KR20130127547A

KR20130127547A - 항원성 타우 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20130127547A
Application number: KR1020137028550A
Authority: KR
Inventors: 3세 조지 조셉 스미스; 켄네스 넬슨 윌스; 제프 시안카오 주
Original assignee: 화이자 백신스 엘엘씨
Priority date: 2009-07-30
Filing date: 2010-07-20
Publication date: 2013-11-22
Also published as: NZ598356A; CO6612199A2; JP2013500326A; AU2010277254A1; TW201436804A; KR20120049900A; AU2010277254B2; SG177637A1; PE20120817A1; US20110177109A1; MX2012001194A; NZ618391A; CA2768346A1; WO2011013034A4; CN102596236B; WO2011013034A1; RU2014112002A; RU2518291C2; RU2012102701A; AR078085A1

Abstract

본 발명은 타우(tau)-관련된 신경 질환의 치료를 위한, 바람직하게는 면역원성 담체에 결합된 항원성 타우 펩타이드를 포함하는 면역원 및 조성물에 관한 것이다. 상기 명세는 또한 상기 면역원 및 조성물의 제조 방법 및 약물에서 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

항원성 타우 펩타이드 및 이의 용도{ANTIGENIC TAU PEPTIDES AND USES THEREOF}

본 발명은 타우(tau)-관련된 신경 질환 또는 병, 예를 들어 알쯔하이머 병 및 경도 인지 장애의 치료를 위한, 면역원성 담체, 예를 들어 바이러스 유사 입자(VLP)에 결합된 항원성 타우 펩타이드를 포함하는 면역원, 면역원성 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 명세는 또한 상기 면역원, 면역원성 조성물 및 약학 조성물의 제조 방법 및 약물에서 이들의 용도에 관한 것이다.

알쯔하이머 치매 또는 AD라고도 지칭되는 알쯔하이머 병은 기억 상실 및 심각한 정신 황폐를 유발하는 진행성 신경퇴행성 질환 또는 병이다. AD는 가장 통상적인 형태의 치매이며, 모든 치매의 절반을 넘게 차지한다. 세계적으로 2600만명 이상의 사람들이 AD의 영향으로 고통받고 있으며, 이 수는 연령대가 증가함에 따라 2050년까지 4 배가 될 것으로 예상된다(Brookmeyer et al., Alzheimer's & Dementia 3:186-191 (2007)). 생명의 상실 및 감소된 삶의 질 이외에, 진단 이후 평균적으로 AD 환자가 8 내지 10 년을 살고 높은 수준의 매일 치료를 필요로 하는 경우 사회에 지불되는 경제적 비용은 막대하다. 초기에, 가벼운 기억 상실 및 혼동을 호소하는 환자는 경도 인지 장애(MCI)(일부의 경우 알쯔하이머병의 전통적인 증상으로 진행하여, 지적 및 사회적 능력의 중증 장애를 발생시킨다)를 앓는 것을 특징으로 한다.

알쯔하이머 병(AD)은 전형적으로는 뇌의 초로성 반점과 신경섬유 매듭의 축적을 특징으로 하며, 이는 신경세포의 사멸에 이은 진행성 인지 감퇴를 발생시킨다. AD에 대해 현재 이용할 수 있는 요법들의 대부분은 상기 증상들에 대한 치료에 초점을 두지만, 이들 요법은 상기 질병의 진행을 반드시 멈추게 하지는 않는다. 따라서, 뉴런을 AD의 쇠약 효과로부터 보호할 수 있는 요법을 확인하기 위한 새로운 접근법들이 바람직함은 분명하다.

AD 치료를 위한 대부분의 현행 치료학적 접근법들은 광범위하게 인정된 "아밀로이드 연쇄 가설"에 근거 한다. 이 개념은 병태생리적 역할을, 단량체 내지 올리고머 형태의 신경- 및 시냅스 독소로서 뿐만 아니라 AD 병리학의 특징적인 특징들 중 하나인 아밀로이드 반점 중에 중합체로서 침착되는 아밀로이드-β(Aβ)로 돌리고 있다. 상기 범위의 Aβ 형태에 대한 단클론 항체는 뇌-혈액 평형을 혈액쪽으로 이동시켜 뇌 Aβ 저장소를 고갈시키므로 효능 있는 것으로 여겨진다.

AD의 병태생리는 노인성 반점에의 Aβ의 침착 이상의 것을 특징으로 하며, 신경섬유 매듭(NFT)의 축적을 또한 포함한다. NFT는 과인산화된 타우 단백질과 함께 결합되는 쌍 나선 필라멘트에 의해 형성된 원 섬유이다. 타우는 30 개 초과의 상이한 세린 및 쓰레오닌 잔기(Hanger et al., J. Neurochem. 71:2465-2476 (1998)) 뿐만 아니라 여러 타이로신 잔기(Lebouvier et al, JAD 18: 1-9 (2009))에서 다양한 키나제에 의해 일시적으로 인산화될 수 있다. AD에서, 명백히 키나제와 포스파타제 활성의 불균형이 존재하여, NFT로서 응집하고 축적되는 과인산화된 형태의 타우 단백질이 생성된다.

경도 인지 장애(MCI)는 노화에 대해 통상적으로 예상되는 것 이상의 무시할 수 없는 기억력 장애를 갖지만 아직 치매나 AD의 다른 징후들은 보이지 않는 것으로서 가장 통상적으로 정의된다. MCI는 정상적인 노화 및 초기 치매와 관련된 인지 변화 사이의 과도적인 상태를 나타내는 것으로 보인다. 기억력 상실이 우세한 징후인 경우, 상기 유형의 MCI는 기억 상실성 MCI로서 추가로 세부 정의된다. 이러한 하위유형의 MCI를 갖는 개인들은 아마도 매년 대략 10 내지 15%의 비율로 AD로 진행하는 듯하다(Grundman M et al, Arch Neurol. 61, 59-66, 2004). 2005년에 공개된 대규모 연구는 시험 첫 해 동안 MCI 환자의 치료가 AD로의 변이를 지연시킬 수 있음을 입증한 첫 번째 임상 시험이며(Petersen RC et al, NEJM 352, 2379-2388, 2005), 이는 상기 환자들이 또한 AD에 대한 치료 중재에 실행가능한 집단을 나타냄을 가리킨다.

최근의 연구는 병리학적 타우의 매듭(tangle) 마우스 모델에서 인산화된 타우 펩타이드에 대한 백신화가 뇌 중의 응집된 타우의 감소 및 매듭-관련된 행동 결손의 개선을 생성시킴을 보고하였다(Asuni et al., J. Neurosci . 27:9115-9129 (2007)). AD의 인지 상실 및 진행에 대한 과인산화된 타우 및 NFT의 영향이 완전히 이해된 것은 아니지만, 최근의 의견은 아밀로이드만 표적화하는 것은 상기 질병의 과정에 걸쳐 개선을 보이기에 충분하지 않을 것이며, 이는 추가적이거나 대안적인 표적화를 필요로 하게 할 것임을 암시한다(Oddo et al., J. Biol . Chem. 281:39413 (2006)). 이것을 고려할 때, 상기 타우 단백질의 질병 형태를 표적화하는 활성 백신 접근법은 AD 및 MCI에 대한 유효 치료 백신의 생성을 필요로 할 수도 있다.

더욱 또한, AD 및 MCI 외에, 관련된 병리학적 형태들을 특이적으로 표적화하는 타우 백신이 잠재적으로 이로울 수 있는 타우 병리학 또는 "타우병증"과 또한 관련 있는 다수의 질병이 존재한다. 이들 질병으로는 전측두엽 치매, 파킨슨병, 픽병, 진행성 핵상 마비, 및 근위축성 측삭 경화증/파킨슨증-치매 복합체를 들 수 있다(예를 들어 문헌[Spires - Jones et al., TINS 32:150-9(2009)]을 참조하시오).

본원은 면역 반응, 특히 항체 반응을 유도하여, 병리학적으로 과인산화된 상태의 자기-항원 타우에 대해 항체 역가를 이끌어낼 수 있는 하나 이상의 항원성 타우 펩타이드를 포함하는 신규의 면역원, 면역원성 조성물 및 약학 조성물을 제공한다. 상기와 같은 면역원, 면역원성 조성물 및 약학 조성물은 다수의 바람직한 성질들, 예를 들어 과인산화된 타우와 관련된 신경퇴행성 질병, 예를 들어 알쯔하이머병 및 MCI의 유도 및 발병에 대한 치료 효과와 함께 면역 반응, 특히 항체 반응을 유도하는 능력을 나타낸다.

하나의 태양에서, 상기 명세는 면역원성 담체에 결합된 하나 이상의 항원성 타우 펩타이드를 포함하는 면역원을 제공하며, 이때 상기 항원성 타우 펩타이드는 pSer-396 포스포-타우 에피토프, pThr-231/pSer-235 포스포-타우 에피토프, pThr-231 포스포-타우 에피토프, pSer-235 포스포-타우 에피토프, pThr-212/pSer-214 포스포-타우 에피토프, pSer-202/pThr-205 포스포-타우 에피토프, 및 에피토프로부터 선택된 포스포-타우 에피토프를 포함한다.

일례로, 상기 포스포-타우 에피토프는 pSer-396 포스포-타우 에피토프이다. 추가의 예에서, 상기 포스포-타우 에피토프는 pThr-231/pSer-235 포스포-타우 에피토프이다. 추가의 예에서, 상기 포스포-타우 에피토프는 pThr-231 포스포-타우 에피토프이다. 추가의 예에서, 상기 포스포-타우 에피토프는 pSer-235 포스포-타우 에피토프이다. 추가의 예에서, 상기 포스포-타우 에피토프는 pThr-212/pSer-214 포스포-타우 에피토프이다. 추가의 예에서, 상기 포스포-타우 에피토프는 pSer-202/pThr-205 포스포-타우 에피토프이다. 추가의 예에서, 상기 포스포-타우 에피토프는 pTyr18 포스포-타우 에피토프이다.

또 다른 태양에서, 본원은 면역원성 담체에 결합된 하나 이상의 항원성 타우 펩타이드를 포함하는 면역원을 제공하며, 이때 상기 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 4, 6 내지 26, 105 및 108 내지 112로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

일례로, 상기 항원성 타우 펩타이드는 식 (G)_nC로 나타내는 연결기에 의해 상기 면역원성 담체에 공유 결합되며, 이때 상기 연결기는 상기 펩타이드의 C-말단(펩타이드-(G)_nC) 또는 N-말단(C(G)_n-펩타이드)에 있고, n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 추가의 예에서, 상기 연결기는 상기 타우 펩타이드의 N-말단에 있고 이때 n은 1 또는 2이다. 또 다른 예에서, 상기 연결기는 상기 타우 펩타이드의 C-말단에 있고 이때 n은 1 또는 2이다. 추가의 예에서, 상기 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 4 및 6 내지 13으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 예에서, 상기 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 4 및 6 내지 13으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다. 추가의 예에서, 상기 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 11에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진다.

또 다른 예에서, 상기 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 14 내지 19로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 예에서, 상기 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 14 내지 19로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다. 추가의 예에서, 상기 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 16에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진다.

또 다른 예에서, 상기 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 20 내지 24로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 예에서, 상기 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 20 내지 24로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다. 추가의 예에서, 상기 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 21에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진다.

또 다른 예에서, 상기 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 105 및 108 내지 112로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 예에서, 상기 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 105 및 108 내지 112로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다. 추가의 예에서, 상기 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 105에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진다.

하나의 태양에서, 본원은 본 발명에 개시된 면역원들 중 임의의 것을 제공하며, 이때 상기 면역원성 담체는 헤모시아닌(예를 들어 KLH), 혈청 알부민, 글로불린, 회충으로부터 추출된 단백질, 또는 불활성화된 세균 독소이다.

하나의 태양에서, 본원은 본 발명에 개시된 면역원들 중 임의의 것을 제공하며, 이때 상기 면역원성 담체는 HBcAg VLP, HBsAg VLP, 및 Q베타 VLP로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 유사 입자이다. 일례로, 상기 명세는 본 발명에 개시된 바와 같은 2 개 이상의 면역원을 포함하는 조성물을 제공한다. 추가의 예에서, 상기 조성물은 본 발명에 개시된 바와 같은 3 개 이상의 면역원을 포함한다.

일례로, 본원은 본 발명에 개시된 바와 같은 2 개 이상의 면역원을 포함하는 조성물을 제공하며, 이때

a) 제 1 면역원의 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 4 및 6 내지 13으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고;

b) 제 2 면역원의 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 14 내지 19로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.

또 다른 예에서, 본원은 본 발명에 개시된 바와 같은 2 개 이상의 면역원을 포함하는 조성물을 제공하며, 이때

b) 제 2 면역원의 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 20 내지 24로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.

a) 제 1 면역원의 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 14 내지 19로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고;

추가의 예에서, 본원은 본 발명에 개시된 바와 같은 2 개 이상의 면역원을 포함하는 조성물을 제공하며, 이때

b) 제 2 면역원의 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 105 및 108 내지 112로부터 선택된다.

a) 제 1 면역원의 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 20 내지 24로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고;

또 다른 예에서, 상기 명세는 본 발명에 개시된 바와 같은 4 개의 면역원 중 3 개 이상을 포함하는 조성물을 제공하며, 이때

b) 제 2 면역원의 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 14 내지 19로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고;

c) 제 3 면역원의 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 20 내지 24로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고;

d) 제 4 면역원의 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 105 및 108 내지 112로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.

추가의 예에서, 상기 명세는 본 발명에 개시된 조성물들 중 임의의 것을 제공하고, 이때 각각의 상기 항원성 타우 펩타이드는 독립적으로 식 (G)_nC로 나타내는 연결기에 의해 상기 면역원성 담체에 공유 결합되며, 이때 각각의 상기 연결기는 독립적으로 상기 타우 펩타이드의 C-말단(펩타이드-(G)_nC) 또는 N-말단(C(G)_n-펩타이드)에 있고, 각각의 n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 추가의 예에서, 상기 명세는 본 발명에 개시된 조성물들 중 임의의 것을 제공하며, 이때 각각의 상기 연결기는 상기 타우 펩타이드의 N-말단에 있고 이때 각각의 n은 독립적으로 1 또는 2이다.

또 다른 태양에서, 본원은 4 개의 면역원 중 3 개 이상을 포함하는 조성물을 제공하며, 이때

a) 제 1 면역원은 Q베타 VLP에 결합된 하나 이상의 항원성 타우 펩타이드를 포함하고, 이때 상기 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 11로 이루어지며, 이때 상기 펩타이드는 식 (G)_nC로 나타내는 연결기에 의해 상기 VLP에 공유 결합되고, 이때 상기 연결기는 상기 타우 펩타이드의 C-말단(펩타이드-(G)_nC) 또는 N-말단(C(G)_n-펩타이드)에 있으며, n은 1 또는 2이고;

b) 제 2 면역원은 Q베타 VLP에 결합된 하나 이상의 항원성 타우 펩타이드를 포함하고, 이때 상기 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 16으로 이루어지며, 이때 상기 펩타이드는 식 (G)_nC로 나타내는 연결기에 의해 상기 VLP에 공유 결합되고, 이때 상기 연결기는 상기 타우 펩타이드의 C-말단(펩타이드-(G)_nC) 또는 N-말단(C(G)_n-펩타이드)에 있으며, n은 1 또는 2이고;

c) 제 3 면역원은 Q베타 VLP에 결합된 하나 이상의 항원성 타우 펩타이드를 포함하고, 이때 상기 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 21로 이루어지며, 이때 상기 펩타이드는 식 (G)_nC로 나타내는 연결기에 의해 상기 VLP에 공유 결합되고, 이때 상기 연결기는 상기 타우 펩타이드의 C-말단(펩타이드-(G)_nC) 또는 N-말단(C(G)_n-펩타이드)에 있으며, n은 1 또는 2이고;

d) 제 4 면역원은 Q베타 VLP에 결합된 하나 이상의 항원성 타우 펩타이드를 포함하고, 이때 상기 항원성 타우 펩타이드는 서열번호 105로 이루어지며, 이때 상기 펩타이드는 식 (G)_nC로 나타내는 연결기에 의해 상기 VLP에 공유 결합되고, 이때 상기 연결기는 상기 타우 펩타이드의 C-말단(펩타이드-(G)_nC) 또는 N-말단(C(G)_n-펩타이드)에 있으며, n은 1 또는 2이다.

일례로, 상기 제 1, 제 2 및 제 3 면역원의 각각의 연결기들은 각각의 상기 항원성 타우 펩타이드의 N-말단에 있으며 이때 각각의 상기 연결기들에 대해서 n은 2이다.

또 다른 태양에서, 본원은 본 발명에 개시된 면역원 및 조성물 중 임의의 것을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 알룸, CpG-함유 올리고뉴클레오타이드, 및 사포닌-기재 항원보강제로부터 선택된 하나 이상의 항원보강제를 추가로 포함한다.

추가의 태양에서, 본원은 본 발명에 개시된 면역원 및 조성물 중 임의의 것, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일례로, 하나 이상의 항원보강제는 CpG 7909(서열번호 27), CpG 10103(서열번호 28) 및 CpG 24555(서열번호 29)로부터 선택된 CpG-함유 올리고뉴클레오타이드이다.

추가의 태양에서, 본원은 본 발명에 개시된 면역원 및 조성물 중 임의의 것, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 태양에서, 본원은 포유동물에게 본 발명에 개시된 면역원, 조성물, 및 약학 조성물 중 임의의 것을 투여함을 포함하는 면역화 방법을 제공한다. 예를 들어, 하나의 태양에서, 상기와 같은 투여는 약학적으로 유효한 용량의, 본 발명에 개시된 면역원, 조성물, 및 약학 조성물 중 임의의 것을 사용함으로써 발생한다.

또 다른 태양에서, 상기 명세는 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의, 본 발명에 개시된 면역원, 면역원성 조성물, 및 약학 조성물 중 임의의 것을 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에게서 타우-관련된 신경 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

하나의 태양에서, 상기와 같은 투여는 약학적으로 유효한 용량의, 본 발명에 개시된 면역원, 조성물, 및 약학 조성물 중 임의의 것을 사용함으로써 발생한다.

또 다른 태양에서, 상기 명세는 포유동물에게 a) 약학적으로 유효한 용량의, 본 발명에 개시된 면역원, 면역원성 조성물, 및 약학 조성물 중 임의의 것; 및 b) 약학적으로 유효한 용량의 하나 이상의 항원 보강제를 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에게서 타우-관련된 신경 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일례로, 상기 하나 이상의 항원보강제는 알룸, CpG-함유 올리고뉴클레오타이드, 및 사포닌-기재 항원보강제로부터 선택된다. 추가의 예에서, 상기 하나 이상의 항원보강제는 CpG 7909(서열번호 27), CpG 10103(서열번호 28) 및 CpG 24555(서열번호 29)로부터 선택된 CpG-함유 올리고뉴클레오타이드이다.

추가의 예에서, 상기 신경 질환은 알쯔하이머 병이다. 또 다른 예에서, 상기 신경 질환은 경도 인지 장애로서 진단된다. 또 다른 예에서, 상기 신경 질환은 기억 상실성 MCI로서 진단된다.

또 다른 예에서, 상기 명세는 약제의 제조를 위한 본 발명에 개시된 면역원, 조성물, 및 약학 조성물 중 임의의 것의 용도를 제공한다. 예를 들어, 하나의 태양에서, 상기와 같은 약제를 포유동물의 타우-관련된 신경 질환의 치료를 위해 사용할 수 있다. 일례로, 상기 신경 질환은 알쯔하이머 병이다. 또 다른 예에서, 상기 신경 질환은 경도 인지 장애(MCI)로서 진단된다. 또 다른 예에서, 상기 신경 질환은 기억 상실성 MCI로서 진단된다.

추가의 태양에서, 상기 명세는 본 발명에 개시된 면역화 방법들 중 임의의 것에 반응하여 생성된 단리된 항체를 제공하며, 이때 상기 항체는 인간 타우의 과인산화된 형태에 특이적으로 결합한다.

추가의 태양에서, 상기 명세는 포유동물에게 인간 타우의 과인산화된 형태에 특이적으로 결합하는 항체를 투여함을 포함하는 상기 포유동물의 타우-관련된 신경 질환의 치료 방법을 제공하며, 이때 상기 항체는 본 발명에 개시된 면역화 방법들 중 임의의 것에 반응하여 생성된다.

추가의 태양에서, 상기 명세는 포유동물의 타우-관련된 신경 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명에 개시된 항체들 중 임의의 것의 용도를 제공한다. 일례로, 상기 신경 질환은 알쯔하이머 병이다. 또 다른 예에서, 상기 신경 질환은 경도 인지 장애(MCI)로서 진단된다. 또 다른 예에서, 상기 신경 질환은 기억 상실성 MCI로서 진단된다.

추가의 태양에서, 본원은 서열번호 4, 6 내지 26, 31 내지 76 및 105 내지 122로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어진 단리된 펩타이드를 제공한다. 추가의 태양에서, 본원은 상기 단리된 펩타이드 중 임의의 것을 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 추가의 태양에서, 본원은 상기 핵산 중 임의의 것을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 추가의 태양에서 본원은 상기 발현 벡터 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

도 1a 및 1b는 실시예 5에 개시된 바와 같은, 피하 면역된 Balb/c 마우스 군에 대한 설명, 및 역가 및 선택성 결과를 나타낸다. Balb/c 마우스를 300 ㎍의 펩타이드, 100 ㎍의 펩타이드-KLH 또는 100 ㎍의 펩타이드-VLP로 피하 면역시켰다. 50 ㎕의 티터맥스 골드(TiterMax Gold)(Alexis Biochemicals)를 나열된 곳에 항원보강제로서 사용하였다. 항원 특이성 역가 측정 분석(실시예 13 참조)에서 시험된 혈청 희석 범위는 1:30 내지 1:7,290이었다.
도 2는 실시예 5에 개시된 바와 같은, 면역된 Balb/c 마우스 군에 대한 설명 및 역가 결과를 나타낸다. Balb/c 마우스를 피하 면역시켰다. 50 ㎕의 티터맥스 골드를 나열된 곳에 항원보강제로서 사용하였다. 항원 특이성 역가 측정 분석(실시예 13 참조)에서 시험된 혈청 희석 범위는 1:900 내지 1:1,968,300이었다.
도 3은 실시예 6에 추가로 개시된 바와 같은, 피하 면역된 Balb/c 마우스 군에 대한 설명을 나타낸다. 100 ㎍의 펩타이드를 초회 항원 자극에 사용하였고 100 ㎍의 펩타이드-VLP를 추가 항원 자극에 사용하였다. 750 ㎍의 알룸(Al(OH)₃)을 나열된 곳에 항원보강제로서 사용하였다. 항원 특이성 역가 측정 분석(실시예 13 참조)에서 시험된 혈청 희석 범위는 1:800 내지 1:1,750,000이었다. ND는 측정 안 됨을 의미한다.
도 4a, 4b 및 4c는 실시예 7에 개시된 바와 같은, 근육 내 면역된 TG4510++ 마우스에 대한 결과를 나타낸다. 도 4a는 군 1 내지 7에 대한 역가 결과를 나타내는 반면, 도 4b는 군 8 내지 17에 대한 역가 결과를 나타낸다. 도 4c는 군 1 내지 6에 대한 선택성 결과를 나타낸다. CPG는 CpG-24555이다. 알룸은 Al(OH)₃이다. 항원 특이성 역가 측정 분석(실시예 13 참조)에서 시험된 혈청 희석 범위는 1:5,000 내지 1:15,800,000이었다. ND는 측정 안 됨을 의미한다.
도 5는 실시예 8에 개시된 바와 같은, 면역된 마우스에 대한 설명을 나타낸다. Balb/c 마우스를 근육 내(IM) 또는 피하(SC) 경로를 통해 면역시켰다. 90 ㎍의 펩타이드-VLP를 나열된 곳에 사용하였다. 1,595 ㎍의 알룸(Al(OH)₃), 20 ㎍의 CpG-24555 및 12 ㎍의 ABISCO-100을 나열된 곳에 사용하였다. 항원 특이성 역가 측정 분석(실시예 13 참조)에서 시험된 혈청 희석 범위는 1:5,000 내지 1:15,800,000이었다. 표준 곡선에 대한 검출 하한은 0.0025 ㎎/㎖이었다. NA는 적용할 수 없음을 의미한다.
도 6은 실시예 11에 개시된 바와 같은, 면역된 마우스에 대한 설명을 나타낸다. Balb/c 마우스를 근육 내로 면역시켰다. 100 ㎍의 펩타이드-VLP를 사용하였다. 252(750) ㎍의 알룸(Al(OH)₃)을 나열된 곳에 사용하였다. 항원 특이성 역가 측정 분석(실시예 13 참조)에서 시험된 혈청 희석 범위는 1:500 내지 1:2,720,000이었다. ND는 측정 안 됨을 의미한다.
도 7은 실시예 11에 개시된 바와 같은, 면역된 마우스에 대한 설명을 나타낸다. Balb/c 마우스를 근육 내로 면역시켰다. 750 ㎍의 알룸(Al(OH)₃)을 항원보강제로서 사용하였다. 항원 특이성 역가 측정 분석(실시예 13 참조)에서 시험된 혈청 희석 범위는 1:500 내지 1:15,800,000이었다.
도 8은 실시예 12에 개시된 바와 같은, 면역된 마우스에 대한 설명을 나타낸다. TG4510 -/-(야생형 한배 새끼) 마우스를 근육 내로 면역시켰다. 100 ㎍의 각각의 펩타이드-VLP를 0일째 초회 항원 자극 및 14일째 추가 항원 자극에, 나열된 바와 같이 사용하였다. 나열된 양의 알룸(Al(OH)₃)을 사용하였다. "처리 없음" 군으로부터의 혈청을 모았다. 항원 특이성 역가 측정 분석(실시예 13 참조)에서 시험된 혈청 희석 범위는 1:5,000 내지 1:15,800,000이었다.
도 9는 실시예 12에 개시된 바와 같은, 면역된 마우스에 대한 설명을 나타낸다. TG4510 -/-(야생형 한배 새끼) 마우스를 근육 내로 면역시켰다. 100 ㎍의 각각의 펩타이드-VLP를 0일째 초회 항원 자극 및 14일째 추가 항원 자극에 사용하였다. 알룸을 사용하지 않거나 504 ㎍의 알룸(Al(OH)₃)을 사용하였다. 비장을 21일째에 수거하였다. 5 x 10⁵ 비장 세포당 스폿의 수를 인터페론-감마 T-세포 엘리스폿(ELIspot)에 의해 측정한 바와 같이 나타낸다(실시예 14 참조). 결과는 3 개의 비장 풀로부터의 것이다. 펩타이드 HBV-1(서열번호 77)은 관련 없는 펩타이드였다. BSA는 관련 없는 단백질이었다. ND는 측정 안 됨을 가리킨다. ^*는 p<0.05 대 경우에 따라 관련 없는 펩타이드 또는 단백질을 가리킨다.
도 10은 인간 타우 동형(isoform) 2의 아미노산 서열, 진뱅크(Genbank) 수납 번호 NP_005901(서열번호 30)을 나타낸다.

정의 및 일반적인 기법

본 발명에서 달리 정의하지 않는 한, 본 명세와 관련하여 사용된 과학 기술 용어들은 당해 분야의 통상적인 숙련가들에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 일반적으로, 본 발명에 개시된 세포 및 조직 배양물, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학, 하이브리드화, 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학 및 약학 화학과 관련되고, 이들의 기법에 사용된 명명법은 널리 공지되고 당해 분야에 통상적으로 사용되는 것들이다.

본 명세의 방법 및 기법을 달리 나타내지 않는 한 당해 분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라 본 명세서 전체를 통해 인용 및 논의된 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌들에 개시된 바와 같이 일반적으로 수행한다. 예를 들어 하기 문헌들을 참조하시오: Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et　al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); and Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). 효소 반응 및 정제 기법들을 당해 분야에서 통상적으로 수행되거나 본 발명에 개시된 바와 같이 제조자의 명세서에 따라 수행한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "경도 인지 장애(MCI)"란 용어는 0.5의 임상적인 치매 등급(CDR)(예를 들어 문헌[Hughes et al. , Brit. J. Psychiat. 140: 566-572,1982]을 참조하시오)에 의해 전형적으로 특성화되고, 다른 인지 도메인의 손상된 기능이 아니라 기억력 손상에 의해 추가로 특성화되는 기억 및 인지 장애의 범주를 지칭한다. 기억 장애를 바람직하게는 "단락 시험"과 같은 시험을 사용하여 측정한다. 경도 인지 장애로 진단된 환자는 종종 손상된 지연된 회상 행위를 나타낸다. 경도 인지 장애는 전형적으로는 노화와 관련되며 일반적으로는 45 세 이상의 환자들에게서 발생한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "치매"란 용어는 문헌[American Psychiatric Association: Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition, Washington, D. C. , 1994 ]("DSM-IV")에서 정의된 바와 같이, 가장 광범위한 의미의 정신병을 지칭한다. 상기 DSM-IV는 기억 장애를 포함한 다발성 인지 결함을 특징으로 하는 "치매"를 정의하며 추정되는 병인에 따라 다양한 치매들을 나열한다. 상기 DSM-IV는 치매 및 관련된 정신 질환의 상기와 같은 진단, 범주화 및 치료에 대해 일반적으로 인정되는 기준을 열거한다.

"타우" 또는 "타우 단백질"이란 용어는 신경 세포의 미세소관 및 광범위한 타우 응집체의 성분, 예를 들어 신경섬유 매듭의 안정화와 관련된 타우 단백질을 지칭한다. 특히, 본 발명에 사용된 바와 같은 "타우 단백질"이란 용어는 서열번호 30의 인간 타우, 또는 변형되거나 변형되지 않은 다른 인간 동형, 또는 임의의 다른 동물들로부터의 상응하는 동족체를 포함하거나 이들로 이루어진 임의의 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "타우 단백질"이란 용어는 비제한적으로 상기 정의된 바와 같은 타우 단백질의 글리코실화, 아세틸화, 및 인산화를 포함한 번역 후 변형을 추가로 포함한다.

"타우병증"이란 용어는 타우 관련된 질환 또는 병, 예를 들어 알쯔하이머 병, 진행성 핵상 마비(PSP), 기저피질 퇴화(CBD), 픽병, 염색체 17과 관련된 전측두엽 치매 및 파킨슨증(FTDP-17), 파킨슨병, 발작, 외상성 뇌 상해, 경도 인지 장애 등을 지칭한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "항원" 및 "면역원"(호환적으로 사용된다)이란 용어는 항체, B 세포 수용체(BCR) 또는 T 세포 수용체(TCR)(MHC 분자에 의해 제공되는 경우)에 의해 결합될 수 있는 분자를 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "항원" 및 "면역원"이란 용어는 또한 T-세포 에피토프를 포함한다. 항원은 또한 면역계에 의해 인식될 수 있고/있거나 체액 면역 반응 및/또는 세포 면역 반응을 유도하여 B- 및/또는 T-림프구의 활성화를 유도할 수 있다. 그러나, 이는 적어도 몇몇 경우에, 상기 항원이 T 헬퍼 세포 에피토프를 함유하거나 이에 결합되고 항원보강제가 제공되는 것을 필요로 할 수도 있다. 항원은 하나 이상의 에피토프(예를 들어 B- 및 T-에피토프)를 가질 수 있다. 상기에 언급된 특이 반응은 상기 항원이 바람직하게는, 전형적으로 매우 선택적인 방식으로, 그의 상응하는 항체 또는 TCR과 반응하고 다른 항원에 의해서 유발될 수도 있는 다수의 다른 항체 또는 TCR과는 반응하지 않을 것임을 가리키고자 한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 항원은 또한 여러 개별 항원들의 혼합물일 수도 있다. "항원" 및 "면역원"이란 용어는 모두 비제한적으로 폴리펩타이드를 포함한다.

"항원성 부위"란 용어 및 "항원성 에피토프"란 용어(이들은 본 발명에서 호환적으로 사용된다)는 폴리펩타이드의 연속적이거나 불연속적인 부분을 지칭하며, MHC 분자와 관련하여 항체에 의해 또는 T-세포 수용체에 의해 면역특이적으로 결합될 수 있다. 면역특이적 결합은 비특이적인 결합은 제외하지만 교차 반응성을 반드시 제외하는 것은 아니다. 항원성 부위는 전형적으로는 상기 항원성 부위 특유의 공간 형태로 5 내지 10 개의 아미노산을 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, 아미노산 잔기와 관련하여 "인산화된"이란 용어는, 달리 통상적으로는 하이드록실 기가 존재하는 잔기의 측 쇄 상에 포스페이트 기가 존재함을 지칭한다. 상기와 같은 인산화는 전형적으로는 포스페이트 기(-PO₃H₂)에 대한 하이드록실 기로부터의 수소 원자의 치환으로서 발생한다. 당해 분야의 숙련가들에 의해 인식되는 바와 같이, 국소 환경의 pH에 따라, 상기 포스페이트 기는 하전되지 않은 중성 기(-PO₃H₂)으로서 존재하거나 단일(-PO₃H^-) 또는 이중(-PO₃ ^2-) 음 전하를 가질 수 있다. 전형적으로 인산화될 수 있는 아미노산 잔기는 세린, 쓰레오닌 및 타이로신의 측 쇄를 포함한다. 본 명세 전체를 통해 인산화된 아미노산 잔기는 굵은 문자로 밑줄 그어 나타낸다.

본 발명에 사용된 바와 같이, 아미노산 잔기에 대한 언급은 1-문자 또는 3-문자 기호로 나타낸다(예를 들어 문헌[Lehninger, Biochemistry, 2^nd edition, Worth Publishers, New York, 1975, p. 72]을 참조하시오).

본 발명에 사용된 관사 "하나의"는 상기 관사의 문법적 목적어의 하나 또는 하나보다 많음(즉 하나 이상)을 지칭한다. 예로서, "하나의 요소"는 하나의 요소 또는 하나보다 많은 요소를 의미한다. 더욱이, 내용상 달리 요구되지 않는 경우, 내용상 달리 명백히 가리키지 않는다면, 단수의 용어는 복수를 포함하고 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다.

"펩타이드" 또는 "폴리펩타이드"란 용어는 상기 중합체의 길이에 상관없이 아미노산의 중합체를 지칭하며; 따라서 단백질 단편, 올리고펩타이드, 및 단백질이 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 정의 내에 포함된다. 상기 용어는 또한 폴리펩타이드의 발현 후 변형을 명시하지도 제외하지도 않는다, 예를 들어 글리코실 기, 아세틸 기, 포스페이트 기, 지질 기 등의 공유 결합을 포함하는 폴리펩타이드는 상기 폴리펩타이드란 용어에 의해 분명히 포함된다. 또한 상기 정의 내에는 아미노산의 하나 이상의 동족체(예를 들어 비천연 아미노산, 관련되지 않은 생물계에서 오직 자연적으로만 발생하는 아미노산, 포유동물 계로부터의 변형된 아미노산 등을 포함한다)를 함유하는 폴리펩타이드, 천연 및 비천연 모두의, 치환된 결합뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 다른 변형을 갖는 폴리펩타이드가 포함된다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "타우 단편"이란 용어는 본 발명에 정의된 바와 같은 타우 단백질의 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 개 이상의 연속된 아미노산을 포함하거나 이들로 이루어진 임의의 폴리펩타이드를 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "pSer-396 포스포-타우 에피토프"란 용어는 아미노산 서열 K S P(즉 인간 타우 서열로부터의 Lys-395 Ser-396 Pro-397)를 포함하는 펩타이드를 지칭하며, 이때 상기 세린 잔기는 인산화되고, 서열 넘버링은 서열번호 30으로서 제공된 인간 타우 동형 2에 근거한다. 상기 pSer-396 포스포-타우 에피토프는 전형적으로는 길이가 약 3 내지 약 25 아미노산이다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "pThr-231/pSer-235 포스포-타우 에피토프"란 용어는 아미노산 서열 T PPK S (서열번호 1)(즉 인간 타우 서열로부터의 Thr231 Pro-232 Pro-233 Lys-234 Ser-235)를 포함하는 펩타이드를 지칭하며, 이때 상기 쓰레오닌 및 세린 잔기가 각각 인산화되고, 서열 넘버링은 서열번호 30으로서 제공된 인간 타우 동형 2에 근거한다. 상기와 같은 에피토프는 전형적으로는 길이가 약 5 내지 약 25 아미노산이다. 상기 pThr-231/pSer-235 포스포-타우 에피토프는 또한 인산화된 Thr-231 잔기를 포함하지만 인산화된 Ser-235 잔기는 포함하지 않거나, 인산화된 Ser-235 잔기는 포함하지만 인산화된 Thr-231 에피토프는 포함하지 않는 상기 에피토프의 형태를 지칭할 수 있다. 상기 에피토프의 상기와 같은 버전은 전형적으로는 길이가 약 3 내지 약 20 아미노산이다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "pThr-212/pSer-214 포스포-타우 에피토프"란 용어는 아미노산 서열 TP S (즉 인간 타우 서열로부터의 Thr-212 Pro-213 Ser-214)를 포함하는 펩타이드를 지칭하며, 이때 상기 쓰레오닌 및 세린 잔기가 각각 인산화되고, 서열 넘버링은 서열번호 30으로서 제공된 인간 타우 동형 2에 근거한다. 상기 pThr-212/pSer-214 포스포-타우 에피토프는 전형적으로는 길이가 약 3 내지 약 25 아미노산이다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "pSer-202/pThr-205 포스포-타우 에피토프"란 용어는 아미노산 서열 S PG T (서열번호 3)(즉 인간 타우 서열로부터의 Ser-202 Pro-203 Gly-204 Thr-205)를 포함하는 펩타이드를 지칭하며, 이때 상기 세린 및 쓰레오닌 잔기가 각각 인산화되고, 서열 넘버링은 서열번호 30으로서 제공된 인간 타우 동형 2에 근거한다. 상기 pSer-202/pThr-205 포스포-타우 에피토프는 전형적으로는 길이가 약 4 내지 약 25 아미노산이다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "정제된" 및 "단리된"이란 용어는 동의어이다. 예를 들어, 폴리펩타이드에 관하여 "단리된" 또는 "정제된"이란 용어들은 기원 또는 유래 출처에 의해 (1) 고유 상태로 동반하는 자연적으로 관련된 성분들과 관련되지 않거나, (2) 동일한 종으로부터의 다른 단백질이 실질적으로 없거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, (4) 자연적으로 존재하지 않는 폴리펩타이드를 지칭한다. 따라서, 화학적으로 합성되거나 자연적으로 기원하는 세포와 상이한 세포 계에서 합성된 폴리펩타이드는 그의 자연적으로 관련된 성분들로부터 "단리될" 것이다. 폴리펩타이드를 또한 당해 분야에 널리 공지된 단백질 정제 기법을 사용하여, 단리에 의해 자연적으로 관련된 성분들이 실질적으로 없도록 만들 수도 있다. 폴리펩타이드는 샘플의 약 60 내지 75% 이상이 단일 종의 폴리펩타이드를 나타낼 때 "실질적으로 순수하거나", "실질적으로 동종이거나," "실질적으로 정제된다". 상기 폴리펩타이드는 단량체성 또는 다량체성일 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩타이드는 전형적으로는 폴리펩타이드 샘플의 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% w/w를 차지할 수 있으며, 보다 대개는 약 95% 및 바람직하게는 99% 이상 순수할 수 있다. 단백질 순도 또는 동종성을 당해 분야에 널리 공지된 다수의 수단에 의해서, 예를 들어 단백질 샘플의 폴리아크릴아미드 젤 전기 영동에 이어서, 상기 젤을 당해 분야에 널리 공지된 색소로 염색할 때 단일 폴리펩타이드 밴드를 가시화함으로써 나타낼 수 있다. 몇몇 목적을 위해서, HPLC 또는 정제에 대해 당해 분야에 널리 공지된 다른 수단을 사용함으로써 더 높은 분해능을 제공할 수도 있다.

본 발명에 사용된 바와 같은 타우-관련된 신경 질환이란 용어는 타우(특히 타우의 과인산화된 형태)가 한 역할을 하는 것으로 여겨지는 임의의 질병 또는 다른 병을 의미한다. 상기와 같은 질환, 질병 및/또는 병은 전형적으로는 신경섬유 매듭(전형적으로는 타우의 과인산화된 형태를 포함한다)의 존재와 상관 있으며 비제한적으로 알쯔하이머 병, MCI, 전측두엽 치매, 픽병, 진행성 핵상 마비, 기저피질 퇴화, 괌의 파킨슨증-치매 복합체, 및 다른 타우병증을 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "항원성 타우 펩타이드"란 용어는 예를 들어 포유동물 종, 예를 들어 인간으로부터의 모든 타우-유도된 폴리펩타이드뿐만 아니라 "항원성 타우 펩타이드 생물 활성"을 나타내는 그의 변체, 동족체, 상동체 및 유도체, 및 이들의 단편을 포함한다. 예를 들어, "항원성 타우 펩타이드"란 용어는 서열번호 1 내지 26, 31 내지 76, 및 105 내지 122로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 이들로 필수적으로 이루어진 폴리펩타이드뿐만 아니라 동일한 생물 활성을 필수적으로 나타내는 이들의 변체, 동족체 및 유도체를 지칭한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "항원성 타우 펩타이드 생물 활성"이란 용어는 본 명세의 타우 항원성 펩타이드가 피실험자에게서 길항작용 프로파일로 자가 타우 항체를 유도하는 능력을 지칭하며, 상기와 같은 자가항체는 타우의 과인산화된 병리학적 형태의 수준을 감소시킬 수 있는 반면 타우의 통상적인 비-과인산화된, 비-병리학적 형태에는 실질적으로 결합할 수 없다. 더욱 또한, 항원성 타우 펩타이드 생물 활성을 갖는 항원성 타우 펩타이드를, 환자에게 투여할 때 타우-특이적인 T-세포 반응을 최소화하도록 디자인할 수 있다. 특정한 구조가 본 명세의 범위 내에 있는지 있지 않은지를 확인하기 위한 기법을 사용할 수 있음은 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다. 상기와 같은 기법은 비제한적으로 본 명세의 실시예 부분에 개시된 기법 및 또한 하기를 포함한다. 추정적인 항원성 타우 펩타이드 생물 활성을 갖는 펩타이드를 분석하여 상기 펩타이드의 면역원성을 확인할 수 있다(예를 들어 상기 추정적인 펩타이드에 의해 발생한 항혈청이, 타우의 비-과인산화된, 비-병리학적 형태와는 실질적으로 결합하지 않지만, 타우의 과인산화된 형태와는 결합하는지를 측정할 수 있다). 더욱이, 추정적인 항원성 타우 펩타이드 생물 활성을 갖는 펩타이드를 분석하여 상기 펩타이드가 타우-특이적인 T-세포 매개된 반응을 실질적으로 유도하는지의 여부를 측정할 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "과인산화된" 또는 "비정상적으로 인산화된"이란 용어는 타우 분자당 적어도 약 7 개(즉 약 7 개 이상)의 포스페이트 기를 함유하는 타우를 지칭한다(예를 들어 문헌[Kopke et al., J. Biol Chem 268:24374-84 (1993)]을 참조하시오). 과인산화된 타우는 AD 환자에서 발견되는 신경섬유 매듭(NFT) 및 쌍 나선 필라멘트(PHF)의 주성분이며, 과인산화는 타우의 정상적인 생물 활성 및 자가 응집의 상실에 원인이 된다. 일부 타우 잔기는 전형적으로는 예를 들어 PHF 및 NFT에서 병리학적 과인산화된 형태로 오직 인산화되어 발견된다. 상기와 같은 잔기는 Ser-202, Thr-205, Thr-212, Ser-214, Thr-231, Ser-235, Ser-396 및/또는 Ser-404, Tyr-18을 포함한다. 따라서, 미세소관에 결합하는 타우와 통상적으로 관련되지 않는 여러 부위, 특히 상기 타우의 미세소관 결합 부위에 측면 인접하고 PHF 및 NFT의 주성분을 포함하는 프롤린 풍부 영역에서 발견되는 부위에서 인산화된 타우 단백질이 또한 과인산화된 타우, 또는 비정상적으로 인산화된 타우란 용어에 포함된다.

항원성 타우 펩타이드

인간 타우 단백질은 중추 신경계의 뉴런에 비교적 풍부하지만 다른 장소에는 덜 흔한 미세소관 관련된 단백질이다. 뇌 조직에서, 타우는 상기 타우 유전자의 2, 3 및 10 엑손에서 선택적 이어붙이기(alternative splicing)의 결과로서 6 개의 상이한 동형으로서 존재한다. 인간 타우 동형 2(서열번호 30)를 본 발명에서 본 명세의 모든 타우 펩타이드에 관한 아미노산 넘버링의 기준으로서 사용한다. 타우는 통상적으로 튜불린과 상호작용하여 미세소관을 안정화하고 튜불린 조립체를 미세소관으로 진전시킬 뿐만 아니라 단백질의 축삭 수송을 제공한다. 타우는 인간 성인 뇌에서 정상적인 상태에서 전형적으로는 분자당 2 내지 3 개의 포스페이트 기를 함유하는, 발생적으로 조절되는 인단백질이다. 그러나, 타우는 대개 Ser/Thr-Pro 동기에서, 30 개 초과의 상이한 잔기에서 상이한 키나제들에 의해 일시적으로 인산화될 수 있다(Hanger et al., J. Neurochem. 71:2465-2476 (1998)).

본 명세의 항원성 타우 펩타이드는 전형적으로는 타우의 병리학적 형태의 에피토프가 발견되는, 전체 타우 단백질로부터 선택된 부위를 모방하도록 작은 크기를 가질 것이다. 앞서 개시한 바와 같이, 상기와 같은 타우의 병리학적 형태는 전형적으로는 상기 타우 단백질 내 몇몇 아미노산에서의 인산화를 특징으로 한다. 따라서 상기 명세의 항원성 타우 펩타이드는 전형적으로 길이가 100 미만의 아미노산, 예를 들어 75 미만의 아미노산, 예를 들어 50 미만의 아미노산이다. 상기 명세의 항원성 타우 펩타이드는 전형적으로 길이가 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 약 30 아미노산이다. 서열 목록에 제공된 상기 명세의 항원성 타우 펩타이드의 특정 예들은 4 내지 31 아미노산 길이 범위의 펩타이드를 포함한다. 당해 분야의 숙련가들에게 자명한 바와 같이, 상기와 같은 항원성 펩타이드는 전형적으로는 유리 N-말단을 가지며, 카복실화된 또는 아미드화된 C-말단을 가질 수 있다.

상기 명세의 항원성 펩타이드는 과인산화되거나 병리학적 형태의 인간 타우 부분으로부터 유래한 아미노산 서열을 포함한다. 특히, 상기와 같은 항원성 타우 펩타이드는 전형적으로는 에피토프에 결합하는 항체들과 관련하여 문헌에 언급될 수 있는 특정한 포스포-타우 에피토프를 포함할 것이다(예를 들어 PHF1, TG3, AT8, 및/또는 AT100; 예를 들어 하기 문헌들을 참조하시오: Hanger et al., J. Biol . Chem. 282(32):23645-23654 (2007); Pennanen et al., Biochem . Biophys . Res . Comm. 337:1097-1101 (2005); Porzig et al., Biochem . Biophys . Res . Comm. 358:644-649 (2007)).

본원은 단독으로 또는 서로 함께 사용될 때, 과인산화된 타우의 병리학적 형태에 대해 면역 반응을 이끌어내는데 이롭게 사용될 수 있는 인간 타우 단백질의 특정한 항원 영역들을 확인하였다. 예를 들어 pSer-396 포스포-타우 에피토프는 전형적으로는 인산화된 세린 잔기 Ser-396을 포함하는 인간 타우의 단편이다. 상기와 같은 단편은 전형적으로는 길이가 약 3 내지 약 20 아미노산이며(예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20), Ser-396의 N-말단 및 C-말단 모두 상에 고유 인간 타우 서열로부터의 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 예를 들어, pSer-396 포스포-타우 에피토프는 전형적으로는 서열번호 30에 나열된 바와 같은 인간 타우 서열의 395, 396, 및 397 잔기(즉 Lys-395 Ser-396 Pro-397, 이때 Ser-396이 과인산화된다)를 포함할 것이다. 상기와 같은 pSer-396 에피토프는 또한 상기 고유 인간 서열의 인산화된 세린 잔기 Ser-404를 추가로 포함할 수 있다. pSer-396 포스포-타우 에피토프를 포함하는 타우 펩타이드의 예가 서열번호 4, 및 6 내지 13으로서 제공된다.

더욱이, 예를 들어 상기 pThr-231/pSer-235 포스포-타우 에피토프는 전형적으로는 인산화된 쓰레오닌 잔기 Thr-231 및 인산화된 세린 잔기 Ser-235 모두를 포함하는 인간 타우의 단편이다. 한편으로, pThr-231/pSer-235 포스포-타우 에피토프는 Thr-231 및 Ser-235 중 오직 하나만을 포함한다. 상기와 같은 에피토프는 전형적으로는 길이가 약 3 내지 약 20 아미노산이며(예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20), Thr-231의 N-말단 쪽에 고유 인간 타우 서열로부터의 하나 이상의 아미노산(즉 Arg-230) 및/또는 Ser-235의 C-말단 쪽에 하나 이상의 아미노산(즉 Pro-236)을 포함한다. pThr-231/pSer-235 에피토프를 포함하는 타우 펩타이드의 예가 서열번호 14 내지 19로서 제공된다.

더욱이, 예를 들어 상기 pThr-212/pSer-214 포스포-타우 에피토프는 전형적으로는 인산화된 쓰레오닌 잔기 Thr-212 및 인산화된 세린 잔기 Ser-214를 포함하는 인간 타우의 단편이다. 상기와 같은 에피토프는 전형적으로 길이가 약 3 내지 약 20 아미노산이며(예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20), Thr-212의 N-말단 쪽에 고유 인간 타우 서열로부터의 하나 이상의 아미노산(즉 Arg-211) 및 Ser-214의 C-말단 쪽에 하나 이상의 아미노산(즉 Leu-215)을 포함한다. pThr-212/pSer-214 에피토프를 포함하는 타우 펩타이드의 예가 서열번호 20 내지 24로서 제공된다.

더욱이, 예를 들어 상기 pSer-202/pThr-205 포스포-타우 에피토프는 전형적으로는 인산화된 세린 잔기 Ser-202 및 인산화된 쓰레오닌 잔기 Thr-205를 포함하는 인간 타우의 단편이다. 상기와 같은 에피토프는 전형적으로 길이가 약 6 내지 약 20 아미노산이며(예를 들어 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20), 전형적으로는 Ser-202의 N-말단 쪽에 고유 인간 타우 서열로부터의 하나 이상의 아미노산(즉 Gly-201) 및 Thr-205의 C-말단 쪽에 하나 이상의 아미노산(즉 Pro-206)을 포함한다. pSer-202/pThr-205 에피토프를 포함하는 타우 펩타이드의 예가 서열번호 25로서 제공된다.

더욱이, 예를 들어 상기 pTyr-18 포스포-타우 에피토프는 전형적으로는 인산화된 타이로신 잔기 Tyr-18을 포함하는 인간 타우의 단편이다. 상기와 같은 에피토프는 전형적으로 길이가 약 6 내지 약 20 아미노산이며(예를 들어 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20), 전형적으로는 Tyr-18의 N-말단 쪽에 고유 인간 타우 서열로부터의 하나 이상의 아미노산(즉 Thr-17) 및 Tyr-18의 C-말단 쪽에 하나 이상의 아미노산(즉 Gly-19)을 포함한다. pTyr-18 에피토프를 포함하는 타우 펩타이드의 예가 서열번호 112로서 제공된다.

본 명세의 항원성 타우 펩타이드는 또한, 소수의 아미노산이 치환되거나, 첨가되거나 결실되었지만 동일한 면역학적 성질을 필수적으로 유지하는 펩타이드를 포함하여, 상술한 포스포-타우 에피토프를 포함하는 타우 펩타이드를 포함할 수 있다. 또한, 상기와 같은 유도된 항원성 타우 펩타이드를, 상기 항원성 타우 펩타이드가 형태적으로 구속되고/되거나 상기 항원성 타우 펩타이드가 적합한 화학의 수행 후에 면역원성 담체에 커플링되도록, 특히 N- 및 C-말단 단부에서 아미노산에 의해 추가로 변형시킬 수 있다.

본 명세의 항원성 타우 펩타이드는 면역학적 성질을 필수적으로 손상시키지 않고 아미노산이 결실되거나, 삽입되거나 치환된 타우의 아미노산 서열로부터 유도된 작용적으로 활성인 변형 펩타이드를 또한 포함한다, 즉 상기와 같은 작용상 변형 펩타이드는 실질적인 항원성 타우 펩타이드 생물 활성을 유지한다. 전형적으로, 상기와 같은 작용상 변형 펩타이드는 서열번호 1 내지 26, 31 내지 76, 및 105 내지 122 중 임의의 것에 개시된 아미노산 서열과 상동성인, 바람직하게는 고도로 상동성인 아미노산 서열을 갖는다.

하나의 태양에서, 상기와 같은 작용적으로 활성인 변형 펩타이드는 서열번호 1 내지 26, 31 내지 76, 및 105 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 일치성을 나타낸다.

상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열 일치성을 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 베스트핏(Bestfit), FASTA 또는 BLAST를 통상적으로 사용하여 측정할 수 있다(Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol . Biol. 132:185-219 (2000); Altschul et al., J. Mol . Biol. 215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucelic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). 특정 서열이 예를 들어 기준 아미노산 서열에 대해 95% 일치하는지를 측정하기 위해서 베스트핏 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하는 경우, 매개변수들을, 상기 일치 백분율이 상기 기준 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 계산되고 상기 기준 서열 중의 아미노산 잔기의 총 수의 5% 이하의 상동성 차이가 허용되도록 설정한다. 폴리펩타이드들 간의 일치 백분율을 측정함에 있어서 상기 언급한 방법을 본 발명에 개시된 모든 단백질, 단편 또는 변체에 적용할 수 있다.

작용 활성 변체는 천연 작용 활성 변체, 예를 들어 대립유전자 변체 및 종 변체, 및 예를 들어 돌연변이 기법에 의해서 또는 직접적인 합성에 의해서 생산될 수 있는 비천연 작용 활성 변체를 포함한다.

작용 활성 변체는 서열번호 1 내지 26 및 31 내지 76에 나열된 펩타이드들 중 임의의 것과 대략, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 아미노산 잔기까지 상이하며, 항원성 타우 생물 활성은 여전히 유지한다. 상기 비교가 정렬을 필요로 하는 경우, 상기 서열들을 최대 상동성으로 정렬시킨다. 변이 부위는, 상기 생물 활성이 서열번호 1 내지 26, 31 내지 76, 및 105 내지 122에 나열된 펩타이드들 중 임의의 것과 실질적으로 유사한 한, 상기 펩타이드 중 어디에나 존재할 수 있다.

표현형 잠재성 아미노산 치환의 제조 방법에 관한 지침이 문헌[Bowie et al., Science, 247: 1306-1310 (1990)]에 제공되어 있으며, 상기 문헌은 변화에 대한 아미노산 서열의 허용성 연구를 위한 2 가지 주요 전략이 존재함을 교시한다.

첫 번째 전략은 진화 과정 동안 자연 선택에 의한 아미노산 치환의 허용성을 활용한다. 상이한 종들 중의 아미노산 서열을 비교함으로써, 종들 간에 보존된 아미노산 위치를 확인할 수 있다. 상기 보존된 아미노산은 단백질 작용에 중요한 듯하다. 대조적으로, 치환이 자연 선택에 의해 허용된 아미노산 위치는 단백질 작용에 중요하지 않은 위치들을 가리킨다. 따라서, 아미노산 치환을 허용하는 위치들은 상기 변형된 펩타이드의 특정한 면역원 활성을 여전히 유지하면서 변형될 수 있다.

두 번째 전략은 단백질 작용에 중요한 부위들을 식별하기 위해 클로닝된 유전자의 특정 위치에 아미노산 변화를 도입하는 유전 공학을 사용한다. 예를 들어, 부위-지정 돌연변이 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이가 사용될 수 있다(Cunningham et al., Science, 244: 1081-1085 (1989)). 이어서 생성되는 변형 펩타이드를 특이적인 항원성 타우 생물 활성에 대해 시험할 수 있다.

보위(Bowie) 등에 따르면, 이들 2 가지 전략은 단백질이 놀랍게도 아미노산 치환에 허용성이 있음을 밝혀냈다. 상기 저자들은 아미노산 변화가 상기 단백질 중의 몇몇 아미노산 위치에서 허용되는 듯함을 또한 지적한다. 예를 들어, 가장 매몰되거나 안쪽의(상기 단백질의 3차 구조 내에서) 아미노산 잔기는 비극성 측 쇄를 요하는 반면, 표면 또는 외부 쪽 측 쇄의 특징들은 일반적으로 거의 보존되지 않는다.

단백질의 아미노산에 대한 돌연변이의 도입 방법은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다(예를 들어 하기의 문헌들을 참조하시오: Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)).

돌연변이를 또한 상업적으로 입수할 수 있는 키트, 예를 들어 "퀵체인지(QuikChange)TM 부위-지정 돌연변이 키트"(Stratagene)를 사용하여 도입시킬 수 있다. 항원성 타우 펩타이드의 작용에 그다지 영향을 미치지 않는 아미노산을 치환시킴으로써 상기 항원성 타우 펩타이드에 대한 작용 활성 변체의 생성을 당해 분야의 숙련가에 의해 수행할 수 있다. 본 명세에 따른 펩타이드들 중 하나에서 수행될 수 있는 아미노산 치환의 한 가지 유형은 보존적 아미노산 치환이다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질(예를 들어 전하 또는 소수성)을 갖는 측 쇄 R 기를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로 보존적 아미노산 치환은 단백질의 작용 성질을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2 개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우, 서열 일치 퍼센트 또는 유사성 정도를 상기 치환의 보존적 성질을 교정하기 위해 상향 조절할 수도 있다. 이러한 조절을 수행하는 수단은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Pearson, Methods Mol . Biol. 243:307-31 (1994)]을 참조하시오).

유사한 화학적 성질을 갖는 측 쇄가 있는 아미노산 기의 예로는 1) 지방족 측 쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 2) 지방족-하이드록실 측 쇄; 세린 및 쓰레오닌; 3) 아미드 함유 측 쇄: 아스파라진 및 글루타민; 4) 방향족 측 쇄: 페닐알라닌, 타이로신, 및 트립토판; 5) 염기성 측 쇄: 리신, 아르기닌 및 히스티딘; 6) 산성 측 쇄: 아스파트산 및 글루탐산; 및 7) 황 함유 측 쇄: 시스테인 및 메티오닌이 있다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 기는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-타이로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파테이트, 및 아스파라진-글루타민이다.

한편으로, 보존적 치환은 문헌[Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992)]에 개시된 PAM250 로그-우도 행렬에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "보통의 보전적" 치환은 상기 PAM250 로그 우도 행렬에서 음이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.

작용 활성 변형 펩타이드를 또한 하이브리드화 기법을 사용하여 단리할 수 있다. 간단히, 관심 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 예를 들어 서열번호 1 내지 26, 31 내지 76, 및 105 내지 122의 전체 또는 일부에 대해 높은 상동성을 갖는 DNA를 사용하여 작용 활성 펩타이드를 제조한다. 따라서, 상기 명세의 항원성 타우 펩타이드는 또한 서열번호 1 내지 26 및 31 내지 76 중 임의의 것에 작용상 동등하고 서열번호 1 내지 26, 31 내지 76, 및 105 내지 122 중 임의의 것을 암호화하는 핵산 또는 그의 보체와 하이브리드화하는 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있는 펩타이드를 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 쉽게 입수할 수 있는 코돈 표를 사용하여 본 발명에 개시된 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 쉽게 측정할 수 있다. 그 자체로서, 이들 핵산 서열은 본 발명에 제공되지 않는다.

작용 활성 변체인 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 핵산에 대한 하이브리드화의 엄격성은 예를 들어 10% 폼아미드, 5x SSPE, 1x 덴하르트 용액, 및 1x 연어 정자 DNA(저 엄격성 조건)이다. 보다 바람직한 조건은 25% 폼아미드, 5x SSPE, 1x 덴하르트 용액, 및 1x 연어 정자 DNA(보통 염격성 조건)이고, 훨씬 더 바람직한 조건은 50% 폼아미드, 5x SSPE, 1x 덴하르트 용액, 및 1x 연어 정자 DNA(고 염격성 조건)이다. 그러나, 상술한 폼아미드 농도 이외의 여러 인자가 상기 하이브리드화의 엄격성에 영향을 미치며 당해 분야의 숙련가는 유사한 엄격성을 수행하기 위해 이들 인자를 적합하게 선택할 수 있다.

작용 활성 변체를 암호화하는 핵산 분자를 또한 탐침으로서, 관심 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 예를 들어 서열번호 1 내지 26, 31 내지 76, 및 105 내지 122에 열거된 펩타이드들 중 임의의 것을 암호화하는 핵산 분자 DNA의 일부를 사용하는 PCR과 같은 유전자 증폭 방법에 의해 단리할 수 있다.

펩타이드 /단백질의 생산

본 명세의 폴리펩타이드를 천연 출처로부터 유도하고 포유동물, 예를 들어 인간, 영장류, 고양이, 개, 말, 마우스, 또는 래트로부터 단리할 수 있다. 따라서 상기 명세의 폴리펩타이드를 표준 단백질 정제 기법을 사용하여 세포 또는 조직 출처로부터 단리할 수 있다.

한편으로, 폴리펩타이드를 화학적으로 합성하거나 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 명세의 폴리펩타이드(예를 들어 타우 단편)를 당해 분야에 널리 공지된 고상 과정에 의해 합성할 수 있다. 적합한 합성을 "T-boc" 또는 "F-moc" 과정을 사용하여 수행할 수 있다. 환상 펩타이드를 완전히 자동화된 장치에서 널리 공지된 "F-moc" 과정 및 폴리아미드 수지를 사용하는 고상 방법에 의해 합성할 수 있다. 한편으로, 당해 분야의 숙련가들은 상기 방법을 수동으로 수행하는데 필요한 실험 과정을 알 것이다. 고상 합성에 대한 기법 및 과정은 하기 문헌에 개시되어 있다: Solid Phase Peptide Synthesis : A Practical Approach by E. Atherton and R. C. Sheppard), published by IRL at Oxford University Press (1989) and Methods in Molecular Biology, Vol. 35: Peptide Synthesis Protocols (ed. M. W. Pennington and B. M. Dunn), chapter 7, pp. 91-171 by D. Andreau et al.

한편으로, 상기 명세의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 당해 분야에 널리 공지된 기법을 사용하여 적합한 발현 시스템에서 발현시킬 수 있는 발현 벡터에 도입시킨 다음, 발현된 관심 폴리펩타이드를 단리 또는 정제할 수 있다. 다양한 세균, 효모, 식물, 포유동물 및 곤충 발현 시스템을 당해 분야에서 입수할 수 있으며 임의의 상기와 같은 발현 시스템을 사용할 수 있다. 임의로, 상기 명세의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 무세포 번역 시스템으로 번역할 수 있다.

상기 명세의 항원성 타우 펩타이드는 또한 다수 유전자의 존재, 선택적 전사 사건, 선택적 RNA 이어붙이기 사건, 및 선택적 번역 및 번역 후 사건의 결과로서 발생하는 것들을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드를, 상기 폴리펩타이드가 고유 세포에서 발현되는 경우 존재하는 경우와 실질적으로 동일한 번역 후 변형을 생성시키는 시스템, 예를 들어 배양된 세포에서 발현시키거나, 고유 세포에서 발현되는 경우 존재하는 번역 후 변형, 예를 들어 글리코실화 또는 절단의 변경 또는 생략을 생성시키는 시스템에서 발현시킬 수 있다.

상기 명세의 폴리펩타이드, 예를 들어 항원성 타우 폴리펩타이드를 다른 비-타우 또는 비-타우 유도된 아미노산 서열, 예를 들어 본 발명에 정의된 바와 같은 아미노산 연결기 또는 신호 서열 또는 면역원성 담체뿐만 아니라 단백질 정제에 유용한 리간드, 예를 들어 글루타치온-S-트랜스퍼라제, 히스티딘 태그, 및 스타필로코커스 단백질 A를 함유하는 융합 단백질로서 생성시킬 수 있다. 상기 명세의 하나보다 많은 항원성 타우 폴리펩타이드가 융합 단백질 중에 존재할 수 있다. 이종 폴리펩타이드를, 예를 들어 상기 명세의 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 융합시킬 수 있다. 상기 명세의 폴리펩타이드를 또한 동종 아미노산 서열, 즉 다른 타우 또는 타우-유도된 서열을 포함하는 융합 폴리펩타이드로서 생성시킬 수 있다.

구속된 펩타이드

상기 명세의 항원성 타우 펩타이드는 선형이거나 형태적으로 구속될 수도 있다. 분자와 관련하여 본 발명에 사용된 바와 같이, "형태적으로 구속된"이란 용어는 3차원 구조가 시간에 따라 실질적으로 하나의 공간 배열로 유지되는 분자, 예를 들어 폴리펩타이드를 의미한다. 형태적으로 구속된 분자는 증가된 친화성, 면역원성, 대사 안정성, 막 투과성 또는 용해도와 같은 개선된 성질을 가질 수 있다. 또한, 상기와 같은 형태적으로 구속된 분자는 그의 고유 형태와 유사한 형태로 항원성 타우 에피토프를 제공하여, 자기 타우 분자를 인식하는데 보다 민감한 항-타우 항체를 유도함이 예상된다. 형태 구속 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 비제한적으로 가교 및 환화를 포함한다.

선형 펩타이드 또는 폴리펩타이드 쇄에 형태 구속을 도입하는 여러 접근법이 종래 기술에 공지되어 있다. 예를 들어 펩타이드 중의 2 개의 이웃하는 아미노산 간의 가교는 국소적인 형태 변형을 도출하며, 이의 가요성은 규칙적인 펩타이드의 경우에 비해 제한된다. 상기와 같은 가교를 형성하는 일부 가능성은 락탐 및 피페라지논의 통합을 포함한다(예를 들어 문헌[Giannis and Kolter, Angew . Chem . Int . Ed., 32:1244 (1993)]을 참조하시오).

펩타이드와 관련하여 본 발명에 사용된 바와 같은, "환상"이란 용어는 2 개의 인접하지 않은 아미노산 또는 아미노산 동족체 사이의 분자 내 결합을 포함하는 구조를 지칭한다. 상기 환화는 공유 또는 비공유 결합을 통해 성취될 수 있다. 분자 내 결합은 비제한적으로 주 쇄 대 주 쇄, 측 쇄 대 주 쇄, 측 쇄 대 측 쇄, 측 쇄 대 단부 기, 및 단부 대 단부 결합을 포함한다. 환화의 방법은 비제한적으로, 인접하지 않은 아미노산 또는 아미노산 동족체의 측 쇄들 간의 다이설파이드 결합의 형성; Lys 및 Asp/Glu 잔기의 측 쇄들 간의 아미드 결합의 형성; 세린 잔기와 Asp/Glu 잔기 간의 에스터 결합의 형성; 예를 들어 아미노-말단 잔기의 N-말단 아민에 대한 하나의 아미노산 또는 그의 동족체의 측 쇄 기 간의 락탐 결합의 형성; 및 리시노노르류신과 다이타이로신 결합의 형성을 포함한다. 다이설파이드 결합의 탄소 버전, 예를 들어 에테닐 또는 에틸 결합(J. Peptide Sc. 14:898:902(2008)) 뿐만 아니라 적합하게 다중 치환된 친전자성 시약, 예를 들어 다이-, 트라이- 또는 테트라할로알칸과의 알킬화 반응(PNAS, 105(40), 15293-15298 (2008); ChemBioChem, 6:821-824 (2005))을 또한 사용할 수 있다. 다양한 변형된 프롤린 동족체를 또한 사용하여 펩타이드 내로 형태 구속을 구체화할 수 있다(Zhang et al., J. Med Chem., 39:2738-2744 (1996); Pfeifer and Robinson, Chem. Comm ., 1977-1978 (1998)). 상기 명세의 펩타이드를 환화하는데 사용될 수 있는 화학은 비제한적으로 하기를 포함하는 결합에 의해 환화된 펩타이드를 생성시킨다: 락탐, 하이드라존, 옥심, 티아졸리딘, 티오에테르 또는 설포늄 결합.

미국 특허 공보 제 2004-0176283에 개시된, 형태적으로 구속된 펩타이드 디자인의 더욱 또 다른 접근법은 관심의 짧은 아미노산 서열을 주형에 부착시켜 환상의 구속된 펩타이드를 생성시키는 것이다. 상기와 같은 환상 펩타이드는 그의 주형에 의해 구조적으로 안정화되고 이에 의해 바이러스 및 기생충 상의 형태적 에피토프를 모방할 수 있는 3차원 형태를 제공할 뿐만 아니라 혈청에서의 단백질 분해에 대해 선형 펩타이드보다 더 안정성이다. 미국 특허 공보 제 2004-0176283 호는 펩타이드의 초 2차 구조(supersecondary)를 안정화하기 위해서 적합하게 위치한 아미노산에의 주 쇄 결합을 위한 합성 아미노산의 제조에 의한 형태적으로 구속된 가교결합된 펩타이드의 합성을 추가로 개시한다. 가교결합을, 글루타메이트의 적합하게 위치한 측 쇄 카복실 기에 대해 직각으로 보호된 (2S,3R)-3-아미노프롤린 잔기의 1차 아미노 기의 아미드 결합에 의해 성취할 수 있다. 이러한 접근법은 상기 CS 단백질(이때 하나 이상의 프롤린이 (2S,3R)-3-아미노프롤린에 의해 치환되었다)의 형태적으로 구속된 테트라펩타이드 반복물의 제조에서 수행되었으며, 측 쇄 카복실 기의 도입을 위해서, 글루타메이트가 알라닌에 대한 교체물로서 도입되었다.

가교결합 전략은 또한 알파-나선 형태를 모방하도록 디자인된 "스테이플드(stapled)" 펩타이드를 형성시키기 위한 그럽스(Grubbs) 고리-폐쇄 복분해 반응의 적용(Angew . Int . Ed . Engl . 37:3281 (1998); JACS 122:5891 (2000)); 다중-작용화된 사카라이드의 사용; 트립타치오닌 결합의 사용(Chemistry Eu . J. 24:3404-3409 (2008)); 및 측 쇄 아미노산 잔기로서 통합되거나 펩타이드 서열의 주 쇄 내에 위치할 수 있는 아지드 및 알킨의 "클릭" 반응의 사용(Drug Disc . Today 8(24):1128-1137 (2003))을 포함한다. 금속 이온이, 금속 양이온에 배위하는 특정 잔기(예를 들어 히스티딘)의 격리를 통해 선형 펩타이드의 구속된 형태를 안정화시킬 수 있음은 또한 문헌에 공지되어 있다(Angew . Int . Ed . Engl . 42:421 (2003)). 유사하게, 비-천연 산 및 아민 작용기, 또는 폴리아민 및 다중 산 작용기에 의한 선형 펩타이드 서열의 작용화를 사용하여 활성화 및 아미드 결합 형성에 따른 환화된 구조에 대한 접근을 허용할 수 있다.

하나의 실시태양에 따라, 상기 항원성 타우 펩타이드를, 상기 항원성 타우 펩타이드의 2 개의 인접하지 않은 아미노산, 예를 들어 N- 및 C-말단 아미노산의 서로에 대한 분자 내 공유 결합에 의해 형태적으로 구속한다. 또 다른 실시태양에 따라, 상기 명세의 항원성 타우 펩타이드를 골격 분자에의 공유 결합에 의해 형태적으로 구속한다. 추가의 실시태양에 따라, 상기 항원성 타우 펩타이드를 상기 골격 분자에 단순히 구속시킨다, 즉 하나의 단부(C 또는 N 말단)에 또는 어느 쪽 단부에도 위치하지 않은 또 다른 아미노산을 통해 결합시킨다. 또 다른 실시태양에 따라, 상기 항원성 타우 펩타이드를 상기 골격 분자에 이중으로 구속시킨다, 즉 C 및 N 말단 모두에 결합시킨다.

상기 골격(또한 "플랫폼"이라 칭한다)은 공유 결합을 통해 상기 항원성 타우 펩타이드가 취할 수 있는 형태의 수를 감소시킬 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 형태 구속 골격의 예는 단백질 및 펩타이드, 예를 들어 리포칼린-관련된 분자, 예를 들어 베타-배럴 함유 티오리독신 및 티오리독신 유사 단백질, 뉴클레아제(예를 들어 RNaseA), 프로테아제(예를 들어 트립신), 프로테아제 억제제(예를 들어 에글린(eglin) C), 항체 또는 구조적으로 엄격한 그의 단편, 형광 단백질, 예를 들어 GFP 또는 YFP, 코노톡신, 피브로넥틴 III형 도메인의 루프 영역, CTLA-4, 및 바이러스 유사 입자(VLP)를 포함한다.

다른 적합한 플랫폼 분자는 세파로스와 같은 탄수화물을 포함한다. 상기 플랫폼은 선형 또는 환형 분자, 예를 들어 폐쇄되어 고리를 형성하는 분자일 수 있다. 상기 플랫폼은 일반적으로 상기 항원성 타우 펩타이드에 대해 이종이다. 플랫폼에 결합된 상기와 같은 형태적으로 구속된 펩타이드는 선형 펩타이드보다 단백질 분해에 더 내성인 것으로 생각된다.

하나의 실시태양에 따라, 상기 골격은 본 명세에 정의된 바와 같은 면역원성 담체, 예를 들어 이종 담체 단백질 또는 VLP이다. 추가의 실시태양에서, 상기 항원성 타우 펩타이드는 상기 면역원성 담체 상에 단순히 구속된다. 추가의 실시태양에서, 상기 항원성 타우 펩타이드는 상기 면역원성 담체 상에 이중으로 구속된다. 이와 같은 방식으로, 상기 항원성 타우 펩타이드는, 세포 내 인지 분자로서 특히 적합한 구조인 것으로 입증된 형태적으로 구속된 고리 구조를 형성한다.

상기 명세의 항원성 타우 펩타이드를, 플랫폼에의 접합을 용이하게 하기 위해서, 예를 들어 한쪽 단부 또는 양쪽 단부에 말단 시스테인의 첨가에 의해, 및/또는 연결기 서열, 예를 들어 리신 잔기로 종결되는 연결기인 이중 글리신 헤드 또는 꼬리, 또는 상기와 같은 작용을 수행하는 것으로 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 다른 연결기의 첨가에 의해 변형시킬 수 있다. 상기 담체에 전체 펩타이드 서열을 결합시키고, 따라서 임의의 위치화학 및 화학 선택성 문제를 피하기 위한 생물직교(bioorthogonal) 화학(예를 들어 상술한 클릭 반응)을 또한 사용할 수도 있다. 엄격한 연결기, 예를 들어 문헌[Jones et al ., Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41:4241-4244]에 개시된 것들은 개선된 면역학적 반응을 이끌어내는 것으로 공지되어 있으며 또한 사용될 수도 있다.

추가의 실시태양에서, 상기 항원성 타우 펩타이드를 다가 주형(자체가 담체에 결합된다)에 부착시키며, 따라서 상기 항원의 밀도가 증가한다(하기 참조). 상기 다가 주형은 적합하게 작용화된 중합체 또는 올리고머, 예를 들어 (비제한적으로) 올리고글루타메이트 또는 올리고키토산일 수 있다.

상기 연결기는 상기 펩타이드의 N-말단에, 또는 상기 펩타이드의 C-말단에, 또는 상기 펩타이드의 양쪽 말단에 위치할 수도 있다. 상기 연결기는 0 내지 10 아미노산 길이, 예를 들어 0 내지 6 아미노산 길이일 수도 있다. 한편으로, 상기 아미노산 중 하나 이상의 D-입체이성체 형태의 첨가 또는 치환을 수행하여, 예를 들어 상기 펩타이드의 안정성을 향상시키는데 이로운 유도체를 생성시킬 수도 있다.

다양한 연결기를 사용하는 예시적인 접합들의 조합(모두 본 명세의 범위 내에 있으며, 다양한 실시태양들을 구성한다)을 하기에 제공한다:

펩타이드-GGGGGC (서열번호 79)-골격; 펩타이드-GGGGC (서열번호 80)-골격; 펩타이드-GGGC (서열번호 81)-골격; 펩타이드-GGC-골격; 펩타이드-GC-골격; 펩타이드-C-골격; 펩타이드-GGGGGK (서열번호 82); 펩타이드-GGGGK (서열번호 83); 펩타이드-GGGK (서열번호 84); 펩타이드-GGK; 펩타이드-GK; 펩타이드-K; 펩타이드-GGGGSC (서열번호 85); 펩타이드-GGGSC (서열번호 86); 펩타이드-GGSC (서열번호 87); 펩타이드-GSC; 펩타이드-SC; 펩타이드-GGGGC (서열번호 80); 펩타이드-GGGC (서열번호 81); 펩타이드-GGC; 펩타이드-GC; CSGGGG (서열번호 88)-펩타이드; CSGGG (서열번호 89)-펩타이드; CSGG (서열번호 90)-펩타이드; CSG-펩타이드; CS-펩타이드; CGGGG (서열번호 91)-펩타이드; CGGG (서열번호 92)-펩타이드; CGG-펩타이드; CG-펩타이드.

다양한 연결기 및 이중 구속된 펩타이드를 사용하는 접합들의 예시적인 조합을 하기에 제공하며, 이때 상기 담체는 담체의 동일한 단량체 또는 담체의 상이한 단량체일 수 있다. 하기의 예에서, GC 연결기는 상기 예시되거나 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 다른 GK 연결기 및 GSC 연결기 중 임의의 것에 의해 치환될 수 있다:

담체-CGGGGG (SEQ ID NO: 93)-펩타이드-GGGGGC (SEQ ID NO:79)-담체;

담체-CGGGG (SEQ ID NO:91)-펩타이드-GGGGC (SEQ ID NO:80)-담체;

담체-CGGG (SEQ ID NO: 92)-펩타이드-GGGC (SEQ ID NO:81)-담체;

담체-CG-펩타이드-GC-담체; 담체-C-펩타이드-C-담체.

하나의 실시태양에서, 말단 시스테인 잔기를, 상기 항원성 타우 펩타이드의 아미노산 서열 중에 아직 존재하지 않는 경우, 서열번호 1 내지 26 중에 나타낸 서열들 중 임의의 것을 포함하거나 이들로 이루어진 항원성 타우 펩타이드의 한쪽 또는 양쪽 단부에 가하여 형태적으로 구속된 펩타이드를 생성시킨다.

또 다른 실시태양에서, 가변적인 수의 글리신 잔기 및 하나의 말단 시스테인 잔기를 포함하는 GC 연결기를 서열번호 1 내지 26 중에 나타낸 서열들 중 임의의 것을 포함하거나 이들로 이루어진 항원성 타우 펩타이드의 한쪽 또는 양쪽 단부에 가하여 형태적으로 구속된 펩타이드를 생성시킨다. 바람직하게는, 상기 GC 연결기는 1 내지 10 개의 글리신 잔기, 보다 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 글리신 잔기를 포함한다.

더욱 또 다른 실시태양에서, 가변적인 수의 글리신 잔기 및 하나의 말단 시스테인 잔기를 포함하는 GC 연결기를 서열번호 1 내지 26 중에 나타낸 서열들 중 임의의 것을 포함하거나 이들로 이루어진 항원성 타우 펩타이드의 한쪽 단부에 가하고 말단 시스테인 잔기를, 상기 항원성 타우 펩타이드의 다른 쪽 단부에 아직 존재하지 않는 경우, 상기 항원성 펩타이드의 다른 쪽 단부에 가한다. 바람직하게는 상기 GC 연결기는 1 내지 10 개의 글리신 잔기, 보다 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 글리신 잔기를 포함한다.

면역원성 담체

본 명세의 하나의 실시태양에서, 상기 명세의 항원성 타우 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 면역원성 담체 분자에 결합시켜 백신화 프로토콜을 위한 면역원을 형성시킨다. 본 발명에서 "면역원성 담체"란 용어는 숙주 동물에서 면역원 반응을 독립적으로 이끌어내는 성질을 가지며 상기 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 중의 유리 카복실, 아미노 또는 하이드록실 기와 상기 면역원성 담체 물질 상의 상응하는 기 간의 펩타이드 또는 에스터 결합의 형성을 통해 직접적으로, 또는 한편으로 통상적인 이작용성 결합 기를 통해 또는 융합 단백질로서 결합함으로써 상기 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질에 결합할 수 있는(예를 들어 공유 결합할 수 있는) 물질들을 포함한다.

본 명세의 면역원에 사용되는 담체의 유형은 당해 분야의 숙련가에게 쉽게 공지될 것이다. 상기와 같은 면역원성 담체의 예는 바이러스 유사 입자(VLP); 혈청 알부민, 예를 들어 소 혈청 알부민(BSA); 글로불린; 타이로글로불린; 헤모글로빈; 헤모시아닌(특히 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)); 회충으로부터 추출된 단백질, 불활성화된 세균 독소 또는 변성독소, 예를 들어 파상풍 또는 디프테리아 독소(TT 및 DT) 또는 CRM197, 튜베르쿨린의 정제된 단백질 유도체(PPD); 또는 헤모필루스 인플루엔자에로부터의 단백질 D(PCT 공보 WO 91/18926) 또는 그의 재조합 단편(예를 들어 TT의 단편 C의 도메인 1, 또는 DT의 전좌 도메인, 또는 헤모필루스 인플루엔자에 단백질 D의 N-말단 100 내지 110 아미노산을 포함하는 1/3번째 단백질 D(GB 9717953.5)); 폴리리신; 폴리글루탐산; 리신-글루탐산 공중합체; 리신 또는 오르니틴을 함유하는 공중합체; 리포솜 담체 등이다.

하나의 실시태양에서, 상기 면역원성 담체는 KLH이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 면역원성 담체는 바이러스 유사 입자(VLP), 바람직하게는 재조합 바이러스 유사 입자이다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "바이러스 입자"란 용어는 바이러스의 형태적 형태를 지칭한다. 일부 바이러스 유형에서 상기 입자는 단백질 캡시드에 의해 둘러싸인 게놈을 포함하며; 다른 것들은 추가적인 구조, 예를 들어 외피, 꼬리 등을 갖는다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "바이러스 유사 입자"(VLP)란 용어는 비복제성 및/또는 비감염성 바이러스 입자를 지칭하거나, 바이러스 입자를 닮은 비복제성 및/또는 비감염성 구조, 예를 들어 바이러스의 캡시드를 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "비복제성"이란 용어는 상기 VLP에 의해 포함된 게놈을 복제할 수 없음을 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "비감염성"이란 용어는 숙주 세포에 들어갈 수 없음을 지칭한다. 일례로, 바이러스 유사 입자는 상기 바이러스 게놈 또는 게놈 기능의 일부 또는 전부가 없기 때문에 비복제성 및/또는 비감염성이다. 예를 들어, 바이러스 유사 입자는, 상기 바이러스 게놈이 물리적으로 또는 화학적으로 불활성화된 바이러스 입자이다. 더욱이, 예를 들어, 바이러스 유사 입자는 상기 바이러스 게놈의 복제성 및 감염성 성분의 일부 또는 전부가 없다. 바이러스 유사 입자는 상기 바이러스의 게놈과 다른 핵산을 함유할 수도 있다. 바이러스 유사 입자의 일례는 바이러스 캡시드, 예를 들어 상응하는 바이러스, 예를 들어 박테리오파지, 예를 들어 RNA-파지의 바이러스 캡시드이다. "바이러스 캡시드" 또는 "캡시드"란 용어는 바이러스 단백질 아단위로 구성된 거대분자 조립체를 지칭한다. 예를 들어 60, 120, 180, 240, 300, 360 및 360 초과의 바이러스 단백질 아단위가 있을 수 있다. 이들 아단위의 상호작용은 고유의 반복적인 기구를 갖는 바이러스 캡시드 또는 바이러스 캡시드 유사 구조의 형성을 도출할 수 있으며, 이때 상기 구조는 예를 들어 구형 또는 관상이다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "RNA 파지의 바이러스 유사 입자"란 용어는 RNA 파지의 피막 단백질, 그의 변체 또는 단편을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나 이루어진 바이러스 유사 입자를 지칭한다. 예를 들어, RNA 파지의 바이러스 유사 입자는, 비복제성 및/또는 비감염성이고 적어도 상기 RNA 파지의 복제 기구를 암호화하는 유전자 또는 유전자들이 없는, 상기 RNA 파지의 구조를 닮을 수 있으며, 숙주에 대한 바이러스 부착 또는 숙주 내로의 입장을 책임지는 단백질 또는 단백질들을 암호화하는 유전자 또는 유전자들이 또한 없을 수도 있다. 그러나, 상기 정의는 또한, 상기 언급한 유전자 또는 유전자들은 여전히 존재하지만 불활성이고, 따라서 RNA 파지의 비복제성 및/또는 비감염성 바이러스 유사 입자를 도출하는 RNA 파지의 바이러스 유사 입자를 포함할 것이다. 본 명세 내에서, "아단위" 및 "단량체"란 용어는 호환성이며 상기 상황 하에서 동등하게 사용된다. 더욱이, 본 명세에서, "RNA-파지"란 용어 및 "RNA-박테리오파지"란 용어는 호환 사용된다.

본원은 포유동물에게서 인산화된 타우에 대한 면역 반응을 유도하고/하거나 증대시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 명세의 조성물은 하나 이상의 항원성 타우 펩타이드에 결합된 바이러스 유사 입자(VLP)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원성 타우 펩타이드를 정렬되고 반복적인 항원-VLP 배열의 형성을 위해 상기 VLP에 결합시킬 수 있다. 예를 들어, 하나의 경우에, 본 발명에 개시된 바와 같은 20 개 이상, 30 개 이상, 60 개 이상, 120 개 이상, 180 개 이상, 360 개 이상 또는 540 개 이상의 펩타이드를 상기 VLP에 결합시킨다.

RNA 파지 피막 단백질의 180 개 아단위의 자가 조립으로부터 형성되고 숙주 RNA를 임의로 함유하는 캡시드 구조를 본 발명에서 "RNA 파지 피막 단백질의 VLP"라 칭한다. 구체적인 예는 Q베타 피막 단백질의 VLP이다. 상기 특정한 경우에, Q베타 피막 단백질의 VLP는 Q베타 CP 아단위(예를 들어 억제를 통해 보다 긴 A1 단백질의 임의의 발현을 제외하는 TAA 정지 코돈을 함유하는 Q베타 CP 유전자의 발현에 의해 생성된다, 문헌[Kozlovska, T. M., et al., Intervirology 39: 9-15 (1996)]을 참조하시오)로부터 독점적으로 조립되거나, 캡시드 조립체 중에 A1 단백질 아단위를 추가로 함유할 수도 있다. 일반적으로, 상기 캡시드 조립체 중의 Q베타 CP에 비해 Q베타 A1 단백질의 백분율은 캡시드 형성을 보장하기 위해 제한될 것이다.

본 명세와 관련하여 면역원성 담체로서 적합한 VLP의 예는 비제한적으로 B형 간염 바이러스의 캡시드 단백질(Ulrich, et al., Virus Res. 50: 141-182 (1998)), 홍역 바이러스(Warnes, et al., Gene 160: 173-178 (1995)), 신드비스 바이러스, 로타바이러스(미국 특허 제 5,071,651 호 및 5,374,426 호), 구제역 바이러스(Twomey, et al., Vaccine 13: 1603-1610, (1995)), 노로바이러스(Jiang, X., et al., Science 250: 1580-1583 (1990); Matsui, S. M., et al., J Clin. Invest. 87: 1456-1461 (1991)), 레트로바이러스 GAG 단백질(PCT 공개 WO 96/30523), 레트로트랜스포손 Ty 단백질 pl, B형 간염 바이러스의 표면 단백질(PCT 공개 WO 92/11291), 인유두종 바이러스(PCT 공개 WO 98/15631), 인간 폴리오마 바이러스(Sasnauskas K., et al., Biol. Chem. 380 (3): 381-386 (1999); Sasnauskas K., et al., Generation of recombinant virus-like particles of different polyomaviruses in yeast, 3rd International Workshop "Virus-like particles as vaccines", Berlin, September 26-29 (2001)), RNA 파지, Ty, fr파지, GA-파지, AP 205-파지 및 Q베타-파지의 캡시드 단백질을 포함한다.

당해 분야의 숙련가들에게 쉽게 자명한 바와 같이, 상기 명세의 면역원성 담체로서 사용되는 VLP는 임의의 특정 형태로 제한되지 않는다. 상기 입자를 화학적으로 합성하거나 천연이거나 비천연일 수 있는 생물학적 방법을 통해 합성할 수 있다. 예로서, 상기 유형의 실시태양은 바이러스 유사 입자 또는 그의 재조합 형태를 포함한다. 보다 특정한 실시태양에서, 상기 VLP는 VLP를 형성하는 것으로 공지된 바이러스 중 임의의 것의 재조합 폴리펩타이드를 포함하거나, 한편으로 이들로 이루어질 수 있다. 상기 VLP는 상기와 같은 폴리펩타이드의 하나 이상의 단편뿐만 아니라 상기와 같은 폴리펩타이드의 변체를 추가로 포함하거나, 한편으로 상기로 이루어질 수 있다. 폴리펩타이드의 변체는 예를 들어 그의 야생형 대응물과 아미노산 수준에서 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 일치성을 공유할 수 있다. 본 명세에 사용하기에 적합한 변형 VLP는 상기 VLP가 "바이러스 유사 입자"를 형성할 수 있고 본 발명에서 정의한 바와 같은 "면역원성 담체"로서 사용될 수 있는 한 어떠한 유기체로부터도 유래될 수 있다.

상기 명세에 따른 바람직한 VLP는 HBV의 캡시드 단백질 또는 코어 및 표면 항원(각각 HBcAg 및 HBsAg) 또는 그의 재조합 단백질 또는 단편, 및 RNA-파지의 피막 단백질 또는 그의 재조합 단백질 또는 단편, 보다 바람직하게는 Q베타의 피막 단백질 또는 그의 재조합 단백질 또는 단편을 포함한다.

하나의 실시태양에서, 상기 명세의 항원성 타우 펩타이드와 함께 사용되는 면역원성 담체는 HBcAg 단백질이다. 본 명세와 관련하여 사용될 수 있는 HBcAg 단백질의 예는 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예로서 비제한적으로 하기 문헌[Yuan et al., J. Virol. 73:10122-10128 (1999)] 및 PCT 공보 WO 00/198333, WO 00/177158, WO 00/214478, WO 00/32227, WO 01/85208, WO 02/056905, WO 03/024480, 및 WO 03/024481에 개시된 HBV 코어 단백질이 있다. 본 명세에 사용하기에 적합한 HBcAg는 "바이러스 유사 입자"를 형성할 수 있고 본 발명에서 정의된 바와 같이 "면역원성 담체"로서 사용될 수 있는 한 어떠한 유기체로부터도 유래될 수 있다.

본 명세와 관련하여 사용될 수 있는 특히 중요한 HBcAg 변체는 하나 이상의 천연 시스테인 잔기가 결실되거나 치환된 변체들이다. 유리 시스테인 잔기가 다이설파이드 교환, 예를 들어 주입되거나 다른 물질과의 복합 요법에서 형성되는 화학 물질 또는 대사산물과의 반응, 또는 직접적인 산화 및 UV 광에의 노출 시 뉴클레오타이드와의 반응을 포함한 다수의 화학적 부 반응들과 관련될 수 있음은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 따라서 특히 HBcAg가 핵산에 결합하는 강한 성향을 갖는 사실을 고려할 때 독성 부가물이 생성될 수 있다. 따라서 상기 독성 부가물은 다양한 종들 간에 분포되어 있을 것이며, 이는 개별적으로 각각 낮은 농도로 존재할 수 있지만 함께할 때는 독성 수준에 도달할 수도 있다. 상기에 비추어, 천연 시스테인 잔기가 제거되도록 변형시킨 백신 조성물 중의 HBcAg의 사용에 대한 한 가지 이점은 항원 또는 항원성 결정인자가 부착될 때 독성 종이 결합할 수 있는 부위의 수가 감소하거나 전체적으로 제거될 것이라는 것이다.

또한, B형 간염 코어 항원 전구체 단백질의 N-말단 리더 서열이 없는 HBcAg의 가공된 형태를 또한, 특히 HBcAg가 가공(예를 들어 세균 시스템에서의 발현)이 일어나지 않을 조건 하에서 생산될 때, 상기 명세와 관련하여 사용할 수 있다.

상기 명세에 따른 다른 HBcAg 변체는 i) 표준 서열 비교 컴퓨터 연산을 사용하여, 야생형 HBcAg 아미노산 서열들 중 하나와 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상 일치하는 폴리펩타이드 서열, ii) 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34 또는 35 개 이상의 아미노산이 상기 C-말단으로부터 제거된 돌연변이체를 포함한 C-말단 절두 돌연변이체, ii) 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 또는 17 개 이상의 아미노산이 상기 N-말단으로부터 제거된 돌연변이체를 포함한 N-말단 절두 돌연변이체, iii) 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 또는 17 개 이상의 아미노산이 상기 N-말단으로부터 제거되고 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34 또는 35 개 이상의 아미노산이 상기 C-말단으로부터 제거된 HBcAg를 포함한 N-말단 및 C-말단 모두에서 절두된 돌연변이체를 포함한다.

상기 명세의 범위 내에 있는 더욱 다른 HBcAg 변형 단백질은, 4 개의 아르기닌 반복물 중 하나 이상이 결실되었지만 C-말단 시스테인은 유지하는 외부 에피토프의 면역원성 발현을 증대시키기 위해 변형시킨 변체(예를 들어 PCT 공보 WO 01/98333 참조), 및 키메릭 C-말단 절두된 HBcAg, 예를 들어 PCT 공보 WO 02/14478, WO 03/102165 및 WO 04/053091에 개시된 것들이다.

또 다른 실시태양에서, 상기 명세의 항원성 타우 펩타이드와 함께 사용되는 면역원성 담체는 HBsAg 단백질이다. 본 명세와 관련하여 사용될 수 있는 HBsAg 단백질을 당해 분야의 숙련가들에 의해 쉽게 결정할 수 있다. 예로서 비제한적으로 미국 특허 제 5,792,463 호, 및 PCT 공보 WO 02/10416 및 WO 08/020331에 개시된 HBV 표면 단백질을 포함한다. 본 명세에 사용하기에 적합한 HBcAg는 "바이러스 유사 입자"를 형성할 수 있고 본 발명에서 정의된 바와 같이 "면역원성 담체"로서 사용될 수 있는 한 어떠한 유기체로부터도 유래될 수 있다.

더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 명세의 항원성 타우 펩타이드와 함께 사용되는 면역원성 담체는 Q베타 피막 단백질이다. Q베타 피막 단백질은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 발현 시 캡시드로 자가 조립되는 것으로 밝혀졌다(Kozlovska T.M. et al., GENE 137: 133-137 (1993)) 상기 수득된 캡시드 또는 바이러스 유사 입자는 25 ㎚의 직경 및 T=3 유사 대칭을 갖는 정20면체 파지 유사 캡시드 구조를 나타내었다. 더욱이, 상기 박테리오파지 Q베타의 결정 구조가 풀렸다. 상기 캡시드는 상기 피막 단백질의 180 사본을 함유하며, 이들 사본은 다이설파이드 가교에 의해 공유 오량체 및 육량체로 결합하여(Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 5435554 (1996)) Q베타 피막 단백질의 캡시드의 현저한 안정성을 도출한다. Q베타 캡시드 단백질은 또한 유기 용매 및 변성제에 대해 통상적이지 않은 내성을 나타낸다. 상기 Q베타 피막 단백질의 캡시드의 높은 안정성은 특히 본 명세와 관련하여 포유동물 및 인간의 면역화 및 백신화에 사용하기에 유리한 특징이다.

본 명세와 관련하여 사용될 수 있는 Q베타 피막 단백질의 예를 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정할 수 있다. 예들이 PCT 공보 WO 02/056905, WO 03/024480, WO 03/024481에 광범위하게 개시되어 있으며, 이때 비제한적으로 PIR 데이터베이스에, Q베타 CP라 지칭되는 수납 번호 VCBPQ베타 번; Q베타 A1 단백질이라 지칭되는 수납 번호 AAA16663 번으로 개시된 아미노산 서열; 및 N-말단 메티오닌이 절단된 변체 단백질; 100, 150 또는 180 개 정도로 많은 아미노산이 누락된 Q베타 A1의 C-말단 절두된 형태; 결실 또는 치환에 의한 리신 잔기의 제거에 의해 또는 치환 또는 삽입에 의한 리산 잔기의 첨가에 의해 변형된 변체 단백질(예를 들어 PCT 공보 WO 03/024481에 개시된 Q베타-240, Q베타-243, Q베타-250, Q베타-251 및 Q베타-259를 참조하시오), 및 본 발명에 개시된 Q베타 코어 단백질들 중 임의의 것에 대해 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상의 일치성을 나타내는 변체를 포함한 그의 변체가 포함된다. 본 명세에 사용하기에 적합한 변형 Q베타 피막 단백질은 "바이러스 유사 입자"를 형성할 수 있고 본 발명에서 정의된 바와 같이 "면역원성 담체"로서 사용될 수 있는 한 어떠한 유기체로부터도 유래될 수 있다.

결합

상기 명세의 항원성 타우 펩타이드를 화학적 접합을 통해 또는 유전자 조작된 융합 상대의 발현에 의해 면역원성 담체에 결합시킬 수 있다. 상기 결합은 반드시 직접적일 필요는 없고, 연결기 서열을 통해 발생할 수 있다. 보다 일반적으로, 항원성 펩타이드를 면역원성 담체에 융합시키거나, 접합시키거나 달리 부착시키는 경우에, 이격자 또는 연결기 서열을 전형적으로는 상기 항원성 펩타이드의 한쪽 단부 또는 양쪽 단부에 가한다. 상기와 같은 연결기 서열은 일반적으로는 프로테아솜, 엔도솜의 프로테아제 또는 세포의 다른 소낭 구획에 의해 인식되는 서열을 포함한다.

하나의 실시태양에서, 본 명세의 펩타이드는 상기 면역원성 담체와의 융합 단백질로서 발현된다. 상기 펩타이드의 융합을 상기 면역원성 담체 내로의 1차 서열의 삽입에 의해, 또는 상기 면역원성 담체의 N- 또는 C-말단에의 융합에 의해 수행할 수 있다. 이후부터, 면역원성 담체에 대한 펩타이드의 융합 단백질을 언급하는 경우, 상기 아단위 서열의 어느 한 단부에의 융합 또는 상기 담체 서열 내의 상기 펩타이드의 내부 삽입이 포함된다. 융합을, 이후에 언급되는 바와 같이, 상기 항원성 펩타이드의 상기 담체의 서열 내로의 삽입, 상기 항원성 펩타이드에 의한 상기 담체 서열의 일부의 치환, 또는 결실, 치환 또는 삽입의 조합에 의해 수행할 수 있다.

상기 면역원성 담체가 VLP인 경우, 상기 키메릭 항원성 펩타이드-VLP 아단위는 일반적으로 VLP로 자가 조립될 수 있을 것이다. 아단위에 융합된 에피토프를 표시하는(displaying) VLP를 또한 본 발명에서는 키메릭 VLP로서 지칭한다. 예를 들어 EP 0 421 635 B는 바이러스 유사 입자에 외부 펩타이드 서열을 제공하기 위한 키메릭 헤파드나바이러스 코어 항원 입자의 용도를 개시한다.

측면 인접하는 아미노산 잔기를 VLP의 아단위 서열의 어느 한 단부에 융합되는 항원성 펩타이드 서열의 어느 한 단부에 가하거나, 상기와 같은 펩타이드 서열의 VLP의 아단위 서열 내로의 내부 삽입을 위해 가할 수 있다. 글리신 및 세린 잔기가 상기 융합되는 펩타이드에 첨가되는 측면 인접하는 서열에 사용하기에 특히 유리한 아미노산이다. 글리신 잔기는 추가적인 가요성을 부여하며, 이는 VLP 아단위 서열 내로의 외부 서열 융합의 잠재적인 탈안정화 효과를 감소시킬 수도 있다.

상기 명세의 특정한 실시태양에서, 상기 면역원성 담체는 HBcAg VLP이다. HBcAg의 N-말단(Neyrinck, S. et al., Nature Med. 5:11571163 (1999))에 대한 또는 소위 주요 면역우세 영역(MIR) 중의 삽입을 위한 상기 항원성 펩타이드의 융합 단백질이 개시되었으며(Pumpens et al., Intervirology 44:98-114 (2001), PCT 공보 WO 01/98333), 이는 상기 명세의 특정한 실시태양이다. 상기 MIR 중의 결실을 갖는 HBcAg의 천연 변체가 또한 개시되었으며(Pumpens et al., Intervirology 44:98-114 (2001)), wt HBcAg에 비해 결실 부위에 상응하는 MIR의 위치에서의 삽입뿐만 아니라, N- 또는 C-말단에의 융합은 상기 명세의 추가의 실시태양이다. 상기 C-말단에 대한 융합이 또한 개시되었다(Pumpens et al., Intervirology 44:98-114 (2001)). 당해 분야의 숙련가는 전통적인 분자 생물학 기법을 사용하여 융합 단백질을 어떻게 제작하는지에 대한 지침을 쉽게 찾을 것이다. HBcAg 및 HBcAg 융합 단백질을 암호화하고 HBcAg 및 HBcAg 융합 단백질의 발현에 유용한 벡터 및 플라스미드가 개시되었고(Pumpens et al., Intervirology 44:98-114 (2001), Neyrinck, S. et al., Nature Med. 5:1157-1163 (1999)), 상기 명세의 실시에 사용될 수 있다. HBcAg의 MIR에 삽입되는 에피토프의 자가 조립 및 표시의 효율성의 최적화에 중요한 인자는 상기 삽입 부위의 선택뿐만 아니라, 삽입 시 상기 MIR 내에서 HBcAg 서열로부터 결실되는 아미노산의 수(유럽 특허 EP 0421635; 미국 특허 제 6,231,864 호), 또는 다른 말로, HBcAg로부터 아미노산이 새로운 에피토프로 치환되는 수의 선택이다. 예를 들어, HBcAg 아미노산 76-80, 79-81, 79-80, 75-85 또는 80-81의 외부 에피토프에 의한 치환이 개시되었다(Pumpens et al., Intervirology 44:98-114 (2001); 유럽 특허 EP 0421635; 미국 특허 제 6,231,864 호, PCT 특허 공개 WO00/26385). HBcAg는 캡시드 조립에 중요치 않고 핵산과 결합할 수 있는 긴 아르기닌 꼬리를 함유한다. 상기 아르기닌 꼬리를 포함하거나 상기 꼬리가 없는 HBcAg는 모두 본 명세의 실시태양이다.

상기 명세의 또 다른 특정한 실시태양에서, 상기 면역원성 담체는 RNA 파지의 VLP, 바람직하게는 Q베타이다. RNA 파지의 주요 피막 단백질들은 세균, 및 특히 에스케리키아 콜라이에서 발현 시 VLP로 자발적으로 조립된다. 항원성 펩타이드가 Q베타의 A1 단백질의 절두된 형태의 C-말단에 융합되거나, A1 단백질 내부에 삽입된 융합 단백질 구조물이 개시되었다(Kozlovska et al., Intervirology, 39:9-15 (1996)). 상기 A1 단백질은 UGA 정지 코돈에서 억제에 의해 생성되며, 329 아미노산, 또는 N-말단 메티오닌의 절단을 고려하는 경우, 328 아미노산의 길이를 갖는다. 알라닌(상기 Q베타 CP 유전자에 의해 암호화되는 두 번째 아미노산) 앞의 N-말단 메티오닌의 절단은 대개 에스케리키아 콜라이에서 발생하며, 상기와 같은 것은 상기 Q베타 피막 단백질의 N-말단에 대한 경우이다. 상기 A1 유전자의 부분인 UGA 앰버 코돈의 3'은 상기 CP 신장부를 암호화하며, 상기 신장부는 195 아미노산의 길이를 갖는다. 상기 CP 신장부의 72 번과 73 번 사이의 상기 항원성 펩타이드의 삽입은 상기 명세의 추가적인 실시태양들을 도출한다(Kozlovska et al., Intervirology 39:9-15 (1996)). C-말단 절두된 Q베타 A1 단백질의 C-말단에서 항원성 펩타이드의 융합은 상기 명세의 추가의 바람직한 실시태양을 도출한다. 예를 들어 문헌[Kozlovska et al., Intervirology, 39:9-15 (1996)]은 에피토프가 19번 위치에서 절두된 Q베타 CP 신장부의 C-말단에 융합된 Q베타 A1 단백질 융합물을 개시한다.

문헌[Kozlovska et al., Intervirology, 39:9-15 (1996)]에 개시된 바와 같이, 상기 융합된 에피토프를 표시하는 입자의 조립은 모자이크 입자를 형성하기 위해서 전형적으로는 A1 단백질-항원 융합 및 야생형 CP 모두의 존재를 필요로 한다. 그러나, 바이러스 유사 입자를 포함하고, 이에 의해 특히 RNA 파지 Q베타 피막 단백질(항원성 펩타이드가 융합된 VLP 아단위로 독점적으로 구성된다)의 VLP를 포함하는 실시태양이 또한 본 명세의 범위 내에 있다.

상기 모자이크 입자의 생산을 다수의 방식으로 수행할 수 있다. 문헌[Kozlovska et al., Intervirology, 39:9-15 (1996)]은 3 가지 방법을 개시하며, 이들 방법은 모두 상기 명세의 실시에 사용될 수 있다. 첫 번째 접근법에서, 상기 VLP 상의 융합된 에피토프의 효율적인 표시는, 클로닝된 UGA 억제 유전자 tRNA(UGA 코돈의 Trp로의 번역을 도출한다)를 암호화하는 플라스미드(plSM3001 플라스미드(Smiley et al., Gene 134:33-40 (1993)))를 갖는 에스케리키아 콜라이 균주에서 CP와 CP 신장부 사이에 상기 UGA 정지 코돈을 갖는 Q베타 A1 단백질 융합을 암호화하는 플라스미드의 발현에 의해 매개된다. 또 다른 접근법에서, 상기 CP 유전자 정지 코돈을 UAA로 변경시키고, 상기 A1 단백질-항원 융합을 발현하는 두 번째 플라스미드를 함께 형질전환시킨다. 상기 두 번째 플라스미드는 상이한 항생제 내성을 암호화하며 복제 기원은 상기 첫 번째 플라스미드와 양립성이다. 세 번째 접근법에서, CP 및 A1 단백질-항원 융합은 이중 시스트론(bicistronic) 방식으로 암호화되며, 문헌[Kozlovska et al., Intervirology, 39:9-15 (1996)]의 도 1에 개시된 바와 같이, Trp 프로모터와 같은 프로모터에 작동적으로 결합된다.

더욱이 항원 또는 항원성 결정인자의 융합에 적합한 VLP가 PCT 공개 WO 03/024481에 개시되어 있으며 박테리오파지 fr, RNA 파지 MS-2, 유두종 바이러스의 캡시드 단백질, 레트로트랜스포손 Ty, 효모 및 또한 레트로바이러스 유사 입자, HIV2 Gag, 동부(Cowpea) 모자이크 바이러스, 파르보바이러스 VP2 VLP, HBsAg(미국 특허 제 4,722,840 호 및 유럽 특허 EP 0020416B1)을 포함한다. 상기 명세의 실시에 적합한 키메릭 VLP의 예는 또한 문헌[Intervirology 39:1(1996)]에 개시된 것들이다. 본 명세에 사용하기 위해 고려되는 VLP의 추가의 예는 HPV-1, HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-33, HPV-45, CRPV, CPOV, HIV GAG 및 담배 모자이크 바이러스이다. 추가의 예로는 SV-40, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 단순 바이러스, 로타바이러스, 및 노로 바이러스의 VLP가 있다.

면역원성 담체에 결합되거나 결합되지 않은, 본 명세에 따른 항원성 타우 펩타이드를 포함하여, 상기 명세의 일부를 형성하는 임의의 재조합 발현된 펩타이드 또는 단백질의 경우, 상기 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 핵산은 또한 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터를 함유하는(자율적으로 또는 염색체로 삽입된) 숙주 세포처럼 본 명세의 태양을 형성한다. 상기 숙주 세포에서의 발현 및 그로부터의 면역원의 단리에 의해 상기 펩타이드 또는 단백질을 재조합적으로 생산하는 방법은 상기 명세의 추가의 태양이다.

또 다른 실시태양에서, 상기 명세의 펩타이드를 당해 분야에 널리 공지된 기법을 사용하여 면역원성 담체에 화학적으로 결합시킨다. 접합은 단일 점 접합(예를 들어 N-말단 또는 C-말단 점)을 통해 펩타이드의 자유 이동을 허용하도록 발생하거나, 펩타이드의 양쪽 단부가 면역원성 담체 단백질 또는 VLP와 같은 골격 구조에 접합되는 고정된 구조로서 발생할 수 있다. 상기와 같은 접합을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 접합 화학을 통해, 예를 들어 글루탐산 또는 아스파트산과 같은 접합 점으로서 통상적으로 공지된 시스테인 잔기, 리신 잔기 또는 다른 카복시 부분을 통해 수행할 수 있다. 따라서, 예를 들어 직접적인 공유 결합의 경우, CDAP 및 SPDP와 같은 통상적인 상업적으로 입수할 수 있는 이종 이작용성 연결기를 사용하여(제조자의 설명서를 사용한다), 카보다이이미드, 글루타르알데하이드 또는 (N-[y-말크이미도부티릴옥시] 숙신이미드 에스터를 사용할 수 있다. 아실하이드라진 펩타이드 유도체를 통한 단백질 담체에의 펩타이드, 특히 환화된 펩타이드의 접합 예가 PCT 공개 WO 03/092714에 개시되어 있다. 상기 결합 반응 후에, 상기 면역원을 투석 방법, 젤 여과 방법, 분별법 등에 의해 쉽게 단리하고 정제할 수 있다. 시스테인 잔기(바람직하게는 환화된 영역 밖의 연결기)로 종결되는 펩타이드를 편의상 말레이미드 화학을 통해 담체 단백질에 접합시킬 수 있다.

상기 면역원성 담체가 VLP인 경우, 동일한 아미노산 서열 또는 상이한 아미노산 서열을 갖는 여러 항원성 펩타이드를 단일 VLP 분자에 결합시켜, 바람직하게는 PCT 공보 WO 00/3227, WO 03/024481, WO 02/056905 및 WO 04/007538에 개시된 바와 같이 배향된 방식으로 여러 항원성 결정인자를 제공하는 반복적이고 정렬된 구조를 도출시킬 수 있다.

상기 명세의 하나의 태양에서, 상기 항원성 펩타이드를 화학적 가교결합에 의해, 전형적이고 바람직하게는 이종 이작용성 가교결합제를 사용함으로써 VLP에 결합시킨다. 여러 이종-이작용성 가교결합제가 당해 분야에 공지되어 있다. 일부 실시태양에서, 상기 이종 이작용성 가교결합제는 첫 번째 부착 부위, 즉 상기 VLP 또는 VLP 아단위의 리신 잔기의 측 쇄 아미노 기와 반응할 수 있는 작용기, 및 바람직한 두 번째 부착 부위, 즉 항원성 펩타이드에 융합되고 임의로 또한 환원에 의한 반응에 이용될 수 있게 제조된 시스테인 잔기와 반응할 수 있는 추가의 작용기를 함유한다. 상기 과정의 첫 번째 단계(전형적으로는 유도체화라 지칭된다)는 상기 VLP와 상기 가교결합제와의 반응이다. 상기 반응의 생성물은 활성화된 VLP(또한 활성화된 담체라 지칭된다)이다. 두 번째 단계에서, 반응하지 않은 가교결합제를 표준 방법, 예를 들어 젤 여과 또는 투석을 사용하여 제거한다. 세 번째 단계에서, 상기 항원성 펩타이드를 상기 활성화된 VLP와 반응시키며, 상기 단계를 전형적으로는 결합 단계라 칭한다. 반응하지 않은 항원성 펩타이드를 네 번째 단계에서, 예를 들어 투석에 의해 임의로 제거할 수도 있다. 여러 이종 이작용성 가교결합제가 당해 분야에 공지되어 있다. 이때, 바람직한 가교결합제 SMPH(Pierce), 설포-MBS, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-SIAB, 설포-SMPB, 설포-SMCC, SVSB, SIA 및 예를 들어 피어스 케미칼 캄파니(the Pierce Chemical Company (Rockford, IL, USA))로부터 입수할 수 있고 아미노 기에 대해 반응성인 하나의 작용기와 시스테인 잔기에 대해 반응성인 하나의 작용기를 갖는 다른 가교결합제가 있다. 상기 언급한 가교결합제들은 모두 티오에테르 결합의 형성을 도출한다.

상기 명세의 실시에 적합한 가교결합제의 또 다른 부류는 결합 시 상기 항원성 펩타이드와 VLP 간의 다이설파이드 결합의 도입을 특징으로 한다. 상기 부류에 속하는 바람직한 가교결합제는 예를 들어 SPDP 및 설포-LC-SPDP(Pierce)를 포함한다. 가교결합제에 의한 상기 VLP의 유도체화의 정도는 실험 조건, 예를 들어 각각의 반응 상대의 농도, 하나의 시약의 다른 시약에 대한 과잉, pH, 온도 및 이온 강도의 변화에 의해 영향을 받을 수 있다. 결합의 정도, 즉 상기 VLP의 아단위당 항원성 펩타이드의 양을 상기 백신의 요건에 맞도록 상술한 실험 조건들을 변화시킴으로써 조절할 수 있다.

상기 VLP에 대한 항원성 펩타이드의 또 다른 결합 방법은 상기 항원성 펩타이드 상의 시스테인 잔기와 상기 VLP의 표면상의 리신 잔기의 결합이다. 일부 실시태양에서, 상기 VLP에 결합시키기 위한 항원성 펩타이드에 대한, 두 번째 부착 부위로서 또는 그의 일부로서 시스테인 잔기를 함유하는 아미노산 연결기의 융합이 필요할 수도 있다. 일반적으로, 가요성 아미노산 연결기가 유리하다. 상기 아미노산 연결기의 예는 : (a) CGG; (b) N-말단 감마 1-연결기; (c) N-말단 감마 3-연결기; (d) Ig 힌지 영역; (e) N-말단 글리신 연결기; (f) (G)_kC(G)_n (이때 n=0 내지 12 및 k=0 내지 5); (g) N-말단 글리신-세린 연결기; (h) (G)_kC(G)_m(S)_i(GGGGS)_n (이때 n=0 내지 3, k=0 내지 5, m=0 내지 10, i=0 내지 2); (i) GGC; (k) GGC-NH2; (l) C-말단 감마 1-연결기; (m) C-말단 감마 3-연결기; (n) C-말단 글리신 연결기; (o) (G)_nC(G)_k (이때 n=0 내지 12 및 k=0 내지 5); (p) C-말단 글리신-세린 연결기; (q) (G)_m(S)_t(GGGGS)_n(G)_oC(G)_k (이때 n=0 내지 3, k=0 내지 5, m=0 내지 10, t=0 내지 2, 및 o=0 내지 8)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아미노산 연결기의 추가의 예는 면역글로불린의 힌지 영역, 글리신 세린 연결기 (GGGGS)_n, 및 글리신 연결기 (G)_n이며, 이들은 모두 두 번째 부착 부위로서 시스테인 잔기 및 임의로 추가의 글리신 잔기를 추가로 함유한다. 상기 아미노산 연결기의 전형적으로 바람직한 예는 N-말단 감마 1: CGDKTHTSPP (서열번호 94); C-말단 감마 1: DKTHTSPPCG (서열번호 95); N-말단 감마 3: CGGPKPSTPPGSSGGAP (서열번호 96); C-말단 감마 3: PKPSTPPGSSGGAPGGCG (서열번호 97); N-말단 글리신 연결기: GCGGGG (서열번호 98) 및 C-말단 글리신 연결기: GGGGCG (서열번호 99)이다.

상기 명세의 실시에 특히 적합한 다른 아미노산 연결기는 소수성 항원성 펩타이드가 VLP에 결합될 때, N-말단 연결기의 경우 CGKKGG (서열번호 100), 또는 CGDEGG (서열번호 101), 또는 C-말단 연결기의 경우 GGKKGC (서열번호 102) 및 GGEDGC (서열번호 103)이다. 상기 C-말단 연결기의 경우, 상기 말단 시스테인은 임의로 C-말단 아미드화된다.

본 명세의 일부 실시태양에서, 상기 펩타이드의 C-말단에서 GGCG(서열번호 104), GGC 또는 GGC-NH2("NH2"는 아미드화를 나타낸다) 연결기 또는 그의 N-말단에서 CGG는 아미노산 연결기로서 바람직하다. 일반적으로, 글리신 잔기가 상기 결합 반응에서 보다 벌크한 아미노산의 잠재적인 입체 장애를 피하기 위해서 두 번째 부착 부위로서 사용되는 시스테인과 벌키 아미노산 사이에 삽입될 것이다. 상기 명세의 추가의 실시태양에서, 상기 아미노산 연결기 GGC-NH2는 상기 항원성 펩타이드의 C-말단에 융합된다.

상기 항원성 펩타이드 상에 존재하는 시스테인 잔기는 바람직하게는 상기 활성화된 VLP 상의 이종-이작용성 가교결합제와 반응하기 위해 환원된 상태로 존재한다, 즉 유리 시스테인 또는 유리 설프하이드릴 기를 갖는 시스테인 잔기가 이용될 것이다. 상기 시스테인 잔기가 산화된 형태로 결합 부위로서 작용하는 경우에, 예를 들어 상기 잔기가 다이설파이드 가교를 형성하는 경우에, 예를 들어 DTT, TCEP 또는 p-머캅토에탄올에 의한 상기 다이설파이드 가교의 환원이 바람직하다. 저 농도의 환원제가 PCT 공보 WO 02/05690에 개시된 바와 같이 결합에 적합한 반면, 보다 높은 농도는 상기 결합 반응을 억제하며, 숙련가가 알고 있는 바와 같이, 이 경우 결합 전에 예를 들어 투석, 젤 여과 또는 역상 HPLC에 의해 상기 환원제를 제거하거나 그의 농도를 감소시켜야 한다.

상술한 방법에 따라 이종-이작용성 가교결합제를 사용하여 상기 VLP에 항원성 펩타이드를 결합시키는 것은 상기 항원성 펩타이드를 상기 VLP에 배향된 방식으로 결합될 수 있게 한다. 상기 VLP에 항원성 펩타이드를 결합시키는 다른 방법은 상기 항원성 펩타이드를 카보다이이미드 EDC, 및 NHS를 사용하여 상기 VLP에 가교결합시키는 방법을 포함한다.

다른 방법들에서, 상기 항원성 펩타이드를 동종-이작용성 가교결합제, 예를 들어 글루타르알데하이드, DSGBM [PEO] 4, BS3, (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA) 또는 상기 VLP의 아민 기 또는 카복실 기에 대해 반응성인 작용기를 갖는 다른 공지된 동종-이작용성 가교결합제를 사용하여 상기 VLP에 부착시킨다.

상기 VLP를 항원성 펩타이드에 결합시키는 다른 방법은 상기 VLP를 비오틴화하고, 상기 항원성 펩타이드를 스트렙트아비딘-융합 단백질로서 발현시키는 방법, 또는 상기 항원성 펩타이드와 VLP를 모두, 예를 들어 PCT 공보 WO 00/23955에 개시된 바와 같이 비오틴화시키는 방법을 포함한다. 이 경우에, 상기 항원성 펩타이드를 먼저, 유리 결합 부위가 여전히 상기 VLP(다음 단계에 첨가된다)의 결합에 이용될 수 있도록 항원성 펩타이드 대 스트렙트아비딘의 비를 조절함으로써 스트렙트아비딘 또는 아비딘에 결합시킬 수 있다. 한편으로, 모든 성분들을 "단일 용기" 반응으로 혼합할 수 있다. 다른 리간드-수용체 쌍(이 경우 상기 수용체 및 리간드의 수용성 형태를 이용할 수 있으며 상기 형태는 상기 VLP 또는 항원성 펩타이드에 가교결합될 수 있다)을, 항원성 펩타이드를 VLP에 결합시키기 위한 결합제로서 사용할 수도 있다. 한편으로, 상기 리간드나 수용체를 상기 항원성 펩타이드에 융합시킬 수 있으며, 따라서 이들은 상기 수용체 또는 상기 리간드 각각에 대해 화학적으로 결합되거나 융합되는 VLP에 대한 결합을 매개할 수 있다. 융합을 또한 삽입 또는 치환에 의해 수행할 수도 있다.

하나 또는 여러 항원 분자를, 바람직하게는 입체적으로 허용되는 경우 RNA 파지의 VLP의 노출된 리신 잔기를 통해, 상기 RNA 파지 피막 단백질의 캡시드 또는 VLP의 하나의 아단위에 부착시킬 수 있다. 따라서 상기 RNA 파지의 피막 단백질의 VLP 또는 특히 Q베타 피막 단백질 VLP의 독특한 특징은 아단위당 여러 항원을 결합시키는 가능성이다. 이는 치밀한 항원 배열의 생성을 허용한다.

상기 명세의 하나의 실시태양에서, 상기 바이러스 유사 입자에 대한 하나 이상의 항원 또는 항원성 결정인자의 결합 및 부착은 각각, 상기 바이러스 유사 입자의 하나 이상의 첫 번째 부착 부위와 상기 항원성 펩타이드의 하나 이상의 두 번째 부착 간의 상호작용 및 회합 각각에 의해서이다.

Q베타 피막 단백질의 VLP 또는 캡시드는 그의 표면상에 한정된 수의 리신 잔기를 나타내며, 이때 상기 표면은, 상기 캡시드의 내부를 향하고 상기 RNA와 상호작용는 3 개의 리신 잔기, 및 상기 캡시드의 외부에 노출된 4 개의 다른 리신 잔기를 갖는 한정된 위상을 갖는다. 이들 한정된 성질은 상기 리신 잔기가 RNA와 상호작용하는 상기 입자의 내부보다는 상기 입자의 외부에의 항원의 부착에 유리하다. 다른 RNA 파지 피막 단백질의 VLP가 또한 그의 표면상에 한정된 수의 리신 잔기 및 상기 리신 잔기의 한정된 위상을 갖는다.

본 명세의 추가의 실시태양에서, 상기 첫 번째 부착 부위는 리신 잔기이고/이거나 상기 두 번째 부착은 설프하이드릴 기 또는 시스테인 잔기를 포함한다. 본 명세의 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 첫 번째 부착 부위는 리신 잔기이고 두 번째 부착 부위는 시스테인 잔기이다. 추가의 실시태양에서, 상기 항원 또는 항원성 결정인자는 시스테인 잔기를 통해, 상기 RNA 파지 피막 단백질의 VLP의 리신 잔기, 및 특히 Q베타 피막 단백질의 VLP에 결합된다.

RNA 파지로부터 유래된 VLP의 또 다른 이점은 알맞은 비용으로 다량의 물질을 생산할 수 있게 하는 세균에서의 높은 발현 수율이다. 더욱이, 담체로서 상기 VLP의 사용은 가변적인 항원 밀도와 함께, 각각 확고한 항원 배열 및 접합체를 형성할 수 있게 한다. 특히, RNA 파지의 VLP의 사용 및 이에 따라 특히 RNA 파지 Q베타 피막 단백질의 VLP의 사용은 매우 높은 항원 밀도를 성취할 수 있게 한다.

일부 실시태양에서, 면역원성 조성물은 면역원성 접합체, 즉 하나 또는 여러 항원성 타우 펩타이드에 결합된 면역원성 담체의 혼합물을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 면역원성 조성물은 아미노산 서열이 상이한 면역원성 담체들로 구성될 수 있다. 예를 들어, "야생형" VLP, 및 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경된(예를 들어 결실되거나, 삽입되거나 치환된) 변형된 VLP 단백질을 포함하는 백신 조성물을 제조할 수 있다. 한편으로, 동일한 면역원성 담체를 사용할 수도 있지만 상기 항체를 상이한 아미노산 서열의 항원성 타우 펩타이드에 결합시킬 수도 있다.

따라서 본원은 i) 상기 명세에 따른 항원성 타우 펩타이드를 제공하고, ii) 상기 명세에 따른 면역원성 담체, 바람직하게는 VLP를 제공하고, iii) 상기 항원성 타우 펩타이드 및 상기 면역원성 담체를 결합시킴을 포함하는 면역원의 제조 방법에 관한 것이다. 하나의 실시태양에서, 상기 결합 단계는 화학적 가교결합을 통해, 바람직하게는 이종 이작용성 가교결합제를 통해 발생한다.

항원성 타우 펩타이드를 포함하는 조성물

본원은 또한, 바람직하게는 면역원성 담체, 보다 바람직하게는 VLP, 훨씬 더 바람직하게는 HBsAg, HBcAg, 또는 Q베타 VLP에 결합된, 상기 명세의 항원성 타우 펩타이드, 및 임의로 하나 이상의 항원보강제를 포함하는 조성물, 특히 "주 면역원성 조성물"이라고도 지칭되는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 상기와 같은 면역원성 조성물은, 특히 약학 조성물로서 제형화될 때, 타우-관련된 질환, 예를 들어 알쯔하이머 병의 예방, 치료 또는 경감에 유용한 듯하다.

면역원성 조성물

일부 실시태양에서, 본 명세에 따른 주 면역원성 조성물은 서열번호 1 내지 26, 31 내지 76, 및 105 내지 122로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항원성 타우 펩타이드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 항원성 타우 펩타이드를 면역원성 담체, 바람직하게는 VLP, 보다 바람직하게는 HBsAg, HBcAg 또는 Q베타 VLP에 결합시킨다.

상기 명세에 따른 항원성 타우 펩타이드를 포함하는 주 면역원성 조성물을 하기에 보다 상세히 개시하는 바와 같이, 다수의 방식으로 제형화할 수 있다.

일부 실시태양에서, 주 면역원성 조성물은 단일 종의 항원성 타우 펩타이드를 포함한다, 예를 들어 상기 면역원성 조성물은 실질적으로 전부가 동일한 아미노산 서열을 갖는 항원성 타우 펩타이드의 집단을 포함한다. 다른 실시태양에서, 주 면역원성 조성물은 2 개 이상의 상이한 항원성 타우 펩타이드를 포함한다, 예를 들어 상기 면역원성 조성물은, 집단의 구성원들의 아미노산 서열이 상이할 수 있는 항원성 타우 펩타이드 집단을 포함한다.

예를 들어, 일부 실시태양에서, 주 면역원성 조성물은 바람직하게는 면역원성 담체, 보다 바람직하게는 VLP, 훨씬 더 바람직하게는 HBsAg, HBcAg 또는 Q베타 VLP에 결합되고 서열번호 1 내지 26, 31 내지 76, 및 105 내지 122로부터 선택된 제 1 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항원성 타우 펩타이드; 및 면역원성 담체, 보다 바람직하게는 VLP, 훨씬 더 바람직하게는 HBsAg, HBcAg 또는 Q베타 VLP에 결합되고 바람직하게는 서열번호 1 내지 26, 31 내지 76, 및 105 내지 122로부터 선택된 제 2 아미노산 서열을 포함하는, 적어도 제 2 항원성 타우 펩타이드를 포함하며, 이때 상기 제 2 아미노산 서열은 상기 제 1 아미노산 서열과 1, 2, 3, 4, 5, 6 내지 10, 또는 15 개 아미노산까지 상이하다.

또 다른 예로서, 주 면역원성 조성물은 바람직하게는 면역원성 담체, 보다 바람직하게는 VLP, 훨씬 더 바람직하게는 HBsAg, HBcAg 또는 Q베타 VLP에 결합되고 서열번호 1 내지 26, 31 내지 76, 및 105 내지 122로부터 선택된 제 1 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항원성 타우 펩타이드; 바람직하게는 면역원성 담체, 보다 바람직하게는 VLP, 훨씬 더 바람직하게는 HBsAg, HBcAg 또는 Q베타 VLP에 결합되고 바람직하게는 서열번호 1 내지 26, 31 내지 76, 및 105 내지 122로부터 선택된 제 2 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항원성 타우 펩타이드(이때 상기 제 2 아미노산 서열은 상기 제 1 아미노산 서열과 1, 2, 3, 4, 5, 6 내지 10, 또는 15 개 아미노산까지 상이하다); 및 바람직하게는 면역원성 담체, 보다 바람직하게는 VLP, 훨씬 더 바람직하게는 HBsAg, HBcAg 또는 Q베타 VLP에 결합되고 바람직하게는 서열번호 1 내지 26, 31 내지 76, 및 105 내지 122로부터 선택된 제 3 아미노산 서열을 포함하는, 적어도 제 3 항원성 타우 펩타이드(이때 상기 제 3 아미노산 서열은 상기 제 1 및 제 2 아미노산 서열 모두와 1, 2, 3, 4, 5, 6 내지 10, 또는 15 개 아미노산까지 상이하다)를 포함한다.

다른 실시태양에서, 주 면역원성 조성물은 상술한 바와 같이, 다량체화된 항원성 타우 펩타이드를 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "항원성 타우 펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물" 또는 "상기 명세의 면역원성 조성물" 또는 "주 면역원성 조성물"은 면역원성 담체에 결합되거나 결합되지 않은 단일 종(다량체화되거나 되지 않은) 또는 다수 종의 항원성 타우 펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물을 지칭한다.

항원보강제

일부 실시태양에서, 주 면역원성 조성물은 하나 이상의 항원보강제를 포함한다. 적합한 항원보강제는 포유동물, 바람직하게는 인간에 사용하기에 적합한 것들을 포함한다. 인간에 사용될 수 있는 공지된 적합한 항원보강제의 예로는 비제한적으로 알룸, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드, MF59^TM(4.3% w/v 스쿠알렌, 0.5% w/v 폴리솔베이트 80(트윈 80), 0.5% w/v 솔비탄 트라이올리에이트(스판 85), CpG-함유 핵산(이때 사이토신은 메틸화되지 않는다), QS21(사포닌 항원보강제), MPL(모노포스포릴 지질 A), 3DMPL(3-O-탈아실화된 MPL), 아퀼라(Aquilla)로부터의 추출물, ISCOMS(예를 들어 문헌[Sjolander et al., J. Leukocyte Biol . 64:713 (1998)]; PCT 공보 WO 90/03184, WO 96/11711, WO 00/48630, WO 98/36772, WO 00/41720, WO 06/134423 및 WO 07/026190을 참조하시오), LT/CT 돌연변이체, 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드)(PLG) 미세입자, 퀼(Quil) A, 인터류킨 등이 있다. 비제한적으로 동물 실험을 포함한 수의학적 용도를 위해서, 프로인트, N-아세틸-뮤라밀-L-쓰레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, 노르-MDP라 칭한다), N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-다이팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP 19835A, MTP-PE라 칭한다), 및 RIBI(2% 스쿠알렌/트윈 80 유화액 중의, 세균으로부터 추출된 3 개 성분, 모노포스포릴 지질 A, 트레할로스 다이마이콜레이트 및 세포벽 골격(MPL+TDM+CWS)을 함유한다)를 사용할 수 있다.

상기 조성물의 유효성을 증대시키기 위한 추가의 예시적인 항원보강제는 비제한적으로 (1) 수중 유적형 유화액 제형(다른 특정한 면역자극제, 예를 들어 뮤라밀 펩타이드(하기 참조) 또는 세균 세포벽 성분이 있거나 없다), 예를 들어 (a) 미세유동화제를 사용하여 1 ㎛ 이하의 입자로 제형화한, 5% 스쿠알렌, 0.5% 트윈 80(폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노-올리에이트) 및 0.5% 스판 85(솔비탄 트라이올리에이트)를 함유하는 MF59^TM(PCT 공보 WO 90/14837; Chapter 10 in Vaccine design : the subunit and adjuvant approach , eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995)(다이팔미토일 포스파티딜에탄올아민(MTP-PE)에 공유 결합된 뮤라밀 트라이-펩타이드를 임의로 함유한다), (b) 1 ㎛ 이하의 유화액으로 미세유동화되거나 보다 큰 입자 크기 유화액이 생성되도록 와동된, 10% 스쿠알렌, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉-차단된 중합체 L121, 및 thr-MDP를 함유하는 SAF, 및 (c) 2% 스쿠알렌, 0.2% 트윈 80, 및 하나 이상의 세균 세포 벽 성분, 예를 들어 모노포스포릴 지질 A(MPL), 트레할로스 다이마이콜레이트(TDM), 및 세포 벽 골격(CWS), 바람직하게는 MPL + CWS(DETOX^TM)를 함유하는 RIBI^TM 항원보강제 시스템(RAS)(Ribi Immunochem, Hamilton, MT, USA); (2) 사포닌 항원보강제, 예를 들어 QS21, STIMULON^TM(Cambridge Bioscience, Worcester, MA), 아비스코(Abisco)(등록상표)(Isconova, Sweden), 또는 아이스코매트릭스(Iscomatrix)(등록상표)(Commonwealth Serum Laboratories, Australia)를 사용하거나, 이로부터 생성된 입자, 예를 들어 ISCOM(면역자극 복합체)(상기 ISCOMS는 추가적인 세제가 없을 수도 있다), 예를 들어 PCT 공보 WO 00/07621; (3) 완전 프로인트 항원보강제(CFA) 및 불완전 프로인트 항원보강제(IFA); (4) 사이토킨, 예를 들어 인터류킨(예를 들어 IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (PCT 공보 WO 99/44636) 등), 인터페론(예를 들어 감마 인터페론), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF) 등; (5) 모노포스포릴 지질 A(MPL) 또는 3-O-탈아실화된 MPL(3dMPL), 예를 들어 영국 특허 제 GB-2220221 호 및 유럽 특허 제 EP-A-0689454, 임의로 폐렴 구균 사카라이드와 함께 사용될 때 알룸의 실질적인 부재 하에서, 예를 들어 PCT 공보 WO 00/56358; (6) 3dMPL과 예를 들어 QS21 및/또는 수중 유적형 유화액과의 조합, 예를 들어 EP-A-0835318, EP-A-0735898, EP-A-0761231; (7) CpG 동기[Krieg, Vaccine (2000) 19:618-622; Krieg, Curr Opin Mol Ther (2001) 3:15-24; Roman et al., Nat . Med . (1997) 3:849-854; Weiner et al ., PNAS USA (1997) 94:10833-10837; Davis et al , J. Immunol (1998) 160:870-876; Chu et al ., J. Exp . Med (1997) 186:1623-1631; Lipford et al , Ear . J. Immunol . (1997) 27:2340-2344; Moldoveami e/ al ., Vaccine (1988) 16:1216-1224, Krieg et al ., Nature (1995) 374:546-549; Klinman et al ., PNAS USA (1996) 93:2879-2883; Ballas et al , J. Immunol, (1996) 157:1840-1845; Cowdery et al , J. Immunol (1996) 156:4570-4575; Halpern et al , Cell Immunol . (1996) 167:72-78; Yamamoto et al , Jpn . J. Cancer Res ., (1988) 79:866-873; Stacey et al , J. Immunol ., (1996) 157:2116-2122; Messina et al , J. Immunol , (1991) 147:1759-1764; Yi et al , J. Immunol (1996) 157:4918-4925; Yi et al , J. Immunol (1996) 157:5394-5402; Yi et al , J. Immunol, (1998) 160:4755-4761; and Yi et al , J. Immunol , (1998) 160:5898-5906; PCT 공보 WO 96/02555, WO 98/16247, WO 98/18810, WO 98/40100, WO 98/55495, WO 98/37919 및 WO 98/52581]를 포함하는, 즉 하나 이상의 CG 다이뉴클레오타이드를 함유하는 올리고뉴클레오타이드(이때 타이로신은 메틸화되지 않는다); (8) 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 폴리옥시에틸렌 에스터, 예를 들어 PCT 공보 WO 99/52549; (9) 옥톡시놀과 병용되는 폴리옥시에틸렌 솔비탄 에스터 계면활성제(PCT 공보 WO 01/21207) 또는 하나 이상의 추가적인 비이온성 계면활성제, 예를 들어 옥톡시놀과 병용되는 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 또는 에스터 계면활성제(PCT 공보 WO 01/21152); (10) 사포닌 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드(예를 들어 CpG 올리고뉴클레오타이드)(PCT 공보 WO 00/62800); (11) 면역자극제 및 금속염의 입자, 예를 들어 PCT 공보 WO 00/23105; (12) 사포닌 및 수중 유적형 유화액, 예를 들어 PCT 공보 WO 99/11241; (13) 사포닌(예를 들어 QS21) + 3dMPL + IM2(임의로 + 스테롤), 예를 들어 PCT 공보 WO 98/57659; (14) 상기 조성물의 효능을 증대시키기 위한 면역자극제로서 작용하는 다른 물질, 예를 들어 N-아세틸-뮤라밀-L-쓰레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-25 아세틸-노르뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(노르-MDP), N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타르니닐-L-알라닌-2-(1'-2'-다이팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민 MTP-PE)를 포함한 뮤라밀 펩타이드, (15) 천연 또는 합성된 톨형 수용체(TLR)에 대한 리간드(예를 들어 문헌[Kanzler et al., Nature Med. 13:1552-1559(2007)]에 개시된 바와 같은), 예를 들어 TLR3 리간드, 예를 들어 폴릴:C 및 유사한 화합물, 예 를 들어 힐톤올(Hiltonol) 및 암플리젠(Ampligen)을 포함한다.

하나의 실시태양에서, 본 명세의 면역원성 조성물은 하나 이상의 항원보강제를 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 항원보강제는 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 보다 바람직하게는 CpG 올리고뉴클레오타이드이다. 하나의 실시태양에서, 상기 CpG 올리고뉴클레오타이드는 핵산 서열 5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3'(CpG 7909; 서열번호 27)을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 상기 CpG 올리고뉴클레오타이드는 핵산 서열 5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3'(CpG 24555; 서열번호 29)을 갖는다. 서열번호 29의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 핵산 서열은 가장 3'쪽 CG 다이뉴클레오타이드의 역전에 의해 앞서 보고된 면역자극성 올리고뉴클레오타이드(CpG 10103) 5'TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3'(서열번호 28)와 상이하다. 이들 두 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 간의 활성 유사성은 CpG 올리고뉴클레오타이드의 면역자극 활성이 CpG 동기의 수, 상기 CG 다이뉴클레오타이드에 측면 인접하는 서열, 상기 CpG 동기의 위치 및 상기 CpG 동기들 간의 간격에 의존하는 것으로 앞서 보고되었기 때문에 놀라운 것이다(Ballas et al., 1996, J. Immunol.; Hartmann et al., 2000, J. Immunol.; Klinman et al., 2003, Clin . Exp . Immunol). 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 CpG 24555에서 가장 3'쪽 CG 다이뉴클레오타이드의 제거는 선행 명세로부터 예상된 바와 같은 항원-특이성 면역 반응을 증대시키는 상기 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 능력에 부정적인 영향을 미치지 않았다. CpG 24555는 CpG 10103과 비교 시 유사한, 및 일부의 경우 향상된 면역자극 활성을 나타내었다.

상기 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 이중 가닥이거나 단일 가닥일 수 있다. 일반적으로, 이중 가닥 분자는 생체 내에서 보다 안정한 반면, 단일 가닥 분자는 증가된 면역 활성을 갖는다. 따라서, 상기 명세의 일부 태양에서, 상기 핵산은 단일 가닥인 것이 바람직하고 다른 태양에서는 상기 핵산이 이중 가닥인 것이 바람직하다.

본 발명에 개시된 CpG 서열들 중 임의의 것(예를 들어 CpG 24555, CpG 10103, 및 CpG 7909)에 대해서, 상기 뉴클레오타이드 간 결합들 중 임의의 것은 포스포로티오에이트 또는 포스포다이에스터 결합일 수 있다.

"핵산" 및 "올리고뉴클레오타이드"란 용어는 다수의 뉴클레오타이드(즉 포스페이트 기 및 교환가능한 유기 염기(치환된 피리미딘(예를 들어 시토신(C), 티미딘(T) 또는 유라실(U)) 또는 치환된 퓨린(예를 들어 아데닌(A) 또는 구아닌(G))이다)에 결합된 당(예를 들어 리보스 또는 데옥시리보스)을 포함하는 분자)를 의미하는 것으로 본 발명에서 호환 사용된다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 올리고리보뉴클레오타이드(즉 폴리뉴클레오타이드 - 포스페이트) 및 임의의 다른 유기 염기 함유 중합체를 지칭한다. 핵산 분자를 기존의 핵산 출처(예를 들어 게놈 또는 cDNA)로부터 수득할 수 있으나, 바람직하게는 합성적이다(예를 들어 핵산 합성에 의해 생산된다).

하나의 실시태양에서, 상기 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 포스포다이에스터 뉴클레오사이드 간 가교, β-D-리보스(데옥시리보스) 단위 및/또는 천연 뉴클레오사이드 염기(아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 유라실)를 수반하는 천연 RNA 및 DNA에 비해, 다양한 화학적 변형 및 치환을 포함할 수 있다. 화학적 변형의 예는 숙련가에게 공지되어 있으며 예를 들어 하기의 문헌들에 개시되어 있다: Uhlmann E. et al. (1990), Chem. Rev. 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke, S.T. et al. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:107-129; and Hunziker J. et al., (1995), Mod. Synth. Methods 7:331-417. 상기 명세에 따른 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형을 가질 수도 있으며, 이때 각각의 변형은 천연 DNA 또는 RNA로 구성된 동일한 서열의 올리고뉴클레오타이드에 비해 특정한 포스포다이에스터 뉴클레오사이드 간 가교 및/또는 특정 β-D-(데옥시)리보스 단위 및/또는 특정한 천연 뉴클레오사이드 염기 위치에 위치한다.

예를 들어, 상기 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 상기와 같은 변형은 a) 변형된 뉴클레오사이드 간 가교에 의한 뉴클레오사이드의 3' 및/또는 5' 단부에 위치한 포스포다이에스터 뉴클레오사이드 간 가교의 치환, b) 데포스포 가교에 의한 뉴클레오사이드의 3' 및/또는 5' 단부에 위치한 포스포다이에스터 가교의 치환, c) 또 다른 단위에 의한 당 포스페이트 주쇄로부터의 당 포스페이트 단위의 치환, d) 변형된 당 단위에 의한 β-D-리보스 단위의 치환, 및 e) 천연 뉴클레오사이드 염기의 치환으로부터 선택될 수 있다.

핵산은 또한 치환된 퓨린 및 피리미딘, 예를 들어 C-5 프로핀 피리미딘 및 7-데아자-7-치환된 퓨린 변형된 염기를 포함한다(Wagner et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14:840-4). 퓨린 및 피리미딘은 비제한적으로 아데닌, 시토신, 구아닌, 티미딘, 5-메틸시토신, 2-아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 하이포잔틴, 및 다른 천연 및 비천연 핵염기, 치환 및 비치환된 방향족 부분을 포함한다. 다른 상기와 같은 변형은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다.

변형된 염기는 DNA 및 RNA에서 전형적으로 발견되는 천연 염기, 예를 들어 T, C, G, A 및 U와 화학적으로 상이하지만, 이들 천연 염기와 기본적인 화학 구조는 공유한다. 상기 변형된 뉴클레오사이드 염기는 예를 들어 하이포잔틴, 유라실, 다이하이드로유라실 슈도유라실, 2-티오유라실, 4-티오유라실, 5-아미노유라실, 5-(C1-C6)-알킬유라실, 5-(C2-C6)-알케닐유라실, 5-(C2-C6)-알킬닐유라실, 5-(하이드록시메틸)유라실, 5-클로로유라실, 5-플루오로유라실, 5-브로모유라실, 5-하이드록시시토신, 5-(C1-C6)-알킬시토신, 5-(C2-C6)-알케닐시토신, 5-(C2-C6)-알킬닐시토신, 5-클로로시토신, 5-플루오로시토신, 5-브로모시토신, N2-다이메틸구아닌, 2,4-다이아미노-퓨린, 8-아자퓨린, 치환된 7-데아자퓨린, 바람직하게는 7-데아자-7-치환된 및/또는 7-데아자-8-치환된 퓨린, 5-하이드록시메틸시토신, N4-알킬시토신, 예를 들어 N4-에틸시토신, 5-하이드록시데옥시시티딘, 5-하이드록시메틸데옥시시티딘, N4-알킬데옥시시티딘, 예를 들어 N4-에틸데옥시시티딘, 6-티오데옥시구아노신, 및 나이트로피롤의 데옥시리보뉴클레오사이드, C5-프로피닐피리미신, 및 다이아미노퓨린, 예를 들어 2,6-다이아미노퓨린, 이노신, 5-메틸시토신, 2-아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린, 하이포잔틴 또는 천연 뉴클레오사이드 염기의 다른 변형으로부터 선택될 수 있다. 상기 목록은 예시적인 것을 의미하며 제한인 것으로 해석해서는 안 된다.

상기 명세의 일부 태양에서, 본 발명에 개시된 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 CpG 다이뉴클레오타이드는 바람직하게는 메틸화되지 않는다. 메틸화되지 않은 CpG 동기는 메틸화되지 않은 시토신-구아닌 다이뉴클레오타이드 서열이다(즉 메틸화되지 않은 5' 시토신에 이어서 3' 구아노신이 있고 포스페이트 결합에 의해 결합된다). 다른 태양에서, 상기 CpG 동기는 메틸화된다. 메틸화된 CpG 동기는 메틸화된 시토신-구아닌 다이뉴클레오타이드 서열이다(즉 메틸화된 5' 시토신에 이어서 3' 구아노신이 있고 포스페이트 결합에 의해 결합된다).

상기 명세의 일부 태양에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 변형된 시토신을 함유할 수 있다. 변형된 시토신은 상기 올리고뉴클레오타이드의 면역자극 활성을 손상시키지 않으면서 상기 염기를 대체할 수 있는 시토신의 천연 또는 비천연 피리미딘 염기 동족체이다. 변형된 시토신은 비제한적으로 5-치환된 시토신(예를 들어 5-메틸-시토신, 5-플루오로-시토신, 5-클로로-시토신, 5-브로모-시토신, 5-요오도-시토신, 5-하이드록시-시토신, 5-하이드록시메틸-시토신, 5-다이플루오로메틸-시토신, 및 비치환되거나 치환된 5-알키닐-시토신), 6-치환된 시토신, N4-치환된 시토신(예를 들어 N4-에틸-시토신), 5-아자-시토신, 2-머캅토-시토신, 이소시토신, 슈도-이소시토신, 축합된 고리 시스템을 갖는 시토신 동족체(예를 들어 N,N'-프로필렌 시토신 또는 페녹사진), 및 유라실 및 그의 유도체(예를 들어 5-플루오로-유라실, 5-브로모-유라실, 5-브로모비닐-유라실, 4-티오-유라실, 5-하이드록시-유라실, 5-프로피닐-유라실)를 포함한다. 상기 바람직한 시토신 중 일부는 5-메틸-시토신, 5-플루오로-시토신, 5-하이드록시-시토신, 5-하이드록시메틸-시토신, 및 N4-에틸-시토신을 포함한다. 상기 명세의 또 다른 실시태양에서, 상기 시토신 염기는 보편적인 염기(예를 들어 3-나이트로피롤, P-염기), 방향족 고리 시스템(예를 들어 플루오로벤젠 도는 다이플루오로벤젠) 또는 수소 원자(dSpacer)에 의해 치환된다.

상기 명세의 일부 태양에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 변형된 구아닌을 함유할 수 있다. 변형된 구아닌은 상기 올리고뉴클레오타이드의 면역자극 활성을 손상시키지 않으면서 상기 염기를 대체할 수 있는 구아닌의 천연 또는 비천연 퓨린 염기 동족체이다. 변형된 구아닌은 비제한적으로 7-데아자구아닌, 7-데아자-7-치환된 구아닌, 하이포잔틴, N2-치환된 구아닌(예를 들어 N2-메틸-구아닌), 5-아미노-3-메틸-3H,6H-티아졸로[4,5-d]피리미딘-2,7-다이온, 2,6-다이아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 퓨린, 인돌, 아데닌, 치환된 아데닌(예를 들어 N6-메틸-아데닌, 8-옥소-아데닌), 8-치환된 구아닌(예를 들어 8-하이드록시구아닌 및 8-브로모구아닌), 및 6-티오구아닌을 포함한다. 상기 명세의 또 다른 실시태양에서, 상기 구아닌 염기는 보편적인 염기(예를 들어 4-메틸-인돌, 5-나이트로-인돌, 및 K-염기), 방향족 고리 시스템(예를 들어 벤즈이미다졸 또는 다이클로로-벤즈이미다졸, 1-메틸-1H-[1,2,4]트라이아졸-3-카복실산 아미드) 또는 수소 원자(dSpacer)에 의해 치환된다.

몇몇 실시태양에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드 간 결합을 포함할 수도 있다. 이들 변형된 결합은 분해에 대해 부분적으로 내성일 수 있다(예를 들어 안정화된다). "안정화된 핵산 분자"란 용어는 생체 내 분해(예를 들어 엑소- 또는 엔도-뉴클레아제를 통해)에 비교적 내성인 핵산 분자를 의미한다. 안정화는 길이 또는 2차 구조의 함수일 수 있다. 수십 내지 수백 킬로염기 길이의 핵산은 생체 내 분해에 대해 비교적 내성이다. 보다 짧은 핵산의 경우, 2차 구조는 그의 효과를 안정화 및 증가시킬 수 있다. 머리핀(stem loop) 구조의 형성은 핵산 분자를 안정화시킬 수 있다. 예를 들어, 핵산의 3' 단부가 다시 접혀 머리핀 구조를 형성하도록 상부 영역에 대해 자기-상보성을 갖는 경우, 상기 핵산은 안정화되고 보다 큰 활성을 나타낼 수 있다.

생체 내 용도의 경우, 핵산은 바람직하게는 분해(예를 들어 엔도- 및 엑소-뉴클레아제를 통해)에 대해 비교적 내성이다. 상기 핵산 주 쇄의 변형은 생체 내로 투여될 때 핵산의 향상된 활성을 제공하는 것으로 나타났다. 2차 구조, 예를 들어 머리핀은 핵산을 분해에 대해 안정화시킬 수 있다. 한편으로, 핵산 안정화는 포스페이트 주 쇄 변형을 통해 수행될 수 있다. 바람직한 안정화된 핵산은 적어도 부분적으로 포스포티오에이트 변형된 주 쇄를 갖는다. 포스포로티오에이트를 포스포아미데이트 또는 H-포스포네이트 화학을 사용하는 자동화된 기법을 사용하여 합성시킬 수 있다. 아릴- 및 알킬-포스포네이트를, 예를 들어 미국 특허 제 4,469,863 호에 개시된 바와 같이 제조할 수 있고; 알킬포스포트라이에스터(이때 하전된 산소 부분은 미국 특허 제 5,023,243 호 및 유럽 특허 제 092,574 호에 개시된 바와 같이 알킬화된다)를 상업적으로 입수할 수 있는 시약을 사용하여 자동화된 고상 합성에 의해 제조할 수 있다. 다른 DNA 주 쇄 변형 및 치환을 만드는 방법들이 개시되었다(Uhlmann, E. and Peyman, A. (1990) Chem. Rev. 90:544; Goodchild, J. (1990) Bioconjugate Chem. 1:165). CpG 동기를 갖는 2'-O-메틸 핵산은 또한 에톡시-변형된 CpG 핵산과 같이, 면역 활성화를 유발시킨다. 실제로, 상기 CpG 효과를 완전히 제거하는 주 쇄 변형은 발견되지 않았지만, 상기 효과는 상기 C를 5-메틸 C로 대체함으로써 크게 감소된다. 포스포로티오에이트 결합을 갖는 구조물은 최대 활성을 제공하며 세포 내 엑소- 및 엔도-뉴클레아제에 의한 분해로부터 상기 핵산을 보호한다. 다른 변형된 핵산은 포스포다이에스터 변형된 핵산, 포스포다이에스터와 포스포로티오에이트 핵산의 조합, 메틸포스포네이트, 메틸포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, p-에톡시, 및 이들의 조합을 포함한다. 각각의 이들 조합 및 면역 세포에 대한 이들의 특정한 효과가 CpG 핵산에 대하여 PCT 공보 WO 96/02555 및 WO 98/18810 및 미국 특허 제 6,194,388 호 및 제 6,239,116 호에 보다 상세히 논의되어 있다. 이들 변형된 핵산은 향상된 뉴클레아제 내성, 증가된 세포 흡수, 증가된 단백질 결합, 및/또는 변경된 세포 내 위치로 인해 보다 자극적인 활성을 나타낼 수 있는 것으로 여겨진다.

생체 내 투여를 위해서, 핵산을, 표적 세포(예를 들어 수지상 세포, B-세포, 단핵세포 및 천연 살해(NK) 세포) 표면에 대한 보다 높은 친화성 결합 및/또는 표적 세포에 의한 증가된 세포 흡수를 생성시켜 "핵산 전달 복합체"를 형성시키는 분자와 회합시킬 수 있다. 핵산을 당해 분야에 널리 공지된 기법을 사용하여 적합한 분자와 이온에 의해 또는 공유적으로 회합시킬 수 있다. 다양한 결합제 또는 가교결합제, 예를 들어 단백질 A, 카보다이이미드, 및 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오) 프로피오네이트(SPDP)를 사용할 수 있다. 한편으로 핵산을 널리 공지된 기법을 사용하여 리포솜 또는 바이로솜으로 캡슐화할 수 있다.

다른 안정화된 핵산은 비제한적으로 비이온성 DNA 동족체, 예를 들어 알킬- 및 아릴-포스페이트(이때 하전된 포스포네이트 산소는 알킬 또는 아릴 기에 의해 치환된다), 포스포다이에스터 및 알킬포스포트라이에스터(이때 상기 하전된 산소 부분은 알킬화된다)를 포함한다. 다이올, 예를 들어 테트라에틸렌글리콜 또는 헥사에틸렌글리콜을 어느 한쪽 또는 양쪽 말단에 함유하는 핵산이 또한 뉴클레아제 분해에 대해 실질적으로 내성인 것으로 나타났다. 일부 실시태양에서, 상기 명세의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 친지성 치환된 뉴클레오타이드 동족체 및/또는 피리미딘-퓨린 다이뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

상기 올리고뉴클레오타이드는 하나 또는 2 개의 이용 가능한 5' 단부를 가질 수 있다. 예를 들어 2 개의 올리고뉴클레오타이드를 3'-3' 결합을 통해 부착시켜 하나 또는 2 개의 이용 가능한 5' 단부를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 생성시킴으로써 2 개의 상기와 같은 5' 단부를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 생성시키는 것이 가능하다. 상기 3'-3' 결합은 포스포다이에스터, 포스포로티오에이트 또는 임의의 다른 변형된 뉴클레오사이드 간 가교일 수 있다. 상기와 같은 결합을 수행하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 상기와 같은 결합은 문헌[Seliger, H. et al., Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'- and 5'-5'-internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression, Nucleosides & Nucleotides (1991), 10(1-3), 469-77] 및 [Jiang, et al., Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7(12), 2727-2735]에 개시되었다.

또한, 상기 3'-말단 뉴클레오사이드들 간의 결합이 포스포다이에스터, 포스포로티오에이트 또는 다른 변형된 가교가 아닌 3'-3'-결합된 올리고뉴클레오타이드를 추가의 이격자, 예를 들어 트라이- 또는 테트라-에틸렌글리콜 포스페이트 부분을 사용하여 제조할 수 있다(Durand, M. et al., Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31(38), 9197-204, 미국 특허 제 5,658,738 호 및 5,668,265 호). 한편으로, 상기 비-뉴클레오타이드 결합제를 표준 포스포아미다이트 화학을 사용하여 에탄다이올, 프로판다이올로부터, 또는 무염기성(abasic) 데옥시리보스(dSpacer) 단위(Fontanel, Marie Laurence et al., Nucleic Acids Research (1994), 22(11), 2022-7)로부터 유도할 수도 있다. 상기 비-뉴클레오타이드 결합제를 1 회 또는 수 회 혼입하거나, 서로 결합시켜 상기 결합되는 두 올리고뉴클레오타이드의 3'-단부들 사이에 임의의 바람직한 거리를 허용할 수 있다.

뉴클레오사이드의 3' 및/또는 5' 단부에 위치한 포스포다이에스터 뉴클레오사이드 간 가교를 변형된 뉴클레오사이드 간 가교에 의해 치환시킬 수 있으며, 이때 상기 변형된 뉴클레오사이드 간 가교는 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, NR₁R₂-포스포아미데이트, 보라노포스페이트, α-하이드록시벤질 포스포네이트, 포스페이트-(C₁-C₂₁)-O-알킬 에스터, 포스페이트-[(C₆-C₁₂)아릴-(C₁-C₂₁)-O-알킬]에스터, (C₁-C₈)알킬포스포네이트 및/또는 (C₆-C₁₂)아릴포스포네이트 가교, (C₇-C₁₂)-α-하이드록시메틸-아릴(예를 들어 PCT 공보 95/01363에 개시됨)로부터 선택되며, 이때 (C₆-C₁₂)아릴, (C₆-C₂₀)아릴 및 (C₆-C₁₄)아릴은 할로겐, 알킬, 알콕시, 나이트로, 시아노에 의해 임의로 치환되고, 이때 R₁ and R₂ 는 서로 독립적으로, 수소, (C₁-C₁₈)-알킬, (C₆-C₂₀)-아릴, (C₆-C₁₄)-아릴, (C₁-C₈)-알킬, 바람직하게는 수소, (C₁-C₈)-알킬, 바람직하게는 (C₁-C₄)-알킬 및/또는 메톡시에틸이거나, R₁ 및 R₂ 는 이들을 갖는 질소 원자와 함께 5 내지 6 원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고, 상기 고리는 O, S 및 N 기로부터 선택된 추가의 헤테로원자를 추가로 함유할 수 있다.

데포스포 가교에 의한 포스포다이에스터 가교의 치환은 뉴클레오사이드의 3' 및/또는 5' 단부에 위치하며(데포스포 가교는 예를 들어 문헌[Uhlmann E. and Peyman A. in "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Chapter 16, pp. 355 ff]에 개시되어 있다), 이때 데포스포 가교는 예를 들어 상기 데포스포 가교 폼아세탈, 3'-티오폼아세탈, 메틸하이드록실아민, 옥심, 메틸렌다이메틸-하이드라조, 다이메틸렌설폰 및/또는 실릴 기로부터 선택된다.

상기 명세의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 임의로 키메릭 주 쇄를 가질 수도 있다. 키메릭 주 쇄는 하나보다 많은 유형의 결합을 포함하는 것이다. 하나의 실시태양에서, 상기 키메릭 주 쇄를 식 5' Y1N1ZN2Y2 3'에 의해 나타낼 수 있다. Y1 및 Y2는 1 내지 10 개의 뉴클레오타이드를 갖는 핵산 분자이다. Y1 및 Y2는 각각 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 상기 키메릭 올리고뉴클레오타이드의 2 개 이상의 뉴클레오타이드는 주 쇄 변형을 포함하므로, 이들 핵산은 일종의 "안정화된 면역자극성 핵산"의 예이다.

상기 키메릭 올리고뉴클레오타이드에 관하여, Y1 및 Y2는 서로 독립적인 것으로 간주된다. 이는 Y1 및 Y2가 각각 동일한 분자 중에서 서로 상이한 서열 및 상이한 주 쇄 결합을 가질 수도, 갖지 않을 수도 있음을 의미한다. 일부 실시태양에서, Y1 및/또는 Y2는 3 내지 8 개의 뉴클레오타이드를 갖는다. N1 및 N2는 N1ZN2가 총 6 개 이상의 뉴클레오타이드를 갖는 한 0 내지 5 개의 뉴클레오타이드를 갖는 핵산 분자이다. N1ZN2의 뉴클레오타이드는 포스포다이에스터 주 쇄를 가지며 변형된 주 쇄를 갖는 핵산을 포함하지 않는다. Z는 바람직하게는 본 발명에서 인용된 것들로부터 선택된 면역자극성 핵산 동기이다.

식 Y1N1ZN2Y2의 중심 뉴클레오타이드(N1ZN2)는 포스포다이에스터 뉴클레오타이드 간 결합을 가지며 Y1 및 Y2는 하나 이상을 갖지만, 하나보다 많거나 심지어 모든 변형된 뉴클레오타이드 간 결합을 가질 수도 있다. 바람직한 실시태양에서, Y1 및/또는 Y2는 2 개 이상 또는 2 내지 5 개의 변형된 뉴클레오타이드 간 결합을 갖거나 Y1은 5 개의 변형된 뉴클레오타이드 간 결합을 갖고 Y2는 2 개의 변형된 뉴클레오타이드 간 결합을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 변형된 뉴클레오타이드 간 결합은 포스포로티오에이트 변형된 결합, 포스포로다이티오에이트 결합 또는 p-에톡시 변형된 결합이다.

상기 핵산은 또한 2' 위치에서 하이드록실 기 이외의 및 5' 위치에서 포스페이트 기 이외의 저 분자량 유기 기들에 공유 결합된 주 쇄 당을 갖는 핵산을 포함한다. 따라서, 변형된 핵산은 2'-O-알킬화된 리보스 기를 포함할 수도 있다. 또한, 변형된 핵산은 리보스 대신에 아라비노스 또는 2'-플루오로아라비노스와 같은 당을 포함할 수도 있다. 따라서, 상기 핵산은 주 쇄 조성이 이종일 수 있으며, 이에 의해 펩타이드-핵산(핵산 염기를 갖는 아미노산 주 쇄를 갖는다)과 같이, 함께 결합된 중합체 단위들의 임의의 가능한 조합을 함유할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 핵산은 주 쇄 조성이 동종이다.

상기 당 포스페이트 주 쇄로부터의 당 포스페이트 단위(즉 β-D-리보스 및 포스포다이에스터 뉴클레오사이드 간 가교가 함께 당 포스페이트 단위를 형성한다)(즉 당 포스페이트 주 쇄는 당 포스페이트 단위로 구성된다)를 또 다른 단위로 치환할 수 있으며, 이때 상기 다른 단위는 예를 들어 "모폴리노-유도체" 올리고머를 형성하기에(예를 들어 문헌[Stirchak E. P. et al. (1989) Nucleic Acid Res. 17:6129-41]에 개시된 바와 같다), 즉 예를 들어 모폴리노-유도체에 의한 치환; 또는 폴리아미드 핵산("PNA")을 형성하기에(예를 들어 문헌[Nielsen P. E. et al. (1994) Bioconjug. Chem. 5:3-7]에 개시된 바와 같다), 예를 들어 PNA 주 쇄 단위, 예를 들어 2-아미노에틸글리신에 의한 치환에 적합하다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 다른 탄수화물 주 쇄 변형 및 치환, 예를 들어 포스페이트 기를 갖는 펩타이드 핵산(PHONA), 차단된 핵산(LNA), 및 알킬 연결기 또는 아미노 연결기를 갖는 주 쇄 부분을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 가질 수도 있다. 상기 알킬 연결기는 분지되거나 분지되지 않고, 치환되거나 치환되지 않으며, 키랄 순수하거나 라세미 혼합물일 수 있다.

β-리보스 단위 또는 β-D-2' 데옥시리보스 단위를 변형된 당 단위에 의해 치환할 수 있으며, 이때 상기 변형된 당 단위는 예를 들어 β-D-리보스, α-D-2'-데옥시리보스, L-2'-데옥시리보스, 2'-F-2'-데옥시리보스, 2'-F-아라비노스, 2'-O-(C₁-C₆)알킬-리보스로부터 선택되고, 바람직하게는 2'-O-(C₁-C₆) 알킬-리보스는 2'-O-메틸리보스, 2'-O-(C₁-C₆)알케닐-리보스, 2'-[O-(C₁-C₆)알킬-O-(C₁-C₆)알킬]-리보스, 2'-NH2-2'-데옥시리보스, β-D-자일로퓨라노스, α-아라비노퓨라노스, 2,4-다이데옥시-β-D-에리쓰로-헥소-피라노스, 및 카보사이클릭(예를 들어 문헌[Froehler J. (1992) Am. Chem. Soc. 114:8320]에 개시된다) 및/또는 개방 쇄 당 동족체(예를 들어 문헌[Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223]에 개시된다) 및/또는 바이사이클로당 동족체(예를 들어 문헌[Tarkov M. et al. (1993) Helv. Chim. Acta. 76:481]에 개시된다)이다.

일부 실시태양에서, 상기 당은 특히 포스포다이에스터 또는 포스포다이에스터 유사 뉴클레오사이드 간 결합에 의해 결합된 하나 또는 2 개 모두의 뉴클레오타이드에 대해 2'-O-메틸리보스이다.

상기 명세의 올리고뉴클레오타이드를 당해 분야에 널리 공지된 다수의 과정들 중 임의의 것을 사용하여 드 노보 합성할 수 있다. 예를 들어, b-시아노에틸 포스포아미다이트 방법(Beaucage, S. L., and Caruthers, M. H., (1981) Tet. Let. 22:1589); 뉴클레오사이드 H-포스포네이트 방법(Garegg et al., (1986) Tet. Let. 27:4051-4054; Froehler et al., (1986) Nucl. Acid Res.14:5399-5407; Garegg et al., (1986) 27:4055-4058; Gaffney et al., (1988) Tet. Let. 29:2619-2622). 이들 화학을 시중에서 입수할 수 있는 다양한 자동화된 핵산 합성기에 의해 수행할 수 있다. 이들 올리고뉴클레오타이드를 합성 올리고뉴클레오타이드라 칭한다. 한편으로, T-풍부 및/또는 TG 다이뉴클레오타이드를 플라스미드 중에서 대규모로 생성시키고(Sambrook T. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor laboratory Press, New York, 1989) 보다 작은 조각들로 분리하거나 전체를 투여할 수 있다. 핵산을 공지된 기법, 예를 들어 제한 효소, 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 사용하는 것들을 사용하여 기존의 핵산 서열(예를 들어 게놈 또는 DNA)로부터 제조할 수 있다.

포스포로티오에이트와 같은 변형된 주 쇄를 포스포아미데이트 또는 H-포스포네이트 화학을 사용하는 자동화된 기법을 사용하여 합성할 수 있다. 아릴- 및 알킬-포스포네이트를 예를 들어 미국 특허 제 4,469,863 호에 개시된 바와 같이 제조할 수 있고, 알킬포스포트라이에스터(이때 하전된 산소 부분은 미국 특허 제 5,023,243 호에 개시된 바와 같이 알킬화된다)는 상업적으로 입수할 수 있는 시약을 사용하여 자동화된 고상 합성에 의해 제조될 수 있다. 다른 DNA 주 쇄 변형 및 치환을 만드는 방법들이 개시되었다(예를 들어 문헌[Uhlmann, E. and Peyman, A., Chem. Rev. 90:544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1:165, 1990]을 참조하시오).

상기 방식으로 제조된 핵산을 단리된 핵산이라 칭한다. "단리된 핵산"은 일반적으로 세포로부터, 핵으로부터, 미토콘드리아로부터 또는 크로마틴으로부터 및 오염물질로서 간주할 수 있는 임의의 다른 성분들로부터 분리되는 성분과 분리된 핵산을 지칭한다.

일부 실시태양에서, CpG-함유 올리고뉴클레오타이드를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 따라 면역원성 담체와 단순히 혼합할 수도 있다(예를 들어 PCT 공보 WO 03/024480을 참조하시오). 상기 명세의 다른 실시태양에서, CpG-함유 올리고뉴클레오타이드는 VLP 내에 둘러싸일 수도 있다(예를 들어 PCT 공보 WO 03/024481을 참조하시오).

본 명세와 관련하여 항원보강제의 예로는 알룸; CpG-함유 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 CpG 7909, CpG 10103 및 CpG 24555; 및 사포닌 기재 항원보강제, 예를 들어 아이스코매트릭스가 있으며, 이들은 단독으로 사용되거나 함께 사용될 수 있다.

따라서 상기 명세는 항원성 타우 펩타이드, 바람직하게는 서열번호 1 내지 26, 31 내지 76, 및 105 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 하나 이상의 항원보강제를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 상기 항원성 타우 펩타이드를 바람직하게는 면역원성 담체, 바람직하게는 VLP, 보다 바람직하게는 HBsAg, HBcAg 또는 Q베타 VLP에 결합시킨다. 하나의 실시태양에서, 상기 항원보강제는 사포닌 기재 항원보강제, 바람직하게는 아이스코매트릭스이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항원보강제는 알룸이다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 항원보강제는 CpG-함유 올리고뉴클레오타이드이다. 바람직하게는 상기 항원보강제는 CpG 7909 또는 CpG 10103이다. 보다 바람직하게는 상기 항원보강제는 CpG 24555이다.

더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 하나 이상의 항원보강제는 바람직하게는 알룸, 사포닌 기재 항원보강제 및 CpG-함유 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 개의 항원보강제를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 항원보강제는 알룸 및 CpG-함유 올리고뉴클레오타이드, 바람직하게는 CpG 7909, 바람직하게는 CpG 10103, 보다 바람직하게는 CpG 24555이다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 항원보강제는 사포닌 기재 항원보강제, 바람직하게는 아이스코매트릭스, 및 CpG-함유 올리고뉴클레오타이드, 바람직하게는 CpG 7909, 바람직하게는 CpG 10103, 보다 바람직하게는 CpG 24555이다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 항원보강제는 알룸 및 사포닌 기재 항원보강제, 바람직하게는 아이스코매트릭스이다.

더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 하나 이상의 항원보강제는 바람직하게는 알룸, 사포닌 기재 항원보강제, 바람직하게는 아이스코매트릭스, 및 CpG 함유 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 CpG 7909, CpG 10103, 및 CpG 24555로 이루어진 군으로부터 선택되는 3 개의 항원보강제를 포함한다.

제형

본원은 또한 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 제형 중에 상기 명세의 항원성 타우 펩타이드 또는 그의 면역원성 조성물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에 사용된 "부형제"란 용어는 활성 성분 이외의 임의의 성분을 개시한다, 즉 상기 명세의 항원성 타우 펩타이드는 최종적으로 면역원성 담체에 결합되고 하나 이상의 항원보강제와 임의로 결합된다. 상기 부형제의 선택은 주로 특정한 투여 방식, 용해도 및 안정성에 대한 상기 부형제의 영향, 및 상기 투여형의 성질과 같은 인자들에 따라 변할 것이다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 부형제"는 생리적으로 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적으로 허용되는 부형제의 일부 예는 물, 염수, 포스페이트 완충된 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등뿐만 아니라 이들의 조합이다. 많은 경우에, 상기 조성물 중에 등장제, 예를 들어 당, 다중 알콜, 예를 들어 만니톨, 솔비톨, 또는 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 약학적으로 허용되는 물질의 추가적인 예는 습윤제 또는 소량의 보조 물질, 예를 들어 습윤 또는 유화제, 보존제 또는 완충제이며, 이들은 상기 활성 성분의 저장 수명 또는 유효성을 향상시킨다.

본 명세의 약학 조성물 및 그의 제조 방법은 당해 분야의 숙련가들에게 쉽게 자명할 것이다. 상기와 같은 조성물 및 그의 제조 방법을 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995)]에서 찾을 수 있다. 약학 조성물을 바람직하게는 GMP 조건 하에서 제조한다.

상기 명세의 약학 조성물을 벌크로, 단일 단위 용량으로서, 또는 다수의 단일 단위 용량으로서 제조하거나, 포장하거나, 판매할 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "단위 용량"은 소정 량의 활성 성분을 포함하는 구별된 약학 조성물의 양이다. 상기 활성 성분의 양은 일반적으로 피실험자에게 투여되는 활성 성분의 투여량 또는 상기와 같은 투여량의 편리한 분획, 예를 들어 상기와 같은 투여량의 1/2 또는 1/3과 같다.

상기 명세의 약학 조성물은 전형적으로는 비경구 투여에 적합하다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 약학 조성물의 "비경구 투여"는 피실험자의 조직을 물리적으로 파괴시키고 상기 조직 중의 파괴 부분을 통해 상기 약학 조성물을 투여하여, 일반적으로는 혈류 내로, 근육 내로 또는 내부 기관 내로의 직접적인 투여를 생성시킴을 특징으로 하는 임의의 투여 경로를 포함한다. 따라서 비경구 투여는 비제한적으로 약학 조성물의 주사, 외과적 절개를 통한 상기 조성물의 적용, 조직 침투성 비-외과적 상처를 통한 상기 조성물의 적용 등에 의한 상기 조성물의 투여를 포함한다. 특히, 비경구 투여는 비제한적으로 피하, 복강 내, 근육 내, 흉골 내, 정맥 내, 동맥 내, 척수관 내, 심실 내, 요도 내, 두개 내, 활막 내 주사 또는 주입; 및 신장 투석 주입 기법을 포함하는 것으로 간주한다. 바람직한 실시태양은 정맥 내, 피하, 피 내 및 근육 내 경로를 포함한다.

비경구 투여에 적합한 약학 조성물의 제형은 전형적으로는 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들어 멸균 수 또는 멸균 등장성 염수와 배합된 활성 성분을 포함한다. 상기와 같은 제형을 일시주사 투여, 또는 연속적인 투여에 적합한 형태로 제조하거나, 포장하거나 판매할 수 있다. 주사용 제형을 단위 투여형으로, 예를 들어 보존제를 함유하는 수회 용량 용기 또는 앰풀로 제조하거나, 포장하거나 판매할 수 있다. 비경구 투여용 제형은 비제한적으로 유성 또는 수성 비히클, 페이스트 등 중의 현탁액, 용액, 유화액을 포함한다. 상기와 같은 제형은 하나 이상의 추가적인 성분, 예를 들어 비제한적으로 현탁제, 안정제 또는 분산제를 추가로 포함할 수도 있다. 비경구 투여용 제형의 하나의 실시태양에서, 활성 성분을, 조성물의 비경구 투여 전에 적합한 비히클(예를 들어 멸균 발열원 비함유 수)로 재조성되는 건조(즉 분말 또는 과립) 형태로 제공한다. 비경구 제형은 부형제, 예를 들어 염, 탄수화물 및 완충제(바람직하게는 3 내지 9의 pH로)를 함유할 수 있는 수용액을 또한 포함하지만, 일부 용도의 경우, 멸균 비-수성 용액으로서 또는 적합한 비히클, 예를 들어 멸균의 발열원 비함유 수와 함께 사용되는 건조된 형태로서 보다 적합하게 제형화될 수도 있다. 예시적인 비경구 투여형은 멸균 수용액 중의 용액 또는 현탁액, 예를 들어 수성 프로필렌 글리콜 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 상기와 같은 투여형을 경우에 따라 적합하게 완충시킬 수 있다. 유용한 다른 비경구 투여가능한 제형은 미세 결정 형태 또는 리포솜 제제 중에 활성 성분을 포함하는 것들을 포함한다. 비경구 투여용 제형을 즉시 및/또는 변형된 방출이 되도록 제형화할 수도 있다. 변형된 방출 제형은 지연된-, 지속된-, 파동된-, 조절된-, 표적화된 및 프로그램화된 방출을 포함한다.

예를 들어, 하나의 태양에서, 멸균 주사용 용액을 최종적으로는 하나 이상의 항원보강제와 함께, 필요에 따라 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 조합과 적합한 용매 중에서 필요한 양으로, 바람직하게는 면역원성 담체에 결합된, 상기 항원성 펩타이드를 혼입한 다음, 여과 살균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액을, 상기 활성 화합물을 기본 분산 매질 및 상기 열거한 것들 중에서 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조한다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 + 앞서 멸균 여과된 그의 용액으로부터의 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말을 제공하는 진공 건조 및 동결 건조이다. 용액의 적합한 유동성을 예를 들어 코팅제, 예를 들어 레시틴을 사용하고, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기를 유지시키고, 계면활성제를 사용함으로써 유지시킬 수 있다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 조성물 중에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 수행될 수 있다.

상기 명세의 예시적인 비제한적 약학 조성물은 약 5.0 내지 약 6.5 범위의 pH를 갖고 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 200 ㎎/㎖의 상기 명세의 펩타이드, 약 1 밀리 몰 내지 약 100 밀리 몰의 히스티딘 완충제, 약 0.01 ㎎/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 80, 약 100 밀리 몰 내지 약 400 밀리 몰의 트레할로스, 및 약 0.01 밀리 몰 내지 약 1.0 밀리 몰의 이나트륨 EDTA 다이하이드레이트를 포함하는 멸균 수용액으로서의 제형이다.

상기 명세의 항원성 타우 펩타이드를 또한 비 내 또는 흡입에 의해, 전형적으로는 건조 분말 흡입기로부터 건조 분말의 형태로(단독으로, 혼합물로서 또는 혼합된 성분 입자로서, 예를 들어 적합한 약학적으로 허용되는 부형제와 혼합된), 가압된 용기, 펌프, 스프레이, 분무기(바람직하게는 미세한 연무를 생성시키기 위해 전기유체역학을 사용하는 분무기), 또는 적합한 추진제를 사용하거나 사용하지 않는 네뷸라이저로부터 에어로졸 분무로서, 또는 점비액으로서 투여할 수 있다.

상기 가압된 용기, 펌프, 스프레이, 분무기 또는 네뷸라이저는 일반적으로 예를 들어 상기 활성 성분의 분산, 용해 또는 연장 방출에 적합한 작용제 및 용매로서 추진제를 포함하는 상기 명세의 조성물의 용액 또는 현탁액을 함유한다.

건조 분말 또는 현탁액 제형으로 사용하기 전에, 상기 약물 생성물을 일반적으로는 흡입에 의한 전달에 적합한 크기(전형적으로는 5 ㎛ 미만)로 미분화한다. 이를 임의의 적합한 분쇄 방법, 예를 들어 나선 제트 분쇄, 유동층 제트 분쇄, 나노입자의 형성을 위한 초임계 유동 처리, 고압 균질화, 또는 분무 건조에 의해 성취할 수 있다.

흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 캡슐, 블리스터 및 카트리지를 상기 명세의 화합물, 적합한 분말 베이스 및 성능 조절제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

미세한 연무를 생성시키기 위해 전기유체역학을 사용하는 분무기에 사용하기에 적합한 용액 제형은 작동 당 적합한 용량의 상기 명세의 항원성 타우 펩타이드를 함유할 수 있으며 상기 작동 부피는 예를 들어 1 ㎕에서 100 ㎕까지 다양할 수 있다.

적합한 풍미제, 예를 들어 멘톨 및 레보멘톨, 또는 감미제, 예를 들어 사카린 또는 사카린 나트륨을 흡입/비 내 투여를 목적으로 하는 상기 명세의 제형들에 첨가할 수도 있다.

흡입/비 내 투여용 제형을 즉시 및/또는 변형된 방출이 되도록 제형화할 수도 있다. 변형된 방출 제형은 지연된-, 지속된-, 파동된-, 조절된-, 표적화된 및 프로그램화된 방출을 포함한다.

건조 분말 흡입기 및 에어로졸의 경우에, 투여량 단위를 계량된 양을 전달하는 밸브에 의해 정한다. 상기 명세에 따른 단위를 전형적으로는 본 명세의 조성물의 계량된 용량을 투여하거나 "내뿜도록" 조정한다. 전체 1일 용량은 전형적으로는 단일 용량으로 투여되거나, 보다 대개는 하루 전체를 통해 분할된 용량으로 투여될 것이다.

항원성 타우 펩타이드를 포함하는 약학 조성물을 또한 경구 경로 투여를 위해 제형화할 수도 있다. 경구 투여는 상기 화합물이 위장 관으로 들어가도록 삼키고/삼키거나, 상기 화합물이 입으로부터 직접 혈류로 들어가는 구강, 혀 또는 설하 투여를 포함할 수 있다.

경구 투여에 적합한 제형은 고체, 반 고체 및 액체 시스템, 예를 들어 정제; 다중- 또는 나노-미립자, 액체 또는 분말을 함유하는 연질 또는 경질 캡슐; 로젠지(액체-충전 포함); 츄정; 젤; 고속 분산 투여형; 필름; 질좌약; 스프레이; 및 구강/점막부착 패치를 포함한다.

액체 제형은 현탁액, 용액, 시럽 및 엘릭서를 포함한다. 상기와 같은 제형을 연질 또는 경질 캡슐(예를 들어 젤라틴 또는 하이드록시프로필메틸셀룰로스로부터 제조된 것) 중의 충전제로서 사용할 수 있으며 상기 제형은 전형적으로는 담체, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 메틸셀룰로스 또는 적합한 오일, 및 하나 이상의 유화제 및/또는 현탁제를 포함한다. 액체 제형을 또한 예를 들어 사셰로부터 고체의 재조성에 의해 제조할 수도 있다.

투여량

상기 명세의 조성물을 타우 관련된 질환 또는 증상의 위험이 있거나 이를 앓고 있는 피실험자에게서 면역요법에 의해 면역 반응을 자극함으로써 상기 피실험자의 상기 질환 또는 증상을 치료, 경감 또는 예방하는데 사용할 수 있다. 면역요법은 초기 면역화에 이어서 추가적인, 예를 들어 1 회, 2 회, 3 회 또는 그 이상의 추가 항원 자극을 포함할 수 있다.

상기 명세의 항원성 타우 펩타이드 또는 그의 조성물의 "면역학적으로 유효한 양"은 포유동물 피실험자에게서 타우의 병리학적 형태에 대해 면역 반응을 유도하기에 유효한, 단일 용량 또는 일련 용량의 일부로서 상기 피실험자에게 전달되는 양이다. 상기 량은 치료되는 개인의 건강 및 신체 조건, 치료되는 개인의 분류 군, 체액 및/또는 세포 면역 반응을 이끌어내는 개인의 면역계의 능력, 백신의 제형 및 다른 관련 인자들에 따라 다양하다. 상기 량은 적합한 시도를 통해 결정될 수 있는 비교적 광범위한 범위 내에 있을 것이다.

"약학적으로 유효한 용량" 또는 "치료학적으로 유효한 용량"은 피실험자에게서 하나 이상의 타우-관련된 질환 또는 증상을 치료하거나, 예방하거나 경감시키는데 필요한 용량이다. 상기 약학적으로 유효한 용량은 투여되는 특정 화합물, 증상의 중증도, 부작용에 대한 피실험자의 민감성, 질병의 유형, 사용되는 조성물, 투여 경로, 치료되는 포유동물의 유형, 건강 및 신체 조건과 같은 고려 하의 특정 포유동물의 신체적 특징, 동반되는 약물 치료, 개인의 면역계의 능력, 목적하는 보호 정도, 및 의학 분야의 숙련가들이 인지하는 다른 인자들에 따라 변할 수 있다. 예방을 목적으로, 각 용량 중의 펩타이드의 양은 전형적인 백신에서 현저한 부작용 없이 면역보호 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 초기 백신화에 이어서, 피실험자에게 적합한 간격으로 1 회 또는 수 회의 추가 항원자극 면역화를 제공할 수도 있다.

임의의 특정 환자의 특정한 용량 수준이 사용되는 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이요법, 투여 시간, 투여 경로, 배출 속도, 약물 조합 및 치료 중인 특정 질병의 중증도를 포함한 다수의 인자들에 따라 다름은 물론이다.

예를 들어, 면역원성 담체에 결합된, 상기 명세의 항원성 타우 펩타이드를 피실험자에게, 예를 들어 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 2 개월, 3 개월 및/또는 1년 후에 임의로 추가 항원 자극을 제공하면서, 각각 약 0.1 ㎍ 내지 약 200 ㎎의 용량으로, 예를 들어 약 0.1 ㎍ 내지 약 5 ㎍, 약 5 ㎍ 내지 약 10 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 25 ㎍, 약 25 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 500 ㎍ 내지 약 1 ㎎, 약 1 ㎎ 내지 약 10 ㎎, 약 10 ㎎ 내지 약 50 ㎎, 또는 약 50 ㎎ 내지 약 200 ㎎의 용량으로 투여할 수 있다. 일부 실시태양에서, 용량당 상기 항원성 타우 펩타이드의 양을 체중 기준으로 결정한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 항원성 펩타이드를 약 0.5 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏, 예를 들어 약 0.5 ㎎/㎏ 내지 약 1 ㎎/㎏, 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 2 ㎎/㎏, 약 2 ㎎/㎏ 내지 약 3 ㎎/㎏, 약 3 ㎎/㎏ 내지 약 5 ㎎/㎏, 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 7 ㎎/㎏, 약 7 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏ 내지 약 15 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏ 내지 약 20 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏ 내지 약 25 ㎎/㎏, 약 25 ㎎/㎏ 내지 약 30 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏ 내지 약 40 ㎎/㎏, 약 40 ㎎/㎏ 내지 약 50 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏ 내지 약 60 ㎎/㎏, 약 60 ㎎/㎏ 내지 약 70 ㎎/㎏, 약 70 ㎎/㎏ 내지 약 80 ㎎/㎏, 약 80 ㎎/㎏ 내지 약 90 ㎎/㎏, 또는 약 90 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏, 또는 약 100 ㎎/㎏ 초과의 양으로 투여한다.

일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 항원성 타우 펩타이드의 단일 용량을 투여한다. 다른 실시태양에서, 수 회 용량의 상기 명세에 따른 항원성 타우 펩타이드를 투여한다. 상기 투여 회수는 다양한 인자들 중 임의의 것, 예를 들어 상기 증상의 중증도, 목적하는 면역보호의 정도, 상기 조성물을 예방을 목적으로 하는지 치유를 목적으로 사용하는지 등에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 항원성 타우 펩타이드를 1 개월에 1 회, 1 개월에 2 회, 1 개월 달에 3 회, 2주마다(qow), 1 주에 1 회(qw), 1 주에 2 회(biw), 1 주에 3 회(tiw), 1 주에 4 회, 1 주에 5 회, 1 주에 6 회, 이틀마다(qod), 매일(qd), 하루에 2 회(qid), 또는 하루에 3 회(tid) 투여한다. 상기 명세의 조성물을 예방 목적으로 사용하는 경우, 상기 조성물을 일반적으로는 초회 항원자극 및 추가 항원 자극 용량으로 투여할 것이다. 상기 추가 항원자극 용량을 적합하게 간격을 두거나 바람직하게는 매년 또는 순환하는 항체의 수준이 목적하는 수준 아래에 있는 회수로 제공할 것이 예상된다. 추가 항원 자극 용량은 원래 면역원성 담체 분자 부재 하의 상기 항원성 타우 펩타이드로 이루어질 수 있다. 상기와 같은 추가 항원 자극 구조물은 또 다른 면역원성 담체를 포함하거나 임의의 담체의 부재 하에서 존재할 수도 있다. 상기와 같은 추가 항원 자극 조성물을 항원보강제와 함께 또는 상기 항원보강제 없이 제형화할 수 있다.

상기 명세에 따른 항원성 타우 펩타이드의 투여 지속 기간, 예를 들어 항원성 타우 펩타이드를 투여하는 기간은 다양한 인자들 중 임의의 것, 예를 들어 환자 반응 등에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 항원성 타우 펩타이드를 대략 하루 내지 대략 한 주, 대략 2 주 내지 대략 4 주, 대략 1 개월 내지 대략 2 개월, 대략 2 개월 내지 대략 4 개월, 대략 4 개월 내지 대략 6 개월, 대략 6 개월 내지 대략 8 개월, 대략 8 개월 내지 대략 1 년, 대략 1 년 내지 대략 2 년, 또는 대략 2 년 내지 대략 4 년, 또는 그 이상의 범위의 기간에 걸쳐 투여할 수 있다.

치료 용도 및 방법

다양한 치료 방법이 또한 본 명세에 의해 고려되며, 상기 방법은 상기 명세에 따른 항원성 타우 펩타이드를 투여함을 포함한다. 치료 방법은 개인에게서 병리학적 형태의 자가-타우에 대해 면역 반응을 유도하는 방법, 및 개인에게서 타우 관련된 질환 또는 증상을 예방, 경감 또는 치료하는 방법을 포함한다.

하나의 태양에서, 본원은 치료학적으로 유효한 양의 상기 명세의 항원성 타우 펩타이드, 또는 그의 면역원성 또는 약학 조성물을 피실험자에게 투여함을 포함하는, 상기 피실험자의 타우 관련된 질환 또는 증상을 치료, 예방 또는 경감시키는 방법을 제공한다.

또 다른 태양에서, 본원은 치료학적으로 또는 면역원성으로 유효한 양의 상기 명세의 항원성 타우 펩타이드, 또는 그의 면역원성 또는 약학 조성물을 피실험자에게 투여함을 포함하는, 상기 피실험자에게서 병리학적 형태의 자가-타우에 대해 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.

"치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 생물학적 질환 및/또는 그의 수반 증상들 중 하나 이상을 경감시키거나 파기시키는 방법을 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 질병, 질환 또는 병을 "경감시키다"는 상기 질병, 질환 또는 병의 중증도 및/또는 증상의 출현 회수를 감소시킴을 의미한다. 더욱이, 본 발명에서 "치료"에 대한 언급은 치유, 완화 및 예방 치료를 포함한다. 상기 피실험자는 바람직하게는 인간이며 임의의 연령의 남성이나 여성일 수 있다.

상기 명세의 다른 태양은 바람직하게는 타우 관련된 질환의 치료에서 약제로서 사용하기 위한 상기 명세에 따른 항원성 타우 펩타이드, 또는 그의 면역원성 조성물 또는 약학 조성물에 관한 것이다.

더욱 또 다른 태양에서, 본원은 바람직하게는 타우 관련된 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 상기 명세의 항원성 타우 펩타이드 또는 그의 면역원성 조성물 또는 약학 조성물의 용도를 제공한다.

본원은 추가의 제한으로서 해석해서는 안 되는 하기의 실시예들에 의해 추가로 예시된다. 본 명세 전체를 통해 인용된 모든 도면 및 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원들의 내용은 그 내용 전체가 명백히 본 발명에 참고로 인용된다.

실시예

사용된 숫자(예를 들어 양, 온도 등)에 관하여 정확성을 확실히 하고자 노력하였지만 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량 기준이며, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨이며, 압력은 대기압이거나 그 부근이다. 하기 실시예에 사용된 바와 같이, 하기의 약어들은 하기의 의미들을 가지며, 달리 나타내지 않는 한 상업적인 출처로부터 쉽게 입수할 수 있다: DMF: 다이메틸폼아미드; TFA: 트라이플루오로아세트산; TIPS: 트라이이소프로필실릴 트라이플루오로메탄설포네이트; TCEP: 트리스(2-카복시에틸)포스핀; mcKLH: 바다 양식된 키홀 림펫 헤모시아닌; HBTU: O-벤조트라이아졸-N,N,N',N'-테트라메틸-유로늄-헥사플루오로-포스페이트; EDTA: 에틸렌-다이아민-테트라아세트산; DMSO: 다이메틸 설폭사이드.

실시예 1: Q베타 플라스미드 제작

고유 Q베타 피막 단백질: Q베타의 피막 단백질에 상응하는 암호화 서열, 진뱅크 수납 번호 AY099114로부터의 뉴클레오타이드 1304 내지 1705를 DNA 2.0(DNA 2.0, Menlo Park, CA, USA)에 의해 합성하였다. NcoI 부위를 도입하기 위한 5' 변형( CC atgg) 및 2 개의 정지 코돈 및 Xhol 부위를 도입하기 위한 3' 변형(gtaTTAATGACTCGAG - 서열번호 78)을 포함시켰다.

코돈 최적화된 Q베타 피막 단백질: 상기 Q베타 피막 단백질 암호화 서열을 또한 진 디자이너(Gene Designer)(Villalobos et al., BMC Bioinformatics 7:285 (2006))를 사용하여 발현을 위해 최적화하였다. 동일한 5' 및 3' 변형들을 상기 코돈 최적화된 Q베타 피막 단백질에 통합시켰다.

고유 및 코돈 최적화된 Q베타 피막 단백질 서열을 모두 제한 절단 및 연결 반응을 포함하는 통상적인 DNA 서브클로닝 방법을 사용하여 pET28 발현 벡터에 도입시켰다.

실시예 2: 합성 타우 펩타이드의 제조

서열번호 31 내지 76, 105 내지 107에 나타내고 하기 실시예 전체를 통해 사용된 바와 같은 상응하는 이름으로 하기 표 5에 나타낸 타우 펩타이드(A-1 내지 A-11; B-1 내지 B-6; C-1 내지 C-5; D-1; E-1, 및 F1로서 지칭됨; A-1P, A-2P, A-3P 등으로서 나타낸, 상기 펩타이드의 인산화된 버전과 함께)를 하기와 같이 제조하였다. 연결기 서열(CGG 또는 GGC)을 함유하는 인산화된 또는 인산화되지 않은 타우 펩타이드의 합성을 심포니(Symphony) 펩타이드 합성기(Protein Technologies, Inc) 상에서 고상 합성 기술을 사용하여 수행하였다. 단일-보호된 아미노산 Fmoc-Ser[PO(O-Bzl)OH]-OH,Fmoc-Thr[PO(O-Bzl)OH]-OH, 및 Fmoc-Tyr[PO(O-Bzl)OH]-OH (EMD Chemicals, Inc)를, 상기 서열의 인산화된 버전에 포스포세린, 포스포쓰레오닌 및 포스포타이로신을 통합시키기 위해 사용하였다. 상기 반응을, 상기 첫 번째 아미노산을 함유하는 NovaSyn TGA 수지(EMD Chemicals, Inc)와 1 시간 동안 1 mmol의 HBTU로 활성화시킨 6.25 배 과잉의 Fmoc-보호된 2차 아미노산(1 mmol)을 혼합함으로써 개시시켰다. 상기 결합 반응을 각 아미노산에 대해 1 회 반복하였다. 상기 Fmoc 기의 제거는 2 x 5 분 동안 DMF 중의 20% 피페리딘에서 성취되었다. 상기 합성된 펩타이드를, 실온에서 3 시간 동안 2.5% TIPS 및 2.5% 티오아니솔을 함유하는 TFA 용액 5 ㎖과 함께 상기 수지를 배양함으로써 상기 수지로부터 방출시켰다. 조 펩타이드를 여과, 다이에틸 에테르-매개된 침전 및 진공 건조에 이어서 회수하였다. 상기 펩타이드의 정제를 BEH 130 예비 C18 컬럼을 갖는 역상 HPLC(Waters 2525 Binary Gradient Module)에서 수행하였다. 이동 상은 완충제 A로서 수 중의 0.1% TFA 및 완충제 B로서 아세토나이트릴 중의 0.1% TFA로 이루어졌다. 상기 펩타이드를 함유하는 수집된 분획들을 합하고 진공 하에서 동결 건조시켰다. 대략 20 ㎎의 펩타이드가 95% 초과의 순도로 상기 조 펩타이드 100 ㎎의 전형적인 주입으로부터 정제되었다. 모든 정제된 펩타이드를 LC-MS에 의해 확인하였다.

유사하게, 추가적인 타우 펩타이드(서열번호 108 내지 122)를 합성하고 정제하였다.

실시예 3: Q베타- VLP : 발현, 정제, 및 타우 펩타이드와의 접합

에스케리키아 콜라이에서 Q베타의 발현: Q베타 cDNA를 함유하는 플라스미드 pET28을 에스케리키아 콜라이 BL21(DE3) 수용 세포 내로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 37 ℃에서 밤새 50 ㎍/㎖의 가나마이신을 함유하는 2x YT 배지 5 ㎖에 접종하였다. 상기 밤새 접종물을 50 ㎍/㎖의 가나마이신을 함유하는 TB 배지 500 ㎖로 희석하고, 37 ℃에서 250 rpm에서 0.8 OD600으로 증식시키고, 밤새 0.4 mM IPTG(이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드)로 유도하였다. 상기 세포를 2500 RCF에서 15 분간 원심분리에 의해 수확하였다. 상기 세포 펠릿을 -80 ℃에서 보관하였다.

에스케리키아 콜라이로부터 Q베타 VLP의 정제: 모든 정제 단계를 4 ℃에서 수행하였다. Q베타를 발현하는 세포 펠릿을 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)이 보충된 25 mM 트리스 pH 8.0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% 트리톤-100을 함유하는 용해 완충제에 재현탁시켰다. 상기 재현탁 용액을 미세유동화기(Microfluidics Corp.)에 통과시킨 다음, 한외원심분리시켰다. 단백질을, 50% 포화로 황산 암모늄을 가한 다음 15,000 RCF에서 30 분간 원심분리에 의해 침전시켰다. 상기 펠릿을 4 ℃에서 밤새 25 mM Hepes pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA를 함유하는 완충제에 재현탁하고 투석시켰다. 상기 투석된 용액을 원심분리하고 이어서 25 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA 중에서 평형화시킨 캡토(Capto) Q 컬럼(GE)에 로딩하였다. 상기 컬럼을 세척하고 25 mM HEPES pH 7.5, 1 mM EDTA를 함유하는 완충제 중의 100 mM NaCl에서부터 1 M NaCl로의 구배로 실행시켰다. Q베타 단백질을 SDS-PAGE를 사용하여 확인하였다. Q베타를 함유하는 분획들을 10 mM 칼륨 포스페이트, pH 7.4, 150 mM KCl 중에서 밤새 투석시키고, 하이드록시아파타이트 컬럼(타입 II, Bio-Rad Inc.)에 로딩하였다. 상기 컬럼을 세척하고 10 mM 칼륨 포스페이트 pH 7.5, 150 mM KCl을 함유하는 완충제 100%로부터 500 mM 칼륨 포스페이트, pH 7.5, 0.5 M KCl을 함유하는 완충제 100%로의 구배로 용출시켰다. Q베타를 함유하는 분획들을 모으고, 투석하고, 25 mM 트리스-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.7 M(NH4)₂SO₄ 중에서 평형화시킨 페닐 컬럼에 로딩하였다. 상기 단백질을 25 mM 트리스-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.7 M(NH₄)₂SO₄를 함유하는 완충제 100%에서부터 25 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl을 함유하는 완충제 100%로의 구배로 용출시켰다. 순수한 Q베타를 함유하는 분획들을 모으고 4 ℃에서 밤새 PBS 중에서 투석시켰다. 단백질 농도를 브래드포드(Bradford) 분석에 의해 측정하였다.

타우 펩타이드의 Q베타 VLP에의 결합: 타우 펩타이드의 Q베타-VLP에의 결합을 이작용성 가교결합제 SMPH(숙신이미딜-6-[β-말레이미도프로피온아미도]헥사노에이트)(Thermo Scientific) (Freer et al., Virology 322(2):360-369 (2004))를 통해 매개하였다. 상기 펩타이드를 5 mM EDTA 10 ㎎/㎖을 함유하는 PBS(Invitrogen), pH 7.0 중에 용해시키고, 실온에서 1 시간 동안 동일한 부피의 고정화된 TCEP 다이설파이드 환원 젤과 함께 배양하여 환원시켰다. 상기 펩타이드 용액을 1000 x g에서 2 분간 원심분리에 의해 회수하였다. PBS(Invitrogen) 중의 2 ㎎/㎖의 Q베타-VLP 단백질을 실온에서 1 시간 동안 DMSO 중의 7 mM SMPH와 배양함으로써 활성화하였다. 상기 유도체화된 VLP를 1000 x g에서 2 분간 제바 탈염 스핀 컬럼(Zeba Desalt Spin column)(Thermo Scientific)에 통과시킴으로써 탈염시켰다. 상기 활성화된 VLP 용액을 10 배 몰 과잉의 환원된 펩타이드와 실온에서 2 내지 3 시간 동안 혼합하였다. 상기 반응 혼합물을 농축시키고 PBS 중에서 또는 50 mM NaCl을 함유하는 25 mM 히스티딘 pH 7.4 중에서 4 ℃에서 밤새 투석시켰다. 상기 단백질 농도를 쿠마씨 플러스(Coomassie Plus) 단백질 분석(Thermo Scientific)으로 측정하였다.

실시예 4: 펩타이드 - KLH 접합체의 제조

CGG 연결기(서열번호 31)를 갖는 타우 펩타이드 A-1P를 mcKLH(Thermo Scientific, Cat. No. 77605)에 접합시켜 마우스에서 그의 면역원성을 평가하였다. 상기 접합을 이작용성 가교결합제 SMPH((숙신이미딜-6-[β-말레이미도프로피온아미도]헥사노에이트)(Thermo Scientific) 를 통해 매개시켰다. 5 mM EDTA를 함유하는 PBS, pH 7.0 중의 10 ㎎/㎖의 A-1P 펩타이드를 먼저 동일한 부피의 고정화된 TCEP 다이설파이드 환원 젤로 실온에서 1 시간 동안 교반함으로써 처리하였다. 상기 펩타이드 용액을 1000 x g에서 2 분간 원심분리시킴으로써 회수하였다. KLH의 활성화는 실온에서 1 시간 동안 DMSO 중의 100 mM SMPH 200 ㎕와 PBS 중의 10 ㎎/㎖의 KLH를 배양함으로써 수행되었다. 상기 반응 혼합물을 제바 탈염 스핀 컬럼(Thermo Scientific)에 통과시켰다. 이어서 상기 수거된 유도체화된 KLH를 실온에서 2 시간 동안 환원된 A-1P와 혼합하였다. 상기 반응 혼합물을 4 ℃에서 밤새 0.6 M NaCl을 함유하는 PBS 중에서 투석시켰다. 상기 단백질 농도를 쿠마씨 플러스 단백질 분석(Thermo Scientific)으로 측정하였다.

실시예 5: 면역원성 및 B 세포 기억에 대한 펩타이드 면역화 연구

표 5에 나타낸 선택 펩타이드가 면역원성인지를 측정하고 면역학적 기억이 발달하였는지를 측정하기 위한 실험을 수행하였다. 3 마리의 Balb/c 마우스 군들을 도 1a, 1b 및 2에 도시된 바와 같이, 0일째에 펩타이드 또는 Q베타 VLP에 접합된 펩타이드로 초회 항원자극하고 14일 및 101일째에 추가 항원 자극한 반면, 일부 마우스는 101일째에 단지 초회만 항원 자극하였다. 28, 101, 104, 108 및 115일째에 혈청을 수집하였다. 선택 마우스로부터의 혈청을 94일째에 수집하였다. 면역된 동물로부터의 항체 반응을 항원 특이성 역가 측정 분석(실시예 13에 개시된 바와 같이)을 사용하여 조사하였다.

상기 펩타이드가 28일째로부터의 혈청 샘플을 사용하여 면역원성임을 보이는 상기 항원 특이성 IgG 역가 결과를 도 1b에 요약한다. 이 연구는 펩타이드 A-1, A-1P, B-1P 및 C-1P가, 항원보강제로서 티터맥스 골드(TiterMax Gold)(Alexis Biochemicals)를 사용하여 면역화할 때 면역원성임을 보였다. 상기 A-1P 펩타이드 및 티터맥스 골드, 또는 Q베타-VLP에 접합된 A-1P에 의한 초회 항원자극에 이어서, 14일째 A-1P-Q베타-VLP에 의한 추가 항원 자극은 상기 A-1P 티터맥스 초회-추가 항원 자극 군보다 더 큰 항체 역가를 생성시켰다. 항원보강제로서 KLH에 접합된 A-1P(실시예 4에 개시된 바와 같이 제조됨)에 의한 초회 항원 자극 및 14일째 추가 항원 자극은 또한 상기 A-1P 티터백스 초회-추가 항원 자극 군보다 더 큰 항체 역가를 생성시켰다.

면역화에 사용된 인산화된(A-1P, B-1P, D-1P, C-1P) 또는 인산화되지 않은 펩타이드(A-1)에 대해 유도된 항체의 선택성을 또한 검사하였다. 이를 상기 면역화에 사용된 각각의 펩타이드의 인산화된 및 인산화되지 않은 버전 모두에 대한 상기 항체 역가를 비교함으로써 수행하였다(도 1b 참조). 특이 역가 대 비특이 역가의 비를 계산하였다. 이 실험에서, A-1(군 1)에 대한 항체 반응은 상기 동물을 면역시킨 펩타이드의 인산화 상태에 대해 선택성(<0.1 배)인 반면, C-1P(군 5)에 대한 항체는 선택성(>7C-1P/C-1 역가 비)인 듯하다. 군 2(A-1P)는 선택성이지 않았다.

A-1P B 세포 기억 회상 반응을 보이는 결과를 도 2에 나타낸다. 군 A(티터맥스와 A-1P의 초회 항원 자극, A-1P-Q베타-VLP에 의한 추가 항원 자극) 및 군 B(A-1P-Q베타-VLP에 의한 초회 항원 자극 및 추가 항원 자극)를 군 C(Q베타-VLP에 접합된 A-1P에 의해 101일째 초회 항원 자극됨)와 비교하였다. 3 개의 군은 모두 IgM 반응을 가졌다. IgG는 104일째에 101 일째 추가 항원 자극된 2 개의 군 모두에서 검출되었지만 101일째 초회 항원 자극된 군의 경우는 7일까지 검출되지 않았다. 104일 역가는 94일 역가보다 더 컸다. 7일 및 14일째 IgG 역가는 또한 101일 초회 항원 자극 군(군 C)보다 더 컸다. 108일 및 115일째 군 A 및 B IgG 역가는 동일한 반면, 군 C IgG 역가는 115일까지 최고조에 달하지 않았다. 이들 데이터는 장기적인 항체 반응 및 B 세포 기억 회상을 가리킨다.

실시예 6: 면역원성에 대한 펩타이드 초회 항원 자극 및 펩타이드 - VLP 추가 항원 자극 면역화 연구

표 5로부터의 선택 펩타이드가, 알룸(Al(OH)₃; 알하이드로젤(Alhydrogel) 2% '85', Brenntag Biosector)으로 항원보강된 펩타이드 초회 항원 자극에 이어서 Q베타-VLP에 접합된 펩타이드에 의한 추가 항원 자극으로서 면역시켰을 때 면역원성임을 측정하기 위한 실험을 수행하였다. 4 마리의 Balb/c 마우스의 군들을 도 3에 도시된 바와 같이 0일째에 초회 항원 자극하고 28일 및 56일째에 추가 항원 자극하였다. 혈청들을 70일째에 수집하였다. 면역된 동물들로부터의 항체 반응을 항원 특이성 역가 측정 분석(실시예 13에 개시된 바와 같음)을 사용하여 조사하였다.

결과를 도 3에 요약한다. 군 1 내지 6에서, 면역화에 사용된 펩타이드에 대한 IgG 항체는 시험된 최대 희석 비(1:1,749,600)에서 검출되었으며, 이는 상기 면역된 펩타이드 항원에 대한 확고한 항체 반응을 가리킨다. 처리되지 않은 군(군 7)에서는 항체가 검출되지 않았다. 펩타이드 D-1P 및 C-1P를 사용하는 면역화에 의해 발생된 항체는 펩타이드 E-1P를 인식하였다. 펩타이드 D-1P 및 C-1P는 E-1P 내에 완전히 포함된다.

면역화에 사용된 인산화된(A-1P, B-1P, D-1P, C-1P, E-1P) 또는 인산화되지 않은 펩타이드(A-1)에 의해 유도된 항체들의 선택성을 조사하였다. 이를 인산화된 펩타이드의 인산화되지 않은 버전 및 인산화되지 않은 펩타이드의 인산화된 버전에 대한 상기 항체 역가를 측정함으로써 수행하였다(도 3 참조). 특이 역가 대 비특이 역가의 비를 계산하였다. 이 실험에서, D-1P(군 4), C-1P(군 5) 및 E-1P(군 6)에 대한 항체는 상기 동물을 면역시킨 펩타이드의 인산화 상태에 대해 선택성(>10 역가 비)이었다.

실시예 7: 면역원성에 대한 펩타이드 - VLP 면역화 연구

표 5로부터의 선택 펩타이드 및 펩타이드들의 조합이 다양한 항원보강제와의 Q베타-VLP 접합체로서 면역시켰을 때 면역원성인지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 4 개의 TG4510 +/+(트랜스제닉 이중 양성, 문헌[Ramsden et al, J. Neuroscience 25(46):10637 (2005)]을 참조하시오) 또는 TG4510 -/-(야생형 한배 새끼 대조군) 마우스 군을 0일째에 초회 항원 자극하고 56일째 및 28일 또는 29일째에 추가 항원 자극하였다. 혈청을 63일째에 수집하였다. 면역된 동물로부터의 항체 반응을 실시예 13에 개시된 바와 같은 항원 특이성 IgG 역가 측정 분석을 사용하여 조사하였다.

상기 63일째 샘플 결과를 도 4에 요약한다. 모든 군에서, 상기 면역화에 사용된 펩타이드 또는 펩타이드들의 조합에 대한 항체(IgG)가 7.7E+04 내지 1.58E+06 범위의 평균 역가에서 검출되었다. 각각 100 ㎍ 또는 10 ㎍의 3 개의 펩타이드-Q베타-VLP 접합체 조합의 면역화는 100 ㎍의 펩타이드-Q베타-VLP 접합체 단독의 면역화와 유사한 역가를 이끌어내었다. 조합 투여 군 1 및 2의 A-1P, B-1P 및 C-1P 역가는 관련된 단일 투여 군(군 3, 4 및 5)의 경우의 1.7 내지 4.4 배이다. 조합 투여 군 11 및 12의 A-1P, B-1P 및 C-1P 역가는 관련된 단일 투여 군(군 13, 14 및 15)의 경우의 0.32 내지 2.8 배이다. 항원보강제(알룸, 또는 CpG-24555(2008 년 12월 9일자로 출원된 미국 가 특허 출원 제 61/121,022 호) 또는 CpG-24555를 갖는 ABISCO-100(Isconova))가 사용되거나 사용되지 않은 경우에 항체가 검출되었다. 상기 펩타이드에 대한 항체는 처리되지 않은 대조군에서 검출되지 않았다.

면역화에 사용된 인산화된(A-1P, B-1P, D-1P, C-1P, E-1P)에 의해 유도된 항체의 선택성을 선택 군들에서 조사하였다. 이를 군 1 내지 7의 인산화된 펩타이드의 인산화되지 않은 버전에 대한 항체 역가를 측정함으로써 수행하였다(도 4). 특이 역가 대 비특이 역가의 비를 계산하였다. 이 실험에서, 항체들은 모든 투여 군들에서 B-1에 비해 B-1P에 대해 선택성이었다(>10 배 역가 비). 상기 항체들은 군 6, 비-알룸 함유 군에서만 C-1에 비해 C-1P에 대해 선택성이었다. 상기 항체들은 군 2, 3 및 6에서는 A-1에 비해 A-1P에 대해 선택성이었으나, 군 1, 알룸으로 항원보강된 고 용량의 조합 면역화 군에서는 아니었다. 상기 인산화되지 않은 펩타이드에 대한 항체는 처리되지 않은 대조군에서 검출되지 않았다.

실시예 8: 경로, 항원보강제 및 이소타입에 대한 펩타이드 - VLP 면역화 연구

상이한 항원보강제 및 투여 경로가 사용되는 경우 유도되는 항체들의 면역원성 및 이소타입을 비교하기 위한 실험을 수행하였다. 3 마리의 Balb/c 마우스 군들을 도 5에 도시된 바와 같이 0일째에 초회 항원 자극하고 17일째에 추가 항원 자극하였다. 혈청을 24일째에 수집하였다. 면역화된 동물로부터의 항체 반응을 실시예 13에 개시된 바와 같이 항원 특이성 역가 측정 분석을 사용하여 조사하였다.

Q베타-VLP에 접합된 A-1P를 피하 또는 근육 내 주사를 통해 BALB/c에게 전달하였다. 상이한 조합의 항원들을 또한 근육 내 경로를 통해 시험하였다. 27일째 샘플을 사용한 결과를 도 5에 요약한다. Q베타-VLP에 접합되고 알룸으로 항원보강된 A-1P의 피하 및 근육 내 투여 모두는 IgG 항체 반응을 이끌어내었다. 상기 근육 내 투여된 군은 피하 투여된 군(11)보다 더 큰 A-1P 대 A-1 역가 비(70)를 가졌다. 이는 투여 경로가 반응의 선택성에 영향을 미칠 수 있음을 가리킨다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 사용된 모든 항원보강제 조합들은 항원보강제로서 알룸을 포함하지 않는 군 3(0.17) 및 4(0.17)보다 훨씬 더 큰 IgG1 대 IgG2a 비를 갖는 알룸 함유 군(군 2 및 5에 대해 각각 21 및 12의 비)을 갖는 IgG1 및 IgG2a 항체를 유도하였다. 이는 Th2에 대한 왜곡된 면역 반응에 대한 알룸의 공지된 효과와 일치한다(Lindblad, Immunol Cell Biol. 82(5):497-505 (2004); Marrack et al., Nature Rev. 9:287-293 (2009)). 상기 결과는 항원보강제를 사용하여 본 실시예에 사용된 백신에 대한 항체 반응을 변경시킬 수 있음을 암시한다. 상기 펩타이드들에 대한 항체는 처리되지 않은 대조군에서 검출되지 않았다.

실시예 9: 연결기 분석을 위한 펩타이드 - VLP 면역화

면역원성이 표 5로부터의 선택 펩타이드의 연결기(CGG 또는 GGC)의 위치에 의해 영향을 받는지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 이때, A-1P 펩타이드를 상기 펩타이드의 N-말단(즉 서열번호 31 - A-1P) 또는 C-말단(즉 서열번호 41 - A-11P) 상의 연결기와 함께 사용하였다. 4 마리의 TG4510 +/+ 마우스 군들을 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 0일째에 초회 항원 자극하고 14일째에 추가 항원 자극하였다. 마우스를 20일째에 방혈시켰다. 면역화된 동물로부터의 항체 반응을 실시예 13에 개시된 바와 같은 항원 특이성 역가 측정 분석을 사용하여 조사하였다.

표 1에 나타낸 결과들을 근거로, 상기 Q베타-VLP에 대한 연결기 서열을 상기 타우 특이성 서열의 N-(CGG) 또는 C-말단(GGC) 상에 놓을 수 있으며, 상기 서열은 여전히 인산화 선택성 IgG 반응을 이끌어낼 수 있다(>10 배 역가 비, 표 1). 상기 실험에 사용된 펩타이드(서열번호 31 및 41)는 상기 CGG 연결기가 서열번호 31에서 N-말단이고 상기 연결기 GGC가 서열번호 41에서 C-말단임을 제외하고 동일한 서열을 갖는다. 상기 두 펩타이드는 모두 20일째 샘플에서 유사한 IgG 역가를 이끌어 내었다. 상기 두 펩타이드 서열에 의해 유도된 항체는 표 1에 나타낸 바와 같이, 49 및 >132의 인산화된 대 인산화되지 않은 IgG 역가 비에 의해 측정된 바와 같이 선택성이었다. 상기 펩타이드들에 대한 항체는 56일째 처리되지 않은 대조군에서는 검출되지 않았다(도 4에서 군 7).

마우스를 근육 내 면역시켰다. 100 ㎍의 펩타이드-VLP 및 750 ㎍의 알룸(Al(OH)₃)을 사용하였다. 항원 특이성 역가 측정 분석(실시예 13 참조)에서 시험된 혈청 희석 비 범위는 1:5,000 내지 1:15,800,000 이었다.
백신	항원보강제	마우스	N	20일째 IgG 역가			선택성
백신	항원보강제	마우스	N	A-1P IgG (mg/mL)	A-1P 역가	A-1 역가	A-1P/A-1
A-1P-VLP	알룸	TG4510++	4	0.62	6.85E+05	1.90E+04	49.0
A-11P-VLP	알룸	TG4510++	4	0.42	6.58E+05	< 5.00E+03	> 132

실시예 10: 절두된 펩타이드에의 다클론 항체의 결합

표 5로부터의 선택 펩타이드가, 항체들이 유도된 A-1P, B-1P 또는 C-1P 내에 존재하는 면역원성 에피토프를 함유하는지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 A-1P, B-1P 또는 C-1P로 백신화한 마우스로부터 혈청을 수집하였다. 면역된 동물들로부터의 항체 반응을 데이터 분석에 대해 하기와 같이 변형시킨 항원 특이성 역가 측정 분석(실시예 13에 개시된 바와 같음)을 사용하여 조사하였다: 코팅되지 않은 웰 평균 신호의 2 배 신호를 양으로 간주한 반면 상기 코팅되지 않은 웰 평균 신호의 2 배 아래의 신호를 음으로 간주하였다.

A-1P, B-1P 또는 C-1P 펩타이드의 펩타이드-VLP 접합체로 면역시킨 동물들로부터의 항체가 상기 펩타이드들 각각의 보다 짧은 버전에 결합하는지를 측정하기 위해서, ELISA를 수행하였다. 시험된 각각의 타우 펩타이드를 플레이트 항원으로서 사용하였으며 A-1P, B-1P 또는 C-1P-VLP 면역된 마우스로부터의 1:4 x 10⁴ 및 1:4 x 10⁵ 희석 비의 혈청을, 관련된 펩타이드에 결합할 수 있는지를 측정하기 위해 시험하였다(표 3 참조). 상기 혈청은 앞서 항원 특이성 항체를 갖는 것으로 나타났다. 혈청은 관련된 모 펩타이드(A-1P 및 유도체의 경우 A-1P, B-1P 및 유도체의 경우 B-1P, C-1P 및 C-1P/E-1P 유도체의 경우 C-1P)로 면역시킨 마우스로부터 것이었다(표 2 참조). 각각의 항혈청을 2 개의 희석 비(1:4 x 10⁴ 및 1:4 x 10⁵)로 사용하였다. 상기 펩타이드에 대한 결합이 검출되었으면, 양의 결과를 목록에 싣는다. 신호가 어느 혈청 희석 비로부터도 검출되지 않았으면, 음의 결과를 목록에 싣는다. 상기 시험된 샘플들은 모두, A-5P, A-10P 및 B-2P를 제외하고, 양의 신호를 가졌으며, 이는 완전 길이(모) 펩타이드에 의해 유도된 항체가 상기 시험된 보다 짧은 유도체의 대부분에 또한 결합함을 가리킨다.

마우스를 근육 내 면역시켰다. 100 ㎍의 펩타이드, 100 ㎍의 펩타이드-VLP 및 750 ㎍의 알룸(Al(OH)₃)을 나열된 곳에 사용하였다. 항원 특이성 역가 측정 분석(실시예 13 참조)에서 1:4 x 10⁴ 및 1:4 x 10⁵ 의 희석 비를 각 혈청에 대해 시험하였다.
	초회 항원 자극 ( 0일째)	추가 항원 자극
혈청	백신	백신	일수	마우스 균주	혈청 수집 (일)
1	A-1P-VLP + 알룸	A-1P-VLP + Alum	14, 28	TG4510 -/-	42
2	A-1P-VLP + 알룸	A-1P-VLP + Alum	14	TG4510 -/-	20
3	B-1P	B-1P-VLP	28, 56	Balb/c	70
4	B-1P	B-1P-VLP	28, 56	Balb/c	70
5	C-1P-VLP + 알룸	C-1P-VLP + Alum	14, 28	TG4510 -/-	42
6	C-1P	C-1P-VLP	28, 56	Balb/c	70

"양"은 상기 웰에 대한 OD가 배경(코팅되지 않은 웰) 평균의 OD의 2 배 이상임을 가리킨다. "음"은 상기 웰에 대한 OD가 배경(코팅되지 않은 웰) 평균의 OD의 2 배 미만임을 가리킨다.
펩타이드	혈청 A	혈청 B
A-1P	양	양
A-2P	양	양
A-4P	양	음
A-5P	음	음
A-6P	양	양
A-7P	양	양
A-8P	양	양
A-9P	양	양
A-10P	음	음
B-1P	양	양
B-2P	음	음
B-3P	양	양
B-4P	양	음
B-5P	양	음
B-6P	양	음
C-1P	양	양
C-2P	양	양
C-3P	양	양
C-4P	양	양
C-5P	양	양

실시예 11: 면역원성 및 기억에 대한 절두된 펩타이드 면역화 연구

표 5로부터의 선택 펩타이드가 Q베타-VLP 접합체로서 면역시켰을 때 면역원성인지를 측정하기 위한 2 개의 실험을 수행하였다. 이들 연구 중 하나를 또한 면역학적 기억이 발달하였는지를 측정하기 위해 사용하였다. MHC I 군 및 MHC II 군 T-세포 리간드에 대한 펩타이드 항원의 잠재적인 결합을 피하기 위한 노력으로, 보다 짧은 버전의 A-1P, B-1P 및 C-1P "모" 펩타이드를 시험하였다. 7 내지 11 아미노산의 펩타이드 길이를 선택하였는데, 그 이유는 MHC II 군 분자가 일반적으로 13 내지 17 아미노산을 갖는 펩타이드에 결합하고 8 이상 아미노산의 펩타이드 길이는 MHC I 결합에 요구되기 때문이다(Murphy et al., Janeway Immunobiology, Garland Science (2007)). 따라서, 11 이하의 아미노산을 갖는 펩타이드들은 MHC II 군 제한된 CD4 T-세포 반응을 유도하지 않을 것이며 7 아미노산 펩타이드는 CD4 T-세포도 MHC I 군 제한된 CD8 T-세포 반응도 유도하지 않을 것이다. 7 아미노산 길이의 펩타이드 F-1P를 또한 시험하였다. 3 또는 6 마리의 Balb/c 마우스 군들을 도 6에 나타낸 바와 같이 0일째에 초회 항원 자극하고 14일째에 추가 항원 자극하였다. 3 개의 군을 또한 108일째에 추가 항원 자극하였으며 3 개의 군을 108일째에 초회 항원 자극하였다(도 7 참조). 혈청을 21일째, 또는 28일째, 또는 111일, 115일 및 122일째, 또는 21일, 105일, 111일, 115일 및 122일째에 수집하였다. 면역된 동물로부터의 항체 반응을 항원 특이성 역가 측정 분석(실시예 13에 개시된 바와 같음)을 사용하여 조사하였다.

결과를 도 6에 요약한다. 모든 펩타이드-Q베타-VLP 접합체는 B-5P를 제외하고(이때 3 마리의 마우스 중 단지 2 마리만이 1:15,800의 혈청 희석 비에서 검출 가능한 항체를 가졌다) 상기 ELISA에서 시험된 마우스들 전부로부터 항원 특이성 IgG 항체를 유도하였다. 이러한 결과는 CGG 연결기를 갖는 7 내지 11 아미노산 타우 펩타이드가 면역원성이며 상기 면역원에 특이적인 항체를 이끌어낼 수 있음을 가리킨다.

면역화에 사용된 인산화된 펩타이드 형태에 대해 유도된 항체들의 선택성을 조사하였다(도 6 참조). 이들 펩타이드의 대부분은 인산화되지 않은 형태에 비해 상기 펩타이드의 인산화된 형태에 대해 선택성이었다(>10 배 역가 비). 상기 단축된 A-1P, B-1P 및 C-1P 유도체들 중 다수는, 상기 면역화 펩타이드의 인산화되지 않은 버전을 플레이트 항원으로서 사용한 경우 ELISA 신호가 검출되지 않았다. 상기 단축된 A-1P, B-1P 및 C-1P 유도체들 중 다수의 선택성은 모 펩타이드와 같거나 이보다 크다. 상기 CGG 연결기가 없는 펩타이드 A-2P의 활성 면역화는 JNPL3 타우 P301L 과발현 동물 모델(Asuni et al., J. Neurosci. 27:9115 (2007))에서 뇌 중의 응집된 타우를 감소시키고 매듭-관련된 감각운동 장애의 진행을 느리게 하는 것으로 보고되었다. A-2P는, Q-베타-VLP에 접합될 때 면역원성이었다. 그러나, 상기 유도된 항체는 ELISA 분석에서 인산화되지 않은 버전(A-2)에 비해 상기 펩타이드의 인산화된 버전(A-2P)에 대해 선택성이지 않았다(1.7의 A-2P/A-2 역가 비). 대조적으로, 이들 항체는 A-1보다 A-1P에 대해 선택성이었다(>10.0의 A-1P/A-1 역가 비). 상기 역가는 ELISA 항원으로서 A-2P 및 A-1P를 사용할 때 동일하였다. 이는 상기 비-포스포특이성 항체들 대부분의 에피토프가, A-1P 중에 함유되지 않은 펩타이드 A-2P의 12 아미노산을 포함함을 암시한다. 이 실험에서, C-1P는 항원보강제로서 알룸이 있는 경우보다 알룸이 없이 시험될 때 더 큰 선택성을 가졌다(각각 군 14 및 10). 항원보강제, 예를 들어 알룸을 사용하여 상기 인산화된 펩타이드 대 인산화되지 않은 펩타이드에 대한 선택성을 변경시킬 수 있다. 상기 펩타이드들에 대한 항체는 처리되지 않은 대조군에서 검출되지 않았다. 이러한 결과는 CGG 연결기를 갖는 7 내지 11 아미노산 타우 펩타이드가 포스포-펩타이드 선택성 항체를 유도할 수 있음을 가리킨다.

A-1P, B-1P, 및 C-1P에 대한 기억 회상 반응의 시험 결과를 도 7에 나타낸다. 0, 14 및 108일째 초회 항원 자극하고 추가 항원 자극한 펩타이드-Q베타-VLP 면역된 마우스에 대한 111, 115 및 122일째 IgG 역가(각각 최종 면역화로부터 +3, +7 및 +14일째)를 108일째 초회 항원 자극한 경우와 비교하였다. 군 1, 2 및 3은 최종 추가 항원 자극 후 105, 84일째에 큰 IgG 역가를 가졌다. 108일째 초회 항원 자극 군(군 4, 5 및 6)과 비교하여, 상기 군은 또한 111일 내지 115일째에 IgG 역가의 큰 증가를 가졌다. 이들 데이터는 장기적인 항체 반응 및 기억 회상을 가리킨다.

실시예 12: 알룸 존재 및 알룸 부재 하의 면역원성 및 T-세포 반응에 대한 절두된 펩타이드 면역화 연구

A-1P, B-1P 및 C-1P(표 5)로부터 유래된 펩타이드가, 0 또는 504 ㎍의 알룸(Al(OH)₃)과 함께 100 ㎍의 Q베타-VLP 접합체로 면역시키는 경우 또는 알룸 존재 또는 부재 하의 펩타이드-Q베타-VLP 접합체의 조합으로서 제공되는 경우 면역원성임을 측정하기 위한 실험을 수행하였다. 비장에서 T-세포 반응을 또한 분석하였다. 3 마리의 TG4510 -/- 야생형 한배 새끼 마우스 군들을 도 8에 나타낸 바와 같이 0일째에 초회 항원 자극하고 14일째에 추가 항원 자극하였다. 혈청 및 비장을 21일째에 수집하였다. 면역된 동물들로부터의 항체 반응을 항원 특이성 역가 측정 분석(실시예 13에 개시된 바와 같음) 및 IFN-γ ELISPOT 분석(실시예 14에 개시된 바와 같음)을 사용하여 조사하였다.

상기 항원 특이성 IgG 역가는 상기 시험된 펩타이드가 모두 504 ㎍의 알룸(Al(OH)₃)과 함께 또는 알룸 없이 Q베타-VLP 접합체로서 면역시켰을 때 모두 면역원성임을 보인다(도 8 참조). 총 750 ㎍의 알룸 대 300 ㎍ 펩타이드-Q베타-VLP 접합체의 조합으로서 A-8P, B-3P 및 C-2P의 면역화는 상기 3 개의 펩타이드 모두에 대해 선택적인 항체 반응을 생성시켰다.

상기 면역된 인산화된 펩타이드 대 상기 펩타이드의 인산화되지 않은 버전에 대해 유도된 항체들의 선택성을 ELISA에 의해 검사하였다(도 8). 특이 역가 대 비특이 역가의 비가 보다 큰 선택성을 가리키는 보다 큰 비로 계산되었다. 상기 유도된 항체는 알룸이 상기 초회 항원 자극 및 추가 항원 자극에 포함되었는지의 여부와 관계없이, 및 상기 펩타이드-Q베타-VLP 접합체가 단독으로 면역되었는지 함께 면역되었는지에 관계없이 상기 펩타이드의 인산화된 형태에 대해 선택성이었다.

단일 펩타이드 Q베타-VLP에 의한 면역화 후 비장에서의 T-세포 반응을 IFN-γ ELISPOT 분석을 사용하여 분석하였다(도 9 참조). 모 타우 펩타이드(A-1P, B-1P, C-1P) 및 그의 상응하는 절두된 버전에 특이적인 IFN-γ를 분비하는 T-세포의 빈도를 최종 펩타이드 Q베타-VLP 추가 항원 자극 후 21일, 7일째에 분석하였다. 관련되지 않은 펩타이드 대조군(HBV-1)에 비해, 알룸의 존재 또는 부재 하에서 B-3P-Q베타-VLP 및 C-2P-Q베타-VLP로 면역화 후 B-1P, B-1, B-3P, B-3, C-1P, C-1, C-2P 또는 C-2 특이성 IFN-γ 분비 T-세포의 수는 그다지 발생하지 않았다. 현저한(p<0.05) 수준의 A-3P 특이성 IFN-γ T-세포 반응은 A-3P-Q베타-VLP로 면역화 후에 유도되었다. 상기 A-3P 펩타이드는 예측된 마우스 MHC I 군 K^b 결합 에피토프(IVYKSPVV, 문헌[Lundegaard et al. Bioinformatics 24:1397-1398 (2008)]을 참조하시오)를 함유하며, 상기 에피토프는 A-3P 면역된 동물에서 관찰된 T-세포 반응에 기여할 수 있다. 상기 에피토프는 또한 A-1P, A-1, A-2P, A-2 및 A-3 중에 존재한다. 상기 A-1P 펩타이드가 7 아미노산 길이 펩타이드(A-8P Q베타-VLP)로 단축되면, A-8P Q베타-VLP 면역된 마우스에서 IFN-γ-특이성 T-세포 반응은 배경 수준으로 감소하였다.

CD4 T 헬퍼 세포가 이소타입 전환된 항체 반응의 발생 및 기억 B 세포의 생성에 필요하다(Murphy et al., Janway Immunobiology, Garland Science, (2007)). 따라서, IgG 항체 반응이 절두된 포스포-타우 펩타이드 Q베타-VLP로 면역화 후 그의 각각의 펩타이드 에피토프에 대해 생성된다는 발견은 CD4 T 헬퍼 반응이 상기 백신에 대해 유도됨을 암시한다. 상기 절두된 펩타이드 접합체로 면역화 후 현저한 수준의 타우-펩타이드 특이성 T-세포는 생성되지 않았으므로, 상기 백신의 또 다른 성분에 대한 T-세포 반응을 시험하였다. 상기 VLP-단백질에 대한 T-세포 반응의 분석은 IFN-γ 특이성 T-세포가 VLP 에피토프에 대해 생성되었음을 나타낸다(관련되지 않은 단백질 대조군(BSA, Sigma Aldrich A9418)에 대해 4 내지 15 배).

실시예 13: 항원 특이성 항체 역가 측정

하기의 분석을 사용하여 실시예 5 내지 12에 상술한 바와 같이, 면역된 동물로부터의 항체 반응을 측정하였다.

비색분석 ELISA를 사용하여 양성 신호에 의해 나타내는 바와 같이, 검출 가능한 항원 특이성 항체를 갖는 혈청의 최고 희석 비를 측정하였다. 일련의 희석물을 혈청 샘플로부터 제조하고 상기 분석에서 시험하였다. 일부 분석에서, 상기 포스포-타우 펩타이드에 특이적인 단클론 항체를 양성 대조군 또는 표준으로서 사용하였다. 백신화되지 않은 마우스(BALB/c, TG4510 +/+ 또는 Tg4510 -/-)로부터의 혈청을 음성 대조군으로서 사용하였다. 96-웰 고 결합 폴리스타이렌 플레이트(CoStar 9018)를 18 내지 21 시간 동안 4 ℃에서 0.1M 탄산 나트륨 pH 8.2(Sigma S7795) 중에서 희석된 100 ㎕의 펩타이드로 코팅하였다. 상기 펩타이드들은 모두 C-1P 및 C-1(이들은 3 ㎍/㎖이었다)을 제외하고 0.3 ㎍/㎖의 농도였다. 다음날, 상기 코팅 용액을 제거하고 상기 플레이트를, 실온에서 1 시간 동안 600 rpm에서 하일돌프 티트라맥스(Heildolph Titramax) 1000을 사용하여 진탕하면서 0.05% 트윈 20(Sigma P2287) 및 1% BSA(Sigma A9418)를 함유하는 PBS(EMD OmniPure 6507) 용액으로 차단하였다. 상기 차단 용액을 제거한 후에 상기 샘플들을 상기 플레이트에 가하였다.

표준으로서 사용된 마우스 혈청 및 단클론 항체를 0.5% 트윈 20(PBS-T)을 함유하는 PBS 중에서 0.5 또는 1 로그 희석 비를 사용하여 연속 희석하였다. 상기 혈청 샘플들에 대해서, 1:500, 1:5000 또는 1:15,800으로 출발하는 6 또는 8 개의 희석 비를 각 샘플들에 대해 시험하였다. 표준 및 양성 대조군으로서 사용된 단클론 항체는 하기와 같았다: A-1P의 경우 항-타우 396(Zymed 35-5300), B-1P의 경우 AT-180(Thermo Pierce MN1040); D-1P 및 E-1P의 경우 AT-8(Thermo Pierce MN1020); C-1P의 경우 AT-100(Thermo Pierce MN1060). 웰 당 50, 15.8, 5, 1.58, 0.5, 0.158 및 0.05 ng이 상기 표준 곡선에 대한 단클론 항체의 사용 농도였다.

상기 샘플 및 표준을 중복 웰에서 웰 당 100 ㎕로 상기 플레이트에 가하였다. 상기 플레이트를 600 rpm에서 진탕하면서 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 이어서 상기 플레이트를 PBS-T로 3 회 세척하고 PBS-T에서 1:3000으로 희석한 2차 항체(HRPO-접합된 항-마우스 IgG, Caltag #M30107)를 100 ㎕/웰로 가하였다. 상이한 2차 항체들을 IgG₁ (Caltag #M32107 1:2000), IgG_2a (Caltag #M32307 1:2000), 및 IgM (Caltag #31507 1:3000)의 검출에 사용하였다. 상기 2차 항체를, 진탕하면서 실온에서 1 시간 동안 상기 플레이트에 결합되게 하였다. 상기 플레이트를 다시 PBS-T로 3 회 세척하고 상기 플레이트를 최종 세척 후 흡수 건조시켰다. 전개를 위해서, 100 ㎕의 MB 퍼옥시다제 EIA 기질(Bio-Rad #172-1067)을 실온에서 11 분간 각 웰에 가하였다. 상기 반응을 정지시키기 위해서, 100 ㎕의 1N 황산을 각 웰에 가하였다. 흡광도를 몰레큘라 디바이시스 스펙트라맥스 플러스(Molecular Devices Spectramax plus) 384 상에서 450 ㎚에서 판독하였다. OD 한계 값을, PBS-T로 처리한 모든 웰의 평균을 취하고 3 x 상기 웰의 표준 편차를 더하여 각 플레이트에 대해 계산하였다. 표준 편차를 계산할 수 없는 경우, 상기 PBS-T OD의 2 배 값을 한계 값으로서 사용하였다. 상기 샘플 역가를 상기 계산된 한계 값보다 더 큰 450 ㎚ 흡광도 값을 갖는 첫 번째 샘플 희석 비로부터 측정하였다. 일부 분석의 경우, 관련된 양성 대조용 단클론의 희석 비에 근거한 표준 곡선을 사용하여 상기 표준 곡선에 대한 적정 농도를 계산하였다. 신호가 검출되지 않았을 때 상기 시험된 최저 희석 또는 표준 값을 사용하였으며 가장 큰 희석이 양성일 때 시험된 최대 희석 또는 표준 값을 사용하였다. N이 2보다 클 때 평균 역가를 계산한 반면, N이 1 또는 2일 때는 개별적인 값들을 나타내었다. 선택성 비를, 인산화된 펩타이드에 대한 샘플 역가를 각 샘플에 대해 동일한 펩타이드의 인산화되지 않은 버전의 역가로 나누고, 이어서 상이한 샘플들에 대한 비를 평균함으로써 측정하였다. 10 초과 또는 0.1 미만의 값을 선택성인 것으로 간주하였다. 선택성의 측정에 가장 보수적인 방법은 첫 번째 양성 희석 비를 사용하는 것이었다. 다른 방법, 예를 들어 1의 한계 OD 또는 최대 절반의 OD를 사용하는 것이 보다 큰 선택성 값을 제공할 듯하다.

실시예 14: IFN -γ ELISPOT 분석

상기 IFN-γ ELISOPOT 키트(BD Biosciences; 551083)를 사용하여 펩타이드-Q베타-VLP로 면역화 후 T-세포 반응을 측정하였다. ELISPOT을 A-8P, A-3P, B-3P, C-2P(저 용량 알룸의 존재 또는 알룸 부재 하의) 면역시킨 마우스 및 또한 면역시키지 않은 마우스로부터 모은 비장(N=3)에서 수행하였다. 96 웰 ELISPOT 플레이트를 4 ℃에서 밤새 5 ㎍/㎖의 포획 항-마우스 IFN-γ 항체로 도말하였다. 항체 코팅된 플레이트를 세척하고 10% 소 태아 혈청(VWR A15-204)을 함유하는 RPMI 1640 완전 배지(Invitrogen 11875-119)로 차단하였다.

이어서 비장 세포를 웰 당 500,000 비장 세포로 항-IFN-γ 항체 코팅된 플레이트에 시딩하고 5% CO₂를 갖는 37 ℃ 배양기에서 20 내지 24 시간 동안 10 ㎍/㎖의 펩타이드 또는 단백질 항원으로 자극하였다. 관련 없는 펩타이드 대조군은 펩타이드 HBV-1(서열번호 77)이었으며 소 혈청 알부민(Sigma Aldrich; A9418)을 Q베타-VLP에 대한 관련없는 단백질 대조군으로서 사용하였다. 웰 당 55,555 및 18,520 세포로 시딩한 비장 세포의 포볼(phorbol) 12-미리스테이트 13-아세테이트(0.5 ㎍/㎖ PMA, Sigma Aldrich; P8139) 및 이오노마이신(0.5 ㎍/㎖, Sigma Aldrich; I0634) 자극을 양성 대조군으로서 사용하였다. 20 내지 24 시간 배양 기간 후에, ELISPOT 플레이트를 증류수로 2 회 세척한 다음 세척 완충제(0.05% 트윈-20(Sigma P2287)을 함유하는 1 x PBS(Invitrogen 10010072))로 추가로 3 회 세척하였다. IFN-γ 사이토킨의 검출을, 실온에서 2 시간 동안 10% FBS를 함유하는 PBS 중에서 희석된 비오틴화된 항-IFN-γ 검출 항체 2 ㎍/㎖을 배양한 다음, PBS 10% FBS 중에서 희석된 1:100의 스트렙트아미딘 HRP와 함께 배양함으로써 수행하였다. 플레이트를 세척 완충제로 4 회 및 PBS로 2 회 세척한 후에, IFN-γ 스폿을 AEC 크로마젠-기질을 사용하여 가시화하였다(실온에서 11 분 배양).

IFN-γ 양성 스폿을 스캐닝하고, 포획하고, 셀룰라 테크놀로지(Cellular Technology) ELISpot 분석기 및 5.0 프로페셔널 임뮤노스폿(Professional Immunospot) 소프트웨어 및 웰 당 평균 수를 사용하여 카운트하였다. 상기 관련없는 펩타이드는 상기 펩타이드 항원에 대한 음성 대조군인 반면 BSA는 접합되지 않은 VLP에 대한 음성 대조군이었다. 양성으로 간주되기 위해서, 상기 평균 스폿 값은 스튜던츠 T-시험을 사용하여, 관련된 음성 대조군보다 현저하게 더 커야 한다(p<0.05).

실시예 15: 항원보강제 제형 및 면역화

본 발명에 개시된 특정 실시예들(예를 들어 실시예 5 내지 14)에 사용된 항원보강제를 하기와 같이 제조하였다. CpG-24555를 수중 2 ㎎/㎖ 모액으로 제조하였다. 사용된 알룸은 10 ㎎/㎖ 알루미늄을 함유하는 알하이드로젤 "85"(Brenntag Biosector)이었다. 알하이드로젤 "85"를 100 ㎍의 펩타이드 또는 VLP 접합된 펩타이드와 1:1 비로 혼합하였다. 일반적으로 25 ㎕(근육 내 백신화의 경우) 또는 50 ㎕(피하 백신화의 경우) 이하를 100 ㎍의 VLP를 갖는 용액에 가하고 즉시 와동시키고 얼음 상에 놓았다. 티터맥스 골드(Alexis Biochemicals)를 펩타이드 용액과 1:1의 비로 가하였다. 50 ㎕의 티터맥스 골드를, 100 ㎕ 피하 용량을 위해서 50 ㎕의 2 ㎎/㎖ 펩타이드 용액에 가하고 4 ℃에서 10 분간 믹서밀(Mixermill)(SPEX Sample Prep.)로 유화시켰다. 25 ㎕(12 ㎍)의 AbISCO-100(Isconova)을 100 ㎍ 이하의 VLP-펩타이드 용액 및 5 ㎕(10 ㎍)의 CpG-24555에 가하고 와동시키고 얼음 상에 놓았다.

본 발명에서 개시된 특정 실시예들(예를 들어 실시예 5 내지 14)에서 수행된 면역화 및 동물 연구를 일반적으로 승인된 방법에 따라 수행하였다. 백신화를 위해서, 100 ㎕ 이하의 백신을 꼬리의 기부에 피하 주사하거나 50 ㎕를 뒷다리 전방 경골근 중 한쪽 또는 양쪽에 주사하였다. 하악 아래 랜싱을 통해 또는 종말에는 심장 천자를 통해 채혈을 수행하였다. 전 채혈 및 경부 탈구 후 비장을 제거하고 5% PBS 및 펜/스트렙(Penn/Strep)(Invitrogen Cat.#15140-122)이 있는 저온 멸균 HBBS(Invitrogen Cat #14170) 중에 넣었다. 비장을 70 ㎛ 스크린(Falcon) 상에서 짓이겼다. 세포를 빙냉 HBBS로 세척하고 적혈구를 ACK 용해 완충제(Invitrogen)로 용해시켰다. 비장 세포를 구아바(Guava) PCA 96(Guava Technologies Inc.) 상에서 카운트하였다.

실시예 16: 목적하는 면역 반응을 위한 Q베타/ VLP 에 대한 p 타우 펩타이드 접합 밀도의 최적화

Q베타/VLP에 대한 p타우 펩타이드 에피토프 접합 밀도(Q베타 단량체 아단위당 펩타이드의 수)가 상기 p타우 특이 항체 반응에 영항을 미치는지를 측정하기 위한 실험을 수행하였다. 몰 과잉의 SMPH 및 p타우 펩타이드 과잉을 변화시킴으로써 생성시킨 상이한 결합 조건들을 사용하여 8 개의 상이한 에피토프 밀도의 p타우/VLP 접합체를 생성시켰다(표 4). 5 마리의 암컷 BalbC 마우스(8 주 된 것) 군을 0일 및 14일째에 알룸(Al(OH)₃) 750 ㎍ 중의 각각의 상이한 밀도의 접합체들 100 ug으로 면역시켰다(sc). 혈청을 26일째에 수집하였다. 면역된 동물로부터의 항체 반응을 실시예 13에 개시된 바와 같은 항원 특이성 역가 측정 분석을 사용하여 조사하였다.

표 4에 나타낸 상기 26일째 역가 결과를 근거로, A-8P/Q베타에 대한 2.3 접합 밀도는 더 높은(3.6) 밀도 접합된 형태보다 더 높은 역가의 면역 반응을 생성시켰다. 상이한 B-3P/Q베타 접합체의 경우, 역가는 상기 2.2 및 3.6 접합체 밀도 형태들의 경우 유사하고 가장 높았다. C-2P/Q베타의 경우, 상기 2.2 및 3.5 에피토프 접합 밀도는 유사한 역가를 생성시켰으며, 이는 상기 4.3 접합 밀도 형태보다 약간 더 높았다. 상기 결과는 에피토프 접합 밀도가 항원 특이적인 방식으로 항체 면역 반응에 영항을 미칠 수 있으며, 일반적으로 Q베타 단량체 당 2 내지 3 p타우 펩타이드 에피토프의 접합 밀도를 생성시키는 결합 조건이 바람직함을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Vaccines LLC <120> ANTIGENIC TAU PEPTIDES AND USES THEREOF <130> PC33815A <140> PCT/IB2010/053313 <141> 2010-07-20 <150> US 61/229,860 <151> 2009-07-30 <160> 123 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Thr Pro Pro Lys Ser 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Pro Pro Lys Ser 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Ser Pro Gly Thr 1 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg 1 5 10 15 His Leu Ser <210> 5 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr 1 5 10 15 Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser 20 25 30 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 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<213> Homo sapien <400> 30 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 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Claims

면역원성 담체인 HBcAg VLP 또는 HBsAg VLP에 결합된 항원성 타우 펩타이드를 포함하는 면역원으로서, 상기 항원성 타우 펩타이드가 서열번호 4, 6, 7, 9 내지 12, 14, 16 내지 26 및 105로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항원성 타우 펩타이드가 식 (G)_nC의 연결기에 의해 상기 면역원성 담체에 공유 결합되고, 이때 상기 연결기가 상기 펩타이드의 C-말단(펩타이드-(G)_nC) 또는 N-말단(C(G)_n-펩타이드)에 있고, n이 0, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10인 면역원.
제 1 항에 있어서,
항원성 타우 펩타이드가 서열번호 4, 6, 7 및 9 내지 12로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 면역원.
제 2 항에 있어서,
항원성 타우 펩타이드가 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 면역원.
제 1 항에 있어서,
항원성 타우 펩타이드가 서열번호 14 및 16 내지 19로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 면역원.
제 4 항에 있어서,
항원성 타우 펩타이드가 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 면역원.
제 1 항에 있어서,
항원성 타우 펩타이드가 서열번호 20 내지 24로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 면역원.
제 6 항에 있어서,
항원성 타우 펩타이드가 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 면역원.
제 1 항에 있어서,
항원성 타우 펩타이드가 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 면역원.
면역원성 담체인 HBcAg VLP 또는 HBsAg VLP에 결합된 항원성 타우 펩타이드를 각각 포함하는 2 개 이상의 면역원을 포함하는 면역원성 조성물로서,
(a) 제 1 면역원의 항원성 타우 펩타이드가 서열번호 4, 6, 7 및 9 내지 12로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고;
(b) 제 2 면역원의 항원성 타우 펩타이드가 서열번호 14 및 16 내지 19로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진
면역원성 조성물.
면역원성 담체인 HBcAg VLP 또는 HBsAg VLP에 결합된 항원성 타우 펩타이드를 각각 포함하는 2 개 이상의 면역원을 포함하는 면역원성 조성물로서,
(a) 제 1 면역원의 항원성 타우 펩타이드가 서열번호 4, 6, 7 및 9 내지 12로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고;
(b) 제 2 면역원의 항원성 타우 펩타이드가 서열번호 20 내지 24로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진
면역원성 조성물.
면역원성 담체인 HBcAg VLP 또는 HBsAg VLP에 결합된 항원성 타우 펩타이드를 각각 포함하는 2 개 이상의 면역원을 포함하는 면역원성 조성물로서,
(a) 제 1 면역원의 항원성 타우 펩타이드가 서열번호 14 및 16 내지 19로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고;
(b) 제 2 면역원의 항원성 타우 펩타이드가 서열번호 20 내지 24로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진
면역원성 조성물.
면역원성 담체인 HBcAg VLP 또는 HBsAg VLP에 결합된 항원성 타우 펩타이드를 각각 포함하는 2 개 이상의 면역원을 포함하는 면역원성 조성물로서,
(a) 제 1 면역원의 항원성 타우 펩타이드가 서열번호 4, 6, 7 및 9 내지 12로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고;
(b) 제 2 면역원의 항원성 타우 펩타이드가 서열번호 105의 아미노산 서열로 이루어진
면역원성 조성물.
면역원성 담체인 HBcAg VLP 또는 HBsAg VLP에 결합된 항원성 타우 펩타이드를 각각 포함하는 2 개 이상의 면역원을 포함하는 면역원성 조성물로서,
(a) 제 1 면역원의 항원성 타우 펩타이드가 서열번호 14 및 16 내지 19로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고;
(b) 제 2 면역원의 항원성 타우 펩타이드가 서열번호 105의 아미노산 서열로 이루어진
면역원성 조성물.
면역원성 담체인 HBcAg VLP 또는 HBsAg VLP에 결합된 항원성 타우 펩타이드를 각각 포함하는 2 개 이상의 면역원을 포함하는 면역원성 조성물로서,
(a) 제 1 면역원의 항원성 타우 펩타이드가 서열번호 20 내지 24로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고;
(b) 제 2 면역원의 항원성 타우 펩타이드가 서열번호 105의 아미노산 서열로 이루어진
면역원성 조성물.
제 1 면역원, 제 2 면역원, 제 3 면역원 및 제 4 면역원으로부터 선택된 3 개 이상의 면역원을 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 제 1 면역원, 제 2 면역원, 제 3 면역원 및 제 4 면역원이 각각 면역원성 담체인 HBcAg VLP 또는 HBsAg VLP에 결합된 항원성 타우 펩타이드를 포함하고,
(a) 제 1 면역원의 항원성 타우 펩타이드가 서열번호 4, 6, 7 및 9 내지 12로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고;
(b) 제 2 면역원의 항원성 타우 펩타이드가 서열번호 14 및 16 내지 19로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고;
(c) 제 3 면역원의 항원성 타우 펩타이드가 서열번호 20 내지 24로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고;
(d) 제 4 면역원의 항원성 타우 펩타이드가 서열번호 105의 아미노산 서열로 이루어진
면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 면역원, 또는 제 9 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 과인산화된 타우와 관련된 신경퇴행성 질병의 치료를 위한 약학 조성물.