TWI609026B - 抑制與免疫治療阿茲海默型癡呆的胜肽疫苗 - Google Patents

Description

抑制與免疫治療阿茲海默型癡呆的胜肽疫苗

本發明係有關於一種用於抑制及免疫治療阿茲海默型癡呆的胜肽疫苗及其配方。

阿茲海默症(AD)為最常見的癡呆類型，一種慢性、喪失認知能力的神經病變，嚴重的行為異常，甚至是死亡。約10%的65歲族群以及40%的85歲族群受到阿茲海默症的影響。不像其它會導致死亡的疾病，如心臟疾病、癌症與中風，由於藥物科技長足的發展使人類可活到發生癡呆風險的年紀，因此阿茲海默症的死亡率在下個2-30年會急劇增加。現今，在美國約有7-8%的醫療成本是花費在癡呆疾病。目前，美國約有250-400萬的癡呆病人，而全世界有1700-2500萬的癡呆病人，且至今尚無法完全治療或治癒此種破壤性疾病。

首先由Alois Alzheimer(1907)發現，2個顯微觀察結果，即神經纖維纏結與老年性澱粉樣斑為此疾病的病理特徵。傳統上，可利用活組織切片或屍體組織切片來診斷阿茲海默症。目前，已改成使用近期發展出的配位標記澱粉樣蛋白斑塊正電放射同位素，合併脊髓液中特定分子的認知試驗與分析來進行診斷，而不使用組織切片。

已有相當多的證據顯示β-澱粉樣蛋白(Aβ)-老年澱粉樣蛋白斑的主要成分在AD中扮演著非常重的角色。可由維基百科網頁中(http：//en.wikipedia.org/wiki/Beta_amyloid#cite_note-wales2010-41)獲得β-澱粉樣蛋白(Aβ)最新的相關報導(2013年2月13日)。成功的AD疾病-修飾治療為給予可影響β-澱粉樣蛋白沉澱的物質。參照Morgan,D.等人的“Immunotherapy for Alzheimer’s Disease”文獻(1)。

阿茲海默症必須，但不明顯的初始因子為Aβ所組成之澱粉樣蛋白的凝集。阿茲海默症與唐氏綜合症(引起早發型阿茲海默症)常見的家族遺傳型式為過度表現Aβ胜肽較長C端(42個胺基酸)。Aβ _1-42胜肽容易形成β折疊結構並且聚集成寡聚物與纖維。在產生認知病徵前，這些澱粉樣蛋白沉澱可能於腦中存在10年或更久。此疾病的第2病程為由過磷酸微管結合蛋白tau(hyperphosphorylated microtubule binding protein tau)形成突觸神經原纖維糾結。在沒有澱粉樣蛋白沉澱的情況下，Tau也會造成其它的神經退化性疾病，但其在臨床表現與腦中病理位置上不同於阿茲海默症。在tau轉殖老鼠模式中，顱內注射澱粉樣蛋白或配種表現Aβ沉澱的老鼠會引起tau沉澱。然而，以抗-Aβ免疫治療來抑制澱粉樣蛋白沉澱可抑制表現多種基因老鼠的tau病理形態。比起澱粉樣蛋白，Tau病理形態與認知狀態更相關，與心理狀態趨近一致。根據尚未確定的機制，這些病理會造成突觸功能、突觸的損失，最終造成神經元的喪失，導致大量的腦萎縮。

目前有各種關於此機制的假說。澱粉樣蛋白及/或tau 的中等程度凝集被認為與毒性有直接關係。即使是這疾病的最早階段，“輕度認知功能障礙(MCI)”仍具有大量斑塊與糾結(tangle)病理的產生，以及神經元的喪失。這些發現顯示出治療此疾病的最早階段，可實質地控制阿茲海默症，如同心血管疾病。

於1999年，發展出以疫苗來減少過度表現澱粉樣前驅蛋白之轉殖鼠的澱粉樣蛋白沉澱。之後，疫苗或Aβ被動免疫治療可恢復小鼠的記憶障礙。由免疫系統所主動產生或被動給予的Aβ特異性抗體可持續地減少不同的Aβ-澱粉樣變性轉殖鼠中的斑塊。

有鑑於疫苗在動物模式中的成功，且缺乏任何改變阿茲海默症疾病的治療，第一個臨床上試圖刺激AD病患免疫系統以產生Aβ抗體的疫苗稱為AN1792，其由全長的Aβ _1-42組成，含有B與T細胞抗原決定位，聚集成纖維。在第1期安全性臨床試驗中，對60個病患給予1或多劑量疫苗。最初可觀察到各種抗體反應，且許多接種的病患無法產生可偵測之Aβ胜肽抗原抗體力價。由於許多患者無法產生免疫反應，因此將疫苗配方改成含有QS-21佐劑，以試圖刺激第2期安全性與免疫原性臨床試驗的免疫原性。此目的為透過多次接種期望為免疫病患產生抗體力價。然而，由於有少部分病患(約6%)產生無菌性腦膜炎(一種中樞神經在(CNS)的發炎症狀)，因此此臨床試驗在短暫地開始後即停止。在CNS發炎的病患中，有2位病患死亡，在驗屍後發現CNS的T細胞浸潤，顯示具有腦膜炎。由此可知，AN1792疫苗配方的不良反應是疫苗所造成的自身免疫反應(2)。從功效的觀點來看， 以MRI所觀察到的鼠腦收縮及認知能力在疫苗組與安慰劑組兩者間並無不同。

僅管重新改進AN1792疫苗，利用針對Aβ胜肽之新穎疫苗及佐劑以免疫治療阿茲海默症的研發策略已成為一個需大量創造思考領域。大部分的情況下，由於在針對全長Aβ _1-42胜肽的疫苗人體試驗中發現不良反應，因此研發目標已變為B細胞活化、抗體保護與最小的T細胞參與(至少針對Aβ)。

目前，除了本發明人及其團隊之外，有4個使用各種針對Aβ片段之疫苗設計與配方的主動免疫第I/II期臨床試驗。這些臨床試驗包括：以Aβ _1-7 N端片段共軛連結白喉類毒素蛋白為免疫原的ACC-001(Elan Corporation Inc.與Wyeth)；使用Aβ ₁-₅ N端胜肽片段偶合Q β類病毒顆粒為免疫原的CAD106(ImmunodrugTM；Cytos Biotechnology AG與Novartis Pharma AG)；使用Aβ N端胜肽共軛連結ISCO-MATRIX的V950(Merck)；以及使用Aβ胜肽類似物共軛連結載體分子的GSK/Affiris。此外，還有一些針對Aβ的其他疫苗，可參照Tabira,T(3)。

如上述所有針對Aβ疫苗設計與配方的人類臨床試驗，面臨各抗體反應的弱免疫原性，接受這些疫苗的病患中有由30%至約70-80%可產生針對Aβ胜肽的抗體，其使得對疫苗所產生之抗-Aβ抗體進一步的分析變得複雜。所有的疫苗設計皆非常複雜，需要將非常短的Aβ胜肽片段共軛連結至一大型蛋白或類病毒載體，因此使得大部分的抗體反應是針對非所欲的載體，而不是短的目標胜肽；複雜的疫苗設計使得製造程序也為複雜，因此難以控制品質且不具經濟效益。由於使用的佐劑與配方可能具 有Th1活化特性，因此這些疫苗在安全性中具不確定性。此外，至今仍沒有疫苗具有任何臨床療效，例如接種疫苗後改善認知功能。

在已開發國家中，AD是一種最昂貴的社會疾病。新穎的治療必須抑制、延遲AD的發生或減緩AD的病程。即使可發現小鼠中的AD免疫干擾，但就Aβ人類疫苗以抑制阿茲海默症在安全性及功效上仍具有非常大的挑戰。由上述可知目前疫苗設計與配方在前臨床與臨床上的限制，業界亟需一種安全且有效的疫苗配方，以提供廣泛的免疫治療，防止及治療阿茲海默型癡呆。當此疫苗配方可成功地對抗阿茲海默型病徵時，其會成為治療此疾病的標準方法。

參考文獻

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本發明有關於Aβ胜肽免疫原的結構及含此Aβ胜肽免疫原結構的胜肽組成及其組合，含此Aβ胜肽免疫原結構之疫苗配方的藥學組成物，以及具有Aβ胜肽N端的Aβ胜肽免疫原結 構作為B細胞(B)抗原決定位，透過連接子連接至源自病原蛋白的異源性T輔助細胞(Th)，其可共同刺激產生高特異性針對Aβ胜肽N端的抗體，以提供AD患者或AD高風險個體保護性免疫反應。

在一實施例中，Aβ胜肽免疫原結構可包括源自Aβ _1-42胜肽中介於10至14個胺基酸之具有B細胞抗原位的雜合Aβ胜肽，例如，Aβ _1-10、Aβ _1-12、Aβ _1-14，其連接至源自病原性蛋白的異源性Th抗原決定位，例如，麻疹病毒融合(MVF)蛋白(SEQ ID NO：34)，其可共同刺激產生與老化斑塊(senile plaques)中全長Aβ _1-42胜肽(SEQ ID NO：1)具交叉反應的高特異性抗體。在另一實施例中，Aβ胜肽免疫原結構含有具有B細胞抗原位Aβ _1-14的雜合胜肽，其連接至可刺激老化斑塊(senile plaques)中全長Aβ _1-42胜肽交叉反應之各種病原蛋白(SEQ ID NOs：33至47)的異源性Th抗原決定位。關於刺激B細胞抗原位之Aβ _1-14胜肽的異源性Th抗原決定位，可透過免疫篩選測試獲得經常使用之源自天然病原菌的白喉毒素(SEQ ID NO：37)、惡性瘧原蟲(SEQ ID NO：38)、霍亂毒素(SEQ ID NO：40)，以及源自麻疹病毒融合蛋白(MVF 1至5)與B型肝炎表面抗原(HBsAg 1至3)的優化人工Th抗原決定位，其可為一單一序列或組合序列(例如，SEQ ID NOs：34與41至47)。在其它實施例中，含有Aβ胜肽免疫原結構與源自不同病原之異源性Th抗原決定位之混合物的胜肽組成物可覆蓋寬廣遺傳背景的病患，以治療與抑制阿茲海默型癡呆。在一實施例中，Aβ胜肽免疫原(SEQ ID NOs：62、63)與合併型式之源自MVF與HBsAg的異源性Th抗原決定位(SEQ ID NOs：44、45) 以等莫耳比例混合，作為一疫苗配方使用，可對不同遺傳背景之疫苗宿主族群提供最大覆蓋範圍。在發明胜肽組成物中，可發現Aβ胜肽免疫原結構具有協同性的刺激，且抗體反應幾乎(>90%)是針對全長的Aβ _1-42，而對異源性Th抗原決定位的免疫原性刺激則不多(如果有的話)。本發明與傳統蛋白質或其它用於刺激胜肽抗原性的生物性載體具有鮮明的對比。在另一實施例中，高度純化的Aβ胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：64 and 65)選擇性與單一序列的MVF、HBsAg異源性Th抗原決定位(SEQ ID NOs：46、47)以等莫耳比例混合，可對疫苗宿主族群提供最大覆蓋範圍。

本發明更揭示包括疫苗配方的藥學組成物，以治療及抑制阿茲海默型癡呆。在某些實施例中，藥學組成物包括一穩定的免疫原刺激複合物，其透過混合CpG寡聚物與含Aβ胜肽免疫原結構混合物之胜肽組成物電性結合，以進一步刺激針對老化斑塊中全長Aβ _1-42胜肽交叉反應的胜肽免疫原性。在其它實施例中，藥學組成物包括一Aβ胜肽免疫原結構混合物的胜肽組合物，其與作為佐劑的礦物鹽類(包括明礬凝膠(鋁膠)或磷酸鋁(Adjuphos)接觸，以形成提供至疫苗宿主的懸浮疫苗配方。在另一實施例中，藥學組成物包括一Aβ胜肽免疫原結構混合物的胜肽組合物，其與CpG寡聚物形成穩定的免疫原刺激複合物，選擇性地與作為佐劑的礦物鹽類(包括明礬凝膠(鋁膠)或磷酸鋁(Adjuphos)混合，以形成提供至疫苗宿主的懸浮疫苗配方。

本發明更揭示包括治療與抑制阿茲海默型癡呆的方法。此方法使用含有本發明Aβ胜肽免疫原結構之懸浮疫苗配方的藥學組成物，選擇性地與CpG寡聚物形成穩定的免疫原刺激複 合物，其進一步選擇性的輔以作為佐劑的礦物鹽類，以提供給具罹患阿茲海默症風險或阿茲海默症的患者。在某些實施例中，藥學組成物包括Aβ胜肽免疫原結構與其疫苗配方可刺激針對全長Aβ _1-42胜肽的抗體，以in vitro抑制纖維結構，並降低聚集Aβ寡聚物對神經細胞(如PC12細胞株)的毒性。在某些實施例中，接受疫Aβ胜肽免疫原結構疫苗配方的動物或病人可顯著地產生針對全長Aβ _1-42胜肽的抗體，且將毒性Aβ胜肽由中樞神經系統引至週邊系統，可疫苗宿主中血漿與血清的Aβ _1-40的證實。

在本發明其它實施例中，令人驚訝地發現含有Aβ胜肽免疫原的疫苗配方可利用肌肉注射給予至溫血動物中，特別是罹患阿茲海默型癡呆的人類。在本發明另一範疇中，本發明提供一含2種Aβ胜肽結構(SEQ ID NOs：64與65)的肌肉注射劑型。較佳的肌肉注射劑型為一疫苗配方，其含30μg至1000μg/0.5mL胜肽免疫結構複合CpG寡聚物，輔以0.5mL作為佐劑的礦物鹽燲，較佳為100μg至400μg/0.5mL，更佳為300μg/0.5mL。此劑型可儲存2年，且使用前可短暫置於2至8℃。劑型較佳以注射器進行肌肉注射至恆溫動物中，特別是手臂。對於劑型的加熱，可將劑型維持在環境溫度下15至45分鐘，如30分鐘。較佳在吸取藥物時，可將瓶子輕輕倒置幾次使準可視顆粒懸浮。

在本發明其它範疇中，令人驚訝地發現含有Aβ胜肽胜肽免疫原的疫苗配方可利用肌肉注射給予至溫血動物中，特別是罹患阿茲海默型癡呆的獼猴與人類，以刺激主要針對Aβ胜肽N端(Aβ _1-10胜肽)以及Aβ _1-14胜肽寡聚物、聚集物或老化斑塊外層的天冬胺酸(D)高特異性抗體，此可由抗原決定位分析試驗 證明。在本發明另一範疇中，令人驚訝地發現含有Aβ胜肽胜肽免疫原的疫苗配方可利用肌肉注射給予至溫血動物中，特別是罹患阿茲海默型癡呆的獼猴與人類，以刺激高特異性抗體，以刺激所有接種此疫苗配方之動物與病患產生主要針對Aβ _1-42胜肽N端的高特異性抗體，因此，可達到100%的抗體反應率，在疫苗發展上極為罕見。在本發明另一範疇中，令人驚訝地發現含有Aβ胜肽胜肽免疫原的疫苗配方可利用肌肉注射給予至60歲或更老的患者，在阿茲海默症的免疫治療上，首度發現臨床輕度阿茲海默症分類的患者在認知分數(ADAS-Cog，ADCS-CGIC，MMSE)上具有顯著的改善。

在本發明其它範疇中，本發明有關於一種抑制與治療人類阿茲海默型癡呆的方法，包括給予30至750μg，較佳為100至400μg，更佳為約300μg至需要的人類患者，約每12週一次，較佳為約每26週一次，且特別為每52週一次，依據病患針對全長Aβ胜肽的抗體反應，在初始免疫後第0、4、8週進行補強注射。

在上述的治療中，可利用適當的臨床試驗證實疫苗配方與Aβ胜肽免疫原結構的效力，如實施例所述，分別在第0、4、12週給予總共3劑量，每劑量300μg/0.5mL/劑的疫苗配方，可持續超過9個月。可依據抗體力價在每3、6或12個月時補強免疫1次。

適當的臨床試驗為在具罹患阿茲海默症或具阿茲海默症症狀的病患中進行開放式(open label)的試驗，或特別是隨機、雙盲、安慰劑對照、平行試驗。

本發明更提供一種方法，以獲得低製造成本且可控 制品質的Aβ胜肽免疫原結構與可保護具罹患阿茲海默症風險動物及病患的傳遞系統。

在其它範疇中，本發明提供一種Aβ _1-42的人類單株抗體，病患在接受本發明Aβ胜肽免疫原結構的疫苗配方後可刺激產生。已有文獻揭露一種方法，可有效地由人類患者血液之B細胞製備人類單株抗體，如Elisabetta Traggiai et al,in Nature Medicine 10,871-875(2004)所示。

第1圖為本發明特定實施例之疫苗配方由研發至商業化的開發流程圖。本發明依序由胜肽免疫原設計、胜肽組成物設計、疫苗配方設計、in vitro功能性抗原性設計、in vivo免疫原性及功效試驗設計、給藥計畫設計、及臨床試驗設計完成。各步驟的詳細評估使具安全性及有效性之疫苗配方最終可成功上市。

第2A-2B圖顯示高純化Aβ胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：65與64)的HPLC圖譜，其洗湜為20及21分鐘。第2C圖顯示分子量3892.274(理論分子量為3892.52)之Aβ胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：65)及第2D圖顯示分子量4374.568(理論分子量為4374.07(2 E))之Aβ胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：64)的質譜儀(MALDI-TOF)圖譜，顯示UBI AD疫苗(UB-311)配方中所使用之活性藥學成分的精確分子特性。第2E圖顯示於2-8℃儲存超過3年後，由UB-311疫苗配方萃取之二種Aβ胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：64與65)顯示如預期高度精準的HPLC圖譜、洗湜時間、等莫耳比例混合。

第3A-3B圖顯示具有SEQ ID NOs：46與47之Th胜肽的HLA第二類結合區。由於對接受疫苗之患者具有最大的遺傳背景覆蓋度，決定使用二種Aβ胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：64與65)，以擴大免疫反應。

第4圖顯示各種含量(0、10、30、100至300g/0.5mL/劑)之Aβ胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：64與65)合併固定量礦物鹽類之疫苗配方在天竺鼠中超過26週的抗體反應動力特性。

第5A圖顯示透過Aβ胜肽免疫原結構及CpG寡核苷酸(ODN)電荷合併/中和製備穩定胜肽/CpG免疫刺激複合物的示意圖，第5B圖接著製備含有此免疫刺激複合物及鋁礦物鹽的礦物鹽類疫苗。

第6圖顯示在不同佐劑存在下(Alhydrogel/NaCl+CpG ODN；Adjuphos/NaCl+CpG ODN；及NaCl+CpG ODN)，含300μg/0.5mL/劑Aβ胜肽免疫原結構之疫苗配方在狒狒的10週抗體動力特性。

第7圖顯示於2-8℃儲存超過2年後，含Aβ胜肽免疫原結構(等莫耳之SEQ ID NOs：64與65)之UBI AD疫苗在天竺鼠中的免疫原性試驗。UBI AD疫苗在初始及補強(3wpi)接種後仍維持高免疫原性及穩定性。

第8A-8H圖為阿茲海默症人類腦部免疫組織染色：胜肽預封阻試驗的特異性分析。分析成人組織切片(N=32)。所有正常組 織呈陰性。將接種Aβ胜肽免疫原結構(等莫耳之SEQ ID NOs：62與63)狒狒的血清及用於檢測與人類AD患者腦反應的IgG混合。可由高免疫狒狒血清純化之IgG發現腦血管和澱粉樣蛋白斑染色(第8B與8F圖)，但源自免疫前狒狒血清之類似IgG則未發現(第8A與8E圖)。與Aβ _1-14胜肽預培養之免疫血清(第8C與8G圖)可利用由高免疫血清之純化IgG吸收腦血管和澱粉樣蛋白斑所有的免疫反應性，但非相關胜肽(第8D與8H圖)，證明接種包含Aβ胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：62與63)之疫苗配方之高免疫血清的高特異性。

第9圖：在第0、3、6週(箭頭)免疫300μg/劑UBI AD疫苗礦物鹽配方之成年狒狒P.Anubis.的免疫原性試驗(◆，▲，●，■)，並以ELISA分析抗-Aβ抗體力價。在第一次免疫後，4隻狒狒中的3隻狒狒可產生抗-Aβ抗體力價。(B部分)在休息72週後，狒狒於第78、81、104週(箭頭)接種300μg(低劑量，●，■)或1200μg(高劑量，◆，▲)UBI AD疫苗礦物鹽類配方，並分析抗-Aβ抗體力價。在接種一次補強疫苗後，所有的4隻狒狒皆產生強大的抗-Aβ抗體反應。在2年試驗期間結束時，所有狒狒仍保持健康及活力。

第10A-10B圖：UBI AD疫苗對過渡表現hAPP751年輕轉殖小鼠之腦形態、皮層(第10A圖)及海馬迴(第10 B圖)的影響。分析源自僅接種佐劑之轉殖小鼠、接種UBI AD疫苗小鼠、以及未接種小鼠腦部樣本中β澱粉樣蛋白斑塊的量，並發現相較於未接 種及僅接種佐劑，UBI AD反應小鼠皮層與海馬迴中的斑塊減少。

第11A-11B圖：UBI AD疫苗對過渡表現hAPP751年輕轉殖小鼠之腦組織β澱粉樣肽(Aβ _1-42)濃度抑制模式的影響。利用相對的生化萃取由腦組織獲得位於Triton X-100部分中的小原纖維(Small protofibrils)(第11A圖)，以及位於SDS界面活性劑部分中的大型寡聚物及纖維(第11B圖)。接種UBI AD疫苗轉殖小鼠中X-100或SDS腦萃取物的原纖維或大型寡聚物及纖維遠小於未接種轉殖小鼠。

第12圖：經AD疫苗治療之患者的平均抗-Aβ _1-14抗體力價。將試驗期間第0及24/26週(n=17，藍色虛線)及後續觀察期間第0及48週(n=13，紅色虛線)的兩組數據繪製成圖。Aβ _1-14抗體Log₁₀力價隨著時間降低，但所有受試者在試驗結束時仍維持陽性反應(第48週)。

第13圖：年齡>60歲受試者在UBI AD疫苗試驗期間，第0及48週的平均ADAS-Cog(紅色圓形實心)、MMSE(藍色圓形空心)及抗-Aβ _1-14抗體力價(綠色實心條狀)，以及基礎值MMSE分數>20。

第14圖：接種UBI AD疫苗的輕度AD及其它大於60歲受試者(紅色實心圓形)及輕度ADTarenflurbil試驗中的安慰劑組(綠色實心三角形)之間12週平均ADAS-Cog分數的改變。相較於接種Tarenflurbil試驗[Green et al.,JAMA 2009；302(23)：257-2564]中安慰劑不良反應的分數增加(3.81改變)，輕度AD受試者在第0、4、 12週接種UBI AD疫苗後，6位>60歲輕度AD受試者第4、6、12個月(-3.00改變)不斷改善降低的分數。

第15A-15C圖：第I期臨床試驗中接種UBI AD疫苗受試者的免疫原性試驗。利用ELISA分析免疫前與第16週(在第0、4與12週最後一次UBI AD疫苗接種後4週)血清樣本，評估輕度至中度阿茲海默症免疫前(V1/V2；淺色)及免疫後(V7；深色)所有19位受試者血清樣本的抗-Aβ _1-14抗體。Aβ _1-28單體(第15A圖)、Aβ _1-42單體(第15B圖)、Aβ _1-42寡聚物(第15C圖)抗體力價(Log₁₀)。免疫前樣本中發現微量或沒有抗體反應(因此，在配對數據比較中幾乎沒有柵狀(bars)顯示)。在接種Aβ _1-28單體、Aβ _1-42單體及Aβ _1-42寡聚物(其位於Aβ胜肽的N端)後，所有受試者產生高抗-Aβ抗體力價，如第16圖所示。

第16圖：利用經免疫之阿茲海默症患者的血清分析Aβ _1-42 N端上抗原決定位定位的良好特異性分析。利用由接種UBI AD疫苗之患者採集的血清辨識針對Aβ _1-10胜肽的優勢抗原決定位。圖形顯示一種一位受試者(P210)的典型陽性抗原決定位定位反應，此受試者接種3劑UBI AD疫苗並產生2.198之Log₁₀力價之針對Aβ _1-14胜肽的抗-Aβ抗體。將血清以1：50比例稀釋，用於抗原決定位定位。峰值高度表示受試者對不同10-mer Aβ胜肽(SEQ ID NOs：6、8至30)的半抑制濃度(IC₅₀)。僅發現1個主要波峰，對Aβ序列N端，SEQ ID No：6(Aβ _1-10：DAEFRHDSGY)的高度特異性免疫原性。

本發明有關於個別Aβ胜肽免疫原結構、包含這些Aβ胜肽免疫原結構及其組合的胜肽組成物、包含疫苗配方中胜肽組成物的藥學組成物，以及作為B細胞(B)抗原決定位的Aβ胜肽N端(Aβ _1-10至Aβ _1-14)，透過間隔子連接源自病原體蛋白的異源性T輔助(Th)抗原決定位，其可共同刺激產生針對Aβ _1-42 N端的特異性抗體，提供阿茲海默症、或有罹患風險之病患保護性的免疫反應。

本發明更包括治療與抑制阿茲海默症的方法。本發明之方法使用含有Aβ胜肽免疫原結構形式之懸浮疫苗配方的藥學組成物，選擇性地與作為佐劑的礦物鹽類共同給予至阿茲海默症、或有罹患風險的患者。本發明更包括使用疫苗配方，以特定劑量、方式與劑型給予包含Aβ胜肽免疫原之疫苗配方，以治療與抑制阿茲海默症、或有罹患風險患者的方法。

本發明更提供一種方法，以獲得低製造成本且可控制品質的Aβ胜肽免疫原結構與可保護具罹患阿茲海默症風險動物及病患的傳遞系統。本發明之方法有關於一種穩定的免疫刺激複合物以及製備此免疫刺激複合物的方法。更特別是，本發明提供包含Aβ胜肽免疫原結構與高負電性寡聚物，如CpG寡聚物的穩定合成免疫刺激複合物，其可被使用於疫苗傳遞係統中，以刺激in vivo免疫反應。此免疫刺激複合物也可用於製備具儲存控制功能的疫苗配方。

在其它範疇中，本發明提供一種Aβ _1-42人類單株抗體，病患在接受本發明Aβ胜肽免疫原結構的疫苗配方後，可刺 激患者血液中的B細胞產生Aβ _1-42的人類單株抗體。

(a)β澱粉樣蛋白(Aβ)胜肽

(http：//en.wikipedia.org/wiki/Beta_amyloid)維基網站提供最近的β澱粉樣蛋白文章。此網頁內容可作為本發明說明的參考。

β澱粉樣蛋白(Aβ或Abeta)具有36-43個胺基酸的胜肽，是由澱粉樣前驅蛋白而來。Aβ是阿茲海默症患者腦中主要的沉澱成分。已證據證實Aβ是高度多功能胜肽，具有顯著的非病原活性。

澱粉樣前驅蛋白(APP)在被切除後，可形成Aβ，APP為一具未知功能的穿膜醣蛋白。APP可被α-、β-與γ-分泌酶切除；經由β-與γ-分泌酶的連續作用形成Aβ。γ-分泌酶可形成Aβ胜肽，γ-分泌酶切除APP的穿膜區，並形成36-43個胺基酸長度的異構物。最常見的異構物為Aβ _1-40(SEQ ID NO：2)與Aβ _1-42(SEQ ID NO：1)；較長形式的胜肽基本上是透過內質網內的切割產生，而較短形式的胜肽是透過高基式網絡內的切割產生(28)。Aβ _1-40形式更為常見，但Aβ _1-42(SEQ ID NO：1)更具纖維性，故與疾病有關。

APP中的體染色體顯性突變導致遺傳性早發性阿茲海默症(家族性AD或FAD)。此種AD形式佔所有病例不超過10%，且絕大多數的AD不屬於此種突變。然而，家族性阿茲海默症很可能是由改變蛋白水解過程所造成的結果。總Aβ量或Aβ _1-40與Aβ _1-42相對濃度的增加(其中前者多集中在腦血管斑塊，後者在神 經炎斑塊)與家族性與偶發性阿茲海默症有關。

由於其更為疏水性，因此Aβ _1-42為最常見的胜肽澱粉樣形式。然而，已知中間序列KLVFFAE(Aβ _16-22)(SEQ ID NOs：31)本身會形成澱粉樣蛋白，且可能會形成纖維的中心。

主要的研究已接受“澱粉樣蛋白學說”中阿茲海默症的病理狀況是由斑塊造成。另一學說則認為是澱粉樣寡聚物(amyloid oligomers)而非斑塊造成疾病。利用基因工程改造使小鼠表現寡聚物，但非斑塊(APP^E693Q)產生疾病。此外，將小鼠改造由寡聚物轉換為斑塊(APP^E693Q X PS1△E9)，而小鼠所受的傷害不會比寡聚物的小鼠大。原子力顯微鏡可觀察奈米級分子的表面，因此可用於in vitro分析Aβ胜肽的聚集狀態(寡聚物)。

有許多不同方式來計數β澱粉樣蛋白，其可利用免疫組織染色半定量法偵測，並進行定位。Aβ會主要存在於血管，如腦內澱粉樣血管病，或老化斑塊與血管。

一種計數Aβ的高敏感性方法是透過一定量ELISA(qELISA)，其可利用一對抗體辨識Aβ。

顯影化合物，尤其是匹茲堡(Pittsburgh)化合物B(6-OH-BTA-1、硫黃素)與florbetapir F18(18F-AV-45)，可選擇性地in vitro、in vivo結合至β澱粉樣蛋白。此技術可結合正電子發射斷層掃描(PET)來攝影阿茲海默症患者中斑塊沉積的影像。

(b)B細胞抗原決定位：Aβ胜肽N端

本發明有關於一種新穎胜肽組成物，用於產生高力價且對A β胜肽N端具特異性的寡聚抗體(oligoclonal antibody)，其可與AD患者腦中可溶性Aβ _1-42與斑塊交叉反應。藉由優化胜肽組成物的部位特異性，使載體蛋白不相關的反應最小化。

Aβ _1-42的N端片段為短鏈胜肽，如表一所示(如SEQ ID NOs：4至6)。Aβ胜肽的N端，如Aβ _1-14、Aβ _1-12、Aβ _1-10(SEQ ID NOs：4至6)不像Aβ _1-42與Aβ _1-28具有本身的非免疫原性，如實施例7，表4中第3組v.s.第1、2組的免疫原性試驗證實自體T輔助細胞抗原決定位(Th)的第15至第28個胺基酸具有Aβ _1-28免疫原性。這些短鏈Aβ片段可利用化學耦合載體蛋白，如Keyhole Limpet Hemocyanin(KLH)以增強免疫性，如實施例7，表6的第4組所示。“Aβ胜肽-載體”疫苗的主要缺點是，大部分(>90%)的抗體是針對載體蛋白KLH，且有抑制抗原決定位的可能，如實施例7，表6的第4組所示。

本發明免疫原為10至14個胺基酸的Aβ胜肽N端片段(或10至14殘基)，由N端的第1個胺基酸Asp(D)開始，整個合成胜肽免疫原包括這些Aβ胜肽片段與特定的T輔助細胞抗原決定位(Th)(如，SEQ ID NOs：33-47)，其含有多種第2類MHC結合位(MHC Class II binding motifs)以刺激產生僅針對Aβ _1-42胜肽上N端目標位的免疫反應，且對AD患者腦中的Aβ _1-42胜肽與老化斑塊具有高度的交叉反應。

(c)異源性T輔助細胞抗原決定位(Th抗原決定位)

T輔助細胞抗原決定位存在於抗原表現細胞的表面，其結合至MHC分子。T輔助細胞抗原決定位存在於MHC第I 類分子，通常為8至11個胺基酸的胜肽，而MHC第II類分子呈現13至17個較長胺基酸，且非典型MHC分子也呈現非胜肽抗原決定位，如醣脂類。

T輔助細胞(Th細胞)是一淋巴球的子群組，為一白血球，其在免疫系統中扮演重要的角色，特別是後天免疫系統。Th細胞可藉由釋放T細胞激素來幫助其他免疫細胞的活性。在B細胞抗體轉換中、細胞毒殺細胞的活化與增生中、以及極大化吞噬細胞(如巨噬細胞)的殺菌活性中，Th細胞是必需的。

T輔助細胞抗原決定位(Th抗原決定位)為T細胞抗原決定位，其存在於抗原呈現細胞的表面，其結合至MHC第II類分子，且長度為13至17個胺基酸，其可被T輔助細胞特異性辨識，如上所述。

結合至第II類主要組織相容性複合物(Major Histocompatibility Complex(MHC))分子的胜肽為驅動和控制免疫反應的關鍵。預測結合至特定MHC分子的胜肽在尋找可能的疫苗候選物上扮演重要的角色。MHC第II類分子的結合位在兩端呈現開放狀態，可讓大於9-mer的胜肽進行結合。由於結合胜肽的長度不同且9-mer結合核心的位置不同，因此在尋找可促進胜肽與MHC第II類分子結合的共同結構區上非常困難。當分子混雜且會與許多低親合性胜肽結合時，會增加尋找的困難度。

在過去20多年，發明人及其團隊已由各種病原菌的蛋白中，確定許多可能的Th抗原決定位與不同物種(如，人類、豬、牛等)第II類MHC分子的混雜結合結構區，以作為異源性Th抗原決定位(4)，特定的目標B細胞抗原決定位(如，Aβ胜肽片 段)可透過特定的設計連接於Th抗原決定位的N端或C端，以促進免疫原性，產生針對B細胞抗原決定位的高力價特異性抗體(5、6)。應注意的是，使用於疫苗中的設計免疫原可透過免疫實驗確定Th抗原決定位的效果，以此作為篩選步驟(如，實施例7的表4、5、6及7)以選擇優化的Th抗原決定位使用作為疫苗配方。一種理想的Th抗原決定位包括多種混雜的第II類MHC分子結構位，可獲得最大化的T輔助細胞活性以驅動及控制免疫反應，且通常本身具免疫靜默(immunosilent)，即不會產生針對Th抗原決定位的抗體(如，實施例7，表6的第1、2、3組，以及實施例8、9，表7的第1組)，因此可提供非常專一幾乎皆針對B細胞抗原決定位的免疫反應。

胺基酸序列(天然或非天然胺基酸)包括Th抗原決定位。胜肽的Th區為約9至25個胺基酸，較佳約13至17個胺基酸。Th片段及其功能性免疫類似物包括一Th抗原決定位的連續部分，其可促進或刺激Aβ _1-42胜肽N端片段約10至約14個胺基酸(SEQ ID NOs：4至6)的免疫反應。

本發明抗原決定位包括，但不限於，外源病原體的衍生物，如表2所示(SEQ ID NOs：33-41)。此外，Th抗原決定位包括理想化的人工Th與理想化的組合Th(SEQ ID NOs：42-47)。在一固相胜肽合成中，可在重覆N端Aβ胜肽序列中同時產生包含組合Th的胜肽。Th位置也包括免疫類似物。免疫Th類似物包括免疫增強類似物、交叉反應類似物、與這些Th抗原決定位的任何片段。功能性免疫Th類似物更包括在Th抗原決定位中保守性地置換、增加、刪除與插入1至5個胺基酸殘基，其不會實質上 改變Th抗原決定位的Th-刺激功能，最佳為源自麻疹病毒融合蛋白MVF1-4 Ths(SEQ ID NOs：34、41、42、44與46)、B型肝炎表面抗原HBsAg 1-3 Ths(SEQ ID NOs：43、45、47)的Th抗原決定位。

本發明之Aβ胜肽免疫原結構具有約13至約20個胺基酸殘基的Th抗原決定位，其透過“間隔子A”共價連接至Aβ _1-42胜肽N端片段及其交叉反應或功能類似物的C端。本發明Aβ胜肽免疫原結構(如SEQ ID NOs：48至65)的交叉反應與功能性類似物更進一步包括保守性置換、增加、刪除或插入1至5個胺基酸，此胜肽類似物可刺激產生與Aβ _1-42胜肽交叉反應的免疫反應。保守性置換、增加與插入可由天然或非天然的胺基酸完成。

本發明的較佳胜肽免疫原為含有Aβ _1-42胜肽片段的N端片段(SEQ ID NOs：4至6)或其交叉反應免疫類似物、間隔子(如，ε-Lys或Gly、或ε-Lys-Lys-Lys-Lys)；a Th抗原決定位(擇自於表2，SEQ ID NOs：34、37、38、40-47)(參照實施例7，表4的免疫原性試驗結果)。

Th抗原決定位胜肽的功能免疫類似物(如，MvF Ths的各種序列，SEQ ID NOs：34、41、42、44與46；以及HBsAg Ths，SEQ ID NOs：43、45、47)也具有效果，且皆屬於本發明的範疇。Aβ胜肽免疫結構的功能免疫類似物包括SEQ ID NOs：49-51、54-55、57-65的變異物及/或SEQ ID NOs：49-51、54-55、57-65的同源物，其保有實質上與原SEQ ID NOs：51、60相同的免疫原性。例如，變異物為功能類似物，其可具有一保守性的胺基酸置換、整體電荷的改變、共價連接至其它單元、或其胺基酸增加、 插入或刪除、及/或上述之組合。

保守性置換係指一胺基酸置換為其它具有類似化學特性的胺基酸。例如，非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸與蛋胺酸；極性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺與谷氨醯胺；正電荷(鹼性)胺基酸包括精胺酸、賴胺酸、組胺酸；以及負電荷(酸性)胺基酸包括天冬胺酸與谷胺酸。

在一特定實施例中，功能類似物與原胺基酸序列具有至少50%的相似性。在其它實施例中，功能類似物與原胺基酸序列具有至少80%的相似性。在其它實施例中，功能類似物與原胺基酸序列具有至少85%的相似性。在其它實施例中，功能類似物與原胺基酸序列具有至少90%的相似性。

在一實施例中，特定胜肽的功能免疫類似物含有與原胜肽相同的胺基酸序列，且更包括3個賴胺酸(Lys-Lys-Lys)連接至胜肽的N端。在此實施例中，原胜肽序列含有此3個賴胺酸可改變原胜肽的整體電性，但不會改變原胜肽的功能，如MVF Th胜肽系列(表2至7)。

表2顯示Th抗原決定位胜肽功能類似物的其他樣態。特別是，MVF1與MVF2 Th的SEQ ID NOs：34與41為MVF F4與5之SEQ ID NOs：44與46的功能類似物，其利用刪除(SEQ ID NOs：34、41)或增加(SEQ ID NOs：44、46)胺基酸N端與C端的2個胺酸來改變胺基酸骨架。此功能類似物2系列的不同並不會影響這些含有Th抗原決定位序列的功能(如，實施例7中表一的第7、8、14組v.s.實施例7中表5的第1組與實施例8中表7的第1組)。

在其它變化中，異源性Th抗原決定位胜肽可為一組合序列，其在胜肽骨架中同源可變位具有胺基酸混合物。在特定位置的合成步驟中上，可利用添加被保護胺基酸的混合物來取代特定胺基酸，以合成組合胜肽集合(assembly of combinatorial peptides)。此組合異源性Th抗原決定位胜肽集合，可對不同遺傳背景動物提供寬廣的Th抗原決定位覆蓋度。異源性Th抗原決定位胜肽的代表性組合序列包括SEQ ID NOs：42至45，如表2所示。本發明抗原決定位胜肽對不同基因族群的動物及病患，提供寬廣的反應性與免疫原性。

一般來說，本發明Aβ胜肽免疫原結構如下所示：(Aβ _1-42胜肽的N端片段)-(A)o-(Th)-X

其中，(Aβ胜肽的N端片段)為一B細胞抗原決定位，其擇自於約10至14個胺基酸的SEQ ID NOs：4至6；A獨立地為一胺基酸或一擇自於一胺基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys或ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NOs：32)的連接團基(linking group)；Th包括一胺基酸序列，其構成一擇自於SEQ ID NOs：34、37、38、40至47及其功能免疫類似物的T輔助細胞抗原決定位；X為一胺基酸的α-COOH或α-CONH₂；O為0至約4。

本發明Aβ胜肽免疫原結構包括約20個至約50個胺基酸殘基，較仕為約25個至約40個胺基酸殘基。

由間隔子A胺基酸所提供的構象分離，可提供Aβ胜肽免疫原 結構、Th細胞與B細胞之間更有效的反應，以促進Aβ的免疫原性或其功能免疫類似物的交叉反應。

(d)組成物：

(i)胜肽組成物：

本發明組成物可含有一或多個Aβ胜肽免疫原結構。胜肽組成物包括Aβ胜肽免疫原結構與二或多個Th抗原決定位的混合物，其可製備成一藥學上/疫苗的配方，以提供廣泛基因族群的協同性刺激，由於廣泛的MHC第II類分子覆蓋度，因而提供一增強的Aβ _1-42胜肽片段免疫反應。

例如，組成物可含有Aβ胜肽免疫原，如表3所示(SEQ ID NOs：48至65)、同源物、類似物及/或其組合。更特別的是，胜肽組成物可含有具有擇自SEQ ID NOs：62、63、64、65、其同源物、類似物及/或其組合(如實施例7所示之SEQ ID NOs：62、63等莫耳混合物；或如實施例8、9、10所示之SEQ ID NOs：64、65等莫耳混合物)的Aβ胜肽免疫原結構。

(ii)藥學組成物：

本發明更有關於具有Aβ胜肽免疫原結構混合物的組成物，其為藥學組成物，可用於治療及/或抑制阿茲海默症患者或具罹患風險個體的阿茲海默型癡呆。

一般來說，組成物可製備成液體或懸浮液的注射劑型；適合使用於溶液或懸浮液。在注射前，也可製備液體載體。對於其它給藥方式，額外適合的配方包括口服與鼻內給予。本發 明組成物在治療上述病徵上的有效劑量會依據許多因子而改變，包括給予的方式、目標位置、患者的生理狀態，其中患者為接受其它藥物的人類或動物，且此治療可為預防性或治療性。患者通常為人類，但非人類動物，如轉殖動物也可接受治療。

藥學組成物可製備成含有一有效量之Aβ胜肽免疫原結構及一藥學上可接受之載體。藥學組成物更可製備成一適合的劑量單位型式，每公斤體重含有約0.5μg至約1mg的免疫原。當給予多個劑量時，藥學組成物的每單位劑量可方便地分成一適當量。疫苗及治療技術領域人士自可了解依據個體的年齡、體重與健康況狀來決定給予劑量。

(iii)藥學疫苗配方：

在某些實施例中，含有Aβ胜肽免疫原結構的藥學組成物可刺激宿主體內針對Aβ胜肽N端的免疫反應。含有Aβ胜肽免疫原結構的藥學組成物可作為一疫苗，以抑制及治療疫苗宿主或阿茲海默症患者或具罹患風險個體的阿茲海默型癡呆。

此外，在藥學上可接受之傳遞系統中，組成物可含有載體及/或額外的添加物。因此，含有Aβ胜肽免疫原結構的組成物，可使用佐劑、藥學上可接受之載體或其他成分(包括，經常使用於疫苗配方的免疫佐劑)製備成一藥學疫苗配方。本發明之免疫佐劑可為“在與特異性疫苗抗原合併使用時，可加速、延長、或促進抗原特異性免疫反應，且本身不具有任何特異性抗原性的任何物質”。有許多佐劑已被廣泛使用，包括油、鋁鹽、與病毒體。二種常見的鹽類，包括磷酸鋁(如，Adjuphos)與明礬 (如，Alhydrogel)為人類疫苗中最常見的佐劑。本技術領域人士自可了解選擇礦物鹽類以及決定其較佳濃度的方法。

在本發明中，其它也可作為佐劑的成分包括liposyn、皂素、角鯊烯、L121、Emulsigen、單磷酸脂A(MPL)、QS21、ISA 35、ISA 206、ISA50V、ISA51與ISA 720、以及其它有效的佐劑與乳化劑。在一特定實施例中，傳遞系統與佐劑為Montanide^TM ISA 51(一種油類佐劑組成，含有植物油與油酸二縮甘露醇以形成油包水乳化物)、Tween® 80(聚山梨酯80或聚氧乙烯(20)山梨糖醇單油酸酯)、CpG寡核苷酸、及/或其組合。在另一實施例中，藥學組成物為以Emulsigen或Emulsigen D作為佐劑的水包油包水(w/o/w)乳化物。

作為藥學組成物的疫苗可製備成速釋或緩釋配方。此外，藥學組成物可透過免疫原捕捉(immunogen entrapment)與共給予奈米微粒，製備成全身性或局部黏膜免疫反應的配方。本技術領域人士自可輕易地完成此傳遞系統。

含有本發明Aβ胜肽免疫原結構的各種疫苗配方可有效地保護與治療疫苗宿主、AD患者、或具罹患AD風險個體的阿茲海默型癡呆。

(iv)Aβ胜肽免疫刺激複合物：

在某些實施例中，一藥學組成物含有一包含一CpG寡核酸的免疫刺激複合物，以及一包含Aβ胜肽免疫原結構的胜肽組成物。此免疫刺激複合物可特異性地調整作為佐劑以及一胜肽免疫原穩定劑。免疫刺激複合物可為顆粒，且可有效地對免疫 細胞呈現Aβ胜肽免疫原結構，以產生免疫反應。免疫刺激複合物可製備成一腸外給予配方。免疫刺激複合物也可製備成一w/o乳化物，可作為合併礦物鹽類或原位凝膠聚合物的懸浮劑，在腸外給藥後，有效地傳遞Aβ胜肽免疫原結構至疫苗宿主中的免疫細胞，以產生抗-Aβ免疫反應及保護效果。本發明有關於一種穩定的免疫刺激複合物，包括一陽離子的Aβ胜肽免疫原結構及陰離子的分子或寡核酸或聚核酸及其組合；以及一種透過電子結合使陽離子Aβ胜肽免疫原結構與陰離子分子或寡核苷酸或聚核苷酸形成合成物，以穩定陽離子Aβ胜肽免疫原結構的方法。此穩定的免疫刺激複合物可合併至藥學組成物中，作為一免疫原傳遞系統。

本發明之Aβ胜肽免疫原結構為一種“陽離子胜肽”，其為一種在pH 5.0至8.0下時帶正電荷的胜肽。胜肽或胜肽混合物(cocktail)淨電荷是將序列中每個賴胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)的電荷設為+1，將每個天冬胺酸(D)、谷胺酸(E)的電荷設為-1，且其它胺基酸的電荷設為0來進行計算。在未被取代時，各個胜肽的N-端胺基(+1)與C-端羧基(-1)可有效地去除其它電荷。將各個胜肽電荷加總，作為淨電荷。適當的胜肽免疫原淨電荷平均為+1。較佳此胜肽免疫原的淨電荷為大於+2。

本發明所述之“陰離子分子”係指在pH 5.0至8.0下時帶負電荷的分子。寡聚物或多聚物的淨負電是將寡聚物中每個磷酸二酯或硫代磷酸酯的電荷設為-1。適當的陰離子寡核苷酸為具8至64個核酸鹼基的單股DNA分子，以及1至10個重複的CpG單元。較佳，CpG免疫刺激單股DNA分子含有18至48個核酸鹼基， 以及3至8個重複的CpG單元。

更佳，陰離子寡核酸由下式表示：“5' X¹CGX² 3'”，其中C與G為非甲基化，X¹擇自於A(adenine)、G(guanine)與T(thymine)，且X²為C(cytosine)或T(thymine)。或者，陰離子寡核酸由下式表示：“5'(X³)₂CG(X⁴)₂ 3'”，其中C與G為非甲基化，且X³擇自於A、T或G；且X⁴為C或T。

此免疫刺激複合物為尺寸1至50μm的顆粒，且具有許多因子的功能，包括相對的電荷化學計量與反應種類的分子量(32)。顆粒狀免疫刺激複合物具有提供佐劑與提升in vivo免疫反應的附加優點。此外，穩定的免疫刺激複合物適合以各種程序，包括油包水乳化物、礦物鹽懸浮與聚合物凝膠來製備疫苗配方。

(e)製備方法

本發明更有關於製備Aβ胜肽免疫原結構、組成物與藥學組成物/疫苗配方的方法，其可刺激免疫反應與保護AD患者、或具罹患AD風險的個體。

(i)製備Aβ胜肽免疫原結構的方法

本技術領域人士自可利用已知的化學合成法製備本發明之胜肽免疫原。例如參照Fields et al.,Chapter 3 in Synthetic Peptides：A User’s Guide,ed.Grant,W.H.Freeman & Co.,New York,NY,1992,p.77。由於胜肽可利用自動固相合成Merrifield技術以t-Boc或F-moc保護側鏈胺基酸的α-NH₂合成，例如，Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430A或431。可藉由不同胺 基酸混合物在可變位置連接的方式完成胜肽結構(包括組合資料庫胜肽)的製備。

在胜肽免疫原完全組合後，依據標準程序以樹脂處理將胜肽由樹脂上切除，並去除胺基酸側鏈的官能基。將分離的胜肽以HPLC純化，並確定其生化特性，例如，以定序進行胺基酸分析。胜肽的純化及確定方法為本技術領域人士所習知。

將所欲胜肽直接合成於分支的聚-賴氨醯核心樹脂上，以製備本發明的免疫原，作為分支的聚合物(參考文獻9，Wang,et al.,Science,1991；254：285-288)。

由於可確保抗原性、免疫原性及產量的再現性，因此化學程序所合成之胜肽的品質可被控制及確定。以固相合成法製備Aβ胜肽或胜肽免疫原結構的詳細內容如實施例1所示。

在合成胜肽長達25年的免疫性應用中，已發現可保留免疫活性的結構變異範圍，比起可保留小分子之特定藥理特性，或生物性藥物共同產生之大分子活性或毒性的結構變異範圍更具包容性。此即為何胜肽類似物，不論是刻意設計或因合成程序錯誤而無法避免的結果，即刪除序列的副產物混合物，其層析特性與免疫性相似於所欲獲得的胜肽，其與經純化之目標胜肽具有相同的效果。只要建立嚴格的QC程序，以控制製造與產品檢測過程，確保胜肽終產物的再現性與有效性，則經設計之類似物與非預期之類似物的混合物也具有相同效果。

此胜肽也可利用重組DNA技術合成，例如核酸分子、載體、及/或宿主細胞。因此，編碼Aβ胜肽免疫原結構、Aβ胜肽免疫原結構之免疫功能類似物、及其類似物/同源物的核酸 分子也皆屬於本發明之範疇。同樣地，載體、包括含有核酸的表現載體以及含有載體的宿主細胞也皆屬於本發明之範疇。

在各實施例中亦包括Aβ胜肽免疫原結構以及Aβ胜肽免疫原結構之免疫功能類似物的製造方法。例如，本發明之方法可包括培養含有一具有編碼Aβ胜肽免疫原結構及/或其免疫功能類似物核酸之表現載體的宿主細胞，於此條件下表現胜肽及/或類似物。可以習知的重組DNA技術合成較長的合成胜肽免疫原。標準手冊的詳細步驟皆有記載此技術。為建構編碼本發明之胜肽，將此胺基酸序列反轉錄可獲得編碼胺基酸序列的核酸，較佳將密碼子優化為適合宿主表現。接著，若有需要，可利用合成編碼胜肽之寡核酸與任何調控元件，製造合成基因。將此合成基因插入適當的轉殖載體中，並轉染至一宿主細胞。在適合篩選表現系統與宿主的條件下表現此胜肽。純化此胜肽並以標準方法鑑定。

(ii)製備免疫刺激複合物的方法

在各實施例中也包括製造包含Aβ胜肽免疫原結構與CpG寡去氧核酸(ODN)分子。實施例如第5A圖所示，穩定的免疫刺激複合物(ISC)源自於陽離子胜肽與聚陰離子CpG ODN分子。此為受電荷靜電中和驅動的自我組合系統(self-assembling system)。陽離子胜肽對陰離子寡聚物的莫取電荷比可決定聚集的程度。胜肽免疫原與CpG ODN的非共價電性聚集是完全可再現的步驟。胜肽/CpG ODN免疫刺激物複合物凝集物，其有助於呈現至免疫系統中的“專業”抗原呈現細胞，因此可進一步增強複合 物的免疫原性。在製造過程中，這些複合物的品質可輕易地被控制。胜肽/CpG ISC具有良好的in vivo耐受性。更佳，UBI AD疫苗配方使用2種Aβ胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：64與65)，以等莫耳比例與適當的CpG ODN混合，可在溶液中自發性地形成免疫刺激複合物，如實施例8、9所述。

在UBITh® AD疫苗配製的程序中，將Aβ _1-14 UBITh®胜肽免疫原與適當的CpG ODN混合，可在溶液中自發性地形成免疫刺激複合物。此包含CpG ODN與Aβ胜肽免疫原的新型顆粒系統，具有與使用CpG ODN相關之廣泛B細胞有絲分裂的優點，並可平衡Th-1/Th-2型反應。

本發明疫苗配方的CpG ODN在相反電荷的電性中和過程中可100%與免疫原結合，可形成奈米特級的顆粒。此顆粒可有效地降低傳統上CpG佐劑的使用量，減少不良的先天免疫反應，並增加包括抗原呈現細胞(APC)的選擇性免疫途徑。因此，UBI AD疫苗配方為新穎的構想，且可利用其它選擇性機制來增加免疫反應的刺激。

(iii)製備疫苗配方的方法

在各實施例中更包括使用油包水乳化與礦物鹽懸浮的疫苗方配方。為了設計可使用於廣大族群的疫苗，並達成預防的目的，則安全性成為另一個非常重要的素子。儘管在人類臨床上已大量使用油包水乳化物，在幾十年的安全測試下，明礬仍然是疫苗製劑中主要的佐劑。在臨床應用上，明礬或其礦物鹽類佐劑(磷酸鋁)可作為佐劑使用，如實施例8、9所示。

(f)治療與抑制阿茲海默症的方法

(i)治療方式

在預防性的應用上，將一有效量之藥學組成物給予至一可能的阿茲海默症患者或有罹患風險的患者，以消除或降低罹患疾病((生化、組織及/或行為上)包括疾病發展過程中的併發症及病理症狀)風險、減輕疾病嚴重性、或延遲疾病的發作。在治療應用上，將一有效量之組成物給予至一懷疑或已罹患的患者，以治療，或至少阻止疾病((生化、組織及/或行為上)包括疾病發展過程中的併發症及病理症狀)部分的病徵。在某些方法中，藥劑的給予可減少或消除患者的輕度認知障礙，其尚未發展成典型的阿茲海默病變。一足以實現治療或預防性治療的量被定義為一治療或預防有效劑量。在預防與治療方式中，通常可給予多個劑量，直到可獲得足夠的免疫反應。一般來說，可監測免疫反應，若免疫反應開始變弱，可重複給予劑量。

(ii)適於治療的患者

適於治療的患者包括具發展阿茲海默症風險，但尚未顯示症狀的個體，以及顯示出症狀的患者。本發明所述之“預防性治療”係有關於阻止疾病致病過程的治療。本發明所述之“治療”係有關於阻止導致疾病進展及/或症狀之致病過程的治療。事實上，若活的夠久，任何人都有罹患阿茲海默症。因此，本發明之方法可預防性給予至一般族群，而不需對接受者進行任何風險評估。本發明方法可特別使用於已知有罹患阿茲海默症風 險的個體。此個體可包括有罹患此疾病的親人，以及經基因或生化標誌分析確定有罹患風險。阿茲海默症的基因標誌包括APP基因突變，特別是第717位置與第670及671位置，分別稱為Hardy與Swedish突變(參照Hardy，TINS，supra)。其它風險標誌包括早老素(presenilin)基因、PS1、PS2與ApoE4的突變，AD家族遺傳病史，高膽固醇血症或動脈粥樣硬化。

一般來說，患者可選自輕度認知障礙的危險族群、已知具有阿茲海默症相關基因型的患者、Trisomy 21患者(可能的Down's患者)、替代指標顯示有阿茲海默症風險的患者。

在無症狀患者中，可在任何年紀(如10、20、30歲)給予治療。若患者年齡到40、50、60或70歲時，則沒有必要進行治療。在可能的Down's患者中，可藉由給予治療藥劑至母體或出生不久的個體中以進行治療。

可藉由癡呆特徵來辨識罹患阿茲海默症的個體，且特別指依據精神障礙診斷與治療手冊標準，第4版(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,4th edition(DSM-IV)criteria)以及上述風險因子。此外，也可使用一些診斷測試來辨識AD個體。這些診斷包括分析CSF tau與Aβ _1-42的量。提升的tau與減少的Aβ _1-42可表示AD的存在。也可利用NINCDS-ADRDA的阿茲海默症標準來診斷阿茲海默症個體。

通常，治療係在一段時間內接受多個劑量。可藉由分析在各時間下，對治療藥物反應的抗體或活化的T細胞或B細胞，來監測治療效果(如，Aβ _1-42 ELISA)。若反應下降，可給予增強劑量。

已有大量的證據顯示Aβ-澱粉樣蛋白胜肽(老年澱粉樣蛋白斑的主成分)是造成AD的一個主因。成功的AD治療很可能包括影響Aβ-澱粉樣蛋白沉澱在腦中的物質。由免疫系統主動產生或被動給予的Aβ-特異性抗體可持續地減少不同轉殖老鼠中的斑塊。第1個臨床試驗嘗試刺激AD患者的免疫系統以產生Aβ-抗體，但因會產生副作用(6%的患者會產生腦膜炎)，此臨床試驗已失敗(Orgogozo J M,Gilman S,Dartigues J F,et al.2003；Neurology；61：46-54)。

令人驚訝的是，本發明Aβ胜肽免疫原的UBI AD疫苗配方有較小的不良免疫反應，且不會產生腦膜炎。特別是，使用2種等莫耳Aβ胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：64、65)，包括連接至2個優化的麻疹病毒(MVF)融合蛋白與B型肝炎表面抗原(HBsAg)T輔助抗原決定位的Aβ _1-14，並不會產生不良的免疫反應，也不會刺激微出血的產生。

在本發明第一範疇中，令人驚訝的是，較佳將Aβ胜肽免疫原結構以注射器肌肉注射至罹患痴呆的恆溫動物中，特別是人類。

在本發明第二範疇中，本發明提供一種單一劑量之肌肉注射的Aβ胜肽免疫原結構。肌肉注射之Aβ胜肽免疫原結構的較佳劑量為一含有30μg至1000μg/0.5mL/劑的胜肽免疫原結構，較佳介於100μg至400μg/0.5mL/劑，且更佳為300μg/0.5mL/劑，其混合有CpG ODN並以礦物鹽類作為佐劑的疫苗配方。藥劑在使用前可短暫置於2至8℃。藥劑較佳可利用注射器以肌肉注射至恆溫動物中，特別是手臂。對於劑型的加熱，可將藥劑置於室 溫約15分鐘至45分鐘，如，30分鐘。較佳在抽取藥物之前，可將藥瓶輕輕顛倒幾次使顆粒懸浮。

在本發明第三範疇中，本發明係有關於一種抑制及治療人類患者癡呆的方法，包括給予每劑量30至1000μg/0.5mL，較佳100至400μg/0.5mL，更佳約300μg/0.5mL的疫苗配方至需要的人類患者中，在初始免疫後的第0、4、8週後，每12週，較佳約26週，更特別約每52週給予一次。給藥的頻率可視患者的反應而定。例如，若依據抗體力價給藥，則可改變給藥的頻率。

在上述疾病的治療中，Aβ胜肽免疫原結構的使用可藉由適當的臨床試驗確認，如實施例所示，例如，總共3次劑量，第0、4、12週每次給予每劑量300μg/0.5mL的疫苗配方，持續超過9個月。可依據抗體力價，在每3、6、12個月給予一次後續的免疫接種。

適當的臨床試驗係在有罹患阿茲海默症風險或具有阿茲海默症症狀的患者中進行開放性試驗，或特別是隨機、雙盲、安慰劑控制組、平行研究試驗等。

在特別實施例中包括一UBI AD疫苗，其含有二種Aβ胜肽免疫原結構的混合物(SEQ ID NOs：64與65)，Aβ _1-42胜肽的N-端(Aβ _1-14，SEQ ID NOs：4)連接至T輔助抗原決定位(SEQ ID NOs：46與47)，此同源T輔助抗原決定位在AN-1792疫苗的人體試驗中並未發現毒性(aggregated Aβ _1-42,Elan/Wyeth)。在in vitro及in vivo的小型動物試驗中，狒狒和獼猴顯示產生N-端特異性抗體，且這些抗體具有功能上的免疫原性以中和Aβ的毒性，並促進斑塊的清除。此抗體顯示Aβ_1-40由CNS進入周邊循環系統。此 結果表示疫苗不會誘發抗-Aβ_1-42細胞性反應。在重複劑量的急性和慢性毒性研究中證實此疫苗在食蟹猴中具有良好的耐受性。實施例8、9之UBI AD疫苗配方的安全性與免疫原性已更進一步在臨床第1期試驗中輕度至中度的AD患者獲得證實，且在第0、4、12週肌肉注射免疫後，可刺激所有19位患者產生Aβ _1-14 N端的特異性抗體，達到前所未有的100%反應率，並不會導致任何嚴重或無法忍受的副作用。輕度AD老年受試者(n=6；年齡>60歲，MMSE基礎線>20)顯示對UBI AD疫苗配方的高度抗體反應，且使用(i)ADAS-Cog(AD Assessment Scale-Cognitive，特別是臨床試驗的認知功能障礙篩檢量表。此分析由11個評估標準(70點)組成，藉由測量記憶、語言、實踐、注意力和其他認知能力的障礙進行分析，而這些通常視為AD的核心病徵。分數增加代表病情惡化)，(ii)ADCS-CGIC(基礎線改變的AD全球指標，分數減少代表病情惡化)，以及(iii)MMSE(Mini-Mental State Exam，此最常用於評估認知功能，其提供方位、定位、短期記憶、語言功能等的評估。分數減少代表病情惡化)比較6個月核心試驗及6個月觀察期與基礎值分數，證實可促進認知功能。在第IIa期臨床試驗中，利用生物標誌(分子檢測、腦部顯影、基因型)來評估疫苗配方在輕度AD患者的效力，包括藉由主動免疫、循環系統中抗-Aβ _1-14抗體的增加，腦中毒性Aβ寡聚物濃度的減少，來減緩疾病的病程。

(g)特定實施例

本發明特定實施例包括，但不限於： (1)一種Aβ胜肽免疫原結構，包括下式結構：(Aβ _1-42胜肽的N-端片段)-(A)o-(Th)-X

其中(Aβ _1-42胜肽的N-端片段)為一源自Aβ的B細胞抗原決定位，包括約10至約14個胺基酸殘基，其擇自於SEQ ID NOs：4、5與6所組成的族群；各個A獨立地為一胺基酸或一連接基團，其可擇自於一胺基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α，ε-N)Lys、與ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NOs：32)所組成的族群；各個Th包括一胺基酸序列，其構成一輔助T細胞抗原決定位，其擇自於SEQ ID NOs：34、37、38、40至47及其功能免疫類似物；X為一胺基酸的α-COOH或α-CONH₂；以及o為0至約4。

(2)如(1)所述之Aβ胜肽免疫原結構，其中此(Aβ _1-42胜肽的N-端片段)為Aβ _1-14(SEQ ID NO：4)。

(3)如(1)所述之Aβ胜肽免疫原結構，其中A為ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NOs：32)。

(4)如(1)所述之Aβ胜肽免疫原結構，其中Th抗原決定位為SEQ ID NOs：45或46。

(5)如(1)所述之Aβ胜肽免疫原結構，包括SEQ ID NOs：48-65胺基酸序列。

(6)如(1)所述之Aβ胜肽免疫原結構，包括實質上SEQ ID NOs：62-65的胺基酸序列。

(7)如(1)所述之Aβ胜肽免疫原結構，其為SEQ ID NOs： 62、63、64及/或65。

(8)一種組成物，包括如(1)所述之Aβ胜肽免疫原結構。

(9)一種藥學組成物，包括：a. 如(1)所述之Aβ胜肽免疫原結構；以及b. 一藥學上可接受之傳遞載體及/或佐劑。

(10)一種阿茲海默症疫苗組成物，包括a. 如(1)所述之Aβ胜肽免疫原結構；以及b. 一藥學上可接受之傳遞載體及/或佐劑。

(11)一種阿茲海默症疫苗組成物，包括a. 如(7)所述之Aβ胜肽免疫原結構；以及b. 一藥學上可接受之傳遞載體及/或佐劑。

(12)如(10)所述之阿茲海默症疫苗組成物，其中(b)中的佐劑為鋁礦物鹽類，其擇自於alhydrogel®(Al(OH)₃)或adjuphos®(AlPO₄)。

(13)如(10)所述之阿茲海默症疫苗組成物，其中(a)中的胜肽抗原與一CpG寡聚去氧核醣核酸(ODN)混合以形成一穩定的免疫刺激複合物。

(14)一種分離的抗體或其抗原決定位-結合片段，其結合至(1)中Aβ胜肽免疫原結構的(Aβ_1-42胜肽的N-端片段)。

(15)如(14)所述之分離的抗體或其抗原決定位-結合片段，其特異性地結合至Aβ _1-10(SEQ ID NO：6)。

(16)如(14)所述之分離的抗體或其抗原決定位-結合片段，其結合至(1)的Aβ胜肽免疫原結構。

(17)如(15)所述之分離的抗體或其抗原決定位-結合片段， 其結合至SEQ ID NO：6。

(18)一種組成物，包括(14)所述之分離的抗體或其抗原決定位-結合片段。

(19)一種減緩人類患者老人癡呆的嚴重性或延遲發病的方法，包括給予一(10)的疫苗配方。

(20)如(19)所述之方法，其中此疫苗配方以溶液的形式給予每劑量10μg-1000μg的量至AD患者或有罹患風險的個體。

(h)其它實施例

(1)本發明之Aβ胜肽免疫原結構如下式所示：(Aβ_1-42胜肽的N-端片段)-(A)o-(Th)-X

其中(Aβ1-42胜肽的N-端片段)為B細胞抗原決定位，其擇自於具有約10至約14個胺基酸的SEQ ID NOs：4至6所組成的族群；各個A獨立地為一胺基酸或一連接基團，其可擇自於一胺基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys、或ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NOs：32)；各個Th包括一胺基酸序列，其構成一輔助T細胞抗原決定位，且擇自於SEQ ID NOs：34、37、38、40至47及其功能免疫類似物；X為一胺基酸的α-COOH或α-CONH₂；以及o為0至約4。

(2)一種阿茲海默症(AD)疫苗組成物，包括：a. 如(1)所述之Aβ胜肽免疫原結構； b. (a)的功能免疫類似物；c. (a)的任何組合；以及d. 一可接受之傳遞載體或佐劑。

(3)如(2)所述之AD疫苗，其中(d)的佐劑為鋁礦物鹽類alhydrogel®(Al(OH)₃)或adjuphos®(AlPO₄)。

(4)如(2)所述之AD疫苗，其中(a)的胜肽抗原與一CpG寡聚去氧核醣核酸(ODN)混合形成一穩定的免疫刺激複合物。

(5)一種阿茲海默症疫苗組成物，包括：a. 一種Aβ胜肽免疫原結構，其擇自於SEQ ID NOs：49-51、54、55與57-65；b. 一(a)的功能免疫類似物；c. (a)的任何組合；以及d. 一可接受之傳遞載體或佐劑。

(6)一種阿茲海默症疫苗組成物，包括：a. 如(5)所述之Aβ胜肽免疫原結構；b. 一(a)的功能免疫類似物；c. (a)的任何組合；以及d. 一可接受之傳遞載體或佐劑。

(7)如(5)所述之AD疫苗，其中(d)的佐劑為鋁礦物鹽類alhydrogel®(Al(OH)₃)或adjuphos®(AlPO₄)。

(8)如(5)所述之AD疫苗，其中(a)的抗原胜肽與一CpG寡聚去氧核醣核酸(ODN)混合以形成一穩定的免疫刺激複合物。

b. 一(a)的功能免疫類似物；c. (a)的任何組合；以及 d. 一可接受之傳遞載體或佐劑。

(9)如(5)所述之AD疫苗，其中(a)的胜肽抗原與一CpG寡聚去氧核醣核酸(ODN)混合以形成一穩定的免疫刺激複合物。

b. 一(a)的功能免疫類似物；c. (a)的任何組合；以及d. 其中(d)的佐劑為鋁礦物鹽類alhydrogel®(Al(OH)₃)或adjuphos®(AlPO₄)。

(10)一種阿茲海默症(AD)疫苗組成物，包括：a. 一種Aβ胜肽免疫原結構，其擇自於SEQ ID NOs：62、+63、64、+65；b. 一(a)的功能免疫類似物；c. (a)的任何組合；以及d. 一可接受之傳遞載體或佐劑。

(11)一種組成物，包括：a. 一Aβ胜肽免疫原結構，包括SEQ ID NO：64與SEQ ID NO：65的混合物；以及b. 更與CpG ODN混合的(a)混合物。

(12)一種藥學組成物，包括：a. 一Aβ胜肽免疫原結構，包括SEQ ID NO：64與SEQ ID NO：65的混合物；b. 更與CpG ODN混合的(a)混合物；以及c. Adjuphos®。

(13)一種藥學組成物，包括：a. 一Aβ胜肽免疫原結構，包括SEQ ID NO：64與SEQ ID NO： 65的混合物；b. 更與CpG ODN混合的(a)混合物；以及c. Adjuphos®。

(14)一種減緩人類老人癡呆之嚴重性或延遲發病的方法，包括給予(13)之藥學組成物至人類。

(15)一種減緩人類老人癡呆之嚴重性或延遲發病的方法，包括給予300μg/0.5mL/劑量之(13)的藥學組成物至人類。

(16)一種減緩人類老人癡呆之嚴重性或延遲發病的方法，包括：a. 給予300μg/0.5mL/劑量之(13)的藥學組成物至人類；以及b. 在0、4與12週給予作為接種。

(17)一種減緩人類老人癡呆之嚴重性或延遲發病的方法，包括：a. 給予300μg/0.5mL/劑量之(13)的藥學組成物至人類；以及b. 在0、4與12週給予作為接種；以及c. 在(b)步驟後，每3個月、及/或6個月、及/或12月補強一次。

(18)如(14)-(17)任一所述之方法，系利用肌肉注射給予。

(19)如(14)-(18)任一所述之方法，其中此人類具有輕度AD、MCI、或未顯示AD跡象或症狀但超過60歲。

(20)如(19)的方法，其中此人類的給予如下所示： a. 若人類具輕度AD，則此給予為用於治療AD；b. 若人類具MCI，則此給予為抑制及/或減緩人類老人癡呆之嚴重性及/或延遲發病；以及c. 若人類未顯示AD跡象或症狀但超過60歲，則此給予為抑制及/或減緩人類老人癡呆之嚴重性及/或延遲發病。

(21)如上述之AD疫苗，其中(a)的抗原胜肽與一CpG寡聚去氧核醣核酸(ODN)混合以形成一穩定的免疫刺激複合物。

(22)如上述之AD疫苗，其中(a)的Aβ胜肽免疫原結構包括SEQ ID NOs：17至20的胺基酸序列。

(23)如上述之AD疫苗，其中(a)的Aβ胜肽免疫原結構包括SEQ ID NOs：19與20的胺基酸序列。

(24)如上述之AD疫苗，其中(a)的Aβ胜肽免疫原結構包括SEQ ID NOs：17至20的胺基酸序列。

(25)如上述之AD疫苗，其中(a)的Aβ胜肽免疫原結構包括SEQ ID NOs：19與20的胺基酸序列。

(26)如上述之AD疫苗，其中(a)的Aβ胜肽免疫原結構包括SEQ ID NOs：17至20的胺基酸序列。

(27)如上述之AD疫苗，其中(a)的Aβ胜肽免疫原結構包括SEQ ID NOs：19與20的胺基酸序列。

(28)如上述之AD疫苗，其中(a)的Aβ胜肽免疫原結構包括SEQ ID NOs：17至20的胺基酸序列。

(29)如上述之AD疫苗，其中(a)的Aβ胜肽免疫原結構包括SEQ ID NOs：19與20的胺基酸序列。

(30)如上述之AD疫苗，其中(a)的總胜肽抗原量為每劑 量介於約10μg至約1mg。

(31)如上述之AD疫苗，其中此傳遞載體或佐劑擇自於Montanide ISA 50V、聚氧乙烯(20)山梨醇單硬脂酸酯、Emulsigen ®、Emulsigen D及CpG寡核苷酸。

(32)一種減緩人類老人癡呆之嚴重性或延遲發病的方法，包括給予一如上述之任何疫苗配方。

(33)如上述任一方法，其中此癡呆為阿茲海默型癡呆或具有樣澱粉腦血管病變的癡呆。

(34)如上述任一方法，其中此癡呆為與帕金森氏症或路易體癡呆(Lewy Body dementia)相關的癡呆。

(35)如上述任一方法，其中此疫苗配方每劑量包括10μg至1000μg，並以溶液形式給予至AD患者或有罹患風險之病患。也可為每劑量100至750μg或300μg。在臨床試驗中，300μg為有效的目標劑量。

(36)可每3個月及/或每6個月及/或每12個月給予一次。

(37)可依據抗體力價給予以決定疫苗給予的頻率。

(38)如上述任一方法，其中此患者具有發展成阿茲海默症的風險，且此患者擇自於下列所組成的族群：具有輕度認知障礙的患者、具阿茲海默症基因型的患者、Trisomy 21的患者、以及替代指標顯示具有罹患阿茲海默症風險的患者。

(39)如上述任一方法，其中患者具有阿茲海默症基因型，包括具ApoE4基因型的患者。

(40)如上述任一方法，其中包括(a)中Aβ胜肽免疫原及其組合的疫苗配方，在第0、4、12週以每劑量300μg/0.5mL給予3 劑量的初始接種。

(41)如上述任一方法，其中此疫苗配方每3月給予1次，接著每6月給予一次，並接著每12月給予一次。

(42)如上述任一方法，其中源自接種疫苗配方患者血液的B細胞可用於製備與篩選針對Aβ胜肽N端的人類單株抗體，以抑制與治療AD。

(43)一種刺激一個體中免疫反應的方法，包括在初始注射後第0、4、12週提供一初始免疫，之後每3個月、6個月、較佳每12個月給予增強免疫。

(44)劑量可為每劑量10至1000μg，較佳每劑量100至750μg，更佳為30μg。

(45)上述任一給予途徑可為任何習知途徑，例如，肌肉注射、皮下注射、口服等。

一種藥學組成物，其可為一Aβ胜肽免疫原結構與一可接受之傳遞載體或佐劑，其中Aβ胜肽免疫原結構具有一胺基酸序列，其擇自於下列所組成之族群：a)SEQ ID NOs：49-51、54、55與57至65；b)(a)的同源物；c)(a)或(b)的抗原性或免疫原性功能類似物，d)具有至少一保守胺基酸序列取代、胺基酸增加及/或胺基酸刪除的(a)、(b)或(c)；以及e)(a)-(d)的任何組合。

在一特定配方中，Aβ胜肽免疫原結構擇自於SEQ ID NOs：62、63及其混合。

在一其它特定配方中，Aβ胜肽免疫原結構擇自於SEQ ID NOs：64、65及其組合。

其它配方更含有一等莫取混合物。在一特定配方中，Aβ胜肽免疫原結構可擇自於SEQ ID NOs：62與63。其它配方更含有一等莫取混合物。在一特定配方中，Aβ胜肽免疫原結構可擇自於SEQ ID NOs：64與65。

在一特定配方中，SEQ ID NOs：62、63(或64、65)等莫耳混合的量為每劑量約1μg至1000μg。

在一特定配方中，SEQ ID NOs：62、63(或64、65)等莫耳混合的量為每劑量約100μg至750μg。

在一特定配方中，SEQ ID NOs：62、63(或64、65)等莫耳混合的量為每劑量約300μg。

本發明胜肽組成物的功效可藉由注射含本發明胜肽的免疫組成物至動物，如天竺鼠、狒狒、獼猴或人類。參照表4、5、6、7與8(SEQ ID NOs：48至65)。人類的免疫反應直接針對約10至14個胺基酸的Aβ _1-42胜肽N端片段。使用的詳細過程如實施例所述。

下列實施例可用於說明本發明，但不可用於限制本發明的範圍。

【實施例】

實施例1. β澱粉樣蛋白(Aβ)胜肽的合成

本實施例揭露合成經設計之Aβ胜肽結構的方法，其包括發展一有效的目標Aβ疫苗設計與配方。此胜肽可合成用於先導實驗與試驗的小量等級，以及用於疫苗配方及血清檢測的工 業/商品化產品的大量等級(公斤)。

設計長度約10至40個胺基酸的Aβ抗原胜肽庫，分析及篩選可作為有效AD疫苗使用的最佳胜肽結構。在各種血清分析中，代表性的抗原決定位定位包括，Aβ _1-40、Aβ _1-42胜肽，Aβ胜肽N端片段Aβ _1-28、Aβ _1-14、Aβ _1-10、Aβ _15-42與10個胺基酸的胜肽，如表1所示(SEQ ID NOs：1至32)。各結構含有一Aβ胜肽片段(Aβ _1-10至Aβ _1-14)，其合成性地連接至一精心設計源自病原體蛋白的T輔助細胞(Th)，包括麻疹病毒融合蛋白(MVF)與B肝表面抗原蛋白(HBsAg)，如表2所示((SEQ ID NOs：33至47，單一序列(SEQ ID NOs：33至41、46、47)或一組合庫(SEQ ID NOs：42至45))，以增強各Aβ胜肽免疫原結構的免疫原性。由超過100個胜肽結構中選擇18個代表性Aβ胜肽免疫原結構如表3所示(SEQ ID NOs：48至65)。

所有用於免疫原性研究或相關血清試驗以偵測及/或分析抗-Aβ抗體的胜肽以Applied BioSystems Models 430A、431及/或433利用Fmoc化學法合成小規模量。可在一固相載體上，利用獨立的合成程序，在三官能基胺基酸N端以Fmoc保護及側鏈保護基來製備各胜肽。將完成的胜肽由固相載體切除下來，並以90%三氟乙酸(TFA)移除側鏈保護基。利用基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF)分析合成的胜肽以確定正確的胺基酸組成。利用反相HPLC(RP-HPLC)分析各個合成胜肽以確認產物的合成樣態與濃度。

儘管嚴格控制合成過程(包括，逐步地監測偶合效率)，由於在延長循環中某些意外事件，包括胺基酸的插入、刪除、 取代及提前終止，仍可能產生胜肽類似物。因此，合成產物一般包括多種胜肽類似物與目標胜肽。儘管包括這些非預期的胜肽類似物，但最後的合成胜肽產物仍可用作免疫應用，包括免疫診斷(抗體捕捉抗原)與疫苗(胜肽免疫原)。一般來說，只要開發一嚴格的QC程序來監測製造及產品品質檢測程序，以確保這些胜肽最終產物的再現性與有效性，此胜肽類似物，包括刻意設計或合成程序中產生的副產物混合物，皆可有效地作為適當胜肽的純化產物。可利用自製的自動胜肽合成儀UBI 2003合成數百至數千克的大量胜肽，濃度為15mmole至50mmole。

對於使用於臨床試驗之最終疫苗配方的活性成分，Aβ胜肽結構可利用適當的RP-HPLC於淺洗湜梯度下進行純化，並利用MALDI-TOF確定胺基酸組成，並以胺期酸分析與RP-HPLC分析來評估純度與特性。

實施例2. 血清檢測分析與試劑

評估合成胜肽結構及其配方之功能性免疫的血清檢測分析與試劑，如下所示。

a. 用於抗體特異性分析的Aβ _1-42 、Aβ _1-40 、Aβ _1-28 或Aβ _1-14 胜肽ELISA試驗

實施例中評估免疫血清樣本的ELISA分析如下所述。

將96孔盤分別以37℃、pH 9.5(除非另外註明)、1小時的條件下，於10mM NaHCO₃的緩衝液中，塗佈2μg/mL(除非另外註明)的目標胜肽Aβ _1-42、Aβ _1-40、Aβ _1-28或Aβ _1-14(SEQ ID NOs：1至4)。

將塗佈胜肽的孔盤置於250μL含3%(w/w)明膠的PBS溶液，於37℃反應1小時，以封阻非特異性蛋白結合位，接著以含0.05%(v/v)TWEEN® 20的PBS溶液清洗3次，並乾燥。將欲分析的血清利用含20%(v/v)正常山羊血清的PBS溶液以1：20比例稀釋(除非另外註明)。將100μL的稀釋樣本(如，血清、血漿)加至各個孔洞中，並於37℃反應60分鐘。

接著，利用含有0.05%(v/v)TWEEN® 20的PBS溶液清洗孔洞，以移除無結合的抗體。利用特定族群(如，小鼠、天竺鼠或人類)共軛之辣根過氧化物酶(HRP)山羊抗IgG作為一標記，與孔洞中抗體/胜肽抗原複合物結合。將100μL含有預先稀釋之過氧化氫酶標記的山羊抗-IgG、1%(v/v)正常山羊血清與含0.05%(v/v)TWEEN® 20的PBS溶液加至各孔洞中，於37℃反應30分鐘。利用含0.05%(v/v)TWEEN® 20的PBS溶液清洗孔洞6次，以移除未結合的抗體，並與0.04%(w/w)3’,3’,5’,5’-四甲基聯苯胺(TMB)及含0.12%(v/v)過氧化氫的檸檬酸鈉緩衝液反應15分鐘。使用這些成分所產生的有色產物來偵測過氧化酶標記。添加100μL的1.0M H₂SO₄停止反應，並偵測450nm的吸光值。對於狒狒和獼猴免疫球蛋白/IgG的抗體檢測，使用HRP-耦合的山羊抗-人類IgG與對靈長類動物具高交叉反應之IgG作為追蹤標記。對於臨床試驗患者的臨床樣本，使用HRP-耦合的蛋白A/G試劑，進行血清力價檢測。在偵測接種各種Aβ胜肽疫苗配方的動物抗體力價中，使用10倍連續稀釋的血清進行測試，稀釋倍數由1：100至1：10,000，且測試血清的力價以Log₁₀表示，以線性回 歸計算A450，且A450閥值設為0.5。

b. 以特定載體蛋白、Th胜肽、或Th組合庫的ELISA試驗，來評估特定載體蛋白、Th胜肽、或Th組合庫的抗體反應

將96孔的ELISA盤分別以37℃、pH 9.5(除非另外註明)、1小時的條件下，於10mM NaHCO₃的緩衝液中，塗佈100μL的載體蛋白，如KLH(Keyhole limpet hemocyanin)、Th胜肽或Th組合胜肽庫(SEQ ID NOs：44至47)，相關程序類似ELISAs，如上述所示。在偵測接種各種Aβ胜肽疫苗配方之動物抗體力價中，使用10倍連續稀釋的血清進行測試，稀釋倍數由1：100至1：10,000，且測試血清的力價以Log₁₀表示，以線性回歸計算A450，且A450閥值設為0.5。

c. 以10個胺基酸(10-mer)的B細胞抗原決定位叢ELISA試驗，評估Aβ與hAPP(人類澱粉樣蛋白前驅蛋白)的特異性與抗原決定位定位

免疫宿主或疫苗之抗-Aβ抗體的良好特異性分析可利用抗原決定位定位(epitope mapping)進行判斷。簡單來說，於96孔盤中，每孔洞塗佈0.5μg/0.1mL的hAPP 10-mer胜肽(SEQ ID NOs：6、8至30)，接著將100μL的血清樣本(以PBS緩衝液1：100比例稀釋)置於塗佈hAPP 10-mer胜肽的孔洞中，並重複上述抗體ELISA方法的步驟。疫苗的B細胞抗原決定位以及狒狒、獼猴和人類抗-Aβ抗體於接種宿主的良好特異性分析(fine specificity analyses)也預先以Aβ_1-10胜肽(DAEFRHDSGY，SEQ ID No：6)、 N-端置換的Aβ修飾合成胜肽、或非相關的對照組胜肽進行吸附，並接著以抗-Aβ_1-28 ELISA試驗進行額外的特異性分析。

d. 免疫原性的評估

根據實驗免疫步驟，收集人類免疫前與免疫後血清樣本，並以56℃加熱30分鐘以去活化血清補體因子。依據實驗步驟，接種疫苗配方，獲得血液樣本，並評估其對特定位的免疫原性。檢測連續稀釋血清，並利用稀釋倒數的Log₁₀表示活性力價。在針對用於促進B細胞反應之“輔助T細胞抗原決定位”的抗體反應低到可以忽略的程度下，以對目標抗原中所欲抗原決定位特異性刺激高力價B細胞抗體的反應，來評估特定疫苗配方的免疫原性。

e. 偵測血液及腦脊髓液中(CSF)Aβ胜肽抗原的固相酵素連結免疫分析

使用高靈敏度Aβ_1-40免疫分析(InvitrogenTM-BioSourceTM Cytokines & Signaling,Camarillo,CA,USA)偵測食蟹猴血清、血漿及CSF中Aβ_1-40的濃度。正常食蟹猴中的Aβ_1-42量低於偵測極限。利用Aβ_1-40與Aβ_1-42免疫分析套組(The Genetics Company Inc.,Zurich-Schlieren,Switzerland)分析血漿、CSF以及hAPP751轉殖鼠腦組織化學萃取物中Aβ_1-40與Aβ_1-42的量。輕度至中度阿茲海默症患者血漿中，Aβ_1-40的定量可利用市售套組(Human Amyloid β(1-40)Assay Kit,IBL,27714)進行分析。正常人類血漿中Aβ_1-42的量低於偵測極限。

實施例3. 免疫組織化學分析

由屍體檢驗及/或手術病理樣本獲得正常成人組織(PhenoPath Laboratories Inc.,Seattle,WA,USA)與阿茲海默症患者大腦樣本(Dr.Felicia Gaskin,University of Virginia,Charlottesville,VA,USA)。由屍體檢剖中獲得食蟹猴組織樣本(Beijing Jo-Inn New Drug Research Center,Beijing,China)與hAPP轉殖鼠大腦樣本(JSW-Research GmbH,Graz,Austria)。將組織以液態氮快速冷凍，進行冷凍OCT包理化合物及冷凍切片處理，或以福馬林固定、石蠟包埋等標準程序進行切片。

使用免疫前及高度免疫血清，或天竺鼠、hAPP轉殖鼠、狒狒和獼猴的純化IgG，或市售老鼠單株抗體與螢光標記的二級抗體，進行冷凍組織切片的間接免疫螢光分析。利用市售卵白素-生物素套組對冷凍組織切片進行間接免疫過氧化酶的染色，冷凍組織切片包括，使用純化天竺鼠抗-Aβ IgG的正常成人組織冷凍切片，或控制組大腦切片以及使用市售偵測CD3、CD4、CD8(T lymphocyte subsets)、CD11b(microglial cell activation marker)、GFAP(astrocytes)與特定Aβ抗原決定位之單株抗體之接種UBI AD疫苗(UB-311)的獼猴大腦切片。根據標準病理學實驗室程序進行免疫組織化學分析。

實施例4. 淋巴球增生與細胞激素生成的T細胞功能分析

淋巴球增生與細胞激素生成之T細胞功能分析程序，以及T細胞活化的評估，如下所述。

a. 周邊血液單核細胞(PBMC)的分離、冷凍及解凍

採取周邊血液，利用Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離PBMC。在以PBS清洗2次後，將PBMC懸浮於含有RPMI 1640與10%胎牛血清(FCS)的細胞培養基。將PBMC冷凍，儲存於液態氮中，並解凍以進行後續的in vitro培養。

b. T細胞與周邊血液單核細胞(PBMC)的增生分析

於24孔培養盤(Nunc)中培養2.5 x 10⁶細胞/mL的免疫動物PBMC，每孔含有10.0μg經選擇的疫苗免疫原組成。負對照組部分僅含有PBMC，而不含有刺激抗原。將所有組別置於37℃，5.0% CO₂培養箱中培養3天。培養3天後，收集上清液，並利用上述定量分析方法偵測各細胞激素的量。

利用Ficoll-hypaque梯度離心分離狒狒和食蟹猴的周邊血液單核細胞(PBMC)。對於胜肽刺激的狀態(peptide-induced proliferation)及細胞激素的產生，將細胞(2 x 10⁵細胞/孔洞)單獨培養或與添加的胜肽結構(包括Aβ_1-42、Aβ_1-14、Aβ_15-42、UBITh®胜肽、以及以無關的胜肽作為負對照組)共同培養。使用有絲分裂原(PHA、PWM、Con A)作為正對照組。在第6天，加入1μg的3H-thymidine(3H-TdR)至各個三重複的細胞培養盤中。在培養18小時後，收集細胞，並偵測3H-TdR的滲入。刺激指數(S.I.)顯示抗原存在下與抗原不存在的每分鐘滲入量(cpm)；S.I.>3.0表示有顯著意義。

c. 以UBI AD疫苗免疫前與免疫後的PBMC培養，來評估細胞 激素的產生

於培養基中單獨培養或與在各種Aβ胜肽結構或有絲分裂原存在下培養食蟹猴PMBC，以進行細胞激素(IL2、IL6、IL10、IL13、TNF、IFN)分析。使用猴子-特異性細胞激素三明治ELISA試驗套組(U-CyTech Biosciences,Utrecht,The Netherlands)來偵測各細胞激素的濃度。

實施例5. 用於安全性、免疫原性、毒性與效價試驗的動物

天竺鼠： 以成熟、naïve、成年雄性與雌性Duncan-Hartley天竺鼠(300-350g/BW)進行免疫原性試驗。此試驗使用至少3隻天竺鼠。在簽約的動物設施與UBI中，經IACUC申請核准，進行Duncan-Hartley天竺鼠的試驗(8-12週齡；科文斯研究實驗室，Denver,PA,USA)。

阿努比狒狒：以成年雄性狒狒(阿努比狒狒(Papio anubis)，年齡為8至10年，奧克拉荷馬大學健康科學中心大學，奧克拉市，OK,USA)在簽約的動物設施與UBI中，經IACUC申請核准，進行免疫原性試驗。

食蟹猴：以成年雄性及雌性猴子(食蟹猴(Macaca fascicularis)，年齡為約4年；北京昭衍新药研究中心；北京，中國)在簽約的動物設施與UBI中，經IACUC申請核准，進行免疫原性試驗。

hAPP751轉殖鼠：以年輕的hAPP751轉殖小鼠(tg+)及其同胎所生的小鼠(14±2週齡)作為預防阿茲海默症的小鼠模式，且以tg+小鼠及其同胎所生的小鼠(52+2週齡)作為治療模式。 在簽約的動物設施(JSW Research GmbH,Graz,Austria)與UBI中，經IACUC申請核准，進行免疫原性試驗。

hAPP751 tg+小鼠，在小鼠Thy-1啟動子(Rockenstein,E,et al.,1995 and 2001)的控制下，持續過度表現具London(V717I)與Swedish(K670M/N671L)雙突變的人類樣澱粉前驅蛋白(hAPP)。早在3至4個月大時，可於額葉皮質中具成熟斑塊的小鼠中，發現Aβ1-42的沉澱，且在5至7個月大時，斑塊的形成延伸至hAPP751 tg+小鼠的海馬、視丘與嗅覺區。肌肉注射免疫超過16週可由血液ELISA分析發現抗體反應，以及腦澱粉樣蛋白沉澱與腦斑塊，並由免疫染色及生化萃取證明細胞性反應(如，T細胞浸潤、小膠質細胞活化)的增加。

根據本實施例的上述方法，檢測免疫前的動物血清及/或血漿樣本。根據動物種類及操作程序，以Aβ目標胜肽結構免疫各動物。

實施例6. 初步排列用於天竺鼠及狒狒之Aβ胜肽結構免疫原性的一般疫苗配方

在本實施例中，詳述使用於各試驗中的藥學組成物與疫苗配方。簡單的說，各試驗組別中的配方通常含有所有種類的設計Aβ胜肽結構、透過不同形式間隔子(如，K或K加上KKK以增加胜肽結構的溶解度)連接的Aβ胜肽片段，以及設計胜肽結構N端連接之含有源自麻疹病毒融合蛋白與B肝表面抗原的雜亂人工T輔助細胞抗原決定位。一開始，於天竺鼠中評估超過100個設計Aβ胜肽結構相對於全長Aβ_1-42的免疫原性，以及其對AD患者 大腦切片天然斑塊的交叉反應。將Aβ胜肽結構與Seppic Montanide ISA 51以油包水乳化作為人類疫苗使用，且以不同量之胜肽結構混合礦物鹽類或鋁膠(Alum)。將Aβ胜肽結構溶解至水中，濃度20至800μg/mL，並與Montanide ISA 51配製成油包水乳化物(1：1(v/v))中，或添加礦物鹽類或鋁膠(Alum)(1：1(v/v))以進行疫苗的製備。在免疫前，將疫苗配方置於室溫約30分鐘，以震盪器混合10至15秒。

在第0週(初始)與初始免疫後(wpi，補強)第3週以肌肉注射免疫動物，並選擇性地在第5或6 wpi進行第2補強免疫。接著檢測這些免疫動物，以評估含有各合成Aβ胜肽免疫原之疫苗配方的免疫原性以及其對Aβ_1-28與全長Aβ_1-42的交叉反應。在天竺鼠中進行初步篩選，獲得可能具有免疫原性的Aβ胜肽免疫原，由於狒狒被公認具有與人類相似的免疫反應，因此接著在狒狒中進一步測試胜肽在油包水乳化物、礦物鹽類及明礬中的免疫原性，以了解在特定時間內的給藥策略。

在合併至最終疫苗配方前，僅對最確定之Aβ胜肽免疫原，依照GLP控制之前臨床試驗進行進一步的評估免疫原性、期間、毒性與效力試驗，以提出阿茲海默症的研究性新藥申請與臨床試驗。

實施例7. 含Aβ _1-14 胜肽免疫原之多成分疫苗配方在抑制及治療阿茲海默型癡呆上的設計原理、篩選、確定與優化

設計歷程：各疫苗或免疫治療產品必須依據特定疾病的機制以及治療目標蛋白來確定設計中心及方法。目標設計可 包括參與疾病的細胞蛋白或參與病原菌各種蛋白的感染物。由研究至商品化的過程非常長，通常需要一或多個候選者。

一旦選定目標分子，必須經過大量且廣泛的血清驗證。目標分子中B細胞及T細胞抗原決定位的確定與分佈對於分子疫苗的設計非常重要。一旦辨識出B細胞抗原決定位，就可在小型動物中進行大量的先導免疫原性試驗，以評估設計胜肽之疫苗配方所誘導的功能性。所有試驗都進行多組重複，由免疫宿主採集血清進行評估。更可在目標物種或非人類哺乳動物進行早期免疫原試驗，以進一步評估設計的免疫原性及方向。接著，在不同的混合物中製備目標胜肽，以評估在合併使用胜肽結構以製備各配方設計時，各反應功能性的細差異。經過額外的評估後，可完成一最終胜肽結構、胜肽組成物及其配方與配方的各物理參數，構成最終產品的開發流程。

廣泛的設計經驗有助於由研發至商業化，開發下個世代的疫苗產品，如第1圖所示。

a. Aβ1-14胜肽結構在治療阿茲海默症疫苗配方上的設計與驗證

如發明人所揭露的先前發明(Wang,CY 2001,Wang CY,et al 2007)，從Aβ分子，由去除C端區(此序列在阿茲海默患者中經常表現自體T輔助抗原決定位，其會導致嚴重的副作用，如腦膜炎)的Aβ_1-14胜肽選擇更精密的B細胞抗原決定位，作為設計中的目標B細胞抗原決定位，合併至疫苗配方中。

為了獲得最有效的胜肽以合併至疫苗配方中，在天 竺鼠的免疫原性試驗中採用了大量源自各種病原菌或麻疹病毒融合蛋白(MVF)或B型肝炎表面抗原蛋白的雜亂T輔助抗原決定位。16個Aβ_1-14衍生胜肽結構的代表性試驗如表3(SEQ ID NOs：48、51至65)所示，其中Aβ_1-14胜肽透過ε K作為一間隔子連接各雜亂T輔助抗原決定位。此胜肽免疫原結構配製成Montanide ISA 51油包水乳化物，並分別在第0wpi初始接種與3wpi的補強接種100μg/0.5mL疫苗配方至天竺鼠中，以評估各胜肽在天竺鼠中的免疫原性。初步的免疫原分析證明輔助T細胞抗原決定位結構特徵存在於Aβ_1-42的C端，其中由Aβ序列刪除的第15至25胺基酸使Aβ_1-14序列本身不具免疫原性(表1，第1至3組)。被用於恢復及促進Aβ_1-14胜肽免疫原性之T輔助抗原決定位的初步排名，如表4所示，胜肽的免疫原性由弱至強排列，最弱的胜肽結構排在第1位：曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)Th(Seq ID NO：56)<梭狀芽孢桿菌(Clostridium tetani 1)Th(Seq ID NO：48)<百日咳桿菌(Bordetella pertussis)Th(Seq ID NO：52)<梭狀芽孢桿菌(Clostridium tetani 2)Th(Seq ID NO：53)<白喉桿菌(Seq ID NO：54)Th<惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)Th(Seq ID NO：55)<霍亂毒素(cholera toxin)Th(Seq ID NO：57)，將這些Th與源自MVF(SEQ ID NOs：51、58、59)及HBsAg(Seq ID NO：60)的人工T輔助抗原決定位進行排序。Aβ_1-14衍生胜肽結構(Seq ID NO：51)也可被設計成一支鏈四聚體結構，如(Seq ID NO：61)所示，其為一有效的胜肽免疫原結構。綜上所述，上述免疫原性試驗證實了以特定Aβ_1-14衍生結構(SEQ ID NOs：51、57至61)作為最終疫配方設計中免疫原的適應性，以刺激針對全長Aβ_1-42胜 肽N端的抗體，Aβ_1-42胜肽為AD患者老人斑的主要生化成分。

b. 使用源自Aβ1-14的結構與不同的雜亂T細胞抗原決定位，以擴大MHC的覆蓋度

當設計一疫苗來治療不同遺傳背景的患者時，非常重要的是，設計要可覆蓋最大的遺傳背景族群。因此，可發現Aβ_1-14衍生胜肽免疫原結構對此組合的合成免疫原效果。因為源自於MVF與HBsAg的雜亂T輔助抗原決定位代表其中可提供最有效的免疫原性刺激，所以可設計成含有這二個T輔助抗原決定位的胜肽結構組合。MVF與HBsAg二者之T輔助抗原決定位的組合庫形式(SEQ ID NOs：44與45)，如表2所示，具有最大的MHC結合區覆蓋，在初始接種(第0wpi)與二次補強接種(3與5wpi)100μg/0.5mL劑量至天竺鼠中，以評估單獨T輔助抗原決定位或與Aβ1-14衍生結構(SEQ ID NOs：62與63)的免疫原性。如表5所示，二種等重量比的免疫原混合物，比起個別胜肽結構，更可刺激顯著的免疫反應。

c. 連接含有多個MHC結合區之T細胞抗原決定位的目標B細胞抗原決定位的簡單免疫原設計，可產生僅針對B細胞抗原決定位的針對性與特異性免疫反應

初始免疫後(wpi)8週，由免疫宿主採集高免疫性血清，檢試用於B抗原決定位的代表性T輔助抗原決定位免疫原性刺激。以類似的初始與補強免疫接種計畫，接種透過化學共軛在Aβ_1-14胜肽N端增加半胱氨酸KLH-連結的Aβ_1-14胜肽，由類似的免 疫宿主中採取高免疫血清。如表6所示，所有經設計Aβ_1-14胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：62與63)單獨或合併免疫的宿主，皆可產生所需的高力價抗-Aβ_1-14抗體，對目標Aβ_1-42胜肽具交叉反應，而對2個T輔助抗原決定位(SEQ ID NOs：44與45)沒有反應或反應很小。相反地，儘管由傳統載體蛋白KLH對Aβ_1-14抗原決定位生成之相關免疫原性為2.2至3.9 Log₁₀力價，但在所有動物中皆產生針對蛋白載體KLH很高的抗體反應與很高的力價(Log₁₀幾何平均力價為6.2)，再次驗證先前發現特定“集中”針對“目標B細胞抗原決定位”的反應，是基於對B細胞與T細胞抗原決定位的了解，以獲得這些合理設計之胜肽免疫原結構的免疫結果。

d. 在初始(0wpi)與補強(3與6wpi)接種於ISA 51油包水乳化物及明礬中含有各種Aβ _1-14 結構(SEQ ID NOs：62、63)的疫苗後，評估免疫原性

在進行更進一步研發工作以尋找被Aβ_1-14刺激所生成抗體的功能特性之前，因狒狒所生成的免疫反應程度幾乎非常類似於人類，所以先在狒狒中測試合併不同量胜肽結構(等莫耳比例的SEQ ID NOs：62與63)之二種經常使用於人類試驗的不同疫苗配方。將所有疫苗配方以0.5mL/劑量給予至動物。用於未來使用的原本目標劑量為100μg/mL，因此以此劑量給予3隻動物。評估高效力ISA 51油包水配方與最常使用的弱效力明礬在相同量100μg下的相對免疫原性。在油包水乳化系統中，進行每劑量25μg、100μg與400μg的劑量增加試驗。由此試驗首先發現，在給予100μg/0.5mL/劑量之等量胜肽免疫原成分中，相較於ISA油包 水乳化配方，明礬配方產生低免疫反應(大於1 Log₁₀的抗體力價)。儘管每劑量100μg為未來使用於宿主的原本目標劑量，但可分別在由25μg、100μg至400μg劑量增加發現免疫反應增加，如表7所示。因此，對於設計Aβ_1-14胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：62與63)或其類似物，進一步對大於100μg的劑量進行探討。

實施例8. 開發用於治療阿茲海默型癡呆之免疫治療疫苗的標準

UBI公司在開發免疫治療疫苗的策略，包括，基於UBI的技術平台，開發出雜亂Th抗原決定位連接目標B序列的設計，以克服“自身”的障礙與遺傳背景的限制，此疫苗為安全(Safe)、獨特(Unique)、有特徵(Characterizable)、低成本(Cost-effective)、有效(Efficacious)、穩定(Stable)及可改變規模(Scalable)(稱為SUCCESS)(Wang,CY et al,2005,Sokoll,KK.2004)。在初始設計時期需特別注意，使選擇的胜肽免疫原可進入開發階段，使疫苗配方被藥政單位核准成疫苗，在第III期臨床試驗證明有效後，成為人類歷史上第一個完全的合成胜肽疫苗。在胜肽的設計中質量特別受到重視，挑選出許多已經證明可產生所需免疫反應的胜肽，在序列設計時，要考慮到各胜肽的“溶解度”、合成化學產量及純化障礙。具有高安全性的可接受的佐劑同樣是一個重要的因子，但並沒有許多適當的選擇。必須考慮安全性與免疫原性之間的平衡。此外，當因為有安全上的問題時，免疫原性必須妥協，可合併其它的疫苗配方以進一步提升免疫反應。同樣地，疫苗的成功在於其可在大量與廣泛的遺傳背景族群 中，產生所需的免疫反應，因此，一個寬廣MHC覆蓋也必須是一個非常重要的考慮因子。

在上述考量中，為了獲得針對Aβ分子N端的SUCCESS疫苗，儘管單一序列的免疫原性比組合庫形式弱，但仍選擇以單一序列胜肽取代組合形式。由於高免疫原的T輔助抗原決定位通常包括一長鏈疏水性胺基酸，使相應的胜肽難溶於水，因此，胜肽的溶解度也是一個重要的測試因子。必須特別注意是否在特定的位置上增加高電荷胺基酸殘基，如Asp、Glu、Lys與Arg以增加胜肽溶解度。為了獲得高的合成產量，仔細地分析所有參與合成過程與伴隨生成之中間物的化學物質，以獲得最終胜肽的優化序列，其為疫苗配方的重要成分。在考量於免疫原性上所有高品質胜肽的因子後，選擇2種Aβ_1-14胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：64與65)，SEQ ID NO：64為含有源自MVF系列的胜肽，SEQ ID NO：64為含有源自HBsAg系列的胜肽，並更進一步在疫苗配方中分析此胜肽。

合成並純化此胜肽，以獲得高純度胜肽，如第2A-2B圖所示。SEQ ID NOs：64與65在逆相HPLC分別於第20與21分鐘洗湜出來。純化胜肽經MALDI-TOF分析得知SEQ ID NO：64胜肽分子量為3892.274 Da(理論值為3892.52 Da)，SEQ ID NO：65胜肽分子量為4374.568 Da(理論值為4374.04 Da)，兩者皆具有高純度，如第2C-2D圖所示。

“Th”胜肽SEQ ID NOs：46與47兩者皆被使用於刺激Aβ1-14的免疫原性，並大量地分析其在各種族群中的結合區，如第3A-3B圖所示。將此2種雜亂T輔助抗原決定位合併至疫苗設 計中以獲得所有患者的最大遺傳覆蓋度，此設計是安全的。分析覆蓋比例，可合理預期此疫苗可覆蓋接種此疫苗患者的大量族群，覆蓋比例是由大量測試與開發工作延伸至高臨床價值疫苗的重要因子。

為了使疫苗設計可用於大量族群，且預防為接種目的之一，安全性亦成為另一個重要的考慮因子。儘管在許多臨床試驗中，油包水乳化物被廣泛使用於許多人類疫苗配方中，由於數十年的安全性試驗，明礬仍然是使用於疫苗配方中的主要佐劑。明礬或其礦物鹽佐劑(磷酸鋁)被認為用於臨床應用。

a. 在初始(0wpi)與補強(3與5wpi)接種含有高純化Aβ1-14胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：64與65)與固定量之礦物鹽類的疫苗配方後，評估天竺鼠的免疫原性

由UBI AD疫苗開發中的許多免疫原候選物中，選擇二種高純化Aβ_1-14胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：64與65)，測試此二種胜肽等莫耳混合物在固定量(0.5mL)明礬/礦物鹽類的存在下，劑量試驗中天竺鼠的免疫原性，如第4圖所示。改變胜肽混合物的量，使0.5mL礦物鹽(磷酸鹽，Adjuphos)中含有0μg、10μg、30μg、100μg至300μg上述二種Aβ_1-14胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：64與65)，基於0、3與5 wpi(初始免疫後週數)的免疫計畫，於天竺鼠中進行試驗，並觀察超過26週的免疫原性。在約5wpi時具有免疫反應高峰，接種300μg/劑的動物可獲得最高的免疫反應，之後依序為100μg、30μg及10μg/劑，在整個26週期間，具有類似的免疫反應排名。因此，最高劑量300μg/0.5mL Adjuphos是一優 化的免疫條件，且可作為一標準，用於分析其它配方在其它種類中的免疫原性。

b. 透過在胜肽與寡聚物之間形成免疫刺激複合物(ISC)，以進一步提升疫苗配方免疫原性的手段

經常使用的明礬或其相關的礦物鹽作為佐劑，此相關的疫苗配方的免疫原性也會減少目標Aβ_1-14 B細胞抗原決定位1 Log₁₀的力價(類似的試驗可參照實施例7)。因此，需要進一步開發可刺激疫苗配方免疫原性的方法。

更特別是，如第5A-5B圖所示UBI的配方，一種衍生於陽離子胜肽與聚陰離子CpG寡去氧核酸(ODN)(第5A圖)分子的穩定的免疫刺激複合物(ISC)(Sokoll,KK,2004)。此為一種藉由電中和自我組合的系統。陽離子胜肽對陰離子寡聚物的莫耳比會決定組合程度。胜肽免疫原與CpG ODN的非共價鍵電性結合為一種完全可再現的過程。此胜肽/CpG ODN免疫刺激複合物有助於呈現至免疫系統中“專業的”抗原呈現細胞(APC)，因此可進一步促進複合物的免疫原性。在製造過程中，可輕易地控制此複合物的品質。胜肽/CpG ISC在iv vivo中具良好的耐受性。

接著，此免疫刺激複合物可與礦物/鋁鹽類佐劑形成一液態懸浮液，如第5B圖所示。

CpG結構區(motif)為類Toll受體9(TLR9)的拮抗劑，存在於樹狀細胞與B細胞的亞群中。類Toll受體可辨識常見外來分子，如細菌、病毒及寄生蟲的不同分子樣態。特別是未甲基的合成CpG序列可結合並活化TLR9。如有效的B細胞有絲分裂 原，TLR9拮抗劑可刺激強大的免疫反應。其中，CpG的作用機制包括產生長久型抗原特異性抗體。

在AN1792 Aβ1-42胜肽疫苗臨床試驗中，由於其免疫原性的刺激，僅30%的患者抗體是針對Aβ_1-42凝集疫苗，且會導致6%的患者產生類腦膜炎副作用，而臨床試驗失敗。在本發明UBI AD疫苗中，使用以鋁為基礎的佐劑，已知可刺激Th-2型的免疫反應(如，IL4與IL5細胞激素)。此外，Aβ胜肽免疫原結構/CpG ODN免疫刺激複合物為顆粒。顆粒免疫原的免疫途徑受APC刺激，其為一種Th-2型反應。

綜上所述，CpG寡核苷酸已安全地使用於各種人類臨床試驗(>1,000病人)。胜肽/CpG ODN免疫刺激複合物可輕易地被識別。在生理條件下具穩定性與in vivo耐受性。不論是單獨源自於各種胜肽免疫原之CpG複合物，或與礦物鹽類合併使用，皆已在小鼠、天竺鼠、豬，狗，牛，狒狒和獼猴中證實其功效，且僅極少的不良副作用被報導。鋁礦物鹽類為美國目前唯一核准的疫苗佐劑。使用這些佐劑的疫苗組成物具經濟效益且可有效地量產。相對於單獨佐劑，特定的疫苗/佐劑配方是允許的。UBI公司研究發展獨特的組成。如上述用於治療癡呆的UBI AD疫苗，具有“SUCCESS”所需的所有的條件。

實施例9. 用於肌肉注射的UBI AD疫苗配方

Aβ_1-14-εK-KKK-MvF5 Th胜肽免疫原結構(SEQ ID NO：64)與Aβ_1-14-εK-HBsAg3 Th胜肽免疫原結構(SEQ ID NO：65)在生理pH下呈陽性。第2A-2B圖及第2E圖顯示此二胜肽單獨與等 莫耳混合的HPLC圖譜。第2C-2D圖顯示此二胜肽的分子量分別為4374 Da與3892 Da。聚陰離子CpG ODN的添加可改變溶液中免疫刺激複合物(ISC)的電中和及立即的“自我組合”。陽離子胜肽：陰離子CpG的莫耳電荷比決定組合的程度。UBI AD疫苗以下列步驟進行製備：製備油包水的ISC，包含二種Aβ胜肽免疫原結構的等莫耳混合物，且其與CpG ODN的莫耳電荷比為1.8：1。

a. 狒狒初始(0wpi)與補強(3與6wpi)接種含有300μg/0.5mL高純化Aβ _1-14 胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：64與65)與CpG寡聚物的免疫刺激複合物，含有或不含有明礬佐劑，評估超過10週的免疫原性

基於高純度Aβ_1-14胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：64與65)的天竺鼠第一級免疫原性與劑量研究，將300μg含有二種等莫耳Aβ_1-14胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：64與65與CpG寡聚物製備成一免疫刺激複合物，如上所述。接著，將製備成含有明礬、或adjuphos、或無佐劑，以每劑量300μg，在第0、3、6週以肌肉注射接種狒狒，並觀察特定抗體力價，觀察期間超過10週。由於狒狒所產生的免疫反應非常類似人類，因此在進行人體試驗前，利用狒狒進行免疫原性與最終配方的評估。將所有的疫苗配方以每劑量0.5mL給予至動物中，每組2隻動物。如第6圖所示，Aβ_1-14胜肽ELISA證明每劑量300μg/0.5mL，所有的三種配方，含有或不含有明礬或adjuphos佐劑具有大致上類似的免疫原性，在0.5 Log₁₀以內。ISC配方可僅單獨以胜肽顯著地刺激免疫原性。然而，在觀察超過8至10週後發現，相較於其它2組，Adjuphos配方可維 持一顯著較高的免疫反應，增加0.5至1個Log₁₀的反應程度(如，約3至10倍的效力)。利用可產生非常專一並良好免疫反應的高純度設計的胜肽，不含有任何佐劑的複雜因子，透過仔細評估三種類似配方在狒狒中的免疫反應，證實此設計的安全性，因而確定UBI AD疫苗的配方，並進一步研究在靈長類動物及人類的免疫原性，特別是，有關於抗體的功能性、急性及慢性毒性，以及最後的臨床試驗，如後續實施例所述。

b. 用於免疫原性、急毒性、慢毒性、效力、臨床安全性、耐受性以及藥效試驗之UBI AD疫苗配方的製備

製備油包水的ISC，包含二種Aβ胜肽免疫原結構的等莫耳混合物，且其與CpG ODN的莫耳電荷比為1.5：1。透過相反電荷的電中和過程，使UBI AD疫苗配方中的CpG ODN可100%結合至胜肽免疫原結構，形成奈米等級的顆粒。比起傳統CpG佐劑的使用，顆粒形式可顯著地降低CpG ODN的劑量，顆粒形式具有更低的潛在不良免疫反應，以及有助於改變免疫原途徑，包括，專業的抗原呈現細胞(APC)。接著，將鋁礦物鹽類、生理食鹽水、防腐劑添加至預製的ISC中。基於狒狒的免疫原性試驗，將鋁礦物鹽、磷酸鋁取代明礬凝膠，以獲得更好的免疫原性。

c. UBI AD疫苗配方的穩定性與免疫原性

如上述內容，製備每劑量300μg/0.5mL，含過量20%磷酸鋁(Adjuphos)為佐劑的UBI AD疫苗配方，將疫苗配方充填至一1mL無菌玻璃瓶，可於2-8℃儲存2年。依據安定性試驗程序， 檢測疫苗樣本。所有物理參數符合品管(QC)規格。將Aβ_1-14胜肽免疫原結構與CpG寡去氧核苷酸(ODN)及adjuphos佐劑分離，並依據各胜肽的規定進行HPLC分析。如第2E圖的所示，此二種Aβ_1-14胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：64與65)顯示出在預期的洗提時間有二種胜肽等莫耳混合物。

取出含有UBI AD疫苗配方的樣品瓶，在天竺鼠中進行免疫原試驗。分別2組試驗，每組含有6隻動物，一組為在0及3wpi給予300μg/劑量的疫苗組，另一組為安慰劑組(即，含有相同配方，但不含此二種胜肽免疫原結構)。如第7圖所示，所有的動物在單一接種後具有顯著的免疫原性，在3wpi後，於5wpi達到最高反應。測試8wpi之免疫血清對所各Th胜肽的反應，以提供免疫刺激。如表8所示，何任反應皆針對Th胜肽，進一步證實此二種Th胜肽的“免疫靜默”特性，可提供針對Aβ胜肽N端非常專一性的免疫反應。因此，有別於傳統的疫苗工藝，專門處理不易界定的生物材料，UBI AD疫苗配方包括明確的化學物質，可產生特定的免疫反應，具有比單株抗體更寬廣的反應、更好的效果，且比傳統胜肽-載體耦合形式的疫苗具有更清楚的反應，故有很高的安全性。

實施例10. 為評估UBI AD疫苗的組織特異性及安全性，進行阿滋海默症患者的腦部免疫組織染色

如實施例7所示，由第3、4組經等莫耳Aβ胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs：62與63)免疫狒狒採集高免疫血清，與純化的IgG部分(fraction)混合，並測試其與AD患者腦部的反應。如 第8A-8H圖所示，利用源自高免疫血清IgG可發現染色的腦血管和澱粉樣蛋白斑，但源自免疫前血清的類似IgG則無此發現。與Aβ_1-14胜肽預反應的免疫血清，可去除腦血管和澱粉樣蛋白斑的所有免疫原性，但非相關胜肽則無法達成，證明經含有Aβ胜肽免疫原(SEQ ID NOs：62與63)之疫苗免疫的血清中，具有高專一性的抗-Aβ抗體。

使用免疫前及高免疫天竺鼠IgG對正常成人組織的冷凍切片進行其它的免疫組織試驗，以觀察特異性與不良的抗體自我反應。以由經UBITh® AD免疫治療之天竺鼠純化的抗-Aβ_1-14 IgG與人類組織片進行免疫反應，並與相同動物免疫前所純化的IgG進行比較。由PhenoPath實驗室的生理學家分析正常成人組織的免疫染色樣態。除了某些肌肉組織(如，子宮內膜)的弱陽性免疫反應之外，所有經測試的成人組織皆為陰性，1/3成人大腦的老化斑塊具有強大的陽性反應，且在脊髓樣本中脊髓液呈陽性免疫染色。

實施例11. UBI原型AD疫苗配方在成年狒狒中的免疫原性試驗

在試驗程序的A部分中，於第0、3及6週免疫4隻成年母狒狒，以Aβ_1-14 UBITh®免疫原(每劑量總胜肽量300μg)與適當免疫刺激複合物(ISC)複合，並使用鋁礦物鹽佐劑，以此作為疫苗配方。ISC/礦物鹽配方可在所有動物中產生強大的抗-Aβ抗體反應(第9圖A部份)。注射部位未發現不良反應。

在試驗程序的B部分：(1)監測反覆暴露臨床目標劑 量與4倍高劑量的安全性及注射部位反應原性，(2)監測劑量遞增試驗中的免疫原性，以及(3)分析所回應之抗體反應的動力學。接著，這些動物休息72週。在此期間，抗-Aβ抗體血清減少10-100倍(第9圖B部份)。在78與81wpi時，將300μg胜肽劑量的疫苗給予至編號564、565動物，將1200μg胜肽劑量的疫苗給予至編號556、561動物。在所有的4隻狒狒中，回覆反應快速地恢復至峰值的抗體力價。在第104週，抗體力價開始下降，而藉由在第104週給予補強劑量，可使動物再次恢復至峰值的力價。利用抗-Aβ_1-28胜肽ELISA偵測在第0、2、5、6、8、10、78、81、84、88、92、96、100、104與107週之血清抗-Aβ抗體反應的動力特性。接種300μg劑量的動物在注射部位並未發現不良反應。然而，僅在第78週，於接種高劑量(1200μg)狒狒的注射部位發現一些紅色及發炎反應；此短暫的反應在1週內完全消除。在對狒狒進行分析的2年內，未發現其它不良情事或安全性的顧慮。

實施例12. 抗-Aβ抗體對原纖維的抑制及抵抗Aβ _1-40 毒性的in vitro神經毒性分析

使用大鼠嗜鉻細胞瘤細胞株PC-12與Aβ_1-40胜肽凝集溶液進行中和毒性分析，如參照Solomon et al.1997。胜肽溶液可透過剛果紅結合形成原纖維(fibrillar)。第6及9天，結合等量染劑的溶液以波長A540nm的吸光值表示。結果證明形成毒性的Aβ_1-40凝集物；以第9天的樣本對PC-12細胞株進行毒性試驗。

組織培養PC-12細胞株，懸浮於培養基中，並置於96孔圓底組織培養盤中，每孔洞100μL，濃度5×10³細胞/孔。分 別測試經37℃處理胜肽(即凝集的Aβ_1-40)與新鮮製備胜肽(即，非凝集的胜肽)在25與6.5μM濃度下的毒性，重複進行試驗。控制組為PC-12細胞株培養基。將培養盤在CO₂培養箱中於37℃培養48小時。利用Promega CytoTox 96®毒性分析檢測細胞毒性。以波長A492nm的吸光值偵測細胞瓦解，且結果以相較於100%瓦解的比例表示。

UBITh® AD疫苗功能免疫原性的評估in vitro

使用大鼠嗜鉻細胞瘤細胞株PC-12與具有毒性的Aβ_1-40胜肽凝集溶液進行中和毒性分析，以評估UBITh® AD疫苗抗體反應的功能性療效。在PC-12細胞中測試Aβ_1-40胜肽凝集溶液的毒性，接著在由免疫動物採取的天竺鼠或狒狒抗-Aβ血清存在下預培養1小時。將抗-Aβ血清以1：30與1：90的比例稀釋。最終結果以Aβ_1-40纖維聚集的抑制率與PC-12細胞對Aβ_1-40纖維毒性的保護率表示。以二個免疫實驗第0週的免疫前血清作為對照組。在1：30與1：90的稀釋比例的實驗中，相較於免疫前血清5至10%的背景抑制率及相較於狒狒免疫前血清15%的背景抑制率，免疫第5、8週的天竺鼠及狒狒血清具有顯著的抑制率(分別在第5及8週，1：30與1：90稀釋比例組之天竺鼠採取的血清具有50至70%抑制率；分別在第5及8週，1：30與1：90稀釋比例組之狒狒採取的血清具有75至50%抑制率)。同樣地，相較於天竺鼠與狒狒免疫前血清的基礎值，對於PC-12細胞抵抗Aβ_1-40毒性的保護率為60至80%。此結果顯示，以UBITh®β-澱粉樣蛋白胜肽免疫原誘導的抗體，具有抵抗毒性Aβ_1-40胜肽的功能性中和活性。

實施例13. UBI AD疫苗對過度表現hAPP751轉殖鼠之腦抑制模式與β-澱粉樣蛋白胜肽(Aβ _1-42 )濃度的影響

發明人評估UBI AD疫苗對在Swedish與London突變之過度表現hAPP751轉殖鼠及其非轉殖同窩鼠(ntg)腦抑制模式與β-澱粉樣蛋白胜肽(Aβ_1-42)濃度的影響(Rockenstein EM,et.1995,and 2001)。

在抑制模式中，於轉殖鼠(tg+)14週大時接種UBI AD疫苗。利用抗-Aβ_1-42抗體對腦組織進行免疫組織染色以偵測澱粉樣蛋白斑塊，結果顯示這些年輕tg+小鼠的澱粉樣蛋白斑塊減少。藉由生化萃取經接種tg+小鼠的腦組織，並定量分析Aβ_1-42的量，結果顯示年輕tg+小鼠的Aβ沉澱減少。這些結果皆顯示Aβ_1-42的減少與UBI AD疫苗的抗體反應有關。

此外，使用抗-CD11b抗體來檢測小膠質細胞的相對活性百分比，並使用抗-CD3抗體檢測T細胞浸潤，結果顯示相較於未接種的tg+控制組動物，接種AD疫苗並不會增加年輕tg+動物腦中免疫細胞的活化。

a. 整體目標：

評估肌肉注射UBI AD免疫治療疫苗超過12至16週期間，對於澱粉樣蛋白沉積和大腦斑塊量，以及血漿中人類β澱粉樣胜肽(Aβ_1-42)量的影響。

轉殖動物利用鼠Thy-1啟動子調控，持續性過度表現具London(717)與Swedish(670/671)突變的人類澱粉樣前驅蛋白 (hAPP)(Rockenstein EM,et.1995,and 2001)。早在3至4個月大時，即可在hAPP751 tg+小鼠額葉皮層中發現成熟斑塊，且在5至7個月大時，斑塊擴展至海馬、視丘和嗅覺流的皮質投視區。

b. 抑制模式的程序

選擇hAPP751轉殖(tg+)小鼠及其非轉殖(ntg)同胎鼠來評估UBI AD疫苗對腦Aβ沉澱及腦Aβ斑塊的影響。將所有的33隻tg+小鼠及10隻ntg小鼠分成4組：tg+安慰劑控制組小鼠(n=10)僅注射佐劑；tg+實驗組小鼠(n=13)注射UBI AD疫苗(90μg/150μL/注射)；未注射tg+控制組小鼠(n=10)；以及非注射ntg控制小鼠(n=10)。3在第0、3、12週注射3劑，並在第16週額外注射1劑。在第25.5週，以Morris水迷宮測試所有小鼠的空間學習。4週後，將小鼠犧牲。

c. 抗-Aβ _1-28 抗體力價的檢測

在第0、3、6、9、12、16、19、22與29週，對所有tg+與ntg小鼠採血。以Aβ_1-28 ELISA分析血清中抗-Aβ_1-28抗體力價。在安慰劑tg+小鼠及未注射tg+小鼠中並未發現抗-Aβ_1-28抗體力價。然而，所有注射至少2劑UBI AD疫苗的tg+小鼠皆可偵測到抗體力價。

d. 澱粉樣蛋白沉澱&斑塊量的腦形態與分析

在試驗結束，以生理食鹽水(0.9%)心室灌注，快速移除小鼠腦部，並進行分析。將左腦半球冷凍供後續分析。將 右側大腦以pH 7.4新鮮配製之4%多聚甲醛PBS溶液浸漬固定1小時。接著，將此半個大腦移至15%的蔗糖溶液中進行冷凍保護。隔天，將大腦冷凍於乾冰，並保存於-80℃，直到進行組織學研究。冷凍切片(10nm厚)以H&E染色，並分析神經細胞層的完整性和大致上的形態。使用單株抗體4G8(抗-Aβ_18-22)分析冷凍組織切片，以偵測皮質和海馬中的Aβ沉澱及斑塊。確定斑塊的數目與斑塊覆蓋的面積，並以來自穿過各動物矢狀腦的5個不同層的9個組織切片的平均值，建立動物的統計相關數值。分析UBI AD疫苗治療組中的7隻tg+小鼠以及未治療控制組的7隻tg+小鼠。結果以UBI AD疫苗治療組(n=7)對未治療組(n=7)動物之Aβ_1-28斑塊量的百分比，以及9個免疫組織切片中所偵測到的平均相對斑塊量表示。UBI AD疫苗反應tg+小鼠與未治療動物的比較也包括大腦皮質(0.22% vs.0.32%)以及海馬迴區(0.20% vs.0.29%)；在高度反應疫苗治療組中，平均的斑塊量降低。

e. 以生化分離大腦組織來偵測Aβ _1-42

如下述，將動物犧牲並製備大腦樣本。將左腦冷凍，並使用高靈敏Aβ_1-42 ELISA套組(GENETICS Company,Switzerland)分析4個腦萃取物溶解部分的Aβ_1-42胜肽；以標準品確定Aβ_1-42的量。4個腦萃取物的結果以ng/g大腦濕重表示。以TRIS緩衝鹽溶液(TBS)、Triton X-100、SDS與甲酸(FA)萃取各動物的右腦半球(包括嗅球(bulbus olfactorius))，以分析Aβ_1-42，且二重複各萃取部分的檢測。簡單地說，TBS萃取物含有腦組織的水溶性Aβ_1-40與Aβ_1-42部分。為溶解剩餘的β-澱粉樣蛋白胜肽， 必須使用界面活性劑。Triton X-100為一具二種屬性的寡聚乙二醇衍生物；異辛基團與苯環可破壞非極性的凡得瓦力，且重複的-O-CH₂-CH₂-基團可破壞氫鍵。SDS具有類似的兩性特徵，但更為強大，且可破壞整個二級結構；Aβ胜肽可為鏈狀且胜肽鏈可延伸。甲酸為最強的溶劑，且可破壞主要的氫鍵。TBS可溶解寡聚物結構。Triton可溶解較小的聚合物，例如，原纖維。SDS可破壞所有其它結構，且其它保護，包括強大、複合的不溶性纖維可在FA中分離，成為單體。因此，為了分析β-澱粉樣蛋白聚合狀態與抗澱粉樣測試化合物的效力，對這4種分離部分進行研究。

在Aβ定量ELISA或生化萃取試驗中，相較於未治療tg+小鼠，疫苗治療(UBI AD疫苗)tg+小鼠的抗-Aβ抗體反應與Aβ的減少有關。應注意的是，在與未治療的控制動物(第11A-11B圖)相比時，UBI AD疫苗tg+小鼠組中，各腦組織生物萃取物中的Aβ_1-42量較低。

f. 小神經膠質細胞活化的檢測

利用CD11b抗體分析冷凍組織切片中活化的小膠質細胞；透過各切片中每單位面積的數量作為小神經膠質細胞的聚集平均數；由5個不同層的9個組織切片的平均值，建立動物的統計相關數值。

疫苗治療tg+小鼠(n=7)與未治療tg+小鼠(n=7)的結果，以大腦皮層與海馬迴中，被染色之CD11b陽性細胞區的比例來表示，結果顯示，相較於未治療控制組動物，經治療的動物具有較小的染色區。此結果表示，與未治療轉殖小鼠相比，不 會增加疫苗治療動物中被活化小神經膠質細胞的量。

g. 腦組織中T細胞浸潤的檢測

分析冷凍組織切片，以偵測大腦皮層、海馬迴與血管中T細胞的量，且分別計數細胞。由5個不同層的9個組織切片的平均值建立動物的統計相關數值。疫苗治療tg+小鼠(n=7)與未治療tg+小鼠(n=7)的結果，以大腦皮層、海馬迴與血管中被染色之CD3陽性T細胞的數目表示，且結果顯示，相較於未治療動物，疫苗治療動物可稍微降低大腦皮層、海馬迴與血管中經免疫染色的T細胞平均數。

h. 結論

在16週的期間，以肌肉注射UBI AD疫苗或安慰劑疫苗至hAPP751轉殖小鼠3至4次。動物對於UBI AD疫苗具有良好的耐受性，特別是給予動物每劑量高濃度的UBI Aβ_1-14胜肽免疫原結構(90μg/150μL)。在反應組中，這些動物之4個腦組織萃取物的Aβ斑塊量與Aβ_1-42量減少。也可由免疫組織染色得知Aβ沉澱與斑塊的減少。在疫苗治療tg+hAPP751小鼠中，並沒有證據顯示小神經膠質細胞的活化或T細胞浸潤。

實施例14. UBI AD疫苗抗體反應的抗原決定位定位

利用塗佈Aβ_1-14(SEQ ID NO：4)、Aβ_1-28(SEQ ID NO：3)、Aβ_15-42(SEQ ID NO：67)、MvF5 Th(SEQ ID NO：46)、HBsAg3 Th(SEQ ID NO：47)胜肽作為固相抗原的反應盤進行ELISA測 試，以評估經免疫天竺鼠及狒狒血清中，對UBI AD疫苗之抗體反應的特異性。可利用Aβ_1-14與Aβ_1-28胜肽偵測疫苗所誘發之高力價抗-Aβ抗體(表2)；然而，由於“B細胞抗原決定位延展(spreading)”至超過第14個胺基酸，因此Aβ_1-28也可偵測到其它抗體，是潛在的不良交叉反應源。

為了解決此問題，同樣以ELISA測試高免疫天竺鼠抗血清及狒狒抗血清與Aβ_17-42胜肽的反應。ELISA力價顯示並未在高免疫樣本中偵測到抗原決定位延展。高免疫血清顯示可促進與Aβ_1-28胜肽的結合，但不會與Aβ_17-42反應。高免疫血清不會與MvF5 Th(SEQ ID NO：46)及HBsAg3 Th(SEQ ID NO：47)胜肽反應。在良好的抗原決定位定位方法中，圍繞著Aβ_1-14胜肽序列的N端天冬胺酸“D”及人類β澱粉樣肽前體蛋白(hAPP)鄰近區域，合成24個重複的10-mer胜肽，以覆蓋整個Aβ_1-14與鄰近的hAPP位置(表9)。將這些胜肽分別塗佈於微孔盤，作為ELISA檢測的固相免疫吸附劑。陽性對照組ELISA盤塗佈Aβ_1-28。於第0、10、84與111週由經免疫狒狒採取血清，進行抗體結合試驗。將狒狒血清連續稀釋並以塗佈5ug/mL 10-mer胜肽的孔盤進行分析。如預期，具有Aβ_1-14(SEQ ID NO：4)N端10-mer的胜肽(DAEFRHDSGY)與SEQ ID NO：6，可強烈地與所有4隻狒狒的免疫血清反應。Aβ_1-14第1個位置的“D”在抗體特異性中扮演重要的角色。刪除“D”或將第1個位置修飾成“E”(谷胺酸)會大幅降低對10-mer胜肽的結合，顯示狒狒抗體對Aβ_1-10(SEQ ID NO：6)的高特異性，以及對Aβ_1-42胜肽或其前驅物上Aβ胜肽免疫原結構其他位置的抗體辨識位交叉反應低。此外，利用免疫血清進行的抗原決定位定位， 可進一步以競爭抑制型ELISA確認，如表10所示。綜上所述，這些抗體抗原決定位的發現證實由UBI AD免疫治療疫苗誘發的抗體可直接專一性地針對Aβ的N端，而不超過第14個胺基酸的位置，也非MvF5 Th與HBsAg 3 Th。

實施例15. 接種多劑量UBI AD疫苗食蟹猴之血清與CSF中的抗體反應及Aβ _1-40 量

疫苗反應的藥物動力學顯示，第2組低劑量中(150μg/0.25mL)4/6的食蟹猴以及第3組高劑量(75μg/1.25mL)中所有的6隻食蟹猴，在第1次免疫後，會產生針對Aβ_1-14胜肽免疫原結構的抗體，且抗體具有對Aβ_1-42的交叉反應。

如表11所示，低劑量組與高劑量組的動物在試驗期間(經過27週)皆維持高力價抗體。透過抗原決定位定位(表12)與4隻免疫5次高劑量(750μg/劑)與低劑量(150μg/劑)食蟹猴血清抗體反應的良好特異性顯示，在所有4隻動物中對Aβ_1-10胜肽(DAEFRHDSGY)(SEQ ID NO：6)N端的強大特異性，在先前狒狒試驗免疫血清中也有類似的現象(表9)。狒狒中有一些不同的反應樣態，所有4隻動物對於圍繞Aβ_1-42胜肽N端第4、5、6位置RHD殘基的SEQ ID NOs：20至22胜肽具有一些溫合的反應。除了上述4隻動物之外，在所有食蟹猴試驗中，沒有對其它10-mer胜肽的額外反應。

利用市售的免疫分析套組來分析UBI AD疫苗對血清與CSF中Aβ量的影響。如表13所示，檢測接種後第0、15、21及25.5週血清中及犧牲時(第15週+1天或第27週)CSF中的Aβ_1-40濃度。 接種UBI AD疫苗之食蟹猴血清中Aβ_1-40的量增加，而接種安慰劑疫苗之動物則為正常含量。相較之下，不論接種安慰劑或UBI AD疫苗之食蟹猴腦脊髓液中，Aβ_1-40含量則維持在一穩定的狀態。此結果可支持“周邊槽假說(Peripheral Sink Hypothesis)”的抗-Aβ抗體流動模式，抗體可促使Aβ胜肽由腦外流至周邊循環系統。

實施例16. 接種多劑量UBI AD疫苗之食蟹猴的細胞性免疫反應

在第15、21及25.5週，由全血分離周邊血液單核細胞(PBMC)樣本，且與各種Aβ胜肽培養。如表14所示，在加入Aβ_1-14胜肽至培養基時，未發現淋巴細胞增殖反應。然而，當加入Aβ_1-42或Aβ_15-42(SEQ ID NO：67)胜肽至時PBMC培養基中時，則呈現陽性增生反應。

收集第15、21與25.5週的PBMC樣本，並檢測在Aβ胜肽或PHA有絲分裂原存在時，細胞激素的釋放。如表15所示，在全長Aβ_1-42胜肽時，可偵測到3種細胞激素(IL2、IL6、TNFα)的釋放，但Aβ_1-14胜肽則無；相較於安慰劑疫苗樣本，UBI AD疫苗治療樣本的細胞激素釋放並未增加。在Aβ胜肽存在下，所有PBMC培養中其它細胞激素(IL10、IL13、IFN)皆低於偵測極限。

由於食蟹猴接種的UBI AD疫苗免疫僅具有Aβ_1-14胜肽N端免疫原與外來T輔助抗原決定位，不含Aβ_17-42胜肽，表示Aβ_1-42胜肽的存在導致PBMC培養的陽性增生結果，並非UBI AD疫苗反應，而是天然Aβ的背景反應。

這些結果可支持UBI AD疫苗的安全性，其僅具有 Aβ_1-14與外來T輔助抗原決定位，表示不會產生針對正常食蟹猴中Aβ胜肽可能的自身細胞性免疫反應。相較之下，AN-1792疫苗臨床試驗中的腦膜炎不良反應可部分歸責於疫苗中纖維狀/凝集Aβ_1-42免疫原內含有T細胞抗原決定位。

實施例17. 豚鼠、獼猴和狒狒中不同劑量UBI AD疫苗之免疫原性的比較

大量測試Aβ胜肽免疫原結構的適合性後，選擇具有SEQ ID NOs：64與65的胜肽結構來設計疫苗配方。選擇的疫苗配方包括二種胜肽免疫原結構，其與CpG寡聚物形成免疫刺激複合物，並以礦物鹽類作為佐劑(UBI AD疫苗)，以此疫苗配方進行大量試驗，如實施例8-15所示，以校正疫苗在多種物種及臨床試驗接種計畫中的免疫原性(天竺鼠、獼猴和狒狒)。如表16顯示，在給予1或2劑量後，胜肽劑量與應答率的比較(陽性力價反應的動物數/試驗動物數)，並顯示UBI AD疫苗各接種計畫的動物體重。由此分析可知，基於所有動物的數據，每劑量較佳大於100ug，可在接種1次後達到良好的反應率，且補強注射可獲得高或接近完全的反應率。選擇300μg/0.5mL的UBI AD疫苗進行人體試驗。在第1期臨床試驗中，在第0、4、12週進行接種。接種1劑後4週，19位受試者有2位具有陽性抗-Aβ抗體力價，接種2劑後4週(8週)，19位受試者有17位呈陽性反應，接種3劑後4週(16週)，所有19位受試者皆呈陽性反應，且持續到第1期臨床試驗結束(24至26週)。

實施例18. 第1期臨床試驗顯示的UBI AD疫苗(UB-311)治療效果

基於病理、生化和遺傳證據，Aβ胜肽為一種主要的治療目標，所有的證據支持其在病程中的角色。主動式Aβ免疫治療，如UBI AD疫苗(UB-311)的目的在於刺激免疫反應，以產生強大的抗-Aβ抗體，其可由循環系統捕捉多餘的Aβ胜肽，且抑制或減緩認知能力的下降。

UB-311第1期臨床試驗的名稱為“第1期，評估UBI AD免疫治療疫苗(UB-311)，在輕度至中度阿茲海默症患者中之安全性、耐受性及免疫原性的開放式試驗”，基於經最終核可的試驗計畫進行試驗。所有19位輕度至中度AD患者報名參加。每位受試者分別在第0、4及12週以肌肉注射接種試驗藥物(UB-311)3次。整個試驗持續24至26週。

除了評估UB-311第1期臨床試驗所獲得的安全性、耐受性、免疫原性及功效數據之外，並分析受試者的Aβ胜肽量及免疫功能。所收集之第0、4、8、12、16及24/26週免疫UB-311前、後血液分離周邊血液單核細胞(PBMC)與血清/血漿樣本，以進行血清學和免疫原性分析，包括(1)抗-Aβ抗體力價，(2)抗原決定位定位，(3)血漿中Aβ_1-40的量，以及(4)in vitro淋巴球增生與細胞激素的分析。

所有19位輕度至中度阿茲海默症(AD)患者，在第0、4及12週，以肌肉注射接種3劑UBI AD疫苗(UB-311)。

在給予臨床上輕度至中度AD患者時，可證實UB-311的安全性及耐受性。利用絕對、可能、或許與UB-311相關之不良 事件(AEs)的發生率來評估UB-311治療的主要指標。在試驗期間，16個治療相關的AE發生於19位受試者中的9位。所有的治療相關AE包括輕度注射部位反應(5位)，中度躁動(moderate agitation)(2位)，以及輕度紅血球沉降率增加(2位)。所有的治療相關AE為第1級(輕度)或第2級(中度)嚴重性，且沒有對這些事件採取行動。1位具有僵直性脊椎炎及糖尿病病史的受試者，在之後發生屬於嚴重事件(SAE)的帶狀皰疹。此受試者在發生此事件時，立即送醫並受到適當的治療。判斷此SAE並無因果關係，且此受試者在二週後因情況好轉而出院。

評估UB-311的耐受性。所有19位受試者完成治療，且僅管有受試者發生AE，但沒有提早退出試驗。因此，耐受性為100%。

實施例19. UB-311疫苗的給予可刺激所有受試者產生針對Aβ _1-14 胜肽N端的抗體

如第12圖所示，檢測在第0、4、8、12、16及24-26週抗-Aβ_1-14抗體量的改變，以評估UB-311疫苗的免疫原性。抗-Aβ_1-14抗體量的平均值以log₁₀轉換，所有受試者第0週(治療前)為1.16，在第4週輕微地增加至1.22，在第8及12週明顯地增加至2.02與1.91，在第16週(第3次免疫後第4週)達到峰值2.68，並在第24-26週下降至2.22。

抗體力價經Log₁₀轉換，且以第0週的數值為基礎值。在所有的3種專一性抗體力價觀察到類似的趨勢。除了抗-Aβ_1-42單體抗體，抗體力價改變的平均值在第4週輕微地增加，此時，患 者已在第0週接種第1劑UB-311，但在接種第2劑之前。在第8週接種第2劑後，於此抗體力價也持續增加。在第12週接種第3劑後，第16週時仍可偵測到抗體力價的峰值平均變化。

實施例20. 以腦科學，認知與功能測試評估UB-311疫苗在輕度至中度阿茲海默症的功效

透過分析19位患者之ADAS-Cog分數、MMSE分數與ADCS-CGIC的改變來評估UB-311的功效。評估第0週(V2)、16週(V7)及24-26週的ADAS-Cog分數與ADCS-CGIC分數。評估預篩選(V1)、第16、24-26週的MMSE分數。所有受試者的ADAS-Cog分數由第0週至第16週及由第16週至第24-26週分別增加1.42與0.79。所有受試者ADAS-Cog分數的平均基礎值為26.26，在第16週增加至27.68，在第24-26週輕微增加至28.47。此外，在MMSE分數中由預篩選至第16週及由第16週至第24-26週分別減少0.32與0.79(第13圖)。

受試者在預篩選的平均MMSE分數為19.16。第16週時，分數降至18.84，且在第24-26週，最後一次訪視時，降至18.05。值得注意的是，即使此2種等級(scales)的平均值不同，但每個受試者分數的分佈相當分散，因此，此二種等級的趨勢是穩定的。

關於ADCS-CGOC試驗，在治療結束後(第3劑)4週的第16週，超過35%的受試者改善。在治療停止後，於第24-26週，受試者的改善率下降不超過18%。在16週，約略小於半數的受試者，其ADCS-CGIC沒有改變，且在V7(Visit 7)後，停止治療後8至10週，ADCS-CGIC稍微增加至大於所有受試者的50%。比較受 試者改善與惡化，在第16週顯示出陽性結果可支持試驗疫苗，但在第24-26週則無(最後一劑疫苗後12週)。

在子群分析中，結果證明輕度AD的較老受試者(年齡>60歲，且MMSE基礎值>20)對於UB-311疫苗具有較佳的反應，結果顯示(1)平均ADAS-Cog下降3點(相較於超過12週之Tarenflurbil第2期臨床試驗的安慰劑組增加3.81點)，(2)穩定的平均MMSE分數(相較於超過12週之Tarenflurbil第2期臨床試驗的安慰劑組增加2.04點)，如第14圖所示，以及(3)較高的改善比例，且ADCS-CGIC沒有改變比例。對於年齡>60歲之輕度AD受試者所有3種認知分數的改善是前所未有的。

實施例21. 針對Aβ _1-28 單體、Aβ _1-42 單體或Aβ _1-42 寡聚物之人類抗體的酵素免疫分析(ELISA)

阿茲海默症試驗可證明Aβ凝集及Aβ衍生寡聚物在AD病原機制中扮演核心角色。Aβ寡聚物會結合至表現N-甲基-D天冬胺酸(NMDA)型谷胺酸受體(NMDA-R)之NR1與NR2B單元的神經元，參照Lacor,et al in 2007。當Aβ寡聚物結合至海馬神經元細胞上的NR1與NR2B時，配體-受體的結合會導致突觸末端的數目大量減少，而突觸末端與記憶和認知功能障礙及癡呆有關。目前，細胞的in vitro試驗結果及臨床試驗顯示，抗-Aβ寡聚物抗體可阻止此結合，並保護神經元抵抗Aβ寡聚物的毒性。UBI AD疫苗(UB-311)含有2種胜肽免疫原，各胜肽包括一短鏈Aβ胜肽N端(Aβ_1-14)，其連結至不同的Th2 N端UBITh®胜肽抗原決定位。為評估UBI AD疫苗反應的免疫原性，開發出可偵測Aβ_1-28單 體、Aβ_1-42單體與Aβ_1-42寡聚物的抗-Aβ抗體酵素免疫分析(ELISA)。

將Aβ_1-28單體、Aβ_1-42單體或Aβ_1-42寡聚物預塗佈於微孔盤上，作為固相抗原。在分析過程中，以1：10連續稀釋將血清樣本稀釋1：100至1：100,000，並添加至預先塗佈的微孔盤中。若具有Aβ_1-28單體、Aβ_1-42單體或寡聚物抗體，其會與固相抗原結合。經清洗微孔盤以移除未結合的抗體及其它血清成分後，加入辣根過氧化物酶-耦合重組蛋白A/G至每個孔洞中，與結合的抗體反應。清洗孔洞以移除未結合的耦合物，並加入含有3’,3’,5’,5’-四甲基聯苯胺(TMB)與過氧化氫的溶液至每個孔洞中。在血清試驗中，將所呈現的黃色按比例來表示Aβ-特異性抗體量。以稀釋的硫酸溶液停止反應。以分光光度計偵測在波長450nm下，各孔洞顏色的變化。以UBI® ELISA力價計算程式計算相關的抗體力價。

相較於Aβ單體或澱粉樣斑塊，Aβ寡聚物對神經元最具毒性。主動免疫治療的目標不僅可促進產生針對Aβ單體的抗體，也包括針對Aβ寡聚物的抗體。19位輕度至中度AD受試者在第0(基礎值)、4與12週UB 311注射前，及第8、16及24週，採集血清樣本，分析抗-Aβ抗體力價。第15A-15C圖顯示，所有19位受試者在篩選觀察(V1/V2)及第16週(UB-311最後免疫後4週)之Aβ_1-28單體、Aβ_1-42單體與Aβ1-42寡聚物的抗體力價。

實施例22. 抗原決定位定位：偵測針對Aβ N-端胜肽之人類抗體的競爭性結合抑制酵素免疫分析(EIA)

利用ELISA分析，以抗原決定位定位確定，線狀或重疊10-mer之Aβ胜肽(介於第9至24個胺基酸)的抗-Aβ_1-14抗體的結合位或抗原決定位。分析19位受試者的臨床血清樣本。第16週(第0、4、12週之3次免疫後)的結果如下所示(第16圖)。

以合成Aβ_1-28胜肽作為一固相抗原，且預先塗佈濃度2μg/mL的胜肽至微孔盤。在實驗前，將各血清樣本以1：50、1：100、1：200及1：400比例稀釋，並決定最佳的稀釋比例。經最佳稀釋比例的抗-Aβ血清樣本分別與設計的10-mer胜肽混合，作為液相免疫吸附物。在加至Aβ_1-28預塗佈盤前，將此混合物利用稀釋的血清以1：5比例連續稀釋。以最佳稀釋比例的抗-Aβ血清作為控制組。在分析的過程中，10-mer胜肽會特異性地結合至優勢的抗體結合位，且競爭性抑制抗-Aβ抗體與固相抗原的結合。在清洗孔洞以移除未結合的抗體及其它血清成分後，加入辣根過氧化物酶-耦合重組蛋白A/G至每個孔洞中，與結合的抗體反應。清洗孔洞以移除未結合的耦合物，並加入含有3’,3’,5’,5’-四甲基聯苯胺(TMB)與過氧化氫的溶液至每個孔洞中。在血清試驗中，將所呈現的黃色按比例來表示Aβ-特異性抗體量。以稀釋的硫酸溶液停止反應。使用IC50 5X程式(Molecular devices)以分光光度計偵測在波長450nm下，各孔洞顏色的變化。將控制組孔洞中，抗-Aβ抗體與固相抗原的結合設定為最大的結合(100%)，且以10-mer胜肽的半抑制濃度(IC50)來判斷抗原決定位特異性。

實施例23. 以經UB-311免疫之患者血清中抗體所辨識之專一性針對Aβ _1-10 胜肽的優勢抗原決定位

良好的抗原決定位定位方法可辨識目標區內特定序列的優勢抗體結合位(表17)，沿著Aβ_1-14胜肽序列(SEQ ID No4)與人類β-澱粉樣蛋白前驅蛋白的鄰近區域合成重疊的10-mer胜肽(SEQ ID NOs：6、8至30)，以覆蓋整個由N端天冬胺酸“D”起始的Aβ_1-14及鄰近的hAPP位置(第16圖)。檢測19位受試者免疫前與接種3劑UB-311後第16週所採集的血清樣本。以治療前的樣本作為抗-Aβ抗體基礎值(未顯示)。如預期，優勢抗體反應直接針對Aβ的游離胺基端(SEQ ID No.6)，如第16圖及表17所示。更特別的是，胜肽DAEFRHDSGY，Aβ_1-14的N端10-mer，與所有19位患者的免疫血清有最強的反應。19位受試者中有8位可偵測到與其它Aβ 10-mer胜肽的微弱額外抗體反應。檢測在第4、8、12及24-26週由某些受試者採集的血清樣本，並獲得相同的結果(未顯示)。綜上所述，此數據可證明UB-311所誘發的主要抗體是特異性針對Aβ的N端區域，且不超過第14個胺基酸。

實施例24. 在經UBI AD疫苗(UB-311)免疫3次後，提升血漿中的Aβ _1-40 胜肽

目前，不論是調整病情的臨床試驗或以膽鹼酯酶(cholinesterase)抑制劑治療AD患者，血漿中Aβ_1-40(SEQ ID NO：2)、Aβ_1-42(SEQ ID No：1)或Aβ_1-42：Aβ_1-40比例並無顯著改變。然而，血漿中Aβ被視為一可能的AD標誌。

在發明人先前的試驗中，接種UBI AD疫苗可增加狒狒血漿中的Aβ_1-40，但接種安慰劑疫苗的動物，則維持在一正常值。此結果顯示，“Peripheral Sink Hypothesis”可能是抗-Aβ抗 體的運作模式。即使受試者在免疫6次UB-311後的抗-Aβ抗體力價會遠高於免疫3次後的力價，但此現象仍可在目前的試驗中發現。如表18所示，比較12對受試者在UB-311治療前及第16週(第3劑免疫後4週)血漿中Aβ_1-40量與第16週的Aβ_1-28抗體濃度。如預期，在UB-311免疫前，所有抗體力價皆為陰性。8位抗-Aβ_1-28抗體力價大於Log₁₀ 2.4的受試者，在接種UBITh® AD疫苗後，提升Aβ_1-40的量；4位抗體力價小於Log₁₀ 2.0的3位受試者，在治療後，不會提升Aβ_1-40的量。幾乎所有受試者的Aβ_1-40增加量很小，除了一個例外(P109受試者)，其顯示在免疫前，血漿中即具有不尋常的高Aβ_1-40量，在免疫後，則具有非常高的程度(1031.9pg/mL)。產生此非常高濃度Aβ_1-40的原因仍不清楚。沒有受試者之血漿具有可偵測程度的Aβ_1-42胜肽。

實施例25. UB-311免疫不會因Aβ _1-14 或Aβ _1-42 胜肽的存在誘發人類淋巴球(PBMC)

新型疫苗的來臨與越來越多的公開文獻顯示接種與自體免疫疾病之間的關聯，並會導致公眾對接種的疑慮。可利用抗原誘導之淋巴球增生與細胞激素來評估此免疫系統是否在一接種後為被高度活化，並包括此反應途徑。此試驗的目的為在Aβ胜肽存在或不存在下，以淋巴球增生刺激指數(SI)分析，或以PHA有絲分裂原為陽性對照組以及在第16週接種3劑UB 311後，AD患者淋巴球的細胞激素濃度來評估UB-311的免疫原(Aβ_1-14)。

以聚蔗糖-泛影葡胺梯度離心分離AD患者的周邊血液單核細胞(PBMC)。對於胜肽誘導的增生及細胞激素的產生， 將細胞(2.5 x 10⁵/孔)單獨三重複培養，或添加胜肽(最終濃度為10μg/mL)，包括Aβ_1-14(SEQ IN No：4)、Aβ_1-16(未顯示)、Aβ_1-28(SEQ IN No：3)、Aβ_17-42(未顯示)、Aβ1-42(SEQ ID No：1)與一非相關的38-mer胜肽(p1412)。細胞在5% CO₂的環境下於37℃培養72小時，接著由各孔洞移除100μL的上清液，並以-70℃冷凍以進行細胞激素分析。於每個孔洞中添加10μL含有0.5μCi之3H-胸腺嘧啶(3H-TdR,Amersham,Cat No.TRK637)培養基，培養18小時，接著以液相閃爍計數偵測放射線同位素。使用絲分裂原植物血凝素(PHA)作為淋巴球增生的陽性控制組。以僅培養細胞，不含有Aβ胜肽或PHA有絲分裂原作為陰性控制組。將具Aβ胜肽之三重複實驗組的每分鐘平均計數(cpm)除以三重複陰性控制組來計算刺激指數(SI)；SI>3.0視為具有顯著的增生反應。

由第0週(基礎值)與16週(第3劑後4週)採集的全血分離出周邊血液單核細胞，接著在各種Aβ胜肽存在下或不存在下進行培養。如表19所示，當加入Aβ_1-14、其它Aβ胜肽或p1412(非相關的控制組胜肽)至各培養基中時，未發現顯著的增生反應。如預期，在加入PHA有絲分裂原至培養基中時，會產生陽性增生反應。在UB 311免疫前後觀察類似PHA的反應顯示，受試者的免疫功能並沒有顯著地改變(表19)。

實施例26. US-311免疫劑量的Aβ _1-14 胜肽不會誘發人類細胞激素

在僅有細胞、或在Aβ胜肽或PHA存在下，將培養基等分，進行PBMC培養的細胞激素分析(IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、 IFN-γ)。使用人類特異性細胞激素三明治ELISA套組(U-CyTech Biosciences,Utrecht,The Netherlands)，依據說明書的指示，檢測各細胞激素的濃度(pg/mL)。在僅有第0週及第16週採集的PBMC細胞、或在Aβ胜肽、p1412(非相關胜肽)或PHA有絲分裂原(陽性控制組)存在下，培養3天，分析細胞激素的釋放。套組的偵測範圍介於5至320pg/mL。任何低於5pg/mL或大於320pg/mL的偵測濃度係分別為低於偵測極限(BQL)或高於偵測極限(AQL)。然而，對於統計的考量，將BQL或AQL分別以低於(5pg/mL)或高於(320pg/mL)偵測極限取代。第0週及第16週各細胞激素的平均濃度如表20所示。如預期，在陽性控制組，PHA存在下，除了IL-2之外，細胞激素大量產生。可在基礎值(第0週)及第16週發現，與Aβ_1-14或其它Aβ胜肽刺激有關之細胞激素的產生，但幾乎所有的數值類似於陰性控制組(僅有細胞)。

為了評估免疫後細胞性免疫反應的改變，比較實驗組與陰性控制組由基礎值至第16週平均細胞激素濃度的改變，並以魏克遜符號等級和檢定(Wilcoxon signed-rank test)進行分析。結果顯示全長Aβ_1-42胜肽會增加4種細胞激素(IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α)的分泌；此發現可能是Aβ_1-42凝集的構象抗原決定所造成。然而，在Aβ_1-14或其它Aβ胜肽中，並未發現細胞激素分泌的向上調控。

摘要：UBI AD疫苗含有2種胜肽免疫原，Aβ_1-14胜肽的N端分別連結至MvF5Th與HBsAg3 Th抗原決定位。使用in vitro淋巴球增生與細胞激素分析來評估UBI AD疫苗在細胞性免疫反應中的影響。當加入Aβ_1-14胜肽或任何其它Aβ_1-14胜肽至培養基中 時，並未發現淋巴球的增生反應，如表19所示。除了Aβ_1-42胜肽之外，在以Aβ_1-14胜肽或任何其它Aβ_1-14胜肽治療時，並未偵測到UBI AD疫苗接種患者之淋巴球所誘導的細胞激素向上調控，然而在UB 311免疫後第16週，相較於免疫原的第0週，Aβ_1-42胜肽會刺激可觀的4種細胞激素(IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α)(表20)。由於僅Aβ_1-14並不會發現到此向上調控，所以透過Th2型之T細胞反應所增加的細胞激素可能與UBI AD疫苗反應無關。Aβ_1-42的反應被懷疑是天然Aβ的背景反應，其與Aβ_1-42中的天然T輔助抗原決定位有關。PHA不會導致IL-2的產生，且Katial,et al等人在類似的實驗及正常人類PBMC下也發現相同的結果。綜上所述，此結果顯示UBI AD疫苗不會在第1期臨床試驗的AD患者中，產生可能的自身性發炎、細胞性免疫反應，因此進一步證實UBI AD疫苗的安全性。

Aβ_1-10的50%抑制為約0.3μg/ml。狒狒抗-Aβ抗體的特異性主要針對N端天冬氨酸(D)。使用人類澱粉樣蛋白前驅蛋白(hAPP)的10-mer Aβ胜肽以狒狒免疫血清樣本來進行抗原決定位定位偵測，顯示針對N端Aβ_1-10胜肽的特異性。

N=每組6隻食蟹猴(第0、3、6、9、12及15週)； N=每組3隻食蟹猴(第21及27週)。

Aβ_1-14(SEQ ID NO：4)DAEFRHDSGYEVHH

Aβ_1-16(SEQ ID NO：66)DAEFRHDSGYEVHHQK

Aβ_17-42(SEQ ID NO：67)LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA

Aβ_1-42(SEQ ID NO：1)DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA

a. 在最後免疫(15wpi)後，由6隻食蟹猴採取的周邊血液單核細胞(PBMCs)在Aβ胜肽或PHA有絲分列原存在或不存在下，培養24小時。以市售ELISA分析(U-CyTech Biosciences,Utrecht,The Netherlands)檢測上清液的各細胞激素(IL-2、IL-6、TNF-α)濃度。

b. 結果以平均±標準差表示。

c. BDL：低於偵測極限。

1. 狒狒在A部分第0、3週及B部分第78、81週(在72週休息後)接受免疫。

2. 每1mL含有600μg胜肽。

3. Log₁₀>2表為陽性抗-Aβ力價。

4. 數字表示：陽性力價動物/總實驗動物數，BW：體重。

粗體表示Aβ_1-40在第0、4、12週免疫UBI AD疫苗後第16週的增加

*p1412為一不相關的控制組胜肽統計分析，利用成對樣本t檢定分析第0週與第16週淋巴球增生的差異。利用魏克遜符號等級和檢定分析Aβ胜肽與控制組對細胞激素平均濃度改變的差異(第0週與第16週)。以2成對檢定分析統計上顯著的程度(p<0.05)。使用R(第2.13.0版)進行所有的統計分析。

1. 分析的可量化範圍介於5至320pg/mL。

2. 90%或更高之受試者的濃度高於偵測極限(AQL)，如320pg/mL。

3. 1位受試者具AQL值。

4. 6位受試者具AQL值。

5. 8位受試者具AQL值。

6. 4位受試者具AQL值。

7. PHA有絲分裂原組中無IL-2產生的結果與Katial et.al文獻的報告一致。

<110> 美國聯合生物醫學公司(United Biomedical,Inc.)

<120> 抑制與免疫治療阿茲海默型癡呆的胜肽疫苗

<130> 1004263.211WO(2032-WO)

<140> PCT/US2013/37865

<141> 2013-04-23

<150> 13843883

<151> 2013-03-15

<160> 67

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 42

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(42)

<223> Abeta 1-42或APP 770(D672-A713)

<400> 1

<210> 2

<211> 40

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 尚未歸類的特徵胜肽

<222> (1)..(40)

<223> Abeta 1-40 or APP770(D672-V711)

<400> 2

<210> 3

<211> 28

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(28)

<223> Abeta 1-28或AP770(D672-K699)

<400> 3

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(14)

<223> Abeta 1-14或APP770(D672-H685)

<400> 4

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<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

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<223> Abeta 1-12或APP 770(D672-V683)

<400> 5

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<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

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<223> Abeta 1-10或APP 770(D672-Y681)

<400> 6

<210> 7

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<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(28)

<223> Abeta 15-42或APP 770(Q686-A711)

<400> 7

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta-9-1或APP 770(T663-D672)

<400> 8

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta-8-2或APP 770(E664-A673)

<400> 9

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta-7-3或APP 770(E665-E674)

<400> 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta-6-4或APP 770(I666-F675)

<400> 11

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta-5-5或APP 770(S667-R676)

<400> 12

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> PROPEP

<222> (1)..(10)

<223> Abeta-4-6或APP 770(E668-H677)

<400> 13

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta-3-7或APP 770(V669-D678)

<400> 14

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta-2-8或APP 770(K670-S679)

<400> 15

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta-1-9或APP 770(M671-G680)

<400> 16

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta 2-11或APP 770(A673-E682)

<400> 17

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta 3-12或APP 770(E674-V683)

<400> 18

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta 4-13或APP 770(F675-H684)

<400> 19

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta 5-14或APP 770(R676-H685)

<400> 20

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta 6-15或APP 770(H677-Q686)

<400> 21

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta 7-16或APP 770(D678-K687)

<400> 22

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta 8-17或APP 770(S679-L688)

<400> 23

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta 9-18或APP 770(G680-V689)

<400> 24

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta 10-19或APP 770(Y681-F690)

<400> 25

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta 11-20或APP 770(E682-F691)

<400> 26

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta 12-21或APP 770(V683-A692)

<400> 27

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta 13-22或APP 770(H684-E693)

<400> 28

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta 14-23或APP 770(H685-D694)

<400> 29

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta 15-24或APP 770(Q686-V695)

<400> 30

<210> 31

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(7)

<223> Abeta 16-22或APP 770(K687-E693)

<400> 31

<210> 32

<211> 4

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(1)

<223> epsilon K

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(4)

<223> spacer A

<400> 32

<210> 33

<211> 17

<212> PRT

<213> 梭狀芽孢桿菌

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(17)

<223> 梭狀芽抱桿菌1 Th

<400> 33

<210> 34

<211> 15

<212> PRT

<213> 麻疹病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(15)

<223> MvF1 Th

<400> 34

<210> 35

<211> 24

<212> PRT

<213> 百日咳桿菌

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(24)

<223> 百日咳桿菌Th

<400> 35

<210> 36

<211> 17

<212> PRT

<213> 梭狀芽孢桿菌

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(17)

<223> 梭狀芽孢桿菌2 Th

<400> 36

<210> 37

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(23)

<223> 白喉桿菌-白喉Th

<400> 37

<210> 38

<211> 21

<212> PRT

<213> 惡性瘧原蟲

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(21)

<223> 惡性瘧原蟲Th

<400> 38

<210> 39

<211> 17

<212> PRT

<213> 曼氏血吸蟲

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(17)

<223> 曼氏血吸蟲Th

<400> 39

<210> 40

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(25)

<223> 霍亂毒素Th

<400> 40

<210> 41

<211> 15

<212> PRT

<213> 麻疹病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(15)

<223> MvF 2 Th

<400> 41

<210> 42

<211> 22

<212> PRT

<213> 麻疹病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(22)

<223> KKKMvF 3 Th

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (7)..(7)

<223> S或T

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (10)..(10)

<223> K或R

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (11)..(11)

<223> G或T

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (15)..(15)

<223> H或T

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (16)..(16)

<223> K或R

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (19)..(19)

<223> G或T

<400> 42

<210> 43

<211> 18

<212> PRT

<213> B型肝炎病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(18)

<223> HBsAg 1 Th

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (1)..(1)

<223> K或R

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (2)..(2)

<223> K或R

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (3)..(3)

<223> K或R

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (4)..(4)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (5)..(5)

<223> F或K或R

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (6)..(6)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (7)..(7)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (9)..(9)

<223> K或R

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (10)..(10)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (11)..(11)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (13)..(13)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (15)..(15)

<223> Q或L或I或V或F

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (17)..(17)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (18)..(18)

<223> D或R

<400> 43

<210> 44

<211> 19

<212> PRT

<213> 麻疹病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 4 Th

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (4)..(4)

<223> S或T

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (7)..(7)

<223> K或R

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (8)..(8)

<223> G或T

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (12)..(12)

<223> H或T

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (13)..(13)

<223> K或R

<400> 44

<210> 45

<211> 18

<212> PRT

<213> B型肝炎病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(18)

<223> HBsAg 2 Th

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (4)..(4)

<223> I或F

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (5)..(5)

<223> I或F

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (6)..(6)

<223> T或L

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (7)..(7)

<223> I或L

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (11)..(11)

<223> I或L

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (14)..(14)

<223> P或I

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (15)..(15)

<223> Q或T

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (16)..(16)

<223> S或T

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (17)..(17)

<223> L或I

<400> 45

<210> 46

<211> 19

<212> PRT

<213> 麻疹病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 5 Th

<400> 46

<210> 47

<211> 18

<212> PRT

<213> B型肝炎病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(18)

<223> HBsAg 3 Th

<400> 47

<210> 48

<211> 32

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(14)

<223> Abeta 1-14

<220>

<221> 胜肽

<222> (15)..(15)

<223> epsilon K作為間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (16)..(32)

<223> 梭狀芽孢桿菌1 Th

<400> 48

<210> 49

<211> 26

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(10)

<223> Abeta 1-10

<220>

<221> 胜肽

<222> (11)..(11)

<223> epsilon K作為間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (12)..(26)

<223> MvF 1 Th

<400> 49

<210> 50

<211> 28

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(12)

<223> Abeta 1-12

<220>

<221> 胜肽

<222> (13)..(13)

<223> epsilon K作為間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (14)..(28)

<223> MvF 1 Th

<400> 50

<210> 51

<211> 30

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(14)

<223> Abeta 1-14

<220>

<221> 胜肽

<222> (15)..(15)

<223> epsilon K作為間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (16)..(30)

<223> MvF 1 Th

<400> 51

<210> 52

<211> 39

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(14)

<223> Abeta 1-14

<220>

<221> 胜肽

<222> (15)..(15)

<223> epsilon K作為間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (16)..(39)

<223> 百日咳桿菌Th

<400> 52

<210> 53

<211> 32

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(14)

<223> Abeta 1-14

<220>

<221> 胜肽

<222> (15)..(15)

<223> epsilon K作為間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (16)..(32)

<223> 梭狀芽孢桿菌2 Th

<400> 53

<210> 54

<211> 38

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(14)

<223> Abeta 1-14

<220>

<221> 胜肽

<222> (15)..(15)

<223> epsilon K作為間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (16)..(38)

<223> Diphtheria Th

<400> 54

<210> 55

<211> 36

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(14)

<223> Abeta 1-14

<220>

<221> 胜肽

<222> (15)..(15)

<223> epsilon K作為間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (16)..(36)

<223> 惡性瘧原蟲Th

<400> 55

<210> 56

<211> 32

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(14)

<223> Abeta 1-14

<220>

<221> 胜肽

<222> (15)..(15)

<223> epsilon K作為間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (16)..(32)

<223> 曼氏血吸蟲Th

<400> 56

<210> 57

<211> 40

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(14)

<223> Abeta 1-14

<220>

<221> 胜肽

<222> (15)..(15)

<223> epsilon K作為間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (16)..(40)

<223> 霍亂毒素Th

<400> 57

<210> 58

<211> 30

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(14)

<223> Abeta 1-14

<220>

<221> 胜肽

<222> (15)..(15)

<223> epsilon K作為間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (16)..(30)

<223> MvF 2 Th

<400> 58

<210> 59

<211> 37

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(14)

<223> Abeta 1-14

<220>

<221> 胜肽

<222> (15)..(15)

<223> epsilon K作為間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (16)..(37)

<223> KKKMvF 3 Th

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (22)..(22)

<223> S或T

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (25)..(25)

<223> K或R

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (26)..(26)

<223> G或T

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (30)..(30)

<223> H或T

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (31)..(31)

<223> K或R

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (34)..(34)

<223> G或T

<400> 59

<210> 60

<211> 33

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(14)

<223> Abeta 1-14

<220>

<221> 胜肽

<222> (15)..(15)

<223> epsilon K作為間隔子

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (16)..(16)

<223> K或R

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (17)..(17)

<223> K或R

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (18)..(18)

<223> K或R

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (19)..(19)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (20)..(20)

<223> F或K或R

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (21)..(21)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (22)..(22)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (24)..(24)

<223> K或R

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (25)..(25)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (26)..(26)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (28)..(28)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (30)..(30)

<223> Q或L或I或V或F

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (32)..(32)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (33)..(33)

<223> D或R

<400> 60

<210> 61

<211> 31

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(14)

<223> (Abeta 1-14)x 4作為分支胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (15)..(15)

<223> (epsilon K)x 2作為連結子

<220>

<221> 胜肽

<222> (16)..(16)

<223> epsilon K作為連結間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (17)..(31)

<223> MvF 1 Th

<400> 61

<210> 62

<211> 37

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(14)

<223> Abeta 1-14

<220>

<221> 胜肽

<222> (15)..(15)

<223> epsilon K作為連結間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (16)..(37)

<223> KKK-MvF 4 Th

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (22)..(22)

<223> S或T

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (25)..(25)

<223> K或R

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (26)..(26)

<223> G或T

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (30)..(30)

<223> H或T

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (31)..(31)

<223> K或R

<400> 62

<210> 63

<211> 33

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(14)

<223> Abeta 1-14

<220>

<221> 胜肽

<222> (15)..(15)

<223> epsilon K作為連結間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (16)..(33)

<223> HBsAg 2 Th

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (19)..(19)

<223> I或F

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (20)..(20)

<223> I或F

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (21)..(21)

<223> T或L

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (22)..(22)

<223> I或L

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (26)..(26)

<223> I或L

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (29)..(29)

<223> P或I

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (30)..(30)

<223> Q或T

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (31)..(31)

<223> S或T

<220>

<221> 尚未歸類的特徵

<222> (32)..(32)

<223> L或I

<400> 63

<210> 64

<211> 37

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(14)

<223> Abeta 1-14

<220>

<221> 胜肽

<222> (15)..(15)

<223> epsilon K作為連結間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (16)..(37)

<223> KKK-MvF 5 Th

<400> 64

<210> 65

<211> 33

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(14)

<223> Abeta 1-14

<220>

<221> 胜肽

<222> (15)..(15)

<223> epsilon K作為連結間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (16)..(33)

<223> HBsAg 3 Th

<400> 65

<210> 66

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(16)

<223> Abeta 1-16或APP 770(D672-K687)

<400> 66

<210> 67

<211> 26

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(26)

<223> Abeta 17-42或APP 770(L688-A713)

<400> 67

Claims (8)

1. 一種Aβ胜肽免疫原結構，包括SEQ ID NO：62、63、64及/或65。
2. 一種組成物，包括申請專利範圍第1項之Aβ胜肽免疫原結構。
3. 一種藥學組成物，包括：(a)申請專利範圍第1項之Aβ胜肽免疫原結構；以及(b)一藥學上可接受之載體及/或佐劑。
4. 一種阿茲海默症疫苗組成物，包括：(a)申請專利範圍第1項之Aβ胜肽免疫原結構；以及(b)一藥學上可接受之載體及/或佐劑。
5. 如申請專利範圍第4項所述之阿茲海默症疫苗組成物，其中(b)中的佐劑為鋁礦物鹽類，其擇自於氫氧化鋁或磷酸鋁。
6. 如申請專利範圍第4項所述之阿茲海默症疫苗組成物，其中(a)中的胜肽抗原與一CpG寡聚去氧核醣核酸(ODN)混合以形成一穩定的免疫刺激複合物。
7. 一種申請專利範圍第4項所述疫苗組成物之用途，其係用於製備減緩人類患者老人癡呆的嚴重性或延遲發病之藥物。
8. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該疫苗組成物以溶液的形式投予每劑量10μg-1000μg的量至AD患者或有罹患風險的個體。