CN111405908A

CN111405908A - Tau肽免疫原构建体

Info

Publication number: CN111405908A
Application number: CN201880069699.3A
Authority: CN
Inventors: 王长怡
Original assignee: United Brain Science Corp
Current assignee: United Brain Science Corp
Priority date: 2017-10-27
Filing date: 2018-10-26
Publication date: 2020-07-10
Also published as: JP2021508673A; RU2020117191A; WO2019084488A1; AU2018355574A1; EP3700558A1; SG11202003624SA; US20210101948A1; BR112020008202A2; MX2020005555A; JP2024012498A; TW201922775A; EP3700558A4; US11773148B2; KR20200083524A; CA3079236A1; TWI804521B; US20240150419A1; RU2020117191A3

Abstract

本公开是关于用以治疗及/或预防Tau蛋白病之针对Tau蛋白质部分的个别肽免疫原构建体。本公开还涉及含有肽免疫原构建体的组合物，制备和使用肽免疫原构建体的方法，以及由肽免疫原构建体产生的抗体。

Description

TAU肽免疫原构建体

本申请是要求2017年10月27日提交的美国临时申请序列号62/578,124(其通过引用并入本文整体)的权益的PCT国际申请。

技术领域

本公开是关于基于Tau蛋白质部分的肽免疫原构建体及其制剂，其可用以预防及治疗Tau蛋白病。

背景技术

Tau蛋白(或τ蛋白)是稳定微管的蛋白质(参见网站：en.wikipedia.org/wiki/Tau_protein)。中枢神经系统的神经元中富含Tau蛋白质，而其他地方较为少见，但在CNS星形胶质细胞和寡树突胶质细胞中也以非常低的水平表达。神经系统的病理学和痴呆症，例如阿兹海默病和帕金森氏症，与Tau蛋白质有关，这些蛋白质已经变得有缺陷且无法再恰当地稳定微管。

Tau蛋白质是来自单个基因选择式剪接的产物，此基因在人类中称为MAPT(微管相关蛋白质Tau)，位于17号染色体上。Tau蛋白质在1975年被鉴定为微管装配所必需的热稳定蛋白质，并从此被定性为内在无序的蛋白质。

Tau蛋白质是一种高度可溶的微管相关蛋白质(MAP)。在人类中，相较于非神经元细胞，这些蛋白质主要存在于神经元中。Tau的主要功能之一是调节轴突微管的稳定性。其他神经系统MAPs可能表现出类似的功能，如同Tau基因剔除小鼠所表明大脑发育未显示异常-可能是因为其他MAPs对Tau缺失的补偿。Tau不存在于树突中，且主要作用在轴突的远程部分，在此其提供微管稳定的但也根据需求而具有灵活性。相对之下，位于轴突近端部分中的MAP6(STOP)蛋白质实质上是固定微管，而MAP2是稳定树突中的微管。

Tau蛋白质与微管蛋白交互作用以稳定微管，并促进微管蛋白组装成微管。Tau有两种控制微管稳定性的方法：同种型和磷酸化。

成年人脑中表达长度范围介于352至441个氨基酸的六种Tau同种型；这些是通过来自MAPT转录体的选择式mRNA剪接所产生的(Fitzpatrick，et al.，2017；UniProtKB-P10636)。

同种型的特征在于其结合结构域数目。三种同种型具有三个结合结构域，而另外三种则具有四个结合结构域。结合结构域位于蛋白质的羧基端且带正电荷(使其与带负电的微管结合)。具有四个结合结构域的同种型在稳定微管方面比具有三个结合结构域的同种型更好。同种型的差别在于，在氨基端半段中存在或不存在29或58个氨基酸的插入物，以及在羧基端半段中包含或不存在由MAPT的外显子10所编码的31-氨基酸微管结合重复。包含外显子10导致产生三种Tau同种型，每种同种型具有四个重复(4R)。而在另外三种同种型中则是将其排除，每种同种型具有三个重复(3R)。四个重复(R1-R4)包含于441个氨基酸的Tau同种型中的残基244-368。

Tau是一种磷酸化蛋白质，其在最长的Tau同种型上具有79个潜在的丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)磷酸化位点。据报导，在正常Tau蛋白质的这些位点中约有30个会发生磷酸化。Tau的磷酸化受许多激酶调节，包括PKN(一种丝氨酸/苏氨酸激酶)。当PKN活化时，它使Tau磷酸化，导致微管组织的破坏。Tau的磷酸化也受到发育调节。例如，胎儿Tau在胚胎CNS中比成人Tau更高度磷酸化。由于磷酸酶的活化，所有六种同种型的磷酸化程度随着年龄而降低。与激酶一样，磷酸酶也在调节Tau的磷酸化中起作用。例如，PP2A和PP2B都存在于人脑组织中并具有使Ser396去磷酸化的能力。这些磷酸酶与Tau的结合影响了Tau与MT的结合。

Tau蛋白的过度磷酸化(Tau包涵体，pTau)可导致配对的螺旋纤丝(pairedhelical filaments)和直丝(straight filaments)的缠结的自组装，其涉及阿尔茨海默氏病、额颞叶失智症(frontotemporal dementia)和其他Tau蛋白病的致病机转。所有六种Tau同种型在阿尔茨海默氏病脑的配对的螺旋纤丝中经常以过度磷酸化的状态存在。在其他神经退行性疾病中，已经报导了富含某些Tau同种型的聚集体的沉积。当错误折叠时，这种非常可溶的蛋白质可以形成极不可溶的聚集体，其导致许多神经退行性疾病。

最近的研究表明Tau可能于阿尔茨海默氏病通过基于外泌体的机制在细胞外释放。最近指出，人类大脑不同区域的性别特异性Tau基因表达与于Tau蛋白病的表达形式和风险的性别差异有关。疾病如何发挥作用的某些方面也表明其与朊蛋白(prion)具有一些相似之处。

具有丰富丝状Tau包涵体的神经退行性疾病被称为Tau蛋白病。除阿尔茨海默氏病外，这些疾病还包括仅缠结型痴呆(tangle-only dementia)、慢性创伤性脑病变(chronictraumatic encephalopathy，CTE)、嗜银颗粒病(argyrophilic grain disease)、进行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy)、皮质基底核退化症(corticobasaldegeneration)、全脑胶质细胞Tau蛋白病(globular glial tauopathy)和皮克氏病(Pick’s disease)。与阿尔茨海默氏病不同，这些其他疾病缺乏类淀粉β斑块。在阿尔茨海默氏病、仅缠结型痴呆和慢性创伤性脑病变中，所有六种Tau同种型(3R和4R)都存在于疾病细丝中。在嗜银颗粒病、进行性核上性麻痹、皮质基底核退化症和全脑胶质细胞Tau蛋白病中，仅发现4R Tau同种型，而在皮克氏病中仅存在3R Tau包涵体。具有明显细丝形态的人类Tau蛋白病的发生导致了聚集Tau的不同分子构形异构物(molecular conformers)存在的观点。多种分子构形异构物的出现也可以解释为什么来自患有阿尔茨海默氏病个体大脑的细丝比起重组蛋白质的体外组装细丝在诱导小鼠脑中的Tau病理学方面更为有效。

重复性轻度创伤性脑损伤(TBI)现在被认为是接触性运动(特别是美式足球)以及军事爆炸的震荡力量中脑损伤的核心组成部分。它可导致慢性创伤性脑病变(CTE)，其特征在于过度磷酸化的Tau的纤维状缠结。大脑液体中高水平的Tau蛋白质与头部创伤后的恢复不良有关。

Tau假说认为Tau的过度或异常磷酸化导致正常成人Tau转变为配对的螺旋纤丝(paired helical filaments，PHF-Tau)和神经纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)。Tau蛋白质是高度可溶的微管相关蛋白质(MAP)。通过其同种型和磷酸化，Tau蛋白质与微管蛋白交互作用以稳定微管组装。Tau蛋白质构成六个同种型的家族，其具有范围介于352-441个的氨基酸。CNS中最长的同种型具有四个重复序列(R1、R2、R3和R4)和两个插入片段(总共441个氨基酸)，而最短的同种型具有三个重复序列(R1、R3和R4)且没有插入片段(总共352个氨基酸)。所有六种Tau同种型在来自AD的配对的螺旋纤丝中经常以过度磷酸化状态存在。

改变Tau的功能和同种型表达的突变导致过度磷酸化。在没有突变情况下的Tau聚集的过程尚不清楚，但可能是由于磷酸化、蛋白酶作用或暴露于聚阴离子(例如醣胺聚醣)程度增加所引起。过度磷酸化的Tau使微管解聚并将正常Tau、MAP 1(微管相关蛋白质1)、MAP 2和泛素螯合形成PHFs的缠结。这种不溶性结构破坏细胞质功能并干扰轴突运输，此可导致细胞死亡。

迄今为止，具有成本效益可用以治疗Tau蛋白病患者的定点(site-directed)肽免疫原及其制剂开发的需求仍尚未得到满足。

参考文献

1.″Tau protein，″Wikipedia，The Free Encyclopedia，website address：en.wikipedia.org/wiki/Tau_protein(accessed September 29，2017).

2.Fitzpatrick，AWP，et al.，“Cryo-EM structures of Tau filaments fromAlzheimer′s disease”，Nature，547(7662)：185-190(2017).

发明概述

本公开是关于用于治疗及/或预防Tau蛋白病的个别肽免疫原构建体，其靶向Tau蛋白质的部分。本公开也关于含有此肽免疫原构建体的组合物、制备和使用此肽免疫原构建体的方法，以及利用此肽免疫原构建体所产生的抗体。

公开的肽免疫原构建体含有约15个或更多个氨基酸。此肽免疫原构建体含有B细胞表位，其来自具有如表8所示SEQ ID NO：100氨基酸序列的人类Tau蛋白质的最长同种型(GenBank：AGF19246.1)的部分。B细胞表位可通过任选的异源性间隔物连接至衍生自病原菌蛋白质的异源性T辅助细胞(Th)表位。公开的肽免疫原构建体可刺激针对Tau的高特异性的抗体的产生。公开的肽免疫原构建体可供患有Tau蛋白病的患者作为免疫治疗的使用。

肽免疫原构建体的B细胞表位部份具有来自全长Tau蛋白质(SEQ ID NO：100)的氨基酸序列。在一些实施方案中，B细胞表位具有含有如表1所示SEQ ID NOs：1-21和101-124任一的序列。

本公开的肽免疫原构建体可含有如表2所示衍生自病原菌蛋白质的异源性Th表位氨基酸序列(例如SEQ ID NOs：22至50)。在某些实施方案中，异源性Th表位衍生自自然界的病原菌，例如白喉毒素(SEQ ID NO：26)、恶性疟原虫(SEQ ID NO：27)、霍乱毒素(SEQ IDNO：29)。在其他实施方案中，异源性Th表位为衍生自麻疹病毒融合蛋白(MVF 1至5)或B型肝炎表面抗原(HBsAg 1至3)的理想化人工Th表位，其为单一序列或组合序列(例如SEQ IDNOs：33、32和34)形式。

在一些实施方案中，肽免疫原构建体包含来自Tau的B细胞表位，其通过任选的异源性间隔物连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。在某些实施方案中，肽免疫原构建体包含具有来自Tau的氨基酸序列的B细胞抗原决定部位(SEQ ID NOs：1-21和101-124)，其通过任选的异源性间隔物连接至衍生自病原菌蛋白质的异源性Th表位(例如SEQ ID NOs：22至50)。在一些实施方案中，任选的异源性间隔物为能够将两个氨基酸及/或肽连接在一起的分子或化学结构。在某些实施方案中，间隔物是天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或其组合。在具体实施方案中，肽免疫原构建体具有如表3所示SEQ ID NOs：51-71和125-155的氨基酸序列。

本公开也关于包含Tau肽免疫原构建体的组合物。在一些实施方案中，公开的组合物包含超过一个的Tau肽免疫原构建体以涵盖来自Tau的多个B细胞表位。在某些实施方案中，组合物包含Tau肽免疫原构建体的混合物(例如SEQ ID NOs：51-71和125-155的任意组合)，其具有超过一个衍生自病原菌蛋白质的异源性Th表位，以涵盖患者的广泛遗传背景。相较于只包含单一Th肽免疫原构建体的组合物，包含肽免疫原构建体混合物的组合物在免疫接种后可导致较高百分比的反应率，以治疗Tau蛋白病。

本公开也关于用以治疗及/或预防Tau蛋白病的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含公开的肽免疫原构建体，肽免疫原构建体是以稳定的的免疫刺激复合物形式存在，此形式是藉由混合CpG寡聚体和包含肽免疫原复合物的组合物以通过静电结合所形成。这种稳定的的免疫刺激复合物可进一步增强肽免疫原构建体的免疫原性。在一些实施方案中，药物组合物包含佐剂，例如矿物盐，其包括明矾凝胶(ALHYDROGEL)、磷酸铝(ADJUPHOS)，或包括MONTANIDE ISA 51或720的油包水乳液。

本公开也关于针对公开的Tau肽免疫原构建体的抗体。具体而言，当施用受试者时，本公开的肽免疫原构建体可刺激高特异性抗体的产生，此抗体可与Tau氨基酸序列(SEQID NOs：1-21和101-124)交叉反应。利用肽免疫原构建体制造的高特异性抗体可与重组含有Tau的蛋白质交叉反应。公开的抗体利用高特异性结合至Tau，没有太多，如果有的话，则是针对用于免疫原性增强的异源性Th表位，此与使用用于肽抗原性增强的常规蛋白质或其他生物载体所制造的抗体形成鲜明对比。

本公开也包括利用公开的肽免疫原构建体及/或针对肽免疫原构建体的抗体以治疗及/或预防Tau蛋白病的方法。在一些实施方案中，用以治疗及/或预防Tau蛋白病的方法包含将包含公开的肽免疫原构建体的组合物施用宿主。在某些实施方案中，在此方法中所使用的组合物包含公开的肽免疫原构建体，此肽免疫原构建体是以稳定的的免疫刺激复合物形式存在，此稳定的的免疫刺激复合物是利用带负电的寡核苷酸(例如CpG寡聚体)通过静电结合所形成，此复合物可进一步补充佐剂(任选为矿物盐或油类以作为佐剂)，用以施用患有Tau蛋白病的患者。公开的方法也包括将肽免疫原构建体施用具有Tau蛋白病风险或已患病的宿主的给药方案、剂型和途径。

附图简述

第1A图显示当在Tau的抗原性区域上进行分析时针对非磷酸化Tau肽在初次免疫后(wpi)6周由多个Tau免疫原构建体获得的免疫血清以Log₁₀效价表示的ELISA结果。

第1B图显示当在Tau的抗原性区域上进行分析时针对磷酸化Tau肽在初次免疫后(wpi)6周由多个Tau免疫原构建体获得的免疫血清以Log₁₀效价表示的ELISA结果。

第2图显示含有Tau蛋白质单体、二聚体、三聚体和寡聚体的细胞溶胞产物的蛋白质印迹分析。不同泳道表示由每个泳道上方所示非磷酸化Tau肽免疫原构建体引发的IgG抗体(左侧)。这些肽免疫原构建体对应于表3所示的结构。分析每个抗体的结合概况并在直方图中总结(右侧)。针对Tau免疫原构建体的代表性免疫血清证明了针对多种Tau(单体、二聚体、三聚体、寡聚体和聚合物)的结合反应性。

第3A图显示相较于来自免疫前血清的抗体，在暴露于针对磷酸化Tau肽免疫原(使用的Tau肽免疫原如每一图示上方所示，浓度介于0至5μg/mL)的各种抗体后的全长Tau(Tau具有441个氨基酸)聚集程度的图形。利用聚集体的硫磺素T(ThT)染色测量Tau聚集的程度。

第3B图显示在5μg/mL的针对磷酸化Tau肽免疫原构建体的抗体和亚甲蓝(已知亚甲蓝可在体外使Tau去聚集，作为阳性对照)存在下的体外Tau聚集水平的直方图。

第4图显示在暴露于针对磷酸化或非磷酸化Tau肽免疫原(如每一图示上方所示)的抗体后的Tau聚集程度的图形。利用聚集体的硫磺素T(ThT)染色测量Tau聚集的程度。对于针对磷酸化或非磷酸化Tau免疫原的抗体发现了不同程度的抑制。

第5图显示在暴露于针对磷酸化或非磷酸化代表性Tau肽免疫原(如每一图示下方所示)的抗体后的预形成人工Tau纤维的Tau去聚集程度图形。利用聚集体的硫磺素T(ThT)染色测量Tau聚集的程度。利用来自衍生自代表性磷酸化或非磷酸化Tau免疫原的免疫血清的抗体发现了不同程度的去聚集。

第6图显示利用本公开Tau肽免疫原产生的抗磷酸化Tau和抗非磷酸化Tau IgGs的蛋白质印迹分析(在变性条件下)(如左侧所示)。利用本公开代表性Tau肽免疫原产生的抗磷酸化Tau和抗非磷酸化Tau IgGs的点印迹分析(在非变性条件下)(如右图所示)。由磷酸化Tau肽免疫原引发的抗体显示优先结合Tau的纤维和寡聚体。

第7图显示使用利用本公开磷酸化和非磷酸化Tau肽免疫原产生的代表性抗体的免疫组织化学染色。左图显示于阿尔茨海默氏病特异性与正常脑切片的结合概况；而右图显示在正常组织没有交叉反应。

第8A图显示利用由本公开磷酸化和非磷酸化Tau肽免疫原产生的代表性抗体针对纤维Tau的神经元保护的组织染色。

第8B图显示定量利用由本公开磷酸化和非磷酸化Tau肽免疫原产生的代表性抗体针对纤维Tau的神经元保护的图形。

【实施方式】

本公开是关于用于治疗及/或预防阿尔茨海默氏病及/或Tau蛋白病的个别肽免疫原构建体，其靶向Tau蛋白质的部分。本公开也关于含有此肽免疫原构建体的组合物、制备和使用此肽免疫原构建体的方法，以及利用此肽免疫原构建体所产生的抗体。

公开的肽免疫原构建体含有约15个或更多个氨基酸。此肽免疫原构建体含有B细胞表位，其来自具有如表8所示SEQ ID NO：100氨基酸序列的人类Tau蛋白质的最长同种型(GenBank：AGF19246.1)的部分。B细胞表位可通过任选的异源性间隔物连接至衍生自病原菌蛋白质的异源性T辅助细胞(Th)表位。公开的肽免疫原构建体可刺激针对Tau具有高特异性的抗体的产生。公开的肽免疫原构建体可供患有阿尔茨海默氏病及/或Tau蛋白病的患者作为免疫治疗的使用。

本公开的肽免疫原构建体可含有如表2所示衍生自病原菌蛋白质的异源性Th表位氨基酸序列(例如SEQ ID NOs：22至50)。在某些实施方案中，异源性Th表位衍生自自然界的病原菌，例如：白喉毒素(SEQ ID NO：26)、恶性疟原虫(SEQ ID NO：27)、霍乱毒素(SEQ IDNO：29)。在其他实施方案中，异源性Th表位为衍生自麻疹病毒融合蛋白(MVF 1至5)或B型肝炎表面抗原(HBsAg 1至3)的理想化人工Th表位，其为单一序列或组合序列(例如SEQ IDNOs：33、32和34)形式。

在一些实施方案中，肽免疫原构建体包含来自Tau的B细胞表位，其通过任选的异源性间隔物连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。在某些实施方案中，肽免疫原构建体包含具有来自Tau的氨基酸序列的B细胞抗原决定部位(SEQ ID NOs：1-21和101-124)，其通过任选的异源性间隔物连接至衍生自病原菌蛋白质的异源性Th表位(例如SEQ ID NOs：22至50)。在一些实施方案中，任选的异源性间隔物为能够将两个氨基酸及/或肽连接在一起的分子或化学结构。在某些实施方案中，间隔物是天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或其组合。在具体实施方案中，肽免疫原构建体具有如表4所示SEQ ID NOs：51-71和125-155的氨基酸序列。

本公开也关于包含Tau肽免疫原构建体的组合物。在一些实施方案中，公开的组合物包含超过一个的Tau肽免疫原构建体以涵盖来自Tau的多个B细胞表位。在某些实施方案中，组合物包含Tau肽免疫原构建体的混合物(例如SEQ ID NOs：51-71和125-155的任意组合)，其具有超过一个衍生自病原菌蛋白质的异源性Th表位，以涵盖患者的广泛遗传背景。相较于只包含单一肽免疫原构建体的组合物，包含肽免疫原构建体混合物的组合物在免疫接种后可导致较高百分比的反应率，以治疗阿尔茨海默氏病及/或Tau蛋白病。

本公开也关于用以治疗及/或预防阿尔茨海默氏病及/或Tau蛋白病的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含公开的肽免疫原构建体，肽免疫原构建体是以稳定的的免疫刺激复合物形式存在，此形式是藉由混合CpG寡聚体和包含肽免疫原复合物的组合物以通过静电结合所形成。这种稳定的的免疫刺激复合物可进一步增强肽免疫原构建体的免疫原性。在一些实施方案中，药物组合物包含佐剂，例如矿物盐，其包括明矾凝胶(ALHYDROGEL)、磷酸铝(ADJUPHOS)，或包括MONTANIDE ISA 51或720的油包水乳液。

本公开也包括利用公开的肽免疫原构建体及/或针对肽免疫原构建体的抗体以治疗及/或预防阿尔茨海默氏病及/或Tau蛋白病的方法。在一些实施方案中，用以治疗及/或预防阿尔茨海默氏病及/或Tau蛋白病的方法包含将包含公开的肽免疫原构建体的组合物施用宿主。在某些实施方案中，此方法中所使用的组合物包含公开的肽免疫原构建体，此肽免疫原构建体是以稳定的的免疫刺激复合物形式存在，此稳定的的免疫刺激复合物是利用带负电的寡核苷酸(例如CpG寡聚体)通过静电结合所形成，其可与进一步补充的佐剂(任选为矿物盐或油类以作为佐剂)复合，用以施用患有阿尔茨海默氏病及/或Tau蛋白病的患者。公开的方法也包括将肽免疫原构建体施用具有阿尔茨海默氏病及/或Tau蛋白病风险或已患病的宿主的给药方案、剂型和途径。

本文使用的章节标题仅用于组织的目的，不应被理解为限制所述主题。本申请中引用的所有参考文献或参考文献的部分出于任何目的通过引用明确地将整体并入本文。

除非特别说明，在此使用的所有技术和科学用语如本发明所属技术领域中具有通常知识者的通常理解具有相同意义。除非上下文清楚地指出，否则单词“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包含复数形式。类似地，单词“或(or)”是意指包括“和(and)”，除非上下文另有明确说明。因此，“包含A或B”是指包括A，或B，或A和B。更应被理解的是，用于给定多肽的所有的氨基酸大小和所有分子量或分子质量值是近似的，并且被提供作为描述之用。然而类似或等同于在此描述者的方法和材料可被用于以下所述的公开的方法、合适的方法和材料的实践或测试中。在此提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括术语的解释)为准。此外，材料、方法和实施方案仅是说明性的而非意指加以限制。

Tau肽免疫原构建体

本公开提供肽免疫原构建体，其包含具有来自Tau的氨基酸序列的B细胞表位，B细胞表位直接或是通过任选的异源性间隔物共价连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。

本文使用术语“Tau肽免疫原构建体”或“肽免疫原构建体”是指肽，其包含(a)具有来自最长Tau同种型全长序列(SEQ ID NO：100)约15个或更多个氨基酸残基的B细胞表位；(b)异源性Th表位；以及(c)任选的异源性间隔物。

在某些实施方案中，Tau肽免疫原构建体可利用此分子式表示：

(Th)_m-(A)_n-(Tau片段)-X

或

(Tau片段)-(A)_n-(Th)_m-X

其中

Th为异源性T辅助细胞表位；

A为异源性间隔物；

(Tau片段)为具有来自SEQ ID NO：100的约15至约40个氨基酸残基的B细胞表位；

X为氨基酸的α-COOH或α-CONH₂；

m为1至约4；以及

n为0至约10。

于下文描述所揭露Tau肽免疫原构建体的各种组分。

a.Tau片段

在一些实施方案中，Tau片段含有非磷酸化氨基酸(例如SEQ ID NOs：2、4、6、8、11、13、15、17、19和21)，如表1所示。在其他实施方案中，Tau片段含有磷酸化的丝氨酸及/或苏氨酸氨基酸(例如SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、10、12、14、16、18和20)，如表1所示。表1肽中所示的Tau片段和磷酸化位点是例示性的，且本公开包括SEQ ID NO：100全长Tau蛋白质的任何其他片段及/或磷酸化位点。

b.异源性T辅助细胞表位(Th表位)

本公开提供肽免疫原构建体，其包含来自Tau的B细胞表位，B细胞表位直接地或是通过任选的异源性间隔物共价连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。

于Tau肽免疫原构建体的异源性Th表位可增强Tau片段的免疫原性，其通过合理设计促进针对优化目标B细胞表位(即Tau片段)的特异性高效价抗体的产生。

本文使用术语“异源性”是指衍生自并非Tau野生型序列的部分或与其同源的氨基酸序列的氨基酸序列。因此，异源性Th表位为衍生自非天然存在于Tau的氨基酸序列的Th表位(即Th表位对Tau而言不是自体衍生的)。因为Th表位对Tau而言是异源性的，当异源性Th表位共价连接至Tau片段时，Tau的天然氨基酸序列不会向氨基端或羧基端方向延伸。

本公开的异源性Th表位可为不具有天然存在于Tau的氨基酸序列的任何Th表位。Th表位可具有衍生自任何物种(例如人类、猪、牛、狗、大鼠、小鼠、豚鼠等)的氨基酸序列。Th表位还可具有针对多种物种第2类MHC分子的混杂结合基序。在某些实施方案中，Th表位包含多个混杂的第2类MHC结合基序，以允许T辅助细胞的最大活化，从而导致免疫反应的启动和调节。优选的Th表位本身为非免疫原性的(即如果有的话，很少利用Tau肽免疫原构建体所产生的抗体是针对Th表位)，因此允许针对Tau片段的目标B细胞表位的非常集中的免疫反应。

本公开的Th表位包括，但不限于，衍生自外来病原菌的氨基酸序列，如表2(SEQ IDNOs：22至50)所例示。此外，Th表位包括理想化人工Th表位和组合的理想化人工Th表位(例如SEQ ID NOs：23和30-36)。异源性Th表位肽以组合序列(例如SEQ ID NOs：31-34)呈递，包含基于特定肽的同源物的可变残基在肽骨架内于特定位置处表示的氨基酸残基的混合物。可以利用在合成过程期间在特定位置添加选定受保护的氨基酸的混合物，而非一个特定的氨基酸，于单一过程中合成组合肽的集合。此种组合异源性Th表位肽集合可允许对具有不同遗传背景的动物广泛的Th表位覆盖。异源性Th表位肽的代表性组合序列包含如表2所示的SEQ ID NOs：31-34。本发明的Th表位肽对来自基因多样性群体的动物和患者提供广泛的反应性和免疫原性。

包含Th表位的Tau肽免疫原构建体可于与Tau片段串联的单一固相肽合成中同时产生。Th表位也可包括Th表位的免疫类似物。免疫Th类似物包括免疫增强类似物、交叉反应类似物和任何这些Th表位的片段，其足以增强或刺激对Tau片段的免疫反应。

Th表位肽的功能免疫类似物也是有效的，且被包括作为本发明的一部分。功能免疫Th类似物可包含于Th表位中从1至约5个氨基酸残基的保守性取代、添加、删除和插入，其实质上未改变Th表位的Th刺激功能。如上文针对Tau片段所描述的，可以利用天然或非天然氨基酸完成保守性取代、添加和插入。表2识别了Th表位肽的功能类似物的另一种变体。具体而言，MvF1和MvF2Th的SEQ ID NOs：23和30是MvF4和MvF5的SEQ ID NOs：33和35的功能类似物，因为利用在氨基端和羧基端将各两个氨基酸删除(SEQ ID NOs：23和30)或插入(SEQID NOs：33和35)而使其氨基酸骨架有所区别。在类似序列的这两个系列之间的差异并不会影响包含于此些序列中的Th表位的功能。因此，功能免疫Th类似物包括衍生自麻疹病毒融合蛋白MvF1-4Ths(SEQ ID NOs：23、30、31、33和35)和衍生自肝炎表面蛋白质HBsAg 1-3Ths(SEQ ID NOs：32、34和36)的Th表位的多种版本。

在Tau肽免疫原构建体中的Th表位可共价连接于Tau肽的氨基端或羧基端。在一些实施方案中，Th表位是共价连接至Tau肽的氨基端。在其他实施方案中，Th表位是共价连接至Tau肽的羧基端。在某些实施方案中，超过一个的Th表位共价连接至Tau片段。当超过一个的Th表位连接至Tau片段时，每一个Th表位可具有相同氨基酸序列或不同氨基酸序列。另外，当超过一个的Th表位连接至Tau片段时，Th表位可以任何顺序排列。例如，Th表位可连续地连接至Tau片段的氨基端，或连续地连接至Tau片段的羧基端，或当不同的Th表位共价连接至Tau片段的羧基端时，Th表位可共价连接至Tau片段的氨基端。Th表位相对于Tau片段的排列并无限制。

在一些实施方案中，Th表位直接地共价连接至Tau片段。在其他实施方案中，Th表位通过于下文进一步详细描述的异源性间隔物共价连接至Tau片段。

c.异源性间隔物

公开的Tau肽免疫原构建体任选地包含异源性间隔物，其将来自Tau的B细胞表位共价连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。

如上所述，术语“异源性”是指衍生自并非Tau野生型序列的部分或与其同源的氨基酸序列的氨基酸序列。因此，当异源性间隔物共价连接至来自Tau的B细胞表位时，Tau的天然氨基酸序列不会向氨基端或羧基端方向延伸，因为间隔物对Tau序列而言是异源性的。

间隔物为能够将两个氨基酸及/或肽连接在一起的任何分子或化学结构。依据应用的不同，间隔物的长度或极性可能会有所不同。间隔物连接可通过酰胺或羧基连结，但是其他官能基也是可能的。间隔物可包括化学化合物、天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。

间隔物可为Tau肽免疫原构建体提供结构特征。结构上，间隔物提供Th表位与Tau片段的B细胞表位的物理分离。通过间隔物的物理分离可破坏通过将Th表位连接至B细胞表位所产生的任何人工二级结构。另外，通过间隔物的表位的物理分离可消除Th细胞及/或B细胞反应之间的干扰。此外，可设计间隔物以产生或修饰肽免疫原构建体的二级结构。例如，可设计间隔物以作为柔性铰链，用以增强Th表位和B细胞表位的分离。柔性铰链间隔物也可允许所呈递的肽免疫原与适当的Th细胞和B细胞之间更有效率的交互作用，以增强对Th表位和B细胞表位的免疫反应。编码柔性铰链的序列的例示见于通常富含脯氨酸的免疫球蛋白重链铰链区。利用序列Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO：101)提供了一种作为间隔物的特别有用的柔性铰链，其中Xaa是任何氨基酸，以天门冬氨酸为优选。

间隔物也可为Tau肽免疫原构建体提供功能特征。例如，可设计间隔物以改变Tau肽免疫原构建体的总电荷，其可影响肽免疫原构建体的溶解度。此外，改变Tau肽免疫原构建体的总电荷可影响肽免疫原构建体与其他化合物和试剂结合的能力。如下文进一步详细讨论的，Tau肽免疫原构建体可通过静电结合与高度带电的寡核苷酸(例如CpG寡聚体)形成稳定的免疫刺激复合物。Tau肽免疫原构建体的总电荷对于形成这些稳定的免疫刺激复合物而言是重要的。

可作为间隔物的化学化合物包括，但不限于，(2-胺乙氧基)乙酸(AEA)、5-氨基戊酸(AVA)、6-氨基己酸(Ahx)、8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(AEEA，mini-PEG1)、12-氨基-4，7，10-三氧杂十二酸(mini-PEG2)、15-氨基-4，7，10，13-四氧杂十五烷酸(mini-PEG3)、trioxatridecan-succinamic acid(Ttds)、12-氨基十二烷酸、Fmoc-5-氨基-3-氧戊酸(O1Pen)等。

天然存在的氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天门冬酰氨酸、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、离氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。

非天然存在的氨基酸包括，但不限于，ε-N离氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、甲状腺素、γ-氨基丁酸、高丝氨酸、瓜氨酸、氨基苯甲酸、6-胺基己酸(Aca；6-胺基己酸)、巯基丙酸(MPA)、3-硝基酪氨酸、焦谷氨酸等。

Tau肽免疫原构建体中的间隔物可共价连接在Th表位和Tau肽的氨基端或羧基端。在一些实施方案中，间隔物共价连接至Th表位的羧基端和Tau肽的氨基端。在其他实施方案中，间隔物共价连接至Tau肽的羧基端和Th表位的氨基端。在某些实施方案中，可使用超过一个的间隔物，例如，当在肽免疫原构建体中存在超过一个的Th表位时。当使用超过一个的间隔物时，每个间隔物可以彼此相同或不同。此外，当肽免疫原构建体中存在超过一个的Th表位时，可利用间隔物分隔开Th表位，间隔物可为相同或不同，利用间隔物将Th表位与B细胞表位分开。间隔物相对于Th表位或Tau片段的排列没有限制。

在某些实施方案中，异源性间隔物是天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。在其他实施方案中，间隔物包含超过一个的天然存在或非天然存在的氨基酸。在具体实施方案中，间隔物为Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α，ε-N)Lys或ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ IDNO：102)。

Tau肽免疫原构建体的具体实施方案

Tau肽免疫原构建体可利用以下分子式表示：

(Th)_m-(A)_n-(Tau片段)-X

或

(Tau片段)-(A)_n-(Th)_m-X

其中

Th为异源性T辅助细胞表位；

A为异源性间隔物；(Tau片段)为具有来自SEQ ID NO：100的全长Tau蛋白质约15至约40个氨基酸残基的B细胞表位；

X为氨基酸的α-COOH或α-CONH₂；

m为1至约4；以及

n为0至约10。

在某些实施方案中，Tau肽免疫原构建体中的异源性Th表位具有选自SEQ ID NOs：51-71和125-155中的任一个及其组合的氨基酸序列，如表3所示。在具体实施方案中，Th表位具有选自SEQ ID NOs：30-36中的任一个的氨基酸序列。在某些实施方案中，Tau肽免疫原构建体包含超过一个的Th表位。

在某些实施方案中，任选的异源性间隔物是选自Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α，ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：102)中的任一个及其组合。在具体实施方案中，异源性间隔物为ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：102)。

在某些实施方案中，Tau片段具有来自SEQ ID NO：100的全长Tau蛋白质约15至约40个氨基酸残基。在具体实施方案中，Tau片段具有如表1所示以SEQ ID NOs：1-21和101-124表示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，Tau肽免疫原构建体具有选自SEQ ID NOs：51-71和125-155中任一个的氨基酸序列，如表3所示。

a.变体、同源物和功能类似物

也可使用上述免疫原肽的变体和类似物，其可诱导抗体及/或与抗体交叉反应，而此抗体是针对Tau蛋白质的优选表位。类似物(包括等位基因、物种以及诱导变体)，通常于一个、两个或几个位置上有别于天然存在的肽，通常是由于保守性取代。类似物通常展现与天然肽至少80或90％的序列同一性。一些类似物还包括非天然氨基酸或在一个、两个或几个位置上的氨基端或羧基端氨基酸的修饰。

作为功能类似物的变体可具有于氨基酸位置上的保守性取代、总电荷改变、与其他官能基共价连接或氨基酸的添加、插入或删除及/或其任意组合。

保守性取代是指一个氨基酸残基被另一个具有相似化学性质的氨基酸残基所取代。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天门冬酰氨酸和谷氨酰胺；带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；而带负电的(酸性)氨基酸包括天门冬氨酸和谷氨酸。

在一个特定实施方案中，功能类似物与原始氨基酸序列具有至少50％的同一性。在另一实施方案中，功能类似物与原始氨基酸序列具有至少80％的同一性。在又一实施方案中，功能类似物与原始氨基酸序列具有至少85％的同一性。在又一实施方案中，功能类似物与原始氨基酸序列具有至少90％的同一性。

变体还包括磷酸化残基的变化。例如，变体可包括在被磷酸化的肽内的不同残基。变体免疫原性Tau肽也可包括假磷酸化肽。假磷酸化肽是藉由用酸性氨基酸残基(例如谷氨酸和天门冬氨酸)取代Tau肽的一个或多个磷酸化的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基所产生。

组合物

本公开还提供包含公开的Tau免疫原构建体的组成

a.肽组合物

包含公开的Tau肽免疫原构建体的组合物可为液体或固体形式。液体组合物可包括不改变Tau肽免疫原构建体的结构或功能特性的水、缓冲液、溶剂、盐及/或任何其他可接受的试剂。肽组合物可含有一种或多种公开的Tau肽免疫原构建体。

b.药物组合物

本公开还关于包含公开的Tau肽免疫原构建体的药物组合物。

药物组合物可含有在药学上可接受递送系统中的载体及/或其他添加剂。因此，药物组合物可含有Tau肽免疫原构建体的药物上有效剂量以及药学上可接受的载体、佐剂及/或其它赋形剂(例如稀释剂、添加剂、稳定剂、防腐剂、助溶剂、缓冲剂等)。

药物组合物可含有一种或多种佐剂，其作用是加速、延长或增强针对Tau肽免疫原构建体的免疫反应，而本身不具有任何特异性抗原作用。药物组合物中使用的佐剂可包括油、铝盐、仿病毒颗粒(virosomes)、磷酸铝(例如

)、氢氧化铝(例如

)、liposyn、皂苷、角鲨烯、L121、

单磷酸脂质A(MPL)、QS21、ISA 35、ISA 206、ISA 50V、ISA 51、ISA 720，以及其他佐剂和乳化剂。

在一些实施方案中，药物组合物含有MONTANIDE^TM ISA 51(由植物油和二缩甘露醇油酸酯所组成的油质佐剂组合物，用以制造油包水乳液)、

80(也称为聚山梨醇酯80或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯)、CpG寡核苷酸及/或其任意组合。在其他实施方案中，药物组合物是以Emulsigen或Emulsigen D作为佐剂的水包油包水(即w/o/w)乳液。

药物组合物可配制成立即释放或缓续释放剂型。另外，可配制药物组合物用于通过免疫原包封和与微粒共同施用以诱导系统性或局部性黏膜免疫。所属技术领域中具有通常知识者很容易判定此种递送系统。

药物组合物可以以液体溶液或悬浮液形式配制成注射剂。含有Tau肽免疫原构建体的液体载体也可在注射前制备。药物组合物可利用任何适合的用法施用，例如i.d.、i.v.、i.p.、i.m.、鼻内、口服、皮下等，并且可在任何适合的递送装置中施用。在某些实施方案中，可配制药物组合物供静脉内、皮下、皮内或肌肉内施用。也可制备适用于其他给药方式的药物组合物，包括口服和鼻内应用。

药物组合物也可以适合的剂量单位形式配制。在一些实施方案中，药物组合物含有每公斤体重约0.5μg至约1mg的Tau肽免疫原构建体。药物组合物的有效剂量取决于许多不同的因素，包括施用方式、靶点、患者的生理状态、患者是人类或动物、施用的其它药物，以及处理是供预防还是治疗。通常，患者是人类，但也可治疗包括基因转基因哺乳类动物的非人类哺乳类动物。当以多剂量递送时，药物组合物可以方便地分成每个剂量单位形式的适当量。施用的剂量取决于治疗领域众所周知的受试者年龄，体重和一般健康状况。

在一些实施方案中，药物组合物含有超过一种的Tau肽免疫原构建体。含有超过一种Tau肽免疫原构建体的混合物的药物组合物允许协同性增强结构的免疫效力。含有超过一种Tau肽免疫原构建体的药物组合物可在更大的遗传群体中更为有效，这是由于广泛的第2类MHC覆盖，因此提供针对Tau肽免疫原构建体的经改善的免疫反应。

在一些实施方案中，药物组合物含有选自SEQ ID NOs：51-71和125-155的Tau肽免疫原构建体，以及其同源物、类似物及/或组合。在具体实施方案中，药物组合物含有选自SEQ ID NOs：51-71和125-155的Tau肽免疫原构建体，以及其任意组合。

含有Tau肽免疫原构建体的药物组合物可用以于施用后在宿主中引发免疫反应并产生抗体。

c.免疫刺激复合物

本公开也关于含有与CpG寡核苷酸形成免疫刺激复合物的Tau肽免疫原构建体的药物组合物。此种免疫刺激复合物特别适合作为佐剂和肽免疫原稳定剂。免疫刺激复合物呈微粒形式，其可有效地将Tau肽免疫原呈递给免疫系统的细胞以产生免疫反应。免疫刺激复合物可配制成用于肠胃外施用的悬浮液。免疫刺激复合物还可配制成w/o乳液形式，作为与矿物盐或原位凝胶聚合物结合的悬浮液，用于在肠胃外施用后将Tau肽免疫原有效递送至宿主免疫系统的细胞。

稳定的的免疫刺激复合物可藉由通过静电结合将Tau肽免疫原构建体与阴离子型分子、寡核苷酸、多核苷酸或其组合复合而形成。稳定的的免疫刺激复合物可作为免疫原递送系统并入药物组合物中。

在某些实施方案中，将Tau肽免疫原构建体设计成包含阳离子部份，其于范围为5.0至8.0的pH下带有正电荷。Tau肽免疫原构建体或结构的混合物的阳离子部份的净电荷计算是依据，每个赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)带有+1电荷，每个天门冬氨酸(D)或谷氨酸(E)带有-1电荷，以及序列中其他氨基酸所带的电荷为0。将在Tau肽免疫原构建体中的阳离子部份的电荷相加，并表示为净平均电荷。适合的肽免疫原具有净平均正电荷为+1的阳离子部份。优选地，肽免疫原具有范围大于+2的净正电荷。在一些实施方案中，Tau肽免疫原构建体的阳离子部份为异源性间隔物。在某些实施方案中，当间隔物序列为(α，ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：102)时，Tau肽免疫原构建体的阳离子部份具有+4的电荷。

如本文所述的“阴离子型分子”是指在范围为5.0至8.0的pH下带有负电荷的任何分子。在某些实施方案中，阴离子型分子是寡聚体或聚合物。寡聚体或聚合物上的净负电荷计算是依据，在寡聚体中的每个磷酸二酯或硫代磷酸酯基团带有-1电荷。适合的阴离子型寡核苷酸是具有8至64个核苷酸碱基的单链DNA分子，CpG基序的重复数在1至10的范围内。优选地，CpG免疫刺激性单链DNA分子含有18至48个核苷酸碱基，CpG基序的重复数在3至8的范围内。

更优选地，阴离子型寡核苷酸可以分子式5′X¹CGX² 3′表示，其中C和G是未甲基化的；且X¹是选自由A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)和T(胸腺嘧啶)组成的群组；且X²是C(胞嘧啶)或T(胸腺嘧啶)。或者，阴离子型寡核苷酸可以分子式5′(X³)₂CG(X⁴)₂ 3′表示，其中C和G是未甲基化的；且X³是选自由A、T或G组成的群组；且X⁴是C或T。

所得到的免疫刺激复合物呈颗粒形式，其大小通常在1-50微米的范围内，且是许多因素(包括相互作用成份的相对电荷化学计量和分子量)的函数。微粒免疫刺激复合物具有提供佐剂化和体内特异性免疫反应的向上调节的优点。此外，稳定的的免疫刺激复合物适用于通过各种方法(包括油包水乳液、矿物盐悬浮液和聚合凝胶)制备药物组合物。

抗体

本公开还提供利用Tau肽免疫原构建体所引发的抗体。

本公开Tau肽免疫原构建体包含Tau片段、异源性Th表位，以及任选的异源性间隔物，当施用宿主时Tau肽免疫原构建体可引发免疫反应和抗体的产生。Tau肽免疫原构建体设计可破坏针对自体Tau的免疫耐受，并引发可识别构型表位(而非线性表位)的位点特异性抗体的产生。

由Tau肽免疫原构建体产生的抗体可识别并结合形式为单体、二聚体、三聚体和寡聚体的Tau。

令人惊讶地，由Tau肽免疫原构建体所引发的抗体可预防Tau的聚集(抗聚集活性)，并且可以使预形成的Tau聚集体解聚(去聚集活性)。

利用本发明Tau肽免疫原构建体免疫动物产生的免疫反应证实，构建体具有能力以产生与单体、二聚体、三聚体和寡聚体形式的Tau反应的有效的定点抗体(site-directedantibodies)。

方法

本公开还涉及用以制备和使用Tau肽免疫原构建体、组合物和药物组合物的方法。

a.Tau肽免疫原构建体的制造方法

本公开的Tau肽免疫原构建体可利用普通技术人员所熟知的化学合成方法加以制备(参见例如Fields et al.，Chapter 3in Synthetic Peptides：A User’s Guide，ed.Grant，W.H.Freeman&Co.，New York，NY，1992，p.77)。Tau肽免疫原构建体可利用自动化美利弗德(Merrifield)固相合成法来合成，利用侧链受保护的氨基酸，以t-Boc或F-moc化学保护α-NH₂，在例如应用生物系统肽合成仪430A或431型(Applied Biosystems PeptideSynthesizer Model 430A或431)上进行。包含Th表位的组合数据库肽的Tau肽免疫原构建体的制备可通过提供用于在给定可变位置进行偶联的替代性氨基酸的混合物而达成。

在所希望的的Tau肽免疫原构建体组装完成后，依照标准程序处理树脂，将肽从树脂上切下，并将氨基酸侧链上的官能基切除。可利用HPLC纯化游离的肽，并利用例如氨基酸分析或定序以描述生化特性。肽的纯化和表征方法是本发明所属技术领域中具有通常知识者所熟知的。

可以控制和确定通过此化学过程所产生的肽的质量，且结果是Tau肽免疫原构建体的再现性、免疫原性和产量可以获得保证。通过固相肽合成的Tau肽免疫原构建体的制造的详细描述显示于实施例1中。

已经发现允许保留所希望的免疫活性的结构变异范围比起允许保留小分子药物特定药物活性或与生物来源药品共同产生的大分子中存在所希望的活性及非所希望的毒性的结构变异范围更具包容性。因此，具有与所希望的肽相似的色层分析和免疫学特性的肽类似物，不论是刻意设计或因合成过程错误而无法避免地作为删除序列副产物的混合物产生的，其通常如经纯化的所希望的的肽制剂具有相同的效果。只要建立严格的QC程序，以监控制造过程与产品评估过程，确保使用这些肽的终产物的再现性与有效性，则经设计的类似物与非预期的类似物的混合物也是有效的。

也可利用包括核酸分子、载体及/或宿主细胞的重组DNA技术来制备Tau肽免疫原构建体。因此，编码Tau肽免疫原构建体及其免疫功能类似物的核酸分子也包括在本公开中作为本发明的一部分。类似地，包含核酸分子的载体(包括表达载体)以及含有载体的宿主细胞也包括在本公开中作为本发明的一部分。

各种例示性实施方案也包括制造Tau肽免疫原构建体及其免疫功能类似物的方法。例如，方法可包括在表达肽及/或类似物的条件下培养宿主细胞的步骤，宿主细胞包含含有编码Tau肽免疫原构建体及/或其免疫功能类似物的核酸分子的表达载体。较长的合成肽免疫原可利用公知的重组DNA技术来合成。这些技术可于具有详细实验计划的众所周知的标准手册中加以提供。为了结构编码本发明肽的基因，将氨基酸序列反向转译以获得编码氨基酸序列的核酸序列，优选地利用对于其中具有待表达基因的生物体来说最适合的密码子。接下来，通常通过合成编码肽和任何调节因子(如有必要的话)的寡核苷酸以制造合成基因。将合成基因插入适合的克隆载体内并转染到宿主细胞中。然后在适合所选表达系统和宿主的合适条件下表达肽。利用标准方法纯化肽并描述其特性。

b.免疫刺激复合物的制造方法

各种例示性实施方案还包括制造包含Tau肽免疫原构建体和CpG寡脱氧核苷酸(ODN)分子的免疫刺激复合物的方法。稳定的的免疫刺激复合物(ISC)衍生自Tau肽免疫原构建体的阳离子部份和聚阴离子CpG ODN分子。自行组合系统是由电荷的静电中和所驱动。Tau肽免疫原构建体的阳离子部分对阴离子寡聚体的莫耳电价比例的化学计量决定缔合的程度。Tau肽免疫原构建体和CpG ODN的非共价静电结合是完全可再现的过程。此肽/CpGODN免疫刺激复合物聚集体有助于呈递至免疫系统中“专业的”抗原呈递细胞(APC)，因此可进一步增强复合物的免疫原性。在制造过程中，可轻易地描绘此些复合物的特征以控制质量。肽/CpG ISC在体内具有良好的耐受性。设计这种包含CpG ODN和Tau片段衍生的肽免疫原构建体的新颖微粒系统，以利用与CpG ODN使用相关的广义B细胞促有丝分裂(mitogenicity)，但促进平衡的Th-1/Th-2型反应。

在公开的药物组合物中的CpG ODN在由相反电荷静电中和所介导的过程中100％结合至免疫原，导致微米大小的微粒的形成。微粒形式允许来自CpG佐剂常规使用的CpG剂量的显着减少，不利的先天性免疫反应的可能性更低，且促进包括抗原呈递细胞(APC)在内的替代性免疫原处理途径。因此，此种剂型在概念上是新颖的，且通过替代的机制藉由促进免疫反应的刺激而提供潜在的优点。

c.药物组合物的制造方法

各种例示性实施方案还包括含有Tau肽免疫原构建体的药物组合物。在某些实施方案中，药物组合物使用油包水乳液和具有矿物盐的悬浮液。

为了使药物组合物可被广大群体所使用，且避免Tau聚集也成为投药目标的一部分，安全性成为另一个需要考虑的重要因素。尽管在临床试验中对于许多剂型而言在人类使用油包水乳液，但基于其安全性，明矾仍然是制剂中使用的主要佐剂。因此，明矾或其矿物盐磷酸铝(ADJUPHOS)经常作为制剂中的佐剂供临床应用。

其他佐剂和免疫刺激剂包括3De-O-acylated monophosphoryl lipid A(MPL)或3-DMP、聚合或单体氨基酸，例如聚谷氨酸或聚离氨酸。此种佐剂可以与或不与其他特定的免疫刺激剂一起使用，免疫刺激剂例如muramyl peptides(例如N-acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamine(thr-MDP)、N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine(nor-MDP)、

N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2-(1′-2′

dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamine(MTP-PE)、

N-acetylglucsaminyl-N-acetylmuramyl-L-A1-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxypropylamide(DTP-DPP)Theramide^TM)，或其他细菌细胞壁成份。水包油乳液包含MF59(参见Van Nest等人的专利申请案WO 90/14837，其通过引用整体并入本文)，包含5％角鲨烯、0.5％Tween 80，以及0.5％Span 85(任选含有不同量的MTP-PE)，利用微射流机配制成次微米颗粒；SAF，包含10％角鲨烯、0.4％Tween 80、5％pluronic-嵌段共聚合物L121，以及thr-MDP，利用微射流化形成次微米乳液或利用漩涡震荡以产生大颗粒乳液；以及Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi ImmunoChem，Hamilton，Mont.)，其包含2％角鲨烯、0.2％Tween 80，以及一种或多种的细菌细胞壁成份，细菌细胞壁成份选自由monophosphoryl lipid A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)以及细胞壁骨架(CWS)组成的群组，优选为MPL+CWS(Detox^TM)。其他佐剂包含弗氏完全佐剂(CFA)、弗氏不完全佐剂(IFA)，以及细胞因子(例如介白素(IL-1、IL-2和IL-12)、巨噬细胞群落刺激因子(M-CSF)，以及肿瘤坏死因子(TNF))。

佐剂的选择取决于含有佐剂的免疫原制剂的稳定性、给药途径、给药计划、佐剂对接种疫苗的物种的效力，且在人类中药学上可接受的佐剂是指已经被相关监管机构批准或可批准用于人类给药的佐剂。例如单独明矾、MPL或弗氏不完全佐剂(Chang et al.，Advanced Drug Delivery Reviews 32：173-186(1998)，其通过引用整体并入本文)或适合人类施用的其任选地所有组合。

组合物可包括药学上可接受的无毒载体或稀释剂，其被定义为通常用于配制供动物或人类给药的药物组合物的载体。选择稀释剂以免影响此结合的生物活性。此种稀释剂的范例是蒸馏水、生理磷酸缓冲盐水、林格氏液、葡萄糖溶液和汉克溶液。此外，药物组合物或剂型还可包含其他载体、佐剂或无毒的，非治疗性的，非免疫原性的稳定剂等。

药物组合物还可包括大的缓慢代谢的大分子(例如蛋白质、多醣类(例如甲壳素)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚合物(例如胶乳功能化琼脂糖(latex functionalizedsepharose)、琼脂糖(agarose)、纤维素等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物，以及脂质聚集体(例如油滴或脂质体)。另外，这些载体可作为免疫刺激剂(即佐剂)。

本发明的药物组合物可进一步包含合适的递送载体。合适的递送载体包括，但不限于，病毒、细菌、可生物降解的微球体、微粒、奈米粒子、脂质体、胶原蛋白微球和螺旋体(cochleates)。

d.药物组合物的使用方法

本公开也包括使用包含Tau肽免疫原构建体的药物组合物的方法。

在某些实施方案中，包含Tau肽免疫原构建体的药物组合物可用于：

(a)抑制宿主中的Tau聚集；

(b)诱导宿主中预形成的Tau聚集体的解聚；

(c)减少宿主中由外源性Tau聚集体所引发的神经退化；

(d)减少于Tau过度表达细胞中的神经退化；

(e)降低宿主中血清Tau含量；

(f)减少宿主大脑中Tau寡聚体含量；

(g)于宿主中减少神经病理学和恢复运动能力等。

上述方法包含施用包含Tau肽免疫原构建体的医药上有效剂量的药物组合物给有其需要的宿主。

如本文所述的“Tau蛋白病”包括涉及脑内微管蛋白质Tau的病理性聚集的任何神经退行性疾病。因此，除了家族性和偶发性阿尔茨海默氏病之外，可以使用本发明的方法治疗的其他Tau蛋白病，包括但不限于，额颞叶失智症、17号染色体相关的帕金森氏症(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底核退化症、皮克氏病、进行性皮质下胶质细胞增生症(progressive subcortical gliosis)、仅缠结型痴呆、伴发钙化的弥漫性神经原纤维缠结(diffuse neurofibrillary tangles with calcification)、嗜银颗粒性痴呆(argyrophilic grain dementia)、肌萎缩性侧索硬化症-帕金森氏症-失智复合症(amyotrophic lateral sclerosis parkinsonism-dementia complex)、拳击手型失智症(dementia pugilistica)、唐氏症(Down syndrome)、吉斯特曼-施特劳斯病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallerworden-Spatz disease)、包涵体肌炎(inclusion body myositis)、库贾氏病(Creutzfeld-Jakob disease)、多发性系统萎缩症(multiple system atropy)、尼曼匹克症C型(Niemann-Pick disease typeC)、朊蛋白大脑类淀粉血管病变(prion protein cerebral amyloid angiopathy)、亚急性硬化脑炎(subacute sclerosing panencephalitis)、强直性肌肉失养症(myotonicdystrophy)、非关岛型运动神经元病伴随神经纤维缠结(non-guanamian motor neurondisease with neurofibrillary tangles)、脑炎后帕金森氏症(postencephaliticparkinsonism)和慢性创伤性脑病变。

本公开的另一范畴是关于促进Tau聚集体从受试者脑中清除的方法。在有效促进Tau聚集体从受试者脑中清除的条件下，此方法涉及对受试者施用任何一种或多种免疫原性Tau肽，此免疫原性Tau肽具有选自由SEQ ID NOs：1-21和101-124组成的群组的氨基酸序列，或施用一种或多种抗体，此抗体可识别包含选自由SEQ ID NOs：1-21和101-124和51-71和125-155组成的群组的氨基酸序列的免疫原性Tau表位。

Tau聚集体的清除包括神经纤维缠结及/或神经纤维缠结的病理性Tau前驱物的清除。神经纤维缠结通常与神经退行性疾病有关，神经退行性疾病包括，例如：偶发性和家族性阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症、嗜银颗粒性痴呆、拳击手型失智症、慢性创伤性脑病变、伴发钙化的弥漫性神经原纤维缠结、唐氏症、吉斯特曼-施特劳斯病、哈勒沃登-施帕茨病、遗传性额颞叶失智症、17号染色体相关的帕金森氏症(FTDP-17)、包涵体肌炎、库贾氏病、多发性系统萎缩症、尼曼匹克症C型、皮克氏病、朊蛋白大脑类淀粉血管病变、偶发性皮质基底核退化症(sporadic corticobasal degeneration)、进行性核上性麻痹、亚急性硬化脑炎、强直性肌肉失养症、运动神经元病伴随神经纤维缠结、仅缠结型痴呆和进行性皮质下胶质细胞增生症。

本公开的另一范畴是关于减缓受试者Tau病理学相关行为表型进展的方法。在有效减缓受试者Tau病理学相关行为表型进展的条件下，此方法涉及对受试者施用任何一种或多种免疫原性Tau肽，此免疫原性Tau肽包含选自由SEQ ID NOs：1-21和101-124和51-71和125-155组成的群组的氨基酸序列，或施用一种或多种抗体，此抗体可识别包含选自由SEQ ID NOs：1-21和101-124和51-71和125-155组成的群组的氨基酸序列的免疫原性Tau表位。

如本文所述，Tau病理学相关行为表型包括，但不限于，认知功能障碍、早期人格改变和去抑制、冷漠、意志缺失、缄默症、失用症、持续动作、刻板的运动/行为、口部过度活动(hyperorality)、错乱、无法计划或组织连续任务、自私/冷漠、反社会特质、缺乏同理心、踌躇、无语法的讲话伴随频繁语义错误但相对保存完好的理解、受损的理解和选词障碍、缓慢渐进的步态不稳、后冲(retropulsions)、不动、经常跌倒、非对左旋多巴反应的躯干僵硬、核上性凝视麻痹、方波形急跳(square wave jerks)、眼球垂直方向运动变慢、假性延髓麻痹、肢体失用症、肌张力障碍、皮质性感觉丧失和震颤。

根据本公开的方法，在一个实施方案中，将一种免疫原性Tau肽或免疫原性Tau肽的组合施用需要的受试者。Tau蛋白质的合适的免疫原性Tau肽片段含有一个或多个表位，此表位模拟Tau蛋白质的病理形式。例示性免疫原性Tau表位在一个或多个氨基酸处被磷酸化，所述氨基酸在Tau的病理形式中被磷酸化，但在Tau的正常或非病理形式中未被磷酸化。

在一些实施方案中，免疫原性Tau肽的施用在受试者中诱导针对免疫原性Tau肽和Tau的病理形式的主动免疫反应，从而促进相关Tau聚集体的清除，减缓Tau病理学相关行为的进展，以及治疗潜在的Tau蛋白病。根据本发明的此范畴，免疫反应涉及针对免疫原性Tau肽的有益体液(抗体介导的)及/或细胞(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导)反应的发展。

通过测试来自受试者的生物样品(例如，血液、血浆、血清、尿液、唾液、粪便、CSF或淋巴液)可以测定和监测体液免疫反应的存在，以确定是否存在针对免疫原性Tau肽的抗体。用以检测生物样品中的抗体的方法是本领域所熟知的，例如ELISA、点印迹、SDS-PAGE凝胶或ELISPOT。细胞介导的免疫反应的存在可以通过本领域易得知的增生试验(CD4+T细胞)或CTL(细胞毒性T淋巴细胞)试验来测定。

本发明的分离的免疫原性Tau肽包括于以下表1和3中所示的SEQ ID NOs：1-21和101-124和51-71和125-155的任一氨基酸序列。磷酸化的每个序列的氨基酸残基以粗体和底线显示。表1中肽的名称对应于在具有如表8所示SEQ ID NO：100氨基酸序列的人类Tau蛋白质的最长同种型中的这些肽的氨基酸位置。

具体实施方案

本发明包含以下具体实施方案：

(1)一种Tau肽免疫原构建体，其可以下列分子式表示：

(Th)_m-(A)_n-(Tau片段)-X

或

(Tau片段)-(A)_n-(Th)_m-X

其中

Th为异源性T辅助细胞表位；

A为异源性间隔物；

(Tau片段)为具有来自SEQ ID NO：100的全长Tau蛋白质约15至约40个氨基酸残基的B细胞表位；

X为氨基酸的α-COOH或α-CONH₂；

m为1至约4；以及

n为0至约10。

(2)如(1)的Tau肽免疫原构建体，其中Tau片段是选自由SEQ ID NOs：1-21和101-124组成的群组。

(3)如(1)或(2)任一的Tau肽免疫原构建体，其中T辅助细胞表位是选自由SEQ IDNOs：22-50组成的群组。

(4)如(1)的Tau肽免疫原构建体，其中肽免疫原构建体是选自由SEQ ID NOs：51-71和125-155组成的群组。

(5)一种Tau肽免疫原构建体，包含：

包含来自SEQ ID NO：100的全长Tau蛋白质序列约15至约40个氨基酸残基的B细胞表位；

包含选自由SEQ ID NOs：22-50组成的群组的氨基酸序列的T辅助细胞表位；以及

选自由氨基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α，ε-N)Lys和ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：102)组成的群组的任选的异源性间隔物，

其中B细胞表位是直接或通过任选的异源性间隔物共价连接至T辅助细胞表位。

(6)如(5)的Tau肽免疫原构建体，其中B细胞表位是选自由SEQ ID NOs：1-21和101-124组成的群组。

(7)如(5)的Tau肽免疫原构建体，其中T辅助细胞表位是选自由SEQ ID NOs：22-50组成的群组。

(8)如(5)的Tau肽免疫原构建体，其中任选的异源性间隔物为(α，ε-N)Lys或ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：102)。

(9)如(5)的Tau肽免疫原构建体，其中T辅助细胞表位是共价连接至B细胞表位的氨基端。

(10)如(5)的Tau肽免疫原构建体，其中T辅助细胞表位是通过任选的异源性间隔物共价连接至B细胞表位的氨基端。

(11)一种包含如(1)至(4)任一的肽免疫原构建体的组合物。

(12)一种药物组合物，包含：

a.如(1)至(4)任一的肽免疫原构建体；以及

b.药学上可接受的递送载体及/或佐剂。

(13)如(12)的药物组合物，其中

a.Tau肽免疫原构建体是选自由SEQ ID NOs：51-71和125-155组成的群组；以及

b.Tau肽免疫原构建体与CpG寡脱氧核苷酸(ODN)混合以形成稳定的免疫刺激复合物。

(14)一种分离抗体或其表位结合片段，其可特异性地结合至如(1)至(10)任一的Tau肽免疫原构建体的B细胞表位。

(15)如(14)的分离抗体或其表位结合片段结合至Tau肽免疫原构建体。

(16)一种分离抗体或其表位结合片段，其可特异性地结合至如(1)至(10)任一的Tau肽免疫原构建体的B细胞表位。

(17)一种包含如(14)至(16)任一的分离抗体或其表位结合片段的组合物。

实施例1.由非磷酸化的TAU肽免疫原构建体所引发的抗体和结合概况

a.Tau片段的合成和免疫

于详细说明中描述用于合成设计的Tau片段的方法，其被包括在非磷酸化和磷酸化的Tau肽免疫原构建体的开发工作中。通常，以小规模合成肽用于血清学试验、以实验室中试规模合成肽用于田间或临床研究，以及以大规模(千克)合成肽用于药物组合物的工业/商业生产。设计了大型Tau相关抗原性B细胞表位肽库，其具有长度范围为约10至约40个氨基酸的序列，用于广泛的血清学筛选，以及选择作为候选B细胞表位以合并进入Tau肽免疫原构建体设计中，用于Tau疫苗制剂的免疫原性和功能测试。

在这些血清学研究中作为重组蛋白质的全长Tau(表8)购自rPeptide Company(Tau-441，T-1001-2)。表1(SEQ ID NOs：1至21和101-124)识别出在各种血清学测定中用于表位鉴定的Tau肽片段。通过将Tau肽与精心设计的T辅助细胞(Th)表位合成连接，将选择的Tau肽片段制成Tau肽免疫原构建体，所述精心设计的T辅助细胞(Th)表位衍生自包括麻疹病毒融合蛋白(MVF)、B型肝炎表面抗原蛋白质(HBsAg)、流行性感冒病毒、破伤风梭菌，以及Epstein-Barr病毒(EBV)的病原菌蛋白质。设计的Th表位如表2(SEQ ID NOs：22至50)所示。

如详细说明中所述制备使用油包水乳液和与矿物盐悬浮的制剂。在设计合适的药物组合物以供庞大人口用于预防疾病时，重要的是考虑组合物的安全性。尽管在临床试验中对于许多药物组合物而言在人体中使用油包水乳液，但由于其安全性，明矾仍然是药物组合物中使用的主要佐剂。明矾或其矿物盐，例如ADJUPHOS(磷酸铝)，经常作为调剂中的佐剂供临床应用。(i)利用经核准供人类使用的油剂Seppic MONTANIDE^TM ISA 51配制油包水乳液，或(ii)与矿物盐ADJUPHOS(磷酸铝)或ALHYDROGEL(明矾)混合，以配制非磷酸化Tau肽免疫原构建体，肽结构如指定以不同量配制。通常利用将Tau肽免疫原构建体以约400μg/mL浓度溶解于水中，并与MONTANIDE^TM ISA 51配制成油包水乳液(1∶1体积)或者与矿物盐(1∶1体积)配制成组合物。将组合物置于室温下约30分钟，并在免疫接种前利用漩涡震荡混合约10至15秒。利用超过1个剂量的特定组合物免疫接种一些动物，其在时间0(初次免疫)和初次免疫后(wpi)3周(加强免疫)施用，且任选于6wpi进行第二次加强免疫，其通过肌内途径投药。然后利用选定的B细胞表位肽测试这些接受免疫接种的动物，以评估存在于剂型中的各种Tau肽免疫原构建体的免疫原性，以及它们与相关目标肽或蛋白质的交叉反应性。之后，针对免疫流程所指定特定期间内的给药方案，将那些在豚鼠初始筛选中具有有效免疫原性的Tau肽免疫原构建体在灵长类动物中以油包水乳液、矿物盐和基于明矾的剂型作进一步测试。

将溶于溶剂(ISA 51 VG、CpG3 50μg/mL、0.2％

-80)的非磷酸化Tau肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：52、54、56、58、61、63、65、67、69和71)按特定的时间表注射到豚鼠体内，收集免疫血清进行广泛的血清学分析。

b.ELISA测定和结果

在初次免疫后不同时间点收集来自接受免疫接种动物的血清，并起初通过ELISA分析结合概况，以测定相对应结构对其自身B细胞表位标靶的免疫原性。利用以选自如表9a-9e所示的不同肽涂覆的平板通过ELISA广泛评估来自其他功能区域的Tau肽之间的血清学交叉反应性。

开发并于以下实施例描述用以评估免疫血清样品的ELISA试验。简而言之，利用配制于pH 9.5的10mM碳酸氢钠缓冲液(除非另有说明)中浓度为2μg/mL(除非另有说明)的目标肽Tau片段A145-P160、P172-P189、P182-P200、S195-P213、R209-L224、V228-L243、K257-K274、R379-L408、V275-K311和V393-L425肽(分别为SEQ ID NOs：2、4、6、8、11、13、15、17、19和21)，将其以100μL体积于37℃下作用1小时，以分别地涂覆96孔盘的孔洞。将以肽涂覆的孔洞与250μL配制于PBS中浓度为3重量百分比的明胶于37℃下反应1小时，以阻断非特异性蛋白质结合位点，接着利用含有0.05体积百分比

20的PBS洗涤孔洞三次并干燥。利用含有20体积百分比正常山羊血清、1重量百分比明胶和0.05体积百分比

20的PBS以1∶20比例(除非另有说明)稀释待测血清。将100μL稀释样品(例如血清、血浆)加入每个孔洞并于37℃下反应60分钟。然后利用配制于PBS中浓度为0.05体积百分比的

20洗涤孔洞6次，以移除未结合的抗体。使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合物种(例如小鼠、豚鼠或人类)特异性山羊抗IgG作为标记的示踪剂，以在阳性孔洞中与形成的抗体/肽抗原复合物结合。将100μL过氧化物酶标记的山羊抗IgG(其以预滴定的最佳稀释倍数配制于内含1体积百分比正常山羊血清与0.05体积百分比

20的PBS中)加到每个孔洞中，并在37℃下再反应30分钟。利用内含0.05体积百分比

20的PBS洗涤孔洞6次以移除未结合的抗体，并与100μL包含0.04重量百分比3’，3’，5’，5’-四甲基联苯胺(TMB)和0.12体积百分比过氧化氢于柠檬酸钠缓冲液中的底物混合物再反应15分钟。藉由形成有色产物利用底物混合物以检测过氧化物酶标记。藉由加入100μL的1.0M硫酸终止反应并测定450nm处的吸光值(A₄₅₀)。为了测定接受各种Tau衍生肽免疫原的疫苗接种动物的抗体效价，将从1∶100至1∶10,000的10倍连续稀释的血清进行测试，且利用A₄₅₀阀值设为0.5的A₄₅₀的线性回归分析计算测试血清的效价，以Log₁₀表示。通过绘制如第1A图中所示的直方图进一步分析表9a-9e中所示的ELISA结果。

通常，当针对其自身B细胞表位进行测试时发现，高免疫原性与每种选择的Tau肽结构相关(表9a-9e和第1A图)。发现由SEQ ID Nos：52、54、56、58和61的肽免疫原构建体所引发的抗体的高交叉反应性(参见第1A图)。

有趣的是，发现含有B细胞表位K257-K274(SEQ ID NO：15)的SEQ ID NO：65是设计的Tau肽结构中的高免疫原性序列，但是由此结构所引发的抗体是最具特异性的，其与任何其他B细胞表位没有太大的交叉反应性(参见第1A图)。相反，含有B细胞表位R379-L408(SEQID NO：17)的SEQ ID NO：67的Tau肽免疫原构建体是最具免疫原性的，其与自身B细胞表位具有高反应性，但也具有与其他Tau B细胞表位的合理交叉反应性(参见第1A图)。

实施例2.由磷酸化的TAU肽免疫原构建体所引发的抗体和结合概况

在初次免疫后(wpi)6周，通过ELISA对针对磷酸化Tau肽免疫原构建体产生的抗体结合其磷酸化B细胞表位的能力进行评估。

a.免疫

配制磷酸化Tau肽免疫原(SEQ ID NOs：51、53、55、57、59、60、62、64、66、68和70)并在针对非磷酸化Tau肽免疫原与实施例1中讨论的相同条件下施用豚鼠。在0、3和6wpi施用含有磷酸化Tau肽免疫原的制剂。

b.ELISA测定和结果

利用配制于pH 9.5的10mM碳酸氢钠缓冲液(除非另有说明)中浓度为2μg/mL(除非另有说明)的磷酸化Tau目标肽片段A145-P160、P172-P189、P182-P200、S195-P213、R209-L224、V228-L243、K257-K274、R379-L408、V275-K311和V393-L425肽(分别为SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、10、12、14、16、18和20)，将其以100μL体积于37℃下作用1小时，以分别地涂覆96孔盘的孔洞。将以肽涂覆的孔洞与250μL配制于PBS中浓度为3重量百分比的明胶于37℃下反应1小时，以阻断非特异性蛋白质结合位点，接着利用含有0.05体积百分比

20的PBS洗涤孔洞6次以移除未结合的抗体，并与100μL包含0.04重量百分比3’，3’，5’，5’-四甲基联苯胺(TMB)和0.12体积百分比过氧化氢于柠檬酸钠缓冲液中的底物混合物再反应15分钟。藉由形成有色产物利用底物混合物以检测过氧化物酶标记。藉由加入100μL的1.0M硫酸终止反应并测定450nm处的吸光值(A₄₅₀)。为了测定接受各种Tau衍生肽免疫原的疫苗接种动物的抗体效价，将从1∶100至1∶10，000的10倍连续稀释的血清进行测试，且利用A₄₅₀阀值设为0.5的A₄₅₀的线性回归分析计算测试血清的效价，以Log₁₀表示。在注射后不同时间点收集来自接受免疫接种动物的血清，且通过ELISA分析结合概况。利用不同Tau片段涂覆ELISA平板且结果如表10a-10d所示。

通过绘制如第1B图中所示的直方图进一步分析表10a-10d中所示的ELISA结果。当以磷酸化Tau肽结构作为免疫原时发现类似的免疫原性和血清学特征，包括B细胞表位之间的交叉反应性。

实施例3.由磷酸化的TAU肽免疫原构建体所引发的抗体和针对其非磷酸化的肽对应物的结合概况

如下文进一步详细描述，在注射后(wpi)6周，通过ELISA对针对磷酸化Tau肽产生的抗体结合其相对应非磷酸化对应物的能力进行评估。

a.免疫

配制磷酸化Tau肽免疫原(SEQ ID NOs：51、53、55、57、59、60、62、64、66、68和70)并在针对非磷酸化Tau肽免疫原于实施例1中所述条件下施用豚鼠。

b.ELISA测定和结果

利用配制于pH 9.5的10mM碳酸氢钠缓冲液(除非另有说明)中浓度为2μg/mL(除非另有说明)的目标肽Tau片段A145-P160、P172-P189、P182-P200、S195-P213、R209-I224、V228-L243、K257-K274、R379-L408、V275-K311和V393-L425肽(分别为SEQ ID NOs：2、4、6、8、11、13、15、17、19和21)，将其以100μL体积于37℃下作用1小时，以分别地涂覆96孔盘的孔洞。将以肽涂覆的孔洞与250μL配制于PBS中浓度为3重量百分比的明胶于37℃下反应1小时，以阻断非特异性蛋白质结合位点，接着利用含有0.05体积百分比

20的PBS洗涤孔洞6次以移除未结合的抗体，并与100μL包含0.04重量百分比3’，3’，5’，5’-四甲基联苯胺(TMB)和0.12体积百分比过氧化氢于柠檬酸钠缓冲液中的底物混合物再反应15分钟。藉由形成有色产物利用底物混合物以检测过氧化物酶标记。藉由加入100μL的1.0M硫酸终止反应并测定450nm处的吸光值(A₄₅₀)。为了测定接受各种Tau衍生肽免疫原的疫苗接种动物的抗体效价，将从1∶100至1∶10,000的10倍连续稀释的血清进行测试，且利用A₄₅₀阀值设为0.5的A₄₅₀的线性回归分析计算测试血清的效价，以Log₁₀表示。在注射后不同时间点收集来自接受免疫接种动物的血清，且通过ELISA分析结合概况。

利用不同非磷酸化Tau片段涂覆ELISA平板且结果如表11a-11e所示。当在相对应非磷酸化Tau B细胞表位肽测试免疫血清时，对于针对磷酸化Tau肽结构所产生的所有抗体而言获得类似血清学结合概况。根据在实施例1、2和3中进行的广泛的免疫原性和血清学研究，由Tau肽免疫原构建体引发的抗体显然表现出相似的性质。大多数这些性质可归因于氨基酸序列。利用交叉反应性研究的构型评估指出，肽的磷酸化仅引起细微差异，表明由其相对应的磷酸化与非磷酸化肽免疫原构建体引发的这些免疫血清具有相似的功能特性。

实施例4.针对非磷酸化TAU肽免疫原的抗体的结合概况

a.由利用不同大小的不同Tau肽免疫原构建体免疫豚鼠抗血清所纯化的抗非磷酸化Tau抗体的特异性

如实施例1所述，利用非磷酸化Tau肽免疫原构建体免疫豚鼠。针对对不同大小Tau分子复合物的结合特异性，利用蛋白质印迹以筛选抗非磷酸化Tau抗体(抗非p-Tau抗体(anti-non-p-Tau antibodies))，此抗非磷酸化Tau抗体是由利用不同Tau肽免疫原构建体免疫的豚鼠抗血清中纯化出来。在光诱导交联(PICUP)处理之后，在12％Tris-甘氨酸SDS-PAGE上分离Tau(20μM)的各种形式(单体、二聚体、三聚体、寡聚体和聚合物)，并将其转移到硝化纤维(NC)膜上。将膜与浓度为1μg/mL的从豚鼠抗血清中纯化的抗非磷酸化Tau抗体一起反应，然后将与HRP缀合的驴抗豚鼠抗体(706-035-148，Jackson)与膜一起反应。利用化学发光试剂Western Lightning ECL Pro(PerkinElmer)显现印迹。

b.结果

含有Tau的单体、二聚体、三聚体和寡聚体的溶胞产物的蛋白质印迹分析显示在第2图(左图)中。单体Tau出现在约60kDa处，且二聚体、三聚体和寡聚体出现于其相对应的分子量处。市售单株抗体Mab Tau 5和Mab Tau 46能够检测单体Tau，且在较小程度上检测到Tau的二聚体形式(第2图，泳道1和2)。利用Mab Tau5作为总Tau标记，而Tau46是Tau 404-441的标记。

由非磷酸化肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：52、54、56、58、61、63、65、67、69和71)引发的IgG抗体以不同的效率检测Tau单体、二聚体、三聚体和寡聚体(第2图，泳道4-13)。分析每种抗体的结合概况，并在直方图中定量汇总(第2图，右图)。通常，相较于那些衍生自来自氨基端区域的Tau肽免疫原构建体的抗体，衍生自来自羧基端区域的Tau肽免疫原构建体的抗体能够引发具有更高优先结合特征的抗体(数据未显示)。

实施例5.针对非磷酸化TAU肽免疫原的抗体可抑制TAU聚集

a.免疫和暴露于Tau

如实施例1所述利用非磷酸化Tau免疫原构建体(SEQ ID NOs：52、54、56、58、61、63、65、67、69和71)，或如实施例2所述利用磷酸化Tau免疫原构建体(SEQ ID NOs：51、53、55、57、60、62、64、66、68和70)，对动物进行免疫。

然后将免疫产生的抗体在促进Tau聚集的条件下暴露于含有市售全长Tau441重组蛋白质的样品中。利用60μg的Tau置于体积为100μL之内含10unit/mL肝素的1xPBS中于37℃下反应7天进行聚集以产生Tau441β-折叠纤维，然后于4℃下将其转移到300kDa截取过滤器(Pall)上以分离β-折叠纤维。利用硫磺素T(ThT，Sigma)荧光验证这些聚集。

在有或无由Tau肽免疫原构建体所引发的IgG抗体存在下，将Tau置于体积为200μL之内含浓度为5μM肝素的PBS缓冲溶液中反应3天进行聚集。在离心(13，000xg，4℃，30分钟)后，收获Tau聚集体并用ThT试验加以确认。

b.结果

第3A图包含多个图标，其显示在针对每一图标上方所示的非磷酸化Tau肽免疫原构建体的抗体存在下的全长Tau(Tau441)聚集程度。第3A图中所示的虚线表示使用免疫前IgG评估Tau聚集的对照样品。结果显示，与免疫前血清对照样品相比，针对非磷酸化Tau肽免疫原的所有抗体均可抑制Tau聚集。抗体能够以不同的程度抑制Tau聚集。

第3B图定量了在针对直方图下方所示的非磷酸化Tau肽免疫原构建体的抗体存在下利用聚集体的ThT染色所测定的全长Tau(Tau441)聚集程度。结果显示，与免疫前血清对照样品相比，针对非磷酸化Tau肽免疫原的抗体可抑制Tau聚集。抗体能够以不同的程度抑制Tau聚集。

结果表明，当使用具有更接近Tau的羧基端区域的B细胞表位的Tau肽免疫原构建体时，其对Tau聚合具有更大的抗聚集能力。

实施例6.针对TAU肽免疫原的抗体可抑制TAU聚集

a.免疫和暴露于Tau

如实施例1所述利用非磷酸化Tau免疫原构建体免疫动物。动物也如实施例2所述利用磷酸化Tau免疫原构建体进行免疫。

然后将免疫产生的抗体暴露于细胞溶胞产物，细胞溶胞产物来自(a)冈田酸(okadaic acid，OKA)处理的神经元细胞(SH-SY5Y细胞)，其作为过度磷酸化Tau或(b)无冈田酸处理的神经元细胞，其作为非磷酸化Tau。在时间点为wpi6和9的抗血清存在下，将OKA加到培养基中至终浓度为100nM反应3小时，以确定抗血清在抑制Tau聚集的效果的剂量依赖性作用。

b.结果

第4图包含多个图标，其显示在暴露于针对每一图示上方所示的Tau肽免疫原的抗体后不同溶胞产物的Tau聚集程度。利用聚集体的ThT染色测定Tau聚集的程度。同样，来自磷酸化或非磷酸化Tau肽免疫原构建体的抗体可抑制Tau聚集，这与先前实施例中所描述的血清学分析一致。

结果表明，使用衍生自Tau的中央与羧基端区域的Tau表位对Tau聚合具有更大的抗聚集能力。

实施例7.在暴露于针对TAU肽免疫原的抗体后的预形成Tau聚集体的解聚

a.免疫和暴露于预形成Tau聚集体

然后将免疫产生的抗体暴露于预形成Tau纤维。然后将预形成Tau聚集体与或不与纯化自豚鼠抗血清的抗p-Tau抗体或抗非p-Tau抗体进行反应2和4天。在反应后，于4℃下以13，000xg离心30分钟后收集聚集体，然后利用ThT试验加以定量。

b.结果

第5图包含多个图标，其显示在暴露于如第5图(右图)上方所示针对Tau肽免疫原(SEQ ID NOs：66和67的代表性肽结构)的抗体后Tau去聚集的程度。利用ThT染色和蛋白质印迹测定Tau聚集的程度。

来自蛋白质印迹和ThT试验的数据显示，分别由SEQ ID NOs：67和66引发的抗非p/p-Tau 379-408 IgGs具有破坏Tau纤维聚集的能力。

实施例8.通过利用磷酸化TAU和非磷酸化TAU肽免疫原构建体产生的代表性抗体对TAU纤维、寡聚体和单体的非变性形式的特异性结合进行点印迹分析

a.免疫、抗Tau抗体的结合概况的蛋白质印迹和点印迹分析

如实施例5所述制备不同种类的Tau蛋白质(即，α-螺旋单体、β-折叠单体、β-折叠寡聚体和β-折叠纤维)。使用不同种类的Tau蛋白质进行蛋白质印迹和点印迹分析，其利用由使用不同Tau肽免疫原构建体免疫的豚鼠抗血清纯化而来的抗p-Tau或抗非p-Tau抗体作为一级抗体。为用于严格的特异性对照，在印迹上点缀各种形式的β-折叠纤维、寡聚体、单体、α-螺旋单体和其它对照试剂。用以制备供血清学测试和评估使用的这些试剂的详细程序在实施例11中进一步描述。

b.结果

第6图(左图)包含由Tau肽免疫原(SEQ ID NOs：59、66和70)所产生的抗p-Tau IgG和由Tau肽免疫原(SEQ ID NO：67)所产生的抗非p-Tau IgG的蛋白质印迹分析(在变性条件下)。蛋白质印迹分析结果显示，针对Tau的羧基端的抗p-Tau IgGs可特异性识别高分子量Tau聚集体，而非Tau单体。

第6图(右图)包含分别由Tau肽免疫原SEQ ID NOs：66和67所产生的抗p-Tau和抗非p-Tau IgGs的点印迹分析(在非变性条件下)。结果显示，抗非p-/p-Tau 379-408 IgGs均可特异性结合各种形式的Tau，而非其他淀粉样蛋白质(amyloidogenic proteins)(即Aβ1-42和alpha-突触核蛋白)。此外，当与单株抗体Mab Tau 5和针对Tau的非羧基端区域的另一种IgG相比时，衍生自本发明(分别为SEQ ID NOs：66和67)的抗p-/抗非p-Tau 379-408IgGs对于纤维和寡聚体而非单体具有更高的亲和力。另外，抗p-Tau 379-408 IgG不与β-折叠单体结合。

实施例9.针对TAU肽免疫原的抗体的组织结合概况

a.免疫和组织染色

然后将免疫产生的抗体用于来自健康(正常)脑部和阿尔茨海默氏病(AD)脑部组织染色。在将抗Tau 349-408(SEQ ID NOs：66或67)或免疫前血清应用于组织之前，将人类组织组(Pantomics)以二甲苯脱蜡，在乙醇中复水，然后利用内含0.25％胰蛋白酶溶液和0.5％CaCl₂的PBS处理30分钟，并于内含1％过氧化氢的甲醇中反应以阻断内源性过氧化物酶活性，之后与内含10％Block Ace(Sigma)之PBS反应。切片用3-3′-二氨基联苯胺(DAB)显色，并在用显微镜检查之前用苏木精复染。

b.结果

第7图显示此实验的染色图像。针对非磷酸化Tau379-408(SEQ ID NO：67)和磷酸化Tau 379-408(SEQ ID NO：66)的抗体与来自正常组织的切片没有交叉反应性，但是与阿尔茨海默氏病脑组织具有交叉反应。针对磷酸化肽(SEQ ID NO：66)的抗体显示出对AD脑的海马回区域的更强结合。

实施例10.TAU肽免疫原构建体及其制剂引发的抗体：减少由外源性TAU纤维所引发的神经退化的神经保护作用

为了评估由利用不同Tau肽免疫原构建体免疫的豚鼠抗血清纯化的抗Tau抗体的神经保护作用，采用体外神经退化模型，其于以NGF处理神经元分化的PC12细胞处理外源性预形成的Tau聚集体。

利用NGF(100ng/mL)处理PC12细胞6天以诱导神经元分化。利用cell³ iMagerduos高通量成像系统(Screen)确认并分析神经元分化细胞的形态。利用荧光素染料标记细胞死亡，并利用细胞计数软件计数细胞。由Tau肽免疫原构建体引发的抗体可进入细胞并结合Tau聚集体(数据未显示)。对反映在神经突生长和神经元分化细胞数量上的NGF的神经营养作用进行量化。在标准化后，将神经突生长程度和神经元分化细胞数量以百分比(平均值±SEM)表示。将有和无NGF处理的PC12细胞的神经突长度分别视为100％和0％。将NGF处理6天的神经元分化的PC12细胞的数量标准化至100％。

通过将由肝素处理的外源性预形成Tau聚集体添加到神经元分化的PC12细胞于37℃下反应一周以观察神经退化。在预形成Tau聚集体存在下，于神经元分化的PC12细胞中的神经突长度缩短且细胞数量减少。此Tau纤维驱动的神经退化以浓度依赖性方式与添加的外源性Tau聚集体的量成比例。市售的抗Tau抗体(例如Mab Tau 5和Mab Tau46)，而非从未经处理

的豚鼠纯化的抗体，可减弱Tau纤维驱动的神经退化。采用此模型作为筛选平台，以鉴定由利用不同Tau肽免疫原构建体免疫的豚鼠抗血清纯化的哪些抗Tau抗体具有浓度依赖性方式的恢复神经元存活的神经保护作用(第8A和B图)。

结果，由利用半数以上不同Tau肽免疫原构建体免疫的豚鼠抗血清纯化的抗Tau抗体可恢复神经突生长。提供浓度为5μg/mL的Tau纤维，此浓度先前被优化以引起损伤(第8A图)。由利用磷酸化或非磷酸化Tau肽结构免疫的豚鼠抗血清纯化的抗Tau抗体可保护神经元分化的PC12细胞免于Tau纤维引发的神经元死亡。第8B图显示来自利用SEQ ID NOs：65、67和69免疫所提供抗非p-Tau抗体的数据。

第8A和8B图的结果证明抗Tau抗体(例如SEQ ID NOs：65、67和69)可保护神经元免受Tau纤维的神经毒性。通过利用Cell³ Imager duos软件(Miteklab)计算培养物中存活的细胞数量，观察并定量由Tau肽免疫原构建体(SEQ ID Nos：65、67和69)引发的抗Tau抗体的抗神经退化作用。

关于通过体外功能试验评估抗Tau抗体的神经保护作用，已经表明体外Tau聚集接种的抑制可于生物体中显着降低病理学并改善认知，如Yanamandra，K，et al.(Neuron 80：402-414，2013)所报导。Tau单体被认为是天然非结构性的，且在Tau聚集和相关细胞的细胞毒性中可能没有太多的功能作用。最近的发现表明，病理聚集的起始可以从Tau单体从惰性(inert)转化为具有接种能力形式(seed-competent form)开始(Mirbaha，H.，et al.，eLife 2018；7：e36584；doi：10.7554/eLife.36584)。基于这些发现，我们测试了利用Tau肽免疫原构建体引发的抗Tau抗体减少接种活性的能力。具体地，将针对Tau肽免疫原构建体的抗Tau抗体与来自阿尔茨海默氏病(AD)患者的脑部匀浆物一起反应，并发现这些抗体具有减少此种接种活性的能力(数据未显示)。免疫原性和血清学分析促进了神经保护干预的发展，我们广泛的Tau免疫原设计作为分子和血清学层次的疫苗可用以治疗具破坏性的Tau蛋白病。

实施例11.其他的血清学试验和试剂

于下文中详细描述用以评估合成肽结构及其制剂的功能性免疫原性的血清学试验和试剂。

a.利用基于B细胞表位簇肽的ELISA试验对Tau片段进行精细特异性分析和表位鉴定

利用表位鉴定测定于接受免疫的宿主中抗Tau抗体的精细特异性分析。简而言之，利用待鉴定来自Tau 275-311区域(SEQ ID NO：19)的个别Tau片段肽(SEQ ID NOs：115和156-171)涂覆96孔盘的孔洞，每一孔洞每0.1mL体积含有0.5μg的Tau片段肽，然后按照上述抗体ELISA方法的步骤以二重复方式于孔盘的孔洞中加入100μL血清样品(以1∶100比例稀释于PBS中)进行反应。为了额外的反应性和特异性确认，还对Tau肽免疫原构建体的B细胞表位和于接受免疫的宿主中免疫血清抗Tau抗体的相关精细特异性分析进行测试，其是利用无间隔物和Th序列的相对应的Tau肽(例如表1所示SEQ ID NOs：1-21、101-124和表4至7所示SEQ ID NOs：72-99，以及表8所示SEQ ID NO：100)。

b.免疫原性评估

根据实验免疫流程收集来自动物的免疫前和免疫血清样品，并在56℃下加热30分钟以使血清补体因子去活化。在施用Tau肽免疫原构建体后，根据流程获得血液样品，并评估其针对特定靶点的免疫原性。测试连续稀释的血清，并将阳性效价表示为稀释度倒数的Log₁₀。特定Tau肽免疫原构建体的免疫原性是通过其引发针对目标抗原内所希望的表位特异性的高效价B细胞抗体反应的能力而加以评估，同时保持针对用以提供增强所希望的B细胞反应的“辅助T细胞表位”的低至可忽略的抗体反应性。

c.利用重组Tau蛋白质制备Tau聚集体(二聚体、三聚体、寡聚体和纤维)

为了制备聚集的Tau，将置于1.5mL微量离心管内配制于100μL PBS/KCl聚集缓冲液(pH 7.4的内含2.5mM氯化镁、50mM HEPES和150mM氯化钾的1x PBS)中纯化的重组Tau蛋白质(浓度为0.1μg/μL)放置在恒温震荡器(Eppendorf)内在没有震荡的状况下在37℃反应7天。将聚集的Tau立即置于-80℃冷冻以备后用。

d.抗Tau抗体的纯化

利用亲和性管柱(Thermo Scientific，Rockford)从初次免疫后(wpi)3至15周的豚鼠收集的血清中纯化抗Tau抗体，所述豚鼠是利用含有不同序列的肽的Tau肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：51-71和125-155)进行免疫接种。简而言之，在缓冲液(0.1M磷酸和0.15M氯化钠，pH 7.2)平衡后，将400μL血清加入Nab Protein G Spin column中，然后翻滚式混合(end-over-end mixing)10分钟并以5,800x g离心1分钟。利用结合缓冲液(400μL)洗涤管柱三次。随后，将洗脱缓冲液(400μL，0.1M甘氨酸，pH 2.0)加入spin column中在以5,800xg离心1分钟后洗脱抗体。将洗脱的抗体与中和缓冲液(400μL，0.1M Tris，pH 8.0)混合，并通过使用Nano-Drop OD₂₈₀测定以测量这些纯化抗体的浓度，以BSA(牛血清白蛋白)作为标准品。

e.由利用不同大小的不同Tau肽免疫原构建体免疫的豚鼠抗血清所纯化的抗Tau抗体的特异性

针对对不同大小Tau分子复合物的结合特异性，利用蛋白质印迹筛选抗Tau抗体，此抗Tau抗体是由利用不同Tau肽免疫原构建体免疫的豚鼠抗血清纯化而来。在光诱导交联(PICUP)处理之后，在12％Tris-甘氨酸SDS-PAGE上分离Tau(20μM)的各种形式，并将其转移到硝化纤维(NC)膜上。将膜与浓度为1μg/mL的从豚鼠抗血清中纯化的抗Tau抗体一起反应，然后将与HRP缀合的驴抗豚鼠抗体(706-035-148，Jackson)与膜一起反应。利用化学发光试剂Western Lightning ECL Pro(PerkinElmer)显现印迹。单体Tau印迹位于60kDa大小附近，而二聚体、三聚体或寡聚体各自分子量比单体Tau分子量大几倍。利用能够检测各种寡聚物种类(例如二聚体、三聚体和较大寡聚体)的商业抗体(例如Mab Tau 5或Mab Tau 46)作为阳性对照。

f.利用不同种类的淀粉样蛋白质(amyloidogenic proteins)进行点印迹分析

Aβ_1-42、Tau和α-Syn的α-螺旋单体、β-折叠单体、β-折叠寡聚体和β-折叠纤维的制备如下文所描述。

Aβ_1-42 α-螺旋单体：将20μg的Aβ₁-₄₂ β-折叠单体(50μL)加入含有20％三氟乙酸和20％六氟异丙醇的1xPBS(10μL)中，并在4℃下反应24小时，以形成α-螺旋单体。

Aβ₁-₄₂ β-折叠单体：将配制于120μL含有5％TFA的1xPBS中于37℃反应24小时进行聚集的60μg的Aβ_1-42转移到10kDa截取过滤器(Millipore)上，以回收β-折叠单体。

Aβ_1-42 β-折叠寡聚体：将配制于120μL 1xPBS中于37℃反应3天进行聚集的60μg的Aβ_1-42在冰上超音波震荡，并转移到10和30kDa截取过滤器(Millipore)上，以回收小于35kDa的β-折叠寡聚体纤维。

Aβ_1-42 β-折叠纤维：将配制于120μL 1xPBS中于37℃反应3天进行聚集的60μg的Aβ_1-42在冰上超音波震荡，并转移到30kDa截取过滤器(Millipore)上，以分离β-折叠纤维。

α-Syn α-螺旋单体：将40μg新鲜制备的α-Syn在4℃下溶于冷的100μL 1xPBS中，并立即转移到10kDa截取过滤器(Millipore)上，以回收α-螺旋单体。

α-Syn β-折叠单体：将配制于100μL PBS/氯化钾缓冲液中在37℃下反应24小时的40μg的α-Syn转移到10kDa截取过滤器(Millipore)上，以回收β-折叠单体。

α-Syn β-折叠寡聚体：将配制于100μL PBS/氯化钾缓冲液中在37℃下反应8天进行聚集的40μg的α-Syn在冰上超音波震荡，且之后转移到30和100kDa截取过滤器上，以回收β-折叠寡聚体。

α-Syn β-折叠纤维：将配制于100μL PBS/氯化钾缓冲液中在37℃下反应8天进行聚集的40μg的α-Syn在冰上超音波震荡，且之后转移到30和100kDa截取过滤器上，以分离β-折叠纤维。

Tau441 α-螺旋单体：于4℃下将配制于100μL 1xPBS中的60μg的Tau转移到100kDa截取过滤器上，以回收α-螺旋单体。

Tau441 β-折叠单体：将配制于含有10unit/mL肝素的100μL 1xPBS中于25℃下反应48小时进行聚集的60μg的Tau于4℃下转移到100kDa截取过滤器上，以回收β-折叠单体。

Tau441 β-折叠寡聚体：将配制于含有10unit/mL肝素的100μL 1xPBS中于37℃下反应48小时进行聚集的60μg的Tau于4℃下转移到100和300kDa截取过滤器(Pall)上，以回收β-折叠寡聚体。

Tau441 β-折叠纤维：将配制于含有10unit/mL肝素的100μL 1xPBS中于37℃下反应6天进行聚集的60μg的Tau于4℃下转移到300kDa截取过滤器(Pall)上，以分离β-折叠纤维。

利用硫磺素T(ThT，Sigma)荧光或PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)验证这些单体和聚集体。利用Nano-Drop和作为标准品的市售淀粉样Aβ_1-42贮液测定淀粉样蛋白质的浓度。利用蛋白质量为3μg的Aβ_1-42、4μg的α-Syn和7μg的Tau，将这些单体和寡聚体分别点样到PVDF膜上。将膜与从豚鼠抗血清纯化而来的抗Tau抗体(作为一级抗体)(稀释倍数为1∶1，000)进行反应，然后将膜与抗豚鼠HRP缀合二级抗体(稀释倍数为1∶5，000；Vector Laboratories)进行杂交。利用Luminata Western HRP底物(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)处理膜，并利用ChemiDoc-It 810数字影像系统(UVP Inc.，Upland，CA，USA)检测信号。

实施例12.用于免疫原性和功效研究的动物

a.豚鼠：

在成熟未具有抗体

的成年雄性和雌性Duncan-Hartley豚鼠(300-350g/BW)中进行免疫原性研究。此实验每组至少使用3只豚鼠。涉及Duncan-Hartley豚鼠(8-12周龄；Covance Research Laboratories，Denver，PA，USA)的试验方案是在订有合约的实验动物设施以及作为试验委托者的United Biomedical，Inc.(UBI)中依照动物实验管理小组(IACUC)审查通过的申请下进行。

实施例13.由针对目标B细胞表位的TAU肽免疫原构建体所引发集中抗体反应的鉴定：代表性研究

在代表性的精细表位鉴定研究(表16)中确定了由针对其Tau 275-311区域(SEQID NO：19)的Tau肽免疫原构建体所引发的针对特定残基的抗体结合位点，合成来自此区域具有增加长度的重叠肽(SEQ ID NOs：115和156-171)并将其分别涂覆在96孔微量滴定板的孔洞上以作为固相免疫吸附剂。将肽(每一孔洞每0.1mL体积含有0.5μg的肽)涂覆在微量滴定板上，然后按照上述抗体ELISA方法的步骤以二重复方式于孔盘的孔洞中加入100μL血清样品(以1∶100比例稀释于PBS中)进行反应。

将汇集的针对SEQ ID NO：68Tau肽免疫原构建体的6wpi豚鼠抗血清(其以1：100稀释倍数配制于样品稀释缓冲液中)加到利用来自此区域的Tau重叠肽(浓度为2.0μg/mL)涂覆的微量滴定板的孔洞中，然后于37℃下反应1小时。在利用洗涤缓冲液洗涤微量滴定板的孔洞后，加入辣根过氧化物酶缀合的蛋白质A/G并反应30分钟。在再次使用PBS洗涤后，将底物加入孔洞中，利用ELISA平板读取器测定450nm处的吸光值，其以二重复方式分析样品。抗血清与B细胞表位免疫原构建体的相对应长Tau肽的结合代表最大结合。

如表16所示，汇集的6wpi豚鼠免疫血清显示出高精确性的结合特征，在此具有SEQID NOs 164和115序列的两个Tau肽在长度上仅有两个氨基酸差异，但是较长的肽SEQ IDNO：115可从此过度磷酸化和聚集区域呈递强Tau表位。然而，由于删除两个氨基端氨基酸(I297和K298)，汇集的免疫血清无法识别肽SEQ ID NO：164，此表明这两个氨基酸在将此区域呈递作为免疫显性表位中是关键的。

如表12、13a、13b和15所示，此区域遭受Tau肽结构的进一步仔细设计以用于免疫原性研究，其包括在第301个氨基酸位置合并脯氨酸的反式构型供免疫原性评估。通常，在此过度磷酸化和聚集区域中，除了SEQ ID NO：128以外，在SEQ ID NOs：126-132、135、136、140和141的精心设计的Tau免疫原肽结构中可发现高免疫原性。

另外的Tau肽免疫原构建体设计是用于针对Tau的“绒毛状外壳(fuzzy coat)”区域，其位于经常从Tau异构体删除的氨基端区域。还设计了如表3所示来自此区域的Tau肽免疫原构建体(SEQ ID Nos：137-139)，并评估其相对应的免疫原性。

表14显示来自绒毛状外壳区域的Tau肽免疫原构建体具有高度免疫原性。这些结果表明，来自氨基端绒毛状外壳区域的Tau肽免疫原构建体可用于合并进入组合物中以引发用以预防Tau聚集的抗体，此外还可能减少导致Tau聚集的单体Tau接种的起始。

所有说明书中所揭示的发明技术特点可以任意方式组合。说明书中揭示的每一技术特点可以提供相同、等同或相似目的的其他方式替换。因此，除非另有特别说明，文中所有揭示的特点均只是等同或相似特点的一般系列的实例。

由上述可知，本领域技术人员能轻易地了解本发明的必要特征，在不脱离其精神与范围之下能就本发明做许多改变与调整以应用于不同用途与条件。

表1.Tau和磷酸化Tau(pTau)片段的氨基酸序列

¹磷酸化残基用粗体和底线表示

表2.在Tau肽免疫原构建体设计中所使用包含理想化人工Th表位的病原菌蛋白质衍生的Th表位的氨基酸序列

表8.具有4R和2N的Tau蛋白质序列全长(441个氨基酸)同种型(GenBank：AGF19246.1)

表9a.Tau肽结构的免疫原性分析(数据对应第1A图)

佐剂：ISA51VG；CpG3 50μg/ml；0.2％tween 80

免疫原剂量：初次免疫：400μg/1.0ml/剂/IM(4个注射部位，0.25ml/部位)；加强免疫：100μg/0.25ml/剂/IM

免疫接种时间表：0、3和6wpi

表9b.Tau肽结构的免疫原性分析(数据对应第1A图)

佐剂：ISA 51VG；CpG3 50μg/ml；0.2％tween 80

免疫接种时间表：0、3和6wpi

表9c.Tau肽结构的免疫原性分析(数据对应第1A图)

佐剂：ISA 51VG；CpG3 50μg/ml；0.2％tween 80

免疫接种时间表：0、3和6wpi

表9d.Tau肽结构的免疫原性分析(数据对应第1A图)

佐剂：ISA 51VG；CpG3 50μg/ml；0.2％tween 80

免疫接种时间表：0、3和6wpi

表9e.Tau肽结构的免疫原性分析(数据对应第1A图)

佐剂：ISA 51VG；CpG3 50μg/ml；0.2％tween 80

免疫接种时间表：0、3和6wpi

表10a.磷酸化Tau肽结构的免疫原性分析(数据对应第1B图)

佐剂：ISA 51VG；CpG3 50μg/ml；0.2％tween 80

免疫原剂量：初次免疫：400μg/1.0ml/剂/IM(4个注射部位，0.25ml/部位)；加强免疫：100μg/0.25ml/剂

表10b.磷酸化Tau肽结构的免疫原性分析(数据对应第1B图)

佐剂：ISA 51VG；CpG3 50μg/ml；0.2％tween 80

表10c.磷酸化Tau肽结构的免疫原性分析(数据对应第1B图)

佐剂：ISA 51VG；CpG3 50μg/ml；0.2％tween 80

免疫接种时间表：0、3和6wpi

表10d.磷酸化Tau肽结构的免疫原性分析(数据对应第1B图)

佐剂：ISA 51VG；CpG3 50μg/ml；0.2％tween 80

免疫接种时间表：0、3和6wpi

表11a.磷酸化Tau肽结构的免疫原性分析

佐剂：ISA 51VG；CpG3 50μg/ml；0.2％tween 80

免疫接种时间表：0、3和6wpi

表11b.磷酸化Tau肽结构的免疫原性分析

佐剂：ISA 51VG；CpG3 50μg/ml；0.2％tween 80

免疫接种时间表：0、3和6wpi

表11c.磷酸化Tau肽结构的免疫原性分析

佐剂：ISA 51VG；CpG350μg/ml；0.2％tween 80

免疫接种时间表：0、3和6wpi

表11d.磷酸化Tau肽结构的免疫原性分析

佐剂：ISA 51VG；CpG3 50μg/ml；0.2％tween 80

免疫接种时间表：0、3和6wpi

表11e.磷酸化Tau肽结构的免疫原性分析

佐剂：ISA 51VG；CpG3 50μg/ml；0.2％tween 80

免疫接种时间表：0、3和6wpi

表12.含有来自Tau过度磷酸化和聚集部位的B细胞表位的Tau肽结构免疫原性分析

佐剂：ISA 51VG；CpG3：50μg/ml；0.2％tween 80

免疫接种时间表：0、3和6wpi

表13a.衍生自来自Tau 275-311区域的B细胞表位的Tau肽结构的免疫原性分析

佐剂：ISA 51VG；CpG3：50μg/ml；0.2％tween 80

免疫接种时间表：0、3和6wpi

表13b

表14.来自Tau氨基端‘绒毛状外壳’的Tau肽结构的免疫原性分析

佐剂：ISA 51VG；CpG3：50μg/ml；0.2％tween 80

免疫接种时间表：0、3和6wpi

表16.通过精细表位鉴定定位Tau 275-311内的免疫原性区域

Claims

1.一种以下述分子式代表的Tau肽免疫原构建体:

(Th)m–(A)n–(Tau片段)–X

或

(Tau片段)–(A)n–(Th)_m–X

其中

Th为异源性T辅助细胞表位；

A为异源性间隔物；

(Tau片段)为具有来自SEQ ID NO:100的全长Tau蛋白质约15至约40个氨基酸残基的B细胞表位；

X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2；

m为1至约4；以及

n为0至约10。

2.如权利要求第1项所述的Tau肽免疫原构建体，其中该Tau片段系选自由SEQ ID NOs:1-21和101-124组成的群组。

3.如权利要求第1或2项任一所述的Tau肽免疫原构建体，其中该T辅助细胞表位系选自由SEQ ID NOs:22-50组成的群组。

4.如权利要求第1项所述的Tau肽免疫原构建体，其中该肽免疫原构建体系选自由SEQID NOs:51-71和125-155组成的群组。

5.一种Tau肽免疫原构建体，包含：

包含来自SEQ ID NO:100的全长Tau蛋白质序列约15至约40个氨基酸残基的B细胞表位；

包含选自由SEQ ID NOs:22-50组成的群组之一氨基酸序列的T辅助细胞表位；以及

选自由氨基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys和ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQID NO:102)组成的群组的任选的异源性间隔物，

其中该B细胞表位系直接或通过该任选的异源性间隔物共价连接至该T辅助细胞表位。

6.如权利要求第5项所述的Tau肽免疫原构建体，其中该B细胞表位系选自由SEQ IDNOs:1-21和101-124组成的群组。

7.如权利要求第5项所述的Tau肽免疫原构建体，其中该T辅助细胞表位系选自由SEQID NOs:22-50组成的群组。

8.如权利要求第5项所述的Tau肽免疫原构建体，其中该任选的异源性间隔物为(α,ε-N)Lys或ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO:102)。

9.如权利要求第5项所述的Tau肽免疫原构建体，其中该T辅助细胞表位系共价连接至该B细胞表位的氨基端。

10.如权利要求第5项所述的Tau肽免疫原构建体，其中该T辅助细胞表位系通过该任选的异源性间隔物共价连接至该B细胞表位的氨基端。

11.一种包含如权利要求第1至4项任一所述的肽免疫原构建体的组合物。

12.一种药物组合物，包含：

a.如权利要求第1至4项任一所述的肽免疫原构建体；以及

b.药学上可接受的递送载体及/或佐剂。

13.如权利要求第12项所述的药物组合物，其中

a.该Tau肽免疫原构建体系选自由SEQ ID NOs:51-71和125-155组成的群组；以及

b.该Tau肽免疫原构建体与CpG寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide，ODN)混合以形成稳定的免疫刺激复合物。

14.一种分离抗体或其表位结合片段，其可特异性地结合至如权利要求第1至10项任一所述的该Tau肽免疫原构建体的该B细胞表位。

15.如权利要求第14项所述的分离抗体或其表位结合片段结合至该Tau肽免疫原构建体。

16.一种分离抗体或其表位结合片段，其可特异性地结合至如权利要求第1至10项任一所述的该Tau肽免疫原构建体的该B细胞表位。

17.一种包含如权利要求第14至16项任一所述的该分离抗体或其表位结合片段的组合物。