TWI769424B - 針對降鈣素基因相關胜肽（ｃｇｒｐ）的胜肽免疫原及其用於預防和治療偏頭痛的製劑 - Google Patents

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Abstract

本揭露是關於靶向降鈣素基因相關胜肽(CGRP)之部分的胜肽免疫原結構、含有此結構的組成物、利用此結構所引發的抗體以及用以製備和使用此結構及其組成物的方法。揭露的胜肽免疫原結構具有超過約30個的胺基酸，且含有(a)具有來自全長CGRP蛋白之CGRP受體結合或活化區域的約7個以上連續胺基酸殘基的B細胞抗原決定位，(b)異源性Th抗原決定位；以及(c)任選的異源性間隔子。揭露的CGRP胜肽免疫原結構可刺激針對CGRP的高特異性抗體的產生，用於預防及/或治療偏頭痛。

Description

針對降鈣素基因相關胜肽(CGRP)的胜肽免疫原及其用於預防和治療偏頭痛的製劑
本揭露是關於靶向降鈣素基因相關胜肽(CGRP)的胜肽免疫原結構及其製劑，以用於預防和治療偏頭痛。
偏頭痛是一種常見的身體病況，在美國影響多達3700萬人。偏頭痛被認為是一種全身性疾病，而不僅是頭痛。最近的研究表明，早在偏頭痛症狀出現前24小時，大腦中的變化就可能開始發生。偏頭痛的症狀因患病個體而異，但可能包括嚴重的搏動性頭痛(通常僅在頭部的一側)、噁心、嘔吐、光敏感(畏光)、聲音敏感(畏聲)或這些症狀的組合。即使在頭痛消失後，這些症狀仍然持續。
偏頭痛有多種亞型，其症狀包括虛弱、麻木、視力改變或喪失、眩暈和說話困難(一些患者可能看起來像是中風)。由這種慢性疾病引起的無能是非常嚴重的，可導致工作日的中斷和喪失參加家庭活動的能力。
有時人們可能會使用“頓挫性(Abortive)”藥物治療，這種藥物在早期服用時可以阻止偏頭痛的發作。對於許多患者而言，預防性藥物可以減少偏頭痛的發生頻率和嚴重程度。但是，許多用於預防或治療偏 頭痛的藥物主要是針對其他疾病(例如癲癇發作、抑鬱、高血壓和肌肉痙攣)而開發的。
研究人員數十年來一直致力於開發專門針對偏頭痛的“靶向”預防療法。降鈣素基因相關胜肽(CGRP)是在周圍和中樞神經元中合成的分子。它涉及包括偏頭痛在內的不同疼痛過程，並且作用如同血管擴張劑。用於偏頭痛的頓挫性藥物治療著重在於在偏頭痛開始時阻止CGRP活化。已顯示小分子CGRP拮抗劑藥物可基於某些措施減輕偏頭痛，但這些拮抗劑可能具有包括肝毒性在內的嚴重的副作用。
靶向CGRP分子的單株抗體對疼痛過程具有抑制效果，且可用作頓挫性藥物治療。針對CGRP的單株抗體可具有長半衰期，這意味著其與每日給藥的常規的偏頭痛藥物(除了肉毒桿菌毒素以外，肉毒桿菌毒素為每90天注射一次)相比可以較低的頻率給藥。用於偏頭痛的單株抗體可以每月一次的頻率進行皮下注射，且到目前為止已証實其在偏頭痛的天數方面有統計學上顯著的減少。多家不同的製藥公司正在開發這些新的抗體以供FDA批准。
雖然可以證明此種單株抗CGRP或抗CGRP受體抗體在偏頭痛的免疫治療是有效的，但是它們昂貴且必須每月給藥以維持對血清和體液CGRP水平的充分抑制以及由此產生的臨床效益。透過安全且耐受性良好的疫苗接種方法之靶向CGRP分子的具有成本效益的免疫治療對於偏頭痛治療而言仍是令人興奮的新干預手段和發展。
典型的胜肽/半抗原-載體蛋白免疫原製備方法存在許多缺點和不足。例如，製備方法涉及複雜的化學耦合步驟，它們使用昂貴的藥物級KLH或類毒素蛋白作為T輔助細胞載體，利用此蛋白免疫原所引發的大多數抗體都是針對載體蛋白而不是針對目標B細胞抗原決定位等。
鑑於使用單株抗體治療和典型的胜肽/半抗原-載體蛋白製劑在經濟和實踐上的缺點和侷限性，顯然仍有需求(此需求在於要開發能夠針對CGRP上之功能位點引發高特異性免疫反應的有效免疫治療組成物，此組成物須可易於患者使用，能夠按照嚴格的優良製造作業規範(GMP)生產，並且需具有成本效益以在全球應用治療偏頭痛患者)未被滿足。
針對位於以上背景技術部分中的陳述可以找到引用其他支持文獻的兩篇文獻回顧，在此以引用的方式將其整體併入本文。第一篇文獻包含有關CGRP和CGRP受體的最新評論(網站：en.wikipedia.org/wiki/Calcitonin_gene-related_peptide)，而第二篇文獻探討CGRP訊息傳遞的生物學特性、CGRP在偏頭痛中的作用的重要臨床證據(包括靶向CGRP治療的療效)、CGRP在三叉血管系統中的作用，以及對於三叉神經節在偏頭痛病理生理學中之重要作用的新見解(Edvinsson,et al.,2018)。
參考文獻
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本揭露是關於作為B細胞抗原決定位之降鈣素基因相關胜肽(CGRP)的部分。本揭露還關於含有來自CGRP之B細胞抗原決定位的胜肽免疫原結構、含有此胜肽免疫原結構的組成物、製備和使用此胜肽免疫原結構的方法，以及利用此胜肽免疫原結構製造的抗體。
本揭露的一範疇是關於在用於預防及/或治療偏頭痛之胜肽免疫原結構及其製劑中作為B細胞抗原決定位之來自不同生物體的CGRP的部分。揭露的CGRP胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：116-127和130-180)具有30個或更多個的總胺基酸，且含有功能性B細胞抗原決定位胜肽(功能性B細胞抗原決定位胜肽具有衍生自來自人類、狨猿(marmoset)或大鼠/小鼠的CGRP(即分別為SEQ ID NOs：1-3)約7至約30個的胺基酸(表1的SEQ ID NOs：4-13、15-19和20-24)。功能性B細胞抗原決定位胜肽可透過任選的異源性間隔子連接至衍生自病原體蛋白的異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位胜肽(例如SEQ ID NOs：74-115)，以形成揭露的胜肽免疫原結構。
揭露的CGRP胜肽免疫原結構可含有具有約7至約30個胺基酸的CGRP B細胞抗原決定位胜肽。B細胞抗原決定位胜肽可衍生自位於CGRP分子羧基端和中間區域的CGRP受體結合區域(例如，表1所示的SEQ ID NOs：5-9和15-22)。B細胞抗原決定位胜肽也可衍生自位於CGRP分子胺基端和中間區域之環狀的C2-C7環狀結構附近的CGRP受體活化位點(例如表1所示的SEQ ID NOs：4、10-13和23-24)。設計的CGRP B細胞抗原決定位胜肽可在CGRP胜肽的胺基端或羧基端與衍生自病原體蛋白的異源性Th抗原決定位(例如表2的SEQ ID NOs：74-115)連接。B細胞和Th抗原決定位共同作用，以刺激與各種物種的全長CGRP(SEQ ID NO：1-3)交叉反應的高特異性抗體的產生。
在某些實施例中，用於增強CGRP B細胞抗原決定位胜肽之異源性Th抗原決定位是衍生自天然病原體EBV BPLF1(SEQ ID NO：112)、EBV CP(SEQ ID NO：109)、破傷風梭菌(SEQ ID NOs：74、77、104、106-108)、霍亂毒素(SEQ ID NO：81)和曼氏血吸蟲(SEQ ID NO：80)，以及那些衍生自麻疹病毒融合蛋白(MVF 1至5)和B型肝炎表面抗原(HBsAg 1至3)的理想化人工Th抗原決定位，其以單一序列或組合序列(例如SEQ ID NOs：75、82-99)形式存在。
揭露的CGRP胜肽免疫原結構含有設計的B細胞和Th抗原決定位胜肽，二者共同作用以刺激針對CGRP功能性位點(包括位於CGRP分子羧基端的CGRP受體結合區域或涉及受體活化之環狀的C2-C7環狀結構)的高特異性抗體的產生，以對易患或患有偏頭痛的患者提供治療性免疫反應。
本揭露的另一範疇是關於含有CGRP胜肽免疫原結構的胜肽組成物。在一些實施例中，組成物包含一種胜肽免疫原結構。在其他實施 例中，胜肽組成物包含CGRP胜肽免疫原結構的混合物。在某些實施例中，CGRP胜肽免疫原結構的混合物具有衍生自不同病原體的異源性Th抗原決定位，其可用於允許覆蓋患者中廣泛的遺傳背景，導致免疫後更高百分比的反應率，用於預防及/或治療偏頭痛。
在本揭露胜肽組成物中可以觀察到於CGRP免疫原結構的協同性增強。衍生自這種含有CGRP胜肽免疫原結構之組成物給藥的抗體反應大多數(>90%)是集中在針對CGRP功能性位點或受體結合區域胜肽(SEQ ID NOs：4-13和15-24)之欲求交叉反應上，沒有很多，如果有的話，則是針對用於免疫原性增強的異源性Th抗原決定位。這與使用常規載體蛋白(例如用於此種胜肽抗原性增強的KLH、類毒素或其他生物載體)的標準方法形成鮮明對比。
本揭露還關於用於預防及/或治療偏頭痛的醫藥組成物和製劑。在一些實施例中，醫藥組成物包含穩定化的免疫刺激複合物，其透過將CpG寡聚合物與含有CGRP胜肽免疫原結構之混合物的胜肽組成物混合透過靜電結合而形成，以進一步增強CGRP胜肽免疫原性，此CGRP胜肽免疫原對全長CGRP(例如SEQ ID NOs：1-3)具有欲求交叉反應性。
在其他實施例中，醫藥組成物包含與礦物鹽(包括鋁膠(ALHYDROGEL)或磷酸鋁(ADJU-PHOS))接觸以形成懸浮液劑型或與作為佐劑之MONTANIDETM ISA 51或720接觸以形成油包水乳液之CGRP胜肽免疫原結構混合物的胜肽組成物，用於預防及/或治療偏頭痛。
此外，本揭露還提供用於CGRP胜肽免疫原結構及其製劑之低成本製造和品質控管的方法，此CGRP胜肽免疫原結構及其製劑可用於在動物中預防及/或治療偏頭痛。
本揭露還關於針對揭露之CGRP胜肽免疫原結構的抗體。特別地，本揭露的CGRP胜肽免疫原結構能夠刺激與全長CGRP分子交叉反應的高度特異性功能性抗體的產生。本揭露的抗體利用高特異性結合至CGRP，沒有很多，如果有的話，則是針對用於免疫原性增強的異源性Th抗原決定位，此與利用用於此種胜肽抗原性增強的常規蛋白或其他生物載體所製造的抗體形成鮮明對比。因此，相較於其他胜肽或蛋白質免疫原，揭露的CGRP胜肽免疫原結構能夠破壞針對自身CGRP的免疫耐受性，具有高反應率。
在一些實施例中，當將胜肽免疫原結構投予個體時，揭露的抗體針對並特異性地結合至位於CGRP分子羧基端部分的CGRP受體結合位點(例如SEQ ID NOs：5-9和15-22)。利用這些CGRP胜肽免疫原結構引發的高度特異性抗體可以抑制CGRP和CGRP受體的結合，以及下游活化事件(由CGRP之環狀的C2-C7環狀結構附近的區域所引起的細胞cAMP升高)，導致偏頭痛的有效預防及/或治療。
在其他實施例中，當將本發明胜肽免疫原結構(例如SEQ ID NOs：4、10-13和23-24)投予個體時，揭露的抗體是針對負責下游細胞活化事件之位於環狀的C2-C7環狀結構附近的CGRP胺基端或中間區域，或是針對CGRP受體結合位點的羧基端和中間區域。利用CGRP胜肽免疫原結構引發的高度特異性抗體可以抑制(1)CGRP和CGRP受體的結合，以及(2)由CGRP之環狀的C2-C7環狀結構附近的區域所引起的下游活化事件，導致對細胞cAMP升高的抑制，因此導致對偏頭痛患者的有效治療。
基於它們獨特的特徵和性質，由CGRP胜肽免疫原結構引發的揭露的抗體能夠提供預防性免疫治療方法來治療患有偏頭痛的患者。
在另一範疇，本發明提供針對CGRP的人類單株抗體，其由接受含有本揭露CGRP胜肽免疫原結構之組成物的患者所誘導產生。Traggiai,E.,et al,2004描述一種由來自人類患者血液中分離的B細胞製備人類單株抗體的有效方法，此文獻以引用方式併入本文。
本揭露還關於製備揭露的CGRP胜肽免疫原結構、組成物和抗體的方法。揭露的方法可提供用於CGRP胜肽免疫原結構與含有此結構之組成物的低成本製造和品質控管，此結構及組成物可用於用以治療患有偏頭痛之患者的方法中。
本揭露還包括使用揭露的CGRP胜肽免疫原結構及/或針對CGRP胜肽免疫原結構的抗體於易患或患有偏頭痛的個體中進行預防及/或治療的方法。用以於個體中預防及/或治療偏頭痛的方法包括對個體投予含有揭露的CGRP胜肽免疫原結構之組成物。在某些實施例中，方法中使用的組成物含有揭露的CGRP胜肽免疫原結構，CGRP胜肽免疫原結構透過靜電結合與帶有負電荷的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)形成穩定的免疫刺激複合物，其可進一步與佐劑添加，供患有偏頭痛的患者施用。
揭露的方法還包括用於投予CGRP胜肽免疫原結構的給藥方案、劑型和給藥途徑，以於個體中預防及/或治療偏頭痛。
第1圖顯示來自多種物種的CGRP序列比對，多種物種包括人類(SEQ ID NO：1)、小鼠(SEQ ID NO：3)、大鼠(SEQ ID NO：3)、狨猿(SEQ ID NO：2)和許多其他物種(包括馬、雞、豬、綿羊、牛、狗、負鼠、壁虎、青蛙、河豚、比目魚、金魚、鮭魚、青鱂、斑馬魚)。此圖式改編自Watkins,et al.,2013。
第2圖描述CGRP在偏頭痛的病理生理學中所起的核心作用。此圖式改編自Russell,et al.,2014。
第3圖描述CGRP傳遞的構成要素和與CGRP相關的偏頭痛治療的作用部位。(a)人類α型降鈣素基因相關胜肽(CGRP)的胺基酸結構；(b)CGRP受體複合物，其由兩個完整的膜蛋白(降鈣素受體樣受體(CALCRL)和受體活性修飾蛋白1(RAMP1))和兩個細胞質蛋白(受體偶聯蛋白(RCP)和G5蛋白(Gas)的a次單位)所組成。(c)在含有CGRP的三叉神經靜脈曲張(CGRP-containing trigeminal nerve varicosity)(含有CGRP的三叉神經靜脈曲張可支配的腦血管平滑肌細胞)中所說明之CGRP相關偏頭痛治療的靶點。5-HT，5-羥色胺受體。此圖式改編自Edvinsson,et al.,2018。
第4圖描述用於偏頭痛治療之高精密度CGRP專門設計胜肽免疫原結構及其製劑從發現到商業化的途徑。
第5圖描述在天竺鼠中之CGRP胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：116-118、124-127、128、129、131、133、135、137、119-122、139、123、130)(此些CGRP胜肽免疫原結構具有衍生自CGRP分子胺基端、中間、羧基端區域之CGRP B細胞抗原決定位胜肽)的免疫原性研究結果。
第6圖描述在來自代表性CGRP胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：116-118、124-127、128、129、131、133、135、137、119-123、130、139和150)之天竺鼠免疫血清(收集自6wpi採血)的純化抗體存在下在CGRP活化的細胞培養物中的中和活性，中和活性表示為細胞內cAMP產生的IC50。
第7圖顯示配製於ADJUPHOS和ISA51製劑中之代表性CGRP胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：123、131、141、151)於Balb/C小鼠中的免疫原性研究結果，來自於7wpi、10wpi和13wpi採血之天竺鼠免疫血清純 化而來相對應的抗體具有反應性且與全長人類CGRP分子具有交叉反應性。
第8圖顯示當與單獨佐劑或生理食鹽水之對照品相比較時在利用配製於如所示的ADJUPHOS或ISA乳液製劑中之CGRP胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：123、131、141)在0、3和6wpi進行免疫接種之Balb/C小鼠中所測量到對辣椒素誘導的皮膚血流的抑制作用。
本揭露是關於作為B細胞抗原決定位之降鈣素基因相關胜肽(CGRP)的部分。本揭露還關於含有來自CGRP之B細胞抗原決定位的胜肽免疫原結構、含有此胜肽免疫原結構的組成物、製備和使用此胜肽免疫原結構的方法，以及利用此胜肽免疫原結構製造的抗體。
本揭露的一範疇是關於在用於預防及/或治療偏頭痛之胜肽免疫原結構及其製劑中作為B細胞抗原決定位之來自不同生物體的CGRP的部分。揭露的CGRP胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：116-127和130-180)具有30個或更多個的總胺基酸，且含有功能性B細胞抗原決定位胜肽(功能性B細胞抗原決定位胜肽具有衍生自來自人類、狨猿或大鼠/小鼠的CGRP(即分別為SEQ ID NOs：1-3)約7至約30個的胺基酸(表1的SEQ ID NOs：4-13、15-19和20-24)。功能性B細胞抗原決定位胜肽可透過任選的異源性間隔子連接至衍生自病原體蛋白的異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位胜肽(例如SEQ ID NOs：74-115)，以形成揭露的胜肽免疫原結構。
揭露的CGRP胜肽免疫原結構可含有具有約7至約30個胺基酸的CGRP B細胞抗原決定位胜肽。B細胞抗原決定位胜肽可衍生自位於CGRP分子羧基端和中間區域的CGRP受體結合區域(例如，表1所示的SEQ ID NOs：5-9和15-22)。B細胞抗原決定位胜肽也可衍生自位於CGRP 分子胺基端和中間區域之環狀的C2-C7環狀結構附近的CGRP受體活化位點(例如表1所示的SEQ ID NOs：4、10-13、20-22)。設計的CGRP B細胞抗原決定位胜肽可在CGRP胜肽的胺基端或羧基端與衍生自病原體蛋白的異源性Th抗原決定位(例如表2的SEQ ID NOs：74-115)連接。B細胞和Th抗原決定位共同作用，以刺激與各種物種的全長CGRP(SEQ ID NO：1-3)交叉反應的高特異性抗體的產生。
在某些實施例中，用於增強CGRP B細胞抗原決定位胜肽之異源性Th抗原決定位是衍生自天然病原體EBV BPLF1(SEQ ID NO：112)、EBV CP(SEQ ID NO：109)、破傷風梭菌(SEQ ID NOs：74、77、104、106-108)、霍亂毒素(SEQ ID NO：81)和曼氏血吸蟲(SEQ ID NO：80)，以及那些衍生自麻疹病毒融合蛋白(MVF 1至5)和B型肝炎表面抗原(HBsAg 1至3)的理想化人工Th抗原決定位，其以單一序列或組合序列(例如SEQ ID NOs：75、82-99)形式存在。
揭露的CGRP胜肽免疫原結構含有設計的B細胞和Th抗原決定位胜肽，二者共同作用以刺激針對CGRP功能性位點(包括位於CGRP分子羧基端的CGRP受體結合區域或涉及受體活化之環狀的C2-C7環狀結構)的高特異性抗體的產生，以對易患或患有偏頭痛的患者提供治療性免疫反應。
本揭露的另一範疇是關於含有CGRP胜肽免疫原結構的胜肽組成物。在一些實施例中，組成物包含一種胜肽免疫原結構。在其他實施例中，胜肽組成物包含CGRP胜肽免疫原結構的混合物。在某些實施例中，CGRP胜肽免疫原結構的混合物具有衍生自不同病原體的異源性Th抗原決定位，其可用於允許覆蓋患者中廣泛的遺傳背景，導致免疫後更高百分比的反應率，用於預防及/或治療偏頭痛。
在本揭露胜肽組成物中可以觀察到於CGRP免疫原結構的協同性增強。衍生自這種含有CGRP胜肽免疫原結構之組成物給藥的抗體反應大多數(>90%)是集中在針對CGRP功能性位點或受體結合區域胜肽(SEQ ID NOs：4-13、15-19和20-24)之欲求交叉反應上，沒有很多，如果有的話，則是針對用於免疫原性增強的異源性Th抗原決定位。這與使用常規載體蛋白(例如用於此種胜肽抗原性增強的KLH、類毒素或其他生物載體)的標準方法形成鮮明對比。
本揭露還關於用於預防及/或治療偏頭痛的醫藥組成物和製劑。在一些實施例中，醫藥組成物包含穩定化的免疫刺激複合物，其透過將CpG寡聚合物與含有CGRP胜肽免疫原結構之混合物的胜肽組成物混合透過靜電結合而形成，以進一步增強CGRP胜肽免疫原性，此CGRP胜肽免疫原對全長CGRP(例如SEQ ID NOs：1-3)具有欲求交叉反應性。
在其他實施例中，醫藥組成物包含與礦物鹽(包括鋁膠(ALHYDROGEL)或磷酸鋁(ADJU-PHOS))接觸以形成懸浮液劑型或與作為佐劑之MONTANIDETM ISA 51或720接觸以形成油包水乳液之CGRP胜肽免疫原結構混合物的胜肽組成物，用於預防及/或治療偏頭痛。
此外，本揭露還提供用於CGRP胜肽免疫原結構及其製劑之低成本製造和品質控管的方法，此CGRP胜肽免疫原結構及其製劑可用於在動物中預防及/或治療偏頭痛。
本揭露還關於針對揭露之CGRP胜肽免疫原結構的抗體。特別地，本揭露的CGRP胜肽免疫原結構能夠刺激與全長CGRP分子交叉反應的高度特異性功能性抗體的產生。本揭露的抗體利用高特異性結合至CGRP，沒有很多，如果有的話，則是針對用於免疫原性增強的異源性Th抗原決定位，此與利用用於此種胜肽抗原性增強的常規蛋白或其他生 物載體所製造的抗體形成鮮明對比。因此，相較於其他胜肽或蛋白質免疫原，揭露的CGRP胜肽免疫原結構能夠破壞針對自身CGRP的免疫耐受性，具有高反應率。
在一些實施例中，當將胜肽免疫原結構投予個體時，揭露的抗體針對並特異性地結合至位於CGRP分子羧基端部分的CGRP受體結合位點(例如SEQ ID NOs：5-9和15-22)。利用這些CGRP胜肽免疫原結構引發的高度特異性抗體可以抑制CGRP和CGRP受體的結合，以及下游活化事件(由CGRP之環狀的C2-C7環狀結構附近的區域所引起的細胞cAMP升高)，導致偏頭痛的有效預防及/或治療。
在其他實施例中，當將本發明胜肽免疫原結構(例如SEQ ID NOs：4、10-13和23-24)投予個體時，揭露的抗體是針對負責下游細胞活化事件之位於環狀的C2-C7環狀結構附近的CGRP胺基端或中間區域，或是針對CGRP受體結合位點的羧基端和中間區域。利用CGRP胜肽免疫原結構引發的高度特異性抗體可以抑制(1)CGRP和CGRP受體的結合，以及(2)由CGRP之環狀的C2-C7環狀結構附近的區域所引起的下游活化事件，導致對細胞cAMP升高的抑制，因此導致對偏頭痛患者的有效治療。
基於它們獨特的特徵和性質，由CGRP胜肽免疫原結構引發的揭露的抗體能夠提供預防性免疫治療方法來治療患有偏頭痛的患者。
在另一範疇，本發明提供針對CGRP的人類單株抗體，其由接受含有本揭露CGRP胜肽免疫原結構之組成物的患者所誘導產生。Traggiai,E.,et al,2004描述一種由來自人類患者血液中分離的B細胞製備人類單株抗體的有效方法，此文獻以引用方式併入本文。
本揭露還關於製備揭露的CGRP胜肽免疫原結構、組成物和抗體的方法。揭露的方法可提供用於CGRP胜肽免疫原結構與含有此結構 之組成物的低成本製造和品質控管，此結構及組成物可用於用以治療患有偏頭痛之患者的方法中。
本揭露還包括使用揭露的CGRP胜肽免疫原結構及/或針對CGRP胜肽免疫原結構的抗體於易患或患有偏頭痛的個體中進行預防及/或治療的方法。用以於個體中預防及/或治療偏頭痛的方法包括對個體投予含有揭露的CGRP胜肽免疫原結構之組成物。在某些實施例中，方法中使用的組成物含有揭露的CGRP胜肽免疫原結構，CGRP胜肽免疫原結構透過靜電結合與帶有負電荷的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)形成穩定的免疫刺激複合物，其可進一步與佐劑添加，供患有偏頭痛的患者施用。
揭露的方法還包括用於投予CGRP胜肽免疫原結構的給藥方案、劑型和給藥途徑，以於個體中預防及/或治療偏頭痛。
通則
本文使用的章節標題僅用於組織的目的，不應被理解為限制所述主題。本申請中引用的所有參考文獻或參考文獻的部分出於任何目的透過引用明確地將整體併入本文。
除非特別說明，在此使用的所有技術和科學用語如本發明所屬技術領域中具有通常知識者的通常理解具有相同意義。除非上下文清楚地指出，否則單詞“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”包含複數形式。類似地，單詞“或(or)”是意指包括“和(and)”，除非上下文另有明確說明。因此，“包含A或B”是指包括A，或B，或A和B。更應被理解的是，用於給定多胜肽之所有的胺基酸大小和所有分子量或分子質量值是近似的，並且被提供作為描述之用。然而類似或等同於在此描述者的方法和材料可被用於以下所述之揭露的方法、合適的方法和材料的實踐或測試中。在此提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻透過引用整體 併入本文。在衝突的情況下，以本說明書(包括術語的解釋)為準。此外，本文揭露的材料、方法和實施例僅是說明性的而非意指加以限制。
CGRP胜肽免疫原結構
本揭露提供含有B細胞抗原決定位胜肽的胜肽免疫原結構，此B細胞抗原決定位胜肽具有來自CGRP(SEQ ID NOs：1-3)或其片段之胺基酸序列。CGRP胜肽免疫原結構可含有具有約7至約30個胺基酸的CGRP B細胞抗原決定位胜肽。B細胞抗原決定位胜肽可來自(1)位於CGRP分子羧基端/中間區域的CGRP受體結合區域(例如，表1所示的SEQ ID NOs：5-9和15-22)；或(2)來自位於CGRP分子胺基端/中間區域之環狀的C2-C7環狀結構附近的CGRP受體活化位點(例如表1所示的SEQ ID NOs：4、10-13和23-24)。B細胞抗原決定位直接地或是透過任選的異源性間隔子共價地連接至衍生自病原體蛋白質的異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位(例如表2的SEQ ID NOs：74-115)。這些結構(含有設計的B細胞和Th細胞抗原決定位共同作用)刺激與各種物種的全長CGRP(SEQ ID NO：1-3)交叉反應的高特異性抗體的產生。
本文使用術語“CGRP胜肽免疫原結構”或“胜肽免疫原結構”是指具有約30個以上胺基酸的胜肽，其含有(a)具有來自全長CGRP(SEQ ID NOs：1-3)之約7個以上連續胺基酸殘基的B細胞抗原決定位；(b)異源性Th抗原決定位；以及(c)任選的異源性間隔子。
在某些實施例中，CGRP胜肽免疫原結構可利用以下分子式作為代表：(Th)m-(A)n-(CGRP功能性B細胞抗原決定位胜肽)-X
或(CGRP功能性B細胞抗原決定位胜肽)-(A)n-(Th)m-X
或(Th)m-(A)n-(CGRP功能性B細胞抗原決定位胜肽)-(A)n-(Th)m-X
其中Th為異源性T輔助細胞抗原決定位；A為異源性間隔子；(CGRP功能性B細胞抗原決定位胜肽)為具有涉及受體結合或受體活化的來自CGRP的7至30個胺基酸殘基的B細胞抗原決定位胜肽；X為胺基酸的α-COOH或α-CONH2；m為1至約4；以及n為0至約10。
基於許多理論基礎設計和選擇本揭露的CGRP胜肽免疫原結構，包括：i. CGRP B細胞抗原決定位胜肽本身是非免疫原性的，以避免自體T細胞活化；ii.透過使用蛋白質載體或有效的T輔助細胞抗原決定位，可以使CGRP B細胞抗原決定位胜肽具有免疫原性；iii.當CGRP B細胞抗原決定位胜肽成為免疫原性的並投予宿主時，胜肽免疫原結構：a.引發優先針對CGRP B細胞抗原決定位(而非蛋白質載體或T輔助細胞抗原決定位)的高效價抗體；b.在接受免疫的宿主中破壞免疫耐受性並產生與CGRP(SEQ ID NOs：1-3)交叉反應的高度特異性抗體；c.產生可以抑制CGRP和CGRP受體結合以及相關下游事件(例如細胞內cAMP產量增加)的高度特異性抗體；以及 d.產生能夠在體內造成辣椒素誘導的皮膚血流減少的高度特異性抗體。
揭露的CGRP胜肽免疫原結構及其製劑可有效地發揮醫藥組成物的作用，以預防及/或治療易患或患有偏頭痛的個體。
揭露的CGRP胜肽免疫原結構的各種組分在下文進一步詳細描述。
a.來自CGRP的B細胞抗原決定位胜肽
本揭露關於用於產生高效價抗體的新穎胜肽組成物，所述高效價抗體對多種物種之降鈣素基因相關胜肽(CGRP)蛋白(例如SEQ ID NOs：1-3)具有特異性。胜肽免疫原結構的位點特異性使針對位於CGRP上其他區域的不相關位點或位於載體蛋白上的不相關位點的抗體產生最小化，從而提供高安全係數。
本文使用術語“CGRP”是指屬於降鈣素(CT)胜肽家族之37個胺基酸的神經胜肽α-CGRP。人類CGRP衍生自UniProtKB：P06881-1且具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列。狨猿(Callithrix jacchus)CGRP衍生自GenBank Accession No.：AAL35592.1且具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列。大鼠(Rattus norvegicus)CGRP衍生自UniProtKB：P01256，而小鼠(Mus musculus)CGRP衍生自UniProtKB：Q99JA0，且大鼠和小鼠CGRP都具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列。在本揭露中所使用CGRP的胺基酸序列如表1所示。
在人類中，CGRP衍生自編碼降鈣素的基因，是由位於11號染色體上的降鈣素/CGRP基因的選擇性剪接所形成。在人類中，CGRP具有兩種同型異構物：α-CGRP和β-CGRP。α-同型異構物與β-同型異構物的差別在於位於第3、22和25個位置的胺基酸。在平滑肌細胞內的分子層次 上，CGRP可透過其羧基端區域與其受體結合，然後透過使用其環狀結構區域活化受體。具有雙硫鍵之環狀的C2-C7環狀結構在受體活化中具有核心作用，並且與細胞內cAMP的升高密切相關。在哺乳類動物的血漿中，CGRP的半衰期約為10分鐘。在人類三叉神經節中，CGRP反應性神經元占所有神經元的50%(Tajti,et al.,1999)。
CGRP在中樞和周圍神經系統中廣泛表現。它主要與緊鄰血管的小的無髓鞘感覺神經元有關。CGRP是有效的血管擴張劑，且局部投予CGRP會導致血液流量短暫增加。CGRP還與疼痛傳播、疼痛調節和神經性炎症有關。利用辣椒素透過瞬態受體電位陽離子通道V1的活化可使CGRP從感覺神經元釋放。雷射都卜勒成像儀(LDI)已用於檢測由CGRP所引起之皮膚血流的結果變化。
如同在多種疼痛模型中於CGRP敲除小鼠的減弱反應所證明CGRP也與炎症性疼痛相關。這種在疼痛感知中的作用與在感覺神經元中CGRP的表現是一致的。
本揭露的一範疇是利用靶向CGRP之主動免疫療法以發揮長期CGRP阻斷作用和臨床功效，用以預防及/或治療CGRP-偏頭痛。因此，本揭露關於靶向全長CGRP蛋白(SEQ ID NO：1-3)之部分的胜肽免疫原結構及其製劑，以用於預防和治療偏頭痛。
CGRP胜肽免疫原結構的B細胞抗原決定位部分可包含來自全長CGRP蛋白(以SEQ ID NOs：1-3代表)的任何部分的約7至約30個胺基酸。在某些實施例中，基於設計理論基礎篩選和選擇的B細胞抗原決定位胜肽包含如表1所示的SEQ ID NOs：4-13和15-24的胺基酸序列。
在一些實施例中，B細胞抗原決定位胜肽來自位於CGRP分子羧基端/中間區域R11-F37(SEQ ID NO：9)的CGRP受體結合區域，或其片段 (例如SEQ ID NOs：5-8和15-22)。在其他實施例中，B細胞抗原決定位胜肽來自位於環狀的C2-C7環狀結構附近的CGRP受體活化區域(例如A1-N25(SEQ ID NO：13))或其片段(例如SEQ ID NOs：4、10-12和23-24)。
本揭露的CGRP B細胞抗原決定位胜肽還包括CGRP的免疫功能類似物或同源物。CGRP B細胞抗原決定位胜肽的免疫功能類似物或同源物包括保留與原始胜肽免疫原性實質相同的的變異物。免疫功能類似物可具有於胺基酸位置的保留性取代、總電荷改變、與其他官能基共價連接或胺基酸的添加、插入或刪除及/或其任意組合(例如SEQ ID NOs：9 vs 25的CGRP胜肽)。
由包含來自CGRP的這些B細胞抗原決定位的胜肽免疫原結構產生的抗體是高度特異性的，並且與各種物種的全長CGRP(例如，SEQ ID NOs：1-3)有交叉反應。基於它們獨特的特徵和性質，由CGRP胜肽免疫原結構引發的揭露的抗體能夠提供預防性免疫治療方法以預防及/或治療偏頭痛。
b.異源性T輔助細胞抗原決定位(Th抗原決定位)
本揭露提供胜肽免疫原結構，其包含來自CGRP的B細胞抗原決定位，B細胞抗原決定位直接地或是透過任選的異源性間隔子共價連接至異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位。
於CGRP胜肽免疫原結構中的異源性Th抗原決定位可增強CGRP片段的免疫原性，其促進針對基於設計理論篩選和選擇的優化目標CGRP B細胞抗原決定位胜肽之特異性高效價抗體的產生。
本文使用術語“異源性”是指衍生自並非CGRP野生型序列之部分或與其同源之胺基酸序列的胺基酸序列。因此，異源性Th抗原決定位為衍生自非天然存在於CGRP之胺基酸序列的Th抗原決定位(即Th抗 原決定位對CGRP而言不是自體衍生的)。因為Th抗原決定位對CGRP而言是異源性的，當異源性Th抗原決定位共價連接至CGRP B細胞抗原決定位胜肽時，CGRP的天然胺基酸序列不會向胺基端或羧基端方向延伸。
本揭露的異源性Th抗原決定位可為不具有天然存在於CGRP之胺基酸序列的任何Th抗原決定位。Th抗原決定位還可具有針對多種物種第2類MHC分子的混雜結合基序。在某些實施例中，Th抗原決定位包含多個混雜的第2類MHC結合基序，以允許T輔助細胞的最大活化，從而導致免疫反應的啟動和調節。較佳的Th抗原決定位本身為非免疫原性的(即如果有的話，很少利用CGRP胜肽免疫原結構所產生抗體是針對Th抗原決定位)，因此允許針對CGRP分子之目標B細胞抗原決定位胜肽的非常集中的免疫反應。
本揭露的Th抗原決定位包括，但不限於，衍生自外來病原菌之胺基酸序列，如表2(SEQ ID NOs：74-115)所例示。此外，Th抗原決定位包括理想化人工Th抗原決定位和組合的理想化人工Th抗原決定位(例如SEQ ID NOs：75和82-99)。異源性Th抗原決定位胜肽以組合序列(例如SEQ ID NOs：85、91、94和97)呈現，包含基於特定胜肽之同源物的可變殘基在胜肽骨架內於特定位置處作為代表的胺基酸殘基的混合物。可以利用在合成過程期間在特定位置添加選定受保護之胺基酸的混合物，而非一個特定的胺基酸，於單一過程中合成組合胜肽的集合。此種組合異源性Th抗原決定位胜肽集合可允許對具有不同遺傳背景之動物廣泛的Th抗原決定位覆蓋。異源性Th抗原決定位胜肽之代表性組合序列包含如表2所示的SEQ ID NOs：85、91、94和97。本發明的Th抗原決定位胜肽對來自基因多樣性群體的動物和患者提供廣泛的反應性和免疫原性。
c.異源性間隔子
揭露的CGRP胜肽免疫原結構任選地包含異源性間隔子，其將CGRP B細胞抗原決定位胜肽共價連接至異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位。
如上所述，術語“異源性”是指衍生自並非CGRP天然型序列之部分或與其同源之胺基酸序列的胺基酸序列。因此，當異源性間隔子共價連接至CGRP B細胞抗原決定位胜肽時，CGRP的天然胺基酸序列不會向胺基端或羧基端方向延伸，因為間隔子對CGRP序列而言是異源性的。
間隔子為能夠將兩個胺基酸及/或胜肽連接在一起的任何分子或化學結構。依據應用的不同，間隔子的長度或極性可能會有所不同。間隔子連接可透過醯胺或羧基連結，但是其他官能基也是可能的。間隔子可包括化學化合物、天然存在的胺基酸或非天然存在的胺基酸。
間隔子可為CGRP胜肽免疫原結構提供結構特徵。結構上，間隔子提供Th抗原決定位與CGRP片段的B細胞抗原決定位的物理分離。透過間隔子的物理分離可破壞透過將Th抗原決定位連接至B細胞抗原決定位所產生的任何人工二級結構。另外，透過間隔子之抗原決定位的物理分離可消除Th細胞及/或B細胞反應之間的干擾。此外，可設計間隔子以產生或修飾胜肽免疫原結構的二級結構。例如，可設計間隔子以作為柔性鉸鏈，用以增強Th抗原決定位和B細胞抗原決定位的分離。柔性鉸鏈間隔子也可允許所呈現之胜肽免疫原與適當的Th細胞和B細胞之間更有效率的交互作用，以增強對Th抗原決定位和B細胞抗原決定位的免疫反應。編碼柔性鉸鏈之序列的例示見於通常富含脯胺酸的免疫球蛋白重鏈鉸鏈區。利用序列Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO：71)提供了一種 作為間隔子使用之特別有用的柔性鉸鏈，其中Xaa是任意胺基酸，以天門冬胺酸為較佳。
間隔子也可為CGRP胜肽免疫原結構提供功能特徵。例如，可設計間隔子以改變CGRP胜肽免疫原結構的總電荷，其可影響胜肽免疫原結構的溶解度。此外，改變CGRP胜肽免疫原結構的總電荷可影響胜肽免疫原結構與其他化合物和試劑結合的能力。如下文進一步詳細討論的，CGRP胜肽免疫原結構可透過靜電結合與高度帶電的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)形成穩定的免疫刺激複合物。CGRP胜肽免疫原結構的總電荷對於形成這些穩定的免疫刺激複合物是重要的。
可作為間隔子的化學化合物包括，但不限於，(2-胺乙氧基)乙酸(AEA)、5-胺基戊酸(AVA)、6-胺基己酸(Ahx)、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(AEEA,mini-PEG1)、12-胺基-4,7,10-三氧雜十二酸(mini-PEG2)、15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷酸(mini-PEG3)、trioxatridecan-succinamic acid(Ttds)、12-胺基十二烷酸、Fmoc-5-胺基-3-氧戊酸(O1Pen)等。
天然存在的胺基酸包括丙胺酸、精胺酸、天門冬醯胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸和纈胺酸。
非天然存在的胺基酸包括，但不限於，ε-N離胺酸、β-丙胺酸、鳥胺酸、正白胺酸、正纈胺酸、羥脯胺酸、甲狀腺素、γ-胺基丁酸、高絲胺酸、瓜胺酸、胺基苯甲酸、6-胺基己酸(Aca；6-胺基己酸)、3-硫醇丙酸(MPA)、3-硝基酪胺酸、焦麩胺酸等。
CGRP胜肽免疫原結構中的間隔子可共價連接在Th抗原決定位和CGRP B細胞抗原決定位胜肽的胺基端或羧基端。在一些實施例中，間 隔子共價連接至Th抗原決定位的羧基端和CGRP B細胞抗原決定位胜肽的胺基端。在其他實施例中，間隔子共價連接至CGRP B細胞抗原決定位胜肽的羧基端和Th抗原決定位的胺基端。在某些實施例中，可使用一個以上的間隔子，例如，當在CGRP胜肽免疫原結構中存在一個以上的Th抗原決定位時。當使用一個以上的間隔子時，每個間隔子可以彼此相同或不同。此外，當CGRP胜肽免疫原結構中存在一個以上的Th抗原決定位時，可利用間隔子分隔開Th抗原決定位，間隔子可為相同或不同，利用間隔子將Th抗原決定位與CGRP B細胞抗原決定位胜肽分開。間隔子相對於Th抗原決定位或CGRP B細胞抗原決定位胜肽的排列沒有限制。
在某些實施例中，異源性間隔子是天然存在的胺基酸或非天然存在的胺基酸。在其他實施例中，間隔子包含一個以上的天然存在或非天然存在的胺基酸。在具體實施例中，間隔子為Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：72)或Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO：73)。
d. CGRP胜肽免疫原結構的具體實施例
在某些實施例中，CGRP胜肽免疫原結構可利用以下分子式表示：(Th)m-(A)n-(CGRP功能性B細胞抗原決定位胜肽)-X
或(CGRP功能性B細胞抗原決定位胜肽)-(A)n-(Th)m-X
或(Th)m-(A)n-(CGRP功能性B細胞抗原決定位胜肽)-(A)n-(Th)m-X
其中Th為異源性T輔助細胞抗原決定位； A為異源性間隔子；(CGRP功能性B細胞抗原決定位胜肽)為具有涉及受體結合或受體活化的來自CGRP的7至30個胺基酸殘基的B細胞抗原決定位胜肽；X為胺基酸的α-COOH或α-CONH2；m為1至約4；以及n為0至約10。
B細胞抗原決定位胜肽可包含來自全長CGRP蛋白(以SEQ ID NOs：1-3代表)的任何部分的約7至約30個胺基酸。在某些實施例中，B細胞抗原決定位具有選自如表1所示SEQ ID NOs：4-13和15-22中任一的胺基酸序列。在某些實施例中，B細胞抗原決定位胜肽來自位於CGRP分子羧基端/中間區域R11-F37(SEQ ID NO：9)的CGRP受體結合區域，或其片段(例如SEQ ID NOs：5-8和15-22)。在其他實施例中，B細胞抗原決定位胜肽來自位於環狀的C2-C7環狀結構附近的CGRP受體活化區域(例如A1-N25(SEQ ID NO：13))或其片段(例如SEQ ID NOs：4、10-12和23-24)。
CGRP胜肽免疫原結構中的異源性Th抗原決定位具有選自SEQ ID NOs：74-115及其組合中任一的胺基酸序列，如表2所示。在一些實施例中，CGRP胜肽免疫原結構含有一個以上的Th抗原決定位。
任選的異源性間隔子是選自Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys、Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO：71)、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：72)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO：73)及其任意組合中的任一個，其中Xaa是任何胺基酸，但以天門冬胺酸為較佳。在具體實施例中，異源性間隔子為ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：72)或Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO：73)。
在某些實施例中，CGRP胜肽免疫原結構具有選自如表3所示SEQ ID NOs：116-127和130-180中任一個的胺基酸序列。
包含Th抗原決定位之CGRP胜肽免疫原結構是於與CGRP片段串聯的單一固相胜肽合成中同時產生。Th抗原決定位也可包括Th抗原決定位的免疫類似物。免疫Th類似物包括免疫增強類似物、交叉反應類似物和任何這些Th抗原決定位的片段，其足以增強或刺激對CGRP B細胞抗原決定位胜肽的免疫反應。
在CGRP胜肽免疫原結構中的Th抗原決定位可共價連接於CGRP B細胞抗原決定位胜肽的胺基端或羧基端。在一些實施例中，Th抗原決定位是共價連接至CGRP B細胞抗原決定位胜肽的胺基端。在其他實施例中，Th抗原決定位是共價連接至CGRP B細胞抗原決定位胜肽的羧基端。在某些實施例中，一個以上的Th抗原決定位共價連接至CGRP B細胞抗原決定位胜肽。當一個以上的Th抗原決定位連接至CGRP B細胞抗原決定位胜肽時，每一個Th抗原決定位可具有相同胺基酸序列或不同胺基酸序列。另外，當一個以上的Th抗原決定位連接至CGRP B細胞抗原決定位胜肽時，Th抗原決定位可以任何順序排列。例如，Th抗原決定位可連續地連接至CGRP B細胞抗原決定位胜肽的胺基端，或連續地連接至CGRP B細胞抗原決定位胜肽的羧基端，或當不同的Th抗原決定位共價連接至CGRP B細胞抗原決定位胜肽的羧基端時，Th抗原決定位可共價連接至CGRP B細胞抗原決定位胜肽的胺基端。Th抗原決定位相對於CGRP B細胞抗原決定位胜肽的排列並無限制。
在一些實施例中，Th抗原決定位直接地共價連接至CGRP B細胞抗原決定位胜肽。在其他實施例中，Th抗原決定位透過異源性間隔子共價連接至CGRP片段。
e.變異物、同源物和功能類似物
也可使用上述免疫原胜肽結構的變異物和類似物，其可誘導抗體及/或與抗體交叉反應，而此抗體是針對較佳的CGRP B細胞抗原決定位胜肽。類似物(包括等位基因、物種以及誘導變異物)，通常於一個、兩個或幾個位置上有別於天然存在的胜肽，通常是由於保留性取代。類似物通常展現與天然胜肽至少80或90%的序列一致性。一些類似物還包括非天然胺基酸或在一個、兩個或幾個位置上之胺基端或羧基端胺基酸的修飾。
作為功能類似物的變異物可具有於胺基酸位置上的保留性取代、總電荷改變、與其他官能基共價連接或胺基酸的添加、插入或刪除及/或其任意組合。
保留性取代是指一個胺基酸殘基被另一個具有相似化學性質的胺基酸殘基所取代。例如，非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和甲硫胺酸；極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸和麩醯胺酸；帶正電的(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸和組胺酸；而帶負電的(酸性)胺基酸包括天門冬胺酸和麩胺酸。
在一個特定實施例中，功能類似物與原始胺基酸序列具有至少50%的一致性。在另一實施例中，功能類似物與原始胺基酸序列具有至少80%的一致性。在又一實施例中，功能類似物與原始胺基酸序列具有至少85%的一致性。在又一實施例中，功能類似物與原始胺基酸序列具有至少90%的一致性。
Th抗原決定位胜肽的功能免疫類似物也是有效的，且被包括作為本發明的一部分。功能免疫Th類似物可包含於Th抗原決定位中從1至 約5個胺基酸殘基的保留性取代、添加、刪除和插入，其實質上未改變Th抗原決定位的Th刺激功能。如上文針對CGRP B細胞抗原決定位胜肽所描述的，可以利用天然或非天然胺基酸完成保留性取代、添加和插入。表2辨識了Th抗原決定位胜肽之功能類似物的另一種變異物。具體而言，MvF1和MvF2 Th的SEQ ID NOs：75和82是MvF4和MvF5 Th的SEQ ID NOs：94和98的功能類似物，因為利用在胺基端和羧基端將各兩個胺基酸刪除(SEQ ID NOs：75和82)或插入(SEQ ID NOs：94和98)而使其胺基酸骨架有所區別。在類似序列的這兩個系列之間的差異並不會影響包含於此些序列中之Th抗原決定位的功能。因此，功能免疫Th類似物包括衍生自麻疹病毒融合蛋白MvF1-4 Ths(SEQ ID NOs：75、82、85和94)和衍生自肝炎表面蛋白質HBsAg 1-3 Ths(SEQ ID NOs：91、97和99)之Th抗原決定位的多種版本。
組成物
本揭露還提供包含揭露的CGRP免疫原胜肽結構的組成物。
a.胜肽組成物
包含揭露的CGRP胜肽免疫原結構的組成物可為液體或固體/凍乾形式。液體組成物可包括不改變CGRP胜肽免疫原結構之結構或功能特性的水、緩衝液、溶劑、鹽及/或任何其他可接受的試劑。胜肽組成物可含有一種或多種揭露的CGRP胜肽免疫原結構。
b.醫藥組成物
本揭露還關於包含揭露的CGRP胜肽免疫原結構的醫藥組成物。
醫藥組成物可含有藥學上可接受的遞送系統中的載體及/或其他添加劑。因此，醫藥組成物可含有CGRP胜肽免疫原結構的藥學上有效 劑量以及藥學上可接受的載體、佐劑及/或其它賦形劑(例如稀釋劑、添加劑、穩定劑、防腐劑、助溶劑、緩衝劑等)。
醫藥組成物可含有一種或多種佐劑，其作用是加速、延長或增強針對CGRP胜肽免疫原結構的免疫反應，而本身不具有任何特異性抗原作用。醫藥組成物中使用的佐劑可包括油、油乳液、鋁鹽、鈣鹽、免疫刺激複合物、細菌和病毒衍生物、仿病毒顆粒(virosomes)、碳水化合物、細胞因子、聚合物微粒。在某些實施例中，佐劑可選自明礬(磷酸鋁鉀)、磷酸鋁(例如ADJU-PHOS®)、氫氧化鋁(例如ALHYDROGEL®)、磷酸鈣、弗氏不完全佐劑(IFA)、弗氏完全佐劑、MF59、佐劑65、Lipovant、ISCOM、liposyn、皂苷、角鯊烯、L121、EmulsIL-6n®、單磷酸脂質A(MPL)、Quil A、QS21、MONTANIDE® ISA 35、ISA 50V、ISA 50V2、ISA 51、ISA 206、ISA 720、脂質體、磷脂質、肽聚糖、脂多醣(LPS)、ASO1、ASO2、ASO3、ASO4、AF03、親脂性磷脂質(脂質A)、γ菊糖、藻類菊粉(algammulin)、葡聚糖、右旋糖酐、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、果聚醣、木聚糖、雙十八烷基二甲基溴化銨(DDA)，以及其他佐劑和乳化劑。
在一些實施例中，醫藥組成物含有MONTANIDETM ISA 51(由植物油和二縮甘露醇油酸酯所組成的油質佐劑組成物，用以製造油包水乳液)、Tween® 80(也稱為聚山梨醇酯80或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯)、CpG寡核苷酸及/或其任意組合。在其他實施例中，醫藥組成物是以EmulsIL-6n或EmulsIL-6n D作為佐劑的水包油包水(即w/o/w)乳液。
醫藥組成物還可包括藥學上可接受的添加劑或賦形劑。例如，醫藥組成物可含有抗氧化劑、黏結劑、緩衝劑、增積劑、載劑、螫合劑、 著色劑、稀釋劑、崩散劑、乳化劑、填充劑、膠化劑、pH緩衝劑、防腐劑、助溶劑、穩定劑等。
醫藥組成物可配製成立即釋放或緩續釋放劑型。另外，可配製醫藥組成物用於透過免疫原包封和與微粒共同投予以誘導系統性或局部性黏膜免疫。所屬技術領域中具有通常知識者很容易判定此種遞送系統。
醫藥組成物可以以液體溶液或懸浮液型式配製成注射劑。含有CGRP胜肽免疫原結構的液體載體也可在注射前製備。醫藥組成物可利用任何適合的用法投予，例如i.d.、i.v.、i.p.、i.m.、鼻內、口服、皮下等，並且可在任何適合的遞送裝置中施用。在某些實施例中，可配製醫藥組成物供靜脈內、皮下、皮內或肌內投予。也可製備適用於其它給藥方式的醫藥組成物，包括口服和鼻內應用。
醫藥組成物也可以適合的劑量單位形式配製。在一些實施例中，醫藥組成物含有每公斤體重約0.1μg至約1mg的CGRP胜肽免疫原結構。醫藥組成物的有效劑量取決於許多不同的因素，包括投予方式、靶點、患者的生理狀態、患者是人類或動物、投予的其它藥物，以及處理是供預防還是治療。通常，患者是人類，但也可治療包括基因轉殖哺乳類動物的非人類哺乳類動物。當以多劑量遞送時，醫藥組成物可以方便地分成每個劑量單位形式的適當量。如治療領域眾所周知的，投予的劑量取決於個體的年齡、體重和一般健康狀況。
在一些實施例中，醫藥組成物含有一種以上的CGRP胜肽免疫原結構。含有一種以上CGRP胜肽免疫原結構之混合物的醫藥組成物允許協同性增強結構的免疫功效。含有一種以上CGRP胜肽免疫原結構的醫藥組成物可在更大的遺傳群體中更為有效，這是由於廣泛的第2類MHC覆蓋，因此提供針對CGRP胜肽免疫原結構之經改善的免疫反應。
在一些實施例中，醫藥組成物含有選自SEQ ID NOs：120-127和130-180(表3)的CGRP胜肽免疫原結構，以及同源物、類似物及/或其組合。
在某些實施例中，將具有組合形式之衍生自MVF和HBsAg的異源性Th抗原決定位(SEQ ID NOs：85、91、94和97)的CGRP胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：161-163)以等莫耳比率混合，用於製劑中，以允許對具有不同遺傳背景之宿主群體最大覆蓋。
此外，藉由CGRP胜肽免疫原結構(例如具有SEQ ID NO：108的UBITh®1)所引發的抗體反應大部分(>90%)是集中在針對CGRP之B細胞抗原決定位胜肽的所欲求的交叉反應性，沒有太多，如果有的話，則是針對用於免疫原性增強的異源性Th抗原決定位(實施例6，表10)。此與利用用於此種CGRP胜肽抗原性增強的常規蛋白(例如KLH)或其他生物蛋白載體所製造的抗體形成鮮明對比。
在其他實施例中，包含胜肽組成物的醫藥組成物，例如CGRP胜肽免疫原結構混合物與作為佐劑之礦物鹽(包括明礬凝膠(ALHYDROGEL)或磷酸鋁(ADJUPHOS))接觸形成懸浮液劑型，用以投予宿主。
含有CGRP胜肽免疫原結構的醫藥組成物可用以於投予後在宿主中引發免疫反應並產生抗體。
c.免疫刺激複合物
本揭露也關於含有與CpG寡核苷酸形成免疫刺激複合物的CGRP胜肽免疫原結構的醫藥組成物。此種免疫刺激複合物特別適合作為佐劑和胜肽免疫原穩定劑。免疫刺激複合物呈微粒形式，其可有效地將CGRP胜肽免疫原呈現給免疫系統的細胞以產生免疫反應。免疫刺激複合物可 配製成用於腸胃外投予的懸浮液。免疫刺激複合物還可配製成油包水(w/o)乳液形式，作為與礦物鹽或原位凝膠聚合物結合的懸浮液，用於在腸胃外投予後將CGRP胜肽免疫原結構有效遞送至宿主免疫系統的細胞。
穩定化的免疫刺激複合物可藉由透過靜電結合將CGRP胜肽免疫原結構與陰離子型分子、寡核苷酸、多核苷酸或其組合複合而形成。穩定化的免疫刺激複合物可作為免疫原遞送系統併入醫藥組成物中。
在某些實施例中，將CGRP胜肽免疫原結構設計成包含陽離子部份，其於範圍為5.0至8.0的pH下帶有正電荷。CGRP胜肽免疫原結構或結構的混合物的陽離子部份的淨電荷計算是依據，每個離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)帶有+1電荷，每個天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)帶有-1電荷，以及序列中其他胺基酸所帶的電荷為0。將在CGRP胜肽免疫原結構之陽離子部份中的電荷相加，並表示為淨平均電荷。適合的胜肽免疫原具有淨平均正電荷為+1的陽離子部份。較佳地，胜肽免疫原具有範圍大於+2之淨正電荷。在一些實施例中，CGRP胜肽免疫原結構的陽離子部份為異源性間隔子。在某些實施例中，當間隔子序列為(α,ε-N)Lys、(α,ε-N)-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：72)或Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO：73)時，CGRP胜肽免疫原結構的陽離子部份具有+4的電荷。
如本文所述的“陰離子型分子”是指在範圍為5.0至8.0的pH下帶有負電荷的任何分子。在某些實施例中，陰離子型分子是寡聚合物或聚合物。寡聚合物或聚合物上的淨負電荷計算是依據，在寡聚合物中的每個磷酸二酯或硫代磷酸酯基團帶有-1電荷。適合的陰離子型寡核苷酸是具有8至64個核苷酸鹼基的單鏈DNA分子，CpG基序的重複數在1至10 的範圍內。較佳地，CpG免疫刺激性單鏈DNA分子含有18至48個核苷酸鹼基，CpG基序的重複數在3至8的範圍內。
更佳地，陰離子型寡核苷酸可以分子式5' X1CGX2 3'表示，其中C和G是未甲基化的；且X1是選自由A(腺嘌呤)、G(鳥嘌呤)和T(胸腺嘧啶)組成的群組；且X2是C(胞嘧啶)或T(胸腺嘧啶)。或者，陰離子型寡核苷酸可以分子式5'(X3)2CG(X4)2 3'表示，其中C和G是未甲基化的；且X3是選自由A、T或G組成的群組；且X4是C或T。在具體實施例中，CpG寡核苷酸具有以下序列：CpG1：5' TCg TCg TTT TgT CgT TTT gTC gTT TTg TCg TT 3'(完全硫代磷酸化)(SEQ ID NO：182)、CpG2：5'磷酸TCg TCg TTT TgT CgT TTT gTC gTT 3'(完全硫代磷酸化)(SEQ ID NO：183)或CpG3：5' TCg TCg TTT TgT CgT TTT gTC gTT 3'(完全硫代磷酸化)(SEQ ID NO：184)。
所得到的免疫刺激複合物呈顆粒形式，其大小通常在1-50微米的範圍內，且是許多因素(包括交互作用成份的相對電荷化學計量和分子量)的函數。微粒免疫刺激複合物具有提供佐劑化和體內特異性免疫反應之向上調節的優點。此外，穩定化的免疫刺激複合物適用於透過各種方法(包括油包水乳液、礦物鹽懸浮液和聚合凝膠)製備醫藥組成物。
本揭露也關於用於預防及/或治療偏頭痛的醫藥組成物，包含製劑。在一些實施例中，醫藥組成物包含穩定化的免疫刺激複合物，其是藉由混合CpG寡聚合物和包含CGRP胜肽免疫原結構(例如SEQ ID NOs：120-127和130-180)之混合物的胜肽組成物以透過靜電結合所形成，以進一步增強CGRP胜肽免疫原結構的免疫原性，並引發與SEQ ID NOs：1-3之CGRP蛋白交叉反應的抗體，此抗體針對CGRP受體結合或受體活化區域(實施例6)。
在又一實施例中，醫藥組成物含有CGRP胜肽免疫原結構之混合物(例如SEQ ID NOs：120-127和130-180的任意組合)，其與CpG寡聚合物形成穩定化的免疫刺激複合物，較佳地，將免疫刺激複合物與具有高安全係數之作為佐劑的礦物鹽(包括明礬凝膠(ALHYDROGEL)或磷酸鋁(ADJUPHOS))混合，以形成用以投予宿主的懸浮液劑型。
抗體
本揭露還提供利用CGRP胜肽免疫原結構所引發的抗體。
本揭露提供CGRP胜肽免疫原結構及其製劑，其於製造中具有成本效益，其最佳設計可引發靶向CGRP分子上之CGRP受體結合或受體活化區域(SEQ ID NOs：4-13和15-24)的高效價抗體，其於接受免疫的宿主中能夠破壞針對自身蛋白CGRP的免疫耐受性具有高反應率。利用CGRP胜肽免疫原結構產生的抗體對CGRP受體結合或活化區域具有高親和力。
在一些實施例中，用於引發抗體的CGRP胜肽免疫原結構包含CGRP胜肽的雜合，此CGRP胜肽靶向CGRP分子上之CGRP受體結合或受體活化區域(SEQ ID NOs：4-13和15-24)，CGRP胜肽透過任選的間隔子連接至衍生自病原體蛋白質的異源性Th抗原決定位(例如衍生自麻疹病毒融合(MVF)蛋白和其他蛋白質(SEQ ID NOs：74-115))。CGRP胜肽免疫原結構之B細胞抗原決定位和Th抗原決定位胜肽共同作用以刺激與CGRP蛋白(SEQ ID NO：1-3)上之CGRP受體結合或活化區域交叉反應的高度特異性抗體的產生。
用以使胜肽免疫原性增強的傳統方法，例如透過化學偶聯載體蛋白(例如鑰孔血藍蛋白(KLH)或其他載體蛋白(例如白喉類毒素(DT)和破傷風類毒素(TT)蛋白))，通常導致產生大量針對載體蛋白的抗體。因 此，此種胜肽-載體蛋白組成物的主要缺陷在於利用此種免疫原所產生的大部分(>90%)抗體是可導致抗原決定位抑制之針對載體蛋白KLH、DT或TT的非功能性抗體。
有別於用以使胜肽免疫原性增強的傳統方法，利用揭露的CGRP胜肽免疫原結構(例如SEQ ID NOs：116-127和130-180)所產生的抗體可以高特異性結合至CGRP B細胞抗原決定位胜肽(SEQ ID NO：4-13和15-24)，沒有太多，如果有的話，抗體則是針對異源性Th抗原決定位(例如SEQ ID NOs：74-115)或任選的異源性間隔子。
方法
本揭露也關於用以製備和使用CGRP胜肽免疫原結構、組成物和醫藥組成物的方法。
a. CGRP胜肽免疫原結構的製造方法
本揭露的CGRP胜肽免疫原結構可利用普通技術人員所熟知的化學合成方法加以製備(參見例如Fields,et al.,1992)。CGRP胜肽免疫原結構可利用自動化美利弗德(Merrifield)固相合成法來合成，利用側鏈受保護之胺基酸，以t-Boc或F-moc化學保護α-NH2，在例如應用生物系統胜肽合成儀430A或431型(Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430A或431)上進行。包含Th抗原決定位之組合資料庫胜肽的CGRP胜肽免疫原結構的製備可透過提供用於在給定可變位置進行偶聯的替代性胺基酸的混合物而達成。
在欲求之CGRP胜肽免疫原結構組裝完成後，依照標準程序處理樹脂，將胜肽從樹脂上切下，並將胺基酸側鏈上的官能基切除。可利用HPLC純化游離的胜肽，並利用例如胺基酸分析或定序以描述生化特 性。胜肽的純化和表徵方法是本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的。
可以控制和確定透過此化學過程所產生之胜肽的品質，且結果是CGRP胜肽免疫原結構的再現性、免疫原性和產量可以獲得保證。透過固相胜肽合成之CGRP胜肽免疫原結構的製造的詳細描述顯示於實施例1中。
已經發現允許保留欲求免疫活性之結構變異範圍比起允許保留小分子藥物特定藥物活性或與生物來源藥品共同產生的大分子中存在欲求活性及非欲求毒性的結構變異範圍更具包容性。
因此，與欲求胜肽具有相似的色層分析和免疫學特性的胜肽類似物，不論是刻意設計或因合成過程錯誤而無法避免地作為刪除序列副產物的混合物產生的，其通常如經純化之欲求的胜肽製劑具有相同的效果。只要建立嚴格的QC程序，以監控製造過程與產品評估過程，確保使用這些胜肽之終產物的再現性與功效，則經設計的類似物與非預期的類似物的混合物也是有效的。
也可利用包括核酸分子、載體及/或宿主細胞的重組DNA技術來製備CGRP胜肽免疫原結構。因此，編碼CGRP胜肽免疫原結構及其免疫功能類似物的核酸分子也包括在本揭露中作為本發明的一部分。類似地，包含核酸分子的載體(包括表現載體)以及含有載體的宿主細胞也包括在本揭露中作為本發明的一部分。
各種例示性實施例也包括製造CGRP胜肽免疫原結構及其免疫功能類似物的方法。例如，方法可包括在表現胜肽及/或類似物的條件下培養宿主細胞之步驟，宿主細胞包含含有編碼CGRP胜肽免疫原結構及/或其免疫功能類似物之核酸分子的表現載體。較長的合成胜肽免疫原可 利用公知的重組DNA技術來合成。這些技術可於具有詳細實驗計畫之眾所周知的標準手冊中加以提供。為了構建編碼本發明胜肽的基因，將胺基酸序列反向轉譯以獲得編碼胺基酸序列的核酸序列，較佳地利用對於其中具有待表現基因的生物體來說最適合的密碼子。接下來，通常透過合成編碼胜肽和任何調節因子(如有必要的話)的寡核苷酸以製造合成基因。將合成基因插入適合的選殖載體內並轉染到宿主細胞中。然後在適合所選表現系統和宿主的合適條件下表現胜肽。利用標準方法純化胜肽並描述其特性。
b.免疫刺激複合物的製造方法
各種例示性實施例還包括製造包含CGRP胜肽免疫原結構和CpG寡去氧核苷酸(ODN)分子的免疫刺激複合物的方法。穩定化的免疫刺激複合物(ISC)衍生自CGRP胜肽免疫原結構的陽離子部份和聚陰離子CpG ODN分子。自行組合系統是由電荷的靜電中和所驅動。CGRP胜肽免疫原結構之陽離子部分對陰離子寡聚合物的莫耳電價比例的化學計量決定締合的程度。CGRP胜肽免疫原結構和CpG ODN的非共價靜電結合是完全可再現的過程。此胜肽/CpG ODN免疫刺激複合物聚集體有助於呈現至免疫系統中“專業的(professional)”抗原呈現細胞(APC)，因此可進一步增強複合物的免疫原性。在製造過程中，可輕易地描繪此些複合物的特徵以控制品質。胜肽/CpG ISC在體內具有良好的耐受性。設計這種包含CpG ODN和CGRP胜肽免疫原結構的新穎微粒系統，以利用與CpG ODN使用相關的廣義B細胞促有絲分裂(mitogenicity)，但促進平衡的Th-1/Th-2型反應。
在揭露的醫藥組成物中的CpG ODN在由相反電荷靜電中和所介導的過程中100%結合至免疫原，導致微米大小之微粒的形成。微粒形式 允許來自CpG佐劑常規使用之CpG劑量的顯著減少，不利的先天性免疫反應的可能性更低，且促進包括抗原呈現細胞(APC)在內的替代性免疫原處理途徑。因此，此種劑型在概念上是新穎的，且透過替代的機制藉由促進免疫反應的刺激而提供潛在的優點。
c.醫藥組成物的製造方法
各種例示性實施例還包括含有CGRP胜肽免疫原結構的醫藥組成物。在某些實施例中，醫藥組成物是利用油包水乳液和具有礦物鹽的懸浮液的劑型。
為了使醫藥組成物可被廣大群體所使用，安全性成為另一個需要考慮的重要因素。儘管在許多臨床試驗中都使用了油包水乳液，但基於其安全性，明礬仍然是製劑中使用的主要佐劑。因此，明礬或其礦物鹽磷酸鋁(ADJUPHOS)經常作為製劑中的佐劑供臨床應用。
其他佐劑和免疫刺激劑包括3 De-O-acylated monophosphoryl lipid A(MPL)或3-DMP、聚合或單體胺基酸，例如聚麩胺酸或聚離胺酸。此種佐劑可以與或不與其他特定的免疫刺激劑一起使用，免疫刺激劑例如胞壁醯肽(muramyl peptides)(例如N-acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamine(thr-MDP)、N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine(nor-MDP)、N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2-(1′-2′dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamine(MTP-PE)、N-acetylglucsaminyl-N-acetylmuramyl-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxy propylamide(DTP-DPP)TheramideTM，或其他細菌細胞壁成份。水包油乳液包含MF59(參見Van Nest等人的專利申請案WO 90/14837，其透過引用整體併入本文)，包含5%角鯊烯、0.5% TWEEN 80，以及0.5% Span 85 (任選含有不同量的MTP-PE)，利用微射流機配製成次微米顆粒；SAF，包含10%角鯊烯、0.4% TWEEN 80、5% pluronic-嵌段共聚合物L121，以及thr-MDP，利用微射流化形成次微米乳液或利用漩渦震盪以產生大顆粒乳液；以及RibiTM佐劑系統(RAS)(Ribi ImmunoChem,Hamilton,Mont.)，其包含2%角鯊烯、0.2% TWEEN 80，以及一種或多種的細菌細胞壁成份，細菌細胞壁成份選自由monophosphoryl lipid A(MPL)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)以及細胞壁骨架(CWS)組成的群組，較佳為MPL+CWS(DetoxTM)。其他佐劑包含弗氏完全佐劑(CFA)、弗氏不完全佐劑(IFA)，以及細胞因子(例如介白素(IL-1、IL-2和IL-12)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)，以及腫瘤壞死因子(TNF-α))。
佐劑的選擇取決於含有佐劑之免疫原製劑的穩定性、給藥途徑、給藥計畫、佐劑對接受免疫之物種的功效，且在人類，藥學上可接受的佐劑是指已經被相關監管機構批准或可批准用於人類給藥的佐劑。例如單獨明礬、MPL或弗氏不完全佐劑((Chang,et al.,1998)，其透過引用整體併入本文)或其任選地所有組合適於人類投予。
組成物可包括藥學上可接受的無毒載體或稀釋劑，其被定義為通常用於配製供動物或人類給藥的醫藥組成物的載體。選擇稀釋劑以免影響組成物的生物活性。此種稀釋劑的範例是蒸餾水、生理磷酸緩衝鹽水、林格氏液、葡萄糖溶液和漢克溶液。此外，醫藥組成物或劑型還可包含其他載體、佐劑或無毒的，非治療性的，非免疫原性的穩定劑等。
醫藥組成物還可包括大的緩慢代謝的大分子(例如蛋白質、多醣類(例如甲殼素)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚合物(例如膠乳功能化瓊脂糖(latex functionalized sepharose)、瓊脂糖(agarose)、纖維素等)、聚合胺基 酸、胺基酸共聚物，以及脂質聚集體(例如油滴或脂質體)。另外，這些載體可作為免疫刺激劑(即佐劑)。
本發明的醫藥組成物可進一步包含合適的遞送載體。合適的遞送載體包括，但不限於，病毒、細菌、可生物降解的微球體、微粒、奈米粒子、脂質體、膠原蛋白微球和螺旋體(cochleates)。
d.醫藥組成物的使用方法
本揭露也包括使用包含CGRP胜肽免疫原結構之醫藥組成物的方法。
在某些實施例中，包含CGRP胜肽免疫原結構之醫藥組成物可用於治療偏頭痛。
在一些實施例中，方法包含投予包含CGRP胜肽免疫原結構之藥學上有效劑量的醫藥組成物給有其需要的宿主。在某些實施例中，方法包含投予包含CGRP胜肽免疫原結構之藥學上有效劑量的醫藥組成物給溫血動物(例如人類、食蟹獼猴、小鼠)，以引發可與人類CGRP蛋白(SEQ ID NO：1)或來自其他物種之CGRP蛋白(例如SEQ ID NOs：2和3)交叉反應的高特異性抗體。
在某些實施例中，含有CGRP胜肽免疫原結構的醫藥組成物可用於治療偏頭痛，如在體內辣椒素誘導的背側血流模型所示。
e.體外功能分析和體內概念驗證研究
由CGRP胜肽免疫原結構在接受免疫的宿主中所引發的抗體可用於體外功能分析。這些功能分析包括但不限於：(1)與CGRP蛋白(SEQ ID NOs：1-3)的體外結合；(2)體外抑制CGRP與其受體的結合；(3)體外抑制細胞內cAMP升高； (4)在小鼠體內抑制辣椒素誘導的背側血流模型。
具體實施例
(1)一種CGRP胜肽免疫原結構，其具有約30個或更多個的胺基酸，以以下分子式表示：(Th)m-(A)n-(CGRP功能性B細胞抗原決定位胜肽)-X
或(CGRP功能性B細胞抗原決定位胜肽)-(A)n-(Th)m-X
或(Th)m-(A)n-(CGRP功能性B細胞抗原決定位胜肽)-(A)n-(Th)m-X
其中Th為異源性T輔助細胞抗原決定位；A為異源性間隔子；(CGRP功能性B細胞抗原決定位胜肽)為具有衍生自CGRP受體結合或活化區域的7至約30個胺基酸殘基的B細胞抗原決定位胜肽，具有如表1所示CGRP(SEQ ID NOs：1-3)之SEQ ID NOs：4-13和15-24；X為胺基酸的α-COOH或α-CONH2；m為1至約4；以及n為0至約10。
(2)如(1)所述之CGRP胜肽免疫原結構，其中CGRP受體結合或活化區域是選自由SEQ ID NOs：4-13和15-24組成之群組。
(3)如(1)或(2)任一所述之CGRP胜肽免疫原結構，其中異源性T輔助細胞抗原決定位是選自由SEQ ID NOs：74-115組成之群組。
(4)如(1)所述之CGRP胜肽免疫原結構，其中胜肽免疫原結構是選自由SEQ ID NOs：120-127和130-180組成之群組。
(5)一種CGRP胜肽免疫原結構，包含：a. B細胞抗原決定位，其包含來自CGRP序列SEQ ID NOs：1至3的約7至約30個的胺基酸殘基；b. T輔助細胞抗原決定位，其包含選自由SEQ ID NOs：74-115及其任意組合組成之群組的胺基酸序列；以及c.任選的異源性間隔子，其是選自由胺基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：72)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO：73)和Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO：71)及其任意組合組成之群組，其中B細胞抗原決定位是直接或透過任選的異源性間隔子共價連接至T輔助細胞抗原決定位。
(6)如(5)所述之CGRP胜肽免疫原結構，其中B細胞抗原決定位是選自由SEQ ID NOs：4-13和15-24組成之群組。
(7)如(5)所述之CGRP胜肽免疫原結構，其中T輔助細胞抗原決定位是選自由SEQ ID NOs：78、77、80-82、85、91、94、97、98-99、106-109、112及其任意組合組成之群組。
(8)如(5)所述之CGRP胜肽免疫原結構，其中任選的異源性間隔子為(α,ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：72)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO：73)或Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO：71)，其中Xaa為任意胺基酸。
(9)如(5)所述之CGRP胜肽免疫原結構，其中T輔助細胞抗原決定位是共價連接至B細胞抗原決定位的胺基端。
(10)如(5)所述之CGRP胜肽免疫原結構，其中T輔助細胞抗原決定位是透過任選的異源性間隔子共價連接至B細胞抗原決定位的胺基端。
(11)一種組成物，其包含如(1)所述之CGRP胜肽免疫原結構。
(12)一種醫藥組成物，其包含：a.如(1)所述之胜肽免疫原結構；以及b.藥學上可接受的遞送載體及/或佐劑。
(13)如(12)所述之醫藥組成物，其中a. CGRP功能性B細胞抗原決定位胜肽是選自由SEQ ID NOs：4-13和15-24組成之群組；b.異源性T輔助細胞抗原決定位是選自由SEQ ID NOs：74-115組成之群組，以及c.異源性間隔子是選自由胺基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：72)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO：73)和Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO：71)及其任意組合組成之群組；以及其中CGRP胜肽免疫原結構與CpG寡去氧核苷酸(ODN)混合以形成穩定化的免疫刺激複合物。
(14)如(12)所述之醫藥組成物，其中a. CGRP胜肽免疫原結構是選自由SEQ ID NOs：120-127和130-180組成之群組；以及 其中CGRP胜肽免疫原結構與CpG寡去氧核苷酸(ODN)混合以形成穩定化的免疫刺激複合物。
(15)一種用以在動物中產生針對CGRP之抗體的方法，其包含對動物投予如(12)所述之醫藥組成物。
(16)一種分離的抗體或其抗原決定位結合片段，其特異性地結合至SEQ ID NOs：4-13和15-24的CGRP受體結合或活化區域。
(17)如(16)所述之分離的抗體或其抗原決定位結合片段，其結合至CGRP胜肽免疫原結構。
(18)一種組成物，其包含如(16)所述之分離的抗體或其抗原決定位結合片段。
(19)一種用以在動物中預防及/或治療偏頭痛的方法，其包含對動物投予如(12)所述之醫藥組成物。
實施例1. CGRP相關胜肽的合成及其製劑的製備 a. CGRP相關胜肽的合成
描述了包含在CGRP胜肽免疫原結構開發工作中用以合成CGRP相關胜肽的方法。以小規模量合成的胜肽用於血清學分析、實驗室試驗和田間試驗，大規模(千克)量合成的胜肽則用於醫藥組成物的工業/商業生產。為了抗原決定位鑑定，以及為了篩選和選擇用於有效靶向CGRP之治療性疫苗中的最佳胜肽免疫原結構，設計了具有長度為約10至70個胺基酸之序列的大量CGRP相關抗原性胜肽。
人類、小鼠、大鼠和獼猴物種之代表性全長CGRP(SEQ ID NOs：1-3)、CGRP胜肽片段，以及在各種血清學分析中供抗原決定位鑑定使用的10-mer胜肽，列於表1(SEQ ID NOs：1-70)中。
將選擇的CGRP B細胞抗原決定位胜肽透過合成方法連接至衍生自病原體蛋白(包括麻疹病毒融合蛋白(MVF)、B型肝炎表面抗原蛋白(HBsAg)、流行性感冒病毒、破傷風梭菌，以及Epstein-Barr病毒(EBV))之經周密設計的T輔助細胞(Th)抗原決定位胜肽(如表2所示(SEQ ID NOs：74-115))，以製成CGRP胜肽免疫原結構。Th抗原決定位胜肽是以單一序列(SEQ ID NOs：74-84、86-90、92-93、95-96、98-115)或組合資料庫(SEQ ID NOs：85、91、94和97)形式使用，以增強其各自CGRP胜肽免疫原結構的免疫原性。
表3(SEQ ID NOs：116-180)中鑑定了選自數百種胜肽結構的代表性CGRP胜肽免疫原結構。用於供抗CGRP抗體偵測及/或測量之免疫原性研究或相關血清學測試的所有胜肽是在應用生物系統胜肽合成儀430A、431及/或433型上利用F-moc化學小規模合成。每一個胜肽是透過在固相載體上的獨立合成所製備，在三官能基胺基酸的胺基端與側鏈保護基團具有F-moc保護。將完整的胜肽從固相載體上切下，並用90%三氟乙酸(TFA)移除側鏈保護基團。利用基質輔助雷射脫附游離飛行時間(MALDI-TOF)質譜儀評估合成的胜肽產物以確定正確的胺基酸組成。也利用反相HPLC(RP-HPLC)評估各個合成胜肽以確認產物的合成樣態與濃度。儘管嚴格控制合成過程(包括逐步地監測偶合效率)，由於在延長循環中某些意外事件，包括胺基酸的插入、刪除、取代及提前終止，仍可能產生胜肽類似物。因此，合成產物一般包括多種胜肽類似物與目標胜肽。
儘管包括這些非預期的胜肽類似物，但最後的合成胜肽產物仍可用作免疫應用，包括免疫診斷(作為抗體捕捉抗原)與醫藥組成物(作為胜肽免疫原)。一般來說，只要開發一嚴格的QC程序來監測製造過程及 產品品質評估程序，以確保使用這些胜肽之最終產物的再現性與功效，此胜肽類似物，包括刻意設計或合成程序中產生的副產物混合物，通常可如欲求胜肽的純化產物同樣有效。可利用客製的自動胜肽合成儀UBI2003或類似機型以15mmole至150mmole的規模合成數百至數千克的大量胜肽。
對於供臨床試驗之最終醫藥組成物使用的活性成分，可利用預備的RP-HPLC於淺洗提梯度下純化CGRP相關胜肽免疫原結構，並利用MALDI-TOF質譜、胺基酸分析和RP-HPLC描繪純度與一致性的特性。
b.含有CGRP胜肽免疫原結構之組成物的製備
製備採用油包水乳液和具有礦物鹽之懸浮液的劑型。為了設計醫藥組成物供廣大族群使用，安全性成為另一個需要考慮的重要因素。儘管在人類許多醫藥組成物的臨床試驗中使用油包水乳液，但基於其安全性，明礬仍然是用於醫藥組成物中的主要佐劑。因此，明礬或其礦物鹽ADJUPHOS(磷酸鋁)經常作為佐劑供臨床應用製劑的使用。
簡而言之，在以下描述的每個實驗組中所指定的劑型通常包含所有類型專門設計的CGRP胜肽免疫原結構。利用代表免疫原B細胞抗原決定位胜肽之相對應CGRP胜肽，針對其相對免疫原性，於天竺鼠中仔細評估超過200種專門設計的CGRP胜肽免疫原結構。利用塗覆選自SEQ ID NOs：1-70之胜肽的孔盤以ELISA試驗在各種同源性胜肽中分析抗原決定位鑑定和血清學交叉反應。
如指定，利用經核准供人類使用的油劑Seppic MONTANIDETM ISA 51以油包水乳液形式，或與礦物鹽ADJUPHOS(磷酸鋁)或ALHYDROGEL(明礬)混合，以配製不同量的CGRP胜肽免疫原結構。通常利用將CGRP胜肽免疫原結構以約20至2000μg/mL濃度溶解於水中， 並與MONTANIDETM ISA 51配製成油包水乳液(1：1體積)，或者與礦物鹽ADJUPHOS或ALHYDROGEL(明礬)(1：1體積)配製，以製成組成物。將組成物置於室溫下約30分鐘，並在免疫接種前利用漩渦震盪混合約10至15秒。利用2至3個劑量的特定組成物免疫接種動物，其在時間0(初次免疫)和初次免疫後(wpi)3週(加強免疫)投予，任選5或6wpi進行第二次加強免疫，透過肌內途徑投藥。然後利用選定的B細胞抗原決定位胜肽測試來自接受免疫接種之動物的血清，以評估存在於劑型中的各種CGRP胜肽免疫原結構的免疫原性，以及相對應血清與CGRP蛋白的交叉反應性。針對其相對應血清的功能特性，將最初在天竺鼠篩選中發現的那些具有強免疫原性的CGRP胜肽免疫原結構在體外實驗中做進一步測試。然後，以油包水乳液、礦物鹽和基於明礬的配方製備所選的候選CGRP胜肽免疫原結構按照免疫方案在指定的特定期間內進行給藥方案。
在試驗用新藥申請之後於患有偏頭痛之患者中進行臨床試驗的提交準備中，只有最有希望的CGRP胜肽免疫原結構會在被納入供於GLP指導的臨床前研究中針對免疫原性、持續時間、毒性和功效研究之最終劑型之前會進行進一步廣泛的評估。
以下實施例是用於說明本發明，且不用以限制本發明的範圍。
實施例2. 血清學試驗和試劑
以下詳細描述用以評估CGRP胜肽免疫原結構及其製劑之功能性免疫原性的血清學試驗和試劑。
a.供免疫原性和抗體特異性分析之基於CGRP或CGRP B細胞抗原決定位胜肽的ELISA試驗
開發並於下文描述於以下實施例中所述用以評估免疫血清樣品的ELISA試驗。利用配製於pH 9.5之10mM碳酸氫鈉緩衝液(除非另有說 明)中濃度為2μg/mL(除非另有說明)的CGRP或CGRP B細胞抗原決定位胜肽等(SEQ ID NOs：1至70)，將其以100μL體積於37℃下作用1小時，以分別地塗覆96孔盤的孔洞。
將以CGRP或CGRP B細胞抗原決定位胜肽塗覆的孔洞與250μL配製於PBS中濃度為3重量百分比的明膠於37℃下反應1小時，以阻斷非特異性蛋白質結合位點，接著利用含有0.05體積百分比TWEEN® 20的PBS洗滌孔洞三次並乾燥。利用含有20體積百分比正常山羊血清、1重量百分比明膠和0.05體積百分比TWEEN® 20的PBS以1：20比例(除非另有說明)稀釋待測血清。將100μL稀釋樣品(例如血清、血漿)加入每個孔洞並於37℃下反應60分鐘。然後利用配製於PBS中濃度為0.05體積百分比的TWEEN® 20洗滌孔洞6次，以移除未結合的抗體。使用辣根過氧化物酶(HRP)共軛物種(例如天竺鼠或大鼠)特異性山羊多株抗IgG抗體或蛋白質A/G作為標記的示蹤劑，以在陽性孔洞中與形成的抗體/胜肽抗原複合物結合。將100微升HRP標記的偵測試劑以預滴定的最佳稀釋倍數配製於內含1體積百分比正常山羊血清與0.05體積百分比TWEEN® 20的PBS中，將其加到每個孔洞中，並在37℃下再反應30分鐘。利用內含0.05體積百分比TWEEN® 20的PBS洗滌孔洞6次以移除未結合的抗體，並與100μL包含0.04重量百分比3’,3’,5’,5’-四甲基聯苯胺(TMB)和0.12體積百分比過氧化氫於檸檬酸鈉緩衝液中的受質混合物再反應15分鐘。藉由形成有色產物利用受質混合物以偵測過氧化物酶標記。藉由加入100μL的1.0M硫酸終止反應並測定450nm處的吸光值(A450)。為了測定接受各種胜肽疫苗製劑之疫苗接種動物的抗體效價，將從1：100至1：10,000之10倍連續稀釋的血清或從1：100至1：4.19x 108之4倍連續稀釋的血清進行測試， 且利用A450臨界值設為0.5之A450的線性回歸分析計算測試血清的效價，以Log10表示。
b.利用基於Th胜肽的ELISA試驗評估針對Th胜肽的抗體反應性
以類似的ELISA方法並如上所述進行，利用配製於pH 9.5之10mM碳酸氫鈉緩衝液(除非另有說明)中濃度為2μg/mL(除非另有說明)的100μL Th胜肽於37℃下作用1小時，以分別地塗覆96孔ELISA盤的孔洞。為了測定接受各種CGRP胜肽疫苗製劑之疫苗接種動物的抗體效價，將從1：100至1：10,000之10倍連續稀釋的血清進行測試，且利用A450臨界值設為0.5之A450的線性回歸分析計算測試血清的效價，以Log10表示。
c.透過基於B細胞抗原決定位簇10-mer胜肽之ELISA試驗利用抗原決定位鑑定對目標CGRP B細胞抗原決定位胜肽進行精細特異性分析
利用基於B細胞抗原決定位簇10-mer胜肽之ELISA試驗利用抗原決定位鑑定對來自利用CGRP胜肽免疫原結構免疫接種之宿主的抗CGRP抗體進行精細特異性分析。簡而言之，依照上述抗體ELISA方法的步驟，以二重複方式，利用每孔洞每0.1mL含有0.5μg之個別CGRP或相關10-mer胜肽(SEQ ID NOs：26-70塗覆96孔盤的孔洞，然後將100μL血清樣品(配製於PBS中，稀釋倍數為1：100)於10-mer盤中進行反應。為了特異性確認，利用相對應CGRP胜肽或非相關的對照胜肽對來自接受免疫之宿主的抗CGRP抗體進行與目標B細胞抗原決定位相關精細特異性分析。
d.免疫原性評估
依照實驗疫苗接種程序收集來自動物或人類個體的免疫前和免疫血清樣品，並在56℃下加熱30分鐘以使血清補體因子失活。在投予疫 苗製劑後，根據程序獲得血液樣品，並利用基於相對應CGRP B細胞抗原決定位胜肽的ELISA試驗評估其針對特定靶點的免疫原性。測試了連續稀釋的血清，並將稀釋倍數之倒數取對數(Log10)以表示陽性效價。對於其能力(引發針對目標抗原內欲求抗原決定位特異性之高效價抗體反應和與CGRP蛋白高交叉反應性，且同時將針對用以提供欲求B細胞反應增強之“T輔助細胞抗原決定位”之抗體反應性維持在低至可忽略)，而評估特定疫苗製劑的免疫原性。
實施例3. 在針對細胞內cAMP產生之體外試驗中評估利用CGRP胜肽免疫原結構及其製劑所引發之抗體的功能特性
進一步測試免疫疫苗中之免疫血清或純化的抗CGRP抗體抑制CGRP誘導的細胞內cAMP產生的能力。
a.抗體純化
根據抗體純化試劑盒(Thermo fisher,Cat no.89953)的使用手冊，遵循所有抗體純化程序。針對每個組別各自的IgG純化濃度仔細校正以用於體外測定。
b.細胞製備和維持
L6(ATCC® CRL-1458TM)細胞株購自ATCC。此細胞株的基礎培養基是ATCC配製的達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)，貨號為30-2002。加入胎牛血清至終濃度為10%以製成完整的生長培養基。並將其置於溫度為37℃含有95%空氣、5% CO2的環境培養。
c.在有/無IgGs狀況下進行CGRP處理
使用基於細胞的cAMP活化測定針對體外中和活性進一步篩選抗CGRP IgGs。所有步驟均在384孔圓底低體積微量盤(Mediomics,LLC 貨號163301)中進行。在抗CGRP IgG(終濃度為1-20μg/ml)存在下，將五微升的大鼠α-CGRP(終濃度為10nM)在室溫下反應30分鐘。然後將配置於1XKRB-IBMS緩衝液中的大鼠L6肌肉細胞(體積為5微升，細胞數目為5000個)加入。將微量盤在室溫下反應30分鐘。
d.基於細胞的CGRP中和測試(cAMP水平檢測)
在反應後，按照製造商的說明使用MEDIOMICS BRIDGE-IT cAMP全合一(ALL IN ONE)螢光測定(MEDIOMICS，貨號122938/122939)進行cAMP活化。將10μl的cAMP全合一檢測溶液添加到每個孔洞中，並透過上下吸液混合以裂解細胞與開始cAMP檢測。覆蓋微量盤以避免蒸發和暴露於光線。將微量盤在室溫下反應30分鐘，透過螢光讀取器(SPECTRAMAX I3X MULTI-MODE MICROPLATE READER)偵測螢光強度(以波長485NM激發，偵測540NM波長處的發散)。以百分比記錄數據。0%代表僅有L6細胞，而100%代表CGRP處理的L6細胞。
實施例4. 用於安全性、免疫原性、毒性和功效研究的動物 a.天竺鼠：
在成熟，未與抗原接觸或未受抗原刺激的(naïve)，成年雄性和雌性Duncan-Hartley天竺鼠(300-350g/BW)中進行免疫原性研究。實驗中每一組使用至少3隻天竺鼠。在聯合生物醫學公司(UBI)作為試驗委託者之簽訂合約的動物設施依照經核准的IACUC申請進行涉及Duncan-Hartley天竺鼠(8-12週齡；Covance Research Laboratories,Denver,PA,USA)的試驗計畫。
b.食蟹獼猴：
在UBI作為試驗委託者之簽訂合約的動物設施依照經核准的IACUC申請於成年雄性和雌性猴子(食蟹獼猴，約3-4歲；昭衍新藥研究中心，中國蘇州)進行免疫原性和重複劑量毒性研究。
c.小鼠
在辣椒素誘發(challenge)前於0、3、6、9、12wpi對雌性Balb/C小鼠(n=6隻/組)注射5次，其是在一注射部位(後肢股四頭肌)利用待測疫苗(40μg/0.1ml/劑)或對照品(0.1ml/劑)進行肌肉注射(IM)。將動物飼養在聯亞生技(UBI Asia)實驗室的動物設施中，並在固定溫度(22℃)、濕度(72%)、12小時光照/12小時黑暗週期之條件下適應環境1週。小鼠可隨意進食鼠糧和水。所有試驗計畫均遵循實驗動物護理原則。如試驗計畫所述進行採血。利用ELISA分析針對抗CGRP(小鼠)檢測抗體效價。
實施例5. 提供於天竺鼠中進行CGRP胜肽結構免疫原性評估的疫苗製劑
在各個實驗中使用的醫藥組成物和疫苗製劑如以下內容所示更加詳細地描述。
簡而言之，在每個實驗組中所指定的劑型通常含有所有類型專門設計的CGRP胜肽免疫原結構，其具有CGRP B細胞抗原決定位胜肽片段，CGRP B細胞抗原決定位胜肽片段透過不同類型間隔子(例如εLys(εK)或lysine-lysine-lysine(KKK)以增強胜肽結構的溶解度)連接至混雜T輔助細胞抗原決定位，混雜T輔助細胞抗原決定位包含衍生自麻疹病毒融合蛋白和B型肝炎表面抗原的兩組人工T輔助細胞抗原決定位。CGRP B細胞抗原決定位胜肽連接至專門設計的胜肽結構的胺基端或羧基端。最初針對其與相對應CGRP B細胞抗原決定位胜肽的相對免疫原性在天竺鼠中對數百種專門設計的CGRP胜肽免疫原結構進行評估。如指定，將不同量的CGRP胜肽免疫原結構配製於使用經核准供人類疫苗使用的 油劑Seppic MONTANIDE ISA 51的油包水乳液中或使用礦物鹽(ADJUPHOS)或ALHYDROGEL(明礬)的懸浮液中。通常利用將CGRP胜肽結構以約20至800μg/mL濃度溶解於水中，並與MONTANIDE ISA 51配製成油包水乳液(1：1體積)，或者與礦物鹽(ADJUPHOS)或ALHYDROGEL(明礬)(1：1體積)配製，以製成疫苗製劑。將疫苗製劑置於室溫下約30分鐘，並在免疫接種前利用漩渦震盪混合約10至15秒。
利用2至5個劑量的特定疫苗製劑免疫接種一些動物，其在時間0(初次免疫)和初次免疫後(wpi)3週(加強免疫)投予，任選5或6wpi進行第二次加強免疫，透過肌內途徑投藥。然後，針對在個別疫苗製劑中使用之相對應CGRP胜肽免疫原結構的免疫原性，以及針對其與相對應CGRP B細胞抗原決定位胜肽或全長CGRP的交叉反應性，以評估這些接受免疫的動物。針對在如免疫方案指定之特定期間內的給藥方案，將在天竺鼠初次篩選中具有強免疫原性的那些CGRP胜肽免疫原結構在獼猴中以油包水乳液、礦物質鹽類和以明礬為基底的製劑中進行進一步測試。
利用相對應小鼠CGRP胜肽免疫原結構，針對其於小鼠中突破免疫耐受性的能力，只將最有希望的CGRP胜肽免疫原結構候選物進行進一步廣泛評估。在小鼠中具有最佳免疫原性的CGRP胜肽免疫原結構，其可引發針對內源性CGRP的抗CGRP抗體效價；特別是具有在小鼠模型中抑制辣椒素誘導的皮膚血流的能力。將優化的CGRP胜肽免疫原結構納入最終疫苗劑型中，提供在提交研究性新藥申請準備之GLP指導的免疫原性、持續時間、毒性和功效證明的研究中和在偏頭痛患者進行的臨床試驗中使用。
實施例6. 用於治療偏頭痛之包含CGRP胜肽免疫原結構的多組分疫苗製劑的設計合理性、篩選、鑑定、功能特性評估和優化
基於第1至4圖提供的科學資訊，選擇CGRP作為設計的目標分子和本發明的內容。第1圖顯示來自人類(SEQ ID NO：1)、獼猴(SEQ ID NO：2)、小鼠/大鼠(SEQ ID NO：3)和許多其他物種的CGRP序列的比對；第2圖描述與CGRP有關的生理學和病理生理學。第3圖描述為什麼CGRP可以成為新的偏頭痛治療的靶點。第4圖描述基於高精密度專門設計合成胜肽的疫苗發現到商業化的途徑。第4圖描述這些步驟的簡要綜述，並附有流程圖，此流程圖標識CGRP疫苗製劑從發現到商業化(工業化)的開發過程。對每個步驟的詳細評估和分析，帶來令人愉悅和令人不愉快的驚喜，在過往導致無數的實驗，最終將導致安全且有效的CGRP疫苗製劑的商業化。
a.設計歷史
每種胜肽免疫原結構或免疫治療產品都需要自己的設計重點和方法，設計重點和方法是基於其特定的疾病機制和干預所需的目標蛋白。對於偏頭痛的治療，根據如第1、2和3圖概述的可用科學資訊，選擇CGRP作為目標分子。如第4圖所示，從發現到商業化的過程通常需要一至數十年才能完成。與用於干預之功能位點相關的CGRP B細胞抗原決定位胜肽的鑑定是免疫原結構設計的關鍵。在各種製劑中包含各種T輔助細胞支持物(T helper support)(載體蛋白或合適的T輔助細胞胜肽)在天竺鼠中進行連續的先導免疫原性研究，且之後在特定體外功能分析或於選定的動物模型所進行的體內概念驗證研究中評估所引發純化抗體或使用特定CGRP胜肽免疫原結構之疫苗製劑的功能特性。經過廣泛的血清學驗證，然後在非人類靈長類動物中進一步測試候選CGRP B細胞抗原決定位胜肽免疫原結構，以進一步驗證CGRP胜肽免疫原設計的免疫原性和方向。然後以不同的混合物配製選擇的CGRP胜肽免疫原結構，以評估 當組合使用時在胜肽結構間與各自交互作用有關之功能特性的細微差異。經過額外的評估，確定最終的胜肽結構、胜肽組成物及其製劑，以及製劑的各個物理參數，從而導致最終產品的開發過程。
基於多種設計理論選擇CGRP胜肽免疫原結構的胺基酸序列。這些理論中的幾個包括使用CGRP B細胞抗原決定位胜肽序列，內容如下：
(i)CGRP內缺乏自體T輔助細胞抗原決定位以避免自體T細胞活化(如先前在治療阿茲海默症使用靶向Aβ1-42之AN1792疫苗的臨床試驗中所報導，自體T細胞活化可能導致大腦發炎，進而造成腦膜炎球菌性腦炎)。
(ii)本身是非免疫原性的，因為其為自身的分子；
(iii)當投予宿主時，透過使用蛋白質載體或有效的T輔助細胞抗原決定位，可以使其獲得免疫原性；
(iv)引發針對CGRP胜肽序列(B細胞抗原決定位)且非針對蛋白質載體或有效的T輔助細胞抗原決定位的高效價抗體；
(v)引發高效價的抗體，其可抑制由於CGRP和CGRP受體交互作用以及細胞活化所引起的細胞內cAMP升高；以及
(vi)此疫苗製劑在投予動物模型(例如BALB/C小鼠)時可抑制辣椒素誘導的背側血流，可作為治療偏頭痛的概念驗證證據。
b.用於醫藥組成物之CGRP胜肽免疫原結構的設計和驗證，此醫藥組成物具有治療偏頭痛患者的潛力
為了產生最有效的胜肽結構以包含進入醫藥組成物中，人類CGRP B細胞抗原決定位胜肽的組庫(例如SEQ ID NOs：4-24)和衍生自各種病原體或人工T輔助細胞抗原決定位的混雜T輔助細胞抗原決定位(例 如SEQ ID NOs：74-115)被進一步設計並製成例如代表性CGRP胜肽免疫原結構(例如SEQ ID NOs：116-180)，提供最初用於天竺鼠的免疫原性研究。
i)從受體結合或受體活化區域中選擇CGRP B細胞抗原決定位胜肽序列進行設計
選擇位於CGRP中間/羧基端區域的CGRP受體結合區域和來自CGRP胺基端C2-C7環狀結構/中間區域的受體活化區域進行CGRP B細胞抗原決定位設計，然後進一步製成胜肽免疫原結構以在天竺鼠引發免疫血清，免疫血清起初提供透過在CGRP B細胞抗原決定位胜肽塗覆的微量盤上利用ELISA進行免疫原性測定，然後提供進行體外功能分析評估。
CGRP與CGRP受體結合後，CGRP受體會在細胞內傳遞活化訊號，從而在其他細胞事件中導致細胞內cAMP水平升高。當與缺乏抗體的對照組相比時，如第6圖和在第5圖內顯示之表格所示，來自天竺鼠免疫血清針對特定CGRP胜肽免疫原結構之純化的抗體具有能力去中和CGRP功能特性，能力評估為抑制50%的cAMP升高的IC50。
起初利用ISA 51和CpG配製這些CGRP胜肽免疫原結構，以400μg/1mL的劑量在天竺鼠中進行初次免疫，並以100μg/0.25mL的劑量進行加強免疫(3、6和9wpi)，供免疫原性研究。為了測試在天竺鼠中的免疫原性，使用ELISA試驗，將來自各次(wpi)採血的天竺鼠免疫血清以10倍連續稀釋的方式從1：100稀釋至1：10000。以每孔洞0.5μg胜肽的量利用相對應小鼠/大鼠CGRP B細胞抗原決定位胜肽和全長CGRP胜肽塗覆ELISA微量盤。利用A450臨界值設為0.5之A450的線性回歸分析計算測試血清的效價，以Log10表示，如第5圖所示，在表4、5和6則顯示代表性B細胞抗原決定位衍生的CGRP胜肽免疫原結構的詳細效價。儘管設計的短 CGRP胜肽由於其缺乏內源性Th抗原決定位而通常是非免疫原性的，但是外源性Th抗原決定位的添加可增強特定CGRP胜肽免疫原結構的免疫原性。來自表4、5和6以及第5圖之各種結構的反應性/特異性模式的詳細分析可評估CGRP分子內某些殘基所賦予的免疫原性，此有助於進一步設計最佳的胜肽免疫原結構。
ii)在所選CGRP B細胞抗原決定位內缺乏自體T輔助細胞抗原決定位以避免自體T細胞活化
如表8所示，代表性的CGRP B細胞抗原決定位，例如具有SEQ ID Nos：5、6和15的那些，當提供給對應物胜肽免疫原結構使用於有效疫苗製劑中給藥時，它們本身未引發針對CGRP的任何抗體，因此是在所選CGRP B細胞抗原決定位內缺乏非欲求內源性Ths抗原決定位。
iii)利用CGRP胜肽免疫原結構所引起的集中抗體反應僅靶向CGRP B細胞抗原決定位
眾所周知，用以加強針對標靶B細胞抗原決定位胜肽之免疫反應的所有載體蛋白(例如鑰孔血藍蛋白(KLH)、白喉類毒素(DT)和破傷風類毒素(TT)蛋白))，透過將這種B細胞抗原決定位胜肽與各自載體蛋白化學共軛可引發超過90%的抗體是針對增強載體蛋白，而少於10%的抗體是針對免疫宿主中的標靶B細胞抗原決定位。
因此評估本發明CGRP胜肽免疫原結構的特異性是重要的。兩個代表的CGRP胜肽免疫原結構(來自表9的SEQ ID NOs：142和143)具有來自CGRP 20-37和22-37之不同長度的B細胞抗原決定位，B細胞抗原決定位透過間隔子序列連接至異源性T輔助細胞抗原決定位UBITh®1(SEQ ID NO：98)，被製備用於抗原性評估。將UBITh®1(用於B細胞抗原決定位免疫增強作用之T輔助細胞抗原決定位胜肽)塗覆在微量盤上，並 將天竺鼠的免疫血清用於測試與用於免疫增強作用之UBITh®1胜肽的交叉反應性。如表8所示，與這些結構對相對應目標CGRP B細胞抗原決定位胜肽的高免疫原性(即使僅注射一劑，針對CGRP B細胞抗原決定位所產生之抗體的高效價(>5Log10)說明了這一點)形成鮮明對比，發現大多數(如果不是全部)免疫血清與UBITh®1胜肽無反應性。
總之，簡單的免疫原設計(包含連接至精心選擇的T輔助細胞抗原決定位的目標CGRP B細胞抗原決定位胜肽)可產生僅針對相對應CGRP B細胞抗原決定位胜肽的集中的免疫反應。對於醫藥組成物設計而言，其產生的免疫反應越具有特異性，則其為組成物提供的安全性越高。因此，本發明CGRP胜肽免疫原結構為高特異性的，但對其B細胞目標是高度有效的。
iv)利用針對所選CGRP胜肽免疫原結構的免疫血清進行精細的抗原決定位鑑定(epitope mapping)
如表10所示，在精細抗原決定位鑑定研究中，將抗體結合位點定位至在目標B細胞抗原決定位區域內的特定殘基上，合成45個重疊的10-mer胜肽(SEQ ID NOs：26-70)，其涵蓋第-9個胺基酸至第45個胺基酸的序列，涵蓋CGRP分子加工前後CGRP的全長區域和前驅物序列。將這些10-mer胜肽作為固相免疫吸附物分別塗覆至96孔微量盤上。將以1：100稀釋比例配製於樣品稀釋緩衝液中的匯集的天竺鼠抗血清加到利用2.0μg/mL的10-mer胜肽塗覆的微量盤孔洞中，隨後在37℃下培養1小時。在利用洗滌緩衝液洗滌微量盤孔洞後，加入辣根過氧化物酶(HRP)共軛重組蛋白A/G並培養30分鐘。利用PBS再次洗滌後，將受質加入孔洞中，利用ELISA微量盤式分析儀測量450nm處的吸光值，以二重複方式分析樣 品。CGRP胜肽免疫原所引發免疫血清與相對應CGRP B細胞抗原決定位胜肽塗覆孔洞的結合代表最大的抗體結合信號。
表10所示的精細抗原決定位鑑定結果顯示，來自CGRP胜肽免疫原結構SEQ ID NOs：122、123、127、129、130、132、137和139(包含來自源自胺基酸11至37之受體結合區域以及來自胺基酸1-25、11-25、8-18、11-35、11-37、15-37和18-37之位於C2-C7環狀結構附近的抗體活化區域的CGRP B細胞抗原決定位胜肽)的匯集的天竺鼠血清誘導主要針對來自胺基酸1-37(SEQ ID NO：1)之10-mer胜肽簇的高效價抗體，與胜肽具有高度交叉反應，主要是與以下胺基酸有不同形式的交叉反應：1-13是與B抗原決定位1-25；15-26是與B抗原決定位11-25；非主要是與B抗原決定位8-18；22-33和26-36是與B抗原決定位11-35；23-33和28-37是與B抗原決定位11-37；23-33和28-37是與B抗原決定位18-37；22-33和26-36是與B抗原決定位11-35；17-26、20-30和28-37是與B抗原決定位15-37。令人感興趣的是發現，儘管採用了相同的B細胞抗原決定位來設計胜肽免疫原結構SEQ ID NOs：123和130，但是與SEQ ID NO：130相比，SEQ ID NO：123只有間隔子差異(具有額外的KKK間隔子)。在結構SEQ ID NO：130(其具有較短的間隔子無KKK殘基)中發現具有針對AAs 20-30和AAs 26-36的額外反應性。
總而言之，設計的合成CGRP胜肽免疫原結構在天竺鼠中誘導了強大的免疫反應，產生了針對CGRP中不同的10-mer胜肽簇的多株抗體，這些10-mer胜肽簇與各自羧基端附近的CGRP受體結合區域和位於C2-C7環狀結構附近的受體活化區域都非常接近，可提供重要的醫學干預。抗原決定位鑑定和功能分析評估將允許鑑定用於疫苗製劑的最佳胜肽免疫原結構。
實施例7. 在體外模式下對利用CGRP胜肽免疫原結構及其製劑所引發的抗體進行功能特性評估
如表4、5、6、7、8和9所示，在證明從利用精心挑選的候選CGRP免疫原結構免疫之天竺鼠的免疫血清純化而來的抗體具有高免疫原性和交叉反應性之後，設計了以下研究以評估來自每隻動物在6wpi收集之這些免疫血清的代表性純化的IgGs能否能夠抑制在CGRP與其受體結合後由於CGRP中C2-C7環狀結構的活化而導致cAMP的細胞內升高。
在平滑肌細胞內的分子層次上，CGRP可透過其羧基端區域與其受體結合，然後透過使用其環狀結構區域活化受體(參考文獻)。具有雙硫鍵之環狀的C2-C7環狀結構在受體活化中具有核心作用，受體活化與細胞內cAMP的升高密切相關。在中和測定中，使用多種抗CGRP IgGs來表徵其潛在的抗CGRP影響。具體地，使用細胞內cAMP水平的改變透過功能藥理學評估效果。此體外功能評估對於評估那些針對本發明CGRP胜肽免疫原結構之天竺鼠免疫血清的抗CGRP作用特別重要，在實施例4中詳述測定方法。
利用抗CGRP抗體在CGRP活化的磷酸化中抑制細胞內cAMP升高
如實施例4所述收集來自每隻動物之6wpi採血的免疫血清並純化抗體。如實施例6所示，針對其個別免疫原性在天竺鼠中測試21種CGRP胜肽免疫原結構。基於其在胜肽免疫原結構中所使用的個別目標B細胞抗原決定位胜肽而將純化的抗體分為三類。它們分別地針對來自胺基端區域、中間區域和羧基端區域的B細胞抗原決定位胜肽。以在CGRP處理的L6細胞中檢測到之cAMP的百分比記錄數據。0%代表僅L6細胞，而100%代表CGRP處理的L6細胞。如第6圖以及隨附的表格所示，對於cAMP水平而言，包含來自胺基端、中間或羧基端區域之CGRP B細胞抗 原決定位胜肽的結構展現從0.60至>20的IC50(μg/mL)。出於實際目的，我們使用小於10μg/mL的IC50作為顯著的抗體介導的cAMP產生抑制。表現出有效功能免疫原性之代表性結構的排名(具有從低到高的IC50μg/mL)為SEQ ID NOs：130>127>150>125>137>123>121>119>124>131>126>133>120>129>135>116~117~118~128~139，且利用在CGRP 37-mer結構中高達幾個殘基的精密度，我們可以描繪出CGRP胜肽免疫原結構的最佳設計。
總之，如上所示之CGRP胜肽免疫原結構在其個別功能特性的相對排名對於在後續CGRP疫苗製劑中的使用具有價值以證明功能性功效。
實施例8. 作為CGRP疫苗概念驗證研究在BALB/C小鼠辣椒素誘導的皮膚血流模型以預防性模式對代表性小鼠CGRP胜肽免疫原結構進行評估 a.試驗理論基礎
降鈣素基因相關胜肽(CGRP)是37個胺基酸的胜肽，在中樞和周圍神經系統中廣泛表現。它主要與緊鄰血管的小的無髓鞘感覺神經元有關。CGRP是有效的血管擴張劑，且局部投予CGRP會導致血液流量短暫增加。CGRP還與疼痛傳播、疼痛調節和神經性炎症有關。利用辣椒素透過瞬態受體電位陽離子通道的活化可使CGRP從感覺神經元釋放。
雷射都卜勒成像儀(LDI)已用於檢測皮膚血流的結果變化，此變化已證明主要是由CGRP所引起。如同在多種疼痛模型中於CGRP敲除小鼠的減弱反應所證明CGRP也與炎症性疼痛相關。這種在疼痛感知中的作用與在感覺神經元中CGRP的表現是一致的。
在哺乳類動物的血漿中，CGRP的半衰期約為10分鐘。在人類三叉神經節中，CGRP免疫反應性神經元占所有神經元的50%(Tajti,et al.,1999)。透過使用抗CGRP疫苗接種方法靶向CGRP以治療偏頭痛可滿足未被滿足的醫療需求，其具有長期CGRP阻斷的潛力在長的持續時間中具有經濟效益地以預防模式治療偏頭痛。
設計此研究以在Balb/C小鼠模型中測試人類CGRP胜肽免疫原結構對應物之代表性對應物的鼠CGRP胜肽免疫原結構，其在實施例7中鑑定為具有減少辣椒素誘導的皮膚血流的能力，此模型作為概念驗證研究以說明抗CGRP疫苗治療偏頭痛的功效。
b.試驗設計 代表性試驗項目：
以下列出本試驗中使用的CGRP胜肽免疫原結構疫苗製劑：
第1組：(SEQ ID NO：123)p4799kb：以ISA51和CpG3配製的UBITh®1-AA11-37(人類αCGRP)
第2組：(SEQ ID NO：141)p5154kb：以ISA51和CpG3配製的UBITh®3-AA11-37(人類αCGRP)
第3組：(SEQ ID NO：151)p5155kb：以ISA51和CpG3配製的UBITh®3-AA11-37(大鼠/小鼠αCGRP)
第4組：(SEQ ID NO：123)p4799kb：以ADJUPHOS和CpG3配製的UBITh®1-AA11-37(人類αCGRP)
第5組：(SEQ ID NO：131)p5144kb：以ISA51和CpG3配製的UBITh®1-AA11-25(人類αCGRP)
對照物質：
第6組：ISA51和CpG3
第7組：ADJUPHOS和CpG3
第8組：生理食鹽水
組別和劑量：
分組執行如下：
個體識別：
利用苦味酸(picric acid)記號識別受試動物。
組識別：
正確標記鼠籠以進行識別，標記包括試驗名稱、IACUC編號、給藥途徑、觀察期間、籠號、每籠動物數量、種類、品系、性別、入室日期、入室週齡，動物編號、飼育人和代理人。
給藥途徑和注射部位：
在辣椒素誘發(challenge)前於0、3、6、9、12wpi對雌性Balb/C小鼠(n=6隻/組)注射5次，其是在一注射部位(後肢股四頭肌)利用待測疫苗(40μg/0.1ml/劑)或對照品(0.1ml/劑)進行肌肉注射(IM)。
處理程序：
在處理過程中於0、3、6、9和12wpi總共注射5次對照品或試驗項目。
生物樣品的收集和製備：
在室溫下靜置至少30分鐘至最多60分鐘的時間將血液凝結在試管中，以分離血清與血凝塊。透過使用冷凍離心機以1,000 x g離心10分鐘以移除血凝塊。立即將血清轉移到無菌的1.5mL微量離心管(聚丙烯管)中。在處理期間，將所有樣品保持在濕冰上。未使用的血清樣品在-80℃下冷凍保存。
雷射都卜勒成像儀(LDI)：
在實驗當天，將小鼠的後背剃毛，並將小鼠置於位於LDI儀器下方的加熱墊上。利用25mg/kg的舒泰(Zoletil)誘導麻醉，並在掃描前將動物在麻醉下穩定約20分鐘。以兩次基線掃描作為開始之後是掃描系列。
將2μL辣椒素溶液(將50mg辣椒素配製於溶液中，此溶液含有83.4μL EtOH、55.6μL Tween 20和27.8μL純水，其以3：2：1比例配製)塗在置於動物後背之兩個O形圈中的每一個上。每2.5分鐘掃描一次，繼續掃描10分鐘。使用moorVMS-LDF軟體分析感興趣區域的數據。利用Excel工作表計算在每個時間點來自感興趣區域的訊號的平均值。數據報告為始於基線之變化的百分比。
抗體效價的免疫學分析：
收集血清或CSF樣品，並使用全長人類CGRP進行抗原塗覆透過如實施例2所示製備的ELISA試劑盒測量抗CGRP抗體效價。將血清樣品從起始稀釋濃度1：1000進行3倍連續稀釋。利用自動微量盤讀取儀偵測吸光值A450以測定抗體ELISA效價，以Log10表示。
c.試驗結果 注射部位反應：
免疫程序有時會導致注射部位出現輕微且暫時性的腫脹。
來自接受免疫接種之小鼠免疫血清的抗體效價：
代表性的ELISA結果顯示，來自小鼠對應物的胜肽免疫原結構(例如SEQ ID NO：151)和兩個CGRP胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：123和141)不僅誘導針對其個別B細胞抗原決定位胜肽(SEQ ID NOs：15和9)的高免疫原性效價，也發現來自這兩種免疫血清的抗體針對其同源全長人類CGRP具有中等交叉反應性，如第7圖所示。此研究表明，兩種代表性CGRP胜肽免疫原能夠誘導對人類CGRP B細胞抗原決定位胜肽與其小 鼠對應物胜肽具有交叉反應性的特定抗體。在此POC動物試驗中，小鼠/大鼠CGRP B細胞抗原決定位胜肽免疫原結構對應物使用UBITh®3(比UBITh®1更有效的組合Th胜肽庫)作為T輔助細胞胜肽以進一步增強所選結構在小鼠中的免疫原性(例如SEQ ID NO：132、134、136、138、140、141和151)以及連接子(例如SEQ ID NO：72)。
LDI結果：
用於皮膚血流測量的辣椒素模型在動物和人類中都是體內藥效動力學模型。它是非侵入性的，技術上並不復雜，並且給出了快速且客觀的結果變數。此模型可被重複測試，且測量結果具有足夠的再現性。因此，此模型為CGRP阻斷療法的臨床評估提供理想的評估方法。就像所有其他生物標誌物模型一樣，此模型也有其侷限性。辣椒素模型仍然是所欲研究項目之自然發生的病理生理過程的模擬。藥物或疫苗誘導的抗體對辣椒素誘導的皮膚血流的影響可能會提供抗CGRP活性的趨勢，這表明它們抑制外周皮膚血流的功效。
如第8圖所示，當與生理食鹽水或各種單獨佐劑製劑的對照品相比時，配製於含有CpG之ADJUPHOS和ISA51製劑中具有SEQ ID NOs：123、131、141和151的CGRP胜肽免疫原結構均形成胜肽/CpG複合物，其在接受三次免疫接種後在接受疫苗接種的小鼠中引起顯著且具特異性的抗CGRP抗體效價(Log10從4到6)。動物在8wpi、12wpi和14wpi進行測量，分別顯示出對辣椒素誘導的皮膚微血管血流的抑制(第8圖)。在所測量的時間內，這種抑制作用的持續時間持續14週。儘管在於免疫原性研究中之所選抗體製劑的效價或其針對個別抗體之cAMP抑制功效在體外分析測量中的相對應IC50s值中發現差異，但三種代表性CGRP胜肽免疫原結構(例如SEQ ID NOs：123、131和141)及其製劑在於這些接受免疫接 種的小鼠中具有相似的能力去減少辣椒素誘導的皮膚血流，此表明使用這些CGRP胜肽免疫原結構治療偏頭痛的功效。
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*利用畫有底線的半胱胺酸之半胱胺酸雙硫鍵使胜肽環化。
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Figure 108148534-A0305-02-0079-15
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Figure 108148534-A0305-02-0081-16
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Claims (14)

  1. 一種CGRP胜肽免疫原結構，其具有約30個或更多個的胺基酸，以以下分子式表示：(Th)m-(A)n-(CGRP功能性B細胞抗原決定位胜肽)-X或(CGRP功能性B細胞抗原決定位胜肽)-(A)n-(Th)m-X或(Th)m-(A)n-(CGRP功能性B細胞抗原決定位胜肽)-(A)n-(Th)m-X其中Th為一異源性T輔助細胞抗原決定位；A為一異源性間隔子；(CGRP功能性B細胞抗原決定位胜肽)為具有衍生自CGRP受體結合或活化區域的7至約30個胺基酸殘基的一B細胞抗原決定位胜肽，其中該CGRP受體結合或活化區域係選自由SEQ ID NOs：4-13和15-24組成之群組；X為一胺基酸的一α-COOH或α-CONH2；m為1至約4；以及n為0至約10。
  2. 如請求項1所述之CGRP胜肽免疫原結構，其中該異源性T輔助細胞抗原決定位係選自由SEQ ID NOs：74-115組成之群組。
  3. 如請求項1所述之CGRP胜肽免疫原結構，其中該胜肽免疫原結構係選自由SEQ ID NOs：120-127和130-180組成之群組。
  4. 一種CGRP胜肽免疫原結構，包含： a.一B細胞抗原決定位，其包含來自該CGRP序列SEQ ID NOs：1至3的約7至約30個的胺基酸殘基，其中該B細胞抗原決定位係選自由SEQ ID NOs：4-13和15-24組成之群組；b.一T輔助細胞抗原決定位，其包含選自由SEQ ID NOs：74-115及其任意組合組成之群組的一胺基酸序列；以及c.一任選的異源性間隔子，其係選自由一胺基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：72)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO：73)和Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO：71)及其任意組合組成之群組，其中該B細胞抗原決定位係直接或透過該任選的異源性間隔子共價連接至該T輔助細胞抗原決定位。
  5. 如請求項4所述之CGRP胜肽免疫原結構，其中該T輔助細胞抗原決定位係選自由SEQ ID NOs：68、71、74-82、87、89-92、95及其任意組合組成之群組。
  6. 如請求項4所述之CGRP胜肽免疫原結構，其中該任選的異源性間隔子為(α,ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：72)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO：73)或Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO：71)，其中Xaa為任意胺基酸。
  7. 如請求項4所述之CGRP胜肽免疫原結構，其中該T輔助細胞抗原決定位係共價連接至該B細胞抗原決定位的胺基端。
  8. 如請求項4所述之CGRP胜肽免疫原結構，其中該T輔助細胞抗原決定位係透過該任選的異源性間隔子共價連接至該B細胞抗原決定位的胺基端。
  9. 一種組成物，其包含如請求項1所述之CGRP胜肽免疫原結構。
  10. 一種醫藥組成物，其包含： a.如請求項1所述之胜肽免疫原結構；以及b.一藥學上可接受的遞送載體及/或佐劑。
  11. 如請求項10所述之醫藥組成物，其中a.該CGRP功能性B細胞抗原決定位胜肽係選自由SEQ ID NOs：4-13和15-24組成之群組；b.該異源性T輔助細胞抗原決定位係選自由SEQ ID NOs：74-115組成之群組，以及c.該異源性間隔子係選自由一胺基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：72)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO：73)和Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO：71)及其任意組合組成之群組；以及其中該CGRP胜肽免疫原結構與一CpG寡去氧核苷酸(ODN)混合以形成一穩定化的免疫刺激複合物。
  12. 如請求項10所述之醫藥組成物，其中a.該CGRP胜肽免疫原結構係選自由SEQ ID NOs：120-127和130-180組成之群組；以及其中該CGRP胜肽免疫原結構與一CpG寡去氧核苷酸(ODN)混合以形成一穩定化的免疫刺激複合物。
  13. 一種如請求項1所述之CGRP胜肽免疫原結構用於製備在一動物中產生針對CGRP之抗體的醫藥組成物的用途。
  14. 一種如請求項1所述之CGRP胜肽免疫原結構用於製備在一動物中預防及/或治療偏頭痛的醫藥組成物的用途。
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