KR101926030B1 - 알츠하이머형 치매의 예방 및 면역요법을 위한 펩티드 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개별적인 Aβ 펩티드 면역원 구축물, 상기 Aβ 펩티드 면역원 구축물 및 그의 혼합물을 포함하는 펩티드 조성물, 상기 Aβ 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 백신 제제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이고, 여기서 개별적인 Aβ 펩티드 면역원 구축물은 알츠하이머 질환의 위험이 있거나 그 질환이 존재하는 환자에게 보호 면역 반응을 제공하는 Aβ 펩티드의 N-말단에 대해 작용하는 고 특이적 항체의 생성을 자극하기 위해 함께 작용하는 병원체 단백질로부터 유래된 이종 T 헬퍼 세포 (Th) 에피토프에 스페이서 잔기(들)을 통해 연결된 B 세포 (B) 에피토프로서 Aβ 펩티드의 N-말단을 갖는다.

Description

알츠하이머형 치매의 예방 및 면역요법을 위한 펩티드 백신{PEPTIDE VACCINE FOR PREVENTION AND IMMUNOTHERAPY OF DEMENTIA OF THE ALZHEIMER'S TYPE}

본원은 본 명세서에서 완전히 제시된 것처럼 그 전체가 참조로 포함되는, 2013년 3월 15일 출원된 미국 특허 출원 13/843,883을 기초로 한 우선권을 주장한다.

발명의 분야

본원은 알츠하이머형 치매의 예방 및 면역요법을 위한 펩티드-기반 백신 및 그의 제제에 관한 것이다.

알츠하이머 질환 (AD)은 인지 능력의 상실, 심각한 행동 이상, 및 사망을 특징으로 하는 만성 신경변성 질환인 치매의 가장 흔한 형태이다. 이것은 65세 이상 집단의 대략 10%에서 및 85세 이상 집단의 40%에서 발생한다. 심장 질환, 암 및 뇌졸중과 같은 다른 주요 사망 원인과는 달리, 알츠하이머 질환으로 인한 사망률은 의료 기술의 발전 때문에 보다 많은 개인이 치매 위험이 있는 나이까지 살게 되면서 향후 20 내지 30년에 걸쳐 크게 상승할 것이다. 미국에서 모든 의료 비용의 7-8%는 현재 치매와 관련된다. 현재 미국에 2.5 내지 4.0백만 명의 AD 환자가 살고 있고, 세계적으로는 17 내지 25백만 명의 환자가 살고 있다. 이러한 파괴적인 질환에 대한 명확한 치료 또는 치유법은 존재하지 않는다.

문헌 [Alois Alzheimer (1907)]에서 처음으로 규정된 바와 같이, 2개의 현미경적 침착물, 즉, 신경섬유 매듭 및 노인성 아밀로이드 플라크는 여전히 질환의 병리학적 특징이다. 알츠하이머 질환의 명확한 진단은 전통적으로 생검 또는 사후 조직병리학을 필요로 하였다. 최근에 인지 시험 및 척수액 내의 특이적 분자의 측정과 조합된, 양전자 방출 동위원소를 사용하여 아밀로이드 백신을 표지하는 리간드의 도입으로, 상기 질환의 보다 명확한 진단이 이제 조직병리학 없이도 이용가능하게 되었다.

노인성 아밀로이드 플라크의 주요 성분인 β-아밀로이드 (Aβ) 펩티드가 AD에서 중요한 역할을 수행함을 제시하는 상당한 증거가 축적되었다. β-아밀로이드 (Aβ) 펩티드에 대한 최신 검토 내용 (2013년 2월 13일 당시)은 그 링크가 본원에 참고로 포함된 위키페디아 (http://en.wikipedia.Org/wiki/Beta_amyloid#cite_note-wales2010-41)로부터 이용가능하다. AD에 대한 성공적인 질환-조절 요법은 뇌 내의 β-아밀로이드의 침착에 영향을 주는 생성물을 포함하는 것으로 보인다. 본 발명에 관련된 최근의 출판 문헌 ["Immunotherapy for Alzheimer's Disease" (Morgan D. J Int Med 2011; 269:54-63)]은 해당 분야의 검토 문헌으로서 참고로 포함된다.

알츠하이머 질환에 필요하지만 충분하지 않은 개시 인자는 Aβ 펩티드로 이루어진 아밀로이드 응집체의 축적이다. 알츠하이머 질환 및 다운 (Down) 증후군 환자의 가족성 형태의 유전학 (조발 알츠하이머 병상을 야기함)은 공통 요소로서 Aβ 펩티드의 보다 긴 C-말단 형태 (42개 아미노산 길이)의 과다 생성을 보인다. 상기 Aβ_{1 -42} 펩티드는 베타 시트 구조를 형성하고 올리고머 및 원섬유로 응집하기 쉽다. 상기 아밀로이드 침착물은 질환의 인지 증상의 개시 전에 뇌에 10년 이상 존재할 수 있다. 질환의 발병의 제2 단계는 과인산화된 미소관 결합 단백질 tau로부터 뉴런내 신경섬유 매듭의 형성이다. 다른 신경변성 질환은 또한 아밀로이드 침착물의 부재 하에 tau 병리상태에 의해 형성될 수 있지만, 이들은 임상 제시 및 뇌 내의 국지적인 병리학적 위치 둘 모두에서 알츠하이머와 상이하다. tau 트랜스제닉 (transgenic) 마우스 모델에서, tau 침착물은 아밀로이드의 두개내 주사 또는 Aβ 침착물을 생산하는 마우스와의 교배에 의해 침전될 수 있다. 또한, 항-Aβ 면역요법을 사용한 아밀로이드 침착의 방해는 다수의 도입유전자를 발현하는 마우스에서 tau 병리상태의 진행을 감소시킬 수 있다. tau 병리상태는 아밀로이드 병리상태보다 인지 상태와 더 잘 연관되는 것으로 보이고, 이것은 정신 기능장애의 보다 근인 (proximal cause)이라는 사실과 일치한다. 불명확한 메카니즘에 의해, 상기 병리상태는 시냅스 기능, 시냅스의 상실, 및 궁극적으로 상당한 뇌 위축을 야기하는 뉴런 상실을 유발한다.

관련되는 기계론적 (mechanistic) 단계에 대한 많은 가설이 존재한다. 올리고머로 언급되는, 아밀로이드 및/또는 tau의 중간 크기 응집체는 독성의 보다 직접적인 원인으로 고려된다. 질환의 가장 이른 시기인 "경도 인지 손상" (MCI) 기에도, 플라크 및 매듭 병리상태의 상당한 축적, 및 뉴런 상실이 존재하는 것으로 보인다. 이러한 관찰은 심혈관 질환에서 시행되는 것만큼, 가능한 가장 이른 시기의 질환의 치료가 알츠하이머 질환의 제어에 필수적일 것임을 시사한다.

1999년에, 백신 방법은 아밀로이드 전구체 단백질을 과다생산하는 트랜스제닉 마우스에서 아밀로이드 침착물을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 이후에, Aβ를 표적으로 하는 백신 또는 수동 면역요법은 상기 마우스에서 기억 결함을 구제하는 것으로 밝혀졌다. 면역계에서 능동적으로 생성되거나 수동적으로 투여된 Aβ-특이적 항체는 Aβ-아밀로이드증의 상이한 트랜스제닉 마우스 모델에서 플라크 부담 (burden)을 지속적으로 감소시킨다. 동물 모델에서 백신 접종의 성공, 및 알츠하이머 질환에 대한 임의의 대체 질환 조절 요법의 결여를 감안하여, Aβ-항체를 생성하기 위해 AD 환자의 면역계를 자극하는 제1 임상 시도는 원섬유로 응집되는, B 및 T 세포 에피토프를 모두 함유하는 전장 Aβ_{1 -42} 펩티드로 이루어진 AN1792로 불리는 백신으로 개시되었다. 약 60명의 환자를 1상 안전성 시험에서 하나 이상의 용량의 백신으로 처리하였다. 초기 관찰 중의 하나는 가변적인 항체 반응이었고, 많은 환자 백신은 표적 Aβ 펩티드 항원에 대한 검출가능한 항체 역가를 생성하지 못하였다. 많은 환자에서 상기 면역 반응의 결여는 2상 안전성 및 면역원성 시험에서 AN1792 백신 제제의 면역원성을 향상시키는 시도에서 QS-21을 아주반트 (adjuvant)로서 포함하는 백신 제제의 변화를 유도하였다. 그 목표는 다수회 접종을 통해 환자를 미리 정해진 항체 역가로 면역화하는 것이다. 그러나, 면역화는 중추신경계 (CNS)의 염증성 반응인 무균성 수막뇌병증이 발생한 일부의 환자 (-6%) 때문에 시험을 개시하고 얼마 되지 않아 중지되었다. CNS 염증의 이들 증상이 발생한 2명의 환자가 사망하였고, 후속 부검을 통해 수막 염증의 징후가 명백한 CNS의 T 세포 침윤이 존재하는 것으로 밝혀졌다. AN1792 백신 제제의 유해한 반응은 백신에 의해 야기된 자가면역 반응인 것으로 결론지어졌다 (Orgogozo JM, et al., Neurology 2003; 61:46-54). 효능의 관점에서, MRI에 의한 뇌 위축비율 또는 인지 능력의 차이는 백신과 위약 백신 투여자 사이에서 관찰되지 않았다.

AN1792 백신 실패에도 불구하고, 알츠하이머 질환의 면역요법을 위해 Aβ 펩티드에 대한 신규한 백신 전략 및 아주반트의 개발은 뛰어한 창의성이 필요한 분야가 되고 있다. 대부분의 경우에, 목적은 AN1792 환자에서 보인 전장 Aβ_{1 -42} 펩티드에 대한 백신을 사용한 인간 시험에서 발견된 유해 사건 때문에 최소 T 세포 관여 (적어도 Aβ에 대한)를 보이면서 B 세포 활성화 및 항체 생산을 개발하는 것이었다.

현재, 본 발명자와 동료들에 의해 관리되는 본 발명의 본 발명의 생성물 외에, Aβ 단편을 표적화하는 다양한 백신 설계 및 제제를 사용한 능동 면역화의 4개의 I/II기 임상 시험이 존재한다. 이들 시험은 다음을 포함한다: 면역원으로서 디프테리아 톡소이드 단백질에 접합된 Aβ_{1 -7} 아미노-말단 펩티드 단편을 사용하는 ACC-001 (엘란 코포레이션 인크. (Elan Corporation Inc.) 및 와이어쓰 (Wyeth)); 면역원으로서 Qβ 바이러스-유사 입자에 커플링된 Aβ_{1 -5} 아미노-말단 펩티드 단편을 사용하는 CAD106 (이뮤노드럭(Immunodrug)™; 시토스 바이오테크놀로지 아게 (Cytos Biotechnology AG) 및 노바티스 파마 아게 (Novartis Pharma AG)); 면역원으로서 ISCO-MATRIX에 접합된 Aβ 아미노-말단 펩티드를 사용하는 V950 (머크 (Merck)); 및 면역원으로서 운반체 분자에 접합된 Aβ 펩티드 모방체 (mimetic)를 사용하는 GSK/아피리스 (Affiris). 추가로, 문헌 [Tabira T (Tohoku J Exp Med 2010; 220:95-106)]에서 설명된 바와 같은 Aβ를 표적화하는 다른 백신 방안이 존재한다.

상기한 바와 같이, 현재 인간 시험에서 Aβ를 표적화하는 모든 백신 설계 및 제제는 이들 백신을 투여한 단지 30% 내지 대략 70% 내지 80%의 환자에서 표적 Aβ 펩티드에 대한 항체가 발생하고, 이것은 백신이 생성한 항-Aβ 항체의 효능에 대한 임의의 추가의 분석을 보다 복잡하게 만든다는 점에서 가변적인 항체 반응과 함께 약한 면역원성에 따른 문제점을 보인다. 대부분의 백신 설계는 복잡하고, 매우 짧은 Aβ 펩티드 단편을 운반체와 같은 큰 단백질 또는 바이러스 입자에 접합에 접합할 것을 필요로 하고, 따라서 이것은 대부분의 항체 반응이 짧은 표적 펩티드보다 요구되지 않은 운반체를 향하도록 유도하고; 복잡한 백신 설계가 대규모 제조 절차를 좌우하여, 품질 제어가 어렵고 비용-효과적이지 않다. 이들 백신은 사용되는 아주반트 및 제제의 잠재적인 Th1 활성화 특성 때문에 그의 안전성 특징이 불확실하다. 추가로, 지금까지, 어떠한 이들 백신도 백신을 투여받은 환자에서 임의의 임상 효능, 예컨대 인지 기능의 개선을 보이지 않았다.

선진국에서, AD는 사회에 가장 많은 비용을 치르게 하는 질환 중의 하나이다. 새로운 요법은 AD를 억제하거나, 발병을 지연시키거나 그 진행을 느리게 하는 것으로 판명되어야 하다. AD에 대해 마우스에서 면역학적 개입이 유망함을 보여주는 발견에도 불구하고, 알츠하이머형 치매의 예방 및 치료를 위한 Aβ를 표적화하는 안전하고 효과적인 인간 백신은 여전히 어려운 과제이다. 상기 논의된 바와 같이 전임상 또는 임상 시험에서 현재의 백신 설계 및 제제의 한계에 비추어, 알츠하이머형 치매의 예방 및 치료를 위해 광범하게 반응성인 면역요법을 제공하기 위한 안전하고 효과적인 백신 제제의 개발에 대한 충족되지 않은 긴급한 필요성이 존재한다. 그러한 백신 제제가 알츠하이머 병리상태에 대해 성공적일 때, 질환의 억제를 위한 표준 방법 중의 하나가 될 것이다.

본원은 개별적인 Aβ 펩티드 면역원 구축물, 상기 Aβ 펩티드 면역원 구축물 및 그의 혼합물을 포함하는 펩티드 조성물, 상기 Aβ 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 백신 제제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이고, 여기서 개별적인 Aβ 펩티드 면역원 구축물은 알츠하이머 질환의 위험이 있거나 그 질환이 존재하는 환자에게 보호 면역 반응을 제공하는 Aβ 펩티드의 N-말단에 대해 작용하는 고 특이적 항체의 생성을 자극하기 위해 함께 작용하는 병원체 단백질로부터 유래된 이종 T 헬퍼 (helper) 세포 (Th) 에피토프에 스페이서 잔기(들)을 통해 연결된 B 세포 (B) 에피토프로서 Aβ 펩티드의 N-말단을 갖는다.

한 실시양태에서, Aβ 펩티드 면역원 구축물은 노인성 플라크에서 전장 Aβ_{1 -42} 펩티드 (서열 1)와 교차반응성인 고 특이적 항체의 생성을 자극하기 위해 함께 작용하는 병원성 단백질, 예컨대 홍역 바이러스 융합 (MVF) 단백질 (서열 34)로부터 유래된 이종 Th 에피토프에 연결된 Aβ_{1 -42} 펩티드의 아미노 말단으로부터의 10 내지 14개의 아미노산 길이의 B 세포 항원 부위, 예를 들어 Aβ_{1 -10}, Aβ_{1 -12}, Aβ_{1 -14}를 갖는 하이브리드 Aβ 펩티드를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, Aβ 펩티드 면역원 구축물은 노인성 플라크에서 전장 Aβ_{1 -42} 펩티드와 교차반응성인 항체를 유도할 수 있는 다양한 병원성 단백질 (서열 33 내지 47)로부터 유래된 이종 Th 에피토프에 연결된 B 세포 항원 부위 Aβ_{1 -14} 펩티드를 갖는 하이브리드 펩티드를 포함한다. B 세포 항원 부위 Aβ_{1 -14} 펩티드를 향상시키기 위해 사용되는 이종 Th 에피토프 중에서, 천연 병원체 디프테리아 독소 (서열 37), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum: 열대열원충) (서열 38), 콜레라 독소 (서열 40)로부터 유래된 Th 에피토프, 및 단일 서열 또는 조합 서열 형태의 홍역 바이러스 융합 단백질 (MVF 1 내지 5) 및 B형 간염 표면 항원 (HBsAg 1 내지 3)로부터 유래된 이상적인 인공 Th 에피토프 (예를 들어 서열 34 및 41 내지 47)가 면역원성 스크리닝 시험을 통해 상기 B 세포 항원성 향상에서 특히 유용한 것으로 밝혀졌다. 다른 실시양태에서, 상이한 병원체로부터 유래된 이종 Th 에피토프와 Aβ 펩티드 면역원 구축물의 혼합물을 포함하는 펩티드 조성물은 환자의 넓은 유전자 배경의 적용 범위를 허용하여, 알츠하이머형 치매의 치료 및 예방을 위한 백신 면역화시에 보다 높은 반응자 비율을 유도하기 위해 사용된다. 한 실시양태에서, Aβ 펩티드 면역원 구축물 (서열 62 및 63)은 다양한 유전자 배경을 갖는 백신 숙주 집단의 최대 적용 범위를 허용하기 위해 백신 제제에 사용하기 위해 조합 형태의 MVF 및 HBsAg로부터 유래된 이종 Th 에피토프 (서열 44 및 45)와 등몰비로 혼합된다. Aβ 펩티드 면역원 구축물의 상승적 (synergistic) 향상은 본 발명의 펩티드 조성물에서 관찰되었고, 항체 반응은 전장 Aβ_{1 - 42}에 대한 요구되는 교차 반응성에 대부분 (>90%) 초점을 맞추었고, 면역원성 향상을 위해 사용된 이종 Th 에피토프에 대한 반응성은 있다 하여도 매우 작았다. 이것은 상기 펩티드 항원성 향상을 위해 사용되는 통상의 단백질 또는 다른 생물학적 운반체와 매우 대조적이다. 또 다른 실시양태에서, 고도로 정제된 Aβ 펩티드 면역원 구축물 (서열 64 및 65)과 단일 서열 형태의 MVF 및 HBsAg로부터 유래된 이종 Th 에피토프 (서열 46 및 47)는 다양한 유전자 배경을 갖는 백신 숙주 집단의 최대 적용 범위를 허용하기 위해 백신 제제에 사용하기 위해 임의로 등몰비로 혼합된다.

본 개시내용은 또한 알츠하이머형 치매의 치료 및 예방을 위한 백신 제제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 몇몇 실시양태에서, 제약 조성물은 노인성 플라크에 존재하는 전장 Aβ_{1 -42}와 목적하는 교차반응성을 향한 Aβ 펩티드 면역원성을 추가로 향상시키기 위해 정전기 회합을 통해 Aβ 펩티드 면역원 구축물의 혼합물을 포함하는 펩티드 조성물과 CpG 올리고머를 혼합함으로써 형성된 안정화된 면역자극 복합체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 현탁액 백신 제제를 형성하기 위해 아주반트로서 명반 (alum) 겔 (알히드로겔 (Alhydrogel)) 또는 인산알루미늄 (아주포스 (Adjuphos))를 포함하는 무기염과 접촉하는 Aβ 펩티드 면역원 구축물의 혼합물의 펩티드 조성물을 포함하는 제약 조성물을 백신 숙주에 투여하기 위해 사용하였다. 추가의 또 다른 실시양태에서, CpG 올리고머와 안정화된 면역자극 복합체를 형성하는 Aβ 펩티드 면역원 구축물의 혼합물의 펩티드 조성물을 포함하는 제약 조성물은 백신 숙주에 투여하기 위한 현탁액 백신 제제를 형성하기 위해 고 안정성 인자와 함께 아주반트로서 명반 겔 (알히드로겔) 또는 인산알루미늄 (아주포스)를 포함하는 무기염과 임의로 혼합된다.

개시내용은 또한 알츠하이머형 치매의 치료 및 예방 방법을 포함한다. 개시된 방법은 알츠하이머 질환의 위험이 있거나 이 질환이 존재하는 환자에게 투여하기 위한, 임의로 아주반트로서의 무기염으로 추가로 보충된, 임의로 CpG 올리고머와 안정한 면역자극 복합체를 형성하는 본 발명의 Aβ 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 현탁액 백신 제제를 포함하는 제약 조성물을 이용한다. 이들 실시양태에서, Aβ 펩티드 면역원 구축물 및 그로부터 유래된 백신 제제를 포함하는 제약 조성물은 시험관 내에서 원섬유 제제를 억제하고 응집된 Aβ 올리고머에 의해 매개되는, PC12 세포주 세포에 의해 제시되는 뉴런 세포에 대한 세포독성을 시험관 내에서 감소시키기 위해 전장 Aβ_{1 -42} 펩티드에 대한 항체를 유도할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, Aβ 펩티드 면역원 구축물로부터 유래된 백신 제제를 투여한 동물 또는 환자는 전장 Aβ_1-42 펩티드에 대한 유의한 항체가 발생하였고, 백신 숙주의 혈장 및 혈청에서 상승된 수준의 Aβ_{1 -40}에 의해 입증되는 바와 같이 상기 독성 Aβ 펩티드를 중추신경계로부터 말초부 내로 운반하는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 놀랍게도 Aβ 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 백신 제제는 알츠하이머형 치매로 고통 받는 온혈 동물, 특히 인간에게 유리하게 근육내 적용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 추가의 또 다른 측면에서, 백신 제제는 2가지 Aβ 펩티드 면역원 구축물 (서열 64 및 65)의 근육내 투여를 위한 투여 형태를 제공한다. 근육내 주사를 위한 바람직한 투여 형태는 아주반트로서 0.5 mL 무기염으로 보충된, 바람직하게는 100 ㎍ 내지 400 ㎍/0.5 mL, 보다 바람직하게는 300 ㎍/0.5 mL의 CpG 올리고머와 복합체화된 30 ㎍ 내지 1000 ㎍/0.5 mL의 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 백신 제제이다. 투여 형태는 2년 초과의 기간 동안 안정하고, 사용 직전까지 2 내지 8℃에서 유지될 수 있다. 투여 형태는 온혈 동물에게, 특히 팔에 주사기를 사용한 근육내 주사에 의해 바람직하게는 투여된다. 투여 형태의 예열 (warming up)을 위해, 투여 형태는 주위 온도에서 약 15분 내지 45분, 예를 들어 30분 동안 유지될 수 있다. 바람직하게는, 약물 물질을 빼내기 전에, 잠재적인 육안으로 보이지 않는 입자의 분산을 위해 바이알을 약하게 여러 번 뒤집는다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 놀랍게도 Aβ 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 백신 제제는 우수한 에피토프 맵핑 (mapping) 연구에 의해 입증되는 바와 같이 노인성 플라크에서 아미노산 "아스파르트산 (D)"이 Aβ_{1 -42} 펩티드 올리고머, 응집체의 외부 부분에 노출된 Aβ_{1 -10} 펩티드로 표시되는 Aβ 펩티드의 N-말단에 대해 주로 작용하는 고 특이적 항체를 유도하기 위해 알츠하이머형 치매로 고통 받는 온혈 동물, 특히 히말라야 원숭이 (rhesus macaque) 및 인간에게 유리하게 근육내 적용될 수 있음이 밝혀졌다. 본 발명의 추가의 또 다른 측면에서, 놀랍게도 Aβ 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 백신 제제는 상기 백신 제제를 투여한 모든 동물 및 모든 환자에서 Aβ_{1 -42} 펩티드의 N-말단에 대해 주로 작용하는 고 특이적 항체를 유도하기 위해 알츠하이머형 치매로 고통 받는 온혈 동물, 특히 히말라야 원숭이 및 인간에게 유리하게 근육내 적용되어, 백신 개발 역사에서 극히 드문 100% 항체 반응 비율을 달성할 수 있음이 밝혀졌다. 본 발명의 추가의 또 다른 측면에서, 놀랍게도 본 발명의 Aβ 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 백신 제제는 알츠하이머 질환 환자의 면역요법이 처음 조사되었기 때문에 전례가 없는 인지 점수 (ADAS-Cog, ADCS-CGIC, MMSE)의 유의한 개선을 보이면서, 임상적으로 경도 알츠하이머 질환 범주에 속하는 60세 이상의 환자에게 유리하게 근육내 적용될 수 있음이 밝혀졌다.

본 발명의 추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 초기 면역화 0, 4, 및 8주 후의 3회 주사에 의한 프라이밍 (priming) 후에 전장 Aβ 펩티드에 대한 환자의 항체 반응에 따라 30 ㎍ 내지 750 ㎍, 바람직하게는 100 ㎍ 내지 400 ㎍, 보다 바람직하게는 약 300 ㎍을 그를 필요로 하는 인간 환자에게 약 12주마다 1회, 바람직하게는 약 26주마다 1회, 및 특히 약 52주마다 1회 투여하는 것을 포함하는 인간 환자에서 알츠하이머형 치매의 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.

상기 언급된 질환의 치료에서 백신 제제 및 Aβ 펩티드 면역원 구축물의 유용성은 적합한 임상 연구, 예를 들어 실시예에서 설명되는 연구에 의해, 예를 들어 매회 300 ㎍/0.5 mL/용량 백신 제제를 9개월 초과의 기간 동안 0, 4, 및 12주에 총 3회 투여를 적용함으로써 추가로 확인될 수 있다. 항체 역가에 따라 3, 6 또는 12개월마다 1회의 후속 면역화가 수행될 수 있다.

적합한 임상 연구는 알츠하이머 질환의 위험이 있거나 또는 알츠하이머 질환의 증상이 존재하는 환자에서 공개 (open label) 연구 또는 특히 무작위, 이중-맹검, 위약-대조, 병행 연구이다.

본 개시내용은 또한 알츠하이머 질환의 위험이 있거나 또는 알츠하이머 질환이 존재하는 동물 및 환자를 보호할 수 있는 Aβ 펩티드 면역원 구축물, 및 전달 시스템의 저비용 제조 및 품질 제어 방법을 제공한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 Aβ 펩티드 면역원 구축물의 백신 제제를 투여한 환자에 의해 유도된 Aβ_{1 -42}에 대한 인간 모노클로날 항체를 제공한다. 인간 환자의 혈액으로부터 단리된 B 세포로부터 인간 모노클로날 항체를 제조하는 효율적인 방법은 본원에 참고로 포함된 문헌 [Elisabetta Traggiai et al., Nature Medicine 10, 871-875 (2004)]에 기재되어 있다.

참고문헌:

도 1은 본원에 개시된 특정 실시양태에 따른 백신 제제의 발견으로부터 상업화 (산업화)까지의 개발 과정을 보여주는 흐름도이다. 본 개시내용은 이 흐름도에 요약된 펩티드 면역원 설계, 펩티드 조성물 설계, 백신 제제 설계, 시험관 내 기능적 항원성 설계, 생체 내 면역원성 및 효능 연구 설계, 투여 방식 설계, 및 임상 프로토콜 설계를 포함한다. 즐겁고 불편한 놀라움과 함께, 합리적인 설계를 기초로 하여 고도로 안전하고 효과적인 백신 제제의 상업화의 최종적인 성공을 이끄는 각각의 단계의 상세한 평가가 본원에서 추가로 설명된다.
도 2a는 용리 시간이 20분인 고도로 정제된 Aβ 펩티드 면역원 구축물 (서열 65)의 HPLC 프로파일을 보여준다.
도 2b는 용리 시간이 21분인 고도로 정제된 Aβ 펩티드 면역원 구축물 (서열 64)의 HPLC 프로파일을 보여준다.
도 2c는 이론적 분자량이 3892.52인 Aβ 펩티드 면역원 구축물 (서열 65)에 대한, 분자량이 3892.274에서 측정된 질량 분광 분석 (MALDI-TOF) 프로파일이고, UBI AD 백신 (UB-311) 제제에서 활성 제약 성분으로서 사용되는 분자의 특성의 높은 정밀도를 보여준다.
도 2d는 이론적 분자량이 4374.07인 Aβ 펩티드 면역원 구축물 (서열 64)에 대한, 분자량이 4374.568에서 측정된 질량 분광 분석 (MALDI-TOF) 프로파일이고, UBI AD 백신 (UB-311) 제제에서 활성 제약 성분으로서 사용되는 분자의 특성의 높은 정밀도를 보여준다.
도 2e는 용리 시간이 각각 20분 및 21분인 고도로 정제된 Aβ 펩티드 면역원 구축물 (서열 65 및 64)의 HPLC 프로파일을 보여준다. 2가지 Aβ 펩티드 면역원 구축물 (서열 64 및 65)은 3년에 걸쳐 2-8℃에서 보관된 후에 UB-311 백신 제제로부터 추출하였고, 이것은 이전에 혼합된 등몰비에서의 용리 시간을 갖는 예상된 HPLC 프로파일을 보이고 상기 합리적 설계 백신 제제의 높은 정밀도 특성을 입증한다.
도 3a는 광범한 문헌 검색을 기초로 한, Th 펩티드 서열 46의 HLA 클래스 II 결합 모티프를 보여준다. 백신이 투여되는 환자의 유전자 배경의 최대 적용 범위에 의해 면역 반응을 확장하기 위해 2가지 Aβ 펩티드 면역원 구축물 (서열 64 및 65)의 조합물을 사용하기로 결정하였다.
도 3b는 광범한 문헌 검색을 기초로 한, Th 펩티드 서열 47의 HLA 클래스 II 결합 모티프를 보여준다. 백신이 투여되는 환자의 유전자 배경의 최대 적용 범위에 의해 면역 반응을 확장하기 위해 2가지 Aβ 펩티드 면역원 구축물 (서열 64 및 65)의 조합물을 사용하기로 결정하였다.
도 4는 상이한 양 (0, 10, 30, 100 내지 300 ㎍/0.5 mL 용량)의 Aβ 펩티드 면역원 구축물 (서열 64 및 65)을 고정량의 무기염과 조합하여 포함한 백신 제제에 대한 기니 피그 (guinea pig)의 26주 기간에 걸친 항체 반응의 운동학을 보여준다.
도 5a는 Aβ 펩티드 면역원 구축물과 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN) 사이의 전하 회합/중화를 통한 안정한 펩티드/CpG 면역자극 복합체의 제조를 위한 모식도이다.
도 5b는 그러한 면역자극 복합체 및 알루미늄-기반 무기염을 포함하는 무기염-기반 백신 현탁액의 제조를 위한 도 5a에 후속적인 모식도이다.
도 6은 상이한 아주반트 (알히드로겔/NaCl+CpG ODN; 아주포스/NaCl+CpG ODN; 및 NaCl+CpG ODN)의 존재 하에 Aβ 펩티드 면역원 구축물의 300 ㎍/0.5 mL/용량에서 백신 제제의 개코원숭이에서 10주 기간에 걸친 항체 반응의 운동학을 보여준다.
도 7: 2 내지 8℃에서 2년 보관한 후, Aβ 펩티드 면역원 구축물 (등몰비의 서열 64 및 65)을 포함하는 UBI AD 백신의 기니 피그에서의 면역원성 연구. UBI AD 백신은 표준 프라임 (prime) 및 부스트 (boost) (3 wpi) 프로토콜 후에 고 면역원성 및 안정한 상태로 유지되었다.
도 8a: 인간 AD 뇌로부터의 뇌 혈관은 면역전 개코원숭이 혈청으로부터의 IgG 분획으로 면역조직화학적으로 염색되지 않는다.
도 8b: 인간 AD 뇌로부터의 뇌 혈관은 등몰비의 Aβ 펩티드 면역원 구축물 서열 62 및 63으로 면역화된 개코원숭이로부터의 과다면역 혈청으로부터 정제된 IgG에 의한 면역조직화학적 염색을 보여준다.
도 8c: 인간 AD 뇌로부터의 뇌 혈관은 Aβ_{1 -14} 펩티드와 함께 예비 인큐베이팅된, 도 8b에 대해 설명된 과다면역 혈청으로부터 정제된 IgG로 면역조직화학적으로 염색되지 않는다. 이 도면은 Aβ_{1 -14} 펩티드와의 예비 인큐베이팅이 과다면역 혈청으로부터 정제된 IgG에 의한 뇌 혈관의 모든 면역반응성을 흡수해버림을 보여주고, 이것은 Aβ 펩티드 면역원 구축물 (서열 62 및 63)을 포함하는 백신 제제를 사용한 백신 접종에 의한 과다면역 혈청의 높은 특이성을 입증한다.
도 8d: 인간 AD 뇌로부터의 뇌 혈관은 비-관련 펩티드와 함께 예비 인큐베이팅된, 도 8b에 대해 설명된 과다면역 혈청으로부터 정제된 IgG에 의한 면역조직화학적 염색을 보인다.
도 8e: 인간 AD 뇌로부터의 아밀로이드 플라크는 면역전 개코원숭이 혈청로부터의 IgG 분획으로 면역조직화학적으로 염색되지 않는다.
도 8f: 인간 AD 뇌로부터의 아밀로이드 플라크는 등몰비의 Aβ 펩티드 면역원 구축물 서열 62 및 63으로 면역화된 개코원숭이로부터의 과다면역 혈청으로부터 정제된 IgG에 의한 면역조직화학적 염색을 보인다.
도 8g: 인간 AD 뇌로부터의 아밀로이드 플라크는 Aβ_{1 -14} 펩티드와 함께 예비 인큐베이팅된, 도 8b에 대해 설명된 과다면역 혈청으로부터의 정제된 IgG로 면역조직화학적으로 염색되지 않는다. 이 도면은 Aβ_{1 -14} 펩티드와의 예비 인큐베이팅이 과다면역 혈청으로부터 정제된 IgG에 의한 뇌 혈관의 모든 면역반응성을 흡수해버림을 보여주고, 이것은 Aβ 펩티드 면역원 구축물 (서열 62 및 63)을 포함하는 백신 제제를 사용한 백신 접종에 의한 과다면역 혈청의 높은 특이성을 입증한다.
도 8h: 인간 AD 뇌로부터의 아밀로이드 플라크는 비-관련 펩티드와 함께 예비 인큐베이팅된, 도 8b에 대해 설명된 과다면역 혈청으로부터 정제된 IgG에 의한 면역조직화학적 염색을 보인다.
도 9: 성체 개코원숭이, 피. 아누비스(P. anubis)에서 UBI AD 백신의 면역원성 연구. (파트 A) 무기염 내에 제제화된 300 ㎍/용량의 UBI AD 백신 (◆, ▲, ●, ■) 으로 0, 3, 6주 (화살표)에 면역화되고 ELISA에 의해 항-Aβ 항체 역가에 대해 검정된 개별 개코원숭이. 4마리의 개코원숭이 중 3마리가 최초의 면역화 후에 항-Aβ 항체 역가를 생성하였음을 유의한다. (파트 B) 무기염 내에 제제화된 300 ㎍ (저용량, ●, ■) 또는 1200 ㎍ (고용량, ◆, ▲)의 UBI AD 백신으로 72주 휴식 기간 후에 78, 81 및 104주 (화살표)에 면역화되고 항-Aβ 항체 역가에 대해 검정된 개별 개코원숭이. 4마리의 개코원숭이 모두가 단일 백신 부스트 후에 강력한 항-Aβ 항체 반응을 나타내었음을 유의한다. 2년 연구 기간의 끝에, 4마리의 모든 개코원숭이는 건강하고 활발한 상태로 유지되었다.
도 10a: hAPP751을 과다발현하는 어린 트랜스제닉 마우스로부터 피질의 뇌 형태에 대한 예방 방식에서 UBI AD 백신의 효과. 아주반트 단독으로 처리된 트랜스제닉 마우스, UBI AD 백신으로 처리된 마우스로부터의 반응자, 및 비-처리된 마우스로부터 얻은 뇌 샘플을 아밀로이드 베타 플라크 로드 (load)에 대해 분석하였고, 비처리된 마우스 및 아주반트 단독으로 처리된 마우스에 비해 UBI AD 처리 반응자 마우스에서 플라크의 수 감소 및 "㎛²당 더 작은 평균 플라크 크기"를 보였다.
도 10b: hAPP751을 과다발현하는 어린 트랜스제닉 마우스로부터 해마의 뇌 형태에 대한 예방 방식에서 UBI AD 백신의 효과. 아주반트 단독으로 처리된 트랜스제닉 마우스, UBI AD 백신으로 처리된 마우스로부터의 반응자, 및 비-처리된 마우스로부터 얻은 뇌 샘플을 아밀로이드 베타 플라크 로드에 대해 분석하였고, 비처리된 마우스 및 아주반트 단독으로 처리된 마우스에 비해 UBI AD 처리 반응자 마우스에서 플라크의 수 감소 및 "㎛²당 더 작은 평균 플라크 크기"를 보였다.
도 11a: hAPP751을 과다발현하는 어린 트랜스제닉 마우스로부터 뇌 조직 추출액 내의 아밀로이드 β-펩티드 (Aβ_{1 - 42})에 대한 예방 방식에서 UBI AD 백신의 효과. 작은 원시섬유 (protofibril)를 뇌 조직의 생화학적 추출의 트리톤 (Triton) X-100 분획으로부터 얻었다. UBI AD 백신으로 처리된 트랜스제닉 반응자 마우스는 비처리된 트랜스제닉 마우스로부터의 트리톤 X-100 분획으로부터 얻은 뇌 조직 추출액에 비해 훨씬 더 적은 원시섬유를 갖는 것으로 밝혀졌다.
도 11b: hAPP751을 과다발현하는 어린 트랜스제닉 마우스로부터 뇌 조직 추출액 내의 아밀로이드 β-펩티드 (Aβ_{1 -42}) 농도에 대한 예방 방식에서 UBI AD 백신의 효과. 큰 올리고머 및 원섬유를 뇌 조직의 생화학적 추출액의 SDS 세제 분획으로부터 얻었다. UBI AD 백신으로 처리된 트랜스제닉 반응자 마우스는 비처리된 트랜스제닉 마우스로부터의 SDS 분획으로부터 얻은 뇌 조직 추출액에 비해 훨씬 더 적은 큰 올리고머 및 원섬유를 갖는 것으로 밝혀졌다.
도 12: 환자에서 UBI AD 백신 처리 후의 평균 항-Aβ_{1 -14} 항체 역가. 2 세트의 데이타를 플로팅하였고, 여기서 한 세트는 시험 기간 동안 제0주 내지 24/26주로부터 얻은 데이타를 이용하고 (n = 17, 실선), 다른 세트는 추적 관찰 기간을 포함하여 제0주 내지 제48주로부터 얻은 데이타를 이용하였다 (n = 13, 쇄선). Aβ_{1 -14} 항체 log₁₀ 역가는 시간에 걸쳐 감소하지만, 연구 종료 (제48주)시에 모든 대상체에서 양성으로 유지되었다.
도 13: UBI AD 백신 시험을 거친 기준선 MMSE 점수가 20이상인 60세 이상의 대상체에서 제0주 내지 제48주의 평균 ADAS-Cog (속이 찬 원), MMSE (속이 빈 원) 점수 및 항-Aβ_1-14 항체 역가 (속이 찬 막대).
도 14: 경도 AD가 존재하는 60세 초과의 UBI AD 백신 (속이 찬 원)과 타렌플러빌 (Tarenflurbil) 시험에서 경도 AD가 존재하는 위약군 (속이 찬 삼각형) 사이의 12개월 기간에 걸친 평균 ADAS-Cog 점수의 변화. 경도 AD가 존재하는 60세 이상의 6명의 대상체는 타렌플러빌 시험에서 위약을 투여한 경도 AD가 존재하는 대상체에 비해 제0주, 제4주, 제12주에 UBI AD 백신을 사용한 면역화 4, 6, 12개월 후에 평가할 때 감소된 점수 (-3.00 변화)의 개선을 보였고 (Green et al., JAMA 2009; 302(23):257-2564), 동일한 시간에 걸쳐 증가된 점수 (3.81 변화)의 불량한 반응을 보였다.
도 15a: I상 임상 시험에서 UBI AD 백신을 투여한 환자에서 면역원성 연구. 경도 내지 중등도 알츠하이머 질환이 존재하는 모든 19명의 개체로부터의 혈청 샘플을 항-Aβ 항체에 대해 처리 전 (V1/V2; 연회색 막대) 및 제16주에 면역화 후 (V7; 흑색 막대)에 평가하였다. Aβ_{1 -28} 단량체에 대한 항체 역가 (log₁₀)는 처리 전 방문 및 0, 4, 및 12주에 전달된 UBI AD 백신의 3회 백신 접종의 마지막 접종 4주 후인 제16주에 수집된 혈청 샘플을 사용하여 ELISA 시험에 의해 평가하였다. 항체 반응성은 처리 전 샘플에서 거의 또는 전혀 발견되지 않았다 (따라서, 대부분의 쌍을 이룬 (paired) 데이타 비교에서 막대가 존재하지 않는다). 모든 개체는 도 16에 도시된 바와 같이 Aβ 펩티드의 N-말단에 위치하는 Aβ_1-28 단량체 처리 후에 고역가 항-Aβ 항체를 생성하였다.
도 15b: I상 임상 시험에서 UBI AD 백신을 투여한 환자에서 면역원성 연구. 경도 내지 중등도 알츠하이머 질환이 존재하는 모든 19명의 개체로부터의 혈청 샘플을 항-Aβ 항체에 대해 처리 전 (V1/V2; 연회색 막대) 및 제16주에 면역화 후 (V7; 흑색 막대)에 평가하였다. Aβ_{1 -42} 단량체에 대한 항체 역가 (log₁₀)는 처리 전 방문 및 0, 4, 및 12주에 전달된 UBI AD 백신의 3회 백신 접종의 마지막 접종 4주 후인 제16주에 수집된 혈청 샘플을 사용하여 ELISA 시험에 의해 평가하였다. 항체 반응성은 처리 전 샘플에서 거의 또는 전혀 발견되지 않았다 (따라서, 대부분의 쌍을 이룬 데이타 비교에서 막대가 존재하지 않는다). 모든 개체는 도 16에 도시된 바와 같이 Aβ 펩티드의 N-말단에 위치하는 Aβ_1-42 단량체 처리 후에 고역가 항-Aβ 항체를 생성하였다.
도 15c: I상 임상 시험에서 UBI AD 백신을 투여한 환자에서 면역원성 연구. 경도 내지 중등도 알츠하이머 질환이 존재하는 모든 19명의 개체로부터의 혈청 샘플을 항-Aβ 항체에 대해 처리 전 (V1/V2; 연회색 막대) 및 제16주에 면역화 후 (V7; 흑색 막대)에 평가하였다. Aβ_{1 -42} 올리고머에 대한 항체 역가 (log₁₀)는 처리 전 방문 및 0, 4, 및 12주에 전달된 UBI AD 백신의 3회 백신 접종의 마지막 접종 4주 후인 제16주에 수집된 혈청 샘플을 사용하여 ELISA 시험에 의해 평가하였다. 항체 반응성은 처리 전 샘플에서 거의 또는 전혀 발견되지 않았다 (따라서, 대부분의 쌍을 이룬 데이타 비교에서 막대가 존재하지 않는다). 모든 개체는 도 16에 도시된 바와 같이 Aβ 펩티드의 N-말단에 위치하는 Aβ_1-42 올리고머 처리 후에 고역가 항-Aβ 항체를 생성하였다.
도 16: 알츠하이머 질환이 존재하는 면역화된 환자로부터의 혈청에 의한 Aβ_{1 -42}의 N-말단에서의 우수한 특이성 분석을 위한 에피토프 맵핑. UBI AD 백신으로 면역화된 환자로부터 제16주에 수집된 혈청 샘플에서 항체에 의해 인식되는 우세한 에피토프는 Aβ_{1 -10} 펩티드에 특이적이다. 이 그래프는 3 용량의 UBI AD 백신을 투여하고 Aβ_{1 -14} 펩티드에 대해 2.198의 항-Aβ 항체 log₁₀ 역가를 생성한 1명의 개체 (P210)의 전형적인 양성 에피토프-맵핑 반응을 보여준다. 혈청을 에피토프 맵핑을 위해 1:50으로 희석하였다. 피크 높이는 상이한 10량체 Aβ 펩티드 (서열 6, 8 내지 30)에 대한 대상체의 샘플의 최대 억제 농도의 1/2 (IC50)을 나타낸다. 아미노-말단 Aβ 서열 (서열 6) (Aβ_1-10: DAEFRHDSGY)에 고도로 특이적인 면역반응성에 대응하는 단일 주요 피크가 관찰된다.

본 개시내용은 개별적인 Aβ 펩티드 면역원 구축물, 상기 Aβ 펩티드 면역원 구축물 및 그의 혼합물을 포함하는 펩티드 조성물, 백신 제제에 상기 펩티드 조성물을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이고, 여기서 개별적인 Aβ 펩티드 면역원 구축물은 알츠하이머 질환의 위험이 있거나 그 질환이 존재하는 환자에게 보호 면역 반응을 제공하는 Aβ_1-42 펩티드의 N-말단에 대해 작용하는 특이적 항체의 생성을 자극하기 위해 함께 작용하는 병원체의 단백질로부터의 이종 T 헬퍼 세포 (Th) 에피토프에 스페이서 잔기(들)을 통해 연결된 B 세포 (B) 에피토프로서 Aβ 펩티드의 N-말단 (Aβ_{1 -10} 내지 Aβ_{1 - 14})을 갖는다.

본 개시내용은 또한 알츠하이머 질환의 치료 및 예방 방법을 포함한다. 개시된 방법은 알츠하이머 질환의 위험이 있거나 그 질환이 존재하는 환자에게 투여하기 위한, 임의로 정전기 회합을 통해 고도로 음 대전된 올리고뉴클레오티드, 예컨대 CpG 올리고머와 안정한 면역자극 복합체를 형성하는 Aβ 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 현탁액 백신 제제를 포함하는 제약 조성물을 이용하고, 상기 복합체는 임의로 아주반트로서 무기염으로 추가로 보충된다. 본 개시내용은 또한 알츠하이머 질환의 위험이 있거나 그 질환이 존재하는 환자의 예방 및 치료를 위해 Aβ 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 백신 제제의 투여를 위한 투여 요법, 투여 방식 및 투여 형태로 백신 제제를 이용하는 방법을 포함한다.

본 개시내용은 또한 알츠하이머 질환의 위험이 있거나 또는 알츠하이머 질환이 존재하는 동물 및 환자를 보호할 수 있는 Aβ 펩티드 면역원 구축물 및 백신 제제의 저비용 제조 및 품질 제어 방법을 제공한다. 본 발명은 안정화된 면역자극 복합체, 및 안정화된 면역자극 복합체의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 생체 내에서 개선된 면역 반응을 갖는 백신 전달 시스템에 유용한, Aβ 펩티드 면역원 구축물 및 고도로 음대전된 올리고뉴클레오티드, 예컨대 CpG 올리고머를 포함하는 안정화된 합성 면역자극 복합체를 제공한다. 이들 면역자극 복합체는 또한 제어 방출을 위한 데포 (depot)로서 기능하도록 설계된 백신 제제의 제조에 유용하다.

추가의 측면에서, 본 발명은 이전에 본 발명의 Aβ 펩티드 면역원 구축물의 백신 제제를 투여한 환자의 혈액으로부터 단리된 B 세포에 의해 유도된 Aβ_{1 -42}에 대한 인간 모노클로날 항체를 제공한다.

(a) 아밀로이드 베타 ( Aβ ) 펩티드

명칭 "베타 아밀로이드" 하의 위키페디아 내의 항목은 그에 대한 최신 검토 내용을 제공한다 (http://en.wikipedia.org/wiki/Beta_amyloid). 상기 항목에 대한 인터넷 링크는 본원에 참고로 포함된다.

아밀로이드 베타 (Aβ 또는 A베타)는 아밀로이드 전구체 단백질로부터 프로세싱된 36-43개 아미노산의 펩티드이다. Aβ는 알츠하이머 질환 환자의 뇌에서 발견되는 침착물의 주성분이다. 또한, Aβ는 유의한 비-병리학적 활성을 갖는 고도로 다기능성인 펩티드라는 증거가 발견되었다.

Aβ는 기능이 결정되지 않은 막횡단 (transmembrane) 당단백질인 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 순차적인 절단 후에 형성된다. APP는 α-, β- 및 γ-세크레타제에 의해 프로세싱될 수 있고; Aβ 단백질은 β 및 γ 세크레타제의 연속적인 작용에 의해 생성된다. Aβ 펩티드의 C-말단 단부를 생산하는 γ 세크레타제는 APP의 막횡단 영역 내를 절단하고, 36-43개의 아미노산 잔기 길이의 많은 이소형을 생성할 수 있다. 가장 통상적인 이소형은 Aβ_{1 -40} (서열 2) 및 Aβ_{1 -42} (서열 1)이고; 더 긴 형태는 전형적으로 소포체에서 이루어진 절단에 의해 생산되고, 더 짧은 형태는 트랜스-골지망 (trans-Golgi network)에서의 절단에 의해 생산된다 ([Hartmann T, et al., 1997]; [Nature Medicine 3:1016-1020]). Aβ_{1 - 40} 형태가 둘 중 더 흔한 형태이지만, Aβ_{1 -42} (서열 1)가 보다 원섬유 형성성이고, 따라서 질환 상태와 연관된다.

APP에서 상염색체-우성 돌연변이는 유전성 조기 발생 알츠하이머 질환 (가족성 AD 또는 FAD)을 야기한다. 상기 형태의 AD는 단지 모든 환자의 10% 이하만을 차지하고, 거의 대부분의 AD는 상기 돌연변이를 수반하지 않는다. 그러나, 가족성 알츠하이머 질환은 변경된 단백질 분해 프로세싱에 의해 발생하는 것 같다. Aβ_{1 -40} 및 Aβ_{1 -42} 둘 모두의 총 Aβ 수준 또는 상대적인 농도의 증가 (전자는 뇌혈관 플라크에서 더 농축되고, 후자는 신경염 플라크에서 더 농축된다)는 가족성 및 산발성 알츠하이머 질환 둘 모두의 발병에 관련되었다.

그의 보다 높은 소수성 특성 때문에, Aβ_{1 -42}는 펩티드의 가장 아밀로이드 형성성이 큰 형태이다. 그러나, 중앙 서열 KLVFFAE (Aβ_{16 -22}) (서열 31)는 그 자체가 아밀로이드를 형성하는 것으로 알려져 있고, 아마도 원섬유의 코어를 형성한다.

플라크가 알츠하이머 질환의 병리상태의 원인이 된다는 "아밀로이드 가설"은 대부분의 연구자들에 의해 수용된다. 다른 가설은 플라크보다는 아밀로이드 올리고머가 질환의 원인이 된다는 것이다. 플라크가 아니라 올리고머를 발현하도록 유전적으로 조작된 마우스 (APP^E693Q)에서는 질환이 발생한다. 또한, 올리고머를 플라크로 전환하도록 조작된 마우스 (APP^E693Q X PS1ΔE9)는 올리고머 단독 마우스보다 더 손상되지 않는다. 나노규모 분자 표면을 가시화하는 원자 현미경은 시험관 내에서 Aβ 펩티드의 응집 상태 (올리고머)를 결정하기 위해 사용될 수 있다.

아밀로이드 베타를 측정하기 위한 많은 상이한 방법이 존재한다. 이것은 위치 결정도 허용하는 면역조직화학적 염색을 사용하여 반-정량적으로 측정될 수 있다. Aβ는 주로 뇌 아밀로이드 혈관 병증에서처럼 혈관에, 또는 노인성 플라크 및 혈관 영역에 존재할 수 있다.

Aβ를 측정하기 위한 고도로 민감한 한 방법은 Aβ를 인식하는 한 쌍의 항체를 이용하는 정량적 효소 면역흡착 검정 (qELISA)을 통해 수행된다.

영상화 화합물, 특히 피츠버그 (Pittsburgh) 화합물 B (6-OH-BTA-1, 티오플라빈) 및 플로르베타피르 F18 (18F-AV-45)은 시험관 내에서 및 생체 내에서 아밀로이드 베타에 선택적으로 결합할 수 있다. 상기 기술은 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 영상화와 조합하여 알츠하이머 질환 환자 내의 플라크 침착물의 영역을 영상화하기 위해 사용되었다.

(b) B 세포 에피토프 : Aβ 펩티드의 N-말단

본 발명은 AD 환자의 뇌에서 가용성 Aβ_{1 -42} 및 플라크에 교차 반응성을 갖는, Aβ 펩티드의 N-말단에 대한 특이성을 갖는 고역가 올리고클로날 항체의 생성을 위한 신규한 펩티드 조성물에 관한 것이다. 합리적인 설계 노력을 통한 펩티드 조성물의 부위-특이성은 운반체 단백질 상의 비관련 부위에 작용하지 않은 항체의 생성을 최소화한다.

표 1은 Aβ_{1 -42}의 N-말단으로부터의 펩티드 단편(들)을 포함하는 많은 짧은 선형 펩티드를 제공한다. Aβ_{1 -42} (서열 1) 및 Aβ_{1 -28} (서열 3) 펩티드는 운반체 단백질을 필요로 하지 않으면서 면역 반응을 유도하기에 충분히 길다. 그러나, 더 짧은 N-말단 Aβ 펩티드, 예컨대 AβAβ_{1 -14}, Aβ_{1 -12}, Aβ_{1 -10} (서열 4 내지 6)은 실시예 7의 표 4에 제시된 바와 같이 그 자체가 비-면역원성이다 (면역원성 연구에서 군 3을 군 1 및 2와 비교하라). 이 결과는 Aβ_{1 -28} 펩티드를 면역원성으로 만드는 아미노산 15 내지 28 사이의 자가 T 헬퍼 세포 에피토프 (Th)의 존재를 확인해 준다. 짧은 Aβ 단편은 실시예 7의 표 6의 군 4에 제시된 바와 같이 운반체 단백질, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)에 대한 화학적 커플링에 의해 면역증강될 수 있다. 상기 "Aβ 펩티드(들)-운반체" 백신의 주요 결함은 조합에 의해 생성된 항체의 대부분 (>90%)이 실시예 7의 표 6의 군 4에 제시된 바와 같이 운반체 단백질 KLH에 대해 작용하는 비-기능성 항체라는 점 및 에피토프 억제 잠재력이다.

본 발명의 펩티드 면역원은 위치 1에서 아미노산 Asp (D)으로 시작하는 Aβ 펩티드의 N-말단 단편의 10 내지 14개의 아미노산 (10 내지 14량체)를 포함한다. 이들 Aβ 펩티드 단편을 포함하는 완전히 합성된 펩티드 면역원도 다수의 MHC Class II 결합 모티프를 갖는 선택된 T 헬퍼 세포 에피토프 (Th) (예를 들어 서열 33-47)를 포함하고, 이것은 AD 환자의 뇌에서 Aβ_{1 -42} 펩티드 및 노인성 플라크에 대한 높은 교차 반응성을 보이면서 Aβ_{1 -42} 펩티드 상의 N-말단 표적 부위에만 초점을 맞춘 면역 반응을 유도한다.

(c) 이종 T 헬퍼 세포 에피토프 ( Th 에피토프 )

T 세포 에피토프는 항원-제시 세포의 표면에 제시되고, 여기서 MHC 분자에 결합된다. MHC 클래스 I 분자에 의해 제시되는 T 세포 에피토프는 전형적으로 8 내지 11개 아미노산 길이의 펩티드이고, MHC 클래스 II 분자는 더 긴, 13-17개의 아미노산 길이의 펩티드를 제시하고, 비-전통적인 MHC 분자는 또한 비-펩티드 에피토프, 예컨대 당지질을 제시한다.

T 헬퍼 세포 (Th 세포)는 면역계, 특히 적응 면역계에서 중요한 역할을 수행하는 백혈구의 일종인 림프구의 하위군이다. 이 세포는 T 세포 시토카인을 방출함으로써 다른 면역 세포의 활성을 돕는다. 이 세포는 B 세포 항체 캘래스 스위칭 (class switching), 세포독성 T 세포의 활성화 및 성장, 및 포식세포, 예컨대 대식세포의 살박테리아 활성의 최대화에 필수적이다.

T 헬퍼 세포 에피토프 (Th 에피토프)는 MHC 클래스 II 분자에 결합되는 항원-제시 세포의 표면에 제시되고 상기 설명된 바와 같이 T 헬퍼 세포에 의해 특이적으로 인식되는 13 내지 17개 아미노산 길이의 T 세포 에피토프이다.

주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 클래스 II 분자에 대한 펩티드 결합은 면역 반응의 개시 및 조절을 위해 매우 중요하다. 특이적 MHC 분자에 결합하는 분자의 예측은 백신에 대한 잠재적인 후보물질을 결정할 때 중요한 역할을 수행한다. 클래스 II MHC 내의 결합 홈 (groove)은 양 말단부에서 개방되어, 9량체보다 긴 펩티드가 결합하도록 허용한다. 펩티드의 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합을 용이하게 하는 컨센서스 모티프의 발견은 결합 펩티드의 상이한 길이 및 9량체 결합 코어의 상이한 위치 때문에 어렵다. 어려운 수준은 분자가 잡다하고 (promiscuous), 많은 수의 저친화도 펩티드에 결합할 때 증가한다.

지난 20년에 걸쳐서, 본 발명자와 동료들은 펩티드 면역원 구축물의 설계를 위해 불균일 Th 에피토프로서 사용하기 위해 많은 병원체의 단백질로부터 상이한 종 (예를 들어, 인간, 돼지, 소 등)의 MHC 클래스 II 분자에 대한 잡다한 결합 모티프를 사용하여 많은 잠재적인 Th 에피토프를 확인하였고 ([Wang CY, 2004]; 미국 특허 6,713,301 B1 및 [Wang CY, 2005]; 미국 특허 6,906,169), 여기서 특이적인 표적 B 세포 에피토프 (예를 들어, Aβ 펩티드 단편)는 합리적인 설계를 통해 B 세포 에피토프에 대해 작용하는 특이적 고역가 항체를 생성하는 향상된 면역원성을 위해 N 또는 C-말단에서 상기 Th 에피토프에 연결된다 (5, 6). 백신에 사용되는 모든 합리적으로 설계된 면역원은 백신 제제에서 사용하기 위한 최적 Th 에피토프를 선택하기 위해, 스크리닝 과정의 일부로서 실험적 면역화를 통해 상기 Th 에피토프의 유효성에 대해 검증되어야 함 (예를 들어 실시예 7, 표 4, 5, 6 및 7)이 강조되어야 한다. 이상적인 Th 에피토프는 T 헬퍼 세포의 최대 활성화를 허용하여 면역 반응의 개시 및 조절을 가능하게 하는 다수의 잡다한 MHC 클래스 II 결합 모티프를 포함할 것이고, 대체로 그 자체에 대해 면역침묵성 (immunosilent)이고, 즉 면역원 구축물에 의해 생성된 어떤 항체도 Th 에피토프에 대해 작용하지 않고 (예를 들어, 실시예 7의 표 6의 군 1, 2 및 3; 및 실시예 8 및 9의 표 7의 군 1), 따라서 대부분 표적화된 B 세포 에피토프에 대해 작용하도록 면역 반응을 특히 집중시킬 수 있다.

Th는 Th 에피토프를 포함하는 아미노산 (천연 또는 비-천연 아미노산)의 서열을 의미한다. 그 펩티드의 Th 도메인은 약 9 내지 약 25개 아미노산, 바람직하게는 약 13 내지 약 17개 아미노산이다. Th 절편 및 그의 기능적 면역학적 유사체는 약 10 내지 약 14개의 아미노산 잔기의 Aβ_{1 -42} 펩티드의 N-말단 단편 (서열 4 내지 6)에 대한 면역 반응을 향상시키거나 자극하기에 충분한 Th 에피토프의 인접하는 부분을 포함한다.

본 발명의 Th 에피토프는 표 2에 예시된 바와 같은 외래 병원체로부터 유래된 것 (서열 33-41)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 또한, Th 에피토프는 이상적인 인공 Th 및 이상적인 인공 조합 Th (서열 42-47)를 포함한다. 조합 Th를 포함하는 펩티드는 N-말단 Aβ 펩티드(들) 서열과 직렬로 단일 고체상 펩티드 합성에서 동시에 생산된다. Th 부위는 또한 면역학적 유사체를 포함한다. 면역학적 Th 유사체는 임의의 이들 Th 에피토프의 면역 향상 유사체, 교차반응성 유사체 및 절편을 포함한다. 기능적 면역학적 Th 유사체는 홍역 바이러스 융합 단백질 MVF1-5 Th (서열 34, 41, 42, 44 및 46)로부터, 및 B형 간염 표면 항원 HBsAg 1-3 Th (서열 43, 45, 47)로부터 유래된 여러 개의 버전의 Th 에피토프에서 가장 잘 예시되는 바와 같이 Th 에피토프의 Th-자극 기능을 본질적으로 변경하지 않는 Th 에피토프 내의 1 내지 약 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환, 부가, 결실 및 삽입을 추가로 포함한다.

본 발명의 Aβ 펩티드 면역원 구축물은 Aβ_{1 -42} 펩티드의 N-말단 단편의 C 말단, 및 그의 교차반응성 또는 기능성 유사체에 "스페이서 A"를 통해 공유 부착된 약 13 내지 약 20개 아미노산 잔기의 Th 에피토프를 갖는다. 본 발명에 따른 Aβ 펩티드 면역원 구축물 (예를 들어, 서열 48 내지 65)의 교차반응성 및 기능성 유사체는 펩티드 유사체가 Aβ_{1 -42} 펩티드와 교차반응성인 면역 반응을 유도할 수 있다면, 1 내지 약 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환, 부가, 결실, 또는 삽입을 추가로 포함할 수 있다. 보존적 치환, 부가, 및 삽입은 본원에 규정된 바와 같은 천연 또는 비-천연 아미노산으로 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 펩티드 면역원은 Aβ_{1 -42} 펩티드의 N-말단 단편 (서열 4 내지 6) 또는 그의 교차반응성 면역학적 유사체; 스페이서 (예를 들어 ε-Lys, Gly, 또는 ε-Lys-Lys-Lys-Lys); 및 표 2에 제시된 것으로부터 선택된 Th 에피토프 (서열 34, 37, 38, 40-47) (실시예 7의 표 4에서 면역원성 시험 결과 참조)를 포함하는 펩티드이다.

Th 에피토프 펩티드의 기능적 면역학적 유사체 (예를 들어, 다양한 서열의 MvF Th, 즉 서열 34, 41, 42, 44 및 46; 및 HBsAg Th, 즉 서열 43, 45, 47)도 효과적이고, 본 발명의 일부로서 포함된다. Aβ 펩티드 면역원 구축물의 기능적 면역학적 유사체는 원래의 펩티드 서열 51 및 60과 실질적으로 동일한 면역원성을 보유하는 서열 49-51, 54-55, 57-65의 변이체 및/또는 서열 49-51, 54-55, 57-65의 상동체를 포함한다. 예를 들어, 기능성 유사체인 변이체는 아미노산 위치의 보존적 치환; 전체 전하의 변화; 또 다른 모이어티 (moiety)에 대한 공유 부착; 또는 아미노산 부가, 삽입, 또는 결실; 및/또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다.

보존적 치환은 1개의 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 예를 들어, 비극성 (소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산은 글라이신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함하고; 양 하전 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함하고; 음 하전 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.

특정 실시양태에서, 기능성 유사체는 원래의 아미노산 서열에 적어도 50% 동일성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 기능성 유사체는 원래의 아미노산 서열에 적어도 80% 동일성을 갖는다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 기능성 유사체는 원래의 아미노산 서열에 적어도 85% 동일성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 기능성 유사체는 원래의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성을 갖는다.

한 실시양태에서, 특정 펩티드의 기능적 면역학적 유사체는 원래의 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 펩티드의 아미노 말단에 부가된 3개의 라이신 (Lys-Lys-Lys)을 추가로 포함한다. 상기 실시양태에서, 3개의 라이신을 원래의 펩티드 서열에 포함시키면, 원래의 펩티드의 전체 전하가 변하지만, MVF Th 펩티드 시리즈에서 예시되는 바와 같이 원래의 펩티드의 기능은 변하지 않는다 (표 2 내지 7).

표 2는 Th 에피토프 펩티드에 대한 기능성 유사체의 또 다른 변이를 보여준다. 특히, MVF1 Th 및 MVF2 Th의 서열 34 및 41은 N-말단 및 C-말단에서 각각 2개의 아미노산의 결실 (서열 34 및 41) 또는 부가 (서열 44 및 46)에 의해 아미노산 프레임에서 상이하기 때문에 MVF4 Th 및 MVF5 Th의 서열 44 및 46의 기능성 유사체이다. 상기 유사한 서열의 2개의 시리즈는 이들 서열 내에 포함된 Th 에피토프의 기능에 영향을 주지 않을 것이다 (예를 들어, 실시예 7의 표 4의 군 7, 8, 14 vs. 실시예 7의 표 5의 군 1 및 실시예 8의 표 7의 군 1).

다른 변이에서, 이종 Th 에피토프 펩티드는 해당 특정 펩티드에 대한 상동체의 가변 잔기를 기초로 하여 펩티드 프레임워크 내의 특정 위치에 제시되는 아미노산 잔기의 혼합물을 포함하는 조합 서열로서 제시될 수 있다. 조합 펩티드의 조립체는 합성 과정 동안 특정 위치에서 하나의 특정 아미노산 대신에 지정된 보호된 아미노산의 혼합물을 첨가함으로써 한 과정으로 합성할 수 있다. 상기 조합 이종 Th 에피토프 펩티드 조립체는 다양한 유전자 배경을 갖는 동물에 대한 넓은 Th 에피토프 적용 범위를 허용할 수 있다. 이종 Th 에피토프 펩티드의 대표적인 조합 서열은 표 2에 제시된 서열 42 내지 45를 포함한다. 본 발명의 Th 에피토프 펩티드는 유전적으로 다양한 집단으로부터의 동물 및 환자에게 넓은 반응성 및 면역원성을 제공한다.

일반적으로, 본 발명의 Aβ 펩티드 면역원 구축물은 다음 식으로 표시된다:

(Aβ_{1 -42} 펩티드의 N-말단 단편)-(A)_o-(Th)-X

여기서, (Aβ_{1 -42} 펩티드의 N-말단 단편)은 약 10 내지 약 14개 아미노산 잔기의 서열 4 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 B 세포 에피토프이고;

각각의 A는 독립적으로 아미노산 Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α,ε-N)Lys, 또는 ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 32)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 또는 연결기이고;

각각의 Th는 서열 34, 37, 38, 40 내지 47로 이루어진 군으로부터 선택되는 헬퍼 T 세포 에피토프를 구성하는 아미노산 서열 및 그의 기능적 면역학적 유사체를 포함하고;

X는 아미노산의 α-COOH 또는 α-CONH₂이고;

o는 0 내지 약 4이다.

본 발명의 Aβ 펩티드 면역원 구축물은 약 20 내지 약 50개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 약 25 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 포함한다.

스페이서 (A)에 의한 입체형태적 분리는 제시된 Aβ 펩티드 면역원 구축물과 적절한 Th 세포 및 B 세포 사이의 보다 효율적인 상호작용을 허용하고, 따라서 Aβ 펩티드 면역원 구축물 또는 그의 교차반응성 기능적 면역학적 유사체의 면역원성을 향상시킨다.

(d) 조성물:

(i) 펩티드 조성물:

본 개시내용의 조성물은 하나 이상의 Aβ 펩티드 면역원 구축물을 포함할 수 있다. Aβ 펩티드 면역원 구축물과 2 이상의 Th 에피토프의 혼합물을 포함하는 펩티드 조성물은 보다 넓은 MHC 클래스 II 적용 범위 때문에 보다 넓은 유전자 집단에서 면역효능의 상승적 향상을 허용하는 제약/백신 제제에서 제조될 수 있다. 상기 조성물은 Aβ_{1 -42} 펩티드 단편에 개선된 면역 반응을 제공할 수 있다.

예를 들어, 조성물은 표 3에 제시된 Aβ 펩티드 면역원 구축물 (서열 48 내지 65), 그의 상동체, 유사체 및/또는 조합물을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 펩티드 조성물은 서열 62, 63, 64 및 65로부터 선택된 서열을 갖는 Aβ 펩티드 면역원 구축물, 그의 상동체, 유사체 및/또는 조합물 (예를 들어 실시예 7에 제시된 등몰 혼합물로서 서열 62 및 63 또는 실시예 8, 9, 및 10의 또 다른 등몰 혼합물로서 서열 64 및 65)을 포함할 수 있다.

(ii) 제약 조성물:

본원은 또한 AD의 위험이 있거나 그 질환이 존재하는 환자에서 알츠하이머형 치매의 치료 및/또는 예방을 위한 제약 조성물인 Aβ 펩티드 면역원 구축물의 혼합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

조성물은 액체 형태 (예를 들어, 용액 또는 현탁액)로 제조될 수 있다. 전형적으로, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능제로 제조된다. 주사 전에 액체 비히클이 또한 제조될 수 있다. 다른 투여 방식에 적합한 추가의 제제는 경구 및 비내 적용을 포함한다. 상기 설명한 병태의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지의 여부, 투여되는 다른 의약, 및 치료가 예방 목적인지 치료 목적인지의 여부를 포함하는 많은 상이한 인자에 따라 상이하다. 대체로, 환자는 인간이지만, 트랜스제닉 포유동물을 포함하는 비인간 포유동물도 치료될 수 있다.

제약 조성물은 유효량의 Aβ 펩티드 면역원 구축물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하도록 제제화된다. 제약 조성물은 또한 일반적으로 체중 1 kg당 약 0.5 ㎍ 내지 약 1 mg의 면역원을 포함하는 적합한 단위 투여 형태로 제제화된다. 다수 용량으로 전달될 때, 제약 조성물은 단위 투여 형태당 적절한 양으로 편리하게 분할될 수 있다. 투여되는 투여량은 백신 및 치료 분야에 잘 알려져 있는 바와 같이 대상체의 연령, 체중 및 일반적인 건강 상태에 따라 결정될 것이다.

(iii) 제약학적 백신 제제:

특정 실시양태에서, Aβ 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 제약 조성물은 백신 숙주에서 Aβ 펩티드의 N-말단에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 사용된다. 본 발명의 Aβ 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 제약 조성물은 AD의 위험이 있거나 그 질환이 존재하는 백신 숙주 또는 환자에 대해 알츠하이머형 치매의 예방 및 치료를 위한 백신으로서 사용될 수 있다.

추가로, 조성물은 제약상 허용되는 전달 시스템에 담체 및/또는 다른 첨가제를 포함할 수 있다. 따라서, Aβ 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 조성물은 백신 제제에 통상적으로 제공되는 면역학적 아주반트를 포함하는 아주반트, 제약상 허용되는 담체 또는 다른 성분을 사용하여 제약 백신 제제로서 제제화될 수 있다. 면역학적 아주반트는 "특정 백신 항원과 조합되어 사용될 때 그 자체가 임의의 특정 항원 효과를 갖지 않으면서 항원-특이적 면역 반응을 가속하거나 연장하거나 향상시키는 작용을 하는 임의의 물질"로 규정된다. 오일, 알루미늄 염, 및 비로좀 (virosome)을 비롯하여 광범위한 용도에서 많은 공지의 아주반트가 존재한다. 인산알루미늄 (예를 들어 아주포스) 및 수산화알루미늄 (예를 들어 알히드로겔)을 포함하는 2개의 통상적인 염은 인간 백신에서 가장 통상적인 아주반트이다. 무기염을 선택하고 사용되는 무기염 또는 이들의 조합물의 바람직한 농도를 결정하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.

아주반트로서 본 발명에서 사용될 수 있는 다른 성분은 피포신, 사포닌, 스쿠알렌, L121, 에멀시겐 (Emulsigen), 모노포스포릴 지질 A (MPL), QS21, ISA35, ISA206, ISA50V, ISA51, 및 ISA720 및 다른 효과적인 아주반트 및 유화제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 전달 비히클 및 아주반트는 몬타나이드(Montanide)™ ISA51 (유중수형 에멀젼의 생산을 위한 식물성 기름 및 만나이드 올레에이트를 포함하는 오일 백신 아주반트 조성물), 트윈(Tween)® 80 (폴리소르베이트 80 또는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트로도 알려짐), CpG 올리고뉴클레오티드, 및/또는 이들의 임의의 조합물이다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 아주반트로서 에멀시겐 또는 에멀시겐 D가 존재하는 수중유중수형 (즉 w/o/w) 에멀젼이다.

백신으로서 제약 조성물은 속방형 또는 지속 방출형 제제로서 제제화될 수 있다. 추가로, 제약 조성물은 면역원 포획 및 마이크로입자의 동시 투여를 통해 전신 또는 국소 점막 면역의 유도를 위해 제제화될 수 있다. 상기 전달 시스템은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정된다.

본 개시내용의 Aβ 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 다양한 백신 제제는 AD의 위험이 있거나 그 질환이 존재하는 백신 숙주 또는 환자에서 보호 및 알츠하이머형 치매의 치료에 효과적이다.

(iv) Aβ 펩티드 면역자극 복합체:

특정 실시양태에서, 제약 조성물은 (a) CpG 올리고뉴클레오티드 및 (b) Aβ 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 면역자극 복합체를 포함할 수 있다. 그러한 면역자극 복합체는 아주반트로서 및 펩티드 면역원 안정화제로서 특정하게 적합화된다. 면역자극 복합체는 미립자 형태로 존재하고, 이것은 면역 반응을 생성하기 위해 Aβ 펩티드 면역원 구축물을 면역계의 세포에 효율적으로 제시할 수 있다. 면역자극 복합체는 비경구 투여를 위한 현탁액으로 제제화될 수 있다. 면역자극 복합체는 또한 보호를 제공하면서 항-Aβ 면역 반응을 생성하기 위해 비경구 투여 후에 Aβ 펩티드 면역원 구축물의 백신 숙주의 면역계의 세포에 대한 효율적인 전달을 위해 w/o 에멀젼의 형태로, 무기염 또는 계내 (in-situ) 겔화 중합체와 조합되어 현탁액으로서 제제화될 수 있다. 본 발명은 양이온성 Aβ 펩티드 면역원 구축물 및 음이온성 분자 또는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 조합물을 포함하는 안정화된 면역자극 복합체, 및 정전기 회합을 통해 음이온성 분자 또는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 복합체하여 양이온성 Aβ 펩티드 면역원 구축물을 안정화하는 방법에 관한 것이다. 안정화된 면역자극 복합체는 제약 조성물 내에 면역원 전달 시스템으로 포함될 수 있다.

본원에 설명된 바와 같이 "양이온성 펩티드"인 Aβ 펩티드 면역원 구축물은 5.0 내지 8.0의 pH에서 양 대전된 펩티드를 의미한다. 펩티드 또는 펩티드 칵테일 (cocktail)의 순 전하는 각각의 라이신 (K), 아르기닌 (R) 또는 히스티딘 (H)에 대해 +1 전하를, 각각의 아스파르트산 (D) 또는 글루탐산 (E)에 대해 -1 전하를, 서열 내의 다른 아미노산에 대해 0의 전하를 부여함으로써 계산한다. 각각의 펩티드의 N-말단 아민 (+1) 및 C-말단 카르복실레이트 (-1) 말단기로부터의 전하 기여도는 비치환될 때 서로 효과적으로 상쇄한다. 전하는 각각의 펩티드에 대해 집계하고, 순 평균 전하로 표현된다. 적합한 펩티드 면역원은 +1의 순 평균 양성 전하를 갖는다. 바람직하게는, 펩티드 면역원은 +2 초과의 순 양성 전하를 갖는다.

본원에 설명된 바와 같이 "음이온성 분자"는 5.0-8.0의 pH에서 음 대전된 분자를 의미한다. 올리고머 또는 중합체의 순 음전하는 올리고머 내의 각각의 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트기에 대해 -1 전하를 부여함으로써 계산한다. 적합한 음이온성 올리고뉴클레오티드는 8 내지 64개 뉴클레오티드 염기의 단일 가닥 DNA 분자이고, CpG 모티프 내의 반복체의 수는 1 내지 10이다. 바람직하게는, CpG 면역자극 단일 가닥 DNA 분자는 18-48개의 뉴클레오티드 염기를 포함하고, CpG 모티프의 반복체의 수는 3 내지 8이다.

보다 바람직하게는, 음이온성 올리고뉴클레오티드는 화학식 5' X¹CGX² 3'으로 표시되고, 여기서 C 및 G는 비메틸화되고; X¹은 A (아데닌), G (구아닌) 및 T (티민)로 이루어진 군으로부터 선택되고; X²는 C (시토신) 또는 T (티민)이다. 또는, 음이온성 올리고뉴클레오티드는 화학식 5'(X³)₂CG(X⁴)₂ 3'으로 표시되고, 여기서 C 및 G는 비메틸화되고; X³은 A, T 또는 G로 이루어진 군으로부터 선택되고; X⁴는 C 또는 T이다.

생성되는 면역자극 복합체는 크기가 전형적으로 1-50 마이크로미터인 입자의 형태이고, 상호작용 물질종의 상대적인 전하 화학양론 및 분자량을 포함하는 많은 인자의 함수이다. 미립자형 면역자극 복합체는 생체 내에서 특이적 면역 반응의 아주반트화 (adjuvantation) 및 상향조절을 제공하는 추가의 이점을 갖는다. 추가로, 안정화된 면역자극 복합체는 유중수형 에멀젼, 무기염 현탁액 및 중합체 겔을 포함하는 다양한 과정에 의해 백신 제제를 제조하기 위해 적합하다.

(e) 제조 방법

본 개시내용은 또한 면역 반응을 유도하고 AD의 위험이 있거나 그 질환이 존재하는 환자의 보호를 위한 Aβ 펩티드 면역원 구축물, 조성물 및 제약 조성물, 백신 제제의 제조 방법에 관한 것이다.

(i) Aβ 펩티드 면역원 구축물의 제조 방법.

본 발명의 펩티드 면역원은 통상의 기술자에게 잘 공지된 화학적 합성 방법에 의해 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Moore V. Chapter 2 in Synthetic Peptides: A User s Guide, ed. GA Grant, W. H. Freeman & Co., New York, NY, 1992, p. 63-67] 참조). 따라서, 펩티드는 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems) 펩티드 합성기 모델 430A 또는 431에서 측쇄 보호된 아미노산을 사용하여 t-Boc 또는 F-moc 화학에 의해 보호된 α-NH₂로 자동 메리필드 (Merrifield) 고체상 합성 기술을 사용하여 합성할 수 있다. Th 에피토프에 대한 조합 라이브러리 펩티드를 포함하는 펩티드 구축물의 제조는 제시된 가변 위치에서 커플링을 위한 대체 아미노산의 혼합물을 제공함으로써 달성할 수 있다.

목적하는 펩티드 면역원의 완전한 조립 후에, 수지로부터 펩티드를 절단하고 아미노산 측쇄 상의 기능성 기의 차단 해제를 위해 표준 절차에 따라 수지를 처리한다. 유리 펩티드는 HPLC에 의해 정제하고, 생화학적으로, 예를 들어 아미노산 분석 또는 서열결정에 의해 특성화하였다. 펩티드에 대한 정제 및 특성화 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.

본 발명의 면역원은 또한 목적하는 펩티드 구축물의 합성에 의해 분지된 폴리-라이실 코어 수지 상에 직접 중합체로서 제조될 수 있다 (Wang, et al., Science, 1991; 254:285-288).

상기 화학 공정에 의해 생산된 펩티드의 품질은 제어되고 명확해질 수 있고, 그 결과, 항원성, 면역원성 및 수득량의 재현성이 보장될 수 있다. 고체상 펩티드 합성을 통한 Aβ 관련 펩티드 또는 펩티드 면역원 구축물 제조에 대한 상세한 설명을 실시예 1에 제시한다.

합성 펩티드의 면역학적 적용 분야에서 25년의 경험 동안, 본 발명자는 의도된 면역학적 활성의 보유를 허용하는 구조적 가변성 범위가 소분자 약물에 의한 특이적 약물 활성 또는 생물학적으로 유래된 약물과 동시 생산되는 큰 분자에서 발견되는 목적하는 활성 및 바람직하지 않은 독성의 보유를 위해 허용되는 구조적 가변성 범위보다 훨씬 더 수용성임을 밝혀내었다. 따라서, 의도된 펩티드와 유사한 크로마토그래피 및 면역학적 특성을 갖는, 의도적으로 설계되거나 또는 결실 서열 부산물의 혼합물로서 합성 과정의 오류에 의해 불가피하게 생산된 펩티드 유사체는 종종 목적하는 펩티드의 정제된 제제만큼 효과적이다. 설계된 유사체 및 의도하지 않은 유사체 혼합물은 이들 펩티드를 사용하는 최종 제품의 재현성 및 효능을 보장하도록 제조 공정 및 제품 평가 공정을 모두 모니터링하기 위해 분별력 있는 QC 절차가 개발된다면 효과적이다.

펩티드는 또한 핵산 분자, 벡터, 및/또는 숙주 세포를 포함하는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 따라서, Aβ 펩티드 면역원 구축물 및 Aβ 펩티드 면역원 구축물의 면역학적 기능성 유사체 및 그의 유사체/상동체를 코딩하는 핵산 분자가 또한 본 발명의 일부로서 본 개시내용에 포함된다. 유사하게, 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포도 본 발명의 일부로서 본 개시내용에 포함된다.

다양한 예시적인 실시양태는 또한 Aβ 펩티드 면역원 구축물 및 Aβ 펩티드 면역원 구축물의 면역학적 기능성 유사체의 생산 방법을 포함한다. 예를 들어, 이 방법은 Aβ 펩티드 면역원 구축물 및/또는 그의 면역학적 기능성 유사체를 코딩하는 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 펩티드 및/또는 유사체가 발현되는 조건 하에 인큐베이팅하는 단계를 포함할 수 있다. 더 긴 합성 펩티드 면역원은 잘 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 합성할 수 있다. 그러한 기술은 상세한 프로토콜과 함께 잘 공지된 표준 매뉴얼에 제시된다. 본 발명의 펩티드를 코딩하는 유전자를 구축하기 위해, 아미노산 서열은 바람직하게는 유전자가 발현될 유기체에 대해 최적인 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 얻기 위해 역번역된다. 다음으로, 합성 유전자는 전형적으로 펩티드를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 및 필요한 경우 임의의 조절 요소를 합성함으로써 제조된다. 합성 유전자는 적합한 클로닝 벡터 내로 삽입되고, 숙주 세포 내로 형질감염된다. 이어서, 펩티드는 선택된 발현 시스템 및 숙주에 적절한 적합한 조건 하에 발현된다. 펩티드는 정제되고, 표준 방법에 의해 특성화된다.

(ii) 면역자극 복합체의 제조 방법

다양한 예시적인 실시양태는 또한 Aβ 펩티드 면역원 구축물 및 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN) 분자를 포함하는 면역자극 복합체 (ISC)의 생산 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 도 5a에 예시된 바와 같이, 안정화된 면역자극 복합체는 양이온성 펩티드 및 다가음이온성 CpG ODN 분자로부터 유래한다. 도 5a는 전하의 정전기 중화에 의해 유도된 자가조립 시스템을 보여준다. 양이온성 펩티드 대 음이온성 올리고머의 몰 전하 비의 화학양론은 회합 정도를 결정한다. 펩티드 면역원 및 CpG ODN의 비-공유 정전기 회합은 완전히 재현가능한 과정이다. 펩티드/CpG ODN 면역자극 복합체는 자가 응집하고, 면역계의 "전문적인 (professional)" 항원 프로세싱 세포 (APC) 제시를 용이하게 하고, 따라서 복합체의 면역원성을 추가로 향상시킨다. 이들 복합체는 제조 동안 품질 제어를 위해 쉽게 특성화된다. 펩티드/CpG ISC는 생체 내에서 잘 관용된다.

한 실시양태에서, 백신 제제 (UBI AD 백신)는 실시예 8 및 9에서 설명되는 바와 같이 용액 내에서 면역자극 복합체의 자발적 형성을 유발하는 개인 소유의 (proprietary) CpG ODN과 혼합된, 등몰비로 제조된 2가지 Aβ 펩티드 면역원 구축물 (서열 64 및 65)을 사용한다. CpG ODN 및 Aβ 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 상기 신규한 미립자 시스템은 CpG ODN 사용과 연관된 일반화된 B 세포 미토겐성 (mitogenicity)을 이용하지만, 균형잡힌 Th-1/Th-2형 반응을 촉진하도록 설계되었다.

개시된 백신 제제 내의 CpG ODN은 반대 전하의 정전기 중화에 의해 매개된 과정으로 면역원에 100% 결합하여, 마이크로미터-크기의 미립자의 형성을 야기한다. 미립자 형태는 CpG 아주반트의 통상적인 사용으로부터 CpG의 유의하게 감소된 투여량을 허용하고, 유해한 선천 면역 반응의 감소된 잠재력을 갖고, 항원-제시 세포 (APC)를 포함하는 다른 면역원 프로세싱 경로를 가능하게 한다. 따라서, 개시된 제제 (UBI AD 백신)는 그 개념이 신규한 것으로서, 다른 메카니즘에 의하 면역 반응의 자극을 촉진함으로써 이점을 제공한다.

(iii) 백신 제제의 제조 방법.

다양한 예시적인 실시양태는 또한 도 5b에 제시된 바와 같이 유중수형 에멀젼 및 무기염이 존재하는 현탁액을 사용하는 백신 제제를 포함한다. 백신이 큰 집단에 의해 사용되고 예방이 또한 투여 목적의 일부가 되도록 설계하기 위해, 안전성이 또 다른 중요한 고려 인자가 되고 있다. 임상 시험에서 많은 백신 제제에 대해 인간에서의 유중수형 에멀젼의 사용에도 불구하고, 명반은 그의 수십 년의 안전성 시험 때문에 백신 제제에 사용하기 위한 주요 아주반트로 유지되고 있다. 명반 또는 그의 무기염 아주포스 (인산알루미늄)를 실시예 8 및 9에 예시되는 바와 같이 임상 용도를 위한 제제에서 아주반트로서 사용하였다.

(f) 알츠하이머 질환의 치료 및 예방 방법

(i) 치료 요법

예방 용도에서, 제약 조성물은 알츠하이머 질환에 취약하거나 그 질환의 위험이 있는 환자에게 그의 합병증 및 질환의 발병에서 중간 단계의 병리학적 표현형을 비롯하여 질환 (생화학적, 조직학적 및/또는 거동)의 위험을 제거하거나 감소시키거나, 중증도를 완화하거나, 발병을 지연하기에 충분한 양으로 투여된다.

치료 용도에서, 조성물은 알츠하이머 질환으로 의심되거나 그 질환으로 이미 고통받고 있는 환자에게 그의 합병증 및 질환의 발병에서 중간 단계의 병리학적 표현형을 비롯하여 질환의 증상 (생화학적, 조직학적 및/또는 거동)의 위험을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 투여된다.

몇몇 방법에서, 작용제의 투여는 특징적인 알츠하이머 병리상태가 아직 발생하지 않은 환자에서 경도 인지 손상을 감소시키거나 제거한다. 치료적 또는 예방적 처리를 달성하기에 적당한 양은 치료 유효 용량 또는 예방 유효 용량으로서 규정된다. 예방 및 치료 요법 둘 모두에서, 작용제는 대체로 충분한 면역 반응이 달성될 때까지 여러 개의 투여량으로 투여된다. 전형적으로, 면역 반응은 모니터링되고, 면역 반응이 약해지기 시작하면 반복 투여량이 투여된다.

(ii) 치료를 잘 받아들이는 환자

치료를 잘 받아들이는 환자는 알츠하이머 질환의 발생 위험이 있지만 증상을 보이지 않는 개체, 및 현재 증상을 보이는 환자를 포함한다.

용어 "예방적 처리"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 질환을 야기하는 발병 과정을 중지시키는 것을 목적으로 하는 처리를 의미한다.

용어 "치료"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 질환 진행을 야기하고/하거나 증상 효과를 갖는 발병 과정을 중지시키는 것을 목적으로 하는 처리를 의미한다.

실질적으로 모든 사람은 충분히 오래 살면 알츠하이머 질환으로 고통받을 위험이 존재한다. 따라서, 본 발명의 방법은 대상 환자의 위험에 대한 임의의 평가를 필요로 하지 않으면서 일반적인 집단에 대해 예방적으로 투여될 수 있다 (즉, 임의의 살아있는 사람은 환자로 평가할 수 있다). 본 방법은 알츠하이머 질환의 공지의 유전적 위험을 갖는 개체에 대해 특히 유용하다. 상기 개체는 상기 질환을 경험한 친척이 존재하는 개체, 및 유전자 또는 생화학적 마커의 분석에 의해 그 위험이 결정된 개체를 포함한다. 알츠하이머 질환에 대한 위험의 유전자 마커는 APP 유전자의 돌연변이, 특히 위치 717 및 위치 670 및 671에서의 돌연변이 (각각 하디 (Hardy) 및 스웨덴 (Swedish) 돌연변이로 언급됨)를 포함한다 (문헌 [Hardy J. Trends in Neurosciences 1997; 20:154-159] 참조). 위험의 다른 마커는 프레세닐린 유전자, PS1 및 PS2, 및 ApoE4의 돌연변이, AD, 고콜레스테롤혈증 또는 아테롬성 동맥경화증의 가족력이다.

일반적으로, 환자는 경도 인지 손상이 있는 환자, 알츠하이머 질환과 연관된 것으로 알려진 유전자형을 갖는 환자, 삼염색체성 (Trisomy) 21을 갖는 환자 (즉, 잠재적인 다운 증후군 환자), 알츠하이머 질환의 위험을 나타내는 대리 마커를 갖는 환자로 이루어진 대상체의 위험군으로부터 선택된다.

무증상 환자에서, 치료는 임의의 연령 (예를 들어, 10, 20, 30세)에서 시작할 수 있다. 환자가 40, 50, 60 또는 70세에 도달할 때 치료를 개시할 필요가 있는 것은 아니다. 잠재적인 다운 증후군 환자의 경우에, 치료는 치료제를 모친에게 투여함으로써 출생 전에 또는 출생 직후에 시작할 수 있다.

현재 알츠하이머 질환으로 고통받는 개체는 본원에서 사용되는 바와 같이 문헌 [Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition (DSM-IV)] 기준, 및 상기 설명된 위험 인자의 존재에 따라 규정된 질환에 특히 관련되는 특징적인 치매로부터 알 수 있다. 추가로, 많은 진단 시험이 AD가 존재하는 개체를 확인하기 위해 이용가능하다. 이들은 CSF tau 및 Aβ_{1 -42} 수준의 측정을 포함한다. 상승된 tau 및 감소된 Aβ_{1 -42} 수준은 AD의 존재를 의미한다. 알츠하이머 질환으로 고통받는 개체는 또한 NINCDS-ADRDA 알츠하이머 기준에 의해 진단될 수 있다.

치료는 전형적으로 일정 기간에 걸친 다수의 투여를 수반한다. 치료는 치료제 (예를 들어, Aβ_{1 -42} ELISA)에 대한 항체, 또는 활성화된 T-세포 또는 B-세포 반응을 검정함으로써 모니터링될 수 있다. 반응이 실패하면, 부스터 (booster) 투여량이 필요하다.

노인성 아밀로이드 플라크의 주요 성분인 Aβ-아밀로이드 펩티드가 AD에서 원인이 되는 역할을 수행함을 제시하는 상당한 증거가 축적되었다. AD에 대한 성공적인 질환-조절 요법은 뇌 내의 β-아밀로이드의 침착에 영향을 주는 생성물을 포함하는 것으로 보인다. 면역계에 의해 능동적으로 생성되거나 또는 수동적으로 투여된 Aβ-특이적 항체는 상이한 트랜스제닉 마우스 모델에서 플라크 부담 (burden)을 일관되게 감소시킨다. 그러나, 항-Aβ 항체를 생성하기 위해 AD 환자의 면역계를 자극하는 최초의 임상 시도는 허용되지 않는 부작용 때문에 유보되어야 하였다 (6%의 치료된 환자에서 수막뇌염, [Orgogozo JM, et al. Neurology 2003; 61: 46-54]).

놀랍게도, 각각 홍역 바이러스 융합 (MVF) 단백질 및 B형 간염 표면 항원 (HBsAg)으로부터 유래된 2개의 이상적인 인공 T 헬퍼 에피토프에 연결된 2가지 Aβ_{1 -14} 펩티드 면역원 구축물 (서열 64 및 65)을 등몰비로 사용하는 현재 개시된 제제 (UBI AD 백신)를 사용할 때 어떠한 유해한 면역 반응 또는 미세출혈 (microhemorrhage)의 발생도 관찰되지 않는다.

개시된 방법의 한 측면에서, 놀랍게도 Aβ 펩티드 면역원 구축물은 치매로 고통 받는 온혈 동물, 특히 인간에게 유리하게 근육내 적용될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

제2 측면에서, 본 발명은 Aβ 펩티드 면역원 구축물의 근육내 투여를 위한 투여 형태를 제공한다. Aβ 펩티드 면역원 구축물의 근육내 투여를 위한 바람직한 투여 형태는 아주반트로서 무기염의 존재 하에 바람직하게는 100 ㎍ 내지 400 ㎍/0.5 mL/용량, 보다 바람직하게는 300 ㎍/0.5 mL/용량의 CpG ODN과 복합체된 30 ㎍ 내지 1000 ㎍/0.5 mL/용량의 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 백신 제제이다. 투여 형태는 사용 직전까지 2 내지 8℃에서 유지될 수 있다. 투여 형태는 온혈 동물에게, 특히 팔에 주사기를 사용한 근육내 주사에 의해 바람직하게는 투여된다. 투여 형태의 예열을 위해, 투여 형태는 주위 온도에서 약 15분 내지 45분, 예를 들어 30분 동안 유지될 수 있다. 바람직하게는, 약물 물질을 빼내기 전에, 잠재적인 육안으로 보이지 않는 입자의 분산을 위해 바이알을 약하게 여러 번 뒤집는다.

제3 측면에서, 본 발명은 초기 면역화 0, 4, 및 8주 후의 초기 프라이밍 후에 30 ㎍ 내지 1000 ㎍/0.5 mL/용량, 바람직하게는 100 ㎍ 내지 400 ㎍/0.5 mL/용량, 보다 바람직하게는 약 300 ㎍/0.5 mL/용량을 그를 필요로 하는 인간 환자에게 약 12주마다 1회, 바람직하게는 약 26주마다 1회, 특히 약 52주마다 1회 투여하는 것을 포함하는, 인간 환자에서 치매의 예방 및 치료 방법에 관한 것이다. 주사 빈도는 환자 반응에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, 투여 빈도는 주사가 항체 역가에 따라 투여되어야 할 경우 상이할 수 있다.

상기 언급된 질환의 치료에서 Aβ 펩티드 면역원 구축물의 유용성은 적합한 임상 연구에서, 예를 들어 매회 300 ㎍/0.5 mL/용량의 백신 제제를 0, 4, 및 12주에 총 3회 투여를 적용한 후, 예를 들어 실시예에서 설명되는 바와 같이 9개월 초과의 기간 동안 수행함으로써 추가로 확인될 수 있다. 항체 역가에 따라 3, 6 또는 12개월마다 1회의 후속 면역화가 수행될 수 있다.

적합한 임상 연구는 알츠하이머 질환의 위험이 있거나 또는 알츠하이머 질환의 증상이 존재하는 환자에서 공개 연구 또는 특히 무작위, 이중-맹검, 위약-대조, 병행 연구이다.

구체적인 실시양태는 AN-1792 백신 (응집된 Aβ_{1 -42}, 엘란/와이어쓰)을 투여받은 환자에서 자가 Th 에피토프에서 관찰된 독성 효과가 없는, 각각 T 헬퍼 (Th) 에피토프 (서열 46 및 47)에 합성 방식으로 연결된 Aβ_{1 -42} 펩티드의 N-말단 (Aβ_{1 -14}, 서열 4)을 갖는 2가지 Aβ 펩티드 면역원 구축물 (서열 64 및 65)의 혼합물을 포함하는 백신 제제 (UBI AD 백신)를 포함한다. 작은 동물, 개코원숭이 및 마카크 (macaque)에서 시험관 내 연구 및 생체 내 연구는 예상된 N-말단 부위-특이성을 갖는 항체가 생성되고, 상기 항체는 Aβ의 독성 활성을 중화하고 플라크 청소를 자극하는 기능적 면역원성을 갖는다는 것을 보여준다. 항체는 Aβ_{1 -40}을 CNS로부터 말초 순환계 내로 유도하는 것으로 보인다. 결과는 백신이 항-Aβ_{1 -42} 세포 반응을 유발하지 않음을 나타낸다. UBI AD 백신은 반복 용량 급성 및 만성 독성 연구 동안 시노몰거스 마카크에서 잘 관용되었다. 실시예 8 및 9에서 실시된 UBI AD 백신 제제의 안전성 및 면역원성을 경도 내지 중등도 AD의 환자의 I상 시험에서 추가로 시험하였고, 모든 19명의 환자에서 Aβ_{1 -14} 펩티드의 N-말단에 특이성을 갖는 항체를 유도하고, 따라서 임의의 심각한 또는 허용될 수 없는 유해 사건을 유발하지 않으면서 0, 4 및 12주에 근육내 면역화 후에 이례적인 100% 반응 비율을 달성할 수 있음이 밝혀졌다. 경도 AD의 노인 환자의 하위세트 (n = 6; 기준선 MMSE ≥ 20인 연령 ≥ 60세)는 (i) ADAS-Cog (AD Assessment Scale-Cognitive); (ii) ADCS-CGIC (Alzheimer's Disease Cooperative Study - Clinical Global Impressions of Change); 및 (iii) 6개월 코어 연구 동안 및 6개월 추적 관찰 기간 후에 기준선 점수에 비교한 MMSE (Mini-Mental State Exam) 점수에 의해 평가될 때 UBI AD 백신 제제에 대한 높은 항체 반응 및 개선된 인지 및 기능성 성과를 모두 보였다. ADAS-Cog가 임상 시험에 사용되는 가장 인기있는 인지 시험 기구이다. ADAS-Cog는 종종 AD의 코어 증상으로 언급되는, 기억, 언어, 행동, 주의 및 다른 인지 능력의 방해를 측정하는 11개의 과제 (70점)로 이루어진다 (점수의 증가는 악화를 나타낸다). ADCS-CGIC는 기준선으로부터의 변화에 대한 단일한 전체적인 평가이다 (점수의 감소는 악화를 나타낸다). MMSE는 인지 기능을 스크리닝하기 위해 가장 통상적으로 사용되는 도구이고, 방향, 정보 등록, 단기 기억, 언어 기능의 척도를 제공한다 (점수의 감소는 악화를 나타낸다). IIa상 시험에서, 생체마커 (분자 진단학, 뇌 영상화, 유전자형 결정)가 아마도 뇌에서 독성 Aβ 올리고머의 농도를 감소시키기 위해 능동 면역화를 통해 순환계 내의 항-Aβ_{1 -14} 항체를 증가시킴으로써 질환 진행의 감소 평가를 비롯하여 경도 AD의 환자에서 백신 제제의 효능을 평가하기 위해 사용된다.

(g) 구체적인 실시양태

본 발명의 구체적인 실시양태는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다:

(1) 다음 식을 포함하는 Aβ 펩티드 면역원 구축물:

(Aβ_{1 -42} 펩티드의 N-말단 단편)-(A)_o-(Th)-X

여기서, (Aβ_{1 -42} 펩티드의 N-말단 단편)은 서열 4 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약 10 내지 약 14개 아미노산 잔기를 포함하는 Aβ로부터의 B 세포 에피토프이고;

각각의 A는 독립적으로 아미노산 Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α,ε-N)Lys, 또는 ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 32)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 또는 연결기이고;

각각의 Th는 서열 34, 37, 38, 40 내지 47로 이루어진 군으로부터 선택되는 헬퍼 T 세포 에피토프를 구성하는 아미노산 서열 및 그의 기능적 면역학적 유사체를 포함하고;

X는 아미노산의 α-COOH 또는 α-CONH₂이고;

o는 0 내지 약 4이다.

(2) (1)에 있어서, (Aβ_{1 -42} 펩티드의 N-말단 단편)이 Aβ_{1 -14} (서열 4)인 Aβ 펩티드 면역원 구축물.

(3) (1)에 있어서, A가 ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 32)인 Aβ 펩티드 면역원 구축물.

(4) (1)에 있어서, Th 에피토프가 서열 45 또는 46인 Aβ 펩티드 면역원 구축물.

(5) (1)에 있어서, 서열 48 - 65의 아미노산 서열을 포함하는 Aβ 펩티드 면역원 구축물.

(6) (1)에 있어서, 본질적으로 서열 62 - 65의 아미노산 서열로 이루어진 Aβ 펩티드 면역원 구축물.

(7) (1)에 있어서, 서열 62, 63, 64, 및/또는 65인 Aβ 펩티드 면역원 구축물.

(8) (1)에 따른 Aβ 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 조성물.

(9) a. (1)에 따른 Aβ 펩티드 면역원 구축물; 및

b. 제약상 허용되는 전달 비히클 및/또는 아주반트

를 포함하는 제약 조성물.

(10) a. (1)에 따른 Aβ 펩티드 면역원 구축물; 및

b. 제약상 허용되는 전달 비히클 및/또는 아주반트

를 포함하는 알츠하이머 질환 백신 조성물.

(11) a. (7)에 따른 Aβ 펩티드 면역원 구축물; 및

b. 제약상 허용되는 전달 비히클 및/또는 아주반트

를 포함하는 알츠하이머 질환 백신 조성물.

(12) (10)에 있어서, (b)에서 아주반트가 알히드로겔 (Al(OH)₃) 또는 아주포스 (AlPO₄)로 이루어진 군으로부터 선택되는 알루미늄의 무기염인 알츠하이머 질환 백신 조성물.

(13) (10)에 있어서, (a)에서 펩티드 항원이 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)와 혼합되더 안정화된 면역자극 복합체를 형성하는 것인 알츠하이머 질환 백신 조성물.

(14) (1)에 따른 Aβ 펩티드 면역원 구축물의 (Aβ_{1 -42} 펩티드의 N-말단 단편) 성분에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 에피토프-결합 단편.

(15) (14)에 있어서, Aβ_{1 -10} (서열 6)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 에피토프-결합 단편.

(16) (14)에 있어서, (1)에 따른 Aβ 펩티드 면역원 구축물에 결합된 단리된 항체 또는 그의 에피토프-결합 단편.

(17) (15)에 있어서, 서열 6에 결합된 단리된 항체 또는 그의 에피토프-결합 단편.

(18) (14)에 따른 단리된 항체 또는 그의 에피토프-결합 단편을 포함하는 조성물.

(19) (10)에 따른 백신 제제를 투여하는 것을 포함하는, 인간 환자에서 치매의 중증도를 감소시키거나 또는 치매의 발병을 지연시키는 방법.

(20) (19)에 있어서, 상기 백신 제제가 AD의 위험이 있거나 그 질환이 존재하는 환자에게 용량당 10 ㎍ 내지 1000 ㎍을 포함하는 수용액으로 투여되는 것인 방법.

(h) 추가의 실시양태

(1) 본 발명의 Aβ 펩티드 면역원 구축물은 다음 식으로 표시된다:

(Aβ_{1 -42} 펩티드의 N-말단 단편)-(A)_o-(Th)-X

여기서, (Aβ_{1 -42} 펩티드의 N-말단 단편)은 약 10 내지 약 14개 아미노산 잔기의 서열 4 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 B 세포 에피토프이고;

각각의 A는 독립적으로 아미노산 Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α,ε-N)Lys, 또는 ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 32)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 또는 연결기이고;

각각의 Th는 서열 34, 37, 38, 40 내지 47을 포함하는 군으로부터 선택되는 헬퍼 T 세포 에피토프를 구성하는 아미노산 서열 및 그의 기능적 면역학적 유사체를 포함하고;

X는 아미노산의 α-COOH 또는 α-CONH₂이고;

o는 0 내지 약 4이다.

(2) a. (1)에 따른 Aβ 펩티드 면역원 구축물;

b. (a)의 기능적 면역학적 유사체;

c. (a) 또는 (b)의 임의의 조합; 및

d. 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트

를 포함하는 알츠하이머 질환 (AD) 백신 조성물.

(3) (2)에 있어서, (d)에서 아주반트가 알히드로겔 (Al(OH)₃) 또는 아주포스 (AlPO₄)인 알루미늄의 무기염인 AD 백신.

(4) (2)에 있어서, (a)에서 펩티드 항원이 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)와 혼합되어 안정화된 면역자극 복합체를 형성하는 것인 AD 백신.

(5) a. 서열 49-51, 54, 55, 및 57-65를 포함하는 군으로부터 선택되는 Aβ 펩티드 면역원 구축물;

b. (a)의 기능적 면역학적 유사체;

c. (a) 또는 (b)의 임의의 조합; 및

d. 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트

를 포함하는 알츠하이머 질환 (AD) 백신 조성물.

(6) a. (5)에 따른 Aβ 펩티드 면역원 구축물;

b. (a)의 기능적 면역학적 유사체;

c. (a) 또는 (b)의 임의의 조합; 및

d. 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트

를 포함하는 알츠하이머 질환 (AD) 백신 조성물.

(7) (5)에 있어서, (d)에서 아주반트가 알히드로겔 (Al(OH)₃) 또는 아주포스 (AlPO₄)인 알루미늄의 무기염인 AD 백신.

(8) (5)에 있어서, (a), (b), 또는 (c)에서 펩티드 항원이 안정화된 면역자극 복합체를 형성하기 위해 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)와 혼합되는 것인 AD 백신.

(9) (5)에 있어서, (a), (b), 또는 (c)에서 펩티드 항원이 안정화된 면역자극 복합체를 형성하기 위해 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)와 혼합되고, (d)에서 아주반트가 알히드로겔 (Al(OH)₃) 또는 아주포스 (AlPO₄)인 알루미늄의 무기염인 AD 백신.

(10) a. 서열 62+63, 64+65를 포함하는 군으로부터 선택되는 Aβ 펩티드 면역원 구축물;

b. (a)의 기능적 면역학적 유사체;

c. (a) 또는 (b)의 임의의 조합; 및

d. 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트

를 포함하는 알츠하이머 질환 (AD) 백신 조성물.

(11) a. 서열 64 및 서열 65의 혼합물을 포함하는 Aβ 펩티드 면역원 구축물; 및

b. CpG ODN과 추가로 혼합된 (a)의 혼합물

을 포함하는 조성물.

(12) a. 서열 64 및 서열 65의 혼합물을 포함하는 Aβ 펩티드 면역원 구축물;

b. CpG ODN과 추가로 혼합된 (a)의 혼합물; 및

c. 아주포스

를 포함하는 제약 조성물.

(13) a. 서열 64 및 서열 65의 혼합물을 포함하는 Aβ 펩티드 면역원 구축물;

b. CpG ODN과 추가로 혼합된 (a)의 혼합물; 및

c. 알히드로겔

을 포함하는 제약 조성물.

(14) (13)에 따른 제약 조성물을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 치매의 중증도를 감소시키거나 또는 발병을 지연시키는 방법.

(15) (13)에 따른 제약 조성물을 인간에게 300 ㎍/0.5 mL/용량의 용량으로 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 치매의 중증도를 감소시키거나 또는 발병을 지연시키는 방법.

(16) a. (13)에 따른 제약 조성물을 인간에게 300 ㎍/0.5 mL/용량의 용량으로 투여하고;

b. 프라임으로서 0, 4, 및 12주에 투여하는 것

을 포함하는, 인간에서 치매의 중증도를 감소시키거나 또는 발병을 지연시키는 방법.

(17) a. (13)에 따른 제약 조성물을 인간에게 300 ㎍/0.5 mL/용량의 용량으로 투여하고;

b. 프라임으로서 0, 4, 및 12주에 투여하고;

c. (b)의 단계 후에 3개월마다 1회, 및/또는 6개월마다 1회, 및/또는 12개월마다 1회 부스팅하는 것

을 포함하는, 인간에서 치매의 중증도를 감소시키거나 또는 발병을 지연시키는 방법.

(18) (14)-(17) 중 어느 하나에 있어서, 투여가 근육내 주사에 의해 수행되는 것인 방법.

(19) (14)-(18) 중 어느 하나에 있어서, 인간이 경도 AD, MCI를 갖거나, 또는 AD의 징후 또는 증상을 보이지 않지만 60세 초과인 방법.

(20) (19)에 있어서, 인간에 대한 투여가 다음과 같이 수행되는 것인 방법:

a. 인간이 경도 AD를 가질 경우, 투여는 AD의 치료를 위한 것이고;

b. 인간이 MCI를 가질 경우, 투여는 치매의 예방 및/또는 중증도의 감소 및/또는 발병의 지연을 위한 것이고;

c. 인간이 AD의 징후 또는 증상을 보이지 않지만 60세 초과일 경우, 투여는 치매의 예방 및/또는 중증도의 감소 및/또는 발병의 지연을 위한 것이다.

(21) (2)-(10) 중 어느 하나에 있어서, (a)에서 펩티드 항원이 안정화된 면역자극 복합체를 형성하기 위해 올리고데옥시뉴클레오티드 CpG와 혼합되는 것인 AD 백신.

(22) 상기 중 어느 하나에 있어서, (a)에서 Aβ 펩티드 면역원 구축물이 서열 17 내지 20의 아미노산 서열을 포함하는 AD 백신.

(23) 상기 중 어느 하나에 있어서, (a)에서 Aβ 펩티드 면역원 구축물이 서열 19 내지 20의 아미노산 서열을 포함하는 AD 백신.

(24) 상기 중 어느 하나에 있어서, (a)엥서 펩티드 항원의 총량이 약 10 ㎍ 내지 약 1 m/용량인 AD 백신.

(25) 상기 중 어느 하나에 있어서, 전달 비히클 또는 아주반트가 몬타나이드 ISA50V, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트, 에멀시겐, 에멀시겐 D, 및 CpG 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 AD 백신.

(26) 상기 중 어느 하나에 따른 백신 제제를 투여하는 것을 포함하는, 인간 환자에서 치매의 중증도를 감소시키거나 또는 발병을 지연시키는 방법.

(27) 상기 중 어느 하나에 있어서, 치매가 알츠하이머형 치매 또는 아밀로이드 혈관 병증이 있는 혈관 치매인 방법.

(28) 상기 중 어느 하나에 있어서, 치매가 파킨슨 (Parkinson) 질환과 연관된 치매 또는 루이체 (Lewy Body) 치매인 방법.

(29) 상기 중 어느 하나에 있어서, 상기 백신 제제가 AD의 위험이 있거나 그 질환이 존재하는 환자에게 용량당 10 ㎍ 내지 1000 ㎍을 포함하는 수용액으로 투여되는 것인 방법. 또한, 100 내지 750 ㎍/용량 또는 300 ㎍/용량이 허용된다. 300 ㎍이 효능을 보이면서 임상 시험에서 사용되는 표적 용량일 수 있다.

(30) 투여는 3개월마다 1회 및/또는 6개월마다 1회 및/또는 12개월마다 1회 실시될 수 있다.

(31) 투여는 백신 투여의 빈도를 결정하기 위해 항체 역가를 기초로 할 수 있다.

(32) 상기 중 어느 하나에 있어서, 환자가 알츠하이머 질환의 발생 위험이 있고, 추가로 환자는 경도 인지 손상이 있는 환자, 알츠하이머 질환과 연관된 것으로 알려진 유전자형을 갖는 환자, 삼염색체성 21을 갖는 환자 및 알츠하이머 질환의 위험을 나타내는 대리 마커를 갖는 환자인 방법.

(33) 상기 중 어느 하나에 있어서, 알츠하이머 질환과 연관된 것으로 알려진 유전자형을 갖는 환자가 ApoE4 유전자형을 갖는 환자를 포함하는 것인 방법.

(34) 상기 중 어느 하나에 있어서, (a)에서 Aβ 펩티드 면역원 구축물 및 이들의 조합물을 포함하는 백신 제제가 300 ㎍/0.5 mL/용량으로 0, 4 및 12주에 3회 용량의 초기 프라이밍을 위해 투여되는 것인 방법.

(35) 상기 중 어느 하나에 있어서, 백신 제제가 약 3개월마다 1회, 이어서 6개월마다 1회, 및 이어서 12개월마다 1회 투여되는 것인 방법.

(36) 상기 중 어느 하나에 있어서, 이전에 백신 제제를 투여한 환자의 혈액으로부터의 B 세포가 AD의 예방 및 치료를 위한, Aβ 펩티드의 N-말단을 표적화하는 인간 모노클로날 항체의 제조 및 선택을 위해 사용되는 것인 방법.

(37) 초기 주사로부터 0, 4 및 12주에 프라이밍 면역화를 제공한 후, 부스트 면역화를 3개월마다 1회, 6개월마다 1회, 가장 바람직하게는 12개월마다 1회 제공하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법.

(38) 투여는 10 ㎍ 내지 1000 ㎍/용량, 바람직하게는 100 ㎍ 내지 750 ㎍, 훨씬 더 바람직하게는 300 ㎍/용량으로 수행할 수 있다.

(39) 상기 중 어느 하나에 따른 투여 경로는 관련 기술분야에 공지된 임의의 표준 경로, 예컨대 근육내 경로, 피하, 경구 등일 수 있다.

Aβ 펩티드 면역원 구축물 백신 제제로서 유용한 제약 조성물은 Aβ 펩티드 면역원 구축물 및 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트를 포함하고, Aβ 펩티드 면역원 구축물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다:

a) 서열 49-51, 54, 55, 및 57 내지 65;

b) (a)의 상동체;

c) (a) 또는 (b)의 항원적 및 면역학적 기능성 유사체,

d) 적어도 하나의 보존적 아미노산 치환, 아미노산 부가, 및/또는 아미노산 결실을 갖는 (a), (b), 또는 (c); 및

e) (a)-(d)의 임의의 조합.

구체적인 제제에서, Aβ 펩티드 면역원 구축물은 서열 62 및 63 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 구체적인 제제에서, Aβ 펩티드 면역원 구축물은 서열 64 및 65 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 제제는 특정 제제의 등몰 혼합물을 추가로 포함하고, Aβ 펩티드 면역원 구축물은 서열 62 및 63으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 제제는 특정 제제의 등몰 혼합물을 추가로 포함하고, Aβ 펩티드 면역원 구축물은 서열 64 및 65로 이루어진 군으로부터 선택된다.

구체적인 제제에서, 서열 62 및 63 (또는 64 및 65)의 등몰 혼합물의 양은 약 1 ㎍ 내지 약 1000 ㎍/용량이다.

구체적인 제제에서, 서열 62 및 63 (또는 64 및 65)의 등몰 혼합물의 양은 약 100 ㎍ 내지 약 750 ㎍/용량이다.

구체적인 제제에서, 서열 62 및 63 (또는 64 및 65)의 등몰 혼합물의 양은 약 300 ㎍/용량이다.

본 발명의 펩티드 조성물의 효능은 동물, 예를 들어, 기니 피그, 개코원숭이, 시노몰거스 마카크, 또는 인간에게 본 발명의 펩티드를 포함하는 면역원 조성물을 주사함으로써 확립할 수 있다. 표 4, 5, 6, 7 및 8, 서열 48 내지 65를 참조한다. 체액성 면역 반응은 약 10 내지 약 14개 아미노산 잔기의 Aβ_{1 -42} 펩티드의 N-말단 단편에 대한 것이다. 사용된 절차의 상세한 설명을 실시예에 제공한다.

다음 실시예는 본 발명을 예시하는 역할을 하고, 본 발명의 범위를 제한하기 위해 사용되어서는 안 된다.

실시예 1

아밀로이드 베타 ( Aβ ) 관련 펩티드의 합성

효과적으로 표적화하는 Aβ 백신 설계 및 제제에 대한 개발 노력에 포함된 디자이너 (designer) Aβ 관련 펩티드 구축물을 합성하기 위한 방법을 설명한다. 펩티드는를 실험실 파일럿 및 필드 (field) 연구를 위해 유용한 소규모 양으로, 및 백신 제제의 공업적 상업적 생산 및 혈청학적 검정을 위해 유용한 대규모 (킬로그램) 양으로 합성할 수 있다.

대략 10 내지 40개 아미노산 길이의 서열을 갖는 Aβ 관련 항원 펩티드의 큰 레퍼토리 (repertoire)를 효과적인 AD 백신에 사용하기 위한 가장 최적 펩티드 구축물의 스크리닝 및 선택을 위해 설계하였다. 다양한 혈청학적 검정에서 에피토프 맵핑을 위해 사용된 대표적인 Aβ_{1 -40}, Aβ_{1 -42} 펩티드, N-말단 Aβ 펩티드 단편 Aβ_{1 -28}, Aβ_{1 -14}, Aβ_1-10, Aβ_{15 -42} 및 10량체 펩티드는 표 1 (서열 1 내지 32)에서 확인된다. 각각의 구축물은 그들의 각각의 Aβ 펩티드 면역원 구축물의 면역원성을 향상시키기 위해 표 2 (서열 33 내지 47)에서 단일 서열 (서열 33 내지 41, 46, 47)로 또는 조합 라이브러리 (서열 42 내지 45)로 확인되는, 홍역 바이러스 융합 단백질 (MVF) 및 B형 간염 표면 항원 단백질 (HBsAg)을 포함한 병원체 단백질로부터 유래된 주의깊게 설계된 헬퍼 T 세포 (Th) 에피토프에 합성적으로 연결된 Aβ 펩티드 단편 (Aβ_{1 -10} 내지 Aβ_{1 - 14})을 함유한다. 100개 초과의 펩티드 구축물로부터 선택된 18개의 대표적인 Aβ 펩티드 면역원 구축물이 표 3 (서열 48 내지 65)에서 확인된다.

항-Aβ 항체의 검출 및/또는 측정을 위한 면역원성 연구 또는 관련 혈청학적 시험을 위해 사용된 모든 펩티드를 어플라이드 바이오시스템즈 모델 430A, 431 및/또는 433의 펩티드 합성기에 의해 Fmoc 화학을 이용하여 소규모로 합성하였다. 각각의 펩티드는 N-말단에서 Fmoc 보호 및 및 삼기능성 아미노산의 측쇄 보호기를 사용하여 고체상 지지체 상에서 독립적인 합성에 의해 생산하였다. 완성된 펩티드를 고체 지지체로부터 절단하고, 측쇄 보호기는 90% 트리플루오로아세트산 (TFA)에 의해 제거하였다. 합성 펩티드 제제를 정확한 아미노산 함량을 보장하기 위해 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화-비행 시간형 (MALDI-TOF: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time-Of-Flight) 질량 분광 분석에 의해 평가하였다. 각각의 합성 펩티드를 또한 제제의 합성 프로파일 및 농도를 확인하기 위해 역상 HPLC (RP-HPLC)에 의해 평가하였다.

합성 과정 (커플링 효율을 단계적으로 모니터링하는 것을 포함함)의 엄격한 제어에도 불구하고, 아미노산 삽입, 결실, 치환 및 미성숙 종결을 비롯한 연장 주기 동안 의도하지 않은 사건 때문에 펩티드 유사체가 또한 생산되었다. 따라서, 합성된 제제는 대개 표적화된 펩티드와 함께 다수의 펩티드 유사체를 포함하였다. 그러한 의도하지 않은 펩티드 유사체의 포함에도 불구하고, 생성되는 합성된 펩티드 제제는 면역진단 (항체 포획 항원으로서) 및 백신 접종 (펩티드 면역원으로서)을 포함한 면역학적 용도에서 사용하기 위해 적합하였다. 대개, 의도적으로 설계되거나 부산물의 혼합물로서 합성 과정을 통해 생성된 상기 펩티드 유사체는 이들 펩티드를 사용하는 최종 제품의 재현성 및 효능을 보장하도록 제조 공정 및 제품 평가 공정을 모두 모니터링하기 위해 분별력 있는 QC 절차가 개발되기만 하면, 종종 목적하는 펩티드의 정제된 제제만큼 효과적이다. 수백 내지 킬로 그램 양의 대규모 펩티드 합성은 맞춤형 자동화 펩티드 합성기 UBI2003 상에서 15 mmole 내지 50 mmole 규모로 수행하였다.

임상 시험용 최종 백신 제제에 사용되는 활성 성분에 대해, Aβ 펩티드 구축물을 얕은 용리 구배 하에 제조 RP-HPLC에 의해 정제하고, 순도 및 정체 (identity)에 대해 MALDI-TOF 질량 분광분석법, 아미노산 분석 및 RP-HPLC에 의해 특성화하였다.

실시예 2

혈청학적 검정 및 시약

합성 펩티드 구축물 및 그의 제제의 기능적 면역원성을 평가하기 위한 혈청학적 검정 및 시약을 아래에 상세히 설명한다.

a. 항체 특이성 분석을 위한 Aβ _{1 -42} , Aβ _{1 -40} , Aβ _{1 -28} 또는 Aβ _{1 -14} 펩티드-기반 ELISA 시험

다음 실시예에 설명된 면역 혈청 샘플을 평가하기 위한 ELISA 검정을 개발하였고 아래에 설명한다.

96-웰 플레이트의 웰을 10 mM NaHCO₃ 완충제 (pH 9.5) (달리 나타내지 않으면) 내에서 2 ㎍/mL (달리 나타내지 않으면)로 100 ㎕의 표적 펩티드 Aβ_{1 -42}, Aβ_{1 -40}, Aβ_{1 -28}, 또는 Aβ_{1 -14} (서열 1 내지 4)로 37℃에서 1시간 동안 개별적으로 코팅하였다.

펩티드-코팅된 웰을 비-특이적 단백질 결합 부위를 차단하기 위해 PBS 내의 3 중량% 젤라틴 250 ㎕과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅한 후, 0.05 부피%의 TWEEN® 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하고 건조시켰다. 분석할 혈청을 20 부피% 정상 염소 혈청, 1 중량% 젤라틴 및 0.05 부피% TWEEN® 20을 함유하는 PBS로 1:20 희석하였다 (달리 나타내지 않으면). 100 마이크로리터 (100 ㎕)의 희석된 시료 (예를 들어, 혈청, 혈장)을 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 60분 동안 반응시켰다.

이어서, 비결합된 항체를 제거하기 위해 웰을 PBS 내의 0.05 부피% TWEEN® 20로 6회 세척하였다. 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 종 (예를 들어, 마우스, 기니 피그, 또는 인간) 특이적 염소 항-IgG를 양성 웰 내에 형성된 항체/펩티드 항원 복합체와 결합하기 위한 표지된 추적물질 (tracer)로서 사용하였다. 100 마이크로리터의 퍼옥시다제-표지된 염소 항-IgG를 예비-적정된 최적 희석비에서 PBS 내의 0.05 부피% TWEEN® 20을 갖는 1 부피% 정상 염소 혈청 내에서 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 추가로 30분 동안 인큐베이팅하였다. 웰을 비결합된 항체를 제거하기 위해 PBS 내의 0.05 부피% TWEEN® 20으로 6회 세척하고, 시트르산나트륨 완충제 내의 0.04 중량% 3',3',5',5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 및 0.12 부피% 과산화수소를 함유하는 기질 혼합물 100 ㎕과 추가로 15분 동안 반응시켰다. 상기 기질 혼합물은 착색된 생성물을 형성함으로써 퍼옥시다제 표지를 검출하기 위해 사용되었다. 100 ㎕의 1.0 M H₂SO₄의 첨가에 의해 반응을 중지시키고, 450 nm에서 흡광도 (A₄₅₀)를 결정하였다. 개코원숭이 및 마카크 Ig/IgG 검출을 위해, 영장류 IgG에 높은 교차 반응성을 갖는 HRP-접합된 염소 항-인간 IgG 시약을 추적물질로서 사용하였다. 시험에 도입하는 환자로부터 임상 샘플에 대해, 앞서 검증된 ELISA 시험 키트에서 최적으로 적정된 HRP-접합된 단백질 A/G 시약을 혈청 역가 결정을 위해 사용하였다. 다양한 Aβ 펩티드 백신 제제를 투여받은 백신 처리한 동물의 항체 역가의 결정을 위해, 1:100 내지 1:10,000의 혈청의 10배 연속 희석액을 시험하였고, 시험된 혈청의 역가 (Log₁₀으로 표현함)는 컷오프 A₄₅₀을 0.5로 설정하여 A₄₅₀의 선 회귀 분석에 의해 계산하였다.

b. 특이적 운반체 단백질, Th 펩티드 또는 Th 조합 라이브러리 기반 ELISA 시험에 의한 운반체 단백질, Th 펩티드 또는 Th 조합 펩티드 라이브러리 상의 헬퍼 T 세포 에피토프에 대한 항체 반응성의 평가

96-웰 ELISA 플레이트의 웰을 상기 설명된 바와 같이 수행된, 유사한 ELISA에서 10 mM NaHCO₃ 완충제 (pH 9.5) (달리 나타내지 않으면) 내에서 2 ㎍/mL (달리 나타내지 않으면)로 100 ㎕의 운반체 단백질, 예컨대 KLH (키홀 림펫 헤모시아닌), Th 펩티드 또는 Th 조합 펩티드 라이브러리 (서열 44 내지 47)으로 37℃에서 1시간 동안 개별적으로 코팅하였다. 다양한 Aβ 펩티드 백신 제제를 투여받은 백신 처리한 동물의 항체 역가의 결정을 위해, 1:100 내지 1:10,000의 혈청의 10배 연속 희석액을 시험하였고, 시험된 혈청의 역가 (Log₁₀으로 표현함)는 컷오프 A₄₅₀을 0.5로 설정하여 A₄₅₀의 선 회귀 분석에 의해 계산하였다.

c. B 세포 에피토프 클러스터 (cluster) 10량체 펩티드-기반 ELISA 시험에 의한 Aβ 및 hAPP (인간 아밀로이드 전구체 단백질)을 향한 우수한 특이성 분석 및 에피토프 맵핑의 평가

면역화시킨 숙주 또는 백신에서 항-Aβ 항체의 우수한 특이성 분석을 에피토프 맵핑에 의해 결정하였다. 간단히 설명하면, 96-웰 플레이트의 웰을 개별 hAPP 10량체 펩티드 (서열 6, 8 내지 30)로 0.1 mL 웰당 0.5 ㎍로 코팅한 후, 100 ㎕ 혈청 샘플 (PBS 내에 1:100 희석)을 상기 설명된 항체 ELISA 방법의 단계에 따라 10량체 플레이트 웰 내에서 이중으로 인큐베이팅하였다. 백신의 B 세포 에피토프, 및 면역화시킨 숙주에서 개코원숭이, 마카크 및 인간 항-Aβ 항체의 관련 우수한 특이성 분석을 또한 Aβ_{1 -10} 펩티드 (DAEFRHDSGY, 서열 6), N-말단에서 치환한 Aβ-변형 합성 펩티드, 또는 비-관련 대조군 펩티드를 사용하여 예비-흡수한 후, 추가의 특이성 확인을 위해 항-Aβ_{1 -28} ELISA 시험에 의해 시험하였다.

d. 면역원성 평가

인간 대상체 또는 동물로부터 면역전 및 면역 혈청 샘플을 실험 백신 접종 프로토콜에 따라 수집하고, 56℃에서 30분 동안 가열하여 혈청 보체 인자를 불활성화시켰다. 백신 제제의 투여 후에, 혈액 샘플을 프로토콜에 따라 얻고, 특이적 표적 부위(들)에 대한 그들의 면역원성을 평가하였다. 연속 희석된 혈청을 시험하고, 양성 역가를 상호 희석의 Log₁₀으로 표현하였다. 특정 백신 제제의 면역원성은 목적하는 B 세포 반응의 향상을 제공하기 위해 사용된 "헬퍼 T 세포 에피토프"를 향한 낮은 내지 무시가능한 항체 반응성을 유지하면서 표적 항원 내에서 목적하는 에피토프 특이성을 향해 생성된 고역가 B 세포 항체 반응을 유도하는 그의 능력에 의해 평가한다.

e. 혈액 및 뇌척수액 ( CSF ) 내에서 Aβ 관련 펩티드 항원의 검출을 위한 고체상 효소-연결 면역검정

고민감도 Aβ_{1 -40} 면역검정 (인비트로겐(Invitrogen)™-바이오소스(BioSource)™ 시토카인 앤 시그널링 (Cytokines & Signaling), 미국 캘리포니아주 카말리로)을 이용하여 키트 지시에 따라 시노몰거스 마카크에서 혈청, 혈장 및 CSF 내의 Aβ_{1 -40}의 농도를 결정하였다. Aβ_{1 -42} 수준은 정상 마카크에서 검출 한계 미만이었다. hAPP751 트랜스제닉 마우스로부터 뇌 조직의 화학적 추출액, 혈장 및 CSF 내의 Aβ_{1 -40} 및 Aβ_{1 -42} 수준을 Aβ_{1 -40} 및 Aβ_{1 -42} 면역검정의 지시에 따라 결정하였다 (더 제네틱스 컴퍼니 인크. (The Genetics Company Inc., 스위스 취리히 쉴러렌)). 경도 내지 중등도 알츠하이머 질환이 있는 개체의 혈장 내의 Aβ_{1 -40} 수준의 정량을 키트 지시에 따라 결정하였다 (인간 아밀로이드 β(1-40) 검정 키트, IBL, 27714). 인간 혈장 내의 Aβ_{1 -42} 수준은 검출 한계 미만이었다.

실시예 3

면역조직화학적 분석

정상 성인 인간 조직 (페노패쓰 래보래토리스 인크. (PhenoPath Laboratories Inc., 미국 워싱턴주 시애틀) 및 알츠하이머 질환 사례의 뇌 시료 (닥터 펠리시아 가스킨 (Dr. Felicia Gaskin), 유니버시티 오브 버지니아 (University of Virginia, 미국 버지니아주 샤롯데스빌)를 사후 및/또는 외과적 병리학적 시료로부터 얻었다. 시노몰거스 마카크 조직 시료 (베이징 조-인 뉴 드럭 리서치 센터 (Beijing Jo-Inn New Drug Research Center, 중국 베이징)) 및 hAPP 트랜스제닉 마우스 뇌 시료 (제이에스더블유-리서치 게엠베하 (JSW-Research GmbH, 오스트리아 그라츠))를 부검에서 얻었다. 조직은 액체 질소 내에 급속-동결되고 냉 OCT 포매 화합물 내에 침수되고 냉동-절단되거나, 포르말린-고정되고 파라핀-포매되고 표준 절차에 의해 절편으로 제조되었다.

냉동보존된 조직 절편의 간접 면역형광 분석을 기니 피그, hAPP 트랜스제닉 마우스, 개코원숭이 및 마카크로부터의 면역전 및 과다면역 혈청 또는 정제된 IgG를 사용하여, 또는 상업적으로 이용가능한 뮤린 모노클로날 항체 및 형광단-접합된 2차 항체를 사용하여 수행하였다. 아비딘-비오틴 향상된 상업적으로 이용가능한 키트를 사용하는 간접 면역 퍼옥시다제 염색을 정제된 기니 피그 항-Aβ IgG를 사용하여 정상 성인 조직의 냉동보존된 조직 절편에 대해, 또는 CD3, CD4, CD8 (T 림프구 하위세트), CD11b (미세아교 세포 활성화 마커), GFAP (별아교세포) 및 특이적 Aβ 에피토프를 검출하는 상업적으로 이용가능한 모노클로날 항체를 사용하여 대조군 및 UBI AD 백신 (UB-311) 처리 마카크로부터의 뇌 절편에 대해 수행하였다. 면역조직화학 분석은 표준 병리학 실험실 절차에 따라 수행하였다.

실시예 4

림프구 증식 및 시토카인 생산을 위한 T 세포 기능성 검정

T 세포 활성화의 평가를 위한, 림프구 증식 및 시토카인 생산을 포함한 T 세포 기능성 검정을 위한 절차를 다음과 같이 상세히 설명한다.

a. 말초 혈액 단핵 세포 ( PBMC )의 단리, 동결, 및 해동

헤파린 처리 혈액을 수집하고, PBMC를 피콜-하이파크 (Ficoll-Hypaque) 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하였다. 포스페이트 완충 염수 (PBS) 내에 2회 세척한 후, PBMC를 10% 태소 혈청 (FCS)을 보충한 RPMI 1640으로 이루어진 세포 배양 배지 내에 재현탁시켰다. 몇몇 실험에 대해, 단리된 PBMC를 동결시키고, 액체 N₂ 내에 저장하고, 후속 시험관내 배양을 위해 해동시켰다.

b. T 세포 및 말초 혈액 단핵 세포 ( PBMC ) 증식 검정

백신 접종한 동물로부터의 PBMC를 10.0 ㎍의 선택된 백신 면역원 조성물의 존재 하에 24-웰 배양 플레이트 (넝크 (Nunc))의 개별 웰 내에서 2.5 x 10⁶개 세포/mL로 배양하였다. 자극 항원 없이 PBMC를 단독으로 함유하는 음성 대조군 배양액을 또한 포함시켰다. 모든 배양액을 37℃에서 3일 동안 5.0% CO₂ 인큐베이터 내에 유지하였다. 상청액을 배양 개시의 3일 후에 수집하고, 개별적인 시토카인을 상기 설명된 정량 검정을 이용하여 측정하였다.

개코원숭이로부터 및 시노몰거스 마카크로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 피콜-하이파크 구배 원심분리에 의해 단리하였다. 펩티드-유도된 증식 및 시토카인 생산을 위해, 세포 (2 x 10⁵개 세포/웰)를 단독으로, 또는 개별 펩티드 도메인 (Aβ_{1 -42}, Aβ_{1 -14}, Aβ_{15 -42}, Th 펩티드, 및 음성 대조군으로서 비-관련 펩티드 포함)을 첨가하여 배양하였다. 미토겐 (mitogen) (PHA, PWM, Con A)을 양성 대조군으로서 사용하였다. 제6일에, 1 μCi의 ³H-티미딘 (³H-TdR)을 각각의 3개의 복제 세포 배양 웰에 첨가하였다. 18시간 인큐베이션 후에, 세포를 수거하고, ³H-TdR 혼입을 결정하였다. 자극 지수 (S.I.)는 항원의 존재 하의 분당 계수 (cpm)를 항원의 부재 하에 cpm으로 나눈 값을 나타낸다; S.I. > 3.0이 유의한 것으로 간주되었다.

c. UBI AD 백신을 사용한 면역화 전 및 면역화 후 PBMC 배양에 의해 생성된 시토카인의 평가

시노몰거스 마카크 PMBC 배양액으로부터 시토카인 분석 (IL-2, IL-6, IL-10, IL-13, TNF-α, IFN-γ)을 배양 배지의 분취액에 대해 단독으로 또는 다양한 Aβ 펩티드 도메인 또는 미토겐의 존재 하에 수행하였다. 원숭이-특이적 시토카인 샌드위치 ELISA 시험 키트 (유사이테크 바이오사이언시스 (U-CyTech Biosciences, 네덜란드 위트레흐트))를 사용하여 키트 지시에 따라 개별 시토카인의 농도를 결정하였다.

실시예 5

안전성, 면역원성, 독성 및 효능 연구에 사용된 동물

기니 피그 : 면역원성 연구를 성숙, 나이브 (naive), 성체 수컷 및 암컷 덩컨-하틀리(Duncan-Hartley) 기니 피그 (300-350 g/BW)에서 수행하였다. 실험에서는 군 당 적어도 3마리 기니 피그를 사용하였다. 덩컨-하틀리 기니 피그 (8-12주령; 코반스 리서치 래보래토리스 (Covance Research Laboratories), 미국 펜실베니아주 덴버)를 포함한 프로토콜을 계약된 동물 시설에서 및 후원자로서 UBI에서 승인된 IACUC 신청 하에 수행하였다.

아누비스 개코원숭이 : 성체 수컷 개코원숭이 (파피오 아누비스(Papio anubis), 8 내지 10살; 유니버시티 오브 오클라호마 헬쓰 센터 (University of Oklahoma Health Sciences Center, 미국 오클라호마주 오클라호마 시티))에서 면역원성 연구를 계약된 동물 시설에서 및 후원자로서 UBI에서 승인된 IACUC 신청 하에 수행하였다.

시노몰거스 마카크 : 성체 수컷 및 암컷 원숭이 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis), 대략 4살; 베이징 조-인 뉴 드럭 리서치 센터, 중국 베이징)에서 면역원성 및 반복 용량 독성 연구를 계약된 동물 시설에서 및 후원자로서 UBI에서 승인된 IACUC 신청 하에 수행하였다.

hAPP751 트랜스제닉 마우스 : 어린 hAPP751 트랜스제닉 (tg+) 마우스 및 그들의 한배 새끼 (14±2주령)에서 면역원성 및 효능 연구를 알츠하이머 질환에 대한 예방 모델로서 사용하고, 노령의 tg+ 마우스 및 그들의 한배 새끼 (52±2주령)를 치료 모델에서 사용하였다. 두 연구는 모두 계약된 동물 시설 (제이에스더블유-리서치 게엠베하, 오스트리아 그라츠)에서 및 후원자로서 UBI에서 승인된 IACUC 신청 하에 수행하였다.

hAPP751 tg+ 마우스는 뮤린 Thy-1 프로모터의 조절 제어 하에 런던 (London) (V717I) 및 스웨덴 (K670M/N671L) 이중 돌연변이를 함유하는 인간 아밀로이드 전구체 단백질 (hAPP)을 구성적으로 과발현한다 (Rockenstein, E, et al., 1995 및 2001). hAPP751 tg+ 마우스에서, Aβ_{1 -42} 침착은 전두 피질 내에 성숙 플라크가 출현하면서 3 내지 4월령만큼 초기에 일어나고, 5 내지 7월령에 플라크 형성이 해마, 시상 및 후각 영역으로 확장한다. 16주 기간에 걸쳐 근육내 백신 접종의 효과는 항체 반응에 대해 혈청의 ELISA 검정에 의해, 뇌 아밀로이드 침착 및 뇌 플라크 로드에 대해 및 뇌 내의 증가된 수준의 세포 반응성 (예를 들어, T 세포 침윤, 미세아교 세포 활성화)의 증거에 대해 면역염색에 의해 및 생화학적 추출에 의해 관찰하였다.

면역화에 앞서, 개별 동물로부터 혈청 및/또는 혈장 샘플을 상기 실시예에서 상기 설명된 방법에 따라 Aβ 표적 펩티드의 존재에 대해 시험하였다. 각각의 동물을 종 및 프로토콜에 따라 백신 제제의 용량당 Aβ 표적 펩티드 구축물로 면역화시켰다.

실시예 6

기니 피그 및 개코원숭이에서 Aβ 펩티드 구축물의 면역원성의 초기 순위결정을 위한 일반적 백신 제제

각각의 실험에 사용된 제약 조성물 및 백신 제제는 아래 설명된 실시예에 보다 상세히 설명되어 있다. 간단히 설명하면, 각각의 연구 군에 명시된 제제는 일반적으로 상이한 종류의 스페이서 (예를 들어, εK, 또는 펩티드 구축물의 용해도를 향상시키기 위해 KKK를 갖는 εK)를 통해 연결된 Aβ 펩티드의 단편을 갖는 모든 종류의 디자이너 Aβ 펩티드 구축물, 및 디자이너 펩티드 구축물의 N-말단에서 연결된 Aβ 펩티드 단편(들)을 갖는 홍역 바이러스 융합 단백질 및 B형 간염 표면 항원으로부터 유래된 2개 세트의 인공 T 헬퍼 에피토프를 포함한 잡다한 헬퍼 T 세포 에피토프의 변이를 함유하였다. 100개 초과의 디자이너 Aβ 펩티드 구축물을 전장 Aβ_{1 -42}를 사용한 상대적인 면역원성, 및 추가로 AD 환자의 뇌 절편으로부터의 천연 플라크와의 그들의 교차 반응성에 대해 기니 피그에서 초기에 평가하였다. Aβ 펩티드 구축물은 명시된 바와 같이 다양한 양의 펩티드 구축물에서 무기염 또는 알히드로겔 (명반)과 혼합된, 인간 백신 용도로 승인된 오일로서 세픽 (Seppic) 몬타나이드™ ISA51을 사용하여 유중수형 에멀젼으로 제조하였다. 백신은 대체로 Aβ 펩티드 구축물을 약 20 내지 800 ㎍/mL로 물에 용해시키고, 몬타나이드™ ISA51을 사용하여 유중수형 에멀젼 (1:1 부피비)으로, 또는 무기염 또는 알히드로겔 (명반) (1:1 부피비)을 사용하여 제제화함으로써 제조하였다. 백신 제제를 실온에서 약 30분 동안 유지하고 면역화에 앞서 약 10 내지 15초 동안 볼텍스 (vortex)에 의해 혼합하였다.

몇몇 동물을 2 내지 3 용량의 특정 백신 제제로 면역화시켰고, 이것은 시간 0 (프라임) 및 초기 면역화 (wpi)의 3주 후에 (부스터), 임의로 제2 부스트에 대해 5 또는 6 wpi에 근육내 경로에 의해 투여하였다. 이어서, 이들 면역화시킨 동물을 백신 제제 내에 존재하는 다양한 합성 Aβ 펩티드 면역원의 면역원성 및 그들의 Aβ_{1 -28} 및 전장 Aβ_{1 -42}와의 교차 반응성을 평가하기 위해 시험하였다. 이어서, 기니 피그 내의 초기 스크리닝에서 강력한 면역원성을 갖는 이들 Aβ 펩티드 면역원을 추가로 면역화 프로토콜에 의해 지시된 바와 같이 명시된 기간에 걸쳐 투여 방식에 대해 인간과 유사한 면역 반응 프로파일을 갖는 것으로서 교정된 종인 개코원숭이에서 유중수형 에멀젼, 무기염 및 명반-기반 제제로 시험하였다.

단지 가장 유망한 Aβ 펩티드 면역원 후보물을 최종 백신 제제로 포함시키기 전에 추가로 알츠하이머 질환의 환자에서 임상 시험 및 신약 승인 신청 (Investigational New Drug application)의 제출을 위한 제제로서 GLP 지도된 전임상 연구에서 면역원성, 지속시간, 독성 및 효능 연구에 대해 광범하게 평가하였다.

실시예 7

알츠하이머형 치매의 예방 및 치료를 위한 Aβ _{1 -14} 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 다중-성분 백신 제제의 설계 근거, 스크리닝, 확인 및 최적화

설계 역사 : 각각의 백신 또는 면역치료 제품은 구체적인 질환 메카니즘 및 개입을 위해 요구되는 표적 단백질(들)에 기반한 그 자신의 설계 초점 및 방안을 요구한다. 설계가 그를 모델로 삼는 표적은 질환 경로에 관여된 세포 단백질 또는 병원체로부터 몇몇 단백질이 관여될 수 있는 감염성 물질을 포함할 수 있다. 연구로부터 상업화까지의 과정은 대개 달성하기 위해 수십 년이 요구되는 매우 긴 과정이다.

일단 표적 분자가 선택되면 광범한 과정의 혈청학적 검증이 요구된다. 표적 분자 내의 B 세포 및 T 세포 에피토프의 확인 및 분포는 분자 백신 설계에 중요하다. 일단 표적 B 세포가 인지되면, 디자이너 펩티드의 백신 제제에 의해 유도된 항체의 기능적 특성을 평가하기 위해 작은 동물에서 연속적인 파일럿 면역원성 연구를 수행한다. 이어서, 백신 면역원성 및 유도된 항체의 기능적 특성의 추가 검증을 위해 표적 종의 동물에서 상기 혈청학적 적용을 수행한다. 모든 연구는 평가를 위한 면역화시킨 숙주로부터 수집한 혈청을 사용하여 다수의 평행 군에서 수행한다. 면역원성 및 설계의 방향을 추가로 검증하기 위해, 표적 종에서 또는 인간 백신의 경우에 비-인간 영장류에서 초기 면역원성 연구를 또한 수행한다. 이어서, 표적 펩티드를 각각의 제제 설계를 제조하기 위해 조합으로 사용될 때 펩티드 구축물 사이의 각각의 상호작용에 관련된 기능적 특성의 미묘한 차이를 평가하기 위해 다양한 혼합물로 제조한다. 추가의 평가 후에, 최종 제품 개발 과정에 도달하는 최종 펩티드 구축물, 펩티드 조성물 및 그의 제제를 제제의 각각의 물리적 파라미터와 함께 확립한다.

광범한 설계 경험은 도 1에 제시된 바와 같이 발견으로부터 상업화까지 차세대 백신 제품의 개발을 가속화된 속도로 허용한다.

a. 알츠하이머 질환의 환자를 치료하는 잠재력을 갖는 백신 제제에 대한 적합한 Aβ _1-14 유래 펩티드 구축물의 설계 및 검증

본 발명자들이 개시한 이전의 발명 (Wang CY. 미국 특허 6,906,169, 미국: 유나이티드 바이오메디컬 인크. (United Biomedical Inc.), 2005; Wang CY. 미국 특허 7,951,909, 미국: 유나이티드 바이오메디컬 인크., 2011; Wang CY. 미국 특허 8,232,373, 미국: 유나이티드 바이오메디컬 인크., 2012))에 대한 후속으로, 수막뇌염과 같은 중증 부작용을 일으킬 수 있는, 알츠하이머 질환의 환자에 종종 존재하는 자가 T 헬퍼 에피토프를 발현하는 서열의 C-말단 도메인이 없는 Aβ_{1 -14} 펩티드 상에 정착된 Aβ 분자로부터 B 세포 에피토프의 추가의 개량을 백신 제제에 포함시키기 위한 설계에서 표적 B 세포 에피토프로서 선택하였다.

백신 제제 내로 포함시키기 위한 가장 강력한 펩티드 구축물을 생성하기 위해, 다양한 병원체로부터 유래된 잡다한 T 헬퍼 에피토프의 큰 레퍼토리, 또는 홍역 바이러스 융합 (MVF) 단백질 서열 또는 B형 간염 표면 항원 (HBsAg) 단백질로부터 추가로 설계된 인공 T 헬퍼 에피토프를 기니 피그에서 면역원성 연구에 사용하였다. 16개의 Aβ_1-14 유래 펩티드 구축물의 대표적인 연구를 표 3에 제시하고 (서열 48, 51 내지 65), 여기서, Aβ_{1 -14} 펩티드는 스페이서로서 εK를 통해 개별적인 잡다한 T 헬퍼 에피토프와 연결되었다. 펩티드 면역원 구축물을 몬타나이드™ ISA51 유중수형 에멀젼 내로 제제화하고, 0 wpi에 프라임 및 3 wpi에 부스트에 대해 표준 ISA51 에멀젼 내에 100 ㎍/0.5 mL로 제조된 각각의 백신 제제를 투여함으로써 기니 피그에서 그들의 각각의 면역원성에 대해 시험하였다. 예비 면역원성 분석은 Aβ_{1 -42}의 C-말단에서 헬퍼 T 세포 에피토프 구조 특색의 존재를 확인하였고, 여기서 Aβ 서열의 아미노산 15 내지 28로부터 펩티드 서열의 결실은 Aβ_{1 -14} 서열을 그 자체로 비-면역원성으로 만들었다 (표 4, 군 1 내지 3). Aβ_{1 -14} 펩티드의 면역원성의 면역원성을 회복하고 향상시키기 위해 사용된 T 헬퍼 에피토프의 예비 순위결정을 증가하는 순서로 표 4에 제시하고, 여기서 가장 약한 펩티드 구축물을 먼저 나열하였다: 쉬스토소마 만소니(Schistosoma mansoni) Th (서열 56) < 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani)1 Th (서열 48) < 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) Th (서열 52) < 클로스트리디움 테타니2 Th (서열 53) < 디프테리아 Th (서열 54) < 플라스모디움 팔시파룸 Th (서열 55), 여기서 콜레라 독소 Th (서열 57)은 MVF (서열 51, 58, 59) 및 HBsAg (서열 60)으로부터 유래된 인공 T 헬퍼 에피토프 사이에서 순위결정된다. Aβ_{1 -14} 유래 펩티드 구축물 (서열 51)은 또한 강력한 펩티드 면역원 구축물로서 서열 61에 제시된 바와 같이 분지된 사량체 구조로서 설계할 수 있다. 요약하면, 상기 면역원성 연구에서는 AD의 환자의 노인성 플라크의 주요 생화학적 성분인 전장 Aβ_{1 -42} 펩티드의 N-말단에 대해 생성된 항체를 유도하기 위한 최종 백신 제제의 설계에 사용하기 위한 면역원으로서 특이적 Aβ_{1 -14} 유래 구축물 (서열 51, 57 내지 61)의 적합성을 검증하였다.

b. 상이한 잡다한 T 헬퍼 에피토프를 갖는 Aβ1 -14 유래 구축물을 사용함으로써 MHC 적용 범위의 확대

다양한 유전자 배경의 환자를 치료하기 위해 백신을 설계할 때, 다양한 유전자 배경을 갖는 최대 집단을 포괄하도록 설계하는 것이 중요하다. 따라서, 그러한 조합을 위한 Aβ_{1 -14} 유래 펩티드 면역원 구축물들의 상승적 면역원성 효과에 대해 탐구하였다. MVF 및 HBsAg로부터 유래된 잡다한 T 헬퍼 에피토프는 그러한 면역원성 향상을 제공하는 가장 강력한 것 중 하나를 나타내므로, 이들 2가지 헬퍼 T 에피토프를 함유하는 펩티드 구축물의 조합물을 상기 탐구를 위해 설계하였다. MVF 및 HBsAg (서열 44 및 45) 모두에 대한 T 헬퍼 에피토프의 조합 라이브러리 형태를 Aβ_{1 -14} 유래 구축물 (서열 62 및 63)로, 최대 MHC 결합 모티프 적용 범위를 염두에 두고 표 2에 제시된 바와 같이 설계하였고, 이들을 개별적으로 또는 조합으로, 100 ㎍/0.5 mL/용량으로 프라임 (0 wpi) 및 2회의 부스트 (3 및 5 wpi) 스케쥴 이후 기니 피그에서 면역원성에 대해 평가하였다. 표 5에 제시된 바와 같이, 동일한 중량비의 2개의 면역원의 혼합물은 각각의 개별적인 펩티드 구축물에 의해 유도된 것에 비해 상당한 면역 반응을 유도하였다.

c. 다수의 MHC 결합 모티프를 갖는 주의깊게 선택된 T 헬퍼 에피토프에 연결된 표적 B 에피토프를 포함한 단순 면역원 설계는 B 세포 에피토프에 대해서만 표적화된 집중되고 순수한 면역 반응을 생성한다

B 에피토프 면역원성 향상을 위해 사용된 각각의 T 헬퍼 에피토프를 사용한 시험을 위해 면역화시킨 숙주로부터 초기 면역화의 8주 후 (wpi) 과다면역 혈청을 수집하였다. Aβ_{1 -14} 펩티드의 N-말단에서 첨가된 시스테인 잔기와 화학적 커플링을 통해 제조된 KLH-연결된 Aβ_{1 -14} 펩티드의 유사한 프라임 및 부스트 면역화 스케쥴을 적용한 유사한 면역화시킨 숙주로부터 과다면역 혈청. 표 6으로부터 볼 수 있는 바와 같이, 디자이너 Aβ_{1 -14} 펩티드 면역원 구축물 (서열 62 및 63)로 단독으로 또는 조합으로 면역화시킨 모든 숙주는 2개의 T 헬퍼 에피토프 (서열 44 및 45)에 대한 반응성이 거의 또는 전혀 생성되지 않으면서, 표적화된 Aβ_{1 -42} 교차반응성을 향한 목적하는 고역가의 항-Aβ_1-14 항체 교차반응성을 생성하였다. 이와 반대로, Aβ_{1 -14} 에피토프에 대해 유도된 통상적인 운반체 단백질 KLH에 의해 생성된 상대적인 면역원성에도 불구하고 (2.2 내지 3.9의 Log₁₀ 역가), 매우 높은 역가 (6.2의 Log₁₀ 역가의 기하평균(GeoMean))를 갖는, 모든 동물에 의해 단백질 운반체 KLH에 대한 매우 높은 항체 반응이 생성되었고, 이것은 "표적화된 B 세포 에피토프"에 대해 유도된 독특한 "집중된" 반응이 B 세포 및 T 세포 에피토프의 구조 및 기능의 이해에 기반하여 이들 합리적으로 설계된 펩티드 면역원 구축물을 사용한 면역화의 성과이었다는 이전의 관찰을 다시 검증하였다.

d. ISA51 유중수형 에멀젼 내에 및 명반 내에 다양한 양의 Aβ _{1 -14} 구축물 (서열 62 및 63)을 함유하는 백신 제제의 프라임 (0 wpi ) 및 부스트 (3 및 6 wpi) 후 개코원숭이에서 면역원성의 평가

이들 Aβ_{1 -14} 펩티드 면역원 구축물에 의해 유도된 항체의 기능적 특성을 탐구하기 위해 추가의 개발 작업을 하기 전에, 인간 시험에 가장 빈번하게 사용되는 2개의 상이한 제제 내에 다양한 양으로 이들 펩티드 구축물 (서열 62 및 63, 등몰비로)을 포함하는 백신 제제의 상대적인 면역원성의 평가를, 규모에서 인간과 가장 닮은 면역 반응을 생성하는 동물 종인 개코원숭이에서 수행하였다. 모든 백신 제제를 동물에게 0.5 mL/용량으로 제공하였다. 미래의 사용을 위한 원래의 표적화된 용량은 100 ㎍/mL이고, 따라서 3마리의 동물에게 상기 용량을 제공하였다. 동일한 100 ㎍에서 보다 강력한 ISA51 유중수형 제제 대 보다 약하지만 가장 빈번하게 사용되는 아주반트 명반 사이의 상대적인 면역원성에 대한 평가를 또한 수행하였다. 시험된 유중수형 에멀젼 시스템에서, 25 ㎍, 100 ㎍ 및 400 ㎍/용량의 용량 상승 연구를 평가하였다. 상기 연구로부터 최초의 관찰은 100 ㎍/0.5 mL/용량으로 제공한 동일한 펩티드 면역원 함량을 갖는 ISA 유중수형 에멀젼 제제에 비해 명반-기반 제제에 의해 생성된 낮아진 면역 반응 (항체 역가에서 1 초과의 Log₁₀으로)이었다. 100 ㎍/용량이 면역화시킨 숙주에서 미래의 백신 제제 투여를 위해 원래 표적화된 양이지만, 표 7에 제시된 바와 같이 25 ㎍으로부터 각각 100 ㎍ 내지 400 ㎍로 투여 증가시 면역 반응의 증가가 관찰되었다. 따라서, 디자이너 Aβ_{1 -14} 펩티드 면역원 구축물 (서열 62 및 63) 또는 그들의 유사체의 펩티드 면역원 구축물에 대해, 100 ㎍을 넘는 용량을 추가로 탐구할 것이다.

실시예 8

알츠하이머형 치매의 치료를 위한 성공적인 면역치료 백신의 개발을 위한 기준

면역치료 백신을 개발하기 위한 UBI의 전략은 유전적 다양성의 "자가" 장벽 및 제한을 극복하기 위해 플랫폼 (platform) 기술에 기반하여 표적 B 서열에 연결되는 개인 소유의 잡다한 Th 에피토프의 설계, 및 안전, 특유, 특성화 가능, 비용 효과적, 효능있는, 안정한 및 규모 확대 가능한 (Safe, Unique, Characterizable, Cost-effective, Efficacious, Stable and Scalable) (SUCCESS로서 조어함)인 최적 펩티드-기반 백신 제제의 개발을 포함한다 ([Wang CY, et al., 2005]; [Sokoll KK, 2004]). 백신 제제를 위한 프로그램의 개발기에 도입할 선택된 펩티드 면역원이 관리기관의 승인 관점으로부터 특성화가능하도록 초기 설계기에 특별한 주의를 기울였고, 이것은 상기 백신이 III상 시험 후 환자에서 효과적인 것으로 입증될 때 인간 역사에서 수백만 용량을 기초로 환자에게 제공될 최초의 전체 합성 펩티드 기반 백신일 것이기 때문이다. 상세한 내용으로 할 때 서열 설계에 고유한 사용할 개별적인 펩티드의 "용해도", 합성 화학 수율 및 정제 장애에 대해, 이미 상당한 목적하는 면역 반응을 일으키는 것으로 입증된 많은 것 중에서 선택된 펩티드의 품질 설계에서 특별한 주의를 기울였다. 높은 안전성 인자를 갖는 잘 허용되는 아주반트가 많은 허용되는 선택권 중에서 또한 중요한 고려 인자일 것이다. 안전성 인자 및 면역원성의 규모 사이의 균형이 고려되어야 한다. 또한, 안전성 인자 때문에 면역원성이 손상될 때, 면역 반응을 추가로 상승시키기 위해 다른 백신 제제 특색이 포함될 수 있다. 다시, 백신의 성공은 다양한 유전자 배경을 갖는 가능한 크고 넓은 집단에서 목적하는 면역 반응을 생성하는 그의 능력에 달려 있고, 따라서 넓은 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 적용 범위는 또한 매우 중요한 고려 인자이어야 한다.

상기 고려의 면에서, Aβ 분자의 N-말단에서 표적화하는 SUCCESS 백신을 달성하기 위해, 조합 형태 대신에 단일 서열의 펩티드가 조합 라이브러리 형식의 그들의 상대물에 비해 그들의 비교적 보다 약한 면역원성에도 불구하고 선택될 것이다. 고도로 강력한 면역원성 향상 T 헬퍼 에피토프는 대체로 상응하는 펩티드를 가용성이 아니도록 만드는 긴 스트레치 (stretch)의 소수성 아미노산 잔기를 포함하므로, 펩티드 용해도가 또한 시험을 위한 핵심 인자이다. 고도로 대전된 잔기, 예컨대 Asp, Glu, Lys, 및 Arg가 펩티드 용해도를 향상시키키기 위해 특수한 위치에 첨가될 것인지 특별한 관심을 기울여야 한다. 합성에서 고수율을 달성하기 위해, 모든 합성 과정에 관여된 화학은 생성된 중간체와 함께, 최적 서열에 도달하도록 모두 광범하게 평가되었고, 최종 펩티드는 백신 제제의 핵심 성분으로서 추정될 것이다. 면역원성 측면으로부터 모든 고도로 자격있는 펩티드 후보물의 균형잡힌 고려 후에, 2가지 Aβ_{1 -14} 펩티드 면역원 구축물 (서열 64 및 65)을 선택하였고, 여기서 서열 64를 갖는 펩티드는 MVF 시리즈로부터의 것이고 서열 65를 갖는 펩티드는 HBsAg 시리즈로부터의 것이고, 백신 제제에서 추가의 탐구를 위해 추가로 분석하였다.

도 2a, 2b, 2e에 제시된 바와 같이 이들 펩티드를 합성하고 고순도로 정제하였다. 얕은 구배를 갖는 역상 분석 하에 서열 65 및 64의 두 펩티드에 대한 HPLC 프로파일은 각각 20 및 21분의 용리 시간을 보여주었다. 이들 정제된 펩티드의 MALDI-TOF 분석은 도 2c 및 2d에 제시된 바와 같이 둘 모두 높은 정밀도로 서열 65를 갖는 펩티드에 대해 3892.274 (3892.52의 이론적 값), 및 펩티드 서열 64에 대해 4374.568 (4374.04의 이론적 값)의 분자량을 제공하였다.

둘 모두 Aβ_{1 -14}의 면역원성을 향상시키기 위해 사용된 서열 46 및 47의 "Th" 펩티드를 도 3a 및 3b에 제시된 바와 같이 다양한 집단에서 그들의 결합 모티프에 대해 광범하게 평가하였다. 모든 환자의 유전자 배경의 최대 적용 범위을 허용하기 위해 2개의 잡다한 T 헬퍼 에피토프를 백신 설계에 포함시키는 것이 안전하다. 분석된 % 적용 범위로부터, 상기 백신은 모두는 아니지만 백신을 투여받는 환자의 큰 집단을 포괄하기 위해 매우 합당한 변화를 가질 것이고, 이것은 높은 임상 값의 백신으로 연장된 광범한 시험 및 개발 노력을 정당화하기 위해 중요한 인자이다.

백신이 큰 집단에 의해 사용되고 예방이 또한 투여 목적의 일부가 되도록 설계하기 위해, 안전성이 또 다른 중요한 고려 인자가 되고 있다. 임상 시험에서 많은 백신 제제에 대해 인간에서의 유중수형 에멀젼의 사용에도 불구하고, 명반은 그의 수십 년의 안전성 시험 때문에 백신 제제에 사용하기 위한 주요 아주반트로 유지되고 있다. 명반 또는 그의 무기염 아주포스 (인산알루미늄)를 임상 용도를 위한 제제에서 아주반트로서 사용하도록 고려하였다.

a. 고정량의 무기염과 함께 다양한 양의 고도로 정제된 Aβ _{1 -14} 펩티드 면역원 구축물 (서열 64 및 65)을 함유하는 백신 제제의 프라임 (0 wpi ) 및 부스트 (3 및 5 wpi) 후에 기니 피그에서 면역원성의 평가

전임상 및 임상 시험을 위한 UBI AD 백신의 개발을 위해 많은 면역원성 후보 중에서 2가지 고도로 정제된 Aβ_{1 -14} 펩티드 면역원 구축물 (서열 64 및 65)의 선택 후에, 이들 2가지 펩티드의 등몰비 혼합물을 도 4에 제시한 바와 같이 기니 피그에서 투여 연구에서 고정량 (0.5 mL)의 명반/무기염의 존재 하에 그들의 면역원성에 대해 시험하였다. 0.5 mL의 무기염 (인산알루미늄, 아주포스) 내의 0 ㎍, 10 ㎍, 30 ㎍, 100 ㎍ 내지 300 ㎍의 상기 언급한 2가지 Aβ_{1 -14} 펩티드 면역원 구축물 (서열 64 및 65)을 함유하는 상이한 양의 펩티드 혼합물을 0, 3 및 5 wpi (초기 면역화 후 주수)의 면역화 스케쥴에 기반하여 기니 피그에서 시험하였고, 여기서 면역원성을 26주 기간에 걸쳐 관찰하였다. 초기 면역화의 약 5주 후의 면역 반응의 피크에서, 300 ㎍/용량을 투여받은 동물이 최고 면역 반응을 나타냈고, 이어서 100 ㎍ 및 30 ㎍을 투여받은 동물, 이어서 10 ㎍ 용량 순이고, 26주 기간 내내 유사한 면역 반응 순위가 이어졌다. 따라서, 300 ㎍/0.5 mL 아주포스의 최고 용량이 면역화를 위한 최적 조건으로 간주되었고, 상이한 종에서 다른 관련 제제 내의 면역원성을 탐구하기 위해 지침으로서 사용할 것이다.

b. 펩티드 및 올리고뉴클레오티드 사이에 면역자극 복합체 ( ISC )의 형성을 통해 백신 제제의 면역원성을 추가로 향상시키는 수단

명반 또는 그의 연관 무기염을 아주반트로서 사용하는 것에 고유하게, 연관 백신 제제 면역원성은 또한 그들의 표적 Aβ_{1 -14} B 세포 에피토프에 대한 역가가 약 1 Log₁₀ 감소될 것이다 (실시예 7의 유사한 연구에서 추정된 바와 같이). 따라서, 백신 제제의 면역원성을 추가로 향상시키는 수단이 탐구된다.

보다 구체적으로, 도 5a에 제시된 UBI 제제에서, 안정화된 면역자극 복합체 (ISC)는 양이온성 펩티드 및 다가음이온성 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN) 분자로부터 유래한다 (상부 패널) (Sokoll KK, 2004). 이것은 전하의 정전기 중화에 의해 유도된 자가조립 시스템이다. 양이온성 펩티드 대 음이온성 올리고머의 몰 전하 비의 화학양론은 회합 정도를 결정한다. 펩티드 면역원 및 CpG ODN의 비-공유 정전기 회합은 완전히 재현가능한 과정이다. 펩티드/CpG ODN 면역자극 복합체는 응집하여, 면역계의 "전문적인" 항원 프로세싱 세포 (APC) 제시를 용이하게 하고, 따라서 복합체의 면역원성을 추가로 향상시킨다. 이들 복합체는 제조 동안 품질 제어를 위해 쉽게 특성화된다. 펩티드/CpG ISC는 생체 내에서 잘 관용된다.

이어서, 면역자극 복합체를 도 5b의 하부 패널에 제시된 바와 같이 무기염/알루미늄 염 아주반트와 조합하여 수성 현탁액을 형성할 수 있다.

CpG 모티프는 수지상 세포 (pDC) 및 B 세포의 하위세트에서 발견되는 Toll-유사 수용체 9 (TLR9)의 효능제로서 특성화되었다. Toll-유사 수용체는 박테리아, 바이러스 및 기생충과 같은 일반적 외래 침략자의 특징인 뚜렷이 구분되는 분자 패턴을 인식하는 능력을 갖는다. 특이적으로 비메틸화된, 합성 CpG 서열은 TLR9에 결합하고 활성화할 수 있다. 강력한 B-세포 미토겐으로서, TLR9 효능제는 강한 항체 면역 반응을 유도하는데 효과적이다. CpG 작용의 메카니즘은 특히, 장시간 지속하는 항원 특이적 항체의 개발을 수반한다.

단지 30%의 환자에서 표적화된 Aβ_{1 -42} 응집된 백신에 대해 작용성인 항체를 유도하는데 있어서 그의 면역원성에서, 및 환자의 6%에서 수막뇌염-유사 부작용을 유발한데 있어서 둘 모두 실패한 AN1792 Aβ_{1 -42} 펩티드 백신 임상 시험의 면에서, UBI AD 백신을 위한 본 발명에서 사용된 알루미늄-기반 아주반트는 Th-2형 면역 반응 (즉, IL-4 및 IL-5 시토카인)을 자극하는 것으로 공지되어 있다. 추가로, Aβ 펩티드 면역원 구축물/CpG ODN 면역자극 복합체는 미립자형이다. 미립자형 면역원의 가공은 Th-2형의 반응을 편향하는 APC에 의해 촉진된다.

요약하면, CpG 올리고뉴클레오티드는 몇몇 인간 임상 시험에서 안전하게 (Safely) 사용되었다 (>1,000 환자). 펩티드/CpG ODN 유래 면역자극 복합체는 쉽게 특성화된다. 생리학적 조건 하에 안정하고 생체 내에서 잘 관용된다. 수많은 펩티드 면역원으로부터 유래된 CpG-기반 복합체는 단독으로 또는 무기염과 조합으로 최소의 유해 사건이 보고되면서 마우스, 기니 피그, 돼지, 개, 소, 개코원숭이 및 마카크에서 효능이 있는 것으로 입증되었다. 알루미늄-기반 무기염은 USA에서 현재 허가받은 백신 내에 포함된 유일한 아주반트이다. 이들 아주반트를 사용하는 백신 조성물은 비용 효과적이고, 효율적으로 규모 조정되는 것으로 공지되어 있다. 아주반트 단독에 비해 특정한 백신/아주반트 제제가 허가받았다. UBI는 탐구되고 개발된 특유한 조성을 갖는다. 치매의 치료를 위한 UBI AD 백신의 상기 설명된 특색은 SUCCESS이기 위해 필요한 모든 요소를 갖는다.

실시예 9

근육내 주사를 위한 UBI AD 백신의 제제화

Aβ_{1 -14}-εK-KKK-MvF5 Th 펩티드 면역원 구축물 (서열 64) 및 Aβ_{1 -14}-εK-HBsAg3 Th 펩티드 면역원 구축물 (서열 65)은 생리학적 pH에서 양이온성이다. 도 2a, 2b, 2c (좌측)는 단독으로 및 등몰비 혼합물로 2가지 펩티드의 HPLC 프로파일을 예시한다. 도 2d 및 2e (우측)은 분자량 (Da)이 각각 3892 및 4374인 2가지 펩티드의 MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 특성화된 프로파일을 예시한다. 다가음이온성 CpG ODN의 첨가는 전하 중화 및 용액 내의 면역자극 복합체 (ISC)의 즉시 "자가-조립"을 일으킨다. 양이온성 펩티드:음이온성 CpG의 몰 전하 비의 화학양론은 회합 정도를 결정한다. UBI AD 백신을 단계별로 제조하였다: ISC를 CpG ODN에 대한 대략 동일한 몰 전하 비를 갖는 2가지 Aβ 펩티드 면역원 구축물의 등몰 혼합물을 사용하여 주사용수 내에 제조하였다.

a. 아주반트로서 명반 또는 아주포스의 부재 또는 존재 하에 CpG 올리고머와 면역자극 복합체를 형성하는 300 ㎍ /0.5 mL의 고도로 정제된 Aβ _{1 -14} 펩티 드 면역원 구축물 (서열 64 및 65)을 함유하는 백신 제제의 프라임 (0 wpi ) 및 부스트 (3 및 6 wpi) 후에 개코원숭이에서 10주 기간에 걸친 면역원성의 평가

고도로 정제된 Aβ_{1 -14} 펩티드 면역원 구축물 (서열 64 및 65)을 사용하는 기니 피그에서의 면역원성 및 투여 연구의 처음 수준에 기반하여, 2가지 Aβ_{1 -14} 펩티드 면역원 구축물 (서열 64 및 65)을 등몰비로 함유하는 300 ㎍ 혼합물을 상기 설명된 바와 같이 CpG 올리고머와의 면역자극 복합체로서 제조하였다. 이어서, 이들을 개코원숭이를 면역화시키기 위해, 명반 또는 아주포스와 함께 또는 아주반트 없이, 특이적 항체 수준을 10주 기간에 걸쳐 관찰하는 0, 3, 6주 면역화 프로토콜에 기반한 근육내 주사를 위해 300 ㎍ 펩티드/용량으로 제제화하였다. 인간 시험에 도입하기에 앞서 상기 면역원성 평가 및 최종 제제 평가를 위해 개코원숭이를 사용하였고, 이것은 상기 동물 종이 규모에서 인간과 가장 닮은 면역 반응을 생성하기 때문이다. 모든 백신 제제를 동물에게 0.5 mL/용량으로 군 당 2마리 동물에 제공하였다. 도 6에 제시된 바와 같이, 0.5 mL/용량 내의 300 ㎍에서, 3가지 모든 제제가 아주반트로서 명반 또는 아주포스의 존재 또는 부재 하에, Aβ_{1 -14} 펩티드를 향한 ELISA에 의해 입증된 바와 같이 0.5 Log₁₀ 규모 내에서 대략 동일한 수준의 면역원성을 나타냈다. ISC 제제는 펩티드 단독에 의해 발휘된 면역원성을 유의하게 향상시켰다. 그러나, 8 내지 10주 기간에 걸친 관찰 후에, 아주포스에 의해 지지된 제제는 반응 규모에서 0.5에서 1 Log₁₀로 확대되는 (즉, 약 3 내지 10배 더 강한) 다른 2개의 군에 비해 유의하게 더 높은 면역 반응을 유지하였다. 따라서, 아주반트로부터의 임의의 복합하게 하는 인자 없이 매우 집중된 목적하는 면역 반응을 생성하는 고도로 정제된 합리적으로 설계된 펩티드를 사용함으로써 높은 안전성 인자를 갖도록 설계된, 3개의 밀접하게 관련된 제제를 사용하여 개코원숭이에서 면역원성의 상기 주의깊은 교정을 통해, UBI AD 백신 제제를 다음 실시예에 예시된 바와 같이 면역원성, 특이성, 유도된 항체에 관련된 기능적 특성, 급성 및 만성 독성, 및 최종 임상 효능에 대해 영장류 및 인간에서 추가의 탐구를 위해 완결하였다.

b. 면역원성, 급성 독성, 만성 독성, 효능, 및 임상 안전성, 내약성 및 효능 연구를 위한 UBI AD 백신 제제의 제조 .

ISC를 대략 동일한 펩티드 대 CpG ODN의 몰 전하 비로 CpG와 추가로 혼합된, 2가지 Aβ 펩티드 면역원 구축물 (서열 64 및 65)의 등몰 혼합물을 사용하여 주사용수 내에 제조하였다. UBI AD 백신 제제 내의 CpG ODN은 반대 전하의 정전기 중화에 의해 매개된 과정으로 펩티드 면역원 구축물에 100% 결합하여, 마이크로미터-크기의 미립자의 형성을 야기한다. 미립자 형태는 CpG 아주반트의 통상적인 사용으로부터 CpG ODN의 유의하게 감소된 투여량을 허용하여, 유해한 선천 면역 반응에 대한 가능성을 더 적게 하고, 전문적인 항원-제시 세포 (APC)를 포함한 대체 면역원 프로세싱 경로를 촉진한다. 예비형성된 ISC에 알루미늄 무기염, 등장성을 위한 염수 용액 및 방부제를 순차적으로 첨가하였다. 알루미늄 무기염 중에서, 면역원성의 보다 우수한 지속에 대한 개코원숭이 면역원성 연구 결과에 기반하여 명반 겔 대신에 인산알루미늄을 사용하였다.

c. UBI AD 백신 제제의 안정성 및 면역원성 연구

20%의 과잉으로 아주반트로서 인산알루미늄 (아주포스)을 사용하여 300 ㎍/0.5 mL/용량으로 제조된 UBI AD 백신 제제를 상기 설명된 바와 같이 제조하고, 1 mL 멸균 유리 바이알에 충진하고 2-8℃에서 2년 동안 저장하였다. 샘플을 안정성 시험 프로토콜에 따라 회수하였다. 모든 물리적 파라미터는 품질 관리 (QC) 명세서를 만족하였다. Aβ_1-14 펩티드 면역원 구축물을 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN) 및 아주포스 아주반트로부터 분해하고, 각각의 펩티드에 대한 분석 세목에 따라 HPLC에 의해 분석하였다. 도 2c의 좌측 최하부 패널에 제시된 바와 같이, 2가지 Aβ_{1 -14} 펩티드 면역원 구축물 (서열 64 및 65)는 HPLC 분석 시에 예상된 용리 시간에 2가지 각각의 펩티드의 등몰 혼합물인 것으로 밝혀졌다.

기니 피그에서 면역원성 연구를 위해 UBI AD 백신 제제를 담은 바이알을 회수하였다. 각각 6마리 동물을 포함하는 2개의 군을 시험하였고, 여기서 하나는 300 ㎍/용량을 0 및 3 wpi에 투여하는 백신군인 반면, 다른 군에게는 위약 백신 제제 (즉, 2가지 펩티드 면역원 구축물이 없는 동일한 제제)를 투여하였다. 도 7에 제시된 바와 같이, 3 wpi에서 부스트 후에 5 wpi에 피크 반응에 도달하는, 단일 투여 시에 모든 동물에 의해 유의한 면역원성이 달성되었다. 8 wpi로부터 얻은 면역혈청을 면역원성 향상을 제공하기 위해 사용된 각각의 Th 펩티드와 그들의 반응성에 대해 추가로 시험하였다. 표 8에 제시된 바와 같이, 존재하더라도 적은 반응성이 Th 펩티드에 대해 유도되어, 이들 2가지 Th 펩티드의 "면역침묵성" 성질을 추가로 확인하고, 따라서 Aβ 펩티드의 N-말단에만 전적으로 유도된 매우 집중된 면역 반응을 허용하였다. 따라서, 잘 특성화되지는 않은 생물학적 물질을 전적으로 취급하는 역사적인 백신 산업에서 벗어나, UBI AD 백신 제제는 잘 규정된 화학물질로 이루어져 있고, 설계된 대로 집중된 면역 반응을 생성하고, 모노클로날 항체보다 더 넓게 반응성이어서, 통상적인 펩티드-운반체 접합형의 백신보다 효능이 더 효과적이고 훨씬 더 순수하여, 높은 안전성 인자를 나타낸다.

실시예 10

UBI AD 백신의 혈청학적 특이성 및 안전성을 평가하기 위한 알츠하이머 질환이 있는 인간 뇌의 면역조직화학적 염색

실시예 7에서 설명한 등몰비의 Aβ 펩티드 면역원 구축물 (서열 62 및 63)로 면역화시킨 군 3 및 군 4의 개코원숭이로부터의 과다면역 혈청을 정제된 IgG 분획과 함께 모으고, 인간 AD 뇌와 그들의 반응성에 대해 시험하였다. 도 8에 제시된 바와 같이, 뇌 혈관 및 아밀로이드 플라크를 사용한 염색이 과다면역 혈청으로부터 정제된 IgG에 의해 밝혀졌지만, 면역전 혈청으로부터의 유사한 IgG 분획에서는 그렇지 않았다. 면역 혈청을 Aβ_{1 -14} 펩티드와 함께 예비 인큐베이팅하면 뇌 혈관 및 아밀로이드 플라크 둘 모두와의 모든 면역반응성을 흡수해버리지만 비-관련 펩티드에 의해서는 그렇지 않았고, 이것은 Aβ 펩티드 면역원 구축물 (서열 62 및 63)을 포함하는 백신 제제를 사용한 백신 접종에 의한 면역 혈청에서 항-Aβ 항체 반응성의 높은 특이성을 증명한다.

특이성 및 바람직하지 않은 항체 자가반응성에 대해 모니터링하기 위해, 면역전 및 과다면역 기니 피그 IgG를 사용하는 또 다른 면역조직병리학 연구를 성인 정상 인간 조직의 저온유지 절편에 대해 수행하였다. 인간 조직의 패널 (N = 32)을 UBI AD 면역치료 백신으로 면역화시킨 기니 피그로부터의 정제된 항-Aβ_{1 -14} IgG와의 면역반응성에 대해 스크리닝하고, 동일한 동물로부터의 면역전 정제된 IgG에 비교하였다. 성인 정상 조직의 절편 상에서 관찰된 면역염색 패턴을 페노패쓰 래보래토리스에서 보증된 임상 병리학자가 검토하였다. 몇몇 근육 조직 (예를 들어, 자궁내막)의 약한 양성 면역반응성을 제외하고는, 시험된 모든 성인 인간 조직은, 3개의 성인 대뇌 시료 중 하나에서 노인성 플라크에서 강한 양성 반응성 및 척수 샘플 내에서 뇌척수액의 양성 면역염색과는 달리 음성이었었다.

실시예 11

성체 개코원숭이에서 원형(prototype) UBI AD 백신 제제의 면역원성 연구

프로토콜의 파트 A에서, 4마리의 성체 수컷 개코원숭이를 개인 소유의 면역자극 복합체 (ISC)로 복합체화되고 알루미늄 무기염 아주반트를 사용하여 제제화한 Aβ_{1 -14} 펩티드 면역원 (300 ㎍ 총 펩티드/용량)으로 0, 3 및 6주에 면역화시켰다. ISC/무기염 제제는 모든 동물에서 강한 항-Aβ 항체 반응을 생성시켰다 (도 9a). 유해한 주사 부위 반응은 인지되지 않았다.

프로토콜의 파트 B에 대한 목표는 (1) 표적 임상 용량 및 4배 더 높은 용량에서 안전성 및 반복 노출의 주사 부위 반응원성을 모니터링하고, (2) 용량 상승 연구로 면역원성을 모니터링하고, (3) 회상 (recall) 항체 반응의 운동학을 평가하기 위한 것이었다. 이어서, 이들 동물을 72주 동안 휴식시켰다. 중간 기간에, 항-Aβ 항체의 혈청 수준은 10-100배 감쇠되었다. 초기 주사의 78주 및 81주 후에 (도 9b), 4마리의 동물에게 백신을, 300 ㎍ 펩티드 용량으로 동물 번호 564 및 565에 또는 1200 ㎍ 용량으로 동물 번호 556 및 561에 투여하였다. 회상 반응은 4마리의 모든 개코원숭이에서 피크 항체 역가를 빠르게 회복하였다. 제104주에, 항체 역가가 감소하기 시작하였고, 동물은 제104주에 부스터 용량에 의해 다시 피크 역가로 회복되었다. 혈청 항-Aβ 항체 반응의 운동학을 항-Aβ_{1 -28} 펩티드 ELISA에 의해 제0, 2, 5, 6, 8, 10, 78, 81, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 107 및 111주에 결정하였다. 주사 부위 반응은 300 ㎍ 용량을 투여받은 동물에서 주지되지 않았다. 그러나, 고용량 (1200 ㎍)을 투여받은 개코원숭이에 대해 단지 제78주에 몇몇 발적 및 염증이 주사 부위에서 주지되었고; 상기 일시적 반응은 1주 이내에 완전히 해소되었다. 다른 유해 사건 또는 안전성 문제는 개코원숭이를 평가한 2년 내내 보고되지 않았다.

실시예 12

항- Aβ 항체에 의한 원섬유 형성의 억제 및 Aβ _{1 -40} -매개 독성으로부터의 보호에 대한 시험관 내 신경독성 검정

문헌 [Solomon B, et al. (Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:4109-4112)]에 이전에 설명된 바와 같이, 신경독성 검정에서는 래트 크롬친화세포종 세포주 PC-12 및 Aβ_1-40 펩티드의 노화시킨 (aged) 용액을 사용하였다. 펩티드 용액을 콩고 레드 (Congo Red) 결합에 의해 원섬유 형성에 대해 특성화하였다. 제6일 및 제9일에, 흡광도 A_540nm에 의해 제시된 바와 같이 용액은 동등한 양의 염료에 결합하였다. 상기 관찰은 독성 Aβ_1-40 응집체의 형성에 대한 증거를 제공하였고; 제9일 제제를 PC-12 세포에 대한 독성에 대해 시험하였다.

PC-12 세포를 조직 배양액 내에 성장시키고, 검정 배지 내에 현탁시키고 96-웰 환저 조직 배양 플레이트의 웰 내에 100 ㎕ 내에 5 x 10³개 세포/웰로 넣었다. 37℃-인큐베이팅된 펩티드 (즉, 응집된 Aβ_{1 -40}) 및 새로 제조한 펩티드 (즉, 비-응집된)의 독성을 25 및 6.5 μΜ에서 이중으로 시험하였다. 대조군은 검정 매질만을 갖는 PC-12 세포이었다. 플레이트를 37℃에서 CO₂ 인큐베이터 내에서 48시간 동안 인큐베이팅하였다. 세포에 대한 독성은 프로메가 (Promega) 사이토톡스(CytoTox) 96® 세포독성 검정에 의해 결정하였다. 용해를 흡광도 A_492nm에 의해 결정하고, 결과를 100% 용해에 비해 세포독성의 백분율로서 제시하였다.

기능적 면역원성에 대한 UBI AD 백신의 시험관내 평가

래트 크롬친화세포종 세포주 PC-12, 및 독성인 것으로 특성화된 Aβ_{1 -40} 펩티드의 노화시킨 용액을 사용하는 신경독성 검정을 사용하여, UBI AD 백신에 대한 항체 반응의 기능적 효능을 평가하였다. 노화시킨 Aβ_{1 -40} 펩티드 용액을 동물 면역화 프로토콜로부터 기니 피그 또는 개코원숭이 항-Aβ 혈청의 존재 하에 1-시간 예비-인큐베이션 이후 PC-12 세포에 대한 독성에 대해 시험하였다. 항-Aβ 혈청을 1:30 및 1:90 희석비에서 시험하였다. 최종 결과를 Aβ_{1 -40} 원섬유 응집의 억제 백분율 및 Aβ_{1 -40} 원섬유-매개 세포독성으로부터 PC-12 세포의 보호 백분율로서 제시하였다. 두 면역화 실험의 제0주로부터 면역전 혈청을 대조군으로 포함시켰다. 1:30 및 1:90 희석비 모두에서 제5주 및 제8주로부터의 면역 기니 피그 혈청 및 개코원숭이 혈청은 상응하는 희석비에서 면역전 혈청에 대한 배경 5 내지 10% 억제에 비해 유의한 억제 (각각 1:30 및 1:90 희석비에서 제5주 및 제8주에 수집된 혈액 모두에 대한 기니 피그 혈청에 대해 50 내지 70%); 및 원섬유생성 검정의 억제에서 면역전 개코원숭이 혈청에 대한 15% 배경 억제에 비해 유의한 억제 (각각 1:30 및 1:90 희석비에서 제5주 및 제8주에 수집된 혈액 모두에 대한 개코원숭이 혈청에 대해 75 및 50%)를 제공하였다. 유사하게, 기니 피그 및 개코원숭이 모두로부터 면역전 혈청으로부터 얻어진 배경 결과에 비해, 60 내지 80% 범위의 Aβ_{1 -40}-매개 독성으로부터 PC-12 세포의 보호가 이들 조건에 대해 발견되었다. 이들 결과는 UBITh® 아밀로이드-β 펩티드 면역원을 사용한 면역화에 의해 유도된 항체애 대한 독성 Aβ_{1 -40} 펩티드에 대한 기능적 중화 활성을 확립한다.

실시예 13

뇌 형태에 대한 예방 방식에서 UBI AD 백신의 효과 및 hAPP751을 과다발현하는 어린 트랜스제닉 마우스의 뇌 샘플 내의 아밀로이드-β 펩티드 ( Aβ _{1 -42} ) 농도

본 발명자들은 뇌 형태에 대한 예방 방식에서 UBI AD 백신의 효과, 및 스웨덴 및 런던 돌연변이를 갖는 hAPP751을 과다발현하는 어린 트랜스제닉 (tg+) 마우스의 뇌 샘플 내의 및 그들의 비-트랜스제닉 (ntg) 한배 새끼에서 아밀로이드-β 펩티드 (Aβ_{1 -42}) 농도를 평가하였다 (Rockenstein EM, et al., 1995 및 2001).

어린 트랜스제닉 (tg+) 마우스를 예방 방식으로 ~14주령에서 UBI AD 백신으로 면역화시켰다. 뇌 조직을 아밀로이드 플라크의 결정을 위해 항-Aβ_{1 -42} 항체로 면역조직화학적으로 염색할 때, 이들 반응성 어린 tg+ 마우스에 대한 결과는 플라크 로드가 감소되었음을 보여주었다. 백신 접종한 어린 tg+ 마우스의 뇌 조직을 생화학적으로 추출하고 정량적 검정에 의해 Aβ_{1 -42} 수준에 대해 평가할 때, 어린 tg+ 반응자 마우스로부터의 결과는 Aβ 침착의 감소를 나타냈다. 이들 두 파라미터는 모두 Aβ_{1 -42} 로드의 감소가 UBI AD 백신에 대한 항체 반응과 상호관련됨을 나타낸다.

추가로, 항-CD11b 항체를 사용하는 % 상대 미세아교 세포 활성화의 결정 및 항-CD3 항체를 사용하는 T 세포 침윤의 결정은 비처리된 tg+ 대조군 동물에 비해 AD 백신-처리한 어린 tg+ 동물의 뇌 내에서 증가된 면역 세포 활성화에 대한 증거가 없음을 밝혔다.

a. 전체 목적 :

뇌 아밀로이드 침착 및 뇌 플라크 로드에 대한 UBI AD 면역치료 백신을 사용한 12 내지 16주 기간에 걸쳐 근육내 백신 접종의 효과, 및 혈장 내 인간 아밀로이드-β 펩티드 (Aβ_1-42) 수준의 평가.

트랜스제닉 동물은 뮤린 Thy-1 프로모터의 조절 제어 하에 런던 (717) 및 스웨덴 (670/671) 돌연변이를 갖는 인간 아밀로이드 전구체 단백질 (hAPP)을 구성적으로 과발현한다 (Rockenstein EM, et al., 1995 and 2001). hAPP751 tg+ 마우스에서, Aβ_{1 -42} 침착은 전두 피질 내에 성숙 플라크가 출현하면서 3 내지 4월령만큼 초기에 일어나고, 5 내지 7월령에 플라크 형성이 해마, 시상 및 후각로의 피질 돌기 영역으로 확장한다.

b. 예방 방식을 위한 프로토콜 요약

뇌 Aβ 침착에 대한 UBI AD 백신의 효과, 및 뇌 Aβ 플라크 로드를 평가하기 위해, hAPP751 트랜스제닉 (tg+) 마우스 및 그들의 비-트랜스제닉 (ntg) 한배 새끼 (14+2주)를 선택하였다. 총 33마리 tg+ 마우스 및 10마리 ntg 마우스를 4개 군으로 분리하였다: tg+ 위약 대조군 마우스 (n = 10)에게 단지 아주반트를 주사하고; tg+ 실험 마우스 (n = 13)에게 UBI AD 백신 (90 ㎍/150 ㎕ 용량)을 주사하였다; 비처리된 tg+ 대조군 마우스 (n = 10); 및 비처리된 ntg 대조군 마우스 (n = 10). 총 3가지 용량을 0, 3, 12주에 투여하고, 추가 용량을 제16주에 투여하였다. 제25.5주에, 모든 마우스를 모리스 (Morris) 물 미로 시험에 의해 공간 학습에 대해 모니터링하였다. 마우스를 추가로 4주 동안 추적조사한 후 희생시켰다.

c. 항- Aβ _{1 -28} 항체 역가의 결정

모든 tg+ 및 ntg 마우스를 제0, 3, 6, 9, 12, 16, 19, 22 및 29주에 채혈하였다. Aβ_{1 -28} ELISA를 이용하여 항-Aβ_{1 -28} 항체 역가의 결정을 위해 혈청을 분리하였다. 위약-처리된 tg+ 마우스 및 비처리된 tg+ 마우스는 검출가능한 항-Aβ_{1 -28} 항체 역가를 갖지 않았다. 그러나, 적어도 2회 UBI AD 백신 주사를 투여한 어린 tg+ 마우스는 검출가능한 항체 역가를 가졌다.

d. 뇌 형태, 및 아밀로이드 침착 및 플라크 로드의 분석

생전 연구의 끝에, 종료 시에, 마우스를 생리 (0.9%) 염수로 경심장 주입하고, 뇌를 신속하게 제거하고, 반절단하고, 추가의 분석을 위해 준비하였다. 좌측 반뇌를 동결시키고, 아래 섹션 e에 설명된 바와 같이 나중에 분석하였다. 우측 반뇌를 1시간 동안 PBS (pH 7.4) 내에서 신선한 4% 파라포름알데히드 내에 침액 고정시켰다. 이어서, 반뇌를 냉동보호를 위해 15% 수크로스 용액에 옮겼다. 다음날, 뇌를 드라이아이스 상에서 동결시키고 조직학적 조사에 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 저온유지 절편 (10 nm 두께)를 H&E로 염색하고, 기록하고, 뉴런층 완전성 (integrity) 및 거시적 형태에 대해 평가하였다. 냉동절단된 조직 절편을, 피질 및 해마에서 Aβ 침착 및 플라크 로드를 결정하기 위해 모노클로날 항체 4G8 (항-Aβ_{17 - 24})을 사용하여 평가하였다. 플라크의 수 및 플라크에 의해 덮인 영역을 정량하였고, 각각의 동물의 시상 뇌를 가로질러 5개의 상이한 층으로부터 9개 조직 슬라이스의 평균값이 동물에 대한 통계학상 관련 값을 구성하였다. UBI AD 백신 처리군에서 7마리 tg+ 마우스 및 비처리된 대조군에서 7마리 tg+ 마우스를 평가하였다. 결과를 UBI AD 백신 처리된 (n = 7) 대 비처리된 (n = 7) 동물의 % Aβ_{1 -28} 플라크 로드로서 표현하고 (도 10a, 10b), 면역조직화학에 의해 9개의 조직 절편에서 검출된 평균 상대 플라크 로드를 나타낸다. UBI AD 백신 반응자 tg+ 마우스 대 비처리된 동물의 비교가 뇌 피질 (0.22% vs. 0.32%) 및 해마 (0.20% vs. 0.29%)에서 또한 포함되었고; 감소된 평균 플라크 로드가 고도 반응성인 백신-처리된 동물에서 인지되었다.

e. 뇌 조직의 생화학적 분획화에 의한 Aβ _{1 -42} 의 결정

동물을 치사시키고 뇌를 아래 섹션에 설명된 바와 같이 준비하였다. 좌측 반뇌를 따로 동결시키고, 나중에 4개의 뇌 추출액으로부터 가용성 분획을 항원 검출을 위한 고민감도 Aβ_{1 -42} ELISA 키트 (더 제네틱스 컴퍼니 (스위스) 제품)를 사용하여 Aβ_{1 -42} 펩티드 수준에 대해 평가하였고; 제조자가 제공하는 표준물에 비교하여 Aβ_{1 -42} 수준을 결정하였다. 4개의 뇌 분획에서 얻어진 결과를 ng/g 습윤 뇌로서 제공한다. 각각의 동물의 좌측 반뇌 (후각 팽대부 포함)를 Aβ_{1 -42}의 특성화 및 평가를 위해 TRIS-완충 염수 (TBS), 트리톤 X-100 세제, SDS 세제, 및 포름산 (FA)을 사용하여 추출하고, 분획을 이중으로 시험하였다. 간단히 설명하면, TBS 추출액은 뇌 조직의 수용성 Aβ_{1 -40} 및 Aβ_{1 -42} 분획을 함유한다. 남아있는 베타 아밀로이드 펩티드를 용해시키기 위해, 세제 및 산이 필요하다. 트리톤 X-100은 2개의 특성을 갖는 올리고-에틸렌 글리콜 유도체이다; 벤젠 고리를 갖는 이소-옥틸 잔기는 무극성 반 데어 발스력 (van der Waal force)을 파괴하고, 반복된 -O-CH₂-CH₂- 잔기는 수소 결합을 분해시킨다. SDS는 유사한 양면 효과를 갖지만 보다 강하고 전체 2차 구조를 파괴하고; Aβ 펩티드는 선형을 취할 것이고, 펩티드 사슬은 펼쳐진다. 포름산은 가장 강한 용매이고 주로 수소 결합을 파괴한다. TBS는 올리고머 구조를 가용화시키는 것으로 추정할 수 있다. 트리톤은 원시섬유와 같은 보다 작은 중합체를 가용화시킨다. SDS는 전체 남아있는 구조를 파괴하고, 강하게 복합체화된 불용성 원섬유를 포함하는 남아있는 부분을 주로 단량체로서 FA 내에 분리시킬 수 있다. 따라서, 베타 아밀로이드 중합체화 상태 및 항-아밀로이드 형성성 시험 화합물의 효능을 평가하기 위해, 4개의 모든 분획을 조사하였다.

Aβ 정량적 ELISA 및 생화학적 추출은 백신-처리된 (UBI AD 백신) 반응자 tg+ 마우스의 항-Aβ 항체 반응이 비처리된 tg+ 마우스에 비해 감소된 Aβ 로드와 연관되는지 그렇지 않은지 시험한다. 뇌 조직의 각각의 4개의 생화학적 추출액 내의 Aβ_{1 -42} 수준을 비처리된 tg+ 대조군 동물로부터 결과에 비교할 때 UBI AD 백신 반응자 tg+ 마우스에서 Aβ_1-42의 감소된 전체 수준에 특히 주목한다 (도 11a, 11b).

f. 미세아교 세포 활성화의 결정

냉동절단된 조직 절편을, CD11b 항체를 사용하여 활성화된 미세아교 세포에 대해 평가하였고; 평균 사물 (object) 크기를 미세아교 세포의 클러스터링의 평균 측정치로서 각각의 슬라이스 내의 사물의 수를 통한 면적의 몫 (quotient)으로서 평가하였고; 각각의 동물의 시상 뇌를 가로질러 5개의 상이한 층으로부터 9개 슬라이스의 평균값이 동물에 대한 통계학상 관련 값을 구성하였다.

뇌 피질 및 해마에서 염색된 CD11b-양성 세포 면적의 %로서 표현된, 백신-처리된 tg+ 마우스 (n = 7) 대 비-처리된 tg+ 마우스 (n = 7)의 결과는 처리된 동물이 비-처리된 tg+ 대조군 동물에 비해 더 낮은 염색된 평균 면적 %를 보여주었다. 이들 결과는 백신-처리된 동물은 비처리된 트랜스제닉 마우스에 비해 증가된 수의 활성화된 미세아교 세포를 보이지 않음을 나타낸다.

g. 뇌 조직에서 T-세포-침윤의 결정

뇌 피질, 해마 내의 및 혈관 내의 T-세포의 수를 검출하기 위해 냉동절단된 조직 절편을 평가하고, 세포를 독점적으로 계수하였다. 각각의 동물의 시상 뇌를 가로질러 5개의 상이한 층으로부터 9개 조직 슬라이스의 평균값이 동물에 대한 통계학상 관련 값을 구성하였다. 뇌 피질 및 해마에서 염색된 CD3-양성 T-세포의 수 및 혈관 내에서 염색된 T-세포의 수로서 표현된 백신-처리된 tg+ 마우스 (n = 7) 대 비-처리된 tg+ 대조군 마우스 (n = 7)의 결과는, 백신-처리된 동물이 비처리된 tg+ 대조군 동물에 비해 뇌 피질, 해마 및 혈관 내에 계수된 면역염색된 T-세포의 평균수의 근소한 감소를 보여줌을 나타낸다.

h. 결론

hAPP751 트랜스제닉 마우스에게 UBI AD 백신 또는 위약 백신을 16주 기간에 걸쳐 근육내 경로로 3 또는 4회 주사하였다. 동물은 특히 이들 동물에게 용량당 제공된 UBI Aβ_{1 -14} 펩티드 면역원 구축물의 높은 농도 (90 ㎍/150 ㎕)를 고려할 때, UBI AD 백신에 대한 우수한 전체 내약성을 가졌다. 반응자에서, 이들 동물로부터 4개 뇌 조직 추출액에서 감소된 Aβ 플라크 로드 및 감소된 Aβ_{1 -42} 수준이 관찰되었다. 감소된 Aβ 침착 및 플라크가 또한 면역조직화학에 의해 밝혀졌다. 백신-처리된 tg+ hAPP751 마우스의 뇌에서 미세아교 세포 활성화 또는 T-세포 침윤의 증거는 존재하지 않았다.

실시예 14

안전성을 위한 UBI AD 백신에 대한 항체 반응의 에피토프 맵핑

고체상 항원으로서 Aβ_{1 -14} (서열 4), Aβ_{1 -28} (서열 3), Aβ_{17 -42} (서열 67), MvF5 Th (서열 46), HBsAg3 Th (서열 47) 펩티드로 코팅된 플레이트를 사용한 ELISA 시험으로 면역화시킨 기니 피그 및 개코원숭이로부터의 혈청 내의 UBI AD 백신에 대한 항체 반응의 특이성에 대해 평가하였다. 백신에 의해 유도된 고역가 항-Aβ 항체는 Aβ_{1 -14} 및 Aβ_{1 -28} 항원을 사용하여 검출되었지만 (표 1); Aβ_{1 -28} 펩티드는 또한 잠재적으로 유해한 교차 반응성의 공급원인 아미노산 14를 넘어 "B 세포 에피토프 전파 (spreading)" 때문에 추가의 항체를 검출한다는 우려가 존재하였다.

이러한 우려를 해결하기 위해, 과다면역 기니 피그 항혈청 및 과다면역 개코원숭이 항혈청을 또한 ELISA에 의해 Aβ_{17 -42} 펩티드를 사용하여 시험하였다. ELISA 역가는 시험된 과다면역 샘플에서 에피토프 전파가 검출되지 않았음을 나타낸다. 과다면역 혈청은 Aβ_{1 -28} 펩티드에 대한 향상된 결합을 보여주었지만, Aβ_{17 -42}와 반응하지 않았다. 과다면역 혈청은 MvF5 Th (서열 46) 또는 HBsAg3 Th (서열 47) 펩티드 도메인과 반응하지 않았다. 우세한 항체 결합 부위(들)을 표적 영역 내의 특이적 잔기에 위치시키는 우수한 에피토프 맵핑 방법에서, Aβ_{1 -14}의 전체 길이 + 인접 hAPP 위치를 포괄하도록, Aβ_1-14 펩티드 서열의 N-말단 아스파르트산 잔기 "D" 및 인간 아밀로이드-β 펩티드 전구체 단백질 (hAPP)의 인접한 영역 주위에 24개의 겹치는 10량체 펩티드를 합성하였다 (표 9). 이들 중첩된 (nested) 펩티드를 개별적으로 사용하여 ELISA 시험을 위한 고체상 면역흡착제로서 미세적정 웰을 코팅하였다. 양성 대조군 ELISA 플레이트는 Aβ_{1 -28}로 코팅하였다. 이들을 제0, 10, 84 및 111주로부터 4마리 면역화시킨 개코원숭이로부터의 혈청과의 항체 결합에 대해 시험하였다. 개코원숭이 혈청을 연속 희석하고, 5 ㎍/mL로 10량체 펩티드로 코팅한 플레이트 상에서 검정하였다. 예상된 바와 같이, Aβ_{1 -14} (서열 4)의 N-말단 10량체를 나타내는 서열 6의 펩티드 (DAEFRHDSGY)는 4마리의 모든 개코원숭이로부터 면역 혈청과 강하게 반응하였다. Aβ_{1 -14}의 위치 1의 "D"는 항체 특이성에 대한 핵심이었다. 위치 1의 "D"의 결실 또는 "E" (글루탐산)로의 변형은 10량체 펩티드에 대한 결합을 심하게 감소시켰고, 이것은 Aβ_{1 -10} (서열 6)에 대한 개코원숭이 항체의 높은 특이성, 및 Aβ_{1 -42} 펩티드 또는 그의 전구체 상의 다른 부위에서 Aβ 펩티드 면역원 구축물에 교차반응성인 항체 인식 부위의 낮은 발생 가능성을 나타낸다. 추가로, 면역 혈청에 의해 인식되는 우수한 특이성에 대한 에피토프 맵핑은 표 10에 제시된 바와 같이 경쟁적 억제 ELISA에 의해 추가로 확인되었다. 요약하면, 이들 항체 에피토프 발견은 UBI AD 면역치료 백신 후보물질에 의해 유도된 항체가, 잔기 14를 넘은 부위가 아니고 또한 MvF5 Th 및 HBsAg3 Th 도메인이 아니라, Aβ의 N-말단 도메인에 특이적으로 작용함을 입증하였다.

실시예 15

UBI AD 백신을 사용한 다수 면역화를 받은 시노몰거스 마카크로부터 혈청 및 CSF 내의 항체 반응 및 Aβ _{1 -40} 수준

백신 반응의 운동학은 저용량 군 2 (150 ㎍/0.25 mL)의 6마리 마카크 중 4마리 및 고용량 군 3 (750 ㎍/1.25 mL)의 6마리 모든 마카크가 최초의 면역화 후에 Aβ_{1 -42}와 교차반응성인 Aβ_{1 -14} 펩티드 면역원 구축물에 대한 항체를 생성함을 보여주었다.

표 11에 제시된 바와 같이, 저용량 및 고용량 동물 둘 모두는 연구의 지속시간 (제27주까지) 동안 고역가 항체를 지속하였다. 고용량 (750 ㎍) 또는 저용량 (150μ)의 UBI AD 백신으로 3회 (9 WPI) 및 5회 (15 WPI) 면역화시킨 군 당 4마리 마카크로부터 혈청을 사용한 에피토프 맵핑을 통한 항체 반응의 우수한 특이성 (표 12)은 군 당 4마리 모든 동물에서 N-말단 Aβ_1-10 펩티드 (DAEFRHDSGY) (서열 6)에 대한 강한 특이성을 나타냈고, 이것은 보다 초기 개코원숭이 연구로부터 면역 혈청을 사용하여 관찰된 것 (표 9)과 유사하였다. 개코원숭이에서 관찰된 반응성 패턴과는 달리, Aβ_{1 -42} 펩티드의 N-말단의 위치 4, 5 및 6에서 잔기 RHD를 둘러싸는 서열 20 내지 22를 갖는 펩티드에 대한 4마리 모든 동물에서 일부 보통의 반응성이 관찰되었다. 시험된 임의의 마카크 샘플에 대해 상기 언급된 4개 외부의 다른 10량체 펩티드에 대한 추가의 반응성은 인지되지 않았다.

혈청 및 CSF 내의 Aβ_{1 -40} 수준에 대한 UBI AD 백신의 효과는 상업적으로 이용가능한 면역검정 키트를 사용하여 결정하였다. 표 13에 제시된 바와 같이, 백신 접종 후의 Aβ_{1 -40} 농도를 0, 15, 21 및 25.5주의 혈청 내에서 및 희생의 시간 (제15주+1일 또는 제27주)에 CSF 내에서 결정하였다. 혈청 내의 Aβ_{1 -40} 수준은 UBI AD 백신을 투여받은 마카크 내에서 상승하였지만, 위약 백신을 투여받은 동물에서 정상 수준이 인지되었다. 이와 대조적으로, Aβ_{1 -40} 수준은 위약 또는 UBI AD 백신을 투여받은 마카크의 뇌척수액 (CSF)에서 정상 상태 (steady state)를 유지하였다. 이들 결과는 항-Aβ 항체에 대한 작용 방식으로서, 항체가 뇌로부터 말초 순환계로 Aβ 펩티드의 유출을 촉진하는 "말초 이동 가설 (Peripheral Sink Hypothesis)"을 지지한다.

실시예 16

UBI AD 백신을 사용한 다수의 면역화를 받은 시노몰거스 마카크로부터의 세포성 면역 반응

말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플을 15, 21 및 25.5주에 수집된 전체 혈액으로부터 단리한 후, 다양한 Aβ 펩티드의 존재 하에 배양하였다. 표 14에 제시된 바와 같이, Aβ_{1 -14} 펩티드를 배양 배지에 첨가할 때, 림프구에 의한 증식 반응은 관찰되지 않았다. 그러나, Aβ_{1 -42} 또는 Aβ_{17 -42} (서열 67) 펩티드를 몇몇 PBMC 배양액에 첨가할 때 양성 증식 반응이 인지되었다.

15, 21 및 25.5주에 수집된 PBMC 샘플을 Aβ 펩티드 또는 PHA 미토겐의 존재 하에 시토카인 분비에 대해 또한 시험하였다. 표 15에 제시된 바와 같이, 3개의 시토카인 (IL-2, IL-6, TNF-α)은 전장 Aβ_{1 -42} 펩티드에 반응하여 검출가능한 분비를 보여주었지만 Aβ_{1 -14} 펩티드에 대해 그렇지 않았고; 위약 백신 샘플에 비해 UBI AD 백신-처리된 샘플에서 시토카인 분비의 상향-조절은 검출되지 않았다. Aβ 펩티드의 존재 하에 시험한 3개의 다른 시토카인 (IL-10, IL-13, IFN-γ)는 모든 PBMC 배양액에서 검정 검출 한계 미만이었다.

마카크를 Aβ_{17 -42} 펩티드 도메인 없이 외래 T 헬퍼 에피토프와 함께 단지 N-말단 Aβ_1-14 펩티드 면역원만을 갖는 UBI AD 백신으로 면역화시켰고, Aβ_{1 -42} 펩티드의 존재 하에 PBMC 배양액에서 인지된 양성 증식 결과는 UBI AD 백신 반응에 관련되지 않았고, 대신에 천연 Aβ에 대한 배경 반응이었음을 나타낸다.

이들 결과는 단지 Aβ_{1 -14} 및 외래 T 헬퍼 에피토프를 갖는 UBI AD 백신의 안전성을 지지하고, 이것은 정상 마카크에서 Aβ 펩티드에 대한 잠재적인 염증성 항-자가 세포-매개 면역 반응을 생성하지 않음을 보여준다. 이와 대조적으로, AN-1792 백신의 임상 시험 연구에서 뇌염과 연관된 유해 사건은 부분적으로, 상기 백신의 원섬유/응집된 Aβ_{1 -42} 면역원 내에 T 세포 에피토프의 포함에 기인하였다.

실시예 17

기니 피그 , 마카크 및 개코원숭이에서 상이한 수준의 UBI AD 백신의 면역원성 비교

AD 백신의 핵심 성분으로서 그들의 적합성에 대한 다양한 Aβ 펩티드 면역원 구축물의 광범한 시험 후에, 백신 제제를 고안하고 설계하기 위해 서열 64 및 65를 갖는 펩티드 구축물을 선택하였다. 아주포스의 무기염을 보충하고, CpG 올리고머와 면역자극 복합체를 형성하는 2가지 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 선택된 백신 제제 (UBI AD 백신)을 실시예 8 내지 15에 설명된 바와 같이 광범하게 시험하여, 임상 시험에서 그의 사용을 위한 제제에서 투여 요법 및 다수의 종 (기니 피그, 마카크, 및 개코원숭이)에서 그의 면역원성을 교정하였다. 표 16은 1 또는 2회의 용량 후에 펩티드 용량 대 반응자 비율 (양성 역가를 갖는 동물의 수/시험한 동물의 총수), 및 UBI AD 백신의 투여 스케쥴 평가를 위한 각각의 종의 체중을 요약한다. 분석으로부터, 관련된 모든 종으로부터의 데이타에 기반하여, 부스트 시에 높거나 거의 완전한 반응 비율을 허용할 것인 단일 주사 (shot) 후 상당한 반응 비율에 도달하도록 100 ㎍보다 초과의 용량 당 수준을 설정하는 것이 바람직하다. 인간 대상체에서 연구를 위해 300 ㎍/0.5 mL 용량의 UBI AD 백신을 선택하였다. I상 임상 연구에서, 개체를 0, 4, 12주에 면역화시켰다. 1회 용량의 4주 후, 19명의 등록된 대상체 중 2명이 양성 항-Aβ 항체 역가를 갖고; 8주에 2회 용량의 4주 후, 19명의 대상체 중 17명이 양성이고; 16주에 3회 용량의 4주 후, 19명의 모든 대상체가 양성이고, 제24-26주에 I상 연구의 끝까지 양성으로 남았다.

실시예 18

I상 임상 연구는 UBI AD 백신 ( UB - 311)에 의한 치료 효과를 제안한다

Aβ 펩티드는 질환 진행에서 그의 역할을 지지하는 병리학적, 생화학적 및 유전적 증거에 기반하여 AD에서 주요 치료 표적이다. UBI AD 백신 (UB-311)과 같은 능동 Aβ 면역요법의 목표는 순환혈로부터 과도한 Aβ 펩티드를 포획하고 인지 감소로 예방하거나 느리게 하는 강건한 항-Aβ 항체를 생성하도록 면역 반응을 자극하는 것이다.

UB-311 I상 임상 연구 (표제 "A Phase I, Open-label Study to Evaluate the Safety, Tolerability and Immunogenicity of the UBI AD Immunotherapeutic Vaccine (UB-311) in Patients with Mild to Moderate Alzheimer's Disease")가 승인된 최종 임상 프로토콜에 기반하여 수행되었다. 경도 내지 중등도 AD가 있는 총 19명의 환자를 등록시켰다. 각각의 환자에게 제0, 4 및 12주에 연구 약물 (UB-311)의 3회 근육내 주사를 제공하였다. 총 연구 지속시간은 24-26주이었다.

UB-311 I상 임상 시험으로부터 수집된 안전성, 내약성, 면역원성 및 효능 데이타의 평가에 추가로, 탐구 목적을 위한 항체 결합 에피토프, Aβ 펩티드 수준, 및 연구 대상체의 면역 기능의 연구 분석이 설명된다. 혈청학 및 면역원성 분석을 위한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 혈청 혈장 샘플의 단리를 위해 제0, 4, 8, 12, 16, 및 24/26주에 UB-311 면역화 전후에 수집된 혈액으로부터의 결과는 (1) 항-Aβ 항체 역가, (2) 에피토프 맵핑, (3) 혈장 Aβ_{1 -40} 수준, 및 (4) 시험관내 림프구 증식 및 시토카인 분석을 포함한다.

경도 내지 중등도 알츠하이머 질환 (AD)이 있는 총 19명의 대상체를 연구에 등록하였고, 제0, 4 및 12주에 UBI AD 면역치료 백신 (UB-311)의 3회의 근육내 주사를 제공하였다.

UB-311은 임상 기록된 경도 내지 중등도 AD가 있는 환자에게 투여할 때 만족스러운 안정성 및 내약성 프로파일을 나타냈다. UB-311에 확실하게, 아마도 또는 가능하게 관련된 유해 사건 (AE)의 발생을 UB-311 치료의 안정성 평가를 위한 1차 종점으로서 설계하였다. 연구 기간 동안, 16건의 치료-관련 AE 에피소드가 19명의 대상체 중에서 9명에서 보고되었다. 치료-관련 AE 중에는 경도의 주사 부위 반응 (5명의 대상체), 중등도 동요 (2명의 대상체), 및 경도의 적혈구 침강 속도 증가 (2명의 대상체)가 있었다. 모든 치료-관련 AE를 중증도에 있어서 등급 1 (경도) 또는 등급 2 (중등도)로 등급을 매기고, 이들 이들 에피소드에 대한 행동은 취하지 않았다. 강직 척추염 및 당뇨병의 병력이 있는 1명의 대상체는 추적 조사 기간 동안 대상포진의 중증 유해 사건 (SAE)을 보고하였다. 사건의 발생 시에 대상체를 즉시 입원시키고 적절한 치료를 제공하였다. 상기 SAE는 인과관계에서 가능성이 없는 것으로 판단되었고, 대상체는 그의 개선된 상태로 인해 2주 후에 퇴원하였다.

UB-311의 내약성을 평가하였다. 19명의 모든 대상체는 치료를 완료하였고, AE 발생에도 불구하고 1명도 연구에서 조기에 배제되지 않았다. 따라서, 내약성은 100%이었다.

실시예 19

UB -311 백신의 투여는 모든 대상체에서 Aβ _{1 -14} 도메인의 N-말단에 특이성을 갖는 항체를 유도하였다.

도 12에 제시된 바와 같이, UB-311 백신의 면역원성을 평가하기 위해 항-Aβ_{1 -14} 항체 수준의 변화를 제0, 4, 8, 12, 16 및 24-26주에 측정하였다. 모든 대상체에 대한 Log₁₀으로 변환한 항-Aβ_{1 -14} 항체 수준의 평균값은 제0주 (처리 전)에 1.14이고, 제4주에 1.21로 근소하게 증가하고, 제8주 및 제12주에 2.00 및 1.91로 현저하게 증가하고, 제16주 (제3 면역화의 4주 후)에 2.70으로 피크이고, 제24-26주에 2.28로 감소하였다.

항체 역가를 Log₁₀ 변환하였고, 제0주에 그들의 값을 기준선으로서 사용하였다. 3개의 모든 특이적 항체 역가에 대해 비슷한 경향이 관찰되었다. 항체 역가의 변화의 평균값은 제4주에 근소하게 증가하되, 항-Aβ_{1 -42} 단량체 항체에서는 대상체가 제0주에 UB-311의 제1 용량을 이미 투여받았지만 제2 용량 이전인 시점이었다. 제4주에 제2 용량을 대상체에게 제공한 후 제8주에 항체 역가는 또한 증가하였다. 제12주에 제3 용량의 투여 후에, 제16주에 항체 역가의 피크 평균 변화가 검출되었다.

실시예 20

신경학적, 인지 및 기능 시험은 경도 내지 중등도 알츠하이머 질환에서 UB -311 백신의 효능을 평가한다.

19명의 환자에서 ADAS-Cog 점수, MMSE 점수, 및 ADCS-CGIC의 변화를 측정함으로써 UB-311의 효능을 평가하였다. ADAS-Cog 점수 및 ADCS-CGIC를 제0주 (V2), 제16주 (V7) 및 제24-26주에 평가하였다. MMSE 점수는 예비스크린 (prescreen) (V1), 제16주 및 제24-26주에 측정하였다. 대상체 중에서, 제0주에서 제16주까지 및 제16주에서 제24-26주까지 각각 ADAS-Cog 점수의 1.42 및 0.79의 증가가 관찰되었다. 기준선에서 평균 ADAS-Cog 점수는 대상체들 사이에 26.26이고, 제16주에 27.68로 증가하고, 제24-26주 28.47로 근소하게 증가하였다. 또한, 예비스크린 방문으로부터 제16주까지 및 제16주로부터 제24-26주까지 MMSE 점수의 0.32 및 0.79의 감소가 발견되었다 (도 13).

예비스크린 방문에서 대상체의 평균 MMSE 점수는 19.16이었다. 상기 점수는 제16주에 18.84로, 및 제24-26주 마지막 방문에 18.05로 감소하였다. 특히, 변경된 2개 눈금의 평균 점수에도 불구하고, 개별 대상체에 대한 점수의 분포는 꽤 분산되어 있고, 따라서 2개 눈금의 경향은 안정한 것으로 보였다.

ADCS-CGOC 등급결정에 대해, 대상체의 35% 초과가 마지막 치료 (제3 용량)의 4주 후인 제16주에 개선을 보였다. 이들 개선 비율은 제24-26주에 치료의 보다 긴 중단 후에 환자 집단의 18% 이하로 감소하였다. 제16주에, 근소하게 절반 미만의 대상체는 ADCS-CGIC의 변화를 보이지 않았고, 상기 대상체 범주는 제16주 이후 비-치료 추적 기간의 추가의 8 내지 10주 후에 총 대상체의 50% 초과로 약하게 증가하였다. 개선 대 악화의 대상체 비율을 비교하면, 조사 제품에 찬성하여 제16주에 양성 결과가 보였지만, 제24-26주 (마지막 백신 용량의 12주 후)에는 그렇지 않았다.

하위군 분석에서, 결과는 경도 AD가 있는 보다 고령의 대상체 (연령 > 60세 및 기준선 MMSE > 20)가 (1) 평균 ADAS-Cog에서 3점의 감소 (12개월 기간에 걸친 타렌플러빌 II상 시험으로부터 위약군에서 3.81점의 증가에 비해), (2) 도 14에 제시된 바와 같이 안정한 평균 MMSE 점수 (12개월 기간에 걸친 타렌플러빌 II상 시험으로부터 위약군에서 2.04점의 감소에 비해), 및 (3) ADCS-CGIC에서 개선 및 등급 변화 없음의 보다 높은 비율을 보임으로써, UB-311 백신에 대해 보다 우수한 반응을 가졌음을 입증하였다. >60세의 경도 AD 환자에서 3개 인지 점수 중 3개에서 그러한 개선은 결코 보고된 바 없고 가장 열광적으로 받아들여 진다.

실시예 21

Aβ _{1 -28} 단량체, Aβ _{1 -42} 단량체 또는 Aβ _{1 -42} 올리고머에 대한 인간 항체의 검출을 위한 효소 면역검정 (ELISA)

알츠하이머 질환의 연구는 Aβ 응집체 및 Aβ-유래 올리고머가 AD 발병에 중심 역할을 하는 것을 입증하였다. N-메틸-D-아스파르테이트 (NMDA)형 글루타메이트 수용체 (NMDA-R) 하위단위 NR1 및 NR2B를 발현하는 뉴런에 대한 Aβ 올리고머의 결합이 문헌 [Lacor PN in Current Genomics 2007; 8:486-508]에서 보고되었다. Aβ 올리고머가 해마 뉴런 세포 상의 NR1 및 NR2B에 결합할 때, 상기 리간드-수용체 결합은 시냅스 말단의 수의 유의한 감소를 일으키고, 이것은 기억 및 인지 결손 및 치매와 연관된다. 최근에, 세포에서 시험관 내 연구 및 임상 시험의 결과는 항-Aβ 올리고머 항체가 상기 결합을 차단하고 Aβ 올리고머 독성으로부터 뉴런을 보호할 수 있음을 나타냈다. UBI AD 백신 (UB-311)은 2가지 펩티드 면역원을 함유하고, 각각의 펩티드는 상이한 Th2-기반 N-말단 펩티드 에피토프에 합성적으로 연결된 짧은 N-말단 Aβ 펩티드 (Aβ_{1 - 14})를 포함한다. UBI AD 백신 반응의 면역원성을 평가하기 위해, Aβ_{1 -28} 단량체, Aβ_{1 -42} 단량체 및 Aβ_{1 -42} 올리고머에 대한 항체의 시험관 내 검출을 위한 항-Aβ 항체 효소 면역검정 (ELISA) 시험이 개발되었다.

Aβ_{1 -28} 단량체, Aβ_{1 -42} 단량체 또는 Aβ_{1 -42} 올리고머를 고정 항원으로서 마이크로플레이트의 웰 상에 예비-코팅하였다. 검정의 경과 동안, 혈청 샘플을 1:100에서 1:100,000까지 1:10 연속 희석하고, 예비-코팅된 마이크로플레이트에 첨가하였다. 항-Aβ_1-28, 항-Aβ_{1 -42} 단량체 또는 올리고머 항체는 존재한다면 고정 항원에 결합한다. 비결합된 항체 및 다른 혈청 성분을 제거하기 위해 웰을 세척한 후에, 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 재조합 단백질 A/G의 표준화 제제를 각각의 웰에 첨가하고, 결합된 항체와 반응시켰다. 웰을 세척하여 비결합 접합체를 제거하고, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 및 과산화수소를 함유하는 기질 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 시험한 혈청 샘플 내에 있다면 존재하는 Aβ-특이적 항체의 양에 비례하여 황색 색상이 발색하였다. 묽은 황산 용액을 첨가하여 효소-기질 반응을 종료시켰다. 이어서, 각각의 웰에서 일어나는 색상 변화를 450 nm 파장에서 마이크로플레이트 판독기 내의 흡광도 (A₄₅₀)의 분광광도 측정에 의해 결정하였다. UBI® ELISA 역가 계산 프로그램을 이용하여 상대 항체 역가를 계산하였다.

Aβ 올리고머가 Aβ 단량체 또는 아밀로이드 플라크에 비해 뉴런에 대해 가장 독성인 것으로 나타났다. 능동 면역요법에 대한 목표는 Aβ 단량체에 특이적인 항체 생산을 유도하는 것뿐만 아니라 Aβ 올리고머에 대한 항체의 생산도 유도하는 것이다. 제0주 (기준선), 각각의 UB 311 주사 전에 제4주 및 제12주, 및 제8, 16 및 24주에 경도 내지 중등도 AD가 있는 19명의 환자로부터 수집된 혈청 샘플을 항-Aβ 항체 역가에 대해 분석하였다. 도 15는 19명의 등록된 대상체의 각각에 대해 스크리닝 방문 (V1/V2)에 및 마지막 UB-311 면역화의 4주 후인 제16주 (V7)에 항-Aβ_{1 -28} 단량체, 항-Aβ_{1 -42} 단량체 및 항-Aβ_{1 -42} 올리고머의 항체 역가를 도시한 것이다.

실시예 22

에피토프 맵핑 : N-말단 펩티드에 대한 인간 항체의 검출을 위한 경쟁적 결합 억제 효소 면역검정 (EIA)

에피토프 맵핑을 이용하여, ELISA 시험에 의해 Aβ 펩티드 (Aβ 상의 잔기 -9 내지 24)의 선형의 겹치는 10량체 아미노산 서열 상에서 항-Aβ_{1 -14} 항체의 결합 부위 또는 에피토프를 확인하였다. 19명의 대상체로부터 임상 혈청 샘플을 평가하였다. 0, 4 및 12주에 3회 면역화 후에 제16주의 결과를 아래에 제시한다 (도 16).

합성 Aβ_{1 -28} 펩티드를 고정 항원으로서 선택하고, 마이크로플레이트의 웰 상에 2 ㎍/mL의 농도로 예비-코팅하였다. 실험 전에, 각각의 혈청 샘플을 1:50, 1:100, 1:200 및 1:400 희석하고, 최적 희석을 결정하기 위해 시험하였다. 최적 희석된 항-Aβ 혈청 샘플을 액체상 면역흡착제로서 설계된 10량체 펩티드와 개별적으로 혼합하였다. 혼합물을 최적 희석된 혈청으로 1:5 연속 희석한 후, Aβ_{1 -28} 예비-코팅된 플레이트에 옮겼다. 대조군으로서 최적 희석된 항-Aβ 혈청을 단독으로 사용하였다. 검정의 경과 동안, 10량체 펩티드는 우세한 항체 결합 부위에 특이적으로 결합하고, 항-Aβ 항체 및 고정 항원의 결합을 경쟁적으로 억제하였다. 비결합된 항체 및 다른 혈청 성분을 제거하기 위해 웰을 세척한 후에, 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 재조합 단백질 A/G의 표준화 제제를 각각의 웰에 첨가하고 결합된 항체와 반응시켰다. 비결합된 접합체를 제거하기 위해 웰을 세척한 후, 과산화수소 및 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB)을 함유하는 기질 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 시험한 혈청 샘플 내에 있다면 존재하는 Aβ-특이적 항체의 양에 비례하여 황색 색상이 발색하였다. 묽은 황산 용액을 첨가하여 효소-기질 반응을 종료시켰다. 이어서, 각각의 웰에서 일어나는 색상 변화를 IC₅₀ 5X 프로그램 (몰레큘라 디바이시즈 (Molecular devices))을 이용하여 마이크로플레이트 판독기 내에서 450 nm 파장 (A₄₅₀)에서 분광광도 측정에 의해 결정하였다. 항-Aβ 항체 및 대조군 내의 고정 항원의 결합은 최대 결합 (100%)을 잘 나타냈고, 10량체 펩티드의 최대 억제 농도의 절반 (IC₅₀)을 에피토프 특이성의 지표로서 사용하였다.

실시예 23

UB -311 면역화시킨 환자로부터 혈청 샘플 내의 항체에 의해 인지된 우세한 에피토프는 Aβ _{1 -10} 펩티드에 특이적이었다.

우세한 항체 결합 부위를 표적 영역 내의 특이적 잔기에 위치시키는 우수한 에피토프 맵핑 방법에서 (표 17), N-말단 아스파르트산 잔기 "D"에서 시작하여 Aβ_{1 -14}의 전체 길이 + 인접 hAPP 위치를 포괄하도록 Aβ_{1 -14} 펩티드 서열 (서열 4) 및 인간 아밀로이드-β 전구체 단백질 (hAPP)의 인접한 영역을 따라 24개의 겹치는 10량체 펩티드 (서열 6, 8 내지 30)를 합성하였다 (도 16). 면역화 전에 및 3회 용량의 UB-311을 투여한 후 제16주에 19명의 대상체로부터 수집된 혈청 샘플을 시험하였다. 치료전 샘플은 기준선 항-Aβ 항체 수준이었다 (데이타를 제시하지 않는다). 예상된 바와 같이, 그에 대해 양성 에피토프 맵이 생성된 19개의 모든 샘플에서 우세한 항체 반응이 도 16 및 표 17에 제시된 바와 같이 Aβ의 유리 아미노 말단 (서열 6)에 대해 유도되었다. 보다 구체적으로, Aβ_{1 -14}의 N-말단 10량체를 나타내는 펩티드 DAEFRHDSGY는 19명의 모든 환자로부터 면역화시킨 혈청과 가장 강하게 반응하였다. 다른 Aβ 10량체 펩티드에 대한 약한 반응성을 갖는 추가의 항체 반응이 19명의 대상체 중 8명에서 검출되었다. 모든 대상체는 아니지만 몇몇 대상체로부터 제4, 8, 12 및 24-26주에 수집된 혈청 샘플을 또한 시험하였고 일관된 결과를 보여주였다 (데이타를 제시하지 않는다). 요약하면, 이들 데이타는 UB-311에 의해 유도된 대다수의 항체가 Aβ의 N-말단 도메인에 특이적으로 작용성이었고 잔기 14를 넘어선 부위에 대해서는 그렇지 않았음을 입증한다.

실시예 24

UBI AD 백신 ( UB - 311)의 3회 면역화 후 혈장 내에서 상승된 Aβ _{1 -40} 펩티드

현재, Aβ_{1 -40} (서열 2), Aβ_{1 -42} (서열 1), 또는 Aβ_{1 - 42}:Aβ_{1 -40} 비의 혈장 농도에서의 변화는 질환-변형 치료의 임상 시험의 상황에서, 또는 콜린에스테라제 억제제로 치료한 AD 환자에서 치료 반응과 유의하게 연관된 것으로 밝혀지지 않았다. 그럼에도 불구하고, 혈장 Aβ 수준은 AD의 가능한 생체마커로서 제안되었다.

본 발명자들의 선행 연구에서, 혈청 내 Aβ_{1 -40} 수준은 UBI AD 백신을 투여한 마카크에서 상승하지만, 위약 백신을 투여한 동물에서 정상 수준이 인지되었다. 이들 결과는 "말초 이동 가설"이 항-Aβ 항체에 대한 작용 방식일 수도 있음을 나타냈다. 상기 현상은 본 연구에서 또한 관찰되었지만, 항-Aβ 항체 역가는 3회 면역화 후 인간 대상체에서 항체 역가보다 6회 UB-311 면역화 후의 마카크에서 훨씬 더 높았다. 표 18에 제시된 바와 같이, Aβ_{1 -40} 혈장 샘플을 UB-311 치료 전에 및 제16주 (제3 면역화의 4주 후)에 시험한 12개의 쌍을 이룬 사례의 혈장 Aβ_{1 -40} 수준을 제16주의 혈청 Aβ_{1 -28} 항체 농도에 비교하였다. UB-311 면역화 전에 모든 항체 역가는 음성이었다. Log₁₀ 2.4를 초과하는 항-Aβ_{1 -28} 항체 역가를 갖는 8명의 개체는 UBI AD 백신 (UB-311)을 투여받은 후 상승된 Aβ_{1 -40} 역가를 가진 반면; Log₁₀ 2.0 미만의 항체 수준을 갖는 4명의 개체 중 3명은 치료 후 상승되지 않았다. 증가된 Aβ_{1 -40} 수준은 대부분의 경우 작지만, 단, 면역화 전에 혈장 내에서 흔치 않게 높은 Aβ_{1 -40} 수준 및 면역화 후에 유의하게 더 높은 수준 (1031.9 pg/mL)을 보여준 1명은 제외되었다 (대상체 P109). 매우 높은 Aβ_{1 -40}에 대한 이유는 불확실하다. 대상체는 누구도 혈장 내에 측정가능한 수준의 Aβ_{1 -42} 펩티드를 갖지 않았다.

실시예 25

UB -311 면역화는 Aβ _{1 -14} 또는 Aβ _{1 -42} 펩티드의 존재 하에 인간 림프구 ( PBMC )를 자극하지 않는다

새로운 백신의 출현 및 특정 면역화 및 자가면역 질환 사이의 연관성을 청구하는 증가하는 수의 널리 공개된 보고서는 면역화의 위험에 대한 대중의 우려를 불러일으켰다. 백신 접종 이후 면역계가 과다-활성화되는지 여부, 및 존재한다면 어떠한 경로(들)이 관련되는지를 평가하기 위해 항원 자극에 반응한 림프구 증식 및 시토카인 생산을 이용하였다. 본 연구의 목적은 양성 대조군으로서 Aβ 펩티드 또는 PHA 미토겐의 부재 또는 존재 하에 림프구 증식의 자극 지수 (SI)뿐만 아니라, 제16주에 3회 UB 311 면역화 전후에 AD 환자로부터 배양된 림프구 내의 시토카인 농도를 측정함으로써 UB-311의 면역원 (Aβ_{1 - 14})의 안전성을 평가하기 위한 것이다.

AD 환자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 피콜-하이파크 구배 원심분리에 의해 단리하였다. 펩티드-유도된 증식 및 시토카인 생산을 위해, 세포 (2.5 x 10⁵개/웰)를 단독으로 또는 Aβ_{1 -14} (서열 4), Aβ_{1 -16} (서열: 포함되지 않음), Aβ_{1 -28} (서열 3), Aβ_{17 -42} (서열: 포함되지 않음), Aβ_{1 -42} (서열 1) 및 비-관련 38량체 펩티드 (p1412)를 비롯한 개별 펩티드 도메인 (10 ㎍/mL의 최종 농도로)을 첨가하여 함께 삼중으로 배양하였다. 배양액을 5% CO₂에서 37℃에서 72시간 동안 인큐베이팅한 후, 100 ㎕의 상청액을 각각의 웰로부터 제거하고 시토카인 분석을 위해 -70℃에서 동결시켰다. 0.5 μCi의 ³H-티미딘 (³H-TdR, 아머샴 (Amersham), Cat No. TRK637)을 함유하는 배양 배지 10 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고 18 hr 동안 인큐베이팅한 후, 액체 섬광 계수에 의해 방사성 동위원소 혼입을 검출하였다. 미토겐 피토헤마글루티닌 (PHA)를 림프구 증식을 위한 양성 대조군으로서 사용하였다. Aβ 펩티드 또는 PHA 미토겐 없이 단독 배양된 세포를 음성 및 양성 대조군으로서 사용하였다. 자극 지수 (SI)는 Aβ 펩티드를 갖는 삼중 실험 배양액의 분당 평균 계수 (cpm)를 삼중 음성 대조군 배양액의 평균 cpm으로 나눔으로써 계산하였다; SI > 3.0을 유의한 증식 반응으로 간주하였다.

제0주 (기준선) 및 제16주 (제3 용량의 4주 후)에 수집된 전체 혈액으로부터 말초 혈액 단핵 세포 샘플을 단리한 후, 다양한 Aβ 펩티드의 부재 또는 존재 하에 배양하였다. 표 19에 제시된 바와 같이, Aβ_{1 -14}, 다른 Aβ 펩티드 또는 p1412 (비-관련 대조군 펩티드)을 배양 배지에 첨가할 때 림프구에 의한 유의한 증식 반응이 관찰되지 않았다. 예상된 바와 같이, PHA 미토겐을 배양 배지에 첨가할 때 양성 증식 반응이 인지되었다. UB 311 면역화 전후에 PHA에 대한 유사한 반응의 관찰 (p=0.87)은 연구 대상체의 면역 기능의 유의한 변경이 없음을 제안한다 (표 19).

실시예 26

UB -311 면역화는 Aβ _{1 -14} 펩티드의 존재 하에 인간 시토카인을 자극하지 않는다.

세포를 단독으로 또는 Aβ 펩티드 도메인 또는 PHA의 존재 하에 갖는 배양 배지의 분취액에 대해 PBMC 배양액으로부터 시토카인 분석 (IL-2, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ)을 수행하였다. 인간-특이적 시토카인 샌드위치 ELISA 키트 (유사이테크 바이오사이언시스, 네덜란드 위트레흐트)를 이용하여, 제조자의 지시에 따라 개별 시토카인의 농도 (pg/mL)를 결정하였다. 3일 동안 배양한 후 세포를 단독으로 (음성 대조군) 또는 Aβ 펩티드, p1412 (비-관련 펩티드) 또는 PHA 미토겐 (양성 대조군)의 존재하에 갖는 제0주 및 제16주에 수집된 PBMC 샘플을 또한 시토카인 분비에 대해 시험하였다. 키트의 정량가능한 범위는 5 내지 320 pg/mL이다. 5 pg/mL 미만 또는 320 pg/mL 초과의 임의의 측정된 농도를 각각 정량 한계 미만 (BQL) 또는 정량 한계 초과 (AQL)로 나타냈다. 그러나, 통계적 고려를 위해, BQL 또는 AQL을 각각 하부 (5 pg/mL) 또는 상부 (320 pg/mL) 정량 한계로 교체하였다. 제0주 및 제16주에 각각의 시토카인의 평균 농도를 표 20에 제시한다. 예상된 바와 같이, IL-2를 제외하고는, 양성 대조군 PHA의 존재 하에 시토카인 생산의 유의한 증가가 존재하였다. Aβ_{1 -14} 또는 다른 Aβ 펩티드를 사용한 자극에 반응한 시토카인의 생산이 기준선 (제0주) 및 제16주에 관찰되었지만, 대부분의 값은 상응하는 음성 대조군 (세포 단독)에 유사하게 나타났다.

면역화 후에 세포-매개 면역 반응의 변화를 평가하기 위해, 기준선으로부터 제16주까지 평균 시토카인 농도의 변화를 음성 대조군과 비교하고, 쌍을 이룬 윌콕슨 부호(Wilcoxon signed)-순위 검정에 의해 검토하였다. 4개의 시토카인 (IFN-γ, IL-6, IL-10, TNF-α)는 전장 Aβ_{1 -42} 펩티드에 반응하여 분비의 눈에 띄는 증가를 보여주었고; 상기 관찰은 Aβ_{1 -42} 응집체의 입체형태적 에피토프에 기인할 수 있다. Aβ_{1 -14} 또는 다른 Aβ 펩티드에서 시토카인 분비의 상향-조절은 검출되지 않았다.

요약: UBI AD 백신은 각각 MvF5 Th 및 HBsAg3 Th 에피토프에 합성적으로 연결된, 각각 유리 N-말단 Aβ_{1 -14} 펩티드를 갖는 2가지 펩티드 면역원을 함유한다. 시험관내 림프구 증식 및 시토카인 분석을 사용하여, 세포성 면역 반응에 대한 UBI AD 백신의 면역화의 영향을 평가하였다. 표 19에 제시된 바와 같이 Aβ_{1 -14} 펩티드 또는 임의의 다른 Aβ 펩티드를 배양 배지에 첨가할 때, 림프구에 의한 증식 반응은 관찰되지 않았다. Aβ_{1 -14} 및 다른 Aβ 펩티드를 사용한 치료 시에 UBI AD 백신-면역화시킨 환자의 림프구에 의한 시토카인 분비의 상향-조절은 검출되지 않았지만, 단, 치료 전의 제0주 수준에 비해 제16주에 UB 311 면역화 후에 4개의 시토카인 (IFN-γ, IL-6, IL-10, TNF-α)의 주목할만한 증가를 유도한 Aβ_{1 -42}는 제외되었다 (표 20). Aβ_{1 -14}를 단독으로 사용하여 상향-조절이 검출되지 않았으므로, Th2형 T 세포 반응을 통한 시토카인 방출의 증가는 아마도 UBI AD 백신 반응에 비관련된다. Aβ_{1 -42}에 대한 반응은 Aβ_{1 -42} 상에서 확인된 천연 T 헬퍼 에피토프에 관련될 수 있는 천연 Aβ에 대한 배경 반응인 것으로 추정된다. PHA에 반응하여 IL-2 생산의 결여가 관찰되었고, 이것은 정상 인간 PBMC를 사용하여 유사한 실험 조건 하에 문헌 [Katial RK, et al. in Clin Diagn Lab Immunol 1998; 5:78-81]에서 보고된 발견과 일치한다. 결론적으로, 이들 결과는 UBI AD 백신이 I상 임상 시험에 참여한 경도 내지 중등도 알츠하이머 질환의 환자에서 잠재적으로 염증성인 항-자가, 세포-매개 면역 반응을 생성하지 않았음을 보여주었고, 따라서 UBI AD 백신 (UB-311)의 안전성을 추가로 입증한다.

[표 1]

혈청학적 검정에 사용된 Aβ_{1 -42} 펩티드 및 그의 절편

[표 2]

Aβ_{1 -42} 유래 펩티드 면역원 구축물의 설계에 사용하기 위해 선택된 잡다한 T 헬퍼 에피토프

[표 3]

Aβ 펩티드 면역원 구축물의 설계에서 Aβ_{1 -42} 펩티드의 N-말단을 향한 특이적 항체의 유도를 위한 이상적인 인공 Th 에피토프를 포함하는 병원체 단백질 유래 Th 에피토프에 의한 Aβ_{1 -14} 펩티드의 면역원성 향상

[표 4]

다양한 Aβ 유래 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 백신 제제를 사용한 프라임 (0 wpi) 및 부스트 (4 wpi) 시에 기니 피그에서 면역원성의 평가

[표 5]

2가지 Aβ_{1 -14} 유래 펩티드 면역원 구축물 및 그의 조합물을 포함하는 백신 제제를 사용한 프라임 (0 wpi) 및 부스트 (4 wpi) 시에 기니 피그에서 면역원성의 평가

[표 6]

기니 피그에서 2가지 Aβ_{1 -14} 유래 펩티드 면역원 구축물 및 그의 조합물을 포함하는 백신 제제를 사용한 프라임 (0 wpi) 및 부스트 (4 wpi) 시에 면역원의 Th 펩티드 또는 운반체 단백질 요소에 대해 유도된 항체의 평가

[표 7]

ISA51 w/o 에멀젼 내의 및 명반 내의 다양한 양의 Aβ_{1 -14} 유래 펩티드 면역원 구축물 (서열 62+63)을 포함하는 백신 제제를 사용한 프라임 (0 wpi) 및 부스트 (3 및 6 wpi) 시에 개코원숭이에서 면역원성의 평가

[표 8]

2가지 Aβ_{1 -14} 펩티드 면역원 구축물을 포함하는 백신 제제를 사용한 프라임 (0 wpi) 및 부스트 (4 wpi) 시에 Aβ 펩티드 면역원 구축물의 Th 펩티드에 대해 유도된 항체의 평가 (기니 피그 내에서 8 wpi 혈청으로부터)

[표 9]

면역화 기간 (0 내지 111 wpi) 동안 수집한 백신 접종한 개코원숭이로부터의 혈청에 의한 Aβ_{1 -42}의 N-말단에서 우수한 특이성 분석을 위한 에피토프 맵핑

[표 10]

개코원숭이로부터 과다면역 혈청을 사용한 경쟁적 억제 ELISA에 의한 에피토프 맵핑

Aβ_{1 -10} 펩티드의 50% 억제는 약 0.3 ㎍/mL이다. 개코원숭이 항-Aβ 항체의 특이성은 N-말단 아스파르트산 (D)을 우세하게 표적으로 한다.

개코원숭이 면역 혈청 샘플에 의해 검출된 인간 아밀로이드 전구체 단백질 (hAPP)의 10량체 Aβ 펩티드를 사용한 에피토프 맵핑은 N-말단 Aβ_{1 -10} 펩티드에 대한 특이성을 보여준다.

[표 11]

시노몰거스 마카크에서 항체 역가 (Log₁₀)에 대한 UBI AD 백신의 반복 용량의 효과

N = 6마리 마카크/군 (제0, 3, 6, 9, 12 및 15주).

N = 3마리 마카크/군 (제21, 27주).

[표 12]

위약 백신 (0 ㎍/용량) 또는 UBI AD 백신 (150 ㎍/용량 또는 750 ㎍/용량)으로 면역화시킨 시노몰거스 마카크로부터 제9 및 15주에 수집한 항혈청의 특이성 분석

[표 13]

혈청 (상부 패널) 및 뇌척수액 (하부 패널) 내의 UBI AD 백신 전후에 시노몰거스 마카크로부터 Aβ_{1 -40} 농도 (pg/mL)

[표 14]

다양한 Aβ 펩티드와 동시배양 시에 시노몰거스 마카크에서 말초 혈액 단핵 세포에 의한 자극 지수로서 표현된 증식

[표 15]

Aβ_{1 -14}, Aβ_{1 -42} 펩티드 또는 PHA (피토헤마글루티닌) 미토겐^a를 사용한 자극 시에 시노몰거스 마카크 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 시토카인 농도의 측정

^a 6마리 시노몰거스 마카크로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 Aβ 펩티드 또는 PHA 미토겐의 부재 또는 존재 하에 마지막 면역화 (15 wpi) 후 24시간 배양하였다. 배양 상청액을 상업적 ELISA 시험 (유사이테크 바이오사이언시스, 네덜란드 위트레흐트)에 의해 검출가능한 농도의 각각의 시토카인 (IL2, IL6 및 TNFα)에 대해 시험하였다.

^b 결과를 평균±표준 편차로서 제시한다.

^c BDL, 검출 수준 미만.

[표 16]

기니 피그, 히말라야 원숭이 및 개코원숭이에서 상이한 용량 수준의 UBI AD 백신의 면역원성의 비교

¹ 파트 A에서 0 및 3주에 및 파트 B에서 78 및 81주에 (72주 휴식 기간 후에) 면역화시킨 개코원숭이.

² 각각의 1 mL 용량은 600 ㎍ 펩티드로 이루어진다.

³ Log₁₀ 값 >2는 양성 항-Aβ 역가로서 점수를 매긴다.

⁴ 숫자는 양성 역가를 갖는 동물의 수/시험한 동물의 총수를 나타낸다.

BW: 체중.

[표 17]

모든 백신 접종한 환자로부터 혈청 (16 wpi)에 의한 Aβ_{1 -42}의 N-말단에서 우수한 특이성 분석을 위한 에피토프 맵핑

[표 18]

UBI AD 백신을 사용한 면역화 전후에 AD 환자의 혈장 내의 Aβ_{1 -40} 농도 (pg/mL)의 분석 및 감소하는 순서로 항-Aβ_1-28 항체 역가 (Log₁₀)를 사용한 교정

볼드체(bold type)의 데이타는 제0, 4 및 12주에 UBI AD 백신의 면역화 후에 제16주에 증가된 수준의 Aβ_{1 -40}을 가졌다. .

[표 19]

다양한 Aβ 펩티드와의 동시배양 후 제0주 및 제16주에 수집한 환자 대상체로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 의한 평균 자극 지수

^* p1412는 비-관련 대조군 펩티드이다.

통계 분석: 제0주 및 제16주 사이의 림프구 증식의 차이를 쌍을 이룬 t-검정에 의해 검사하였다. Aβ 펩티드 및 대조군에 반응한 평균 시토카인 농도의 변화의 차이 (제16주 대 제0주)를 쌍을 이룬 윌콕슨 부호-순위 검정에 의해 검사하였다. 통계적 유의성 수준을 2-테일드 (tailed) 시험 (p<0.05)에 의해 결정하였다. 모든 통계 분석을 위해 R (버전 2.13.0)을 사용하였다.

[표 20]

다양한 Aβ 펩티드와의 동시배양 시에 제0주 및 제16주에 환자 대상체로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 의해 생산된 평균 시토카인 농도 (SD) (pg/mL)¹

1. 검정의 정량가능한 범위는 5 내지 320 pg/mL이다.

2. 90% 이상의 대상체의 농도는 상부 정량 한계 초과 (AQL), 즉, 320 pg/mL 초과이었다.

3. 1명의 환자는 AQL 값을 가졌다.

4. 6명의 환자는 AQL 값을 가졌다.

5. 8명의 환자는 AQL 값을 가졌다.

6. 4명의 환자는 AQL 값을 가졌다.

7. PHA 미토겐에 반응하여 관찰된 IL-2 생산의 결여는 유사한 실험 조건 하에 문헌 [Katial et al., 1998]에 보고된 발견과 일치한다.

SEQUENCE LISTING <110> Wang, Chang-Yi <120> Peptide vaccine for prevention and immunotherapy of dementia of the Alzheimer's type <130> 1004263.211WO (2032-WO) <140> PCT/US2013/37865 <141> 2013-04-23 <150> 13843883 <151> 2013-03-15 <160> 67 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(42) <223> Abeta 1-42 or APP 770(D672-A713) <400> 1 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 2 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(40) <223> Abeta 1-40 or APP770(D672-V711) <400> 2 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 3 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(28) <223> Abeta 1-28 or AP770(D672-K699) <400> 3 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Abeta 1-14 or APP770(D672-H685) <400> 4 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(12) <223> Abeta 1-12 or APP 770(D672-V683) <400> 5 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta 1-10 or APP 770(D672-Y681) <400> 6 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(28) <223> Abeta 15-42 or APP 770(Q686-A711) <400> 7 Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala 1 5 10 15 Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 20 25 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta -9-1 or APP 770(T663-D672) <400> 8 Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta -8-2 or APP 770(E664-A673) <400> 9 Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp Ala 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta -7-3 or APP 770(E665-E674) <400> 10 Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp Ala Glu 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta -6-4 or APP 770(I666-F675) <400> 11 Ile Ser Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta -5-5 or APP 770(S667-R676) <400> 12 Ser Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PROPEP <222> (1)..(10) <223> Abeta -4-6 or APP 770(E668-H677) <400> 13 Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta -3-7 or APP 770(V669-D678) <400> 14 Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta -2-8 or APP 770(K670-S679) <400> 15 Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta -1-9 or APP 770(M671-G680) <400> 16 Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta 2-11 or APP 770(A673-E682) <400> 17 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta 3-12 or APP 770(E674-V683) <400> 18 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta 4-13 or APP 770(F675-H684) <400> 19 Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta 5-14 or APP 770(R676-H685) <400> 20 Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta 6-15 or APP 770(H677-Q686) <400> 21 His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta 7-16 or APP 770(D678-K687) <400> 22 Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta 8-17 or APP 770(S679-L688) <400> 23 Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta 9-18 or APP 770(G680-V689) <400> 24 Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta 10-19 or APP 770(Y681-F690) <400> 25 Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta 11-20 or APP 770(E682-F691) <400> 26 Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta 12-21 or APP 770(V683-A692) <400> 27 Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta 13-22 or APP 770(H684-E693) <400> 28 His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu 1 5 10 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta 14-23 or APP 770(H685-D694) <400> 29 His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp 1 5 10 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta 15-24 or APP 770(Q686-V695) <400> 30 Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val 1 5 10 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <223> Abeta 16-22 or APP 770(K687-E693) <400> 31 Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu 1 5 <210> 32 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> epsilon K <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(4) <223> spacer A <400> 32 Lys Lys Lys Lys 1 <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Clostridium tetani 1 Th <400> 33 Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 1 5 10 15 Leu <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> MvF1 Th <400> 34 Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val 1 5 10 15 <210> 35 <211> 24 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(24) <223> Bordetella pertussis Th <400> 35 Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala 1 5 10 15 Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu 20 <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Clostridium tetani 2 Th <400> 36 Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys 1 5 10 15 Thr <210> 37 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> diphtheria bacilli - Diphtheria Th <400> 37 Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Ile Leu Pro Gly His Gly Cys 20 <210> 38 <211> 21 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Plasmodium falciparum Th <400> 38 Asp His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe 1 5 10 15 Asn Val Val Asn Ser 20 <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Schistosoma mansoni <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Schistosoma mansoni Th <400> 39 Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg 1 5 10 15 His <210> 40 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(25) <223> Cholera Toxin Th <400> 40 Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala 1 5 10 15 Thr Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser 20 25 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> MvF 2 Th <400> 41 Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile 1 5 10 15 <210> 42 <211> 22 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> KKKMvF 3 Th <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> G or T <400> 42 Lys Lys Lys Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa 1 5 10 15 Ile Glu Xaa Ile Leu Phe 20 <210> 43 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 1 Th <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> L or I or V or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> F or K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> L or I or V or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> L or I or V or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> L or I or V or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> L or I or V or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> L or I or V or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Q or L or I or V or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> L or I or V or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> D or R <400> 43 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Pro Xaa Ser 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 44 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF 4 Th <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <400> 44 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 45 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 2 Th <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> I or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> I or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> T or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> P or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Q or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> L or I <400> 45 Lys Lys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Arg Ile Xaa Thr Ile Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Asp <210> 46 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF 5 Th <400> 46 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 47 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 3 Th <400> 47 Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr 1 5 10 15 Ile Asp <210> 48 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Abeta 1-14 <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(15) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(32) <223> Clostridium tetani 1 Th <400> 48 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 20 25 30 <210> 49 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Abeta 1-10 <220> <221> PEPTIDE <222> (11)..(11) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (12)..(26) <223> MvF 1 Th <400> 49 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Ser Glu Ile Lys 1 5 10 15 Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val 20 25 <210> 50 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(12) <223> Abeta 1-12 <220> <221> PEPTIDE <222> (13)..(13) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (14)..(28) <223> MvF 1 Th <400> 50 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val Lys Leu Ser Glu 1 5 10 15 Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val 20 25 <210> 51 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Abeta 1-14 <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(15) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(30) <223> MvF 1 Th <400> 51 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Leu 1 5 10 15 Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val 20 25 30 <210> 52 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Abeta 1-14 <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(15) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(39) <223> Bordetella pertussis Th <400> 52 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Gly 1 5 10 15 Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala Glu 20 25 30 Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu 35 <210> 53 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Abeta 1-14 <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(15) <223> epsilon K as a spcer <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(32) <223> Clostridium tetani 2 Th <400> 53 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Trp 1 5 10 15 Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys Thr 20 25 30 <210> 54 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Abeta 1-14 <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(15) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(38) <223> Diphtheria Th <400> 54 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Asp 1 5 10 15 Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser Ile 20 25 30 Leu Pro Gly His Gly Cys 35 <210> 55 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Abeta 1-14 <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(15) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(36) <223> Plasmodium falciparum Th <400> 55 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Asp 1 5 10 15 His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe Asn 20 25 30 Val Val Asn Ser 35 <210> 56 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Abeta 1-14 <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(15) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(32) <223> Schistosoma mansoni Th <400> 56 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Lys 1 5 10 15 Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg His 20 25 30 <210> 57 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Abeta 1-14 <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(15) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(40) <223> Cholera Toxin Th <400> 57 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Ala 1 5 10 15 Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala Thr 20 25 30 Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser 35 40 <210> 58 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Abeta 1-14 <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(15) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(30) <223> MvF 2 Th <400> 58 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Ile 1 5 10 15 Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile 20 25 30 <210> 59 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Abeta 1-14 <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(15) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(37) <223> KKKMvF 3 Th <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> S or T <220> 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(22)..(22) <223> L or I or V or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> L or I or V or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> L or I or V or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> L or I or V or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Q or L or I or V or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> L or I or V or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> D or R <400> 60 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Pro Xaa Ser Xaa 20 25 30 Xaa <210> 61 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> (Abeta 1-14) x 4 as branched peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(15) <223> (epsilon K) x 2 as a linker <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(16) <223> epsilon K as linked spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (17)..(31) <223> MvF 1 Th <400> 61 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Lys 1 5 10 15 Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val 20 25 30 <210> 62 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Abeta 1-14 <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(15) <223> epsilon K as a linked spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(37) <223> KKK- MvF 4 Th <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> K or R <400> 62 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Lys 1 5 10 15 Lys Lys Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile 20 25 30 Glu Thr Ile Leu Phe 35 <210> 63 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Abeta 1-14 <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(15) <223> epsilon K as a linked spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(33) <223> HBsAg 2 Th <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> I or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> I or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> T or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> P or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Q or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> L or I <400> 63 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Lys 1 5 10 15 Lys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Arg Ile Xaa Thr Ile Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Asp <210> 64 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Abeta 1-14 <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(15) <223> epsilon K as a linked spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(37) <223> KKK-MvF 5 Th <400> 64 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Lys 1 5 10 15 Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile 20 25 30 Glu Thr Ile Leu Phe 35 <210> 65 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Abeta 1-14 <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(15) <223> epsilon K as a linked spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(33) <223> HBsAg 3 Th <400> 65 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Lys 1 5 10 15 Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr Ile 20 25 30 Asp <210> 66 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Abeta 1-16 or APP 770(D672-K687) <400> 66 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 <210> 67 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(26) <223> Abeta 17-42 or APP 770(L688-A713) <400> 67 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 1 5 10 15 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 20 25

Claims (20)

1. 서열 62 및 서열 63의 아미노산 서열로 이루어진 Aβ 펩티드 면역원 구축물들의 조합을 포함하는, 알츠하이머 질환 백신 조성물.
2. 제1항에 있어서, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)를 추가로 포함하는 조성물.
3. 제2항에 있어서, 아주반트를 추가로 포함하는 조성물.
4. a) 서열 62 및 서열 63의 아미노산 서열로 이루어진 Aβ 펩티드 면역원 구축물들의 조합;
   b) CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN); 및
   c) 제약상 허용되는 전달 비히클, 아주반트 또는 둘다
   를 포함하는, 알츠하이머 질환 치료용 제약 조성물.
5. 제4항에 있어서, Aβ 펩티드 면역원 구축물들의 조합이 등몰비(equal molar ratio)로 존재하고, Aβ 펩티드 면역원 구축물 및 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)가 안정화된 면역자극 복합체의 형태로 존재하는 것인 제약 조성물.
6. 제5항에 있어서, 제약상 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트가 인산알루미늄(AlPO₄)인 제약 조성물.
7. a) 서열 62 및 서열 63의 아미노산 서열로 이루어진 Aβ 펩티드 면역원 구축물들의 조합;
   b) CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN); 및
   c) 제약상 허용되는 전달 비히클, 아주반트 또는 둘다
   로 이루어진, 알츠하이머 질환 치료용 제약 조성물.
8. a) 등몰비의, 서열 62 및 서열 63의 아미노산 서열로 이루어진 Aβ 펩티드 면역원 구축물들의 조합;
   b) CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN); 및
   c) 제약상 허용되는 전달 비히클, 아주반트 또는 둘다
   를 포함하고, 여기서 a)의 Aβ 펩티드 면역원 구축물 및 b)의 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)는 안정화된 면역자극 복합체의 형태로 존재하며, c)의 제약상 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트는 인산알루미늄(AlPO₄)인, 알츠하이머 질환 치료용 제약 조성물.
9. 서열 64 및 서열 65의 아미노산 서열로 이루어진 Aβ 펩티드 면역원 구축물들의 조합을 포함하는, 알츠하이머 질환 백신 조성물.
10. 제9항에 있어서, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)를 추가로 포함하는 조성물.
11. 제10항에 있어서, 아주반트를 추가로 포함하는 조성물.
12. a) 서열 64 및 서열 65의 아미노산 서열로 이루어진 Aβ 펩티드 면역원 구축물들의 조합;
    b) CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN); 및
    c) 제약상 허용되는 전달 비히클, 아주반트 또는 둘다
    를 포함하는, 알츠하이머 질환 치료용 제약 조성물.
13. 제12항에 있어서, Aβ 펩티드 면역원 구축물들의 조합이 등몰비(equal molar ratio)로 존재하고, Aβ 펩티드 면역원 구축물 및 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)가 안정화된 면역자극 복합체의 형태로 존재하는 것인 제약 조성물.
14. 제13항에 있어서, 제약상 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트가 인산알루미늄(AlPO₄)인 제약 조성물.
15. a) 서열 64 및 서열 65의 아미노산 서열로 이루어진 Aβ 펩티드 면역원 구축물들의 조합;
    b) CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN); 및
    c) 제약상 허용되는 전달 비히클, 아주반트 또는 둘다
    로 이루어진, 알츠하이머 질환 치료용 제약 조성물.
16. a) 등몰비의, 서열 64 및 서열 65의 아미노산 서열로 이루어진 Aβ 펩티드 면역원 구축물들의 조합;
    b) CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN); 및
    c) 제약상 허용되는 전달 비히클, 아주반트 또는 둘다
    를 포함하고, 여기서 a)의 Aβ 펩티드 면역원 구축물 및 b)의 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)는 안정화된 면역자극 복합체의 형태로 존재하며, c)의 제약상 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트는 인산알루미늄(AlPO₄)인, 알츠하이머 질환 치료용 제약 조성물.
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