CN113226348A - 免疫治疗il-6失调疾病的il-6的肽免疫原及其制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于靶向介白素6(IL‑6)蛋白的部分的单个肽免疫原构建体、包含该构建体的组合物、利用该构建体产生的抗体，以及制备和使用该构建体及其组合物的方法。本发明的IL‑6肽免疫原构建体包含来自IL‑6的B细胞表位，此B细胞表位直接地或通过任选的异源性间隔子连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。IL‑6肽免疫原构建体可刺激针对IL‑6受体(IL‑6R)结合位点的高特异性抗体的产生，以预防及/或治疗受IL‑6失调影响的疾病。

Description

免疫治疗IL-6失调疾病的IL-6的肽免疫原及其制剂
技术领域
本发明是关于靶向介白素6(IL-6)的肽免疫原构建体及其制剂，其用于受IL-6失调影响的疾病的免疫治疗。
背景技术
IL-6是由184个氨基酸(表1)组成的小的(～25kD)分泌醣蛋白，其特征在于四螺旋束(four-helix bundle)结构。它是由几种细胞类型所产生，包括白血球(T和B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞)、纤维母细胞、成骨细胞、角质细胞、内皮细胞、肾丝球间质细胞(mesangial cells)、脂肪细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、脑细胞(星状细胞、微胶细胞、神经元)，以及对各种刺激(例如脂多醣和其他细菌产物、病毒、细胞因子(TNF-α、IL-1、转化生长因子(TGF)-β)、三磷酸腺苷、副甲状腺素、维生素D3、同型半胱氨酸和第二型血管收缩素(Sebba，2008))反应的一些肿瘤细胞。
循环IL-6以低浓度(≤1pg/mL)存在于健康人的血液中，并且在发炎反应期间显著增加，在败血症期间达到ng/mL范围的浓度。IL-6通过刺激急性期免疫反应和造血作用，对宿主防御感染和组织损伤做出了重要贡献。此外，它还在生理状况下调控代谢、再生和神经过程。一旦释放，IL-6通过活化独特的IL-6受体(IL-6R)信号系统(包括IL-6R和下游信号分子)发挥其多效性的生物效应。
IL-6R由两条链构成：(1)IL-6结合链或IL-6Rα(其以两种形式存在，即(a)80kD跨膜IL-6Rα(mIL-6Rα)和(b)50-55kD可溶性IL-6Rα(sIL-6Rα))，以及(2)130kD信号转导链，其命名为IL-6Rβ(或gp130)。
膜IL-6Rα(或mIL-6Rα)在有限数量的细胞类型(即肝细胞、巨核细胞和白血球(包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞与T和B淋巴细胞)的表面上表达。可溶性IL-6Rα(或sIL-6Rα)存在于人类血浆(25-75ng/mL)和组织液中，其可通过金属蛋白酶(去整合素金属蛋白酶(即ADAM))对mIL-6Rα进行蛋白质水解切割(脱落(shedding))而产生，或者，在较小的部分，是通过删除跨膜结构域的选择性剪接而产生。膜IL-6Rβ在所有人类细胞上普遍地表达(Sebba，2008)。
在与IL-6Rα(mIL-6Rα或sIL-6Rα)结合后，IL-6诱导IL-6Rα/IL-6Rβ链的同源二聚化，导致形成六聚体(包含两个IL-6、两个IL-6Rα和两个IL-6Rβ蛋白质)，接着引发下游信号级联反应(Rose-John，et al.，2017)。
通过IL-6与mIL-6Rα结合的细胞活化被称为“传统信号转导(classicsignaling)”。所有其他不表达mIL-6Rα的细胞通过“反式信号转导(trans-signaling)”获得IL-6信号：其中IL-6与循环的sIL-6Rα结合，并且此复合物与细胞表面上的IL-6Rβ形成信号转导复合物。反式信号转导可以在广泛的人类细胞中发生，因此有助于解释IL-6的多效性活性。目前了解IL-6的稳态(homeostatic)和再生活性是由传统信号转导所介导的，而促炎作用主要是由反式信号转导途径活化所引起的。越来越多的证据表明IL-6反式信号转导特别地涉及疾病的发展。还在循环中以相对高的浓度检测到可溶形式的sIL-6Rβ(或sgp130)，其主要通过选择性剪接产生。由于sIL-6Rβ可以与IL-6/sIL-6Rd复合物结合，因此它作为IL-6介导的反式信号转导的天然且特异性的抑制剂，而传统信号转导不受sIL-6Rβ的影响。
虽然IL-6Rd是IL-6的独特结合受体，但IL-6Rβ(或gp130)信号转导链由IL-6家族成员(包含白血病抑制因子、抑瘤素M、睫状神经营养因子、IL-11、心肌营养素-1、神经生成素-1、IL-27和IL-35)共享。
在IL-6结合后，受体同源二聚化促进IL-6Rβ(或gp130)链与酪氨酸激酶JAK(Janus激酶)之间的交互作用，导致其相互转录活化(transactivation)。接下来，JAK活化通过两个关键蛋白质(即(1)含有Src同源结构域的蛋白质酪氨酸磷酸酶-2(SHP-2)，和(2)转录蛋白的信号转导子与活化子(STAT1-STAT3))的磷酸化引发三个主要的细胞内信号转导途径。在被磷酸化后，SHP-2可与Grb2(生长因子受体结合蛋白2)交互作用，导致活化Ras/ERK/MAPK(大鼠肉瘤蛋白/胞外信号调节激酶/促分裂原活化蛋白激酶)级联反应；及/或活化PI3K/Akt(磷酸肌醇-3激酶/蛋白质激酶B)途径。相反地，STATs蛋白质的磷酸化诱导异二聚体(STAT1/STAT3)或同质二聚体(STAT1/STAT1及/或STAT3/STAT3)的形成，其随后移位至细胞核中。在所有情况下，这些细胞内途径的活化导致诱发多种目标基因的转录，这些目标基因负责IL-6的多效生物活性(Lazzerini，et al.，2016)。
IL-6表现出广泛的生物活性，关键地涉及急性发炎反应的活化，以及从先天免疫转变为获得性免疫。IL-6在多种其他过程(包括代谢、认知功能和胚胎发育)中具有多种其他作用。
已经研究了IL-6对急性炎症反应活化的影响。当发生源自各种因素的感染或组织损伤时，迅速诱导全身性急性期反应以中和病原体并防止其进一步侵入，使组织损伤最小化并促进伤口愈合。这种由发热和由肝细胞产生的急性期蛋白质所组成的急性期反应主要由IL-6驱动。
为此，IL-6通过作用于参与体温调节的下视丘视前区(preoptic hypothalamicregion)的神经元来增加体温，并刺激肝脏合成急性期蛋白质(例如C-反应蛋白(CRP)、纤维蛋白原、补体因子C3、血清淀粉样蛋白A、铁调素、血红素结合蛋白、α1-酸性醣蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α1-抗糜蛋白酶和血浆铜蓝蛋白)，而白蛋白、运铁蛋白、纤维黏连蛋白、甲状腺素运载蛋白(transthyretin)和视黄醇结合蛋白(“负”急性期蛋白质)的产生受到抑制。
此外，IL-6促进单核细胞向巨噬细胞分化，刺激骨髓前驱细胞和巨核细胞的成熟导致嗜中性粒细胞增多症和血小板增多症，通过血管内皮生长因子的产生诱导血管生成，通过向上调节内皮细胞上的黏附分子(特别是，细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子(VCAM-1))表达来增强淋巴细胞和嗜中性粒细胞的运输，增加B淋巴细胞的抗体产生，并增强T辅助(TH)淋巴细胞的增生促进它们向TH2或TH17细胞分化。在所有情况下，这些变化通过不同但协同的机制作出贡献以实现最终为宿主防御的整体反应。
除了其在免疫炎性反应中的关键参与外，IL-6还通过调控许多多元系统功能在生理条件下发挥重要作用，例如胚胎发生、葡萄糖和脂质代谢、骨重塑、肝脏再生、神经组织稳态、认知功能、睡眠、记忆、疼痛和情绪行为。
这些免疫炎性效应以外的知识可能有助于解释在类风湿性关节炎(RA)和其他以IL-6水平持续升高为特征的慢性炎症疾病中观察到的一些全身表现的致病机制。
在RA患者中，在病理生理学和临床上针对该细胞因子对代谢和骨稳态的影响特别感兴趣。
脂肪组织在生理条件下显著地贡献IL-6的产生，其占循环IL-6水平的约35％。在长时间运动中，收缩骨骼肌成为IL-6的主要来源，其血浆水平增加高达100倍。IL-6刺激脂肪细胞中的脂肪分解(并抑制脂肪生成)，并通过增加极低密度脂蛋白受体表达，来增加外围组织对胆固醇和三酸甘油酯的摄入，促进体重减轻和血清脂质水平降低。此外，IL-6增强肝脏细胞和肌肉细胞的胰岛素敏感性，提高葡萄糖利用率和耐受性。虽然这些效应表明这种细胞因子可能是运动诱导的胰岛素活性增加的生理机制的一部分，从而增强耐力。然而，部分由于例如长期过度运动导致的IL-6的慢性升高可导致肝脏和脂肪细胞的胰岛素抗性。
关于对骨组织的影响，IL-6通过调节成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞的分化和活性来影响骨骼发育、生长和维持所需的骨吸收和骨形成。IL-6增强位在基质/成骨细胞表面的核因子-kB配体受体活化因子(RANKL)表达的作用，因而刺激破骨细胞分化和骨吸收，其可促进骨重塑，对生理条件下的骨稳态具有潜在的积极作用。在RA中，其夸大且持久的活化诱导异常的破骨细胞生成，导致骨质疏松症和骨破坏。
关于IL-6、IL-6受体、IL-6信号转导、IL-6的多效性的生物学效应、对免疫炎性反应的影响、免疫炎性以外的效应以及IL-6在各种病理状态(包括类风湿性关节炎、自体免疫过程发展、关节损伤、关节外表现)中的作用的最新评论在此被引用作为参考(Lazzerini，P.，et al.，2016)，其中可以在上述背景部分的陈述内找到支持文件。
由于IL-6是一种多效的细胞因子，其参与几乎每个器官系统的生理学，并在对损伤或感染的反应中起主要作用，因此IL-6的异常表达与多种人类疾病有关，尤其是炎性和自体免疫疾病、冠状动脉和神经系统疾病、妊娠问题和肿瘤。
有兴趣开发用以抑制IL-6结合至IL6R(即IL-6Rα和IL-6Rβ/或gp130)复合物的抗体作为针对许多这些疾病的疗法。开发的第一种这样的抗体是Tocilizumab，其次是Sarilumab，两者都靶向IL-6R并且已被批准用于治疗类风湿性关节炎、Castleman氏病和全身性幼年型特发性关节炎。Siltuximab是一种靶向IL-6的单克隆抗体，其是目前美国FDA唯一批准用于特发性多中心型Castleman氏病(idiopathic Multicentric Castleman’sdisease，MCD)的疗法。Sirukumab是另一种高亲和力抗IL-6单克隆抗体，其被设计以提供患有中度至重度类风湿性关节炎的成人阻断IL-6路径，但并未获得FDA的关节炎咨询委员会的建议批准，原因在于在服用此药物的患者中增加的死亡率。已经为此目的对许多其他抗IL-6或抗IL-6R单克隆抗体进行了积极探索(于Rose-John，et al.，2017中讨论)。尽管许多单克隆抗IL-6或抗IL-6受体抗体可能在某些疾病的免疫治疗中证明是有效的，但它们很昂贵并且必须被频繁且长期地给药以维持对血清IL-6的充分抑制和由此衍生而来临床效益。
还描述了几种用于对抗IL-6相关免疫疾病的疫苗接种方法。一种方法是使用具有七个氨基酸取代的人类IL-6变体，Sant1(De Benedetti，et al.，2001；美国第6,706,261号专利)，作为免疫原。然而，自近二十年前其首次披露以来，这项工作并没有带来任何临床发展。另一团队(Desallais，L.，et al.，2014)报导了使用五种随机选择的IL-6肽(此些肽覆盖超过了长度为184个残基的IL-6蛋白的40％)，通过利用复杂的化学偶合程序将此些IL-6肽连结至大载体蛋白KLH以增强各肽的免疫原性。在此方法下制备的疫苗产生的抗体主要是针对非所需的载体蛋白KLH，并且仅一小部分是靶向IL-6。此外，此疫苗在配方中需要弗氏完全佐剂(CFA)和弗氏不完全佐剂(ICFA)，这对于临床和产业应用来说还称不上是最理想的。
如上所述，目前IL-6疫苗设计存在许多限制和问题(例如，用于免疫原制备的复杂的化学偶合程序，使用KLH作为载体蛋白但其中大多数引发的抗体是针对载体蛋白，使用临床上不允许的弗氏完全佐剂以增强疫苗接种的免疫原性，尽管使用最具攻击性的免疫方案但在接受疫苗接种的动物中针对目标IL-6的免疫原性仍较弱，不明确的作用机制等)。因此，显然需要开发一种有效的免疫治疗疫苗，此疫苗要能够引发针对IL-6的高度特异性免疫反应、易于施用给患者、能够在严格的良好制造规范(GMP)下生产，并且要对供应全世界应用以治疗受IL-6失调影响的疾病的患者来说具有成本效益。
本发明的主要目的是产生/开发IL-6肽免疫原构建体及其疫苗制剂，其中所设计的肽免疫原构建体的B细胞表位与IL-6上的IL-6R结合位点极相似，利用这种肽免疫原构建体及其制剂能够在接种的宿主中产生强烈的免疫反应，以允许突破对自身蛋白IL-6的免疫耐受性，并产生靶向IL-6R结合位点的有效抗体，用于治疗受IL-6失调影响的疾病。
发明内容
本发明涉及靶向介白素6(IL-6)的单个肽免疫原构建体及其制剂，其用于受IL-6失调影响的疾病的免疫治疗。
这些单个的IL-6肽免疫原构建体具有30个或更多个的氨基酸的长度，包含衍生自IL-6受体结合区域E42-C83(SEQ ID NO：16)或N144-I166(SEQ ID NO：19)或其片段的功能性B细胞表位，其通过间隔子残基连接至衍生自病原体蛋白质的异源性T辅助细胞(Th)表位。这些IL-6肽构建体(含有设计的B细胞和Th细胞表位共同作用)刺激针对IL-6R结合区域的高度特异性抗体的产生，为易患或患有受IL-6失调影响的疾病的个体提供治疗性免疫反应。
在一些实施例中，本发明的IL-6肽免疫原构建体包含杂合肽，此杂合肽具有衍生自IL-6R结合区域或其片段的B细胞表位(SEQ ID NOs：5-20、72-74，如表1所示)，其连接至衍生自病原体蛋白质的异源性Th表位(SEQ ID NOs：78-106和216-226，如表2所示)，其共同作用以刺激与重组人类IL-6(SEQ ID NO：1)或其他物种的IL-6(例如猕猴(SEQ ID NO：2)、小鼠(SEQ ID NO：3)和大鼠IL-6(SEQ ID NO：4))交叉反应的高度特异性抗体的产生。
参考文献
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附图说明
图1显示来自人类(SEQ ID NO：227)、猕猴(SEQ ID NO：228)、小鼠(SEQ ID NO：229)和大鼠(SEQ ID NO：230)物种的IL-6序列的序列比对。在氨基酸位置44-50和73-83的分子内环状结构用画有阴影半胱氨酸和括号显示。
图2显示根据本文本发明的特定实施例鉴定出导向针对所选目标的医药组合物的商业化(工业化)的开发过程的流程图。本发明包括IL-6肽免疫原设计、IL-6肽组合物设计、IL-6药剂剂型设计、体外IL-6功能性抗原性研究设计、体内IL-6免疫原性和功效研究设计，以及IL-6治疗临床试验方案设计。对每个步骤的详细评估和分析已经导致一系列实验，这些实验最终将导致安全且有效的IL-6医药组合物的商业化。
图3A-3D显示用以说明在利用不同IL-6肽免疫原构建体免疫的天竺鼠中在12周期间内抗体反应动力学的图式。具体地，针对SEQ ID NOs：107、112-114和116-118肽免疫原构建体的抗体反应显示在第3A图中；针对SEQ ID NOs：124-130肽免疫原构建体的抗体反应显示在第3B图中；针对SEQ ID NOs：131-137肽免疫原构建体的抗体反应显示在第3C图中；以及针对SEQ ID NOs：138-145肽免疫原构建体的抗体反应显示在第3D图中。利用重组人类IL-6涂覆ELISA盘。通过4倍连续稀释将血清从1∶100稀释至1∶4.19x108。利用4-参数罗吉特曲线拟合(four-parameter logistic curve-fit)的非线性回归计算测试血清的效价，表示为Log10(EC50)。
图第4A-4B显示针对不同IL-6肽免疫原构建体的各种纯化的多克隆抗IL-6抗体的交叉反应性。具体地，针对SEQ ID NOs：107、116、118、124-128的结果显示在第4A图中，而针对SEQ ID NOs：129-133的结果显示在第4B图中。利用重组人类、猴子、小鼠或大鼠IL-6蛋白质涂覆ELISA盘。利用4倍连续稀释将通过蛋白质A层析从天竺鼠血清纯化的多克隆抗IL-6IgG抗体从10μg/mL稀释至0.00238ng/mL。利用4-参数罗吉特曲线拟合的非线性回归计算EC50。
图5A显示在基于ELISA的测试中针对IL-6和IL-6R的交互作用的利用不同IL-6肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：107、116、118、124、132、133、124和137以及GP IgG)所产生各种纯化多克隆抗IL-6抗体的中和活性。利用重组人类IL-6R蛋白质涂覆ELISA盘。将浓度为10ng/ml的人类IL-6和各种多克隆抗IL-6IgG抗体(各种多克隆抗IL-6IgG抗体利用3倍连续稀释配制成从100至0.412μg/mL的递减浓度)预混合，然后加入IL-6R涂覆的孔中。利用生物素标志的兔抗IL-6抗体检检测捕获的IL-6，然后再利用链抗生物素蛋白poly-HRP检测。藉由利用4-参数罗吉特曲线拟合的非线性回归计算IC50。
图5B显示在基于ELISA的测试中针对IL-6/IL-6R和gp130的交互作用的利用不同IL-6肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：128、129、134和135以及GP IgG)所产生各种纯化多克隆抗IL-6抗体的中和活性。利用重组gp130-Fc融合蛋白涂覆ELISA盘。将以预定比例预先形成的IL-6/IL-6R复合物和各种多克隆抗IL-6IgG抗体(各种多克隆抗IL-6IgG抗体利用3倍连续稀释配制成从100至0.412μg/mL的递减浓度)预混合，然后加入gp130-Fc涂覆的孔中。利用生物素标志的兔抗IL-6抗体检检测捕获的IL-6/IL-6R复合物，然后再利用链抗生物素蛋白poly-HRP检测。利用4-参数罗吉特曲线拟合的非线性回归计算IC50。
图6显示在基于ELISA的测试中针对IL-6依赖性STAT3磷酸化的利用不同IL-6肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：116、124、127、128、129、134、135和137以及GP IgG)所产生各种纯化多克隆抗IL-6抗体的中和活性。将RMPI 8226细胞与人类IL-6(浓度为10ng/mL)和各种多克隆抗IL-6IgG抗体(浓度为100μg/mL)在37℃，5％CO2下培养30分钟，然后进行裂解以在基于ELISA的测试中测定磷酸化STAT3的水平。
图第7A-7B显示针对IL-6依赖性细胞增生的利用不同IL-6肽免疫原构建体所产生各种纯化多克隆抗IL-6抗体的中和活性。SEQ ID NOs：116、118、124-129、131、132和133的中和活性显示在第7A图中，而SEQ ID NOs：134-145的中和活性显示在图7B中。将TF-1细胞与人类IL-6(浓度为10ng/mL)和指定浓度的各种多克隆抗IL-6IgG抗体在37℃，5％CO2下培养72小时。通过测量于代谢活跃的细胞中的ATP量来监测细胞存活率。
图8A-8B显示针对IL-6诱导的MCP-1分泌的利用不同IL-6肽免疫原构建体所产生各种纯化多克隆抗IL-6抗体的中和活性。SEQ ID NOs：116、118、124-134和136的中和活性显示在第8A图中，而SEQ ID NOs：138-145的中和活性显示在图8B中。将U937细胞与人类IL-6(浓度为10ng/mL)和指定浓度的各种多克隆抗IL-6IgG抗体在37℃，5％CO2下培养24小时。收集培养物上清液以测定MCP-1水平。
图9显示利用预防模型在大鼠的胶原蛋白诱发关节炎(CIA)中供大鼠IL-6肽构建体功效评估的实验设计。在第-31天、第-10天和第4天利用剂量为45μg的肽免疫原构建体SEQ ID NOs：148或157以肌内方式对雌性Lewis大鼠(每组n＝7)进行免疫接种。为了诱发关节炎，在第0天和第7天利用牛第II型胶原蛋白/IFA乳液对动物进行皮内诱发(challenge)。
图10显示在利用不同IL-6肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：148和157)免疫的大鼠中于28天期间内抗体反应的动力学。利用重组大鼠IL-6涂覆ELISA盘。通过4倍连续稀释将血清从1∶100稀释至1∶4.19x108。利用4-参数罗吉特曲线拟合的非线性回归计算测试血清的效价，表示为Log10(EC50)。
图11显示在先前利用不同IL-6肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：148和157)免疫的胶原蛋白诱发的大鼠中关节炎评分的降低。
图12显示在先前利用不同IL-6肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：148和157)免疫的胶原蛋白诱发的大鼠中后爪肿胀的减少。
图13显示在先前利用不同IL-6肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：148和157)免疫的胶原蛋白诱发的大鼠中血液嗜中性粒细胞增多症的减轻。
图14显示利用治疗模型在大鼠的胶原蛋白诱发关节炎(CIA)中供大鼠IL-6肽免疫原构建体功效评估的实验设计。在第-7天、第7天、第14天、第21天和第28天利用剂量为45μg的SEQ ID NO：148以肌内方式对雌性Lewis大鼠(每组n＝6或7)进行免疫接种。为了诱发关节炎，在第0天和第7天利用牛第II型胶原蛋白/IFA乳液对动物进行皮内诱发。
图15显示在利用与ISA 51或ISA 51/CpG配制的SEQ ID NO：148免疫的大鼠中于43天期间内抗体反应的动力学。利用重组大鼠IL-6涂覆ELISA盘。通过4倍连续稀释将血清从1∶100稀释至1∶4.19x108。利用4-参数罗吉特曲线拟合的非线性回归计算测试血清的效价，表示为Log10(EC50)。
图16显示在先前利用与ISA 51或ISA 51/CpG配制的SEQ ID NO：148免疫的胶原蛋白诱发的大鼠中关节炎评分和后爪肿胀的减少。
图17显示在先前利用与ISA 51或ISA 51/CpG配制的SEQ ID NO：148免疫的胶原蛋白诱发的大鼠中肝脏C反应蛋白(CRP)的减少。
图18显示在先前利用与ISA 51或ISA 51/CpG配制的SEQ ID NO：148免疫的胶原蛋白诱发的大鼠中踝关节破坏的减轻。
图19显示在先前利用与ISA 51或ISA 51/CpG配制的SEQ ID NO：148免疫的胶原蛋白诱发的大鼠中组织炎症细胞因子(TNF-α、IL-17和MCP-1)产生的减少。
图20显示在利用与ISA 51/CpG或ADJU-PHOS/CpG配制的不同剂量的SEQ ID NO：148免疫的大鼠中于43天期间内抗体反应的动力学。按照与图17相同的实验设计进行此研究。利用重组大鼠IL-6涂覆ELISA盘。通过4倍连续稀释将血清从1∶100稀释至1∶4.19x108。通过将数值为0.45的临界值(cutoff)结合到利用非线性回归产生的每个血清样品的4-参数罗吉特曲线中计算测试血清的效价，表示为Log10。
图21显示在利用与ISA 51/CpG或ADJU-PHOS/CpG配制的递增剂量的SEQ ID NO：148免疫的胶原蛋白诱发的大鼠中体重减轻的减少。
图22显示在利用与ISA 51/CpG或ADJU-PHOS/CpG配制的递增剂量的SEQ ID NO：148免疫的胶原蛋白诱发的大鼠中后爪肿胀的减少。
图23显示利用与ISA 51/CpG或ADJU-PHOS/CpG配制的递增剂量的SEQ ID NO：148免疫的胶原蛋白诱发的大鼠于第24天时的后爪的肉眼观察结果。
图24显示在利用与ISA 51/CpG或ADJU-PHOS/CpG配制的递增剂量的SEQ ID NO：148免疫的胶原蛋白诱发的大鼠中关节炎评分的减少。
图25显示在利用与ISA 51/CpG或ADJU-PHOS/CpG配制的递增剂量的SEQ ID NO：148免疫的胶原蛋白诱发的大鼠中血液嗜中性粒细胞增多症的减轻。
图26显示在利用与ISA 51/CpG或ADJU-PHOS/CpG配制的递增剂量的SEQ ID NO：148免疫的胶原蛋白诱发的大鼠中血小板释放的减少。
图27显示在利用与ISA 51/CpG或ADJU-PHOS/CpG配制的递增剂量的SEQ ID NO：148免疫的胶原蛋白诱发的大鼠中血液AST增加的减少。
图28显示在利用与指定佐剂配制的不同IL-6肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：102、114、115、117和118)免疫的天竺鼠中于12周期间内抗体反应的动力学。利用重组人类IL-6涂覆ELISA盘。通过4倍连续稀释将血清从1∶100稀释至1∶4.19x108。利用4-参数罗吉特曲线拟合的非线性回归计算测试血清的效价，表示为Log10(EC50)。
实施方式
本发明涉及靶向介白素6(IL-6)的单个肽免疫原构建体及其制剂，其用于受IL-6失调影响的疾病的免疫治疗。
本发明的IL-6肽免疫原构建体具有30个或更多个的氨基酸，包含衍生自IL-6受体(IL-6R)结合区域E42-C83(SEQ ID NO：16)或N144-I166(SEQ ID NO：19)或其片段(SEQ IDNOs：5-19)的功能性B细胞表位，其通过任选的异源性间隔子连接至衍生自病原体蛋白质的异源性T辅助细胞(Th)表位(SEQ ID NOs：78-106和216-226)。这些IL-6肽构建体(含有设计的B细胞和Th细胞表位共同作用)刺激针对IL-6R结合区域的高度特异性抗体的产生，为患有或易患受IL-6失调影响的疾病的患者提供预防性及/或治疗性免疫反应。本发明的IL-6肽免疫原构建体可包含杂合肽，此杂合肽具有衍生自IL-6R结合区域或其片段的B细胞抗原位点(SEQ ID NOs：5-20；72-75)，其连接至衍生自病原体蛋白质的异源性Th表位(例如表2的SEQ ID NOs：78-106和216-226)，其共同作用以刺激与重组人类IL-6(SEQ ID NO：1)或其他物种的IL-6(例如猕猴(SEQ ID NO：2)、小鼠(SEQ ID NO：3)和大鼠IL-6(SEQ ID NO：4))交叉反应的高度特异性抗体的产生。
在一些实施例中，IL-6肽免疫原构建体(例如表3的SEQ ID NOs：107-186)含有杂合肽，此杂合肽具有B细胞抗原位点，例如C73-C83(SEQ ID NO：5)，B细胞抗原位点与衍生自各种病原体蛋白质的异源性Th表位(SEQ ID NOs：78-106和216-226)连接，可引发与重组人类IL-6(SEQ ID NO：1)交叉反应的抗体，且其与其他物种的IL-6(SEQ ID NOs：2、3、4)具有交叉反应。在用于增强B细胞抗原位点的异源性Th表位中，衍生自天然病原体EBV BPLF1(SEQ ID NO：105)、EBV CP(SEQ ID NO：102)、破伤风梭菌1、2、4(SEQ ID NOs：78、99-101)、霍乱毒素(SEQ ID NO：85)、曼氏血吸虫(SEQ ID NO：84)和那些衍生自麻疹病毒融合蛋白(MVF 1至5)和B型肝炎表面抗原(HBsAg 1至3)的理想化人工Th表位以单一序列或组合序列(例如SEQ ID NOs：79、86-92)形式通过免疫原性筛选测试特别用于这种B细胞抗原性增强中。
本发明还涉及肽组合物，其包含IL-6肽免疫原构建体与衍生自不同病原体的异源性Th表位的混合物。包含IL-6肽免疫原构建体混合物的组合物可用于允许覆盖患者中广泛的遗传背景，导致免疫后更高百分比的反应率，用于预防及/或治疗受IL-6失调影响的疾病。当使用含有一种以上IL-6肽免疫原构建体的肽组合物时，可以观察到免疫反应的协同性增强。
衍生自这种肽免疫原构建体的抗体反应大多数(＞90％)是集中在针对IL-6R结合区域肽(SEQ ID NOs：5-19)的所需的交叉反应上，如果有的话，很少是针对用于免疫原性增强的异源性Th表位。这与使用常规载体蛋白(例如用于此种肽抗原性增强的KLH、类毒素或其他生物载体)的标准方法形成鲜明对比。
本发明还涉及医药组合物，其包括用于预防及/或治疗受IL-6失调影响的疾病的制剂。在一些实施例中，医药组合物包含稳定化的免疫刺激复合物，其通过将CpG寡聚合物与含有IL-6肽免疫原构建体的混合物的肽组合物混合通过静电结合而形成，以进一步增强IL-6肽免疫原性，此IL-6肽免疫原性有助于与全长人类IL-6(SEQ ID NO：1)或与其他物种的IL-6(例如猕猴(SEQ ID NO：2)、小鼠(SEQ ID NO：3)和大鼠(SEQ ID NO：4))的所需的交叉反应。
在其他实施例中，医药组合物包含IL-6肽免疫原构建体与矿物盐(包括铝胶(ALHYDROGEL)或磷酸铝(ADJU-PHOS))接触以形成悬浮液或与作为佐剂的MONTANIDE ISA51或720接触以形成油包水乳液的混合物的肽组合物，用于施用患者以预防及/或治疗受IL-6失调影响的疾病。
此外，本发明还提供用于IL-6肽免疫原构建体及其制剂的低成本制造和质量管控的方法，此IL-6肽免疫原构建体及其制剂用于预防及/或治疗患有受IL-6失调影响的疾病的动物和患者。
本发明还涉及针对本发明的IL-6肽免疫原构建体的抗体。特别地，本发明的IL-6肽免疫原构建体能够刺激与IL-6分子上的IL-6R结合位点交叉反应的高度特异性抗体的产生。本发明的抗体利用高特异性结合至IL-6R结合位点，没有很多，如果有的话，是针对用于免疫原性增强的异源性Th表位，此与利用用于这种肽抗原性增强的常规蛋白或其他生物蛋白载体所制造的抗体形成鲜明对比。因此，相较于其他肽或蛋白质免疫原，本发明的IL-6肽免疫原构建体能够破坏针对自身IL-6蛋白的免疫耐受性，具有高反应率。
在某些实施例中，抗体针对并特异性地结合至人类IL-6分子(SEQ ID NO：1)上的IL-6R结合位点。由IL-6肽免疫原构建体引发的高度特异性抗体可以抑制IL-6和IL-6R的结合，以及下游事件(例如IL-6诱导的STAT3磷酸化、IL-6依赖性细胞增生、IL-6诱发的MCP产生和其他IL-6相关的病理状态)，导致患有受IL-6失调影响的疾病的患者的有效治疗。
在另一方面，本发明提供在接受含有本发明的IL-6肽免疫原构建体的组合物的患者中所诱导针对IL-6的人类抗体(多克隆和单克隆)。Traggiai等人(2004)描述由从人类患者血液中分离的B细胞制备人类单克隆抗体的有效方法，其公开内容通过引用整体并入本文。
基于它们独特的特征和性质，由IL-6肽免疫原构建体引发的本发明的抗体能够提供免疫治疗方法来治疗患有受IL-6失调影响的疾病的患者。
本发明还涉及制备本发明的IL-6肽免疫原构建体、组合物和抗体的方法。本发明的方法提供IL-6肽免疫原构建体和含有构建体的组合物的低成本制造和质量控制，其可用于治疗患有IL-6失调影响的疾病的患者的方法。本发明的方法可提供用于IL-6肽免疫原构建体与含有此构建体的组合物的低成本制造和质量管控，此构建体及组合物可用于用以治疗患有受IL-6失调影响的疾病患者的方法中。
本发明还包括使用本发明的IL-6肽免疫原构建体及/或针对IL-6肽免疫原构建体的抗体于个体中预防及/或治疗受IL-6失调影响的疾病的方法。本发明的方法包括对个体施用含有本发明的IL-6肽免疫原构建体的组合物的步骤。在一些实施例中，所述方法中使用的组合物含有本发明的IL-6肽免疫原构建体，IL-6肽免疫原构建体透静电结合与带有负电荷的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)形成稳定的免疫刺激复合物，其可进一步与佐剂添加，供易患或患有受IL-6失调影响的疾病的个体施用。
本发明的方法还包括用于施用肽免疫原构建体的给药方案、剂型和给药途径，以预防及/或治疗受IL-6失调影响的疾病。
定义
本文使用的章节标题仅用于组织的目的，不应被理解为限制所述主题。本申请中引用的所有参考文献或参考文献的部分出于任何目的通过引用明确地将整体并入本文。
除非特别说明，在此使用的所有技术和科学用语如本发明所属技术领域中具有通常知识者的通常理解具有相同意义。除非上下文清楚地指出，否则单词“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包含复数形式。类似地，表述“或(or)”是意指包括“和(and)”，除非上下文另有明确说明。因此，“包含A或B”是指包括A，或B，或A和B。更应被理解的是，用于给定多肽的所有的氨基酸大小和所有分子量或分子质量值是近似的，并且被提供作为描述的用。然而类似或等同于在此描述者的方法和材料可被用于以下所述的本发明的方法、合适的方法和材料的实践或测试中。在此提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括术语的解释)为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的而并非用于限制。
IL-6肽免疫原构建体
本发明提供含有B细胞表位的肽免疫原构建体，此B细胞表位具有来自IL-6受体(IL-6R)结合区域E42-C83(SEQ ID NO：16)或N144-I166(SEQ ID NO：19)或其片段(例如SEQID NOs：5-19)的氨基酸序列。B细胞表位直接地或是通过任选的异源性间隔子共价地连接至衍生自病原体蛋白质的异源性T辅助细胞(Th)表位。这些构建体(含有设计的B细胞和Th细胞表位共同作用)刺激针对IL-6上的IL-6R结合区域的高度特异性抗体的产生，为易患或患有受IL-6失调影响的疾病的患者提供治疗性免疫反应。
本文使用术语“IL-6肽免疫原构建体”或“肽免疫原构建体”是指具有30个以上氨基酸的长度的肽，其含有(a)具有来自全长人类IL-6(SEQ ID NO：1)的IL-6R结合区域约10个以上连续氨基酸残基的B细胞表位(以肽E42-C83(SEQ ID NO：16)或N144-I166(SEQ IDNO：19)或其片段(例如SEQ ID NOs：5-19)作为代表；(b)异源性Th表位；以及(c)任选的异源性间隔子。
在某些实施例中，IL-6肽免疫原构建体可利用以下分子式作为代表：
(Th)m-(A)n-(IL-6的IL-6R结合区域或其片段)-X
或
(IL-6的IL-6R结合区域或其片段)-(A)n-(Th)m-X
或
(Th)m-(A)n-(IL-6的IL-6R结合区域或其片段)-(A)n-(Th)m-X
其中
Th为异源性T辅助细胞表位；
A为异源性间隔子；
(IL-6的IL-6R结合区域或其片段)为B细胞表位肽，其具有来自IL-6(SEQ ID NO：1)的IL-6R结合区域的7至42个氨基酸残基；
X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
m为1至约4；以及
n为0至约10。
基于许多理论基础设计和选择本发明的IL-6肽免疫原构建体，包括：
i.IL-6B细胞表位肽本身是非免疫原性的，以避免自体T细胞活化；
ii.通过使用蛋白质载体或有效的T辅助细胞表位，可以使IL-6B细胞表位肽具有免疫原性；
iii.当IL-6B细胞表位肽成为免疫原性并施用给宿主时，肽免疫原构建体：
a.引发优先针对IL-6肽序列(B细胞表位)而非蛋白质载体或T辅助细胞表位的高效价抗体；
b.在接受免疫的宿主中破坏免疫耐受性并产生与IL-6(SEQ ID NO：1)交叉反应的高度特异性抗体；
c.产生可以抑制IL-6和IL-6R的结合以及下游事件(例如IL-6诱导的STAT3磷酸化、IL-6依赖性细胞增生、IL-6诱发的MCP产生)的高度特异性抗体；以及
d.产生可以导致其他IL-6相关的病理状态的体内减少的高度特异性抗体。
本发明的IL-6肽免疫原构建体及其制剂可有效地发挥医药组合物的作用，以预防及/或治疗易患或患有受IL-6失调影响的疾病的个体。
本发明的IL-6肽免疫原构建体的各种组分在以下进一步详细描述。
a.来自IL-6R结合区域的B细胞表位肽
本发明涉及用于产生高效价抗体的新的肽组合物，所述高效价抗体对人类重组IL-6蛋白具有特异性，并且对来自猕猴、小鼠和大鼠物种的IL-6蛋白具有交叉反应性。肽组合物的位点特异性使针对位于IL-6上其他区域的不相关位点或位于载体蛋白上的不相关位点的抗体产生最小化，从而提供高安全系数。
本文使用术语“IL-6”是指来自人类的全长IL-6蛋白(UniProtKB P05231；GenBank登录号NP_000591.1)和具有交叉反应性的来自其他物种的全长IL-6蛋白(包括猕猴(UniProtKBAOA1D5QM02-1；GenBank登录号NP_001274245.1)、小鼠(UniProtKB P08505；GenBank登录号NP_112445.1)和大鼠(UniProtKB P20607；GenBank登录号NP_036721.1)。来自人类(SEQ ID NO：227)、猕猴(SEQ ID NO：228)、小鼠(SEQ ID NO：229)和大鼠(SEQ IDNO：230)的全长IL-6序列的氨基酸序列比对如图1所示。
更具体地，本文使用术语“IL-6”是指切除氮端信号肽(含有约24至28个氨基酸，取决于物种)的全长、成熟的IL-6蛋白的氨基酸序列。来自人类(SEQ ID NO：1)、猕猴(SEQ IDNO：2)、小鼠(SEQ ID NO：3)和大鼠(SEQ ID NO：4)的全长成熟的IL-6蛋白的氨基酸序列如表1所示。在整个本申请中，IL-6蛋白内氨基酸位置的编号是基于IL-6的全长、成熟序列，其中氮端信号序列被切除，以SEQ ID NOs：1-4作为表示，如表1所示。
IL-6R由两条链构成：(1)IL-6结合链或IL-6Rα，其以两种形式存在，即(a)80kD跨膜IL-6Rα(mIL-6Rα)(UniProtKB：P08887；GenBank登录号NP_000556.1)和(b)50-55kD可溶性IL-6Rα(sIL-6Rα)(UniProtKB：P08887或P08887-2))，以及(2)130kD信号转导链，其命名为IL-6Rβ或gp130(UniProtKB：P40189；GenBank登录号NP_002175.2)。
膜IL-6Rα(或mIL-6Rα)在有限数量的细胞类型(即肝细胞、巨核细胞和白血球(包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞与T和B淋巴细胞)的表面上表达。可溶性IL-6Rα(或sIL-6Rα)存在于人类血浆(25-75ng/mL)和组织液中，其可通过金属蛋白酶(去整合素金属蛋白酶(即ADAM))对mIL-6Rα进行蛋白质水解切割(脱落(shedding))而产生，或者在较小的部分，是通过删除跨膜结构域的选择性剪接而产生。
膜IL-6Rβ或gp130在所有人类细胞上普遍地表达(Sabba，2008)。
在传统信号转导中，IL-6结合至与膜结合的IL-6受体(mIL-6Rα)，IL-6-mIL-6Rα复合物与IL-6Rβ次单位(gp130)结合，诱发gp130二聚化和细胞内信号传导。或者，IL-6可结合至可溶性IL-6Rα(sIL-6Rα)，其通过去整合素金属蛋白酶17(ADAM17)对mIL-6Rα进行切割而产生。然后IL-6-sIL-6Rα复合物结合至与膜结合的IL-6Rβ次单位(gp130)，且甚至在不表达IL-6R的细胞上诱导反式信号转导。因此，在与mIL-6Rα或sIL-6Rα结合后，IL-6诱导六聚体蛋白(包含两个IL-6、两个IL-6Rα和两个IL-6Rβ(gp130))的形成，其接着引发下游信号级联反应(Rose-John，et al.，2017)。
通过IL-6与mIL-6Rα结合的细胞活化被称为“传统信号转导”。所有其他不表达mIL-6Rα的细胞通过“反式信号转导”获得其IL-6信号：其中IL-6与循环的sIL-6Rα结合，并且此复合物与细胞表面上的IL-6Rβ或gp130形成信号转导复合物。反式信号转导可以在广泛的人类细胞中发生，因此有助于IL-6的多效性活性。目前了解IL-6的稳态和再生活性是由传统信号转导所介导的，而促炎作用主要是由反式信号转导途径活化所引起的。越来越多的证据表明IL-6反式信号转导特别地涉及疾病的发展。还在循环中以相对高的浓度检测到可溶形式的IL-6Rβ(sIL-6Rβ)或gp130(sgp130)，其主要通过选择性剪接产生。由于sgp130可以与IL-6/sIL-6Rα复合物结合，因此它作为IL-6介导的反式信号转导的天然且特异性的抑制剂，而传统信号转导不受sgp130的影响。
虽然IL-6Rα是IL-6的独特结合受体，但IL-6Rβ(或gp130)信号转导链由IL-6家族成员(包含白血病抑制因子、抑瘤素M、睫状神经营养因子、IL-11、心肌营养素-1、神经生成素-1、IL-27和IL-35)共享。
IL-6肽免疫原构建体的IL-6B细胞表位部分靶向IL-6分子上的IL-6R结合区域。B细胞表位肽含有衍生自全长成熟IL-6蛋白(SEQ ID NOs：1-4)的E42-C83(SEQ ID NO：16)或N144-I166(SEQ ID NO：19)的约7至约42个氨基酸残基。使用IL-6蛋白片段进行广泛的血清学筛选后，选择了IL-6B细胞表位，其中一些蛋白中含有天然存在的分子内环状结构，如图1中画有阴影的半胱氨酸所示。
在某些实施例中，基于设计理论筛选和选择的B细胞表位肽含有根据全长成熟的IL-6蛋白序列(SEQ ID NO：1)的编号来自由内源性半胱氨酸(例如C73-C83(SEQ ID NO：5)或C44-C50(SEQ ID NO：15))形成的IL-6的内部分子内环状结构的氨基酸序列，或来自IL-6分子羧基端的氨基酸序列(包括来自N144-I166(SEQ ID NO：19)的氨基酸序列)。在一些实施例中，B细胞表位具有SEQ ID NOs：5-19的氨基酸序列，如表1所示。
本发明的IL-6B细胞表位肽还包括IL-6肽的免疫功能性类似物或同源物(SEQ IDNOs：5-19)。IL-6B细胞表位肽的免疫功能性类似物或同源物包括保留与原始肽免疫原性实质相同的的变体。免疫功能性类似物可具有于氨基酸位置的保留性取代、总电荷改变、与其他官能基共价连接或氨基酸的添加、插入或删除及/或其任意组合(例如SEQ ID NOs：72-76的IL-6肽)。
b.异源性T辅助细胞表位(Th表位)
本发明提供肽免疫原构建体，其包含来自IL-6的B细胞表位，B细胞表位直接地或是通过任选的异源性间隔子共价连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。
于IL-6肽免疫原构建体中的异源性Th表位可增强IL-6片段的免疫原性，其促进针对基于设计理论筛选和选择的优化目标B细胞表位肽(即IL-6片段)的特异性高效价抗体的产生。
本文使用术语“异源性”是指衍生自并非IL-6野生型序列的部分或与其同源的氨基酸序列的氨基酸序列。因此，异源性Th表位为衍生自非天然存在于IL-6的氨基酸序列的Th表位(即Th表位对IL-6而言不是自体衍生的)。因为Th表位对IL-6而言是异源性的，当异源性Th表位共价连接至IL-6片段时，IL-6的天然氨基酸序列不会向氨基端或羧基端方向延伸。
本发明的异源性Th表位可以是不具有天然存在于IL-6的氨基酸序列的任何Th表位。Th表位还可具有针对多种物种第2类MHC分子的混杂结合基序。在某些实施例中，Th表位包含多个混杂的第2类MHC结合基序，以允许T辅助细胞的最大活化，从而导致免疫反应的启动和调节。较佳的Th表位本身为非免疫原性的(即如果有的话，很少利用IL-6肽免疫原构建体所产生抗体是针对Th表位)，因此允许针对IL-6的目标B细胞表位肽的非常集中的免疫反应。
本发明的Th表位包括，但不限于，衍生自外来病原菌的氨基酸序列，如表2(SEQ IDNOs：78-106和216-226)所例示。此外，Th表位包括理想化人工Th表位和组合的理想化人工Th表位(例如SEQ ID NOs：79、86、91、92和79、86-92)。异源性Th表位肽以组合序列(例如SEQID NOs：87-90)呈现，包含基于特定肽的同源物的可变残基在肽骨架内于特定位置处作为代表的氨基酸残基的混合物。可以利用在合成过程期间在特定位置添加选定受保护的氨基酸的混合物，而非一个特定的氨基酸，在单一过程中合成组合肽的集合。此种组合异源性Th表位肽集合可允许对具有不同遗传背景的动物广泛的Th表位覆盖。异源性Th表位肽的代表性组合序列包含如表2所示的SEQ ID NOs：87-90。本发明的Th表位肽对来自基因多样性群体的动物和患者提供广泛的反应性和免疫原性。
c.异源性间隔子
本发明的IL-6肽免疫原构建体任选地包含异源性间隔子，其将IL-6B细胞表位肽共价连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。
如上所述，术语“异源性”是指衍生自并非IL-6天然型序列的部分或与其同源的氨基酸序列的氨基酸序列。因此，当异源性间隔子共价连接至IL-6B细胞表位肽时，IL-6的天然氨基酸序列不会向氨基端或羧基端方向延伸，因为间隔子对IL-6序列而言是异源性的。
间隔子为能够将两个氨基酸及/或肽连接在一起的任何分子或化学结构。依据应用的不同，间隔子的长度或极性可能会有所不同。间隔子连接可通过酰胺或羧基连结，但是其他官能基也是可能的。间隔子可包括化学化合物、天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。
间隔子可为IL-6肽免疫原构建体提供构建体特征。结构上，间隔子提供Th表位与IL-6片段的B细胞表位的物理分离。通过间隔子的物理分离可破坏通过将Th表位连接至B细胞表位所产生的任何人工二级结构。另外，通过间隔子的表位的物理分离可消除Th细胞及/或B细胞反应的之间的干扰。此外，可设计间隔子以产生或修饰肽免疫原构建体的二级结构。例如，可设计间隔子以作为柔性铰链，用以增强Th表位和B细胞表位的分离。柔性铰链间隔子也可允许所呈现的肽免疫原与适当的Th细胞和B细胞的间更有效率的交互作用，以增强对Th表位和B细胞表位的免疫反应。编码柔性铰链的序列的例示见于通常富含脯氨酸的免疫球蛋白重链铰链区。利用序列Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO：76)提供了一种作为间隔子使用的特别有用的柔性铰链，其中Xaa是任意氨基酸，以天门冬氨酸为较佳。
间隔子也可为IL-6肽免疫原构建体提供功能特征。例如，可设计间隔子以改变IL-6肽免疫原构建体的总电荷，其可影响肽免疫原构建体的溶解度。此外，改变IL-6肽免疫原构建体的总电荷可影响肽免疫原构建体与其他化合物和试剂结合的能力。如下文进一步详细讨论的，IL-6肽免疫原构建体可通过静电结合与高度带电的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)形成稳定的免疫刺激复合物。IL-6肽免疫原构建体的总电荷对于形成这些稳定的免疫刺激复合物是重要的。
可作为间隔子的化学化合物包括，但不限于，(2-胺乙氧基)乙酸(AFA)、5-氨基戊酸(AVA)、6-氨基己酸(Ahx)、8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(AEEA，mini-PEG1)、12-氨基-4，7，10-三氧杂十二酸(mini-PEG2)、15-氨基-4，7，10，13-四氧杂十五烷酸(mini-PEG3)、trioxatridecan-succinamic acid(Ttds)、12-氨基十二烷酸、Fmoc-5-氨基-3-氧戊酸(O1Pen)等。
天然存在的氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天门冬酰氨酸、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
非天然存在的氨基酸包括，但不限于，ε-N赖氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、甲状腺素、γ-氨基丁酸、高丝氨酸、瓜氨酸、氨基苯甲酸、6-氨基己酸(Aca；6-氨基己酸)、3-硫醇丙酸(MPA)、3-硝基酪氨酸、焦谷氨酸等。
IL-6肽免疫原构建体中的间隔子可共价连接在Th表位和IL-6B细胞表位肽的氨基端或羧基端。在一些实施例中，间隔子共价连接至Th表位的羧基端和IL-6B细胞表位肽的氨基端。在其他实施例中，间隔子共价连接至IL-6B细胞表位肽的羧基端和Th表位的氨基端。在某些实施例中，可使用一个以上的间隔子，例如，当在IL-6肽免疫原构建体中存在一个以上的Th表位时。当使用一个以上的间隔子时，每个间隔子可以彼此相同或不同。此外，当IL-6肽免疫原构建体中存在一个以上的Th表位时，可利用间隔子分隔开Th表位，间隔子可为相同或不同，利用间隔子将Th表位与IL-6B细胞表位肽分开。间隔子相对于Th表位或IL-6B细胞表位肽的排列没有限制。
在某些实施例中，异源性间隔子是天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。在其他实施例中，间隔子包含一个以上的天然存在或非天然存在的氨基酸。在具体实施例中，间隔子为Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(d，ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：77)或Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO：231)。
d.IL-6肽免疫原构建体的具体实施例
在某些实施例中，IL-6肽免疫原构建体可利用以下分子式表示：
一种IL-6肽免疫原构建体，其具有约超过30个氨基酸的长度，以分子式表示：
(Th)m-(A)n-(IL-6的IL-6R结合区域或其片段)-X
或
(IL-6的IL-6R结合区域或其片段)-(A)n-(Th)m-X
或
(Th)m-(A)n-(IL-6的IL-6R结合区域或其片段)-(A)n-(Th)m-X
其中
Th为异源性T辅助细胞表位；
A为异源性间隔子；
(IL-6的IL-6R结合区域或其片段)为B细胞表位肽，其具有来自IL-6(SEQ ID NO：1)的IL-6R结合区域的约7至约42个氨基酸残基；
X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
m为1至约4；以及
n为0至约10。
在一些实施例中，(IL-6的IL-6R结合区域或其片段)是具有选自SEQ ID NOs：5-19中任一个的氨基酸序列的B细胞表位肽。在某些实施例中，B细胞表位具有来自IL-6(SEQ IDNOs：1-4)的E42-C83(SEQ ID NO：16)或N144-I166(SEQ ID NO：19)或其片段的氨基酸序列。在具体实施例中，(IL-6的IL-6R结合区域或其片段)是B细胞表位，其包含至少一个来自C73-C83(SEQ ID NO：5)及/或C44-C50(SEQ ID NO：15)的天然存在的分子内环状结构，如图1所示。
在某些实施例中，IL-6肽免疫原构建体中的异源性Th表位具有选自SEQ ID NOs：78-106、216-226中任一个或其组合的氨基酸序列，如表2所示。在一些实施例中，IL-6肽免疫原构建体包含一个以上的Th表位。
在某些实施例中，任选的异源性间隔子是选自Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α，ε-N)Lys、Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO：76)、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：77)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO：231)任一个及其任意组合，其中Xaa是任意氨基酸，但以天门冬氨酸为较佳。在特定实施例中，异源性间隔子是ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：77)或Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO：231)。
在某些实施例中，IL-6B细胞表位肽具有来自SEQ ID NO：1的全长成熟IL-6蛋白的约7至约42个氨基酸残基。在具体实施例中，IL-6B细胞表位肽包含来自包含在IL-6中的分子内环状结构的氨基酸序列(E42-C83，SEQ ID NO：16)。在具体实施例中，IL-6B细胞表位肽包含来自氨基酸C73-C83(SEQ ID NO：5)或IL-6C44-C50(SEQ ID NO：15)的IL-6的内部环状结构(例如SEQ ID NOs：5-8、10、12、15-17)，如表1所示。
在某些实施例中，IL-6肽免疫原构建体具有如表3所示选自SEQ ID NOs：107-215中任一个的氨基酸序列。在具体实施例中，IL-6肽免疫原构建体具有选自SEQ ID NOs：107-160中任一个的氨基酸序列。
包含Th表位的IL-6肽免疫原构建体可于与IL-6片段串联的单一固相肽合成中同时产生。Th表位也可包括Th表位的免疫类似物。免疫Th类似物包括免疫增强类似物、交叉反应类似物和任何这些Th表位的片段，其足以增强或刺激对IL-6B细胞表位肽的免疫反应。
在IL-6肽免疫原构建体中的Th表位可共价连接于IL-6B细胞表位肽的氨基端或羧基端。在一些实施例中，Th表位是共价连接至IL-6B细胞表位肽的氨基端。在其他实施例中，Th表位是共价连接至IL-6B细胞表位肽的羧基端。在某些实施例中，一个以上的Th表位共价连接至IL-6B细胞表位肽。当一个以上的Th表位连接至IL-6B细胞表位肽时，每一个Th表位可具有相同氨基酸序列或不同氨基酸序列。另外，当一个以上的Th表位连接至IL-6B细胞表位肽时，Th表位可以任何顺序排列。例如，Th表位可连续地连接至IL-6B细胞表位肽的氨基端，或连续地连接至IL-6B细胞表位肽的羧基端，或当不同的Th表位共价连接至IL-6B细胞表位肽的羧基端时，Th表位可共价连接至IL-6B细胞表位肽的氨基端。Th表位相对于IL-6B细胞表位肽的排列并无限制。
在一些实施例中，Th表位直接地共价连接至IL-6B细胞表位肽。在其他实施例中，Th表位通过异源性间隔子共价连接至IL-6片段。
e.变体、同源物和功能性类似物
也可使用上述免疫原肽构建体的变体和类似物，其可诱导抗体及/或与抗体交叉反应，而此抗体是针对较佳的IL-6B细胞表位肽。类似物(包括等位基因、物种以及诱导变体)，通常于一个、两个或几个位置上有别于天然存在的肽，通常是由于保留性取代。类似物通常展现与天然肽至少80或90％的序列一致性。一些类似物还包括非天然氨基酸或在一个、两个或几个位置上的氨基端或羧基端氨基酸的修饰。
作为功能性类似物的变体可具有于氨基酸位置上的保留性取代、总电荷改变、与其他官能基共价连接或氨基酸的添加、插入或删除及/或其任意组合。
保留性取代是指一个氨基酸残基被另一个具有相似化学性质的氨基酸残基所取代。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天门冬酰氨酸和谷氨酰胺；带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；而带负电的(酸性)氨基酸包括天门冬氨酸和谷氨酸。
在一个特定实施例中，功能性类似物与原始氨基酸序列具有至少50％的一致性。在另一实施例中，功能性类似物与原始氨基酸序列具有至少80％的一致性。在又一实施例中，功能性类似物与原始氨基酸序列具有至少85％的一致性。在又一实施例中，功能性类似物与原始氨基酸序列具有至少90％的一致性。
变体还包括磷酸化残基的变化。例如，变体可包括在被磷酸化的肽内的不同残基。变体免疫原性IL-6肽也可包括伪磷酸化肽。伪磷酸化肽是藉由用酸性氨基酸残基(例如谷氨酸和天门冬氨酸)取代IL-6肽的一个或多个磷酸化的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基所产生。
Th表位肽的功能免疫类似物也是有效的，且被包括作为本发明的一部分。功能免疫Th类似物可包含于Th表位中从1至约5个氨基酸残基的保留性取代、添加、删除和插入，其实质上未改变Th表位的Th刺激功能。如上文针对IL-6B细胞表位肽所描述的，可以利用天然或非天然氨基酸完成保留性取代、添加和插入。表2辨识了Th表位肽的功能性类似物的另一种变体。具体而言，MvF1和MvF2 Th的SEQ ID NOs：79和86是MvF4和MvF5的SEQ ID NOs：89和91的功能性类似物，因为利用在氨基端和羧基端将各两个氨基酸删除(SEQ ID NOs：79和86)或插入(SEQ ID NOs：89和91)而使其氨基酸骨架有所区别。在类似序列的这两个系列之间的差异并不会影响包含于此些序列中的Th表位的功能。因此，功能免疫Th类似物包括衍生自麻疹病毒融合蛋白MvF1-4Ths(SEQ ID NOs：79、86、87和89)和衍生自肝炎表面蛋白质HBsAg 1-3Ths(SEQ ID NOs：88、90和92)的Th表位的多种版本。
组合物
本发明还提供包含本发明的IL-6免疫原肽构建体的组合物。
a.肽组合物
包含本发明的IL-6肽免疫原构建体的组合物可为液体或固体/冻干形式。液体组合物可包括不改变IL-6肽免疫原构建体的结构或功能特性的水、缓冲液、溶剂、盐及/或任何其他可接受的试剂。肽组合物可含有一种或多种本发明的IL-6肽免疫原构建体。
b.医药组合物
本发明还涉及包含本发明的IL-6肽免疫原构建体的医药组合物。
医药组合物可含有药学上可接受的递送系统中的载体及/或其他添加剂。因此，医药组合物可含有IL-6肽免疫原构建体的药学上有效剂量以及药学上可接受的载体、佐剂及/或其它赋形剂(例如稀释剂、添加剂、稳定剂、防腐剂、助溶剂、缓冲剂等)。
医药组合物可含有一种或多种佐剂，其作用是加速、延长或增强针对IL-6肽免疫原构建体的免疫反应，而本身不具有任何特异性抗原作用。医药组合物中使用的佐剂可包括油、油乳液、铝盐、钙盐、免疫刺激复合物、细菌和病毒衍生物、仿病毒颗粒(virosomes)、碳水化合物、细胞因子、聚合物微粒。在某些实施例中，佐剂可选自明矾(磷酸铝钾)、磷酸铝(例如
Figure BDA0003136164750000221
)、氢氧化铝(例如
Figure BDA0003136164750000222
)、磷酸钙、弗氏不完全佐剂(IFA)、弗氏完全佐剂、MF59、佐剂65、Lipovant、ISCOM、liposyn、皂苷、角鲨烯、L121、
Figure BDA0003136164750000223
单磷酸脂质A(MPL)、Quil A、QS21、
Figure BDA0003136164750000224
ISA 35、ISA 50V、ISA 50V2、ISA 51、ISA 206、ISA 720、脂质体、磷脂质、肽聚糖、脂多醣(LPS)、AS01、AS02、AS03、AS04、AF03、亲脂性磷脂质(脂质A)、γ菊糖、藻类菊粉(algammulin)、葡聚糖、右旋糖酐、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、果聚醣、木聚糖、双十八烷基二甲基溴化铵(DDA)，以及其他佐剂和乳化剂。
在一些实施例中，医药组合物含有MONTANIDETM ISA 51(由植物油和二缩甘露醇油酸酯所组成的油质佐剂组合物，用以制造油包水乳液)、
Figure BDA0003136164750000225
80(也称为聚山梨醇酯80或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯)、CpG寡核苷酸及/或其任意组合。在其他实施例中，医药组合物是以EmulsIL-6n或EmulsIL-6n D作为佐剂的水包油包水(即w/o/w)乳液。
医药组合物还可包括药学上可接受的添加剂或赋形剂。例如，医药组合物可含有抗氧化剂、黏结剂、缓冲剂、增积剂、载剂、螫合剂、着色剂、稀释剂、崩散剂、乳化剂、填充剂、胶化剂、pH缓冲剂、防腐剂、助溶剂、稳定剂等。
医药组合物可配制成立即释放或缓续释放剂型。另外，可配制医药组合物用于通过免疫原包封和与微粒共同施用以诱导系统性或局部性黏膜免疫。所属技术领域中具有常规知识者很容易判定此种递送系统。
医药组合物可以以液体溶液或悬浮液型式配制成注射剂。含有IL-6肽免疫原构建体的液体载体也可在注射前制备。医药组合物可利用任何适合的用法施用，例如i.d.、i.v.、i.p.、i.m.、鼻内、口服、皮下等，并且可在任何适合的递送装置中施用。在某些实施例中，可配制医药组合物供静脉内、皮下、皮内或肌内施用。也可制备适用于其它给药方式的医药组合物，包括口服和鼻内应用。
医药组合物也可以适合的剂量单位形式配制。在一些实施例中，医药组合物含有每公斤体重约0.1μg至约1mg的IL-6肽免疫原构建体。医药组合物的有效剂量取决于许多不同的因素，包括施用方式、靶点、患者的生理状态、患者是人类或动物、施用的其它药物，以及处理是供预防还是治疗。通常，患者是人类，但也可治疗包括基因转殖哺乳类动物的非人类哺乳类动物。当以多剂量递送时，医药组合物可以方便地分成每个剂量单位形式的适当量。如治疗领域众所周知的，施用的剂量取决于受试者的年龄、体重和一般健康状况。
在一些实施例中，医药组合物含有一种以上的IL-6肽免疫原构建体。含有一种以上IL-6肽免疫原构建体的混合物的医药组合物允许协同性增强构建体的免疫功效。含有一种以上IL-6肽免疫原构建体的医药组合物可在更大的遗传群体中更为有效，这是由于广泛的第2类MHC覆盖，因此提供针对IL-6肽免疫原构建体的经改善的免疫反应。
在一些实施例中，医药组合物含有选自SEQ ID NOs：107-215(表3)的IL-6肽免疫原构建体，以及同源物、类似物及/或其组合。
在某些实施例中，将具有组合形式的衍生自MVF和HBsAg的异源性Th表位(SEQ IDNOs：87-90)的IL一6肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：170-172)以等摩尔比率混合，用于制剂中，以允许对具有不同遗传背景的宿主群体最大覆盖。在本发明肽组合物中观察到在IL-673-83免疫原构建体(SEQ ID NOs：170、172)中的协同性增强。
此外，IL-6肽免疫原构建体(例如具有SEQ ID NO：91的
Figure BDA0003136164750000231
1)所引发的抗体反应大部分(＞90％)是集中在针对IL-6的B细胞表位肽(SEQ ID NO：5)的所所需的交叉反应性，没有太多，如果有的话，则是针对用于免疫原性增强的异源性Th表位(实施例6，表8)。此与用于此种IL-6肽抗原性增强的常规蛋白(例如KLH)或其他生物蛋白载体形成鲜明对比。
在其他实施例中，包含肽组合物的医药组合物，例如IL-6肽免疫原构建体混合物与作为佐剂的矿物盐(包括明矾凝胶(ALHYDROGEL)或磷酸铝(ADJUPHOS))接触形成悬浮液剂型，用以施用宿主。
含有IL-6肽免疫原构建体的医药组合物可用于施用后在宿主中引发免疫反应并产生抗体。
c.免疫刺激复合物
本发明也涉及含有与CpG寡核苷酸形成免疫刺激复合物的IL-6肽免疫原构建体的医药组合物。此种免疫刺激复合物特别适合作为佐剂和肽免疫原稳定剂。免疫刺激复合物呈微粒形式，其可有效地将IL-6肽免疫原呈现给免疫系统的细胞以产生免疫反应。免疫刺激复合物可配制成用于肠胃外施用的悬浮液。免疫刺激复合物还可配制成油包水(w/o)乳液形式，作为与矿物盐或原位凝胶聚合物结合的悬浮液，用于在肠胃外施用后将IL-6肽免疫原构建体有效递送至宿主免疫系统的细胞。
稳定化的免疫刺激复合物可通过静电结合将IL-6肽免疫原构建体与阴离子型分子、寡核苷酸、多核苷酸或其组合复合而形成。稳定化的免疫刺激复合物可作为免疫原递送系统并入医药组合物中。
在某些实施例中，将IL-6肽免疫原构建体设计成包含阳离子部份，其于范围为5.0至8.0的pH下带有正电荷。IL-6肽免疫原构建体或构建体的混合物的阳离子部份的净电荷计算是依据，每个赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)带有+1电荷，每个天门冬氨酸(D)或谷氨酸(E)带有-1电荷，以及序列中其他氨基酸所带的电荷为0。将在IL-6肽免疫原构建体的阳离子部份中的电荷相加，并表示为净平均电荷。适合的肽免疫原具有净平均正电荷为+1的阳离子部份。较佳地，肽免疫原具有范围大于+2的净正电荷。在一些实施例中，IL-6肽免疫原构建体的阳离子部份为异源性间隔子。在某些实施例中，当间隔子序列为(α，ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：77)时，IL-6肽免疫原构建体的阳离子部份具有+4的电荷。
如本文所述的“阴离子型分子”是指在范围为5.0至8.0的pH下带有负电荷的任何分子。在某些实施例中，阴离子型分子是寡聚合物或聚合物。寡聚合物或聚合物上的净负电荷计算是依据，在寡聚合物中的每个磷酸二酯或硫代磷酸酯基团带有-1电荷。适合的阴离子型寡核苷酸是具有8至64个核苷酸碱基的单链DNA分子，CpG基序的重复数在1至10的范围内。较佳地，CpG免疫刺激性单链DNA分子含有18至48个核苷酸碱基，CpG基序的重复数在3至8的范围内。
更佳地，阴离子型寡核苷酸可以分子式5’X1CGX23’表示，其中C和G是未甲基化的；且X1是选自由A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)和T(胸腺嘧啶)组成的组；且X2是C(胞嘧啶)或T(胸腺嘧啶)。或者，阴离子型寡核苷酸可以分子式5’(X3)2CG(X4)23’表示，其中C和G是未甲基化的；且X3是选自由A、T或G组成的组；且X4是C或T。在具体实施例中，CpG寡核苷酸具有以下序列：CpG1：5’TCgTCg TTT TgTCgT TTT gTCgTTTTgTCg TT 3’(完全硫代磷酸化)(SEQ ID NO：232)、CpG2：5’磷酸TCgTCg TTT TgTCgT TTT gTCgTT 3’(完全硫代磷酸化)(SEQ ID NO：233)或CpG3：5’TCgTCg TTT TgTCgT TTT gTCgTT 3’(完全硫代磷酸化)(SEQ ID NO：234)。
所得到的免疫刺激复合物呈颗粒形式，其大小通常在1-50微米的范围内，且是许多因素(包括交互作用成份的相对电荷化学计量和分子量)的函数。微粒免疫刺激复合物具有提供佐剂化和体内特异性免疫反应的向上调节的优点。此外，稳定化的免疫刺激复合物适用于通过各种方法(包括油包水乳液、矿物盐悬浮液和聚合凝胶)制备医药组合物。
本发明也涉及用于预防及/或治疗受IL-6失调影响的疾病的医药组合物，包含制剂。在一些实施例中，医药组合物包含稳定化的免疫刺激复合物，其是藉由混合CpG寡聚合物和包含IL-6肽免疫原构建体(例如SEQ ID NOs：107-215)的混合物的肽组合物以通过静电结合所形成，以进一步增强IL-6肽免疫原构建体的免疫原性，并引发与SEQ ID NOs：1-4的IL-6蛋白交叉反应的抗体，此抗体针对IL-6R结合区域(实施例6)。
在又一实施例中，医药组合物含有IL-6肽免疫原构建体的混合物(例如SEQ IDNOs：107-215的任意组合)，其与CpG寡聚合物形成稳定化的免疫刺激复合物，较佳地，将免疫刺激复合物与具有高安全系数的作为佐剂的矿物盐(包括明矾凝胶(ALHYDROGEL)或磷酸铝(ADJUPHOS))混合，以形成用以施用给宿主的悬浮液剂型。
抗体
本发明还提供利用本发明的IL-6肽免疫原构建体所引发的抗体。
本发明提供IL-6肽免疫原构建体及其制剂，其于制造中具有成本效益，其最佳设计可引发靶向IL-6分子上的IL-6R结合区域的高效价抗体，其于接受免疫的宿主中能够以高反应率破坏针对自身蛋白IL-6的免疫耐受性。利用IL-6肽免疫原构建体产生的抗体对IL-6R结合区域具有高亲和力。
在一些实施例中，用于引发抗体的IL-6肽免疫原构建体包含IL-6肽的杂合，此杂合具有B细胞表位(B细胞表位含有约7至约42个氨基酸，涵盖具有任选包含衍生自位于IL-6内的IL-6肽C73-C83(SSEQ ID NO：5)或C44-C50(SEQ ID NO：15)的分子内环状结构的IL-6Rα和IL-6Rβ结合区域(参见表1、图1，以及SEQ ID NOs：1和227))，B细胞表位通过任选的间隔子连接至衍生自病原体蛋白质的异源性Th表位(例如衍生自麻疹病毒融合(MVF)蛋白和其他蛋白质(SEQ ID NOs：78-106和216-226))。IL-6肽免疫原构建体的B细胞表位和Th表位共同作用以刺激与IL-6蛋白质(SEQ ID NO：1)的IL-6R结合区域交叉反应的高度特异性抗体的产生。
用以使肽免疫原性增强的传统方法，例如通过化学偶联载体蛋白(例如钥孔血蓝蛋白(KLH)或其他载体蛋白(例如白喉类毒素(DT)和破伤风类毒素(TT)蛋白))，通常导致产生大量针对载体蛋白的抗体。因此，此种肽-载体蛋白组合物的主要缺陷在于利用此种免疫原所产生的大部分(＞90％)抗体是可导致表位抑制的针对载体蛋白KLH、DT或TT的非功能性抗体。
有别于用以使肽免疫原性增强的传统方法，利用本发明的IL-6肽免疫原构建体(例如SEQ ID NO：142)所产生的抗体可以高特异性结合至IL-6B细胞表位肽(例如SEQ IDNOs：5-19)，没有太多，如果有的话，抗体则是针对异源性Th表位(例如表8的SEQ ID NO：91)或任选的异源性间隔子。具体而言，在接受免疫的动物中所引发的多克隆抗体可以高特异性结合至中央IL-6R结合区域(SEQ ID NO：107)，其经由顺式信号转导(cis-signaling)导致抑制IL-6和IL-6R交互作用，如第5A图所示。
方法
本发明也涉及用以制备和使用IL-6肽免疫原构建体、组合物和医药组合物的方法。
a.IL-6肽免疫原构建体的制造方法
本发明的IL-6肽免疫原构建体可利用普通技术人员所熟知的化学合成方法加以制备(参见例如Fields et al.，Chapter 3in Synthetic Peptides：A User’s Guide，ed.Grant，W.H.Freeman&Co.，New York，NY，1992，p.77)。IL-6肽免疫原构建体可利用自动化美利弗德(Merrifield)固相合成法来合成，利用侧链受保护的氨基酸，以t-Boc或F-moc化学保护d-NH2，在例如应用生物系统肽合成仪430A或431型(Applied BiosystemsPeptide Synthesizer Model 430A或431)上进行。包含Th表位的组合数据库肽的IL-6肽免疫原构建体的制备可通过提供用于在给定可变位置进行偶联的替代性氨基酸的混合物而达成。
在所需的的IL-6肽免疫原构建体组装完成后，依照标准程序处理树脂，将肽从树脂上切下，并将氨基酸侧链上的官能基切除。可利用HPLC纯化游离的肽，并利用例如氨基酸分析或定序以描述生化特性。肽的纯化和表征方法是本发明所属技术领域中具有通常知识者所熟知的。
可以控制和确定通过此化学过程所产生的肽的质量，且结果是疫原构建体的再现性、免疫原性和产量可以获得保证。通过固相肽合成的IL-6肽免疫原构建体的制造的详细描述显示于实施例1中。
已经发现允许保留所需的免疫活性的构建体变异范围比起允许保留小分子药物特定药物活性或与生物来源药品共同产生的大分子中存在所需的活性及非所需的毒性的构建体变异范围更具包容性。
因此，与所需的肽具有相似的色层分析和免疫学特性的肽类似物，不论是刻意设计或因合成过程错误而无法避免地作为删除序列副产物的混合物产生的，其通常如经纯化的所需的肽制剂具有相同的效果。只要建立严格的QC程序，以监控制造过程与产品评估过程，确保使用这些肽的终产物的再现性与功效，则经设计的类似物与非预期的类似物的混合物也是有效的。
也可利用包括核酸分子、载体及/或宿主细胞的重组DNA技术来制备IL-6肽免疫原构建体。因此，编码IL-6肽免疫原构建体及其免疫功能性类似物的核酸分子也包括在本发明中作为本发明的一部分。类似地，包含核酸分子的载体(包括表达载体)以及含有载体的宿主细胞也包括在本发明中作为本发明的一部分。
各种示例性实施例也包括制造IL-6肽免疫原构建体及其免疫功能性类似物的方法。例如，方法可包括在表达肽及/或类似物的条件下培养宿主细胞的步骤，宿主细胞包含含有编码IL-6肽免疫原构建体及/或其免疫功能性类似物的核酸分子的表达载体。较长的合成肽免疫原可利用公知的重组DNA技术来合成。这些技术可于具有详细实验计划的众所周知的标准手册中加以提供。为了构建编码本发明肽的基因，将氨基酸序列反向转译以获得编码氨基酸序列的核酸序列，较佳地利用对于其中具有待表达基因的生物体来说最适合的密码子。接下来，通常通过合成编码肽和任何调节因子(如有必要的话)的寡核苷酸以制造合成基因。将合成基因插入适合的选殖载体内并转染到宿主细胞中。然后在适合所选表达系统和宿主的合适条件下表达肽。利用标准方法纯化肽并描述其特性。
b.免疫刺激复合物的制造方法
各种示例性实施例还包括制造包含IL-6肽免疫原构建体和CpG寡脱氧核苷酸(0DN)分子的免疫刺激复合物的方法。稳定化的免疫刺激复合物(ISC)衍生自IL-6肽免疫原构建体的阳离子部份和聚阴离子CpG ODN分子。自行组合系统是由电荷的静电中和所驱动。IL-6肽免疫原构建体的阳离子部分对阴离子寡聚合物的摩尔电荷比的化学计量决定缔合的程度。IL-6肽免疫原构建体和CpG ODN的非共价静电结合是完全可再现的过程。此肽/CpGODN免疫刺激复合物聚集体有助于呈现至免疫系统中″专业的”抗原呈现细胞(APC)，因此可进一步增强复合物的免疫原性。在制造过程中，可容易地描绘这些复合物的特征以控制质量。肽/CpG ISC在体内具有良好的耐受性。设计这种包含CpG ODN和IL-6肽免疫原构建体的新颖微粒系统，以利用与CpG ODN使用相关的广义B细胞促有丝分裂(mitogenicity)，但促进平衡的Th-1/Th-2型反应。
在本发明的医药组合物中的CpG ODN在由相反电荷静电中和所介导的过程中100％结合至免疫原，导致微米大小的微粒的形成。微粒形式允许来自CpG佐剂常规使用的CpG剂量的显著减少，不利的先天性免疫反应的可能性更低，且促进包括抗原呈现细胞(APC)在内的替代性免疫原处理途径。因此，此种剂型在概念上是新颖的，且通过替代的机制促进免疫反应的刺激而提供潜在的优点。
c.医药组合物的制造方法
各种示例性实施例还包括含有IL-6肽免疫原构建体的医药组合物。在某些实施例中，医药组合物是利用油包水乳液和具有矿物盐的悬浮液的剂型。
为了使医药组合物可被广大群体所使用，安全性成为另一个需要考虑的重要因素。尽管在许多临床试验中都使用了油包水乳液，但基于其安全性，明矾仍然是制剂中使用的主要佐剂。因此，明矾或其矿物盐磷酸铝(ADJUPHOS)经常作为制剂中的佐剂供临床应用。
其他佐剂和免疫刺激剂包括3De-O-acylated monophosphoryl lipid A(MPL)或3-DMP、聚合或单体氨基酸，例如聚谷氨酸或聚赖氨酸。此种佐剂可以与或不与其他特定的免疫刺激剂一起使用，免疫刺激剂例如胞壁酰肽(muramyl peptides)(例如N-acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamine(thr-MDP)、N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine(nor-MDP)、N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2-(1′-2′dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamine(MTP-PE)、N-acetylglucsaminyl-N-acetylmuramyl-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxypropylamide(DTP-DPP)THERAMIDETM)，或其他细菌细胞壁成份。水包油乳液包含MF59(参见Van Nest等人的专利申请案WO 90/14837，其通过引用整体并入本文)，包含5％角鲨烯、0.5％TWEEN 80，以及0.5％Span 85(任选含有不同量的MTP-PE)，利用微射流机配制成次微米颗粒；SAF，包含10％角鲨烯、0.4％TWEEN 80、5％pluronic-嵌段共聚合物L121，以及thr-MDP，利用微射流化形成次微米乳液或利用漩涡震荡以产生大颗粒乳液；以及RIBITM佐剂系统(RAS)(Ribi ImmunoChem，Hamilton，Mont.)，其包含2％角鲨烯、0.2％TWEEN 80，以及一种或多种的细菌细胞壁成份，细菌细胞壁成份选自由monophosphoryl lipid A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)以及细胞壁骨架(CWS)组成的组，较佳为MPL+CWS(DetoxTM)。其他佐剂包含弗氏完全佐剂(CFA)、弗氏不完全佐剂(IFA)，以及细胞因子(例如介白素(IL-1、IL-2和IL-12)、巨噬细胞群落刺激因子(M-CSF)，以及肿瘤坏死因子(TNF-α))。
佐剂的选择取决于含有佐剂的免疫原制剂的稳定性、给药途径、给药计划、佐剂对接受免疫的物种的功效，且在人类，药学上可接受的佐剂是指已经被相关监管机构批准或可批准用于人类给药的佐剂。例如单独明矾、MPL或弗氏不完全佐剂(Chang，et al.，1998)，其通过引用整体并入本文)或其任选地所有组合适于人类施用。
组合物可包括药学上可接受的无毒载体或稀释剂，其被定义为通常用于配制供动物或人类给药的医药组合物的载体。选择稀释剂以免影响组合物的生物活性。此种稀释剂的范例是蒸馏水、生理磷酸缓冲盐水、林格氏液、葡萄糖溶液和汉克溶液。此外，医药组合物或剂型还可包含其他载体、佐剂或无毒的，非治疗性的，非免疫原性的稳定剂等。
医药组合物还可包括大的缓慢代谢的大分子(例如蛋白质、多醣类(例如甲壳素)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚合物(例如胶乳功能化琼脂糖(latex functionalizedsepharose)、琼脂糖(agarose)、纤维素等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物，以及脂质聚集体(例如油滴或脂质体)。另外，这些载体可作为免疫刺激剂(即佐剂)。
本发明的医药组合物可进一步包含合适的递送载体。合适的递送载体包括但不限于，病毒、细菌、可生物降解的微球体、微粒、纳米粒子、脂质体、胶原蛋白微球和螺旋体(cochleates)。
d.医药组合物的使用方法
本发明也包括使用包含IL-6肽免疫原构建体的医药组合物的方法。
在某些实施例中，包含IL-6肽免疫原构建体的医药组合物可用于治疗受IL-6失调影响的疾病。
在一些实施例中，方法包含施用包含IL-6肽免疫原构建体的药学上有效剂量的医药组合物给有其需要的宿主。在某些实施例中，方法包含施用包含IL-6肽免疫原构建体的药学上有效剂量的医药组合物给温血动物(例如人类、食蟹猕猴、小鼠)，以引发可与人类IL-6蛋白(SEQ ID NO：1)或来自其他物种的IL-6蛋白(SEQ ID NOs：2-4)交叉反应的高特异性抗体。
在某些实施例中，含有IL-6肽免疫原构建体的医药组合物可用于治疗由IL-6调控的功能障碍所影响的疾病，如在体外分析和体内疾病模型所示。
e.体外功能分析和体内概念验证研究
由IL-6肽免疫原构建体在接受免疫的宿主中所引发的抗体可用于体外功能分析。这些功能分析包括但不限于：
(1)对作为重组蛋白的IL-6蛋白(SEQ ID NO：1)的体外结合；
(2)对IL-6与IL-6Rd顺式结合的体外抑制作用；
(3)对IL-6/IL-6Rα与IL-6Rβ反式结合的体外抑制作用(实施例3)；
(4)对IL-6诱导的TF-1增生的体外抑制作用(实施例3和7)；
(5)对IL-6诱导的STAT3磷酸化的体外抑制作用(实施例3和7)；
(6)于人类U937细胞中对IL-6诱导的MCP-1产生的体外抑制作用(实施例3和7)；
(7)对大鼠胶原蛋白诱发关节炎(CIA)模型的体内抑制作用；
(8)对大鼠嗜中性粒细胞从骨髓向循环系统释放的体内抑制/减弱作用；
(9)如同大鼠关节炎评分所示的关节炎症状的体内抑制作用，关节炎评分是测定：
(i)发炎诱导的肝脏分泌蛋白；
(ii)踝关节破坏；
(iii)组织TNF-α、IL-17和MCP的产生；
(iv)体重减轻逆转；
(v)后爪肿胀；
(vi)嗜中性粒细胞增多症减轻；
(vii)血小板释出减少。
具体实施例
(1)一种具有约30个或更多个氨基酸的IL-6肽免疫原构建体，其由以下分子式表示：
(Th)m-(A)n-(IL-6的IL-6R结合区域或其片段)-X
或
(IL-6的IL-6R结合区域或其片段)-(A)n-(Th)m-X
或
(Th)m-(A)n-(IL-6的IL-6R结合区域或其片段)-(A)n-(Th)m-X
其中
Th为异源性T辅助细胞表位；
A为异源性间隔子；
(IL-6的IL-6R结合区域或其片段)为B细胞表位肽，其具有来自IL-6(SEQ ID NO：1)的IL-6R结合区域的约7至约42个氨基酸残基；
X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
m为1至约4；以及
n为0至约10。
(2)如(1)所述的IL-6肽免疫原构建体，其中IL-6R结合区域或其片段是选自由SEQID NOs：5-19组成的组。
(3)如(1)或(2)任一所述的IL-6肽免疫原构建体，其中异源性T辅助细胞表位是选自由SEQ ID NOs：78-106和216-226组成的组。
(4)如(1)所述的IL-6肽免疫原构建体，其中肽免疫原构建体是选自由SEQ IDNOs：107-215组成的组。
(5)一种IL-6肽免疫原构建体，其包含：
a.B细胞表位，其包含来自SEQ ID NOs：1至4的IL-6序列的约7至约42个氨基酸残基；
b.T辅助细胞表位，其包含选自由SEQ ID NOs：78-106、216-226及其任意组合组成的组的氨基酸序列；以及
c.任选的异源性间隔子，其选自由氨基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α，ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：77)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO：231)和Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO：76)及其任意组合组成的组，
其中B细胞表位是直接地或通过任选的异源性间隔子共价地连接至T辅助细胞表位。
(6)如(5)所述的IL-6肽免疫原构建体，其中B细胞表位是选自由SEQ ID NOs：5至19组成的组。
(7)如(5)所述的IL-6肽免疫原构建体，其中T辅助细胞表位是选自由SEQ ID NOs：78-106组成的组。
(8)如(5)所述的IL-6肽免疫原构建体，其中任选的异源性间隔子为(α，ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：77)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO：231)或Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO：76)，在此Xaa为任意氨基酸，且以天门冬氨酸为较佳。
(9)如(5)所述的IL-6肽免疫原构建体，其中T辅助细胞表位是共价地连接至B细胞表位的氨基端。
(10)如(5)所述的IL-6肽免疫原构建体，其中T辅助细胞表位是通过任选的异源性间隔子共价地连接至B细胞表位的氨基端。
(11)一种包含如(1)所述的IL-6肽免疫原构建体的组合物。
(12)一种医药组合物，其包含：
a.如(1)所述的肽免疫原构建体；以及
b.药学上可接受的递送载体及/或佐剂。
(13)如(12)所述的医药组合物，其中
a.IL-6R结合区域或其片段是选自由SEQ ID NOs：5-19组成的组；
b.异源性T辅助细胞表位是选自由SEQ ID NOs：78-106和216-226组成的组；以及
c.异源性间隔子是选自由氨基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α，ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：77)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO：231)和Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO：76)，及其任意组合组成的组；以及
其中IL-6肽免疫原构建体与CpG寡脱氧核苷酸(ODN)混合以形成稳定化的免疫刺激复合物。.
(14)如(12)所述的医药组合物，其中
a.IL-6肽免疫原构建体是选自由SEQ ID NOs：107-215组成的组；以及
其中IL-6肽免疫原构建体与CpG寡脱氧核苷酸(ODN)混合以形成稳定化的免疫刺激复合物。
(15)一种于动物中用以产生针对IL-6的抗体的方法，其包含将如(12)所述的医药组合物施用给动物。
(16)一种分离的抗体或其表位结合片段，其专一性地结合至位于如(1)所述的IL-6肽免疫原构建体中的IL-6的IL-6R结合区域或其片段。
(17)如(16)所述的分离的抗体或其表位结合片段，其结合至IL-6肽免疫原构建体。
一种分离的抗体或其表位结合片段，其专一性地结合至如(1)至(10)任一所述的IL-6肽免疫原构建体的B细胞表位肽。
(18)一种组合物，其包含如(16)所述的分离的抗体或其表位结合片段。
(19)一种于动物中用以预防及/或治疗受IL-6失调影响的疾病的方法，其包含将如(12)所述的医药组合物施用动物。
实施例1.IL-6相关肽的合成及其制剂的制备
a.IL-6相关肽的合成
描述了包含在IL-6肽免疫原构建体开发工作中用以合成IL-6相关肽的方法。以小规模量合成的肽用于血清学分析、实验室试验和田间试验，大规模(千克)量合成的肽则用于医药组合物的工业/商业生产。为了表位作图，以及为了筛选和选择用于有效靶向IL-6的医药组合物中的最佳肽免疫原构建体，设计了具有长度为约7至70个氨基酸的序列的大量IL-6相关抗原性肽。
人类、小鼠、大鼠和猕猴物种的代表性全长IL-6(SEQ ID NOs：1-4)、IL-6肽片段，以及在各种血清学分析中供表位作图使用的10-mer肽(SEQ ID NOs：5-75)，列于表1中。
将选择的IL-6B细胞表位肽通过合成方法连接至衍生自病原体蛋白(包括麻疹病毒融合蛋白(MVF)、B型肝炎表面抗原蛋白(HBsAg)、肽流行性感冒病毒、破伤风梭菌，以及Epstein-Barr病毒(EBV))的经周密设计的T辅助细胞(Th)表位肽(如表2所示(SEQ ID NOs：78-106和216-226))，以制成IL-6肽免疫原构建体。Th表位肽是以单一序列(SEQ ID NOs：78-86和91-106)或组合数据库(SEQ ID NOs：87-90)形式使用，以增强其各自IL-6肽免疫原构建体的免疫原性。
表3(SEQ ID NOs：107-215)中鉴定了选自数百种肽构建体的代表性IL-6肽免疫原构建体。
用于供抗IL-6抗体检测及/或测量的免疫原性研究或相关血清学测试的所有肽是在应用生物系统肽合成仪430A、431及/或433型上利用F-moc化学小规模合成。每一个肽是通过在固相载体上的独立合成所制备，在三官能基氨基酸的氨基端与侧链保护基团具有F-moc保护。将完整的肽从固相载体上切下，并用90％三氟乙酸(TFA)移除侧链保护基团。利用基质辅助雷射脱附游离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪评估合成的肽产物以确定正确的氨基酸组成。也利用反相HPLC(RP-HPLC)评估各个合成肽以确认产物的合成样态与浓度。尽管严格控制合成过程(包括逐步地监测偶合效率)，由于在延长循环中某些意外事件，包括氨基酸的插入、删除、取代及提前终止，仍可能产生肽类似物。因此，合成产物一般包括多种肽类似物与目标肽。
尽管包括这些非预期的肽类似物，但最后的合成肽产物仍可用作免疫应用，包括免疫诊断(作为抗体捕捉抗原)与医药组合物(作为肽免疫原)。一般来说，只要开发一严格的QC程序来监测制造过程及产品质量评估程序，以确保使用这些肽的最终产物的再现性与功效，此肽类似物，包括刻意设计或合成程序中产生的副产物混合物，通常可如所需的肽的纯化产物同样有效。可利用客制的自动肽合成仪UBI2003或类似机型以15mmole至150mmole的规模合成数百至数千克的大量肽。
对于供临床试验的最终医药组合物使用的活性成分，可利用预备的RP-HPLC于浅洗脱梯度下纯化IL-6相关肽免疫原构建体，并利用MALDI-TOF质谱、氨基酸分析和RP-HPLC描绘纯度与一致性的特性。
b.含有IL-6肽免疫原构建体的组合物的制备
制备采用油包水乳液和具有矿物盐的悬浮液的剂型。为了设计医药组合物供广大族群使用，安全性成为另一个需要考虑的重要因素。尽管在人类许多医药组合物的临床试验中使用油包水乳液，但基于其安全性，明矾仍然是用于医药组合物中的主要佐剂。因此，明矾或其矿物盐ADJUPHOS(磷酸铝)经常作为佐剂供临床应用制剂的使用。
简而言的，在以下描述的每个实验组中所指定的剂型通常包含所有类型专门设计的IL-6肽免疫原构建体。利用代表免疫原B细胞表位肽的相对应IL-6肽，针对其相对免疫原性，于天竺鼠中仔细评估超过200种专门设计的IL-6肽免疫原构建体。利用涂覆选自SEQ IDNOs：1-75的肽的孔盘以ELISA试验在各种同源性肽中分析表位作图和血清学交叉反应。
如指定，利用经核准供人类使用的油剂Seppic MONTANIDETM ISA 51以油包水乳液形式，或与矿物盐ADJUPHOS(磷酸铝)或ALHYDROGEL(明矾)混合，以配制不同量的IL-6肽免疫原构建体。通常利用将IL-6肽免疫原构建体以约20至800μg/mL浓度溶解于水中，并与MONTANIDETM ISA 51配制成油包水乳液(1：1体积)，或者与矿物盐ADJUPHOS或ALHYDROGEL(明矾)(1：1体积)配制，以制成组合物。将组合物置于室温下约30分钟，并在免疫接种前利用漩涡震荡混合约10至15秒。利用2至3个剂量的特定组合物免疫接种动物，其在时间0(初次免疫)和初次免疫后(wpi)3周(加强免疫)施用，任选5或6wpi进行第二次加强免疫，通过肌内途径投药。然后利用选定的B细胞表位肽测试来自接受免疫接种的动物的血清，以评估存在于剂型中的各种IL-6肽免疫原构建体的免疫原性，以及相对应血清与IL-6蛋白的交叉反应性。针对其相对应血清的功能特性，将最初在天竺鼠筛选中发现的那些具有强免疫原性的IL-6肽免疫原构建体在体外实验中做进一步测试。然后，以油包水乳液、矿物盐和基于明矾的配方制备所选的候选IL-6肽免疫原构建体按照免疫方案在指定的特定期间内进行给药方案。
在试验用新药申请的后于受IL-6失调影响的疾病患者进行临床试验的提交准备中，只有最有希望的IL-6肽免疫原构建体会在被纳入供于GLP指导的临床前研究中针对免疫原性、持续时间、毒性和功效研究的最终剂型的前会进行进一步广泛的评估。
以下实施例是用于说明本发明，且不用以限制本发明的范围。
实施例2.血清学试验和试剂
以下详细描述用以评估IL-6肽免疫原构建体及其制剂的功能性免疫原性的血清学试验和试剂。
a.抗体特异性分析的基于IL-6或IL-6肽片段的ELISA试验
开发并于下文描述于以下实施例中所述用以评估免疫血清样品的ELISA试验。利用配制于pH 9.5的10mM碳酸氢钠缓冲液(除非另有说明)中浓度为2μg/mL(除非另有说明)的IL-6或IL-6片段肽(SEQ ID NOs：1至20、72至75)，将其以100μL体积于37℃下作用1小时，以分别地涂覆96孔盘的孔。
将以IL-6或IL-6片段肽涂覆的孔与250μL配制于PBS中浓度为3重量百分比的明胶于37℃下反应1小时，以阻断非特异性蛋白质结合位点，接着利用含有0.05体积百分比
Figure BDA0003136164750000341
20的PBS洗涤孔三次并干燥。利用含有20体积百分比正常山羊血清、1重量百分比明胶和0.05体积百分比
Figure BDA0003136164750000342
20的PBS以1：20比例(除非另有说明)稀释待测血清。将100μL稀释样品(例如血清、血浆)加入每个孔并于37℃下反应60分钟。然后利用配制于PBS中浓度为0.05体积百分比的
Figure BDA0003136164750000343
20洗涤孔6次，以移除未结合的抗体。使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合物种(例如天竺鼠或大鼠)特异性山羊多克隆抗IgG抗体或蛋白质A/G作为标记的示踪剂，以在阳性孔中与形成的抗体/肽抗原复合物结合。将100微升HRP标记的检测试剂以预滴定的最佳稀释倍数配制于内含1体积百分比正常山羊血清与0.05体积百分比
Figure BDA0003136164750000351
20的PBS中，将其加到每个孔中，并在37℃下再反应30分钟。利用内含0.05体积百分比
Figure BDA0003136164750000352
20的PBS洗涤孔6次以移除未结合的抗体，并与100μL包含0.04重量百分比3’，3’，5’，5’-四甲基联苯胺(TMB)和0.12体积百分比过氧化氢于柠檬酸钠缓冲液中的底物混合物再反应15分钟。藉由形成有色产物利用底物混合物以检测过氧化物酶标记。藉由加入100μL的1.0M硫酸终止反应并测定450nm处的吸光值(A450)。为了测定接受各种肽制剂的免疫接种动物的抗体效价，将从1：100至1：10，000的10倍连续稀释的血清或从1：100至1：4.19x 108的4倍连续稀释的血清进行测试，且利用A450临界值设为0.5的A480的线性回归分析计算测试血清的效价，以Log10表示。
b.利用基于Th肽的ELISA试验评估针对Th肽的抗体反应性
以类似的ELISA方法并如上所述进行，利用配制于pH 9.5的10mM碳酸氢钠缓冲液(除非另有说明)中浓度为2μg/mL(除非另有说明)的100μL Th肽于37℃下作用1小时，以分别地涂覆96孔ELISA盘的孔。为了测定接受各种IL-6肽制剂的免疫接种动物的抗体效价，将从1∶100至1∶10,000的10倍连续稀释的血清进行测试，且利用A450临界值设为0.5的A450的线性回归分析计算测试血清的效价，以Log10表示。
c.通过基于B细胞表位簇10-mer肽的ELISA试验利用表位作图对目标IL-6B细胞表位肽进行精细特异性分析
利用基于B细胞表位簇10-mer肽的ELISA试验利用表位作图对来自利用IL-6肽免疫原构建体免疫接种的宿主的抗IL-6抗体进行精细特异性分析。简而言的，依照上述抗体ELISA方法的步骤，以二重复方式，利用每孔每0.1mL含有0.5μg的单个IL-6 10-mer肽(SEQID NOs：21-71)涂覆96孔盘的孔，然后将100μL血清样品(配制于PBS中，稀释倍数为1∶100)于10-mer盘中进行反应。为了特异性确认，利用相对应IL-6肽或非相关的对照肽对来自接受免疫的宿主的抗IL-6抗体进行与目标B细胞表位相关精细特异性分析。
d.免疫原性评估
依照实验程序收集来自动物或人类个体的免疫前和免疫血清样品，并在56℃下加热30分钟以使血清补体因子失活。在施用制剂后，根据程序获得血液样品，并利用基于相对应IL-6B细胞表位肽的ELISA试验评估其针对特定靶点的免疫原性。测试了连续稀释的血清，并将稀释倍数的倒数取对数(Log10)以表示阳性效价。对于其能力(引发针对目标抗原内所需的表位特异性的高效价抗体反应和与IL-6蛋白高交叉反应性，且同时将针对用以提供所需的B细胞反应增强的“T辅助细胞表位”的抗体反应性维持在低至可忽略)，而评估特定制剂的免疫原性。
e.用于评估大鼠血清中C-反应蛋白(CRP)水平的免疫分析法
使用多克隆兔抗大鼠CRP抗体(Sino Biological)作为捕获抗体，而生物素标记的兔抗大鼠CRP抗体(Assaypro LLC)作为检测抗体，通过三明治ELISA测定大鼠C-反应蛋白(CRP)水平。简而言的，将多克隆兔抗大鼠CRP抗体以50ng/孔的量配制于涂覆缓冲液(15mM碳酸钠，35mM碳酸氢钠，pH 9.6)中以固定在96孔盘上，并在4℃下隔夜反应。利用200μL/孔的测定稀释液(含1％牛血清白蛋白、0.05％TWEEN-20和0.01％液体生物防腐剂ProClin300的PBS)在室温下反应1小时以封阻涂覆的孔。利用200μL/孔的洗涤缓冲液(内含0.05％TWEEN-20和0.01％ProClin 300的PBS)洗涤微量盘3次。使用重组大鼠CRP(SinoBiological)在测定稀释液中产生标准曲线(通过2.5倍连续稀释，范围为450至1.84ng/mL)。将100μL的稀释血清(1∶30,000)和标准品加入涂覆的孔中。在室温下反应2小时。将所有孔吸干，并利用200μL/孔的洗涤缓冲液洗涤5次。将捕获的CRP与100μL的检测抗体溶液(在测定稀释液中内含100ng/ml生物素标记的兔抗大鼠CRP抗体)在室温下反应1小时。然后，使用链抗生物素蛋白(streptavidin)poly-HRP(1∶10,000稀释，Thermo FisherScientific)检测结合的生物素标记的抗体1小时(100μL/孔)。将所有孔吸干，并利用200μL/孔的洗涤缓冲液洗涤6次。最后，利用100μL/孔的NeA-Blue TMB底物(Clinical ScienceProducts)对孔进行显影，且通过加入100μL/孔的1M硫酸终止反应。通过VersaMax ELISA微孔盘读取仪(Molecular Devices)测定显影吸光值，并使用SoftMax Pro软件(MolecularDevices)产生的4-参数罗吉特曲线拟合而产出标准曲线，并用其计算在所有试验样品中的CRP浓度。使用Prism软件(GraphPad Software)利用Student t检验比较数据。
实施例3.在动物中评估利用IL-6肽免疫原构建体及其制剂所诱发的抗体的功能特性
进一步测试免疫血清或纯化的抗IL-6抗体在接受免疫的动物中的能力：(1)阻断IL-6与其受体IL-6R(IL-6α和IL-6Rβ/gp130)间的交互作用和(2)在RPMI 8226细胞中抑制IL-6诱导的STAT3磷酸化和(3)抑制IL-6依赖性TF-1细胞增生，以及(4)在U937细胞株中抑制单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)产生。
a.细胞
(1)RPMI 8226细胞株购自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，并将其置于37℃含有5％CO2的加湿培养箱内维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、4.5g/L L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中。
(2)将TF-1细胞株置于37℃含有5％C02的加湿培养箱内维持在补充有2mM谷氨酰胺、1％丙酮酸钠(NaP)和2ng/ml人类颗粒球巨噬细胞群落刺激因子(人类GM-CSF)和10％FBS以及1％青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中。
(3)将U937细胞株置于37℃含有5％C02的加湿培养箱内维持在补充有2mM谷氨酰胺、1％NaP和10％FBS以及1％青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中。
b.IL-6与IL-6Rα链的结合(顺式结合)
针对其抑制IL-6结合至IL-6Rα的相对能力，通过ELISA检查了来自先前利用不同IL-6肽免疫原构建体免疫的天竺鼠的合并免疫血清的纯化的IgG多克隆抗体。利用体积为50μL的重组His标记人类IL-6Rα(GenScript)(其以4μg/mL浓度配制于涂覆缓冲液(15mM碳酸钠，35mM碳酸氢钠，pH 9.6)中)分别地涂覆96孔盘的孔，并在4℃下隔夜反应。利用200μL/孔的测定稀释液(含1％牛血清白蛋白、0.05％TWEEN-20和0.01％ProClin 300的PBS)在室温下反应1小时以封阻涂覆的孔。利用200μL/孔的洗涤缓冲液(内含0.05％TWEEN-20和0.01％ProClin 300的PBS)洗涤微量盘3次。将100μL混合物(混合物由浓度为10ng/mL的人类IL-6(GenScript)和不同浓度的纯化的天竺鼠IgG多克隆抗体组成)在室温下预反应1小时，然后添加到涂覆的孔中。在室温下反应1小时。将所有孔吸干，并利用200μL/孔的洗涤缓冲液洗涤3次。利用100μL/孔生物素标记的兔抗IL-6抗体(1∶1,000稀释，R&D Systems)在室温下反应1小时以检测补获的IL-6。然后，使用链抗生物素蛋白poly-HRP(1∶40,000稀释，Thermo Fisher Scientific)检测结合的生物素标记的抗体1小时(100μL/孔)。将所有孔吸干，并利用200μL/孔的洗涤缓冲液洗涤3次。最后，利用100μL/孔的OptEIA TMB底物(BDBiosciences)使孔显影，且通过加入100μL/孔的1M硫酸终止反应。通过VersaMax ELISA微孔盘读取仪(Molecular Devices)测定显影吸光值，并藉由使用4-参数罗吉特曲线拟合产出反应曲线，以于Prism 6软件(GraphPad Software)中计算半数最大抑制浓度(IC50)。
c.IL-6/IL-6Rα链复合至IL-6Rβ链/gp130的结合(反式结合)
利用体积为50μL的重组人类gp130-Fc嵌合体蛋白(R&D systems)(其以300ng/mL浓度配制于涂覆缓冲液(15mM碳酸钠，35mM碳酸氢钠，pH 9.6)中)分别地涂覆96孔盘的孔，并在4℃下隔夜反应。利用200μL/孔的测定稀释液(含1％牛血清白蛋白、0.05％TWEEN-20和0.01％ProClin 300的PBS)在室温下反应1小时以封阻涂覆的孔。利用200μL/孔的洗涤缓冲液(内含0.05％TWEEN-20和0.01％ProClin 300的PBS)洗涤微量盘3次。在测定的前，通过将His标记的人类IL-6Rd(4μg/mL，GenScript)与IL-6(100ng/mL，GenScript)在室温下反应1小时，以形成sIL-6Rα/IL-6复合物(其IL-6对sIL-6Rd的摩尔比率为1∶20)。将10μL预形成的复合物溶液与不同浓度的纯化的天竺鼠IgG多克隆抗体在总体积为100μL的状况下在室温反应1小时，然后将混合物添加到gp130-Fc涂覆的孔中。在室温下反应1小时。将所有孔吸干，并利用200μL/孔的洗涤缓冲液洗涤3次。利用100μL/孔生物素标记的兔抗IL-6抗体(1∶1,000稀释，R&D Systems)在室温下反应1小时以检测补获的IL-6。然后，使用链抗生物素蛋白poly-HRP(1∶40,000稀释，Thermo Fisher Scientific)检测结合的生物素标记的抗体1小时(100μL/孔)。将所有孔吸干，并利用200μL/孔的洗涤缓冲液洗涤3次。最后，利用100μL/孔的OptEIA TMB底物(BD Biosciences)使孔显影，且通过加入100μL/孔的1M硫酸终止反应。通过VersaMax ELISA微孔盘读取仪(Molecular Devices)测定显影吸光值，并藉由使用4-参数罗吉特曲线拟合产出反应曲线，以于Prism 6软件(GraphPad Software)中计算半数最大抑制浓度(IC50)。
d.IL-6依赖性TF-1细胞增生分析
人类红细胞性白血病(erythroleukemia)TF-1细胞能够对人类IL-6反应而增生。在37℃含有5％CO2的环境中，在每个孔内总体积为100μL补充有2.5％FBS的RPMI 1640培养基中，在不同浓度的纯化的天竺鼠IgG多克隆抗体存在下，将5x 103个细胞与终浓度为10ng/mL的人类重组IL-6一起培养72小时以进行此分析。也将抗IL-6受体抗体Tocilizumab纳入作为研究对照。通过在每个孔添加40μL的CellTiterGlo试剂(Promega)，然后在室温下进行反应10分钟，以测定细胞的生长和存活。使用SpectraMax i3x多功能微量盘检测仪(Molecular Devices)测量所得的冷光，并使用4-参数罗吉特曲线拟合产出反应曲线，Prism6软件(GraphPad Software)中计算半数最大抑制浓度(IC50)。
e.IL-6诱导的STAT3磷酸化分析
没有持续地活化的STAT3磷酸化的人类骨髓瘤细胞株RPMI 8226需要暴露于IL-6才能活化STAT3。为了研究纯化的IgG是否能抑制在RPMI 8226细胞中的IL-6诱导的STAT3磷酸化，在37℃含有5％CO2的环境中，在总体积为500μL的RMPI 8226培养基中，在天竺鼠多克隆抗体(浓度为100μg/mL)存在下，将8x105个细胞与终浓度为10ng/mL的IL-6一起培养30分钟。将抗IL-6受体抗体Tocilizumab纳入作为研究对照。利用PathScan p-Stat3 ELISA试剂盒(Cell Signaling)测量磷酸化的STAT3水平。简而言的，通过将细胞悬浮在30μL的补充有1％磷酸酶抑制剂混合液3(Phosphatase Inhibitor Cocktail 3，Sigma-Aldrich)的细胞裂解缓冲液(Cell Signaling)中以制备细胞裂解物，并通过在4℃下利用12,000xg离心10分钟以移除细胞碎片。根据供货商的说明手册，使用10μg澄清的细胞裂解物来测量磷酸化的STAT3含量。通过VersaMax ELISA微孔盘读取仪(Molecular Devices)测定显影吸光值。
f.IL-6诱导的MCP-1产生
U937是前单核细胞细胞株，其可通过多种试剂而被诱导分化为成熟的巨噬细胞。IL-6可以促进单核细胞中MCP-1的产生。利用IL-6肽构建体免疫原所引发的抗IL-6抗体可调控U937细胞株中IL-6依赖性MCP-1分泌。在37℃含有5％CO2的环境中，于每个孔内总体积为100μL的U937培养基中，藉由将8x103个细胞、终浓度为10ng/mL的人类重组IL-6和不同浓度的纯化的天竺鼠IgG多克隆抗体一起培养24小时以进行此分析。也将抗IL-6受体抗体Tocilizumab纳入作为研究对照。通过将培养基以300xg离心10分钟来制备澄清的上清液，并将其储存在-30℃下。根据供货商的说明，将100μL稀释的上清液(1∶100稀释)应用于人类MCP-1定量ELISA试剂盒(Thermo Fisher)。通过VersaMax ELISA微孔盘读取仪(M0lecularDevices)测定显影吸光值，并使用SoftMax Pro软件(M0lecular Devices)产生的4-参数罗吉特曲线拟合而产出标准曲线，且用其计算在所有试验样品中的MCP-1浓度。使用4-参数罗吉特曲线拟合产出反应曲线，Prism 6软件(GraphPad Software)中计算半数最大抑制浓度(IC50)。
实施例4.用于安全性、免疫原性、毒性和功效研究的动物
天竺鼠：
在成熟，未与抗原接触或未受抗原刺激的
Figure BDA0003136164750000391
成年雄性和雌性Duncan-Hartley天竺鼠(300-350g/BW)中进行免疫原性研究。实验中每一组使用至少3只天竺鼠。在联合生物医学公司(UBI)作为试验委托者的签订合约的动物设施依照经核准的IACUC申请进行涉及Duncan-Hartley天竺鼠(8-12周龄；Covance Research Laboratories，Denver，PA，USA)的试验计划。
大鼠：
将Lewis大鼠用于胶原蛋白诱发关节炎(CIA)的诱导中。从Biolasco购买8-12周龄的雌性Lewis大鼠，且体重配对出约180g。将动物饲养在联亚生技(UBI Asia)实验室的动物设施中，并在固定温度(22℃)、湿度(72％)、12小时光照/12小时黑暗周期的条件下适应环境1周。大鼠可随意进食鼠粮和水。所有试验计划均遵循实验动物护理原则。通过皮内途径在第0天和第7天在尾巴底部施用胶原蛋白诱发注射。如试验计划所述进行采血。临床观察是使用评分系统每周评估3次，以评估在CIA鼠模型中关节炎的严重程度，直到第35天。利用ELISA分析针对抗IL-6(大鼠)检测抗体效价。评估相关的炎症生物标记(例如CRP)以及血液WBC计数的血液学检测。
实施例5.提供在天竺鼠中进行IL-6肽构建体免疫原性评估的制剂
在各个实验中使用的医药组合物和制剂如以下内容所示更加详细地描述。简而言之，在每个实验组中所指定的剂型通常含有所有类型专门设计的IL-6肽免疫原构建体，其具有IL-6B细胞表位肽片段，IL-6B细胞表位肽片段通过不同类型间隔子(例如εLys(εK)或lysine-lysine-lysine(KKK)以增强肽构建体的溶解度)和混杂T辅助细胞表位连接，混杂T辅助细胞表位包含衍生自麻疹病毒融合蛋白和B型肝炎表面抗原的两组人工T辅助细胞表位。IL-6B细胞表位肽连接至专门设计的肽构建体的氨基端或羧基端。最初针对其与相对应IL-6B细胞表位肽的相对免疫原性在天竺鼠中对数百种专门设计的IL-6肽免疫原构建体进行评估。如指定，将不同量的IL-6肽免疫原构建体配制于使用经核准供人类疫苗使用的油剂Seppic MONTANIDE ISA 51的油包水乳液中或使用矿物盐(ADJUPHOS)或ALHYDROGEL(明矾)的悬浮液中。通常利用将IL-6肽构建体以约20至800μg/mL浓度溶解于水中，并与MONTANIDE ISA 51配制成油包水乳液(1∶1体积)，或者与矿物盐(ADJUPHOS)或ALHYDROGEL(明矾)(1∶1体积)配制，以制成制剂。将制剂置于室温下约30分钟，并在免疫接种前利用漩涡震荡混合约10至15秒。
利用2至3个剂量的特定制剂免疫接种一些动物，其在时间0(初次免疫)和初次免疫后(wpi)3周(加强免疫)施用，任选5或6wpi进行第二次加强免疫，通过肌内途径投药。然后，针对在单个制剂中使用的相对应IL-6肽免疫原构建体的免疫原性，针对其与重组IL-6的交叉反应性，以评估这些接受免疫的动物。针对在如免疫方案指定的特定期间内的给药方案，将在天竺鼠初次筛选中具有强免疫原性的那些IL-6肽免疫原构建体在猕猴中以油包水乳液、矿物质盐类和以明矾为基底的制剂中进行进一步测试。
利用相对应小鼠或大鼠IL-6肽免疫原构建体，针对其于小鼠或大鼠中突破免疫耐受性的能力，只将最有希望的IL-6肽免疫原构建体候选物进行进一步广泛评估。在大鼠中具有最佳免疫原性的IL-6肽免疫原构建体，其可引发针对内源性IL-6的抗IL-6抗体效价；特别是具有在CIA诱导的Lewis大鼠模型中抑制血液炎症因子和减轻类风湿性关节炎的临床症状的能力，或在食蟹猕猴中具有抑制由皮下施用外源性IL-6所引发血液嗜中性粒细胞增多症的能力。将优化的IL-6肽免疫原构建体纳入最终剂型中，提供在提交研究性新药申请准备的GLP指导的免疫原性、持续时间、毒性和功效证明的研究中和在自身免疫性类风湿性关节炎患者进行的临床试验中使用。
实施例6.设计合理性、筛选、鉴定、功能特性的评估以及用于治疗自身免疫性类风湿性关节炎包含IL-6肽免疫原构建体的多组分制剂的优化
IL-6，一种细胞因子，被选作设计的目标分子和本发明的内容。图1显示来自物种为人类(SEQ ID NO：227)、猕猴(SEQ ID NO：228)、小鼠(SEQ ID NO：229)和大鼠(SEQ IDNO：230)的IL-6序列的比对。图2描述本发明和开发步骤的总体概述，其中的流程图识别导致IL-6制剂商业化(工业化)的开发过程。对每个步骤的详细评估和分析，带来令人愉快和令人不愉快的惊喜，在过去导致无数次的实验，最终将导致安全且有效的IL-6制剂的商业化。
a.设计历史
每种肽免疫原构建体或免疫治疗产品都需要自己的设计重点和方法，设计重点和方法是基于其特定的疾病机制和干预所需的目标蛋白。设计是根据目标IL-6分子，其为细胞因子。从研究到商业化的过程通常需要一至数十年才能完成。与用于干预的功能位点相关的IL-6B细胞表位肽的鉴定是免疫原构建体设计的关键。在天竺鼠中进行连续的先导免疫原性研究，在各种制剂中包含各种T辅助细胞支持物(T helper support)(载体蛋白或合适的T辅助细胞肽)，以评估引发抗体的功能特性。经过广泛的血清学验证，然后在目标物种或非人类灵长类动物中进一步测试候选IL-6B细胞表位肽免疫原构建体，以进一步验证IL-6肽免疫原设计的免疫原性和方向。然后以不同的混合物配制选择的IL-6肽免疫原构建体，以评估在当组合使用时在肽构建体间与各自相互作用有关的功能特性的细微差异。经过额外的评估，确定最终的肽构建体、肽组合物及其制剂，以及制剂的各个物理参数，从而导致最终产品的开发过程。
b.用于医药组合物的IL-6衍生的肽免疫原构建体的设计和验证，此医药组合物具有治疗受IL-6失调影响的疾病(包括自身免疫性类风湿性关节炎)的患者的潜力
为了产生最有效的肽构建体以包含进入医药组合物中，人类IL-6B细胞表位肽的组库(SEQ ID NOs：5-19)和衍生自各种病原体或人工T辅助细胞表位的混杂T辅助细胞表位(SEQ ID NOs：78-106和216-226)被进一步设计并制成IL-6肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：107-215)，提供最初用于天竺鼠的免疫原性研究。
i)从包含两个分子内环状结构的区域中选择IL-6B细胞表位肽序列进行设计
在许多其他测试区域中，选择位于两个分子内环状结构的间并包含两个分子内环状结构的区域，以用于进一步的B细胞表位肽设计。发现此区域在IL-6R的α和β或gp130链附近。IL-6与IL-6R结合后，IL-6R将在细胞内传递活化信号，从而导致的后续主要的细胞事件。于如表1的SEQ ID NO：1或图1的SEQ ID NO：227内所示，两个环状结构是C73-C83(SEQID NO：5)和C44-C50(SEQ ID NO：15)，两个环状结构之间的区域是位于3至4α螺旋束。
最初，针对IL-6C73-C83(SEQ ID NO：5)选择小鼠和大鼠对应物环状结构(例如SEQID NOs：20和74)作为B细胞表位，以设计与
Figure BDA0003136164750000411
3T辅助细胞表位肽(SEQ ID NO：89)和接头(SEQ ID NO：77)连接的IL-6肽免疫原结构。利用ISA 51和CpG配制两种IL-6肽免疫原构建体以400μg/1mL的浓度在天竺鼠中进行初次免疫，并以100μg/0.25mL的浓度进行加强免疫(3、6和9wpi)。为了测试在天竺鼠中的免疫原性，使用ELISA试验，将天竺鼠免疫血清以10倍连续稀释的方式从1∶100稀释至1∶10000。以每孔0.5μg肽的量利用人类IL-6肽(SEQ IDNO：5)、小鼠或大鼠肽(SEQ ID NOs：20和74)涂覆ELISA微量盘。利用A450临界值设为0.5的A450nm的线性回归分析计算测试血清的效价，以Log10表示。ELISA结果显示，来自人类IL-673-83(SEQ ID NO：107)和小鼠IL-6 72-82(SEQ ID NO：146)的两种肽免疫原构建体不仅诱导针对其自身B细胞表位肽人类IL-6 C73-C83(SEQ ID NO：5)和小鼠B细胞表位肽(SEQ IDNO：20)的高免疫原性效价，如表4所示也发现两种抗血清针对其来自人类和小鼠IL-6的同源B细胞表位肽具有中等的交叉反应性。研究表明，设计的两种肽免疫原能够诱导针对人类IL-6C73-C83肽及其小鼠对应物肽具有交叉反应性的特异性抗体。此外，如表5A所示，针对免疫原性和其与人类IL-6蛋白的交叉反应性，还测试IL-6肽免疫原构建体124、125、126和132(环状)以及133(非环状)，其具有超出IL-6 73-83延伸至环状结构氨基端部分的序列，结果显示其具有高免疫原性和中等的交叉反应性。
随后，针对来自IL-6C44至C50的另一个环状结构进行设计。选择覆盖C44-C50环状结构的不同大小的B细胞表位肽来构建IL-6肽免疫原。利用
Figure BDA0003136164750000421
1T辅助细胞表位肽(SEQID NO：91)和短接头εK或较长接头KKK-εK(SEQ ID NO：77)构建新的人类IL-6免疫原构建体。对于目标B细胞表位肽，将
Figure BDA0003136164750000422
1T辅助细胞表位肽和接头序列置于结构的氨基端或羧基端或两端。来自三种不同大小的B细胞表位IL-644-50(SEQ ID NO：15)、IL-642-57(SEQID NO：12)、IL-642-72(SEQ ID NO：10)的七个人类IL-6免疫原构建体(SEQ ID NO：128、129、131和134-137)被设计并用于免疫原性研究。将每种肽免疫原与ISA51和CpG配制以免疫天竺鼠，利用400μg/ml的剂量进行初次免疫，并于3、6、9wpi以100μg/ml的剂量进行加强免疫，每组3只的天竺鼠。进行ELISA测定以评估设计的IL-6肽免疫原的免疫原性。利用IL-6B细胞表位肽和人类IL-6蛋白(SEQ ID NO：1)涂覆微量盘的孔作为目标肽。将天竺鼠免疫血清以10倍连续稀释的方式从1∶100稀释至1∶100000。利用A450临界值设为0.5的A450nm的线性回归分析计算测试血清的效价，以Log10表示。所有八种肽免疫原均诱导针对涂覆在微量盘孔中的B细胞表位肽的强免疫原性效价。ELISA结果表明，这七个肽免疫原构建体不仅诱导针对相对应IL-6B细胞表位肽的高免疫原性效价，而且这些抗血清对人类IL-6蛋白(SEQID NO：1)具有中等的交叉反应性，如表5B所示。
此外，针对两个其他B细胞表位肽进行设计，此些B细胞表位肽具有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：9(即IL-6 61-75和IL-6 52-72)的介于两个环状结构之间的序列。利用
Figure BDA0003136164750000431
1T辅助细胞表位肽(SEQ ID NO：91)和短接头εK或较长接头KKK-εK(SEQ ID NO：77)构建新的人类IL-6免疫原构建体(SEQ ID NOs：127、138-145)。对于目标B细胞表位肽，将
Figure BDA0003136164750000432
1T辅助细胞表位肽和接头序列置于构建体的氨基端或羧基端。来自三种不同大小的B细胞表位IL-652-72(SEQ ID NO：9)、IL-661-75(SEQ ID NO：13)、IL-661-72(SEQ ID NO：14)的九个人类IL-6免疫原构建体(SEQ ID NO：127、138-145)被设计并用于免疫原性研究。将每种肽免疫原与ISA51和CpG配制以免疫天竺鼠，利用400μg/ml的剂量进行初次免疫，并于3、6、9wpi以100μg/ml的剂量进行加强免疫，每组3只的天竺鼠。进行ELISA测定以评估设计的IL-6肽免疫原的免疫原性。利用IL-6B细胞表位肽和人类IL-6蛋白(SEQ ID NO：1)涂覆微量盘的孔作为目标肽。将天竺鼠免疫血清以10倍连续稀释的方式从1∶100稀释至1∶100000。利用A450临界值设为0.5的A450nm的线性回归分析计算测试血清的效价，以Log10表示。所有九种肽免疫原均诱导针对涂覆在微量盘孔中的B细胞表位肽的强免疫原性效价。ELISA结果表明，这八个肽免疫原构建体不仅诱导针对相对应IL-6B细胞表位肽的高免疫原性效价，而且这些抗血清对人类IL-6蛋白(SEQ ID NO：1)具有中等的交叉反应性，如表5C所示。
除了如以上所述的包含内源性内部环状结构的肽构建体的外，IL-6B细胞表位肽设计还针对位于人类IL-6上与单克隆抗体Olokizumab相关的表位。已知Olokizumab抑制IL-6/sIL-6R与gp130的结合。设计覆盖部分的Olokizumab相关构型表位的两种不同序列大小的肽，以构建IL-6肽免疫原构建体。选择
Figure BDA0003136164750000433
1T辅助细胞表位肽(SEQ ID NO：91)和较长接头εK-KKK(SEQ ID NO：77)以构建新的人类IL-6免疫原构建体。将
Figure BDA0003136164750000434
1T辅助细胞表位和接头序列置于B细胞表位肽的氨基端或羧基端或两端。来自两种不同大小的B细胞表位(SEQ ID NO：18和19)的五个人类IL-6免疫原构建体(SEQ ID NOs：112-117)被设计并用于免疫原性研究。将在氨基端和羧基端均具有
Figure BDA0003136164750000435
1的另一种IL-6 73-83构建体(SEQ IDNO：118)(第6组)用作免疫原性和免疫特异性比较的对照组。将每种肽免疫原与ISA51和CpG配制以免疫天竺鼠，利用400μg/ml的剂量进行初次免疫，并于3、6、9wpi以100μg/ml的剂量进行加强免疫，每组3只的天竺鼠。进行ELISA测定以评估这些设计的肽免疫原的免疫原性。利用三种B细胞表位肽(IL-6C73-C83(SEQ ID NO：5)、IL-6150-162(SEQ ID NO：18)和IL-6144-166(SEQ ID NO：19))涂覆微量盘的孔作为目标肽。将天竺鼠免疫血清以10倍连续稀释的方式从1∶100稀释至1∶100000。利用A450临界值设为0.5的A450nm的线性回归分析计算测试血清的效价，以Log10表示。所有六种肽免疫原均诱导针对涂覆在微量盘孔中的其自身的B细胞表位肽的强免疫原性效价。ELISA数据显示，在五个免疫原构建体(SEQ ID NOs：112-117)的间存在交叉反应性，因为它们共享如表5D所示来自序列144至166的相同的螺旋-转折-螺旋(helix-turn-helix)结构。表5E显示来自这些构建体的免疫血清对人类IL-6蛋白的交叉反应性，指明此位点对IL-6结合干预的潜力，这将在其他IL-6诱导的功能测定中进行测试。
ii)在IL-6肽免疫原构建体设计中用以增强所选IL-6B细胞表位肽免疫原性的衍生自病原体的异源性T辅助细胞表位及其包含物的排名
表2列出总共29种异源性Th表位(SEQ ID NOs：78-106和216-226)，其已在小鼠、大鼠、天竺鼠、狒狒和猕猴等多种物种中进行相对效力的测试，以增强B细胞表位的免疫原性。
针对在天竺鼠中的免疫原性研究，进行IL-6肽免疫原构建体(此IL-6肽免疫原构建体含有IL-6C73-C83 B细胞表位肽(SEQ ID NO：5)，其通过εK间隔子与各个混杂的T辅助细胞表位连接)的代表性研究，以对如表6所示的各个异源性T辅助细胞表位的相对效力进行排名。将在初次免疫后第6周(6wpi)获得的结果用于对不同的IL-6肽免疫原构建体进行排名。虽然所有选定的Th表位均具有增强IL-6B细胞表位肽的免疫原性的能力，但发现最有效的构建体是SEQ ID NO：119的构建体。
针对在不同物种(包括灵长类动物)中的每种和所有IL-6肽免疫原构建体的免疫原性进行仔细校正可确保最终Th肽选择和最终制剂开发的成功。
iii)针对其与重组IL-6的抗体反应性对IL-6肽免疫原构建体的免疫原性进行评估
图3进一步说明在利用25种不同IL-6肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：107、112-114、116-118和124-145)免疫的天竺鼠中在12周期间内的抗血清的动力学。利用4倍连续稀释将从0、3、6、8/9和12wpi收集的天竺鼠抗血清从1∶100稀释至1∶4.19x 108。利用每孔50ng量的人类IL-6(GenScript)涂覆ELISA微量盘。藉由利用4-参数罗吉特曲线拟合来计算待测血清的效价，表示为Log(EC50)，以于Log获得半最大效应浓度(the half of maximal effectconcentration(EC50))。25种免疫原构建体均能够引起与天然人类IL-6的一定程度的交叉反应性，这表明其升高的抗IL-6抗体可能具有中和IL-6活性的潜力。
为了研究设计的人类IL-6肽免疫原是否会引起来自不同动物物种具有交叉反应性的抗体，这些数据可为进一步的动物试验提供有用的信息。选择利用29种不同免疫原构建体(SEQ ID NOs：107、112-114、116-118和124-145)所诱导的8-或9-wpi血清通过蛋白质A亲和性层析法进行IgG纯化。图4说明利用SEQ ID NOs：107、116、118和124-133所诱导的纯化的多克隆天竺鼠IgG与人类、猴和大鼠重组IL-6蛋白(均购自GenScript)交叉反应。其中，(SEQ ID NOs：107、118和124-126)的肽以不同肽构建体含有IL-6 73-83环状结构，肽(SEQID NOs：128、129和131)含有IL-6 44-50环状结构，而SEQ ID NO：132包含两个环状结构。
iv)在IL-6B细胞表位肽设计中鉴定内源性/自体Th表位以供排除
存在于目标蛋白中潜在的内源性/自体Th表位的鉴定可为用于免疫治疗干预的组合物的设计提供益处，因为在肽免疫原构建体中存在T辅助细胞表位结构特征可能在加强免疫时引起非所需的炎症，此乃由于自体T细胞的活化，如同先前的阿兹海默症疫苗AN1792。如表7所示，尽管在强力油包水乳液剂型中进行配制，游离的IL-6B细胞表位肽IL-662-83(SEQ ID NO：6)、IL-6 58-83(SEQ ID NO：7)、IL-6 52-83(SEQ ID NO：8)、IL-6 52-72(SEQ ID NO：9)和IL-6 42-72(SEQ ID NO：10)在免疫原性测试中提供了干净的背景，这表明它们有资格作为IL-6 B细胞表位肽候选物以用于构建供IL-6制剂使用的IL-6肽免疫原构建体。
v)利用IL-6肽免疫原构建体所引起的集中抗体反应仅靶向IL-6B细胞表位
众所周知，用以加强针对标靶B细胞表位肽的免疫反应的所有载体蛋白(例如钥孔血蓝蛋白(KLH)或其他载体蛋白(例如白喉类毒素(DT)和破伤风类毒素(TT)蛋白))，通过将这种B细胞表位肽与各自载体蛋白化学缀合可引发超过90％的抗体是针对增强载体蛋白，而少于10％的抗体是针对免疫宿主中的标靶B细胞表位。因此评估本发明IL-6肽免疫原构建体的特异性是重要的。一系列八个IL-6肽免疫原构建体(来自表3的SEQ ID NOs：138-145)具有不同长度的B细胞表位，B细胞表位通过间隔子序列连接至异源性T辅助细胞表位
Figure BDA0003136164750000451
1(SEQ ID NO：91)，被制备用于抗原性评估。将
Figure BDA0003136164750000452
1(用于B细胞表位免疫增强作用的T辅助细胞表位肽)涂覆在微量盘上，并将天竺鼠的免疫血清用于测试与用于免疫增强作用的
Figure BDA0003136164750000453
1肽的交叉反应性。与这些构建体对相对应目标IL-6B细胞表位肽具有高免疫原性(如针对IL-6B细胞表位所产生的抗体的高效价所示)相反，如表8所示发现大多数(如果不是全部)免疫血清与
Figure BDA0003136164750000454
1肽无反应性。
总而言之，简单的肽免疫原设计(包含连接至精心选择的T辅助细胞表位的目标IL-6B细胞表位肽)可产生仅针对相对应IL-6B细胞表位肽的集中且干净的免疫反应。对于医药组合物设计而言，其产生的免疫反应越具有特异性，则其为组合物提供的安全性越高。因此，本发明IL-6肽免疫原构建体为高特异性的，但对其目标是高度有效的。
vi)针对其抗体对IL-6和IL-6R交互作用的抑制对IL-6肽免疫原构建体进行免疫原性评估
IL-6通过异源三聚体IL-6R/gp130复合物发出信号，其参与引发下游信号转导的活化。单独IL-6和IL-6R都不能活化下游信号转导。进行进一步的研究，以研究候选IL-6肽免疫原构建体是否可以在天竺鼠中引发抗体，并且所引发的抗体可以中和IL-6从而阻断IL-6与IL-6受体(IL-6R)之间的交互作用(Rose-John，et al.，2017)。
将纯化的天竺鼠IgGs(天竺鼠IgGs是从利用25种各自的候选IL-6肽免疫原构建体(SEQID NOs：107、116、118、124-145)免疫的天竺鼠的免疫血清中纯化而来)用于ELISA试验以进行评估：(a)如实施例3所述利用相对应IL-6B细胞表位肽作为固相抗原涂覆通过ELISA评估其相对免疫原性；(b)其与来自人类、猴子和啮齿动物物种的IL-6蛋白发生交叉反应的相对能力；如果(a)和(b)均得到肯定的结果，则研究这些纯化的抗体能否中和IL-6蛋白，且从而抑制IL-6和IL-6Ra之间的相互作用(即顺式信号转导)或IL-6/IL-6Ra和IL-6Rb/或gp130之间的相互作用(即反式信号转导)。
如图3所示，利用精心设计的各个候选IL-6肽免疫原构建体免疫的天竺鼠的所有纯化抗体在与免疫方案相匹配的时间过程中显示出显著的抗体效价。此外，如图4A和4B所示，来自免疫血清的所有纯化抗体(免疫血清衍生自利用这些IL-6肽免疫原构建体的免疫接种)均显示出与人类IL-6蛋白的高反应性，并且也与猴(猕猴)和啮齿类IL-6蛋白具有中等交叉反应性。
此外，如第5A图所示，代表性抗体(代表性抗体由利用各个候选IL-6肽免疫原构建体免疫(例如这些具有SEQ ID NOs：107、116、118、124、132-134和137序列)的天竺鼠的免疫血清纯化而来)可通过顺式信号转导模式以剂量依赖性方式竞争性地抑制IL-6和IL-6Ra交互作用。
此外，如第5B图所示，代表性抗体(代表性抗体由利用各个候选IL-6肽免疫原构建体免疫(例如这些具有SEQ ID NOs：128、129、134和135序列)的天竺鼠的免疫血清纯化而来)可通过反式信号转导模式以剂量依赖性方式竞争性地抑制IL-6-IL-6Ra复合物与IL-6Rb/gp130交互作用。
相反，由衍生自肽免疫原构建体(SEQ ID NO：130)(此肽免疫原构建体包含现有技术B细胞表位肽序列(SEQ ID NO：11))的免疫血清纯化而来的抗体不能抑制顺式或反式信号转导途径。
vii)利用多种IL-6肽免疫原构建体所引发的免疫血清(9wpi)针对精细特异性进行表位作图(epitope mapping)
含有IL-6肽免疫原构建体的IL-6组合物的设计是集中在在IL-6R结合位点附近包含两个分子内环状结构C44-C50(SEQ ID NO：15)和C73-C83(SEQ ID NO：5)的区域。这种基于构建体的设计旨在保留至少一个天然分子内环状结构作为免疫原性靶点。
八个代表性的IL-6B细胞表位肽62-83(SEQ ID NO：124)、58-83(SEQ ID NO：125)、52-83(SEQ ID NO：126)、52-72(SEQ ID NO：127)、42-72(SEQ ID NO：128)具有位于B细胞表位氨基端的Th、42-72(SEQ ID NO：129具有位于B细胞表位羧基端的Th)、50-67(SEQ ID NO：130)和73-83(SEQ ID NO：107)。
将IL-662-83(SEQ ID NO：6)、58-83(SEQ ID NO：7)、52-83(SEQ ID NO：8)、52-72(SEQ ID NO：9)、42-72(SEQ ID NO：10)、50-67(SEQ ID NO：11)和73-83(SEQ ID NO：5)用于设计B细胞表位肽，此B细胞表位肽与位于B细胞表位肽的氨基端或羧基端的
Figure BDA0003136164750000471
1(SEQID NO：91)连接以形成原型肽免疫原。在B细胞表位和Th表位的间使用εK接头或εK-KKK(SEQID NO：77)间隔子以形成如表3所示的肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：124-130、107)。通过环化将位于氨基酸(aa)42-83、42-72和73-83内的所有B细胞表位肽设计为具有C44-C50或C73-C83的约束环状结构。
使用单个的IL-6B细胞表位肽C73-C83(SEQ ID NO：5)和E42-G72(SEQ ID NO：10)供微量盘涂覆进行ELISA试验，以针对由利用IL-6肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：124-130、107)免疫的天竺鼠所获得高免疫血清的抗体反应性作评估。结果显示，包含C73-C83环状构建体的结构SEQ ID NOs：124、125、126和107可诱导针对IL-6B细胞表位肽C73-C83(SEQ IDNO：5)的高效价抗体，而利用包含C44-C50环状结构的IL-6肽免疫原构建体SEQ ID NOs：127-130所诱导的天竺鼠抗血清与B细胞表位肽E42-C72(SEQ ID NO：10)有抗体反应性，而对C73-C83环状结构(SEQ ID NO：5)仅有少许或无交叉反应性，显示免疫原性的高特异性，即设计的免疫原构建体能够引起特异性抗体以与IL-6相对应的B细胞表位功能区块反应(表9)。
在精细表位作图研究(表9)中，将抗体结合位点定位至在目标区域内的特定残基上，合成51个重叠的10-mer肽(SEQ ID NOs：21至71)，其覆盖IL-6从第32个氨基酸至第91氨基酸序列区域。将这些10-mer肽作为固相免疫吸附物分别涂覆至96孔微量盘上。将以1∶100稀释比例配制于样品稀释缓冲液中的汇集的天竺鼠抗血清加到利用2.0μg/mL的10-mer肽涂覆的微量盘孔中，随后在37℃下培养1小时。在利用洗涤缓冲液洗涤微量盘孔后，加入辣根过氧化物酶(HRP)缀合重组蛋白A/G并培养30分钟。利用PBS再次洗涤后，将底物加入孔中，利用ELISA微量盘式分析仪测量450nm处的吸光值，以二重复方式分析样品。IL-6肽免疫原所引发免疫血清与相对应IL-6B细胞表位肽涂覆孔的结合代表最大的抗体结合信号。
精细表位作图结果显示，来自包含C73-C83环状结构的IL-6肽免疫原构建体SEQID NOs：124、125、126和107的汇集的天竺鼠血清可诱导主要针对从氨基酸69-78(SEQ IDNO：58)至氨基酸76-85(SEQ ID NO：65)的10mer肽簇的高效价抗体，其对于具有氨基酸35-44(SEQ ID NO：24)的肽具有高交叉反应性，且对于略微超出环状结构氨基端处偶尔具有中度活性。
令人惊讶地，来自包含C44-C50环状结构的IL-6肽免疫原构建体SEQ ID NOs：127-129的汇集的天竺鼠血清可诱导主要针对C44-C50环状结构以外从氨基酸61-70(SEQ IDNO：50)至氨基酸67-76(SEQ ID NO：56)的10mer肽簇的高效价抗体，IL-6肽构建体129具有更广泛的分散抗体反应性，延伸至B细胞表位肽氨基端部分41-50(SEQ ID NO：30)、45-54(SEQ ID NO：34)、57-66(SEQ ID NO：46)、58-67(SEQ ID NO：47)。值得注意的是，通过各自的ELISAs，利用IL-6肽免疫原构建体128和129所产生的免疫血清在竞争性IL-6/IL-6Rα顺式和(IL-6/IL-6Rα复合物)/IL-6Rβ反式竞争性结合抑制研究中显示优先的反式抑制作用。
总而言的，设计的合成IL-6肽免疫原构建体(IL-6肽免疫原构建体以与
Figure BDA0003136164750000481
1表位肽连接的位于IL-6中的环状结构C44-C50和C73-C83表示)可诱导强大的免疫反应，产生针对接近IL-6R结合区域的不同10mer肽簇的多克隆抗体，以允许结合抑制(IL-6/IL-6Rα介导的顺式或(IL-6/IL-6Rα复合物)/IL-6Rβ(或Gp130)介导的反式竞争性结合抑制(参见第5A和5B图))，其应具有重要的医学意义。
实施例7.在体外模式下对利用IL-6肽免疫原构建体及其制剂所引发的抗体进行功能特性评估
在证明从利用精心挑选的各个候选IL-6肽免疫原构建体免疫的天竺鼠的免疫血清纯化而来的抗体具有高免疫原性和交叉反应性的后，设计了以下研究以评估来自这些免疫血清的各个纯化的IgG能否能够(a)抑制IL-6诱导的STAT3磷酸化；(b)在TF-1细胞株中抑制细胞增生；(c)在U937细胞中抑制IL-6诱导的MCP-1产生，全部试验以离体方式进行。
利用抗IL-6抗体抑制IL-6诱导的STAT3磷酸化
IL-6信号转导路径最初参与在细胞膜上IL-6/IL-6Ra/IL6Rb(或Gp130)的复合物形成，随后在细胞质中发生下游蛋白STAT3磷酸化。针对其抑制IL-6诱导的STAT3磷酸化的能力，将RPMI 8226细胞株用于评估这些衍生自利用精心挑选的候选IL-6肽免疫原构建体免疫的天竺鼠免疫血清的纯化抗IL-6抗体的能力，因为此8226细胞株不会持续表达磷酸化的STAT3。
首先，同时使用IL-6(10ng/m1)和不同浓度的纯化的IgGs处理培养的细胞。抗IL-6R单克隆抗体，如图6所示，利用代表性免疫原(SEQ ID NOs：128、129、134、135和137)所引发的抗IL-6IgGs在IgG浓度为100μg/mL状况下可降低STAT3磷酸化。来自利用包含现有技术B细胞表位序列(SEQ ID NO：11)的肽构建体(SEQ ID NO：130)所引发的免疫血清的IgG不能抑制STAT3磷酸化。
在TF-1细胞中抑制IL-6依赖性细胞增生
人类红细胞性白血病TF-1细胞能够对人类IL-6反应而增生。为了研究来自利用精心挑选的候选IL-6肽构建体(SEQ ID NOs：116、118、124-129、131-145)免疫的天竺鼠免疫血清的纯化IgGs是否能够在TF-1细胞株中抑制IL-6依赖性细胞增生，同时使用IL-6(10ng/ml)和纯化的天竺鼠IgGs处理所有TF-1细胞培养物。将未经IL-6处理的TF-1细胞以及仅利用IL-6而无抗体处理的TF-1细胞作为对照组。如第7A和7B图所示，比起所有其他组别，TF-1细胞在仅有IL-6存在下更具增生性，并且其细胞增生为没有利用IL-6处理组别的细胞的两倍。在利用代表性候选IL-6肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：116、118、124-245、127-129、131-145)所引发的抗IL-6IgG抗体存在下的TF-1细胞生长可以被抑制至某种程度(第7A和7B图)。来自利用包含现有技术B细胞表位序列(SEQ ID NO：11)的肽构建体(SEQ ID NO：130)所引发的免疫血清的IgG不能抑制IL-6引发的细胞增生。
抑制IL-6诱导的MCP-1产生
MCP-1在急性和慢性炎症过程中扮演重要的角色。MCP-1是一种趋化因子，可在疾病的致病机制中吸引单核细胞和嗜碱性粒细胞。IL-6可以诱导前单核细胞系U937中MCP-1的表达。为了研究利用IL-6肽免疫原构建体在天竺鼠中所引发的抗IL-6抗体是否能抑制U937细胞株中IL-6依赖性MCP-1的分泌，利用浓度为10ng/ml的IL-6细胞因子处理所有细胞培养组以诱导MCP-1的产生。将纯化IgGs的代表性制剂(纯化Ig6s是来自利用候选IL-6肽免疫原构建体(SEQID NOs：116、118、124-134、136138-145)所引发的天竺鼠免疫血清)以不同浓度加入测试组中，并且还包括Tocilizumab作为阳性对照组。将仅存在IL-6而未添加抗体状况下的U937细胞培养设置为阴性对照组。如图8A和8B所示，除了来自利用包含现有技术B细胞表位序列(SEQ ID NO：11)的肽构建体(SEQ ID NO：130)所引发的免疫血清的IgG(参见第8A图)以外，以剂量依赖方式，在利用代表性候选肽构建体所引发的纯化IgGs抗体处理的组别中观察到不同程度抗体浓度依赖性的MCP-1产生的抑制。
上述离体功能研究指出，这些代表性IL-6肽免疫原构建体显示出对IL-6诱导的炎症过程和致病机制的抑制作用，表明它们具有治疗受IL-6失调影响的疾病(包括自身免疫性类风湿性关节炎)的潜力。
实施例8.在LEWIS大鼠胶原蛋白诱发关节炎(CIA)模型的预防性模式中对IL-6肽免疫原构建体进行评估
在如下所述的预防研究中针对类风湿性关节炎以评估IL-6肽免疫原构建体对大鼠胶原蛋白诱发关节炎(CIA)模型的影响。
人类IL-6与大鼠IL-6共有约40％的氨基酸序列相似性。基于大鼠IL-6蛋白序列，以人类IL-6B细胞表位肽IL-6 73-83和IL-6 144-166的同源物设计大鼠肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：148和157)，将作为B细胞表位肽增强T辅助细胞表位的
Figure BDA0003136164750000501
(SEQ ID NO：89)和作为接头的εK-KKK(SEQ ID NO：77)分别地连接至IL-6B细胞表位肽的氨基端或羧基端。
利用如图9简要所示的实验方案将Lewis大鼠用于本研究。将总共21只大鼠分为3组，安慰剂组仅注射佐剂。利用IL-6肽免疫原构建体注射实验组的大鼠，构建体是利用ISA51和CpG配制为45μg/0.5mL剂量，用于初次免疫和加强免疫。在第-31、-10和4天施用共三剂。在第三次施用前4天(第0天)通过皮内途径利用牛第II型胶原蛋白/IFA乳液(每只大鼠使用体积100μL内含100μg胶原蛋白)在尾根对所有大鼠进行注射，并在第三次施用后3天(第7天)追加。在第-31、-10、0、7、14、21、26、28和35天对大鼠进行放血。采用ELISA分析法测定针对大鼠重组IL-6蛋白的免疫原性效价。
ELISA结果表明，在第-31天免疫前，各组均未观察到可检测的抗体效价。在三次免疫后，安慰剂处理的大鼠未显示出针对抗大鼠重组IL-6的可检测抗体效价。比起其他组别(SEQ ID NO：157)，在CIA期间中靶向IL-673-83B细胞表位的肽免疫原(SEQ ID NO：148)可引发更强的抗IL-6抗体效价，Log(EC50)约为3.0(图10)。
以预防模式在大鼠CIA模型评估IL-6免疫疗法的影响
针对关节炎的临床体征和症状，对利用大鼠IL-6肽构建体(具有SEQ ID NOs 148或157)免疫的后进行CIA关节炎引发的大鼠仔细检查。利用胶原蛋白(牛第II型胶原蛋白，Chondrex Inc.)注射在大鼠中迅速发展为CIA引发的关节炎。在胶原蛋白诱发后约2周，在后爪中发现急性关节炎的临床炎症体征(包括包括红斑和关节肿胀，每爪评分为0-4(总分在0至16的间))。每组在CIA诱发后约3周发现最高的关节炎严重程度评分和最严重的爪肿胀(图11和12)。通过关节炎严重程度评分评估不同IL-6免疫原构建体的治疗功效。相较于其他受试免疫原构建体(SEQ ID NO：157)，利用SEQ ID NOs：148免疫的组别展现较低的关节炎严重程度评分(减轻的关节炎严重程度)与较轻微的足爪肿胀，且在此体内免疫治疗研究期间与安慰剂组别相比具有统计学上的显著差异(图11和12以及表10与表11)。
为了观察在大鼠CIA诱发研究期间IL-6免疫原是否能够减少嗜中性粒细胞从骨髓释放至循环中，结果显示从骨髓释出的嗜中性粒细胞数量从第0天开始逐渐增加，并在第14天达到其峰值。大鼠IL-6免疫原(SEQ ID NO：148)有效地减少嗜中性粒细胞从骨髓释放至循环中(图13和表12)。这表明两种设计的IL-6免疫原构建体在减少炎症过程中都起着重要作用。
这项研究结果指出，对于合并IL-6 73-83作为B细胞表位肽的人类IL-6肽免疫原构建体而言，大鼠IL-6B细胞表位肽IL-6 72-82代表良好候选，用以在预防模式中治疗受IL-6失调影响的疾病，在此针对IL-6分子的诱导的多克隆抗体可中和血液循环的细胞因子IL-6，以阻断/抑制其信号转导，从而减少临床炎症性病理过程。
利用大鼠IL-6肽免疫原构建体或仅利用佐剂通过肌内途径对CIA大鼠注射3次。这些动物对45μg/0.5mL剂量的候选大鼠IL-6制剂具有良好的总体耐受性。相较于具有SEQ IDNO：157者，具有SEQ ID NO：148的候选大鼠IL-6肽免疫原在抗体反应和减轻关节炎严重程度方面显示更高的功效。
实施例9.如在LEWIS大鼠CIA模型的治疗性模式中所示IL-6肽免疫原构建体及其制剂对类风湿性关节炎治疗的影响
在Lewis大鼠的胶原蛋白诱发关节炎(CIA)模型中针对IL-6肽免疫原构建体进行概念验证(POC)研究
为了确认IL-6免疫原构建体(SEQ ID NO：148)的功效，在Lewis大鼠CIA模型中进行POC研究，其中在此功效研究中评估两种不同的佐剂制剂，如图14所示。将七只动物分配给两个治疗组的各一组，将六只动物分配给安慰剂组。以45μg/0.5mL/剂量进行初次免疫和加强免疫(加强免疫在第-7、7、14、21和28天进行)，使用仅利用ISA 51或利用ISA51/CpG配制的肽免疫原构建体(SEQ ID NO：148)注射两个治疗组的动物。在与治疗组相同的注射时间点，将不含肽免疫原构建体的佐剂载体单独使用以注射安慰剂组。在第0天和第7天通过皮内途径利用牛第II型胶原蛋白/IFA乳液(每只大鼠使用体积100μL内含100μg胶原蛋白)在尾根对所有组别进行注射，以诱发关节炎。此研究在第35天终止。
利用ELISA对来自免疫大鼠血清针对大鼠IL-6重组蛋白的免疫原性效价进行评估。结果指出，两个治疗组(两个治疗组是利用以不同佐剂配制的相同IL-6肽免疫原构建体处理)在免疫后均以稳定增加的方式产生针对大鼠IL-6的高抗体效价。两个治疗组的效价均在第21天达到水平为3Log(EC50)的峰值，并保持平稳直到第35天研究终止(图15)。此结果进一步证实，在利用两种佐剂配方状况下，肽免疫原构建体(SEQ ID NO：148)具有相当的免疫原性，并且能够突破免疫耐受性，以诱导针对大鼠IL-6的特异性多克隆抗体，从而有效地增强抗体产生。
在利用IL-6免疫原构建体免疫接种和利用CIA关节炎诱发前和后，在Lewis大鼠针对CIA诱发关节炎在治疗组和安慰剂组的间进行临床评估。基于研究期间关节炎严重程度的临床体征，将关节炎严重程度分级为每爪评分为0-4(总分在0至16的间)。结果显示，CIA诱发的关节炎在利用胶原蛋白诱发后在大鼠中迅速发展。佐剂安慰剂组在第14天达到数值为9的最高关节炎评分。相反地，两个治疗组均显示较轻微的关节炎严重程度，两组在第14天相同时间点的评分均小于6，具有统计学上的意义(p＜0.01)。从那时起，从第14天到第35天，观察到在每2至3天监测的所有组别中的关节炎评分均下降，直至研究结束共进行了9次评估。每次评估的结果均显示，从第14天到第35天，两个治疗组的关节炎严重程度评分均比安慰剂组低得多，并且具有统计学上的意义(大多数情况下p＜0.01或P＜0.001)。到第35天研究结束时，安慰剂组的得分约为6，而两个治疗组的得分都约为3，如图16所示。还评估位于后爪的CIA的临床体征，结果显示从第14天起在患关节炎的所有大鼠中后爪的体积均增加，其乃关节发炎的后果。但是观察到相似的结果，分别在第14、21、28和35天，两个治疗组的后爪体积均比安慰剂组少得多，其具有统计学上的意义(大部分p＜0.01至P＜0.001)。到第35天研究结束时，这两个治疗组的后爪体积已接近正常体积，而安慰剂组保持较高的体积，如图16所示。所有这些发现表明，两种佐剂在本研究中显示出相似的临床疗效，但是ISA51+CpG组合比ISA51稍好。
血清IL-6水平与关节受累(joint involvement)程度和严重性呈正相关；而其他一些下游血清炎症生物标记(例如C-反应蛋白(CRP))也是评估炎症严重程度的指标。将ELISA用于测定CRP的血清水平。与两个治疗组相比，安慰剂组(佐剂载体处理的CIA)的大鼠具有显著较高的血清CRP水平(p＜0.05)(图17)。在第21天在以免疫原(SEQ ID NO：148)处理的CIA大鼠中的血清CRP平均值接近正常值，其显著地低于安慰剂组。
进行组织病理学检查研究，以评估IL-6肽免疫原对踝关节组织破坏变化的影响。在第35天牺牲CIA大鼠(7只/每治疗组，6只/安慰剂组)，并去除踝关节组织以进行组织切片的固定、脱钙和石蜡包埋。制备组织切片并利用H&E染色。组织病理学检查显示于图18，其中正常对照组显示健康的关节间隙和正常组织。相反地，安慰剂组表现出关节炎的典型特征，其特征在于明显的滑膜和关节周围炎症、滑膜增生和骨侵蚀。利用SEQ ID NO：148免疫的CIA大鼠的关节病理学显示较轻微的炎症(其具有较轻微的细胞浸润、较轻微的滑膜增生和骨侵蚀)，表明通过肽免疫原构建体(SEQ ID NO：148)减轻踝关节的破坏。图18还显示在三个不同组别的病理学评分的比较，其采用改良的Mankin评分系统以评估关节软骨，通过在软骨结构分级评分为0至6、在细胞形态分级评分为0至3、将番红素O染色分级评分为0至4，以及将滑膜炎症和增生分级评分为0至4(Clin Immunol.124：244-257)。与安慰剂组的11分相比，肽免疫原构建体(SEQ ID NO：148)治疗组可将病理学评分显著地降低至6分。
炎症细胞因子被认为在RA致病机制中具有重要作用。免疫组织化学染色法用于评估发炎的踝组织。简而言的，将福尔马林固定的石蜡包埋组织切片置于二甲苯中脱蜡，浸入递减浓度的乙醇中，并在水中复水。所有切片均经过微波增强的抗原修复处理。将浸在抗原修复柠檬酸盐溶液(Scytek)中的玻片固定切片置于微波炉中以最大功率加热至沸腾，然后冷却至室温30分钟。利用3％过氧化氢/PBS作用10分钟以阻断内源性过氧化物酶活性。将切片与Ultravision Protein Block(ThermoFisher)在室温下预反应1小时。然后将切片与一级兔抗大鼠IL-17(Abbiotec，以1：100比例稀释于PBST中)、抗大鼠TNF-α(Abcam，以1：100比例稀释于PBST中)或抗大鼠MCP-1(Abcam，以1∶200比例稀释于PBST中)在4℃下隔夜反应，利用TBST(Scytek)洗涤，然后显影(使用Polink-2Plus HRP Rabbit with DAB Kit(GBILabs))。将切片利用苏木精(Leica Biosystems)复染、脱水并固定在封片胶(SurgipathMicromount mounting medium(Leica Biosystems))中。图19显示在安慰剂组中组织TNF-α、IL-17和MCP-1的显著增加。但是，在IL-6免疫原处理的CIA大鼠中，这些细胞因子的产生被大大地抑制。
这项研究表明，IL-6肽免疫原构建体的免疫接种显著地降低炎症性关节炎的发生率，并保护骨骼和软骨免受破坏。这些发现强烈地支持IL-6肽免疫原免疫接种在生物体内的临床应用以治疗或预防类风湿性关节炎和其他自身免疫性疾病。
在CIA模型中评估剂量和佐剂对IL-6肽免疫原构建体所引起的免疫反应的影响
在CIA大鼠中进行的POC研究表明，设计的肽免疫原构建体对IL-6诱导的致病机制具有高免疫原性和治疗功效，此暗示其于类风湿性关节炎和其他自身免疫性疾病的潜在免疫治疗应用。以下研究将集中于肽免疫原构建体的优化和佐剂的选择以及在CIA Lewis大鼠的剂量确定。
将MONTANIDE ISA 51和ADJU-PHOS作为不同佐剂分别与相同肽免疫原(SEQ IDNO：148)和CpG一同配制在大鼠CIA免疫研究中进行评估。将五只大鼠分配给五组的各一组，其接受两种佐剂制剂其中的一，针对这两种不同佐剂共有10组。在初次免疫和加强免疫(加强免疫在第-7、7、14、21和28天进行)通过i.m.途径以0.5体积利用5、15、45、150μg的不同剂量注射治疗组的所有动物，进行临床观察直到第35天。在没有肽免疫原的两个不同的佐剂安慰剂组仅注射制剂中的佐剂载体。在以下研究中评估抗IL-6效价、体重、后爪肿胀检查、关节炎严重程度评分、血液嗜中性粒细胞、血小板计数和肝功能。
针对涂覆在微量盘孔中的大鼠IL-6重组蛋白通过ELISA测量抗IL-6效价。结果表明，通过ELISA法检测，注射了两种不同佐剂载体的两个安慰剂组均未发现可检测到的抗IL-6抗体效价，而利用具有两种佐剂制剂的IL-6免疫原构建体(SEQ ID NO：148)免疫的所有治疗组均产生针对大鼠IL-6的抗体。一般而言，结果显示观察到剂量依赖性方式，特别是对于使用ISA 51制剂的组别(图20)。在接受免疫的大鼠中，ISA 51制剂诱导的免疫反应高于ADJUPHOS制剂，来自所有剂量的免疫原性Log10值分别超过3。
在35天的研究过程中，每7天监测一次体重。在图21描绘接受免疫接种的大鼠的体重变化模式，相较于正常大鼠，实验的CIA大鼠的体重减轻在每一组中始于第14天，在第21天达到最低点，然后体重逐渐增加。在研究结束时(第35天)，相较于正常对照组，所有CIA大鼠仍表现出约10％的体重减轻。数据还指出体重变化呈现剂量依赖性方式，在较高剂量组中观察到较低的体重减轻。无论使用何种佐剂，剂量为150μg的剂量组都比其他剂量组增加较多的体重。相较的下，使用ADJUPHOS剂量为150μg的剂量组在第28天和第35天的体重增加高于任何其他组，体重增加超过200g(表13)。
还通过定量爪体积变化来评估在大鼠中的CIA所诱导的炎症和破坏的临床严重性。肉眼观察指出，利用ISA 51或ADJUPHOS配制的IL-6免疫原构建体(SEQ ID NO：148)可在大鼠模型中防范CIA的发展。在胶原蛋白诱发后的研究过程中，记录位于大鼠爪部肿胀和发红的急性临床体征。从第7天到第21天，所有接受免疫的大鼠均显示爪肿胀的增加，然后随着炎症减轻而逐渐恢复，如图22和表14所示。当在第24天与正常组相比，安慰剂组在肉眼观察中显示明显的肿胀和发红变化(图23)。肽免疫原构建体(SEQ ID NO：148)以剂量依赖性方式减少爪发红和肿胀。通过定量分析，在第24天于150μg剂量组发现最大程度地减少炎症。ADJU-PHOS的效果略优于MONTANIDE ISA 51。
根据红斑和肿胀体征的炎症变化(评分标准)，将每只爪子的关节炎临床严重程度分级评分为0-4。每两或三天检查一次动物，并以平均值±标准误差进行测量，以评估关节炎的严重程度(图24和表15)。由胶原蛋白激发所引起的关节炎发展的初始体征在第14天可见。在治疗组和安慰剂组中，CIA组的关节炎评分迅速增加，在约第20天达到分数为5-9的最高评分，然后炎症表现从第21天到第35天逐渐变弱。然而，在研究期间，通过临床体征评分，所有利用免疫原构建体(SEQ ID NO：148)的治疗组导致的关节炎减轻程度均大于安慰剂组。还观察到肽免疫原剂量依赖性方式，在所有治疗组(使用佐剂ISA51或ADJUPHOS)中，较高剂量组的关节炎评分均较低。发现利用两种不同佐剂载体的两个安慰剂组在临床关节炎体征中的严重性更高，因为其临床体征得分高于所有治疗组。当与使用ISA 51和ADJUPHOS制剂的5和15μg剂量相比，发现最佳剂量水平为45和150μg，其可显著降低关节炎的体征和症状。在第33天和第35天，ADJUPHOS制剂组在150μg剂量水平下分别比ISA 51组呈现更为显著的关节炎评分降低(ADJUPHOS制剂组分别具有61％和63％的关节炎评分降低，而ISA 51制剂组分别具有31％和45％的关节炎评分降低)。
在第一次胶原蛋白注射后，从第0天到第7天的嗜中性粒细胞计数迅速增加，然后在第二次诱发后逐渐上升直到第14天。上升的嗜中性粒细胞计数可通过免疫接种以剂量依赖性方式迅速减少(图25和表16)。发现所有免疫原处理组在每个时间点的嗜中性粒细胞计数的减少量均高于安慰剂组。在IL-6免疫原处理组中，两个较高剂量可显著地降低嗜中性粒细胞增多症，但是ADJUPHOS制剂在45和150μg剂量下可分别地显著降低嗜中性粒细胞计数至1.55±0.23x103个每μL和1.36±0.25x 103个每μL(p＜0.001)，其较相同剂量水平下使用ISA 51的制剂效果更佳。
胶原蛋白诱发的关节炎也与血小板计数的显著增加有关。在受试的CIA大鼠中，所有组别在首次胶原蛋白注射后平均血小板计数均呈现稳定增长，然后逐渐下降(图26和表17)。还观察到剂量依赖性，显示使用较高剂量时血小板计数较低。特别地，使用ADJUPHOS配制的IL-6组合物在45和150μg剂量下可显著地降低血小板水平至接近正常值，而安慰剂组在每个时间点具有较高的血液血小板计数。
在日立7080化学分析仪(Hitachi)上使用常规的人类AST测试通过测量血清天门冬氨酸转胺酶(AST)水平来量化肝损伤(图27和表18)。相较于正常大鼠组，使用IL-6肽免疫原构建体制剂和胶原蛋白处理的大鼠可导致第0天到第7天间的血清AST水平的适度增加。AST浓度一直稳定到第21天，然后缓慢下降至研究结束。在AST水平也观察到剂量依赖性。在两种制剂中，使用150μg剂量的大鼠均显示出显著较低的AST水平。在45μg剂量下，仅在ADJUPHOS制剂中显示显著较低的AST水平，而在ISA 51制剂中则没有。
总之，利用佐剂配制的II-6肽免疫原构建体(SEQ ID NO：148)能够诱导IL-6抗体以中和过量的IL-6，从而减轻关节炎的严重程度并抑制炎性因子(例如血液嗜中性粒细胞和血小板)数量以及保护肝功能。在每个IL-6肽免疫原构建体处理组中观察到类似的对组合物的剂量依赖性反应模式。结果显示，接受每剂150μg的动物产生最高的免疫反应，其次是接受45μg的动物。此外，当与IL-6肽免疫原构建体合并使用时，两种佐剂递送系统(ISA51和ADJUPHOS)均显示出减轻关节炎症状的能力。然而，佐剂ADJU-PHOS在与关节炎有关的所有病理学参数方面的表现均较MONTANIDE ISA 51稍佳。因此，最高剂量(每0.5mLADJUPHOS含150μg免疫原)被认为是大鼠免疫的最佳剂量，并将被用作探索不同物种免疫原性的指导。
实施例10.利用IL-6肽免疫原构建体及其制剂通过免疫接种治疗慢性炎症疾病
IL-6参与广泛的生物学事件，例如免疫反应、造血作用和急性期反应。然而，IL-6的过度生产与多种疾病的致病机制有关，包括多种慢性炎症疾病和癌症。针对IL-6信号使用抑制剂应可提供重要信息，以更好地了解受IL-6失调影响的疾病的分子机制，此有助于开发针对这些疾病的新治疗干预。在实施例11至15中描述本发明IL-6肽免疫原构建体及其制剂作为医药组合物用于疾病预防及/或治疗的临床应用。在此提供关于在疾病中针对IL-6信号临床应用IL-6抑制剂的综述文章作为参考(Mihara，et al.，2012)。
慢性炎症疾病的贫血症(ACD)
贫血通常在患有慢性炎症疾病(例如RA、发炎性肠道疾病和癌症)的患者中观察到，被称为ACD(慢性疾病的贫血症(anemia of chronic disease))。ACD的特征在于在储存铁充足的情况下发生的低铁血症(hypoferremia)。炎症细胞因子被认为在ACD中扮演重要角色。
在猴胶原蛋白诱发的关节炎中观察到的贫血的特征在于血清铁和转铁蛋白饱和度降低以及血清铁蛋白升高。贫血的严重程度与血清IL-6水平相关。铁调素是人类和其他哺乳动物中铁稳态的主要调节剂。其抑制铁在小肠中的吸收以及从巨噬细胞释放循环铁，从而有效地减少了铁向骨髓中成熟的红细胞的输送。经过基因工程改造以过量产生铁调素的小鼠在出生后不久就死于严重的铁缺乏症。
IL-6诱导肝细胞中铁调素的产生。将TCZ(一种针对IL-6受体的单克隆抗体)施用具有胶原蛋白所诱发关节炎的猴子，可迅速改善贫血并引起血清铁调素迅速但短暂的降低。比起来自健康的动物，来自关节炎猴的血清更能有效诱导铁调素mRNA的表达，而此可通过施用TCZ而加以抑制。这些证据表明，TCZ可通过抑制IL-6所诱导的铁调素产生来改善猴关节炎的贫血。
代替昂贵的抗体治疗，在患者中施用本发明的IL-6肽免疫原构建体及其制剂以诱导IL-6R结合位点抗体去干预IL-6和IL-6R结合，从而治疗疾病。
实施例11.利用IL-6肽免疫原构建体及其制剂通过免疫接种治疗癌症
在人类致癌作用中的慢性炎症
慢性炎症在人类致癌作用中扮演重要角色。有许多报导描述在癌症患者血清中IL-6水平升高，此与疾病的严重程度和预后有关。IL-6与许多癌症的生长和分化调控有关。还发现IL-6升高与肾细胞癌、卵巢癌、淋巴癌、黑素瘤和前列腺癌的不良预后有关。通过活化ERK1/2，IL-6刺激肿瘤细胞增生。IL-6是细胞存活的重要调节剂，为肿瘤细胞提供机制以逃避由紧迫和细胞毒性药物所诱导的细胞死亡。另外，已经显示IL-6的生理作用不仅促进肿瘤增生，还促进恶病质的转移和症状。
多发性骨髓瘤(MM)
MM是浆细胞的恶性肿瘤，为成年人中最常见的恶性淋巴瘤。其特征在于肿瘤细胞位于骨髓，这些细胞在骨髓中散播并诱导骨骼疾病。在骨髓微环境中的MM细胞和基质细胞之间的交互作用刺激细胞因子、生长因子和黏附分子的产生。它们一起在骨髓MM细胞的增生和定位中起重要作用。MM细胞引起骨质溶解，导致骨痛和高钙血症。IL-6是MM细胞的主要生长因子。在大约一半的MM患者中观察到培养的MM细胞的增生是由自分泌环(autocrineloop)所介导，且现在众所周知由骨髓环境产生的IL-6是参与MM细胞生长和存活的主要细胞因子。此外，众所周知IL-6是MM细胞存活的要素，因为它阻止了由例如地塞米松(dexamethasone)、Fas和血清剥夺等不同刺激所诱导的MM细胞凋亡。相较于单独的IL-6，IL-6-sIL-6R复合物在于天然MM细胞中向上调节Bc1-xL和Mc1-l方面更为有效，天然MM细胞在细胞表面不表达IL-6R。因此，重要的是要使含有IL-6肽免疫原构建体的组合物能够引发针对会干扰反式信号转导(即在IL-6/IL-6Rα与IL-6Rβ/i.e.gp130形成复合物的层次进行干扰)的位点的抗体。因此，本发明IL-6组合物可适用于MM的治疗。
前列腺癌
在前列腺癌中的IL-6和IL-6R的表达以及IL-6作为生长因子的作用已得到充分证明。IL-6在晚期前列腺癌细胞株LNCaP中负责抵抗细胞凋亡和升高Bc1-2家族的抗细胞凋亡成员的水平。由于前列腺癌细胞的生长取决于雄性激素的存在，因此几乎所有患有晚期前列腺癌的患者最初都会对雄性激素剥夺和抗雄性激素治疗产生反应。因为IL-6在前列腺癌细胞刺激雄性激素的合成和ARs(雄性激素受体)的表达，所以IL-6可能会降低抗雄性激素治疗在前列腺癌的疗效。另一方面，在AR阴性前列腺癌细胞中，IL-6被称为细胞凋亡的抑制剂。本发明的IL-6组合物将允许在接受免疫接种的患者中产生抗IL-6抗体以中和IL-6在这些癌症患者中施加的负面影响。
癌症相关的食欲不振和恶病质
癌症相关的食欲不振和恶病质是与恶性疾病相关的严重并发症。恶病质的特征是贫血、肝功能异常、疲劳和呕吐。已观察到胰脏癌患者血清IL-6升高，并与恶病质相关。如上所述，IL-6与铁代谢有关。另外，IL-6还具有与过量葡萄糖代谢和肌肉损失有关的调节作用。在同源小鼠模型(syngeneic mouse model)中，IL-6对于癌症恶病质也是必要的，其中抗IL-6抗体的治疗阻止了癌症恶病质的诱发。此外，在同源小鼠中，注射IL-6cDNA转染的Lewis肺癌细胞可导致肿瘤净生长率不变，但会导致体重减轻和生存期缩短。据报导，在晚期非小细胞肺癌患者中抗人类IL-6抗体(ALD518)可逆转疲劳并减少瘦体重的损失(服用ALD518的患者为-0.19kg，而服用安慰剂的患者为-1.50kg)。在这些患者中，ALD518可增加血红素、红细胞容积比、红细胞平均血红素量和白蛋白的水平，并在58％的患者(其于基线时血红素水平≤11g/dl)中使血红素水平升高至≥12g/dl。因此，抗IL-6抗体(抗IL-6抗体可以是单克隆抗体，或是利用含有IL-6肽免疫原构建体的组合物通过免疫患者所引发的抗体)可能是一种非红细胞生成刺激剂(non-erythropoietic-stimulating agent)，可用于治疗癌症相关的贫血。
患有长期溃疡性结肠炎的患者罹患结肠癌的风险要高得多，这表明免疫系统在结肠中作为肿瘤促进者的作用。一项研究表明，IL-6在固有层内的先天免疫细胞中对肠损伤反应而被产生，其能增强肿瘤起始细胞的增生并保护正常和癌前肠上皮细胞免于在急性结肠炎和CAC(结肠炎相关癌症)期间所诱发的细胞凋亡。此外，在溃疡性结肠炎模型中于氧化偶氮甲烷(azoxymethane)诱发的结肠肿瘤，肿瘤的出现伴随F4/80+CDllbhighGrllow(M2)巨噬细胞亚群的共同出现，其为肿瘤促进因子(包括IL-6)的来源。这些结果表明，IL-6阻断可能是治疗结肠炎相关癌症的一种方法。
代替昂贵的抗体治疗，用来干预IL-6和IL-6受体交互作用，并降低IL-6血清水平，从而导致癌症(包括多发性骨髓瘤(MM)、雄性激素依赖性或雄性激素非依赖性前列腺癌、非小细胞肺癌、癌症相关的食欲不振和恶病质、与癌症相关的贫血，以及结肠炎相关癌症)的治疗和改善，利用IL-6肽免疫原构建体及其制剂进行免疫接种将适合于治疗这些毁灭性疾病。
实施例12.利用IL-6肽免疫原构建体及其制剂通过免疫接种治疗类风湿性关节炎
类风湿性关节炎(RA)
类风湿关节炎(RA)是一种病因不明的慢性进展性自身免疫性炎症疾病，尤其会影响手和脚的关节。受累关节的滑膜组织被炎性细胞(如巨噬细胞和淋巴细胞)浸润，导致增生并伴有新血管形成，继而引起关节肿胀、僵硬和疼痛。此过程最终导致关节中的软骨破坏和骨吸收，部分患者患有永久性残疾。IL-6的生物活性以及在RA患者的血清和关节液中IL-6的升高表明IL-6是参与RA发育的关键细胞因子的一。在日本和全世界范围内进行使用抗IL-6R单克隆抗体TCZ(托珠单抗(tocilizumab))的七项III期临床试验表明，其在患有中至重度RA成年患者中作为单一药物治疗或与DMARDs(疾病修饰抗风湿药物(disease-modifying anti-rheumatic drugs))做联合治疗均有效。此外，SAMURAI(针对类风湿关节炎使用活性药物对照的单一药物治疗研究，IL-6抑制剂)和LITHE(托珠单抗安全性和结构性关节损伤预防试验)试验均证明TCZ治疗可显著抑制关节的放射学损害。结果，TCZ现在已在许多国家被批准用于RA的治疗。
全身型幼年特发性关节炎(sJIA)
全身型幼年特发性关节炎(sJIA)是慢性儿童期关节炎的一种亚型，可导致关节破坏和功能障碍，并伴有全身性炎症。这种长期的炎症还会引起突发性发烧(spike fever)、贫血和生长障碍。sJIA的急性并发症称为巨噬细胞活化症候群，其与严重发病相关。据报导IL-6在患者血液和关节液中显著升高，并且IL-6水平已显示与疾病活动相关。TCZ在一项随机双盲安慰剂对照退出III期临床试验中对56例常规治疗方案无效的sJIA患者显示出出色的疗效。它于2008年在日本被批准为用于sJIA的第一个生物药。
如上所示，代替昂贵的抗体治疗，用来干预IL-6和IL-6受体交互作用的水平，以降低IL-6血清水平，以及改善sJIA疾病，利用本发明IL-6肽免疫原构建体及其制剂进行免疫接种将适合于治疗sJIA疾病。
实施例13.利用IL-6肽免疫原构建体及其制剂通过免疫接种治疗Castleman氏病
Castleman氏病是具有良性增生性淋巴结的淋巴增生性疾病，其特征在于滤泡增生和微血管增生并伴有内皮增生。IL-6在增生性淋巴结中大量产生，且IL-6是引起各种临床症状的关键因素。两项开放性临床试验表明，每2周以8mg/kg体重的量施用抗IL-6R抗体TCZ对临床症状、实验室检查结果以及经组织学确定的改善有明显作用。此外，TCZ治疗导Castleman氏病患者的血清铁调素-25迅速降低。在开始TCZ治疗后，观察到长期减少，伴随着铁相关参数的逐步正常化和症状改善，这表明IL-6对于在Castleman氏病中诱发铁调素方面有重要作用。TCZ于2005年在日本被批准作为一种针对Castleman氏病的孤儿药。
代替昂贵的抗体治疗，以干预IL-6和IL-6受体交互作用的水平，从而降低IL-6血清水平，以及改善Castleman氏病，利用IL-6肽免疫原构建体及其制剂进行免疫接种将适合于治疗Castleman氏病。
实施例14.利用IL-6肽免疫原构建体及其制剂通过免疫接种治疗抑郁症
免疫系统和大脑间的联系可能会为抑郁症的治疗提供新的机制理解和见解。免疫系统和大脑的间的细胞因子介导的交流与抑郁症的致病机制有关。在C型肝炎病毒感染的患者中，重度抑郁症常见于干扰素治疗(干扰素治疗是一种有效的细胞因子诱导剂)后(占四分的一)。在健康志愿者中的实验性免疫活化会导致抑郁症症状并降低认知能力。横断面研究的统合分析已证实在抑郁症患者的循环炎症细胞因子水平升高。纵贯性研究表明，血清细胞因子水平先升高，因此有可能引起抑郁症症状。此外，炎症系统的活化被认为是产生抗抑郁药物抗性的基础，强调炎症与治疗反应的关系。基于这些发现，使用本发明IL-6肽免疫原构建体及其制剂靶向特别是IL-6的炎症细胞因子将是最有意义的，其可对于具有抑郁症和疼痛的患者(特别是对于具有慢性炎性状态的患者)提供治疗益处。
表1.在血清学检测中所使用的IL-6及其片段的氨基酸序列
Figure BDA0003136164750000601
Figure BDA0003136164750000611
*用以取代在IL-6片段的氨基端及/或羧基端氨基酸的半胱氨酸画有底线。
表2.用于IL-6肽免疫原构建体设计包括理想化人工Th表位的病原体蛋白衍生的Th表位的氨基酸序列
Figure BDA0003136164750000621
表3.IL-6肽免疫原构建体的氨基酸序列
Figure BDA0003136164750000631
表3.(接续)
Figure BDA0003136164750000641
表3.(接续)
Figure BDA0003136164750000651
*利用半胱氨酸间双硫键的形成使多肽环化，半胱氨酸间的双硫键以粗斜体表示。用以取代在IL-6片段的氨基端及/或羧基端氨基酸的半胱氨酸画有底线。
Figure BDA0003136164750000652
1：SEQ ID NO：91
Figure BDA0003136164750000653
2：SEQ ID NO：92
Figure BDA0003136164750000654
3：SEQ ID NO：89
表4.在天竺鼠中靶向IL-6R结合位点的含有IL-6衍生肽免疫原构建体的疫苗制剂的免疫原性评估
Figure BDA0003136164750000661
表5A-5E.靶向IL-6/IL-6Rα/IL-6Rβ(或gp130)结合位点的含有IL-6衍生肽免疫原构建体的疫苗制剂的免疫原性评估
(表5A)
Figure BDA0003136164750000671
(表5B)
Figure BDA0003136164750000681
(表5C)
Figure BDA0003136164750000691
(表5D)
Figure BDA0003136164750000701
(表5E)
Figure BDA0003136164750000702
Figure BDA0003136164750000711
表7.在所选的IL6R结合位点B表位序列中缺少内源性IL-6Th表位
Figure BDA0003136164750000721
表8.针对IL-6肽免疫原构建体的Th表位部位于天竺鼠的免疫原性评估
Figure BDA0003136164750000731
Figure BDA0003136164750000741
Figure BDA0003136164750000751
表10.利用含有IL-6R结合位点肽构建体的疫苗免疫的CIA大鼠的关节炎评分
Figure BDA0003136164750000761
*，p＜0.05 **，p＜0.01 ***，p＜0.001 ****，p＜0.0001
表11.利用含有IL-6R结合位点肽构建体的疫苗免疫的CIA大鼠的后爪肿胀
组别 第14天 第21天 第26天 第35天
安慰剂 1.5±0.1 2.3±0.2 2.2±0.1 1.9±0.1
SEQ ID NO：148 1.4±0.1 1.6±0.3 1.6±0.4 1.6±0.3
SEQ ID NO：157 1.5±0.1 2.0±0.3 1.9±0.3 1.6±0.3
*，p＜0.05 **，p＜0.01 ***，p＜0.001
表12.利用含有IL-6R结合位点肽构建体的疫苗免疫的CIA大鼠的嗜中性粒细胞水平
组别 第0天 第7天 第14天 第21天 第26天
安慰剂 2.0±0.4 3.8±0.9 6.6±0.8 4.0±0.7 4.7±0.8
SEQ ID NO：148 2.4±0.4 3.9±0.8 4.2±1.2 2.8±0.6 3.1±0.6
SEQ ID NO：157 2.3±0.3 4.3±1.0 5.0±1.1 3.0±0.6 3.7±1.1
*，p＜0.05 **，p＜0.01
表13.利用不同剂量水平含有IL-6R结合位点衍生肽结构(SEQ ID NO：148)的疫苗制剂免疫的CIA大鼠的体重
Figure BDA0003136164750000771
*，p＜0.05 **，p＜0.01
表14.利用不同剂量水平含有IL-6R结合位点肽构建体(SEQ ID NO：148)的疫苗制剂免疫的CIA大鼠的后爪肿胀
Figure BDA0003136164750000781
*，p＜0.05 **，p＜0.01 ***，p＜0.001
表15A-15B.利用不同剂量水平含有IL-6R结合位点肽构建体(SEQ ID NO：148)的疫苗制剂免疫的CIA大鼠的关节炎评分
(表15A)具有ISA 51/CpG的制剂
Figure BDA0003136164750000791
*，p＜0.05 **，p＜0.01 ***，p＜0.001
(表15B)具有ADJU-PHOS/CpG的制剂
Figure BDA0003136164750000792
*，p＜0.05 **，p＜0.01 ***，p＜0.001
表16A-16B.利用不同剂量水平含有IL-6R结合位点肽构建体(SEQ ID NO：148)的疫苗制剂免疫的CIA大鼠的嗜中性粒细胞水平
(表16A)具有ISA 51/CpG的制剂
Figure BDA0003136164750000801
*，p＜0.05 **，p＜0.01
(表16B)具有ADJU-PHOS/CpG的制剂
Figure BDA0003136164750000802
*，p＜0.05 **，p＜0.01 ***，p＜0.001 ****，p＜0.0001
表17A-17B.利用不同剂量水平含有IL-6R结合位点肽构建体(SEQ ID NO：148)的疫苗制剂免疫的CIA大鼠的血小板释放
(表17A)具有ISA 51/CpG的制剂
Figure BDA0003136164750000811
*，p＜0.05 **，p＜0.01
(表17B)具有ADJU-PHOS/CpG的制剂
Figure BDA0003136164750000812
*，p＜0.05 **，p＜0.01 ***，p＜0.001
表18A-18B.利用不同剂量水平含有IL-6衍生肽构建体(SEQ ID NO：148)的疫苗制剂免疫的CIA大鼠的AST
(表18A)具有ISA 51/CpG的制剂
Figure BDA0003136164750000821
*，p＜0.05 **，p＜0.01
(表18B)具有ADJU-PHOS/CpG的制剂
Figure BDA0003136164750000822
*，p＜0.05 **，p＜0.01
表19.来自靶向人类IL-6R结合位点肽免疫原构建体的免疫血清的IgGs与猕猴和啮齿类动物IL-6蛋白的交叉反应
Figure BDA0003136164750000831
表20A-20B.利用IL-6肽免疫原构建体所诱导的IgGs对顺式/反式结合的中和活性
(表20A)对于顺式结合的抑制作用的IC50
Figure BDA0003136164750000841
(表20B)对于反式结合的抑制作用的IC50
Figure BDA0003136164750000842
表21.利用IL-6肽免疫原构建体所诱导的IgGs对IL-6所诱导的TF-1增生的中和活性
Figure BDA0003136164750000851
表22.利用IL-6肽免疫原构建体所诱导的IgGs对人类、猴和啮齿类动物IL-6的交叉反应
Figure BDA0003136164750000861
Figure IDA0003136164860000011
Figure IDA0003136164860000021
Figure IDA0003136164860000031
Figure IDA0003136164860000041
Figure IDA0003136164860000051
Figure IDA0003136164860000061
Figure IDA0003136164860000071
Figure IDA0003136164860000081
Figure IDA0003136164860000091
Figure IDA0003136164860000101
Figure IDA0003136164860000111
Figure IDA0003136164860000121
Figure IDA0003136164860000131
Figure IDA0003136164860000141
Figure IDA0003136164860000151
Figure IDA0003136164860000161
Figure IDA0003136164860000171
Figure IDA0003136164860000181
Figure IDA0003136164860000191
Figure IDA0003136164860000201
Figure IDA0003136164860000211
Figure IDA0003136164860000221
Figure IDA0003136164860000231
Figure IDA0003136164860000241
Figure IDA0003136164860000251
Figure IDA0003136164860000261
Figure IDA0003136164860000271
Figure IDA0003136164860000281
Figure IDA0003136164860000291
Figure IDA0003136164860000301
Figure IDA0003136164860000311
Figure IDA0003136164860000321
Figure IDA0003136164860000331
Figure IDA0003136164860000341
Figure IDA0003136164860000351
Figure IDA0003136164860000361
Figure IDA0003136164860000371
Figure IDA0003136164860000381
Figure IDA0003136164860000391
Figure IDA0003136164860000401
Figure IDA0003136164860000411
Figure IDA0003136164860000421
Figure IDA0003136164860000431
Figure IDA0003136164860000441
Figure IDA0003136164860000451
Figure IDA0003136164860000461
Figure IDA0003136164860000471
Figure IDA0003136164860000481
Figure IDA0003136164860000491
Figure IDA0003136164860000501
Figure IDA0003136164860000511
Figure IDA0003136164860000521
Figure IDA0003136164860000531
Figure IDA0003136164860000541
Figure IDA0003136164860000551
Figure IDA0003136164860000561
Figure IDA0003136164860000571
Figure IDA0003136164860000581
Figure IDA0003136164860000591
Figure IDA0003136164860000601
Figure IDA0003136164860000611
Figure IDA0003136164860000621
Figure IDA0003136164860000631
Figure IDA0003136164860000641
Figure IDA0003136164860000651
Figure IDA0003136164860000661
Figure IDA0003136164860000671
Figure IDA0003136164860000681
Figure IDA0003136164860000691
Figure IDA0003136164860000701
Figure IDA0003136164860000711
Figure IDA0003136164860000721
Figure IDA0003136164860000731
Figure IDA0003136164860000741
Figure IDA0003136164860000751
Figure IDA0003136164860000761
Figure IDA0003136164860000771
Figure IDA0003136164860000781
Figure IDA0003136164860000791
Figure IDA0003136164860000801
Figure IDA0003136164860000811
Figure IDA0003136164860000821
Figure IDA0003136164860000831
Figure IDA0003136164860000841
Figure IDA0003136164860000851
Figure IDA0003136164860000861
Figure IDA0003136164860000871
Figure IDA0003136164860000881
Figure IDA0003136164860000891
Figure IDA0003136164860000901
Figure IDA0003136164860000911
Figure IDA0003136164860000921
Figure IDA0003136164860000931
Figure IDA0003136164860000941
Figure IDA0003136164860000951

Claims (19)

1.具有约30个或更多个氨基酸的IL-6肽免疫原构建体，其由以下所示的分子式表示：
(Th)m–(A)n–(IL-6的IL-6R结合区域或其片段)–X
或
(IL-6的IL-6R结合区域或其片段)–(A)n–(Th)m–X
或
(Th)m–(A)n–(IL-6的IL-6R结合区域或其片段)–(A)n–(Th)m–X
其中
Th为异源性T辅助细胞表位；
A为异源性间隔子；
(IL-6的IL-6R结合区域或其片段)为B细胞表位肽，其具有来自IL-6(SEQ ID NO:1)的IL-6R结合区域的约7至约42个氨基酸残基；
X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
m为1至约4；以及
n为0至约10。
2.如权利要求1所述的IL-6肽免疫原构建体，其中所述IL-6R结合区域或其片段选自由SEQ ID NOs:5-19组成的组。
3.如权利要求1所述的IL-6肽免疫原构建体，其中所述T辅助细胞表位选自由SEQ IDNOs:78-106和216-226组成的组。
4.如权利要求1所述的IL-6肽免疫原构建体，其中所述肽免疫原构建体选自由SEQ IDNOs:107-215组成的组。
5.IL-6肽免疫原构建体，其包含：
a.B细胞表位，其包含来自SEQ ID NOs:1至4的所述IL-6序列的约7至约42个氨基酸残基；
b.T辅助细胞表位，其包含选自由SEQ ID NOs:78-106、216-226及其任意组合组成的组的氨基酸序列；以及
c.任选的异源性间隔子，其选自由氨基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO:77)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO:231)和Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO:76)及其任意组合组成的组，其中所述B细胞表位直接地或通过所述任选的异源性间隔子共价地连接至所述T辅助细胞表位。
6.如权利要求5所述的IL-6肽免疫原构建体，其中所述B细胞表位选自由SEQ ID NOs:5至19组成的组。
7.如权利要求5所述的IL-6肽免疫原构建体，其中所述T辅助细胞表位选自由SEQ IDNOs:78至106及其任意组合组成的组。
8.如权利要求5所述的IL-6肽免疫原构建体，其中所述任选的异源性间隔子是(α,ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO:77)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO:231)或Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO:76)，或其任意组合。
9.如权利要求5所述的IL-6肽免疫原构建体，其中所述T辅助细胞表位共价地连接至所述B细胞表位的所述氨基端。
10.如权利要求5所述的IL-6肽免疫原构建体，其中所述T辅助细胞表位通过所述任选的异源性间隔子共价地连接至所述B细胞表位的所述氨基端。
11.包含如权利要求1所述的IL-6肽免疫原构建体的组合物。
12.医药组合物，其包含：
a.如权利要求1所述的IL-6肽免疫原构建体；以及
b.药学上可接受的递送载体及/或佐剂。
13.如权利要求12所述的医药组合物，其中
a.所述IL-6R结合区域或其片段选自由SEQ ID NOs:5-19组成的组；
b.所述Th表位选自由SEQ ID NOs:78-106和216-226组成的组；以及
c.所述异源性间隔子选自由氨基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO:77)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO:231)和Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO:76)，及其任意组合组成的组；以及
其中所述IL-6肽免疫原构建体与CpG寡脱氧核苷酸(ODN)混合以形成稳定化的免疫刺激复合物。
14.如权利要求12所述的医药组合物，其中
a.所述IL-6肽免疫原构建体选自由SEQ ID NOs:107-215组成的组；以及
其中所述IL-6肽免疫原构建体与CpG寡脱氧核苷酸(ODN)混合以形成稳定化的免疫刺激复合物。
15.一种在动物中产生针对IL-6的抗体的方法，其包含将如权利要求12所述的医药组合物施用给所述动物。
16.分离的抗体或其表位结合片段，其专一性地结合至位于如权利要求1所述的IL-6肽免疫原构建体中的所述IL-6的IL-6R结合区域或其片段。
17.如权利要求16所述的分离的抗体或其表位结合片段，其结合至所述IL-6肽免疫原构建体。
18.组合物，其包含如权利要求16所述的分离的抗体或其表位结合片段。
19.一种在动物中预防及/或治疗受IL-6失调影响的疾病的方法，其包含将如权利要求12所述的医药组合物施用给所述动物。
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