CN108794615A - 预防与免疫治疗阿尔茨海默型痴呆的肽疫苗 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及单个Aβ肽免疫原构建体，含有这些Aβ肽免疫原构建体及其混合物的肽组合物，包含含有这些Aβ肽免疫原构建体的疫苗制剂的药物组合物，其中所述单个Aβ肽免疫原构建体具有Aβ肽N端的作为B细胞(B)表位，其通过间隔子残基连接至源自病原体蛋白的异源性T辅助细胞(Th)表位，它们一起作用以刺激产生针对Aβ肽N端的高特异性抗体，提供保护性免疫应答，保护罹患阿尔茨海默病患者或有罹患阿尔茨海默病风险的患者。

Description

预防与免疫治疗阿尔茨海默型痴呆的肽疫苗
本申请是国际申请号PCT/US2013/037865，估国际申请日为2013年4月23日，进入中国国家阶段日期为2015年11月10日，中国申请号为201380076473.3，发明名称为“预防与免疫治疗阿尔茨海默型痴呆的肽疫苗”的分案申请。
本申请要求2013年3月15日提交的美国专利申请序列号13/843,883的优先权，其全文通过引用并入本文，如同在本说明书中完全描述一样。
技术领域
本公开涉及一种用于预防及免疫治疗阿尔茨海默型痴呆的基于肽的疫苗及其制剂。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease，AD)为最常见的痴呆类型，一种慢性、丧失认知能力的神经变性疾病，严重的行为异常，和死亡。约10％的大于65岁的群体以及40％的大于85岁的群体受到阿尔茨海默病的影响。不像其它会导致死亡的疾病，如心脏疾病、癌症与卒中，由于药物科技长足的发展使人类可活到发生痴呆风险的年纪，因此阿尔茨海默病的死亡率在接下来的20-30年会急剧增加。现今，在美国所有医疗成本中有7-8％是花费在痴呆症上的。目前，美国有250-400万的AD患者，而全世界有1700-2500万患者，且至今尚无法确定的治疗或治愈这种破坏性疾病。
首先由Alois Alzheimer(1907)发现，两种显微沉积，即神经纤维缠结与老年性淀粉样蛋白斑为此疾病的病理特征。传统上，需要活组织检查或死后组织病理学来确诊阿尔茨海默病。目前，利用近期引入的使用正电子发射同位素配体标记淀粉样蛋白斑块，与认知检测和脊髓液中特定分子的测量组合来进行诊断，不使用组织病理学即可获得这种疾病的更明确的诊断。
已经积累相当多的证据显示β-淀粉样蛋白(Aβ)肽——老年淀粉样蛋白斑的主要成分——在AD中扮演着非常重的角色。可由维基百科网页http://en.wikipedia.org/wiki/Beta_amyloid#cite_note-wales2010-41获得β-淀粉样蛋白(Aβ)肽最新的综述(到2013年2月13日)，该链接包含在本文中作为参考。成功的AD疾病-减轻治疗可能包括影响β-淀粉样蛋白在脑中沉积的产品。引用包括Morgan，D.关于“Immunotherapy for Alzheimer’s Disease(阿尔茨海默病的免疫治疗)”的最近发表的文献(Morgan D.J Int Med 2011；269：54-63)作为本领域的综述，其与本发明相关。
阿尔茨海默病必要但不充分的初始因子为由Aβ肽组成的淀粉样蛋白聚集体的积聚。阿尔茨海默病与唐氏综合征病例(引起早发型阿尔茨海默病理学)的家族遗传形式具有过量产生Aβ肽较长的C端形式(长度为42个氨基酸)作为常见成分。Aβ1-42肽容易形成β折叠结构并且聚集成寡聚物与原纤维。在出现该病症的认知症状前，这些淀粉样蛋白沉积可能在脑中存在十年或更久。该疾病发病机制的第二步为由过磷酸化的微管结合蛋白tau(hyperphosphorylated microtubule binding protein tau)形成神经元内神经原纤维缠结。在没有淀粉样蛋白沉积的情况下，tau病理学也会造成其它的神经变性疾病，但其在临床表现与脑中局部病理学位置上不同于阿尔茨海默病。在tau转基因小鼠模型中，颅内注射淀粉样蛋白或与产生Aβ沉积的小鼠交配会引起tau沉积。并且，以抗-Aβ免疫治疗来中断淀粉样蛋白沉积可减少表达多种转基因的小鼠的tau病理进展。比起淀粉样蛋白病理学，tau病理学似乎与认知状态更相关，与其是精神功能障碍更接近的原因一致。根据尚未确定的机制，这些病理学会造成突触功能、突触的损失，最终造成神经元的丧失，导致大量的脑萎缩。
目前有多种关于所涉及的机制步骤的假说。淀粉样蛋白和/或tau(称为寡聚物)的中等程度聚集体被认为是更直接的毒性原因。甚至在该疾病的最早阶段，“轻度认知功能损害(mild cognitive impairment，MCI)”期，仍具有大量斑块与缠结(tangle)病理的积累，以及神经元的丧失。这些发现提示，如同对心血管疾病所做的那样，在可能的最早阶段治疗该疾病可实质地控制阿尔茨海默病。
于1999年，发现一种减少过量产生淀粉样蛋白前体蛋白的转基因小鼠中的淀粉样蛋白沉积的疫苗方法。之后，发现靶向Aβ的疫苗或被动免疫治疗可恢复这些小鼠的记忆缺陷。由免疫系统所主动产生或被动给予的Aβ特异性抗体一致地减少不同的Aβ-淀粉样变性转基因小鼠模型中的斑块负担。有鉴于疫苗接种在动物模型中的成功，且缺乏任何备选的减轻疾病的阿尔茨海默病疾病的疗法，刺激AD患者的免疫系统产生Aβ抗体的首次临床尝试使用称为AN1792的疫苗开始，其由全长的Aβ1-42肽组成，含有B与T细胞表位，聚集成原纤维。在第1期安全性试验中，对约60名患者给予一次或多次剂量的所述疫苗。初始观察中的一种是可变的抗体反应，且许多患者疫苗无法产生可检测的针对靶Aβ肽抗原的抗体滴度。这种在多名患者中缺少免疫应答导致疫苗配制的改变，即包含QS-21作为佐剂，以试图在2期安全性和免疫原性试验中增强AN1792疫苗的免疫原性。此目的为通过多次接种免疫患者至预定的抗体滴度。然而，由于有少部分患者(约6％)产生无菌性脑膜脑病(asepticmeningoencephalopathy)(一种中枢神经系统(CNS)的炎症反应)，因此，免疫在试验开始后的短时间内即停止。有两名发生了CNS炎症的这些症状的患者死亡，随后的验尸发现CNS的T细胞浸润，明显具有脑膜炎迹象。由此可知，AN1792疫苗制剂的不良反应是由该疫苗引起的自身免疫反应(Orgogozo JM，等，Neurology 2003；61：46-54)。从功效的观点来看，在接受疫苗与接受安慰剂疫苗的那些之间没有观察到MRI显示的脑收缩率或认知表现的差异。
尽管AN1792疫苗受挫，但是开发用于阿尔茨海默病的免疫治疗的针对Aβ肽的新颖疫苗策略及佐剂已成为一个需大量创造性的领域。大部分的情况下，由于在使用针对全长Aβ1-42肽的疫苗的人体试验中发现不良事件，如在AN1792的情形中所示的，因此，目标已变为以最少的T细胞(至少针对Aβ)参与产生B细胞活化和抗体产生。
目前，除了本发明人及其团队所管理的本发明的产品之外，还有4个使用各种靶向Aβ片段的疫苗设计与制剂的主动免疫的I/II期临床试验。这些临床试验包括：以与白喉类毒素蛋白缀合的Aβ1-7氨基端肽片段为免疫原的ACC-001(Elan Corporation Inc.与Wyeth)；使用与Qβ病毒样颗粒偶联的Aβ1-5氨基端肽片段为免疫原的CAD106(ImmunodrugTM；Cytos Biotechnology AG与Novartis Pharma AG)；使用与ISCO-MATRIX缀合的Aβ氨基端肽为免疫原的V950(Merck)；以及使用与载体分子缀合的Aβ肽模拟物为免疫原的GSK/Affiris。此外，还有其他靶向Aβ的疫苗途径，如在Tabira T的综述中所述(Tohoku J ExpMed 2010；220：95-106)。
如上述，目前在人体试验中的所有靶向Aβ的疫苗设计与制剂具有弱免疫原性与可变抗体反应的缺点，原因在于仅30％至约70-80％的接受这些疫苗的患者产生了针对靶Aβ肽的抗体，其使得对由疫苗产生的抗-Aβ抗体产生的功效的分析变得更加复杂。大多数疫苗设计是复杂的，需要将非常短的Aβ肽片段缀合到大型蛋白或病毒颗粒样载体，因此使得大部分的抗体反应是针对不需要的载体，而不是短的靶标肽；复杂的疫苗设计表示大量的制备程序，因此难以控制质量且不是成本有效性的。由于使用的佐剂与制剂潜在的Th1活化特性，因此这些疫苗在其安全性特征方面是不确定的。此外，至今这些疫苗仍然无一表现出在接受所述疫苗的患者中的任何临床功效，例如认知功能的改善。
在发达国家中，AD是最昂贵的社会疾病之一。必须找到新疗法来预防、延迟AD的发生或减缓AD的进展。尽管在小鼠中有关于AD免疫学干预的有希望的发现，但是用于预防或治疗阿尔茨海默型痴呆的安全有效的靶向Aβ的人类疫苗仍然是一种挑战。考虑到上文讨论的目前在临床前或临床试验中疫苗设计与配制的局限性，对于开发提供用于预防和治疗阿尔茨海默型痴呆的广泛响应性免疫疗法的安全有效的疫苗制剂存在尚未实现的和亟需的需求。当这样的疫苗制剂可成功地对抗阿尔茨海默的病理学时，其会成为预防该疾病的标准方法之一。
发明概述
本公开内容涉及单独的Aβ肽免疫原构建体，包含所述Aβ肽免疫原构建体及其混合物的肽组合物，包含含有这些Aβ肽免疫原构建体的疫苗制剂的药物组合物，其中所述单独的Aβ肽免疫原构建体具有Aβ肽的N端作为B细胞(B)表位，通过间隔残基连接至源自病原体蛋白的异源性T辅助细胞(Th)表位，其共同作用刺激产生高特异性针对Aβ肽N端的抗体，以为有患阿尔茨海默病危险或患有阿尔茨海默病的患者提供保护性免疫应答。
在一个实施方案中，Aβ肽免疫原构建体可包含具有来自Aβ1-42肽氨基端的长度为10至14个氨基酸的B细胞抗原位点的杂合Aβ肽，例如，Aβ1-10、Aβ1-12、Aβ1-14，其连接至源自病原性蛋白如麻疹病毒融合(MVF)蛋白的异源性Th表位(SEQ ID NO：34)，它们共同作用刺激产生与老年斑(senile plaques)中全长Aβ1-42肽(SEQ ID NO：1)交叉反应的高特异性抗体。在另一些实施方案中，Aβ肽免疫原构建体含有具有B细胞抗原位点Aβ1-14肽的杂合肽，其连接至各种病原性蛋白的异源性Th表位(SEQ ID NOs：33至47)，能够引发与老年斑中全长Aβ1-42肽交叉反应的抗体。关于用于增强B细胞抗原位点的Aβ1-14肽的异源性Th表位，通过免疫原性筛选测试发现下述Th表位特别用于所述B细胞免疫原性增强：源自天然病原体白喉毒素(Diphtheria Toxin)的Th表位(SEQ ID NO：37)、恶性疟原虫的Th表位(PlasmodiumFalciparum)(SEQ ID NO：38)、霍乱毒素的Th表位(Cholera Toxin)(SEQ ID NO：40)的Th表位，以及源自麻疹病毒融合蛋白(MVF 1至5)与乙型肝炎表面抗原(HBsAg 1至3)的那些优化人工Th表位，其可为单一序列或组合序列(例如，SEQ ID NOs：34与41至47)的形式。在其它实施方案中，含有Aβ肽免疫原构建体与源自不同病原体的异源性Th表位的混合物的肽组合物用于允许覆盖患者中广泛的遗传背景，在用于治疗与预防阿尔茨海默型痴呆的疫苗免疫时产生更高百分数的响应率。在一个实施方案中，Aβ肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：62和63)与组合形式的源自MVF与HBsAg的异源性Th表位(SEQ ID NOs：44和45)以等摩尔比例混合用在疫苗制剂中，以允许对具有多样性遗传背景的疫苗宿主群体提供最大的覆盖。在本发明的肽组合物中观察到Aβ肽免疫原构建体的协同性的增强，且抗体反应主要(＞90％)集中为针对全长Aβ1-42的需要的交叉反应性，而针对用于免疫原性增强的异源性Th表位的交叉反应性不多(如果有的话)。这是与用于所述肽抗原性增强的常规蛋白或其他生物学载体的鲜明对比。在另一个实施方案中，高度纯化的Aβ肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：64和65)与单一序列形式的来源于MVF和HBsAg的异源性Th表位(SEQ ID NOs：46和47)任选地以等摩尔比例混合用于疫苗制剂，以允许对具有多样性遗传背景的疫苗宿主群体提供最大的覆盖。
本公开内容还涉及用于治疗和预防阿尔茨海默型痴呆的包含疫苗制剂的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包括稳定的免疫刺激复合物，其通过将CpG寡聚物与含Aβ肽免疫原构建体混合物的肽组合物经由静电缔合而混合形成，以进一步将Aβ肽免疫原性增强为针对老年斑中存在的全长Aβ1-42肽的需要的交叉反应。在其它实施方案中，药物组合物包含Aβ肽免疫原构建体混合物的肽组合物，其与作为佐剂的矿物盐类(包括明矾凝胶(铝胶)或磷酸铝(Adjuphos)接触，以形成悬浮疫苗制剂，所述药物组合物用于施用给疫苗宿主。在另一个实施方案中，药物组合物包含Aβ肽免疫原构建体混合物的肽组合物，其与CpG寡聚物形成稳定的免疫刺激复合物，所述药物组合物任选地与作为佐剂的矿物盐类(包括明矾凝胶(铝胶)或磷酸铝(Adjuphos))混合，以形成用于施用给疫苗宿主的悬浮疫苗制剂。
本公开内容还包括用于治疗与预防阿尔茨海默型痴呆的方法。所公开的方法使用含有本发明的Aβ肽免疫原构建体的药物组合物，包括含有本发明的Aβ肽免疫原构建体的悬浮疫苗制剂，其任选地与CpG寡聚物形成稳定的免疫刺激复合物，进一步任选的辅以作为佐剂的矿物盐类，以用于施用给具罹患阿尔茨海默病风险或患有阿尔茨海默病的患者。在这些实施方案中，包含Aβ肽免疫原构建体的药物组合物与来源于其的疫苗制剂可刺激针对全长Aβ1-42肽的抗体，以在体外抑制原纤维形成，并在体外降低对神经原细胞的细胞毒性，如由PC12细胞系细胞所示例的。在一些实施方案中，接受来源于Aβ肽免疫原构建体的疫苗制剂的动物或患者产生显著的针对全长Aβ1-42肽的抗体，并且发现将所述毒性Aβ肽由中枢神经系统引至周围，如由疫苗宿主血浆与血清中升高水平的Aβ1-40所证实的。
在本发明另一个方面中，令人惊讶地发现含有Aβ肽免疫原构建体的疫苗制剂可以有利地肌内给予至温血动物中，特别是患有阿尔茨海默型痴呆的人。在本发明另一个方面中，本发明提供用于肌内施用两种Aβ肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：64与65)的剂型。优选的肌内注射剂型为疫苗制剂，其含30μg至1000μg/0.5mL的与CpG寡聚物复合的肽免疫原构建体，辅以0.5mL作为佐剂的矿物盐，优选为100μg至400μg/0.5mL，更优选为300μg/0.5mL。此剂型稳定性超过2年，且可以保存在2至8℃直到使用前不久取出。剂型优选以注射器进行肌内注射至温血动物中，特别是手臂。对于剂型的加热，可将剂型维持在环境温度下约15分钟至45分钟，如30分钟。优选地，在取出药物物质之前，可将小瓶轻轻倒置几次，以使潜在的看不见的颗粒分散。
在本发明的另一个方面中，令人惊讶地发现，包含Aβ肽免疫原构建体的疫苗制剂可以有利地肌内给予温血动物，特别是患有阿尔茨海默型痴呆的猕猴(rhesus macaques)和人，以激发主要针对由Aβ1-10肽所代表的Aβ肽N端的高特异性抗体，所述Aβ肽N端具有暴露在Aβ1-42肽寡聚物、聚集体外部部分或在老年斑中的氨基酸“天冬氨酸(D)”，由由精细表位绘图研究所证实的。在本发明的另一个方面中，令人惊讶地发现，包含Aβ肽免疫原构建体的疫苗制剂可以有利地肌内给予温血动物，特别是患有阿尔茨海默型痴呆的猕猴和人，以在接受所述疫苗制剂的所有动物和所有人中激发主要针对Aβ1-42肽N端的高特异性抗体，由此获得100％的抗体反应率，这在疫苗研发史上极其罕见的。在本发明的另一方面方面中，令人惊讶地发现，包含本发明的Aβ肽免疫原构建体的疫苗制剂可以有利地肌内给予年龄为60岁以上且在临床上处于轻度阿尔茨海默病范围的患者，在认知评分(ADAS-Cog，ADCS-CGIC，MMSE)方面具有显著的改善，这是自最初研究患有阿尔茨海默病的患者的免疫疗法以来首次的改善。
在本发明另一个方面中，其涉及预防和治疗人患者中阿尔茨海默型痴呆的方法，所述方法包括给有此需要的人患者施用30μg至750μg，优选为100μg至400μg，更优选为约300μg，在初次免疫后第0、4和8周三次注射致敏后约每12周一次，优选为约每26周一次，且特别为约每52周一次，这取决于患者针对全长Aβ肽的抗体反应。
所述疫苗制剂和Aβ肽免疫原构建体在治疗上文提及的病症中的用途可以在适当的临床研究中进一步证实，例如，实施例中所述的那些，例如，在第0、4和12周给予总共三次剂量，每次给予300μg/0.5mL/剂的疫苗制剂，持续超过9个月。依据抗体滴度，可在每3、6或12个月时继续免疫一次。
适当的临床研究为在具有患阿尔茨海默病的风险或具有阿尔茨海默病症状的患者中进行的开放式标记(open label)研究，或特别是随机、双盲、安慰剂对照的平行研究。
本公开内容还提供一种用于低成本制备和质量控制Aβ肽免疫原构建体的方法，以及能够保护有患有阿尔茨海默病风险或患有阿尔茨海默病的动物及患者的递送系统。
在另一个方面中，本发明提供针对Aβ1-42的人单克隆抗体，该抗体由接受本发明Aβ肽免疫原构建体的疫苗制剂的患者诱导。Elisabetta Traggiai等，在Nature Medicine10，871-875(2004)中记载了一种由从人患者血液分离的B细胞制备人单克隆抗体的有效方法，其通过引用包括在本文中。
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附图简述
图1为显示本文公开的特定实施方案所述的疫苗制剂从发现到商业化(工业化)的研发过程的流程图。本公开内容包括在该流程图中总结的肽免疫原设计、肽组合物设计、疫苗制剂设计、体外功能性抗原性设计、体内免疫原性及功效研究设计、剂量给药方案设计、及临床流程设计。本文进一步记载了所述步骤每一步的详细评估，具有令人满意的和不令人满意的惊讶，基于合理设计导致高度安全和有效的疫苗制剂商业化的最终成功。
图2A示例具有20分钟的洗脱时间的高度纯化的Aβ肽免疫原构建体(SEQ ID NO：65)的HPLC图谱。
图2B示例具有21分钟的洗脱时间的高度纯化的Aβ肽免疫原构建体(SEQ ID NO：64)的HPLC图谱。
图2C是测量分子量为3892.274的Aβ肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：65)的质谱(MALDI-TOF)图谱，其具有的理论分子量为3892.52，显示在UBI AD疫苗(UB-311)制剂中用作活性药物成分的分子性质的高精确性。
图2D是测量分子量为4374.568的Aβ肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：64)的质谱(MALDI-TOF)图谱，其具有的理论分子量为4374.07，显示在UBI AD疫苗(UB-311)制剂中用作活性药物成分的分子性质的高精确性。
图2E显示分别具有20和21分钟的洗脱时间的高度纯化的Aβ肽免疫原构建体(SEQID NOs：65与64)的HPLC图谱。这两种Aβ肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：64与65)于2-8℃储存超过3年后由UB-311疫苗制剂提取出来，显示出具有同之前以等摩尔比例混合的洗脱时间的预期的HPLC图谱，这说明该合理设计的疫苗制剂的高精确性性质。
图3A示例基于广泛的文献检索的Th肽SEQ ID NO：46的HLA II类结合基序。由于对接受疫苗的患者具有最大的遗传背景覆盖度，决定使用二种Aβ肽免疫原构建体(SEQ IDNOs：64与65)的组合，以扩大免疫应答。
图3B示例基于广泛的文献检索的Th肽SEQ ID NO：47的HLA II类结合基序。由于对接受疫苗的患者具有最大的遗传背景覆盖度，决定使用二种Aβ肽免疫原构建体(SEQ IDNOs：64与65)的组合，以扩大免疫应答。
图4显示在豚鼠中超过26周的针对结合不同含量(0、10、30、100至300μg/0.5mL剂量)的Aβ肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：64与65)与固定量的矿物盐类组合的疫苗制剂的抗体反应动力特性。
图5A是通过Aβ肽免疫原构建体与CpG寡脱氧核苷酸(ODN)之间的电荷缔合/中和制备稳定的肽/CpG免疫刺激复合物的示意图。
图5B是继图5A后制备含有所述免疫刺激复合物及铝系矿物盐的矿物盐系疫苗混悬剂的示意图。
图6显示在不同佐剂存在下(铝胶/NaC1+CpG ODN；Adjuphos/NaCl+CpG ODN；及NaC1+CpG ODN)，含300μg/0.5mL/剂的Aβ肽免疫原构建体的疫苗制剂在狒狒中10周期间的抗体反应动力特性。
图7显示于2-8℃储存2年后，含Aβ肽免疫原构建体(等摩尔比率的SEQ ID NOs：64与65)的UBI AD疫苗在豚鼠中的免疫原性研究。UBI AD疫苗在标准的致敏及加强(3wpi)流程后维持高免疫原性和稳定性。
图8A：来自人AD脑的大脑血管没有被来自免疫前狒狒血清的IgG级分免疫组织化学染色。
图8B：来自人AD脑的大脑血管显示出用从来自用等摩尔比率的Aβ肽免疫原构建体SEQ ID NOs：62与63免疫的狒狒的高免疫血清纯化的IgG的免疫组织化学染色。
图8C：来自人AD脑的大脑血管没有被由与Aβ1-14肽预先温育的图8B所述的高免疫血清纯化的IgG免疫组织化学染色。该图显示与Aβ1-14肽预先温育吸收大脑血管与由超免疫血清纯化的IgG的所有免疫反应性，这证明用包含Aβ肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：62与63、)的疫苗制剂接种的超免疫血清的高特异性。
图8D：来自人AD脑的大脑血管显示出被由与不相关的肽预先温育的图8B所述的高免疫血清纯化的IgG的免疫组织化学染色。
图8E：来自人AD脑的淀粉样蛋白斑块不被来自免疫前狒狒血清的IgG级分免疫组织化学染色。
图8F：来自人AD脑的淀粉样蛋白斑块表现出被由来自用等摩尔比率的Aβ肽免疫原构建体SEQ ID NOs：62与63免疫的狒狒的超免疫血清纯化的IgG的免疫组织化学染色。
图8G：来自人AD脑的淀粉样蛋白斑块没有被由与Aβ1-14肽预先温育的图8B所述的高免疫血清纯化的IgG免疫组织化学染色。该图显示与Aβ1-14肽预先温育吸收大脑血管与由超免疫血清纯化的IgG的所有免疫反应性，这证明用包含Aβ肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：62与63)的疫苗制剂接种的超免疫血清的高特异性。
图8H：来自人AD脑的淀粉样蛋白斑块表现出被由与不相关的肽预先温育的图8B所述的高免疫血清纯化的IgG的免疫组织化学染色。
图9：在成年狒狒P.anubis中的UBI AD疫苗的免疫原性研究。(A部分)个体狒狒在第0、3、6周(箭头)以300μg/剂的配制在矿物盐中的UBI AD疫苗(◆，▲，●，■)免疫，并且通过ELISA测定抗-Aβ抗体滴度。注意到在第一次免疫后，4只狒狒中有3只产生抗-Aβ抗体滴度。(B部分)在休息72周后，个体狒狒于第78、81和104周(箭头)以300μg(低剂量，●，■)或1200μg(高剂量，◆，▲)配制在矿物盐中的UBI AD疫苗免疫，并测定抗-Aβ抗体滴度。注意到在单次疫苗加强后，所有的4只狒狒皆产生强抗-Aβ抗体反应。在2年试验期间结束时，所有狒狒保持健康及活力。
图10A：预防模式的UBI AD疫苗对来自过表达hAPP751的幼转基因小鼠的皮层的脑形态的影响。分析由用单独的佐剂处理的转基因小鼠、来自用UBI AD疫苗处理的小鼠的响应者和未处理的小鼠获得的脑样品的β淀粉样蛋白斑块负荷，发现当与未处理的和用单独的佐剂处理的那些相比较时，在UBI AD处理的响应者小鼠中减少的斑块数量和“较低的平均斑块尺寸/μm2”。
图10B：预防模式的UBI AD疫苗对来自过表达hAPP751的幼转基因小鼠的海马的脑形态的影响。分析由用单独的佐剂处理的转基因小鼠、来自用UBI AD疫苗处理的小鼠的响应者和未处理的小鼠获得的脑样品的β淀粉样蛋白斑块负荷，发现当与未处理的和用单独的佐剂处理的那些相比较时，在UBI AD处理的响应者小鼠中减少的斑块数量和“较低的平均斑块尺寸/μm2”。
图11A：预防模式的UBI AD疫苗对过表达hAPP751的幼转基因小鼠的脑组织提取物中β淀粉样蛋白肽(Aβ1-42)浓度的影响。小的初原纤维(protofibrils)由脑组织生物化学提取的Triton X-100级分获得。当与由来自未处理的转基因小鼠的Triton X-100级分产生的脑组织提取相比时，发现用UBI AD疫苗处理的转基因响应者小鼠具有少得多的初原纤维。
图11B：预防模式的UBI AD疫苗对过表达hAPP751的幼转基因小鼠的脑组织提取物中β淀粉样蛋白肽(Aβ1-42)浓度的影响。大的寡聚物和原纤维从脑组织生物化学提取的SDS去污剂级分获得。当与由来自未处理的转基因小鼠的SDS级分产生的脑组织提取相比时，发现用UBI AD疫苗处理的转基因响应者小鼠具有少得多的大寡聚物和原纤维。
图12：患者中经UBI AD疫苗治疗后的平均抗-Aβ1-14抗体滴度。绘制两组数据，一组来自在试验期间的第0周和第24/26周之间(n＝17，实线)获得的数据，另一组来自包括第0和48周之间的随访观察期间(n＝13，虚线)获得的数据。Aβ1-14抗体Log10滴度随着时间降低，但在研究结束时(第48周)在所有受试者中保持为正的。
图13：在年龄≥60岁且进行UBI AD疫苗试验具有≥20的基线MMSE得分的受试者中在第0和48周之间的平均ADAS-Cog(实心圆形)、MMSE(空心圆形)及抗-Aβ1-14抗体滴度(实心条状)。
图14：在具有轻度AD且年龄大于60岁的UBI AD疫苗(实心圆形)与在Tarenflurbil试验中来自轻度AD的安慰剂组(实心三角形)之间12个月期间平均ADAS-Cog分数的改变。与在Tarenflurbil试验中(Green等，JAMA 2009；302(23)：257-2564)接受安慰剂且在相同的时间期间表现出差的反应(具有增加的分数(3.81改变))的具有轻度AD的受试者相比，当在第0、4、12周用UBI AD疫苗免疫后4、6、12个月(-3.00改变)评价时，六名年龄≥60岁的具有轻度AD的受试者表现出改善，分数减小。
图15A：第I期临床试验中接受UBI AD疫苗的患者的免疫原性研究。在治疗前(V1/V2；浅灰色条)和在第16周免疫后(V7；黑色条)评价所有19名具有轻度至中度阿尔茨海默病的个体的血清样品的抗-Aβ抗体。使用在治疗前访视和第16周(即在第0、4和12周递送的三次UBI AD疫苗接种的最后一次后4周)采集的血清样品，通过ELISA检测评价针对Aβ1-28单体的抗体滴度(log10)。在免疫前样品中发现微量或没有抗体反应性(因此，在大部分配对数据比较中没有看到条)。在用Aβ1-28单体治疗后，所有个体都产生高滴度的抗Aβ抗体，所述Aβ1-28单体位于Aβ肽的N端，如在图16中所示。
图15B：第I期临床试验中接受UBI AD疫苗的患者的免疫原性研究。在治疗前(V1/V2；浅灰色条)和在第16周免疫后(V7；黑色条)评价所有19名具有轻度至中度阿尔茨海默病的个体的血清样品的抗-Aβ抗体。使用在治疗前访视和第16周(即在第0、4和12周递送的三次UBI AD疫苗接种的最后一次后4周)采集的血清样品，通过ELISA检测评价针对Aβ1-42单体的抗体滴度(log10)。在免疫前样品中发现微量或没有抗体反应性(因此，在大部分配对数据比较中没有看到条)。在用Aβ1-42单体治疗后，所有个体都产生高滴度的抗Aβ抗体，所述Aβ1-42单体位于Aβ肽的N端，如在图16中所示。
图15C：第1期临床试验中接受UBIAD疫苗的患者的免疫原性研究。在治疗前(V1/V2；浅灰色条)和在第16周免疫后(V7；黑色条)评价所有19名具有轻度至中度阿尔茨海默病的个体的血清样品的抗-Aβ抗体。使用在治疗前访视和第16周(即在第0、4和12周递送的三次UBI AD疫苗接种的最后一次后4周)采集的血清样品，通过ELISA检测评价针对Aβ1-42寡聚物的抗体滴度(log10)。在免疫前样品中发现微量或没有抗体反应性(因此，在大部分配对数据比较中没有看到条)。在用Aβ1-42寡聚物治疗后，所有个体都产生高滴度的抗Aβ抗体，所述Aβ1-42寡聚物位于Aβ肽的N端，如在图16中所示。
图16：利用经免疫的阿尔茨海默病患者的血清的表位绘图，用于Aβ1-42N端的精细特异性分析。在第16周由用UBI AD疫苗免疫的患者采集的血清样品中的抗体所识别的主要表位具体为Aβ1-10肽。该图表示来自接受三次剂量的UBI AD疫苗并产生2.198的针对Aβ1-14肽的抗-Aβ抗体Log10滴度的一名个体(P210)的典型的阳性表位-绘图反应。将血清以1：50比例稀释，用于表位绘图。峰高度表示受试者的样品对不同10-mer Aβ肽(SEQ ID NOs：6、8至30)的半最大抑制浓度(IC50)。观察到单一主峰，对应于对氨基端Aβ序列，SEQ ID No：6(Aβ1-10：DAEFRHDSGY)高度特异性的免疫反应性。
发明详述
本公开内容涉及个体Aβ肽免疫原构建体、包含这些Aβ肽免疫原构建体及其混合物的肽组合物、包含在疫苗制剂中的这些肽组合物的药物组合物，所述个体Aβ肽免疫原构建体具有Aβ肽的N端(Aβ1-10至Aβ1-14)作为B细胞(B)表位，通过间隔残基连接至源自病原体蛋白的异源性T辅助细胞(Th)表位，其共同作用刺激产生针对Aβ1-42肽N端的特异性抗体，以为有患阿尔茨海默病危险或患有阿尔茨海默病的患者提供保护性免疫应答。
本公开内容还包括治疗与预防阿尔茨海默病的方法。所公开的方法使用含有Aβ肽免疫原构建体的药物组合物，包括含有Aβ肽免疫原构建体的混悬疫苗制剂，其任选地通过静电缔合与高负电性的寡核苷酸如CpG寡聚物形成稳定的免疫刺激复合物，该复合物任选地进一步补充有作为佐剂的矿物盐类，用于施用给有患阿尔茨海默病危险或患有阿尔茨海默病的患者。本公开内容还包括使用疫苗制剂用来预防和治疗有患阿尔茨海默病危险或患有阿尔茨海默病的患者的方法，特别是关于包含所述Aβ肽免疫原的疫苗制剂的给药的剂量方案、模式与剂型
本公开内容还提供一种用于低成本制备和质量控制Aβ肽免疫原构建体和能够保护动物和有患阿尔茨海默病危险或患有阿尔茨海默病的患者的疫苗制剂的方法。本发明涉及稳定的免疫刺激复合物以及制备此免疫刺激复合物的方法。更具体地，本发明提供包含Aβ肽免疫原构建体与高负电性寡核苷酸，如CpG寡聚物的稳定的合成的免疫刺激复合物，所述高负电性寡核苷酸用于疫苗传递系统，具体提高的体内免疫应答。该免疫刺激复合物也可用于制备设计作为可控释放的储库制剂作用的疫苗制剂。
在另一方面中，本发明提供由从之前接受本发明的Aβ肽免疫原构建体的疫苗制剂的患者血液中分离的B细胞诱导的针对Aβ1-42的人单克隆抗体。
(a)β淀粉样蛋白(Aβ)肽
维基百科中题目为“Beta amyloid(β淀粉样蛋白)”的论文提供了该主题的最新的综述(http://en.wikipedia.org/wiki/Beta_amyloid)。该论文的互联网连接提供在本文中作为参考。
β淀粉样蛋白(Amyloid beta，Aβ或Abeta)是具有36-43个氨基酸的肽，是由淀粉样蛋白前体蛋白加工而来。Aβ是在阿尔茨海默病患者脑中发现的沉积的主要成分。还已经发现证据证实Aβ是高度多功能肽，具有显著的非病原活性。
淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的顺序切割后，形成Aβ，APP为具有未确定功能的跨膜糖蛋白。APP可被α-、β-与γ-分泌酶加工；经由β与γ分泌酶的连续作用产生Aβ蛋白。γ分泌酶产生Aβ肽的C端，其在APP的跨膜区内切割，并且可以产生多个长度为36-43个氨基酸的同种型。最常见的同种型为Aβ1-40(SEQ ID NO：2)与Aβ1-42(SEQ ID NO：1)；较长形式典型地是通过发生在内质网内的切割产生，而较短形式是通过跨高尔基体网络内的切割产生(Hartmann T，等，1997；Nature Medicine 3：1016-1020)。Aβ1-40形式是这两种中更为常见的，但Aβ1-42(SEQ ID NO：1)更具纤维原性(fibrillogenic)，故与疾病状态有关。
APP中的常染色体显性突变导致遗传性早发性阿尔茨海默病(hereditary early-onset Alzheimer′s disease)(家族性AD或FAD)。这种AD形式仅占所有病例不超过10％，且绝大多数的AD不伴有所述突变。然而，家族性阿尔茨海默病很可能是由改变的蛋白水解加工所造成的结果。总Aβ水平或Aβ1-40与Aβ1-42相对浓度的增加(其中前者更多集中在脑血管斑块，后者在神经炎斑块)已经牵涉在家族性与偶发性阿尔茨海默病的发病机制中。
由于其更为疏水性的性质，因此Aβ1-42为最常见的肽淀粉样蛋白形成形式。然而，已知中间序列KLVFFAE(Aβ16-22)、(SEQ ID NOs：31)本身会形成淀粉样蛋白，且可能会形成原纤维的核心。
大部分研究者接受“淀粉样蛋白假说”，即，阿尔茨海默病的病理学是由斑块造成。另一备选的假说则认为是淀粉样蛋白寡聚物(amyloid oligomers)而非斑块造成该疾病。利用基因工程改造来表达寡聚物而不是斑块(APPE693Q)的小鼠产生了该疾病。此外，将小鼠另外改造以将寡聚物转换为斑块(APPE693QX PS1ΔE9)，而该小鼠所受的伤害不比仅有寡聚物的小鼠大。原子力显微镜能够显现纳米级分子的表面，因此可用于在体外确定Aβ肽的聚集状态(寡聚物)。
有许多不同方式来测量β淀粉样蛋白，其可利用免疫组织染色半定量检测，这还允许进行定位。Aβ可能主要存在于血管，如脑淀粉样血管病(cerebral amyloidangiopathy)，或老年斑与血管区域中。
一种测量Aβ的高敏感性方法是通过定量酶免疫吸附测定(qELISA)，其利用一对识别Aβ的抗体进行。
成像化合物，尤其是Pittsburgh化合物B(6-OH-BTA-1，一种硫黄素)与florbetapir F18(18F-AV-45)，能够选择性地在体外和体内结合β淀粉样蛋白。此技术与正电子发射断层扫描(PET)组合已经用来对阿尔茨海默病患者中的斑块沉积区域成像。
(b)B细胞表位：Aβ肽N端
本发明涉及一种新颖的肽组合物，用于产生高滴度且对Aβ肽N端具特异性的寡克隆抗体(oligoclonal antibody)，其具有与AD患者脑中可溶性Aβ1-42和斑块的交叉反应性。通过合理设计努力提高所述肽组合物的位点特异性，使针对载体蛋白上不相关位点的抗体的产生最小化。
表1提供多种短的线性肽，包括来自Aβ1-42N端的肽片段。Aβ1-42(SEQ ID NO：1)和Aβ1-28(SEQ ID NO：3)肽充分长，足以引发免疫反应而无需载体蛋白。然而，更短的N-端Aβ肽，如Aβ1-14、Aβ1-12、Aβ1-10(SEQ ID NOs：4至6)本身是非免疫原型的，如在实施例7的表4中所示(在免疫原性研究中将第3组与第1和2组进行比较)。这一结果证实在氨基酸15-28存在使得Aβ1-28肽有免疫原性的自体T辅助细胞表位(Th)。短的Aβ片段可以通过化学偶联到载体蛋白上而被免疫强化(immunopotentiated)，例如，所示载体蛋白为实施例7中表6的第4组中所示的匙孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)。所述“Aβ肽-载体”疫苗的主要缺陷是由该组合产生的大部分(＞90％)抗体是非功能性的针对载体蛋白KLH的抗体，如在实施例7的表6第4组中所示，以及表位抑制的潜力。
本发明的肽免疫原包括10至14个氨基酸的起始于位置1的氨基酸Asp(D)的Aβ肽N端片段(10-至14-mer)。包含这些Aβ肽片段的整个合成的肽免疫原还包含所选的T辅助细胞表位(Th)(例如，SEQ ID NOs：33-47)，其具有多种II类MHC结合基序(MHC Class IIbinding motifs)，其引发专门集中在Aβ1-42肽上N端靶位点上的免疫应答，且对AD患者脑中的Aβ1-42肽与老年斑具有高度的交叉反应。
(c)异源性T辅助细胞表位(Th表位)
T细胞表位存在于抗原递呈细胞的表面，其结合至MHC分子。由I类MHC分子递呈的T细胞表位典型地是长为8至11个氨基酸的肽，而II类MHC分子递呈较长的肽，长度为13至17个氨基酸，且非典型MHC分子也递呈非肽表位，如糖脂类。
T辅助细胞(Th细胞)是淋巴细胞的亚组，一种类型的白细胞，其在免疫系统中特别是适应性免疫系统中起重要作用。其通过释放T细胞细胞因子来帮助其他免疫细胞的活性。在B细胞抗体种类转换中、细胞毒T细胞的活化与生长中、以及使吞噬细胞(如巨噬细胞)的杀菌活性最大化中，其是必需的。
T辅助细胞表位(Th表位)为递呈在抗原递呈细胞表面上的T细胞表位，在抗原递呈细胞表面上，其结合至II类MHC分子，且长度为13至17个氨基酸，其可被T辅助细胞特异性识别，如上所述。
结合至II类主要组织相容性复合物(Major Histocompatibility Complex(MHC))分子的肽对于免疫应答的起始和调节是关键的。预测结合至特定MHC分子的肽在确定可能的疫苗候选物中起重要作用。II类MHC的结合槽在两个末端是开放的，允许长于9-mer的肽进行结合。由于结合肽的长度不同且9-mer结合核心的位置变化，因此难以寻找促进肽与II类MHC分子结合的共有基序。当分子混杂且会与许多低亲合性肽结合时，难度水平将增加。
在过去20多年，本发明人及其团队已由多种病原体的蛋白中鉴定了许多可能的Th表位，所述Th表位具有与不同物种(如，人、猪、牛等)II类MHC分子结合的混杂结合基序，以作为异源性Th表位用于设计肽免疫原构建体(Wang CY，2004；美国专利号6,713,301 B1和Wang CY，2005；美国专利号6,906,169)，在所述肽免疫原构建体中，特定的目标B细胞表位(如，Aβ肽片段)可通过合理设计连接于所述Th表位的N端或C端，以增强免疫原性，产生针对所述B细胞表位的特异性的高滴度抗体(5，6)。应强调的是，用在疫苗中的所有合理设计的免疫原应该通过实验性免疫(作为筛选过程的一部分)确定所述Th表位的效果(如，实施例7的表4、5、6及7)，以选择优化的Th表位用于疫苗制剂。一种理想的Th表位包括多种混杂的II类MHC结合基序，以允许最大化的T辅助细胞活化，导致免疫应答的起始和调控，且通常本身是免疫静默的(immunosilent)，即由所述免疫原构建体产生的抗体都不针对所述Th表位(如，实施例7，表6的第1、2、3组，以及实施例8、9，表7的第1组)，由此允许非常集中的主要针对所靶向的B细胞表位的免疫应答。
Th是指包含Th表位的氨基酸(天然或非天然氨基酸)的序列。主题肽的Th结构域为约9至约25个氨基酸，优选约13至约17个氨基酸。Th片段及其功能性免疫学类似物包括Th表位的连续部分，该部分足以增强或刺激针对Aβ1-42肽约10至约14个氨基酸的N端片段(SEQID NOs：4至6)的免疫应答。
本发明表位包括，但不限于，来源于外源病原体的那些，如表2所示(SEQ ID NOs：33-41)。此外，Th表位包括理想化的人工Th与理想化的组合Th(SEQ ID NOs：42-47)。在单一固相肽合成中，同时产生包含组合Th的肽，其与N端Aβ肽序列串联。Th位点也包括免疫学类似物。免疫学Th类似物包括免疫增强类似物、交叉反应类似物、与这些Th表位中任何一种的片段。功能性免疫学Th类似物更包括在Th表位中保守性地置换、添加、删除与插入1至约5个氨基酸残基，其不会实质上改变Th表位的Th-刺激功能，最佳为源自麻疹病毒融合蛋白MVF1-5 Ths(SEQ ID NOs：34、41、42、44与46)、乙型肝炎表面抗原HBsAg 1-3 Ths(SEQ IDNOs：43、45、47)的Th表位的多个版本所示例的。
本发明的Aβ肽免疫原构建体具有约13至约20个氨基酸残基的Th表位，其通过“间隔子A”共价连接至Aβ1-42肽N端片段及其交叉反应或功能类似物的C端。本发明Aβ肽免疫原构建体(如SEQ ID NOs：48至65)的交叉反应与功能性类似物可以进一步包括保守性置换、添加、删除或插入1至约5个氨基酸，条件是所述肽类似物能够引发与Aβ1-42肽交叉反应的免疫应答。保守性置换、添加与插入可用本文定义的天然或非天然的氨基酸完成。
本发明优选的肽免疫原为含有下述的肽：Aβ1-42肽的N端片段(SEQ ID NOs：4至6)或其交叉反应免疫学类似物；间隔子(如，ε-Lys，Gly，或ε-Lys-Lys-Lys-Lys)；选自表2中的那些的Th表位(SEQ ID NOs：34、37、38、40-47)、(参照实施例7表4的免疫原性试验结果)。
Th表位肽的功能免疫学类似物(如，MvF Ths的各种序列，SEQ ID NOs：34、41、42、44与46；以及HBsAg Ths，SEQ ID NOs：43、45、47)也具有效果，且包括其作为本发明的部分。Aβ肽免疫原构建体的功能免疫学类似物包括SEQ ID NOs：49-51、54-55、57-65的变体和/或SEQ ID NOs：49-51、54-55、57-65的同源物，其保有实质上与原始肽SEQ ID NOs：51和60相同的免疫原性。例如，变体为功能类似物，其可在氨基酸位置具有保守性置换；整体电荷的改变；共价连接至其它结构部分；或其氨基酸添加、插入或删除；和/或它们的任意组合。
保守性置换是指一个氨基酸置换为另一种具有类似化学特性的氨基酸。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸与甲硫氮酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺与谷氨酰胺；正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸与组氨酸；以及负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸与谷氨酸。
在特定实施方案中，功能类似物与原氨基酸序列具有至少50％的同一性。在另一个实施方案中，功能类似物与原氨基酸序列具有至少80％的同一性。在另一个实施方案中，功能类似物与原氨基酸序列具有至少85％的同一性。在另一个实施方案中，功能类似物与原氨基酸序列具有至少90％的同一性。
在一个实施方案中，特定肽的功能免疫学类似物含有与原肽相同的氨基酸序列，且还包括3个添加到肽的氨基端的赖氨酸(Lys-Lys-Lys)。在此实施方案中，原肽序列含有3个赖氨酸可改变原肽的整体电性，但不会改变原肽的功能，如MVF Th肽系列(表2至7)所示例的。
表2显示Th表位肽功能类似物的另一种变异。具体地，MVF1 Th与MVF2 Th的SEQ IDNOs：34与41为MVF4 Th与MVF5 Th的SEQ ID NOs：44与46的功能类似物，原因在于它们在氨基酸框架中的不同在于分别在N-端和C-端删除(SEQ ID NOs：34和41)或包含(SEQ ID NOs：44和46)两个氨基酸。这两个系列的类似物序列之间的不同并不会影响这些序列中所含有的Th表位的功能(如，实施例7中表4的第7、8、14组vs.实施例7中表5的第1组与实施例8中表7的第1组)。
在其它变异中，异源性Th表位肽可为组合序列递呈，基于对特定肽同源的可变残基，其包含存在于肽骨架中特定位置的氨基酸残基的混合物。在合成过程中，可以通过在特定位置加入设计的保护的氨基酸的混合物而不是一种特定的氨基酸，可以一步合成组合肽集合(assembly of combinatorial peptides)。此组合异源性Th表位肽集合可允许对不同遗传背景的动物提供宽广的Th表位覆盖度。异源性Th表位肽的代表性组合序列包括SEQ IDNOs：42至45，如表2所示。本发明的表位肽对来自遗传多样性群体的的动物及患者提供宽广的反应性与免疫原性。
一般来说，本发明的Aβ肽免疫原构建体用下式表示：
(Aβ1-42肽的N端片段)-(A)o-(Th)-X
其中，
(Aβ1-42肽的N端片段)为B细胞表位，其选自由约10至约14个氨基酸的SEQ ID NOs：4至6组成的组；
每个A独立地为氨基酸选自由氨基酸Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α，ε-N)Lys或ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NOs：32)组成的组的连接团基(linking group)；
每个Th包括组成辅助T细胞表位的氨基酸序列，选自由SEQ ID NOs：34、37、38、40至47及其功能免疫学类似物组成的组；
X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2；并且
o为0至约4。
本发明Aβ肽免疫原构建体包含约20个至约50个氨基酸残基，优选为约25个至约40个氨基酸残基。
由间隔子(A)所提供的构象分离允许所递呈的Aβ肽免疫原构建体与适当的Th细胞与B细胞之间更有效的相互作用，由此增强Aβ肽免疫原构建体或其交叉反应性功能免疫学类似物的免疫原性。
(d)组合物：
(i)肽组合物：
本发明组合物可含有一或多个Aβ肽免疫原构建体。包含Aβ肽免疫原构建体与两个以上Th表位的混合物的肽组合物可制备成药物/疫苗的制剂，从而由于更宽泛的II类MHC覆盖度而允许协同性增强更宽的遗传群体中的免疫原性。这样的组合物能够提供对Aβ1-42肽的改善的免疫应答。
例如，组合物可含有如表3所示的Aβ肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：48至65)，它们的同源物、类似物和/或其组合。更特别的是，肽组合物可含有具有选自SEQ ID NOs：62、63、64、65的序列的Aβ肽免疫原构建体，其同源物、类似物和/或其组合(如实施例7所示的SEQID NOs：62与63等摩尔混合物，或如实施例8、9和10所示的SEQ ID NOs：64与65等摩尔混合物)。
(ii)药物组合物：
本更宽内容还涉及包含Aβ肽免疫原构建体混合物的组合物，其为用于治疗和/或预防有患AD的危险或患有AD的患者中的阿尔茨海默型痴呆的药物组合物。
组合物可以液体形式(例如，溶液或混悬液)制备。典型地，组合物可以制成液体溶液或混悬液的注射剂型。也可制成注射前的液体赋型剂。适于其它给药方式的另外的制剂包括口服与鼻内给予。本发明组合物在治疗上述病况上的有效剂量会依据许多因素而改变，包括给药方式、目标位置、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其他药物和治疗是预防性的还是治疗性的。患者通常为人类，但也可以治疗非人类哺乳动物，包括转基因哺乳动物。
药物组合物配制成含有有效量的Aβ肽免疫原构建体及药学上可接受的载体。药物组合物还配制成适合的单位剂型，通常含有约0.5μg至约1mg免疫原/每kg体重。当以多个剂量递送时，药物组合物可以便利地分成每单位机型适当量。疫苗及治疗技术领域中公知，给药的剂量取决于受试者的年龄、体重与一般健康。
(iii)药学疫苗制剂：
在某些实施方案中，含有Aβ肽免疫原构建体的药物组合物用于在疫苗宿主内引发针对Aβ肽N端的免疫应答。本发明含有Aβ肽免疫原构建体的药物组合物可作为疫苗，以预防及治疗疫苗宿主或有患AD的危险或患有AD的患者的阿尔茨海默型痴呆。
此外，组合物可含有药学上可接受的传递系统中的载体和/或其他添加剂。因此，含有Aβ肽免疫原构建体的组合物可使用佐剂、药学上可接受的载体或其他成分(包括，常规提供在疫苗制剂中的免疫佐剂)制备成药学疫苗制剂。免疫学佐剂定义为“在与特异性疫苗抗原合并使用时，起作用加速、延长或增强抗原特异性免疫应答，而本身不具有任何特异性抗原性作用的任何物质”。有许多已知的佐剂已被广泛使用，包括油、铝盐与病毒体。两种常见的盐类，包括磷酸铝(如，Adjuphos)与氢氧化铝(如，铝胶)，为人类疫苗中最常见的佐剂。本领域技术人员公知用于选择矿物盐类以及确定要用的矿物盐或其组合的优选浓度的方法。
其他也可以在本发明中用作佐剂的成分包括liposyn、皂苷、角鲨烯、L121、Emulsigen、单磷酸脂A(MPL)、QS21、ISA35、ISA206、ISA50V、ISA51与ISA720、以及其它有效的佐剂与乳化剂。在特定实施方案中，递送载体(delivery vehicle)与佐剂为MontanideTMISA51(一种由植物油和油酸二缩甘露醇酯组成的油类佐剂组合物，用于形成油包水乳液剂)、80(还称为：聚山梨酯80或聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯)、CpG寡核苷酸、和/或它们的任意组合。在另一个实施方案中，药物组合物为以Emulsigen或Emulsigen D作为佐剂的水包油包水(即，w/o/w)乳液剂。
作为疫苗的药物组合物可以配制成速释或缓释制剂。此外，可以配制药物组合物，以通过免疫原捕捉(immunogen entrapment)和与微粒共同给药而诱导全身性或局部黏膜免疫性。此类递送系统是本领域的一名普通技术人员容易确定的。
含有本公开内容的Aβ肽免疫原构建体的各种疫苗制剂可有效地保护与治疗疫苗宿主或有患AD的危险或患有AD的患者的阿尔茨海默型痴呆。
(iv)Aβ肽免疫刺激复合物：
在某些实施方案中，药物组合物可以包含含有(a)CpG寡核酸和(b)Aβ肽免疫原构建体的免疫刺激复合物。此免疫刺激复合物特异性地适合作为佐剂以及肽免疫原稳定剂。免疫刺激复合物以颗粒的形式存在，其可有效地将Aβ肽免疫原构建体呈递给免疫系统的细胞，以产生免疫应答。免疫刺激复合物可配制成肠胃外给药的混悬剂。免疫刺激复合物也可制备成w/o乳液剂形式，作为合并矿物盐或原位胶凝聚合物的混悬剂，其用于在肠外给药后，有效地将Aβ肽免疫原构建体递送至疫苗宿主免疫系统的细胞，以产生具有保护性益处的抗-Aβ免疫应答。本发明涉及一种稳定的免疫刺激复合物，其包含阳离子的Aβ肽免疫原构建体及阴离子的分子或寡核苷酸或聚核苷酸及其组合，以及涉及通过静电缔合与阴离子分子或寡核苷酸或聚核苷酸复合而稳定阳离子的Aβ肽免疫原构建体的方法。所稳定的免疫刺激复合物可以结合在药物组合物中，作为免疫原递送系统。
本文所述作为“阳离子肽”的Aβ肽免疫原构建体是指一种在5.0至8.0范围内的pH带正电荷的肽。肽或肽混合物(cocktail)上的净电荷是这样计算的：将序列中每个赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)设为+1电荷，将每个天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)设为-1电荷，且其它氨基酸的电荷设为0。在未被取代时，各个肽的N-端胺基(+1)与C-端羧基(-1)末端基团的电荷分布有效地彼此抵消。将各个肽电荷加总，表示为平均净电荷。适当的肽免疫原具有+1的平均净正电荷平均。优选地，此肽免疫原具有大于+2范围内的净正电荷。
本文所述的“阴离子分子”是指在5.0-8.0范围内的pH带负电荷的分子。寡聚物或多聚物的净负电是这样计算的：将寡聚物中每个磷酸二酯或硫代磷酸酯设为-1电荷。适当的阴离子寡核苷酸为具8至64个核苷酸碱基的单链DNA分子，其中CpG基序重复数在1至10范围内。优选地，CpG免疫刺激性单链DNA分子含有18至48个核苷酸碱基，其中CpG基序重复数在3至8范围内。
更优选地，阴离子寡核苷酸由下式表示：5′X1CGX23′，其中C与G为非甲基化的，X1选自由A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)与T(胸腺嘧啶)组成的组，且X2为C(胞嘧啶e)或T(胸腺嘧啶)。或者，阴离子寡核苷酸由下式表示：5′(X3)2CG(X4)23′，其中C与G为非甲基化的，且X3选自由A、T或G组成的组；且X4为C或T。
所得到的免疫刺激复合物为尺寸典型地在1至50μm范围内的颗粒形式，且具有许多因子的功能，包括相对的电荷化学计量与相互作用种类的分子量。颗粒状免疫刺激复合物具有提供佐剂与上调体内特异性免疫应答的附加优点。此外，稳定的免疫刺激复合物适合以各种程序，包括油包水乳液剂、矿物盐混悬液与聚合物凝胶来制备疫苗制剂。
(e)制备方法
本公开内容还涉及用于制备Aβ肽免疫原构建体、组合物与药物组合物、疫苗制剂的方法，其用于引发免疫应答并且保护有患AD的危险或患有AD的患者。
(i)制备Aβ肽免疫原构建体的方法
本发明的肽免疫原可以通过普通技术人员公知的化学合成方法制备。例如，参照Moore V.在Synthetic Peptides：A User’s Guide(合成的肽：使用者指导)中的第2章，ed.GA Grant，W.H.Freeman&Co.，New York，NY，1992，p.63-67。因此，可以利用自动固相合成Merrifield技术在例如应用生物系统肽合成仪型号430A或431(Applied BiosystemsPeptide Synthesizer Model 430A或431)上使用侧链保护的氨基酸以t-Boc或F-moc化学保护的α-NH2合成肽。可通过在给定的可变位置提供备选氨基酸的混合物完成肽构建体(包括关于Th表位的组合文库肽)的制备。
在需要的肽免疫原完全组装后，依据标准程序处理树脂将肽由树脂上切割下来，并去除氨基酸侧链的官能团。以HPLC纯化游离的肽，并进行生化表征，例如，通过氨基酸分析或通过测序进行。肽的纯化及表征方法是本技术领域普通技术人员公知的。
还可以通过在分支的聚-赖氨酰核心树脂上直接合成所需要的肽构建体将本发明的免疫原制备为分支的聚合物(Wang等，Science，1991；254：285-288)。
由该化学方法产生的肽的质量可以被控制和限定，因此，可以确保抗原性、免疫原性及产量的再现性。以固相肽合成制备Aβ相关肽或肽免疫原构建体的详细内容在实施例1中显示。
在合成肽25年的免疫学应用过程中，申请人已发现允许保留目的免疫学活性的结构变异范围，比起允许保留小分子药物的特定药物活性或与生物来源的药物共同产生的大分子中存在的需要的活性或毒性的结构变异范围更具包容性。因此，与目的肽具有相似的色谱和免疫学特性的肽类似物，不论是刻意设计的还是因合成程序错误而无法避免地作为缺失序列副产物的混合物产生的，通常与经纯化的需要的肽的制剂一样有效。只要建立严格的QC程序，以控制制造过程与产品评估过程，确保使用这些肽的终产物的再现性与有效性，则经设计的类似物与非预期的类似物的混合物也是有效的。
此肽也可利用重组DNA技术制备，所述重组DNA技术包括核酸分子、载体和/或宿主细胞。因此，编码Aβ肽免疫原构建体和Aβ肽免疫原构建体的免疫学功能类似物及其类似物/同源物的核酸分子也作为本发明的一部分包括在本公开内容中。同样地，载体，包括含有核酸分子的表达载体，以及含有载体的宿主细胞也作为本发明的一部分包括在本公开内容中。
多个示例性的实施方案中亦包括制备Aβ肽免疫原构建体以及Aβ肽免疫原构建体的免疫学功能类似物的方法。例如，方法可包括在表达肽和/或类似物的条件下培养含有表达载体的宿主细胞的步骤，所述表达载体包含编码Aβ肽免疫原构建体和/或其免疫学功能类似物的核酸分子。可以通过公知的重组DNA技术合成较长的合成肽免疫原。公知的标准手册以详细的流程提供了此类技术。为构建编码本发明的肽的基因，将该氨基酸序列反向翻译，以获得编码该氨基酸序列的核酸序列，优选地具有关于所述基因被表达的生物体优化的密码子。接着，典型地通过合成编码肽的寡核苷酸和任意的调节元件(如果需要的话)来制成合成的基因。将此合成的基因插入适当的克隆载体中，并转染至宿主细胞。然后，在适合所选的表达系统与宿主的适当条件下表达此肽。通过标准方法纯化此肽并进行表征。
(ii)制备免疫刺激复合物的方法
多种实施方案中也包括制造包含Aβ肽免疫原构建体与CpG寡脱氧核苷酸(ODN)分子的免疫刺激复合物(ISC)的方法。在一个实施方案中，图5A所示，稳定的免疫刺激复合物源自于阳离子肽与聚阴离子CpG ODN分子。图5A示例受电荷的静电中和驱动的自组装系统(self-assembling system)。阳离子肽对阴离子寡聚物的摩尔电荷比的化学计量决定缔合的程度。肽免疫原与CpG ODN的非共价静电缔合是完全可再现的步骤。肽/CpG ODN免疫刺激物复合物自我聚集，并且促进向免疫系统中的“专业”抗原递呈细胞的呈递，因此进一步增强该复合物的免疫原性。在制造过程中，这些复合物易于表征用于质量控制。肽/CpG ISC在体内是良好耐受的。
在一个实施方案中，疫苗制剂(UBI AD疫苗)使用两种Aβ肽免疫原构建体(SEQ IDNOs：64与65)，它们以等摩尔比例制成，与拥有专利的(proprietary)CpG ODN混合，在溶液中自发性地形成免疫刺激复合物，如实施例8和9所述。设计这种新型的颗粒系统，包括CpGODN和Aβ肽免疫原构建体，以利用与CpG ODN应用相关的广泛性的B细胞有丝分裂(mitogenicity)，还促进平衡的Th-1/Th-2型反应。
本公开的疫苗制剂中的CpG ODN在通过相反电荷的静电中和介导的过程中100％与免疫原结合，形成微米尺寸的颗粒。此颗粒形式允许显著降低传统CpG佐剂应用的CpG剂量，具有较少的不利的先天免疫应答的潜力，并促进包括抗原递呈细胞(APC)的备选免疫原加工途径。因此，所公开的制剂(UBI AD疫苗)为新颖的构想，且通过经由备选机制来促进免疫应答的刺激而提供益处。
(iii)制备疫苗制剂的方法
多个实施方案中还包括使用油包水乳液与矿物盐混悬的疫苗制剂，入在图5B中所示。为了设计被大的群体使用并具有预防性(也作为给药的目标的一部分)的疫苗，安全性成为另一个需要考虑的重要因素。尽管在临床试验中在人中使用油包水乳液作为多种疫苗制剂，由于其数十年的安全性测试，明矾仍然是用于疫苗制剂的主要佐剂。在临床应用上，明矾或其矿物盐类Adjuphos(磷酸铝)作为佐剂用在制剂中，如实施例8和9所示。
(f)治疗与预防阿尔茨海默病的方法
(i)治疗方案
在预防性的应用中，将药物组合物施用给易患或有患阿尔茨海默病的危险的患者，所述药物组合物的量足以消除或降低所述危险，减轻严重性，或延缓疾病(包括疾病发展过程中的并发症和中间病理学表型)的发作(生化、组织和/或行为上)。
在治疗应用上，将组合物施用给怀疑或已经患有所述疾病的患者，所述组合物的量足以治愈、或至少部分阻滞疾病(包括疾病发展过程中的并发症和中间病理学表型)的症状(生化、组织和/或行为上)。
在某些方法中，药剂的给予减少或消除尚未发生特征性的阿尔茨海默病变的患者的轻度认知障碍。足以实现治疗或预防性治疗的量被定义为治疗或预防有效的剂量。在预防性与治疗性方案中，药剂通常以多个剂量给药，直到已经获得充分的免疫应答。典型的，监测免疫应答，若免疫应答开始变弱，则给予重复剂量。
(ii)适于治疗的患者
适于治疗的患者包括具有发生阿尔茨海默病的危险但尚未显示症状的受试者，以及目前显示出症状的患者。
本文所用的术语“预防性治疗”涉及目的为终止引起疾病的致病过程的治疗。
本文所用的术语“治疗”涉及目的为终止导致疾病进展和/或具有症状作用的致病过程的治疗。
事实上，如果他或她活的够久，任何人都有罹患阿尔茨海默病的危险。因此，本发明的方法可预防性施用给一般群体，而不需对该受试患者进行任何风险评估(即，任何活着的人都可以定性为患者)。本发明的方法特别可用于确实具有已知的患阿尔茨海默病的遗传风险的个体。所述个体包括有已经经历该疾病的亲属的那些，和通过基因或生化标记分析确定其风险的那些。针对阿尔茨海默病的风险的基因标志包括APP基因突变，特别是第717位置与第670及671位置的突变，分别称为Hardy与Swedish突变(参照Hardy J.Trendsin Neurosciences 1997；20：154-159)。其它风险标志是在早老素(presenilin)基因、PS1、PS2与ApoE4中的突变，AD、高胆固醇血症(hypercholesterolemia)或动脉粥样硬化(atherosclerosis)的家族病史。
一般来说，患者选自由下述患者组成的受试者风险组：患有轻度认知障碍的患者、具有已知的与阿尔茨海默病相关的基因型的患者、具有21号三体性(Trisomy 21)的患者(即，可能的唐氏综合症(Down′s syndrome)患者)、具有指示阿尔茨海默病的风险的替代标记的患者。
在无症状的患者中，可在任何年纪(如10、20、30岁)开始治疗。没必要直到患者年龄到40、50、60或70岁时才开始治疗。在可能的唐氏综合症患者的情形中，可以通过在出生前对母亲或在出生后立即施用治疗剂而开始治疗。
目前患有阿尔茨海默病的个体可以通过特征性的痴呆症以及存在上文所述的风险因子而鉴别，所述特征性的痴呆症用在本文中特别涉及按照精神障碍诊断与统计手册，第4版(DSM-IV)标准(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，4thedition(DSM-IV)criteria)定义的疾病。此外，有多种诊断测试可用于鉴定患有AD的个体。这些包括测量CSF tau与Aβ1-42的水平。升高的tau与减少的Aβ1-42水平表示AD的存在。也可利用NINCDS-ADRDA的阿尔茨海默病标准来诊断患有阿尔茨海默病的个体。
通常，治疗需要在一段时间内接受多个剂量。可以通过随时间测定针对所述治疗剂的抗体或活化的T细胞或B细胞反应(如，Aβ1-42ELISA)来监测治疗。若反应下降，表示需要加强剂量。
已积累了大量的证据表明Aβ-淀粉样蛋白肽(老年淀粉样蛋白斑的主成分)在AD中起因果性作用。用于AD的成功的减轻疾病的治疗可能包括影响β-淀粉样蛋白在脑中沉积的产品。由免疫系统主动产生或被动给予的Aβ-特异性抗体持续地减少不同转基因小鼠中的斑块。然而，由于不可接受的副作用(6％的接受治疗的患者会产生脑膜脑炎，Orgogozo JM，等.Neurology 2003；61：46-54.)，第一个刺激AD患者的免疫系统以产生抗-Aβ抗体的临床试验尝试不得不中止。
令人惊讶的是，使用本文公开的利用两种分别与两种来源于麻疹病毒融合(MVF)蛋白与乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的理想化的人工T辅助表位连接的等摩尔比例的Aβ1-14肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：64与65)的制剂(UBI AD疫苗)没有观察到不利的免疫反应或微出血(microhemorrhages)的发生。
在所公开的方法的第一方面中，令人惊讶地发现，Aβ肽免疫原构建体有利地可以肌内给予患有痴呆的恒温动物，特别是人。
在第二方面中，本发明提供一种用于肌肉施用Aβ肽免疫原构建体的剂型。Aβ肽免疫原构建体的优选的肌内剂型为只有的疫苗制剂，其在作为佐剂的矿物盐的存在下，含有30μg至1000μg/0.5mL/剂的与CpG ODN复合的肽免疫原构建体，优选100μg至400μg/0.5mL/剂，且更优选为300μg/0.5mL/剂。所述剂型可以保存在2至8℃直至使用前不久。剂型优选地利用注射器以肌内注射施用至恒温动物中，特别是手臂。对于剂型的加热，可将所述剂量置于环境温度约15分钟至45分钟，如，30分钟。优选地，在抽取药物物质之前，可将药瓶轻轻颠倒几次使潜在的看不到的颗粒分散。
在第三方面中，本发明涉及一种预防及治疗人患者中的痴呆症的方法，所述方法包括在初始免疫后第0、4和8周初始致敏后约每12周一次、优选约每26周一次、特别是约52周一次向有此需要的人患者施用每剂量30μg至1000μg/0.5mL，优选每剂量100μg至400μg/0.5mL，更优选每剂量约300μg/0.5mL。注射的频率可依据患者的反应而不同。例如，如果必须依据抗体滴度来确定注射，则给药的频率可能不同。
Aβ肽免疫原构建体在治疗上文提及的病症中的效用能够在适当的临床研究中证实，例如，总共给予3次剂量，在第0、4、12周每次给予每剂量300μg/0.5mL的疫苗制剂，任何持续超过9个月，如在实施例中所述的那些。依据抗体滴度，可以每3、6或12个月给予一次继续免疫。
适当的临床研究是在有患阿尔茨海默病的风险或具有阿尔茨海默病的症状的患者中进行的开放标签研究，或特别是随机的、双盲的、安慰剂对照的、平行的研究。
在特别实施方案中包括疫苗制剂(UBI AD疫苗)，其含有两种Aβ肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：64与65)的混合物，其中每一个Aβ1-42肽的N-端(Aβ1-14，SEQ ID NOs：4)合成连接至T辅助(Th)表位(SEQ ID NOs：46与47)，没有在接受AN-1792疫苗(聚集的Aβ1-42，Elan/Wyeth)的患者中对自体性Th表位观察到毒性作用。在小动物狒狒和猕猴中的体外研究及体内研究显示产生具有预测的N-端位点特异性的抗体，且这些抗体具有功能上的免疫原性以中和Aβ的毒性，并促进斑块的清除。此抗体似乎引导Aβ1-40由CNS进入周边循环。结果表示疫苗没有激发抗-Aβ1-42细胞性反应。在重复剂量的急性和慢性毒性研究中证实此疫苗在食蟹猴中具有良好的耐受性。实施例8和9中实施的UBI AD疫苗制剂的安全性与免疫原性进一步在患有轻度至中度AD的患者的I期临床试验中检测，并且发现，在第0、4和12周肌肉免疫后，在所有19位患者产生具有针对Aβ1-14肽N端的特异性的抗体，由此达到前所未有的100％反应率，而没有导致任何严重或无法忍受的不利事件。轻度AD老年受试者的亚组(n＝6；年龄≥60岁，基线MMSE≥20)显示出对UBI AD疫苗制剂的高度抗体反应和改善的认知和功能结果，如在6个月的核心研究过程中和在6个月的观察随访期间，通过(i)ADAS-Cog(ADAssessment Scale-Cognitive(AD评估标准-认知))；(ii)ADCS-CGIC(Alzheimer′sDisease Cooperative Study-Clinical Global Impressions of Change(阿尔茨海默病合作研究-临床变化全球影响))，以及(iii)MMSE(Mini-Mental State Exam(迷你-精神状态检查))评分与基线评分比较测定的。ADAS-Cog是在临床试验中最常用的认知检测仪器。ADAS-Cog由11个任务(70点)组成，其测量记忆、语言、习惯(praxis)、注意力和其他认知能力的障碍，这些通常视为AD的核心症状(评分增加表示恶化)。ADCS-CGIC是从基线改变的单一全球等级(评分减少代表恶化)。MMSE是最常用于筛查认知功能的手段，并且提供方位、定位、短期记忆、语言功能的测量(评分减少代表恶化)。在IIa期试验中，利用生物标志(分子诊断、脑部成像、基因分型)来评估疫苗制剂在轻度AD患者中的效力，包括评估通过经由主动免疫增加循环中的抗-Aβ1-14抗体(可能减少脑中毒性Aβ寡聚物的浓度)对疾病进展的减缓。
(g)特定实施方案
本发明特定的实施方案包括，但不限于下述：
(1)一种Aβ肽免疫原构建体，其包括下式：
(Aβ1-42肽的N-端片段)-(A)o-(Th)-X
其中(Aβ1-42肽的N-端片段)为来自Aβ的包括选自由SEQ ID NOs：4、5和6组成的组的约10至约14个氨基酸残基的B细胞表位；
各个A独立的为选自由下列组成的组的氨基酸或连接基团：氨基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α，ε-N)Lys、和ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NOs：32)；
各个Th包括构成辅助T细胞表位的氨基酸序列，所述辅助T细胞表位选自由SEQ IDNOs：34、37、38、40至47及其功能免疫学类似物组成的组；
X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2；和
o为0至约4。
(2)(1)的Aβ肽免疫原构建体，其中所述(Aβ1-42肽的N-端片段)为Aβ1-14(SEQ ID NO：4)。
(3)(1)的Aβ肽免疫原构建体，其中A为ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NOs：32)。
(4)(1)的Aβ肽免疫原构建体，其中所述Th表位为SEQ ID NOs：45或46。
(5)(1)的Aβ肽免疫原构建体，其包括SEQ ID NOs：48-65的氨基酸序列。
(6)(1)的Aβ肽免疫原构建体，其基本上由SEQ ID NOs：62-65的氨基酸序列组成。
(7)(1)的Aβ肽免疫原构建体，其为SEQ ID NOs：62、63、64和/或65。
(8)一种组合物，其包括权利要求1的Aβ肽免疫原构建体。
(9)一种药物组合物，其包括：
a.(1)的Aβ肽免疫原构建体；以及
b.药学上可接受的递送载体和/或佐剂。
(10)一种阿尔茨海默病疫苗组合物，其包括
a.(1)的Aβ肽免疫原构建体；以及
b.药学上可接受的递送载体和/或佐剂。
(11)一种阿尔茨海默病疫苗组合物，包括
a.(7)的Aβ肽免疫原构建体；以及
b.药学上可接受的递送载体和/或佐剂。
(12)(10)的阿尔茨海默病疫苗组合物，其中(b)中的佐剂为铝矿物盐，其选自由铝胶(Al(OH)3)或adjuphos(AlPO4)组成的组。。
(13)(10)的阿尔茨海默病疫苗组合物，其中(a)中的肽抗原与CpG寡脱氧核苷酸(ODN)混合以形成稳定的免疫刺激复合物。
(14)一种分离的抗体或其表位结合片段，其结合至(1)中Aβ肽免疫原构建体的(Aβ1-42肽的N-端片段)组分。
(15)(14)的分离的抗体或其表位结合片段，其特异性结合至Aβ1-10(SEQ ID NO：6)。
(16)(14)的分离的抗体或其表位结合片段，其结合至权利要求1所述的Aβ肽免疫原构建体。
(17)(15)的分离的抗体或其表位结合片段，其结合至SEQ ID NO：6。
(18)一种组合物，其包括(14)的分离的抗体或其表位结合片段。
(19)一种降低人患者中痴呆的严重性或延缓其发病的方法，所述方法包括施用(10)所述的疫苗制剂。
(20)(19)的方法，其中所述疫苗制剂以包括10μg-1000μg/剂的水溶液施用给有患AD的危险或患有AD的患者。
(h)其它实施方案
(1)本发明的Aβ肽免疫原构建体由下式所示：
(Aβ1-42肽的N-端片段)-(A)o-(Th)-X
其中(Aβ1-42肽的N-端片段)为约10至约14个氨基酸残基的B细胞表位，其选自由SEQ ID NOs：4至6组成的组；
各个A独立地为选自由下列组成的组的氨基酸或连接基团：氨基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α，ε-N)Lys、或ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NOs：32)；
各个Th包括构成辅助T细胞表位的氨基酸序列，其，选自由SEQ ID NOs：34、37、38、40至47及其功能免疫学类似物组成的组；
X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2；以及
o为0至约4。
(2)一种阿尔茨海默病(AD)疫苗组合物，其包括：
a.(1)的Aβ肽免疫原构建体；
b.(a)的功能免疫学类似物；
c.(a)或(b)的任何组合；以及
d.可接受的递送载体或佐剂。
(3)(2)所述的AD疫苗，其中(d)的佐剂为铝矿物盐铝胶(Al(OH)3)或adjuphos(AlPO4)。
(4)(2)所述的AD疫苗，其中(a)的肽抗原与CpG寡脱氧核苷酸(ODN)混合以形成稳定的免疫刺激复合物。
(5)一种阿尔茨海默病(AD)疫苗组合物，其包括：
a.一种Aβ肽免疫原构建体，其选自由SEQ ID NOs：49-51、54、55与57-65组成的组；
b.(a)的功能免疫学类似物；
c.(a)或(b)的任何组合；以及
d.可接受的递送载体或佐剂。
(6)一种阿尔茨海默病(AD)疫苗组合物，其包括：
a.(5)所述的Aβ肽免疫原构建体；
b.(a)的功能免疫学类似物；
c.(a)或(b)的任何组合；以及
d.可接受的递送载体或佐剂。
(7)(5)所述的AD疫苗，其中(d)的佐剂为铝矿物盐铝胶(Al(OH)3)或adjuphos(AlPO4)。
(8)(5)所述的AD疫苗，其中(a)、(b)或(c)的抗原肽与CpG寡脱氧核苷酸(ODN)混合以形成稳定的免疫刺激复合物。
(9)(5)所述的AD疫苗，其中(a)、(b)或(c)的肽抗原与CpG寡脱氧核苷酸(ODN)混合以形成稳定的免疫刺激复合物，并且其中(d)的佐剂为铝矿物盐铝胶(Al(OH)3)或adjuphos(AlPO4)。
(10)一种阿尔茨海默病(AD)疫苗组合物，包括：
a.一种Aβ肽免疫原构建体，其选自包括SEQ ID NOs：62+63，64+65的组；
b.(a)的功能免疫学类似物；
c.(a)或(b)的任意组合；以及
d.可接受的递送载体或佐剂。
(11)一种组合物，其包括：
a.Aβ肽免疫原构建体，其包括SEQ ID NO：64与SEQ ID NO：65的混合物；以及
b.(a)进一步与CpG ODN混合的混合物。
(12)一种药物组合物，其包括：
a.Aβ肽免疫原构建体，其包括SEQ ID NO：64与SEQ ID NO：65的混合物；
b.(a)进一步与CpG ODN混合的混合物；以及
c.Adjuphos。
(13)一种药物组合物，其包括：
a.Aβ肽免疫原构建体，其包括SEQ ID NO：64与SEQ ID NO：65的混合物；
b.(a)进一步与CpG ODN混合的混合物；以及
c.铝胶。
(14)一种降低人中痴呆的严重性或延缓其发病的方法，所述方法包括向人施用(13)的药物组合物至人类。
(15)一种降低人中痴呆的严重性或延缓其发病的方法，所述方法包括向人施用剂量为300μg/0.5mL/剂的(13)的药物组合物。
(16)一种降低人中痴呆的严重性或延缓其发病的方法，所述方法包括：
a.向人施用剂量为300μg/0.5mL/剂的(13)的药物组合物至人类；以及
b.在第0、4与12周给药作为致敏。
(17)一种降低人中痴呆的严重性或延缓其发病的方法，所述方法包括：
a.向人施用剂量为300μg/0.5mL/剂的(13)的药物组合物；以及
b.在第0、4与12周给药作为致敏；以及
c.在(b)步骤后，每3个月加强一次，和/或每6个月加强一次，和/或每12月加强一次。
(18)(14)-(17)任一所述的方法，其中所述施用通过肌内注射进行。
(19)(14)-(18)任一所述的方法，其中所述人具有轻度AD，MCI，或未显示出AD迹象或症状但超过60岁。
(20)如(19)的方法，其中向人的施用如下所示：
a.若人具有轻度AD，施用是用于治疗AD；
b.若人具有MCI，施用是用于预防和/或减轻痴呆的严重性和/或延迟痴呆的发病；以及
c.若人未显示出AD迹象或症状但超过60岁，施用是用于预防和/或减轻痴呆的严重性和/或延迟痴呆的发病。
(21)(2)-(10)任一项所述的AD疫苗，其中(a)的抗原肽与寡脱氧核苷酸CpG混合以形成稳定的免疫刺激复合物。
(22)如上述的AD疫苗，其中(a)的Aβ肽免疫原构建体包括SEQ ID NOs：17至20的氨基酸序列。
(23)如上述的AD疫苗，其中(a)的Aβ肽免疫原构建体包括SEQ ID NOs：19与20的氨基酸序列。
(24)如上述的AD疫苗，其中(a)的肽抗原总量为每剂量约10μg至约1mg。
(25)如上述的AD疫苗，其中所述递送载体或佐剂选自由下述组成的组：MontanideISA50V、聚氧乙烯20失水山梨糖醇单油酸酯、Emulsigen、Emulsigen D及CpG寡核苷酸。
(26)一种降低人患者中痴呆的严重性或延缓其发病的方法，所述方法包括施用如上任一项所述的疫苗制剂。
(27)如上任一项所述的方法，其中所述痴呆为阿尔茨海默型痴呆或具有样淀粉样蛋白脑血管病变的血管性痴呆。
(28)如上任一项所述的方法，其中所述痴呆为与帕金森病或雷维小体痴呆(LewyBody dementia)相关的痴呆。
(29)如上任一项所述的方法，其中所述疫苗制剂以每剂量包括10μg至1000μg的水溶液施用给有患AD的危险或患有AD的患者。每剂量100至750μg或每剂量300μg也是可接受的。300μg可以是临床试验中所用的有效的目标剂量。
(30)施用可以是每3个月一次和/或每6个月一次和/或每12个月一次。
(31)施用可以依据抗体滴度来决定疫苗施用的频率。
(32)如上任一项所述的方法，其中所述患者具有发生成阿尔茨海默病的风险，且所述患者选自由下列组成的组：具有轻度认知障碍的患者、具有已知与阿尔茨海默病相关的基因型的患者、具有21号三体性的患者、以及具有指示阿尔茨海默病的替代标记的患者。
(33)如上任一项所述的方法，其中所述具有已知与阿尔茨海默病相关的基因型的患者包括具ApoE4基因型的患者。
(34)如上任一项所述的方法，其中包括(a)中Aβ肽免疫原及其组合的疫苗制剂在第0、4和12周以每剂量300μg/0.5mL施用3剂量用于初始致敏。
(35)如上任一项所述的方法，其中所述疫苗制剂每3月施用一次，接着每6月施用一次，并接着每12月施用一次。
(36)如上任一项所述的方法，其中来自之前接受所述疫苗制剂的患者血液的B细胞用于制备与选择靶向Aβ肽N端的人单克隆抗体，以用于预防和治疗AD。
(37)一种刺激受试者中免疫应答的方法，所述方法包括在初始注射后第0、4和12周提供致敏免疫，之后每3个月一次、6个月一次、最优选每12个月一次进行加强免疫。
(38)剂量可为每剂量10μg至1000μg，优选每剂量100μg至750μg，甚至更优选为每剂量300μg。
(39)用于上述任一项的施用途径可以是本领域已知的任意标准途径，诸如肌内途径、皮下、口服等。
一种可用作Aβ肽免疫原构建体疫苗制剂的药物组合物，其包含Aβ肽免疫原构建体与可接受的递送载体或佐剂，其中所述Aβ肽免疫原构建体具有选自由下列组成的组的氨基酸序列：
a)SEQ ID NOs：49-51、54、55与57至65；
b)、(a)的同源物；
c)、(a)或(b)的抗原性或免疫学功能类似物，
d)具有至少一个保守氨基酸序列取代、氨基酸添加和/或氨基酸缺失的(a)、(b)或(c)；以及
e)、(a)-(d)的任意组合。
在具体的制剂中，所述Aβ肽免疫原构建体选自由SEQ ID NOs：62和63及其混合物组成的组。
在另一种具体的制剂中，所述Aβ肽免疫原构建体选自由SEQ ID NOs：64和65及其混合物组成的组。
其它制剂进一步含有特定制剂的等摩尔混合物，所述Aβ肽免疫原构建体选自由SEQ ID NOs：62与63组成的组。其它制剂进一步含有特定制剂的等摩尔混合物，所述Aβ肽免疫原构建体选自由SEQ ID NOs：64与65组成的组。
在一种具体的制剂中，SEQ ID NOs：62与63(或64与65)的等摩尔混合物的量为每剂量约1μg至约1000μg。
在一种具体的制剂中，SEQ ID NOs：62与63(或64与65)等摩尔混合物的量为每剂量约100μg至约750μg。
在一种具体的制剂中，SEQ ID NOs：62与63(或64与65)等摩尔混合物的量为每剂量约300μg。
本发明的肽组合物的功效可以通过用包含本发明的肽的免疫原性组合物注射动物(如豚鼠、狒狒、食蟹猴或人)而确定。参照表4、5、6、7与8(SEQ ID NOs：48至65)。体液免疫应答针对Aβ1-42肽约10至约14个氨基酸残基的N端片段。在实施例中提供使用的方法的详细描述。
下列实施例用于说明本发明，但不是用于限制本发明的范围。
实施例1.β淀粉样蛋白(Aβ)相关肽的合成
描述了合成经设计的Aβ相关肽构建体的方法，其包括在开发有效的靶向Aβ的疫苗设计与制剂的尝试中。所述肽可以用于实验室先导与现场研究的小规模量合成，以及以用于疫苗制剂及血清学检测的工业商品化产品的大规模量(千克)合成。
设计具有长度约10至40个氨基酸的序列的Aβ相关的抗原肽的大的全体成员，用于筛选和选择用于有效的AD疫苗中的最佳的肽构建体。在各种血清学分析中，表位绘图所用的代表性Aβ1-40、Aβ1-42肽，Aβ肽N端片段Aβ1-28、Aβ1-14、Aβ1-10、Aβ15-42与10-mer肽显示在表1中(SEQ ID NOs：1至32)。每个构建体含有Aβ肽片段(Aβ1-10至Aβ1-14)，其合成性地连接至精心设计的源自病原体蛋白的辅助T细胞(Th)表位，所述病原体蛋白包括麻疹病毒融合(MVF)蛋白与乙肝表面抗原蛋白(HBsAg)，如表2所示(SEQ ID NOs：33至47)，其为单一序列(SEQ IDNOs：33至41、46、47)或组合文库(SEQ ID NOs：42至45)，以增强它们各自的Aβ肽免疫原构建体的免疫原性。由超过100个肽构建体中选出的18个代表性Aβ肽免疫原构建体显示在表3中(SEQ ID NOs：48至65)。
所有用于免疫原性研究或相关血清学试验以检测和/或测量抗-Aβ抗体的肽以Applied BioSystems Models430A、431和/或433肽合成仪利用Fmoc化学法小规模量合成。在固相支持物上，利用独立的合成，在三官能氨基酸N端以Fmoc保护及侧链保护基团来制备各种肽。将完成的肽由固相支持物上切割下来，并以90％三氟乙酸(TFA)移除侧链保护基。利用基质辅助的激光脱附电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪评价所合成的肽，以确保正确的氨基酸组成。每种合成的肽还利用反相HPLC(RP-HPLC)进行评估，以证实制剂的合成样态与浓度。
尽管严格控制合成过程(包括逐步地监测偶合效率)，但是由于在延伸循环中的意外事件，包括氨基酸的插入、缺失、取代及提前终止，也产生了肽类似物。因此，合成的制剂一般包括多种肽类似物与目标肽。尽管包括这些非预期的肽类似物，但所得到的合成肽制剂仍适合用于免疫学应用，包括免疫诊断(抗体捕捉抗原)与疫苗接种(作为肽免疫原)。一般来说，只要开发严格的QC程序来监测制造过程及产品评价过程以确保使用这些肽的最终产物的再现性与有效性，此肽类似物，不管是刻意设计还是在合成程序中作为副产物混合物产生的，皆通常与所需肽的纯化制剂一样有效。数百克至千克级的大规模的肽合成在定制的自动肽合成仪UBI2003上以15mM至50mM规格进行。
对于使用于临床试验的最终疫苗制剂的活性成分，Aβ肽构建体利用制备级RP-HPLC于浅洗湜梯度下进行纯化，并利用MALDI-TOF质谱法、氨基酸分析和关于纯度和性质的RP-HPLC进行表征。
实施例2.血清学测定与试剂
在下文中详细描述用于评估合成肽结构及其制剂的功能免疫原性的血清学测定与试剂。
a.用于抗体特异性分析的基于Aβ1-42、Aβ1-40、Aβ1-28或Aβ1-14肽的ELISA试验
在下述实施例中所述的用于评估免疫血清样品的ELISA测定如下展开和描述。
将96孔平板的孔分别以100μl在10mM NaHCO3的缓冲液(pH 9.5，除非另外注明)中2μg/mL(除非另外注明)的目标肽Aβ1-42、Aβ1-40、Aβ1-28或Aβ1-14(SEQ ID NOs：1至4)在37℃包被1小时。
将肽包被的孔用250μL在PBS中3重量％的明胶于37℃温育1小时，以封闭非特异性的蛋白结合位点，接着以含0.05体积％20的PBS清洗3次，并干燥。将欲分析的血清利用含20体积％正常山羊血清、1重量％明胶和0.05体积％20的PBS1：20稀释(除非另外注明)。将100微升(100μL)稀释样本(如，血清、血浆)加至各个孔中，并允许在37℃反应60分钟。
接着，利用含有0.05体积％20的PBS清洗孔6次，以移除未结合的抗体。利用辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的物种(如，小鼠、豚鼠或人)特异性山羊抗IgG作为标记的示踪剂，与阳性孔中形成的抗体/肽抗原复合物结合。将100微升(100μL)过氧化物酶标记的山羊抗-IgG(以预先滴定的最佳稀释，并且在含有1体积％正常山羊血清与0.05体积％20的PBS中)加至各孔中，并于37℃再温育30分钟。利用含0.05体积％20的PBS清洗孔6次，以移除未结合的抗体，并再与含0.04重量％3’，3’，5’，5’-四甲基联苯胺(TMB)及0.12体积％过氧化氢的柠檬酸钠缓冲液的底物混合物反应15分钟。使用这些底物混合物通过形成有色产物来检测过氧化物酶标记。添加100μL的1.0MH2SO4终止反应，并检测450nm的吸光度(A450)。对于狒狒和猕猴Ig/IgG检测，使用与灵长类IgG具有高交叉反应性的HRP-缀合的山羊抗-人IgG试剂作为示踪剂。对于来自进入临床试验的患者的临床样品，使用HRP-缀合的蛋白A/G试剂(在之前验证的ELISA检测试剂盒中最佳滴定的)进行血清滴度确定。为了确定接受不同Aβ肽疫苗制剂的接种动物的抗体滴度，检测从1∶100至1∶10,000的10倍连续稀释的血清，并且通过A450的线性回归分析(截点A450设为0.5)计算测试血清的滴度，以Log10表示。
b.以基于特定载体蛋白、Th肽或Th组合文库的ELISA试验来评估针对所述载体蛋白、Th表位或Th组合肽文库上的辅助T细胞表位的抗体反应性
将96孔ELISA平板的孔分别用100μL在10mM NaHCO3缓冲液(pH 9.5，除非另外注明)中2μg/mL(除非另外注明)的载体蛋白，如KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin，匙孔血蓝蛋白)，Th肽或Th组合肽文库(SEQ ID NO s：44至47)在37℃包被1小时，与ELISAs类似，并如上述进行。为了确定接受不同Aβ肽疫苗制剂的接种动物的抗体滴度，检测从1∶100至1∶10,000的10倍连续稀释的血清，并且通过A450的线性回归分析(截点A450设为0.5)计算测试血清的滴度，以Log10表示。
c.以基于B细胞表位簇10-mer肽的ELISA试验来评估针对Aβ与hAPP(人淀粉样蛋白前体蛋白)的精细特异性分析与表位绘图
通过表位绘图(epitope mapping)确定免疫宿主或疫苗中的抗-Aβ抗体的精细特异性分析。简单来说，将96孔平板的孔用0.5μg/0.1mL/孔的各种hAPP 10-mer肽(SEQ IDNOs：6、8至30)包被，接着在上述抗体ELISA法步骤后，将100μL的血清样品(以PBS 1∶100稀释)一式两份在10-mer平板孔中温育。疫苗的B细胞表位以及狒狒、猕猴和人抗-Aβ抗体在免疫宿主中的精细特异性分析(fine specificity analyses)也预先用Aβ1-10肽(DAEFRHDSGY，SEQ ID No：6)、具有N-端置换的Aβ修饰合成肽、或不相关的对照肽进行吸附，并接着以抗-Aβ1-28ELISA试验进行检测以验证额外的特异性。
d.免疫原性评估
根据实验接种流程，收集人受试者或动物的免疫前与免疫血清样品，并以56℃加热30分钟以使血清补体因子失活。依据流程，在施用疫苗制剂后，获得血液样品，并评估其对特定靶位点的免疫原性。检测连续稀释的血清，并利用稀释倒数的Log10表示阳性滴度。通过特定的疫苗制剂引发针对所述靶抗原内需要的表位特异性的高滴度B细胞抗体反应同时保持针对“辅助T细胞表位”的低至可忽略的抗体反应性的能力来评估其免疫原性，其中所述“辅助T细胞表位”用来提供需要的B细胞反应的增强。
e.检测血液及脑脊液中(CSF)的Aβ相关肽抗原的固相酶联免疫测定
使用高灵敏性Aβ1-40免疫测定(InvitrogenTM-BioSourceTMCytokines&Signaling，Camarillo，CA，USA)按照试剂盒使用说明确定食蟹猴血清、血浆及CSF中Aβ1-40的浓度。正常猕猴中的Aβ1-42水平低于检测极限。按照Aβ1-40与Aβ1-42免疫测定(The Genetics CompanyInc.，Zurich-Schlieren，Switzerland)的使用说明确定来自hAPP751转基因小鼠的血浆、CSF和脑组织化学提取物中的Aβ1-40与Aβ1-42的水平。患有轻度至中度阿尔茨海默病的个体的血浆中Aβ1-40水平的定量按照试剂盒使用说明(Human β淀粉样蛋白(1-40)测定试剂盒，IBL，27714)进行确定。正常人血浆中Aβ1-42的水平低于检测极限。
实施例3.免疫组织化学分析
由尸体检验和/或手术病理样本获得正常成人组织(PhenoPath LaboratoriesInc.，Seattle，WA，USA)与患有阿尔茨海默病的病例的大脑样本(Dr.Felicia Gaskin，University of Virginia，Charlottesville，VA，USA)。由尸体检剖中获得食蟹猴组织样本(Beijing Jo-Inn New Drug Research Center，Beijing，China)与hAPP转基因小鼠大脑样本(JSW-Research GmbH，Graz，Austria)。将组织在液氮中快速冷冻，浸没在冷的OCT包理化合物中并且冷冻切片，或将其用福尔马林固定、石蜡包埋并通过标准方法进行切片。
使用来自豚鼠、hAPP转基因小鼠、狒狒和猕猴的免疫前及高度免疫血清或纯化的IgG，或使用市售鼠单克隆抗体与荧光团-缀合的二级抗体，进行冷冻保存的组织切片的间接免疫荧光分析。利用市售抗生物素蛋白-生物素增强的试剂盒对冷冻保存的组织切片进行间接免疫过氧化物酶染色：对正常成人组织的冷冻保存的组织切片使用纯化的豚鼠抗-Aβ IgG，或对于来自对照和UBI AD疫苗(UB-311)处理的猕猴的大脑切片使用检测CD3、CD4、CD8(T淋巴细胞亚组)、CD11b(小胶质细胞活化标记)、GFAP(星形胶质细胞)与特定Aβ表位的市售单克隆抗体。根据标准病理学实验室程序进行免疫组织化学分析。
实施例4.淋巴细胞增殖与细胞因子生成的T细胞功能分析
关于包括用于评估T细胞活化的淋巴细胞增殖与细胞因子生成的T细胞功能测定的程序详细描述如下。
a.外周血单核细胞(PBMC)的分离、冷冻及解冻
采集肝素化的血液，利用Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离PBMC。在磷酸缓冲盐水(PBS)中清洗2次后，将PBMC重悬在由补充有10％胎牛血清(FCS)的RPMI 1640组成的细胞培养基中。对于一些实验，将分离的PBMC冷冻，储存于液N2中，并解冻用于进行后续的体外培养。
b.T细胞与外周血单核细胞(PBMC)的增殖分析
在存在10.0μg经选择的疫苗免疫原组合物的条件下，将来自接种动物的PBMC以2.5x 106细胞/mL于24孔培养平板(Nunc)的各个孔中培养。还包括负对照培养物，其仅含有PBMC，而不含有刺激抗原。将所有培养物在5.0％CO2培养箱中于37℃保持3天。培养开始后3天，收集上清液，并利用上述定量测定检测各种细胞因子的量。
利用Ficoll-hypaque梯度离心分离狒狒和食蟹猴的外周血单核细胞(PBMC)。对于肽诱导的增殖及细胞因子的产生，将细胞(2x105细胞/孔)单独培养或与添加的每种肽结构域(包括Aβ1-42、Aβ1-14、Aβ15-42、Th肽、以及作为负对照的以无关的肽)共同培养。使用有丝分裂原(PHA、PWM、Con A)作为阳性对照。在第6天，向三个重复的细胞培养孔的每一个中加入1μCi的3H-胸苷(3H-TdR)。在温育18小时后，收集细胞，并确定3H-TdR的掺入。刺激指数(S.I.)显示抗原存在下每分钟的计数(cpm)除以抗原不存在的cpm；认为S.I.＞3.0是显著性的。
c.评价在用UBI AD疫苗免疫前与免疫后由PBMC培养物产生的细胞因子
在单独的或在各种Aβ肽结构域或有丝分裂原存在下的培养基等分试样中进行来自食蟹猴PMBC培养物的细胞因子分析(IL2、IL6、IL 10、IL 13、TNF-α、IFN-γ)。使用猴子-特异性细胞因子夹心ELISA检测试剂盒(U-CyTech Biosciences，Utrecht，TheNetherlands)按照试剂盒的使用说明来确定各细胞因子的浓度。
实施例5.用于安全性、免疫原性、毒性与功效研究的动物
豚鼠：用成熟的、初次用于实验的成年雄性与雌性Duncan-Hartley豚鼠(300-350g/BW)进行免疫原性研究。此试验使用每组至少3只豚鼠。在签约的动物机构与作为保证人的UBI，按照核准的IACUC申请，进行涉及Duncan-Hartley豚鼠(8-12周龄；科文斯研究实验室(Covance Research Laboratories)，Denver，PA，USA)的流程。
Anubis狒狒：用成年雄性狒狒(Papio anubis)，年龄为8至10岁，俄克拉荷马大学健康科学中心(University of Oklahoma Health Sciences Center)，奥克拉市，OK，USA)在签约的动物机构与作为保证人的UBI，按照核准的IACUC申请，进行免疫原性研究。
食蟹猴：用成年雄性及雌性猴子(食蟹猴(Macaca fascicularis)，年龄为约4岁；北京昭衍新药研究中心(Beijing Jo-Inn New Drug Research Center)；北京，中国)在签约的动物机构与作为保证人的UBI，按照核准的IACUC申请，进行免疫原性和重复给药毒性研究。
hAPP751转基因小鼠：在幼hAPP751转基因小鼠(tg+)及其同窝所生的小鼠(14±2周龄)中的免疫原性和功效研究用于阿尔茨海默病预防模型，且年老的tg+小鼠及其同窝所生的小鼠(52±2周龄)用作治疗模型。在签约的动物机构(JSW Research GmbH，Graz，Austria)与作为保证人的UBI，按照核准的IACUC申请，进行这两项研究。
hAPP751 tg+小鼠在鼠Thy-1启动子的调节控制下组成型过表达包含London(V717I)与Swedish(K670M/N671L)双重突变的人淀粉样蛋白前体蛋白(hAPP)(Rockenstein，E，等，1995和2001)。早在3至4个月龄时发生Aβ1-42的沉积，在额叶皮质中出现成熟的斑块，且在5至7个月龄时，斑块的形成延伸至hAPP751 tg+小鼠的海马、丘脑与嗅觉区。通过血清ELISA测定的抗体反应，并且通过免疫染色和通过生化提取检测脑淀粉样蛋白沉积和脑斑块负荷以及脑中增加的细胞活性水平的证据(例如，T细胞浸润，小胶质细胞活化)，观察在16周期间的肌内接种的作用。
根据本实验中的上述方法，在免疫之前检测来自个体动物的血清和/或血浆样品中Aβ目标肽的存在。每只动物按照物种和流程用每剂量疫苗制剂的Aβ目标肽构建体进行免疫。
实施例6.初步排列豚鼠和狒狒中的Aβ肽构建体免疫原性的一般疫苗制剂
在下文所述的实施例中，更详细地描述用于各试验中的药物组合物与疫苗制剂。简单的说，每个研究组中指定的制剂通常含有所有种类的设计Aβ肽构建体，其具有通过不同形式间隔子(如，εK或εK加上KKK，以增加所述肽构建体的溶解度)连接的Aβ肽片段和泛宿主性辅助T细胞表位的变异，包括两组来自麻疹病毒融合蛋白与乙肝表面抗原的人工T辅助细胞表位，其中所述Aβ肽片段连接在所述设计的肽构建体的N端。在豚鼠中初始评估超过100种设计Aβ肽构建体，评估它们相对于全长Aβ1-42的免疫原性，以及进一步评估其对来自AD患者大脑切片的天然斑块的交叉反应性。将Aβ肽结构与Seppic MontanideTMISA51(作为核准的用于人疫苗应用的油)制成油包水乳液，且以所指定的不同量的肽构建体与矿物盐或铝胶(Alum)混合。通常通过将Aβ肽构建体以约20至800μg/mL溶解在水中，并与MontanideTM ISA51配制成油包水乳液(1∶1(v/v))，或与矿物盐或铝胶(Alum)(1∶1(v/v))配制以制备疫苗。将疫苗制剂置于室温约30分钟，并且在免疫前涡旋混合约10至15秒。
一些动物用2-3剂量的特定的疫苗制剂免疫，其在第0周(初始)与初始免疫后第3周(wpi)(加强)通过肌内途径给药，任选地在第5或6wpi通过肌内途径进行第二次加强。然后检测这些免疫的动物，以评估疫苗制剂中存在的各种合成的Aβ肽免疫原的免疫原性以及其对Aβ1-28与全长Aβ1-42的交叉反应性。然后将在豚鼠中的初步筛选中具有有效免疫原性的那些Aβ肽免疫原在狒狒中以油包水乳液、矿物盐和基于明矾的制剂形式进一步检测在免疫流程所示的指定期间的给药方案，所述狒狒物种已被校准为具有与人相似的免疫应答模式。
只有最有希望的Aβ肽免疫原候选物进一步彻底地评估，然后结合到最终的疫苗制剂中，以用于准备提交研究新药申请的GLP指导的临床前研究和在患有阿尔茨海默病的患者中的临床试验中的免疫原性、持续时间、毒性与效力研究。
实施例7.用于预防和治疗阿尔茨海默型痴呆的结合Aβ1-14肽免疫原构建体的多成分疫苗制剂的设计原理、筛选、假定与优化
设计历程：各疫苗或免疫治疗性产品必须依据特定疾病的机制以及干预需要的靶蛋白来确定其自身的设计中心及方法。设计可据此作为模型的靶标可以包括参与疾病途径的细胞蛋白或可能涉及多种来源于病原体的蛋白的感染剂。由研究至商品化的过程是一个非常长久的过程，通常需要十年或几十年才能完成。
一旦选定目标分子，必须经过广泛的血清学验证过程。目标分子中B细胞及T细胞表位的鉴定与分布对于分子疫苗的设计是重要的。一旦识别出目标B细胞表位，就可在小动物中进行连续的先导免疫原性研究，以评估由设计肽的疫苗制剂所引发的抗体的功能特性。然后，在目标物种的动物中进行所述血清学应用，以进一步验证所引发的抗体的疫苗免疫原性和功能特性。所有研究都在多个平行组中使用从用于评价的免疫的宿主收集的血清进行。在人疫苗的情形中，还在目标物种和非人灵长类动物中进行早期免疫原性研究，以进一步验证免疫原性和设计的方向。接着，在不同的混合物中制备目标肽，以评估在组合使用制备各制剂设计时，与肽构建体中各相互作用相关的功能特性中的微小区别。经过额外的评估后，确定最终的肽构建体、肽组合物及其制剂，以及所述制剂的各物理参数，构成最终产品的开发流程。
广泛的设计经验允许以加快的步伐从发现到商业化开发下一代疫苗产品，如图1所示。
a.设计并验证用于具有治疗患有阿尔茨海默病的患者的潜力的疫苗制剂的适当的Aβ1-14来源的肽构建体
作为本发明人所公开的先前发明(Wang CY.美国专利号6,906,169，美国：UnitedBiomedical Inc.；2005；Wang CY.美国专利号7,951,909，美国：Untied Biomedical Inc.；2011；Wang CY.美国专利号8,232,373，美国：United Biomedical Inc.；2012)的继续，从Aβ分子对B细胞表位的进一步精化确定了缺少该序列(该序列表达通常存在于阿尔茨海默患者中的自体T辅助表位，其会导致严重的副作用，如脑膜脑炎)的C端结构域的Aβ1-14肽，选择其作为设计用于结合到疫苗制剂中的目标B细胞表位。
为了产生最有效的肽构建体以结合到疫苗制剂中，制备一大组来源于多种病原体的泛宿主性T辅助表位或进一步由麻疹病毒融合(MVF)蛋白或乙型肝炎表面抗原(HBsAg)蛋白设计的人工T辅助表位的全体成员，用于在豚鼠中的免疫原性研究。代表性研究是16个Aβ1-14衍生的肽构建体，如表3所示(SEQ ID NOs：48、51至65)，其中Aβ1-14肽通过εK作为间隔子连接到各泛宿主性T辅助表位。将该肽免疫原构建体配制成MontanideTMISA51油包水乳液，并通过施用在标准ISA51乳液中以100μg/0.5mL制备的各种疫苗制剂以在第0wpi致敏和在第3wpi加强，在豚鼠中检测其各自的免疫原性。初步的免疫原性分析证明辅助T细胞表位结构特征存在于Aβ1-42的C端，其中由Aβ序列第15至28的氨基酸的肽序列缺失使Aβ1-14序列本身不具有免疫原性(表4，第1至3组)。用于恢复及增强Aβ1-14肽免疫原性的T辅助表位以递增次序的初步排名显示在表4中，最弱的肽构建体排在第一位：曼森血吸虫(Schistosomamansoni)Th(SEQ ID NO：56)<破伤风梭菌1(Clostridium tetani 1)Th(SEQ ID NO：48)<百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)Th(SEQ ID NO：52)<破伤风梭菌2(Clostridiumtetani 2)Th(SEQ ID NO：53)<白喉菌(Diphtheria)Th(SEQ ID NO：54)<恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)Th(SEQ ID NO：55)，霍乱毒素(cholera toxin)Th(SEQ ID NO：57)排在那些来源于MVF(SEQ ID NOs：51、58、59)及HBsAg(SEQ ID NO：60)的人工T辅助表位中间。Aβ1-14衍生的肽构建体(SEQ ID NO：51)也可被设计成支链四聚体结构，如(SEQ IDNO：61)所示，其为有效的肽免疫原构建体。综上所述，上述免疫原性研究证实了特定的Aβ1-14衍生的构建体(SEQ ID NOs：51、57至61)作为免疫原用于设计最终疫苗制剂的适用性，所述最终疫苗制剂用于引发针对全长Aβ1-42肽的N端的抗体，所述Aβ1-42肽为AD患者老年斑的主要生化成分。
b.使用具有不同泛宿主性T辅助表位的Aβ1-14衍生的构建体扩大MHC的覆盖度
当设计疫苗来治疗多样化遗传背景的患者时，重要的是，允许设计覆盖具有多样化遗传背景的最大群体。因此，研究Aβ1-14衍生的肽免疫原构建体对此组合的协同免疫原性效果。因为来源于MVF与HBsAg的泛宿主性T辅助表位代表其中提供所述免疫原性增强的最有效的一些表位，所以设计含有这两种辅助T表位的肽构建体组合用于研究。如表2所示，想着具有最大的MHC结合基序覆盖度，将MVF与HBsAg(SEQ ID NOs：44与45)二者的T辅助表位的组合文库形式设计成Aβ1-14衍生的构建体(SEQ ID NOs：62与63)，并且，在以每剂量100μg/0.5mL致敏(第0wpi)与两次加强(第3与5wpi)时间表后，在豚鼠中评价它们单独的或组合的免疫原性。如表5所示，当与由每种单独的肽构建体引发的免疫反应相比时，这两种免疫原的等重量比例混合物确实引发较多的免疫反应。
c.结合连接到具有多个MHC结合基序的仔细选择的T辅助表位的目标B表位的简单免疫原设计产生仅针对所述B细胞表位的集中的和纯粹的免疫应答
从免疫的宿主采集初始免疫后8周(wpi)的高免疫血清，使用用于B表位免疫原性增强的各种T辅助表位进行检测。由以类似的致敏与加强免疫时间表给予KLH-连接的Aβ1-14肽的类似免疫的宿主采集高免疫血清，所述KLH-连接的Aβ1-14肽通过与添加在Aβ1-14肽的N端的半胱氨酸残基的化学偶联而制成。从表6中可以看出，所有用设计的Aβ1-14肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：62与63)单独或组合免疫的宿主都产生所需的高滴度针对靶向的Aβ1-42交叉反应性的抗-Aβ1-14抗体交叉反应性，对目标Aβ1-42肽具交叉反应，而对两种T辅助表位(SEQID NOs：44与45)反应性很小或没有反应性。相反地，尽管由常规载体蛋白KLH对Aβ1-14表位生成的相对的免疫原性(Log10滴度为2.2至3.9)，但在所有动物中皆产生针对蛋白载体KLH很高的抗体反应与很高的滴度(Log10滴度的几何平均值为6.2)，再次验证了之前的观察：特别“集中的”针对“靶向的B细胞表位”的反应是用这些基于对B细胞与T细胞表位的了解而合理设计的肽免疫原构建体免疫的结果。
d.在包含在ISA 51油包水乳液及明矾中的不同量的Aβ1-14构建体(SEQ ID NOs：62和63)的疫苗制剂致敏(第0wpi)与加强(第3与6wpi)后，评估狒狒中的免疫原性
在进行更进一步研发工作以由这些Aβ1-14肽免疫原构建体引发的抗体的功能特性之前，在狒狒中评估疫苗制剂的相对免疫原性，所述疫苗制剂在两种最常用于人检测的不同制剂中结合异不同量的这些肽构建体(等摩尔比例的SEQ ID NOs：62与63)，狒狒是一种产生在规模上更接近人的免疫反应的动物物种。将所有疫苗制剂以0.5mL/剂量给予至动物。将来使用的初始目标剂量为100μg/mL，因此以此剂量给予3只动物。评估更有效的ISA51油包水制剂相对于效力较弱的但是最常使用的明矾以相同的100μg的相对免疫原性。在检测的油包水乳液系统中，评估每剂量25μg、100μg与400μg的剂量增加研究。来自该研究的首要观察是，当与以每剂量100μg/0.5mL给予具有相同肽免疫原含量的ISA油包水乳液制剂相比较时，给予明胶的制剂产生减低的免疫应答(抗体滴度超过1个Log10的)。尽管每剂量100μg是将来免疫宿主中疫苗制剂施用的初始目标量，但是，随着剂量由25μg至100μg至400μg的增加分别观察到免疫应答的增加，如表7所示。因此，对于设计的Aβ1-14肽免疫原构建体(SEQID NOs：62与63)或其类似物的肽免疫原构建体，将进一步对超过100μg的剂量进行探讨。
实施例8.开发用于治疗阿尔茨海默型痴呆的成功的免疫治疗性疫苗的标准
UBI开发免疫治疗性疫苗的策略包括基于平台技术设计连接到目标B序列的专有的泛宿主性Th表位，以克服“自身”的障碍与遗传多样性的限制，并且开发为安全(Safe)、独特(Unique)、特征性(Characterizable)、成本有效性(Cost-effective)、有效(Efficacious)、稳定(Stable)及可改变规模(Scalable)、(表示为SUCCESS)的最佳的基于肽的疫苗制剂(Wang，CY等，2005；SokollKK，2004)。在初始设计时期需特别注意，从调节批准的观点来看，允许选择的将进入疫苗制剂程序的研发阶段的肽免疫原能够被表征，当在III期试验中在患者中证明有效时，该疫苗将成为人类历史上第一个曾经以几百万的剂量基础给予患者的完全的基于合成肽的疫苗。当考虑细节时，在肽的设计中关于质量的特别注意(挑选出许多已经证明产生大量所需的免疫应答的肽)给予所用的各肽的“溶解度”、合成化学产量及序列设计中固有的纯化障碍。具有高安全性因素的充分接受的佐剂也是多个可接受的选择中的一个重要的考虑因素。必须考虑安全性因素与免疫原性等级之间的平衡。当因为安全性因组损害免疫原性时，可以结合哪些其他疫苗制剂特征来进一步提升免疫应答。同样地，疫苗的成功在于其在尽可能大量与广泛的具有多样化遗传背景的群体中产生所需的免疫应答的能力，因此，一个宽广的主要组织相容性复合物(MHC)覆盖度也必须是一个非常重要的考虑因素。
根据上述考虑，为了获得靶向Aβ分子N端的SUCCESS疫苗，尽管与它们组合文库形式的对应体相比，单一序列的免疫原性相对较弱，但仍选择单一序列的肽，而不是组合形式的肽。由于高效力的免疫原性增强T辅助表位通常包括长的疏水性氨基酸残基片段，由此使相应的肽不溶，因此，肽的溶解度也是一个重要的测试因子。必须特别注意是否在特定的位置上添加高电荷残基，如Asp、G1u、Lys与Arg以增加肽溶解度。为了获得高的合成产量，全部广泛评估所有合成过程所涉及的以及产生的中间物的化学物质，以获得最终肽的优化序列，其为疫苗制剂的重要成分。在从免疫原性方面平衡考虑所有高质量肽候选物后，选择两种Aβ1-14肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：64与65)，其中具有SEQ ID NO：64的肽来自MVF系列，具有SEQ ID NO：65的肽来自HBsAg系列，并更进一步分析以进一步用于疫苗制剂。
合成并纯化这些肽，以获得高纯度，如图2A，2B，2E所示。在具有浅梯度的反相分析下关于SEQ ID NOs：65与64两种肽的HPLC模式分别显示出20与21分钟的洗脱时间。由这些纯化的肽的MALDI-TOF分析得知具有SEQ ID NO：65的肽的分子量为3892.274(理论值为3892.52)，肽SEQ ID NO：64的分子量为4374.568(理论值为4374.04)，两者均具有高精确度，如图2C和2D所示。
SEQ ID NOs：46与47的“Th”肽两者都用于增强Aβ1-14的免疫原性，大量地分析其在各种群体中的结合基序，如图3A和3B所示。为了允许所有患者遗传背景的最大覆盖度，将这两种泛宿主性T辅助表位结合到疫苗设计是安全的。从所分析的覆盖百分数来看，所述疫苗将具有非常合理的机会覆盖大的接受所述疫苗的患者群体(如果不是全部的话)，这是证明扩展至高临床价值的疫苗的广泛检测和研发尝试的重要因素。
为了设计被大群体所用的疫苗以及预防也是施用目的的一部分，安全性成为另一个重要的考虑因素。尽管在许多临床试验中，油包水乳液在人中用作多种疫苗制剂，由于数十年的安全性检测，明矾仍然是用于疫苗制剂中的主要佐剂。明矾或其矿物盐Adjuphos(磷酸铝)被认为用作用于临床应用的制剂中的佐剂。
a.在包含不同量的高度纯化的Aβ1-14肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：64与65)与固定量的矿物盐的疫苗制剂的致敏(第0wpi)与加强(第3与5wpi)后，评估豚鼠的免疫原性
由UBI AD疫苗开发中的许多免疫原候选物中，选择两种高度纯化Aβ1-14肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：64与65)用于临床前和临床检测，在豚鼠中的剂量研究中测试这两种肽等摩尔比例的混合物在固定量(0.5mL)的明矾/矿物盐的存在下的免疫原性，如图4所示。基于第0、3与5wpi(初始免疫后周数)的免疫时间表，在豚鼠中检测在0.5mL矿物盐(磷酸盐，Adjuphos)中从0μg、10μg、30μg、100μg至300μg的不同量的包含上文提及的两种Aβ1-14肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：64与65)的肽混合物，其中观察超过26周期间的免疫原性。在初始免疫后约5周时的免疫应答峰值，接受每剂量300μg的动物产生最高的免疫应答，接受100μg合30μg的那些动物次之，然后使接受10μg剂量的，在之后的整个26周期间，具有类似的免疫应答排序。因此，认为最高剂量300μg/0.5mL Adjupho s是优化的免疫条件，且将用作指导来研究其它相关的制剂在其它物种中的免疫原性。
b.通过在肽与寡聚物之间形成免疫刺激复合物(ISC)进一步提升疫苗制剂免疫原性的手段
经常使用的明矾或其相关的矿物盐作为佐剂，此相关的疫苗制剂的免疫原性在针对其目标Aβ1-14B细胞表位的滴度上也会减少1个Log10(以与实施例7类似的研究估测)。因此，开发进一步提高疫苗制剂免疫原性的方法。
更特别是，在如图5A所示UBI的制剂中，稳定的免疫刺激复合物(ISC)来源于阳离子肽与聚阴离子CpG寡脱氧核苷酸(ODN)分子(上图)(Sokoll KK，2004)。此为一种通过电荷的静电中和自我装配的系统。阳离子肽对阴离子寡聚物的摩尔电荷比的化学计量决定缔合的程度。肽免疫原与CpG ODN的非共价静电缔合为一种完全可再现的过程。此肽/CpG ODN免疫刺激复合物有助于递呈至免疫系统中“专门的”抗原递呈细胞(APC)，由此进一步增强所述复合物的免疫原性。在制备过程中，这些复合物容易被表征用于质量控制。肽/CpG ISC在体内被良好地耐受。
接着，所述免疫刺激复合物可与矿物/铝盐佐剂组合形成水性混悬液，如图5B下图所示。
CpG基序已被表征为存在于树突细胞与B细胞的亚组中的Toll样受体9(TLR9)的激动剂。Toll样受体具有识别常见外来侵入物(如细菌、病毒及寄生虫)特有的不同分子模式的能力。特别是未甲基化的合成CpG序列能够结合并激活TLR9。作为有效的B细胞有丝分裂原，TLR9激动剂有效诱导强的抗体免疫应答。其中，CpG的作用机制包括产生长久持续的抗原特异性抗体。
考虑到AN1792 Aβ1-42肽疫苗临床试验，该临床试验在其免疫原性方面是失败的(仅在30％的患者中引发针对靶向的Aβ1-42聚集的疫苗的抗体)，并且在6％的患者中引起脑膜脑炎-样副作用。已知在本发明中用于UBI AD疫苗的基于铝的佐剂刺激Th-2型免疫应答(如，IL-4与IL-5细胞因子)。此外，Aβ肽免疫原构建体/CpG ODN免疫刺激复合物为颗粒。颗粒免疫原的加工受偏向Th-2型反应的APC促进。
综上所述，CpG寡核苷酸已安全地用于多个人临床试验(＞1,000名患者)。肽/CpGODN衍生的免疫刺激复合物容易表征。在生理条件下稳定并且在体内良好耐受。来源于各种肽免疫原的基于CpG的复合物单独的或与矿物盐组合已在小鼠、豚鼠、猪、狗、牛、狒狒和猕猴中证实是有效的，报道极少的不利事件。基于铝的矿物盐是包含在美国目前核准的疫苗中的唯一的佐剂。使用这些佐剂的疫苗组合物具成本有效的，并且已知可有效地量产。相对于单独佐剂，特定的疫苗/佐剂制剂是允许的。UBI研究并开发了独特的组合物。用于治疗痴呆的UBI AD疫苗的上述特征具有成为“SUCCESS”所需的所有要素。
实施例9.配制用于肌内注射的UBI AD疫苗
Aβ1-14-εK-KKK-MvF5 Th肽免疫原构建体(SEQ ID NO：64)与Aβ1-14-εK-HB sAg3 Th肽免疫原构建体(SEQ ID NO：65)在生理pH下是阳离子。图2A，2B及图2C(左侧)显示单独的这两种肽与等摩尔比例混合物的HPLC图谱。图2D和2E(右侧)显示这两种肽通过MALDI-TOF质谱表征的模式，分别具有3892与4374的分子量(Da)。聚阴离子CpG ODN的添加引起溶液中免疫刺激复合物(ISC)的电荷中和及立即的“自我装配”。阳离子肽：阴离子CpG的摩尔电荷比的化学计量决定缔合的程度。UBI AD疫苗以下列步骤进行制备：在注射用水中用这两种Aβ肽免疫原构建体的等摩尔混合物制备ISC，其中与CpG ODN的摩尔电荷比大约相等。
a.在狒狒中疫苗制剂致敏(第0wpi)与加强(第3与6wpi)后10周期间内评估免疫原性，所述疫苗制剂在不存在或存在作为佐剂的明矾或adjuphos的条件下含有与CpG寡聚物的免疫刺激复合物的300μg/0.5mL高度纯化Aβ1-14肽免疫原构建体(SEQ ID NO s：64与65)
基于用高度纯化的Aβ1-14肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：64与65)在豚鼠中的第一免疫原性水平与剂量研究，将300μg含有等摩尔比例的这两种Aβ1-14肽免疫原构建体(SEQID NOs：64与65)的混合物与CpG寡聚物制备成免疫刺激复合物，如上所述。接着，将它们与明矾或adjuphos一起配制，或无佐剂，基于0、3、6周免疫流程以每剂量300μg肽肌内注射免疫狒狒，在10周期间内观察特异性抗体的水平。由于狒狒物种所产生的免疫应答在规格上与人非常类似，因此在进行人体试验前，利用狒狒进行所述免疫原性评估与最终制剂评估。将所有的疫苗制剂以每剂量0.5mL给予至动物中，每组两只动物。如图6所示，以每剂量300μg/0.5mL，所有的三种制剂，在存在或不存在明矾或adjuphos作为佐剂的条进行，表现出大致相同水平的免疫原性，等级在0.5Log10以内，如通过针对Aβ1-14肽的ELISA所证实的。ISC制剂显著的增强仅由所述肽所展示的免疫原性。然而，在8至10周期间的观察后，相比于其它两组，由Adjuphos支持的制剂维持显著较高的免疫应答，反应等级上从0.5扩大至1个Log10(如，约3至10倍更有效)。通过这种利用产生非常集中的需要的免疫应答(没有任何来自佐剂的并发因素)的高度纯化的合理设计的肽的三种紧密相关的制剂在狒狒中仔细校正免疫原性，因此最终确定UBI AD疫苗制剂进一步在灵长类和人中研究免疫原性，特异性，与所引发的抗体相关的功能特性，急性及慢性毒性，以及最终的临床功效，如下述实施例中所示。
b.制备用于免疫原性、急性毒性、慢性毒性、效力和临床安全性、耐受性以及药效研究的UBI AD疫苗制剂
在注射用水中用两种Aβ肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：64和65)的等摩尔混合物(其进一步与CpG以大致相等的肽：CpG ODN摩尔电荷比混合)制备ISC。通过相反电荷的静电中和作用介导的过程，UBI AD疫苗制剂中的CpG ODN 100％结合至肽免疫原构建体，导致形成微米尺寸的颗粒。比起CpG佐剂的传统应用，颗粒形式允许显著地降低CpG ODN的剂量，具有更低的不良先天免疫应答的潜力，以及有助于备用的免疫原加工途径，包括，专业的抗原递呈细胞(APC)。将铝矿物盐、用于张力的生理食盐水和防腐剂按顺序添加至预制的ISC中。基于狒狒的免疫原性研究结果，使用铝矿物盐磷酸铝取代明矾凝胶，以获得更好的免疫原性保持。
c.UBI AD疫苗制剂的稳定性与免疫原性研究
如上述内容，制备每剂量300μg/0.5mL的UBI AD疫苗制剂，其中磷酸铝(Adjuphos)作为佐剂，具有20％的覆盖度，将疫苗制剂充填至1mL无菌玻璃小瓶中，并且于2-8℃储存2年。依据稳定性检测程序，取回样品。所有的物理参数符合质量控制(QC)规格。将Aβ1-14肽免疫原构建体与CpG寡脱氧核苷酸(ODN)及adjuphos佐剂分离，并依据各肽的分析规定通过HPLC进行分析。如图2C左侧下图所示，这两种Aβ1-14肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：64与65)在HPLC分析时在预测的洗脱时间显示出这两种个体肽的等摩尔混合物。
取出含有UBI AD疫苗制剂的小瓶，用于在豚鼠中的免疫原性研究。检测两组，每组具有6只动物，一组为疫苗组，在第0及3wpi给予300μg/剂量，而另一组给予安慰剂疫苗制剂(即，不含这两种肽免疫原构建体的相同制剂)。如图7所示，所有的动物在单次接种后获得显著的免疫原性，在第3wpi加强后，于5wpi达到峰值反应。进一步检测从第8wpi采集的免疫血清，检测其与用来提供免疫原性增强的各种Th肽的反应性。如表8所示，很少(如果有一些的话)有针对所述Th肽的反应性，进一步证实这两种Th肽的“免疫静默”特性，由此允许提供排他性地针对Aβ肽N端的非常集中的免疫应答。因此，有别于历史的疫苗工业(其专门处理没有充分表征的生物材料)，UBI AD疫苗制剂由充分限定的化学物质组成，产生如设计的集中的免疫应答，并且具有比单克隆抗体更广泛的反应性，由此在效果上更有效，且比常规的肽-载体缀合形式的疫苗要纯净得多，由此具有高安全性因子。
实施例10.具有阿尔茨海默病的人脑的免疫组织染色用来评估UBI AD疫苗的血清学特异性和安全性
将来自用实施例7所述的等摩尔比例的Aβ肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：62与63)免疫的第3和4组狒狒的高免疫血清合并，纯化IgG级分并检测其与人AD脑的反应性。如图8所示，通过从高免疫血清纯化的IgG而不是从来自免疫前血清的类似的IgG级分发现与脑血管和淀粉样蛋白斑块二者的染色。用Aβ1-14肽预温育免疫血清吸收掉脑血管和淀粉样蛋白斑块的所有免疫原性，但不相关的肽则无法达成，这证明经含有Aβ肽免疫原(SEQ ID NO s：62与63)的疫苗制剂接种的免疫血清中的抗-Aβ抗体的高特异性。
使用免疫前及高免疫豚鼠IgG对正常成人组织的冷冻切片进行其它的免疫组织病理学研究，以监测特异性与不需要的抗体自身反应性。以由经UBI AD免疫治疗性疫苗免疫的豚鼠纯化的抗-Aβ1-14IgG筛选人组织组(N＝32)的免疫反应性，并与来自相同动物的免疫前纯化的IgG进行比较。由PhenoPath实验室的认证临床病理学家检查在正常成人组织切片上观察到的免疫染色样态。除了某些肌肉组织(如，子宫内膜)的弱阳性免疫反应性之外，所有经测试的成人组织皆为阴性，而对三分之一的成人大脑样品中的老年斑具有强的阳性反应，且在脊髓样品中脑液(cerebral fluid)呈阳性免疫染色。
实施例11.原型UBI AD疫苗制剂在成年狒狒中的免疫原性研究
在流程的A部分中，于第0、3及6周免疫用复合成专利性免疫刺激复合物(ISC)并用铝矿物盐佐剂配制的Aβ1-14肽免疫原(每剂量总肽量300μg)免疫4只成年雄狒狒。ISC/矿物盐制剂在所有动物中产生强抗-Aβ抗体反应(图9A)。没有观察到不良的注射部位反应。
流程的B部分的目标为：(1)监测反复暴露临床目标剂量与4倍高剂量的安全性及注射部位反应原性，(2)监测剂量递增研究中的免疫原性，以及(3)分析响应的抗体反应的动力学。接着，这些动物休息72周。在此期间，抗-Aβ抗体的血清水平减少10-100倍。在初始注射后第78与81周(图9B)，四只动物施用疫苗，其中将300μg肽剂量给予至编号564与565的动物，或将1200μg剂量给予至编号556与561的动物。在所有的4只狒狒中，回忆应答快速地恢复峰值抗体滴度。到第104周，抗体滴度开始下降，而通过在第104周给予加强剂量，使动物再次恢复至峰值滴度。利用抗-Aβ1-28肽ELISA在第0、2、5、6、8、10、78、81、84、88、92、96、100、104、107与111周确定血清抗-Aβ抗体反应的动力学。在接受300μg剂量的动物中没有发现注射部位反应。然而，仅在第78周，在接种高剂量(1200μg)的狒狒的注射部位发现一些红色及炎症；这种短暂的反应在一周内完全消除。在对狒狒进行评估的2年内，未报道其它不良事件或安全性顾虑。
实施例12.通过抗-Aβ抗体对原纤维形成的抑制及抵抗Aβ1-40-介导的毒性的体外神经毒性分析
神经毒性测定使用大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC-12与Aβ1-40肽陈化了的(aged)溶液，如Solomon B，等之前所述(Proc Natl Acad Sci USA 1997；94：4109-4112)。肽溶液特征在于通过刚果红结合形成原纤维(fibrillar)。在第6及9天，结合等量染剂的溶液以吸光度A540nm表示。这一观察结果提供了形成毒性Aβ1-40聚集物的证据；检测第9天的制剂对PC-12细胞的毒性。
将PC-12细胞在组织培养物中生长，并悬浮在测定培养基中，并且以5×103细胞/孔/100μL置于96孔圆底组织培养平板的控制中。一式两份检测经37℃温育的肽(即聚集的Aβ1-40)与新鲜制备肽(即，非聚集的肽)在25与6.5μM浓度下的毒性。对照为仅具有测定培养基的PC-12细胞。将平板在CO2培养箱中于37℃培养48小时。利用Promega Cyto Tox细胞毒性测定确定对所述细胞的毒性。以吸光度A492nm确定溶胞，且结果表示为相比于100％溶胞的细胞毒性百分数。
体外评价UBI AD疫苗的功能免疫原性
使用大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC-12与具有毒性的Aβ1-40肽陈化了的(aged)溶液进行的神经毒性分析来评估针对UBI AD疫苗的抗体反应的功能性疗效。检测聚集的Aβ1-40肽溶液对PC-12细胞的毒性，接着来自动物免疫流程的豚鼠或狒狒抗-Aβ血清的存在下预培养1小时。将抗-Aβ血清以1∶30与1∶90的稀释液进行检测。最终结果以Aβ1-40纤维聚集的抑制百分数与保护PC-12细胞免受Aβ1-40纤维介导的毒性的百分数表示。包括来自这两个免疫实验的第0周的免疫前血清作为对照。来自第5和8周的免疫豚鼠血清和狒狒血清以1∶30与1∶90的稀释液提供显著的抑制(在第5及8周采集的出血的豚鼠血清以1∶30与1∶90的稀释液分别为50至70％)，与此相比的是免疫前血清以相应的稀释液的5-10％的背景抑制；并且(在第5及8周采集的出血的狒狒血清以1∶30与1∶90的稀释液分别为75和50％)，与此相比的是在原纤维形成测定的抑制中免疫前狒狒血清的15％的背景抑制。同样地，相比于由来自豚鼠与狒狒的免疫前血清获得的背景结果，对这些条件发现对PC-12细胞免受Aβ1-40介导的毒性的保护在60至80％范围内。这些结果确定以β-淀粉样蛋白肽免疫原诱导的抗体具有抵抗毒性Aβ1-40肽的功能性中和活性。
实施例13.UBI AD疫苗以预防模式对过表达hAPP751的幼小转基因小鼠的脑形态与脑样品中β-淀粉样蛋白肽(Aβ1-42)浓度的影响
我们评估UBI AD疫苗以预防模式对过表达具有Swedish与London突变的hAPP751的幼小转基因(tg+)小鼠与他们的非转基因(ntg)同窝仔中的脑形态和脑样品中的β-淀粉样蛋白肽(Aβ1-42)浓度的影响(Rockenstein EM，等，1995和2001)。
将幼小的转基因(tg+)小鼠在～14周龄以预防模式用UBI AD疫苗免疫。当利用抗-Aβ1-42抗体对脑组织进行免疫组织化学染色以确定淀粉样蛋白斑块时，关于这些幼小的个体tg+小鼠的结果显示斑块负荷减少。当生化摘下接种的幼小tg+小鼠的脑组织并通过定量测定评估Aβ1-42的水平时，来自这些幼小的tg+响应小鼠的结果显示Aβ沉积的减少。这些参数都表明Aβ1-42负荷的减少与针对UBI AD疫苗的抗体反应有关。
此外，使用抗-CD11b抗体来确定小胶质细胞的相对激活百分数，并使用抗-CD3抗体确定T细胞浸润，结果显示相比于未处理的tg+对照动物，AD疫苗处理的幼小tg+动物的脑中没有增加的免疫细胞激活的证据。
a.整体目标：
为了评估用UBI AD免疫治疗性疫苗在12至16周期间肌内接种对脑淀粉样蛋白沉积和脑斑块负荷以及血浆中人β淀粉样蛋白肽(Aβ1-42)水平的影响。
转基因动物在鼠Thy-1启动子的调节性控制下组成型过表达具London(717)与Swedish(670/671)突变的人淀粉样蛋白前体蛋白(hAPP)(Rockenstein EM，等，1995，和2001)。在hAPP751 tg+小鼠中，早在3至4月龄时发生Aβ1-42沉积，在额叶皮层中出现成熟斑块，且在5至7月龄时，斑块形成扩展至海马、丘脑和嗅觉流的皮质反射区。
b.用于预防模式的流程总结
选择hAPP751转基因(tg+)小鼠及其非转基因(ntg)同窝鼠(14+2周)来评估UBI AD疫苗对脑Aβ沉积及脑Aβ斑块负荷的影响。将所有的33只tg+小鼠及10只ntg小鼠分成4组：tg+安慰剂对照小鼠(n＝10)仅注射佐剂；tg+实验小鼠(n＝13)注射UBI AD疫苗(90μg/150μL剂量)；未处理的tg+对照小鼠(n＝10)；以及未处理的ntg对照小鼠(n＝10)。在第0、3、12周总共注射3次剂量，并在第16周额外注射1次剂量。在第25.5周，以Morris水迷宫测试监控所有小鼠的空间学习。所述小鼠再随访4周，然后处死。
c.抗-Aβ1-28抗体滴度的确定
在第0、3、6、9、12、16、19、22与29周，对所有tg+与ntg小鼠采血。分离血清，并且以Aβ1-28ELISA确定抗-Aβ1-28抗体滴度。在安慰剂处理的tg+小鼠及未处理的tg+小鼠中无一具有可检测的抗-Aβ1-28抗体滴度。然而，接受至少两次UBI AD疫苗注射的幼小tg+小鼠具有可检测的抗体滴度。
d.脑形态和淀粉样蛋白沉积与斑块负荷的分析
在寿命研究结束时，处死时，以生理盐水(0.9％)跨心室(transcardially)灌注，快速摘下小鼠脑部，对半切开，并准备进行进一步的分析。将左脑半球冷冻供如下文部分e所述的后续分析。将右脑半球以新鲜的4％多聚甲醛PBS(pH7.4)浸渍固定1小时。接着，将该半球移至15％的蔗糖溶液中进行冷冻保护。次日，将大脑在干冰上冷冻，并保存于-80℃，直到用于组织学研究。冷冻切片(10nm厚)以H&E染色，记录并评估神经细胞层的完整性和总体形态。使用单克隆抗体4G8(抗-Aβ17-24)分析冷冻组织切片，以检测皮质和海马中的Aβ沉积及斑块负荷。定量斑块的数目与斑块覆盖的面积，并以来自穿过每只动物的矢状脑的5个不同层的9个组织切片的平均值建立动物的统计相关数值。评估UBI AD疫苗处理组中的7只tg+小鼠以及未处理的对照组的7只tg+小鼠。结果以UBI AD疫苗处理的(n＝7)对未处理的(n＝7)动物(图10A、10B)的Aβ1-28斑块负荷的百分比，并且表示通过免疫组织化学在9个组织切片中所检测到的平均相对斑块负荷。UBI AD疫苗响应tg+小鼠与未处理的动物的比较也包括在大脑皮质(0.22％vs.0.32％)以及海马区(0.20％vs.0.29％)中；在高响应性疫苗处理的动物中，平均的斑块负荷降低。
e.通过生化分级脑组织来确定Aβ1-42
如下述部分所述，将动物处死并制备脑。将左脑半球分开冷冻，并使用瑞士GENETICS Company供应的用于抗原检测的高灵敏Aβ1-42ELISA试剂盒分析4个脑提取物的可溶级分的Aβ1-42肽水平；与供应商提供的标准品比较确定Aβ1-42的水平。在4个脑级分中获得的结果以ng/g脑湿重表示。以TRIS缓冲盐(TBS)、Triton X-100去污剂、SDS去污剂与甲酸(FA)提取各动物的左脑半球(包括嗅球(bulbus olfactorius))，以表征和评估Aβ1-42，且一式两份检测所述级分。简单地说，TBS提取物含有脑组织的水溶性Aβ1-40与Aβ1-42级分。为溶解剩余的β-淀粉样蛋白肽，去污剂与酸是必需的。Triton X-100为具有两种属性的寡聚乙二醇衍生物；具有苯环的异辛基残基破坏非极性的范德华力，且重复的-O-CH2-CH2-残基破坏氢键。SDS具有类似的两面性作用，但其更为强大，且破坏整个二级结构；Aβ肽将成为线性的且肽链被延伸。甲酸为最强的溶剂，且主要破坏氢键。可以假设TBS溶解寡聚物结构。Triton溶解较小的聚合物，例如，初原纤维。SDS可破坏所有剩余的结构，且其它部分，包括强复合的不溶性原纤维可在FA中分离，主要作为单体。因此，为了评估β-淀粉样蛋白聚合状态与抗淀粉样测试化合物的效力，研究所有四种级分。
Aβ定量ELISA和生化提取检测相比于未处理的tg+小鼠，疫苗处理的(UBI AD疫苗)响应tg+小鼠的抗-Aβ抗体反应是否与减少的Aβ负荷有关。特别注意的是，当将四份脑组织生化提取物每一份中的Aβ1-42水平与来自未处理的tg+对照动物相比时，在UBI AD疫苗响应tg+小鼠中减少的总体Aβ1-42水平较低(图11A、11B)。
f.小胶质细胞活化的检测
利用CD11b抗体分析冷冻组织切片中活化的小胶质细胞；通过各切片中目标的数目作为面积的系数来评估平均目标尺寸，作为小胶质相比簇集的平均测量；来自穿过每只动物的矢状脑的5个不同层的9个切片的平均值确定动物的统计相关数值。
疫苗处理的tg+小鼠(n＝7)相对于未处理的tg+小鼠(n＝7)的结果，以大脑皮层与海马中，被染色的CD11b阳性细胞区的百分数来表示，结果显示，相比于未处理的tg+对照动物，经处理的动物具有较低百分数的染色区。这些结果表示，与未处理的转基因小鼠相比，疫苗处理的动物没有表现出增加量的活化小胶质细胞。
g.脑组织中T细胞浸润的确定
评估冷冻组织切片，以检测大脑皮层、海马与血管中T细胞的量，且专门计数细胞。来自穿过每只动物的矢状脑的5个不同层的9个切片的平均值确定动物的统计相关数值。疫苗处理的tg+小鼠(n＝7)与未处理的tg+对照小鼠(n＝7)的结果，以大脑皮层与海马中被染色的CD3阳性T细胞的数目与血管中被染色的T细胞的数目表示，且结果显示，相比于未处理的tg+对照动物，疫苗处理的动物表现出稍微降低的大脑皮层、海马与血管中计数的免疫染色的T细胞平均数。
h.结论
在16周的期间，以肌内途径注射UBI AD疫苗或安慰剂疫苗至hAPP751转基因小鼠中3至4次。动物对于UBIAD疫苗具有良好的整体耐受性，特别是考虑给予这些动物的每剂量高浓度的UBI Aβ1-14肽免疫原构建体(90μg/150μL)。在响应者中，在来自这些动物的4个脑组织提取物中观察到减少的Aβ斑块负荷与减少的Aβ1-42水平。也可由免疫组织化学显示减少的Aβ沉积与斑块。在疫苗处理的tg+hAPP751小鼠的脑中，没有小胶质细胞活化或T细胞浸润的迹象。
实施例14.用于安全性的针对UBI AD疫苗的抗体反应的表位绘图
利用包被有Aβ1-14(SEQ ID NO：4)、Aβ1-28(SEQ ID NO：3)、Aβ17-42(SEQ ID NO：67)、MvF5 Th(SEQ ID NO：46)、HB sAg3 Th(SEQ ID NO：47)肽作为固相抗原的平板进行ELISA测试，以评估经免疫的豚鼠及狒狒血清中，针对UBI AD疫苗的抗体反应的特异性。利用Aβ1-14与Aβ1-28抗原检测疫苗所诱发的高滴度抗-Aβ抗体(表1)；然而，由于“B细胞表位延展(spreading)”至超过第14个氨基酸(是潜在的不良交叉反应性的来源)，因此担心Aβ1-28也可检测到其它抗体。
为了解决这一担心，同样以ELISA用Aβ17-42肽测试高免疫豚鼠抗血清及狒狒抗血清。ELISA滴度显示并未在所检测的高免疫样品中检测到表位延展。高免疫血清显示出与Aβ1-28肽的增加的结合，但不会与Aβ17-42反应。高免疫血清不与MvF5 Th(SEQ ID NO：46)或HBsAg3 Th(SEQ ID NO：47)肽结构域反应。在将结构域前抗体结合位点定位到目标区域内特定的残基的精细的表位定位方法中，围绕着Aβ1-14肽序列的N端天冬氨酸残基“D”及人β淀粉样肽前体蛋白(hAPP)的邻近区域，合成24个重叠的10-mer肽，以覆盖整个Aβ1-14长度与邻近的hAPP位置(表9)。将这些巢式肽分别用来包被微量滴定孔，作为ELISA检测的固相免疫吸附剂。阳性对照ELISA平板用Aβ1-28包被。用于第0、10、84与111周来自经免疫的狒狒的血清检测其抗体结合。将狒狒血清连续稀释并以在包被有5ug/mL 10-mer肽的平板上进行测定。如预期的，具有表示Aβ1-14(SEQ ID NO：4)N端10-mer的SEQ ID NO：6的肽(DAEFRHDSGY)强烈地与来自所有4只狒狒的免疫血清反应。Aβ1-14第1个位置的“D”对抗体特异性是关键的。删除“D”或将第1个位置修饰成“E”(谷氨酸)导致严重减少的与10-mer肽的结合，这显示狒狒抗体对Aβ1-10(SEQ ID NO：6)的高特异性，以及存在与Aβ1-42肽或其前体物上其他位置的Aβ肽免疫原构建体交叉反应的抗体识别位点的可能性低。此外，免疫血清识别的精细特异性表位绘图进一步得到竞争抑制性ELISA的确认，如表10所示。综上所述，这些抗体表位的发现证实由UBI AD免疫治疗性疫苗诱发的抗体直接特异性地针对Aβ的N端结构域，而不针对超过第14个残基的位点，也不针对MvF5 Th与HBsAg 3 Th结构域。
实施例15.接受多次UBI AD疫苗免疫的食蟹猴的血清与CSF中的抗体反应及Aβ1-40水平
疫苗反应的药物动力学显示，第2组低剂量中(150μg/0.25mL)的六只食蟹猴中有四只以及第3组高剂量(750μg/1.25mL)中所有的六只食蟹猴，在第一次免疫后，产生与Aβ1-42的交叉反应针对Aβ1-14肽免疫原构建体的抗体。
如表11所示，低剂量与高剂量的动物在研究持续期间(经过27周)均维持高滴度抗体。通过表位绘图(表12)确定的抗体反应与来自用高(750μg)或低(150μg)剂量的UBI AD疫苗免疫三次(9WPI)和五次(15WPI)的每组四只猕猴的血清的精细特异性表明在每组所有4只动物中对Aβ1-10肽(DAEFRHDSGY)(SEQ ID NO：6)N端的强特异性，与用来自之前的狒狒研究的免疫血清的观察(表9)相似。不同于狒狒中观察到的反应性模式，所有4只动物对于围绕Aβ1-42肽N端第4、5、6位置残基RHD的具有SEQ ID NOs：20至22的肽具有一些中等的反应性。除了上述4只动物之外，在所检测的任意猕猴样品中没有观察到对其它10-mer肽的额外反应性。
利用市售的免疫测定试剂盒来分析UBI AD疫苗对血清与CSF中Aβ水平的影响。如表13所示，确定接种后第0、15、21及25.5周血清中及处死时(第15周+1天或第27周)CSF中的Aβ1-40浓度。接受UBI AD疫苗的猕猴血清中Aβ1-40的水平增加，而接种安慰剂疫苗的动物则为正常水平。相较之下，不论接种安慰剂或UBIAD疫苗的猕猴的脑脊液中，Aβ1-40水平维持在稳定的状态。这些结果支持“外周降解假说(Peripheral Sink Hypothesis)”作为抗-Aβ抗体的作用模式，其中所述抗体促使Aβ肽由脑外流至周围循环系统。
实施例16.接受多次UBI AD疫苗免疫的食蟹猴的细胞性免疫应答
由在第15、21及25.5周采集的全血分离外周血单核细胞(PBMC)样品，且在存在各种Aβ肽时培养。如表14所示，在向培养基中加入Aβ1-14肽时，未发现淋巴细胞增殖反应。然而，当向一些PBMC培养物中加入Aβ1-42或Aβ17-42(SEQ ID NO：67)肽时，观察到阳性增殖反应。
还检测第15、21与25.5周采集的PBMC在Aβ肽或PHA有丝分裂原存在时的细胞因子分泌。如表15所示，响应全长Aβ1-42肽而不是Aβ1-14肽，3种细胞因子(IL2、IL6、TNFα)表现出可检测的分泌；相比于安慰剂疫苗样品，UBI AD疫苗处理的样本中没有检测到细胞因子分泌的上调。在所有PBMC培养中，在Aβ肽存在下检测的另外三种细胞因子(IL 10、IL 13、IFN-γ)低于测定检测极限。
猕猴用仅具有N端Aβ1-14肽免疫原与外源T辅助表位的UBI AD疫苗(不含Aβ17-42肽结构域)免疫，这表示在Aβ1-42肽的存在下在PBMC培养物中观察到的阳性增殖结果与UBI AD疫苗反应不相关，而是针对天然Aβ的背景反应。
这些结果支持仅具有Aβ1-14与外源T辅助表位的UBI AD疫苗的安全性，表示其不会在正常猕猴中产生针对Aβ肽的可能的炎性抗自身细胞介导的免疫应答。相较之下，AN-1792疫苗临床试验研究中的脑炎相关的不良事件部分归因于疫苗的纤维状/聚集的Aβ1-42免疫原内含有T细胞表位。
实施例17.豚鼠、猕猴和狒狒中不同水平的UBI AD疫苗的免疫原性的比较
大量测试各种Aβ肽免疫原构建体作为AD疫苗主要成分的适合性后，选择具有SEQID NOs：64与65的肽构建体来创造设计疫苗制剂。选择的疫苗制剂包括两种肽免疫原构建体，其与CpG寡聚物形成免疫刺激复合物，并补充有Adjuphos的矿物盐作为佐剂(UBI AD疫苗)，广泛检测该疫苗制剂，如实施例8-15所述，以校正其在多种物种(豚鼠、猕猴和狒狒)中的免疫原性及其用于临床试验的制剂的给药方案。表16总结了在给予一次或两次剂量后，肽剂量与响应率(具有阳性滴度的动物数/测试的动物总数)，和用于评估UBI AD疫苗的给药时间表的每个物种的体重。由此分析可知，基于来自涉及的所有物种的数据，优选地设定每剂量水平高于100ug，以在单次注射后达到良好的响应率，加强注射将允许高或接近完全的响应率。选择300μg/0.5mL的UBI AD疫苗剂量用于人受试者中的研究。在I期临床研究中，在第0、4、12周免疫个体。一次剂量后四周，19名加入的受试者中有2名具有阳性抗-Aβ抗体滴度，两次剂量后四周(在第8周)，19名受试者有17名呈阳性反应；三次剂量后四周(在第16周)，所有19名受试者均呈阳性反应，且保持阳性直到I期研究结束(第24至26周)。
实施例18.I期临床试验表明UBI AD疫苗(UB-311)的治疗效果
基于病理学、生化和遗传证据，Aβ肽为AD中一种主要的治疗目标，所述证据支持其在疾病进程中的作用。主动Aβ免疫治疗，如UBI AD疫苗(UB-311)的目的在于刺激免疫应答，以产生强健的抗-Aβ抗体，其可由循环系统捕获多余的Aβ肽，且防止或减缓认知下降。
UB-311 I期临床试验的名称为“评估UBI AD免疫治疗性疫苗(UB-311)在轻度至中度阿尔茨海默病患者中的安全性、耐受性及免疫原性的I期开放式标记研究”，基于经最终核准的临床流程进行。总共19名患有轻度至中度AD的患者报名参加。每名患者在第0、4及12周接受三次研究药物(UB-311)的肌内注射。整个研究持续24至26周。
除了评估UB-311 I期临床试验收集的安全性、耐受性、免疫原性及功效数据之外，还描述了研究受试者的抗体结合表位、Aβ肽水平及免疫功能的研究分析。来自在第0、4、8、12、16及24/26周UB-311免疫之前和之后采集的血液用于分离外周血单核细胞(PBMC)和分离用于血清学和免疫原性分析的血清/血浆样品的结果包括：(1)抗-Aβ抗体滴度，(2)表位绘图，(3)血浆Aβ1-40水平，以及(4)体外淋巴细胞增殖与细胞因子的分析。
共有19名轻度至中度阿尔茨海默病(AD)患者加入该研究，并且在第0、4及12周接受三次UBI AD免疫治疗性疫苗(UB-311)肌内注射。
在施用给临床上记录的轻度至中度AD患者时，UB-311表现出令人满意的安全性及耐受性模式。设计明确、可能或者或许与UB-311相关的不良事件(AEs)的发生率作为评估UB-311治疗的安全性的主要终点。在研究期间，在19名受试者中的9名中报道了16次治疗相关的AE发生。治疗相关的AE为轻度注射部位反应(5名受试者)，中度躁动(moderateagitation)(2名受试者)，以及轻度红细胞沉降率增加(2名受试者)。所有的治疗相关的AE为1级(轻度)或2级(中度)严重性，且没有对这些事件采取行动。一名具有强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)及糖尿病病史的受试者在随访期过程中报道带状疱疹的严重不良事件(SAE)的。该受试者在发生此事件时立即送医并提供适当的治疗。判断此SAE在因果关系上是不可能的，且该受试者在两周后因情况好转而出院。
评估UB-311的耐受性。所有19名受试者完成了治疗，且尽管有AE发生，但没有人提早退出研究。因此，耐受性为100％。
实施例19.施用UB-311疫苗在所有受试者中引发具有针对Aβ1-14结构域N端特异性的抗体
如图12所示，在第0、4、8、12、16及24-26周检测抗-Aβ1-14抗体水平的改变，以评估UB-311疫苗的免疫原性。抗-Aβ1-14抗体水平的平均值转换为log10，所有受试者第0周(治疗前)为1.14，在第4周略微地增加至1.21，在第8及12周明显地增加至2.00与1.91，在第16周(第3次免疫后4周)达到峰值2.70，并在第24-26周下降至2.28。
抗体滴度经Log10转换，且以第0周的数值为基础值。对所有3种特异性抗体滴度观察到类似的趋势。除了抗-Aβ1-42单体抗体，抗体滴度改变的平均值在第4周略微地增加，此时，受试者已在第0周接种第一次剂量的UB-311，但在接种第二次剂量之前。在第4周给予受试者第二次剂量后第8周，抗体滴度也增加了。在第12周施用第三次剂量后，第16周时检测到抗体滴度的峰值平均变化。
实施例20.神经学、认知与功能测试评估UB-311疫苗在轻度至中度阿尔茨海默病中的功效
通过测量19名患者的ADAS-Cog分数、MMSE分数与ADCS-CGIC的改变来评估UB-311的功效。评估第0周(V2)、16周(V7)及24-26周的ADAS-Cog分数与ADCS-CGIC。在筛选前(V1)、第16周、24-26周测量MMSE分数。在所有受试者中，观察到ADAS-Cog分数由第0周至第16周及由第16周至第24-26周分别增加1.42与0.79。所有受试者基线的平均ADAS-Cog分数为26.26，在第16周增加至27.68，在第24-26周略微增加至28.47。此外，在MMSE分数中发现由筛选前访视至第16周及由第16周至第24-26周分别减少0.32与0.79(图13)。
受试者在筛选前访视的平均MMSE分数为19.16。第16周时，分数降至18.84，且在第24-26周，最后一次访视时，降至18.05。值得注意的是，即使这两种等级(scales)的平均值不同，但每个受试者分数的分布相当分散，因此，这两种等级的趋势似乎是稳定的。
关于ADCS-CGOC等级，在最后的治疗(第三次剂量)后4周(即第16周)，超过35％的受试者表现出改善。在较长的治疗终止后，于第24-26周，受试者群体的改善率下降至不超过18％。在16周，约略小于半数的受试者的ADCS-CGIC没有改变，且在第16周后的另一个8-10周的无治疗随访期间后，该受试者分类轻微增加至大于所有受试者的50％。比较具有改善相对于恶化的受试者比例，在第16周显示出支持研究的产品的阳性结果，但在第24-26周(最后一次疫苗剂量后12周)则无。
在亚组分析中，结果证明轻度AD的较老受试者(年龄＞60岁，且基线MMSE＞20)对于较好的针对UB-311疫苗的反应，其显示出：(1)平均ADAS-Cog下降3点(相比于来自超过12个月期间的Tarenflurbil II期试验的安慰剂组增加3.81点)，(2)稳定的平均MMSE分数(相比于超过12个月期间的Tarenflurbil II期试验的安慰剂组减少2.04点)，如图14所示，以及(3)较高的具有改善的比例，且ADCS-CGIC没有等级改变。这种在年龄＞60岁的轻度AD患者中所有三种认知分数的改善是从未报道过的，并且被更热心地接受。
实施例21.检测针对Aβ1-28单体、Aβ1-42单体或Aβ1-42寡聚物的人抗体的酶免疫测定(ELISA)
阿尔茨海默病的研究已经证明Aβ聚集物及Aβ-衍生的寡聚物在AD发病机制中起核心作用。Lacor PN已经在Current Genomics 2007；8：486-508中报道了Aβ寡聚物于表达N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)-型谷氨酸受体(NMDA-R)亚基NR1与NR2B的神经元结合。当Aβ寡聚物结合到海马神经元细胞上的NR1与NR2B时，这一配体-受体结合的结果导致突触末端数目的大量减少，而突触末端与记忆和认知缺陷及痴呆有关。最近，细胞的体外研究及临床试验的结果显示，抗-Aβ寡聚物抗体能够阻断这一结合，并保护神经元抵抗Aβ寡聚物的毒性。UBIAD疫苗(UB-311)含有两种肽免疫原，每种肽包括短的Aβ肽N端(Aβ1-14)，其合成连接到不同的Th2-偏好的N端肽表位。为评估UBI AD疫苗反应的免疫原性，开发出用于体外检测针对Aβ1-28单体、Aβ1-42单体与Aβ1-42寡聚物的抗体的抗-Aβ抗体酶免疫测定(ELISA)。
将Aβ1-28单体、Aβ1-42单体或Aβ1-42寡聚物预先包被在微量平板的孔上作为固定的抗原。在测定过程中，将血清样品以1∶10从1∶100连续稀释至1∶100,000，并添加至预先包被的微量平板中。所述抗-Aβ1-28、抗-Aβ1-42单体或寡聚物的抗体(如果存在)与固定的抗原结合。清洗孔以移除未结合的抗体及其它血清成分后，向每个孔中加入辣根过氧化物酶-缀合的重组蛋白A/G的标准化制剂，并允许与结合的抗体反应。通过清洗孔移除未结合的缀合物，并向每个孔中加入含有3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)与过氧化氢的底物溶液。与所检测的血清样品中存在的(如果有一些的话)Aβ-特异性抗体的量成比例显色出黄色。通过加入稀释的硫酸溶液终止所述酶-底物反应。然后，通过在微量平板读数仪中分光光度测量在450nm波长的吸光度(A450)确定每个孔中发生的颜色变化。利用ELISA滴度计算程序来计算相对抗体滴度。
于Aβ单体或淀粉样蛋白斑块相比，Aβ寡聚物表现出对神经元最具毒性。主动免疫治疗的目标不仅要诱导对Aβ单体特异性的抗体产生，也要诱导对Aβ寡聚物特异性的抗体产生。分析在第0(基线值)、4与12周每次UB 311注射前和在第8、16及24周从19名轻度至中度AD患者采集的血清样品的抗-Aβ抗体滴度。图15显示对19名加入的受试者的每一名在筛查访视(V1/V2)和在第16周(V7)(最后的UB-311免疫后4周)的抗-Aβ1-28单体、抗-Aβ1-42单体与抗-Aβ1-42寡聚物的抗体滴度。
实施例22.表位绘图：检测针对N-端肽的人抗体的竞争性结合抑制酶免疫测定(EIA)
通过ELISA检测，利用表位绘图来鉴定抗-Aβ1-14抗体在Aβ肽的线状、重叠的10-mer氨基酸序列(Aβ上的残基-9至24)上的结合位点或表位。评估19名受试者的临床血清样本。第16周(在第0、4和12周的3次免疫后)的结果如下所示(图16)。
选择合成的Aβ1-28肽作为固定抗原，且以2μg/mL的浓度预先包被到微量平板的孔上。在实验前，将各血清样品以1∶50、1∶100、1∶200及1∶400稀释，并检测以确定最佳的稀释。将最佳稀释的抗-Aβ血清样品分别与设计的10-mer肽混合，作为液相免疫吸附物。在转移至Aβ1-28预先包被的平板前，将该混合物利用最佳稀释的血清1：5连续稀释。以单独的最佳稀释的抗-Aβ血清作为对照。在测定的过程中，10-mer肽会特异性地结合至优势的抗体结合位点，且竞争性抑制抗-AB抗体与固定的抗原的结合。在清洗孔移除未结合的抗体及其它血清成分后，向每个孔中加入辣根过氧化物酶-缀合的重组蛋白A/G的标准化制剂，允许与结合的抗体反应。清洗孔移除未结合的缀合物后，向每个孔加入含有3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)与过氧化氢的底物溶液。与所检测的血清样品中存在的(如果有一些的话)Aβ-特异性抗体的量成比例显色出黄色。通过加入稀释的硫酸溶液终止所述酶-底物反应。然后，通过使用IC505X程序(Molecular devices)在微量平板读数仪中在450nm波长(A450)分光光度测量每个孔中发生的颜色变化。将对照孔洞中，抗-Aβ抗体与固定抗原的结合表示最大的结合(100％)，且以10-mer肽的半最大抑制浓度(IC50)作为表位特异性的指示。
实施例23.由来自UB-311免疫的患者的血清样品中的抗体所识别的优势表位对Aβ1-10肽是特异性的
在将优势抗体结合位点定位至目前区域内的特定采集的精细表位绘图方法(表17)中，沿着Aβ1-14肽序列(SEQ ID No 4)与人β-淀粉样蛋白前体蛋白的邻近区域合成24个重叠的10-mer肽(SEQ ID NOs：6、8至30)，以覆盖由N端天冬氨酸“D”起始的Aβ1-14整个长度及邻近的hAPP位置(图16)。检测19名受试者免疫前与接受三次剂量的UB-311后第16周所采集的血清样品。以治疗前的样品作为基线抗-Aβ抗体水平(数据未显示)。如预期，在全部19份样品中产生阳性表位绘图所针对的优势抗体反应针对Aβ的游离氨基端(SEQ ID No.6)，如图16及表17所示。更特别的是，肽DAEFRHDSGY，表示Aβ1-14的N端10-mer，与所有19名患者的免疫血清有最强的反应。19名受试者中有8名检测到具有与其它Aβ 10-mer肽的微弱反应性的额外抗体反应。还检测在第4、8、12及24-26周由某些而非全部受试者采集的血清样品，并显示出一致的结果(数据未显示)。综上所述，这些数据证明UB-311所诱导的大部分抗体特异性针对Aβ的N端结构域，且不针对超过残基14的位点。
实施例24.在UBI AD疫苗(UB-311)免疫三次后，血浆中的Aβ1-40肽增加
目前，不论是减轻疾病的临床试验或以胆碱酯酶(cholinesterase)抑制剂治疗AD患者，Aβ1-40(SEQ ID NO：2)、Aβ1-42(SEQ ID No：1)的血浆浓度变化或Aβ1-42：Aβ1-40比例没有发现与治疗响应统计学相关。然而，血浆Aβ水平被提议为可能的AD标志。
在我们先前的研究中，在接受UBI AD疫苗的猕猴中，血清中的的Aβ1-40水平升高，但在接种安慰剂疫苗的动物中观察到正常水平。这些结果显示，“外周降解假说”可能是抗-Aβ抗体的作用模式。在本研究中也观察到这一现象，尽管与人受试者中三次免疫后的抗体滴度相比，猕猴中六次UB-311免疫后的抗-Aβ抗体滴度要高得多。如表18所示，比较12对病例血浆Aβ1-40水平(在UB-311治疗前及第16周(第三次免疫后4周)检测的Aβ1-40血浆样品)与第16周的血清Aβ1-28抗体浓度。在UB-311免疫前，所有抗体滴度均为负的。8名抗-Aβ1-28抗体滴度大于Log10 2.4的个体在接受UBI AD疫苗(UB-311)后具有升高的Aβ1-40滴度；然而，4名抗体滴度小于Log102.0的个体中有三名在治疗后没有升高。在大部分情形中，增加的Aβ1-40水平小，除了一个例外(受试者P109)，其在免疫前显示出异常高的血浆Aβ1-40水平，和在免疫后显著更高的水平(1031.9pg/mL)。关于该非常高的Aβ1-40的原因仍不清楚。没有受试者在血浆中具有可检测水平的Aβ1-42肽。
实施例25.在Aβ1-14或Aβ1-42肽的存在下的UB-311免疫没有刺激人淋巴细胞(PBMC)
新型疫苗的来临与越来越多的要求特定的免疫与自身免疫疾病之间的联系的高度公开的报道已经引起对免疫风险的公众关注。可以利用响应抗原刺激的淋巴细胞增殖与细胞因子产生来评估免疫系统在接种后是否被高度激活，并且涉及哪些途径(如果有的话)。本研究的目的是在Aβ肽存在或不存在下，或以PHA有丝分裂原为阳性对照，通过测量淋巴细胞增殖的刺激指数(SI)，以及在第16周三次UB311免疫之前和之后，在培养的来自AD患者的淋巴细胞中的细胞因子浓度来评估UB-311的免疫原(Aβ1-14)的安全性。
以Ficoll-hypaque梯度离心分离AD患者的外周血单核细胞(PBMC)。对于肽诱导的增殖及细胞因子的产生，将细胞(2.5x 105/孔)一式三份单独或添加每种肽结构域(最终浓度为10μg/mL)进行培养，所添加的肽包括Aβ1-14(SEQ ID NO：4)、Aβ1-16(未包括SE Q IDNO：)、Aβ1-28(SEQ ID NO：3)、Aβ17-42(未包括SEQ IDN NO：)、Aβ1-42(SEQ ID NO：1)与不相关的38-mer肽(p1412)。培养物在37℃用5％CO2培养72小时，接着由各孔移除100μL的上清液，并在-70℃冷冻以进行细胞因子分析。向每个孔中添加10μL含有0.5μCi的3H-胸苷(3H-TdR，Amersham，Cat No.TRK637)培养基，培养18小时，接着以液闪计数检测放射线同位素掺入。使用有丝分裂原植物血凝素(PHA)作为淋巴细胞增殖的阳性对照。以不含有Aβ肽或PHA有丝分裂原的单独培养的细胞作为阴性和阳性对照。将具有Aβ肽的一式三份实验培养物的每分钟平均计数(cpm)除以一式三份阴性对照培养物的评价cpm来计算刺激指数(SI)；SI＞3.0视为显著的增殖反应。
由第0周(基线值)与第16周(第三次剂量后4周)采集的全血分离出外周血单核细胞，接着在各种Aβ肽的不存在或存在下进行培养。如表19所示，当向培养基中加入Aβ1-14、其它Aβ肽或p1412(不相关的对照肽)时，没有观察到淋巴细胞显著的增殖反应。如预期，在向培养基中加入PHA有丝分裂原时，观察到可能的阳性增殖反应。在UB 311免疫前后观察到类似的针对PHA的反应(p＝0.87)显示，研究受试者的免疫功能并没有显著改变(表19)。
实施例26.在Aβ1-14肽的存在下，US-311免疫不刺激人细胞因子
对仅有细胞、或在Aβ肽结构域或PHA存在下的培养基等分试样进行PBMC培养物的细胞因子分析(IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ)。使用人特异性细胞因子夹心ELISA试剂盒(U-CyTech Biosciences，Utrecht，The Netherlands)依据供应商的使用说明确定各细胞因子的浓度(pg/mL)。利用单独的细胞(阴性对照)，或在Aβ肽、p1412(不相关肽)或PHA有丝分裂原(阳性对照)存在下，培养3天后，检测第0周及第16周采集的PBMC细胞样品的细胞因子分泌。该试剂盒的检测范围为5至320pg/mL。任何低于5pg/mL或大于320pg/mL的检测浓度分别表示为低于定量极限(BQL)或高于定量极限(AQL)。然而，对于统计的考虑，将BQL或AQL分别以定量下限(5pg/mL)或定量上限(320pg/mL)取代。第0周及第16周各细胞因子的平均浓度如表20所示。如预期，在PHA存在下(阳性对照)，除了IL-2之外，细胞因子的产生显著增加。可在基线(第0周)及第16周观察到响应Aβ1-14或其它Aβ肽的刺激的细胞因子的产生，但大部分数值似乎类似于相应的阴性对照(仅有细胞)。
为了评估免疫后细胞介导的免疫应答的改变，将从基线到第16周的平均细胞因子浓度变化与阴性对照的变化进行比较，并以配对的Wilcoxon符号秩检验(Wilcoxonsigned-rank test)进行分析。四种细胞因子(IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α)表现出响应全长Aβ1-42肽分泌显著增加；这一观察可能是Aβ1-42聚集物的构象表位所造成的。在Aβ1-14或其它Aβ肽中，并未检测到细胞因子分泌的上调。
总结：UBI AD疫苗含有两种肽免疫原，每种具有游离的N端Aβ1-14肽，其分别合成连接至MvF5Th与HBsAg3Th表位。使用体外淋巴细胞增殖与细胞因子分析来评估UBI AD疫苗免疫在细胞性免疫应答中的影响。当向培养基中加入Aβ1-14肽或任何其它Aβ肽时，并未观察到淋巴细胞的增殖反应，如表19所示。除了Aβ1-42肽之外，在以Aβ1-14肽或任何其它Aβ肽治疗时，并未检测到UBI AD疫苗免疫的患者的淋巴细胞的细胞因子分泌上调，而在第16周UB 311免疫后，相比于治疗前的第0周水平，Aβ1-42肽引发4种细胞因子(IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α)可见的增加(表20)。由于仅用Aβ1-14没有检测到上调，所以通过Th2型T细胞反应的细胞因子释放增加更可能与UBI AD疫苗反应无关。针对Aβ1-42的反应被怀疑是针对天然Aβ的背景反应，其可能与Aβ1-42中鉴定的天然T辅助表位有关。观察到缺少响应PHA的IL-2产生，这与Katial R，等在Clin Diagn Lab Inmunol 1998；5：78-81中报道的发现相一致(在相似的实验条件下，使用正常的人PBMC)。综上所述，这些结果显示UBI AD疫苗不会在参与I期临床试验的患有轻至中度阿尔茨海默病的患者中产生可能的炎性抗自身、细胞介导的免疫应答，因此进一步证实UBI AD疫苗(UB-311)的安全性。
表1、血清学测定中所使用的Aβ1-42肽及其片段
表2、用于设计Aβ1-42衍生的肽免疫原构建体的选择的泛宿主性T辅助表位
表3、在Aβ肽免疫原构建体的设计中，以包含理想化的人工Th表位的病原体蛋白衍生的Th表位加强Aβ1-14肽的免疫原性，所述病原体蛋白衍生的Th表位用于引发针对Aβ1-42肽N端的特异性抗体
表4、用包含各种Aβ衍生的肽免疫原构建体的疫苗制剂致敏(0wpi)及加强(4wpi)后豚鼠中的免疫原性评估
表5、用包含两种Aβ1-14衍生的肽免疫原构建体及其组合的疫苗制剂致敏(0wpi)及加强(4wpi)后豚鼠中的免疫原性评估
表6、用包含两种Aβ1-14衍生肽免疫原构建体及其组合的疫苗制剂致敏(0wpi)及加强(4wpi)后豚鼠中针对所述免疫原的Th肽或载体蛋白元件的抗体的评估抗体
表7、用包含各种量的Aβ1-14衍生的肽免疫原构建体(SEQ ID NO：62+63)在ISA51w/o乳液和明矾中的疫苗制剂致敏(0wpi)及加强(3及6wpi)后狒狒中的免疫原性评估
表8、用包含两种Aβ1-14肽免疫原构建体的疫苗制剂致敏(0wpi)及加强(4wpi)后针对所述Aβ肽免疫原构建体的Th肽的抗体(来自第8wpi的豚鼠血清)的评估
表9、免疫期间(0-111wpi)，用从接种的狒狒收集的血清进行表位绘图，用于分析Aβ1-42N端的精细特异性分析
表10、用狒狒高度免疫血清通过竞争性抑制ELISA进行表位绘图
Aβ1-10肽的50％抑制为约0.3μg/ml。狒狒抗-Aβ抗体的特异性主要针对N端天冬氨酸(D)。
使用以狒狒免疫血清样品检测的人淀粉样蛋白前体蛋白(hAPP)的10-mer Aβ肽进行的表位绘图显示针对N端Aβ1-10肽的特异性。
表12、在第9及15周从安慰剂疫苗(0μg/剂)或UBI AD疫苗(150μg/剂或750μg/剂)免疫的食蟹猴采集的抗血清的特异性分析
NA＝不可获得
表13、食蟹猴在UBI AD疫苗前后的血清(上图)及脑脊液(下图)的Aβ1-40浓度(pg/mL)
Aβ1-40血清
疫苗剂量 0wpi(n＝6) 15wpi(n＝6) 21wpi(n＝3) 26wpi(n＝3)
0μg(对照) 61.7±12.7 63.0±16.8 63.7±12.2 52.7±2.5
150μg 53.9±6.3 127.4±23.8 144.8±17.3 158.0±38.1
750μg 56.8±7.7 138.2±18.9 144.5±22.5 118.0±20.9
Aβ1-40脑脊液
疫苗剂量 15wpi(n＝3) 28wpi(n＝3)
0μg(对照) 56.4±6.0 59.7±5.9
150μg 63.9±6.5 67.6±5.4
750μg 57.5±5.9 54.3±2.9
表14、由与各种Aβ肽共培养的食蟹猴外周血单核细胞的刺激指数表示增殖
Aβ1-14(SEQ ID NO：4)DAEFRHDSGYEVHH
Aβ1-16(SEQ ID NO：66)DAEFRHDSGYEVHHQK
Aβ17-42(SEQ ID NO：67)LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
Aβ1-42(SEQ ID NO：1)DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
表15、分析以Aβ1-14、Aβ1-42肽或PHA(植物血凝素)有丝分裂原a刺激的食蟹猴外周血单核细胞(PBMCs)中的细胞因子浓度
a.在最后免疫(15wpi)后，来自6只食蟹猴的外周血单核细胞(PBMC)在Aβ肽或PHA有丝分列原不存在或存在下培养24小时。以市售ELISA检测(U-CyTech Biosciences，Utrecht，The Netherlands)检测培养物上清液的各细胞因子(IL-2、IL-6、TNF-α)的可检测的浓度。
b.结果以平均数±标准偏差表示。
c.BDL：低于检测极限。
表16、比较豚鼠、恒河猴和狒狒中不同剂量水平UBI AD疫苗的免疫原性
1.狒狒在A部分第0、3周及B部分第78、81周(在72周的休息期后)免疫。
2.每1mL剂量由600μg肽组成。
3.Log10值＞2评分为阳性抗-Aβ滴度。
4.数字表示：具有阳性滴度的动物数/检测的动物总数。
BW：体重。
表18、分析UBI AD疫苗免疫前后AD患者血浆中Aβ1-40的浓度(pg/mL)以及与递减顺序的抗-Aβ1-28抗体滴度(Log10)的相关性
粗体数据表示在第0、4、12周免疫UBI AD疫苗后第16周具有增加的Aβ1-40水平。
表19、第0和16周由患者受试者采集的外周血单核细胞(PBMCs)与各种Aβ肽培养的平均刺激指数
*p1412为不相关的对照肽。
统计学分析：利用配对t检验分析第0周与第16周淋巴细胞增殖的差异。利用配对Wilcoxon符号秩检验检验响应Aβ肽与对照的平均细胞因子浓度改变的差异(第16周与第0周)。以双尾检验确定统计学显著水平(p＜0.05)。使用R(第2.13.0版)进行所有的统计学分析。
表20、第0和16周由患者受试者采集的外周血单核细胞(PBMCs)与各种Aβ肽共培养所产生的细胞因子平均浓度(SD)(pg/mL)1
1.测定的可量化范围为5至320pg/mL。
2. 90％或更多的受试者的浓度高于检测上限(AQL)，即320pg/mL。
3. 1名患者具有AQL值。
4. 6名患者具有AQL值。
5. 8名患者具有AQL值。
6. 4名患者具有AQL值。
7.观察到的缺少响应PHA有丝分裂原的IL-2产生与Katial等人1998在相似的实验条件下报道的发现一致。

Claims (20)

1.一种Aβ肽免疫原构建体，其包括下式：
(Aβ1-42肽的N-端片段)-(A)o-(Th)-X
其中(Aβ1-42肽的N-端片段)为来自Aβ的包括选自由SEQ ID NOs：4、5和6组成的组的约10至约14个氨基酸残基的B细胞表位；
各个A独立的为选自由下列组成的组的氨基酸或连接基团：氨基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α，ε-N)Lys、和ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NOs：32)；
各个Th包括构成辅助T细胞表位的氨基酸序列，所述辅助T细胞表位选自由SEQ IDNOs：34、37、38、40至47及其功能免疫学类似物组成的组；
X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2；和
o为0至约4。
2.权利要求1所述的Aβ肽免疫原构建体，其中所述(Aβ1-42肽的N-端片段)为Aβ1-14(SEQID NO：4)。
3.权利要求1所述的Aβ肽免疫原构建体，其中A为ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NOs：32)。
4.权利要求1所述的Aβ肽免疫原构建体，其中所述Th表位为SEQ ID NOs：45或46。
5.权利要求1所述的Aβ肽免疫原构建体，其包括SEQ ID NOs：48-65的氨基酸序列。
6.权利要求1所述的Aβ肽免疫原构建体，其基本上由SEQ ID NOs：62-65的氨基酸序列组成。
7.权利要求1所述的Aβ肽免疫原构建体，其为SEQ ID NOs：62、63、64和/或65。
8.一种组合物，其包括权利要求1所述的Aβ肽免疫原构建体。
9.一种药物组合物，其包括：
a.权利要求1所述的Aβ肽免疫原构建体；和
b.药学上可接受的递送载体和/或佐剂。
10.一种阿尔茨海默病疫苗组合物，其包括：
a.权利要求1所述的Aβ肽免疫原构建体；和
b.药学上可接受的递送载体和/或佐剂。
11.一种阿尔茨海默病疫苗组合物，其包括：
a.权利要求7的Aβ肽免疫原构建体；和
b.药学上可接受的递送载体和/或佐剂。
12.权利要求10所述的阿尔茨海默病疫苗组合物，其中(b)中的佐剂为铝的矿物盐，其选自由铝胶(Al(OH)3)或adjuphos(AlPO4)组成的组。
13.权利要求10所述的阿尔茨海默病疫苗组合物，其中(a)中的肽抗原和CpG寡脱氧核苷酸(ODN)混合以形成稳定的免疫刺激复合物。
14.一种分离的抗体或其表位结合片段，其结合至权利要求1所述的Aβ肽免疫原构建体的(Aβ1-42肽的N-端片段)组分。
15.权利要求14所述的分离的抗体或其表位结合片段，其特异性结合至Aβ1-10(SEQ IDNO：6)。
16.权利要求14所述的分离的抗体或其表位结合片段，其结合至权利要求1所述的Aβ肽免疫原构建体。
17.权利要求15所述的分离的抗体或其表位结合片段，其结合SEQ ID NO：6。
18.一种组合物，其包括权利要求14所述的分离的抗体或其表位结合片段。
19.一种降低人患者中痴呆的严重性或延缓其发病的方法，所述方法包括施用权利要求10所述疫苗制剂。
20.权利要求19所述的方法，其中所述疫苗制剂以包括10μg-1000μg/剂的水溶液施用给处于阿尔茨海默病风险的患者或诊断有阿尔茨海默病的患者。
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