H2:L1:L2 DNA滴定を介して除去/最小化し得るため、考慮されなかった。表12は、DNA滴定が、発現されたハーフAb種のパーセンテージを操作するのに効果的であることを示す。「Fc鎖A」タイプのハーフAbの量を減少させる分取SEC精製の有効性を実施例18に示す。
代表的な設計ごとの正しい重鎖と軽鎖の優先的対合を促進する性能または能力は、総対合計算及び総二重特異性計算を用いて評価した。第一に、列「野生型に対する%H1L1及び%H2L2対合の変化」(野生型に対する総対合の変化)における正の値は、Mab設計セットが優先的対合を促進することができたことを示した。第二に、列「野生型に対するH1L1_H2L2及びH1L2_H2L1**の変化」(野生型に対する総二重特異性の変化)における正の値は、Mab設計セットが優先的対合を促進することができたことも示した。
複数の系において優先的対合を促進する代表的なMab設計セットの能力は、設計の「移動可能性」の尺度として試験した。「野生型に対する総対合の変化」計算を用いて、33個のK−L設計のうちの29個は、試験した3つの系のうちの3つで伝達可能であり、3個の設計は、試験した3つの系のうちの2つで伝達可能であった(表14)。言い換えれば、これらの設計は、「野生型に対する対合の変化」の正の値を示した。「野生型に対する総二重特異性の変化」計算を用いて優先的対合を測定した場合、33個のK−L設計のうちの24個は、3つの系のうちの3つで伝達可能として同定され、8個の設計は、3つの系のうちの2つで伝達可能であった(表15)。K−K由来K−L設計の場合、7個の設計のうちの2個は、「野生型に対する総対合の変化」計算を用いて、3つの系のうちの3つで伝達可能であり、4個の設計は、3つの系のうちの2つで伝達可能であった(表16)。「野生型に対する総二重特異性の変化」計算を用いて、7個の設計のうちの1個が、3つの系のうちの3つで伝達可能であり、5個の設計が、3つの系のうちの2つで伝達可能であった(表17)。33個のK−L設計のうちの23個、及び7個のK−K由来K−L設計のうちの1個が、両方の計算を用いて評価した場合に、試験した3つの系のうちの3つで伝達可能であった。
実施例16に記載のSMCAで生成された二重特異性抗体の生物物理学的特徴を評価するため、試験した代表的な設計のサブセットからのプロテインA精製されたSMCA試料に分取SECを施し、ハーフAb種を除去した。少なくとも60%の「H1L1_H2L2及びH1L2_H2L1**」(総二重特異性)を有するSMCA試料をこのステップのために選択した(合計で36個)。このカットオフを満たさないいくつかのSMCA試料も完全のために含まれた。例えば、所与の設計のSMCA試料が、試験した3つの二重特異性系のうちの2つでこのカットオフを満たした場合には、SMCA試料は、このカットオフを満たしたが、3番目ではないが、3つ全ての系のSMCA試料を含んだ。分取SECは、以下のように実行した。試料をカラム上に注入するのに使用したALIAS Bio Coolオートサンプラー(Spark−Holland)を備えたGE Healthcare AKTA Avant 25システム上に取り付けられたSuperdex 200 10/300 Increase(GE Healthcare)カラムを用いて、SMCA試料中の抗体種を分離した。PBS pH7.4中のSMCA試料(0.9ml)(Hyclone DPBS/改変、カルシウム無、マグネシウム無、Cat番号SH−300028.02)を、PBSで満たした2mlループ中に自動的に装填した。その後、試料をカラム上に自動的に注入し、0.5ml/分で、1CV溶出体積で分解した。タンパク質溶出は、OD280でモニターし、0.5ml画分で回収した。SMCA試料ごとに、主ピークを含んだ画分(画分は、Caliperによって評価した)をプールし、実施例19及び20に記載されるようにさらに生物物理学的に特徴付けた。
実施例16では、産生されたハーフAbのパーセンテージは、DNA滴定によって操作することができる、または、「Fc鎖A」タイプのハーフAbの場合には、これらは、プロテインA精製されたSMCA試料の分取SEC精製によって除去/最小化することもできるため、ハーフAbは、「総二重特異性」計算に従って、対合の計算から排除されたことが確認された。「Fc鎖AハーフAb」の除去を実証するため、3つ全ての二重特異性系における2つのK−L設計に対する実施例17の精製されたSMCA試料に、実施例16に記載されるようにLC−MS分析を施した。選択された2つのK−L設計は、(表11Aで同定されたように)2901及び3972であった。結果を表18に示す。
分取SEC後、分取SEC精製されたSMCA二重特異性抗体の熱安定性を測定し、アミノ酸置換が熱安定性に任意の効果を有したかどうかを判断するために、親CAT−2200、ペルツズマブ、CR8071及びSGN−CD19aモノクローナル抗体と比較した。
選択された二重特異性ヘテロ二量体抗体及び野生型対照の熱安定性は、以下のように、示差走査熱量測定(DSC)を用いて測定した。
分取SEC処理後、PBS中の0.4mg/mlの主濃度の試料400μLを、VP−キャピラリーDSC(GE Healthcare)を用いて、DSC分析のために使用した。各DSC起動の開始時に、緩衝液ブランクの注入を5回行って、ベースラインを安定させ、参照用の各試料注入前には、緩衝液注入を設定した。各試料を、60℃/時の速度で20〜100℃、低フィードバックの、8秒間のフィルター、3分間のpreTstat、及び70psiの窒素圧で走査した。結果として得られたサーモグラムを参照し、Origin7ソフトウェアを使用して分析した。
二重特異性抗体が適当な抗原と結合する能力は、アミノ酸置換が、抗原結合に任意の効果を有したかどうかを判断するために評価した。抗原結合親和性は、以下のようにSPRによって決定された。
Biacore T200:CM5シリーズSセンサーチップで試験するために、Biacoreアミンカップリングキット(NHS、EDC、及び1Mエタノールアミン)、及び10mMの酢酸ナトリウム緩衝液は、GE Healthcare Life Science(Mississauga,ON,Canada)から購入した。Biorad ProteOn:GLMセンサーチップで試験するために、Biorad ProteOnアミンカップリングキット(EDC、sNHS、及びエタノールアミン)、及び10mMの酢酸ナトリウム緩衝液は、Bio−Rad Laboratories(Canada)Ltd.(Mississauga,ON)から購入した。0.05% Tween20(PBST)を含むPBS泳動緩衝液は、Teknoca Inc.(Hollister,CA)から購入した。ヤギポリクローナル抗ヒトFc抗体は、Jackson Immuno Research Laboratories Inc.(West Grove,PA)から購入した。抗原:Hisタグ付き組換えヒトCD−19は、Abeam(Cambridge,UK)から購入し、Hisタグ付きインフルエンザBヘマグルチニン(B/Brisbane/60/2008)は、Sino Biological(Beijing,China)から購入した。組換えHer2細胞外ドメイン(ECD)タンパク質は、eBioscience (San Diego,CA)から購入した。組換えヒトIL−17Aは、R&D Systems(Mineapolis,MN)から購入した。
CD−19抗原と結合するための抗体(分取SEC精製されたSMCA試料及びOAA対照)のスクリーニングは、抗His IgG表面上にHisタグ付きCD−19の間接的捕捉、続いて、単一サイクル動態を用いた動態分析のために5つの濃度の精製された抗体の注入、という2つのステップにおいて行われた。製造者の指示に従って、活性及び参照フローセルの上におおよそ12000RUの抗His IgG(His Capture Kit、GE Healthcare)をアミンカップリングすることによって、抗His捕捉表面を、CM5シリーズSセンサーチップ上に調製した。CD−19を、10μl/分の流量で60秒間、活性フローセルの上に10μg/mlで注入した。一般に、これは、抗His IgG表面の上におおよそ250RUのCD−19の捕捉をもたらした。CD−19は、参照(ブランク)フローセル上に捕捉されなかった。捕捉ステップの後、続いて、5つの濃度の精製された抗体(抗体に応じて、200nM及び2倍希釈液、80nM及び2倍希釈液、または40nM及び2倍希釈液)を、600秒の解離相をおいて、40μL/分で180秒間、活性及び参照フローセルの両方の上に順次注入した。捕捉された抗体表面を、10mMグリシンpH1.5によって30μL/分で120秒間再生成し、表面を次の注入サイクル用に調製した。少なくとも2つのモック緩衝液注入を分析物注入ごとに行い、参照用に使用した。得られた単一サイクル動態センサーグラムをBiacore T200 BiaEvaluationソフトウェアバージョン3.0を用いて分析し、1:1の結合モデルにフィットさせた。
ヘマグルチニン(HA)を10mM酢酸緩衝液pH5.5中で希釈し、アミンカップリングを介して、CM5シリーズSセンサーチップ上に直接固定化した。これにより、おおよそ120〜130RUの固定化されたHAが得られた。参照フローセルは、ブランク対照として使用するために空のままにした(エタノールアミン遮断された)。単一サイクル動態を用いた動態分析のために抗体をHA表面上に注入した。続いて、5つの濃度(40nM及び2倍希釈液)の精製された抗体(分取SEC精製されたSMCA試料及びOAA対照)を、3600秒の解離相をおいて、50μL/分で300秒間、活性及び参照フローセルの両方の上に順次注入した。HA表面を、2サイクルの10mMグリシンpH1.5を用いて、30μL/分で120秒間再生成し、表面を次の注入サイクル用に調製した。少なくとも2つのモック緩衝液注入を分析物注入ごとに行い、参照用に使用した。得られた単一サイクル動態センサーグラムを、Biacore T200 BiaEvaluationソフトウェアバージョン3.0を用いて分析し、1:1の結合モデルにフィットさせた。
遺伝子操作された二重特異性抗体の品質を評価するため、実施例17と同様に分取SECにより精製された抗体にUPLC−SECを施した。UPLC−SECを、30℃に設定し、PDA検出器を備えたWaters Acquity UPLCシステム上に取り付けられたWaters BEH200 SECカラム(2.5mL、4.6×150mm、ステンレス鋼、1.7μm粒子)を用いて行った。泳動時間は、7分からなり、0.4ml/分で、PBS及び0.02%のTween20 pH7.4の泳動緩衝液による注入1回当たりの総体積は、2.8mLであった。溶出は、210〜400nmの範囲でUV吸光度によりモニターし、クロマトグラムを280nmで抽出した。ピーク積分は、Empower 3ソフトウェアを用いて行った。
Claims (44)
- 第1のヘテロ二量体及び第2のヘテロ二量体を含む抗原結合ポリペプチド構築物であって、
前記第1のヘテロ二量体(H1L1)は、第1の抗原と特異的に結合する第1のFab領域を形成する第1の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列(H1)及び免疫グロブリンラムダ軽鎖ポリペプチド配列(L1)を含み;前記第2のヘテロ二量体(H2L2)は、第2の抗原と特異的に結合する第2のFab領域を形成する第2の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列(H2)及び免疫グロブリンカッパ軽鎖ポリペプチド配列(L2)を含み、
H1は、H2とは異なり、H1及びH2の各々は、重鎖可変ドメイン(VHドメイン)及び重鎖定常ドメイン1(CH1ドメイン)を含み;
L1は、ラムダ軽鎖可変(VL−ラムダ)ドメイン及びラムダ軽鎖定常(CL−ラムダ)ドメインを含み、L2は、カッパ軽鎖可変(VL−カッパ)ドメイン及びカッパ軽鎖定常(CL−カッパ)ドメインを含み;
H1、H2、L1、及びL2のうちの1つ以上は、L2と比較してL1とH1の優先的対合を促進し、及び/またはL1と比較してL2とH2の優先的対合を促進する、対応する野生型のH1、H2、L1、及びL2ポリペプチド配列と比較して、アミノ酸修飾を含み、前記アミノ酸修飾は、天然に発生するシステイン残基を除去しない
前記抗原結合ポリペプチド構築物。 - H1、H2、L1及びL2が細胞または哺乳類細胞中で同時発現される場合、または、H1、H2、L1及びL2が無細胞発現系中で同時発現される場合、または、H1及びL1が細胞中で生成され、H2及びL2が異なる細胞中で生成され、かつ、前記2つの細胞の産物が酸化還元生成方法を介して混合される場合、または、H1及びL1が無細胞発現系中で生成され、H2及びL2が異なる無細胞発現系中で生成され、かつ、前記2つの無細胞発現系の産物が混合される場合、前記アミノ酸修飾が、L2と比較してL1とH1の優先的対合を促進し、及び/またはL1と比較してL2とH2の優先的対合を促進する、請求項1に記載の構築物。
- 各ヘテロ二量体は、単一Fabを含む、請求項1または2に記載の抗原結合ポリペプチド構築物。
- a.H2は、143位にアミノ酸置換を含み;L2は、124位にアミノ酸置換を含み;及び
i.H1は、186または179位にアミノ酸置換を含み、及びL1は、180位にアミノ酸置換を含み;
ii.H1は、186位にアミノ酸置換を含み;L1は、133位にアミノ酸置換を含み;
iii.H1は、143位にアミノ酸置換を含み;L1は、133位にアミノ酸置換を含み;または
iv.H1は、188位にアミノ酸置換を含み;L1は、178位にアミノ酸置換を含み;
b.H1は、143位にアミノ酸置換を含み;L1は、131位にアミノ酸置換を含み;
i.H2は、186または124_186位にアミノ酸置換を含み、L2は、133または133_160または124_133または176_180;または
ii.H2は、188位にアミノ酸置換を含み;L2は、131位にアミノ酸置換を含み;
iii.H2は、143位にアミノ酸置換を含み;L2は、124_133または124_133_180位にアミノ酸置換を含み;
c.H1は、143位にアミノ酸置換を含み;L1は、131位にアミノ酸置換を含み;
i.H2は、124_186または124_179または188位にアミノ酸置換を含み、L2は、176_178または176_180または131位にアミノ酸置換を含み;または
ii.H2は、143_188または143または124_143位にアミノ酸置換を含み;L2は、124_176_178または124_178または124_180または124_176_180、または124、または124_176位にアミノ酸置換を含み;
d.H1は、179、186、143及び/または188位にアミノ酸置換を含み;L1は、180、133及び/または176_178位にアミノ酸置換を含み;H2は、143位にアミノ酸置換を含み、L2は、131及び/または124位にアミノ酸置換を含み;
e.H1は、39位にアミノ酸置換を含み、または、優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まず;L1は、38位にアミノ酸置換を含み、または、優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まず;H2は、39位にアミノ酸置換を含み、L2は、38位にアミノ酸置換を含み;
f.H1は、143位にアミノ酸置換を含み;L1は、131位にアミノ酸置換を含み;
i.H2は、188または124_186位にアミノ酸置換を含み、L2は、176_178または176_180または131位にアミノ酸置換を含み;または
ii.H2は、143または186位にアミノ酸置換を含み;L2は、124_133または124_133_180位にアミノ酸置換を含み;
g.H1は、188位にアミノ酸置換を含み;L1は、176_178または178位にアミノ酸置換を含み;及び
i.H2は、177_188位にアミノ酸置換を含み、L2は、176_178位にアミノ酸置換を含み;または
ii.H2は、186または124または124_179位にアミノ酸置換を含み;L2は、176または131_176位にアミノ酸置換を含み;
h.H1は、186位にアミノ酸置換を含み;L1は、133位にアミノ酸置換を含み;
i.H2は、188位にアミノ酸置換を含み、L2は、131位にアミノ酸置換を含み;または
ii.H2は、177_188位にアミノ酸置換を含み;L2は、176_178位にアミノ酸置換を含み;または
H1は、124_190位にアミノ酸置換を含み;L1は、135位にアミノ酸置換を含み;H2は、124または188位にアミノ酸置換を含み、L2は、176または176_178位にアミノ酸置換を含み;
i.H1は、177_188位にアミノ酸置換を含み;L1は、176_178位にアミノ酸置換を含み;及び
i.H2は、188位にアミノ酸置換を含み、L2は、176_178または131位にアミノ酸置換を含み;
ii.H2は、186位にアミノ酸置換を含み;L2は、133または124_160_180位にアミノ酸置換を含み;
iii.H2は、124または124_179または124_186位にアミノ酸置換を含み;L2は、176または176_178または176_180位にアミノ酸置換を含み;または
iv.H2は、143位にアミノ酸置換を含み;L2は、133または124_133位にアミノ酸置換を含み;
j.H1は、188位にアミノ酸置換を含み;L1は、178位にアミノ酸置換を含み;H2は、124または188位にアミノ酸置換を含み;L2は、176_178または176_180または176位にアミノ酸置換を含み;
k.H1は、145_188位にアミノ酸置換を含み;L1は、178位にアミノ酸置換を含み;H2は、124及び/または188位にアミノ酸置換を含み;L2は、124、133、及び178のうちの1つ以上にアミノ酸置換を含み;
l.H1は、174、179または186位にアミノ酸置換を含み;L1は、176または180位にアミノ酸置換を含み;H2は、143または190位にアミノ酸置換を含み、L2は、131、135または124位にアミノ酸置換を含み;または
m.H1は、174位にアミノ酸置換を含み;L1は、176位にアミノ酸置換を含み;H2は、190位にアミノ酸置換を含み;L2は、優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まず、または135位にアミノ酸置換を含み;
n.H1は、143_190位にアミノ酸置換を含み;L1は、133位にアミノ酸置換を含み;H2は、124位にアミノ酸置換を含み;L2は、131_135位にアミノ酸置換を含み;
o.H1は、143及び/または186位にアミノ酸置換を含み;L1は、133位にアミノ酸置換を含み;H2は、124位にアミノ酸置換を含み;L2は、131位にアミノ酸置換を含み;
p.H1は、143_179位にアミノ酸置換を含み;L1は、124_178位にアミノ酸置換を含み;H2は、186位にアミノ酸置換を含み、L2は、178_180または160_180位にアミノ酸置換を含み;
q.H1は、143位にアミノ酸置換を含み;L1は、124位にアミノ酸置換を含み;H2は、179または186位にアミノ酸置換を含み、L2は、124_160_180位にアミノ酸置換を含み;
r.H1は、186位にアミノ酸置換を含み;L1は、180または178_180位にアミノ酸置換を含み;H2は、143及び/または179位にアミノ酸置換を含み、L2は、124_178または131位にアミノ酸置換を含み;
s.H1は、179位にアミノ酸置換を含み;L1は、180位にアミノ酸置換を含み;H2は、143位にアミノ酸置換を含み、L2は、124位にアミノ酸置換を含み;
t.H1は、143または186位にアミノ酸置換を含み;L1は、180位にアミノ酸置換を含み、または優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まず;H2は、143_145位にアミノ酸置換を含み、L2は、124位にアミノ酸置換を含み;
u.H1は、優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まず;L1は、135位にアミノ酸置換を含み;H2は、139位にアミノ酸置換を含み、L2は、116位にアミノ酸置換を含み;
v.H1は、優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まず、または45位にアミノ酸置換を含み;L1は、優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まず;H2は、45位にアミノ酸置換を含み、L2は、44位にアミノ酸置換を含み;
w.H1は、139位にアミノ酸置換を含み;L1は、116位にアミノ酸置換を含み;H2は、優先的対合を促進するアミノ酸置換を含まず、L2は、135位にアミノ酸置換を含み;または
x.H1は、124位にアミノ酸置換を含み;L1は、176位にアミノ酸置換を含み;H2は、124位にアミノ酸置換を含み;L2は、176位にアミノ酸置換を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗原結合ポリペプチド構築物。 - 前記第1の抗原に対する前記第1のFab領域の親和性は、前記第1の抗原に対する前記対応する野生型のH1及びL1ポリペプチド配列によって形成されたFab領域の親和性の約100倍以内であり、及び/または前記第2の抗原に対する前記第2のFab領域の親和性は、前記第2の抗原に対する前記対応する野生型のH2及びL2ポリペプチド配列によって形成されたFab領域の親和性の約100倍以内である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗原結合ポリペプチド構築物。
- 前記第1のFab領域の融解温度(Tm)が、前記第1の抗原に対する前記対応する野生型のH1及びL1ポリペプチド配列によって形成されたFab領域のTmの約20℃以内であり、及び/または前記第2のFab領域の融解温度(Tm)が、前記第2の抗原に対する前記対応する野生型のH2及びL2ポリペプチド配列によって形成されたFab領域のTmの約20℃以内である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗原結合ポリペプチド構築物。
- a.H1及びL1が、野生型ポリペプチド配列であり、H2及びL2の各々が、少なくとも1つのアミノ酸修飾を含み;
b.H1、L1、及びH2のうちの1つ以上が、少なくとも1つのアミノ酸修飾を含み、L2が、野生型ポリペプチド配列であり;
c.H1、L1、及びL2のうちの1つ以上が、少なくとも1つのアミノ酸修飾を含み、H2が、野生型ポリペプチド配列であり;
d.H1、H2、及びL2のうちの1つ以上が、少なくとも1つのアミノ酸修飾を含み、L1が、野生型ポリペプチド配列であり;
e.L1、H2、及びL2のうちの1つ以上が、少なくとも1つのアミノ酸修飾を含み、H1が、野生型ポリペプチド配列であり;または
f.H1、L1、H2、及びL2の各々が、少なくとも1つのアミノ酸修飾を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗原結合ポリペプチド構築物。 - 前記アミノ酸修飾が、
a.H1のCH1ドメイン、H2のCH1ドメイン、L1のCL−ラムダドメイン、及びL2のCL−カッパドメインのうちの少なくとも2つ;
b.H1及びH2のCH1及びVHドメイン、L1のCL−ラムダドメイン及びVL−ラムダドメイン、及びL2のCL−カッパドメイン及びVL−カッパドメインのうちの少なくとも2つ、または
c.H1のVHドメイン、H2のVHドメイン、L1のVL−ラムダドメイン、及びL2のVL−カッパドメインのうちの少なくとも2つ中である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗原結合ポリペプチド構築物。 - H1、L1、H2、及び/またはL2の各々が、前記Fab領域中に少なくとも1つのアミノ酸修飾を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の構築物。
- H1、H2、L1及びL2のうちの少なくとも1つが、少なくとも1つの定常ドメイン及び/または少なくとも1つの可変ドメインの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10のアミノ酸修飾を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の構築物。
- 前記アミノ酸修飾が、H1L1またはH2L2のうちの少なくとも1つの相対的対合が野生型に対して少なくとも約10%よりも大きく、かつ、他方の相対的対合が野生型の約10%以内または野生型に対して少なくとも約10%よりも大きくなるように、L2と比較してL1とH1の優先的対合を促進して、H1L1を形成し、または、L1と比較してL2とH2の優先的対合を促進して、H2L2を形成する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の構築物。
- 前記第1のFab領域の熱安定性が、前記対応する野生型のH1及びL1ポリペプチド配列によって形成されたFab領域のTmの約0、1、2、または3℃以内であり、及び/または前記第2のFab領域の熱安定性が、前記対応する野生型のH2及びL2ポリペプチド配列によって形成されたFab領域のTmの約0、1、2、または3℃以内である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の構築物。
- 前記アミノ酸修飾が、表10−A1〜10−A12の1つ以上に示す固有の識別子Mab設計セットからなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の構築物。
- 前記アミノ酸修飾が、表10−B1〜10−B10のいずれか1つに示す固有の識別子Mab設計セットからなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の構築物。
- 前記構築物が、各々が、CH3ドメイン配列を含み、リンカーを有してまたは有さずに、前記第1のFab領域及び第2のFab領域の1つに連結した2つのFcポリペプチドを有する二量体Fcをさらに含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の構築物。
- 前記Fcが、ヒトFc、ヒトIgG1 Fc、ヒトIgA Fc、ヒトIgG Fc、ヒトIgD Fc、ヒトIgE Fc、ヒトIgM Fc、ヒトIgG2 Fc、ヒトIgG3 Fc、またはヒトIgG4 Fcである、請求項15に記載の構築物。
- 前記Fcが、ヘテロ二量体Fcの形成を促進する前記CH3ドメイン配列のうちの少なくとも1つにおいて、野生型と比較して1つ以上の修飾を含む、請求項15または16に記載の構築物。
- 前記Fcが、
i)前記第1のFcポリペプチド中に修飾L351Y_F405A_Y407V、及び前記第2のFcポリペプチド中に修飾T366L_K392M_T394Wを有するヘテロ二量体IgG1 Fc;
ii)前記第1のFcポリペプチド中に修飾L351Y_F405A_Y407V、及び前記第2のFcポリペプチド中の修飾T366L_K392L_T394Wを有するヘテロ二量体IgG1 Fc;
iii)前記第1のFcポリペプチド中の修飾T350V_L351Y_F405A_Y407V、及び前記第2のFcポリペプチド中の修飾T350V_T366L_K392L_T394Wを有するヘテロ二量体IgG1 Fc;
iv)前記第1のFcポリペプチド中の修飾T350V_L351Y_F405A_Y407V、及び前記第2のFcポリペプチド中の修飾T350V_T366L_K392M_T394Wを有するヘテロ二量体IgG1 Fc;または
v)前記第1のFcポリペプチド中の修飾T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V、及び前記第2のFcポリペプチド中の修飾T350V_T366L_N390R_K392M_T394Wを有するヘテロ二量体IgG1 Fc
を含む、請求項15〜17のいずれか1項に記載の構築物。 - 前記Fcが、少なくとも1つのCH2ドメイン配列をさらに含む、請求項15〜18のいずれか1項に記載の構築物。
- H1、L1、H2、及びL2が同時発現される場合、
a)H1L1及びH2L2対合の合計によって測定された場合の正しい対合の総量の変化が、優先的対合を促進する前記Fab領域中にアミノ酸置換を有さない対応するH1、L1、H2、及びL2ポリペプチド鎖の対合と比較して、約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、または45%よりも大きく;
b)生成されたハーフ抗体以外の種のパーセンテージとして生成された二重特異性抗体の量によって測定された場合の正しい対合の総量の変化が、優先的対合を促進する前記Fab領域中にアミノ酸置換を有さない対応するH1、L1、H2、及びL2ポリペプチド鎖の対合と比較して、約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、または80%よりも大きく、または
c)生成された全ての種のパーセンテージとして生成された二重特異性抗体の量によって測定された場合の正しい対合の総量の変化が、優先的対合を促進する前記Fab領域中にアミノ酸置換を有さない対応するH1、L1、H2、及びL2ポリペプチド鎖の対合と比較して、約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、または80%よりも大きい、
請求項19に記載の構築物。 - 前記Fcが、Fc−γ受容体の選択的結合を促進し、Fc−γ受容体への結合を減少または排除し、またはFcRnへの結合を促進するために1つ以上の修飾を含む、請求項20に記載の構築物。
- 前記リンカーが、1つ以上のポリペプチドリンカーである、請求項15〜21のいずれか1項に記載の構築物。
- 前記リンカーが、1つ以上の抗体ヒンジ領域を含む、請求項22に記載の構築物。
- 前記リンカーが、1つ以上のIgG1ヒンジ領域を含む、請求項23に記載の構築物。
- 前記1つ以上のポリペプチドリンカーが、野生型ポリペプチドリンカーと比較して1つ以上の修飾を含む、請求項23または24に記載の構築物。
- 前記アミノ酸修飾が、アミノ酸置換である、請求項1〜25のいずれか1項に記載の構築物。
- H1、H2、L1、及びL2の各々の配列が、ヒト配列またはヒト化配列に由来する、請求項1〜26のいずれか1項に記載の構築物。
- 治療剤または薬物にコンジュゲートした、請求項1〜27のいずれか1項に記載の構築物。
- 請求項1〜27のいずれか1項に記載の構築物をコードする、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドセット。
- 請求項29に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドセットのうちの1つ以上を含む、ベクターまたはベクターセット。
- 前記ベクター、または前記ベクターセットのうちの少なくとも1つのベクターが、多シストロン性である、請求項30に記載のベクターまたはベクターセット。
- 請求項29に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドセット、または請求項30または31に記載のベクターまたはベクターセットを含む、単離細胞。
- 前記細胞が、酵母細胞、細菌性細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞である、請求項32に記載の単離細胞。
- 前記細胞が、請求項30または31に記載のベクターまたはベクターセットで安定的にトランスフェクトされるかまたは一過的にトランスフェクトされる、請求項33に記載の単離細胞。
- 請求項1〜28のいずれか1項に記載の抗原結合ポリペプチド構築物、及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
- 緩衝液、酸化防止剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂質、キレート剤、安定剤、及び賦形剤からなる群から選択される1つ以上の物質をさらに含む、請求項35に記載の薬学的組成物。
- 前記請求項1〜27のいずれか1項に記載の構築物の調製方法であって、
(d)前記抗原結合ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドセットを含む宿主細胞を得るステップ;
(e)前記抗原結合ポリペプチド構築物を発現させる条件下で宿主細胞培養物中の前記宿主細胞を培養するステップ、及び
(f)前記宿主細胞培養物から前記抗原結合ポリペプチド構築物を収集するステップ
を含む、前記方法。 - 前記宿主細胞が、前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドセットで一過的にトランスフェクトされるかまたは安定的にトランスフェクトされる、請求項37に記載の方法。
- 第1の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列(H1)及び第1の免疫グロブリンラムダ軽鎖ポリペプチド配列(L1)を含む第1のヘテロ二量体;及び第2の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列(H2)及び第2の免疫グロブリンカッパ軽鎖ポリペプチド配列(L2)を含む第2のヘテロ二量体中で相補的アミノ酸修飾を表すデータを含むデータセットを記憶し、
H1及びH2の各々は、少なくとも重鎖可変ドメイン(VHドメイン)及び重鎖定常ドメイン(CH1ドメイン)を含み、かつ、互いに異なり;
L1及びL2の各々は、少なくとも軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)及び軽鎖定常ドメイン(CLドメイン)を含み、
前記相補的アミノ酸修飾は、L2と比較してL1とH1の優先的対合を促進し、L1と比較してL2とH2の優先的対合を促進し、
前記データセットは、表10−A1〜10−A12または表10−B1〜10−B10のうちの1つ以上に記載されたそれら修飾またはそれら修飾のサブセットを表すデータを含む、
コンピュータ読み取り可能な記憶媒体。 - 二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物の生成方法であって、
前記構築物は、
a.第1の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列(H1)及び第1の免疫グロブリンラムダ軽鎖ポリペプチド配列(L1)を含む第1のヘテロ二量体;及び
b.第2の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列(H2)及び第2の免疫グロブリンカッパ軽鎖ポリペプチド配列(L2)を含む第2のヘテロ二量体、
を含み、
H1及びH2の各々は、少なくとも重鎖可変ドメイン(VHドメイン)及び重鎖定常ドメイン(CH1ドメイン)を含み、かつ、互いに異なり;
L1及びL2の各々は、軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)及び軽鎖定常ドメイン(CLドメイン)を含み;
H1、L1、H2、及びL2のうちの1つ以上は、L2と比較してL1とH1の優先的対合を促進し、かつ、L1と比較してL2とH2の優先的対合を促進するアミノ酸修飾を含み、
前記方法は、
a.請求項37に記載のデータセットからの1つ以上の相補的アミノ酸修飾をH1、L1、H2、及び/またはL2に導入すること;及び
b.宿主細胞中でH1、L1、H2、及びL2を同時発現し、前記二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物を含む発現産物を生成すること
を含む、前記方法。 - 他のポリペプチド産物に対する前記発現産物中の前記二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物の量を決定して、野生型H1、L1、H2、及びL2の同時発現から得られる発現産物中の二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物の量と比較して前記二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物の量の増加をもたらす相補的アミノ酸修飾の好ましいサブセットを選択することをさらに含む、請求項40に記載の方法。
- 前記構築物が、少なくとも2つのCH3ドメイン配列を含むFcを含み、前記Fcが、1つ以上のリンカーを有してまたは有さずに、前記第1のヘテロ二量体及び前記第2のヘテロ二量体に連結する、請求項40または41に記載の方法。
- 前記Fcが、ホモ二量体Fcを上回ってヘテロ二量体Fcの形成を促進する1つ以上のアミノ酸修飾を含むヘテロ二量体Fcである、請求項42に記載の方法。
- H1、L1、H2、及びL2が同時発現される場合、
a)生成された%H1L1及び%H2L2の合計によって測定された場合の正しい対合の総量の変化が、優先的対合を促進する前記Fab領域中にアミノ酸置換を有さない対応するH1、L1、H2、及びL2ポリペプチド鎖の対合と比較して、約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、または45%よりも大きく;
b)生成されたハーフ抗体以外の種のパーセンテージとして生成された二重特異性抗体の量によって測定された場合の正しい対合の総量の変化が、優先的対合を促進する前記Fab領域中にアミノ酸置換を有さない対応するH1、L1、H2、及びL2ポリペプチド鎖の対合と比較して、約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、または80%よりも大きく、または
c)生成された全ての種のパーセンテージとして生成された二重特異性抗体の量によって測定された場合の正しい対合の総量の変化が、優先的対合を促進する前記Fab領域中にアミノ酸置換を有さない対応するH1、L1、H2、及びL2ポリペプチド鎖の対合と比較して、約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、または80%よりも大きい、
請求項40〜43のいずれか1項に記載の方法。
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