JP2023519104A - 凝集膵島アミロイドポリペプチド（ｉａｐｐ）と関連する障害を予防及び治療するための、ｉａｐｐを標的とするペプチド免疫原 - Google Patents

Abstract

本開示は、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）の一部を標的とするペプチド免疫原コンストラクト、コンストラクトを含む組成物、コンストラクトによって誘導される抗体、ならびにコンストラクト及びその組成物の調製方法及び使用方法を対象とする。本開示のペプチド免疫原コンストラクトは、約３０個超のアミノ酸を有すると共に、（ａ）全長ＩＡＰＰタンパク質のＩＡＰＰ易凝集性領域に由来する約６つ超の連続アミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープ、（ｂ）異種Ｔｈエピトープ、及び（ｃ）任意選択の異種スペーサーを含む。本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、凝集ＩＡＰＰと関連する障害を予防及び／または治療するための、ＩＡＰＰに指向化された高度に特異的な抗体の生成を刺激する。【選択図】図１Ａ

Description

本出願は、2020年2月11日出願の米国仮出願第62/972,760号の利益を主張するＰＣＴ国際出願であり、当該米国仮出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示は、凝集膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）と関連する障害（臨床的膵島移植後の膵島拒絶反応に起因する１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を有する患者、及び２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）を有する患者を含む）を予防及び／または治療するための、ＩＡＰＰを標的とするペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤に関する。

タンパク質の蓄積、修飾、及び凝集は、多数の代謝疾患の病理学的側面であり、こうした代謝疾患には、よく知られる神経変性疾患（ハンチントン病、アルツハイマー病（ＡＤ）、及びパーキンソン病（ＰＤ）など）ならびに非神経代謝疾患（１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）（臨床的膵島移植後の膵島拒絶反応に起因する）及び２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）など）が含まれる。

膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰまたはアミリン）は、膵臓においてβ細胞によってインスリンと共に分泌され、Ｔ２Ｄ患者の膵島（ランゲルハンス島とも呼ばれる）において線維状凝集体を形成する生理学的ペプチドであり、疾患の発症において役割を果たすことが示唆されている。ＩＡＰＰ凝集体は、単離膵島の移植時に１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）患者においても膵島中に見られている。

膵島は、その６５％～８０％がβ細胞から構成され、このβ細胞は、血糖値及び細胞代謝の制御に必要不可欠なインスリン及びＩＡＰＰを産生及び分泌する。

ヒトＩＡＰＰは、プレプロホルモンであるＰｒｅＰｒｏＩＡＰＰ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ３５９８３．１）（配列番号１）がプロセシングを受けて生じるペプチドホルモンである。ＰｒｅＰｒｏＩＡＰＰは、膵臓β細胞において産生されるアミノ酸数８９の前駆体であり、この前駆体は翻訳後に急速に切断されてＰｒｏＩＡＰＰ（アミノ酸数６７のペプチド）（配列番号２）となる。ＰｒｏＩＡＰＰは、さらにタンパク質分解及び翻訳後修飾を受けてＩＡＰＰ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号５ＭＧＱ＿Ａ）（配列番号３）となる（図１Ａ）。ＩＡＰＰは、３７個のアミノ酸からなり、２番目のシステイン残基と７番目のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を有し、そのＣ末端はアミド化されている（図１Ｂ）。ＩＡＰＰの配列は、多くの生物の間で高度に保存されている（図１Ｃ）。

Hayden, M. R., et al., 2001及びHay, D. L., et al., 2015に記載されているように、ヒトＩＡＰＰ（ｈＩＡＰＰ）の発現はインスリンと共に制御される。インスリンの産生が増加するとｈＩＡＰＰのレベルが上昇する。ｈＩＡＰＰは膵臓β細胞から放出されて血液循環に入り、胃内容排出及び満腹制御を介してインスリンとの相乗効果で血糖制御に関与する。ｈＩＡＰＰは生理学的条件の下では細胞代謝の制御因子として働くものの、ｈＩＡＰＰは凝集し、β細胞障害、β細胞死、及びβ細胞量の減少と関連するアミロイド線維を形成する（ＩＡＰＰアミロイドーシス）。

Grimmによる米国特許第9,475,866号の背景技術セクションに記載されているように、ｈＩＡＰＰアミロイドーシスがＴ２Ｄ病態形成の主要要因であることを示す証拠がいくつか存在する：
ａ．２型糖尿病患者の９０％超においてｈＩＡＰＰ線維の沈着が見られる。
ｂ．ｈＩＡＰＰ凝集はβ細胞に有害であり、インスリン産生β細胞の減少と相関する。
ｃ．ｈＩＡＰＰを発現するトランスジェニックマウスモデルでは膵島アミロイド沈着が見られ、Ｔ２Ｄが自発的に生じる。そうしたトランスジェニックマウスモデルでは、β細胞の機能障害、β細胞量の欠乏、及びβ細胞の消失（Ｔ２Ｄ患者由来の組織で観察されたものと酷似している）を伴ってヒト疾患が再現され、このことは、この疾患の発症にヒトＩＡＰＰが寄与することの証拠を与えるものである。
ｄ．ｈＩＡＰＰ凝集を妨害する治療を行うと、糖尿病表現型が改善し、動物の寿命が延びた。
ｅ．ｈＩＡＰＰ凝集及びアミロイドーシスは、β細胞への毒性の必要要件である。非アミロイド形成性のげっ歯類ＩＡＰＰ（ｒＩＡＰＰ）はアミノ酸置換が６つ存在する結果として線維形成が不可能なものであり、β細胞に毒性を示さない。
ｆ．疾患の発症においては、ヒト膵島に見られる病理学的ｈＩＡＰＰ凝集によって、β細胞の機能障害、及びインスリン分泌の障害と関連する死が引き起こされ得る。正常血糖値を維持するためにインスリン分泌及びアミリン分泌を伴ってβ細胞量が代償性に増加することが、毒性ｈＩＡＰＰオリゴマーの形成及びｈＩＡＰＰ線維の沈着を招く方向に働き得る。
ｇ．初期のｈＩＡＰＰオリゴマーは主要な細胞毒性種と見なされる一方で、ｈＩＡＰＰ線維最終産物はβ細胞の消失においても役割を果たし得る。ｈＩＡＰＰ線維は、ドナーから単離された膵島でも観察されており、１型糖尿病を有する個体に臨床的に膵島を移植した後のβ細胞の消失と関連している。

Ｔ２ＤにおいてｈＩＡＰＰ凝集及びアミロイドーシスを引き起こす正確な機構は不明である。Ｔ２Ｄでのインスリン抵抗性はインスリン分泌需要を増加させ、この需要増加には細胞内ｐｒｏＩＡＰＰ量の増加及びｈＩＡＰＰの放出が伴い、これらによってアミロイドーシスが引き起こされる。別の提唱機構は、インスリン抵抗性の状況においてはタンパク質分解がうまくいかないことによって、Ｎ末端がプロセシングされていないｐｒｏＩＡＰＰの蓄積及び凝集が生じるというものである。したがって、ｐｒｏＩＡＰＰもまた、適切な治療標的であり、Ｔ２Ｄを発症しやすい患者を診断するための潜在的バイオマーカーであると見なされる。Brender, J. R., et al., 2008によって行われた以前の研究では、ＩＡＰＰペプチドと膜との相互作用に主に関与する領域は、アミロイド形成領域（ａａ２０～２９）ではなく、Ｎ末端領域（ａａ１～１９）であることが示されている。低濃度のｈＩＡＰＰ_１－１９断片は全長ペプチドとほぼ同程度に膜破壊を誘導する。全長ペプチドと同様に、ｈＩＡＰＰ_１－１９は溶液中でランダムコイル構造を示し、脂質膜に結合するとαヘリックス構造をとる。しかしながら、全長ペプチドとは異なり、ｈＩＡＰＰ_１－１９断片はアミロイド線維を形成しない。したがって、膜破壊はＩＡＰＰのアミロイド形成とは独立して生じ得るものであり、アミロイド形成に関与する配列と膜破壊に関与する配列とはペプチド中で異なる領域に位置する。

コンセンサス凝集傾向予測を利用する配列解析から、ＩＡＰＰのａａ８～１７セグメント及びａａ２０～２９セグメントが最も高い予測アミロイド形成能力を有することが確認された（Louros, N. N., et al., 2017）。したがって、ａａ８～１７セグメント及びａａ２０～２９セグメントの疎水性ポテンシャル及びアミロイド形成特性を低減することを狙った変異が導入された。ａａ８～１７セグメントに大幅な改変を加えてもＩＡＰＰ凝集を抑制することは不可能であり、このことは、ＩＡＰＰ凝集を制御するセグメントはａａ８～１７セグメントのみではないという仮説を裏付けている。しかしながら、荷電残基を存在させるとＩＡＰＰ線維の形成速度が３分の１に低下することから、このセグメントの疎水性性質がアミロイド線維コアの形成に関与していることはほぼ確実である。

糖尿病は、Ｔ１Ｄ、Ｔ２Ｄ、及び妊娠糖尿病を含む代謝疾患の一群である。Ｔ２Ｄは、成人発症糖尿病、肥満関連糖尿病、及びインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）とも呼ばれており、Ｔ２Ｄは、最も一般的な形態の糖尿病であり、すべての症例の約９０％を占める。Ｔ２Ｄは、機能性のインスリン産生β細胞の数が減少することによって特徴付けられる。Ｔ２Ｄの臨床的特徴は、高血糖値、ならびにインスリン抵抗性及び／またはインスリン欠乏である。Ｔ２Ｄは、病状の進行に伴って長期合併症を引き起こし得る。こうした合併症は、循環器疾患、失明に繋がる糖尿病性網膜症、腎不全、感染頻度の上昇、及び平均余命の短期化を招く血行不良が原因の切断などである。この疾患の罹患人数は世界で３億人を超えており、結果として、この疾患による死者数は毎年１００万人を超える。遺伝的決定因子及び環境因子の両方がこの疾患の発症を引き起こし、肥満、運動不足、及び加齢が主な原因である。

Ｔ２Ｄの現在の治療には、生活様式の管理（食事療法及び運動）、ならびに膵臓を刺激してインスリンを放出させるか、またはインスリン応答を増加させることによって血糖値を低下させるための薬理学的介入（メトホルミン及びインスリン供給など）が含まれる。こうした治療は症状の改善に基づくものであるが、持続性に欠けるものである。

グルカゴン－ペプチド１（ＧＬＰ－１）の類似体、及びＧＬＰ－１不活化酵素ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＤＰ４）の阻害剤を使用する新たな治療方針は、ＧＬＰ－１の強力なインスリン分泌促進作用及びそのβ細胞増殖増強作用に基づいている。こうした治療方針は、インスリン及びＩＡＰＰの放出を増加させるものであり、動物モデルにおいて膵島アミロイドーシスの発症を促進することが示されている。こうした新たな治療は、膵島アミロイドーシスの悪化を招く可能性があるものであり、ｈＩＡＰＰの凝集及び膵臓β細胞の消失を低減することが示されている利用可能な治療は存在しない。

自然免疫系を活性化するインフラマソーム－ＩＬ－１系を、ｈＩＡＰＰ、特に凝集線維が特異的に誘導するという知見が得られていることから、より最近の方針では、ＩＬ－１経路を標的とする抗炎症剤または抗体の開発が行われている。

治療法に関する先行研究では、ｈＩＡＰＰを標的とする能動的または受動的な免疫療法手法（具体的には、凝集ｈＩＡＰＰ（オリゴマー及び線維を含む）を標的とするもの）と関連する潜在的利益に光が当てられており、こうした免疫療法手法では、ｈＩＡＰＰを標的とすることで、凝集ＩＡＰＰと関連する障害を治療するための効果的かつ安全な治療法となるように、望ましくない形での自然免疫系の活性化が低減及び抑制される。

ヒト免疫系による最適化及び親和性成熟を経た抗体を使用する受動免疫法は、優れた効力及び安全性が得られる確率が高い有望かつ新たな治療手段となり得る。そのようなモノクローナル抗ＩＡＰＰ抗体は、凝集ＩＡＰＰと関連する障害の免疫療法において有効であることが明らかではあり得るが、そうしたモノクローナル抗ＩＡＰＰ抗体は高価であり、血清中及び体液中のオリゴマーＩＡＰＰまたは凝集ＩＡＰＰのレベルの十分な抑制を維持して、そこから臨床的な利益が得られるようになるには高頻度の投与が避けらないものである。

対照的に、能動免疫化方針（ワクチン接種手法を介するもの）は、オリゴマーＩＡＰＰまたは凝集ＩＡＰＰを標的とするコスト効率の高い部位特異的な免疫療法治療となることが想定され、この免疫療法治療は安全かつ忍容性が高いことが想定される。そのような能動免疫化方針は、凝集ＩＡＰＰと関連する障害に対する介入及び開発として、依然として刺激的かつ新しいものである。

ハプテンペプチド／担体タンパク質免疫原を調製するための従来の化学的複合体化法には不都合及び欠陥がいくつか伴うことから、部位特異的ワクチンの開発は困難を強いられている。一般に、そのような調製方法は、コストがかかる医薬品グレードのＫＬＨまたはトキソイドタンパク質をヘルパーＴ細胞担体タンパク質として使用して複雑な化学的カップリング手順を経るものであり、そこから誘導される抗体のほとんどが、担体タンパク質に対して指向化されたものであり、標的とするＢ細胞エピトープ（複数可）に対して指向化されたものではない。

モノクローナル抗体治療及び従来のペプチド／担体タンパク質ワクチン調製と関連する上述の制限を踏まえると、ＩＡＰＰ上の特定部位（複数可）に対する高度に特異的な抗体応答を誘発する能力を有する有効な免疫療法組成物を開発することに対するアンメットニーズが明確に存在しており、こうした高度に特異的な抗体応答を誘発することで、（１）ｈＩＡＰＰの凝集が低減され、（２）オリゴマーＩＡＰＰまたは凝集ＩＡＰＰへの選択的な結合が生じ、結果的にそれ除去が除去され、（３）凝集ＩＡＰＰによる毒性死滅から膵臓β細胞が保護される。そのような免疫療法ペプチド免疫原組成物及びそのワクチン製剤が存在すれば、患者への投与が容易になり、大スケールでの製造が可能になることで、Ｔ１Ｄ患者及びＴ２Ｄ患者を含めて、凝集ＩＡＰＰと関連する障害に罹患している患者を、コストを抑制しつつ世界的に治療することが容易になると想定される。

上記の背景技術セクション中で述べた事は、３つの総説及びそこで引用される追加の参考文献によって裏付けられており、これらの総説及び参考文献は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。１つ目の記事（Wikipedia：アミリン）はＩＡＰＰに関する最新の総説を含んでおり、２つ目（Akter, R., et al., 2016）ではＩＡＰＰの構造、機能、及び病態生理学について記載されており、３つ目（Grimmによる米国特許第9,475,866号）では、ＩＡＰＰ関連障害の受動免疫療法にモノクローナル抗体を使用する可能性について論じられている。

参考文献：
1． AKTER, R., et al., “Islet Amyloid Polypeptide: Structure, Function, and Pathophysiology.” J. Diabetes Res., 2016:2798269, 18 pages (2016)
2. BOWER, R.L., et al., “Amylin structure-function relationships and receptor pharmacology: implications for amylin mimetic drug development.” British Journal of Pharmacology, 173(12):1883-1898 (2016)
3. BRENDER, J.R., et al., “Amyloid fiber formation and membrane disruption are separate processes localized in two distinct regions of IAPP, the type-2-diabetes-related peptide.” J. Am. Chem. Soc., 130(20):6424-9 (2008)
4. CAO, P., et al., “Aggregation of islet amyloid polypeptide: from physical chemistry to cell biology.” Curr. Opin. Struct. Biol. 23(1):82-89 (2013)
5. CHANG, J.C.C., et al., “Adjuvant activity of incomplete Freund’s adjuvant.” Advanced Drug Delivery Reviews, 32(3):173-186 (1998)
6. FIELDS, G.B., et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User’s Guide, ed. Grant, W.H. Freeman & Co., New York, NY, p.77 (1992)
7. GRIMM, J., et al., “Human islet amyloid polypeptide (hIAPP) specific antibodies and uses thereof.” US Patent No. 9,475,866 B2 (2016-10-25)
8. HAY, D.L., et al., “Amylin: Pharmacology, Physiology, and Clinical Potential.” Pharmacol. Rev., 67(3):564-600 (2015)
9. HAYDEN, M.R., et al., “‘A’ is for Amylin and Amyloid in Type 2 Diabetes Mellitus.” JOP. J. Pancreas (Online), 2(4):124-139 (2001)
10. LOUROS, N.N., et al., “Tracking the amyloidogenic core of IAPP amyloid fibrils: Insights from micro-Raman spectroscopy.” Journal of Structural Biology. 199(2):140-152 (2017)
11. TRAGGIAI, E., et al., “An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus”, Nature Medicine, 10:871-875 (2004).
12. WIKIPEDIA, The Free Encyclopedia, “Amylin”, available at website: en.wikipedia.org/wiki/Amylin)で入手可能 (アクセス日：2020年1月13日)
13. VAN NEST, G., et al.によるWO 1990/014837, “Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion.” (1990-12-13)

本開示は、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）のうちで、Ｂ細胞エピトープとして使用し得る部分を対象とする。本開示は、ＩＡＰＰ由来のＢ細胞エピトープを含むデザイナーペプチド免疫原コンストラクト、ペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物、ペプチド免疫原コンストラクトの調製方法及び使用方法、ならびにペプチド免疫原コンストラクトによって生成される抗体も対象とする。

本開示の一態様は、さまざまな生物に由来するＩＡＰＰの異なる部分に由来するＢ細胞エピトープを対象とする。本開示のＢ細胞エピトープは、ヒトに由来するＩＡＰＰもしくはｐｒｏＩＡＰＰ（配列番号１もしくは配列番号２）または他の生物に由来するＩＡＰＰもしくはｐｒｏＩＡＰＰ（例えば、配列番号３～７及び配列番号１８６～１９２）に由来する約６～約２８個のアミノ酸を有する。ある特定の実施形態では、Ｂ細胞エピトープペプチドは、配列番号８～６９（表１に示す）から選択されるアミノ酸配列を有する。Ｂ細胞エピトープペプチドは、ＩＡＰＰペプチドと膜との相互作用に関与するＮ末端領域に由来するもの（例えば、配列番号８～１４）、ＩＡＰＰの中央領域に由来するもの（例えば、配列番号１４～２１）、またはＩＡＰＰのＣ末端領域に由来するもの（例えば、配列番号２２～２６）であり得る。

ＩＡＰＰまたはｐｒｏＩＡＰＰに由来する本開示のＢ細胞エピトープペプチドは、任意選択の異種スペーサーを介して異種ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープペプチドと連結されてペプチド免疫原コンストラクトを形成し得る。ある特定の実施形態では、異種スペーサーは、２つのアミノ酸及び／またはペプチドを連結して一緒にする能力を有する任意の分子または化学構造であり、こうした分子または化学構造には、化合物、天然起源のアミノ酸、非天然起源アミノ酸、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。異種Ｔｈエピトープは、Ｂ細胞エピトープに対する免疫応答を増強する能力を有する任意のＴｈエピトープであり得る。ある特定の実施形態では、Ｔｈエピトープは、病原体タンパク質由来のものであり、配列番号７３～１１２及び配列番号１７１～１８２のアミノ酸配列（表２に示す）を有する。

本開示のペプチド免疫原コンストラクトは、任意選択の異種スペーサーを介して異種ＴｈエピトープとＮ末端またはＣ末端のいずれかで共有結合で連結されたＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドを含む。本開示のペプチド免疫原コンストラクトは、Ｂ細胞エピトープ及びＴｈエピトープを含み、その総アミノ酸数は２０以上である。ある特定の実施形態では、ペプチド免疫原コンストラクトは、配列番号１１３～１６７のアミノ酸配列（表３に示す）を有する。

本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、設計されたＢ細胞エピトープペプチド及びＴｈエピトープペプチドの両方を含み、これらのエピトープペプチドは、一緒に働くことで、ＩＡＰＰ機能性部位（ＩＡＰＰペプチドと膜との相互作用に関与するＮ末端領域、及び易凝集性領域を含む）に対して指向化された高度に特異的な抗体の生成を刺激し、こうした抗体は、ヒト及び他の生物に見られる全長ＩＡＰＰ配列（例えば、配列番号３～７）のオリゴマーまたは凝集体と交差反応する。本開示のペプチド免疫原コンストラクトから生成される抗体は、ＩＡＰＰ凝集と関連する障害に罹患しやすいまたは罹患している患者に治療的免疫応答を与える能力を有する。

本開示の別の態様は、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含むペプチド組成物（医薬組成物を含む）を対象とする。組成物は、１つ以上のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト、医薬的に許容可能な送達担体、アジュバントを含み得、及び／またはＣｐＧオリゴマーを使用して安定化された免疫刺激性複合体へと製剤化され得る。ある特定の実施形態では、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの混合物は、異なる病原体に由来する異種Ｔｈエピトープを含み、これらの異種Ｔｈエピトープを使用することで、患者の幅広い遺伝的背景をカバーして、ＩＡＰＰ介在性障害（Ｔ１Ｄ及びＴ２Ｄを含む）を有する患者の予防及び／または治療のための免疫化時にレスポンダー率のパーセントを高めることが可能になり得る。

本開示は、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトに対する抗体も対象とする。具体的には、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、全長ＩＡＰＰ分子と交差反応する高度に特異的な機能性抗体の生成を刺激することができる。本開示の抗体は、高い特異性を伴ってＩＡＰＰに結合するものであり、免疫原性増強に用いられる異種Ｔｈエピトープに指向化されたものは、仮に伴うとしても多くはなく、このことは、そのようなペプチド免疫原増強に使用される従来のＫＬＨもしくはトキソイドタンパク質または他の生物学的担体を使用して生成される抗体とは際立って対照的である。したがって、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、自己ＩＡＰＰに対する免疫寛容を打ち破る能力を有し、他のペプチド免疫原またはタンパク質免疫原と比較して、得られるレスポンダー率が高い。ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトによって誘導される本開示の抗体は、その特有の特徴及び特性に基づいて、ＩＡＰＰ介在性障害（Ｔ１Ｄ及びＴ２Ｄを含む）に罹患している患者を治療するための予防的免疫療法手法を提供する能力を有する。

いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ＩＡＰＰペプチドと膜との相互作用に関与するＮ末端領域（例えば、配列番号８～１４）、ＩＡＰＰの中央領域（例えば、配列番号１４～２１）、またはＩＡＰＰのＣ末端領域（例えば、配列番号２２～２６）に対して指向化される。ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトによって誘導される高度に特異的な抗体は、（１）オリゴマーまたは線維へのＩＡＰＰの凝集を抑制し、（２）凝集ＩＡＰＰがβ細胞に細胞毒性を及ぼすことから保護し、それによって、ＩＡＰＰ凝集と関連する障害（Ｔ１Ｄ及びＴ２Ｄを含む）に罹患している患者が有効に治療され得る。

別の態様では、本発明は、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物が投与される患者によって誘導される、オリゴマーＩＡＰＰまたは凝集ＩＡＰＰに対するヒトモノクローナル抗体を提供する。ヒト患者の血液から単離されたＢ細胞からのヒトモノクローナル抗体の調製に有効な方法については、Traggiai, E., et al, 2004によって説明されており、当該文献は参照によって組み込まれる。

本開示は、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト、組成物、及び抗体の調製方法及び使用方法も対象とする。本開示の方法は、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト、及びコンストラクトを含む組成物の低コスト製造及び品質管理を提供する。本開示の方法は、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト、及び／またはＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトから誘導される抗体を使用して、ＩＡＰＰ介在性障害（Ｔ１Ｄ及びＴ２Ｄを含む）に罹患しやすいまたは罹患している対象の予防及び／または治療を行うことも対象とする。本開示の方法は、ＩＡＰＰ介在性障害（Ｔ１Ｄ及びＴ２Ｄを含む）を予防及び／または治療するためにＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを投与するための投薬レジメン、剤形、及び経路も含む。

図１Ａ～図１Ｃは、ヒトＰｒｅＰｒｏＩＡＰＰのアミノ酸配列、ヒトＰｒｏＩＡＰＰのアミノ酸配列、ならびにヒト及び他の生物に由来するＩＡＰＰのアミノ酸配列を示す。図１Ａは、ＩＡＰＰ（アミリン）のヒト配列（配列番号３）ならびにその前駆体であるＰｒｅＰｒｏＩＡＰＰ及びＰｒｏＩＡＰＰのヒト配列（それぞれ配列番号１及び配列番号２）を示す。 図１Ｂは、ＩＡＰＰの一般的な構造を示す。 図１Ｃは、ヒトＰｒｅＰｒｏＩＡＰＰのアミノ酸配列、ヒトＰｒｏＩＡＰＰのアミノ酸配列、ならびにヒト及び他の生物に由来するＩＡＰＰのアミノ酸配列を示す。ヒト、ネコ、マカク、ラット／マウス、モルモット、ヒヒ、クマ、ウシ、ブタ、イヌ、フェレット、及び金魚に由来するＩＡＰＰ配列の多重配列アライメントをＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（１．２．４）で行ったものを示す。アライメントの下部において、アスタリスク（^＊）は、単一の完全保存残基を有する位置を示し、コロン（：）は、強い類似特性を有する残基の間の保存を示し、ピリオド（．）は、弱い類似特性を有する残基の間の保存を示す。 図２は、凝集ＩＡＰＰと関連する障害を治療するための高精度デザイナーＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤の発見から商業化までの経路を示す。 図３は、免疫原性、インビトロ機能特性、及び動物でのインビボ効力の試験に使用したＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１１３～１３８）の設計を示す。 図４は、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１１３～１３８）の免疫原性試験から得られた結果を示し、この免疫原性試験では、ＩＡＰＰ分子のＮ末端領域、中央領域、及びＣ末端領域に由来するＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドを用いたモルモットから初回免疫化後経過週数（ＷＰＩ）が９の時点で得られた免疫血清を用いた。 図５は、対応するＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを用いた初回免疫化後経過週数（ＷＰＩ）が１２の時点で採取したモルモット免疫血清を用いたドットブロット結合アッセイによるＩＡＰＰモノマーへの結合プロファイルを示す。 図６は、対応するＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを用いた初回免疫化後経過週数（ＷＰＩ）が１２の時点で採取したモルモット免疫血清を用いたドットブロット結合アッセイによるＩＡＰＰオリゴマーへの結合プロファイルを示す。 図７は、対応するＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを用いた初回免疫化後経過週数（ＷＰＩ）が１２の時点で採取したモルモット免疫血清を用いたドットブロット結合アッセイによるＩＡＰＰ線維への結合プロファイルを示す。 図８は、対応するＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを用いた初回免疫化後経過週数（ＷＰＩ）が１２の時点で採取したモルモット免疫血清から得られた抗ＩＡＰＰ抗体によるＩＡＰＰの凝集抑制を示す。チオフラビンＴ（ＴｈＴ）蛍光アッセイを実施することで、モノマーから線維への線維形成の抑制、またはオリゴマーから線維への線維形成の抑制を示した。 図９は、４０μＭの凝集ＩＡＰＰオリゴマーに曝露されたＲＩＮ－ｍ５Ｆｓ細胞の相対細胞生存率（上の棒グラフ）及び当該ＲＩＮ－ｍ５Ｆｓ細胞への細胞毒性の抑制率（下の棒グラフ）を示し、これらの細胞生存率及び抑制率は、対応するＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを用いた初回免疫化後経過週数（ＷＰＩ）が１２の時点で採取したモルモット免疫血清から得られた抗ＩＡＰＰ抗体によって得られたものである。ＰＢＳを対照として使用し、この場合、ＩＡＰＰ凝集体を細胞培養物に添加することはしておらず、したがって１００％の細胞生存率が得られた。プールした免疫前血清から得られた精製抗体調製物を陰性対照として使用し、この場合、細胞毒性が最大となった。各抗体調製物について細胞毒性抑制率（％）を計算し、表及び下の棒グラフに示した。 図１０は、ＩＩ型糖尿病（Ｔ２Ｄ）を有するｈＩＡＰＰ^＋／－トランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおける代表的なＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの予防効力評価のための実験プロトコールを示す。 図１１は、ＩＩ型糖尿病（Ｔ２Ｄ）を有するｈＩＡＰＰ^＋／－トランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおける代表的なＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの治療効力評価のための実験プロトコールを示す。

本開示は、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）及びｐｒｏＩＡＰＰのうちで、Ｂ細胞エピトープとして使用し得る部分を対象とする。本開示は、ＩＡＰＰ由来のＢ細胞エピトープを含むデザイナーペプチド免疫原コンストラクト、ペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物、ペプチド免疫原コンストラクトの調製方法及び使用方法、ならびにペプチド免疫原コンストラクトによって生成される抗体も対象とする。

本開示の一態様は、さまざまな生物に由来するＩＡＰＰの異なる部分に由来するＢ細胞エピトープを対象とする。本開示のＢ細胞エピトープは、ヒトに由来するＩＡＰＰ、ｐｒｅｐｒｏＩＡＰＰ、もしくはｐｒｏＩＡＰＰ（配列番号１～３）、または他の生物に由来するＩＡＰＰ、ｐｒｅｐｒｏＩＡＰＰ、もしくはｐｒｏＩＡＰＰ（例えば、配列番号４～７及び配列番号１８６～１９２）に由来する約６～約２８個のアミノ酸を有する。ある特定の実施形態では、Ｂ細胞エピトープペプチドは、配列番号８～６９（表１に示す）から選択されるアミノ酸配列を有する。Ｂ細胞エピトープペプチドは、ＩＡＰＰペプチドと膜との相互作用に関与するＮ末端領域に由来するもの（例えば、配列番号８～１４）、ＩＡＰＰの中央領域に由来するもの（例えば、配列番号１４～２１）、またはＩＡＰＰのＣ末端領域に由来するもの（例えば、配列番号２２～２６）であり得る。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エピトープペプチドは、ａａ８～１７にまたがるＩＡＰＰ易凝集性領域及びａａ２０～２９にまたがるＩＡＰＰ易凝集性領域に由来するもの（例えば、配列番号８～１０、配列番号１２～２５、及び配列番号４１～６３）である。

ＩＡＰＰまたはｐｒｏＩＡＰＰに由来する本開示のＢ細胞エピトープペプチドは、任意選択の異種スペーサーを介して異種ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープペプチドと連結されてペプチド免疫原コンストラクトを形成し得る。ある特定の実施形態では、異種スペーサーは、２つのアミノ酸及び／またはペプチドを連結して一緒にする能力を有する任意の分子または化学構造であり、こうした分子または化学構造には、化合物、天然起源のアミノ酸、非天然起源アミノ酸、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。異種Ｔｈエピトープは、Ｂ細胞エピトープに対する免疫応答を増強する能力を有する任意のＴｈエピトープであり得る。ある特定の実施形態では、Ｔｈエピトープは、病原体タンパク質由来のものであり、配列番号７３～１１２及び配列番号１７１～１８２のアミノ酸配列（表２に示す）を有する。

ある特定の実施形態では、ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドの免疫原性の増強に用いられる異種Ｔｈエピトープは、天然の病原体に由来するもの（ＥＢＶ ＢＰＬＦ１（配列番号１１１）、ＥＢＶ ＣＰ（配列番号１０８）、破傷風菌（Clostridium Tetani）（配列番号７３、配列番号７６、配列番号１０３、配列番号１０５～１０７）、コレラ毒素（配列番号８０）、及びマンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）（配列番号７９））、ならびに麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ１～５）及びＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ１～３）に由来する理想化された人工Ｔｈエピトープであり、これらの異種Ｔｈエピトープは、単一配列または組み合わせ配列（例えば、配列番号７４、配列番号８１～９８、及び配列番号１７１～１８２）のいずれかの形態のものである。

本開示のペプチド免疫原コンストラクトは、任意選択の異種スペーサーを介して異種ＴｈエピトープとＮ末端またはＣ末端のいずれかで共有結合で連結されたＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドを含む。本開示のペプチド免疫原コンストラクトは、Ｂ細胞エピトープ及びＴｈエピトープを含み、その総アミノ酸数は２０以上である。ある特定の実施形態では、ペプチド免疫原コンストラクトは、配列番号１１３～１６７のアミノ酸配列（表３に示す）を有する。

本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、設計されたＢ細胞エピトープペプチド及びＴｈエピトープペプチドの両方を含み、これらのエピトープペプチドは、一緒に働くことで、ＩＡＰＰ分子の中央領域～Ｃ末端領域に位置する易凝集性ＩＡＰＰ部位に対して指向化された高度に特異的な抗体の生成を刺激し、ＩＡＰＰ凝集と関連する障害に罹患しやすいまたは罹患している患者に治療的免疫応答を与える。

本開示の別の態様は、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含むペプチド組成物（医薬組成物を含む）を対象とする。組成物は、１つ以上のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト、医薬的に許容可能な送達担体、アジュバントを含み得、及び／またはＣｐＧオリゴマーを使用して安定化された免疫刺激性複合体へと製剤化され得る。ある特定の実施形態では、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの混合物は、異なる病原体に由来する異種Ｔｈエピトープを含み、これらの異種Ｔｈエピトープを使用することで、患者の幅広い遺伝的背景をカバーして、ＩＡＰＰ凝集と関連する障害を予防及び／または治療するための免疫化時にレスポンダー率のパーセントを高めることが可能になり得る。

本開示のペプチド組成物では、ＩＡＰＰ免疫原コンストラクトでの相乗的な増強が観察され得る。そのようなＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト含有組成物を投与することで得られた抗体応答は、そのほとんど（＞９０％）が、ＩＡＰＰ易凝集性のＩＡＰＰ部位（複数可）（配列番号８～６９）に対する全長ＩＡＰＰオリゴマーまたは全長ＩＡＰＰ凝集体との所望の交差反応性に集中しており、免疫原性増強に用いた異種Ｔｈエピトープに指向化されたものは、仮に伴うとしても多くはなかった。このことは、Ｂ細胞エピトープペプチドの免疫原性を増強するための従来の担体タンパク質（ＫＬＨ、トキソイド、または他の生物学的担体など）を使用する標準的な方法とは際立って対照的である。

本開示は、ＩＡＰＰ凝集と関連する障害を予防及び／または治療するための医薬組成物及び製剤も対象とする。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、安定化された免疫刺激性複合体（ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの混合物を含むペプチド組成物とＣｐＧオリゴマーとを混合することによって静電気的な結び付きを介して形成される）を含むことで、全長ＩＡＰＰ（例えば、配列番号３～７）のオリゴマーまたは凝集体との所望の交差反応性が得られるようにＩＡＰＰペプチドの免疫原性がさらに増強される。

他の実施形態では、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト含む医薬組成物またはコンストラクトの混合物を含む医薬組成物は、医薬的に許容可能な送達媒体もしくはアジュバント（無機塩（アラムゲル（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）もしくはリン酸アルミニウム（ＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ）を含む）など）と共に製剤化されて懸濁製剤を形成するか、またはアジュバントとしてのＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１もしくはＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ７２０と共に製剤化されて油中水型エマルションを形成し、こうした懸濁製剤または油中水型エマルションは、ＩＡＰＰ凝集と関連する障害の予防及び／または治療に使用され得る。

本開示は、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトに対して指向化された抗体も対象とする。具体的には、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、全長ＩＡＰＰ分子のオリゴマーまたは凝集体と交差反応する高度に特異的な機能性抗体の生成を刺激することができる。本開示の抗体は、高い特異性を伴ってオリゴマーＩＡＰＰまたは凝集ＩＡＰＰに結合するものであり、免疫原性増強に用いられる異種Ｔｈエピトープに指向化されたものは、仮に伴うとしても多くはなく、このことは、そのようなペプチド免疫原性増強に使用される従来のタンパク質または他の生物学的担体を使用して生成される抗体とは際立って対照的である。したがって、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、自己ＩＡＰＰに対する免疫寛容を打ち破る能力を有し、他のペプチド免疫原またはタンパク質免疫原と比較して、得られるレスポンダー率が高い。

いくつかの実施形態では、ペプチド免疫原コンストラクトが対象に投与されると、本開示の抗体は、ＩＡＰＰ分子の中央部分～Ｃ末端部分に位置するＩＡＰＰ易凝集性部位（例えば、配列番号１４～２５）に対して指向化され、当該部位に特異的に結合する。こうしたＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトによって誘導される高度に特異的な抗体はＩＡＰＰ凝集を抑制し、ＩＡＰＰ凝集と関連する障害が有効に予防及び／または治療され得る。ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトによって誘導される高度に特異的な抗体は、（１）オリゴマーまたは線維へのＩＡＰＰの凝集を抑制し、（２）凝集ＩＡＰＰがβ細胞に細胞毒性を及ぼすことから保護し、それによって、ＩＡＰＰ凝集と関連する障害に罹患している患者が有効に治療され得る。

ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトによって誘導される本開示の抗体は、その特有の特徴及び特性に基づいて、ＩＡＰＰ凝集と関連する障害に罹患している患者を治療するための予防的免疫療法手法を提供する能力を有する。

別の態様では、本発明は、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物が投与される患者によって誘導される、オリゴマーＩＡＰＰまたは凝集ＩＡＰＰに対するヒトモノクローナル抗体を提供する。ヒト患者の血液から単離されたＢ細胞からのヒトモノクローナル抗体の調製に有効な方法については、Traggiai, E., et al., 2004によって説明されており、当該文献は参照によって組み込まれる。

本開示は、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト、組成物、製剤、及び抗体を調製する方法も対象とする。本開示の方法は、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトならびにコンストラクトを含む組成物及び製剤（ＩＡＰＰ凝集と関連する障害に罹患する患者を治療するための方法において使用され得る）の低コスト製造及び品質管理を提供する。

本開示は、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト及び／またはＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトに対して指向化された抗体を使用して、ＩＡＰＰ凝集と関連する障害に罹患しやすいまたは罹患している対象の予防及び／または治療を行うための方法も含む。対象におけるＩＡＰＰ凝集と関連する障害を予防及び／または治療するための方法は、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトまたはコンストラクトの混合物を含む組成物を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、方法において利用される組成物は、静電気的な結び付きを介して生じる負荷電オリゴヌクレオチド（ＣｐＧオリゴマーなど）との安定な免疫刺激性複合体（アジュバントがさらに添加され得る）の形態で、ＩＡＰＰ凝集と関連する障害に罹患している患者に投与するための本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む。

本開示の方法は、対象におけるＩＡＰＰ凝集と関連する障害を予防及び／または治療するためにＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤を投与するための投薬レジメン、剤形、及び経路も含む。

一般
本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成を目的とするものにすぎず、記載対象を限定するものと解釈してはならない。本出願において引用される参考文献または参考文献の一部はすべて、それらの全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に明確に組み込まれる。

別段の説明がない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数の用語は、別に文脈上明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という言葉は、別に文脈上明確に示されない限り、「及び」を含むことが意図される。したがって、「ＡまたはＢを含む」という語句は、ＡまたはＢ、あるいはＡ及びＢを含むことを意味する。すべてのアミノ酸サイズ、及びポリペプチドに対して与えられるすべての分子量値または分子質量値はおよそのものであり、説明のために提供されるものであることがさらに理解されよう。本開示の方法の実施または試験においては、本明細書に記載のものと同様または同等の方法及び材料を使用することができるが、以下には適切な方法及び材料が記載される。本明細書で言及される刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献はすべて、それらの全体が参照によって組み込まれる。矛盾が生じる場合は、用語の説明を含めて、本明細書が優先されることになる。さらに、本明細書に開示の材料、方法、及び実施例は、例示にすぎず、限定を意図するものではない。

ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト
本開示は、ヒト由来の全長ＩＡＰＰ配列（配列番号３）または他の生物に由来する全長ＩＡＰＰ配列（例えば、配列番号４～７）に由来する約６～約２８個のアミノ酸を有するＢ細胞エピトープペプチドを含むペプチド免疫原コンストラクトを提供する。ある特定の実施形態では、Ｂ細胞エピトープペプチドは、配列番号８～６９（表１に示す）から選択されるアミノ酸配列を有する。

Ｂ細胞エピトープは、病原体タンパク質由来の異種ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープ（例えば、表２に示す配列番号７３～１１２及び配列番号１７１～１８２）に対して、直接的に共有結合で連結されるか、または任意選択の異種スペーサーを介して共有結合で連結され得る。こうしたコンストラクトは、設計されたＢ細胞エピトープ及びＴｈエピトープの両方を含み、これらのエピトープは、一緒に働くことで、さまざまな生物の全長ＩＡＰＰ（配列番号３～７）のオリゴマーまたは凝集体と交差反応する高度に特異的な抗体の生成を刺激する。

本明細書で用いる「ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト」または「ペプチド免疫原コンストラクト」という語句は、（ａ）全長ＩＡＰＰポリペプチド（配列番号３～７）に由来する約６つ超の連続アミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープ、（ｂ）異種Ｔｈエピトープ、及び（ｃ）任意選択の異種スペーサー、を含む約２０個超のアミノ酸を含むペプチドを指す。

ある特定の実施形態では、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、下記の式：
（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－（ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチド）－Ｘ
または
（ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチド）－（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ－Ｘ
または
（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－（ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチド）－（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ－Ｘ
によって表すことができ、
式中、
Ｔｈは、異種ヘルパーＴ細胞エピトープであり、
Ａは、異種スペーサーであり、
（ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチド）は、ＩＡＰＰ凝集を誘発しやすい６～２８個のＩＡＰＰ由来アミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープペプチドであり、
Ｘは、アミノ酸のα－ＣＯＯＨまたはα－ＣＯＮＨ_２であり、
ｍは、１～約４であり、
ｎは、０～約１０である。

本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、多くの理論的根拠に基づいて設計及び選択されたものであり、こうした理論的根拠には、下記のものが含まれる。
ｉ．ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドは、それ単独では非免疫原性であることで、自己Ｔ細胞の活性化が回避される。
ｉｉ．ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドは、タンパク質担体または強力なヘルパーＴ細胞エピトープ（複数可）を使用することによって免疫原性にされ得る。
ｉｉｉ．ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドが免疫原性にされ、宿主に投与されると、ペプチド免疫原コンストラクトは、
ａ．ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープ（複数可）に対して選択的に指向化されており、タンパク質担体またはヘルパーＴ細胞エピトープ（複数可）に対しては指向化されていない高力価抗体を誘導し、
ｂ．免疫化された宿主における免疫寛容を打ち破り、全長ＩＡＰＰ（配列番号３～７）のオリゴマーまたは凝集体との交差反応性を有する高度に特異的な抗体を生成させ、
ｃ．ＩＡＰＰモノマーまたはＩＡＰＰオリゴマーが凝集してＩＡＰＰ線維になることを抑制する能力を有する高度に特異的な抗体を生成させ、
ｄ．凝集ＩＡＰＰが関連細胞毒性をβ細胞に及ぼすことを抑制する能力を有する高度に特異的な抗体を生成させ、
ｅ．インビボ凝集ＩＡＰＰ及びそのような凝集ＩＡＰＰによって引き起こされる障害を低減する能力を有する高度に特異的な抗体を生成させる。

本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤は、医薬組成物またはワクチン製剤として効果的に機能することで、凝集ＩＡＰＰと関連する障害に罹患しやすいまたは罹患している対象に予防及び／または治療を与え得る。

以下には、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトのさまざまな構成要素についてさらに詳細に記載される。

ａ．ＩＡＰＰ由来のＢ細胞エピトープペプチド
本開示は、複数の種のＩＡＰＰ（例えば、配列番号３～７）のオリゴマーまたは凝集体に対する特異性を有する高力価抗体を生成させるための新規のペプチド組成物を対象とする。ＩＡＰＰの他の領域上の無関係な部位または担体タンパク質上の無関係な部位に指向化された抗体の生成が、ペプチド免疫原コンストラクトの部位特異性によって最小化され、それによって高い安全係数が得られる。

本明細書で用いる「ＩＡＰＰ」という用語は膵島アミロイドポリペプチドを指し、膵島アミロイドポリペプチドは、３７個のアミノ酸を含み、２番目のシステイン残基と７番目のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を有し、Ｃ末端がアミド化されており、複数の種にわたって高度に保存された配列を有するペプチドホルモンである（図１Ｂ及び図１Ｃ）。ヒトＩＡＰＰ（ｈＩＡＰＰ）は、プレプロホルモンであるＰｒｅＰｒｏＩＡＰＰ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ３５９８３．１）（配列番号１）がプロセシングを受けて生じる。ＰｒｅＰｒｏＩＡＰＰは、膵臓β細胞において産生されるアミノ酸数８９の前駆体であり、この前駆体は翻訳後に急速に切断されてＰｒｏＩＡＰＰ（アミノ酸数６７のペプチド）（配列番号２）となる。ＰｒｏＩＡＰＰは、さらにタンパク質分解及び翻訳後修飾を受けてＩＡＰＰ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号５ＭＧＱ＿Ａ）（配列番号３）となる（図１Ａ）。本開示で用いる複数の種のＩＡＰＰのアミノ酸配列を図１Ｃに示す。

本開示の一態様は、オリゴマーＩＡＰＰまたは凝集ＩＡＰＰを選択的に標的として長期的な臨床効力を発揮する能動免疫療法を用いて、凝集ＩＡＰＰと関連するＩＡＰＰ障害を予防及び／または治療することである。したがって、本開示は、凝集ＩＡＰＰと関連する障害を予防及び／または治療するための、全長ＩＡＰＰポリペプチド（配列番号３～７）の一部を標的とするペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤を対象とする。

ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトのＢ細胞エピトープ部分は、約６～約２８個のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エピトープペプチドは、配列番号８～６９（表１に示す）から選択されるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、Ｂ細胞エピトープペプチドは、ＩＡＰＰペプチドと膜との相互作用に関与するＮ末端領域に由来するもの（例えば、配列番号８～１４）、ＩＡＰＰの中央領域に由来するもの（例えば、配列番号１４～２１）、またはＩＡＰＰのＣ末端領域に由来するもの（例えば、配列番号２２～２６）であり得る。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エピトープペプチドは、ａａ８～１７にまたがるＩＡＰＰ易凝集性領域及びａａ２０～２９にまたがるＩＡＰＰ易凝集性領域に由来するもの（例えば、配列番号８～１０、配列番号１２～２５、及び配列番号４１～６３）である。他の実施形態では、Ｂ細胞エピトープペプチドは、細胞毒性をβ細胞に及ぼす領域に由来し、こうした領域は、ＩＡＰＰのＮ末端領域、中央領域、～Ｃ末端領域に位置する（例えば、表１及び図３に示す配列番号８～１４及び配列番号１５～２５）。

本開示のＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドは、ＩＡＰＰ（異なる生物に由来するＩＡＰＰ配列（例えば、配列番号３～７及び配列番号１８６～１９２）を含む）の免疫学的に機能性の類似体または相同体も含む。ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドの機能性の免疫学的類似体または免疫学的相同体には、元のペプチドと実質的に同じ免疫原性を保持するバリアントが含まれる。免疫学的に機能性の類似体は、あるアミノ酸位置での保存的置換、全体電荷の変更、別の部分への共有結合での付加、またはアミノ酸の追加、挿入、もしくは欠失、及び／またはそれらの任意の組み合わせを有し得る。

ＩＡＰＰ由来のこうしたＢ細胞エピトープを含むペプチド免疫原コンストラクトから生成される抗体は、さまざまな生物の全長ＩＡＰＰ（例えば、配列番号３～７）の凝集体に高度に特異的であり、それと交差反応する。ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトによって誘導される本開示の抗体は、その特有の特徴及び特性に基づいて、凝集ＩＡＰＰと関連する障害を予防及び／または治療するための予防的免疫療法手法を提供する能力を有する。

ｂ．異種ヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｔｈエピトープ）
本開示は、異種ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープに対して直接的に共有結合で連結または任意選択の異種スペーサーを介して共有結合で連結されたＩＡＰＰ由来のＢ細胞エピトープを含むペプチド免疫原コンストラクトを提供する。

ペプチド免疫原コンストラクト中の異種Ｔｈエピトープは、ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドの免疫原性を増強し、これによって、設計根拠に基づいてスクリーニング及び選択された最適化ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドに対して指向化された特異的な高力価抗体の生成が促進される。

本明細書で用いる「異種」という用語は、アミノ酸配列が、ＩＡＰＰの野生型配列の一部ではないアミノ酸配列に由来するものであること指すか、またはアミノ酸配列が、ＩＡＰＰの野生型配列と相同的ではないアミノ酸配列に由来するものであることを指す。したがって、異種Ｔｈエピトープは、ＩＡＰＰ中に天然には見られないアミノ酸配列に由来するＴｈエピトープである（すなわち、Ｔｈエピトープは、ＩＡＰＰに由来するものではない）。こうしたＴｈエピトープはＩＡＰＰに対して異種のものであるため、ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドに対してこうした異種Ｔｈエピトープが共有結合で連結されても、ＩＡＰＰの天然のアミノ酸配列はＮ末端方向またはＣ末端方向のいずれにも延長されない。

本開示の異種Ｔｈエピトープは、ＩＡＰＰ中に天然に見られるアミノ酸配列を有さない任意のＴｈエピトープであり得る。Ｔｈエピトープは、複数の種のＭＨＣクラスＩＩ分子に非選択的に結合するモチーフも有し得る。ある特定の実施形態では、Ｔｈエピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に非選択的に結合するモチーフを複数含むことで、ヘルパーＴ細胞を最大限に活性化することを可能にし、これによって免疫応答の開始及び制御を引き起こす。Ｔｈエピトープは、好ましくは、それ単独では免疫学的に静的であり、すなわち、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトによって生成される抗体のうちで、Ｔｈエピトープに対して指向化されることになるものは、仮に存在するとしても極めて少なく、それによって、ＩＡＰＰ分子の標的Ｂ細胞エピトープペプチドに指向化された非常に集中的な免疫応答を引き起こすことを可能にする。

本開示のＴｈエピトープには、限定されないが、外来病原体に由来するアミノ酸配列（表２に例示されるもの（例えば、配列番号７３～１１２及び配列番号１７１～１８２））が含まれる。ある特定の実施形態では、ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドの免疫原性の増強に用いられる異種Ｔｈエピトープは、天然の病原体に由来するもの（ＥＢＶ ＢＰＬＦ１（配列番号１１１）、ＥＢＶ ＣＰ（配列番号１０８）、破傷風菌（Clostridium Tetani）（配列番号７３、配列番号７６、配列番号１０３、配列番号１０５～１０７）、コレラ毒素（配列番号８０）、及びマンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）（配列番号７９））、ならびに麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ１～５）及びＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ１～３）に由来する理想化された人工Ｔｈエピトープであり、これらの異種Ｔｈエピトープは、単一配列（例えば、配列番号７３～８３、配列番号８５～８９、配列番号９１～９２、配列番号９４～９５、配列番号９７～１７４、配列番号１７６～１７７、配列番号１７９～１８２）または組み合わせ配列（例えば、配列番号８４、配列番号９０、配列番号９３、配列番号９６、配列番号１７５、及び配列番号１７８）のいずれかの形態のものである。理想化された人工Ｔｈエピトープの組み合わせは、その特定のペプチドに対する相同体の可変残基に基づいて、ペプチドフレームワーク内の特定の位置にアミノ酸残基が示されるものの混合物を含む。組み合わせペプチドの集合物は、合成プロセスの間に、指定の保護アミノ酸の混合物を１つの特定のアミノ酸の代わりに特定の位置に付加することによって１つのプロセスにおいて合成され得る。そのような組み合わせ異種Ｔｈエピトープペプチド集合物は、多様な遺伝的背景を有する動物に対するＴｈエピトープカバー範囲を広げることを可能にし得る。異種Ｔｈエピトープペプチドの代表的な組み合わせ配列には、表２に示す配列番号８４、配列番号９０、配列番号９３、配列番号９６、配列番号１７５、及び配列番号１７８が含まれる。本発明のエピトープペプチドは、遺伝的に多様な集団に由来する動物及び患者に対して幅広い反応性及び免疫原性を与える。

ｃ．異種スペーサー
本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドを異種ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープに共有結合で連結する異種スペーサーを任意選択で含む。

上述したように、「異種」という用語は、アミノ酸配列が、ＩＡＰＰの天然型配列の一部ではないアミノ酸配列に由来するものであること指すか、またはアミノ酸配列が、ＩＡＰＰの天然型配列と相同的ではないアミノ酸配列に由来するものであることを指す。したがって、ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドに対して異種スペーサーが共有結合で連結されても、このスペーサーは、ＩＡＰＰ配列に対して異種のものであるため、ＩＡＰＰの天然のアミノ酸配列は、Ｎ末端方向またはＣ末端方向のいずれにも延長されない。

スペーサーは、２つのアミノ酸及び／またはペプチド連結して一緒にする能力を有する任意の分子または化学構造である。スペーサーの長さまたは極性は、用途に応じて異なり得る。スペーサーの付加は、アミド結合またはカルボキシル結合を介して行われ得るが、他の官能性を利用することも可能である。スペーサーは、化合物、天然起源のアミノ酸、または非天然起源のアミノ酸を含み得る。

スペーサーは、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトに対して構造特徴を付与し得る。構造的には、スペーサーは、ＩＡＰＰ断片のＢ細胞エピトープからＴｈエピトープを物理的に分離する。スペーサーによる物理的な分離は、ＴｈエピトープをＢ細胞エピトープと連結することによって創出される任意の人工二次構造を破壊し得る。さらに、スペーサーによってエピトープを物理的に分離すると、Ｔｈ細胞応答及び／またはＢ細胞応答の間の干渉が除去され得る。さらに、スペーサーは、ペプチド免疫原コンストラクトの二次構造を創出または改変するように設計され得る。例えば、スペーサーは、Ｔｈエピトープ及びＢ細胞エピトープの分離を増進させるための可動性ヒンジとして働くように設計され得る。可動性ヒンジスペーサーは、提示されるペプチド免疫原と適切なＴｈ細胞及びＢ細胞との間の相互作用の効率性を向上させて、Ｔｈエピトープ及びＢ細胞エピトープに対する免疫応答を増強することも可能にし得る。可動性ヒンジをコードする配列の例は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域に見られるものであり、こうした配列はプロリンを多く含むことが多い。スペーサーとして使用され得る特に有用な可動性ヒンジの１つは、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏという配列（配列番号７０）によって提供され、配列中、Ｘａａは、任意のアミノ酸であり、好ましくは、アスパラギン酸である。

スペーサーは、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトに対して機能的特徴も付与し得る。例えば、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの全体電荷が変化するようにスペーサーを設計することができ、これによって、ペプチド免疫原コンストラクトの溶解性に影響を与えることができる。さらに、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの全体電荷を変化させると、ペプチド免疫原コンストラクトが他の化合物及び試薬と結び付く能力に影響を与えることができる。以下にさらに詳細に論じられるように、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、高度に荷電したオリゴヌクレオチド（ＣｐＧオリゴマーなど）と静電気的な結び付きを介して安定な免疫刺激性複合体を形成し得る。ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの全体電荷は、こうした安定な免疫刺激性複合体の形成に重要である。

スペーサーとして使用され得る化合物には、限定されないが、（２－アミノエトキシ）酢酸（ＡＥＡ）、５－アミノ吉草酸（ＡＶＡ）、６－アミノカプロン酸（Ａｈｘ）、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸（ＡＥＥＡ、ミニＰＥＧ１）、１２－アミノ－４，７，１０－トリオキサドデカン酸（ミニＰＥＧ２）、１５－アミノ－４，７，１０，１３－テトラオキサペンタ－デカン酸（ミニＰＥＧ３）、トリオキサトリデカン－コハク酸（Ｔｔｄｓ）、１２－アミノ－ドデカン酸、Ｆｍｏｃ－５－アミノ－３－オキサペンタン酸（Ｏ１Ｐｅｎ）、及び同様のものが含まれる。

天然起源のアミノ酸には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンが含まれる。

非天然起源のアミノ酸には、限定されないが、ε－Ｎリジン、β－アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ－アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリン、アミノ安息香酸、６－アミノカプロン酸（Ａｃａ；６－アミノヘキサン酸）、ヒドロキシプロリン、メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、３－ニトロ－チロシン、ピログルタミン酸、及び同様のものが含まれる。

ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト中に含めるスペーサーは、Ｔｈエピトープ及びＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに共有結合で連結され得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＴｈエピトープのＣ末端及びＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端に共有結合で連結される。他の実施形態では、スペーサーは、ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドのＣ末端及びＴｈエピトープのＮ末端に共有結合で連結される。ある特定の実施形態では、複数のスペーサーを使用することができ、この使用は、例えば、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト中に複数のＴｈエピトープが存在する場合に行われる。複数のスペーサーが使用される場合、各スペーサーは互いに同じか、または異なり得る。さらに、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト中に複数のＴｈエピトープが存在する場合、それらのＴｈエピトープは、スペーサーで分離されることがあり得、このスペーサーは、ＴｈエピトープをＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドから分離するために使用されるスペーサーと同じであるか、または異なり得る。ＴｈエピトープまたはＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドとの関係においてスペーサーの配置に制限は存在しない。

ある特定の実施形態では、異種スペーサーは、天然起源のアミノ酸または非天然起源のアミノ酸である。他の実施形態では、スペーサーは、天然起源のアミノ酸または非天然起源のアミノ酸を複数含む。特定の実施形態では、スペーサーは、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号７１）、またはＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号７２）である。

ｄ．ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの特定の実施形態
ある特定の実施形態では、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、下記の式：
（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－（ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチド）－Ｘ
または
（ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチド）－（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ－Ｘ
または
（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－（ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチド）－（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ－Ｘ
によって表すことができ、
式中
Ｔｈは、異種ヘルパーＴ細胞エピトープであり、
Ａは、異種スペーサーであり、
（ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチド）は、ＩＡＰＰ凝集を誘発しやすい６～２８個のＩＡＰＰ由来アミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープペプチドであり、
Ｘは、アミノ酸のα－ＣＯＯＨまたはα－ＣＯＮＨ_２であり、
ｍは、１～約４であり、
ｎは、０～約１０である。

Ｂ細胞エピトープペプチドは、配列番号３～７によって表される全長ＩＡＰＰポリペプチドの一部に由来する約６～約２８個のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、表１に示す配列番号８～６９のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、Ｂ細胞エピトープペプチドは、ＩＡＰＰペプチドと膜との相互作用に関与するＮ末端領域に由来するもの（例えば、配列番号８～１４）、ＩＡＰＰの中央領域に由来するもの（例えば、配列番号１４～２１）、またはＩＡＰＰのＣ末端領域に由来するもの（例えば、配列番号２２～２６）である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エピトープペプチドは、ａａ８～１７にまたがるＩＡＰＰ易凝集性領域及びａａ２０～２９にまたがるＩＡＰＰ易凝集性領域に由来するもの（例えば、配列番号８～１０、配列番号１２～２５、及び配列番号４１～６３）である。他の実施形態では、Ｂ細胞エピトープペプチドは、細胞毒性をβ細胞に及ぼす領域に由来し、こうした領域は、ＩＡＰＰのＮ末端領域、中央領域、～Ｃ末端領域に位置する（例えば、表１及び図３に示す配列番号８～１４及び配列番号１５～２５）。

ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト中の異種Ｔｈエピトープは、表２に示す配列番号７３～１１２及び配列番号１７１～１８２ならびにそれらの組み合わせ、のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト中には複数のＴｈエピトープが存在する。

任意選択の異種スペーサーは、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号７０）、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号７１）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号７２）、及びそれらの任意の組み合わせ、のうちのいずれかから選択され、配列中、Ｘａａは、任意のアミノ酸であるが、好ましくは、アスパラギン酸である。特定の実施形態では、異種スペーサーは、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号７１）またはＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号７２）である。

ある特定の実施形態では、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、表３に示す配列番号１１３～１６７のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。

ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを構成するＴｈエピトープは、ＩＡＰＰ断片との直列配置で単回の固相ペプチド合成において同時に生成される。Ｔｈエピトープには、Ｔｈエピトープの免疫学的類似体も含まれる。免疫学的Ｔｈ類似体には、免疫増強性類似体、交差反応性類似体、及びこうしたＴｈエピトープのいずれかのセグメントであって、ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドに対する免疫応答を増強または刺激する上で十分なもの、が含まれる。

ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト中に含めるＴｈエピトープは、ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに共有結合で連結され得る。いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープは、ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端に共有結合で連結される。他の実施形態では、Ｔｈエピトープは、ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドのＣ末端に共有結合で連結される。ある特定の実施形態では、複数のＴｈエピトープが、ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドと共有結合で連結される。複数のＴｈエピトープがＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドと連結される場合、各Ｔｈエピトープは、同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有し得る。さらに、複数のＴｈエピトープがＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドと連結される場合、それらのＴｈエピトープは任意の順序で配置され得る。例えば、それらのＴｈエピトープは、ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端に連続して連結されるか、もしくはＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドのＣ末端に連続して連結され得る。または、ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端にＴｈエピトープを共有結合で連結することができ、ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドのＣ末端には別のＴｈエピトープが共有結合で連結される。ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドとの関係においてＴｈエピトープの配置に制限は存在しない。

いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープは、ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドに対して直接的に共有結合で連結される。他の実施形態では、Ｔｈエピトープは、異種スペーサーを介してＩＡＰＰ断片と共有結合で連結される。

ｅ．バリアント、相同体、及び機能性類似体
好ましいＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドに対する抗体を誘導し、及び／または当該抗体と交差反応する、上記の免疫原性ペプチドコンストラクトのバリアント及び類似体も使用され得る。類似体（アレルバリアント、種バリアント、及び誘導バリアントを含む）は、典型的には、１つ、２つ、または少数の位置に天然の起源のペプチドとの差異があり、この差異は、保存的置換によるものであることが多い。類似体は、典型的には、天然のペプチドとの配列同一性が少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のものである。類似体によっては、非天然アミノ酸、またはＮ末端アミノ酸もしくはＣ末端アミノ酸の修飾を１つ、２つ、または少数の位置に含むこともある。

機能性類似体であるバリアントは、あるアミノ酸位置での保存的置換、全体電荷の変更、別の部分への共有結合での付加、またはアミノ酸の追加、挿入、もしくは欠失、及び／またはそれらの任意の組み合わせを有し得る。

保存的置換は、あるアミノ酸残基が、類似の化学特性を有する別のアミノ酸残基に置換されるものである。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンが含まれ、極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれ、正荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが含まれ、負荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。

特定の実施形態では、機能性類似体は、元のアミノ酸配列との同一性が少なくとも５０％である。別の実施形態では、機能性類似体は、元のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である。さらに別の実施形態では、機能性類似体は、元のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８５％である。さらに別の実施形態では、機能性類似体は、元のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％である。

Ｔｈエピトープペプチドの機能性の免疫学的類似体も有効であり、本発明の一部として含まれる。機能性の免疫学的Ｔｈ類似体は、ＴｈエピトープのＴｈ刺激機能を本質的に改変しない１～約５つのアミノ酸残基の保存的な置換、追加、欠失、及び挿入をＴｈエピトープ中に含み得る。保存的な置換、追加、及び挿入は、ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドについて上に記載されるように、天然アミノ酸または非天然アミノ酸を用いて達成され得る。表２には、Ｔｈエピトープペプチドの機能性類似体の別のバリエーションが示される。具体的には、ＭｖＦ１ Ｔｈ及びＭｖＦ２ Ｔｈの配列番号７４及び配列番号８１は、それぞれＭｖＦ４及びＭｖＦ５の配列番号９１～９２及び配列番号９７の機能性類似体であり、これは、これらの配列のアミノ酸フレームが、Ｎ末端及びＣ末端のそれぞれから２つのアミノ酸が欠失することによって異なるか（配列番号７４及び配列番号８１）、またはＮ末端及びＣ末端のそれぞれに２つのアミノ酸が含められることによって異なる（配列番号９１～９２及び配列番号９７）という観点によるものである。これら２つの一連の類似配列の間の差異は、これらの配列中に含まれるＴｈエピトープの機能に影響を与えないと想定される。したがって、機能性の免疫学的Ｔｈ類似体には、麻疹ウイルス融合タンパク質に由来するＴｈエピトープのいくつかのバージョン（ＭｖＦ１～４ Ｔｈ）（配列番号７４、配列番号８１、配列番号８２～８４、配列番号９１～９３、配列番号９７、及び配列番号１７１～１７９）、ならびに肝炎表面タンパク質に由来するＴｈエピトープのいくつかのバージョン（ＨＢｓＡｇ１～３ Ｔｈ）（配列番号８５～９０、配列番号９４～９６、配列番号９８、及び配列番号１８０～１８２）が含まれる。

組成物
本開示は、本開示のＩＡＰＰ免疫原ペプチドコンストラクトを含む組成物も提供する。

ａ．ペプチド組成物
本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物は、液体形態または固体／凍結乾燥形態のものであり得る。液体組成物は、水、緩衝液、溶媒、塩、及び／またはＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの構造特性もしくは機能特性を変化させない任意の他の許容可能な試薬を含み得る。ペプチド組成物は、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトのうちの１つ以上を含み得る。

ｂ．医薬組成物
本開示は、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物も対象とする。

医薬組成物は、医薬的に許容可能な送達系において担体及び／または他の添加剤を含み得る。したがって、医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体、アジュバント、及び／または他の医薬品添加物（希釈剤、添加剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、及び同様のものなど）と一緒に医薬的に有効な量のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含み得る。

医薬組成物は、１つ以上のアジュバントを含み得、この１つ以上のアジュバントは、それ自体はいずれの特定の抗原性作用も有することなくＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトに対する免疫応答を促進、延長、または増強するように働く。医薬組成物において使用されるアジュバントには、油、油エマルション、アルミニウム塩、カルシウム塩、免疫刺激性複合体、細菌系物質及びウイルス系物質、ビロソーム、糖質、サイトカイン、ポリマー微粒子が含まれ得る。ある特定の実施形態では、アジュバントは、アラム（リン酸カリウムアルミニウム）、リン酸アルミニウム（例えば、ＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標））、水酸化アルミニウム（例えば、ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））、リン酸カルシウム、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、完全フロイントアジュバント、ＭＦ５９、アジュバント６５、Ｌｉｐｏｖａｎｔ、ＩＳＣＯＭ、ｌｉｐｏｓｙｎ、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）、ＥｍｕｌｓＩＬ－６ｎ（登録商標）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ２１、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（登録商標）ＩＳＡ３５、ＩＳＡ５０Ｖ、ＩＳＡ５０Ｖ２、ＩＳＡ５１、ＩＳＡ２０６、ＩＳＡ７２０、リポソーム、リン脂質、ペプチドグリカン、リポ多糖（ＬＰＳ）、ＡＳＯ１、ＡＳＯ２、ＡＳＯ３、ＡＳＯ４、ＡＦ０３、親油性リン脂質（リピドＡ）、ガンマイヌリン、アルガムリン（ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ）、グルカン、デキストラン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、レバン、キシラン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、ならびに他のアジュバント及び乳化剤から選択され得る。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１（油中水型エマルション生成用の植物油及びオレイン酸マンニドから構成される油アジュバント組成物）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリソルベート８０もしくはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンオレイン酸モノエステルとしても知られる）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、及び／またはそれらの任意の組み合わせを含む。他の実施形態では、医薬組成物は、アジュバントとしてＥＭＵＬＳＩＧＥＮまたはＥＭＵＬＳＩＧＥＮ Ｄを含む水中油中水型（すなわち、ｗ／ｏ／ｗ型）エマルションである。

医薬組成物は、医薬的に許容可能な添加剤または医薬品添加物も含み得る。例えば、医薬組成物は、抗酸化剤、結合剤、緩衝剤、増量剤、担体、キレート剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、賦形剤、ゲル化剤、ｐＨ緩衝剤、保存剤、可溶化剤、安定化剤、及び同様のものを含み得る。

医薬組成物は、即放型製剤または徐放型製剤として製剤化され得る。さらに、医薬組成物は、微粒子を用いる免疫原の封入及び同時投与を介して全身免疫または局所粘膜免疫が誘導されるように製剤化され得る。そのような送達系は、当業者によって容易に決定される。

医薬組成物は、注射剤（溶液または懸濁液としてのもの）として調製され得る。ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む液体媒体は、注射前に調製されるものでもあり得る。医薬組成物は、任意の適切な送達機器において任意の適切な適用様式（例えば、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、経口、皮下など）によって投与され得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、皮下投与、皮内投与、または筋肉内投与向けに製剤化される。経口適用及び鼻腔内適用を含めて、他の投与様式に適した医薬組成物も調製され得る。

医薬組成物は、適切な単位剤形でも製剤化され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、体重ｋｇ当たり約０．１μｇ～約１ｍｇのＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む。医薬組成物の有効用量は、多くの異なる因子に応じて異なり得、こうした因子には、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトまたは動物であるかどうか、他の投与薬剤、及び治療が予防的または治療的であるかどうかが含まれる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類を含めて、非ヒト哺乳類も治療され得る。医薬組成物は、複数回用量で送達される場合、単位剤形当たり適切な量へと好都合に分割され得る。投与量は、対象の年齢、体重、及び総体的な健康に依存することになり、こうしたことは、治療分野でよく知られている。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む。複数のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの混合物を含む医薬組成物は、コンストラクトの免疫効力を相乗的に増強することが可能である。複数のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物は、ＭＨＣクラスＩＩカバー範囲が広いことで、効力が及ぶ遺伝的集団が大きくなり得るため、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトに対する免疫応答を改善させる。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、配列番号１１３～１６７（表３）から選択されるＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト、ならびにその相同体、類似体、及び／または組み合わせを含む。

ある特定の実施形態では、ＭＶＦ及びＨＢｓＡｇに由来する異種Ｔｈエピトープを組み合わせ形態（配列番号９３、配列番号８４、配列番号９０、及び配列番号９６）で含むＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１４１、配列番号１５１～１５３）を等モル比で混合して製剤に使用することで、多様な遺伝的背景を有する宿主集団を最大限にカバーすることが可能であった。

さらに、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト（例えば、ＵＢＩＴｈ（登録商標）１を利用するもの；配列番号１３６及び配列番号１３７）によって誘発された抗体応答は、そのほどんど（＞９０％）が、ＩＡＰＰのＢ細胞エピトープペプチドに対する所望の交差反応性に集中しており、免疫原性増強に用いた異種Ｔｈエピトープに指向化されたものは、仮に伴うとしても多くはなかった（表４及び表６）。このことは、そのようなＩＡＰＰペプチド免疫原性増強に使用される従来のタンパク質（ＫＬＨなど）または他の生物学的タンパク質担体とは際立って対照的である。

他の実施形態では、ペプチド組成物（例えば、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの混合物を含むもの）と、アジュバントとしての無機塩（アラムゲル（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）またはリン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）を含む）とを接触させたものを含めて懸濁製剤を形成させた医薬組成物を、宿主への投与に使用した。

ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物を使用することで、投与時に宿主において免疫応答が誘発され、抗体が産生され得る。

ｃ．免疫刺激性複合体
本開示は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとの免疫刺激性複合体の形態でＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物も対象とする。そのような免疫刺激性複合体は、アジュバント及び／またはペプチド免疫原安定化剤として働くことに特に適したものである。免疫刺激性複合体は、微粒子の形態をとり、この微粒子は、ＩＡＰＰペプチド免疫原を免疫系の細胞に効率的に提示して免疫応答を生じさせ得る。免疫刺激性複合体は、非経口投与用の懸濁液として製剤化され得る。免疫刺激性複合体は、油中水型（ｗ／ｏ型）エマルションの形態で製剤化されるか、無機塩と組み合わさった懸濁液として製剤化されるか、または非経口投与後に宿主の免疫系の細胞にＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを効率的に送達するためのインサイチュゲル化ポリマーと組み合わさった懸濁液として製剤化されることもあり得る。

ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを、アニオン性分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせと静電気的な結び付きを介して複合体化させることによって、安定化された免疫刺激性複合体が形成され得る。安定化された免疫刺激性複合体は、免疫原送達系として医薬組成物に組み込まれ得る。

ある特定の実施形態では、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、５．０～８．０の範囲内のｐＨで正に荷電するカチオン性部分を含むように設計される。ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分上の正味の電荷またはコンストラクトの混合物のカチオン性部分上の正味の電荷は、それぞれのリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）については＋１の電荷、それぞれのアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）については－１の電荷、当該配列内の他のアミノ酸については０の電荷を割り当てることによって計算される。電荷は、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分内で合計され、正味の平均電荷として表される。適切なペプチド免疫原は、正味の平均正電荷が＋１であるカチオン性部分を有する。好ましくは、ペプチド免疫原は、＋２を超える範囲の正味の正電荷を有する。いくつかの実施形態では、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分は異種スペーサーである。ある特定の実施形態では、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分は、スペーサー配列が（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、（α，ε－Ｎ）－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号７１）、またはＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号７２）である場合、＋４の電荷を有する。

本明細書に記載の「アニオン性分子」は、５．０～８．０の範囲内のｐＨで負に荷電する任意の分子を指す。ある特定の実施形態では、アニオン性分子は、オリゴマーまたはポリマーである。オリゴマー上またはポリマー上の正味の負電荷は、オリゴマー中のそれぞれのホスホジエステル基またはホスホロチオエート基について－１の電荷を割り当てることによって計算される。適切なアニオン性オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基数が８～６４であり、ＣｐＧモチーフのリピート数の範囲が１～１０である一本鎖ＤＮＡ分子である。好ましくは、ＣｐＧ免疫刺激性一本鎖ＤＮＡ分子は、含有ヌクレオチド塩基数が１８～４８であり、ＣｐＧモチーフのリピート数の範囲が３～８のものである。

より好ましくは、アニオン性オリゴヌクレオチドは、５’Ｘ^１ＣＧＸ^２３’という式によって表され、式中、Ｃ及びＧは、メチル化されておらず、Ｘ^１は、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、及びＴ（チミン）からなる群から選択され、Ｘ^２は、Ｃ（シトシン）またはＴ（チミン）である。あるいは、アニオン性オリゴヌクレオチドは、５’（Ｘ^３）_２ＣＧ（Ｘ^４）_２３’という式によって表され、式中、Ｃ及びＧは、メチル化されておらず、Ｘ^３は、Ａ、Ｔ、またはＧからなる群から選択され、Ｘ^４は、ＣまたはＴである。特定の実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧ１：５’ＴＣｇ ＴＣｇ ＴＴＴ ＴｇＴ ＣｇＴ ＴＴＴ ｇＴＣ ｇＴＴ ＴＴｇ ＴＣｇ ＴＴ ３’（完全にホスホロチオエート化されたもの）（配列番号１８３）、ＣｐＧ２：５’リン酸ＴＣｇ ＴＣｇ ＴＴＴ ＴｇＴ ＣｇＴ ＴＴＴ ｇＴＣ ｇＴＴ ３’（完全にホスホロチオエート化されたもの）（配列番号１８４）、またはＣｐＧ３ ５’ＴＣｇ ＴＣｇ ＴＴＴ ＴｇＴ ＣｇＴ ＴＴＴ ｇＴＣ ｇＴＴ ３’（完全にホスホロチオエート化されたもの）（配列番号１８５）という配列を有する。

得られる免疫刺激性複合体は、サイズが典型的には１～５０ミクロンの範囲の粒子の形態をとり、相互作用種の相対的電荷化学量論及び分子量を含めて、多くの因子の影響を受けるものである。微粒子状の免疫刺激性複合体は、インビボで特定の免疫応答のアジュバント作用及び上方制御を与えるという利点を有する。さらに、安定化された免疫刺激性複合体は、油中水型エマルション、無機塩懸濁液、及びポリマーゲルを含めて、さまざまなプロセスによる医薬組成物の調製に適する。

本開示は、凝集ＩＡＰＰと関連する障害を予防及び／または治療するための医薬組成物（製剤を含む）も対象とする。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、安定化された免疫刺激性複合体（ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト（例えば、配列番号１１３～１６７）の混合物を含むペプチド組成物とＣｐＧオリゴマーとを混合することによって静電気的な結び付きを介して形成される）を含み、これによって、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性がさらに増強され、ＩＡＰＰ易凝集性領域に指向化されており、配列番号３～７のＩＡＰＰタンパク質と交差反応する抗体が誘導される。

さらに他の実施形態では、医薬組成物は、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの混合物（例えば、配列番号１１３～１６７の任意の組み合わせ）を、ＣｐＧオリゴマー（高い安全係数を有するアジュバントとしての無機塩（アラムゲル（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）またはリン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）を含む）と任意選択で混合される）との安定化された免疫刺激性複合体の形態で含むことで、宿主に投与するための懸濁製剤を形成する。

抗体
本開示は、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトによって誘導される抗体も提供する。

本開示は、製造でのコスト効率が高く、自体の設計が最適であり、オリゴマーＩＡＰＰまたは凝集ＩＡＰＰを標的とする高力価抗体を誘導する能力を有し、自己タンパク質であるＩＡＰＰに対する免疫寛容を打ち破る能力を有し、免疫化される宿主でのレスポンダー率が高いＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤を提供する。ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトによって生成される抗体は、オリゴマーＩＡＰＰまたは凝集ＩＡＰＰに対して高い親和性を有する。

いくつかの実施形態では、抗体を誘導するためのＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、ＩＡＰＰ部位を標的とするＩＡＰＰペプチドと、病原性タンパク質（麻疹ウイルス融合（ＭＶＦ）タンパク質及び他のものなど）に由来する異種Ｔｈエピトープ（例えば、配列番号７３～１１２及び配列番号１７１～１８２）とが、任意選択の異種スペーサーを介して連結された混成物を含み、ＩＡＰＰペプチドが標的とするＩＡＰＰ部位は、（１）ａａ８～１７にまたがるＩＡＰＰ易凝集性領域の付近及びａａ２０～２９にまたがるＩＡＰＰ易凝集性領域の付近（例えば、配列番号８～１０、配列番号１２～２５、及び配列番号４１～６３）、（２）ＩＡＰＰペプチドと膜との相互作用に関与するＮ末端領域（ａａ１～１９）の付近（配列番号８～１４）、またはβ細胞に細胞毒性を及ぼす領域（こうした領域は、ＩＡＰＰのＮ末端領域、中央領域、～Ｃ末端領域に位置する）の付近（例えば、表１及び図３に示す配列番号８～１４及び配列番号１５～２５）である。ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトのＢ細胞エピトープ及びＴｈエピトープペプチドは、一緒に働くことで、ヒト及び他の生物に由来するＩＡＰＰ（例えば、配列番号３～７）のオリゴマーまたは凝集体と交差反応する高度に特異的な抗体の生成を刺激する。

ペプチドの免疫原性を増強するための伝統的な方法（担体タンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または他の担体タンパク質（ジフテリアトキソイド（ＤＴ）タンパク質及び破傷風トキソイド（ＴＴ）タンパク質など））への化学的カップリングを行うものなど）では、典型的には、そうした担体タンパク質に対して指向化された抗体が大量に生成してしまうという結果を招く。したがって、そのようなペプチド－担体タンパク質組成物の主な欠点は、当該免疫原によって生成される抗体のほとんど（＞９０％）が、担体タンパク質（ＫＬＨ、ＤＴ、またはＴＴ）に対して指向化された非機能性抗体であることであり、こうした担体タンパク質は、エピトープ抑制（ｅｐｉｔｏｐｉｃ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）を招き得るものである。

ペプチドの免疫原性を増強するための伝統的な方法とは異なり、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト（例えば、配列番号１１３～１６７）によって生成される抗体は、ＩＡＰＰ（例えば、配列番号３～７）のオリゴマーまたは凝集体に高度に特異的に結合し、異種Ｔｈエピトープ（例えば、配列番号７３～１１２及び配列番号１７１～１８２）または任意選択の異種スペーサーに対して指向化された抗体は、仮に伴うとしても極めて少ない。一例は、配列番号１３６及び配列番号１３７について表４及び表６に示されており、これらは、これらのペプチド免疫原コンストラクトから生成される抗体が、Ｂ細胞エピトープに対して特異的に指向化され、ＴｈエピトープまたはＣｐＧオリゴヌクレオチドには指向化されないことを実証するものである。

方法
本開示は、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト、組成物、及び医薬組成物の調製方法及び使用方法も対象とする。

ａ．ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを製造するための方法
本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、当業者によく知られる化学合成法によって調製され得る（例えば、Fields, G. B., et al., 1992を参照のこと）。ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、自動化メリフィールド固相合成手法を使用して合成することができ、この手法では、側鎖保護アミノ酸を使用してｔ－Ｂｏｃ化学またはＦ－ｍｏｃ化学のいずれかによってα－ＮＨ_２が保護され、この手法は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒのモデル４３０Ａまたはモデル４３１で行われる。Ｔｈエピトープの組み合わせライブラリーペプチドを含むＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの調製は、所与の可変位置の時点でのカップリングに代替アミノ酸の混合物を使用することによって達成され得る。

所望のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトが完全に構築された後、標準的な手順に従って樹脂を処理することで、樹脂からペプチドを切断し得、アミノ酸側鎖上の官能基を脱保護し得る。この遊離のペプチドは、ＨＰＬＣによって精製され、生化学的に特徴付けられ得る。この特徴付けは、例えば、アミノ酸分析または配列決定によって行われる。ペプチドの精製方法及び特徴付け方法は、当業者によく知られている。

この化学プロセスによって生成されるペプチドの品質は、制御及び規定することができるものであり、結果として、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト、免疫原性、及び収率の再現性が保証され得る。固相ペプチド合成を介するＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの製造の詳細な説明を実施例１に示す。

所期の免疫学的活性の保持を可能にする構造可変性の範囲は、小分子薬物による特定の薬物活性の保持を可能にする構造可変性の範囲、または生物学的に得られる薬物と共に生じる大分子に見られる所望の活性及び望ましくない毒性の保持を可能にする構造可変性の範囲と比較してはるかに柔軟なものであることが明らかになっている。

したがって、ペプチド類似体は、意図的に設計されるものにしても、意図するペプチドと同様のクロマトグラフィー特性及び免疫学的特性を有する欠損配列副生成物の混合物として合成プロセスのエラーによって不可避的に生じるものにしても、所望のペプチドの精製調製物と同じくらい有効であることが多い。設計される類似体及び意図しない類似体混合物は、製造プロセス及び製品評価プロセスの両方を監視するために識別ＱＣ手順が開発されて、こうしたペプチドを用いる最終製品の再現性及び効力が保証される限りにおいては、有効である。

ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、核酸分子、ベクター、及び／または宿主細胞を含めて、組換えＤＮＡ技術を使用しても調製され得る。したがって、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトをコードする核酸分子、及びペプチド免疫原コンストラクトの免疫学的に機能性の類似体をコードする核酸分子もまた、本発明の一部として本開示によって包含される。同様に、核酸分子を含むベクター（発現ベクターを含む）ならびにそうしたベクターを含む宿主細胞もまた、本発明の一部として本開示によって包含される。

さまざまな例示の実施形態は、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト及びその免疫学的に機能性の類似体の生成方法も包含する。例えば、方法は、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト及び／またはその免疫学的に機能性の類似体をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、そうしたペプチド及び／または類似体が発現する条件の下でインキュベートするステップを含み得る。よく知られる組換えＤＮＡ手法によって、より長い合成ペプチド免疫原を合成することができる。そのような手法は、詳細なプロトコールと共に、よく知られる標準的なマニュアルにおいて提供されている。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するには、アミノ酸配列をコードする核酸配列が、アミノ酸配列を逆翻訳して取得され、こうした核酸配列では、好ましくは、遺伝子が発現することになる生物に最適なコドンが用いられる。次に、典型的には、ペプチド及び必要に応じて任意の制御エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって合成遺伝子が調製される。合成遺伝子は、適切なクローニングベクターに挿入され、宿主細胞にトランスフェクトされる。その後、ペプチドは、選択される発現系及び宿主に適した適切条件の下で発現される。ペプチドは、標準的な方法によって精製され、特徴付けられる。

ｂ．免疫刺激性複合体を製造するための方法
さまざまな例示の実施形態は、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）分子を含む免疫刺激性複合体の生成方法も包含する。安定化された免疫刺激性複合体（ＩＳＣ）は、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分及びポリアニオン性ＣｐＧ ＯＤＮ分子から得られる。この自己集合系は、電荷が静電気的に中和されることによって促進される。アニオン性オリゴマーに対するＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分のモル電荷比の化学量論によって結び付きの程度が決まる。ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトとＣｐＧ ＯＤＮとの非共有結合性の静電気的な結び付きは、完全に再現性のあるプロセスである。ペプチド／ＣｐＧ ＯＤＮ免疫刺激性複合集合体は、免疫系の「プロフェッショナル」抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する提示を促進し、それによって自体の免疫原性をさらに増強する。こうした複合体は、製造の間の品質管理のための特徴付けが容易なものである。ペプチド／ＣｐＧ ＩＳＣのインビボでの忍容性は良好である。ＣｐＧ ＯＤＮ及びＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含むこの新規の微粒子系は、ＣｐＧ ＯＤＮの使用と関連する全般的なＢ細胞分裂促進性を利用し、さらにはＴｈ－１／Ｔｈ－２型応答のバランス取りを促進するようにも設計した。

本開示の医薬組成物中のＣｐＧ ＯＤＮは、反対電荷が静電気的に中和されることによって媒介されるプロセスにおいて免疫原に１００％結合し、その結果、ミクロンサイズの微粒子を形成する。この微粒子形態は、ＣｐＧアジュバントの従来の使用と比較してＣｐＧの用量を顕著に減らし、有害な自然免疫応答が生じる可能性を下げることが可能であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む代替の免疫原プロセシング経路を促進する。したがって、そのような製剤は概念的に新規のものであり、代替の機構による免疫応答の刺激を促進することによって利益をもたらすことが見込まれる。

ｃ．医薬組成物を製造するための方法
さまざまな例示の実施形態は、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物も包含する。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、油中水型エマルションを用いるものであることもあり、無機塩を含む懸濁液とされることもある。

大きな集団によって医薬組成物が使用されるためには、安全性は別の重要考慮要因となる。多くの臨床試験において油中水型エマルションが使用されているものの、製剤において使用するための主要なアジュバントは依然としてアラムであり、これはアラムが安全性を有するが故のことである。したがって、臨床応用のための調製物におけるアジュバントとしてアラムまたはその無機塩（リン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ））が使用されることが多い。

他のアジュバント及び免疫刺激剤には、３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３－ＤＭＰ、ポリマーアミノ酸またはモノマーアミノ酸（ポリグルタミン酸またはポリリジンなど）が含まれる。そのようなアジュバントは、他の特定の免疫刺激剤と併用されるか、または他の特定の免疫刺激剤を併用せずに使用され得る。こうした他の特定の免疫刺激剤は、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－スレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ｎｏｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）、Ｎ－アセチルグルコサミニル－Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－Ａｌ－Ｄ－イソグル－Ｌ－Ａｌａ－ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ－ＤＰＰ）Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標））、または他の細菌細胞壁成分などである。水中油型エマルションには、ＭＦ５９（Van Nest, G., et al.に付与されたWO1990/014837を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）（５％のスクアレン、０．５％のＴＷＥＥＮ８０、及び０．５％のＳｐａｎ８５（任意選択で、さまざまな量のＭＴＰ－ＰＥ）を含み、マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化されたもの）、ＳＡＦ（１０％のスクアレン、０．４％のＴＷＥＥＮ８０、５％のｐｌｕｒｏｎｉｃブロックポリマーＬ１２１、及びｔｈｒ－ＭＤＰを含み、マイクロフルイダイザーによってサブミクロンエマルションにされるか、またはボルテックスしてより大きな粒子サイズのエマルションを生成させたもの）、ならびにＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）（２％ のスクアレンと、０．２％のＴＷＥＥＮ８０と、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群から選択される１つ以上の細菌細胞壁成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標）））と、を含む）が含まれる。他のアジュバントには、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ならびにサイトカイン（インターロイキン（ＩＬ－１、ＩＬ－２、及びＩＬ－１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、ならびに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）など）が含まれる。

アジュバントの選択は、アジュバントを含む免疫原性製剤の安定性、投与経路、投薬スケジュール、免疫化される種に対するアジュバントの効力に依存し、ヒトでは、医薬的に許容可能なアジュバントは、関連規制機関によってヒトへの投与の認可を受けているか、または受けることが可能なものである。例えば、アラム、ＭＰＬ、または不完全フロイントアジュバント（Chang, J. C. C., et al., 1998）（当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）は、単独でもヒトへの投与に適し、任意選択でそれらを組み合わせたものもすべて、ヒトへの投与に適する。

組成物は、医薬的に許容可能かつ無毒な担体または希釈剤を含み得、こうした担体または希釈剤は、動物またはヒトへの投与向けの医薬組成物の製剤化に一般に使用される媒体として定義される。希釈剤は、組み合わせるものの生物学的活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及びハンクス液である。さらに、医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または無毒かつ非治療的な非免疫原性の安定化剤、及び同様のものも含み得る。

医薬組成物は、大型で代謝が緩徐な巨大分子も含み得、こうした巨大分子は、タンパク質、キトサンのような多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びコポリマー（例えば、ラテックス官能化ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、アガロース、セルロース、及び同様のもの）、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、ならびに脂質集合体（例えば、油滴またはリポソーム）などである。さらに、こうした担体は、免疫刺激剤（すなわち、アジュバント）として機能し得る。

本発明の医薬組成物は、適切な送達媒体をさらに含み得る。適切な送達媒体には、限定されないが、ウイルス、細菌、生分解性マイクロスフェア、微粒子、ナノ粒子、リポソーム、コラーゲンミニペレット、及び渦巻型ベシクルが含まれる。

ｄ．医薬組成物の使用方法
本開示は、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物の使用方法も含む。

ある特定の実施形態では、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物は、凝集ＩＡＰＰと関連する障害の治療に使用され得る。

いくつかの実施形態では、方法は、薬理学的に有効な量のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物を、それを必要とする宿主に投与することを含む。ある特定の実施形態では、方法は、薬理学的に有効な量のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物を温血動物（例えば、ヒト、マカク、モルモット、マウス、ネコなど）に投与することで、ヒトＩＡＰＰタンパク質または他の生物に由来するＩＡＰＰタンパク質（配列番号３～７）の凝集体と交差反応する高度に特異的な抗体を誘導することを含む。

ある特定の実施形態では、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物を使用することで、トランスジェニックマウスモデルにおける凝集ＩＡＰＰと関連する障害が治療され得る。

ｅ．インビトロの機能アッセイ及びインビボの概念実証試験
ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトによって免疫化された宿主において誘導される抗体は、インビトロの機能アッセイにおいて使用され得る。こうした機能アッセイには、限定されないが、下記のものが含まれる。
（１）血清学的アッセイ（ＥＬＩＳＡ及びドットブロットアッセイを含む）によるＩＡＰＰタンパク質（配列番号３～７）へのインビトロでの結合
（２）ＩＡＰＰモノマーまたはＩＡＰＰオリゴマーからＩＡＰＰ線維への凝集のインビトロでの抑制
（３）凝集ＩＡＰＰがＲＩＮ－ｍ５Ｆ５細胞に及ぼす細胞毒性のインビトロでの抑制
（４）トランスジェニックマウスモデルにおける凝集ＩＡＰＰ及び凝集ＩＡＰＰによって引き起こされる障害（Ｔ２Ｄなど）のインビボでの低減

特定の実施形態
（１）約２０個以上のアミノ酸を有するＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトであって、前記ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトが、下記の式：
（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－（ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチド）－Ｘ
または
（ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチド）－（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ－Ｘ
または
（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－（ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチド）－（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ－Ｘ
によって表され、
式中、
Ｔｈが、異種ヘルパーＴ細胞エピトープであり、
Ａが、異種スペーサーであり、
（ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチド）が、ＩＡＰＰ（配列番号３）に由来する６～約２８個のアミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープペプチドであり、
Ｘが、アミノ酸のα－ＣＯＯＨまたはα－ＣＯＮＨ_２であり、
ｍが、１～約４であり、
ｎが、０～約１０である、前記ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト。

（２）前記ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチドが、配列番号８～６９からなる群から選択される、（１）に記載のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト。

（３）前記Ｔｈエピトープが、配列番号７３～１１２及び配列番号１７１～１８２からなる群から選択される、（１）に記載のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト。

（４）前記ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチドが、配列番号８～２６からなる群から選択され、前記Ｔｈエピトープが、配列番号７３～１１２及び配列番号１７１～１８２からなる群から選択される、（１）に記載のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト。

（５）前記ペプチド免疫原コンストラクトが、配列番号１１３～１６７からなる群から選択される、（１）に記載のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト。

（６）ａ．配列番号３～７のＩＡＰＰ配列に由来する約６～約２８個のアミノ酸残基を含むＢ細胞エピトープと、
ｂ．配列番号７３～１１２及び配列番号１７１～１８２ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヘルパーＴ細胞エピトープと、
ｃ．アミノ酸、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号７１）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号７２）、及びＰｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号７０）、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される任意選択の異種スペーサーと、
を含むＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトであって、
前記Ｂ細胞エピトープが、前記ヘルパーＴ細胞エピトープに対して、直接的に共有結合で連結されるか、または前記任意選択の異種スペーサーを介して共有結合で連結される、前記ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト。

（７）前記Ｂ細胞エピトープが、配列番号８～６９からなる群から選択される、（６）に記載のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト。

（８）前記任意選択の異種スペーサーが、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号７１）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号７２）、またはＰｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号７０）であり、配列中、Ｘａａが、任意のアミノ酸である、（６）に記載のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト。

（９）前記ヘルパーＴ細胞エピトープが、前記Ｂ細胞エピトープのアミノ末端またはカルボキシル末端に共有結合で連結される、（６）に記載のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト。

（１０）前記ヘルパーＴ細胞エピトープが、前記Ｂ細胞エピトープのアミノ末端またはカルボキシル末端に対して前記任意選択の異種スペーサーを介して共有結合で連結される、（６）に記載のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト。

（１１）（１）に記載のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物。

（１２）ａ．（１）に記載のペプチド免疫原コンストラクトと、
ｂ．医薬的に許容可能な送達媒体及び／またはアジュバントと、
を含む医薬組成物。

（１３）ａ．前記ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチドが、配列番号８～６９からなる群から選択され、
ｂ．前記Ｔｈエピトープが、配列番号７３～１１２及び配列番号１７１～１８２からなる群から選択され、
ｃ．前記異種スペーサーが、アミノ酸、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号７１）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号７２）、及びＰｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号７０）、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択され、
前記ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されることで、安定化された免疫刺激性複合体を形成する、（１２）に記載の医薬組成物。

（１４）ａ．前記ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトが、配列番号１１３～１３９及び配列番号１４０～１６７からなる群から選択され、
前記ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されることで、安定化された免疫刺激性複合体を形成する、（１２）に記載の医薬組成物。

（１５）動物においてＩＡＰＰに対する抗体を生成させるための方法であって、前記方法が、（１２）に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。

（１６）配列番号８～２５のアミノ酸配列に特異的に結合する単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。

（１７）前記ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトに結合した、（１６）に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。

（１８）（１６）に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合断片を含む組成物。

（１９）動物における凝集ＩＡＰＰと関連する障害を予防及び／または治療する方法であって、前記方法が、（１２）に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。

実施例１
ＩＡＰＰ関連ペプチドの合成及びその製剤の調製
ａ．ＩＡＰＰ関連ペプチドの合成
ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの開発労力の一部となったＩＡＰＰ関連ペプチドの合成方法について記載する。これらのペプチドは、血清学的アッセイ、実験室パイロット試験、及びフィールド試験に有用な小スケール量で合成すると共に、医薬組成物の産業的／商業的な生産に有用な大スケール（キログラム）量でも合成した。エピトープマッピング、ならびに有効なＩＡＰＰ標的指向型治療ワクチンにおける使用に最も適したペプチド免疫原コンストラクトのスクリーニング及び選択を目的として、アミノ酸数約６～２７の長さの配列を有するＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドの大きなレパートリーを設計した。

表１ならびに図１Ａ及び図１Ｃには、ヒトＩＡＰＰ及びその前駆体の全長配列（配列番号１～３）、さまざまな生物に由来する全長ＩＡＰＰ配列（配列番号４～７及び配列番号１８６～１９２）、ＩＡＰＰペプチド断片の配列（配列番号８～２６）、ならびにさまざまな血清学的アッセイにおいてエピトープマッピングに用いた１０マーペプチドの配列（配列番号２７～６９）が示される。

病原体タンパク質を由来元として慎重に設計したヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープペプチド（表２（配列番号７３～１１２及び配列番号１７１～１８２）に示す）に対して選択ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドを合成的に連結することによってＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを調製した。こうしたＴｈエピトープペプチドの由来元とした病原体タンパク質には、麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ）、Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質（ＨＢｓＡｇ）、インフルエンザ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ ｔｅｔａｎｉ、及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）が含まれる。こうしたＴｈエピトープペプチドを単一配列（例えば、配列番号７３～８３、配列番号８５～８９、配列番号９１～９２、配列番号９４～９５、配列番号９７～１７４、配列番号１７６～１７７、配列番号１７９～１８２）または組み合わせライブラリー配列（例えば、配列番号８４、配列番号９０、配列番号９３、配列番号９６、配列番号１７５、及び配列番号１７８）として使用することで、そのそれぞれのＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性を増強した。

表３には、数百のペプチドコンストラクトから選択した代表的なＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１１３～１６７）が示される。抗ＩＡＰＰ抗体を検出及び／または測定するための免疫原性試験または関連血清学的試験に使用したペプチドはすべて、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓのモデル４３０Ａペプチド合成機、モデル４３１ペプチド合成機、及び／またはモデル４３３ペプチド合成機によってＦ－ｍｏｃ化学を使用して小スケールで合成した。Ｎ末端をＦ－ｍｏｃで保護し、三官能性アミノ酸には側鎖保護基も用いて固相担体上での独立した合成によって各ペプチドを生成させた。合成が完了したペプチドを固相担体から切り離し、９０％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって側鎖保護基を除去した。マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析によって合成ペプチド調製物を評価してアミノ酸内容が正しいことを確かめた。逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によっても各合成ペプチドを評価して調製物の合成プロファイル及び濃度を確認した。合成プロセスの厳格な制御（カップリング効率のステップワイズ監視を含む）を行ったものの、アミノ酸の挿入、欠損、置換、及び中途終結を含めて、伸長サイクルの間の意図しない事象に起因してペプチド類似体も生成された。したがって、合成した調製物には、典型的には、狙ったペプチドに加えて複数のペプチド類似体も含まれていた。

そのような意図しないペプチド類似体は含まれていたものの、それでもなお、得られた合成ペプチド調製物は、免疫学的診断（抗体捕捉抗原として）及び医薬組成物（ペプチド免疫原として）を含めて、免疫学的応用における使用に適したものであった。典型的には、そのようなペプチド類似体は、意図的に設計したものにしても、副生成物の混合物として合成プロセスを介して生じたものにしても、製造プロセス及び製品評価プロセスの両方を監視するために識別ＱＣ手順が開発されて、こうしたペプチドを用いる最終製品の再現性及び効力が保証される限りにおいては、所望のペプチドの精製調製物と同じくらい有効であることが多い。数百グラム～キログラム量での大スケールのペプチド合成は、カスタマイズされた自動化ペプチド合成機ＵＢＩ２００３または同様のもので、１５ミリモル～１５０ミリモルスケールで実施可能である。

臨床試験のための最終的な医薬組成物において使用する活性成分については、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを、緩やかな濃度勾配でグラジエント溶出する分取ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析、アミノ酸分析、及びＲＰ－ＨＰＬＣによってその純度及び独自性を特徴付けた。

ｂ．ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物の調製
油中水型エマルションを用いる製剤、及び無機塩を含む懸濁液における製剤を調製した。大きな集団によって使用されるように医薬組成物を設計するには、安全性は別の重要考慮要因となる。多くの臨床試験において油中水型エマルションが医薬組成物としてヒトに使用されているという事実はあるものの、医薬組成物において使用するための主要なアジュバントは依然としてアラムであり、これはアラムが安全性を有するが故のことである。したがって、臨床応用のための調製物におけるアジュバントとしてアラムまたはその無機塩（ＡＤＪＵＰＨＯＳ（リン酸アルミニウム））が使用されることが多い。

簡潔に記載すると、以下に記載の試験群のそれぞれに具体的に記載される製剤には、一般に、すべての型のデザイナーＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含めた。多数のデザイナーＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを、Ｂ細胞エピトープペプチドとして使用した対応ＩＡＰＰペプチドに対するその相対的な免疫原性について、モルモットにおいて慎重に評価した。異なる相同ペプチドに対するエピトープマッピング及び血清学的交差反応性の分析を、配列番号３～６９を含むリストから選択されるペプチドでコートされたプレートを使用するＥＬＩＳＡアッセイによって行った。

異なる量のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを、ヒトでの使用が認可された油としてＳＥＰＰＩＣ ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１を用いて油中水型エマルションとして調製するか、または無機塩ＡＤＪＵＰＨＯＳ（リン酸アルミニウム）もしくはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（アラム）と混合した（明記されるように行った）。典型的には、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを約２０～２，０００μｇ／ｍＬで水に溶解することによって組成物を調製し、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１を用いて油中水型エマルションにして製剤化（体積で１：１）するか、または無機塩ＡＤＪＵＰＨＯＳもしくはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（アラム）を用いて製剤化（体積で１：１）した。組成物を室温で約３０分間保持し、約１０～１５秒間ボルテックスすることによって混合してから免疫化に使用した。特定の組成物の２～３回用量を用いて動物を免疫化し、この組成物は、初回免疫化後経過週数（ｗｐｉ）が０の時点（プライム）及び３の時点（ブースト）で投与し、２回目のブーストについては任意選択で５ｗｐｉまたは６ｗｐｉの時点で実施し、これらの投与は、筋肉内経路によって実施した。その後、免疫化動物から得られた血清を、選択したＢ細胞エピトープペプチド（複数可）を用いて試験することで、製剤中に存在するさまざまなＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性、及びＩＡＰＰタンパク質を用いた全長ＩＡＰＰオリゴマーまたは全長ＩＡＰＰ凝集体との対応血清の交差反応性について評価した。モルモットにおける最初のスクリーニングにおいて強力な免疫原性を有することが明らかになったＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトについては、その対応血清の機能特性をインビトロアッセイにおいてさらに試験した。次に、選択した候補ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを、免疫化プロトコールによって示される特定期間にわたる投薬レジメン用として、油中水型エマルションベースの製剤、無機塩ベースの製剤、及びアラムベースの製剤として調製した。

新薬臨床試験開始届の提出に備えて行うＧＬＰ指針に沿う前臨床試験における免疫原性試験、持続期間試験、毒性試験、及び効力試験、ならびに凝集ＩＡＰＰと関連する障害に罹患している患者でのその後の臨床試験のための最終的な製剤に組み込む前に、最も有望なＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトのみ、さらなる評価を広範に実施した。

下記の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲の限定に使用してはならない。

実施例２
血清学的アッセイ及び試薬
以下では、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤の機能的免疫原性を評価するための血清学的アッセイ及び試薬について詳述される。

ａ．免疫原性及び抗体特異性を分析するための、ＩＡＰＰベースまたはＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドベースのＥＬＩＳＡ試験
以下の実施例に記載の免疫血清試料を評価するためのＥＬＩＳＡアッセイを開発し、このアッセイについて以下に記載した。２μｇ／ｍＬ（別段の記載がない限り）のＩＡＰＰまたはＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチド（例えば、配列番号３～６９）を含む１０ｍＭのＮａＨＣＯ_３緩衝液（ｐＨ９．５）（別段の記載がない限り）を１００μＬ用いて９６ウェルプレートのウェルを３７℃で個々に１時間コートした。

ＩＡＰＰまたはＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドでコートしたウェルを、ゼラチン含量３重量％のＰＢＳ（２５０μＬ）と共に３７℃で１時間インキュベートして非特異的なタンパク質結合部位をブロッキングした後、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０含量０．０５体積％のＰＢＳを用いて当該ウェルを３回洗浄し、乾燥させた。正常ヤギ血清含量２０体積％、ゼラチン含量１重量％、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０含量０．０５体積％のＰＢＳを用いて、分析対象の血清を（別段の記載がない限り）１：２０希釈した。希釈した検体（例えば、血清、血漿）のうちの１００μＬを各ウェルに添加し、３７℃で６０分間反応させた。次に、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０含量０．０５体積％のＰＢＳを用いてウェルを６回洗浄して非結合抗体を除去した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合型の種（例えば、モルモットまたはラット）特異的ヤギポリクローナル抗ＩｇＧ抗体またはプロテインＡ／Ｇを標識型トレーサーとして使用することで、陽性ウェルにおいて形成された抗体／ペプチド抗原複合体と結合させた。正常ヤギ血清含量１体積％、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０含量０．０５体積％のＰＢＳ中に、あらかじめ力価測定して決定した最適な希釈率でＨＲＰ標識型検出試薬を含めたものを、各ウェルに１００μL添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０含量０．０５体積％のＰＢＳを用いてウェルを６回洗浄して非結合抗体を除去し、クエン酸ナトリウム緩衝液中に３’，３’，５’，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を０．０４重量％、過酸化水素を０．１２体積％含む基質混合物１００μＬを用いてウェルでの反応をさらに１５分間行った。この基質混合物を使用して、着色生成物を形成させることによってペルオキシダーゼ標識を検出した。１．０ＭのＨ_２ＳＯ_４を１００μＬ添加することによって反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度（Ａ_４５０）を決定した。さまざまなペプチドワクチン製剤を投与したワクチン接種動物の抗体力価の決定には、１０倍の段階希釈を行って１：１００～１：１０，０００希釈液とした血清を試験するか、または４倍の段階希釈を行って１：１００～１：４．１９×１０^８希釈液とした血清を試験した。試験した血清の力価（Ｌｏｇ_１０として表される）は、Ａ_４５０のカットオフ値を０．５としてＡ_４５０の線形回帰分析によって計算した。

ｂ．免疫原性及び抗体特異性を分析するための、モノマー全長ＩＡＰＰ分子、オリゴマー全長ＩＡＰＰ分子、または凝集全長ＩＡＰＰ分子を用いたドットブロット試験
この実験ではＰＶＤＦ膜及びＢｉｏ－Ｄｏｔ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用した。この装置にＰＶＤＦ膜を組み入れてから、ＰＶＤＦ膜をメタノールで洗浄した。２００μＬのＴＢＳＴ（０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＴＢＳ緩衝液）を各ウェルに２回ロードして残存メタノールを洗浄除去した。１００ｎｇの標的タンパク質または標的ペプチド（例えば、モノマーＩＡＰＰ、オリゴマーＩＡＰＰ、または凝集ＩＡＰＰ）をウェルに入れ、吸引によって捕捉した。ＩＡＰＰでコートしたウェルを、１０％の脱脂乳を含む２００μＬのＴＢＳと共に３７℃で１時間インキュベートして非特異的なタンパク質結合をブロッキングし、その後に０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＴＢＳで３回洗浄し、乾燥させた。免疫化モルモットから得られた血清試料の希釈液１００μＬを各ウェルに添加し、３７℃で２時間反応させた。その後、０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＴＢＳを用いてウェルを５回洗浄した。装置を開けてＰＶＤＦ膜を取り出した。次に、５％の脱脂乳を含むＴＢＳで最適に希釈して調製したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗モルモットＩｇＧと共に膜をインキュベートした。このインキュベートでは、この試薬を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＴＢＳを用いてウェルを３回洗浄し、膜を化学発光基質と反応させた。この反応をＵＶＰ ＢｉｏＤｏｃ－Ｉｔ ２２０ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍによって検出した。

ｃ．ＴｈペプチドベースのＥＬＩＳＡ試験によるＴｈペプチドに対する抗体反応性の評価
２μｇ／ｍＬ（別段の記載がない限り）のＴｈペプチドを含む１０ｍＭのＮａＨＣＯ_３緩衝液（ｐＨ９．５）（別段の記載がない限り）を１００μＬ用いて９６ウェルプレートのウェルを３７℃で個々に１時間コートし、上記と同様のＥＬＩＳＡ法に供し、上記のようにＥＬＩＳＡを実施した。ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含むさまざまな製剤を投与したワクチン接種動物の抗体力価の決定には、１０倍の段階希釈を行って１：１００～１：１０，０００希釈液とした血清を試験した。試験した血清の力価（Ｌｏｇ_１０として表される）は、Ａ_４５０のカットオフ値を０．５としてＡ_４５０の線形回帰分析によって計算した。

ｄ．Ｂ細胞エピトープクラスター１０マーペプチドベースのＥＬＩＳＡ試験によるエピトープマッピングによって決定した標的ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドの詳細な特異性分析
ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトで免疫化した宿主から得られた抗ＩＡＰＰ抗体の詳細な特異性分析を、Ｂ細胞エピトープクラスター１０マーペプチドベースのＥＬＩＳＡ試験を使用するエピトープマッピングによって実施した。簡潔に記載すると、個々のＩＡＰＰまたはＩＡＰＰ関連１０マーペプチド（配列番号２６～６９）をウェル当たり０．５μｇ／０．１ｍＬで用いて９６ウェルプレートのウェルをコートした。その後、上記の抗体ＥＬＩＳＡ法のステップに従って１０マープレートウェル中で１００μＬの血清試料（ＰＢＳ中１：１００希釈液）を２連でインキュベートした。免疫化した宿主から得られた抗ＩＡＰＰ抗体についての標的Ｂ細胞エピトープ関連の詳細な特異性分析を、対応するＩＡＰＰペプチド、または特異性を確認するための無関係な対照ペプチドを用いて実施した。

ｅ．免疫原性の評価
実験ワクチン接種プロトコールに従って免疫前血清試料及び免疫血清試料を動物対象から採取し、５６℃で３０分間加熱して血清中補体因子を不活化した。ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む製剤の投与後に、プロトコールに従って血液試料を採取し、特定の標的部位（複数可）に対するその免疫原性を、対応ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドベースのＥＬＩＳＡ試験を行って評価した。段階希釈した血清を試験し、希釈率の逆数のＬｏｇ_１０として陽性力価を表した。所望のＢ細胞応答を増強するために用いたヘルパーＴ細胞エピトープへの抗体反応性を低いもの～無視できる程度のものに維持しながら、標的抗原内の所望のエピトープへの特異性及びＩＡＰＰポリペプチドとの高い交差反応性が得られるように指向化された高力価抗体応答を誘発する能力について、特定の製剤の免疫原性を評価した。

実施例３
ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤によって誘導される抗体の機能特性の評価
（１）ＩＡＰＰのモノマー形態、オリゴマー形態、及び線維形態に結合し、（２）ＩＡＰＰアミロイド線維形成を抑制し、（３）ＲＩＮ－ｍ５Ｆ細胞におけるｈＩＡＰＰ凝集体の細胞毒性作用を抑制する能力について、モルモットで得られた免疫血清または精製抗ＩＡＰＰ抗体をさらに試験した。

ａ．ＩＡＰＰオリゴマーの生成
高度に精製されたモノマーＩＡＰＰを１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）に溶解し（１ｍｇ／ｍＬ）、３７℃で２時間インキュベートした。その後にＳｐｅｅｄＶａｃ装置によって溶媒ＨＦＩＰを除去し、当該ペプチドを濃度２０μｇ／μＬでＤＭＳＯに再懸濁した後、１％のＳＤＳを含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）でさらに希釈してその最終濃度を１００μＭとした。

３７℃でのインキュベートを一晩行った後、透析を実施した。Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ １０Ｋ ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ）に試料をロードし、１％ＳＤＳ／ＰＢＳを用いて室温で２４時間透析した。緩衝液を２４時間に１回交換することによってＳＤＳ濃度を段階的に２倍希釈し、この希釈を、ＳＤＳ濃度が０．０１％を下回るまで続けた。

ｂ．ドットブロットアッセイ
免疫原性及び抗体特異性を分析するために、全長ＩＡＰＰポリペプチドモノマー、全長ＩＡＰＰポリペプチドオリゴマー、または全長ＩＡＰＰポリペプチド凝集体を用いて、前述の実施例２に記載のようにドットブロット試験を実施した。結果を図４、図５、及び図６に示す。

ｃ．チオフラビンＴ（ＴｈＴ）アッセイ
ＴｈＴ（Ｓｉｇｍａ）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解し、１０ｍＭに希釈してストック溶液とし、その後にさらに３０μＭに希釈してワーキング溶液とした。上記のようにＩＡＰＰオリゴマー及びＩＡＰＰモノマーを調製した。このオリゴマーまたはモノマーをＤＭＳＯに溶解後、ＰＢＳで希釈してその最終濃度を３０μＭにした。この溶液に対して、モルモット免疫血清から精製したＩｇＧ（１００μｇ／ｍＬ）を添加し、この溶液を３７℃でインキュベートした。その後、この溶液をＴｈＴと１：１の比で混合して試験してそのＲＦＵ（相対蛍光単位）を得た。このＲＦＵは、０時間及び２４時間の両方の時点で、励起波長を４４０ｎｍ、蛍光波長を４８５ｎｍとして読み取った。

ｄ．細胞
ＲＩＮ－ｍ５Ｆ細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入し、５％ＣＯ_２雰囲気、３７℃の加湿インキュベーターにおいて、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、４．５ｇ／ＬのＬ－グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ培地中で維持した。

ｅ．ＭＴＴ細胞生死判定アッセイ
ＲＩＮ－ｍ５Ｆ細胞（２０，０００個細胞／ウェル）を９６ウェルマイクロプレート（１００μＬ／ウェル）中で培養し、３７℃で一晩インキュベートした。さまざまな濃度の抗体を存在させた各ウェルにヒトオリゴマー（総ペプチド濃度５μＭ）を添加した。ＩＡＰＰモノマー／オリゴマー調製物については、上記のように調製した。ＩＡＰＰのモノマー調製物、オリゴマー調製物、または凝集線維調製物をＤＭＳＯに溶解させた後、ＰＢＳで希釈してその最終濃度を４０μＭとした。次に、これらのＩＡＰＰ調製物を、ＩＡＰＰ調製物由来の細胞死を抗体が中和する能力を評価するためのアッセイを実施する前に、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトに対する精製モルモットポリクローナル抗体の段階希釈調製物と共にインキュベートした。インキュベート後、ＲＩＮ－ｍ５Ｆ細胞を含むウェルにＩＡＰＰ調製物／抗体混合物を添加し、２４時間保持した。

細胞の処理に先立ってＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）をＰＢＳに溶解した（５ｍｇ／ｍＬ）。各ウェルから培地を除去後に１１０μＬのＭＴＴ／培地混合物（１０％ＭＴＴ）を各ウェルに添加した。次に、細胞を３７℃で４時間インキュベートした。混合物を除去後に、８０μＬのＤＭＳＯを各ウェルに添加し、細胞を３７℃でさらに１０分間インキュベートした。５４０ｎｍで色の強度を測定した。

Ｒｉｎ－ｍ細胞（２×１０^５個細胞／ｍＬ）を９６ウェルマイクロプレート（１００μＬ／ウェル）中で培養し、３７℃で一晩インキュベートした。さまざまな濃度の抗体を存在させた各ウェルにヒトオリゴマー（総ペプチド濃度５μＭ）を添加した。各測定を４回繰り返した。対照測定では、最高濃度の抗体単独で測定を実施して細胞生存率に対して抗体が何らかの作用を及ぼすかを評価した。３７℃での６時間のインキュベート後にＭＴＴアッセイを行って細胞生存率を評価した。

実施例４
４．安全性試験、免疫原性試験、毒性試験、及び効力試験において使用した動物
ａ．モルモット：
免疫原性試験は、成熟、ナイーブ、かつ成体の雄性及び雌性のＤｕｎｃａｎ－Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（３００～３５０ｇ／ＢＷ）において実施した。実験では、群当たり少なくとも３匹のモルモットを利用した。

Ｄｕｎｃａｎ－Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（８～１２週齢、Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）と関連するプロトコールは、ＵＢＩスポンサーの契約動物施設において、認可されたＩＡＣＵＣ申請内容で実施した。

ｂ．カニクイザル：
免疫原性試験及び反復投与毒性試験は、成体の雄性サル及び雌性サル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、年齢約３～４歳；Ｊｏｉｎｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｕｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ）を用いて、ＵＢＩスポンサーの契約動物施設において、認可されたＩＡＣＵＣ申請内容で実施した。

ｃ．マウス：
高脂肪高スクロース飼料（ＨＦＦＤ）を与えたｈＩＡＰＰ発現トランスジェニックマウスモデル：ＦＶＢ／ｈＩＡＰＰ（ヘミ接合型）ＲＨＦＳｏｅｌ／Ｊマウスにおいて代表的なＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを検証した。予防効力及び／または治療効力は、グルコース代謝及びインスリン分泌の機能性試験を行うと共に、膵臓中のβ細胞量及びｈＩＡＰＰアミロイド負荷ならびにｈＩＡＰＰの血漿中レベルを決定することによって評価した。

実施例５
モルモットにおけるＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性評価のための製剤
ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬製剤を調製した。簡潔に記載すると、各試験群に明記した製剤には、一般に、異なる型のスペーサー（例えば、ペプチドコンストラクトの溶解性を増強するためのεＬｙｓ（εＫ）及び／またはリジン－リジン－リジン（ＫＫＫ））を介して連結されたＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドのセグメントと、非選択的Ｔｈエピトープ（麻疹ウイルス融合タンパク質及びＢ型肝炎表面抗原に由来する２つの人工Ｔｈエピトープセットを含む）と、を含むすべての型のデザイナーＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含めた。ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドは、デザイナーペプチドコンストラクトのＮ末端またはＣ末端に連結した。多数のデザイナーＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを、対応ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドに対するその相対的な免疫原性について、モルモットにおいて最初に評価した。さまざまな量のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを、ヒトでのワクチン使用が認可された油としてＳＥＰＰＩＣ ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５１を用いて油中水型エマルションとして調製するか、または無機塩（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）もしくはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（アラム）を用いて懸濁液として調製した（明記されるように行った）。製剤は、通常、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを約２０～８００μｇ／ｍＬで水に溶解することによって調製し、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５１を用いて油中水型エマルションにして製剤化（体積で１：１）するか、または無機塩（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）もしくはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（アラム）を用いて製剤化（体積で１：１）した。製剤を室温で約３０分間保持し、約１０～１５秒間ボルテックスすることによって混合してから免疫化に使用した。

特定の製剤の２～５回用量を用いて何匹かの動物を免疫化し、この製剤は、初回免疫化後経過週数（ｗｐｉ）が０の時点（プライム）及び３の時点（ブースト）で投与し、２回目のブーストについては任意選択で５ｗｐｉまたは６ｗｐｉの時点で実施し、これらの投与は、筋肉内経路によって実施した。その後、こうした免疫化動物から得られた血清を、それぞれの製剤において使用した対応ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトに対する免疫原性、対応ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドを含む全長ＩＡＰＰのオリゴマーもしくは凝集体に対する免疫原性、または全長ＩＡＰＰに対する免疫原性について評価した。モルモットでの初期のスクリーニングにおいて強力な免疫原性を有していたＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトについては、免疫化プロトコールによって示される特定期間にわたる投薬レジメン向けに、油中水型エマルションベースの製剤、無機塩ベースの製剤、及びアラムベースの製剤としてマカクにおいてさらに試験した。

高度に免疫原性であったＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトについては、対応マウスＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを使用して、マウスにおいて免疫寛容を打ち破る能力についてさらに評価した。マウスでの免疫原性が最良であったＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、内在性ＩＡＰＰに対する抗ＩＡＰＰ抗体力価を誘導した。

最適化されたＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトについては、新薬臨床試験開始届の提出に備えて行うＧＬＰ指針に沿う免疫原性試験、持続期間試験、毒性試験、及び効力証明試験、ならびに凝集ＩＡＰＰと関連する障害を有する患者における臨床試験のための最終的な製剤に組み込むことができる。

実施例６
凝集ＩＡＰＰと関連する障害を治療するためのＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを組み込んだ複数成分ワクチン製剤の設計根拠、スクリーニング、同定、機能特性評価、及び最適化
背景技術セクションに記載の科学的情報に基づいて、本開示のペプチド免疫原コンストラクトを設計するための標的ポリペプチドとしてＩＡＰＰを選択した。図１Ｃは、ヒト由来のＩＡＰＰ配列（配列番号３）、ネコ由来のＩＡＰＰ配列（配列番号４）、マカク由来のＩＡＰＰ配列（配列番号５）、及びいくつかの他の生物に由来するＩＡＰＰ配列の配列アライメントを示す。さらに、ＩＡＰＰと関連する遺伝的特徴及び生理学については他の研究者によって説明されている（例えば、Hayden, M. R., et al., 2001及びHay, D. L., et al., 2015）。図２は、高精度デザイナーＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの発見から商業化（産業化）までの経路を示す。こうしたステップのそれぞれの詳細な評価及び分析を行うことで、安全かつ有効なＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト含有医薬製剤の商業化を最終的にもたらすことになる無数の実験をこれまでに行うに至っている。

ａ．設計履歴
それぞれのペプチド免疫原コンストラクトまたは免疫療法製品には、その特定の疾患機序及び介入を要する標的タンパク質（複数可）に基づくそれ独自の設計着目及び手法が必要である。凝集ＩＡＰＰと関連する障害を治療するために、背景技術及び図１Ａ～１Ｃに概要を示した科学的情報に基づいてＩＡＰＰを標的分子として選択した。図２に示す発見から商業化までの経路には、典型的には、その達成に１０年以上を要するものである。免疫原コンストラクトを設計するには、介入対象の機能性部位（複数可）と関連するＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドを同定することが重要である。さまざまなヘルパーＴ細胞支援物（担体タンパク質または適切なヘルパーＴ細胞ペプチド）をさまざまな製剤に組み込んでモルモットにおいてパイロット免疫原性試験を連続的に実施し、その後に、いくつかのインビトロ機能アッセイまたは選択動物モデルでの概念実証インビボ試験において、精製した誘導抗体の機能特性または特定のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを用いた製剤について評価した。広範な血清学的検証時には、候補ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチド免疫原コンストラクトを非ヒト霊長類においてさらに試験することで、ＩＡＰＰペプチド免疫原設計の免疫原性及び方向性をさらに検証することができる。選択したＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを異なる混合物として調製することで、併用時のペプチドコンストラクトの間のそれぞれの相互作用と関連する機能特性の微妙な差異を評価することができる。追加の評価時には、最終的なペプチドコンストラクト、ペプチド組成物、及びその製剤を、そうした製剤のそれぞれの物理的パラメーターと併せて確立することで、最終的な製品開発プロセスに繋げることができる。

本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、多くの理論的根拠に基づいて設計及び選択されたものであり、こうした理論的根拠には、下記のものが含まれる。
（ｉ）ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドは、それ単独では非免疫原性であることで、自己Ｔ細胞の活性化が回避される。
（ｉｉ）ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドは、タンパク質担体または強力なヘルパーＴ細胞エピトープ（複数可）を使用することによって免疫原性にされ得る。
（ｉｉｉ）ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドが免疫原性にされ、宿主に投与されると、ペプチド免疫原コンストラクトは、
ａ．ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープ（複数可）に対して選択的に指向化されており、タンパク質担体またはヘルパーＴ細胞エピトープ（複数可）に対しては指向化されていない高力価抗体を誘導し、
ｂ．免疫化された宿主における免疫寛容を打ち破り、全長ＩＡＰＰ（例えば、配列番号３～７）のオリゴマーまたは凝集体との交差反応性を有する高度に特異的な抗体を生成させ、
ｃ．ＩＡＰＰモノマーまたはＩＡＰＰオリゴマーが凝集してＩＡＰＰ線維になることを抑制する能力を有する高度に特異的な抗体を生成させ、
ｄ．凝集ＩＡＰＰが関連細胞毒性をβ細胞に及ぼすことを抑制する能力を有する高度に特異的な抗体を生成させ、
ｅ．凝集ＩＡＰＰをインビボで低減する能力を有する高度に特異的な抗体を生成させ、
ｆ．凝集ＩＡＰＰによって引き起こされる障害を治療及び／または予防する能力を有する。

本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤は、医薬組成物またはワクチン製剤として効果的に機能することで、凝集ＩＡＰＰと関連する障害に罹患しやすいまたは罹患している対象に予防及び／または治療を与え得る。

ｂ．凝集ＩＡＰＰと関連する障害に罹患している患者を治療する可能性を有する医薬組成物向けのＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの設計及び検証
医薬組成物に含める上で最も強力なペプチドコンストラクトを得るために、ヒトＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチド（例えば、配列番号８～６９）及びさまざまな病原体に由来する非選択的ヘルパーＴ細胞エピトープまたは人工ヘルパーＴ細胞エピトープ（例えば、配列番号７３～１１２及び配列番号１７１～１８２）のレパートリーをさらに設計し、免疫原性試験（最初はモルモットでのもの）のための代表的なＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト（例えば、配列番号１１３～１６７）とした。

ｉ）（ａ）ＩＡＰＰ易凝集性部位、（ｂ）ＩＡＰＰポリペプチドと膜との相互作用に関与する部位、及び（ｃ）β細胞の細胞毒性に関与する部位、に由来するＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチド配列の選択
ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープを設計するためにＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチド配列を選択した。次に、こうしたＢ細胞エピトープを用いてペプチド免疫原コンストラクトを調製してモルモットにおいて抗体を誘導させ、こうした抗体を、それぞれのＢ細胞エピトープペプチドまたは全長ＩＡＰＰを使用するＥＬＩＳＡによって最初は免疫原性評価に供し、その次に、インビトロ機能アッセイ評価に使用した。

モルモットにおける４００μｇ／１ｍＬでのプライム免疫化、ならびに１００μｇ／０．２５ｍＬでのブースト（３ｗｐｉ、６ｗｐｉ、及び９ｗｐｉの時点で投与を実施）を行うために、ＩＳＡ５１及びＣｐＧと共にＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１１３～１３８（配列番号８～２６のＢ細胞エピトープを含む））を免疫原性試験用として最初に製剤化した。こうしたペプチド免疫原コンストラクトには、ＩＡＰＰのＮ末端領域に由来するＢ細胞エピトープ（配列番号１１３～１２１）、ＩＡＰＰの中央領域に由来するＢ細胞エピトープ（配列番号１２２～１３２）、及びＩＡＰＰのＣ末端領域に由来するＢ細胞エピトープ（配列番号１３３～１３８）を含めた。

モルモットにおいてＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性を試験するために、さまざまな時点（０ｗｐｉ、３ｗｐｉ、６ｗｐｉ、９ｗｐｉ、１２ｗｐｉ、及び１５ｗｐｉ）での採血から得られたモルモット免疫血清を１０倍の段階希釈に供して１：１００～１：１０，０００希釈液としてＥＬＩＳＡアッセイを行った。ウェル当たりのペプチド量を０．５μｇとして全長ヒトＩＡＰＰペプチド（配列番号３）でＥＬＩＳＡプレートをコートした。Ａ_４５０のカットオフ値を０．５としてＡ４５０の線形回帰分析によって被検血清の力価（Ｌｏｇ_１０として表される）を計算した。

表４は、０ｗｐｉ、３ｗｐｉ、６ｗｐｉ、９ｗｐｉ、１２ｗｐｉ、及び１５ｗｐｉの時点で各免疫化動物について得られた免疫原性の結果を示す。図４は、各ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１１３～１３８）の平均相対免疫原性プロファイル（９ｗｐｉの時点でのモルモット血清で得られたもの）のまとめを示す。容易に見て取れるように、ＩＡＰＰのＣ末端領域から得られたペプチド免疫原コンストラクトまたはＩＡＰＰのＣ末端領域を含むペプチド免疫原コンストラクトが、ＩＡＰＰポリペプチドの他の領域に由来するペプチド免疫原コンストラクトと比較して相対的に高い免疫原性を有している。配列番号１２９のペプチド免疫原コンストラクト（１５～３７のアミノ酸を有するＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープ（配列番号１８）を含むもの）の免疫原性が最も高かった。

ｉｉ）自己ヘルパーＴ細胞エピトープは選択ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープ内には存在しない
一般的には、そして理想的には、短いＢ細胞エピトープペプチドは、内在性Ｔｈエピトープが存在しないことから、それ単独では非免疫原性である。単独で高度に免疫原性である短いＢ細胞エピトープペプチドは、アミノ酸配列内にＴｈエピトープが存在することを示唆するものである。したがって、選択した短いＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドに対する実験を実施して、それが単独で免疫応答を誘発する能力を有するかどうかを決定した。

具体的には、ａａ１～１３（配列番号９）を含む短いＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチド、及びａａ１～１６（配列番号１０）を含む短いＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドを評価した。これらの短いＢ細胞エピトープペプチドを含む製剤を用いてモルモットを免疫化することで、表５に示すように、これらのペプチドが非免疫原性であることが明らかとなった。一方で、これらの短いＢ細胞エピトープは、外来Ｔｈエピトープ（ＵＢＩＴＨ（登録商標）１；配列番号９７）を含むペプチド免疫原コンストラクト中に存在する場合は、かなりの免疫応答を誘発することができた。具体的には、配列番号１１５及び配列番号１１６（それぞれ配列番号９のＢ細胞エピトープ及び配列番号１０のＢ細胞エピトープを含む）は、ペプチド免疫原コンストラクトとして存在する場合は、表４に示すように免疫原性となる。したがって、外来Ｔｈエピトープを使用することで、短い非免疫原性Ｂ細胞エピトープペプチドの免疫原性が増強された。

ｉｉｉ）ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトによって誘発される抗体応答は、ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープのみを標的とする
標的Ｂ細胞エピトープペプチドに対する免疫応答の増強に使用される担体タンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）タンパク質、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）タンパク質、及び破傷風トキソイド（ＴＴ）タンパク質）は、そのようなＢ細胞エピトープペプチドとそれぞれの担体タンパク質とが化学的に結合された場合、免疫化宿主において抗体を誘導することになるが、こうした抗体の９０％超が増強担体タンパク質に対するものであり、標的Ｂ細胞エピトープに対して指向化された抗体は１０％に満たない。

それ故に、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの特異性を評価することで、Ｂ細胞エピトープペプチドに対して抗体が指向化され、Ｔｈエピトープには指向化されないことを確認することは興味深いことである。２つの代表的なＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１３７及び配列番号１３６）（それぞれＩＡＰＰのａａ３０～３７由来のＢ細胞エピトープ（配列番号２６）及びＩＡＰＰのａａ２５～３７由来のＢ細胞エピトープ（配列番号２５）が、スペーサーを介して異種Ｔ細胞エピトープＵＢＩＴｈ（登録商標）１（配列番号９７）と連結されたもの）を免疫原性評価用として調製した。配列番号１３７及び配列番号１３６を用いて免疫化したモルモットから得られた血清を、ＵＢＩＴｈ（登録商標）１ペプチドに対するその免疫原性についてＥＬＩＳＡアッセイによって評価することで、免疫増強に使用したＵＢＩＴｈ（登録商標）１ペプチドとのその交差反応性について試験した。この実験では、免疫血清のすべてではないにせよ、そのほとんどが、表６に示すようにＵＢＩＴｈ（登録商標）１には非反応性であることが明らかとなった。こうした結果は、こうしたコンストラクトの免疫原性が、その対応標的ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドに対しては高いものであったこととは対照的であり、このことは、単回投与時でさえＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープ（複数可）に対して生成された抗体が高力価（約５Ｌｏｇ_１０）であったことによって示された（表４に示す配列番号１３６及び配列番号１３７）。

まとめると、標的ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドと慎重に選択したヘルパーＴ細胞エピトープとを連結して組み込むという単純な免疫原設計によって、対応ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドのみを標的とする集中的な免疫応答を生成させることが可能になる。医薬組成物の設計については、ペプチド免疫原が生成させる免疫応答の特異性が高ければ高いほど、そうしたペプチド免疫原によって組成物に備わる安全性プロファイルが向上する。したがって、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトは、そのＢ細胞標的に対して高度に特異的かつ極めて強力であり、このことは、本開示のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトが非常に安全でもあることを示唆している。

ｉｖ）選択したＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトに対して指向化された免疫血清を用いる詳細なエピトープマッピング
抗体結合部位（複数可）をＩＡＰＰポリペプチド内の特定残基に帰属させるために詳細なエピトープマッピング試験を実施した。具体的には、ＩＡＰＰポリペプチドのアミノ酸－７からアミノ酸４４までをカバーする４３種類のオーバーラップする１０マーペプチド（配列番号２７～６９）を合成し、これによって、ＩＡＰＰの全長領域に加えて、当該プロセシング済ＩＡＰＰポリペプチドの前後の前駆体配列も併せてカバーされるようにした。これらの１０マーペプチドを固相免疫吸着物質として９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル上に個々にコートした。複数のペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１１８、配列番号１１３、配列番号１１６、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、及び配列番号１３７）に対するモルモット抗血清を、検体希釈緩衝液での１：１００希釈液として、２．０μｇ／ｍＬの１０マーペプチドをコートしたＥＬＩＳＡプレートウェルに添加し、その後に３７℃で１時間インキュベートした。プレートのウェルを洗浄緩衝液で洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型ｒプロテインＡ／Ｇを添加し、３０分間インキュベートした。ＰＢＳでの洗浄後、基質をウェルに添加して、ＥＬＩＳＡプレートリーダーによって４５０ｎｍでの吸光度を測定した。試料の分析は２連で実施した。ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトで免疫化した動物から得られた免疫血清に由来する抗体が、対応ＩＡＰＰ Ｂ細胞エピトープペプチドがコートされたウェルに結合することを評価して最大抗体結合シグナルを決定した。

この詳細なエピトープマッピング実験から得られた結果を表７に示す。結果のまとめは以下の通りである。
ａ．ＩＡＰＰのＣ末端領域から得られたペプチド免疫原コンストラクトまたはＩＡＰＰのＣ末端領域を含むペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１２８、配列番号１２９、及び配列番号１３３～１３７）は全長ＩＡＰＰペプチド（配列番号３）に対する反応性が高い抗体を誘導した。こうしたコンストラクトのすべてが、ＩＡＰＰのａａ２８～３７に由来する１０マーペプチドに対して指向化された強力な抗体を誘導した。配列番号１２８のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト（ａａ１１～３７）、配列番号１２９のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト（ａａ１５～３７）、配列番号１３４のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト（ａａ２０～３７）、及び配列番号１３５のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト（ａａ２３～３７）は、ＩＡＰＰの他のＢ細胞エピトープ領域に対する反応性は有さないことが明らかとなった。
ｂ．ＩＡＰＰの中央領域に由来するペプチド免疫原コンストラクトまたはＩＡＰＰの中央領域を含むペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２８、及び配列番号１２９）では、全長ＩＡＰＰポリペプチドに対する弱～中程度の反応性が得られた。配列番号１２５のペプチド免疫原コンストラクトでは、ａａ１８～２９にまたがるＢ細胞エピトープとの中程度の反応性が得られた一方で、配列番号１２３のペプチド免疫原コンストラクトでは、ａａ１１～２０をカバーするＢ細胞エピトープペプチドとの排他的な反応性が得られた。ａａ１１～２０は、ＩＡＰＰの中央に位置する膜結合アルファヘリックス領域である。
ｃ．ＩＡＰＰのＮ末端領域をカバーするＢ細胞エピトープペプチドに由来するペプチド免疫原コンストラクトまたはＩＡＰＰのＮ末端領域をカバーするＢ細胞エピトープペプチドを含むペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１１８、配列番号１１３、及び配列番号１１６）では、全長ＩＡＰＰポリペプチドに対する比較的弱い反応性が得られた。

まとめると、ＩＡＰＰのＣ末端領域に由来するＢ細胞エピトープまたはＩＡＰＰのＣ末端領域を含むＢ細胞エピトープを含む設計合成ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトはモルモットにおいて強固な免疫応答を誘導し、この免疫応答によって、ＩＡＰＰを構成する１０マーペプチドの異なるクラスターを標的とするポリクローナル抗体が生成された。配列番号１３３のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト（ａａ１８～３７のＢ細胞エピトープを含む）では、ａａ１８～２９（ＩＡＰＰ易凝集性領域付近）に対する集中的な反応性が得られた。このエピトープマッピング試験は、追加の機能アッセイ評価とも併せて、最適なペプチド免疫原コンストラクト製剤を同定することを可能にするものである。

ｖ）ドットブロット結合アッセイによるＩＡＰＰモノマー結合プロファイル
配列番号１１３～１３８のペプチド免疫原コンストラクトによって誘導された抗体を、ＩＡＰＰモノマーへのその結合能力について評価した。図５は、１２ｗｐｉの時点で採取したモルモット免疫血清を用いたドットブロット結合アッセイによるＩＡＰＰモノマー結合プロファイルを示す（すべての試料を２連で分析した）。この結果は、ＩＡＰＰのＣ末端領域から得られたペプチド免疫原コンストラクトまたはＩＡＰＰのＣ末端領域を含むペプチド免疫原コンストラクト（例えば、配列番号１２８、配列番号１２９、及び配列番号１３４～１３８）では、その他のペプチド免疫原コンストラクトと比較してＩＡＰＰモノマーに対する結合が最も強いプロファイルが得られたことを実証するものである。

ｖｉ）ドットブロット結合アッセイによるＩＡＰＰオリゴマー結合プロファイル
配列番号１１３～１３８のペプチド免疫原コンストラクトによって誘導された抗体を、ＩＡＰＰオリゴマーへのその結合能力について評価した。図６は、１２ｗｐｉの時点で採取したモルモット免疫血清を用いたドットブロット結合アッセイによるＩＡＰＰオリゴマー結合プロファイルを示す（すべての試料を２連で分析した）。この結果は、ＩＡＰＰのＣ末端領域から得られたペプチド免疫原コンストラクトまたはＩＡＰＰのＣ末端領域を含むペプチド免疫原コンストラクト（例えば、配列番号１２８、配列番号１２９、及び配列番号１３４～１３８）では、その他のペプチド免疫原コンストラクトと比較してＩＡＰＰオリゴマーに対する結合が最も強いプロファイルが得られたことを実証するものである。

ｖｉｉ）ドットブロット結合アッセイによるＩＡＰＰ線維結合プロファイル
配列番号１１３～１３８のペプチド免疫原コンストラクトによって誘導された抗体を、ＩＡＰＰ線維へのその結合能力について評価した。図７は、１２ｗｐｉの時点で採取したモルモット免疫血清を用いたドットブロット結合アッセイによるＩＡＰＰ線維結合プロファイルを示す（すべての試料を２連で分析した）。この結果は、ＩＡＰＰのＣ末端領域から得られたペプチド免疫原コンストラクトまたはＩＡＰＰのＣ末端領域を含むペプチド免疫原コンストラクト（例えば、配列番号１２８、配列番号１２９、及び配列番号１３４～１３８）では、その他のペプチド免疫原コンストラクトと比較してＩＡＰＰオリゴマーに対する結合が最も強いプロファイルが得られたことを実証するものである。

ｖｉｉｉ）１２ｗｐｉの時点のモルモット免疫血清から得られた抗ＩＡＰＰ抗体によるＩＡＰＰ凝集の抑制による、モノマーから線維への線維形成及びオリゴマーから線維への線維形成の抑制の明示
本開示のペプチド免疫原コンストラクト及びそれによって誘導された抗体を、（ａ）モノマーから線維へのＩＡＰＰ凝集、及び（ｂ）オリゴマーから線維へのＩＡＰＰ凝集を抑制するその能力について試験した。具体的には、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）蛍光アッセイを実施することで、モノマーから線維への線維形成またはオリゴマーから線維への線維形成の抑制を示した。

全長ＩＡＰＰモノマー、全長ＩＡＰＰオリゴマー、及び全長ＩＡＰＰ線維に対する、１２ｗｐｉ時点の免疫血清によるドットブロット結合プロファイル（図５～７に基づく）を、それらの相対強度に沿って並べた。これについては、パターン認識が容易になるように表８にまとめた。図８に示すように、モノマーからの線維形成及びオリゴマーからの線維形成が著しく抑制されることが明らかとなった。ＩＡＰＰの中央～Ｃ末端領域（易凝集性）に由来するＩＡＰＰエピトープまたはＩＡＰＰの中央～Ｃ末端領域（易凝集性）を含むＩＡＰＰエピトープをカバーするコンストラクトでは選択的な抑制が見られた。Ｎ末端領域（ＩＡＰＰによる膜結合に関与する）で見られた線維形成抑制は、中央領域及びＣ末端領域と比較して弱いものであった。

図８は、配列番号１１３～１３８の対応ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを用いて１２ｗｐｉ時点のモルモット免疫血清から得られた抗ＩＡＰＰ抗体によるＩＡＰＰ凝集の抑制を示す。すべての試料を２連で分析した。

実施例７
ＲＩＮ－ｍ５Ｆｓ細胞に対する細胞毒性の抑制についての、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤によって誘導される抗体のエクスビボ様式での機能特性評価
表４、表５、表６、表７、及び表８に示すように、ＩＡＰＰ免疫原コンストラクトを用いて免疫化したモルモットの免疫血清から精製した抗体が高い免疫原性及び交差反応性を有していることが実証された後、下記の試験を実施することで、本開示のペプチド免疫原コンストラクトによって生成される抗体がＲＩＮ－Ｍ５Ｆｓ細胞においてＩＡＰＰオリゴマーの細胞毒性を抑制する能力を評価した。

具体的には、免疫前血清の存在下、またはＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１１３～１３８）での免疫化で得られた１２ｗｐｉ時点のモルモット免疫血清に由来する抗ＩＡＰＰ抗体の存在下で４０μＭの凝集ＩＡＰＰオリゴマーに曝露した後のＲＩＮ－ｍ５Ｆｓ細胞の生存率を評価した。最大細胞生存率は、ＲＩＮ－ｍ５Ｆｓ細胞の対照試料をＰＢＳに曝露して決定した（この場合、細胞培養物へのＩＡＰＰオリゴマーの添加は行わなかった）。

図９中の上の棒グラフは、免疫前血清の存在下、またはＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１１３～１３８）によって誘導された抗ＩＡＰＰ抗体の存在下で凝集ＩＡＰＰオリゴマーに曝露したＲＩＮ－ｍ５Ｆｓ細胞の細胞生存率を、ＰＢＳ対照に対する相対値として示したものである（上の棒グラフ中で１００％に位置する点線は、ＰＢＳ対照の細胞生存率に対応する）。プールした免疫前血清から精製した抗体調製物を陰性対照とした。この陰性対照は最大細胞毒性に相当するものである（細胞生存率約６０％）。上の棒グラフには、配列番号１１３～１３８によって誘導された抗体の存在下で凝集ＩＡＰＰオリゴマーに曝露したＲＩＮ－ｍ５Ｆｓ細胞の相対細胞生存率も示される。

下記の式を使用して各実験試料の細胞毒性抑制率（％）を決定した。
（標的群の細胞生存率－免疫前群の細胞生存率）／（ＰＢＳ群の細胞生存率－免疫前群の細胞生存率）×１００＝細胞毒性抑制率（％）

各試料の細胞毒性抑制率は、図９に示す下の棒グラフ及び表において報告されている。負の細胞毒性抑制率（免疫前血清を下回る細胞生存率値に相当する）が得られた試料（すなわち、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１２２、配列番号１３０～１３２、及び配列番号１３８）には０．００％の抑制率値を割り当てた。

ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトで細胞毒性の顕著な保護／抑制が観測され、この保護／抑制の強度順は、Ｃ末端領域をカバーするＢ細胞エピトープを有するＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト、次いで、Ｎ末端膜相互作用領域に由来するもの、次いで、中央アルファヘリックス領域に由来するものであった。Ｃ末端領域に由来するペプチド免疫原コンストラクト（すなわち、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３３、配列番号１３４、及び配列番号１３５）では、ＩＡＰＰオリゴマーが及ぼす細胞毒性が最高に抑止／抑制されることが実証された。各試料の細胞毒性抑制率は、パターン認識が容易になるように表８にも報告されている。

まとめると、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトに対して指向化された免疫血清由来のポリクローナル抗体の免疫学的特徴及び機能的特徴（表８にまとめが示される）はすべて、ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを用いた能動免疫化による介入を行う予防様式及び治療様式での効力を実証するためにＩＡＰＰワクチン製剤を試験する上で有用な基準を与えるものである。

実施例８
ＦＶＢ／Ｎ－Ｔｇ（Ｉｎｓ２－ＩＡＰＰ）ＲＨＦＳｏｅｌ／ＪマウスのＩＩ型糖尿病（Ｔ２Ｄ）モデルにおける予防様式及び治療様式の両方でのＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの評価
候補ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤を、プラセボ群と併せて、ｈＩＡＰＰを発現する２つのトランスジェニックマウスモデル（ｈＩＡＰＰ^＋／＋ＴＧマウス及びｈＩＡＰＰ^＋／－ＴＧマウス）：（１）ＦＶＢ／ｈＩＡＰＰ（ホモ接合型）ＲＨＦＳｏｅｌ／Ｊマウス（標準試料を与えた）及び（２）ＦＶＢ／ｈＩＡＰＰ（ヘミ接合型）ＲＨＦＳｏｅｌ／Ｊマウス（高脂肪高スクロース飼料（ＨＦＦＤ）を与えた）において検証した。

ＲＩＰＨＡＴ導入遺伝子についてホモ接合型であるマウスは生存可能かつ繁殖性であり、ラットインスリンＩＩプロモーターの調節制御下でｈＩＡＰＰを発現する。この導入遺伝子に由来するｈｕＩＡＰＰ ＲＮＡは膵臓、腎臓、及び胃で観察される一方で、ｈ－ＩＡＰＰタンパク質は膵臓組織のみで報告されている。ホモ接合型の雄は、ベータ細胞死に起因して自発的に糖尿病を発症する。このベータ細胞死は、インスリン分泌障害（低インスリン血症）、高血糖、及び異常な細胞内ｈ－ＩＡＰＰ凝集体（提供研究者の報告によれば、この種のバックグラウンドでは細胞外凝集体は見られない）と関連している。ホモ接合型の雄の発症は４～８週齢に生じ、この雄は１６週齢付近で死に至る。ホモ接合型の雌は重症度の低い表現型を示す。ＲＩＰＨＡＴトランスジェニックマウスは、インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）またはＩＩ型糖尿病と関連するベータ細胞破壊及び膵島アミロイド沈着、ならびに小胞体（ＥＲ）ストレス経路のベータ細胞アポトーシス及び特徴を研究する上で有用であり得る。

ＲＩＰＨＡＴ導入遺伝子についてヘミ接合型のマウス（高脂肪高スクロース飼料（ＨＦＦＤ）を与えた）もまた、アミロイド自己集合能力を有するヒトＩＡＰＰを過剰発現する糖尿病関連表現型トランスジェニックマウスモデルとして検証されている。

ホモ接合体マウス（ｈＩＡＰＰ^＋／＋ＴＧマウス）ＦＶＢ／Ｎ－Ｔｇ（Ｉｎｓ２－ＩＡＰＰ）ＲＨＦＳｏｅｌ／Ｊ及びヘミ接合体マウス（ｈＩＡＰＰ^＋／－ＴＧマウス）：ＦＶＢ／ｈＩＡＰＰ（ヘミ接合型）ＲＨＦＳｏｅｌ／Ｊは両方共、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入可能である。ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの能動免疫化性質に加えて、ホモ接合体マウスは発症時期が４～８週齢と早く、１６週齢付近で死に至るという理由から、この効力試験では、発症までの期間が１２週間に長期化するヘミ接合体マウスを試験用に選択し、高脂肪高スクロース飼料（ＨＦＦＤ）によって維持した。この試験では、膵臓中のベータ細胞量及びｈＩＡＰＰアミロイド負荷、ならびにｈＩＡＰＰの血漿中レベルを評価することによる予防的疾患介入及び治療的疾患介入、ならびにグルコース代謝及びインスリン分泌の機能性試験を行った。より具体的には、抗体力価及び他の糖尿病関連パラメーター（空腹時血糖値、インスリン及びＩＡＰＰの血清中濃度など）を監視した。さらに、ｈＩＡＰＰオリゴマーによって誘導されるβ細胞への細胞毒性も試験を通じて評価した。

実験及び取り扱いの手順はすべて、動物の人道的扱いについてのＮＩＨ指針に従って、ＵＢＩ Ａｓｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の監督及び承認の下で実施した。

８時間の絶食後の血糖濃度を７日ごとに調べた。値の測定は、尾端から採取した血液試料を使用してｆｒｅｅｓｔｙｌｅ血糖値測定器（Ａｃｃｕ－ｃｈｅｋ Ｐｅｒｆｏｒｍａ）で行った。麻酔下でマウスを屠殺し、膵臓を摘出した。この膵臓を細断して小さな断片にし、ホモジナイズし、５ｍＬの酸アルコール（７０％ＥｔＯＨ中１．５％ＨＣｌ）中、４℃で数日間インキュベートすることによって膵臓からインスリンを抽出し、１Ｍのトリス緩衝液を１：１の比で用いて中和した。この抽出は、酸アルコール中で実施したため、プロテアーゼ阻害剤の添加は不要であった。インスリンレベルの決定は、超高感度インスリンＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）を使用して実施した。血液試料は顎下静脈から採血した。抗体の血清中力価はＥＬＩＳＡによって評価した。

組織の採取及び分析：
４％のパラホルムアルデヒド２０ｍＬを、心臓を介して通液することで鎮静状態のマウスを灌流固定し、膵臓を冷ＰＢＳ中に摘出し、重量測定後に４％のパラホルムアルデヒド中、４℃で２４時間固定化し、パラフィン中に包埋した。組織切片（４μｍ）を脱パラフィン処理後、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）／０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０で洗浄してから、ＴＢＳ／０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／３％ＢＳＡ／２％正常ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を用いて室温で３時間ブロッキングした。ヒトＩＡＰＰ抗体（Ｅ－５，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）またはインスリン抗体（Ｈ－８６，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で切片を処理した。ＬＳＭ ５１０ Ｍｅｔａ共焦点レーザー顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して画像を取得した。

抗体精製
処理群及び対照群から得られた抗体をプロテインＡ／Ｇカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。血清をローディング緩衝液（２０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、２ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ７））で１：２０希釈し、５ｍｌのプロテインＡ／Ｇカラムにロードし、素通り部の収集及びその再ロードを３回実施した。結合した抗体を０．１Ｍのクエン酸（ｐＨ３．０）で溶出し、１ｍｌの溶出液につき１Ｍのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和し、２００μｌのトリス緩衝液を添加した。タンパク質含有画分を統合し、２リットルのＰＢＳ緩衝液に対して透析した（１６時間、４℃）。ブラッドフォード試薬（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して抗体濃度を決定した。

ＩＡＰＰオリゴマーがＲｉｎ－ｍ細胞に及ぼす毒性に対する抗体中和効果
Ｒｉｎ－ｍ細胞（２×１０^５個細胞／ｍＬ）を９６ウェルマイクロプレート（１００μＬ／ウェル）中で培養し、３７℃で一晩インキュベートした。さまざまな濃度の抗体を存在させた各ウェルにヒトオリゴマー（総ペプチド濃度５μＭ）を添加した。各測定を４回繰り返した。対照測定では、最高濃度の抗体単独で測定を実施して細胞生存率に対して抗体がいずれの作用も及ぼさないことを確認した。３７℃での６時間のインキュベート後にＭＴＴアッセイを行って細胞生存率を評価した。

統計解析
定量結果は、平均値±ＳＤとして示される。統計解析は、対照群と試験群との間でのスチューデントｔ検定によって実施した。Ｐ値≦０．０５を有意と見なした。^＊Ｐｖ≦０．０５、^＊＊Ｐｖ≦０．００５、及び^＊＊＊Ｐｖ≦０．０。

ｈＩＡＰＰ＋／－ＴｇマウスＩＩ型糖尿病（Ｔ２Ｄ）モデルにおいてＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトの予防効力及び治療効力を評価する実験プロトコールをそれぞれ図１０及び図１１に示す。

試験では群当たりの総マウス数を１０匹とし、１群はプラセボ群とされる。ＩＳＡ５１及びＣｐＧと共に製剤化した対応ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトが４０μｇ／０．５ｍＬ用量で筋肉内経路を介してプライム免疫化及びブースト免疫化として実験群のマウスに注射されることになる。ＷＰＩが０、３、６、及び９の時点で投与が行われ、全部で４回の用量が投与されることになる。すべてのマウスが高脂肪高スクロース飼料（ＨＦＦＤ）及び水を自由接種することになる。ＷＰＩが０、３、６、９、１２、１５、１８、及び２２の時点でマウスの採血が行われることで、ＥＬＩＳＡによる抗体力価及びドットプロットアッセイ及びＭＴＴ細胞生死判定アッセイを含めて、効力パラメーターが試験される。体重増加及び高血糖を含むＴ２Ｄの臨床症状は１週間に１回評価される。血糖濃度は８～１０時間の絶食後に調べられる。ＷＰＩが９、１２、１５、１８、及び２１の時点での腹腔内ブドウ糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）については、８～１０時間の絶食後に腹腔内注射を介してグルコースが１ｍｇ／ｇＢＷで動物に投与され、０分、１５分、３０分、６０分、９０分、及び１２０分の時点で尾静脈から約３０μＬの血清が採取されることになる。膵臓中のインスリン量及びｈＩＡＰＰ蓄積は試験の終了時点で調べられる。

膵臓中のインスリン量及びｈＩＡＰＰ蓄積は、Ｔ２Ｄの病態形成において重要な役割を有していることが示唆されている。免疫組織化学的染色法を適用して膵臓組織を評価した。試験の終了時点で、麻酔下でマウスを屠殺し、膵臓を冷ＰＢＳ中に摘出し、重量測定後に４％のパラホルムアルデヒド中、４℃で２４時間固定化し、パラフィン中に包埋した。組織切片（４μｍ）を脱パラフィン処理後、マイクロ波照射抗原賦活化処理に供した。スライドにマウントした切片を抗原賦活化クエン酸溶液（Ｓｃｙｔｅｋ）中に浸漬し、最大出力のマイクロ波オーブン内で沸騰するまで加熱した後、室温で３０分間冷却した。３％の過酸化水素／ＰＢＳを用いて内在性ペルオキシダーゼ活性を１０分間ブロッキングした後、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）／０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０で洗浄してから、ＴＢＳ／０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／３％ＢＳＡ／２％正常ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を用いて室温で３時間ブロッキングした。ヒトＩＡＰＰ抗体（Ｅ－５，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）またはインスリン抗体（Ｈ－８６，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で切片を処理した。ＬＳＭ ５１０ Ｍｅｔａ 共焦点レーザー顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して画像を取得した。

Claims (19)

1. 約２０個以上のアミノ酸を有するＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトであって、前記ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトが、下記の式：
   （Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－（ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチド）－Ｘ
   または
   （ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチド）－（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ－Ｘ
   または
   （Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－（ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチド）－（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ－Ｘ
   によって表され、
   式中、
   Ｔｈが、異種ヘルパーＴ細胞エピトープであり、
   Ａが、異種スペーサーであり、
   （ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチド）が、ＩＡＰＰ（配列番号３）の６～約２８個のアミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープペプチドであり、
   Ｘが、アミノ酸のα－ＣＯＯＨまたはα－ＣＯＮＨ_２であり、
   ｍが、１～約４であり、
   ｎが、０～約１０である、前記ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト。
2. 前記ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチドが、配列番号８～６９からなる群から選択される、請求項１に記載のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト。
3. 前記Ｔｈエピトープが、配列番号７３～１１２及び配列番号１７１～１８２からなる群から選択される、請求項１に記載のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト。
4. 前記ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチドが、配列番号８～２６からなる群から選択され、前記Ｔｈエピトープが、配列番号７３～１１２及び配列番号１７１～１８２からなる群から選択される、請求項１に記載のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト。
5. 前記ペプチド免疫原コンストラクトが、配列番号１１３～１６７からなる群から選択される、請求項１に記載のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト。
6. ａ．配列番号３～７のＩＡＰＰ配列に由来する約６～約２８個のアミノ酸残基を含むＢ細胞エピトープと、
   ｂ．配列番号７３～１１２及び配列番号１７１～１８２ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヘルパーＴ細胞エピトープと、
   ｃ．アミノ酸、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号７１）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号７２）、及びＰｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号７０）、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される任意選択の異種スペーサーと、
   を含むＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトであって、
   前記Ｂ細胞エピトープが、前記ヘルパーＴ細胞エピトープに対して、直接的に共有結合で連結されるか、または前記任意選択の異種スペーサーを介して共有結合で連結される、前記ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト。
7. 前記Ｂ細胞エピトープが、配列番号８～６９からなる群から選択される、請求項６に記載のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト。
8. 前記任意選択の異種スペーサーが、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号７１）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号７２）、またはＰｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号７０）であり、配列中、Ｘａａが、任意のアミノ酸である、請求項６に記載のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト。
9. 前記ヘルパーＴ細胞エピトープが、前記Ｂ細胞エピトープのアミノ末端またはカルボキシル末端に共有結合で連結される、請求項６に記載のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト。
10. 前記ヘルパーＴ細胞エピトープが、前記Ｂ細胞エピトープのアミノ末端またはカルボキシル末端に対して前記任意選択の異種スペーサーを介して共有結合で連結される、請求項６に記載のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクト。
11. 請求項１に記載のＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物。
12. ａ．請求項１に記載のペプチド免疫原コンストラクトと、
    ｂ．医薬的に許容可能な送達媒体及び／またはアジュバントと、
    を含む医薬組成物。
13. ａ．前記ＩＡＰＰ機能性Ｂ細胞エピトープペプチドが、配列番号８～６９からなる群から選択され、
    ｂ．前記Ｔｈエピトープが、配列番号７３～１１２及び配列番号１７１～１８２からなる群から選択され、
    ｃ．前記異種スペーサーが、アミノ酸、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号７１）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号７２）、及びＰｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号７０）、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択され、
    前記ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されることで、安定化された免疫刺激性複合体を形成する、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. ａ．前記ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトが、配列番号１１３～１３９及び配列番号１４０～１６７からなる群から選択され、
    前記ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されることで、安定化された免疫刺激性複合体を形成する、請求項１２に記載の医薬組成物。
15. 動物においてＩＡＰＰに対する抗体を生成させるための方法であって、前記方法が、請求項１２に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。
16. 配列番号８～２５のアミノ酸配列に特異的に結合する単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。
17. ＩＡＰＰペプチド免疫原コンストラクトに結合した、請求項１６に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。
18. 請求項１６に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合断片を含む組成物。
19. 動物における凝集ＩＡＰＰと関連する障害を予防及び／または治療する方法であって、前記方法が、請求項１２に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。

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