BR112020008202A2 - construções de imunógeno de peptídeo tau - Google Patents

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Abstract

  A presente descrição refere-se a construções de imunógeno de peptídeo individual objetivando porções da proteína Tau para o tratamento e/ou prevenção de tauopatias. A presente revelação é também direcionada a composições contendo as construções de imunógeno de peptídeo, métodos de produção e uso das construções de imunógeno de peptídeo, e anticorpos produzidos pelos construtos de imunógeno de peptídeo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “CONS- TRUTOS DE IMUNOGÊNIO DE PEPTÍDEO TAU”.
[001] O presente pedido é um pedido internacional PCT que reivindica o benefício do pedido provisório nº de série U.S. 62/578.124, depositado em 27 de outubro de 2017, que é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção refere-se a construtos de imunogênio de peptídeo com base em porções da proteína Tau e formulações dos mesmos para a prevenção e o tratamento de tauopatias
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] As proteínas Tau (ou proteínas τ, após a letra grega com este nome) são proteínas que estabilizam microtúbulos (revisado no sítio da web: en.wikipedia.org/wiki/Tau_protein). Elas são abundantes nos neurônios do sistema nervoso central e são menos comuns em outros locais, porém também são expressas em níveis muito baixos nos astrócitos e oligodendrócitos do SNC. As patologias e demências do sistema nervoso, tais como doença de Alzheimer e doença de Parkinson são associadas às proteínas Tau que se tornaram defeituosas e não estabilizam mais os microtúbulos de maneira adequada.
[004] As proteínas Tau são o produto do splicing alternativo de um único gene que em seres humanos é designado MAPT (proteína Tau associada a microtúbulo) e se situam no cromossomo 17. As proteínas Tau foram identificadas em 1975 como proteínas estáveis ao calor essenciais para o conjunto de microtúbulo e, desde então, têm sido caracterizadas como uma proteína intrinsecamente desordenada.
[005] A proteína Tau é uma proteína associada a microtúbulo altamente solúvel (MAP). Em seres humanos, estas proteínas são encontradas principalmente em neurônios em comparação com células não neuronais. Uma das principais funções da Tau é modular a estabilidade dos microtúbulos axonais. Outras MAPs de sistema nervoso podem realizar funções similares, conforme sugerido pelos camundongos knockout Tau que não mostraram anomalias no desenvolvimento cerebral - possivelmente devido à compensação na deficiência Tau por outras MAPs. Tau não está presente em dendritos e principalmente ativa nas porções distais dos axônios, onde fornece estabilização de microtúbulo, mas também flexibilidade, conforme necessário. Isto contrasta com as proteínas MAP6 (STOP) nas porções proximais dos axônios, que, essencialmente, bloqueiam os microtúbulos e MAP2 que estabiliza os microtúbulos nos dendritos.
[006] As proteínas Tau interagem com tubulina para estabilizar microtúbulos e promover a montagem de tubulina nos microtúbulos. Tau tem dois meios para controlar a estabilidade de microtúbulo: isoformas e fosforilação.
[007] Seis isoformas Tau na faixa de 352 a 441 aminoácidos de comprimento são expressas no cérebro humano adulto; estas são produzidas por splicing de mRNA alternativo de transcrições de MAPT (Fitzpatrick, et al., 2017; UniProtKB - P10636).
[008] As isoformas são distinguidas por seu número de domínios de ligação. Três isoformas têm três domínios de ligação e as outras três têm quatro domínios de ligação. Os domínios de ligação se situam no terminal carbóxi da proteína e são positivamente carregados (permitindo que o mesmo se ligue ao microtúbulo negativamente carregado). As isoformas com quatro domínios de ligação são melhores na estabilização de microtúbulos do que aquelas com três domínios de ligação. As isoformas diferem na presença ou ausência de inserções de 29 ou 58 aminoácidos na metade N-terminal, e a inclusão ou ausência da repetição de ligação ao microtúbulo de 31 aminoácidos, codificados por éxon 10 de MAPT, na metade C-terminal. A inclusão de éxon 10 resulta na produção de três isoformas Tau com quatro repetições cada
(4R), e sua exclusão em três isoformas adicionais com três repetições cada (3R). As quatro repetições (R1–R4) compreendem resíduos 244 a 368 na isoforma Tau de 441 aminoácidos.
[009] Tau é uma fosfoproteína com 79 sítios de Serina (Ser) e Treonina (Thr) potenciais na isoforma Tau mais longa. A fosforilação foi relatada em aproximadamente 30 destes sítios em proteínas Tau normais. A fosforilação de Tau é regulada por um hospedeiro de quinases, incluindo PKN, uma serina/treonina quinase. Quando a PKN é ativada, ela fosforila Tau, resultando na perturbação da organização de microtúbulo. A fosforilação de Tau também é regulada pelo desenvolvimento. Por exemplo, Tau fetal é mais altamente fosforilada no SNC embrionário do que a Tau em adulto. O grau de fosforilação em todas as seis isoformas diminui com a idade devido à ativação de fosfatases. Como as quinases, as fosfatases também desempenham uma função na regulação da fosforilação da Tau. Por exemplo, PP2A e PP2B estão ambas presentes no cérebro humano e têm a capacidade de desfosforilar Ser396. A ligação destas fosfatases a Tau afeta a associação da Tau aos MTs.
[010] A hiperfosforilação da proteína Tau (inclusões Tau, pTau) pode resultar na automongagem de emaranhados de filamentos helicoidais emparelhados e filamentos lineares, que estão envolvidos na patogênese da doença de Alzheimer, demência frontotemporal e outras tauopatias. Todas as seis isoformas Tau estão presentes num estado frequentemente hiperfosforilado em filamentos helicoidais emparelhados do cérebro com doença de Alzheimer. Em outras doenças neurodegenerativas, a deposição de agregados enriquecidos em determinadas isoformas Tau foi relatada. Quando incorretamente enovelada, de outro modo, esta proteína muito solúvel pode formar agregados extremamente insolúveis que contribuem com várias doenças neurodegenerativas.
[011] Pesquisas recentes sugerem que a Tau pode ser liberada extracelularmente por um mecanismo baseado em exossoma na doença de Alzheimer. A expressão de genes Tau específica de gênero através de diferentes regiões do cérebro humano implicou recentemente nas diferenças de gênero nas manifestações e risco de tauopatias. Alguns aspectos de como a doença funciona também sugere que a mesma tenha algumas similaridades com as proteínas de príon.
[012] As doenças neurodegenerativas com inclusões Tau filamentosas abundantes são chamadas de tauopatias. Além da doença de Alzheimer, estas doenças incluem demência só com emaranhados, encefalopatia traumática crônica (CTE), doença por grãos argirofílicos, paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal, tauopatia glial globular e doença de Pick. Diferentemente da doença de Alzheimer, estas outras doenças não têm placas β-amiloides. Na doença de Alzheimer, demência só com emaranhados e encefalopatia traumática crônica, todas as seis isoformas Tau (3R e 4R) estão presentes nos filamentos de doença. Na doença por grãos argirofílicos, paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal e tauopatia glial globular, apenas as isoformas Tau 4R são encontradas, enquanto que na doença de Pick apenas as inclusões Tau 3R estão presentes. A ocorrência de tauopatias humanas com morfologias de filamento distintas levou à ideia de que existem diferentes conformadores moleculares de Tau agregada. A ocorrência de múltiplos conformadores moleculares também pode explicar por que os filamentos dos cérebros de indivíduos com Alzheimer são mais eficazes do que os filamentos montados in vitro de proteína recombinante na indução de patologia Tau no cérebro de camundongo.
[013] A lesão traumática cerebral moderada repetitiva (TBI) é agora reconhecida como um componente central da lesão cerebral em esportes de contato, especialmente futebol americano, e na força concussiva de explosões militares. Isto pode levar à encefalopatia traumática crônica (CTE) que é caracterizada por emaranhados fibrilares de Tau hiperfosforilada. Altos níveis de proteína Tau no fluido que banha o cérebro são ligados à recuperação insatisfatória após traumatismo craniano.
[014] A hipótese Tau estabelece que fosforilação excessiva ou anormal de Tau resulta na transformação de Tau em adulto normal em PHF-Tau (filamento helicoidal emparelhado) e NFTs (emaranhados neurofibrilares). A proteína Tau é uma proteína associada a microtúbulo altamente solúvel (MAP). Através de suas isoformas e fosforilação, a proteína Tau interage com a tubulina para estabilizar o conjunto de microtúbulo. As proteínas Tau constituem uma família de seis isoformas com a faixa de 352 a 441 aminoácidos. A isoforma mais longa no SNC tem quatro repetições (R1, R2, R3 e R4) e duas inserções (total de 441 aminoácidos), enquanto que a isoforma mais curta tem três repetições (R1, R3 e R4) e nenhuma inserção (total de 352 aminoácidos). Todas as seis isoformas Tau estão presentes num estado frequentemente hiperfosforilado em filamentos helicoidais emparelhados de AD.
[015] Mutações que alteram a função e expressão de isoforma de Tau levam à hiperfosforilação. O processo de agregação de Tau na ausência de mutações não é conhecido, mas pode resultar da fosforilação aumentada, ação de protease ou exposição a poliânions, tais como glicosaminoglicanos. A Tau hiperfosforilada desmonta os microtúbulos e sequestra a Tau normal, MAP 1 (proteína associada a microtúbulo 1), MAP 2 e ubiquitina nos emaranhados de PHFs. Esta estrutura insolúvel danifica as funções citoplasmáticas e interfere no transporte axonal, o que pode levar à morte celular.
[016] Até esta data, ainda há uma necessidade não atendida de desenvolvimento de imunogênios de peptídeo sítio-dirigidos e formulações dos mesmos para tratamento com relação custo-benefício de pacientes que sofrem de tauopatias. REFERÊNCIAS:
[017] 1. “Tau protein”, Wikipedia, The Free Encyclopedia, endereço do sítio da web: en.wikipedia.org/wiki/Tau_protein (acessado em 29 de setembro de 2017).
[018] 2. Fitzpatrick, AWP, et al., “Cryo-EM structures of Tau filaments from Alzheimer's disease”, Nature, 547(7662):185-190 (2017).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[019] A presente divulgação se refere a construtos de imunogênio de peptídeo individual tendo como alvo porções da proteína Tau para o tratamento e/ou prevenção de tauopatias. A presente divulgação também se refere a composições que contêm os construtos de imunogênio de peptídeo, métodos de produção e uso dos construtos de imunogênio de peptídeo e anticorpos produzidos pelos construtos de imunogênio de peptídeo
[020] Os construtos de imunogênio de peptídeo divulgados contêm cerca de 15 ou mais aminoácidos. Os construtos de imunogênio de peptídeo contêm um epítopo de células B a partir de porções da isoforma mais longa da proteína humana Tau (GenBank: AGF19246.1) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 100 mostrada na Tabela 8. O epítopo de células B pode ser ligado a um epítopo de célula auxiliar T heterólogo (Th) derivado de proteínas patógenas através de um espaçador heterólogo opcional. Os construtos de imunogênio de peptídeo divulgados estimulam a geração de anticorpos altamente específicos voltados contra Tau. Os construtos de imunogênio de peptídeo divulgados podem ser usados como uma imunoterapia para pacientes que sofrem de tauopatias.
[021] A porção de epítopo de células B dos construtos de imunogênio de peptídeo têm sequências de aminoácidos provenientes da proteína Tau de comprimento completo (SEQ ID NO: 100). Em algumas modalidades, o epítopo de células B tem uma sequência que contém qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-21 e 101-124 conforme mostrado na Tabela 1.
[022] Os construtos de imunogênio de peptídeo da presente divulgação podem conter uma sequência de aminoácidos de epítopo Th heterólogo derivado de uma proteína patogênica (por exemplo, SEQ ID NOs: 22 a 50), conforme mostrado na Tabela 2. Em certas modalidades, o epítopo Th heterólogo é derivado de patógenos naturais, tais como Toxina da Difteria (SEQ ID NO: 26), Plasmodium Falciparum (SEQ ID NO: 27), Toxina da Cólera (SEQ ID NO: 29). Em outras modalidades, o epítopo Th heterólogo é um epítopo Th artificial idealizado derivado de proteína de Fusão do Vírus do Sarampo (MVF 1 a 5) ou Antígeno de Superfície de Hepatite B (HBsAg 1 a 3) sob a forma de sequência única ou sequências combinatórias (por exemplo, SEQ ID NOs: 33, 32 e 34).
[023] Em algumas modalidades, os construtos de imunogênio de peptídeo contêm um epítopo de células B proveniente da Tau ligada a um epítopo de célula auxiliar T heterólogo (Th) através de um espaçador heterólogo opcional. Em certas modalidades, os construtos de imunogênio de peptídeo contêm um sítio antigênico de células B tendo a sequência de aminoácidos proveniente da Tau (SEQ ID NOs: 1-21 e 101-124) ligada a um epítopo Th heterólogo derivado de uma proteína patogênica (por exemplo, SEQ ID NOs: 22 a 50) através de um espaçador heterólogo opcional. Em algumas modalidades, o espaçador heterólogo opcional é uma molécula ou estrutura química capaz de ligar dois aminoácidos e/ou peptídeos em conjunto. Em certas modalidades, o espaçador é um aminoácido de ocorrência natural, um aminoácido de ocorrência não natural ou uma combinação dos mesmos. Nas modalidades específicas, os construtos de imunogênio de peptídeo têm a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 51-71 e 125-155 mostradas na Tabela 3.
[024] A presente divulgação também se refere a composições contendo um construto de imunogênio de peptídeo Tau. Em algumas modalidades, as composições divulgadas contêm mais de um construto de imunogênio de peptídeo Tau para cobrir múltiplos epítopos B da Tau. Em certas modalidades, as composições contêm uma mistura de construtos de imunogênio de peptídeo Tau (por exemplo, qualquer combinação das SEQ ID NOs: 51-71 e 125-155) com mais de um epítopo Th heterólogo derivado de proteínas patogênicas para cobrir um amplo fundo genético em pacientes. As composições contendo uma mistura de construtos de imunogênio de peptídeo podem levar a uma porcentagem mais alta na taxa de resposta após a imunização para o tratamento de tauopatias em comparação com composições contendo apenas um único construto de imunogênio de peptídeo Th.
[025] A presente divulgação também se refere a composições farmacêuticas para o tratamento e/ou prevenção de tauopatias. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm os construtos de imunogênio de peptídeo divulgados sob a forma de um complexo imunoestimulador estabilizado formado através de associações eletrostáticas misturando-se um oligômero CpG com uma composição contendo um complexo de imunogênio de peptídeo. Os complexos imunoestimuladores estabilizados são capazes de melhorar adicionalmente a imunogenicidade dos construtos de imunogênio de peptídeo. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm adjuvantes, tais como sais minerais, incluindo gel de alume (ALHYDROGEL), fosfato de alumínio (ADJUPHOS) ou emulsões de água em óleo incluindo MONTANIDE ISA 51 ou 720.
[026] A presente divulgação também se refere a anticorpos dirigidos contra os construtos de imunogênio de peptídeo Tau divulgados. Em particular, os construtos de imunogênio de peptídeo da presente divulgação são capazes de estimular a geração de anticorpos altamente específicos que são reativamente cruzados com as sequências de aminoácidos Tau (SEQ ID NOs: 1-21 e 101-124) quando administrados a um indivíduo. Os anticorpos altamente específicos produzidos pelos construtos de imunogênio de peptídeo são reativamente cruzados com proteínas contendo Tau recombinante. Os anticorpos divulgados se ligam com alta especificidade a Tau sem serem muito, se forem, dirigidos aos epítopos Th heterólogos empregados para aprimoramento de imunogenicidade, o que contrasta fortemente com a proteína convencional ou outros carreadores biológicos usados para tal aprimoramento de antigenicidade de peptídeo.
[027] A presente divulgação também inclui métodos para tratamento e/ou prevenção de tauopatias com o uso dos construtos de imunogênio de peptídeo divulgados e/ou anticorpos dirigidos contra os construtos de imunogênio de peptídeo. Em algumas modalidades, os métodos para tratamento e/ou prevenção de tauopatias incluindo a administração a um hospedeiro de uma composição contendo um construto de imunogênio de peptídeo divulgado. Em certas modalidades, as composições utilizadas nos métodos contêm um construto de imunogênio de peptídeo divulgado sob a forma de um complexo imunoestimulador estável com oligonucleotídeos negativamente carregados, tais como oligômeros CpG, através de associação eletrostática, cujos complexos são adicionalmente suplementados, de modo opcional, com sais minerais ou óleo como adjuvante, para administração a pacientes com tauopatias. Os métodos divulgados também incluem regimes de dosagem, formas de dosagem e rotas para administração dos construtos de imunogênio de peptídeo a um hospedeiro em risco de, ou com tauopatias.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[028] Figura 1A – resultados ELISA expressos em Títulos Log10 para soros imunes obtidos a partir de múltiplos construtos de imunogênio Tau 6 semanas após a injeção inicial (wpi) contra peptídeos Tau não fosforilados quando analisados em regiões antigênicas de Tau.
[029] Figura 1B – resultados ELISA expressos em Títulos Log10 para soro imune obtidos a partir de múltiplos construtos de imunogênio Tau 6 semanas após a injeção inicial (wpi) contra peptídeos Tau fosforilados quando analisados em regiões antigênicas de Tau.
[030] Figura 2 – análise por Western blot de lisados celulares contendo monômeros, dímeros, trímeros e oligômeros da proteína Tau. As várias faixas indicam anticorpos IgG elicitadas pelos construtos de imunogênio de peptídeo Tau não fosforilados mostrados acima de cada faixa (lado esquerdo). Estes construtos de imunogênio de peptídeo correspondem aos construtos mostrados na Tabela 3. Os perfis de ligação para cada anticorpo foram analisados e resumidos no gráfico de barras (lado direito). Soros imunes representativos dos construtos de imunogênio Tau demonstraram reatividades de ligação a múltiplas espécies de Tau (monômeros, dímeros, trímeros, oligômeros e polímeros).
[031] Figura 3A – Gráficos que mostram o nível de agregação de Tau de comprimento completo (aminoácidos Tau441) após a exposição a vários anticorpos dirigidos contra imunogênios de peptídeo Tau fosforilados a concentrações na faixa de 0 a 5 µg/ml mostradas acima de cada gráfico em comparação com anticorpos dos soros pré-imunes. O nível de agregação de Tau foi medido por coloração com Tioflavina- T (ThT) dos agregados.
[032] Figura 3B – Gráficos de barras que mostram o nível de agregação de Tau in vitro na presença de 5 µg/ml de anticorpos dirigidos contra os construtos de imunogênio de peptídeo Tau fosforilados e cola de metileno, que é conhecida por desagregar Tau in vitro, usado como um controle positivo.
[033] Figura 4 – Gráficos que mostram o nível de agregação de Tau após a exposição a anticorpos dirigidos contra imunogênios de peptídeo Tau fosforilados ou não fosforilados, conforme indicado acima de cada gráfico. O nível de agregação de Tau foi medido por coloração com Tioflavina-T (ThT) dos agregados. um grau de inibição variável foi encontrado para anticorpos dirigidos contra imunogênios Tau fosforilados ou não fosforilados.
[034] Figura 5 – Gráficos que mostram o nível de desagregação de Tau de fibrilas Tau artificiais pré-formadas após a exposição a anticorpos dirigidos contra imunogênios de peptídeo Tau representativos, fosforilados ou não fosforilados, conforme mostrado abaixo de cada gráfico. O nível de agregação de Tau foi medido por coloração com Tioflavina-T (ThT) dos agregados. A desagregação a extensão variável foi encontrada em anticorpos de soros imunes de imunogênios Tau fosforilados ou não fosforilados representativos.
[035] Figura 6 – Análise por Western blot (sob condições de desnaturação) de IgGs Tau anti-fosforilado e Tau anti-não fosforilado produzidas pelos imunogênios de peptídeo Tau da presente divulgação, conforme mostrado à esquerda. A análise por Dot blot (sob condições de desnaturação) de IgGs Tau anti-fosforilado e Tau anti-não fosforilado produzidas pelos imunogênios de peptídeo Tau representativos da presente divulgação, conforme mostrado no painel direito. Os anticorpos elicitados pelos imunogênios de peptídeo Tau fosforilado mostraram ligação preferencial a fibrilas e oligômeros de Tau.
[036] Figura 7 – Coloração imuno-histoquímica por anticorpos representativos gerados tanto por imunogênios de peptídeo Tau fosforilados como não fosforilados da presente divulgação. O painel esquerdo mostra perfis de ligação nas seções cerebrais normais versus específicas da doença de Alzheimer; enquanto o painel direito mostra que não há reatividade cruzada nos tecidos normais.
[037] Figura 8A – Coloração de tecido que mostra a proteção dos neurônios contra Tau de fibrila por anticorpos representativos gerados tanto por imunogênios de peptídeo Tau fosforilados como não fosforilados da presente divulgação.
[038] Figura 8B – Gráfico que quantifica a proteção dos neurônios contra Tau de fibrila por anticorpos representativos gerados tanto por imunogênios de peptídeo Tau fosforilados como não fosforilados da presente divulgação.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[039] A presente divulgação se refere a construtos de imunogênio de peptídeo individual tendo como alvo porções da proteína Tau para o tratamento e/ou prevenção de doença de Alzheimer e/ou tauopatias. A presente divulgação também se refere a composições que contêm os construtos de imunogênio de peptídeo, métodos de produção e uso dos construtos de imunogênio de peptídeo e anticorpos produzidos pelos construtos de imunogênio de peptídeo
[040] Os construtos de imunogênio de peptídeo divulgados contêm cerca de 15 ou mais aminoácidos. Os construtos de imunogênio de peptídeo contêm um epítopo de células B a partir de porções da isoforma mais longa da proteína humana Tau (GenBank: AGF19246.1) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 100 mostrada na Tabela 8. O epítopo de células B pode ser ligado a um epítopo de célula auxiliar T heterólogo (Th) derivado de proteínas patógenas através de um espaçador heterólogo opcional. Os construtos de imunogênio de peptídeo divulgados estimulam a geração de anticorpos altamente específicos voltados contra Tau. Os construtos de imunogênio de peptídeo divulgados podem ser usados como uma imunoterapia para pacientes que sofrem de doença de Alzheimer e/ou tauopatias.
[041] A porção de epítopo de células B dos construtos de imunogênio de peptídeo têm sequências de aminoácidos provenientes da proteína Tau de comprimento completo (SEQ ID NO: 100). Em algumas modalidades, o epítopo de células B tem uma sequência que contém qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-21 e 101-124 conforme mostrado na Tabela 1.
[042] Os construtos de imunogênio de peptídeo da presente divulgação podem conter uma sequência de aminoácidos de epítopo Th heterólogo derivado de uma proteína patogênica (por exemplo, SEQ ID NOs: 22 a 50), conforme mostrado na Tabela 2. Em certas modalidades, o epítopo Th heterólogo é derivado de patógenos naturais, tais como Toxina da Difteria (SEQ ID NO: 26), Plasmodium Falciparum (SEQ ID NO: 27), Toxina da Cólera (SEQ ID NO: 29). Em outras modalidades, o epítopo Th heterólogo é um epítopo Th artificial idealizado derivado de proteína de Fusão do Vírus do Sarampo (MVF 1 a 5) ou Antígeno de Superfície de Hepatite B (HBsAg 1 a 3) sob a forma de sequência única ou sequências combinatórias (por exemplo, SEQ ID NOs: 33, 32 e 34).
[043] Em algumas modalidades, os construtos de imunogênio de peptídeo contêm um epítopo de células B proveniente da Tau ligada a um epítopo de célula auxiliar T heterólogo (Th) através de um espaçador heterólogo opcional. Em certas modalidades, os construtos de imunogênio de peptídeo contêm um sítio antigênico de células B tendo a sequência de aminoácidos proveniente da Tau (SEQ ID NOs: 1-21 e 101-124) ligada a um epítopo Th heterólogo derivado de uma proteína patogênica (por exemplo, SEQ ID NOs: 22 a 50) através de um espaçador heterólogo opcional. Em algumas modalidades, o espaçador heterólogo opcional é uma molécula ou estrutura química capaz de ligar dois aminoácidos e/ou peptídeos em conjunto. Em certas modalidades, o espaçador é um aminoácido de ocorrência natural, um aminoácido de ocorrência não natural ou uma combinação dos mesmos. Nas modalidades específicas, os construtos de imunogênio de peptídeo têm a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 51-71 e 125-155 mostradas na Tabela 4.
[044] A presente divulgação também se refere a composições contendo um construto de imunogênio de peptídeo Tau. Em algumas modalidades, as composições divulgadas contêm mais de um construto de imunogênio de peptídeo Tau para cobrir múltiplos epítopos B da Tau. Em certas modalidades, as composições contêm uma mistura de construtos de imunogênio de peptídeo Tau (por exemplo, qualquer combinação das SEQ ID NOs: 51-71 e 125-155) com mais de um epítopo Th heterólogo derivado de proteína patogênica para cobrir um amplo fundo genético em pacientes. As composições contendo uma mistura de construtos de imunogênio de peptídeo podem levar a uma porcentagem mais alta na taxa de resposta após a imunização para o tratamento de doença de Alzheimer e/ou tauopatias em comparação com composições contendo apenas um único construto de imunogênio de peptídeo.
[045] A presente divulgação também se refere a composições farmacêuticas para o tratamento e/ou prevenção de doença de Alzheimer e/ou tauopatias. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm os construtos de imunogênio de peptídeo divulgados sob a forma de um complexo imunoestimulador estabilizado formado através de associações eletrostáticas misturando-se um oligômero CpG com uma composição contendo um complexo de imunogênio de peptídeo. Os complexos imunoestimuladores estabilizados são capazes de melhorar adicionalmente a imunogenicidade dos construtos de imunogênio de peptídeo. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm adjuvantes, tais como sais minerais, incluindo gel de alume (ALHYDROGEL), fosfato de alumínio (ADJUPHOS) ou emulsões de água em óleo incluindo MONTANIDE ISA 51 ou 720.
[046] A presente divulgação também se refere a anticorpos dirigidos contra os construtos de imunogênio de peptídeo Tau divulgados. Em particular, os construtos de imunogênio de peptídeo da presente divulgação são capazes de estimular a geração de anticorpos altamente específicos que são reativamente cruzados com as sequências de aminoácidos Tau (SEQ ID NOs: 1-21 e 101-124) quando administrados a um indivíduo. Os anticorpos altamente específicos produzidos pelos construtos de imunogênio de peptídeo são reativamente cruzados com proteínas contendo Tau recombinante. Os anticorpos divulgados se ligam com alta especificidade a Tau sem serem muito, se forem, dirigidos aos epítopos Th heterólogos empregados para aprimoramento de imunogenicidade, o que contrasta fortemente com a proteína convencional ou outros carreadores biológicos usados para tal aprimoramento de antigenicidade de peptídeo.
[047] A presente divulgação também inclui métodos para tratamento e/ou prevenção de doença de Alzheimer e/ou tauopatias com o uso dos construtos de imunogênio de peptídeo divulgados e/ou anticorpos dirigidos contra os construtos de imunogênio de peptídeo. Em algumas modalidades, os métodos para tratamento e/ou prevenção de doença de Alzheimer e/ou tauopatias incluindo a administração a um hospedeiro de uma composição contendo um construto de imunogênio de peptídeo divulgado. Em certas modalidades, as composições utilizadas nos métodos contêm um construto de imunogênio de peptídeo divulgado sob a forma de um complexo imunoestimulador estável com oligonucleotídeos negativamente carregados, tais como oligômeros CpG, através de associação eletrostática, cujos complexos são adicionalmente suplementados, de modo opcional, com sais minerais ou óleo como adjuvante, para administração a pacientes com doença de Alzheimer e/ou tauopatias. Os métodos divulgados também incluem regimes de dosagem, formas de dosagem e rotas para administração dos construtos de imunogênio de peptídeo a um hospedeiro em risco de, ou com doença de Alzheimer e/ou tauopatias.
[048] Os cabeçalhos de seção usados no presente documento servem apenas a propósitos organizacionais e não devem ser interpretados como limitando a matéria descrita. Todas as referências ou porções de referências citadas neste pedido são expressamente incorporadas a título de referência no presente documento em sua totalidade para qualquer propósito.
[049] A menos que explicado de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por uma pessoa com habilidade comum na técnica à qual esta invenção pertence. Os termos no singular “um,” “uma,” “o” e “a” incluem referências no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. De modo similar, a palavra “ou” se destina a incluir “e”, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Portanto, “compreendendo A ou B” significa incluindo A ou B, ou A e B. Deve-se compreender adicionalmente que todos os tamanhos de aminoácidos, e todos os pesos moleculares ou valores de massa molecular, fornecidos para polipeptídeos são aproximados, e são fornecidos para descrição. Embora os métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento possam ser usados na prática ou teste do método divulgado, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas no presente documento são incorporados a título de referência em sua totalidade. No caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo explicações de termos, irá controlar. Além disto, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitantes
CONSTRUTO DE IMUNOGÊNIO DE PEPTÍDEO TAU
[050] A presente divulgação fornece construtos de imunogênio de peptídeo contendo um epítopo de células B com uma sequência de aminoácidos proveniente da Tau covalentemente ligada a um epítopo de célula auxiliar T heterólogo (Th) diretamente ou através de um espaçador heterólogo opcional.
[051] A expressão “construto de imunogênio de peptídeo Tau” ou “construto de imunogênio de peptídeo”, conforme usado no presente documento, se refere a um peptídeo contendo (a) um epítopo de células B tendo cerca de 15 ou mais resíduos de aminoácidos provenientes da sequência de comprimento completo da isoforma Tau mais longa (SEQ ID NO: 100); (b) um epítopo Th heterólogo; e (c) um espaçador heterólogo opcional.
[052] Em certas modalidades, o construto de imunogênio de peptídeo Tau pode ser representado pelas fórmulas: (Th)m–(A)n–(fragmento Tau)–X ou (fragmento Tau)–(A)n–(Th)m–X
[053] em que
[054] Th é um epítopo auxiliar T heterólogo;
[055] A é um espaçador heterólogo;
[056] (fragmento Tau) é um epítopo de células B tendo cerca de 15 a cerca de 40 resíduos de aminoácidos da SEQ ID NO: 100;
[057] X é um α-COOH ou α-CONH2 de um aminoácido;
[058] m é de 1 a cerca de 4; e
[059] n é de 0 a cerca de 10.
[060] Os vários componentes do construto de imunogênio de peptídeo Tau divulgado são descritos abaixo. A. FRAGMENTOS TAU
[061] Os construtos de imunogênio de peptídeo divulgados contêm cerca de 15 ou mais aminoácidos. Os construtos de imunogênio de peptídeo contêm um epítopo de células B a partir de porções da isoforma mais longa da proteína humana Tau (GenBank: AGF19246.1) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 100 mostrada na Tabela 8. O epítopo de células B pode ser ligado a um epítopo de célula auxiliar T heterólogo (Th) derivado de proteínas patógenas através de um espaçador heterólogo opcional. Os construtos de imunogênio de peptídeo divulgados estimulam a geração de anticorpos altamente específicos voltados contra Tau. Os construtos de imunogênio de peptídeo divulgados podem ser usados como uma imunoterapia para pacientes que sofrem de doença de Alzheimer e/ou tauopatias.
[062] A porção de epítopo de células B dos construtos de imunogê- nio de peptídeo têm sequências de aminoácidos provenientes da proteína Tau de comprimento completo (SEQ ID NO: 100). Em algumas modalidades, o epítopo de células B tem uma sequência que contém qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-21 e 101-124 conforme mostrado na Tabela 1.
[063] Em algumas modalidades, os fragmentos Tau contêm aminoácidos não fosforilados (por exemplo, SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19, e 21), conforme mostrado na Tabela 1. Em outras modalidades, os fragmentos Tau contêm aminoácidos serina e/ou treonina fosforilados (por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 16, 18, e 20), conforme mostrado na Tabela 1. Os fragmentos Tau assim como os sítios de fosforilação mostrados nos peptídeos da Tabela 1 são exemplificativos e a presente divulgação inclui qualquer outro fragmento e/ou sítio de fosforilação da proteína Tau de compri- mento completo da SEQ ID NO: 100. B. EPÍTOPOS DE CÉLULA AUXILIAR T HETERÓLOGOS (EPÍTOPOS TH)
[064] A presente divulgação fornece construtos de imunogênio de peptídeo contendo um epítopo de células B proveniente da Tau covalentemente ligada a um epítopo de célula auxiliar T heterólogo (Th) diretamente ou através de um espaçador heterólogo opcional.
[065] O epítopo Th heterólogo no construto de imunogênio de peptídeo Tau melhora a imunogenicidade dos fragmentos Tau, o que facilita a produção de anticorpos de alto título específico dirigidos contra o epítopo de células B alvo otimizado (isto é, o fragmento Tau) através de projeto racional.
[066] O termo “heterólogo”, conforme usado no presente documento, se refere a uma sequência de aminoácidos que é derivada de uma sequência de aminoácidos que não faz parte da, ou é homóloga à sequência de Tau do tipo selvagem. Deste modo, uma epítopo Th heterólogo é um epítopo Th derivado de uma sequência de aminoácidos que não é naturalmente encontrada em Tau (isto é, o epítopo Th não é autólogo a Tau). Uma vez que o epítopo Th é heterólogo a Tau, a sequência de aminoácidos natural de Tau não é estendida nas direções N-terminal ou C-terminal quando o epítopo Th heterólogo é covalentemente ligado ao fragmento Tau.
[067] O epítopo Th heterólogo da presente divulgação pode ser qualquer epítopo Th que não tenha uma sequência de aminoácidos naturalmente encontrada em Tau. O epítopo Th pode ter uma sequência de aminoácidos derivada de qualquer espécie (por exemplo, ser humano, porco, gado, cachorro, rato, camundongo, porquinho da índia, etc.). O epítopo Th também pode ter motivos de ligação promíscuos a moléculas MHC classe II de múltiplas espécies. Em certas modalidades, o epítopo Th compreende múltiplos motivos de ligação MHC classe II promíscuos para permitir a ativação máxima de células auxiliares T que levam à iniciação e regulação de respostas imunes. O epítopo Th é preferencialmente imunossilencioso por si só, isto é, poucos, se houver, dos anticorpos gerados pelos construtos de imunogênio de peptídeo
Tau serão dirigidos para o epítopo Th permitindo, deste modo, uma resposta imune muito focalizada dirigida ao epítopo de células B direcionado do fragmento Tau.
[068] Os epítopos Th da presente divulgação incluem, porém sem limitação, sequências de aminoácidos derivadas de patógenos estranhos, conforme exemplificado na Tabela 2 (SEQ ID NOs: 22 a 50). Ademais, os epítopos Th incluem epítopos Th artificiais idealizados e epítopos Th artificiais idealizados combinatórios (por exemplo, SEQ ID NOs: 23 e 30-36). Os peptídeos de epítopo Th heterólogo apresentados como uma sequência combinatória (por exemplo, SEQ ID NOs: 31-34), contêm uma mistura de resíduos de aminoácidos representados nas posições específicas dentro do framework de peptídeo com base nos resíduos variáveis de homólogos para aquele peptídeo particular. Um conjunto de peptídeos combinatórios pode ser sintetizado num processo adicionando-se uma mistura dos aminoácidos protegidos designados, em vez de um aminoácido particular, numa posição especificada durante o processo de síntese. Tais conjuntos de peptídeos de epítopo Th heterólogo combinatórios podem permitir uma ampla cobertura de epítopo Th para animais que têm um fundo genético diferente. Sequências combinatórias representativas dos peptídeos de epítopo Th heterólogo incluem as SEQ ID NOs: 31-34 que são mostradas na Tabela 2. Os peptídeos de epítopo Th da presente invenção fornecem ampla reatividade e imunogenicidade a animais e pacientes de populações geneticamente diferentes.
[069] Os construtos de imunogênio de peptídeo Tau que compreendem epítopos Th são produzidos simultaneamente numa única síntese de peptídeo em fase sólida em tandem com o fragmento Tau. Os epítopos Th também incluem análogos imunológicos de epítopos Th. Os análogos imunológicos de incluem análogos de intensificação imune, análogos reativamente cruzados e segmentos de qualquer um destes epítopos Th que sejam suficientes para intensificar ou estimular uma resposta imune para os fragmentos Tau.
[070] Análogos imunologicamente funcionais dos peptídeos de epítopo Th também são eficazes e incluídos como parte da presente invenção. Análogos Th imunológicos funcionais podem incluir substituições, adições, deleções e inserções conservativas de um a cerca de cinco resíduos de aminoácidos no epítopo Th que não modificam essencialmente a função estimulante de Th do epítopo Th. As substituições, adições e inserções conservativas podem ser realizadas com aminoácidos naturais ou não naturais, conforme descrito acima para os fragmentos Tau. A Tabela 2 identifica outra variação de um análogo funcional para o peptídeo de epítopo Th. Em particular, SEQ ID NOs: 23 e 30 de MvF1 e MvF2 Th são análogos funcionais das SEQ ID NOs: 33 e 35 de MvF4 e MvF5 pelo fato de que eles diferem na estrutura de aminoácido pela deleção (SEQ ID NOs: 23 e 30) ou pela inclusão (SEQ ID NOs: 33 e 35) de dois aminoácidos, cada um, nos N- e C-terminais. As diferenças entre estas duas séries de sequências análogas não afetariam a função dos epítopos Th contidos dentro destas sequências. Portanto, análogos Th imunológicos funcionais incluem várias versões do epítopo Th derivado da proteína de Fusão do Vírus do Sarampo MvF1-4 Ths (SEQ ID NOs: 23, 30, 31, 33 e 35) e da proteína de Superfície da Hepatite HBsAg 1-3 Ths (SEQ ID NOs: 32, 34 e 36).
[071] O epítopo Th no construto de imunogênio de peptídeo Tau pode ser covalentemente ligado na extremidade N- ou C- terminal do peptídeo Tau. Em algumas modalidades, o epítopo Th é covalentemente ligado à extremidade N-terminal do peptídeo Tau. Em outras modalidades, o epítopo Th é covalentemente ligado à extremidade C-terminal do peptídeo Tau. Em certas modalidades, mais de um epítopo Th é covalentemente ligado ao fragmento Tau. Quando mais de um epítopo Th é ligado ao fragmento Tau, cada epítopo Th pode ter a mesma sequência de aminoácidos ou sequências de aminoácidos diferentes. Além disto, quando mais de um epítopo Th é ligado ao fragmento Tau, os epítopos Th podem ser dispostos em qualquer ordem. Por exemplo, os epítopos Th podem ser consecutivamente ligados à extremidade N-terminal do fragmento Tau, ou consecutivamente ligado à extremidade C-terminal do fragmento Tau, ou um epítopo Th pode ser covalentemente ligado à extremidade N- terminal do fragmento Tau enquanto um epítopo Th separado é covalentemente ligado à extremidade C-terminal do fragmento Tau. Não há limitação na disposição dos epítopos Th em relação ao fragmento Tau.
[072] Em algumas modalidades, o epítopo Th é covalentemente ligado ao fragmento Tau diretamente. Em outras modalidades, o epítopo Th é covalentemente ligado ao fragmento Tau através de um espaçador heterólogo descrito em mais detalhes abaixo. C. ESPAÇADOR HETERÓLOGO
[073] Os construtos de imunogênio de peptídeo Tau divulgados contêm opcionalmente um espaçador heterólogo que liga covalentemente o epítopo de células B de Tau ao epítopo de célula auxiliar T heterólogo (Th).
[074] Conforme discutido acima, o termo “heterólogo”, se refere a uma sequência de aminoácidos que é derivada de uma sequência de aminoácidos que não faz parte da, ou é homóloga à sequência de Tau do tipo selvagem. Deste modo, a sequência de aminoácidos natural de Tau não é estendida, mas direções N-terminal ou C-terminal quando o espaçador heterólogo é covalentemente ligado ao epítopo de células B de Tau porque o espaçador é heterólogo à sequência Tau.
[075] O espaçador é qualquer molécula ou estrutura química capaz de ligar dois aminoácidos e/ou peptídeos em conjunto. O espaçador pode variar em comprimento ou polaridade dependendo da aplicação. A fixação de espaçador pode ser através de ligação amida ou carboxila, porém outras funcionalidades também são possíveis. O espaçador pode incluir um composto químico, um aminoácido de ocorrência natural ou um aminoácido de ocorrência não natural.
[076] O espaçador pode fornecer recursos estruturais para o construto de imunogênio de peptídeo Tau. Estruturalmente, o espaçador fornece uma separação física do epítopo Th do epítopo de células B do fragmento Tau. A separação física pelo espaçador pode perturbar quaisquer estruturas secundárias artificiais criadas unindo-se o epítopo Th ao epítopo de células B. Adicionalmente, a separação física dos epítopos pelo espaçador pode eliminar a interferência entre as respostas de célula Th e/ou célula B. Além disto, o espaçador pode ser projetado para criar ou modificar uma estrutura secundária do construto de imunogênio de peptídeo. Por exemplo, um espaçador pode ser projetado para atuar como uma dobradiça flexível para intensificar a separação do epítopo Th e do epítopo de células B. Um espaçador de dobradiça flexível também pode permitir interações mais eficientes entre o imunogênio de peptídeo apresentado e as células Th e células B adequadas para intensificar as respostas imunes para o epítopo Th e o epítopo de células B. Exemplos de sequências que codificam dobradiças flexíveis são encontrados na região de dobradiça de cadeia pesada de imunoglobulina, que são, muitas vezes, ricas em prolina. Uma dobradiça flexível particularmente útil que pode ser usada como um espaçador é fornecida pela sequência Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 101), em que Xaa é qualquer aminoácido e, de preferência, ácido aspártico.
[077] O espaçador também pode fornecer recursos funcionais para o construto de imunogênio de peptídeo Tau. Por exemplo, o espaçador pode ser projetado para alterar a carga total do construto de imunogênio de peptídeo Tau, o que pode afetar a solubilidade do construto de imunogênio de peptídeo. Adicionalmente, a alteração da carga total do construto de imunogênio de peptídeo Tau pode afetar a capacidade de o construto de imunogênio de peptídeo se associar a outros compostos e reagentes. Conforme discutido em mais detalhes abaixo, o construto de imunogênio de peptídeo Tau pode ser formado num complexo imunoestimulador estável com um oligonucleotídeo altamente carregado, tais como oligômeros CpG através de associação eletrostática. A carga total do construto de imunogênio de peptídeo Tau é importante para a formação destes complexos imunoestimuladores estáveis.
[078] Os compostos químicos que podem ser usados como um espaçador incluem, porém sem limitação, ácido (2-aminoetoxi) acético (AEA), ácido 5-aminovalérico (AVA), ácido 6-aminocaproico (Ahx), ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (AEEA, mini-PEG1), ácido 12-amino- 4,7,10-trioxadodecanoico (mini-PEG2), ácido 15-amino-4,7,10,13- tetraoxapenta-decanoico (mini-PEG3), ácido trioxatridecano- succinâmico (Ttds), ácido 12-amino-dodecanoico, ácido Fmoc-5-amino- 3-oxapentanoico (O1Pen) e similares.
[079] Os aminoácidos de ocorrência natural incluem alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.
[080] Os aminoácidos de ocorrência não natural incluem, porém sem limitação, ε-N Lisina, ß-alanina, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, tiroxina, ácido γ-amino butírico, homoserina, citrulina, ácido aminobenzoico, ácido 6-aminocaproico (Aca; ácido 6-Amino- hexanoico), hidroxiprolina, ácido mercaptopropiônico (MPA), 3-nitro- tirosina, ácido piroglutâmico e similares.
[081] O espaçador no construto de imunogênio de peptídeo Tau pode ser covalentemente ligado à extremidade N- ou C- terminal do epítopo Th e do peptídeo Tau. Em algumas modalidades, o espaçador é covalentemente ligado à extremidade C-terminal do epítopo Th e à extremidade N-terminal do peptídeo Tau. Em outras modalidades, o espaçador é covalentemente ligado à extremidade C-terminal do peptídeo Tau e à extremidade N-terminal do epítopo Th. Em certas modalidades, mais de um espaçador pode ser usado, por exemplo, quando mais de um epítopo Th estiver presente no construto de imunogênio de peptídeo. Quando mais de um espaçador é usado, cada espaçador pode ser igual ao outro ou diferente. Adicionalmente, quando mais de um epítopo Th estiver presente no construto de imunogênio de peptídeo, os epítopos Th podem ser separados com um espaçador, que pode ser igual ou diferente do espaçador usado para separar o epítopo Th do epítopo de células B. Não há limitação na disposição do espaçador em relação ao epítopo Th ou ao fragmento Tau.
[082] Em certas modalidades, o espaçador heterólogo é um aminoácido de ocorrência natural ou um aminoácido de ocorrência não natural. Em outras modalidades, o espaçador contém mais de um aminoácido de ocorrência natural ou aminoácido de ocorrência não natural. Nas modalidades específicas, o espaçador é Lys-, Gly-, Lys- Lys-Lys-, (α, ε-N)Lys, ou ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 102). D. MODALIDADES ESPECÍFICAS DO CONSTRUTO DE
IMUNOGÊNIO DE PEPTÍDEO TAU
[083] O construto de imunogênio de peptídeo Tau pode ser representado pelas fórmulas: (Th)m–(A)n–(fragmento Tau)–X ou (fragmento Tau)–(A)n–(Th)m–X
[084] em que
[085] Th é um epítopo auxiliar T heterólogo;
[086] A é um espaçador heterólogo;
[087] (fragmento Tau) é um epítopo de células B tendo cerca de 15 a cerca de 40 resíduos de aminoácidos provenientes da proteína Tau de comprimento completo da SEQ ID NO: 100;
[088] X é um α-COOH ou α-CONH2 de um aminoácido;
[089] m é de 1 a cerca de 4; e
[090] n é de 0 a cerca de 10.
[091] Em certas modalidades, o epítopo Th heterólogo no construto de imunogênio de peptídeo Tau tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das SEQ ID NOs: 51-71 e 125-155 e combinações dos mesmos, mostrado na Tabela 3. Nas modalidades específicas, o epítopo Th tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das SEQ ID NOs: 30-36. Em certas modalidades, o construto de imunogênio de peptídeo Tau contém mais de um epítopo Th.
[092] Em certas modalidades, o espaçador heterólogo opcional é selecionado dentre qualquer um dentre Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α, ε- N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 102), e combinações dos mesmos. Nas modalidades específicas, o espaçador heterólogo é ε-N- Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 102).
[093] Em certas modalidades, o fragmento Tau tem cerca de 15 a cerca de 40 resíduos de aminoácidos provenientes da proteína Tau de comprimento completo da SEQ ID NO: 100. Nas modalidades específicas, o fragmento Tau tem uma sequência de aminoácidos representada pelas SEQ ID NOs: 1-21 e 101-124, conforme mostrado na Tabela 1.
[094] Em certas modalidades, o construto de imunogênio de peptídeo Tau tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das SEQ ID NOs: 51-71 e 125-155, conforme mostrado na Tabela 3.
A. VARIANTES, HOMÓLOGOS E ANÁLOGOS FUNCIONAIS
[095] As variantes e análogos dos peptídeos imunogênicos acima que induzem e/ou são reativamente cruzados com anticorpos aos epítopos preferenciais da proteína Tau também podem ser usados. Análogos, incluindo alélicos, espécies e variantes induzidas, diferem tipicamente de peptídeos de ocorrência natural numa, duas ou algumas posições, muitas vezes devido às substituições conservativas. Análogos exibem tipicamente pelo menos 80 ou 90% de identidade de sequência com peptídeos naturais. Alguns análogos incluem aminoácidos não naturais ou modificações de aminoácidos N- ou C-terminal numa, duas ou algumas posições.
[096] As variantes que são análogos funcionais podem ter uma substituição conservativa numa posição de aminoácido; uma alteração na carga total; uma ligação covalente à outra porção química; ou adições, inserções ou deleções de aminoácidos; e/ou qualquer combinação dos mesmos.
[097] Substituições conservativas ocorrem quando um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido com propriedades químicas similares. Por exemplo, os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; os aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; os aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e os aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico.
[098] Numa modalidade particular, o análogo funcional tem pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos original. Em outra modalidade, o análogo funcional tem pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácidos original. Em ainda outra modalidade, o análogo funcional tem pelo menos 85% de identidade com a sequência de aminoácidos original. Em ainda outra modalidade, o análogo funcional tem pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos original.
[099] As variantes também incluem variações para os resíduos fosforilados. Por exemplo, as variantes podem incluir resíduos diferentes dentro dos peptídeos que são fosforilados. Peptídeos Tau imunogênicos variantes também podem incluir peptídeos pseudofosforilados. Os peptídeos pseudofosforilados são gerados substituindo-se um ou mais dos resíduos de serina, treonina e tirosina fosforilados dos peptídeos Tau por resíduos de aminoácidos ácidos, tal como ácido glutâmico e ácido aspártico.
COMPOSIÇÕES
[0100] A presente divulgação também fornece composições que compreendem o construto de imunogênio Tau divulgado. A. COMPOSIÇÕES DE PEPTÍDEO
[0101] As composições contendo um construto de imunogênio de peptídeo Tau divulgada podem ser sob a forma líquida ou sólida. As composições líquidas podem incluir água, tampões, solventes, sais e/ou qualquer outro reagente aceitável que não altere as propriedades estruturais ou funcionais do construto de imunogênio de peptídeo Tau. As composições de peptídeo podem conter um ou mais dos construtos de imunogênio de peptídeo Tau divulgados. B. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[0102] A presente divulgação também se refere a composições farmacêuticas contendo o construto de imunogênio de peptídeo Tau divulgado.
[0103] As composições farmacêuticas podem conter carreadores e/ou outros aditivos num sistema de distribuição farmaceuticamente aceitável. Consequentemente, as composições farmacêuticas podem conter uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um construto de imunogênio de peptídeo Tau em conjunto com um carreador farmaceuticamente aceitável, adjuvante e/ou outros excipientes, tais como diluentes, aditivos, agentes estabilizantes, conservantes, agentes solubilizantes, tampões e similares.
[0104] As composições farmacêuticas podem conter um ou mais ou mais adjuvantes que atuam para acelerar, prolongar ou intensificar a resposta imune ao construto de imunogênio de peptídeo Tau sem ter qualquer efeito antigênico específico por si só. Os adjuvantes usados na composição farmacêutica podem incluir óleos, sais de alumínio, virossomas, fosfato de alumínio (por exemplo, ADJU-PHOS®), hidróxido de alumínio (por exemplo, ALHYDROGEL®), liposina, saponina, esqualeno, L121, Emulsigen®, monofosforil lipídio A (MPL), QS21, ISA 35, ISA 206, ISA50V, ISA51, ISA 720, assim como outros adjuvantes e emulsificantes.
[0105] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém MONTANIDE™ ISA 51 (uma composição adjuvante oleosa compreendida de óleo vegetal e oleato de manida para produção de emulsões de água em óleo), Tween® 80 (também conhecido como: Polissorbato 80 ou monooleato de Polioxietileno (20) sorbitano), um oligonucleotídeo CpG e/ou qualquer combinação dos mesmos. Em outras modalidades, a composição farmacêutica é uma emulsão de água em óleo em água (isto é, w/o/w) com Emulsigen ou Emulsigen D como o adjuvante.
[0106] As composições farmacêuticas podem ser formuladas como liberação imediata ou para formulações de liberação prolongada. Adicionalmente, as composições farmacêuticas podem ser formuladas para indução de imunidade sistêmica ou de mucosa localizada, através do aprisionamento de imunogênio e coadministração com micropartículas. Tais sistemas de distribuição são prontamente determinados por uma pessoa de habilidade comum na técnica.
[0107] As composições farmacêuticas podem ser preparadas como soluções ou suspensões líquidas injetáveis. Os veículos líquidos contendo o construto de imunogênio de peptídeo Tau também podem ser preparados antes da injeção. A composição farmacêutica pode ser administrada por qualquer modo de aplicação adequado, por exemplo, i.d., i.v., i.p., i.m., intranasalmente, oralmente, subcutaneamente, etc. e em qualquer dispositivo de distribuição adequado. Em certas modalidades, a composição farmacêutica é formulada para administração intravenosa, subcutânea, intradérmica ou intramuscular. As composições farmacêuticas adequadas para outros modos de administração também podem ser preparadas, incluindo aplicações orais e intranasais.
[0108] As composições farmacêuticas podem ser formuladas como liberação imediata ou para formulações de liberação prolongada. Adicionalmente, as composições farmacêuticas podem ser formuladas para indução de imunidade sistêmica ou de mucosa localizada, através do aprisionamento de imunogênio e coadministração com micropartículas. Tais sistemas de distribuição são prontamente determinados por uma pessoa de habilidade comum na técnica.
[0109] As composições farmacêuticas também podem ser formuladas numa forma de unidade de dosagem adequada. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém de cerca de 0,5 μg a cerca de 1 mg do construto de imunogênio de peptídeo Tau por kg de peso corporal. Doses eficazes das composições farmacêuticas variam dependendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é um ser humano ou um animal, outros medicamentos administrados, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Geralmente, o paciente é um ser humano, porém mamíferos não humanos incluindo mamíferos transgênicos também podem ser tratados. Quando distribuídas em múltiplas doses, as composições farmacêuticas podem ser convenientemente divididas numa quantidade adequada por forma de unidade de dosagem. A dosagem administrada irá depender da idade, peso e saúde geral do indivíduo, conforme é bem conhecido na técnica terapêutica.
[0110] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém mais de um construto de imunogênio de peptídeo Tau. Uma composição farmacêutica contém uma mistura de mais de um construto de imunogênio de peptídeo Tau para permitir a intensificação sinérgica da imunoeficácia dos construtos. As composições farmacêuticas contendo mais de um construto de imunogênio de peptídeo Tau podem ser mais eficazes numa população genética maior devido a uma ampla cobertura de MHC classe II, deste modo, fornecem uma resposta imune adequada para os construtos de imunogênio de peptídeo Tau.
[0111] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém um construto de imunogênio de peptídeo Tau selecionado dentre as SEQ ID NOs: 51-71 e 125-155, assim como homólogos, análogos e/ou combinações dos mesmos. Nas modalidades específicas, as composições farmacêuticas contêm um construto de imunogênio de peptídeo Tau selecionado dentre as SEQ ID NOs: 51-71 e 125-155, e qualquer combinação dos mesmos.
[0112] As composições farmacêuticas contendo um construto de imunogênio de peptídeo Tau podem ser usadas para elicitar uma resposta imune e produzir anticorpos num hospedeiro após a administração. C. COMPLEXOS IMUNOESTIMULADORES
[0113] A presente divulgação também se refere a composições farmacêuticas contendo um construto de imunogênio de peptídeo Tau sob a forma de um complexo imunoestimulador com um oligonucleotídeo CpG. Tais complexos imunoestimuladores são especificamente adaptados para atuar como um adjuvante e como um estabilizador de imunogênio de peptídeo. Os complexos imunoestimuladores são sob a forma de um particulado, que pode apresentar eficientemente o imunogênio de peptídeo Tau às células do sistema imune para produzir uma resposta imune. Os complexos imunoestimuladores podem ser formulados como uma suspensão para administração parenteral. Os complexos imunoestimuladores também podem ser formulados sob a forma de emulsões w/o, como uma suspensão em combinação com um sal mineral ou com um polímero gelificante in situ para a distribuição eficiente do imunogênio de peptídeo Tau para as células do sistema imune de um hospedeiro após a administração parenteral.
[0114] O complexo imunoestimulador estabilizado pode ser formado complexando-se um construto de imunogênio de peptídeo Tau com uma molécula aniônica, oligonucleotídeo, polinucleotídeo, ou combinações dos mesmos por meio de associação eletrostática. O complexo imunoestimulador estabilizado pode ser incorporado numa composição farmacêutica como um sistema de distribuição de imunogênio.
[0115] Em certas modalidades, o construto de imunogênio de peptídeo Tau é projetado para conter uma porção catiônica que é positivamente carregada a um pH na faixa de 5,0 a 8,0. A carga líquida na porção catiônica do construto de imunogênio de peptídeo Tau, ou mistura de construtos, é calculada atribuindo-se uma carga +1 para cada lisina (K), arginina (R) ou histidina (H), uma carga -1 para cada ácido aspártico (D) ou ácido glutâmico (E) e uma carga de 0 para o outro aminoácido dentro da sequência. As cargas são resumidas dentro da porção catiônica do construto de imunogênio de peptídeo Tau e expressas como a carga média líquida. Um imunogênio de peptídeo adequado tem uma porção catiônica com uma carga positiva média líquida de +1. De preferência, o imunogênio de peptídeo tem uma carga líquida positiva na faixa que é maior que +2. Em algumas modalidades, a porção catiônica do construto de imunogênio de peptídeo Tau é o espaçador heterólogo. Em certas modalidades, a porção catiônica do construto de imunogênio de peptídeo Tau tem uma carga de +4 quando a sequência de espaçadores é (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 102).
[0116] Uma “molécula aniônica”, conforme descrito no presente documento se refere a qualquer molécula que seja negativamente carregada a um pH na faixa de 5,0 a 8,0. Em certas modalidades, a molécula aniônica é um oligômero ou polímero. A carga líquida negativa no oligômero ou polímero é calculada atribuindo-se uma carga -1 para cada grupo fosfodiéster ou fosforotioato no oligômero. Um oligonucleotídeo aniônico adequado é uma molécula de DNA de fita simples com 8 a 64 bases de nucleotídeo, com o número de repetições do motivo CpG na faixa de 1 a 10. De preferência, as moléculas de DNA de fita simples imunoestimuladoras de CpG contêm 18 a 48 bases de nucleotídeo, com o número de repetições de motivo CpG na faixa de 3 a 8.
[0117] Mais preferencialmente, o oligonucleotídeo aniônico é representado pela fórmula: 5' X1CGX2 3' em que C e G são não metilados; e X1 é selecionado do grupo que consiste em A (adenina), G (guanina) e T (timina); e X2 é C (citosina) ou T (timina). Ou, o oligonucleotídeo aniônico é representado pela fórmula: 5' (X 3)2CG(X4)2 3’ em que C e G são não metilados; e X3 é selecionado do grupo que consiste em A, T ou G; e X4 é C ou T.
[0118] O complexo imunoestimulador resultante é sob a forma de partículas com um tamanho tipicamente na faixa de 1 a 50 mícrons e é uma função de muitos fatores incluindo a estequiometria de carga relativa e o peso molecular das espécies que interagem. O complexo imunoestimulador particulado tem a vantagem de fornecer adjuvante e regulação crescente de respostas imunes específicas in vivo. Adicionalmente, o complexo imunoestimulador estabilizado é adequado para preparar composições farmacêuticas por vários processos incluindo emulsões de água em óleo, suspensões de sais minerais e géis poliméricos.
ANTICORPOS
[0119] A presente divulgação também fornece anticorpos elicitados pelo construto de imunogênio de peptídeo Tau.
[0120] Os construtos de imunogênio de peptídeo Tau divulgados, que compreendem um fragmento Tau, epítopo Th heterólogo, e espaçador heterólogo opcional, são capazes de elicitar uma resposta imune e a produção de anticorpos quando administrados a um hospedeiro. O projeto dos construtos de imunogênio de peptídeo Tau pode quebrar a tolerância a auto Tau e elicitar a produção de anticorpos sítio-específicos que reconhecem epítopo conformacionais não lineares.
[0121] Os anticorpos produzidos pelos construtos de imunogênio de peptídeo Tau reconhecem e se ligam a Tau sob as formas de monômeros, dímeros, trímeros e oligômeros.
[0122] Os anticorpos elicitados pelos construtos de imunogênio de peptídeo Tau podem impedir surpreendentemente a agregação de Tau (atividade antiagregação) e podem desassociar agregados Tau pré- formados (atividade de desagregação).
[0123] As respostas imunes resultantes de animais imunizados com construtos de imunogênio de peptídeo Tau da presente invenção demonstraram a capacidade de os construtos produzirem anticorpos sítio-dirigidos potentes que são reativos a Tau sob as formas de monômeros, dímeros, trímeros e oligômeros.
MÉTODOS
[0124] A presente divulgação também se refere a métodos para produzir e usar os construtos de imunogênio de peptídeo Tau, composições e composições farmacêuticas. A. MÉTODOS PARA FABRICAÇÃO DO CONSTRUTO DE
IMUNOGÊNIO DE PEPTÍDEO TAU
[0125] Os construtos de imunogênio de peptídeo Tau desta divulgação podem ser produzidos por métodos de síntese química bem conhecidos pelas pessoas de habilidade comum na técnica (consulte, por exemplo, Fields et al., Capítulo 3 em Synthetic Peptides: A User’s Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, NY, EUA 1992, página 77). Os construtos de imunogênio de peptídeo Tau podem ser sintetizados com o uso das técnicas de Merrifield automatizadas da síntese em fase sólida com o α-NH2 protegido pela química t-Boc ou F- moc com o uso de aminoácidos protegidos pela cadeia lateral, por exemplo, um Sintetizador de Peptídeos da Applied Biosystems Modelo 430A ou 431. A preparação de construtos de imunogênio de peptídeo Tau que compreende peptídeos da biblioteca combinatória para epítopos Th pode ser realizada fornecendo-se uma mistura de aminoácidos alternativos para acoplamento a uma dada posição variável.
[0126] Após a montagem completa do construto de imunogênio de peptídeo Tau desejado, a resina pode ser tratada de acordo com procedimentos padrão para clivar o peptídeo da resina e os grupos funcionais nas cadeias laterais de aminoácido podem ser desbloqueados. O peptídeo livre pode ser purificado por HPLC e bioquimicamente caracterizado, por exemplo, por análise de aminoácidos ou por sequenciamento. Os métodos de purificação e caracterização para peptídeos são bem conhecidos para uma pessoa de habilidade comum na técnica.
[0127] A qualidade dos peptídeos produzidos por este processo químico pode ser controlada e definida e, como resultado, a reprodutibilidade dos construtos de imunogênio de peptídeo Tau, imunogenicidade e rendimento podem ser assegurados. A descrição detalhada da fabricação do construto de imunogênio de peptídeo Tau através da síntese de peptídeos em fase sólida é mostrada no Exemplo
1.
[0128] Constatou-se que a faixa na variabilidade estrutural que permite a retenção de uma atividade imunológica pretendida é muito mais flexível que a faixa na variabilidade estrutural permitida para retenção de uma atividade de fármaco específica por um fármaco de molécula pequena ou as atividades desejadas e toxicidades indesejadas encontradas em moléculas grandes que são coproduzidas com fármacos biologicamente derivados. Deste modo, análogos de peptídeo, intencionalmente projetados ou inevitavelmente produzidos por erros do processo sintético como uma mistura de subprodutos de sequência de deleção que têm propriedades cromatográficas e imunológicas similares ao peptídeo pretendido, são frequentemente tão eficazes quanto uma preparação purificada do peptídeo desejado. Análogos projetados e misturas de análogos não pretendidos são eficazes desde que um procedimento QC discernível seja desenvolvido para monitorar tanto o processo de fabricação como o processo de avaliação de produto a fim de garantir a reprodutibilidade e a eficácia do produto final que emprega estes peptídeos.
[0129] Os construtos de imunogênio de peptídeo Tau também podem ser produzidos com o uso de tecnologia de DNA recombinante incluindo moléculas de ácido nucleico, vetores e/ou células hospedeiras. Deste modo, as moléculas de ácido nucleico que codificam o construto de imunogênio de peptídeo Tau e imunologicamente funcionais do mesmo também são abrangidas pela presente divulgação como parte da presente invenção. De modo similar, vetores, incluindo vetores de expressão, que compreendem moléculas de ácido nucleico, assim como células hospedeiras contendo os vetores também são abrangidos pela presente divulgação como parte da presente invenção.
[0130] Várias modalidades exemplificativas também abrangem os métodos de produção do construto de imunogênio de peptídeo Tau e os análogos imunologicamente funcionais do mesmo. Por exemplo, os métodos podem incluir uma etapa de incubação de uma célula hospedeira contendo um vetor de expressão que contém uma molécula de ácido nucleico que codifica um construto de imunogênio de peptídeo Tau e/ou análogo imunologicamente funcional do mesmo sob tais condições em que o peptídeo e/ou análogo é expresso. Os imunogênios de peptídeo sintéticos mais longos podem ser sintetizados por técnicas de DNA recombinante bem conhecidas. Tais técnicas são fornecidas em manuais padrão bem conhecidos com protocolo detalhados. Para construir um peptídeo de codificação de gene desta invenção, a sequência de aminoácidos é inversamente traduzida para obter uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos, de preferência com códons que são ideais para o organismo no qual o gene deve ser expresso. A seguir, um gene sintético é produzido tipicamente por sintetização de oligonucleotídeos que codificam o peptídeo e quaisquer elementos reguladores, se necessário. O gene sintético é inserido num vetor de clonagem adequado e transfectado para uma célula hospedeira. O peptídeo é então expresso sob condições adequadas para o sistema de expressão e o hospedeiro selecionados. O peptídeo é purificado e caracterizado por métodos padrão. B. MÉTODOS PARA FABRICAÇÃO DE COMPLEXOS
IMUNOESTIMULADORES
[0131] Várias modalidades exemplificativas também abrangem métodos para produção de complexos imunoestimuladores que compreendem construtos de imunogênio de peptídeo Tau e molécula de oligodesoxinucleotídeo CpG (ODN). Os complexos imunoestimuladores estabilizados (ISC) são derivados de uma porção catiônica do construto de imunogênio de peptídeo Tau e uma molécula ODN CpG. O sistema de automontagem é acionado por neutralização de carga eletrostática. A estequiometria da razão de carga molar entre a porção catiônica do construto de imunogênio de peptídeo Tau e o oligômero aniônico determina a extensão de associação. A associação eletrostática não covalente do construto de imunogênio de peptídeo Tau e ODN CpG é um processo completamente reproduzível. O peptídeo/complexo imunoestimulador ODN CpG se agregam, o que facilita a apresentação para as células apresentadoras de antígeno “profissionais” (APC) do sistema imune intensificando, deste modo, adicionalmente a imunogenicidade dos complexos. Estes complexos são facilmente caracterizados para controle de qualidade durante a fabricação. O peptídeo/ISC CpG são bem tolerados in vivo. Este sistema de particulado inovador que compreende construtos de imunogênio de peptídeo derivados de ODN CpG e fragmento Tau foi projetado para se aproveitar da mitogenicidade de células B generalizada associada ao uso de ODN CpG, e ainda promover respostas do tipo Th-1/Th-2 equilibradas.
[0132] O ODN CpG nas composições farmacêuticas divulgadas é 100% ligado ao imunogênio num processo mediado por neutralização eletrostática de carga oposta, resultando na formação de particulados dimensionados por mícron. A forma de particulado permite uma dosagem significativamente reduzida de CpG do uso convencional de adjuvantes CpG, menos potencial para respostas imunes inatas adversas e facilita as rotas de processamento de imunogênio alternativas incluindo células apresentadoras de antígeno (APC). Consequentemente, tais formulações são conceitualmente inovadoras e oferecem vantagens potenciais promovendo-se a estimulação de respostas imunes por mecanismos alternativos. C. MÉTODOS PARA FABRICAÇÃO DE COMPOSIÇÕES
FARMACÊUTICAS
[0133] Várias modalidades exemplificativas também abrangem composições farmacêuticas contendo construtos de imunogênio de peptídeo Tau. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas empregam emulsões de água em óleo e em suspensão com sais minerais.
[0134] Para que uma composição farmacêutica seja usada por uma grande população e com prevenção de agregação de Tau também sendo parte do objetivo para a administração, a segurança se torna outro fator importante para consideração. Apesar do uso de emulsões de água em óleo em seres humanos para muitas formulações em ensaios clínicos, Alume permanece o adjuvante principal para uso em formulações devido à sua segurança. Alume ou seus sais minerais fosfato de alumínio (ADJUPHOS) são, portanto, frequentemente usados como adjuvantes na preparação para aplicações clínicas.
[0135] Outros adjuvantes e agentes imunoestimulantes incluem monofosforil lipídio 3 Des-O-acilado A (MPL) ou 3-DMP, aminoácidos poliméricos ou monoméricos, tal como ácido poliglutâmico ou polilisina. Tais adjuvantes podem ser usados com ou sem outros agentes imunoestimulantes, tais como peptídeos muramil (por exemplo, N- acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil- L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D- isoglutaminil-L-alanina-2-(1′-2′ dipalmitoil-sn-glicero-3- hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), N-acetilglucsaminil-N- acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida (DTP-DPP) Theramide™) ou outros componentes de parede celular bacteriana. As emulsões de óleo em água incluem MF59 (consulte o documento WO
90/14837 de Van Nest et al., que está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade), contendo 5 % de Esqualeno, 0,5% de Tween 80 e 0,5% de Span 85 (contendo opcionalmente várias quantidades de MTP-PE) formuladas em partículas de submícron com o uso de um microfluidizador; SAF, contendo 10 % de Esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero bloqueado plurônico L121, e thr-MDP, microfluidizada numa emulsão de submícron ou submetida a vórtice para gerar uma emulsão de tamanho de partícula maior; e o sistema de adjuvante Ribi™ (RAS) (Ribi ImmunoChem, Hamilton, Mont.) contendo 2% de esqualeno, 0,2% de Tween 80, e um ou mais componentes de parede celular bacteriana selecionados do grupo que consiste em monofosforilípidio A (MPL), dimicolato de trealose (TDM) e esqueleto de parede celular (CWS), de preferência, MPL+CWS (Detox™). Outros adjuvantes incluem Adjuvante Completo de Freund (CFA), Adjuvante Incompleto de Freund (IFA), e citocinas, tais como interleucinas (IL-1, IL-2, e IL-12), fator estimulador de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e fator de necrose tumoral (TNF).
[0136] A escolha de um adjuvante depende da estabilidade da formulação imunogênica contendo o adjuvante, da via de administração, do cronograma de dosagem, da eficácia do adjuvante para espécies que são vacinadas, e, em seres humanos, um adjuvante farmaceuticamente aceitável é aquele que foi aprovado ou é aprovado para administração humana por órgãos reguladores pertinentes. Por exemplo, alume, MPL ou Adjuvante Incompleto de Freund (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32:173-186 (1998), que está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade) sozinhos ou, opcionalmente, todas as combinações dos mesmos são adequadas para administração humana.
[0137] As composições podem incluir carreadores ou diluentes não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis que são definidos como veículos comumente usados para formular composições farmacêuticas para administração animal ou humana. O diluente é selecionado a fim de não afetar a atividade biológica da combinação. Exemplos de tais diluentes são água destilada, solução salina tamponada com fosfato fisiológica, soluções de Ringer, solução de dextrose e solução de Hank. Além disto, a composição ou formulação farmacêutica também pode incluir outros carreadores, adjuvantes ou estabilizantes não tóxicos, não terapêuticos, não imunogênicos e similares.
[0138] As composições farmacêuticas também podem incluir macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas, tais como proteínas, polissacarídeos como quitosano, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos e copolímeros (por exemplo, sefarose, agarose, celulose funcionalizada com látex e similares), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido e agregados de lipídio (por exemplo, gotículas de óleo ou lipossomas). Adicionalmente, estes carreadores podem funcionar como agentes imunoestimulantes (isto é, adjuvantes).
[0139] As composições farmacêuticas da presente invenção podem incluir adicionalmente um veículo de distribuição adequado. Os veículos de distribuição adequados incluem, porém sem limitação vírus, bactérias, microesferas biodegradáveis, micropartículas, nanopartículas, lipossomas, minipéletes de colágeno e cocleatos. D. MÉTODOS QUE USAM COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[0140] A presente divulgação também inclui métodos de uso de composições farmacêuticas contendo construtos de imunogênio de peptídeo Tau.
[0141] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas contendo construtos de imunogênio de peptídeo Tau podem ser usadas para:
[0142] (a) inibir a agregação de Tau num hospedeiro;
[0143] (b) induzir a desagregação de agregados de Tau pré- formados num hospedeiro;
[0144] (c) reduzir a neurodegeneração acionada por agregados de Tau exógenos num hospedeiro;
[0145] (d) reduzir a neurodegeneração em células de superexpressão de Tau;
[0146] (e) reduzir os níveis de Tau no soro num hospedeiro;
[0147] (f) reduzir o nível de Tau oligomérico no cérebro de um hospedeiro;
[0148] (g) reduzir a neuropatologia e recuperação de atividades motoras num hospedeiro; e similares.
[0149] Os métodos acima compreendem administrar uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade farmacologicamente eficaz de um construto de imunogênio de peptídeo Tau a um hospedeiro que necessite do mesmo.
[0150] Conforme usado no presente documento, uma “tauopatia” abrange qualquer doença neurodegenerativa que envolva a agregação patológica da proteína de microtúbulo Tau dentro do cérebro. Consequentemente, além da doença de Alzheimer familiar e esporádica, outras tauopatias que podem ser tratadas usando os métodos da presente invenção incluem, sem limitação, demência frontotemporal, parkinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, demência só com emaranhados, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência por grãos argirofílicos, complexo esclerose lateral amiotrófica- parkinsonismo-demência, demência pugilística, síndrome de Down, doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, doença de Hallerworden- Spatz, miosite do corpo de inclusão, doença de Creutzfeld-Jakob, atrofia do sistema múltiplo, doença de Niemann-Pick tipo C, angiopatia amiloide cerebral de proteína de príon, panencefalite esclerosante subaguda, distrofia miotônica, doença do neurônio motor não guanamiano com emaranhados neurofibrilares, parkinsonismo pós- encefalítico e encefalopatia traumática crônica.
[0151] Outro aspecto da presente divulgação se refere a um método para promover espaçamento de agregados Tau a partir do cérebro de um indivíduo. Este método envolve administrar, ao indivíduo, qualquer um ou mais peptídeos Tau imunogênicos tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-21 e 101-124, ou um ou mais anticorpos que reconhecem o epítopo Tau imunogênico que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-21 e 101-124 e 51-71 e 125-155 sob condições eficazes para promover o espaçamento de agregados Tau do cérebro do indivíduo.
[0152] O espaçamento de agregados Tau inclui espaçamento de emaranhados neurofibrilares e/ou os precursores Tau patológicos para emaranhados neurofibrilares. Os emaranhados neurofibrilares são frequentemente associados a doenças neurodegenerativas incluindo, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica e familiar, esclerose lateral amiotrófica, demência por grãos argirofílicos, demência pugilística, encefalopatia traumática crônica, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, síndrome de Down, doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, doença de Hallervorden-Spatz, demência frontotemporal hereditária, parkinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), miosite do corpo de inclusão, doença de Creutsfeld-Jakob, atrofia do sistema múltiplo, doença de Niemann-Pick tipo C, doença de Pick, angiopatia amiloide cerebral de proteína de príon, degeneração corticobasal esporádica, paralisia supranuclear progressiva, panencefalite esclerosante subaguda, distrofia miotônica, doença do neurônio motor com emaranhados neurofibrilares, demência só com emaranhados e gliose subcortical progressiva.
[0153] Outro aspecto da presente divulgação se refere a um método para retardar a progressão de um fenótipo comportamental relacionado à patologia de Tau num indivíduo. Este método envolve administrar, ao indivíduo, qualquer um ou mais peptídeos Tau imunogênicos compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-21 e 101-124 e 51-71 e 125-155, ou um ou mais anticorpos que reconhecem o epítopo Tau imunogênico que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-21 e 101-124 e 51-71 e 125-155, sob condições eficazes para retardar o fenótipo comportamental relacionado à patologia de Tau no indivíduo.
[0154] Conforme usado no presente documento, a fenótipo comportamental relacionado à patologia de Tau inclui, sem limitação, disfunções cognitivas, mudança de personalidade precoce e desinibição, apatia, abulia, mutismo, apraxia, perseveração, movimentos/comportamentos estereotipados, hiperoralidade, desorganização, incapacidade de planejar ou organizar tarefas sequenciais, egoísmo/insensibilidade, traços antissociais, falta de empatia, parada, fala agramática com erros parafrásicos frequentes, porém compreensão relativamente preservada, compreensão prejudicada e déficits na busca de palavras, instabilidade da marcha lentamente progressiva, retropulsões, congelamento, quedas frequentes, rigidez axial não responsiva a levodopa, paralisia do olhar supranuclear, abalos em onda quadrada, sacadas verticais lentas, paralisia pseudobulbar, apraxia do membro, distonia, perda sensorial cortical e tremor.
[0155] De acordo com os métodos da presente divulgação, numa modalidade, um peptídeo Tau imunogênico ou uma combinação de peptídeos Tau imunogênicos são administrados a um indivíduo que necessite dos mesmos. Os fragmentos de peptídeo Tau imunogênicos da proteína Tau contêm um ou mais epítopos antigênicos que imitam a forma patológica da proteína Tau. Epítopos Tau imunogênicos exemplificativos são fosforilados num ou mais aminoácidos que são fosforilados na forma patológica de Tau, porém não fosforilados na forma normal ou não patológica de Tau.
[0156] Em algumas modalidades, a administração de peptídeo Tau imunogênico induz uma resposta imune ativa no indivíduo ao peptídeo Tau imunogênico e à forma patológica de Tau facilitando, deste modo, o espaçamento de agregados de Tau relacionados, retardando a progressão do comportamento relacionado à patologia de Tau e tratando a tauopatia subjacente. De acordo com este aspecto da presente invenção, uma resposta imune envolve o desenvolvimento de uma resposta humoral benéfica (mediada por anticorpo) e/ou celular (mediada por células T específicas do antígeno ou seus produtos de secreção) dirigida contra o peptídeo Tau imunogênico.
[0157] A presença de uma resposta imunológica humoral pode ser determinada e monitorada testando-se uma amostra biológica (por exemplo, sangue, plasma, soro, urina, saliva, fezes, CSF ou fluido linfático) do indivíduo quanto à presença de anticorpos dirigidos ao peptídeo Tau imunogênico. Métodos para detectar anticorpos numa amostra biológica são bem conhecidos na técnica, por exemplo, ELISA, Dot blots, géis SDS-PAGE ou ELISPOT. A presença de uma resposta imunológica mediada por células pode ser determinada por ensaios de proliferação (células T CD4+) ou ensaios CTL (linfócito T citotóxico) que são prontamente conhecidos na técnica.
[0158] Peptídeos Tau imunogênicos isolados da presente invenção incluem qualquer uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 1-21 e 101-124 e 51-71 e 125-155 mostradas nas Tabelas 1 e 3 abaixo. Os resíduos de aminoácidos de cada sequência que são fosforilados são mostrados em negrito e sublinhados. Os nomes dos peptídeos na Tabela 1 correspondem à posição de aminoácido destes peptídeos dentro da isoforma mais longa da proteína Tau humana tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:100, conforme mostrado na Tabela 8.
MODALIDADES ESPECÍFICAS
[0159] (1) Um construto de imunogênio de peptídeo Tau pode ser representado pelas fórmulas: (Th)m–(A)n–(fragmento Tau)–X ou (fragmento Tau)–(A)n–(Th)m–X
[0160] em que
[0161] Th é um epítopo auxiliar T heterólogo;
[0162] A é um espaçador heterólogo;
[0163] (fragmento Tau) é um epítopo de células B tendo cerca de 15 a cerca de 40 resíduos de aminoácidos provenientes da proteína Tau de comprimento completo da SEQ ID NO: 100;
[0164] X é um α-COOH ou α-CONH2 de um aminoácido;
[0165] m é de 1 a cerca de 4; e
[0166] n é de 0 a cerca de 10.
[0167] (2) O construto de imunogênio de peptídeo Tau de acordo com (1), em que o fragmento Tau é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-21 e 101-124.
[0168] (3) O construto de imunogênio de peptídeo Tau de acordo com qualquer um dentre (1) ou (2), em que o epítopo Th é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 22-50.
[0169] (4) O construto de imunogênio de peptídeo Tau de acordo com (1), em que o construto de imunogênio de peptídeo é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 51-71 e 125-155.
[0170] (5) Um construto de imunogênio de peptídeo Tau que compreende:
[0171] um epítopo de células B compreendendo cerca de 15 a cerca de 40 resíduos de aminoácidos provenientes da sequência de proteínas Tau de comprimento completo da SEQ ID NO: 100;
[0172] um epítopo T auxiliar que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 22- 50; e
[0173] um espaçador heterólogo opcional selecionado do grupo que consiste num aminoácido, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α, ε-N)Lys e ε-N- Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 102),
[0174] em que o epítopo de células B é covalentemente ligado ao epítopo T auxiliar diretamente ou através do espaçador heterólogo opcional.
[0175] (6) O construto de imunogênio de peptídeo Tau, de acordo com (5), em que o epítopo de células B é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-21 e 101-124.
[0176] (7) O construto de imunogênio de peptídeo Tau, de acordo com (5), em que o epítopo T auxiliar é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 22-50.
[0177] (8) O construto de imunogênio de peptídeo Tau, de acordo com (5), em que o espaçador heterólogo opcional é (α, ε-N)Lys ou ε-N- Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 102).
[0178] (9) O construto de imunogênio de peptídeo Tau, de acordo com (5), em que o epítopo T auxiliar é covalentemente ligado ao terminal amino do epítopo de células B.
[0179] (10) O construto de imunogênio de peptídeo Tau, de acordo com (5), em que o epítopo T auxiliar é covalentemente ligado ao terminal amino do epítopo de células B através do espaçador heterólogo opcional.
[0180] (11) Uma composição que compreende um construto de imunogênio de peptídeo, de acordo com qualquer um dentre (1) a (4).
[0181] (12) Uma composição farmacêutica que compreende:
[0182] a. um construto de imunogênio de peptídeo, de acordo com qualquer um dentre (1) a (4); e
[0183] b. e um veículo e/ou adjuvante de distribuição farmaceuticamente aceitável.
[0184] (13) A composição farmacêutica, de acordo com (12), em que
[0185] a. o construto de imunogênio de peptídeo Tau é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 51-71 e 125-155; e
[0186] b. o construto de imunogênio de peptídeo Tau é misturado com um oligodesoxinucleotídeo CpG (ODN) para formar um complexo imunoestimulador estabilizado.
[0187] (14) Um anticorpo isolado ou fragmento de ligação a epítopo do mesmo que se liga especificamente ao epítopo de células B do construto de imunogênio de peptídeo Tau, de acordo com qualquer um dentre (1) a (10).
[0188] (15) O anticorpo isolado ou fragmento de ligação a epítopo do mesmo, de acordo com (14) ligado ao construto de imunogênio de peptídeo Tau.
[0189] (16) Um anticorpo isolado ou fragmento de ligação a epítopo do mesmo que se liga especificamente ao epítopo de células B do construto de imunogênio de peptídeo Tau, de acordo com qualquer um dentre (1) a (10).
[0190] (17) Uma composição que compreende o anticorpo isolado ou fragmento de ligação a epítopo do mesmo, de acordo com qualquer um dentre (14) a (16).
[0191] EXEMPLO 1
[0192] ANTICORPOS ELICITADOS POR CONSTRUTOS DE
IMUNOGÊNIO DE PEPTÍDEO TAU NÃO FOSFORILADOS E PERFIS DE LIGAÇÃO
[0193] a. Síntese de fragmentos Tau e imunizações
[0194] Métodos para sintetizar designer fragmentos Tau projetados que foram incluídos no esforço de desenvolvimento de construtos de imunogênio de peptídeo Tau fosforilados e não fosforilados são descritos na Descrição Detalhada. Em geral, os peptídeos foram sintetizados em pequena escala para ensaios sorológicos, escala piloto de laboratório para estudos de campo ou clínicos, assim como em larga escala (quilograma) para produção industrial/comercial de composições farmacêuticas. Um grande repertório de peptídeos de epítopo de células B antigênicos relacionados a Tau tendo sequências com comprimentos na faixa de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 aminoácidos foi projetado para triagem e seleção sorológica extensa como o epítopo de células B candidato para incorporação no projeto de construtos de imunogênio de peptídeo Tau para imunogenicidade e teste funcional para uso numa formulação de vacina Tau.
[0195] Tau de comprimento completo (Tabela 8), usada como uma proteína recombinante nestes estudos sorológicos, foi adquirida junto à rPeptide Company (Tau-441, T-1001-2). Os segmentos de peptídeo Tau empregados para mapeamento de epítopo em vários ensaios sorológicos são identificados na Tabela 1 (SEQ ID NOs: 1 a 21 e 101- 124). Os segmentos de peptídeo Tau selecionados foram produzidos nos construtos de imunogênio de peptídeo Tau ligando-se sinteticamente os peptídeos Tau a um epítopo de célula T auxiliar cuidadosamente projetado (Th) derivados de proteínas patogênicas incluindo proteína de Fusão do Vírus do Sarampo (MVF), proteína do antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg), vírus influenza, Clostridum tetani e Epstein-Barr (EBV). Os epítopos Th projetados são mostrados na Tabela 2 (SEQ ID NOs: 22 a 50).
[0196] As formulações que empregam emulsões de água em óleo e em suspensão com sais minerais foram preparadas, conforme descrito na Descrição Detalhada. No projeto de uma composição farmacêutica adequada para ser usada por uma população grande para o propósito de prevenir doença, é importante considerar a segurança da composição.
Apesar do uso de emulsões de água em óleo em seres humanos para muitas composições farmacêuticas em ensaios clínicos, alume permanece o adjuvante principal para uso na composição farmacêutica devido à sua segurança.
Alume ou seus sais minerais, tal como ADJUPHOS (fosfato de alumínio), são frequentemente usados como adjuvantes na preparação para aplicações clínicas.
Os construtos de imunogênio de peptídeo Tau não fosforilados foram preparados (i) numa emulsão de água em óleo com Seppic MONTANIDE™ ISA 51 como o óleo aprovado para uso humano, ou (ii) misturados com sais minerais ADJUPHOS (fosfato de alumínio) ou ALHYDROGEL (alume), em quantidades variáveis de construtos de peptídeo, conforme especificado.
As composições foram tipicamente preparadas dissolvendo-se os construtos de imunogênio de peptídeo Tau em água a cerca de 400 µg/ml e formuladas com MONTANIDE™ ISA 51 em emulsões de água em óleo (1:1 em volume) ou com sais minerais (1:1 em volume). As composições foram mantidas à temperatura ambiente durante cerca de 30 min e misturadas por vórtice por cerca de 10 a 15 segundos antes da imunização.
Alguns animais foram imunizados com mais de uma dose de uma composição específica, que foram administradas no tempo 0 (principal) e 3 semanas após a imunização inicial (wpi) (reforço)e, opcionalmente a 6 wpi para um segundo reforço por via intramuscular.
Estes animais imunizados foram, então testados com peptídeo(s) de epítopo de células B selecionado para avaliar a imunogenicidade dos vários construtos de imunogênio de peptídeo Tau presentes na formulação, assim como sua reatividade cruzada com peptídeos ou proteínas alvo relacionadas.
Aqueles construtos de imunogênio de peptídeo Tau com imunogenicidade potente na triagem inicial em porquinhos da índia foram, então adicionalmente testados em emulsão de água em óleo, sais minerais, e formulações à base de alume em primatas para regimes de dosagem ao longo de um período especificado conforme ditado pelos protocolos de imunizações.
[0197] Construtos de imunogênio de peptídeo Tau não fosforilados (SEQ ID NOs: 52, 54, 56, 58, 61, 63, 65, 67, 69 e 71) dissolvidos em solvente (ISA 51 VG, CpG3 50 µg/ml, 0,2 % de TWEEN®-80) foram injetados em porquinhos da índia em cronograma especificado com soro imune coletado para análise sorológica extensa. B. ENSAIOS ELISA E RESULTADOS
[0198] Soro dos animais imunizados foi coletado em vários pontos no tempo após a imunização inicial e os perfis de ligação foram inicialmente analisados por ELISA para determinar a imunogenicidade do construto correspondente contra seu próprio alvo de epítopo de células B. A avaliação de reatividade sorológicas cruzadas entre peptídeos Tau de outras regiões funcionais foi extensivamente avaliada por ELISA com placas revestidas com peptídeos diferentes selecionados dentre aqueles mostrados nas Tabelas 9a a 9e.
[0199] Os protocolos ELISA foram desenvolvidos para avaliar as amostras de soro imune e são descritos nos Exemplos a seguir. Resumidamente, os poços de placas de 96 poços foram revestidos individualmente por 1 hora a 37°C com 100 μl de fragmentos Tau de peptídeo alvo A145-P160, P172-P189, P182-P200, S195-P213, R209- L224, V228-L243, K257-K274, R379-L408, V275-K311 e V393-L425 (SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19 e 21, respectivamente) a 2 μg/ml (a menos que indicado de outro modo), em tampão de NaHCO 3 10mM, pH 9,5 (a menos que indicado de outro modo). Os poços revestidos com peptídeo foram incubados com 250 μl de 3 % em peso de gelatina em PBS a 37°C por 1 hora para bloquear sítios de ligação de proteína não específicos, seguido de três lavagens com PBS contendo 0,05 % em volume de TWEEN® 20 e, então, secos. Os soros a serem analisados foram diluídos 1:20 (a menos que indicado de outro modo) com PBS contendo 20% em volume de soro de cabra normal, 1% em peso de gelatina e 0,05 % em volume de TWEEN® 20. Cem microlitros (100 μl) dos espécimes diluídos (por exemplo, soro, plasma) foram adicionados a cada um dos poços e deixados reagir por 60 minutos a 37°C.
Os poços foram, então, lavados seis vezes com 0,05 % em volume de TWEEN® 20 em PBS a fim de remover os anticorpos não ligados.
Anti-IgG de cabra específica para espécies conjugadas com peroxidase de raiz-forte (HRP) (por exemplo, camundongo, porquinho da índia ou ser humano), foi usada como um sinalizador identificado para se ligar ao complexo de antígeno anticorpo/peptídeo formado em poços positivos.
Cem microlitros (100 μl) da anti-IgG de cabra identificada com peroxidase, a uma diluição ideal pré-titulada e a 1% em volume de soro de cabra normal com 0,05% em volume de TWEEN® 20 em PBS, foram adicionados a cada poço e incubados a 37°C por mais 30 minutos.
Os poços foram lavados seis vezes com 0,05% em volume de TWEEN® 20 em PBS para remover anticorpo não ligado e reagido com 100 μl da mistura de substratos contendo 0,04 % em peso de 3’, 3’, 5’, 5’-Tetrametilbenzidina (TMB) e 0,12% em volume de peróxido de hidrogênio em tampão de citrato de sódio por mais 15 minutos.
Esta mistura de substratos foi usada para detectar a identificação de peroxidase formando-se um produto colorido.
As reações foram interrompidas pela adição de 100 μl de H2SO4 1,0 M e a absorbância a 450 nm (A450) determinada.
Para a determinação de títulos de anticorpo dos animais imunizados que receberam os vários imunogênios de peptídeo derivados de Tau, diluições em série de 10 vezes de 1:100 a 1:10000 foram testados, e o título de um soro testado, expresso como Log10, foi calculado por análise de regressão linear da A450 com o corte A450 ajustado a 0,5. Os resultados ELISA mostrados nas Tabelas 9a a 9e foram adicionalmente analisados por plotagem em gráficos de barras, conforme mostrado na Figura 1A.
[0200] Em geral, constatou-se que alta imunogenicidade é associada a cada um dos construtos de peptídeo Tau selecionados quando testados contra seu próprio epítopo de células B (Tabelas 9a a 9e e Figura 1A). Foi encontrada alta reatividade cruzada com anticorpos elicitados pelos construtos de imunogênio de peptídeo das SEQ ID Nos: 52, 54, 56, 58 e 61 (consulte a Figura 1A).
[0201] De modo interessante, constatou-se que a SEQ ID NO: 65, que contém o epítopo de células B K257-K274 (SEQ ID NO: 15), é uma sequência altamente imunogênica entre os construtos de peptídeo Tau projetados, embora os anticorpos elicitados a partir deste construto fossem o mais específico sem muita reatividade cruzada com qualquer um dos outros epítopos de células B (consulte a Figura 1A). Pelo contrário, o construto de imunogênio de peptídeo Tau da SEQ ID NO: 67, que contém o epítopo de células B R379-L408 (SEQ ID NO: 17) foi o mais imunogênico, tendo alta reatividade com seu próprio epítopo B, mas também tem uma reatividade razoavelmente cruzada com outros epítopos de célula B Tau (consulte a Figura 1A). EXEMPLO 2
ANTICORPOS ELICITADOS POR CONSTRUTOS DE IMUNOGÊNIO DE PEPTÍDEO TAU FOSFORILADOS E PERFIS DE LIGAÇÃO
[0202] Os anticorpos gerados contra os construtos de imunogênio de peptídeo Tau fosforilados foram avaliados quanto à sua capacidade de se ligar ao seus epítopos de célula B fosforilados por ELISA 6 semanas pós a imunização inicial (wpi). A. IMUNIZAÇÕES
[0203] Imunogênios de peptídeo Tau fosforilados (SEQ ID NOs: 51, 53, 55, 57, 59, 60, 62, 64, 66, 68 e 70) foram formulados e administrados a porquinhos da índia sob as mesmas condições discutidas no Exemplo 1 para os imunogênios de peptídeo Tau não fosforilados. As formulações contendo os imunogênios de peptídeo Tau fosforilados foram administrados em 0, 3 e 6 wpi.
[0204] b. Ensaios ELISA e resultados
[0205] Os poços de placas de 96 poços foram revestidos individualmente por 1 hora a 37°C com 100 μl de fragmentos de peptídeo alvo Tau fosforilados A145-P160, P172-P189, P182-P200, S195-P213, R209-L224, V228-L243, K257-K274, R379-L408, V275- K311 e peptídeo V393-L425 (SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 16, 18 e 20, respectivamente) a 2 μg/ml (a menos que indicado de outro modo), em tampão de NaHCO3 10mM, pH 9,5 (a menos que indicado de outro modo). Os poços revestidos com peptídeo foram incubados com 250 μl de 3 % em peso de gelatina em PBS a 37°C por 1 hora para bloquear sítios de ligação de proteína não específicos, seguido de três lavagens com PBS contendo 0,05% em volume de TWEEN® 20 e, então, secos. Os soros a serem analisados foram diluídos 1:20 (a menos que indicado de outro modo) com PBS contendo 20% em volume de soro de cabra normal, 1% em peso de gelatina e 0,05% em volume de TWEEN® 20. Cem microlitros (100 μl) dos espécimes diluídos (por exemplo, soro, plasma) foram adicionados a cada um dos poços e deixados reagir por 60 minutos a 37°C. Os poços foram, então lavados seis vezes com 0,05% em volume de TWEEN® 20 em PBS a fim de remover os anticorpos não ligados. Anti-IgG de cabra específica para espécies conjugadas com peroxidase de raiz-forte (HRP) (por exemplo, camundongo, porquinho da índia ou ser humano), foi usada como um sinalizador identificado para se ligar ao complexo de antígeno anticorpo/peptídeo formado em poços positivos. Cem microlitros (100 μl) da anti-IgG de cabra identificada com peroxidase, a uma diluição ideal pré-titulada e a 1% em volume de soro de cabra normal com 0,05% em volume de TWEEN® 20 em PBS, foram adicionados a cada poço e incubados a 37°C por mais 30 minutos. Os poços foram lavados seis vezes com 0,05% em volume de TWEEN® 20 em PBS para remover anticorpo não ligado e reagido com 100 μl da mistura de substratos contendo 0,04% em peso de 3’, 3’, 5’, 5’-Tetrametilbenzidina (TMB) e 0,12% em volume de peróxido de hidrogênio em tampão de citrato de sódio por mais 15 minutos. Esta mistura de substratos foi usada para detectar a identificação de peroxidase formando-se um produto colorido. As reações foram interrompidas pela adição de 100 μl de H2SO4 1,0 M e a absorbância a 450 nm (A450) determinada. Para a determinação de títulos de anticorpo dos animais imunizados que receberam os vários imunogênios de peptídeo derivados de Tau, diluições em série de 10 vezes de 1:100 a 1:10000 foram testados, e o título de um soro testado, expresso como Log10, foi calculado por análise de regressão linear da A450 com o corte A450 ajustado a 0,5. O soro dos animais imunizados foi coletado em vários pontos no tempo após a injeção e os perfis de ligação foram analisados por ELISA. As placas ELISA foram revestidas com vários fragmentos Tau e os resultados são mostrados nas Tabelas 10a a 10d.
[0206] Os resultados ELISA mostrados nas Tabelas 10a a 10d foram adicionalmente analisados por plotagem em gráficos de barras, conforme mostrado na Figura 1B. Os perfis de imunogenicidade e sorológicos similares incluindo reatividades cruzadas contra os epítopos de célula B foram encontrados quando os construtos de peptídeo Tau fosforilados foram usados como imunogênios. EXEMPLO 3
ANTICORPOS ELICITADOS POR CONSTRUTOS DE IMUNOGÊNIO DE PEPTÍDEO TAU FOSFORILADOS E PERFIS DE LIGAÇÃO CONTRA SUAS CONTRAPARTES DE PEPTÍDEO NÃO FOSFORILADO
[0207] Os anticorpos gerados contra os peptídeos Tau fosforilados foram avaliados quanto à sua capacidade de se ligar ao seu peptídeo de contraparte por ELISA 6 semanas após a injeção (wpi), conforme descrito em mais detalhes abaixo. A. IMUNIZAÇÕES
[0208] Imunogênios de peptídeo Tau fosforilados (SEQ ID NOs: 51, 53, 55, 57, 59, 60, 62, 64, 66, 68 e 70) foram formulados e administrados a porquinhos da índia sob as condições descritas no Exemplo 1 para os imunogênios de peptídeo Tau não fosforilados. B. ENSAIOS ELISA E RESULTADOS
[0209] Os poços de placas de 96 poços foram revestidos individualmente por 1 hora a 37°C com 100 μl de fragmentos Tau de peptídeo alvo A145-P160, P172-P189, P182-P200, S195-P213, R209- L224, V228-L243, K257-K274, R379-L408, V275-K311 e peptídeo V393-L425 (SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19 e 21, respectivamente) a 2 μg/ml (a menos que indicado de outro modo), em tampão de NaHCO3 10mM, pH 9,5 (a menos que indicado de outro modo). Os poços revestidos com peptídeo foram incubados com 250 μl de 3% em peso de gelatina em PBS a 37°C por 1 hora para bloquear sítios de ligação de proteína não específicos, seguido de três lavagens com PBS contendo 0,05 % em volume de TWEEN® 20 e secos. Os soros a serem analisados foram diluídos 1:20 (a menos que indicado de outro modo) com PBS contendo 20% em volume de soro de cabra normal, 1% em peso de gelatina e 0,05 % em volume de TWEEN® 20. Cem microlitros (100 μl) dos espécimes diluídos (por exemplo, soro, plasma) foram adicionados a cada um dos poços e deixados reagir por 60 minutos a 37°C. Os poços foram, então lavados seis vezes com 0,05% em volume de TWEEN® 20 em PBS a fim de remover os anticorpos não ligados. Anti-IgG de cabra específica para espécies conjugadas com peroxidase de raiz-forte (HRP) (por exemplo, camundongo, porquinho da índia ou ser humano), foi usada como um sinalizador identificado para se ligar ao complexo de antígeno anticorpo/peptídeo formado em poços positivos. Cem microlitros (100 μl) da anti-IgG de cabra identificada com peroxidase, a uma diluição ideal pré-titulada e a 1% em volume de soro de cabra normal com 0,05% em volume de TWEEN® 20 em PBS, foram adicionados a cada poço e incubados a 37°C por mais 30 minutos. Os poços foram lavados seis vezes com 0,05% em volume de TWEEN® 20 em PBS para remover anticorpo não ligado e reagido com 100 μl da mistura de substratos contendo 0,04% em peso de 3’, 3’, 5’, 5’-Tetrametilbenzidina (TMB) e 0,12% em volume de peróxido de hidrogênio em tampão de citrato de sódio por mais 15 minutos. Esta mistura de substratos foi usada para detectar a identificação de peroxidase formando-se um produto colorido. As reações foram interrompidas pela adição de 100 μl de H2SO4 1,0 M e a absorbância a 450 nm (A450) determinada. Para a determinação de títulos de anticorpo dos animais imunizados que receberam os vários imunogênios de peptídeo derivados de Tau, diluições em série de 10 vezes de 1:100 a 1:10000 foram testados, e o título de um soro testado, expresso como Log10, foi calculado por análise de regressão linear da A450 com o corte A450 ajustado a 0,5. O soro dos animais imunizados foi coletado em vários pontos no tempo após a injeção e os perfis de ligação foram analisados por ELISA.
[0210] As placas ELISA foram revestidas com vários fragmentos Tau não fosforilados e os resultados são mostrados nas Tabelas 11a a 11e. Os perfis de ligação sorológica similares foram obtidos para todos os anticorpos gerados contra construtos de peptídeo Tau fosforilados quando os soros imunes foram testados em peptídeos de epítopo de células B Tau não fosforilados correspondentes. A partir dos estudos de imunogenicidade e sorológicos extensos conduzidos nos Exemplos 1, 2 e 3, é claro que os anticorpos elicitados pelos construtos de imunogênio de peptídeo Tau exibem propriedades similares. A maior parte destas propriedades pode ser atribuída às sequências de aminoácidos. A avaliação de conformação com o uso de estudos de reatividade cruzada indica que havia apenas diferenças sutis causadas pela fosforilação dos peptídeos, sugerindo que haveria propriedades funcionais similares destes soros imunes aumentadas por construtos de imunogênio de peptídeo fosforilados ou não fosforilados correspondentes. EXEMPLO 4
PERFIS DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS DIRIGIDOS CONTRA IMUNOGÊNIOS DE PEPTÍDEO TAU NÃO FOSFORILADOS
[0211] a. Especificidade de anticorpos Tau anti-não fosforilados purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia imunizados com construtos de imunogênio de peptídeo Tau diferentes de tamanhos diferentes
[0212] Porquinhos da índia foram imunizados com construtos de imunogênio de peptídeo Tau não fosforilados, conforme descrito no Exemplo 1. Western blot foi usado para realizar a triagem de anticorpos Tau anti-não fosforilados (anticorpos anti-não p-Tau) purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia imunizados com construtos de imunogênio de peptídeo Tau diferentes para a especificidade de ligação ao complexo molecular de tamanhos diferentes. Várias formas (monômeros, dímeros, trímeros, oligômeros e polímeros) de Tau (20 μM) foram separadas em 12% de Tris-glicina SDS-PAGE e transferidas para membrana de nitrocelulose (NC) antes do tratamento de reticulação fotoinduzida (PICUP). A membrana foi incubada com anticorpos anti-não-p-Tau purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia a 1 μg/ml e, então incubada com HRP conjugado com anticorpo anti-porquinho da índia de jumento (706-035-148, Jackson). O blot foi visualizado com reagente de quimioluminescência Western Lightning ECL Pro (PerkinElmer). B. RESULTADOS
[0213] A análise por Western blot de lisados contendo monômeros,
dímeros, trímeros e oligômeros de Tau é mostrada na Figura 2 (painel esquerdo). A Tau monomérica apareceu ao redor de 60 kDa e o dímero, trímero, assim como oligômeros aparecerem em seus pesos moleculares correspondentes. O anticorpo monoclonal comercial Mab Tau 5 e Mab Tau 46 foi capaz de detectar a forma monomérica e, numa extensão menor, dimérica de Tau (Figura 2, faixas 1 e 2). Mab Tau5 foi empregado como um marcador Tau total e Tau46 é um marcador para Tau 404-441.
[0214] Os anticorpos IgG elicitados por construtos de imunogênio de peptídeo não fosforilados (SEQ ID NOs: 52, 54, 56, 58, 61, 63, 65, 67, 69 e 71) detectaram monômeros, dímeros, trímeros e oligômeros Tau em eficiências diferentes (Figura 2, faixas 4 a 13). Os perfis de ligação para cada anticorpo foram analisados e resumidos de maneira quantitativa no gráfico de barras (Figura 2, painel direito). Em geral, os anticorpos derivados de construtos de imunogênio de peptídeo Tau da região C-terminal foram capazes de elicitar anticorpos com perfis de ligação preferenciais mais altos que aqueles da região N-terminal (dados não mostrados). EXEMPLO 5
ANTICORPOS DIRIGIDOS CONTRA IMUNOGÊNIOS DE PEPTÍDEO TAU NÃO FOSFORILADOS INIBEM A AGREGAÇÃO DE TAU A. IMUNIZAÇÃO E EXPOSIÇÃO A TAU
[0215] Os animais foram imunizados com construtos de imunogênio Tau não fosforilados (SEQ ID NOs: 52, 54, 56, 58, 61, 63, 65, 67, 69 e 71), conforme descrito no Exemplo 1, ou construtos de imunogênio Tau fosforilados (SEQ ID NOs: 51, 53, 55, 57, 60, 62, 64, 66, 68 e 70), conforme descrito no Exemplo 2.
[0216] Os anticorpos gerados a partir das imunizações foram, então, expostos a amostras contendo proteína recombinante Tau441 de comprimento completo comercial sob condições que promovem a agregação de Tau. As fibrilas de β-folha Tau441 foram geradas com o uso de 60 μg de Tau agregada em 100 μl 1xPBS com 10 unidades/ml de heparina a 37°C por 7 dias e, então, transferidas para filtros de corte de 300 kDa (Pall) a 4°C para isolar as fibrilas de β-folha. Estas agregações foram verificadas por fluorescência de Tioflavina-T (ThT, Sigma).
[0217] Tau foi agregada em 200 μl de tampão de PBS com heparina a concentração de 5 μM por 3 dias com ou sem anticorpos IgG elicitados a partir dos construtos de imunogênio de peptídeo Tau. Após a centrifugação (13000 x g, 4°C, 30 min), os agregados de Tau foram colhidos e confirmados com os ensaios de ThT. B. RESULTADOS
[0218] A Figura 3A contém gráficos que mostram o nível de agregação de Tau de comprimento completo (Tau441) na presença de anticorpos dirigidos contra os construtos de imunogênio de peptídeo Tau fosforilados mostrados acima de cada gráfico. A linha tracejada mostrada na Figura 3A representa a amostra de controle que avaliou a agregação de Tau com o uso de IgG pré-imune. Os resultados mostram que todos os anticorpos dirigidos contra os imunogênios de peptídeo Tau fosforilados inibiram a agregação de Tau em comparação com a amostra de controle de soro pré-imune. Os anticorpos foram capazes de inibir a agregação de Tau em taxas diferentes.
[0219] A Figura 3B quantifica o nível de agregação de Tau de comprimento completo (Tau441) por coloração com ThT dos agregados na presença de anticorpos dirigidos contra os construtos de imunogênio de peptídeo Tau não fosforilados mostrados abaixo do gráfico de barras. Os resultados mostram que os anticorpos dirigidos contra os imunogênios de peptídeo Tau não fosforilados inibiram a agregação de Tau em comparação com a amostra de controle de soro pré-imune. Os anticorpos foram capazes de inibir a agregação de Tau em taxas diferentes.
[0220] Os resultados sugerem que há maior capacidade antiagregação na polimerização de Tau quando se usa construtos de imunogênio de peptídeo Tau tendo epítopos de célula B mais próximos à região C-terminal de Tau. EXEMPLO 6
ANTICORPOS DIRIGIDOS CONTRA IMUNOGÊNIOS DE PEPTÍDEO TAU INIBEM AGREGAÇÃO TAU A. IMUNIZAÇÃO E EXPOSIÇÃO A TAU
[0221] Animais foram imunizados com construtos de imunogênio Tau não fosforilados, conforme descrito no Exemplo 1. Animais também foram imunizados com construtos de imunogênio Tau fosforilados, conforme descrito no Exemplo 2.
[0222] Os anticorpos gerados a partir das imunizações foram, então expostos a lisados celulares de (a) células neuronais tratadas com ácido ocadaico (OKA) (células SH-SY5Y) como Tau hiperfosforilada ou (b) células neuronais livres de OKA como Tau não fosforilada. OKA foi adicionado no meio a uma concentração final de 100 nM por três horas na presença de antissoros a wpi 6 e 9 para determinar os efeitos dose- dependentes do efeito de antissoros na inibição da agregação de Tau. B. RESULTADOS
[0223] A Figura 4 contém gráficos que mostram o nível de agregação de Tau dos vários lisados após a exposição a anticorpos dirigidos contra os imunogênios de peptídeo Tau mostrados acima de cada gráfico. O nível de agregação de Tau foi medido por coloração com ThT dos agregados. Novamente, os anticorpos tanto dos construtos de imunogênio de peptídeo Tau fosforilados como não fosforilados foram capazes de inibir a agregação de Tau que é consistente com a análise sorológica descrita nos Exemplos anteriores.
[0224] Os resultados sugerem que há maior capacidade antiagregação na polimerização Tau com epítopos Tau derivados das regiões central e C-terminal de Tau. EXEMPLO 7 DESAGREGAÇÃO DE AGREGADOS TAU PRÉ-FORMADOS APÓS
A EXPOSIÇÃO A ANTICORPOS DIRIGIDOS CONTRA IMUNOGÊNIOS DE PEPTÍDEO TAU A. IMUNIZAÇÃO E EXPOSIÇÃO A AGREGADOS DE TAU PRÉ- FORMADOS
[0225] Animais foram imunizados com construtos de imunogênio Tau não fosforilados, conforme descrito no Exemplo 1. Animais também foram imunizados com construtos de imunogênio Tau fosforilados, conforme descrito no Exemplo 2.
[0226] Os anticorpos gerados a partir das imunizações foram, então expostos às fibrilas Tau pré-formadas. Os agregados de Tau pré- formados foram, então incubados com ou sem anticorpos anti-p-Tau ou anticorpos anti-não-p-Tau purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia por 2 e 4 dias. Após a incubação, os agregados foram coletados após a centrifugação de 13000 x g a 4°C por 30 minutos e, e, então, quantificados com o ensaio de ThT. B. RESULTADOS
[0227] A Figura 5 contém gráficos que mostram o nível de desagregação de Tau após a exposição a anticorpos dirigidos contra os imunogênios de peptídeo Tau (construtos de peptídeo representativos das SEQ ID NOs: 66 e 67), conforme mostrado acima na Figura 5 (painel direito). O nível de agregação de Tau foi medido por coloração com ThT e Western blot.
[0228] Os dados tanto a partir do ensaio Western blot como ThT mostram que as IgGs anti-não-p/p-Tau 379-408, elicitadas pelas SEQ ID NOs: 67 e 66, respectivamente, têm a capacidade de interromper a agregação de fibrilas Tau recombinantes.
EXEMPLO 8
[0229] ANÁLISE POR DOT BLOT PARA LIGAÇÃO ESPECÍFICA DE FORMAS NÃO DESNATURADAS DE FIBRILAS, OLIGÔMEROS E
MONÔMEROS TAU POR ANTICORPOS REPRESENTATIVOS GERADOS TANTO POR CONSTRUTOS DE IMUNOGÊNIO DE PEPTÍDEO TAU FOSFORILADOS COMO TAU NÃO FOSFORILADOS. A. IMUNIZAÇÃO, ANÁLISE POR WESTERN BLOT E DOT BLOT DE PERFIS DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-TAU
[0230] Animais foram imunizados com construtos de imunogênio Tau não fosforilados, conforme descrito no Exemplo 1. Animais também foram imunizados com construtos de imunogênio Tau fosforilados, conforme descrito no Exemplo 2.
[0231] Diferentes espécies de proteína Tau (isto é, os monômeros α-hélice, monômeros β-folha, oligômeros β-folha e fibrilas β-folha) foram preparados, conforme descrito no Exemplo 5. Os ensaios Western blot e dot com as diferentes espécies de proteína Tau foram realizados com o uso de anticorpos anti-p-Tau ou anti-não-p-Tau purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia imunizados com diferentes construtos de imunogênio de peptídeo Tau como anticorpos primários. Várias formas de fibrilas, oligômeros, monômeros de β-folha, monômeros α- helicoidais, e outros reagentes de controle foram pontilhadas na mancha para controle específico rígido. Procedimentos detalhados para preparação destes reagentes para teste e avaliação sorológica são descritos adicionalmente no Exemplo 11. B. RESULTADOS
[0232] A Figura 6 (painel esquerdo) contém a análise por Western blot (sob condições de desnaturação) de IgG anti-p-Tau produzida pelos imunogênios de peptídeo Tau (SEQ ID NOs: 59, 66 e 70) e IgG anti- não-p-Tau produzida pelo imunogênio de peptídeo Tau (SEQ ID NO: 67). Os resultados de Western blot mostram que IgGs anti-p-Tau dirigidas contra a extremidade C-terminal de Tau reconhecem especificamente agregado Tau de alto peso molecular, porém não o monômero Tau.
[0233] A Figura 6 (painel direito) contém análise por dot blot (sub condições não desnaturantes) de IgGs anti-p-Tau e anti-não-p-Tau produzidas pelos imunogênios de peptídeo Tau das SEQ ID NOs: 66 e 67, respectivamente. Os resultados mostram que IgGs anti-não-p-/p- Tau379-408 têm ligação específica a várias formas de Tau, porém não a outras proteínas amiloidogênicas (isto é, Aβ1-42 e alfa-Sinucleína). Além disto, quando comparadas com o anticorpo monoclonal Mab Tau 5 e outras IgGs contra a região não C-terminal de Tau, as IgGs anti-p- /anti-não-p-Tau379-408 derivadas desta invenção (SEQ ID NOs: 66 e 67, respectivamente) têm afinidade mais alta com as fibrilas e oligômeros em vez de monômeros. Adicionalmente, a IgG anti-p- Tau379-408 não se liga aos monômeros de β-folha. EXEMPLO 9
PERFIS DE LIGAÇÃO DE TECIDO DE ANTICORPOS DIRIGIDOS CONTRA IMUNOGÊNIOS DE PEPTÍDEO TAU A. IMUNIZAÇÃO E COLORAÇÃO DE TECIDO
[0234] Animais foram imunizados com construtos de imunogênio Tau não fosforilados, conforme descrito no Exemplo 1. Animais também foram imunizados com construtos de imunogênio Tau fosforilados, conforme descrito no Exemplo 2.
[0235] Os anticorpos gerados a partir das imunizações foram, então usados para manchar tecidos de cérebros saudáveis (normais) e cérebros com doença de Alzheimer (AD). O painel de tecidos humanos (Pantomics) foi desparafinado com xileno, reidratado em etanol e tratado com solução de tripsina a 0,25% com CaCl2 a 0,5% em PBS por 30 min e incubado em peróxido de hidrogênio a 1% em metanol para bloquear a atividade da peroxidase endógena seguida de incubação com Block Ace a 10% (Sigma) em PBS, antes da aplicação de anti-Tau 349-408 (SEQ ID NOs: 66 ou 67) ou soros pré-imunes aos tecidos. As seções foram desenvolvidas com 3-3’diaminobenzidina (DAB) e foram contracoradas com hematoxilina antes de serem examinadas microscopicamente. B. RESULTADOS
[0236] A Figura 7 mostra imagens de coloração a partir deste experimento. Anticorpos dirigidos contra Tau 379-408 não fosforilada (SEQ ID NO: 67) e Tau 379-408 fosforilada (SEQ ID NO: 66) não apresentaram reatividade cruzada com seções de tecido normal, porém foram reativamente cruzados com tecidos cerebrais com doença de Alzheimer. O anticorpo dirigido contra o peptídeo fosforilado (SEQ ID NO: 66) mostrou ligação mais forte na região de hipocampo do cérebro com AD. EXEMPLO 10
[0237] ANTICORPOS ELICITADOS POR CONSTRUTOS DE
IMUNOGÊNIO DE PEPTÍDEO TAU E FORMULAÇÕES DOS MESMOS: EFEITO NEUROPROTETOR NA REDUÇÃO DE NEURODEGENERAÇÃO ACIONADA POR FIBRILAS TAU EXÓGENAS
[0238] A fim de avaliar os efeitos neuroprotetores de anticorpos anti- Tau purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia imunizados com construtos de imunogênio de peptídeo Tau diferentes, um modelo de neurodegeneração in vitro com agregados de Tau pré-formados exógenos em células PC12 neuronais diferenciadas tratadas com NGF foi adotado.
[0239] Células PC12 foram tratadas com NGF (100 ng/ml) por 6 dias para induzir a diferenciação neuronal. A morfologia das células neuronais diferenciadas foi confirmada e analisada pelo sistema de imaginologia de alto rendimento cell3 iMager duos (Screen). O corante de fluoresceína foi usado para identificar morte celular e as células foram contadas com o uso de um software de contagem de células. Anticorpos elicitados pelos construtos de imunogênio de peptídeo Tau foram capazes de entrar nas células e se ligar aos agregados de Tau (dados não mostrados). Os efeitos neurotróficos de NGF refletidos no crescimento de neurito e no número de células neuronais diferenciadas foram quantificados. Os níveis de crescimento de neurito e o número de células neuronais diferenciadas foram mostrados em porcentagens (média ± SEM) após a normalização. O comprimento de neurito de células PC12 com e sem tratamento com NGF foram tomados como 100% e 0%, respectivamente. O número de células PC12 neuronais diferenciadas após 6 dias de tratamento com NGF foi normalizado a 100%.
[0240] A neurodegeneração foi observada adicionando-se agregados de Tau pré-formados exógenos tratados com heparina por uma semana a 37°C sobre as células PC12 neuronais diferenciadas. Na presença de agregados de Tau pré-formados, o comprimento de neurito foi encurtado e o número de células foi diminuído nas células PC12 neuronais diferenciadas. Esta neurodegeneração acionada por fibrilas era proporcional à quantidade de agregados de Tau exógenos adicionados de uma maneira dependente de concentração. Os anticorpos anti-Tau (por exemplo, Mab Tau 5 e Mab Tau46), porém não os anticorpos purificados a partir de porquinhos da índia virgens, atenuaram a neurodegeneração acionada por fibrila Tau. Este modelo foi adotado como uma plataforma de triagem para identificar quais anticorpos anti-Tau purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia imunizados com construtos de imunogênio de peptídeo Tau diferentes tinham efeitos neuroprotetores na restauração da sobrevivência neuronal de uma maneira dependente de concentração (Figuras 8A e B).
[0241] Como resultado, os anticorpos anti-Tau purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia imunizados com mais da metade dos construtos de imunogênio de peptídeo Tau diferentes restauraram o crescimento de neurito. A fibrila Tau foi fornecida a 5 ug/ml, uma concentração anteriormente otimizada para causar lesão (Figura 8A). Os anticorpos anti-Tau purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia imunizados com células PC12 neuronais diferenciadas protegidas por construtos de peptídeo Tau fosforilados ou não fosforilados da morte neuronal acionada por fibrila Tau. A Figura 8B mostra os dados dos anticorpos anti-não-p-Tau obtidos a partir de imunizações com as SEQ ID NOs: 65, 67 e 69.
[0242] Os resultados das Figuras 8A e 8B demonstram que anticorpos anti-Tau (por exemplo, SEQ ID NOs: 65, 67 e 69) são capazes de proteger neurônios contra a neurotoxicidade de fibrilas Tau. Os efeitos antineurodegenerativos dos anticorpos anti-Tau elicitados por construtos de imunogênio de peptídeo Tau (SEQ ID Nos: 65, 67 e 69) foram observados e quantificados através de cálculo por software Cell3 Imager duos (Miteklab) para o número de células sobrevividas na cultura.
[0243] Em relação à neuroproteção por anticorpos anti-Tau através de análise de ensaio funcional in vitro, demonstrou-se que a inoculação de agregação de Tau in vitro poderia diminuir consideravelmente a patologia e aprimorar a cognição in vivo, conforme relatado por Yanamandra, K, et al. (Neuron 80:402-414, 2013). O monômero Tau foi considerado nativamente não estruturado e pode não ter uma função muito funcional na agregação de Tau e citotoxicidade celular relacionada. Descobertas recentes mostram que a iniciação de agregação patológica poderia começar com a conversão de monômero Tau de uma forma inerte para uma competente em inoculação (Mirbaha, H., et al., eLife 2018;7:e36584; doi: 10.7554/eLife.36584). Com base nestas descobertas, foram testados os anticorpos anti-Tau elicitados pelos construtos de imunogênio de peptídeo Tau quanto à sua capacidade para reduzir as atividades de inoculação. Especificamente, anticorpos anti-Tau dirigidos contra os construtos de imunogênio de peptídeo Tau foram incubados com homogenatos cerebrais de pacientes com doença de Alzheimer (AD) e constatou-se que estes anticorpos têm a capacidade de reduzir tais atividades de inoculação (dados não mostrados). O projeto de imunogênio Tau, imunogenicidade e análises sorológicas extensos facilitaram o desenvolvimento de uma intervenção neuroprotetora como vacinas tanto nos níveis moleculares como sorológicos para o tratamento de tauopatias devastadoras. EXEMPLO 11
ENSAIOS E REAGENTES SOROLÓGICOS ADICIONAIS
[0244] Ensaios e reagentes sorológicos para avaliar a imunogenicidade funcional dos construtos de peptídeo sintético e formulações dos mesmos são descritos em detalhes abaixo. A. ANÁLISE DE ESPECIFICIDADE FINA E MAPEAMENTO DE
EPÍTOPO PARA FRAGMENTOS TAU POR TESTES ELISA BASEADOS EM PEPTÍDEO DE AGRUPAMENTO DE EPÍTOPOS DE CÉLULA B
[0245] Análises de especificidade fina de anticorpos anti-Tau em hospedeiros imunizados foram determinadas por mapeamento de epítopo. Resumidamente, os poços de placas de 96 poços foram revestidos com peptídeos de fragmento Tau individuais (SEQ ID NOs: 115 e 156-171) a partir da região Tau 275-311 (SEQ ID NO: 19) a ser mapeada, a 0,5 μg por 0,1 ml por poço e, então, 100 μl de amostras de soro (1:100 diluições em PBS) foram incubadas em poços de placa em duplicata após as etapas do método ELISA de anticorpo, conforme descrito acima. O epítopo de células B do construto de imunogênio de peptídeo Tau e as análises de especificidade fina de anticorpos anti-Tau dos soros imunes em hospedeiros imunizados também foram testados com peptídeos Tau correspondentes (por exemplo SEQ ID NOs: 1-21, 101-124, conforme mostrado na Tabela 1, SEQ ID NOs: 72-99, conforme mostrado nas Tabelas 4 a 7, e SEQ ID NO: 100, conforme mostrado na Tabela 8) sem as sequências de espaçador e Th, para confirmação de reatividade e especificidade adicionais. B. AVALIAÇÃO DE IMUNOGENICIDADE
[0246] As amostras de soro pré-imunes e imunes de animais foram coletadas de acordo com protocolos de imunização experimentais e aquecidas a 56°C por 30 minutos para inativar os fatores complementares de soro. Após a administração dos construtos de imunogênio de peptídeo Tau, amostras sanguíneas foram obtidas de acordo com protocolos e sua imunogenicidade contra sítio(s) alvo específico avaliado. Os soros diluídos em série foram testados e títulos positivos foram expressos como Log10 da diluição recíproca. A imunogenicidade de um construto de imunogênio de peptídeo Tau particular foi avaliada quanto à sua capacidade de elicitar resposta de anticorpo de célula B de título alto dirigida contra a especificidade de epítopo desejada dentro do antígeno alvo enquanto mantém uma reatividade de anticorpo baixa a insignificante em direção aos epítopos de “célula T auxiliar” empregados para fornecer intensificação das respostas de célula B desejadas. C. PREPARAÇÃO DE AGREGADOS TAU (DÍMEROS, TRÍMEROS, OLIGÔMEROS E FIBRILAS) COM PROTEÍNA TAU RECOMBINANTE
[0247] Para preparar Tau agregada, a proteína Tau recombinante purificada (0,1 μg/μl) em tampão de agregação PBS/KCl de 100 μl (MgCl2 2,5 mM, HEPES 50 mM e KCl 150 mM em 1 x PBS, pH 7,4) foi incubada a 37°C em tubos Eppendorf de 1,5 ml para 7 dias num Termomisturador (Eppendorf) sem agitação. Tau agregada foi imediatamente congelada a -80°C para uso posterior.
[0248] d. Purificação de anticorpos anti-Tau
[0249] Anticorpos anti-Tau foram purificados a partir dos soros coletados 3 a 15 semanas após a imunização inicial (wpi) de porquinhos da índia imunizados com construtos de imunogênio de peptídeo Tau contendo peptídeos de sequências diferentes (SEQ ID NOs: 51-71 e 125-155) com o uso de uma coluna de afinidade (Thermo Scientific, Rockford). Resumidamente, após o equilíbrio de tampão (fosfato 0,1 M e cloreto de sódio 0,15 M, pH 7,2), 400 μl de soro foram adicionados à coluna Nab Protein G Spin, seguido de mistura final por 10 min e centrifugação a 5800 x g por 1 min. A coluna foi lavada com tampão de ligação (400 μl) três vezes. Subsequentemente, o tampão de eluição (400 μl, glicina 0,1 M pH 2,0) foi adicionado na coluna de centrifugação para eluir os anticorpos após a centrifugação a 5800 x g por 1 min. Os anticorpos eluídos foram misturados com tampão de neutralização (400 μl, Tris 0,1 M pH 8,0) e as concentrações destes anticorpos purificados foram medidas com o uso de Nan-Drop a OD280, com BSA (albumina sérica bovina) como o padrão. E. ESPECIFICIDADE DE ANTICORPOS ANTI-TAU PURIFICADOS A
PARTIR DE ANTISSOROS DE PORQUINHO DA ÍNDIA IMUNIZADOS COM CONSTRUTOS DE IMUNOGÊNIO DE PEPTÍDEO TAU DIFERENTES DE TAMANHOS DIFERENTES
[0250] Western blot foi usado para realizar a triagem de anticorpos anti-Tau purificados a partir de antissoros de porquinho da índia imunizados com construtos de imunogênio de peptídeo Tau diferentes para a especificidade de ligação ao complexo molecular de tamanhos diferentes. Várias formas de Tau (20 μM) foram separadas em 12 % de Tris-glicina SDS-PAGE e transferidas para membrana de nitrocelulose (NC) antes do tratamento de reticulação fotoinduzida (PICUP). A membrana foi incubada com anticorpos anti-Tau purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia a 1 μg/ml e, então incubada com HRP conjugado com anticorpo anti-porquinho da índia de jumento (706-035- 148, Jackson). O blot foi visualizado com reagente de quimiolu- minescência Western Lightning ECL Pro (PerkinElmer). A Tau monomérica apresentou aproximadamente o tamanho de 60 kDa, enquanto o dímero, trímero ou oligômeros tiveram seus respectivos pesos moleculares várias vezes maiores que a Tau monomérica. O anticorpo comercial que é capaz de detectar várias espécies oligoméricas, tais como dímeros, trímeros e oligômeros maiores, por exemplo, Mab Tau 5 ou Mab Tau 46 foi empregado como um controle positivo. F. ENSAIO POR DOT BLOT COM DIFERENTES ESPÉCIES DE
PROTEÍNAS AMILOIDOGÊNICAS
[0251] A preparação de monômeros de α-hélice, monômeros de β- folha, oligômeros de β-folha e fibrilas de β-folha de Aβ1-42, Tau e α-Syn é descrita da seguinte forma.
[0252] 1. Monômeros de α-hélice Aβ1-42: 20 μg de monômeros β- folha Aβ1-42 (50 μl) foram adicionados em 1xPBS contendo 20 % de ácido trifluoroacético e 20% de hexafluoroisopropanol (10 μl) e incubados a 4°C por 24 h para formar os monômeros α-hélice.
[0253] 2. Monômeros de β-folha Aβ1-42: 60 μg de Aβ1-42 em 120 μl 1xPBS contendo 5% de TFA agregado a 37°C por 24 h foram transferidos para um filtro de corte de 10 kDa (Millipore) para recuperar os monômeros de β-folha.
[0254] 3. Oligômeros de β-folha Aβ1-42: 60 μg de Aβ1-42 em 120 μl 1xPBS agregado a 37°C por 3 dias foram sonicados em gelo e transferidos para filtros de corte de 10 e 30 kDa (Millipore) para recuperar as fibrilas oligoméricas de β-folha inferiores a 35 kDa.
[0255] 4. Fibrilas de β-folha Aβ1-42: 60 μg de Aβ1-42 em 120 μl 1xPBS agregado a 37°C por 3 dias foram sonicados em gelo e transferidos para filtros de corte de 30 kDa (Millipore) para isolar as fibrilas de β-folha.
[0256] 5. Monômeros de α-hélice de α-Syn: 40 μg de α-Syn recém-preparada foram dissolvidos em 100 μl de 1xPBS fria a 4°C e imediatamente transferidos para um filtro de corte de 10 kDa (Millipore) para recuperar o monômero de α-hélice.
[0257] 6. Monômeros de β-folha de α-Syn : 40 μg de α-Syn incubada em 100 μl de tampão PBS/KCl a 37°C por 24 h foram transferidos para um filtro de corte de 10 kDa (Millpore) para recuperar os monômeros de β-folha.
[0258] 7. Oligômeros de β-folha de α-Syn: 40 μg de α-Syn agregada em 100 μl de tampão PBS/KCl a 37°C por 8 dias foram sonicados em gelo e, então, transferidos para filtros de corte de 30 e 100 kDa para recuperar os oligômeros de β-folha.
[0259] 8. Fibrilas de β-folha de α-Syn: 40 μg de α-Syn agregada em 100 μl de tampão PBS/KCl a 37°C por 8 dias foram sonicados em gelo e, então, transferidos para filtros de corte de 30 e 100 kDa para isolar as fibrilas de β-folha.
[0260] 9. Monômeros de α-hélice Tau441: 60 μg de Tau preparados em 100 μl 1xPBS a 4°C foram transferidos para um filtro de corte de 100 kDa para recuperar os monômeros de α-hélice.
[0261] 10. Monômeros de β-folha Tau441: 60 μg de Tau agregada em 100 μl 1xPBS com 10 unidades/ml de heparina a 25°C por 48 h foram transferidos para um filtro de corte de 100 kDa a 4°C para recuperar os monômeros de β-folha.
[0262] 11. Oligômeros de β-folha Tau441: 60 μg de Tau agregada em 100 μl 1xPBS com 10 unidades/ml de heparina a 37°C por 48 h foram transferidos para um filtro de corte de 100 e 300 kDa (Pall) a 4°C para recuperar os oligômeros de β-folha.
[0263] 12. Fibrilas de β-folha Tau441: 60 μg de Tau agregada em 100 μl 1xPBS com 10 unidades/ml de heparina a 37°C por 6 dias foram transferidos para filtros de corte de 300 kDa (Pall) a 4°C para isolar as fibrilas de β-folha.
[0264] Estes monômeros e oligômeros foram verificados por fluorescência de tioflavina-T (ThT, Sigma) ou PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida). As concentrações das proteínas amiloidogênicas foram medidas por Nano-Drop com estoque Aβ1-42 amiloidogênico comercial como o padrão. Estes monômeros e oligômeros foram aplicados em pontos individualmente sobre membranas PVDF com a quantidade de 3 μg para Aβ1-42, 4 μg para α-Syn e 7 μg para Tau. As membranas foram incubadas com os anticorpos anti-Tau purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia (1:1000 diluições) como anticorpo primário, seguido de hibridização com o anticorpo secundário conjugado com HRP anti-porquinho da índia (1:5000; Vector Laboratories). As membranas foram tratadas com substratos Luminata Western HRP Substrates (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) e os sinais foram detectados com um sistema de imagem digital ChemiDoc-It 810 (UVP Inc., Upland, CA, EUA). EXEMPLO 12
ANIMAIS USADOS EM ESTUDOS DE IMUNOGENICIDADE E EFICÁCIA A. PORQUINHOS DA ÍNDIA:
[0265] Os estudos de imunogenicidade foram conduzidos em porquinhos da índia Duncan-Hartley macho e fêmea maduros, virgens, adultos (300-350 g/BW). Os experimentos utilizaram pelo menos 3 porquinhos da índia por grupo. Os protocolos que envolvem porquinhos da índia Duncan-Hartley (8 a 12 semanas de idade; Covance Research Laboratories, Denver, PA, EUA), foram realizados sob aplicações aprovadas pela IACUC nas instalações contratadas para animais, assim como em United Biomedical, Inc. (UBI), como patrocinador. EXEMPLO 13
IDENTIFICAÇÃO DE RESPOSTA DE ANTICORPO FOCALIZADA ELICITADA POR CONSTRUTOS DE IMUNOGÊNIO DE PEPTÍDEO TAU PARA O EPÍTOPO DE CÉLULA B ALVO: UM ESTUDO REPRESENTATIVO
[0266] Num estudo de mapeamento de epítopo fino representativo (Tabela 16) para determinar o sítio(s) de ligação ao anticorpo para resíduos específicos elicitados por um construto de imunogênio de peptídeo Tau dirigido em sua região Tau 275-311 (SEQ ID NO: 19), peptídeos sobrepostos com comprimentos crescentes a partir desta região (SEQ ID NOs: 115 e 156-171) foram sintetizados e individualmente revestidos em poços da placa de microtitulação de 96 poços como imunoabsorventes em fase sólida. Os peptídeos (0,5 μg por 0,1 ml por poço) foram revestidos nas placas e, então, 100 μl de amostras de soro (1:100 diluições em PBS) foram incubados em poços de placa em duplicata após as etapas do método ELISA de anticorpo descrito acima.
[0267] Antissoros de porquinhos da índia 6 wpi agrupados dirigidos contra o construto de imunogênio de peptídeo Tau da SEQ ID NO: 68 foram adicionados em 1:100 diluições em tampão de diluente de espécime aos poços de placa com peptídeos sobrepostos Tau a partir desta região a 2,0 μg/ml e, então, incubados por uma hora a 37°C. Após a lavagem dos poços de placa com tampão de lavagem, a proteína conjugada com peroxidase de raiz-forte A/G é adicionada e incubada por 30 min. Após a lavagem novamente com PBS, o substrato é adicionado aos poços para medição da absorbância a 450 nm por leitor de placa ELISA, cujas amostras foram analisadas em duplicata. A ligação de antissoros ao peptídeo Tau longo correspondente do construto de imunogênio de epítopo B representa a ligação máxima.
[0268] Conforme mostrado na Tabela 16, os soros imunes de porquinho da índia 6 wpi agrupados demonstraram um perfil de ligação de alta precisão, em que dois peptídeos Tau com SEQ ID NOs 164 e
115 tendo apenas dois aminoácidos de comprimento diferente, embora o peptídeo mais longo SEQ ID NO:115 fosse capaz de apresentar um epítopo Tau forte a partir desta região de hiperfosforilação e agregação. Entretanto, os soros imunes agrupados não foram capazes de reconhecer o peptídeo SEQ ID NO: 164 devido à deleção de dois aminoácidos N- terminal (I297 e K298), que indica que estes dois aminoácidos são críticos na apresentação desta região como um epítopo imunodominante.
[0269] Esta região foi submetida ao projeto cuidadoso adicional de construtos de peptídeo Tau para estudos de imunogenicidade, conforme mostrado nas Tabelas 12, 13a, 13b, e 15 incluindo construtos de imunogênio de peptídeo que incorporam uma conformação trans de Prolina na posição 301 para avaliação de imunogenicidade. Em geral, alta imunogenicidade foi encontrada nos construtos de peptídeo de imunogênio Tau cuidadosamente projetados das SEQ ID NOs: 126-132, 135, 136, 140 e 141, com exceção da SEQ ID NO: 128 nesta região de hiperfosforilação e agregação.
[0270] Os projetos de construto de imunogênio de peptídeo Tau adicionais foram usados para a região de "revestimento difuso" de Tau que se situa na região N-terminal que é frequentemente deletada dos isômeros Tau. Os construtos de imunogênio de peptídeo Tau a partir desta região (SEQ ID Nos: 137-139) conforme mostrado na Tabela 3 também foram projetados e avaliados quanto à sua imunogenicidade correspondente.
[0271] A Tabela 14 mostra que os construtos de imunogênio de peptídeo Tau a partir da região de revestimento difuso eram altamente imunogênicos. Estes resultados sugerem que construtos de imunogênio de peptídeo Tau a partir da região de revestimento difuso N-terminal podem ser úteis para a incorporação numa composição para elicitar anticorpos para a prevenção de agregação de Tau além da redução potencial na iniciação de inoculação de Tau monomérica que leva à agregação de Tau. TABELA 1
SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DE FRAGMENTOS TAU E TAU FOSFORILADOS (PTAU) SEQ ID Código Descrição Sequência1 pTau - aa145-160 1 p4578 ADGKTKIATPRGAAPP (pT149/pT153) 2 p4579 Tau - aa145-160 ADGKTKIATPRGAAPP pTau - aa172-189 3 p4580 PAKTPPAPKTPPSSGEPP (pT175/pT181/pS185) 4 p4581 Tau - aa172-189 PAKTPPAPKTPPSSGEPP pTau - aa182-200 5 p4582 PPSSGEPPKSGDRSGYSSP (pS184/pY197) 6 p4583 Tau - aa182-200 PPSSGEPPKSGDRSGYSSP pTau - aa195-213 7 p4586 SGYSSPGSPGTPGSRSRTP (pS198/pS208/pS210) 8 p4585 Tau - aa195-213 SGYSSPGSPGTPGSRSRTP pTau - aa195-213 9 p4584 SGYSSPGSPGTPGSRSRTP (pS199/pS202/pT205) pTau - aa209-224 10 p4587 RSRTPSLPTPPTREPK (pT212/pS214/pT217) 11 p4588 Tau - aa209-224 RSRTPSLPTPPTREPK pTau - aa228-243 12 p4589 VVRTPPKSPSSAKSRL (pT231/pS235/pS238) 13 p4598 Tau - aa228-243 VVRTPPKSPSSAKSRL pTau - aa257-274 14 p4599 KSKIGSTENLKHQPGGGK (pS262) 15 p4600 Tau - aa257-274 KSKIGSTENLKHQPGGGK pTau - aa379-408 16 p4601 RENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHL (pS396/pS404) 17 p4602 Tau - aa379-408 RENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHL pTau - aa275-311 ͙ 18 p4603 *P301->S
VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVSGGGSVQIVYK (pS293/pS301) 19 p4604 Tau - aa275-311 VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYK pTau - aa393-425 20 p4606 VYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQL (pS396/pS404/pS422) 21 p4605 Tau - aa393-425 VYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQL 101 p5031a Tau - aa131-141 SKDGTGSDDKK 102 p5032a Tau - aa241-257 SRLQTAPVPMPDLKNVK 103 p5033a Tau - aa243-259 LQTAPVPMPDLKNVKSK 104 p5134a Tau - aa275-281 VQIINKK 105 p5135a Tau - aa281-294 KLDLSNVQSKCGSK 106 p5136a Tau - aa275-294 VQIINKKLDLSNVQSKCGSK 107 p5137a Tau - aa294-311 KDNIKHVPGGGSVQIVYK 108 p5138a Tau - aa294-311, P301→S301 KDNIKHVSGGGSVQIVYK 109 p5158a Tau - aa294-311, trans p301 KDNIKHVPGGGSVQIVYK 110 p5159a Tau - aa275-311, p301 trans VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYK 111 p5183a Tau - aa297-311, p301 trans IKHVPGGGSVQIVYK 112 p5160a Tau - aa22-34 DRKDQGGYTMHQD 113 p5161a Tau - aa18-34 YGLGDRKDQGGYTMHQD 114 p5162a Tau - aa22-38 DRKDQGGYTMHQDQEGD 115 p5186a Tau - aa297-311 IKHVPGGGSVQIVYK 116 p5404a Tau - aa359-370 NITHVPGGGNKK 117 p5405a Tau - aa349-370 RVQSKIGSLDNITHVPGGGNKK
118 p5406a Tau - aa339-370 VKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKK 119 p5407a Tau - aa329-370 HHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKK 120 p5408a Tau - aa329-349 HHKPGGGQVEVKSEKLDFKDR 121 p5456a Tau - aa1-40 MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTD 122 p5457a Tau - aa11-50 MEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQT 123 p5458a Tau - aa1-34 MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQD 124 p5459a Tau - aa1-22 MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGD 1 Os resíduos fosforilados estão em negrito e sublinhados TABELA 2 Sequências de aminoácidos de epítopos Th derivados de proteína patógena incluindo epítopos Th artificiais idealizados para emprego no projeto de construtos de imunogênio de peptídeo Tau Descrição Sequência SEQ ID NO Th de Clostridium tetani1 KKQYIKANSKFIGITEL 22 Th de MvF1 LSEIKGVIVHRLEGV 23 Th de Bordetella pertussis GAYARCPNGTRALTVAELRGNAEL 24 Th de Clostridium tetani2 WVRDIIDDFTNESSQKT 25 Th de difteria DSETADNLEKTVAALSILPGHGC 26 Th de Plasmodium falciparum DHEKKHAKMEKASSVFNVVNS 27 Th de Schistosoma mansoni KWFKTNAPNGVDEKHRH 28 Th de toxina da Cólera ALNIWDRFDVFCTLGATTGYLKGNS 29 Th de MvF2 ISEIKGVIVHKIEGI 30
KKKISISEIKGVIVHKIEGILF Th de KKKMvF3 31
T RT TR T KKKLFLLTKLLTLPQSLD
RRRIKII RII I L IR Th de HBsAg1 VRVV VV V I V 32
F FF F V F F
ISISEIKGVIVHKIETILF Th de MvF4 (UBITh®3) 33
T RT TR
KKKIITITRIITIPQSLD Th de HBsAg2 34
FFLL L ITTI Th de MvF5 (UBITh®1) ISITEIKGVIVHRIETILF 35 HBsAg3 Th (UBITh®2) KKKIITITRIITIITTID 36 Th de Influenza MP1_1 FVFTLTVPSER 37 Th de Influenza MP1_2 SGPLKAEIAQRLEDV 38 Th de Influenza NSP1 DRLRRDQKS 39 Th de EBV BHRF1 AGLTLSLLVICSYLFISRG 40 Th de Clostridium tetani TT1 QYIKANSKFIGITEL 41 Th de EBV EBNA-1 PGPLRESIVCYFMVFLQTHI 42 Th de Clostridium tetani TT2 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE 43 Th de Clostridium tetani TT3 KFIIKRYTPNNEIDSF 44 Th de Clostridium tetani TT4 VSIDKFRIFCKALNPK 45 Th de EBV CP VPGLYSPCRAFFNKEELL 46 Th de HCMV IE1 DKREMWMACIKELH 47 Th de EBV GP340 TGHGARTSTEPTTDY 48 Th de EBV BPLF1 KELKRQYEKKLRQ 49 Th de EBV EBNA-2 TVFYNIPPMPL 50
TABELA 3 Construtos de imunogênio de peptídeo Tau SEQ Código Descrição Sequência1 construto pTau (pT149/pT153) 51 p4578kb UBITh1-εk-kkk-ADGKTKIATPRGAAPP UBITh1-εk-kkk-(A145-P160) construto Tau 52 p4579kb UBITh1-εk-kkk-ADGKTKIATPRGAAPP UBITh1-εk-kkk-(A145-P160) construto pTau (pT175/pT181/pS185) 53 p4580kb UBITh1-εk-kkk-PAKTPPAPKTPPSSGEPP UBITh1-εk-kkk-(P172-P189) construto Tau 54 p4581kb UBITh1-εk-kkk-PAKTPPAPKTPPSSGEPP UBITh1-εk-kkk-(P172-P189) 55 p4582kb construto pTau (pS184/pY197) UBITh1-εk-kkk-(P182-P200) UBITh1-εk-kkk-PPSSGEPPKSGDRSGYSSP construto Tau 56 p4583kb UBITh1-εk-kkk-PPSSGEPPKSGDRSGYSSP UBITh1-εk-kkk-(P182-P200) construto pTau (pS199/pS202/pT205) 57 p4584kb UBITh1-εk-kkk-SGYSSPGSPGTPGSRSRTP
78/100 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 58 p4585kb construto Tau UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) UBITh1-εk-kkk-SGYSSPGSPGTPGSRSRTP construto pTau (pS198/pS208/pS210) 59 p4586kb UBITh1-εk-kkk-SGYSSPGSPGTPGSRSRTP UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 60 p4587kb construto pTau (pT212/pS214/pT217) UBITh1-εk-kkk-(R209-L224) UBITh1-εk-kkk-RSRTPTPGSRSRTPSL construto Tau 61 p4588kb UBITh1-εk-kkk-RSRTPTPGSRSRTPSL UBITh1-εk-kkk-(R209-L224) construto pTau (pT231/pS235/pS238) 62 p4589kb UBITh1-εk-kkk-VVRTPPKSPSSAKSRL UBITh1-εk-kkk-(V228-L243) 63 p4598kb construto Tau UBITh1-εk-kkk-(V228-L243) UBITh1-εk-kkk-VVRTPPKSPSSAKSRL 64 p4599kb construto pTau (pS262) UBITh1-εk-kkk-(K257-K274) UBITh1-εk-kkk-KSKIGSTENLKHQPGGGK 65 p4600kb construto Tau UBITh1-εk-kkk-(K257-K274) UBITh1-εk-kkk-KSKIGSTENLKHQPGGGK 66 p4601kb construto pTau (pS396/pS404) UBITh1-εk-kkk-(R379-L408) UBITh1-εk-kkk-RENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHL construto Tau 67 p4602kb UBITh1-εk-kkk-RENAKAKTDHGAEIVYKSPWSGDTSPRHL UBITh1-εk-kkk-(R379-L408)
construto pTau (pS293/pS301) 68 p4603kb UBITh1-εk-kkk-VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVSGGGSVQIVYK UBITh1-εk-kkk-(V275-K311; *P301->S301) construto Tau 69 p4604kb UBITh1-εk-kkk-VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYK UBITh1-εk-kkk-(V275-K311) construto pTau (pS396/pS404/pS422) 70 p4606kb UBITh1-εk-kkk-VYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQL UBITh1-εk-kkk-(V393-L425) construto Tau 71 p4605kb UBITh1-εk-kkk-VYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQL UBITh1-εk-kkk-(V393-L425) 125 p5031kb UBITh1-εk-kkk-Sl31-K141 UBITh1-εk-kkk-SKDGTGSDDKK 126 p5032kb UBITh1-εk-kkk-S241-K257 UBITh1-εk-kkk-SRLQTAPVPMPDLKNVK 127 p5033kb UBITh1-εk-kkk-L243-K259 UBITh1-εk-kkk-LQTAPVPMPDLKNVKSK 128 p5134kb UBITh1-εK-KKK-V275-K281 UBITh1-εK-KKK-VQIINKK 129 p5135kb UBITh1-εK-KKK-K281-K294 UBITh1-εk-kkk-KLDLSNVQSKCGSK 130 p5136kb UBITh1-εK-KKK-V275-K294 UBITh1-εk-kkk-VQIINKKLDLSNVQSKCGSK
79/100 131 p5137kb UBITh1-εK-KKK-K294-K311 UBITh1-εk-kkk-KDNIKHVPGGGSVQIVYK 132 p5138kb UBITh1-εK-KKK-K294-K311, P301-.S301 UBITh1-εk-kkk-KDNIKHVSGGGSVQIVYK 133 p5142kb UBITh3-εK-KKK-K257-K274 UBITh3-εK-KKK-KSKIGSTENLKHQPGGGK 134 p5143kb UBITh3-εK-KKK-R379-L408 UBITh3-εK-KKK-RENAKAKTDHGAEIVYKSPWSGDTSPRHL 135 p5158kb UBITh1-εK-KKK-K294-K311, p301 trans UBITh1-εK-KKK-KDNIKHVPGGGSVQIVYK 136 p5159kb UBITh1-εK-KKK-V275-K311, p301 trans UBITh1-εK-KKK-VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYK 137 p5160kb UBITh1-εK-KKK-D22-D34 UBITh1-εK-KKK-DRKDQGGYTMHQD 138 p5161kb UBITh1-εK-KKK-Y18-D34 UBITh1-εK-KKK-YGLGDRKDQGGYTMHQD 139 p5162kb UBITh1-εK-KKK-D22-D38 UBITh1-εK-KKK-DRKDQGGYTMHQDQEGD 140 p5183kb UBITh1-εK-KKK-l297-K311,p301 trans UBITh1-εK-KKK-IKHVPGGGSVQIVYK 141 p5184kb I297-K311,p301 trans-KKK-εK-UBITh1 IKHVPGGGSVQIVYK-KKK-εK-UBITh1 142 p5185kb UBITh1-εK-K294-K311 UBITh1-εK-KDNIKHVPGGGSVQIVYK 143 p5186kb UBITh1-εK-l297-K311 UBITh1-εK-IKHVPGGGSVQIVYK 144 p5187kb UBITh1-εK-KKK-l297-K311 UBITh1-εK-KKK-IKHVPGGGSVQIVYK 145 p5200kb UBITh3-εK-KKK-A145-P160 UBITh3-εK-KKK-ADGKTKIATPRGAAPP
146 p5201kb UBITh3-εK-KKK-V275-K311 UBITh3-εK-KKK-VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYK 147 p5404kb UBITh1-εK-KKK-N359-K370 UBITh1-εK-KKK-NITHVPGGGNKK 148 p5405kb UBITh1-εK-KKK-R349-K370 UBITh1-εK-KKK-RVQSKIGSLDNITHVPGGGNKK 149 p5406kb UBITh1-εK-KKK-V339-K370 UBITh1-εK-KKK-VKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKK 150 p5407kb UBITh1-εK-KKK-H329-K370 UBITh1-εK-KKK-HHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKK 151 p5408kb UBITh1-εK-KKK-H329-R349 UBITh1-εK-KKK-HHKPGGGQVEVKSEKLDFKDR 152 p5456kb Tau Ml-D40-KKK-εK-UBITh1 MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTD-KKK-εK-UBITh1 153 p5457kb Tau Mll-T50-KKK-εK-UBITh1 MEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQT-KKK-εK-UBITh1 154 p5458kb Tau Ml-D34-KKK-εK-UBITh1 MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQD-KKK-εK-UBITh1 155 p5459kb Tau Ml-D22-KKK-εK-UBITh1 MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGD-KKK-εK-UBITh1 1 UBITh1 – SEQ ID NO: 35; UBITh3 – SEQ ID NO: 33; Os resíduos fosforilados estão em negrito e sublinhados TABELA 4 P4607X: Análise de Regiões Antigênicas dentro da Proteína Tau (R115-V226) (com base no GenBank: AGF19246.1) SEQ Código Descrição Sequência 72 p4607a peptídeo Tau, L215-V226 LPTPPTREPKKV
80/100 73 p4607b peptídeo Tau, T205-V226 TPGSRSRTPSLPTPPTREPKKV 74 p4607c peptídeo Tau, S195-V226 SGYSSPGSPGTPGSRS RT P SLPTP PT REPKKV 75 p4607d peptídeo Tau, S185-V226 SGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKV 76 p4607e peptídeo Tau, T175-V226 TPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKV 77 p4607f peptídeo Tau, Q165-V226 QANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKV 78 p4607g peptídeo Tau, R155-V226 RGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKV
Tabela 5 p4608X: Análise de Regiões Antigênicas dentro da Proteína Tau (A227-K298) (com base no GenBank: AGF19246.1) SEQ Código Descrição Sequência 79 p4608a peptídeo Tau, V287-K298 VQSKCGSKDNIK 80 p4608b peptídeo Tau, I277-K298 IINKKLDLSNVQSKCGSKDNIK 81 p4608c peptídeo Tau, K267-K298 KrlQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIK 82 p4608d peptídeo Tau, K257-K298 KSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIK peptídeo Tau, P247- PVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNI 83 p4608e K298 K peptídeo Tau, S237- SSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNV 84 p4608f K298 QSKCGSKDNIK peptídeo Tau,A227- AVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQ 85 p4608g K298 IINKKLDLSNVQSKCGSKDNIK TABELA 6 p469X: Análise de Regiões Antigênicas dentro da Proteína Tau (H299- K370) (com base no GenBank: AGF19246.1) SEQ Código Descrição Sequência peptídeo Tau, N359- 86 p4609a N1THVPGGGNKK K370 peptídeo Tau, R349- 87 p4609b RVQSKIGSLDNITHVPGGGMKK K370 peptídeo Tau, V339- 88 p4609c VKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKK K370 peptídeo Tau, H329- 89 p4609d HHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKK K370 peptídeo Tau, T319- TSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGN 90 p4609e K370 KK peptídeo Tau, V309- VYKPVELSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLD 91 p4609f K370 NITHVPGGGNKK peptídeo Tau, H299- HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVrSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDEKD 92 p4609g K370 RVQSKlGSLDNlTHVPGGGNKK TABELA 7 P4610X: Análise de Regiões Antigênicas dentro da Proteína Tau (I371- L441) (com base no GenBank: AGF19246.1) SEQ Código Descrição Sequência 93 p4609a peptídeo Tau, E431- EVSASLAKQGL L441 94 p4609b peptídeo Tau, D421- DSPQLATLADEVSASLAKQGL L441 95 p4609c peptídeo Tau, V411-L441 VSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL 96 p4609d peptídeo Tau, G401- GDTS PRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL L441 97 p4609e peptídeo Tau, E391- EIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQG L441 L 96 p4609f peptídeo Tau, N381- NAKAKTDHGAETVYKSPWSGDTSPPHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLAD L441 EVSASLAKQGL 99 p4609g peptídeo Tau, I371-L441 IETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPWSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVD
SPQLATLADEVSASLAKQGL
TABELA 8 Sequência de proteínas Tau, isoforma de comprimento completo (441 aa) com 4R e 2N (GenBank: AGF19246.1) Sequência (SEQ ID NO: 100) MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTP 70 TAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDK 140 KAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRS 210 RTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINK 280 KLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRV 350 QSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMV 420
DSPQLATLADEVSASLAKQGL TABELA 9A Análise de imunogenicidade de construtos de peptídeo Tau (Os dados correspondem à Figura 1A) Adjuvante: ISA 51VG; CpG3 50 μg/ml; 0,2 % de tween 80 Dose de imunogênio: Principal: 400 µg/1,0 ml/dose/IM (quatro sítios de injeção, 0,25 ml/sítio); Reforços: 100 µg/0,25 ml/dose/IM Cronograma de vacinação: 0, 3 e 6 wpi Anti-p4579a (A145-P160) Anti-p4581a (P172-P189) Título Log10ELISA Título Log10ELISA (SEQ ID NO: 2) (SEQ ID NO: 4) nº Grp Imunogênio nº GP 0 wpi 3 wpi 6 wpi 9 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi 9 wpi 5811 0,15 5,07 5,12 5,42 0,11 8,05 6,70 6,03 p4579kb: construto Tau, 5812 0,11 5,11 5,05 5,15 0,08 4,81 4,76 4,99 1 UBITh1-εk-kkk-(A145-P160) 5813 0,11 9,40 7,49 5,58 0,08 5,06 5,33 5,24 SEQ ID NO: 52 médio 0,12 6,52 5,89 5,38 0,09 5,97 5,60 5,42 5814 0,11 5,89 5,46 5,26 0,08 12,54 9,44 6,81 p4581kb: construto Tau, 5815 0,09 4,52 4,96 5,05 0,07 4,99 5,89 5,45 2 UBITh1-εk-kkk-(P172-P189) 5816 0,11 5,18 5,33 5,12 0,08 4,51 5,07 5,17 SEQ ID NO: 55 médio 0,10 5,20 5,25 5,14 0,08 7,35 6,80 5,81 5817 0,11 4,60 4,97 5,36 0,08 4,40 4,52 4,72 p4583kb: construto Tau, 5818 0,12 4,57 4,67 4,95 0,10 4,55 4,86 5,06 3 UBITh1-εk-kkk-(P182-P200) 5819 0,11 4,76 4,85 4,82 0,11 4,72 4,91 4,94 SEQ ID NO: 56 médio 0,11 4,64 4,83 5,04 0,10 4,56 4,76 4,91 5820 0,09 3,09 4,33 4,20 0,09 3,32 4,67 4,66 p4585kb: construto Tau, 5821 0,10 4,21 4,95 4,92 0,09 4,51 5,05 4,93 4 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 5822 0,09 4,81 4,64 4,85 0,08 4,79 4,54 4,58 SEQ ID NO: 58 médio 0,09 4,04 4,64 4,66 0,08 4,21 4,75 4,72 5823 0,08 2,66 4,42 4,63 0,08 2,96 4,78 4,90 p4588kb: construto Tau, 5824 0,09 2,81 3,81 4,35 0,08 3,29 4,56 4,83 5 UBITh1-εk-kkk-(R209-L224) 5845 0,09 3,03 3,10 3,85 0,08 2,93 3,59 4,50 SEQ ID NO: 61 médio 0,09 2,83 3,78 4,28 0,08 3,06 4,31 4,74
5826 0,10 1,67 2,99 3,30 0,12 2,66 4,31 4,37 p4598kb: construto Tau, 5827 0,11 1,86 3,18 3,66 0,12 2,95 4,62 4,52 6 UBITh1-εk-kkk-(V228-L243) 5828 0,09 3,31 4,06 4,38 0,08 3,87 4,61 4,77 SEQ ID NO: 63 médio 0,10 2,28 3,41 3,78 0,11 3,16 4,51 4,55 5829 0,08 3,02 4,39 4,72 0,08 2,99 4,60 4,77 p4600kb: construto Tau, 5830 0,08 3,93 4,83 4,75 0,08 4,46 5,03 4,93 7 UBITh1-εk-kkk-(K257-K274) 5831 0,08 3,02 4,02 3,86 0,07 3,64 4,52 3,41 SEQ ID NO: 65 médio 0,08 3,32 4,42 4,44 0,08 3,70 4,72 4,37 5832 0,08 3,08 4,27 4,29 0,08 3,26 4,62 4,64 p4602kb: construto Tau, 5833 0,08 2,99 4,04 3,54 0,08 3,15 4,37 4,28 8 UBITh1-εk-kkk-(R379-L408) 5834 0,10 2,86 3,63 4,29 0,10 2,87 4,10 4,45 SEQ ID NO: 67 médio 0,09 2,98 3,98 4,04 0,09 3,09 4,36 4,46 5835 0,12 3,85 4,55 4,33 0,12 4,87 5,08 4,90 p4604kb: construto Tau, 5836 0,08 3,98 4,64 4,44 0,09 4,26 4,95 4,77 9 UBITh1-εk-kkk-(V275-K311) 5837 0,10 4,83 4,83 4,85 0,08 4,44 4,85 4,89 SEQ ID NO: 69 médio 0,10 4,22 4,67 4,54 0,09 4,52 4,96 4,85 5838 0,08 3,05 4,36 4,37 0,08 3,75 4,62 4,63 p4605kb: construto Tau, 5839 0,08 3,18 4,52 4,56 0,08 3,40 4,71 4,76 10 UBITh1-εk-kkk-(V393-L425) 5840 0,10 3,16 4,52 4,59 0,09 3,76 4,85 4,90 SEQ ID NO: 71 médio 0,09 3,13 4,46 4,51 0,08 3,64 4,73 4,76
TABELA 9B Análise de imunogenicidade de construtos de peptídeo Tau (Os dados correspondem à Figura 1A) Adjuvante: ISA 51VG; CpG3 50 μg/ml; 0,2% de tween 80 Dose de imunogênio: Principal: 400 µg/1,0 ml/dose/IM (quatro sítios de injeção, 0,25 ml/sítio); Reforços: 100 µg/0,25 ml/dose/IM Cronograma de vacinação: 0, 3 e 6 wpi Anti-p4583a (P182-P200) Anti-p4585a (S195-P213) Título Log10ELISA Título Log10ELISA (SEQ ID NO: 6) (SEQ ID NO: 8)
nº Grp Imunogênio nº GP 0 wpi 3 wpi 6 wpi 9 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi 9 wpi p4579kb : construto 5811 0,12 3,15 3,59 4,62 0,12 3,02 3,29 4,72 Tau, 5812 0,09 1,20 0,66 2,91 0,12 2,06 2,96 4,24 1 UBITh1-εk-kkk-(A145- 5813 0,08 3,10 3,28 3,76 0,10 3,65 4,23 4,38 P160) médio 0,10 2,48 2,51 3,76 0,11 2,91 3,49 4,45 SEQ ID NO: 52 p4581kb: construto 5814 0,08 4,65 4,83 4,65 0,10 4,42 4,78 4,53 Tau, 5815 0,08 2,36 4,25 4,52 0,10 2,23 4,31 4,52 2 UBITh1-εk-kkk-(P172- 5816 0,09 0,00 0,65 1,75 0,09 2,64 3,05 2,90 P189) médio 0,08 2,34 3,24 3,64 0,10 3,09 4,05 3,98 SEQ ID NO: 55 p4583kb: construto 5817 0,09 4,83 5,53 6,59 0,08 3,08 4,40 4,60 Tau, 5818 0,11 4,69 5,19 5,57 0,09 3,87 4,83 5,02 3 UBITh1-εk-kkk-(P182- 5819 0,12 5,04 5,59 5,34 0,10 3,81 4,90 4,93 P200) médio 0,10 4,85 5,44 5,83 0,09 3,58 4,71 4,85 SEQ ID NO: 56
5820 0,09 2,15 2,82 3,11 0,10 4,02 4,91 4,93 p4585kb: construto Tau, 5821 0,08 3,12 4,60 4,69 0,09 4,88 5,17 5,08 4 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 5822 0,08 4,31 4,29 4,36 0,08 5,80 7,07 5,62 SEQ ID NO: 58 médio 0,08 3,20 3,90 4,05 0,09 4,90 5,71 5,21
5823 0,08 0,00 3,13 3,06 0,08 0,21 3,26 3,10 p4588kb: construto Tau, 5824 0,08 0,00 2,14 2,92 0,07 0,00 1,74 2,79 5 UBITh1-εk-kkk-(R209-L224) 5845 0,09 0,00 0,00 0,00 0,08 0,00 1,39 2,62 SEQ ID NO: 61 médio 0,08 0,00 1,76 1,99 0,08 0,07 2,13 2,84
5826 0,10 0,00 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 0,85 p4598kb: construto Tau, 5827 0,12 0,00 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 0,00 6 UBITh1-εk-kkk-(V228-L243) 5828 0,09 0,00 0,00 0,52 0,09 0,00 0,00 0,39 SEQ ID NO: 63 médio 0,10 0,00 0,00 0,17 0,09 0,00 0,00 0,41 5829 0,08 0,00 2,68 3,14 0,08 0,00 2,52 3,13 p4600kb: construto Tau, 5830 0,08 0,00 2,93 2,70 0,07 0,00 2,37 1,96 7 UBITh1-εk-kkk-(K257-K274) 5831 0,08 0,00 0,28 0,00 0,07 0,00 0,00 0,00 SEQ ID NO: 65 médio 0,08 0,00 1,96 1,95 0,07 0,00 1,63 1,70
5832 0,09 0,00 0,24 1,24 0,07 0,00 0,00 0,35 p4602kb: construto Tau, 5833 0,09 0,00 1,35 0,00 0,07 0,78 2,53 0,33 8 UBITh1-εk-kkk-(R379-L408) 5834 0,10 0,00 0,00 0,00 0,08 1,52 0,00 0,00 SEQ ID NO: 67 médio 0,09 0,00 0,53 0,41 0,07 0,77 0,84 0,23
5835 0,11 0,00 0,73 0,00 0,10 1,00 3,03 2,28 p4604kb: construto Tau, 5836 0,08 2,57 2,97 2,59 0,09 0,47 0,00 0,00 9 UBITh1-εk-kkk-(V275-K311) 5837 0,08 1,78 2,99 2,79 0,08 1,02 2,58 1,94 SEQ ID NO: 69 médio 0,09 1,45 2,23 1,79 0,09 0,83 1,87 1,41 5838 0,08 0,00 3,08 2,91 0,08 0,00 3,02 2,66 p4605kb: construto Tau, 5839 0,08 0,00 3,00 3,12 0,07 0,00 2,75 2,96 10 UBITh1-εk-kkk-(V393-L425) 5840 0,09 0,66 3,04 3,18 0,08 0,00 2,92 3,10 SEQ ID NO: 71 médio 0,08 0,22 3,04 3,07 0,08 0,00 2,90 2,90
TABELA 9C Análise de imunogenicidade de construtos de peptídeo Tau (Os dados correspondem à Figura 1A) Adjuvante: ISA 51VG; CpG3 50 μg/ml; 0,2% de tween 80 Dose de imunogênio: Principal: 400 µg/1,0 ml/dose/IM (quatro sítios de injeção, 0,25 ml/sítio); Reforços: 100 µg/0,25 ml/dose/IM Cronograma de vacinação: 0, 3 e 6 wpi Anti-p4588a (R209-L224) Anti-p4598a (V228-L243) Título Log10ELISA Título Log10ELISA (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 13)
nº Grp Imunogênio nº GP 0 wpi 3 wpi 6 wpi 9 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi 9 wpi p4579kb : construto 5811 0,105 0,000 0,000 0,000 0,093 0,000 0,000 0,000 Tau, 5812 0,095 0,000 0,000 0,000 0,081 0,000 0,000 0,000 1 UBITh1-εk-kkk-(A145- 5813 0,074 0,752 0,000 0,000 0,078 0,000 0,000 0,000 P160) médio 0,091 0,251 0,000 0,000 0,084 0,000 0,000 0,000 SEQ ID NO: 52 p4581kb: construto 5814 0,071 0,000 0,000 0,000 0,074 0,000 0,000 0,000 Tau, 5815 0,070 0,000 0,000 0,000 0,075 0,000 0,000 0,000 2 UBITh1-εk-kkk-(P172- 5816 0,067 0,000 0,000 0,000 0,076 0,000 0,000 0,000 P189) SEQ ID NO: 55 médio 0,069 0,000 0,000 0,000 0,075 0,000 0,000 0,000 p4583kb: construto 5817 0,080 2,922 2,659 1,231 0,084 0,000 0,000 0,000 Tau, 5818 0,084 0,843 0,689 0,000 0,084 0,000 0,000 0,000 3 UBITh1-εk-kkk-(P182- 5819 0,092 2,483 1,984 0,033 0,097 0,000 0,000 0,000 P200) SEQ ID NO: 56 médio 0,085 2,083 1,777 0,421 0,088 0,000 0,000 0,000 p4585kb: construto 5820 0,077 3,288 3,340 3,061 0,077 0,000 2,956 0,000 Tau, 5821 0,076 1,958 0,627 0,000 0,088 0,000 0,000 0,000 4 UBITh1-εk-kkk-(S195- 5822 0,073 3,106 3,455 3,144 0,074 0,000 0,000 0,000 P213) SEQ ID NO: 58 médio 0,075 2,784 2,474 2,068 0,080 0,000 0,985 0,000 p4588kb: construto 5823 0,109 6,026 6,512 6,387 0,080 0,000 0,000 0,000 Tau, 5824 0,070 4,858 5,132 5,159 0,081 0,000 0,000 0,000 5 UBITh1-εk-kkk-(R209- 5845 0,142 5,287 5,314 7,040 0,082 0,000 0,000 0,000 L224) SEQ ID NO: 61 médio 0,107 5,390 5,653 6,195 0,081 0,000 0,000 0,000 p4598kb: construto 5826 0,083 0,000 1,053 1,759 0,086 4,514 4,778 4,929 Tau, 5827 0,094 0,000 0,218 2,044 0,098 4,966 5,146 5,138 6 UBITh1-εk-kkk-(V228- 5828 0,080 0,000 0,000 0,736 0,100 4,563 4,660 4,962 L243) SEQ ID NO: 63 médio 0,086 0,000 0,424 1,513 0,095 4,681 4,861 5,010 p4600kb: construto 5829 0,089 0,000 0,000 0,000 0,084 0,000 0,000 0,000 Tau, 5830 0,076 0,000 0,000 0,000 0,082 0,000 0,000 0,000 7 UBITh1-εk-kkk-(K257- 5831 0,073 0,000 0,000 0,000 0,082 0,000 0,000 0,000 K274) SEQ ID NO: 65 médio 0,079 0,000 0,000 0,000 0,083 0,000 0,000 0,000 p4602kb: construto 5832 0,069 2,468 2,504 1,654 0,079 0,000 0,000 0,000 Tau, 5833 0,093 1,952 2,677 2,274 0,083 0,000 0,000 0,000 8 UBITh1-εk-kkk-(R379- 5834 0,083 2,847 1,839 0,648 0,091 0,000 0,000 0,000 L408) SEQ ID NO: 67 médio 0,082 2,422 2,340 1,525 0,084 0,000 0,000 0,000 p4604kb: construto 5835 0,099 0,000 0,000 0,000 0,089 0,000 0,000 0,000 Tau, 5836 0,086 0,000 0,000 0,000 0,077 0,000 0,000 0,000 9 UBITh1-εk-kkk-(V275- 5837 0,080 0,000 0,000 0,000 0,082 0,000 0,000 0,000 K311) SEQ ID NO: 69 médio 0,088 0,000 0,000 0,000 0,083 0,000 0,000 0,000 p4605kb: construto 5838 0,077 2,752 3,484 4,146 0,076 0,000 0,000 0,000 Tau, 5839 0,070 2,538 4,371 4,716 0,079 0,000 0,000 0,000 10 UBITh1-εk-kkk-(V393- 5840 0,075 2,951 4,301 4,570 0,080 0,000 0,000 0,000 L425) SEQ ID NO: 71 médio 0,074 2,747 4,052 4,477 0,078 0,000 0,000 0,000
TABELA 9D Análise de imunogenicidade de construtos de peptídeo Tau (Os dados correspondem à Figura 1A) Adjuvante: ISA 51VG; CpG3 50 μg/ml; 0,2 % de tween 80 Dose de imunogênio: Principal: 400 µg/1,0 ml/dose/IM (quatro sítios de injeção, 0,25 ml/sítio); Reforços: 100 µg/0,25 ml/dose/IM Cronograma de vacinação: 0, 3 e 6 wpi Anti-p4600a (K257-K274) Anti-p4602a (R379-L408) Título Log10 ELISA Título Log10 ELISA (SEQ ID NO: 15) (SEQ ID NO: 17)
nº Grp Imunogênio nº GP 0 wpi 3 wpi 6 wpi 9 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi 9 wpi p4579kb : construto 5811 0,102 0,000 0,000 0,000 0,076 3,314 2,855 2,809 Tau, 5812 0,102 0,000 0,000 0,000 0,065 2,881 1,857 1,207 1 UBITh1-εk-kkk-(A145- 5813 0,083 0,000 0,000 0,000 0,064 3,113 2,407 2,778 P160) médio 0,096 0,000 0,000 0,000 0,068 3,103 2,373 2,265 SEQ ID NO: 52 p4581kb: construto Tau, 5814 0,093 0,000 0,000 0,000 0,069 3,036 2,075 0,330
UBITh1-εk-kkk-(P172- 5815 0,086 0,000 0,000 0,000 0,068 3,020 2,942 2,471 2 P189) 5816 0,103 0,000 0,000 0,000 0,073 2,791 2,711 2,393 SEQ ID NO: 55 médio 0,094 0,000 0,000 0,000 0,070 2,949 2,576 1,731 p4583kb: construto Tau, 5817 0,090 0,000 0,000 0,000 0,074 0,000 0,000 0,679
UBITh1-εk-kkk-(P182- 5818 0,087 0,000 0,000 0,000 0,083 0,000 0,000 0,000 3 P200) 5819 0,083 0,000 0,000 0,000 0,080 0,000 0,642 2,602 SEQ ID NO: 56 médio 0,087 0,000 0,000 0,000 0,079 0,000 0,214 1,094 p4585kb: construto Tau, 5820 0,078 0,000 0,000 0,000 0,073 1,094 2,307 2,171
UBITh1-εk-kkk-(S195- 5821 0,076 0,000 0,000 0,000 0,073 2,935 2,798 2,205 4 P213) 5822 0,080 0,000 0,000 0,000 0,071 3,865 3,386 3,227 SEQ ID NO: 58 médio 0,078 0,000 0,000 0,000 0,072 2,631 2,830 2,534 p4588kb: construto Tau, 5823 0,083 0,000 0,000 0,000 0,069 3,035 4,551 4,580
UBITh1-εk-kkk-(R209- 5824 0,084 0,000 0,000 0,000 0,079 3,032 2,980 3,100 5 L224) 5845 0,076 0,000 0,000 0,000 0,074 2,846 3,654 4,357 SEQ ID NO: 61 médio 0,081 0,000 0,000 0,000 0,074 2,971 3,728 4,012 p4598kb: construto Tau, 5826 0,091 0,000 0,000 0,000 0,082 3,187 3,971 4,583
UBITh1-εk-kkk-(V228- 5827 0,074 0,000 0,000 0,000 0,085 3,224 4,256 4,648 6 L243) 5828 0,073 0,000 0,000 0,000 0,075 1,762 2,510 3,068 SEQ ID NO: 63 médio 0,079 0,000 0,000 0,000 0,081 2,724 3,579 4,100 p4600kb: construto Tau, 5829 0,063 4,619 5,104 5,879 0,065 0,000 0,877 2,010
UBITh1-εk-kkk-(K257- 5830 0,067 5,125 9,486 8,478 0,069 0,000 0,000 0,000 7 K274) 5831 0,067 5,454 10,840 14,170 0,066 0,000 0,000 0,185 SEQ ID NO: 65 médio 0,066 5,066 8,477 9,509 0,067 0,000 0,292 0,732 p4602kb: construto Tau, 5832 0,071 0,000 0,000 1,879 0,205 8,520 8,112 6,557
UBITh1-εk-kkk-(R379- 5833 0,076 0,000 0,000 0,160 0,074 12,920 11,790 11,200 8 L408) 5834 0,080 0,000 0,000 2,851 0,085 9,382 10,350 8,024 SEQ ID NO: 67 médio 0,076 0,000 0,000 1,630 0,121 10,274 10,084 8,594 p4604kb: construto Tau, 5835 0,086 0,000 0,000 0,000 0,083 4,050 5,398 4,995
UBITh1-εk-kkk-(V275- 5836 0,076 0,000 0,000 0,000 0,067 4,503 4,974 4,876 9 K311) 5837 0,074 0,000 0,000 0,000 0,068 5,233 4,940 4,574 SEQ ID NO: 69 médio 0,079 0,000 0,000 0,000 0,073 4,595 5,104 4,815 p4605kb: construto Tau, 5838 0,075 0,000 0,000 0,000 0,069 4,676 4,511 4,574
UBITh1-εk-kkk-(V393- 5839 0,070 0,000 0,000 0,000 0,064 4,722 4,686 4,868 10 L425) 5840 0,077 0,000 0,000 0,000 0,070 5,202 4,954 4,846 SEQ ID NO: 71 médio 0,074 0,000 0,000 0,000 0,068 4,867 4,717 4,763
TABELA 9E Análise de imunogenicidade de construtos de peptídeo Tau (Os dados correspondem à Figura 1A) Adjuvante: ISA 51VG; CpG3 50 μg/ml; 0,2 % de tween 80 Dose de imunogênio: Principal: 400 µg/1,0 ml/dose/IM (quatro sítios de injeção, 0,25 ml/sítio); Reforços: 100 µg/0,25 ml/dose/IM Cronograma de vacinação: 0, 3 e 6 wpi Anti-p4604a (V275-K311) Anti-p4605a (V393-L425) Título Log10 ELISA Título Log10 ELISA (SEQ ID NO: 19) (SEQ ID NO: 21)
nº Grp Imunogênio nº GP 0 wpi 3 wpi 6 wpi 9 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi 9 wpi p4579kb : construto 5811 0,084 0,000 0,000 0,000 0,088 0,000 0,000 0,000 Tau, 5812 0,072 0,000 0,000 0,000 0,088 0,000 0,000 0,000 1 UBITh1-εk-kkk-(A145- 5813 0,075 0,000 0,000 0,000 0,083 0,000 0,000 0,000 P160) médio 0,077 0,000 0,000 0,000 0,086 0,000 0,000 0,000 SEQ ID NO: 52 p4581kb: construto 5814 0,075 0,000 0,000 0,000 0,078 0,000 0,000 0,000 Tau, 5815 0,072 0,000 0,000 1,342 0,070 0,000 0,000 0,000 2 UBITh1-εk-kkk-(P172- 5816 0,078 0,000 0,000 0,000 0,075 0,000 0,000 0,234 P189) SEQ ID NO: 55 médio 0,075 0,000 0,000 0,447 0,074 0,000 0,000 0,078 p4583kb: construto 5817 0,090 0,000 0,000 0,000 0,083 0,000 0,000 0,000 Tau, 5818 0,088 0,000 0,000 0,000 0,101 0,000 0,000 0,000 3 UBITh1-εk-kkk-(P182- 5819 0,086 0,000 0,000 0,000 0,090 0,000 0,000 0,301 P200) SEQ ID NO: 56 médio 0,088 0,000 0,000 0,000 0,091 0,000 0,000 0,100 p4585kb: construto 5820 0,077 0,000 0,000 0,000 0,084 0,000 0,000 0,000 Tau, 5821 0,074 0,000 0,000 0,000 0,080 0,000 0,578 0,182 4 UBITh1-εk-kkk-(S195- 5822 0,075 0,000 0,000 0,000 0,072 0,000 0,000 1,969 P213) SEQ ID NO: 58 médio 0,075 0,000 0,000 0,000 0,079 0,000 0,193 0,717 p4588kb: construto 5823 0,074 0,000 0,000 0,000 0,074 4,755 5,129 5,495 Tau, 5824 0,076 0,000 0,000 0,000 0,068 4,658 4,882 5,120 5 UBITh1-εk-kkk-(R209- 5845 0,081 0,000 0,000 0,000 0,082 4,583 4,943 5,727 L224) SEQ ID NO: 61 médio 0,077 0,000 0,000 0,000 0,075 4,665 4,985 5,447 p4598kb: construto 5826 0,120 0,000 0,000 0,000 0,112 2,883 2,688 1,790 Tau, 5827 0,097 0,000 0,000 0,000 0,090 2,910 2,322 1,864 6 UBITh1-εk-kkk-(V228- 5828 0,080 0,000 0,000 0,000 0,085 0,000 0,000 0,000 L243) SEQ ID NO: 63 médio 0,099 0,000 0,000 0,000 0,096 1,931 1,670 1,218 p4600kb: construto 5829 0,082 0,000 0,000 0,000 0,078 0,000 0,000 0,000 Tau, 5830 0,084 0,000 0,000 0,000 0,079 0,000 0,000 0,000 7 UBITh1-εk-kkk-(K257- 5831 0,084 0,000 0,000 0,000 0,069 0,000 0,000 0,000 K274) SEQ ID NO: 65 médio 0,083 0,000 0,000 0,000 0,075 0,000 0,000 0,000 p4602kb: construto 5832 0,085 5,034 4,818 4,554 0,071 2,955 2,752 2,808 Tau, 5833 0,095 5,333 4,969 4,957 0,083 3,885 4,090 4,557 8 UBITh1-εk-kkk-(R379- 5834 0,104 5,102 4,827 4,607 0,095 2,931 2,880 3,032 L408) SEQ ID NO: 67 médio 0,095 5,156 4,871 4,706 0,083 3,257 3,241 3,466 p4604kb: construto 5835 0,085 4,967 10,060 7,244 0,100 0,000 0,000 0,000 Tau, 5836 0,079 4,896 7,084 6,091 0,090 0,000 0,000 0,000 9 UBITh1-εk-kkk-(V275- 5837 0,073 5,492 5,930 5,425 0,086 0,000 0,000 1,137 K311) SEQ ID NO: 69 médio 0,079 5,118 7,691 6,253 0,092 0,000 0,000 0,379 p4605kb: construto 5838 0,079 0,000 0,000 0,000 0,090 5,709 5,234 5,387 Tau, 5839 0,086 0,000 0,000 0,000 0,069 7,296 6,288 6,562 10 UBITh1-εk-kkk-(V393- 5840 0,084 0,000 0,000 0,000 0,113 5,513 5,446 5,673 L425) SEQ ID NO: 71 médio 0,083 0,000 0,000 0,000 0,091 6,173 5,656 5,874
TABELA 10A Análise de imunogenicidade de construtos de peptídeo Tau fosforilados (Os dados correspondem à Figura 1B) Adjuvante: ISA 51VG; CpG3 50 μg/ml; 0,2% de tween 80 Dose de imunogênio: Principal: 400 µg/1,0 ml/dose/IM (quatro sítios de injeção, 0,25 ml/sítio); Reforços: 100 µg/0,25 ml/dose/IM Cronograma de vacinação: 0, 3 e 6 wpi Anti-p4578a (A145-P160) Anti-p4580a (P172-P189) Anti-p4582a (P182-P200) Título Log10ELISA Título Log10ELISA Título Log10ELISA (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 3) (SEQ ID NO: 5)
nº Grp Imunogênio nº GP 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi
5778 0,110 5,936 5,193 0,087 4,949 4,856 0,083 3,147 3,229 p4578kb: construto pTau, 5779 0,089 6,520 5,559 0,090 5,069 5,189 0,080 3,141 3,043 1 UBITh1-εk-kkk-(A145-P160) 5780 0,096 6,844 5,642 0,083 4,920 5,013 0,065 2,887 2,904 SEQ ID NO: 51 médio 0,098 6,433 5,465 0,087 4,979 5,019 0,076 3,058 3,059
5781 0,092 5,127 5,277 0,063 5,430 5,732 0,082 3,292 3,754 p4580kb: construto pTau, 5782 0,097 5,035 5,003 0,083 5,401 5,331 0,088 4,421 4,394 2 UBITh1-εk-kkk-(P172-P189) 5783 0,086 5,293 5,594 0,070 5,782 6,406 0,076 1,897 2,395 SEQ ID NO: 53 médio 0,092 5,152 5,291 0,072 5,538 5,823 0,082 3,203 3,514
5784 0,164 4,056 4,521 0,095 3,932 4,344 0,089 4,650 4,929 p4582kb: construto pTau, 5785 0,094 3,135 3,108 0,076 0,725 1,047 0,090 4,817 4,900 3 UBITh1-εk-kkk-(P182-P200) 5786 0,089 5,049 4,981 0,090 4,988 4,920 0,083 5,512 5,843 SEQ ID NO: 55 médio 0,116 4,080 4,203 0,087 3,215 3,437 0,087 4,993 5,224
5787 0,081 4,938 4,758 0,089 4,736 4,644 0,071 3,614 4,508 p4584kb: construto pTau, 5788 0,091 4,694 4,414 0,085 4,071 4,276 0,067 3,009 3,446 4 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 5789 0,074 4,958 4,729 0,091 4,659 4,557 0,089 3,985 4,383 SEQ ID NO: 57 médio 0,082 4,863 4,634 0,088 4,489 4,492 0,076 3,536 4,112
5790 0,085 4,670 4,442 0,092 4,714 4,382 0,084 4,350 4,064 p4586kb: construto pTau, 5791 0,078 4,956 4,876 0,077 4,908 4,803 0,088 4,813 4,816 5 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 5792 0,078 5,534 6,162 0,095 5,489 6,171 0,083 5,139 6,607 SEQ ID NO: 59 médio 0,080 5,053 5,160 0,088 5,037 5,119 0,085 4,767 5,162
5793 0,090 0,000 0,000 0,090 0,000 0,000 0,093 0,000 0,998 p4587kb: construto pTau, 5794 0,090 0,000 0,000 0,087 0,000 0,000 0,098 2,279 1,536 6 UBITh1-εk-kkk-(R209-L224) 5795 0,096 0,939 0,165 0,095 0,000 0,000 0,094 0,000 0,000 SEQ ID NO: 60 médio 0,092 0,313 0,055 0,091 0,000 0,000 0,095 0,760 0,845
5796 0,102 0,000 0,000 0,092 0,000 0,000 0,086 0,000 0,000 p4589kb: construto pTau, 5797 0,076 0,000 0,000 0,078 0,000 0,000 0,083 0,000 0,000 7 UBITh1-εk-kkk-(V228-L243) 5798 0,082 0,000 0,000 0,081 0,000 3,108 0,080 0,000 0,000 SEQ ID NO: 62 médio 0,087 0,000 0,000 0,084 0,000 1,036 0,083 0,000 0,000
5799 0,078 0,000 0,000 0,080 0,000 0,000 0,075 0,000 0,000 p4599kb: construto pTau, 5800 0,080 0,000 0,000 0,084 0,000 0,000 0,095 0,000 0,000 8 UBITh1-εk-kkk-(K257-K274) 5801 0,092 0,000 0,000 0,079 0,000 0,000 0,096 0,000 0,000 SEQ ID NO: 64 médio 0,083 0,000 0,000 0,081 0,000 0,000 0,089 0,000 0,000
5802 0,086 2,493 1,345 0,087 2,680 1,766 0,093 0,000 0,000 p4601kb: construto pTau, 5803 0,102 3,097 2,330 0,099 3,699 2,294 0,080 0,000 0,000 9 UBITh1-εk-kkk-(R379-L408) 5804 0,089 3,213 2,922 0,085 2,930 1,135 0,076 0,000 0,000 SEQ ID NO: 66 médio 0,092 2,934 2,199 0,090 3,103 1,732 0,083 0,000 0,000 p4603kb: construto pTau, 5805 0,075 0,000 0,000 0,087 0,000 0,000 0,085 0,000 0,000
UBITh1-εk-kkk-(V275-K311, 5806 0,085 0,000 0,000 0,084 0,000 0,000 0,081 0,000 0,000 10 P301→S301) 5807 0,074 0,000 0,000 0,084 0,000 0,000 0,088 0,000 0,000 SEQ ID NO: 68 médio 0,078 0,000 0,000 0,085 0,000 0,000 0,085 0,000 0,000
5808 0,080 0,000 0,000 0,092 0,000 0,000 0,103 0,000 0,000 p4606kb: construto pTau, 5809 0,089 0,000 0,000 0,081 0,000 0,000 0,109 0,000 0,000 11 UBITh1-εk-kkk-(V393-L425) 5810 0,081 0,000 0,000 0,069 0,000 0,000 0,096 0,000 0,000 SEQ ID NO: 70 médio 0,083 0,000 0,000 0,081 0,000 0,000 0,103 0,000 0,000
TABELA 10B Análise de imunogenicidade de construtos de peptídeo Tau fosforilados (Os dados correspondem à Figura 1B) Adjuvante: ISA 51VG; CpG3 50 μg/ml; 0,2% de tween 80 Dose de imunogênio: Principal: 400 µg/1,0 ml/dose/IM (quatro sítios de injeção, 0,25 ml/sítio); Reforços: 100 µg/0,25 ml/dose/IM Cronograma de vacinação: 0, 3 e 6 wpi Anti-p4584a (S195-P213) Anti-p4586a (S195-P213) Anti-p4587a (R209-L224) Título Log10 ELISA Título Log10 ELISA Título Log10 ELISA (SEQ ID NO: 9) (SEQ ID NO: 7) (SEQ ID NO: 10)
nº Grp Imunogênio nº GP 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi
5778 0,075 4,442 4,006 0,070 2,921 3,053 0,069 0,000 0,000 p4578kb: construto pTau, 5779 0,079 3,820 3,724 0,069 2,993 2,826 0,074 0,000 0,000 1 UBITh1-εk-kkk-(A145-P160) 5780 0,094 4,014 4,077 0,066 2,961 3,050 0,066 0,000 0,000 SEQ ID NO: 51 médio 0,083 4,092 3,936 0,068 2,958 2,976 0,070 0,000 0,000
5781 0,087 4,063 4,016 0,073 3,106 4,017 0,078 0,000 0,000 p4580kb: construto pTau, 5782 0,085 4,398 4,372 0,072 4,221 4,168 0,075 0,000 0,000 2 UBITh1-εk-kkk-(P172-P189) 5783 0,084 3,091 3,087 0,068 0,793 1,362 0,080 0,000 0,000 SEQ ID NO: 53 médio 0,085 3,851 3,825 0,071 2,707 3,182 0,078 0,000 0,000
5784 0,069 3,216 4,245 0,063 2,992 3,818 0,086 0,000 0,000 p4582kb: construto pTau, 5785 0,073 2,995 2,808 0,069 0,642 1,791 0,074 1,030 0,000 3 UBITh1-εk-kkk-(P182-P200) 5786 0,076 4,758 5,304 0,078 4,538 5,010 0,081 2,568 2,820 SEQ ID NO: 55 médio 0,073 3,656 4,119 0,070 2,724 3,540 0,080 1,199 0,940
5787 0,069 5,280 5,320 0,071 4,890 5,056 0,085 2,979 3,035 p4584kb: construto pTau, 5788 0,071 6,587 7,196 0,069 5,232 6,139 0,073 4,435 4,492 4 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 5789 0,071 5,045 5,312 0,075 4,744 5,013 0,083 2,925 2,940 SEQ ID NO: 57 médio 0,070 5,637 5,943 0,072 4,955 5,403 0,080 3,446 3,489
5790 0,076 5,185 5,545 0,083 5,475 5,314 0,086 3,082 2,865 p4586kb: construto pTau, 5791 0,075 5,345 5,635 0,079 5,163 5,357 0,079 3,249 3,093 5 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 5792 0,066 5,701 8,875 0,073 5,547 9,583 0,091 4,832 4,670 SEQ ID NO: 59 médio 0,072 5,410 6,685 0,078 5,395 6,751 0,085 3,721 3,543
5793 0,069 2,902 2,787 0,075 0,000 0,000 0,087 4,763 4,857 p4587kb: construto pTau, 5794 0,078 2,983 3,088 0,069 2,326 2,836 0,074 4,725 4,864 6 UBITh1-εk-kkk-(R209-L224) 5795 0,069 3,108 2,993 0,065 2,637 2,079 0,074 5,050 4,968 SEQ ID NO: 60 médio 0,072 2,998 2,956 0,070 1,654 1,638 0,078 4,846 4,896
5796 0,082 0,000 0,000 0,071 0,000 0,000 0,078 0,685 3,032 p4589kb: construto pTau, 5797 0,074 0,000 0,000 0,068 0,000 0,000 0,076 2,436 2,700 7 UBITh1-εk-kkk-(V228-L243) 5798 0,080 0,000 0,000 0,066 0,000 0,000 0,081 0,000 0,000 SEQ ID NO: 62 médio 0,079 0,000 0,000 0,068 0,000 0,000 0,078 1,040 1,911
5799 0,069 0,000 0,000 0,068 0,000 0,000 0,081 0,000 0,000 p4599kb: construto pTau, 5800 0,071 0,000 0,000 0,081 0,000 0,000 0,086 0,000 0,000 8 UBITh1-εk-kkk-(K257-K274) 5801 0,071 0,000 0,000 0,073 0,000 0,000 0,082 0,000 0,000 SEQ ID NO: 64 médio 0,070 0,000 0,000 0,074 0,000 0,000 0,083 0,000 0,000
5802 0,068 0,000 0,000 0,071 0,424 0,000 0,088 0,764 2,819 p4601kb: construto pTau, 5803 0,062 0,000 0,000 0,070 0,000 0,000 0,096 3,152 2,660 9 UBITh1-εk-kkk-(R379-L408) 5804 0,058 2,905 1,915 0,066 2,973 1,427 0,104 2,802 0,621 SEQ ID NO: 66 médio 0,063 0,968 0,638 0,069 1,132 0,476 0,096 2,239 2,033 p4603kb: construto pTau, 5805 0,062 0,000 0,000 0,073 0,000 0,000 0,108 0,000 0,000
UBITh1-εk-kkk-(V275-K311, 5806 0,061 0,000 0,000 0,068 0,000 0,000 0,104 0,000 0,000 10 P301→S301) 5807 0,062 0,000 0,000 0,078 0,000 0,000 0,096 0,000 0,000 SEQ ID NO: 68 médio 0,062 0,000 0,000 0,073 0,000 0,000 0,103 0,000 0,000
5808 0,074 0,000 0,000 0,102 0,000 0,000 0,111 3,418 4,861 p4606kb: construto pTau, 5809 0,064 0,000 0,000 0,079 0,000 0,000 0,106 3,321 4,861 11 UBITh1-εk-kkk-(V393-L425) 5810 0,061 0,000 0,000 0,079 0,000 0,000 0,071 3,925 3,423 SEQ ID NO: 70 médio 0,066 0,000 0,000 0,087 0,000 0,000 0,096 3,555 4,382
TABELA 10C Análise de imunogenicidade de construtos de peptídeo Tau fosforilados (Os dados correspondem à Figura 1B) Adjuvante: ISA 51VG; CpG3 50 μg/ml; 0,2% de tween 80 Dose de imunogênio: Principal: 400 µg/1,0 ml/dose/IM (quatro sítios de injeção, 0,25 ml/sítio); Reforços: 100 µg/0,25 ml/dose/IM Cronograma de vacinação: 0, 3 e 6 wpi Anti-p4589a (V228-L243) Anti-p4599a (K257-K274) Anti-p4601a (R379-L408) Título Log10ELISA Título Log10ELISA Título Log10ELISA (SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 14) (SEQ ID NO: 16)
nº Grp Imunogênio nº GP 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi
5778 0,078 0,000 0,000 0,066 0,000 0,000 0,074 3,717 3,152 p4578kb: construto pTau, 5779 0,100 0,000 0,000 0,071 0,000 0,000 0,077 3,186 3,033 1 UBITh1-εk-kkk-(A145-P160) 5780 0,107 0,000 0,000 0,074 0,000 0,000 0,086 3,242 2,855 SEQ ID NO: 51 médio 0,095 0,000 0,000 0,070 0,000 0,000 0,079 3,382 3,013 5781 0,102 0,000 0,000 0,069 0,000 0,000 0,078 3,139 3,211 p4580kb: construto pTau, 5782 0,083 0,000 0,000 0,070 0,000 0,000 0,076 2,869 2,760 2 UBITh1-εk-kkk-(P172-P189) 5783 0,093 0,000 0,000 0,067 0,000 0,000 0,082 2,823 3,188 SEQ ID NO: 53 médio 0,093 0,000 0,000 0,069 0,000 0,000 0,079 2,944 3,053
5784 0,092 0,000 0,000 0,096 0,000 0,000 0,122 0,000 0,000 p4582kb: construto pTau, 5785 0,097 0,000 0,000 0,082 0,000 0,000 0,118 0,000 0,000 3 UBITh1-εk-kkk-(P182-P200) 5786 0,070 0,000 0,000 0,080 0,000 0,000 0,073 0,000 0,000 SEQ ID NO: 55 médio 0,086 0,000 0,000 0,086 0,000 0,000 0,104 0,000 0,000
5787 0,090 0,000 0,000 0,084 0,000 0,000 0,071 4,639 4,505 p4584kb: construto pTau, 5788 0,079 0,000 0,000 0,090 0,000 0,000 0,080 4,220 4,681 4 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 5789 0,079 0,000 0,000 0,085 0,000 0,000 0,076 3,268 3,687 SEQ ID NO: 57 médio 0,083 0,000 0,000 0,086 0,000 0,000 0,076 4,042 4,291
5790 0,078 0,000 0,000 0,080 0,000 0,000 0,077 4,890 4,715 p4586kb: construto pTau, 5791 0,078 0,000 0,000 0,079 0,000 0,000 0,078 4,375 4,300 5 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 5792 0,085 0,000 0,000 0,080 0,000 0,000 0,078 4,236 3,342 SEQ ID NO: 59 médio 0,080 0,000 0,000 0,080 0,000 0,000 0,078 4,500 4,119
5793 0,095 3,155 1,806 0,115 0,000 0,000 0,108 4,500 4,740 p4587kb: construto pTau, 5794 0,062 0,639 0,000 0,072 0,000 0,000 0,075 3,827 3,816 6 UBITh1-εk-kkk-(R209-L224) 5795 0,062 2,892 2,388 0,070 0,000 0,000 0,079 4,045 4,326 SEQ ID NO: 60 médio 0,073 2,229 1,398 0,086 0,000 0,000 0,087 4,124 4,294
5796 0,077 4,738 5,004 0,089 0,000 0,000 0,096 4,608 4,879 p4589kb: construto pTau, 5797 0,063 4,970 5,077 0,073 0,000 0,000 0,076 4,752 4,739 7 UBITh1-εk-kkk-(V228-L243) 5798 0,067 4,341 4,684 0,071 0,000 0,000 0,072 3,476 4,450 SEQ ID NO: 62 médio 0,069 4,683 4,922 0,078 0,000 0,000 0,081 4,279 4,689
5799 0,083 0,000 0,000 0,073 10,440 >10 0,078 0,000 0,539 p4599kb: construto pTau, 5800 0,242 0,000 0,000 0,095 6,378 5,732 0,085 0,000 0,000 8 UBITh1-εk-kkk-(K257-K274) 5801 0,085 0,000 0,000 0,090 7,182 >10 0,097 0,000 0,000 SEQ ID NO: 64 médio 0,137 0,000 0,000 0,086 8,000 5,732 0,087 0,000 0,180
5802 0,060 0,000 0,000 0,098 0,000 0,000 0,097 9,906 >10 p4601kb: construto pTau, 5803 0,069 2,844 2,839 0,082 0,000 0,000 0,121 >10 >10 9 UBITh1-εk-kkk-(R379-L408) 5804 0,071 2,693 2,027 0,098 0,000 0,000 0,100 >10 >10 SEQ ID NO: 66 médio 0,067 1,846 1,622 0,093 0,000 0,000 0,106 9,906 >10 p4603kb: construto pTau, 5805 0,068 0,000 0,000 0,081 0,000 0,000 0,094 4,664 5,271
UBITh1-εk-kkk-(V275-K311, 5806 0,068 0,000 0,000 0,074 0,000 0,000 0,096 4,452 5,467 10 P301→S301) 5807 0,069 0,000 0,000 0,082 0,000 0,000 0,092 4,758 5,015 SEQ ID NO: 68 médio 0,068 0,000 0,000 0,079 0,000 0,000 0,094 4,625 5,251
5808 0,089 2,308 0,000 0,098 0,000 0,000 0,084 6,308 11,990 p4606kb: construto pTau, 5809 0,094 4,224 3,237 0,107 0,000 0,000 0,115 8,761 9,667 11 UBITh1-εk-kkk-(V393-L425) 5810 0,089 2,392 1,767 0,100 0,000 0,000 0,093 4,950 5,308 SEQ ID NO: 70 médio 0,091 2,975 1,668 0,102 0,000 0,000 0,097 6,673 8,988
TABELA 10D Análise de imunogenicidade de construtos de peptídeo Tau fosforilados (Os dados correspondem à Figura 1B) Adjuvante: ISA 51VG; CpG3 50 μg/ml; 0,2% de tween 80 Dose de imunogênio: Principal: 400 µg/1,0 ml/dose/IM (quatro sítios de injeção, 0,25 ml/sítio); Reforços: 100 µg/0,25 ml/dose/IM Cronograma de vacinação: 0, 3 e 6 wpi Título Log10 ELISA Anti-p4603a (V275-K311) Título Log10 ELISA Anti-p4606a (V393-L425) (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 20)
nº Grp Imunogênio nº GP 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi
5778 0,116 0,000 0,000 0,069 0,000 1,797 p4578kb: construto pTau, 5779 0,111 0,000 0,000 0,070 0,000 2,797 1 UBITh1-εk-kkk-(A145-P160) 5780 0,105 0,000 0,000 0,057 0,000 1,854 SEQ ID NO: 51 médio 0,111 0,000 0,000 0,065 0,000 2,149
5781 0,107 0,000 0,000 0,055 0,000 0,000 p4580kb: construto pTau, 5782 0,089 0,000 0,000 0,064 0,000 0,000 2 UBITh1-εk-kkk-(P172-P189) 5783 0,090 0,000 0,000 0,066 0,000 0,000 SEQ ID NO: 53 médio 0,095 0,000 0,000 0,062 0,000 0,000
5784 0,096 0,000 0,000 0,085 0,000 0,000 p4582kb: construto pTau, 5785 0,275 0,000 0,000 0,065 0,000 0,000 3 UBITh1-εk-kkk-(P182-P200) 5786 0,084 0,000 0,000 0,075 0,000 0,000 SEQ ID NO: 55 médio 0,152 0,000 0,000 0,075 0,000 0,000
5787 0,087 0,000 0,000 0,070 0,000 0,000 p4584kb: construto pTau, 5788 0,082 0,159 0,000 0,061 0,000 2,433 4 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 5789 0,079 0,000 0,000 0,058 0,000 0,000 SEQ ID NO: 57 médio 0,083 0,053 0,000 0,063 0,000 0,811
5790 0,075 0,000 0,000 0,065 0,000 0,000 p4586kb: construto pTau, 5791 0,082 0,000 0,000 0,072 0,000 0,000 5 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 5792 0,092 0,000 0,000 0,085 0,000 2,807 SEQ ID NO: 59 médio 0,083 0,000 0,000 0,074 0,000 0,936
5793 0,076 0,000 0,000 0,075 0,000 4,829 p4587kb: construto pTau, 5794 0,085 0,000 0,000 0,077 0,000 4,545 6 UBITh1-εk-kkk-(R209-L224) 5795 0,083 0,000 0,000 0,077 0,000 4,818 SEQ ID NO: 60 médio 0,081 0,000 0,000 0,076 0,000 4,731
5796 0,090 0,000 0,000 0,067 0,000 4,675 p4589kb: construto pTau, 5797 0,072 0,000 0,000 0,226 0,000 4,394 7 UBITh1-εk-kkk-(V228-L243) 5798 0,076 0,000 0,000 0,072 0,000 3,176 SEQ ID NO: 62 médio 0,079 0,000 0,000 0,122 0,000 4,082
5799 0,078 0,000 0,000 0,075 0,000 0,000 p4599kb: construto pTau, 5800 0,096 0,000 0,000 0,096 0,000 0,000 8 UBITh1-εk-kkk-(K257-K274) 5801 0,080 0,000 0,000 0,087 0,000 0,000 SEQ ID NO: 64 médio 0,085 0,000 0,000 0,086 0,000 0,000
5802 0,082 4,683 4,463 0,070 4,947 4,788 p4601kb: construto pTau, 5803 0,084 5,542 5,047 0,079 4,993 4,910 9 UBITh1-εk-kkk-(R379-L408) 5804 0,076 4,827 4,520 0,065 4,965 4,938 SEQ ID NO: 66 médio 0,081 5,017 4,677 0,071 4,968 4,879
5805 0,071 5,080 >10 0,061 0,000 0,000 p4603kb: construto pTau, 5806 0,074 4,898 >10 0,069 0,000 0,000 10 UBITh1-εk-kkk-(V275-K311, P301→S301) 5807 0,078 4,942 10,260 0,072 0,000 0,000 SEQ ID NO: 68 médio 0,074 4,973 10,260 0,067 0,000 0,000
5808 0,111 0,000 0,678 0,091 >10 >10 p4606kb: construto pTau, 5809 0,080 0,000 0,000 0,089 >10 >10 11 UBITh1-εk-kkk-(V393-L425) 5810 0,095 0,000 0,000 0,089 7,200 8,246 SEQ ID NO: 70 médio 0,095 0,000 0,226 0,090 7,200 8,246
TABELA 11A Análise de imunogenicidade de construtos de peptídeo Tau fosforilados Adjuvante: ISA 51VG; CpG3 50 μg/ml; 0,2% de tween 80 Dose de imunogênio: Principal: 400 µg/1,0 ml/dose/IM (quatro sítios de injeção, 0,25 ml/sítio); Reforços: 100 µg/0,25 ml/dose/IM Cronograma de vacinação: 0, 3, 6 wpi Anti-p4583a (P182-P200) Anti-p4585a (S195-P213) Título Log10ELISA Título Log10ELISA (SEQ ID NO: 2) (SEQ ID NO: 4)
nº Grp Imunogênio nº GP 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi
5778 0,17 5,61 5,20 0,14 4,88 4,87 p4578kb: construto pTau, 5779 0,14 5,70 5,73 0,10 4,88 5,05 1 UBITh1-εk-kkk-(A145-P160) 5780 0,11 6,26 5,81 0,09 4,76 4,95 SEQ ID NO: 51 médio 0,14 5,86 5,58 0,11 4,84 4,96 5781 0,11 5,01 5,15 0,11 5,28 5,94 p4580kb: construto pTau, 5782 0,11 4,94 4,97 0,09 5,25 5,33 2 UBITh1-εk-kkk-(P172-P189) 5783 0,11 5,18 5,18 0,09 5,79 6,06 SEQ ID NO: 53 médio 0,11 5,04 5,10 0,10 5,44 5,78 5784 0,14 3,73 4,34 0,09 3,67 4,16 p4582kb: construto pTau, 5785 0,12 2,95 2,85 0,10 0,00 0,00 3 UBITh1-εk-kkk-(P182-P200) 5786 0,13 5,00 4,87 0,12 4,96 4,81 SEQ ID NO: 55 médio 0,13 3,89 4,02 0,10 2,88 2,99 p4584kb: construto pTau, 5787 0,11 4,71 4,64 0,09 4,57 4,60 4 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 5788 0,10 4,65 4,30 0,08 3,46 3,66
SEQ ID NO: 57 5789 0,16 4,65 4,42 0,08 4,54 4,38 médio 0,12 4,67 4,45 0,08 4,19 4,21
5790 0,09 4,44 3,89 0,08 4,70 4,20 p4586kb: construto pTau, 5791 0,10 4,71 4,61 0,09 4,83 4,69 5 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 5792 0,10 5,04 5,33 0,10 5,31 5,57 SEQ ID NO: 59 médio 0,10 4,73 4,61 0,09 4,95 4,82
5793 0,11 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 p4587kb: construto pTau, 5794 0,14 0,00 0,00 0,12 0,00 0,00 6 UBITh1-εk-kkk-(R209-L224) 5795 0,11 0,14 0,00 0,10 0,00 0,00 SEQ ID NO: 60 médio 0,12 0,05 0,00 0,11 0,00 0,00 5796 0,10 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 p4589kb: construto pTau, 5797 0,09 0,00 0,00 0,08 0,00 0,00 7 UBITh1-εk-kkk-(V228-L243) 5798 0,09 0,00 0,00 0,08 0,00 0,00 SEQ ID NO: 62 médio 0,09 0,00 0,00 0,08 0,00 0,00 5799 0,09 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 p4599kb: construto pTau, 5800 0,10 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 8 UBITh1-εk-kkk-(K257-K274) 5801 0,10 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 SEQ ID NO: 64 médio 0,10 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00
5802 0,12 2,12 0,00 0,10 2,69 0,97 p4601kb: construto pTau, 5803 0,10 3,05 1,36 0,08 2,36 0,00 9 UBITh1-εk-kkk-(R379-L408) 5804 0,09 3,08 2,43 0,09 2,89 0,53 SEQ ID NO: 66 médio 0,10 2,75 1,26 0,09 2,65 0,50 5805 0,08 0,00 0,00 0,08 0,00 0,00 p4603kb: construto pTau, 5806 0,09 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 10 UBITh1-εk-kkk-(V275-K311, P301→S301) 5807 0,09 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 SEQ ID NO: 68 médio 0,09 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 5808 0,09 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 p4606kb: construto pTau, 5809 0,10 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 11 UBITh1-εk-kkk-(V393-L425) 5810 0,10 0,00 0,00 0,08 0,00 0,00 SEQ ID NO: 70 médio 0,10 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00
TABELA 11B Análise de imunogenicidade de construtos de peptídeo Tau fosforilados Adjuvante: ISA 51VG; CpG3 50 μg/ml; 0,2 % de tween 80 Dose de imunogênio: Principal: 400 µg/1,0 ml/dose/IM (quatro sítios de injeção, 0,25 ml/sítio); Reforços: 100 µg/0,25 ml/dose/IM Cronograma de vacinação: 0, 3, 6 wpi Anti-p4583a (P182-P200) Anti-p4585a (S195-P213) Título Log10ELISA Título Log10ELISA (SEQ ID NO: 6) (SEQ ID NO: 8)
nº Grp Imunogênio nº GP 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi
5778 0,11 2,70 3,06 0,13 2,96 3,16 p4578kb: construto pTau, 5779 0,09 2,29 2,70 0,11 2,69 2,94 1 UBITh1-εk-kkk-(A145-P160) 5780 0,09 2,56 2,53 0,11 3,02 3,29 SEQ ID NO: 51 médio 0,10 2,52 2,76 0,12 2,89 3,13
5781 0,09 2,45 3,32 0,12 2,78 3,09 p4580kb: construto pTau, 5782 0,09 3,41 3,72 0,11 3,28 3,59 2 UBITh1-εk-kkk-(P172-P189) 5783 0,10 0,97 1,11 0,11 0,72 0,30 SEQ ID NO: 53 médio 0,09 2,28 2,72 0,11 2,26 2,33 5784 0,10 3,23 4,60 0,09 2,78 3,64 p4582kb: construto pTau, 5785 0,10 2,74 4,31 0,13 1,24 0,87 3 UBITh1-εk-kkk-(P182-P200) 5786 0,11 4,84 5,56 0,10 4,47 4,94 SEQ ID NO: 55 médio 0,10 3,60 4,82 0,11 2,83 3,15
5787 0,09 3,00 4,41 0,10 5,06 5,43 p4584kb: construto pTau, 5788 0,09 2,54 3,54 0,09 5,53 9,14 4 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 5789 0,09 3,08 3,84 0,10 4,78 5,14 SEQ ID NO: 57 médio 0,09 2,87 3,93 0,10 5,12 6,57
5790 0,09 3,26 3,53 0,10 4,84 5,02 p4586kb: construto pTau, 5791 0,09 4,38 4,73 0,09 4,82 5,10 5 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 5792 0,10 4,85 6,71 0,08 5,18 8,62 SEQ ID NO: 59 médio 0,09 4,16 4,99 0,09 4,95 6,25
5793 0,11 0,00 0,00 0,10 2,59 2,12 p4587kb: construto pTau, 5794 0,10 0,00 0,00 0,10 3,04 3,03 6 UBITh1-εk-kkk-(R209-L224) 5795 0,09 0,00 0,00 0,10 2,82 2,49 SEQ ID NO: 60 médio 0,10 0,00 0,00 0,10 2,82 2,55 5796 0,09 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 p4589kb: construto pTau, 5797 0,08 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 7 UBITh1-εk-kkk-(V228-L243) 5798 0,08 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 SEQ ID NO: 62 médio 0,08 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00
5799 0,09 0,00 0,00 0,08 0,00 0,00 p4599kb: construto pTau, 5800 0,10 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 8 UBITh1-εk-kkk-(K257-K274) 5801 0,11 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 SEQ ID NO: 64 médio 0,10 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00
5802 0,11 0,00 0,00 0,11 0,00 0,00 p4601kb: construto pTau, 5803 0,10 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 9 UBITh1-εk-kkk-(R379-L408) 5804 0,09 0,00 0,00 0,09 2,90 1,43 SEQ ID NO: 66 médio 0,10 0,00 0,00 0,10 0,97 0,48 5805 0,08 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 p4603kb: construto pTau, 5806 0,09 0,00 0,00 0,08 0,00 0,00 10 UBITh1-εk-kkk-(V275-K311, P301→S301) 5807 0,09 0,00 0,00 0,08 0,00 0,00 SEQ ID NO: 68 médio 0,09 0,00 0,00 0,08 0,00 0,00
5808 0,15 0,00 0,00 0,08 0,00 0,00 p4606kb: construto pTau, 5809 0,11 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 11 UBITh1-εk-kkk-(V393-L425) 5810 0,12 0,00 0,00 0,11 0,00 0,00 SEQ ID NO: 70 médio 0,13 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00
TABELA 11C Análise de imunogenicidade de construtos de peptídeo Tau fosforilados Adjuvante: ISA 51VG; CpG3 50 μg/ml; 0,2 % de tween 80 Dose de imunogênio: Principal: 400 µg/1,0 ml/dose/IM (quatro sítios de injeção, 0,25 ml/sítio); Reforços: 100 µg/0,25 ml/dose/IM Cronograma de vacinação: 0, 3, 6 wpi Anti-p4588a (R209-L224) Anti-p4598a (V228-L243) Título Log10ELISA Título Log10ELISA (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 13)
nº Grp Imunogênio nº GP 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi
5778 0,10 0,00 0,00 0,20 0,00 0,00 p4578kb: construto pTau, 5779 0,09 0,00 0,00 0,11 0,00 0,00 1 UBITh1-εk-kkk-(A145-P160) 5780 0,09 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 SEQ ID NO: 51 médio 0,09 0,00 0,00 0,14 0,00 0,00
5781 0,10 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 p4580kb: construto pTau, 5782 0,08 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 2 UBITh1-εk-kkk-(P172-P189) 5783 0,08 0,00 0,00 0,11 0,00 0,00 SEQ ID NO: 53 médio 0,09 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00
5784 0,08 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 p4582kb: construto pTau, 5785 0,10 0,18 0,00 0,11 0,00 0,00 3 UBITh1-εk-kkk-(P182-P200) 5786 0,11 2,01 2,67 0,19 0,00 0,00 SEQ ID NO: 55 médio 0,10 0,73 0,89 0,13 0,00 0,00
5787 0,10 3,13 2,83 0,10 0,00 0,00 p4584kb: construto pTau, 5788 0,09 4,76 4,39 0,08 0,00 0,00 4 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 5789 0,10 1,33 2,51 0,09 0,00 0,00 SEQ ID NO: 57 médio 0,10 3,07 3,24 0,09 0,00 0,00
5790 0,09 2,35 2,55 0,09 0,00 0,00 p4586kb: construto pTau, 5791 0,08 3,33 3,26 0,09 0,00 0,00 5 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 5792 0,08 4,82 4,82 0,09 0,00 0,00 SEQ ID NO: 59 médio 0,08 3,50 3,54 0,09 0,00 0,00
5793 0,10 5,01 5,11 0,09 0,00 0,00 p4587kb: construto pTau, 5794 0,10 4,98 5,05 0,19 0,00 0,00 6 UBITh1-εk-kkk-(R209-L224) 5795 0,09 5,27 5,22 0,09 2,62 1,56 SEQ ID NO: 60 médio 0,10 5,09 5,13 0,12 0,87 0,52 5796 0,09 0,00 2,74 0,08 4,40 4,98 p4589kb: construto pTau, 5797 0,09 0,65 1,98 0,09 4,77 5,16 7 UBITh1-εk-kkk-(V228-L243) 5798 0,08 0,00 0,00 0,09 3,75 4,68 SEQ ID NO: 62 médio 0,09 0,22 1,57 0,09 4,31 4,94
5799 0,08 0,00 0,00 0,08 0,00 0,00 p4599kb: construto pTau, 5800 0,08 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 8 UBITh1-εk-kkk-(K257-K274) 5801 0,10 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 SEQ ID NO: 64 médio 0,09 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00
5802 0,09 0,00 2,28 0,18 0,00 0,00 p4601kb: construto pTau, 5803 0,08 2,95 1,69 0,09 0,00 1,47 9 UBITh1-εk-kkk-(R379-L408) 5804 0,08 2,26 0,00 0,08 0,00 0,83 SEQ ID NO: 66 médio 0,08 1,74 1,32 0,12 0,00 0,77 p4603kb: construto pTau, 5805 0,09 0,00 0,00 0,08 0,00 0,00
UBITh1-εk-kkk-(V275-K311, 5806 0,08 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 10 P301→S301) 5807 0,09 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 SEQ ID NO: 68 médio 0,09 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00
5808 0,08 3,29 4,85 0,09 0,00 0,00 p4606kb: construto pTau, 5809 0,11 3,24 4,90 0,10 2,60 0,85 11 UBITh1-εk-kkk-(V393-L425) 5810 0,09 3,16 3,17 0,10 0,00 0,00 SEQ ID NO: 70 médio 0,09 3,23 4,31 0,10 0,87 0,28
TABELA 11D Análise de imunogenicidade de construtos de peptídeo Tau fosforilados Adjuvante: ISA 51VG; CpG3 50 μg/ml; 0,2 % de tween 80 Dose de imunogênio: Principal: 400 µg/1,0 ml/dose/IM (quatro sítios de injeção, 0,25 ml/sítio); Reforços: 100 µg/0,25 ml/dose/IM Cronograma de vacinação: 0, 3, 6 wpi Anti-p4600a (K257-K274) Anti-p4602a (R379-L408) Título Log10 ELISA Título Log10 ELISA (SEQ ID NO: 15) (SEQ ID NO: 17)
nº Grp Imunogênio nº GP 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi 5778 0,17 0,00 0,00 0,20 3,48 2,87 p4578kb: construto pTau, 5779 0,09 0,00 0,00 0,10 3,10 2,93 1 UBITh1-εk-kkk-(A145-P160) 5780 0,08 0,00 0,00 0,08 3,23 2,62 SEQ ID NO: 51 médio 0,11 0,00 0,00 0,13 3,27 2,81 5781 0,08 0,00 0,00 0,08 2,88 2,67 p4580kb: construto pTau, 5782 0,08 0,00 0,00 0,08 0,32 0,00 2 UBITh1-εk-kkk-(P172-P189) 5783 0,08 0,00 0,00 0,08 2,23 2,04 SEQ ID NO: 53 médio 0,08 0,00 0,00 0,08 1,81 1,57 p4582kb: construto pTau, 5784 0,12 0,00 0,00 0,08 0,00 0,00 3 UBITh1-εk-kkk-(P182-P200) 5785 0,10 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00
SEQ ID NO: 55 5786 0,18 0,00 0,00 0,19 0,00 0,00 médio 0,13 0,00 0,00 0,12 0,00 0,00
5787 0,09 0,00 0,00 0,09 2,91 2,84 p4584kb: construto pTau, 5788 0,08 0,00 0,00 0,09 2,86 3,42 4 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 5789 0,08 0,00 0,00 0,08 1,88 0,93 SEQ ID NO: 57 médio 0,08 0,00 0,00 0,09 2,55 2,40
5790 0,09 0,00 0,00 0,08 2,99 2,83 p4586kb: construto pTau, 5791 0,08 0,00 0,00 0,08 4,20 4,03 5 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 5792 0,09 0,00 0,00 0,09 3,23 2,98 SEQ ID NO: 59 médio 0,09 0,00 0,00 0,08 3,47 3,28 5793 0,10 0,00 0,00 0,10 3,52 4,45 p4587kb: construto pTau, 5794 0,18 0,00 0,00 0,15 2,71 2,85 6 UBITh1-εk-kkk-(R209-L224) 5795 0,09 0,00 0,00 0,08 3,08 3,43 SEQ ID NO: 60 médio 0,12 0,00 0,00 0,11 3,10 3,58 5796 0,10 0,00 0,00 0,08 3,62 4,56 p4589kb: construto pTau, 5797 0,08 0,00 0,00 0,09 4,48 4,34 7 UBITh1-εk-kkk-(V228-L243) 5798 0,08 0,00 0,00 0,07 3,11 3,76 SEQ ID NO: 62 médio 0,09 0,00 0,00 0,08 3,74 4,22
5799 0,09 5,62 14,11 0,07 0,00 0,00 p4599kb: construto pTau, 5800 0,10 5,84 9,55 0,09 0,00 0,00 8 UBITh1-εk-kkk-(K257-K274) 5801 0,10 5,51 11,39 0,09 0,00 0,00 SEQ ID NO: 64 médio 0,10 5,66 11,68 0,08 0,00 0,00 5802 0,18 0,00 0,00 0,15 7,75 6,71 p4601kb: construto pTau, 5803 0,10 0,00 0,00 0,09 13,34 12,63 9 UBITh1-εk-kkk-(R379-L408) 5804 0,08 0,00 0,00 0,09 9,08 9,59 SEQ ID NO: 66 médio 0,12 0,00 0,00 0,11 10,06 9,64 5805 0,08 0,00 0,00 0,09 4,71 5,55 p4603kb: construto pTau, 5806 0,08 0,00 0,00 0,08 4,53 5,34 10 UBITh1-εk-kkk-(V275-K311, P301→S301) 5807 0,09 0,00 0,00 0,09 4,60 4,91 SEQ ID NO: 68 médio 0,08 0,00 0,00 0,09 4,61 5,27
5808 0,09 0,00 0,00 0,10 3,94 4,40 p4606kb: construto pTau, 5809 0,10 0,00 0,00 0,10 2,81 3,41 11 UBITh1-εk-kkk-(V393-L425) 5810 0,11 0,00 0,00 0,09 3,36 3,44 SEQ ID NO: 70 médio 0,10 0,00 0,00 0,10 3,37 3,75
TABELA 11E Análise de imunogenicidade de construtos de peptídeo Tau fosforilados Adjuvante: ISA 51VG; CpG3 50 μg/ml; 0,2 % de tween 80 Dose de imunogênio: Principal: 400 µg/1,0 ml/dose/IM (quatro sítios de injeção, 0,25 ml/sítio); Reforços: 100 µg/0,25 ml/dose/IM Cronograma de vacinação: 0, 3, 6 wpi Anti-p4604a (V275-K311) Anti-p4605a (V393-L425) Título Log10 ELISA Título Log10 ELISA (SEQ ID NO: 19) (SEQ ID NO: 21)
nº Grp Imunogênio nº GP 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi
5778 0,10 0,00 0,00 0,16 0,00 0,31 p4578kb: construto pTau, 5779 0,09 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 1 UBITh1-εk-kkk-(A145-P160) 5780 0,08 0,00 0,00 0,09 0,00 1,89 SEQ ID NO: 51 médio 0,09 0,00 0,00 0,11 0,00 0,73 5781 0,09 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 p4580kb: construto pTau, 5782 0,08 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 2 UBITh1-εk-kkk-(P172-P189) 5783 0,10 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 SEQ ID NO: 53 médio 0,09 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00
5784 0,09 0,00 0,00 0,11 0,00 0,00 p4582kb: construto pTau, 5785 0,11 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 3 UBITh1-εk-kkk-(P182-P200) 5786 0,10 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 SEQ ID NO: 55 médio 0,10 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00
5787 0,09 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 p4584kb: construto pTau, 5788 0,08 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 4 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 5789 0,09 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 SEQ ID NO: 57 médio 0,09 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00
5790 0,09 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 p4586kb: construto pTau, 5791 0,09 0,00 0,00 0,11 0,00 0,00 5 UBITh1-εk-kkk-(S195-P213) 5792 0,09 0,00 0,00 0,13 0,13 2,11 SEQ ID NO: 59 médio 0,09 0,00 0,00 0,11 0,04 0,70 5793 0,11 0,00 0,00 0,12 4,38 4,78 p4587kb: construto pTau, 5794 0,10 0,00 0,00 0,12 4,38 4,47 6 UBITh1-εk-kkk-(R209-L224) 5795 0,08 0,00 0,00 0,10 4,38 4,76 SEQ ID NO: 60 médio 0,10 0,00 0,00 0,11 4,38 4,67
5796 0,08 0,00 0,00 0,11 4,37 4,23 p4589kb: construto pTau, 5797 0,09 0,00 0,00 0,10 4,33 4,51 7 UBITh1-εk-kkk-(V228-L243) 5798 0,09 0,00 0,00 0,09 2,58 1,70 SEQ ID NO: 62 médio 0,09 0,00 0,00 0,10 3,76 3,48
5799 0,09 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 p4599kb: construto pTau, 5800 0,10 0,00 0,00 0,11 0,00 0,00 8 UBITh1-εk-kkk-(K257-K274) 5801 0,11 1,57 0,00 0,11 0,00 0,00 SEQ ID NO: 64 médio 0,10 0,52 0,00 0,11 0,00 0,00 5802 0,10 4,40 4,00 0,08 1,48 2,92 p4601kb: construto pTau, 5803 0,09 5,10 4,90 0,09 3,03 3,17 9 UBITh1-εk-kkk-(R379-L408) 5804 0,09 4,60 4,20 0,09 2,96 3,00 SEQ ID NO: 66 médio 0,09 4,70 4,37 0,09 2,49 3,03 p4603kb: construto pTau, 5805 0,10 4,90 12,50 0,10 0,00 0,00
UBITh1-εk-kkk-(V275-K311, 5806 0,10 4,80 13,10 0,09 0,00 0,00 10 P301→S301) 5807 0,10 4,80 7,40 0,10 0,00 0,00 SEQ ID NO: 68 médio 0,10 4,83 11,00 0,10 0,00 0,00
5808 0,10 0,00 0,00 0,11 10,14 13,15 p4606kb: construto pTau, 5809 0,13 0,00 0,00 0,12 10,14 12,89 11 UBITh1-εk-kkk-(V393-L425) 5810 0,09 0,00 0,00 0,09 5,87 6,92 SEQ ID NO: 70 médio 0,11 0,00 0,00 0,11 8,72 10,99
TABELA 12 Análise de imunogenicidade de construtos de peptídeo Tau contendo epítopo B proveniente da hiperfosforilação Tau e do sítio de agregação Adjuvante: ISA 51VG; CpG3: 50 μg/ml; 0,2 % de tween 80 Dose de imunogênio: Principal: 400 µg/1,0 ml/dose/IM quatro sítios de injeção, 0,25ml/sítio; Reforços: 100 µg/0,25 ml/dose/IM Cronograma de vacinação: 0, 3 e 6 wpi Título Log10 ELISA Anti-p5031a Título Log10 ELISA Anti-p5032a Título Log10 ELISA Anti-p5033a (131-141) (241-257) (243-259) SEQ ID NO: 101 SEQ ID NO: 102 SEQ ID NO: 103 nº Grp Imunogênio nº GP 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi
6670 0,245 3,110 4,985 0,072 0,000 3,373 0,073 0,000 0,000 p5031kb UBITh1-εk-kkk-Tau 131- 6671 0,291 4,538 5,765 0,083 2,309 4,448 0,069 0,988 3,366 1 141 6672 0,420 3,094 4,640 0,079 0,728 3,971 0,068 1,741 4,446 SEQ ID NO: 125 médio 0,319 3,581 5,130 0,078 1,012 3,931 0,070 0,910 2,604
6673 0,565 2,622 0,000 0,089 4,960 5,276 0,091 4,415 4,737 p5032kb UBITh1-εk-kkk-Tau 241- 6674 0,336 2,691 0,000 0,084 >10 10,66 0,104 5,228 4,904 2 257 6675 0,174 2,595 0,000 0,076 >10 >10 0,071 5,488 5,266 SEQ ID NO: 126 médio 0,358 2,636 0,000 0,083 4,960 7,966 0,089 5,044 4,969
6676 0,162 0,095 0,000 0,065 5,063 5,085 0,060 4,979 5,225 p5033kb UBITh1-εk-kkk-Tau 243- 6677 0,202 1,374 0,000 0,065 4,694 4,784 0,065 4,644 4,893 3 259 6678 0,306 2,219 0,000 0,075 5,088 5,055 0,063 5,557 5,968 SEQ ID NO: 127 médio 0,223 1,229 0,000 0,068 4,948 4,975 0,063 5,060 5,362
TABELA 13A Análise de imunogenicidade de construtos de peptídeo Tau derivados do epítopo B proveniente da região Tau 275-311 Adjuvante: ISA 51VG; CpG3: 50 μg/ml; 0,2 % de tween 80 Dose de imunogênio: Principal: 400 µg/1,0 ml/dose/IM quatro sítios de injeção, 0,25ml/sítio; Reforços: 100 µg/0,25 ml/dose/IM Cronograma de vacinação: 0, 3 e 6 wpi Título Log10 ELISA Anti-p5134a Título Log10 ELISA Anti-p5135a Título Log10 ELISA Anti-p5136a (275-281) (281-294) (275-294) SEQ ID NO: 104 SEQ ID NO: 105 SEQ ID NO: 106 nº Grp Imunogênio nº GP 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi
6742 0,193 0,000 2,847 0,113 0,113 0,000 0,113 0,000 2,973 p5134kb UBITh1-εk-kkk-Tau 6743 0,192 0,284 3,255 0,102 0,102 1,240 0,102 0,648 3,160 1 275-281 6744 0,181 1,133 2,164 0,109 0,109 5,208 0,109 4,416 5,134 SEQ ID NO: 128 médio 0,189 0,472 2,755 0,108 0,108 2,149 0,108 1,688 3,756
6745 0,160 1,466 1,327 0,110 0,110 7,273 0,110 10,235 7,100 p5135kb UBITh1-εk-kkk-Tau 6746 0,587 1,100 2,755 0,150 0,150 5,29 0,150 5,086 5,397 2 281-294 6747 0,269 1,509 3,056 0,103 0,103 7,733 0,103 9,398 8,508 SEQ ID NO: 129 médio 0,339 1,358 2,379 0,121 0,121 6,765 0,121 8,240 7,002
6748 0,485 0,000 1,848 0,126 0,126 6,723 0,126 5,107 >10 p5136kb UBITh1-εk-kkk-Tau 6749 0,232 1,555 1,048 0,149 0,149 7,746 0,149 6,862 >10 3 275-294 6750 0,144 0,000 2,797 0,101 0,101 5,182 0,101 5,134 5,488 SEQ ID NO: 130 médio 0,287 0,518 1,898 0,125 0,125 6,550 0,125 5,701 5,488
6751 0,339 2,714 2,356 0,125 0,125 0,377 0,125 3,116 2,954 p5137kb UBITh1-εk-kkk-Tau 6752 0,213 2,800 2,552 0,122 0,122 1,243 0,122 0,509 2,442 4 294-311 6753 0,201 2,701 2,709 0,101 0,101 0,000 0,101 3,522 3,743 SEQ ID NO: 131 médio 0,251 2,738 2,539 0,116 0,116 0,540 0,116 2,382 3,046 p5138kb 6754 0,222 2,829 2,985 0,154 0,154 2,201 0,154 1,348 2,159 UBITh1-εk-kkk-Tau 6755 0,378 2,971 3,121 0,106 0,106 1,361 0,106 0,000 0,000 5 294-311, P301 —> 6756 0,454 3,012 2,823 0,127 0,127 1,513 0,127 3,343 3,065 S301 SEQ ID NO: 132 médio 0,351 2,937 2,976 0,129 0,129 1,692 0,129 1,564 1,741
TABELA 13B Anti-p5138a (294-311, P301—>S301) Título Log10 ELISA Anti-p5137a (294-311) Título Log10 ELISA SEQ ID NO: 107 SEQ ID NO: 108 nº Grp Imunogênio nº GP 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi
6742 0,120 0,000 0,000 0,124 0,000 0,000 p5134kb 6743 0,104 0,000 0,000 0,125 0,000 0,000 1 UBITh1-εk-kkk-Tau 275-281 6744 0,114 1,075 4,557 0,096 0,804 4,514 SEQ ID NO: 128 médio 0,113 0,358 1,519 0,115 0,268 1,505
6745 0,092 0,000 0,000 0,095 0,000 0,000 p5135kb 6746 0,068 0,000 0,000 0,097 0,000 0,000 2 UBITh1-εk-kkk-Tau 281-294 6747 0,102 0,000 0,000 0,146 0,000 0,000 SEQ ID NO: 129 médio 0,087 0,000 0,000 0,113 0,000 0,000
6748 0,085 0,000 0,805 0,117 0,000 0,712 p5136kb 6749 0,086 2,787 2,896 0,096 2,892 2,715 3 UBITh1-εk-kkk-Tau 275-294 6750 0,105 0,000 2,448 0,110 0,000 2,466 SEQ ID NO: 130 médio 0,092 0,929 2,050 0,108 0,964 1,964
6751 0,097 4,910 5,151 0,130 4,927 5,122 p5137kb 6752 0,112 5,015 5,130 0,099 5,035 5,136 4 UBITh1-εk-kkk-Tau 294-311 6753 0,111 4,999 5,236 0,088 5,001 5,199 SEQ ID NO: 131 médio 0,107 4,975 5,172 0,105 4,988 5,152
6754 0,086 4,851 5,185 0,103 4,896 5,405 p5138kb UBITh1-εk-kkk-Tau 294-311, 6755 0,077 4,997 11,375 0,125 5,078 11,562 5 P301 —> S301 6756 0,080 4,945 4,957 0,108 4,960 5,034 SEQ ID NO: 132 médio 0,081 4,931 7,172 0,112 4,978 7,334
TABELA 14 Análise de imunogenicidade de construtos de peptídeo Tau de ‘revestimento difuso’ de N-terminal Tau Adjuvante: ISA 51VG; CpG3: 50 μg/ml; 0,2% de tween 80 Dose de imunogênio: Principal: 400 µg/1,0 ml/dose/IM quatro sítios de injeção, 0,25ml/sítio; Reforços: 100 µg/0,25 ml/dose/IM Cronograma de vacinação: 0, 3 e 6 wpi Título Log10 ELISA Anti-p5160a Título Log10 ELISA Anti-p5161a Título Log10 ELISA Anti-p5162a (D22-D34) (Y18-D34) (D22-D38) SEQ ID NO: 112 SEQ ID NO: 113 SEQ ID NO: 114 nº Grp Imunogênio nº GP 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi
6898 0,190 4,913 5,564 0,080 5,943 9,261 0,075 3,303 4,186 p5160kb UBITh1-εK-KKK-Tau 6899 0,205 4,786 5,002 0,071 5,356 5,206 0,084 3,316 4,188 1 D22-D34 6900 0,205 4,844 5,016 0,073 5,047 5,343 0,070 0,000 3,392 SEQ ID NO: 137 médio 0,200 4,848 5,194 0,075 5,449 6,603 0,076 2,206 3,922
6901 0,327 5,017 7,534 0,079 6,650 10,454 0,064 3,264 4,380 p5161kb UBITh1-εK-KKK-Tau 6902 0,135 3,461 4,870 0,057 4,783 5,189 0,056 2,164 3,982 2 Y18-D34 6903 0,310 3,643 5,048 0,070 4,887 5,339 0,059 1,919 3,472 SEQ ID NO: 138 médio 0,257 4,040 5,817 0,069 5,440 6,994 0,060 2,449 3,945
6904 0,159 3,471 4,139 0,062 4,883 4,862 0,055 4,600 5,408 p5162kb UBITh1-εK-KKK-Tau 6905 0,264 3,092 3,683 0,076 4,663 4,696 0,071 4,694 5,228 3 D22-D38 6906 0,117 3,316 4,505 0,081 4,826 5,004 0,063 3,726 5,091 SEQ ID NO: 139 médio 0,180 3,293 4,109 0,073 4,791 4,854 0,063 4,340 5,242
TABELA 15 Análise de imunogenicidade de construtos de peptídeo Tau contendo transP301 do local propenso à agregação de Tau Adjuvante: ISA 51VG; CpG3: 50 µg/ml; 0,2 % de tween 80 Dose de imunogênio: Principal: 400 µg/1.0 ml/dose/IM quatro sítios de injeção. 0,25 ml/sítio; Reforços: 100 µg/0,25 ml/dose/IM Cronograma de vacinação: 0, 3 e 6 wpi Anti-p5159a (275-311, P301 trans) Título Anti-p5183a (297-311, P301 trans) Título Anti-p5137a (294-311) Título Log10 ELISA Anti-p4604a (275-311) Título Log10 ELISA Log10 ELISA SEQ ID NO: 110 Log10 ELISA SEQ ID NO: 111 SEQ ID NO: 107 SEQ ID NO: 19 nº Grp Imunogênio nº GP 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi 0 wpi 3 wpi 6 wpi
6919 0,094 5,080 5,866 0,064 2,813 4,759 0,075 3,727 5,083 0 wpi 3 wpi 6 wpi p5158kb UBITh1-εK-KKK-K294- K311. 6920 0,078 >10 13,839 0,086 4,850 4,913 0,095 5,533 5,217 0,069 5,069 6,126 1 trans P301 SEQ ID NO: 135 6921 2,312 5,113 6,209 0,078 2,227 4,753 0,093 3,991 5,033 0,101 >10 11,667
99/100 médio 0,828 5,097 8,638 0,076 3,297 4,808 0,088 4,417 5,111 0,073 5,209 6,836 6922 0,097 5,532 5,772 0,090 4,683 4,774 0,080 4,911 5,006 0,081 5,139 8,210 p5159kb UBITh1-εK-KKK-V275- K311, 6923 0,084 7,204 >10 0,099 4,687 5,000 0,086 4,975 5,540 0,075 5,604 5,938 2 trans P301 SEQ ID NO: 136 6924 0,068 5,105 8,242 0,069 2,709 4,729 0,072 3,425 4,991 0,096 7,207 >10 médio 0,083 5,947 7,007 0,086 4,026 4,834 0,080 4,437 5,179 0,074 5,143 9,951
6925 0,086 5,834 7,915 0,085 4,944 5,068 0,071 4,975 5,195 0,081 5,985 7,945 p5183kb UBITh1-εK-KKK-l297- K311, trans 6926 0,063 5,245 13,971 0,072 3,510 5,111 0,071 4,898 5,792 0,061 5,991 8,297 3 P301 SEQ ID NO: 140 6927 0,077 5,446 6,285 0,069 4,525 4,792 0,063 4,829 5,118 0,059 5,307 13,885 médio 0,075 5,508 9,390 0,076 4,326 4,990 0,068 4,901 5,368 0,062 5,574 6,294
6928 0,071 3,613 5,096 0,089 2,818 3,646 0,074 1,703 4,023 0,060 5,624 9,492 p5184kb I297-K311, trans P301 KKK-εK- 6929 0,084 4,787 5,038 0,079 3,364 3,898 0,107 3,287 4,563 0,063 3,536 5,039 4 UBITh1 SEQ ID NO: 141 6930 0,079 4,959 5,109 0,077 3,506 4,645 0,078 3,005 4,781 0,065 4,806 5,058 médio 0,078 4,453 5,081 0,082 3,229 4,063 0,086 2,665 4,456 0,070 4,787 5,091
TABELA 16 Localização de região imunogênica dentro de Tau 275-311 através do mapeamento de epítopo fino Soro hiperimune (6w) p4603kb, UBITh1-εK-KKK-(V275-K311, 275 311 P301→S301) SEQ ID NO: 68 SEQ ID NO: 19 VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYK Abs (450 nm)
SEQ ID NO:156 KLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYK (281-311) 3,782 SEQ ID NO:157 DLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYK (283-311) 3,802 SEQ ID NO:158 SNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYK (285-311) 3,788 SEQ ID NO:159 VQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYK (287-311) 3,836 SEQ ID NO:160 SKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYK (289-311) 3,826 SEQ ID NO:161 CGSKDNIKHVPGGGSVQIVYK (291-311) 3,781 SEQ ID NO:162 SKDNIKHVPGGGSVQIVYK (293-311) 3,837 SEQ ID NO:163 DNIKHVPGGGSVQIVYK (295-311) 3,732 SEQ ID NO:115 IKHVPGGGSVQIVYK (297-311) 3,477 SEQ ID NO:164 HVPGGGSVQIVYK (299-311) 0,221 SEQ ID NO:165 PGGGSVQIVYK (301-311) 0,099 SEQ ID NO:166 VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGS (275-305) 0,148 SEQ ID NO:167 VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVP (275-301) 0,281 SEQ ID NO:168 VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNI (275-297) 0,303 SEQ ID NO:169 VQIINKKLDLSNVQSKCGS (275-293) 0,320 SEQ ID NO:170 VQIINKKLDLSNVQS (275-289) 0,091 SEQ ID NO:171 VQIINKKLDLS (275-285) 0,095 SEQ ID NO:19 (4604a, Tau V275-K311) 3,994

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES
1. Construção de imunógeno de peptídeo Tau, caracterizada pelo fato de que pode ser representada pelas fórmulas: (fragmento Tau) ou (fragmento Tau) em que Th é um epitopo heterólogo T helper; A é um espaçador heterólogo; (fagmento Tau) é um epitopo de célula B tendo cerca de 15 a cerca de 40 resíduos de aminoácidos de comprimento total de proteína tau da SEQ ID NO: 100; X é um alfa-COOH ou alfa-CONH2 de um aminoácido; m é de 1 a 4; e n é de 0 a cerca de 10
2. Construção de imunógeno de peptídeo Tau, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o fragmento de Tau é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1 -21 e 101 -
124.
3. Construção de imunógeno de peptídeo Tau, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, e caracterizada pelo fato de que o epitopo de Th é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 22 -50.
4. Construção de imunógeno de peptídeo Tau, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a construção de imunógeno de peptídeo é selecionado do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 51 -71 e 125 -155.
5. Construção de imunógeno de peptídeo Tau, caracterizada pelo fato de que compreende: um epitopo de célula B compreendendo cerca de 15 a cerca de 40 resíduos de aminoácido de sequência de proteína Tau de comprimento total da SEQ ID NO: 100;
um epitopo T helper compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 22 -50; e um espaçador heterólogo opcional selecionado do grupo consistindo em um aminoácido, Lys-Gly-Lys-Lys-Lys-, (alfa, epsilon-N) Lys, e epsilon-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 100), em que o epitopo de célula B é ligado covalentemente ao epitopo T helper diretamente ou através do espaçador heterólogo opcional .
6. Construção de imunógeno de peptídeo Tau, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o epitopo de célula B é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1 -21 e 101 -
124.
7. Construção de imunógeno de peptídeo Tau, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o epitopo T helper é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID N-: 22 -50.
8. Construção de imunógeno de peptídeo Tau, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o espaçador heterólogo opcional é (alfa, epsilon-N) Lys ou epsilon-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 100).
9. Construção de imunógeno de peptídeo Tau, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o epitopo T helper epitope é covalentemente ligado ao terminal amino do epitopo de célula B.
10. Construção de imunógeno de peptídeo Tau, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o epitopo T helper é covalentemente ligado ao terminal amino do epitopo de célula B através do espaçador heterólogo opcional
11. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma construção de imunógeno de peptídeo como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: a. uma construção de imunógeno de peptídeo como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4; e b. e um veículo de distribuição e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.
13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a. a construção de imunógeno de peptídeo Tau é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 51 -71 e 125 -155; e b. a construção de imunógeno de peptídeo Tau é misturada com uma oligodesoxinucleotídeo CpG (ODN) para formar um complexo imunoestimulador estabilizado.
14. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de epitopo do mesmo caracterizado pelo fato de que que se liga especificamente ao epitopo de célula B da construção de imunógeno de peptídeo Tau como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
15. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de epitopo do mesmo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de ser ligado à construção de imunógeno de peptídeo Tau.
16. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de epitopo do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente ao epitopo de célula B da construção de imunógeno de peptídeo Tau como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
17. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de epitopo do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 16.
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