CN117999285A - 包含基于mhc蛋白的异源二聚体的双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体地讲涉及包括基于MHC(主要组织相容性复合体)或MHC样蛋白(CD1(分化簇1)或HFE(血色素沉着蛋白))的膜近端结构域的异源二聚体的二价双特异性嵌合抗体，以及用于产生所述双特异性抗体的技术。本发明进一步涉及编码所述双特异性抗体的核酸、表达载体、用于产生所述二价嵌合双特异性抗体的宿主细胞以及用于产生所述细胞的方法。

Description

包含基于MHC蛋白的异源二聚体的双特异性抗体
发明领域
本发明涉及生物技术领域，具体地讲涉及包括基于MHC(主要组织相容性复合体)或MHC样蛋白(CD1(分化簇1)或HFE(血色素沉着蛋白))的膜近端结构域的异源二聚体的二价双特异性嵌合抗体，以及用于产生所述双特异性抗体的技术。本发明进一步涉及编码所述双特异性抗体的核酸、表达载体、用于产生所述二价嵌合双特异性抗体的宿主细胞以及用于产生所述细胞的方法。
发明背景
呈嵌合、人源化或全人类分子形式的单克隆抗体已经证明用作治疗多种障碍和疾病的有效药物。
天然存在的人类抗体分子由两条重链同源二聚体组成，其每一条与两个相同的轻链分子合作形成异源二聚体。呈全分子形式的常规单克隆抗体由重链和轻链的二价(“双臂”)异源二聚体组成。
疾病通常由于几种病理学引起，并且伴有许多伴生疾病。双特异性抗体能够结合并且从而中和两种或更多种不同抗原/抗体分子。与单克隆抗体相比较，医药产品在治疗特性(和价值)方面的显著改善潜力使双特异性抗体成为活跃的研究领域。在过去的二十年里，文献描述了许多关于双特异性抗体的改造版本的解决方案，如Brinkmann,U和REKontermann,2017,The Making ofBispecific Antibodies,MAbs；209Feb/Mar；9(2):182-212,doi:10.1080/19420862.2016.1268307所述。
如上所述，存在许多方法来创建具有组合抗原结合结构域，即具有彼此不同的抗原结合结构域的分子。然而，每种这些方法均具有其缺点。
通过化学方法交联为一种耗时的过程，因为同源二聚体和其他不合期望的副产物应当从相应部分中去除。另外，化学修饰的步骤可能改变蛋白的完整性，从而损害其稳定性。因此，以上方法一般地无效，并且可能导致抗体活性的丧失。
一种基于细胞融合(例如杂交瘤的产生)的方法为任意组装两条重链和两条轻链，产生10种抗体组合。靶异源多聚体抗体仅为以这种方式产生的抗体的一小部分。靶异源多聚体蛋白的分离显著降低产物的产率并增加生产成本。
重组DNA技术用于创建各种异源多聚体抗体，例如单链Fv片段、双体抗体等，其不含Fc片段。这种类型抗体分子的主要缺点为缺少Fc结构域，这导致抗体无法触发效应子功能(比如补体激活、与Fc受体结合等)。因此，需要包含功能性Fc结构域的双特异性抗体。
重组DNA技术进一步用于使用旋钮入孔(Knob-into-Holes)技术设计双特异性抗体。参见国际申请WO9627011和WO9850431以及Merchant AM等人,An efficient route tohuman bispecific IgG,Nat Biotechnol.1998Jul；16(7):677-81。限制以上方法使用的一个因素为以下事实：当在单个细胞中表达时，两种初始抗体的轻链应为相同的，以防止错配和形成不合期望的和/或非活性的分子。
双特异性抗体产物的纯度取决于如下两个因素：
a)细胞中共表达的两条不同重链的异源二聚体组装，和
b)使两条不同轻链与相应的重链正确配对。
设计双特异性抗体的“旋钮入孔”技术解决了细胞中共表达的两条不同重链的异源二聚体正确组装问题。然而，由于两条不同轻链与相应重链的正确配对问题仍未解决，因此使用旋钮入孔技术设计双特异性抗体使适当组装的双特异性产物的产率仅可达到约25％。
两条不同轻链与相应重链的正确配对问题以各种方式解决：
1.在抗体的第一和第二抗原结合部分中使用(相同的)轻链(Van Blarcom T等人,Productive common light chain libraries yield diverse panels of high affinitybispecific antibodies,MAbs.2018Feb/Mar；10(2):256-268.doi:10.1080/19420862.2017.1406570)。
以上解决方案的缺点为其非普适性，因为选择适合于两种效价的轻链可能是有问题的。此外，轻链中的氨基酸取代以优化抗原结合片段的特性可能会影响这两种效价。进一步地，抗体与第二抗原的结合可能被破坏。
2.使用单链格式，即其中对第一抗原具有特异性的抗原结合片段的轻链和重链经几个氨基酸的接头相互连接的格式。
这种格式存在技术缺点，因为其使用接头将抗体核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)融合于另一种结合蛋白(例如scFv或scFab)，或者将例如scFv内的轻和重可变结构域(VH和VL)或轻链(VL-CK(或CL))融合于scFab内的VH-CH1。接头可能会在治疗环境中引起问题。事实上，这些外源肽可引起针对接头本身或蛋白与接头之间的连接区的免疫反应。此外，这些肽的灵活性及其移动性使其更易于蛋白水解切割，可能导致抗体稳定性差、聚集和免疫原性增加。
3.修饰双特异性抗体中的CH1-CK结构域，以允许改变双特异性抗体表达技术中的相互作用界面，以便排除轻链的不正确缔合。例如，国际申请WO2017059551提供了促进期望的重链和期望的轻链之间优选配对的CH1和/或CK中的各种氨基酸取代。
尽管存在以上各种双特异性抗体表达技术，但本领域仍然需要提高双特异性抗体产物的纯度以及用于产生正确地组装的双特异性抗体的可扩展生产解决方案。
发明简述
由本发明作者开发的包括基于MHC或MHC样蛋白(例如CD1(分化簇1)或HFE(人类稳态铁调节蛋白))的膜近端结构域的异源二聚体的新格式的双特异性嵌合抗体，以及用于产生所述双特异性嵌合抗体的技术，令人惊讶地使得可产生具有在细胞中共表达的两条不同重链的正确异源二聚体组装以及两条不同轻链和相应重链之间的正确配对的高产率产物。
由本发明作者开发的包括基于MHC或MHC样蛋白的膜近端结构域的异源二聚体的新格式的双特异性嵌合抗体，以及用于产生所述双特异性抗体的技术，令人惊讶地使得可以高纯度产生正确组装的双特异性嵌合抗体产物。
因此，以上结果降低生产成本并导致用于产生正确组装的双特异性抗体的可扩展生产解决方案。
在一方面，本发明涉及一种二价双特异性嵌合抗体，其中所述抗体包含：
a)特异性地结合于第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链；
其中第一轻链包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域；
其中第一重链包含抗体的重链可变结构域和包括第一(CH1)重链恒定结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体的重链恒定结构域；
b)特异性地结合于第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，
其中第二轻链包含轻链可变结构域和选自以下的恒定结构域：
MHC(主要组织相容性复合体)的第一膜近端结构域或
MHC样蛋白的第一膜近端结构域；
其中第二重链包含重链可变结构域、选自以下的恒定结构域：
MHC(主要组织相容性复合体)的第二膜近端结构域或
MHC样蛋白的第二膜近端结构域；
和包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体；
其中MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC或MHC样蛋白的第二膜近端结构域在其间形成通过二硫键稳定的异源二聚体；
其中一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域以其表面彼此接触，经修饰形成二价双特异性嵌合抗体，所述重链CH3结构域中的修饰为促进异源二聚化的取代。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括在其间形成异源二聚体的MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC或MHC样蛋白的第二膜近端结构域，所述异源二聚体借助于第一和/或第二恒定结构域中的一个或多个突变以在MHC或MHC样蛋白的第一和第二膜近端结构域之间形成S-S键(二硫半胱氨酸桥)，而通过二硫键稳定。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括在其间形成异源二聚体的MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC或MHC样蛋白的第二膜近端结构域，所述异源二聚体借助于将MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域在C-末端延伸一个或多个(1-10个)氨基酸并在C-末端具有末端Cys以在MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和铰链之间形成S-S键(二硫键、半胱氨酸桥)的延伸，而通过二硫键稳定。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域的延伸，该延伸为3个氨基酸GSC的序列。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
包含轻链可变结构域(VL1)和轻链恒定结构域的第一轻链；
第一重链，其包含抗体的重链可变结构域(VH1)和包括第一(CH1)重链恒定结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体的重链恒定结构域；
包含轻链可变结构域(VL2)和MHC的第一膜近端结构域或MHC样蛋白的第一膜近端结构域的第二轻链；
第二重链，其包含重链可变结构域(VH2)、MHC的第二膜近端结构域或MHC样蛋白的第二膜近端结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体；
其中MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC或MHC样蛋白的第二膜近端结构域在其间形成异源二聚体，其借助于第一和/或第二恒定结构域中的一个或多个突变以在MHC或MHC样蛋白的第一和第二膜近端结构域之间形成S-S键(二硫半胱氨酸桥)，而通过二硫键而稳定；
其中在第一Fc变体和第二Fc变体之间于CH3结构域中形成旋钮入孔结构。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
包含轻链可变结构域(VL1)和轻链恒定结构域的第一轻链；
第一重链，其包含抗体的重链可变结构域(VH1)和包括第一(CH1)重链恒定结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体的重链恒定结构域；
包含轻链可变结构域(VL2)和MHC的第一膜近端结构域或MHC样蛋白的第一膜近端结构域的第二轻链；
第二重链，其包含重链可变结构域(VH2)、MHC的第二膜近端结构域或MHC样蛋白的第二膜近端结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体；
其中在第一Fc变体和第二Fc变体之间于CH3结构域中形成旋钮入孔结构，
其中MHC的第一膜近端结构域或MHC样蛋白的第一膜近端结构域进一步包含MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域在C-末端延伸一个或多个(1-10个)氨基酸，并在C-末端具有末端Cys的延伸，以在MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和铰链之间形成S-S键(二硫键、半胱氨酸桥)。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
包含轻链可变结构域(VL1)和轻链恒定结构域的第一轻链；
第一重链，其包含抗体的重链可变结构域(VH1)和包括第一(CH1)重链恒定结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体的重链恒定结构域；
包含轻链可变结构域(VL2)和MHC的第一膜近端结构域或MHC样蛋白的第一膜近端结构域的第二轻链；
第二重链，其包含重链可变结构域(VH2)、MHC的第二膜近端结构域或MHC样蛋白的第二膜近端结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体；
其中在第一Fc变体和第二Fc变体之间于CH3结构域中形成旋钮入孔结构，
其中MHC的第一膜近端结构域或MHC样蛋白的第一膜近端结构域进一步包含MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域通过氨基酸序列GSC的延伸，以在MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和铰链之间形成S-S键(二硫键、半胱氨酸桥)。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含可选自以下的MHC的第一膜近端结构域：
MHC I类(主要组织相容性复合体I类)的第一膜近端结构域，
MHC II类(主要组织相容性复合体II类)的第一膜近端结构域，
MHC I类第一膜近端结构域的修饰变体或
MHC II类第一膜近端结构域的修饰变体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含可选自以下的MHC的第二膜近端结构域：
MHC I类(主要组织相容性复合体I类)的第二膜近端结构域，
MHC II类(主要组织相容性复合体II类)的第二膜近端结构域，
MHC I类第二膜近端结构域的修饰变体或，
MHC II类第二膜近端结构域的修饰变体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含人类MHC I类的膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含人类MHC II类的膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含MHC II类的膜近端结构域，其选自：HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ或HLA-DR。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含MHC I类的膜近端结构域，其选自：HLA-A、HLA-B、HLA-С、HLA-E、HLA-F或HLA-G。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含人类MHC样蛋白的膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含MHC样蛋白的第一膜近端结构域，其可选自：
D1(分化簇1)的第一膜近端结构域，
HFE(血色素沉着蛋白)的第一膜近端结构域，
CD1第一膜近端结构域的修饰变体或
HFE第一膜近端结构域的修饰变体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含MHC样蛋白的第二膜近端结构域，其可选自：
CD1(分化簇1)的第二膜近端结构域，
HFE(血色素沉着蛋白)的第二膜近端结构域，
CD1第二膜近端结构域的修饰变体或
HFE第二膜近端结构域的修饰变体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含CD1的膜近端结构域，其选自：CD1a、CD1b、CD1c、CD1d或CD1e。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括：第二轻链(VL)的可变片段，其通过1-25个氨基酸长的接头与MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域隔开；和/或第二重链(VH)的可变片段，其通过1-25个氨基酸长的接头与MHC或MHC样蛋白的第二膜近端结构域隔开。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
a)一条重链的CH3结构域，其经修饰使得在接触二价双特异性抗体中另一条重链CH3结构域的表面的一条重链CH3结构域的表面上，氨基酸残基由具有更大侧链体积的氨基酸残基取代，导致在一条重链CH3结构域的表面形成旋钮，其可放入到另一条重链CH3结构域表面的孔中，
和
b)另一条重链的CH3结构域，其经修饰使得在接触二价双特异性抗体中第一重链CH3结构域的表面的第二重链CH3结构域的表面上，氨基酸残基由具有更小侧链体积的氨基酸残基取代，导致在第二重链CH3结构域的表面形成孔，其可接受第一重链CH3结构域界面的旋钮；
其中所述具有更大侧链体积的氨基酸残基选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)，
和其中所述具有更小侧链体积的氨基酸残基选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含抗体第一轻链的恒定结构域，其选自CK或CL。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含抗体的CH3结构域，其通过将半胱氨酸(C)作为氨基酸引入到每个CH3结构域的相应位置使得可在CH3结构域之间形成二硫桥而进一步修饰。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性抗体包含一条重链的CH3结构域(其被修饰以形成旋钮)和另一条重链的CH3结构域(其被修饰以形成孔)，或反之亦然。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含一条重链的CH3结构域(其具有氨基酸取代S354C/T366W)和另一条重链的CH3结构域(其具有氨基酸取代Y349C/T366S/L368A/Y407V)。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括一条重链的CH3结构域(其具有氨基酸取代Y349C/T366S/L368A/Y407)和另一条重链的CH3结构域(其具有氨基酸取代S354C/T366W)。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域，其分别为MHC I的α2结构域和MHC II的β2结构域，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域，其分别为MHC II的β2结构域和MHC II的α2结构域，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含具有选自SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38的氨基酸序列的MHC II的α2结构域和具有选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ IDNO:39的氨基酸序列的MHC II的β2结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域，其分别为MHC II的α2结构域修饰变体和MHC II的β2结构域修饰变体，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域，其分别为MHC II的β2结构域修饰变体和MHC II的α2结构域修饰变体，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域，其分别为MHC I的α3结构域和β2微球蛋白(β2Μ)，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域，其分别为β2微球蛋白(β2Μ)和MHC I的α3结构域，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含具有选自SEQ ID NO:1-29的氨基酸序列的MHC I的α3结构域和具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的β2微球蛋白(β2Μ)。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域，其分别为MHC I的α3结构域修饰变体和β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域，其分别为β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体和MHC I的α3结构域修饰变体，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含具有选自SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48的氨基酸序列的β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域，其分别为CD1的α3结构域和β2微球蛋白(β2Μ)，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域，其分别为β2微球蛋白(β2Μ)和CD1的α3结构域，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含具有选自SEQ ID NO:40-44的氨基酸序列的CD1的α3结构域和具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的β2微球蛋白(β2Μ)。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域，其分别为CD1的α3结构域修饰变体和β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域，其分别为β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体和CD1的α3结构域修饰变体，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含具有选自SEQ ID NO:49-56和/或SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CD1的α3结构域修饰变体和具有选自SEQ IDNO:47或SEQ ID NO:48的氨基酸序列的β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域，其分别为HFE的α3结构域和β2微球蛋白(β2Μ)，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域，其分别为β2微球蛋白(β2Μ)和HFE的α3结构域，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HFE的α3结构域和具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的β2微球蛋白(β2Μ)。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域，其分别为HFE的α3结构域修饰变体和β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域，其分别为β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体和HFE的α3结构域修饰变体，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含具有选自SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48的氨基酸序列的β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含MHC或MHC样蛋白的修饰变体，其中修饰变体是指包含半胱氨酸(C)取代，以在由MHC或MHC样蛋白的第一和第二膜近端结构域产生的异源二聚体链之间形成二硫桥的变体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含MHC或MHC样蛋白的修饰变体，其中修饰变体是指在MHC或MHC样蛋白膜近端结构域的多个位置包括一个或多个取代，导致热力学稳定性Tm分别与野生型MHC或MHC样蛋白的膜近端结构域相比较提高多于1摄氏度的变体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含MHC或MHC样蛋白的修饰变体，其中修饰变体是指在MHC或MHC样蛋白膜近端结构域的多个位置包括一个或多个取代，导致聚集体的量分别与野生型MHC或MHC样蛋白的膜近端结构域相比较在高于10mg/ml的浓度下减少多于5％的变体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含MHC或MHC样蛋白的修饰变体，其中修饰变体是指在MHC或MHC样蛋白膜近端结构域的多个位置包括一个或多个取代，导致分别与野生型MHC或MHC样蛋白的膜近端结构域相比较去除糖基化位点的变体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含相同的第一轻链可变结构域和第二轻链可变结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含属于IgG的Fc片段。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含选自人类IgG1、IgG2或IgG4的Fc片段。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括Fc片段单体，其中进一步引入取代，导致二价双特异性抗体缺少ADCC、CDC和/或ADCP特性。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括Fc片段单体，其中进一步引入LALA取代(L234A和L235A)。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括Fc片段单体，其中进一步引入取代，导致抗体的作用延长。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括Fc片段单体，其中进一步引入YTE取代(M252Y、S254T和Τ256Ε)。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括Fc片段单体，其中进一步引入取代，导致二价双特异性抗体的ADCC、CDC和/或ADCP特性增强。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括Fc片段单体，其中进一步引入取代E345R。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体特异性地结合于CD20和CD3。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体特异性地结合于BCMA和CD3。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体特异性地结合于PD-L1和CD47。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体特异性地结合于凝血因子9(FIX)和凝血因子10(FX)。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体特异性地结合于GD2和CD3。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体特异性地结合于AXL和CD3。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体特异性地结合于PD-L1和TGFβ。
在一方面，本发明涉及一种编码任何以上二价双特异性嵌合抗体的分离核酸。
在本发明的一些实施方案中，核酸为DNA。
在一方面，本发明涉及一种包含任何以上核酸的表达载体。
在一方面，本发明涉及一种用于产生任何以上二价双特异性嵌合抗体的宿主细胞的产生方法并且包括用以上表达载体转化细胞。
在一方面，本发明涉及一种包含任何以上核酸的用于产生任何以上二价双特异性嵌合抗体的宿主细胞。
在一方面，本发明涉及一种用于产生任何以上二价双特异性嵌合抗体的包括以下步骤的方法：
a)用以下表达载体转化宿主细胞
-包含编码双特异性嵌合抗体的第一轻链和第一重链的核酸分子的表达载体，
-包含编码双特异性嵌合抗体的第二轻链和第二重链的核酸分子的表达载体，
b)在适合于合成所述二价双特异性嵌合抗体的条件下培养宿主细胞；和
c)从细胞培养物中分离所述二价双特异性抗体。
附图简述
图1为二价双特异性嵌合抗体格式的示意图。
A为二聚化单元的“正向”取向，B为二聚化单元的“反向”取向；
VH1、VL1分别为重链和轻链可变结构域，负责与抗原1结合；
VH2、VL2为负责与抗原2结合的可变结构域。
CH1、CK分别为重链和轻链恒定结构域；
b2M为β2微球蛋白，
CD1b为CD1b蛋白的α3结构域。
旋钮、孔为使得重链能够异源二聚化的抗体CH3结构域的突变。
图2为嵌合抗体的重链和轻链复合体的示意图，其中CH1和CK结构域由β2微球蛋白和CD1b蛋白的膜近端结构域α3取代。
A为二聚化单元的结构域的“直接”取向；
B为二聚化单元的“反向”取向。
VH、VL为抗体的可变结构域，
b2M为β2微球蛋白，
CD1b为CD1b蛋白的膜近端结构域α3，
铰链为抗体的铰链区，前5个氨基酸被明确显示，
Fc为抗体的Fc片段；
来自b2M的C-末端、CD1b的α3结构域和来自铰链区的N-末端的氨基酸被明确显示，
SS键如虚线所示。
图3为包含和不含重链和轻链之间的另外二硫键的嵌合抗体的电泳图，7.5％聚丙烯酰胺凝胶，非还原条件。
泳道：
M为Precision Plus ProteinTMDual Color Standards(BIO-RAD)的标准标记物，相应泳道的分子量在凝胶左侧的栏中表示为kDa；
1-对照帕洛利单抗(Prolgolimab)-IgG1；
2-基于帕洛利单抗可变结构域和取代CH1-CK的MHC样蛋白结构域并具有另外的二硫桥的单特异性嵌合抗体；
3-基于帕洛利单抗可变结构域和取代CH1-CK的MHC样蛋白结构域，没有另外的二硫桥的单特异性嵌合抗体；
4-基于帕洛利单抗可变结构域和取代CH1-CK的MHC样蛋白结构域，呈“反向”取向，具有另外的二硫桥的单特异性嵌合抗体。
图4为测试MHC二聚化单元对重链和轻链之间不正确配对的影响的实验图解。椭圆形表示来自MHC样蛋白的取代CH1和CK的结构域。
第1组：样品01-001-01-003为具有VH和VL的“正确”组合和恒定结构域的“不正确”对的抗体。
第2组：样品0-004-0-007为具有VH和VL的“不正确”组合和恒定结构域的“正确”对的抗体。
第3组：样品01-008-0-010为具有VH和VL“不正确”组合和恒定结构域的“不正确”对的抗体。
第4组：样品01-011和01-012为对照抗体，其分别为其中恒定结构域由MHC二聚化单元取代的嵌合抗体和IgG1格式的经典抗体。
VH和VL的“正确”组合意指来自单一抗体的一对VH和VH。VH和VL的“不正确”组合意指来自不同抗体的VH和VH。
恒定结构域的“正确”对意指一对CH1-CK或来自MHC样蛋白的一对结构域(在这种情况下，β2微球蛋白和CD1b蛋白的α3结构域)。恒定结构域的“不正确”对意指CH1-CD1b或β2微球蛋白-CK对。
图5为涉及链的不正确配对的实验中产生的样品的电泳图。7.5％聚丙烯酰胺凝胶，非还原条件。
A-泳道：
M为Precision Plus ProteinTMDual Color Standards(BIO-RAD)的标准标记物，相应泳道的分子量在凝胶左侧的栏中表示为kDa；
1-01-001；
2-01-002；
3-01-007；
4-01-008；
5-01-009；
6-01-012；
B-泳道：
M-Precision Plus ProteinTMDual Color Standards(BIO-RAD)标准标记物；
1-01-003；
2-01-004；
3-01-005；
4-01-006；
5-01-007；
6-01-012；
C-泳道：
M-Precision Plus ProteinTMDual Color Standards(BIO-RAD)的标准标记物；
1-01-010；
2-01-011。
图6为双特异性嵌合抗体的电泳图。
A-7.5％聚丙烯酰胺凝胶，非还原条件，
B-12.5％聚丙烯酰胺凝胶，还原条件。
泳道：
M为Precision Plus ProteinTMDual Color Standards(BIO-RAD)的标准标记物，相应泳道的分子量在凝胶左侧的栏中表示为kDa；
1-02-004，
2-02-005，
3-02-006，
4-02-007，
5-02-008，
6-02-009。
图7为涉及抗体02-006和02-007与两种不同抗原(hPD1ex-H6F和hCSF1R_His)同时相互作用的实验的传感图。阶段(实验步骤)在图像顶部编号，并通过垂直线分隔。给出每种抗体的2个传感图，其显示在步骤8与hCSF1R_His的相互作用(观察到信号水平增加)和在步骤8不含hCSF1R_His的1xKB缓冲液中的参考信号(信号水平没有增加)。
图8为样品02-004的总离子流色谱图的去卷积质谱。
A-峰4，
B-峰5，
C-峰6。
图9为通过GingisKHAN蛋白酶蛋白水解后双特异性嵌合抗体的SDS凝胶电泳的电泳图。7.5％聚丙烯酰胺凝胶，非还原条件。
A-泳道：
M为Precision Plus ProteinTMDual Color Standards(BIO-RAD)的标准标记物，相应泳道的分子量在凝胶左侧的栏中表示为kDa；
1-未通过GingisKHAN处理的02-004，
2-未通过GingisKHAN处理的02-009，
3-未通过GingisKHAN处理的奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)，
4-未通过GingisKHAN处理的01-011，
5-未通过GingisKHAN处理的帕洛利单抗，
6-未通过100mM碳酸氢铵缓冲液(pH 7.2)中的GingisKHAN处理的02-004；
B-泳道：
M-Precision Plus ProteinTMDual Color Standards(BIO-RAD)标准标记物；
1-通过GingisKHAN蛋白水解后的02-004，
2-通过GingisKHAN蛋白水解后的02-009，
3-通过GingisKHAN蛋白水解后的奥瑞珠单抗，
4-通过GingisKHAN蛋白水解后的01-011，
5-通过GingisKHAN蛋白水解后的帕洛利单抗，
6-通过100mM碳酸氢铵缓冲液(pH 7.2)中的GingisKHAN蛋白水解后的02-004，
C-泳道：
M-Precision Plus ProteinTMDual Color Standards(BIO-RAD)标准标记物；
1-未通过GingisKHAN处理的02-005，
2-通过GingisKHAN蛋白水解后的02-005，
3-未通过GingisKHAN处理的02-006，
4-通过GingisKHAN蛋白水解后的02-006，
5-未通过GingisKHAN处理的02-007，
6-通过GingisKHAN蛋白水解后的02-007，
D-泳道：
M-Precision Plus ProteinTMDual Color Standards(BIO-RAD)标准标记物，
1-未通过GingisKHAN处理的02-008，
2-通过GingisKHAN蛋白水解后的02-008，
3-未通过GingisKHAN处理的02-004，
4-通过GingisKHAN蛋白水解后的02-004。
图10为具有引入到基于MHC样蛋白的膜近端结构域的二聚化单元中的修饰的样品电泳图。7.5％聚丙烯酰胺凝胶，非还原条件。
A-泳道：
M为Precision Plus ProteinTMDual Color Standards(BIO-RAD)的标准标记物，相应泳道的分子量在凝胶左侧的栏中表示为kDa；
1-帕洛利单抗；
2-01-011；
3-03-003；
4-03-004；
5-03-005；
6-03-006；
7-03-007；
8-03-008。
B-泳道：
M-Precision Plus ProteinTMDual Color Standards(BIO-RAD)标准标记物；
1-帕洛利单抗；
2-01-011；
3-03-001；
4-03-002。
发明描述
一般定义和通用方法
除非本文另外定义，否则与本发明相关使用的所有技术和科学术语将具有本领域技术人员通常理解的相同含义。
此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数术语，和复数术语应包括单数术语。一般地，本文所述的细胞培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、有机合成化学、医学和药物化学以及蛋白和核酸的杂交和化学的本文分类和方法为本领域技术人员众所周知并且广泛使用的。酶反应和纯化方法根据如本领域常见的制造商指南或如本文所述进行。
本说明书中的术语“KD”是指亲和常数(或平衡常数)，由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)计算得出，并表示为摩尔浓度(M)。
“结合亲和力”通常是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间非共价相互作用的总和强度。除非另外指明，否则“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在(特征性、真实)结合亲和力。分子X对其结合配偶体Y的亲和力通常可通过亲和常数(KD)表示。优选的Kd值为约200nM、150nM、100nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、1nM或更小。亲和力可通过本领域已知的常见方法来测量，包括本说明书中描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原且倾向于易于解离，而高亲和力抗体通常更快结合抗原且倾向于保持结合更长时间。本领域已知多种测量结合亲和力的方法，其中任何一种均可用于本发明的目的。
术语“Kd”、“koff”或“kdis”是指结合分子和抗原之间的特定相互作用的解离速率常数。解离速率常数koff可使用生物膜层干涉法，例如使用OctetTM系统测量。
术语“Ka”、“kon”或“结合速率”是指缔合速率常数。
术语“R2”是指测定系数。
术语“反应”是指抗体-抗原结合信号。
如本说明书和随后的权利要求中使用的，除非上下文另外规定，否则词语“包括(include)”和“包含(comprise)”或其变体比如“包括(includes)”、“包括(including)”、“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将理解为意味着包括所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
发明详述
二价双特异性嵌合抗体
本发明涉及一种二价双特异性嵌合抗体。
本发明的抗体为单克隆抗体。
术语“单克隆抗体”或“mAb”是指由单独的克隆细胞群合成和分离的抗体。
本发明的抗体为重组抗体。
术语“重组抗体”是指在包含编码抗体的核苷酸序列的细胞或细胞系中表达的抗体，其中所述核苷酸序列在天然中与细胞不相关。
本发明的二价双特异性嵌合抗体为分离的抗体。
用于描述本说明书的各种抗体的术语“分离的”是指已从其中表达抗体的细胞或细胞培养物中鉴定和分离和/或再生的抗体。来自自然环境的杂质(污染物成分)为一般地干扰多肽的诊断或治疗用途，并且可包括酶、激素和其他蛋白或非蛋白溶质的物质。分离的多肽一般地通过至少一个纯化步骤制备。
在一方面，本发明涉及一种二价双特异性嵌合抗体，其中所述抗体包含：
a)特异性地结合于第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链；
其中第一轻链包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域；
其中第一重链包含抗体的重链可变结构域和包括第一(CH1)重链恒定结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体的重链恒定结构域；
b)特异性地结合于第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，
其中第二轻链包含轻链可变结构域和选自以下的恒定结构域：
MHC(主要组织相容性复合体)的第一膜近端结构域或
MHC样蛋白的第一膜近端结构域；
其中第二重链包含重链可变结构域、选自以下的恒定结构域：
MHC(主要组织相容性复合体)的第二膜近端结构域或
MHC样蛋白的第二膜近端结构域；
和包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体；
其中MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC或MHC样蛋白的第二膜近端结构域在其间形成通过二硫键稳定的异源二聚体；
其中一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域以其表面彼此接触，经修饰形成二价双特异性嵌合抗体，所述重链CH3结构域中的修饰为促进异源二聚化的取代。
通过MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC或MHC样蛋白的第二膜近端结构域形成并通过二硫键稳定的异源二聚体意指：
1)包括MHC或MHC样蛋白的第一和/或第二膜近端结构域中的一个或多个突变，以在MHC或MHC样蛋白的第一和第二膜近端结构域之间形成S-S键(二硫键、半胱氨酸桥)的异源二聚体；
或
2)MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域在C-末端延伸一个或多个(1-10个)氨基酸，并在C-末端具有末端Cys以在MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和铰链之间形成S-S键(二硫键、半胱氨酸桥)的延伸。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括在其间形成异源二聚体的MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC或MHC样蛋白的第二膜近端结构域，所述异源二聚体借助于MHC或MHC样蛋白的第一和/或第二膜近端结构域中的一个或多个突变以在MHC或MHC样蛋白的第一和第二膜近端结构域之间形成S-S键(二硫半胱氨酸桥)，而通过二硫键稳定。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括在其间形成异源二聚体的MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC或MHC样蛋白的第二膜近端结构域，所述异源二聚体借助于将MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域在C-末端延伸一个或多个(1-10个)氨基酸并在C-末端具有末端Cys以在MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和铰链之间形成S-S键(二硫键、半胱氨酸桥)的延伸，而通过二硫键稳定。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域的延伸，该延伸为3个氨基酸GSC的序列。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
包含轻链可变结构域(VL1)和轻链恒定结构域的第一轻链；
第一重链，其包含抗体的重链可变结构域(VH1)和包括第一(CH1)重链恒定结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体的重链恒定结构域；
包含轻链可变结构域(VL2)和MHC的第一膜近端结构域或MHC样蛋白的第一膜近端结构域的第二轻链；
第二重链，其包含重链可变结构域(VH2)、MHC的第二膜近端结构域或MHC样蛋白的第二膜近端结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体；
其中MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC或MHC样蛋白的第二膜近端结构域在其间形成异源二聚体，其借助于MHC或MHC样蛋白的第一和/或第二膜近端结构域中的一个或多个突变以在MHC或MHC样蛋白的第一和第二膜近端结构域之间形成S-S键(二硫半胱氨酸桥)，而通过二硫键稳定；
其中在第一Fc变体和第二Fc变体之间于CH3结构域中形成旋钮入孔结构。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
包含轻链可变结构域(VL1)和轻链恒定结构域的第一轻链；
第一重链，其包含抗体的重链可变结构域(VH1)和包括第一(CH1)重链恒定结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体的重链恒定结构域；
包含轻链可变结构域(VL2)和MHC的第一膜近端结构域或MHC样蛋白的第一膜近端结构域的第二轻链；
第二重链，其包含重链可变结构域(VH2)、MHC的第二膜近端结构域或MHC样蛋白的第二膜近端结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体；
其中在第一Fc变体和第二Fc变体之间于CH3结构域中形成旋钮入孔结构，
其中MHC的第一膜近端结构域或MHC样蛋白的第一膜近端结构域进一步包含MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域在C-末端延伸一个或多个(1-10个)氨基酸，并在C-末端具有末端Cys的延伸，以在MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和铰链之间形成S-S键(二硫键、半胱氨酸桥)。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
包含轻链可变结构域(VL1)和轻链恒定结构域的第一轻链；
第一重链，其包含抗体的重链可变结构域(VH1)和包括第一(CH1)重链恒定结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体的重链恒定结构域；
包含轻链可变结构域(VL2)和MHC的第一膜近端结构域或MHC样蛋白的第一膜近端结构域的第二轻链；
第二重链，其包含重链可变结构域(VH2)、MHC的第二膜近端结构域或MHC样蛋白的第二膜近端结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体；
其中在第一Fc变体和第二Fc变体之间于CH3结构域中形成旋钮入孔结构，
其中MHC的第一膜近端结构域或MHC样蛋白的第一膜近端结构域进一步包含MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域通过GSC的延伸，以在MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和铰链之间形成S-S键(二硫键、半胱氨酸桥)。
在以上二价双特异性嵌合抗体中，可变和恒定结构域按以下顺序排列于重链和轻链中：
第一轻链：
1)轻链可变结构域，
2)轻链恒定结构域；
抗体的第一重链：
1)重链可变结构域，
2)第一(CH1)重链恒定结构域，
3)第二(CH2)重链恒定结构域和
4)第三(CH3)重链恒定结构域；
第二轻链：
1)轻链可变结构域，
2)MHC的第一膜近端结构域或MHC样蛋白的第一膜近端结构域；
抗体的第二重链：
1)重链可变结构域，
2)MHC的第二膜近端结构域或MHC样蛋白的第二膜近端结构域，
3)第二(CH2)重链恒定结构域和
4)第三(CH3)重链恒定结构域。
图1显示以上二价双特异性嵌合抗体格式的少数变体。
如本说明书使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”(Ig)包括全抗体。术语“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链或抗原结合部分的糖蛋白。每条重链包含重链可变区(本说明书中缩写为VH)和重链恒定区。已知5种类型的哺乳动物抗体重链，其用以下希腊字母表示：α、δ、ε、γ和μ。(Janeway C.A.,Jr.等人,Immunobiology,5th ed.,由Garland Publishing出版,2001)。存在的重链类型定义抗体的类别；这些链分别存在于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体中。(Rhoades R.A.,Pflanzer R.G.,HumanPhysiology,4th ed.,由Thomson Learning,出版2002)。不同重链的大小和组成不同；α和γ含有约450个氨基酸，而μ和ε具有约550个氨基酸。恒定区在同一同种型的所有抗体中相同，但在不同同种型的抗体中不同。重链γ、α和δ具有由3个恒定结构域CH1、СΗ2和CH3组成的恒定区(在一条线上)和用于增加柔性的铰链区(Woof J.,Burton D.,Nat RevImmunol 4,2004,cc.89-99)；重链μ和ε具有由4个恒定结构域CH1、СΗ2、CH3和CH4组成的恒定区(Janeway C.A.,Jr.等人,Immunobiology,5th ed.,由Garland Publishing出版,2001)。在哺乳动物中，已知仅有两种类型的轻链，由λ和κ表示。每条轻链由轻链可变区(在本说明书中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链的近似长度为211-217个氨基酸。优选地，轻链为kappa(κ)轻链，和恒定结构域CL优选地为C-kappa(κ)。
本发明的“抗体”可具有任何类别(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，优选地为IgG)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，优选地为IgG1)。
VL和VH区可进一步细分成位于更为保守的称为框架区(FR)的区域之间的称为互补决定区(CDR)的高变区。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的3个CDR和4个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
如本说明书使用的术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简称为“抗体部分”或“抗体片段”)是指保留与抗原特异性结合能力的抗体的一个或多个片段。结合到术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的实例包括Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，或Fab样片段，即由VL和VH结构域、MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC或MHC样蛋白的第二膜近端结构域组成的单价片段。
优选地，本发明抗体的抗原结合部分的CDR或整个抗原结合部分源于小鼠、羊驼属或人类供体文库，或基本上具有人类起源的，具有某些改变的氨基酸残基，例如用不同氨基酸残基取代，以便优化抗体的特定特性，例如KD、koff、IC50、EC50、ED50。优选地，本发明抗体的框架区具有人类起源或基本上为人类起源的(至少80、85、90、95、96、97、98或99％的人类起源)。
在其他实施方案中，本发明的抗原结合部分可源于其他非人类物种，包括但不限于小鼠、羊驼属、兔、大鼠或仓鼠。或者，抗原结合区可源于人类物种。
术语“可变”是指在抗体之间可变结构域某些部分的序列大大地不同这一事实。V结构域介导抗原结合并决定每种特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性并不是均匀地分布在110个氨基酸跨度的可变结构域上。相反，V区由称为框架区(FR)的15-30个氨基酸的被称为“高变区”或CDR的较短极其可变区域隔开的不变片段组成。天然重链和轻链的可变结构域各自包含4个FR，其主要采用β-折叠构型，通过3个高变区连接，所述高变区形成连接β-折叠结构，并且在一些情况下形成其一部分的环。每条链上的高变区通过FR紧密地保持在一起，并与另一条链上的高变区一起，助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest.5thEd.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，比如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
本说明书的术语“高变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区一般地包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基和/或来自“高变环”的那些残基。
如本申请中使用的“Kabat编号方案”或“根据Kabat编号”是指用于在抗体的重链和轻链可变区中对比其他氨基酸残基更加可变(即高变)的氨基酸残基进行编号的系统(Kabat等人Ann.N.Y.Acad.Sci.,190:382-93(1971)；Kabat等人Sequences ofProteins ofImmunological Interest,第五版,U.S.Department ofHealth and Human Services,NIH公布号91-3242(1991))。
本发明“结合”靶抗原的抗体是指以下抗体，其以足够的亲和力结合抗原，使得抗体可用作靶向表达该抗原的细胞或组织或蛋白的诊断和/或治疗剂，并与其他蛋白轻微交叉反应。根据分析方法：荧光激活细胞分选(FACS)、放射免疫测定(RIA)或ELISA，在这种实施方案中，抗体与非靶蛋白的结合程度小于抗体与特异性靶蛋白结合的10％。关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性地结合于”特定多肽或特定靶多肽上的表位或对其“特异性”意指与非特异性相互作用显著(可测量程度地)不同的结合。
可例如通过与对照分子的结合相比较确定分子的结合来测量特异性结合。例如，特异性结合可通过与另一个类似于靶标的分子，例如过量的非标记靶标竞争来确定。在这种情况下，如果标记靶标与探针的结合受到过量的未标记靶标竞争性地抑制，则表明特异性结合。如本说明书中使用的术语“特异性结合”或短语“特异性地结合于”特定多肽或特定靶多肽上的表位或对其“特异性”可通过对靶标具有至少约200nM、或至少约150nM、或至少约100nM、或至少约60nM、或至少约50nM、或至少约40nM、或至少约30nM、或至少约20nM、或至少约10nM、或至少约8nM、或至少约6nM、或至少约4nM、或至少约2nM、或至少约1nM或更大的Kd的分子的实例来描述。在一个实施方案中，术语“特异性结合”是指其中分子与特定多肽或特定多肽上的表位结合而基本上不与任何其他多肽或多肽上的表位结合的结合。
术语“双特异性抗体”是指具有能够特异性结合于单个生物分子上的两个不同表位或能够特异性结合于两个不同生物分子上的表位的抗原结合结构域的抗体。双特异性抗体在本文中也称为具有“双重特异性”或为“双重特异性”抗体。
免疫球蛋白的可结晶片段区(“Fc区、Fc”)为与细胞表面Fc受体以及补体系统的一些蛋白相互作用的免疫球蛋白分子的“尾部”区域。这种特性允许抗体激活免疫系统。在IgG、IgA和IgD同种型中，Fc区由两个分别来自两条重链的第二和第三恒定结构域的相同蛋白片段组成；在IgM和IgE同种型中，Fc在每条多肽链中含有3个重链恒定结构域(CH2、CH3和CH4结构域)。
“Fc片段单体”应理解为意指来自两条重链(对于IgG、IgA和IgD同种型)中任一条的第二和第三恒定结构域的Fc区；对于IgM和IgE同种型，Fc单体包含两条重链之一的3个恒定结构域(CH2、CH3和CH4结构域)。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
包含轻链可变结构域(VL1)和轻链恒定结构域的第一轻链；
第一重链，其包含抗体的重链可变结构域(VH1)和包括第一(CH1)重链恒定结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体的重链恒定结构域；
包含轻链可变结构域(VL2)和MHC的第一膜近端结构域或MHC样蛋白的第一膜近端结构域的第二轻链；
第二重链，其包含重链可变结构域(VH2)、MHC的第二膜近端结构域或MHC样蛋白的第二膜近端结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体；
并且其中在第一Fc变体和第二Fc变体之间于CH3结构域中形成旋钮入孔结构，
并且在MHC的第二膜近端结构域和/或MHC样蛋白的第二膜近端结构域和铰链之间插入另一个肽接头。
如本文使用的术语“肽接头”旨在意指任何具有组合结构域能力的肽，其长度取决于其结合于彼此的结构域，并包含任何氨基酸序列。优选地，肽接头长度为4个氨基酸或更多，并由选自G、A、S、P、E、T、D、K的任何一组氨基酸组成。
MHC(主要组织相容性复合体)是指一种主要组织相容性复合体分子，其为存在于所有有核细胞表面的脊椎动物免疫系统的中心组分。MHC存在两种主要形式，特别为MHC I类和II类。
MHC样蛋白是指与MHC I类分子或MHC II类分子的胞外部分具有结构相似性的蛋白。特别是，MHC样蛋白意指例如CD1(分化簇1)蛋白或HFE(遗传性血色素沉着蛋白)蛋白。
MHC I、II、CD1和HFE分子之间的一般结构相似性为明显的。这包括整个分子空间组织的均匀性、结构域的数量(4个)、MHC和MHC样蛋白膜近端结构域的结构相似性以及抗原结合位点、相似的分子量。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含MHC的第一膜近端结构域，其可选自：
MHC I类(主要组织相容性复合体I类)的第一膜近端结构域，
MHC II类(主要组织相容性复合体II类)的第一膜近端结构域，
MHC I类第一膜近端结构域的修饰变体或
MHC II类第一膜近端结构域的修饰变体。
在人类中，经典的MHC I基因称为HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F或HLA-G。I类分子由两条多肽链组成：多态性α链(有时称为重链)和称为β2微球蛋白链的较小链(也称为轻链)，后者通常不具有多态性。这两条链在细胞表面形成非共价异源二聚体。α-链含有3个结构域(α1、α2和α3)。α-链基因的外显子1编码前导序列，外显子2和3编码α1和α2结构域，外显子4编码α3结构域，外显子5编码跨膜结构域，和外显子6和7编码胞质尾部。α链形成包含α1和α2结构域的肽结合区。
α2结构域之后为位于MHC I的α链胞外部分C-末端的α3结构域，并与β2微球蛋白一起形成异源二聚体非共价复合体。所述异源二聚体非共价复合体由MHC I的α3结构域和β2微球蛋白组成，在本发明的说明书中称为基于MHC I膜近端结构域的异源二聚体。
MHC I类分子在所有有核细胞上表达，所述细胞包括肿瘤细胞。它们具体地讲特别是在T和B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞上表达，并用于将CD8+表面的肽片段(一般地长度为8-10个氨基酸)呈递给细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
在人类中，经典的MHC II基因称为HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ或HLA-DR。MHCII类分子为由非共价连接的α和β链组成的异源二聚体。每条链的胞外部分由两个结构域(分别为α1(alpha1)、α2(alpha2)和β1(beta1)、β2(beta2))组成，并通过具有跨膜链段的短肽(约30个氨基酸残基长)连接。跨膜链段之后为含有约10-15个残基的胞质结构域。
除MHC II类分子的抗原结合沟槽不是由单个α链的两个结构域形成而是由不同链的两个结构域(α1和β1结构域)形成之外，类似于I类分子，MHC II类分子的抗原结合区由相互作用链的α螺旋节段形成。
α1结构域之后为α2结构域，其与β2结构域形成异源二聚体非共价复合体。所述异源二聚体非共价复合体由MHC II的α2结构域和MHC II的β2结构域组成，在本发明的说明书中称为基于MHC II的膜近端结构域的异源二聚体。
在MHC II类分子的结构中，抗原结合沟槽比MHC I类分子的更开放，并因此可接受更长的肽。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含MHC的第二膜近端结构域，其可选自：
MHC I类(主要组织相容性复合体I类)的第二膜近端结构域，
MHC II类(主要组织相容性复合体II类)的第二膜近端结构域，
MHC I类第二膜近端结构域的修饰变体或
MHC II类第二膜近端结构域的修饰变体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含人类MHC I类的膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含人类MHC II类的膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含MHC的第一膜近端结构域，其可选自：
MHC I类(主要组织相容性复合体I类)的第一膜近端结构域，
MHC II类(主要组织相容性复合体II类)的第一膜近端结构域，
MHC I类第一膜近端结构域的修饰变体或
MHC II类第一膜近端结构域的修饰变体，
和
MHC的第二膜近端结构域，其可选自：
MHC I类(主要组织相容性复合体I类)的第二膜近端结构域，
MHC II类(主要组织相容性复合体II类)的第二膜近端结构域，
MHC I类第二膜近端结构域的修饰变体或
MHC II类第二膜近端结构域的修饰变体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
作为MHC I类(主要组织相容性复合体I类)第一膜近端结构域的MHC第一膜近端结构域，
和
作为MHC I类(主要组织相容性复合体I类)第二膜近端结构域的MHC第二膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
作为MHC II类(主要组织相容性复合体II类)第一膜近端结构域的MHC第一膜近端结构域，
和
作为MHC II类(主要组织相容性复合体II类)第二膜近端结构域的MHC第二膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
作为MHC I类第一膜近端结构域修饰变体的MHC第一膜近端结构域，
和
作为MHC I类第二膜近端结构域修饰变体的MHC第二膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
作为MHC II类第一膜近端结构域修饰变体的MHC第一膜近端结构域，
和
作为MHC II类第二膜近端结构域修饰变体的MHC第二膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
作为MHC I类(主要组织相容性复合体I类)第一膜近端结构域的MHC第一膜近端结构域，
和
作为MHC I类第二膜近端结构域修饰变体的MHC第二膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
作为MHC I类第一膜近端结构域修饰变体的MHC第一膜近端结构域，
和
作为MHC I类(主要组织相容性复合体I类)第二膜近端结构域的MHC第二膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
作为MHC II类(主要组织相容性复合体II类)第一膜近端结构域的MHC第一膜近端结构域，
和
作为MHC II类第二膜近端结构域修饰变体的MHC第二膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
作为MHC II类第一膜近端结构域修饰变体的MHC第一膜近端结构域，
和
作为MHC II类(主要组织相容性复合体II类)第二膜近端结构域的MHC第二膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含MHC II类的膜近端结构域，所述MHC II类选自：HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ或HLA-DR。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含MHC I类的膜近端结构域，所述MHC I类选自：HLA-A、HLA-B、HLA-С、HLA-E、HLA-F或HLA-G。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含人类MHC样蛋白的膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含MHC样蛋白的第一膜近端结构域，其可选自：
CD1(分化簇1)的第一膜近端结构域，
HFE(血色素沉着蛋白)的第一膜近端结构域，
CD1第一膜近端结构域的修饰变体或
HFE第一膜近端结构域的修饰变体。
CD1(分化簇1)是指作为位于各种抗原呈递细胞比如树突状细胞、巨噬细胞和其他细胞表面上的免疫系统的组分的分化1分子簇。以与MHC I、II类相同的方式，CD1呈递抗原以通过与T细胞受体的相互作用而被T细胞识别。与MHC I、II类不同，CD1蛋白呈递脂质及其衍生物而不是肽。
在人类中发现的多种CD1变体分成5组：CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e，其抗原结合片段的结构不同，并且因此对不同结构的脂质具有特异性。与其他组蛋白不同，CD1e组蛋白不在细胞表面表达，而是可溶性的并且负责脂质转运(Kaczmarek,R.,Pasciak,M.,Szymczak-Kulus,K.,&Czerwinski,M.(2017).CD1:A Singed Cat ofthe Three AntigenPresentation Systems.Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis,65(3),201-214)。
CD1分子的结构类似于MHC I类。以类似的方式，一个CD1分子为由两条多肽链组成的非共价复合体：多态性α链(有时称为重链)和称为β2微球蛋白的较小链(也称为轻链)，后者通常不具有多态性。
α链形成包含α1和α2结构域的抗原结合区。α2结构域之后为位于CD1的α链胞外部分C-末端的α3结构域，并与β2微球蛋白一起形成异源二聚体非共价复合体。所述异源二聚体非共价复合体由CD1的α3结构域和β2微球蛋白组成，在本发明的说明书中称为基于MHC样蛋白膜近端结构域的异源二聚体。
HFE(遗传性血色素沉着蛋白)是指一种血色素沉着蛋白分子。人类HFE基因基因座位于染色体6上，并由5个外显子和4个内含子组成。血色素沉着蛋白为一种与β2微球蛋白相关的膜蛋白，负责经调节转铁蛋白-转铁蛋白受体相互作用来调节铁吸收。HFE基因中的突变导致血色素沉着病，这是一种与铁在各个器官中的累积相关的铁代谢相关隐性病理学。HFE分子的结构与MHC I相同。一个HFE分子为由两条多肽链组成的非共价复合体：多态性α链(有时称为重链)和称为β2微球蛋白的较小链(也称为轻链)，后者通常不具有多态性。
α链包括α1、α2和α3结构域。α3结构域在α2结构域之后，并且位于HFE的α链胞外部分的C-末端且与β2微球蛋白一起形成异源二聚体非共价复合体。所述异源二聚体非共价复合体由HFE的α3结构域和β2微球蛋白组成，在本发明的说明书中称为基于MHC样蛋白膜近端结构域的异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含MHC样蛋白的第二膜近端结构域，其可选自：
CD1(分化簇1)的第二膜近端结构域，
HFE(血色素沉着蛋白)的第二膜近端结构域，
CD1第二膜近端结构域的修饰变体或
HFE第二膜近端结构域的修饰变体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
MHC样蛋白的第一膜近端结构域，其可选自：
CD1(分化簇1)的第一膜近端结构域，
HFE(血色素沉着蛋白)的第一膜近端结构域，
CD1第一膜近端结构域的修饰变体或
HFE第一膜近端结构域的修饰变体，
和
MHC样蛋白的第二膜近端结构域，其可选自：
CD1(分化簇1)的第二膜近端结构域，
HFE(血色素沉着蛋白)的第二膜近端结构域，
CD1第二膜近端结构域的修饰变体或
HFE第二膜近端结构域的修饰变体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
作为CD1第一膜近端结构域的MHC样蛋白第一膜近端结构域，和
作为CD1第二膜近端结构域的MHC样蛋白第二膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
作为HFE第一膜近端结构域的MHC样蛋白第一膜近端结构域，和
作为HFE第二膜近端结构域的MHC样蛋白第二膜近端结构域，
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
作为CD1第一膜近端结构域修饰变体的MHC样蛋白第一膜近端结构域，
和
作为CD1第二膜近端结构域修饰变体的MHC样蛋白第二膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
作为HFE第一膜近端结构域修饰变体的MHC样蛋白第一膜近端结构域，
和
作为HFE第二膜近端结构域修饰变体的MHC样蛋白第二膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
作为CD1第一膜近端结构域的MHC样蛋白第一膜近端结构域，和
作为CD1第二膜近端结构域修饰变体的MHC样蛋白第二膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
作为CD1第一膜近端结构域修饰变体的MHC样蛋白第一膜近端结构域，
和
作为CD1第二膜近端结构域的MHC样蛋白第二膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
作为HFE第一膜近端结构域的MHC样蛋白第一膜近端结构域，和
作为HFE第二膜近端结构域修饰变体的MHC样蛋白第二膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
作为HFE第一膜近端结构域修饰变体的MHC样蛋白第一膜近端结构域，
和
作为HFE第二膜近端结构域的MHC样蛋白第二膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含CD1的膜近端结构域，所述CD1选自：CD1a,CD1b、CD1c、CD1d或CD1e。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括：第二轻链(VL)的可变片段，其通过1-25个氨基酸长的接头与MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域分离；和/或第二重链(VH)的可变片段，其通过1-25个氨基酸长的接头与MHC或MHC样蛋白的第二膜近端结构域分离。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含：
a)一条重链的CH3结构域，其经修饰使得在接触二价双特异性抗体中另一条重链CH3结构域的表面的一条重链CH3结构域的表面上，氨基酸残基由具有更大侧链体积的氨基酸残基取代，导致在一条重链CH3结构域的表面形成旋钮，其可放入到另一条重链CH3结构域表面的孔中，
和
b)另一条重链的CH3结构域，其经修饰使得在接触二价双特异性抗体中第一重链CH3结构域的表面的第二重链CH3结构域的表面上，氨基酸残基由具有更小侧链体积的氨基酸残基取代，导致在第二重链CH3结构域的表面形成孔，其可接受第一重链CH3结构域界面的旋钮；
其中所述具有更大侧链体积的氨基酸残基选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)，
和其中所述具有更小侧链体积的氨基酸残基选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含抗体第一轻链的恒定结构域，其选自CK或CL。
在哺乳动物中，已知仅有两种类型的轻链，表示为lambda(λ)和kappa(κ)。λ轻链的恒定结构域指定为CL，而κ轻链的恒定结构域指定为CK。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含抗体的CH3结构域，其通过将半胱氨酸(C)作为氨基酸引入到每个CH3结构域的相应位置使得可在两个CH3结构域之间形成二硫桥而进一步修饰。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性抗体包含一条重链的CH3结构域(其被修饰以形成旋钮)和另一条重链的CH3结构域(其被修饰以形成孔)，或反之亦然。
“旋钮入孔”(“旋钮入孔”类型的相互作用)为一种使得能够规避与错配副产物相关的问题的方法。这种方法旨在通过向CH3结构域中引入突变来修饰接触界面而迫使两个不同的抗体重链配对。在一条链上，将大体积氨基酸替换为具有短侧链的氨基酸以创建“孔”。相反，将具有大侧链的氨基酸引入到另一个CH3结构域中以创建“旋钮”。这两条重链的共表达相对于同源二聚体形成(“孔-孔”或“旋钮-旋钮”)产生高产率的异源二聚体形成(“旋钮-孔”)(WO9627011和WO9850431,以及Merchant AM等人An efficient route tohuman bispecific IgG,Nat Biotechnol.1998Jul；16(7):677-81)。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含一条重链的CH3结构域(其具有氨基酸取代S354C/T366W)和另一条重链的CH3结构域(其具有氨基酸取代Y349C/T366S/L368A/Y407V)。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括一条重链的CH3结构域(其具有氨基酸取代Y349C/T366S/L368A/Y407)和另一条重链的CH3结构域(其具有氨基酸取代S354C/T366W)。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域，其分别为MHC I的α2结构域和MHC II的β2结构域，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域，其分别为MHC II的β2结构域和MHC II的α2结构域，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含具有选自SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38的氨基酸序列的MHC II的α2结构域和具有选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ IDNO:39的氨基酸序列的MHC II的β2结构域。
SEQ ID NO:30为MHC II类HLA-DM(HLA-DMA*01:01:01:01)的α2膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:31为MHC II类HLA-DM(HLA-DMB*01:01:01:01)的β2膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:32为MHC II类HLA-DO(HLA-DOA*01:01:01)的α2膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:33为MHC II类HLA-DO(HLA-DOB*01:01:01:01)的β2膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:34为MHC II类HLA-DP(HLA-DPA1*01:03:01:01)的α2膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:35为MHC II类HLA-DP(HLA-DPB1*01:01:01:01)的β2膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:36为MHC II类HLA-DQ(HLA-DQA1*01:01:01:01)的α2膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:37为MHC II类HLA-DQ(HLA-DQB1*05:01:01:01)的β2膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:38为MHC II类HLA-DR(HLA-DRA*01:01:01:01)的α2膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:39为MHC类HLA-DR(HLA-DRB1*01:01:01:01)的β2膜近端结构域氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域，其分别为MHC II的α2结构域修饰变体和MHC II的β2结构域修饰变体，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域，其分别为MHC II的β2结构域修饰变体和MHC II的α2结构域修饰变体，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域，其分别为MHC I的α3结构域和β2微球蛋白(β2Μ)，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域，其分别为β2微球蛋白(β2Μ)和MHC I的α3结构域，并且在其间形成异源二聚体。
β2微球蛋白为12kDa的非糖基化蛋白；其功能之一为稳定MHC I类的α链以及CD1和HFE蛋白。以上蛋白中的人类β2微球蛋白具有几乎相同的结构，并且因此，在本发明的说明书中，提及人类β2微球蛋白而没有指明其作为它的一部分的蛋白。
与α链不同，β2微球蛋白不通过膜。人类β2微球蛋白的基因座位于15号染色体上。β2微球蛋白基因由4个外显子和3个内含子组成。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含具有选自SEQ ID NO:1-29的氨基酸序列的MHC I的α3结构域和具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的β2微球蛋白(β2Μ)。
SEQ ID NO:1为MHC I类HLA-A(等位基因A*01:01:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:2为MHC I类HLA-A(A*02:01:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:3为MHC I类HLA-A(A*03:01:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:4为MHC I类HLA-A(A*11:01:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:5为MHC I类HLA-A(A*23:01:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:6为MHC I类HLA-B(B*07:02:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:7为MHC I类HLA-B(B*08:01:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:8为MHC I类HLA-B(B*13:01:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:9为MHC I类HLA-B(B*14:01:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:10为MHC I类HLA-B(B*15:01:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:11为MHC I类HLA-C(C*01:02:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:12为MHC I类HLA-C(C*03:02:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:13为MHC I类HLA-C(C*04:01:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:14为MHC I类HLA-C(C*05:01:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:15为MHC I类HLA-C(C*06:02:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:16为MHC I类HLA-E(E*01:01:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:17为MHC I类HLA-E(E*01:03:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:18为MHC I类HLA-E(E*01:05)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:19为MHC I类HLA-E(E*01:06)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:20为MHC I类HLA-E(E*01:09)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:21为MHC I类HLA-F(F*01:01:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:22为MHC I类HLA-F(F*01:02)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:23为MHC I类HLA-F(F*01:03:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:24为MHC I类HLA-F(F*01:04:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:25为MHC I类HLA-F(F*01:05)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:26为MHC I类HLA-G(G*01:01:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:27为MHC I类HLA-G(G*01:03:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:28为MHC I类HLA-G(G*01:04:01:01)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:29为MHC I类HLA-G(G*01:06)的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:46为MHC I类或MHC样蛋白(CD1,HFE)的通用β2微球蛋白(β2Μ)的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域，其分别为MHC I的α3结构域修饰变体和β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域，其分别为β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体和MHC I的α3结构域修饰变体，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含具有选自SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48的氨基酸序列的β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体。
SEQ ID NO:47为具有突变R12C(SS桥在单元内部)的MHC I类或MHC样蛋白(CD1,HFE)的通用β2微球蛋白(β2Μ)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:48为具有突变R12C(SS桥在单元内部)的MHC I类或MHC样蛋白(CD1,HFE)的通用β2微球蛋白(β2Μ)+具有突变C220A(SS桥已从单元的C-末端移除并转移至单元内部)的铰链的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域，其分别为CD1的α3结构域和β2微球蛋白(β2Μ)，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域，其分别为β2微球蛋白(β2Μ)和CD1的α3结构域，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含具有选自SEQ ID NO:40-44的氨基酸序列的CD1α3结构域和具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的β2微球蛋白(β2Μ)。
SEQ ID NO:40为CD1a的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:41为CD1b的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:42为CD1c的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:43为CD1d的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:44为CD1e的α3膜近端结构域氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域，其分别为CD1的α3结构域修饰变体和β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域，其分别为β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体和CD1的α3结构域修饰变体，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含具有选自SEQ ID NO:49-56或SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CD1的α3结构域修饰变体和具有选自SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48的氨基酸序列的β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体。
SEQ ID NO:49为具有突变N57C(另外的SS桥在单元内部)和在C末端通过3个氨基酸GSC的延伸的CD1b的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:50为具有突变N57C(SS桥在单元内部)和在C末端通过2个氨基酸GS的延伸(SS桥已从单元的C末端移除并转移至单元内部)的CD1b的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:51为具有突变N59A(在预期的N-糖基化位点处的取代)和在C末端通过3个氨基酸GSC的延伸的CD1b的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:52为具有突变N59D(在预期的N-糖基化位点处的取代)和在C末端通过3个氨基酸GSC的延伸的CD1b的α3膜近端结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:53为具有突变N57C、N59A和在C末端通过3个氨基酸GSC的延伸的CD1b的α3膜近端结构域氨基酸序列(另外的SS桥在单元内部+预期的N-糖基化位点已被移除)。
SEQ ID NO:54为具有突变N57C、N59D和在C末端通过3个氨基酸GSC的延伸的CD1b的α3膜近端结构域氨基酸序列(另外的SS桥在单元内部+预期的N-糖基化位点已被移除)。
SEQ ID NO:55为具有突变N57C、N59A和在C末端通过2个氨基酸GS的延伸的CD1b的α3膜近端结构域氨基酸序列(SS桥已转移至单元内部+预期的N-糖基化位点已被移除)。
SEQ ID NO:56为具有突变N57C、N59D和在C末端通过2个氨基酸GS的延伸的CD1b的α3膜近端结构域氨基酸序列(SS桥已转移至单元内部+预期的N-糖基化位点已被移除)。
SEQ ID NO:109为具有在C末端通过3个氨基酸GSC的延伸的CD1b的α3膜近端结构域氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域，其分别为HFE的α3结构域和β2微球蛋白(β2Μ)，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域，其分别为β2微球蛋白(β2Μ)和HFE的α3结构域，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HFE的α3结构域和具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的β2微球蛋白(β2Μ)。
SEQ ID NO:45为HFE的α3膜近端结构域氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域，其分别为HFE的α3结构域修饰变体和β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域，其分别为β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体和HFE的α3结构域修饰变体，并且在其间形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含具有选自SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48的氨基酸序列的β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体。
已知MHC、CD1和HFE的多于1000种表征结构。任何一种以上结构均可用于本发明的双特异性抗体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含MHC或MHC样蛋白的修饰变体，其中修饰变体是指包含半胱氨酸(C)取代以在由MHC或MHC样蛋白的第一和第二膜近端结构域产生的异源二聚体链之间形成二硫桥的变体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含MHC或MHC样蛋白的修饰变体，其中修饰变体是指在MHC或MHC样蛋白膜近端结构域的多个位置包括一个或多个取代，导致热力学稳定性Tm分别与野生型MHC或MHC样蛋白的膜近端结构域相比较提高多于1摄氏度的变体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含MHC或MHC样蛋白的修饰变体，其中修饰变体是指在MHC或MHC样蛋白膜近端结构域的多个位置包括一个或多个取代，导致聚集体的量分别与野生型MHC或MHC样蛋白的膜近端结构域相比较在高于10mg/ml的浓度下减少多于5％的变体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含MHC或MHC样蛋白的修饰变体，其中修饰变体是指在MHC或MHC样蛋白膜近端结构域的多个位置包括一个或多个取代，导致分别与野生型MHC或MHC样蛋白的膜近端结构域相比较去除糖基化位点的变体。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含相同的第一轻链可变结构域和第二轻链可变结构域。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含属于IgG的Fc片段。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包含选自人类IgG1、IgG2或IgG4的Fc片段。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括Fc片段单体，其中进一步引入取代，导致二价双特异性抗体缺少ADCC、CDC和/或ADCP特性。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括Fc片段单体，其中进一步引入LALA取代(L234A和L235A)。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括Fc片段单体，其中进一步引入取代，导致抗体的作用延长。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括Fc片段单体，其中进一步引入YTE取代(M252Y、S254T和Τ256Ε)。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括Fc片段单体，其中进一步引入取代，导致二价双特异性抗体的ADCC、CDC和/或ADCP特性增强。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体包括Fc片段单体，其中进一步引入取代E345R。
以上Fc片段中的突变根据抗体氨基酸链的EU编号进行编号(Edelman,G.M.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1969),pp.78-85；Kabat,E.A.,等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,5thed.,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,(1991)。
Fc片段中的突变理解为意指本申请中描述的抗体氨基酸序列的修饰。抗体的氨基酸序列变体通过向抗体核酸中引入适当的核苷酸变化或通过肽合成来制备。这种修饰包括例如抗体氨基酸序列中残基的缺失和/或插入和/或取代。只要最终构建体具有期望的特征，就可进行缺失、插入和取代的任何组合，以获得最终构建体。
使用氨基酸取代的抗体氨基酸序列的修饰变体为抗体分子中的至少一个氨基酸残基用另一个残基取代。
保守取代在表A中“优选取代”下显示。
术语抗体“效应子功能”是指可归属于抗体的Fc区(天然Fc区序列或Fc区氨基酸变体)的生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：Clq结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体，BCR)下调和B细胞激活。
“抗体依赖性细胞的细胞毒性”或“ADCC”是指一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，随后引起靶细胞的裂解或吞噬。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRJII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达概述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464页表3中。为评价感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定比如在美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的体外ADCC测定。用于这种测定的有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。备选地或者另外地，可例如以比如公开于Clynes等人PNAS(USA)95:652-656(1998)中的动物模型体内评价感兴趣分子的ADCC活性。
“人类效应细胞”为表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。优选地，细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人类白细胞的实例包括外周血单个核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和中性粒细胞；其中PBMC和NK细胞为优选。效应细胞可从其天然来源，例如从如本文描述的血液或PBMC中分离。
“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”是指分子在存在补体的情况下裂解靶标的能力。补体激活途径通过补体系统的第一组分(C1q)同与同源抗原复合的分子(例如抗体)的结合而启动。为评价补体激活，CDC测定，例如如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods202:163(1996)中描述的。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体特异性地结合于CD20和CD3。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体特异性地结合于BCMA和CD3。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体特异性地结合于PD-L1和CD47。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体特异性地结合于凝血因子9(FIX)和凝血因子10(FX)。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体特异性地结合于GD2和CD3。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体特异性地结合于AXL和CD3。
在本发明的一些实施方案中，二价双特异性嵌合抗体特异性地结合于PD-L1和TGFβ。
本申请材料提供以下抗体和抗体样分子：01-001、01-002、01-003、01-004、01-005、01-006、01-007、01-008、01-009、01-010、01-011、01-012、02-004、02-005、02-006、02-007、02-008、02-009、03-001、03-002、03-003、03-004、03-005、03-006、03-007、03-008。
01-001为包括基于VH和CH1的重链以及基于VL和CD1b的轻链的模型单特异性抗体样分子，其中VH为具有SEQ ID NO:103的抗体帕洛利单抗的重链可变结构域的氨基酸序列(帕洛利单抗_VH)，VL为具有SEQ ID NO:104的抗体帕洛利单抗的轻链可变结构域的氨基酸序列(帕洛利单抗_VL)，和CD1b为具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CD1b的α3结构域。
01-002为包括基于VH和b2M的重链和基于VL和CK的轻链的模型单特异性抗体样分子，其中VH为具有SEQ ID NO:103的抗体帕洛利单抗的重链可变结构域的氨基酸序列(帕洛利单抗_VH)，b2M为具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的β2微球蛋白，和VL为具有SEQ ID NO:104的抗体帕洛利单抗的轻链可变结构域的氨基酸序列(帕洛利单抗_VL)。
01-003为包括基于VH和CH1的重链以及基于VL和CD1b的轻链的模型单特异性抗体样分子，其中VH为具有SEQ ID NO:105的抗体奥瑞珠单抗的重链可变结构域的氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VH)，VL为具有SEQ ID NO:106的抗体奥瑞珠单抗的轻链可变结构域的氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VH)，和CD1b为具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CD1b的α3结构域。
01-004为包括基于VH和CH1的重链和基于VL和CK的轻链的模型单特异性抗体样分子，其中VH为具有SEQ ID NO:103的抗体帕洛利单抗的重链可变结构域的氨基酸序列(帕洛利单抗_VH)，和VL为具有SEQ ID NO:106的抗体奥瑞珠单抗的轻链可变结构域的氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VL)。
01-005为包括基于VH和CH1的重链以及基于VL和b2M的轻链的模型单特异性抗体样分子，其中VH为具有SEQ ID NO:103的抗体帕洛利单抗的重链可变结构域的氨基酸序列(帕洛利单抗_VH)，b2M为具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的β2微球蛋白，VL为具有SEQ IDNO:106的抗体奥瑞珠单抗的轻链可变结构域的氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VL)，和CD1b为具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CD1b的α3结构域。
01-006为包括基于VH和CH1的重链和基于VL和CK的轻链的模型单特异性抗体样分子，其中VH为具有SEQ ID NO:105的抗体奥瑞珠单抗的重链可变结构域的氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VH)，和VL为具有SEQ ID NO:104的抗体帕洛利单抗的轻链可变结构域的氨基酸序列(帕洛利单抗_VL)。
01-007为包括基于VH和CH1的重链以及基于VL和b2M的轻链的模型单特异性抗体样分子，其中VH为具有SEQ ID NO:105的抗体奥瑞珠单抗的重链可变结构域的氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VH)，b2M为具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的β2微球蛋白，VL为具有SEQ IDNO:104的抗体帕洛利单抗的轻链可变结构域的氨基酸序列(帕洛利单抗_VL)，和CD1b为具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CD1b的α3结构域。
01-008为包括基于VH和CH1的重链以及基于VL和CD1b的轻链的模型单特异性抗体样分子，其中VH为具有SEQ ID NO:103的抗体帕洛利单抗的重链可变结构域的氨基酸序列(帕洛利单抗_VH)，VL为具有SEQ ID NO:106的抗体奥瑞珠单抗的轻链可变结构域的氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VH)，和CD1b为具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CD1b的α3结构域。
01-009为包括基于VH和b2M的重链和基于VL和CK的轻链的模型单特异性抗体样分子，其中VH为具有SEQ ID NO:103的抗体帕洛利单抗的重链可变结构域的氨基酸序列(帕洛利单抗_VH)，b2M为具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的β2微球蛋白，和VL为具有SEQ ID NO:106的抗体奥瑞珠单抗的轻链可变结构域的氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VL)。
01-010为包括基于VH和CH1的重链以及基于VL和CD1b的轻链的模型单特异性抗体样分子，其中VH为具有SEQ ID NO:105的抗体奥瑞珠单抗的重链可变结构域的氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VH)，VL为具有SEQ ID NO:104的抗体帕洛利单抗的轻链可变结构域的氨基酸序列(帕洛利单抗_VL)，和CD1b为具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CD1b的α3结构域。
01-011为包括基于VH和CH1的重链以及基于VL和b2M的轻链的模型单特异性抗体样分子，其中VH为具有SEQ ID NO:103的抗体帕洛利单抗的重链可变结构域的氨基酸序列(帕洛利单抗_VH)，b2M为具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的β2微球蛋白，VL为具有SEQ IDNO:104的抗体帕洛利单抗的轻链可变结构域的氨基酸序列(帕洛利单抗_VL)，和CD1b为具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CD1b的α3结构域。
01-012为包括基于VH和CH1的重链和基于VL和CK的轻链的模型单特异性抗体样分子，其中VH为具有SEQ ID NO:103的抗体帕洛利单抗的重链可变结构域的氨基酸序列(帕洛利单抗_VH)，和VL为具有SEQ ID NO:104的抗体帕洛利单抗的轻链可变结构域的氨基酸序列(帕洛利单抗_VL)。
02-004为特异性地结合于PD1和CD20的二价双特异性嵌合抗体并且包含：
a)特异性地结合于PD1的抗体的第一轻链和第一重链；
其中第一轻链包含具有SEQ ID NO:104的抗体帕洛利单抗的轻链可变结构域(帕洛利单抗_VL)和轻链恒定结构域；
其中第一重链包含具有SEQ ID NO:103的抗体帕洛利单抗的重链可变结构域(帕洛利单抗_VH)和包括第一(CH1)重链恒定结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体的抗体的重链恒定结构域，其中CH3包括氨基酸取代以形成孔；
b)特异性地结合于CD20的抗体的第二轻链和第二重链，
其中第二轻链包含具有SEQ ID NO:106的抗体奥瑞珠单抗的轻链可变结构域(奥瑞珠单抗_VL)和具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CD1b的α3膜近端结构域；
其中第二重链包含具有SEQ ID NO:105的抗体奥瑞珠单抗的重链可变结构域(奥瑞珠单抗_VH)、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的β2微球蛋白的膜近端结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，其中CH3包括氨基酸取代以形成旋钮。
02-004为特异性地结合于PD1和CD20的二价双特异性嵌合抗体并且包含：
a)特异性地结合于PD1的抗体的第一轻链和第一重链；
其中第一轻链包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列(帕洛利单抗_VL_CK)；
其中第一重链包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列(帕洛利单抗_VH_HC_孔)；
b)特异性地结合于CD20的抗体的第二轻链和第二重链，
其中第二轻链包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VL_CD1b)；
其中第二重链包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VH_b2m_Fc_旋钮)。
02-005为特异性地结合于PD1和CD20的二价双特异性嵌合抗体并且包含：
a)特异性地结合于CD20的抗体的第一轻链和第一重链；
其中第一轻链包含具有SEQ ID NO:106的抗体奥瑞珠单抗的轻链可变结构域(奥瑞珠单抗_VL)和轻链恒定结构域；
其中第一重链包含具有SEQ ID NO:105的抗体奥瑞珠单抗的重链可变结构域(奥瑞珠单抗_VH)和包括第一(CH1)重链恒定结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体的抗体的重链恒定结构域，其中CH3包括氨基酸取代以形成孔；
b)特异性地结合于PD1的抗体的第二轻链和第二重链，
其中第二轻链包含具有SEQ ID NO:104的抗体奥瑞珠单抗的轻链可变结构域(帕洛利单抗_VL)和具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CD1b的α3膜近端结构域；
其中第二重链包含具有SEQ ID NO:103的抗体帕洛利单抗的重链可变结构域(帕洛利单抗_VH)、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的β2微球蛋白的膜近端结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，其中CH3包括氨基酸取代以形成旋钮。
02-005为特异性地结合于PD1和CD20的二价双特异性嵌合抗体并且包含：
a)特异性地结合于CD20的抗体的第一轻链和第一重链；
其中第一轻链包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VL_CK)；
其中第一轻链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VH_HC_孔)；
b)特异性地结合于PD1的抗体的第二轻链和第二重链，
其中第二轻链包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列(帕洛利单抗_VL_CD1b)；
其中第二重链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列(帕洛利单抗_VH_b2m_Fc_旋钮)。
02-006为特异性地结合于PD1和CSF1R的二价双特异性嵌合抗体并且包含：
a)特异性地结合于PD1的抗体的第一轻链和第一重链；
其中第一轻链包含具有SEQ ID NO:104的抗体帕洛利单抗的轻链可变结构域(奥瑞珠单抗_VL)和轻链恒定结构域；
其中第一重链包含具有SEQ ID NO:103的抗体帕洛利单抗的重链可变结构域(帕洛利单抗_VH)和包括第一(CH1)重链恒定结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体的抗体的重链恒定结构域，其中CH3包括氨基酸取代以形成孔；
b)特异性地结合于CSF1R的抗体的第二轻链和第二重链，
其中第二轻链包含具有SEQ ID NO:108的CSF1R抗体的轻链可变结构域和具有SEQID NO:109的氨基酸序列的CD1b的α3膜近端结构域；
其中第二重链包含具有SEQ ID NO:107的CSF1R抗体的重链可变结构域、具有SEQID NO:46的氨基酸序列的β2微球蛋白的膜近端结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，其中CH3包括氨基酸取代以形成旋钮。
02-006为特异性地结合于PD1和CSF1R的二价双特异性嵌合抗体并且包含：
a)特异性地结合于PD1的抗体的第一轻链和第一重链；
其中第一轻链包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列(帕洛利单抗_VL_CK)；
其中第一重链包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列(帕洛利单抗_VH_HC_孔)；
b)特异性地结合于CSF1R的抗体的第二轻链和第二重链，
其中第二轻链包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列(抗CSF1R_VL_CD1b)；
其中第二重链包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列(抗CSF1R_VH_b2m_Fc_旋钮)。
02-007为特异性地结合于PD1和CSF1R的二价双特异性嵌合抗体并且包含：
a)特异性地结合于CSF1R的抗体的第一轻链和第一重链；
其中第一轻链包含具有SEQ ID NO:108的CSF1R抗体的轻链可变结构域和轻链恒定结构域；
其中第一重链包含具有SEQ ID NO:107的CSF1R抗体的重链可变结构域和包括第一(CH1)重链恒定结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体的抗体的重链恒定结构域，其中CH3包括氨基酸取代以形成孔；
b)特异性地结合于PD1的抗体的第二轻链和第二重链，
其中第二轻链包含具有SEQ ID NO:104的抗体帕洛利单抗的轻链可变结构域(帕洛利单抗_VL)和具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CD1b的α3膜近端结构域；
其中第二重链包含具有SEQ ID NO:103的抗体帕洛利单抗的重链可变结构域(帕洛利单抗_VH)、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的β2微球蛋白的膜近端结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，其中CH3包括氨基酸取代以形成旋钮。
02-007为特异性地结合于PD1和CSF1R的二价双特异性嵌合抗体并且包含：
a)特异性地结合于CSF1R的抗体的第一轻链和第一重链；
其中第一轻链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列(抗CSF1R_VL_CK)；
其中第一重链包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列(抗CSF1R_VH_HC_孔)；
b)特异性地结合于PD1的抗体的第二轻链和第二重链，
其中第二轻链包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列(帕洛利单抗_VL_CD1b)；
其中第二重链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列(帕洛利单抗_VH_b2m_Fc_旋钮)。
02-008为特异性地结合于CD20和CSF1R的二价双特异性嵌合抗体并且包含：
a)特异性地结合于CD20的抗体的第一轻链和第一重链；
其中第一轻链包含具有SEQ ID NO:106的抗体奥瑞珠单抗的轻链可变结构域(奥瑞珠单抗_VL)和轻链恒定结构域；
其中第一重链包含具有SEQ ID NO:105的抗体奥瑞珠单抗的重链可变结构域(奥瑞珠单抗_VH)和包括第一(CH1)重链恒定结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体的抗体的重链恒定结构域，其中CH3包括氨基酸取代以形成孔；
b)特异性地结合于CSF1R的抗体的第二轻链和第二重链，
其中第二轻链包含具有SEQ ID NO:108的CSF1R抗体的轻链可变结构域和具有SEQID NO:109的氨基酸序列的CD1b的α3膜近端结构域)；
其中第二重链包含具有SEQ ID NO:107的CSF1R抗体的重链可变结构域、具有SEQID NO:46的氨基酸序列的β2微球蛋白的膜近端结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，其中CH3包括氨基酸取代以形成旋钮。
02-008为特异性地结合于CD20和CSF1R的二价双特异性嵌合抗体并且包含：
a)特异性地结合于CD20的抗体的第一轻链和第一重链；
其中第一轻链包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VL_CK)；
其中第一重链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VH_HC_孔)；
b)特异性地结合于CSF1R的抗体的第二轻链和第二重链，
其中第二轻链包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列(抗CSF1R_VL_CD1b)；
其中第二重链包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列(抗CSF1R_VH_b2m_Fc_旋钮)。
02-009为特异性地结合于CD20和CSF1R的二价双特异性嵌合抗体并且包含：
a)特异性地结合于CSF1R的抗体的第一轻链和第一重链；
其中第一轻链包含具有SEQ ID NO:108的CSF1R抗体的轻链可变结构域和轻链恒定结构域；
其中第一重链包含具有SEQ ID NO:107的CSF1R抗体的重链可变结构域和包括第一(CH1)重链恒定结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体的抗体的重链恒定结构域，其中CH3包括氨基酸取代以形成孔；
b)特异性地结合于CD20的抗体的第二轻链和第二重链，
其中第二轻链包含具有SEQ ID NO:106的抗体奥瑞珠单抗的轻链可变结构域(奥瑞珠单抗_VL)和具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CD1b的α3膜近端结构域；
其中第二重链包含具有SEQ ID NO:105的抗体奥瑞珠单抗的重链可变结构域(奥瑞珠单抗_VH)、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的β2微球蛋白的膜近端结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，其中CH3包括氨基酸取代以形成旋钮。
02-009为特异性地结合于CD20和CSF1R的二价双特异性嵌合抗体并且包含：
a)特异性地结合于CSF1R的抗体的第一轻链和第一重链；
其中第一轻链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列(抗CSF1R_VL_CK)；
其中第一重链包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列(抗CSF1R_VH_HC_孔)；
b)特异性地结合于CD20的抗体的第二轻链和第二重链，
其中第二轻链包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VL_CD1b)；
其中第二重链包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VH_b2m_Fc_旋钮)。
03-001为特异性地结合于PD1的二价单特异性嵌合抗体并且包含：
轻链，其包含具有SEQ ID NO:104的抗体帕洛利单抗的轻链可变结构域(帕洛利单抗_VL)和具有突变N57C(另外的SS桥在单元内部)和在C末端通过3个氨基酸GSC的延伸的具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CD1b的α3膜近端结构域；
重链，其包含具有SEQ ID NO:103的抗体帕洛利单抗的重链可变结构域(帕洛利单抗_VH)、具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的具有突变R12C的β2微球蛋白膜近端结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体。
03-001为特异性地结合于PD1的二价单特异性嵌合抗体并且包含：
包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的轻链和
包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的重链。
03-002为特异性地结合于PD1的二价单特异性嵌合抗体并且包含：
轻链，其包含具有SEQ ID NO:104的抗体帕洛利单抗的轻链可变结构域(帕洛利单抗_VL)和具有突变N57C(SS桥在单元内部)和在C末端通过2个氨基酸GS的延伸(SS桥已从单元的C-末端移除并转移至单元内部)的具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CD1b的α3膜近端结构域；
重链，其包含具有SEQ ID NO:103的抗体帕洛利单抗的重链可变结构域(帕洛利单抗_VH)、具有突变R12C的β2微球蛋白膜近端结构域和具有突变C220A的铰链(其具有SEQ IDNO:48的氨基酸序列)及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体。
03-002为特异性地结合于PD1的二价单特异性嵌合抗体并且包含：
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的轻链和
包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的重链。
03-003为特异性地结合于PD1的二价单特异性嵌合抗体并且包含：
轻链，其包含具有SEQ ID NO:104的抗体帕洛利单抗的轻链可变结构域(帕洛利单抗_VL)和具有突变N59A(在轻链上预期的N-糖基化位点中的取代)和在C末端通过3个氨基酸GSC的延伸的具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CD1b的α3膜近端结构域；
重链，其包含具有SEQ ID NO:103的抗体帕洛利单抗的重链可变结构域(帕洛利单抗_VH)、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的β2微球蛋白膜近端结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体。
03-003为特异性地结合于PD1的二价单特异性嵌合抗体并且包含：
包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的轻链和
包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的重链。
03-004为特异性地结合于PD1的二价单特异性嵌合抗体并且包含：
轻链，其包含具有SEQ ID NO:104的抗体帕洛利单抗的轻链可变结构域(帕洛利单抗_VL)和具有突变N59D(在轻链上预期的N-糖基化位点中的取代)和在C末端通过3个氨基酸GSC的延伸的具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CD1b的α3膜近端结构域；
重链，其包含具有SEQ ID NO:103的抗体帕洛利单抗的重链可变结构域(帕洛利单抗_VH)、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的β2微球蛋白膜近端结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体。
03-004为特异性地结合于PD1的二价单特异性嵌合抗体并且包含：
包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链和
包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的重链。
03-005为特异性地结合于PD1的二价单特异性嵌合抗体并且包含：
轻链，其包含具有SEQ ID NO:104的抗体帕洛利单抗的轻链可变结构域(帕洛利单抗_VL)和具有突变N57C、N59A和在C-末端通过3个氨基酸GSC的延伸(另一个SS桥在单元内部+预期的N-糖基化位点已被移除)的具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CD1b的α3膜近端结构域；
重链，其包含具有SEQ ID NO:103的抗体帕洛利单抗的重链可变结构域(帕洛利单抗_VH)、具有突变R12C的具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的β2微球蛋白膜近端结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体。
03-005为特异性地结合于PD1的二价单特异性嵌合抗体并且包含：
包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的轻链和
包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的重链。
03-006为特异性地结合于PD1的二价单特异性嵌合抗体并且包含：
轻链，其包含具有SEQ ID NO:104的抗体帕洛利单抗的轻链可变结构域(帕洛利单抗_VL)和具有突变N57C、N59D和在C-末端通过3个氨基酸GSC的延伸(另一个SS桥在单元内部+预期的N-糖基化位点已被移除)的具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CD1b的α3膜近端结构域；
重链，其包含具有SEQ ID NO:103的抗体帕洛利单抗的重链可变结构域(帕洛利单抗_VH)、具有突变R12C的具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的β2微球蛋白膜近端结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体。
03-006为特异性地结合于PD1的二价单特异性嵌合抗体并且包含：
包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的轻链和
包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的重链。
03-007为特异性地结合于PD1的二价单特异性嵌合抗体并且包含：
轻链，其包含具有SEQ ID NO:104的抗体帕洛利单抗的轻链可变结构域(帕洛利单抗_VL)和具有突变N57C、N59A和在C末端通过2个氨基酸GS的延伸(SS桥已转移至单元内部+预期的N-糖基化位点已被移除)的具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CD1b的α3膜近端结构域；
重链，其包含具有SEQ ID NO:103的抗体帕洛利单抗的重链可变结构域(帕洛利单抗_VH)、具有突变R12C的β2微球蛋白膜近端结构域和具有突变C220A的铰链(其具有SEQ IDNO:48的氨基酸序列)及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体。
03-007为特异性地结合于PD1的二价单特异性嵌合抗体并且包含：
包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的轻链和
包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的重链。
03-008为特异性地结合于PD1的二价单特异性嵌合抗体并且包含：
轻链，其包含具有SEQ ID NO:104的抗体帕洛利单抗的轻链可变结构域(帕洛利单抗_VL)和具有突变N57C、N59D和在C末端通过2个氨基酸GS的延伸(SS桥已转移至单元内部+预期的N-糖基化位点已被移除)的具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CD1b的α3膜近端结构域；
重链，其包含具有SEQ ID NO:103的抗体帕洛利单抗的重链可变结构域(帕洛利单抗_VH)、具有突变R12C的β2微球蛋白膜近端结构域和具有突变C220A的铰链(其具有SEQ IDNO:48的氨基酸序列)及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体。
03-008为特异性地结合于PD1的二价单特异性嵌合抗体并且包含：
包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的轻链和
包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的重链。
给出这些抗体为出于说明目的，以证实本发明二价双特异性嵌合抗体格式的可操作性，以及证实其令人意外的特性。这些抗体不应解释为以某种方式限制本发明的二价双特异性嵌合抗体。
具有两条不同重链的正确异源二聚体组装和两条不同轻链与相应重链之间的正确配对的产物的产率参数不取决于双特异性嵌合抗体的重链和轻链可变片段及其对抗原的特异性。
本发明的二价双特异性嵌合抗体可用于治疗各种疾病，特别是肿瘤性疾病、自身免疫性疾病或与血液凝结(凝血)障碍相关的疾病。
核酸
在一方面，本发明涉及编码任何以上二价双特异性嵌合抗体或其片段的分离核酸。
术语“核酸”、“核酸序列(nucleic sequence)”、“核酸序列(nucleic acidsequence)”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”在本说明书中可互换使用，意指核苷酸的精确序列，其经过修饰或未过修饰，确定核酸的片段或区域，含有或不含非天然核苷酸，并且为双链DNA或RNA、单链DNA或RNA、或者所述DNA的转录产物。
在此还应当包括的是，本发明不涉及其自然染色体环境中，即呈自然状态的核苷酸序列。本发明的序列已被分离和/或纯化，即其被直接或间接取样，例如通过复制，其环境已被至少部分地修饰。因此，通过重组遗传学例如借助于宿主细胞获得，或者通过化学合成获得的分离核酸也应在此提及。
除非另外规定，指涉核苷酸序列包括其互补物。因此，指涉具有特定序列的核酸应理解为包括具有其互补序列的其互补链的核酸。
在以上实施方案的任何一个中，核酸分子可为分离的。
“分离的”核酸分子为从至少一种核酸分子杂质(前者在抗体核酸的天然来源中与杂质结合)识别和分离的核酸分子。分离的核酸分子不同于其中其在自然条件下发现的形式或设定。因此，分离的核酸分子不同于在自然条件下存在于细胞中的核酸分子。
在一方面，本发明涉及包含编码选自SEQ ID NO:1-79或SEQ ID NO:109的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子。核酸分子还可包含所述核苷酸序列的任何组合。
在一些实施方案中，核酸为DNA。
在一种变体中，本发明涉及一种核酸分子，其包含编码选自以下的以上本发明双特异性抗体的轻链或重链氨基酸序列的核苷酸序列：
包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域的第一轻链氨基酸序列；
第一重链氨基酸序列，其包含抗体的重链可变结构域和包括第一(CH1)重链恒定结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体的重链恒定结构域；
包含轻链可变结构域和选自以下的恒定结构域的第二轻链氨基酸序列：
MHC(主要组织相容性复合体)的第一膜近端结构域或
MHC样蛋白的第一膜近端结构域；
包含重链可变结构域和选自以下的恒定结构域的第二重链氨基酸序列：
MHC(主要组织相容性复合体)的第二膜近端结构域或
MHC样蛋白的第二膜近端结构域，
和包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体。
核酸分子还可包含以上核苷酸序列的任何组合。
本领域的技术人员应当意识到，包含选自以下的以上本发明双特异性抗体的轻链或重链氨基酸序列的肽：
包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域的第一轻链氨基酸序列；
第一重链氨基酸序列，其包含抗体的重链可变结构域和包括第一(CH1)重链恒定结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体的重链恒定结构域；
包含轻链可变结构域和选自以下的恒定结构域的第二轻链氨基酸序列：
MHC(主要组织相容性复合体)的第一膜近端结构域或
MHC样蛋白的第一膜近端结构域；
包含重链可变结构域和选自以下的恒定结构域的第二重链氨基酸序列：
MHC(主要组织相容性复合体)的第二膜近端结构域或
MHC样蛋白的第二膜近端结构域，
和包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，
由于遗传密码的简并性，可由广泛范围的不同DNA序列编码。创建这些编码相同氨基酸序列的备选DNA序列完全处于本领域技术人员的技术范围内。这种变体DNA序列处于本发明的范围内。
本发明的核酸分子可从产生本发明双特异性抗体的任何来源分离。在本发明的某些实施方案中，本发明的核酸分子可以合成而不是分离。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码候选物02-004和02-006的第一重链氨基酸序列(帕洛利单抗_VH_HC_孔)的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:80的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码候选物02-004和02-006的第一轻链氨基酸序列(帕洛利单抗_VL_CK)的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:81的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码候选物02-004和02-009的第二重链氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VH_b2m_Fc_旋钮)的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:82的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码候选物02-004和02-009的第二轻链氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VL_CD1b)的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:83的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码候选物02-005和02-008的第一重链氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VH_HC_孔)的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:84的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码02-005和02-008候选物的第一轻链氨基酸序列(奥瑞珠单抗_VL_CK)的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:85的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码02-005和02-007候选物的第二重链氨基酸序列(帕洛利单抗_VH_b2m_Fc_旋钮)的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:86的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码02-005和02-007候选物的第二轻链氨基酸序列(帕洛利单抗_VL_CD1b)的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:87的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码02-006和02-008候选物的第二重链氨基酸序列(抗CSF1R_VH_b2m_Fc_旋钮)的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:88的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码02-006和02-008候选物的第二轻链氨基酸序列(抗CSF1R_VL_CD1b)的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:89的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码02-007和02-009候选物的第一重链氨基酸序列(抗CSF1R_VH_HC_孔)的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:90的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码02-007和02-009候选物的第一轻链氨基酸序列(抗CSF1R_VL_CK)的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:91的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码03-001和03-005候选物的重链氨基酸序列的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:92的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含具有突变R12C的通用β2微球蛋白(β2Μ)。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码03-003和03-004候选物的重链氨基酸序列的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:93的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含通用β2微球蛋白(β2Μ)。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码03-002、03-007和03-008候选物的重链氨基酸序列的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:94的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含具有突变R12C的通用β2微球蛋白(β2Μ)和具有突变C220A的铰链。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码03-001候选物的轻链氨基酸序列的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:95的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含具有突变N57C和在C-末端通过3个氨基酸GSC的延伸的CD1b的α3膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码03-002候选物的轻链氨基酸序列的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:96的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含具有突变N57C和在C-末端通过2个氨基酸GS的延伸的CD1b的α3膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码03-003候选物的轻链氨基酸序列的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:97的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含具有突变N59A和在C-末端通过3个氨基酸GSC的延伸的CD1b的α3膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码03-004候选物的轻链氨基酸序列的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:98的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含具有突变N57D和在C-末端通过3个氨基酸GSC的延伸的CD1b的α3膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码03-005候选物的轻链氨基酸序列的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:99的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含具有突变N57C、N59A和在C-末端通过3个氨基酸GSC的延伸的CD1b的α3膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码03-006候选物的轻链氨基酸序列的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:100的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含具有突变N57C、N59D和在C-末端通过3个氨基酸GSC的延伸的CD1b的α3膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码03-007候选物的轻链氨基酸序列的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:101的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含具有突变N57C、N59A和在C-末端通过2个氨基酸GS的延伸的CD1b的α3膜近端结构域。
在本发明的一些实施方案中，核酸为编码03-008候选物的轻链氨基酸序列的核酸，并且包括具有SEQ ID NO:102的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含具有突变N57C、N59D和在C-末端通过2个氨基酸GS的延伸的CD1b的α3膜近端结构域。
核酸分子可用于表达本发明的二价双特异性嵌合抗体。
表达载体
在一方面，本发明涉及一种包含以上分离核酸的表达载体。本发明涉及一种适合于表达任何本文所述核苷酸序列的载体。
如本文使用的术语“载体”意指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。在本发明的一些实施方案中，载体为质粒，即另外DNA链段可连接到其中的圆形双链DNA片段。在本发明的一些实施方案中，载体为病毒载体，其中另外的DNA链段可连接到病毒基因组中。在本发明的一些实施方案中，载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如具有复制起始位点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。在本发明的进一步实施方案中，载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在引入到宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。这种载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。
本发明涉及载体，其包含编码任何以上二价双特异性抗体或选自以下的其结构部分的以上核酸分子：
包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域的第一轻链氨基酸序列；
第一重链氨基酸序列，其包含抗体的重链可变结构域和包括第一(CH1)重链恒定结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体的重链恒定结构域；
包含轻链可变结构域和选自以下的恒定结构域的第二轻链氨基酸序列：
MHC(主要组织相容性复合体)的第一膜近端结构域或
MHC样蛋白的第一膜近端结构域；
包含重链可变结构域和选自以下的恒定结构域的第二重链氨基酸序列：
MHC(主要组织相容性复合体)的第二膜近端结构域或
MHC样蛋白的第二膜近端结构域，
和包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，
如本文所述。
表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、植物病毒比如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、粘粒、YAC、EBV衍生的附加体等。DNA分子可连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调控DNA转录和翻译的预期功能。可选择表达载体和表达控制序列以与使用的表达宿主细胞相容。可将部分或完全编码第一和第二结合结构域序列(例如其中结合结构域包含重链和重链序列的重链和轻链序列)的DNA分子引入到单独载体中。在一个实施方案中，将所述DNA分子的任何组合引入到相同的表达载体中。DNA分子可通过标准方法(例如连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位点，或者如果不存在限制性位点则进行平端连接)引入到表达载体中。
在本发明的一些实施方案中，如以上所述，合适的载体为包括限制性位点使得任何VH或VL序列均可易于插入和表达的载体。多聚腺苷酸化和转录终止可发生于编码区下游的天然染色体位点。重组表达载体还可编码促进抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。抗体链基因可克隆到载体中，使得信号肽在框架内连接到免疫球蛋白链的氨基末端。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。
在本发明的一些实施方案中，除抗体链基因之外，本发明的重组载体表达还可携带控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调控序列。本领域的技术人员应当理解，表达载体的设计，包括调控序列的选择，可取决于因素比如要转化的宿主细胞的选择、期望蛋白的表达水平等。用于哺乳动物中表达宿主细胞的优选控制序列包括确保哺乳动物细胞中高水平蛋白表达的病毒元件，比如衍生于逆转录病毒LTR的启动子和/或增强子、巨细胞病毒(CMV)(比如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(比如SV40启动子/增强子)、腺病毒(比如主要晚期启动子腺病毒(AdMLP))、多瘤病毒和强哺乳动物启动子，比如天然免疫球蛋白启动子或肌动蛋白启动子。用于在细菌细胞或真菌细胞例如酵母细胞中表达多肽的方法也为本领域众所周知的。
在本发明的一些实施方案中，除抗体链基因和调控序列之外，本发明的重组表达载体还可携带另外的序列，比如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因促进其中引入载体的宿主细胞的选择。
在本发明的一些实施方案中，载体可包括表达控制序列。如本说明书中使用的术语“表达控制序列”是指对于实现与其连接的编码序列的表达和加工必要的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，比如剪接和多聚腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；提高蛋白稳定性的序列；以及当需要时增强蛋白分泌的序列。这种控制序列的性质根据宿主生物体而不同；在原核生物中，这种控制序列通常包括核糖体结合位点的启动子和转录终止序列；在真核生物中，一般地这种控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”至少包括其存在对于表达和加工必不可少的所有组分，并且还可包括其存在为有利的另外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。
宿主细胞和用于其产生的方法
在一方面，本发明涉及一种用于产生任何以上二价双特异性嵌合抗体的宿主细胞的产生方法并且包括用以上表达载体转化细胞。
在一方面，本发明涉及一种用于产生包含任何以上核酸的任何以上二价双特异性嵌合抗体的宿主细胞。
如本文使用的术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)是指其中已经引入重组表达载体的细胞。本发明涉及可包括例如以上描述的本发明载体的宿主细胞。
本发明进一步涉及包括例如编码本发明二价双特异性嵌合抗体的第一重链的核苷酸序列、编码本发明二价双特异性嵌合抗体的第一轻链的核苷酸序列、编码本发明二价双特异性嵌合抗体的第二重链的核苷酸序列或编码本发明二价双特异性嵌合抗体的第二轻链的核苷酸序列或全部以上4种序列的宿主细胞。应当理解，“重组宿主细胞”和“宿主细胞”不仅是指特定主题细胞，而且还指这种细胞的后代。由于突变或环境影响所致可能会在后代中发生改变，因此这种后代事实上可能与亲代细胞不同；然而，这种细胞仍然包括在如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。
包含编码选自以下的以上双特异性抗体的轻链或重链氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子：
包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域的第一轻链氨基酸序列；
第一重链氨基酸序列，其包含抗体的重链可变结构域和包括第一(CH1)重链恒定结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体的重链恒定结构域；
包含轻链可变结构域和选自以下的恒定结构域的第二轻链氨基酸序列：
MHC(主要组织相容性复合体)的第一膜近端结构域或
MHC样蛋白的第一膜近端结构域；
第二重链氨基酸序列，其包含重链可变结构域和选自以下的恒定结构域：
MHC(主要组织相容性复合体)的第二膜近端结构域或
MHC样蛋白的第二膜近端结构域；
和包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，
并且包含这些核酸分子的载体可用于转染合适的哺乳动物或其细胞、植物或其细胞、细菌或酵母宿主细胞。转化可通过将多核苷酸引入到宿主细胞中的任何已知技术进行。用于将异源多核苷酸引入到哺乳动物细胞中的方法为本领域众所周知的，并且包括葡聚糖介导的转染、阳离子聚合物-核酸复合体转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、多核苷酸包封于脂质体中以及DNA直接显微注射到细胞核中。另外，核酸分子可通过病毒载体引入到哺乳动物细胞中。
用作转化宿主的哺乳动物细胞系为本领域众所周知的，并且包括多种可用的永生化细胞系。这些包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、FreeStyle 293细胞(Invitrogen)、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞和许多其他细胞系。通过确定哪些细胞系具有高表达水平并提供所产生蛋白的必要特性选择细胞系。可使用的其他细胞系为昆虫细胞系，比如Sf9或Sf21细胞。当将编码以上双特异性抗体或其一部分的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以在宿主细胞中表达以上本发明双特性抗体或其一部分，或者更优选地将以上双特异性抗体分泌到其中培养宿主细胞的培养基中的时间段，来产生以上双特异性抗体。以上双特异性抗体可使用标准蛋白纯化技术从培养基中分离。植物宿主细胞包括例如烟草属(Nicotiana),、拟南芥属(Arabidopsis)、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等。细菌宿主细胞包括埃希氏菌属(Escherichia)和链霉菌属(Streptomyces)物种。酵母宿主细胞包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichiapastoris)。
此外，可使用许多已知技术提高从生产细胞系产生本发明双特异性抗体的水平。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)为用于在某些条件下增强表达的常见方法。GS系统全部或部分地与ΕΡNo.0216846、0256055、0323997和0338841相关进行讨论。
不同细胞系或宿主细胞中的本发明双特异性嵌合抗体可能具有彼此不同的糖基化模式。然而，无论结合分子的糖基化状态如何，并且通常无论翻译后修饰存在与否，本文公开的双特异性抗体均为本发明的一部分。
以上宿主细胞不是指使用人类胚胎产生的宿主细胞。
以上宿主细胞不是指通过改变人类生殖系细胞的遗传完整性产生的宿主细胞。
产生抗体的方法
在一方面，本发明涉及一种用于产生任何以上二价双特异性嵌合抗体的方法，其包括下面步骤：
a)用以下表达载体转化宿主细胞
-包含编码本发明二价双特异性嵌合抗体的第一轻链和第一重链的核酸分子的表达载体，
-包含编码本发明二价双特异性嵌合抗体的第二轻链和第二重链的核酸分子的表达载体，
b)在适合于合成所述二价双特异性抗体的条件下培养宿主细胞；和
c)从细胞培养物中分离所述二价双特异性抗体。
本发明涉及用于产生本发明二价双特异性嵌合抗体的方法。本发明的一个实施方案涉及一种用于产生如本文定义的二价双特异性嵌合抗体的方法，其包括产生能够表达二价双特异性嵌合抗体的重组宿主细胞，在适合于表达二价双特异性嵌合抗体的条件下培养所述宿主细胞，并分离所得二价双特异性嵌合抗体。在这种重组宿主细胞中通过这种表达产生的二价双特异性嵌合抗体在本文中称为“二价双特异性嵌合抗体”。
实施例
提供以下实施例以更好地理解本发明。这些实施例仅出于说明目的，并且不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请通过参考结合至本文中。尽管出于清楚理解的目的，已经通过说明和实例对上述发明进行稍为详细地描述，但是根据本发明的教导对于本领域普通技术人员易于显而易见的是可对其进行某些变化和修改而不背离所附实施方案的精神或范围。
材料和通用方法
重组DNA技术
如在Sambrook,J.等人,Molecular cloning:A laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述，使用标准方法操控DNA。根据制造商方案使用分子生物学试剂。
基因合成
从通过化学合成制备的寡核苷酸制备期望的基因链段。通过寡核苷酸的退火和连接(包括PCR扩增)组装300-4,000bp长的侧接单个限制性位点的基因链段，并随后经指定的限制性位点克隆。亚克隆基因片段的DNA序列通过DNA测序证实。
DNA序列测定
通过Sanger测序测定DNA序列。
DNA和蛋白序列分析及序列数据管理
使用Ylab2(Biocad)软件包进行序列创建、映射、分析、注释和说明。
表达载体
应用表达质粒变体在真核细胞(例如CHO细胞)中瞬时表达主题抗体、抗体样蛋白和抗原。除靶蛋白的表达盒之外，(质粒)载体还含有：允许在大肠杆菌中复制所述质粒的复制起点、赋予大肠杆菌对各种抗生素(例如氨苄西林和卡那霉素)的抗性的基因。
包含如以上描述的所述抗体链的融合基因通过PCR和/或基因合成产生，并通过例如使用相应载体中的独特限制性位点，连接相应的核酸链段，用已知的方法和技术组装。通过DNA测序验证亚克隆核酸序列。在大肠杆菌细胞培养物中产生瞬时转染所需量的质粒，并使用已知技术进行分离。
哺乳动物细胞悬浮培养中重组抗原的产生和纯化
在从中国仓鼠卵巢细胞(CHO系)获得的已建立细胞系细胞中产生重组蛋白。使用补充有8mM L-谷氨酰胺和1g/lpluronic 68的无血清培养基在轨道温育器摇床上的烧瓶中进行悬浮培养。对于瞬时表达，使用线性聚乙烯亚胺转染细胞(2-2.2×106细胞/ml)。转染后9天，通过经0.5/0.22μm深床过滤器过滤，使培养液与细胞分离。
组氨酸标记蛋白通过金属螯合层析纯化。纯化的蛋白通过0.22μm过滤并于-70℃下储存。
使用SDS凝胶电泳评估所得蛋白溶液的纯度，在补充有巯基乙醇的变性12％聚丙烯酰胺凝胶和天然8％聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。
哺乳动物细胞悬浮培养中抗体和抗体样蛋白的产生
在从中国仓鼠卵巢细胞(CHO系)获得的永久细胞系细胞中产生对照抗体、本发明的双特异性嵌合抗体和抗体样蛋白。使用补充有8mM L-谷氨酰胺和1g/l pluronic 68的无血清培养基，在轨道温育器摇床上的烧瓶中进行悬浮培养。对于瞬时表达，使用线性聚乙烯亚胺转染细胞(2-2.2×106细胞/ml)。DNA/PEI比率为1:3/1:10。转染后9天，通过经0.5/0.22μm深床过滤器过滤使培养液与细胞分离，并然后使用标准方法在ForteBio上测量蛋白滴度。使澄清的培养液以10-20mg/ml吸附剂通过蛋白A亲和吸附柱，用磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.4)平衡柱。然后用5柱体积的PBS洗涤柱以去除非特异性结合的组分。使用0.1M甘氨酸缓冲液(pH 3)洗脱结合的蛋白。收集主要蛋白洗脱峰，并使用1M Tris-HCl缓冲液(pH 8)将其调至pH 6.8-7.0。所有阶段均在110cm/h流速下进行。然后通过渗析将蛋白渗析到PBS(pH 7.4)中，过滤(0.22μm)，转移到试管中并于-70℃下储存。
在还原和非还原条件下使用SDS凝胶电泳以及使用大小排阻高效液相色谱(SEHPLC)评估所得蛋白溶液的纯度。
SE HPLC在TSK-Gel G3000SWXL柱(7.8x300 mm，粒度：5μm，孔径：)和TSKGel-Guard SWxl预柱上进行。
实施例1.双特异性抗体中CH1/CK结构域取代的选择
为双特异性抗体中重链和轻链的正确异源二聚化，两对CH1/CK结构域之一由来自其他蛋白的结构相同的结构域取代(图1)。以3步选择合适的取代结构域：
1)预产生CH1/CK结构域的三维模型；
2)CH1/CK结构域的三维模型与蛋白数据库(www.rcsb.org)除抗体和T细胞受体之外的所有对象进行结构比对；
3)基于RMSD度量和形成相同二级结构元件的氨基酸数量，根据结构比对结果选择合适的取代。
第一步，预产生CH1/CK结构域的三维模型为使用来自Schrodinger Suite的Prepwizard实用程序在PDBid 4nyl结构的CH1/CK结构域中添加缺失原子。在第二步，使用来自Schrodinger Suite的蛋白结构比对实用程序将所得模型交替地比对于来自蛋白数据库的所有结构(除抗体和T细胞受体之外)。任意结构与CH1/CK结构域模型之间的相似性程度使用如下两个度量进行评估：1)反映一种结构与另一种结构之间原子的均方根偏差的RMSD(将多肽链骨架原子用于计算)，2)根据比对结果形成相同二级蛋白结构元件的氨基酸的数量。表1显示使用RMSD度量的最佳比对结果。
表1.根据RMSD度量，显示与人类抗体CH1/СK结构域的最佳比对质量的PDB结构。PdbID为PDB数据库中的结构标识符；RMSD为结构的原子与CH1/CK结构域模型的均方根偏差；结构名称为来自PDB数据库的标头。
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根据RMSD度量，与CH1/CK结构域具有最大结构相似性的结构属于主要组织相容性复合体I和II类(MHC)蛋白以及其结构类似物CD1和HFE。基于结构相似性程度的可比值(RMSD和来自相同二级结构的氨基酸数量)，可选择任何以上蛋白进行取代。对于涉及CH1/CK结构域取代的进一步工作和出于说明目的，我们选择CD1b，特别是其膜近端结构域。
实施例2.由MHC或MHC样蛋白的膜近端结构域取代CH1/CK的抗体分子中重链和轻链之间二硫键位置的选择.
人类IgG同种型抗体分子由两条轻链和两条重链组成。抗体两条轻链中的每一条均经半胱氨酸残基中硫原子之间的共价键SS桥连接于重链。该键(在IgG1同种型的情况下)通过轻链的C-末端半胱氨酸残基和重链的铰链区N-末端-近端半胱氨酸残基形成。
MHC和MHC样蛋白的膜近端结构域仅通过非共价键连接并且不在其间形成SS桥；因此，由MHC的膜近端结构域取代CH1/CK结构域可潜在地降低抗体分子的热稳定性和在产生期间靶标产物的产率。为避免这一情况，在嵌合抗体分子的轻链中，于适合于与铰链区N-末端近端的半胱氨酸残基形成SS桥的位置，需要位点半胱氨酸取代。
基于MHC或MHC样蛋白与全长抗体分子的结构比对，选择用于半胱氨酸残基引入到MHC或MHC样蛋白膜近端结构域的位置。作为比对的结果，将半胱氨酸残基引入到位于抗体初始CL(CK)结构域位点的MHC或MHC样蛋白的膜近端结构域中的铰链区半胱氨酸残基近端的位置，与天然IgG1同种型抗体分子中的轻链形成SS桥。根据天然抗体的轻链类推，引入的半胱氨酸残基为末端的。为使半胱氨酸残基之间的距离足以建立二硫键，轻链通过两个氨基酸GS延长。图2示意性地显示嵌合抗体中重链和轻链之间SS桥的位置，其中CH1-CK结构域由MHC样蛋白CD1b的膜近端结构域取代。
实施例3
产生二价双特异性嵌合抗体的遗传构建体的产生
为产生编码特异性地结合于第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链序列的构建体，使用包含限制性位点的引物产生包含抗体重链和轻链可变结构域基因的PCR产物。使用SalI/XbaI限制性位点将重链可变结构域克隆到载体pSXn-HChole-NR_VH1中。使用SalI/XbaI限制性位点将轻链可变结构域克隆到载体pSXn-CL-BR_VL1中。
为产生编码特异性地结合于第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链序列的构建体，我们合成了包含抗体的重链和轻链可变结构域和人类CD1序列(https://www.rcsb.org/structure/5wl1)的膜近端结构域(包括或不含各种修饰)的基因的构建体。
使用包含限制性位点的引物通过PCR从寡核苷酸合成该序列。使用SalI/XbaI限制性位点将具有人类CD1序列的第一膜近端结构域(包括或不含修饰)的重链可变结构域克隆到载体pSX-FCknob-PR中。使用Sal1/Xba1限制性位点将具有人类CD1序列的第二膜近端结构域(包括或不含修饰)的轻链可变结构域克隆到载体pSX-HR中。
将以上4种载体在转染步骤进行组合，以产生本发明的二价双特异性嵌合抗体。
在大肠杆菌细胞中产生所需数量的所有以上质粒，并使用Maxiprep Qiagen试剂盒进行纯化。
实施例4.引入的二硫键对全长嵌合抗体组装的作用.
为测试引入的二硫键的可操作性，我们产生了模型单特异性嵌合抗体。这种格式的抗体由两条重链和两条轻链组成，其中重链CH1和轻链CK结构域分别由β2微球蛋白和CD1b蛋白的α3结构域取代。
从抗体帕洛利单抗(CJSC Biocad)获得VH(SEQ ID NO:103)和VL(SEQ ID NO:104)可变结构域的序列。在样品的第一变体中，重链和轻链之间不存在二硫键。在第二变体中，向轻链C-末端添加半胱氨酸(如实施例2所述)；认为半胱氨酸与上铰链区的半胱氨酸形成二硫键，从而稳定重链和轻链异源二聚体。
图3显示产生样品的非还原SDS凝胶电泳的结果。帕洛利单抗样品(经典IgG1)作为对照施用于泳道3上。结果表明，全长分子仅在存在另一个二硫键的情况下组装(泳道2)，而在其不存在的情况下，我们仅观察到迁移率对应于重链二聚体的片段(泳道3)。
我们还产生了一种嵌合抗体，其二聚化单元相对于重链和轻链反向取向(重链CH1结构域和轻链CK结构域分别由CD1b蛋白的α3结构域和β2微球蛋白取代，参见图1B)。图3(泳道4)显示样品在非还原条件下的SDS凝胶电泳结果；结果证实，这种取向也使得有可能组装嵌合抗体。
实施例5.验证基于MHC或MHC样蛋白的二聚化单元对重链和轻链之间正确配对的作用.
为证明基于MHC或MHC样蛋白的二聚化单元的功能，特别是防止轻链和不适当重链之间的不正确配对，我们进行了以下涉及单特异性分子的实验。我们产生了如下4组分子：
1.具有VH和VL的“正确”组合和恒定结构域的“不正确”对的分子。
2.具有VH和VL的“不正确”组合和恒定结构域的“正确”对的分子。
3.具有VH和VL的“不正确”组合和恒定结构域的“不正确”对的分子。
4.对照分子，其包括经典的IgG1格式抗体和其中恒定结构域已由MHC或MHC样蛋白的膜近端结构域(在这种情况下为β2微球蛋白和CD1b蛋白的α3结构域)取代的嵌合抗体。
VH和VL的“正确”组合意指从单一抗体获得的一对VH和VL。VH和VL的“不正确”组合意指从不同抗体获得的VH和VL。
恒定结构域的“正确”对意指一对CH1-CK或来自MHC样蛋白的一对相互作用结构域(在这种情况下为β2微球蛋白和CD1b蛋白的α3结构域)。恒定结构域的“不正确”对意指CH1-CD1b或β2微球蛋白-CK对。
图4显示实验的总体方案。抗体帕洛利单抗的可变结构域序列用作可变结构域VH1和VL1，抗体奥瑞珠单抗(Genentech)的相应可变结构域序列用作VH2和VL2可变结构域。
表2显示蛋白生产率数据。结果表明，在其重链中具有CH1恒定结构域和在其轻链中具有CD1b蛋白膜近端结构域的候选物显示生产率低(抗体01-001、01-003、01-008、01-010)。这与已知的事实相一致，即内质网(ER)的正确折叠和输出需要CH1结构域和CL结构域之间的相互作用(Feige MJ,Groscurth S,Marcinowski M,Shimizu Y,Kessler H,Hendershot LM,Buchner J.An unfolded CH1 domain controls the assembly andsecretion of IgG antibodies.Mol Cell.2009Jun12；34(5):569-79.doi:10.1016/j.molcel.2009.04.028.PMID:19524537；PMCID:PMC2908990)。抗体01-002和01-009在ER中未通过这种质量控制，并且显示生产率高于200mg/l；然而，尽管生产率水平高，但在PAGE期间其迁移率与全长分子的不一致(图5A，泳道2、5)。
表2.模型单特异性嵌合抗体的生产率。VH为抗体的重链可变结构域，VL为抗体轻链可变结构域，CH1为抗体的第一重链恒定结构域，CK为抗体轻链恒定结构域，b2M为β2微球蛋白，CD1b为CD1b蛋白的α3结构域.
图5显示在非还原条件下SDS凝胶电泳的结果。根据结果，来自第1组(图5A泳道1、2，图5B泳道1)和第3组(图5A泳道4、5，图5B泳道1)的抗体的电泳迁移率高于全长分子(图5B泳道2)，表明分子无法组装。尽管VH和VL序列从不同抗体获得，但来自第2组的抗体的电泳迁移率(图5B泳道2、3、4、5(与图5A泳道3相同))与全长分子的迁移率(图5B泳道2)一致。正如预期的那样，来自对照组的抗体组装(图5B泳道2，图5A泳道6(与图5B泳道6相同))。
所得数据表明，当链包括不同性质的恒定结构域时，基于MHC或MHC样蛋白膜近端结构域的二聚化单元可防止在重链和轻链之间形成不正确的对。
实施例6.包含MHC样二聚化单元的二价双特异性嵌合抗体的产生.
为验证主题方法作为用于使用任何一对抗原结合片段(下文的轻链和重链可变片段)组装双特异性分子的平台解决方案的普适性，我们从已知抗体中随机选择了3对轻链和重链可变片段(参见表3)，并使用它们产生6种双特异性嵌合抗体。表3显示产生蛋白的生产率结果。图6显示在非还原和还原条件下产生样品的SDS凝胶电泳结果。对于所有6个样品，存在对应于全长分子的约150kDa处的主泳带。表3还显示根据SE HPLC的样品纯度结果。
表3.使用基于来自MHC样蛋白膜近端结构域的结构域的二聚化单元产生的双特异性嵌合抗体的生产率和纯度.
实施例7.全长双特异性嵌合抗体基于Forte Bio Octert RED 384的亲和力测定
为验证产生的双特异性嵌合抗体没有丧失其抗原结合能力，我们基于Forte BioOctert RED 384进行了亲和力分析。对于抗体02-004和02-005，我们测量了对人类PD-1蛋白(hPD1ex-H6F)的胞外结构域和对在氨基酸序列中包含人类CD20序列的片段的生物素化肽[NH2]CEPANPSEKNSPSTQYCYSIQS[CH2CH2]生物素(在下文称为CD20肽)的亲和力；对于抗体02-006和02-007，我们测量了对人类PD-1蛋白(hPD1ex-H6F)的胞外结构域和对人类CSF1R蛋白(hCSF1R_His)的胞外结构域的亲和力；对于抗体02-008和02-009，我们测量了对人类CSF1R蛋白(hCSF1R_His)的胞外结构域和对CD20肽的亲和力。
具有C-末端His和FLAG标签的人类CSF1R蛋白的aa 20-512序列(分子量为57.4kDa)用作hCSF1R抗原。具有C-末端His和FLAG标签的人类PD-1蛋白的aa 21-170序列(分子量为20.6kDa)用作hPD-1ex-H6F抗原(参见表6)。
编码抗原的基因序列从头合成，克隆到表达载体中，在CHO细胞中产生并使用亲和层析纯化，如通用实施例中所述。
使用具有以下配方的动力学缓冲溶液(在下文称为1хKB)进行实验：4.3mMNa2HPO4；136.9mM NaCl、1.5mM KH2PO4；2.7mM KCl；添加Tween 20的体积分数为0.1％；添加BSA(牛血清白蛋白)的质量分数为0.1％；pH 7.4。在测量之前，用50mM甘氨酸和盐酸的溶液(pH1.8)再生ProA传感器(在再生溶液中5秒，在1xKB中5秒，重复3次)。
在hPD1ex-H6F和hCSF1R_His抗原的情况下，将蛋白A(ProA)生物传感器(ForteBio)浸入浓度为10μg/ml的抗体溶液中持续60秒以固定抗体。基线以1xKB记录60秒。然后将载有抗体的传感器浸入到含有靶抗原(分析物)在动力学缓冲液中的溶液的孔中持续90秒。对浓度为2.50μg/ml(121.4nM)、1.25μg/ml(60.7nM)、0.625μg/ml(30.35nM)的hPD1ex-H6F分析物溶液进行测量。对浓度为2.50μg/ml(43.6nM)、1.25μg/ml(21.8nM)和0.625μg/ml(10.9nM)的hCSF1R_His分析物溶液进行测量。然后，我们在1xKB中持续210s检测到hPD1ex-H6F的复合体解离，持续300s检测到hCSF1R_His的复合体解离。
参考传感器经历了如用于记录分析物传感图的传感器所进行的所有步骤，但缔合步骤除外-在缔合步骤，将传感器浸入没有分析物的1xKB溶液中(参考传感器信号与主要传感图的记录并行测量)。在传感图处理期间，从在与分析物相互作用的传感器上接收的信号中减去参考信号。
为检查分析物和传感器之间的非特异性相互作用，我们使用了无抗体传感器(在加载步骤，将传感器浸入1xKB溶液中；所有其他步骤与用于载有抗体的传感器的那些相同)。
在生物素化CD20肽的情况下，将浓度为5μg/ml的肽在SAX传感器(High PrecisionStreptavidin(SAX)生物传感器，ForteBio)表面固定120秒。基线以1xKB溶液记录120秒。将含有负载肽的传感器浸入到含有1xKB中的抗体溶液(分析物)的孔中持续15秒。对浓度为150μg/ml、75μg/ml和37.5μg/ml的分析物(CD20肽情况下的抗体)溶液进行测量。在1xKB中持续120秒记录复合体解离。
所有测量均在30℃下进行，轨道混合速度为1000转/分钟。
为获得动力学常数(kon为结合/缔合速率常数，kdis为解离速率常数，KD为平衡解离常数或亲和常数)的数值，使用ForteBio OctetData Analysis 9.0软件的Global Fit(选择一组kon、kdis、KD常数来分析不同浓度的几个传感图)，根据1:1相互作用模型处理所得传感图。结果如表4所示。
表4.抗体02-004-02-009与靶抗原之间相互作用的动力学常数kon、kdis、KD.
表5显示分析物和非负载传感器之间非特异性相互作用的验证结果。分析物和非负载传感器之间没有非特异性相互作用。
表5.分析物和非负载传感器之间非特异性相互作用的验证结果.
传感器类型 分析物 浓度,μg/ml 信号,nm
ProA hPD1ex-H6F 2.5 -0.023
ProA hCSF1R_His 2.5 -0.0038
SAX 02-004 150 0.017
SAX 02-005 150 0.0048
SAX 02-008 150 0.0173
SAX 02-009 150 0.0112
根据结果，所有双特异性嵌合抗体02-004-02-009均显示与靶抗原的特异性结合，并且无论相应抗原结合片段的位置如何(在Fab片段内或在包含取代CK和CH1结构域的β2微球蛋白和CD1b蛋白的α3结构域的Fab样片段内)，KD数值均具有相同的数量级。
实施例8.双特异性嵌合抗体与非靶抗原的非特异性结合分析
基于Forte Bio Octert RED 384进行了双特异性嵌合抗体与非靶抗原的非特异性结合的实验研究。
将蛋白A(ProA)生物传感器(ForteBio)浸入含有浓度为10μg/ml的抗体的溶液中持续150秒以固定抗体。基线以1xKB溶液记录30秒。然后将负载抗体的传感器浸入到含有浓度为30μg/ml的非靶抗原的孔中持续150秒。然后记录复合体解离持续30秒。
参考传感器经历了如用于记录分析物传感图的传感器所进行的所有步骤，但缔合步骤除外-在缔合步骤，将传感器浸入没有分析物的动力学缓冲溶液中(参考传感器信号与主要传感图的记录并行测量)。在传感图处理期间，从在与分析物相互作用的传感器上接收的信号中减去参考信号。
抗原组包括：hAng2_H6F、hPD1ex-H6F、hCSF1R_His、IL5R-His、hIL4R-His、hCD38-Avi、C-Avi-His-TEVs-HSA_hBCMA、Her3-H6F、hisOX40、猕猴属CSF1R_C-His(参见表6)。抗原组中的每种研究抗体均具有特异性(靶)抗原，与靶抗原相互作用的结果作为阳性对照给出。
使用ForteBio Octet Data Analysis 9.0软件处理传感图。为报告无非特异性相互作用，在缔合步骤结束时检查记录的信号水平(响应参数)。表7显示双特异性嵌合抗体结合的验证结果。实验显示抗体02-004-02-009与非靶抗原之间无相互作用。
表6.抗原组成
表7.本发明双特异性嵌合抗体非特异性结合的验证结果。该抗原组中的每种测试样品具有一种或多种特异性(靶)抗原，与靶抗原相互作用的结果作为阳性对照给出.
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实施例9.本发明双特异性嵌合抗体与两种抗原同时结合的分析.
基于Forte Bio Octet RED 384分析抗体02-006和02-007与两种不同靶抗原(hPD1ex-H6F和hCSF1R_His)的同时结合。实验基于AR2G传感器(Amine Reactive Second-Generation(AR2G)生物传感器，ForteBio)进行。实验步骤如表8所示。
表8.验证本发明双特异性嵌合抗体与两种不同抗原同时结合的实验步骤.
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将传感器在含有20mM EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和10mM sNHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺)的水溶液中活化300s。将抗原(hPD1ex-H6F)在pH 5.0的10mM醋酸钠缓冲液中加载到生物传感器的表面持续300s。待加载蛋白的浓度为15μg/ml。将传感器表面未反应的活性中心在pH 8.5的1M乙醇胺水溶液中淬灭300s。实验的第五步和所有后续步骤的基线在具有以下配方的动力学缓冲溶液(1xKB)中进行：4.3mM Na2HPO4；136.9mM NaCl、1.5mM KH2PO4；2.7mM KCl；添加Tween 20的体积分数为0.1％；添加BSA的质量分数为0.1％；pH 7.4。记录基线(步骤5)之后，将抗体加载到传感器上；待加载抗体的浓度为30μg/ml(步骤6)。然后记录第三基线(步骤7)。该步骤显示不存在快速信号衰减，表明负载的抗体与先前固定到传感器上的hPD1ex-H6F之间存在特异性相互作用。在缔合的下一步(步骤8)，将含有固定hPD1ex-H6F和结合抗体的传感器浸入到浓度为100μg/ml的hCSF1R_His抗原溶液中。该步骤的信号放大为由于存在加载到传感器上的抗体，即针对hCSF1R_His抗原的FAB片段所致。
使用ForteBio Octet Data Analysis 9.0软件分析传感图。主要结论如表9所示。显示实验步骤(阶段)的传感图如图7所示。根据结果，样品02-006和02-007显示与hPD1ex-H6F和hCSF1R_His抗原的同时结合。
表9.涉及抗体02-006和02-007与两种不同抗原(hPD1ex-H6F和hCSF1R_His)同时相互作用的实验结果.
根据结果，抗体02-006和02-007显示与hPD1ex-H6F和hCSF1R_His抗原同时结合。
实施例10.使用具有质谱检测的反相超高效液相色谱(RP UHPLC)分析本发明双特异性嵌合抗体的分子量
为证实分子的正确组装，我们对本发明全长双特异性嵌合抗体的分子量进行了分析。该方法使得有可能识别由4条不同链组成的本发明全长双特异性嵌合抗体，并将其与由另一组链形成的副产物区分开来。这些数据与实施例5中获得的数据相结合表明，涉及由来自MHC或MHC样蛋白的一对膜近端结构域取代一对恒定CH1-CK结构域的技术解决方案提供本发明双特异性嵌合抗体的正确组装。
使用Agilent 1290Infinity II UPLC Agilent 6530Q-T对色谱-质谱复合体基于BioResolve Polyphenyl RP柱(2.1x 50mm，粒径2.7μm；也使用BioResorve Polyphynyl RP预柱，2.1x 5mm，粒径2.7μmm)进行分析。在分析之前，用PNGase F(Promega)酶处理所有分子以去除N-聚糖。为此，用水将酶稀释至1单位活性/μl的浓度。将蛋白含量为120μg的样品与缓冲溶液(100mM碳酸氢铵pH 7.2)混合，以1单位:50μg的酶:蛋白比率加入PNGase F溶液，将混合物在(37.0±0.1)℃下于恒温器中温育18小时。
为进行分析，根据测量的蛋白浓度选择10μg测试溶液，并用流动相A将浓度调节至0.2mg/ml。样品输入体积为7μl。
在分析之前，以流动相A:95％、B:5％(流动相A含有0.1％甲酸溶液、0.02％三氟乙酸水溶液，流动相B含有0.1％甲酸溶液、30％乙腈/异丙醇)的初始比率用流动相平衡色谱系统至少30min，直至达到稳定压力。根据制造商指南，使用校准标准校准质谱仪。
在(60±1)℃的柱温下，以0.5ml/min的流速和流动相B浓度梯度(样品引入后5-6分钟为5％-27％，之后6-30分钟为27％-37％)分离样品，在280nm的波长下得到色谱图。
数据以PMi Intact软件处理。
双特异性嵌合抗体中包括的链名称如表10所示。
表10.双特异性嵌合抗体02-004-02-009中包括的链名称.
抗体02-004、02-006、02-009(作为最具代表性的抗体)的质量分析结果如表11所示。而且，图8显示抗体02-004的总离子流色谱图的峰4-6的去卷积质谱的图像，其余抗体的峰看起来相似。
对于每种抗体，该表显示相应色谱峰处的物质质量；对这些峰进一步注释，导致鉴定包括在一定质量片段中的链。所有样品中的质量分布相似：主峰在146kDa，和较小质量峰为约23kDa(对应于单个轻链的质量)和约74kDa(对应于重链和轻链异源二聚体)。基于平均质量的理论值注释主峰。
抗体02-004的峰4未通过软件注释，因为设定包括假设所有N-末端谷氨酰胺均呈焦(pyro)形式(相应地，焦谷氨酰胺的质量比谷氨酰胺少18Da)。因此，在峰4获得的质量对应于在峰5注释的分子质量，其中N-末端谷氨酰胺之一呈非焦(non-pyro)形式。
02-004抗体的峰5和6具有3个质量，对应于全长分子和全长分子的两种无赖氨酸形式(缺失一个C-末端半胱氨酸和两个C-末端赖氨酸)。在抗体02-006和02-009中，质量分布呈类似方式。
表11.总离子流色谱峰的注释。抗体和链名称之间的对应关系如表10所示。“-Lys(1)”表示缺失重链的一个C-末端赖氨酸，“-Lys(2)”表示缺失重链的两个C-末端赖氨酸.
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综上所述，结果显示全长双特异性嵌合抗体的质量对应于由4条不同链组成的分子的质量。而且，制备物包括低分子量片段，但其为较小的。
实施例11.使用蛋白水解和所得片段的质量分析证实本发明双特异性嵌合抗体的正确组装
为直接验证轻链和重链之间的正确配对，本发明的双特异性嵌合抗体通过其识别位点位于抗体铰链区(…KSCDK/THTCPPCP…)中的GingisKHAN蛋白酶(Genovis)切割。这种蛋白水解导致全长抗体分解成Fc片段、Fab片段和包含取代CK和CH1结构域的β2-微球蛋白和CD1b蛋白的α3结构域的Fab样片段。在非还原条件下使用垂直电泳在蛋白水解后分析双特异性分子的片段；而且，所得片段进行质谱分析。
蛋白水解反应混合物含有在由100mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM半胱氨酸组成的缓冲液中的40μg双特异性抗体和40单位GingisKHAN酶(比率为1酶单位:1μg蛋白)，体积为60μl。反应在(37.0±0.1)℃下于恒温器中进行1小时，并通过添加浓度为10mM的碘乙酰胺停止。对于电泳，将含有SDS(浓度高达1％SDS)的缓冲液添加至所得样品中，并在非还原条件下进行SDS凝胶电泳。
图9显示SDS凝胶电泳的结果。用GingisKHAN蛋白酶处理双特异性嵌合抗体(02-004-02-009)后，形成3种主要片段，其在电泳图中观察到在40-50kDa区域，并在聚丙烯酰胺凝胶中显示不同的迁移率。含有(01-011)且不含基于MHC样蛋白CD1b(帕洛利单抗，奥瑞珠单抗)膜近端结构域的二聚化单元的单特异性分子也用GingisKHAN蛋白酶处理(图9B，泳道3、4、5)。作为比较由于片段蛋白水解而形成的电泳迁移率的结果，结论是显示最低迁移率水平的片段对应于Fc片段，中等迁移率对应于Fab片段，显示最高迁移率水平的片段对应于包含取代CK和CH1结构域的β2微球蛋白和CD1b蛋白α3结构域的Fab样片段。在抗体02-006-02-009的情况下，电泳图显示由于抗CSF1R片段可变结构域的非特异性切割而形成的另一个片段。为确定由于蛋白水解而形成的片段的精确质量，我们进行了质谱分析。
在质谱分析之前，根据制造商指南，在加入碘乙酰胺后立即将样品转移至Zeba(MWCO 7kDa)柱上的50mM碳酸氢铵pH(7.6±0.2)；之后，以1酶单位:50μg蛋白的比率将PNGase F添加至样品中，并将样品在(37.0±0.1)℃下于恒温器中温育18小时。
根据实施例10中描述的方法进行所得片段的质量分析。
具有质谱检测的RP UHPLC结果如表12所示。
抗体02-006和02-008显示11,424Da和37,035Da的片段，总计48,459Da，对应于包含取代CK和CH1结构域的β2微球蛋白和CD1b蛋白的α3结构域以及针对CSF1R的轻链和重链可变片段的Fab样片段的质量。抗体02-007和02-009显示11,424Da和36,062Da的片段，总计47,486Da，对应于具有针对CSF1R的轻链和重链可变片段的Fab片段的质量，这与这些样品的SDS凝胶电泳后获得的数据一致，并且证实了针对CSF1R的可变结构域中存在假定的进一步蛋白水解位点(图9)。
表12.总离子流色谱峰的注释。表10显示样品和链名称之间的对应关系。Npart为通过GingisKHAN蛋白酶切割全长抗体后形成的相应链的N-末端部分，Cpart为通过GingisKHAN蛋白酶切割全长双特异性嵌合抗体后形成的相应链的C-末端部分。
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在样品02-009的情况下质量97811.8 Da和97693 Da对应于具有一个截短的Fab样片段的分子。
结果表明，本发明的所有双特异性嵌合抗体在蛋白水解后均分解成质量对应于Fc片段、Fab片段和包含取代CK和CH1结构域的β2微球蛋白和CD1b蛋白的α3结构域的Fab样片段的片段，表明基于由来自MHC或MHC样蛋白的一对膜近端结构域取代一对CH1-CK恒定结构域的技术解决方案提供本发明双特异性嵌合抗体的正确组装。
实施例12.验证基于MHC样蛋白膜近端结构域的二聚化单元中氨基酸取代对嵌合抗体热稳定性的影响.
我们进一步测试了二聚化单元中的各种取代及其对所得嵌合抗体的纯度和稳定性的影响。进行测试的单特异性格式为由两条重链和两条轻链组成的抗体，其中重链CH1和轻链CK结构域分别由β2微球蛋白和CD1b蛋白的α3结构域取代(二聚化单元的正向取向)。VH和VL可变结构域的序列从抗体帕洛利单抗(CJSC Biocad)获得。表13所示的突变引入到β2微球蛋白和CD1b蛋白α3结构域的序列中。CD1b蛋白α3结构域的序列进一步包含表13所示的C-末端延伸。表13显示从二聚化单元开始的其中引入突变的位置编号，并且进一步显示根据抗体链氨基酸EU编号来编号的位置对应关系(Edelman G.M.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1969),pp.78-85；Kabat,E.A.,等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,NationalInstitutes ofHealth,Bethesda,MD,(1991)。以下显示从二聚化单元开始的其中引入取代的位置编号；铰链区中的取代位置根据EU编号。
表13.基于β2微球蛋白和CD1b蛋白α3结构域的二聚化单元突变变体的描述.
图10显示产生的抗体的非还原性SDS凝胶电泳结果。将帕洛利单抗(经典IgG1)样品和01-011样品(具有基于MHC样蛋白膜近端结构域的初始二聚化单元的样品，参见实施例5)作为对照分别施用到泳道1和2上(图10A和10B)。结果表明，所有修饰样品主要片段的迁移率对应于全长分子(参见图10A泳道3-8，图10B泳道3-4)，因此，表明引入的修饰并不影响全长分子的组装。SE HPLC(表14)显示，一些修饰导致单体含量降低，低分子片段数量增加(抗体03-001、03-003、03-005、03-006、03-007)；然而，其中一些显示单体百分比增加(03-002、03-004、03-008)。进一步地，我们通过所得抗体的动态光散射分析了聚集温度；结果也显示在表14中。
表14.包含基于MHC样蛋白膜近端结构域的修饰二聚化单元的单特异性嵌合抗体的生产率、纯度和聚集温度.
结果表明，与基于MHC样蛋白的二聚化单元的非修饰变体相比较，根据SE HPLC显示相对单体含量增加的抗体变体进一步显示聚集温度增加。

Claims (57)

1.一种二价双特异性嵌合抗体，其中所述抗体包含：
a)特异性地结合于第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链；
其中第一轻链包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域；
其中第一重链包含抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域，所述重链恒定结构域包括第一(CH1)重链恒定结构域及包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体；
b)特异性地结合于第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，
其中第二轻链包含轻链可变结构域和选自以下的恒定结构域：
MHC(主要组织相容性复合体)的第一膜近端结构域或
MHC样蛋白的第一膜近端结构域；
其中第二重链包含重链可变结构域、选自以下的恒定结构域：
MHC(主要组织相容性复合体)的第二膜近端结构域或
MHC样蛋白的第二膜近端结构域；
和包含第二(CH2)和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体；
其中MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC或MHC样蛋白的第二膜近端结构域在其间形成通过二硫键稳定的异源二聚体；
其中一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域以其表面彼此接触，经修饰形成二价双特异性嵌合抗体，所述重链CH3结构域中的修饰为促进异源二聚化的取代。
2.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC的第一膜近端结构域可选自：
MHC I类(主要组织相容性复合体I类)的第一膜近端结构域，
MHC II类(主要组织相容性复合体II类)的第一膜近端结构域，
MHC I类第一膜近端结构域的修饰变体或
MHC II类第一膜近端结构域的修饰变体。
3.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC的第二膜近端结构域可选自：
MHC I类(主要组织相容性复合体I类)的第二膜近端结构域，
MHC II类(主要组织相容性复合体II类)的第二膜近端结构域，
MHC I类第二膜近端结构域的修饰变体或
MHC II类第二膜近端结构域的修饰变体。
4.权利要求2-3中任何一项的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC II类选自：HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ或HLA-DR。
5.权利要求2-3中任何一项的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC I类选自：HLA-A、HLA-B、HLA-С、HLA-E、HLA-F或HLA-G。
6.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC样蛋白的第一膜近端结构域可选自：
CD1(分化簇1)的第一膜近端结构域，
HFE(血色素沉着蛋白)的第一膜近端结构域，
CD1第一膜近端结构域的修饰变体或
HFE第一膜近端结构域的修饰变体。
7.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC样蛋白的第二膜近端结构域可选自：
CD1(分化簇1)的第二膜近端结构域，
HFE(血色素沉着蛋白)的第二膜近端结构域，
CD1第二膜近端结构域的修饰变体或
HFE第二膜近端结构域的修饰变体。
8.权利要求6-7中任何一项的二价双特异性嵌合抗体，其中CD1选自：CD1a、CD1b、CD1c、CD1d或CD1e。
9.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中第二轻链(VL)的可变片段通过1-25个氨基酸长的接头与MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域隔开和/或第二重链(VH)的可变片段通过1-25个氨基酸长的接头与MHC或MHC样蛋白的第二膜近端结构域隔开。
10.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中
a)一条重链的CH3结构域经修饰使得在接触二价双特异性抗体中另一条重链CH3结构域的表面的一条重链CH3结构域的表面上，氨基酸残基由具有更大侧链体积的氨基酸残基取代，导致在一条重链CH3结构域的表面形成旋钮，其可放入到另一条重链CH3结构域表面的孔中，
和
b)另一条重链的CH3结构域经修饰使得在接触二价双特异性抗体中第一重链CH3结构域的表面的第二重链CH3结构域的表面上，氨基酸残基由具有更小侧链体积的氨基酸残基取代，导致在第二重链CH3结构域的表面形成孔，其可接受第一重链CH3结构域界面的旋钮；
其中所述具有更大侧链体积的氨基酸残基选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)，
和其中所述具有更小侧链体积的氨基酸残基选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)。
11.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中抗体第一轻链的恒定结构域选自CK或CL。
12.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中抗体的CH3结构域通过将半胱氨酸(C)作为氨基酸引入到每个CH3结构域的相应位置使得可在两个CH3结构域之间形成二硫桥而进一步修饰。
13.权利要求10的二价双特异性嵌合抗体，其中一条重链的CH3结构域被修饰以形成旋钮，和另一条重链的CH3结构域被修饰以形成孔，或反之亦然。
14.权利要求13的二价双特异性嵌合抗体，其中一条重链的CH3结构域具有氨基酸取代S354C/T366W，和另一条重链的CH3结构域具有氨基酸取代Y349C/T366S/L368A/Y407V；或
一条重链的CH3结构域具有氨基酸取代Y349C/T366S/L368A/Y407，和另一条重链的CH3结构域具有氨基酸取代S354C/T366W。
15.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的MHC II的α2结构域和MHC II的β2结构域。
16.权利要求15的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC II的α2结构域具有选自SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38的氨基酸序列，和MHCII的β2结构域具有选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQID NO:39的氨基酸序列。
17.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的MHC II的β2结构域和MHC II的α2结构域。
18.权利要求17的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC II的β2结构域具有选自SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:39的氨基酸序列，和MHCII的α2结构域具有选自SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36或SEQID NO:38的氨基酸序列。
19.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的MHC II的α2结构域修饰变体和MHC II的β2结构域修饰变体；或
其中MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的MHC II的β2结构域修饰变体和MHC II的α2结构域修饰变体；或
其中MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的MHC I的α3结构域和β2微球蛋白(β2Μ)。
20.权利要求19的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC I的α3结构域具有选自SEQ ID NO:1-29的氨基酸序列，和β2微球蛋白(β2Μ)具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
21.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的β2微球蛋白(β2Μ)和MHC I的α3结构域。
22.权利要求21的二价双特异性嵌合抗体，其中β2微球蛋白(β2Μ)具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列和MHC I的α3结构域具有选自SEQ ID NO:1-29的氨基酸序列。
23.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的MHC I的α3结构域修饰变体和β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体；或
其中MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体和MHC I的α3结构域修饰变体。
24.权利要求23的二价双特异性嵌合抗体，其中β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体具有选自SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
25.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的CD1的α3结构域和β2微球蛋白(β2Μ)。
26.权利要求25的二价双特异性嵌合抗体，其中CD1的α3结构域具有选自SEQ ID NO:40-44的氨基酸序列，和β2微球蛋白(β2Μ)具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
27.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的β2微球蛋白(β2Μ)和CD1的α3结构域。
28.权利要求27的二价双特异性嵌合抗体，其中β2微球蛋白(β2Μ)具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列，和CD1的α3结构域具有选自SEQ ID NO:40-44的氨基酸序列。
29.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的CD1的α3结构域修饰变体和β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体。
30.权利要求29的二价双特异性嵌合抗体，其中CD1的α3结构域修饰变体具有选自SEQID NO:49-56的氨基酸序列，和β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体具有选自SEQ ID NO:47或SEQID NO:48的氨基酸序列。
31.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体和CD1的α3结构域修饰变体。
32.权利要求31的二价双特异性嵌合抗体，其中β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体具有选自SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48的氨基酸序列，和CD1的α3结构域修饰变体具有选自SEQ IDNO:49-56或SEQ ID NO:109的氨基酸序列。
33.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的HFE的α3结构域和β2微球蛋白(β2Μ)。
34.权利要求33的二价双特异性嵌合抗体，其中HFE的α3结构域具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和β2微球蛋白(β2Μ)具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
35.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的β2微球蛋白(β2Μ)和HFE的α3结构域。
36.权利要求35的二价双特异性嵌合抗体，其中β2微球蛋白(β2Μ)具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列，和HFE的α3结构域具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
37.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的HFE的α3结构域修饰变体和β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体；或
其中MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC样蛋白的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体和HFE的α3结构域修饰变体。
38.权利要求37的二价双特异性嵌合抗体，其中β2微球蛋白(β2Μ)修饰变体具有选自SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
39.权利要求2-3、6-7、19、23、29、31和37中任何一项的二价双特异性嵌合抗体，其中修饰变体是指包括半胱氨酸(C)取代，以在由MHC或MHC样蛋白的第一和第二膜近端结构域产生的异源二聚体链之间形成二硫桥的变体；或
其中修饰变体是指在MHC或MHC样蛋白膜近端结构域的多个位置包括一个或多个取代，导致热力学稳定性Tm分别与野生型MHC或MHC样蛋白的膜近端结构域相比较提高多于1摄氏度的变体；或
其中修饰变体是指在MHC或MHC样蛋白膜近端结构域的多个位置包括一个或多个取代，导致聚集体的量分别与野生型MHC或MHC样蛋白的膜近端结构域相比较在高于10mg/ml的浓度下减少多于5％的变体；或
其中修饰变体是指在MHC或MHC样蛋白膜近端结构域的多个位置包括一个或多个取代，导致分别与野生型MHC或MHC样蛋白的膜近端结构域相比较去除糖基化位点的变体。
40.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中第一轻链可变结构域和第二轻链可变结构域为相同的。
41.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中Fc片段属于IgG。
42.权利要求41的二价双特异性嵌合抗体，其中Fc片段同种型选自人类IgG1、IgG2或IgG4。
43.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中在Fc片段单体中进一步引入取代，导致二价双特异性抗体缺少ADCC、CDC和/或ADCP特性。
44.权利要求43的二价双特异性嵌合抗体，其中在Fc片段单体中进一步引入LALA取代(L234A和L235A)。
45.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中在Fc片段单体中进一步引入导致抗体活性延长的取代。
46.权利要求45的二价双特异性嵌合抗体，其中在Fc片段单体中进一步引入YTE取代(M252Y、S254T和T256E)。
47.权利要求43的二价双特异性嵌合抗体，其中在Fc片段单体中进一步引入取代E345R。
48.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其特异性地结合于CD20和CD3；或
其特异性地结合于BCMA和CD3；或
其特异性地结合于PD-L1和CD47；或
其特异性地结合于凝血因子9(FIX)和凝血因子10(FX)；或
其特异性地结合于GD2和CD3；或
其特异性地结合于AXL和CD3；或
其特异性地结合于PD-L1和TGFβ。
49.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC或MHC样蛋白的第二膜近端结构域在其间形成异源二聚体，所述异源二聚体借助于第一和/或第二膜近端结构域中的一个或多个突变以在MHC或MHC样蛋白的第一和第二膜近端结构域之间形成S-S键(二硫半胱氨酸桥)，而通过二硫键稳定。
50.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和MHC或MHC样蛋白的第二膜近端结构域在其间形成异源二聚体，所述异源二聚体借助于将MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域在C-末端延伸一个或多个(1-10个)氨基酸并在C-末端具有末端Cys以在MHC或MHC样蛋白的第一膜近端结构域和铰链之间形成S-S键(二硫键、半胱氨酸桥)的延伸，而通过二硫键稳定。
51.权利要求50的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC或MHC样蛋白第一膜近端结构域的延伸为GSC。
52.一种分离的核酸，其编码权利要求1-51中任何一项的二价双特异性嵌合抗体。
53.权利要求52的分离核酸，其中核酸为DNA。
54.一种包含权利要求52-53中任何一项的核酸的表达载体。
55.一种用于产生权利要求1-51中任何一项的二价双特异性嵌合抗体的宿主细胞的产生方法，其包括用权利要求54的载体转化细胞。
56.一种用于产生权利要求1-51中任何一项的二价双特异性嵌合抗体的宿主细胞，其包含权利要求52-53中任何一项的核酸。
57.一种用于产生权利要求1-51的二价双特异性嵌合抗体的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)用以下表达载体转化所述宿主细胞：
-包含编码双特异性嵌合抗体的第一轻链和第一重链的核酸分子的表达载体，
-包含编码双特异性嵌合抗体的第二轻链和第二重链的核酸分子的表达载体，
b)在适合于合成所述二价双特异性嵌合抗体的条件下培养所述宿主细胞；和
c)从细胞培养物中分离所述二价双特异性抗体。
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