CN110759987B - 构象特异性的重组Aβ1-42样寡聚体抗原、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了构象特异性的重组Aβ1‑42样寡聚体抗原、其制备方法和应用。本发明提供了重组Aβ1‑42样寡聚体抗原，为6或12个串联的“β淀粉样肽B细胞表位Aβ1‑15和两个辅助性T细胞表位Th嵌合分子”。本发明重组6/12×(Aβ1‑15‑Th)嵌合抗原免疫血清抗体能特异性结合Aβ寡聚体，且中和其毒性，低剂量少次免疫普通和模型小鼠都能产生高水平Th2型抗Aβ抗体，且无有害针对Aβ1‑42的T细胞免疫反应，且减少AD小鼠脑内Aβ和寡聚体含量，上调相关突触蛋白水平，改善学习记忆能力。因此本发明制备的靶向Aβ寡聚体结构特征的重组Aβ1‑42样寡聚体抗原在AD预防中有很大潜力和应用前景。

Description

构象特异性的重组Aβ1-42样寡聚体抗原、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物制药和基因工程技术领域，具体涉及构象特异性的重组Aβ1-42样寡聚体抗原、其制备方法和应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，又称老年痴呆，由德国医生AlzheimerAlois于1906年首次发现，是一种慢性的长期的神经退行性老年疾病，主要临床特征为由突触及神经元缺失引起的认知和记忆功能减退。有数据统计表明，60至80岁老人老年痴呆的发病率约为4％，而80岁以上老人发病率则高至20％到40％，是所有痴呆中发病最普遍的，目前是在老年人中仅次于心脑血管病和癌症的第四大致死病，据世界卫生组织的最新报道，全世界范围内已超过5000万痴呆症患者，并预计到2050年这个数字将增至三倍达到1.5亿多，每年有近1000万的新发病例，平均每三秒新增一例，2015年AD给社会带来的费用估计是8180亿美元，到2030年预计增至2万亿美元，给患者的家庭和社会造成了极大的经济负担和压力。目前已上市治疗AD的几种药物只能在一定程度上缓解症状而不能达到根治的效果，针对中国正逐渐步入老龄化社会的现状，中国阿尔茨海默病的研究和治疗水平亟需得到提高。

AD发病机制的主流假说是由Hardy于1992年提出的淀粉样蛋白级联假说(Amyloidcascade hypothesis)，该假说认为患者脑内一种广泛表达的单链跨膜蛋白——淀粉样前体蛋白(APP)水解而产生过量β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)特别是有毒性的可溶性寡聚体的积累，是产生神经毒性的主要原因，并通过一系列的级联反应造成Tau蛋白过度磷酸化产生神经纤维缠结，最终导致了突触的损伤和神经元的丢失，因此以毒性Aβ作为治疗靶标的方法成为很多科研工作者在治疗阿尔茨海默病中的着力方向。从1999年Schenk等人首次将人纤维化的Aβ42多肽用于免疫AD转基因小鼠并取得了一定的效果(参见Schenk D,et al.,Nature,1999,400:173-7)，一年后由Elan和Wyeth开展研究的AN-1792疫苗以人源纤维化Aβ42联合QS21佐剂首次进行了临床试验，在Ⅰ期临床试验中取得初步性良好反应后，临床II期有6％的患者出现了脑膜炎而被迫终止了实验(参见Orgogozo JM,et al.,Neurology,2003,61:46-54)，后续的研究结果表明患者存在自身毒性T细胞免疫反应可能是炎症出现的原因(参见Cribbs DH,et al.,Int Immunol,2003,15:505-14)。Aβ1-42是由一个B细胞表位(1-15)和两个T细胞表位(17-21，29-42)组成的多肽，研究发现，许多利用AβN端的B细胞表位制备的各种抗原蛋白免疫动物或AD模型动物后均能诱发Th2型免疫反应，避免自身T细胞免疫反应诱发的Th1型炎症细胞反应，因此后续AD免疫治疗的研究方向是选择靶向Aβ42肽的B淋巴细胞表位Aβ1-15，并用外源性的T细胞表位替代自身T细胞表位，以提高疫苗的安全性。已有多个采用这种策略的主动免疫疫苗进入临床研究阶段，但是有一些由于副作用或其他不明原因而终止试验，如ACC-001、Affitope AD02和AD03、V950等，现在仍然正在研发的疫苗包括CAD106、UB-311、MER 5101和Lu AF20513(GodyńJ,et al.,PharmacologicalReports Pr 2016；68(1):127；J.Cummings，et al.，Alzheimers Dement(NY).20173:367-84.)，由诺华公司开发的CAD106疫苗是采用Aβ1-6连接了Qb噬菌体外壳蛋白，动物实验阶段产生了良好的抗体反应，且避免了T细胞免疫反应，临床Ⅰ期和Ⅱa期的结果验证了其良好的安全性和耐受性，现已进入临床Ⅱ/Ⅲ期试验；由United Biochemical公司开发的UB311疫苗采用Aβ1-14混合CpG，并联合铝佐剂配制而成，该疫苗已进入临床Ⅱ期；Mercia Pharma公司的MER 5101是将Aβ1-15偶联到白喉毒素载体上，临床前实验已证明其可改善突触损伤和认知功能，现新入临床Ⅰ期研发阶段。这些已经完成的临床试验都没有达到改善认知能力的治疗效果，可能原因是这些疫苗免疫后主要产生的不是针对Aβ寡聚体的特异性抗体，不能有效中和对突触功能和神经元有较大毒性的寡聚体(Meli G,et al.,NatureCommunications,2014；5(5):3867.)，从而无法使认知能力得到改善。

最近的研究表明进一步提示有毒性的可溶性Aβ寡聚体在AD的致病起着重要的作用，这个Aβ寡聚体致病假说的观点也逐渐得到人们的认可。在具有毒性的Aβ寡聚体分子中，特别是12聚体Aβ1-42，即Aβ*56(K.Zahs,et al,Front Aging Neurosci,2013,5:28)，与记忆能力和突触功能损伤相关，并且在AD病人和模型动物脑中已检测到了强毒性的Aβ*56。因此，无论主动免疫治疗还是被动免疫治疗或预防阿尔茨海默病都应该集中到消除AD病人脑中出现的可溶性Aβ寡聚体。目前临床试验阶段的被动免疫治疗抗体药物的结果则提示针对单体或纤维化Aβ的抗体无效，针对Aβ寡聚体的抗体(如BIIB037和BAN2401)在临床体上体现了治疗效果(J.Sevigny,et al,Nature,2016,537:50-6；S.Budd Haeberlein,et al,J.Prev.Alzheimers Dis,2017,4:255-63.)。这些结果进一步证明针对Aβ的免疫治疗策略必须是靶向Aβ寡聚体这个毒性分子，也进一步支持了这个Aβ寡聚体致病假说。

因此，一个安全有效的AD新型疫苗必须避免有副作用的Th1型炎症细胞反应，同时要求诱导产生的高水平抗体能够特异性中和或清除Aβ寡聚体，特别是用于预防阶段时能够减少体内的Aβ寡聚体水平，保护神经突触功能和认识能力，从而能产生有效的免疫预防作用。

发明内容

考虑到Aβ1-42的结构特征是B细胞表位+T细胞表位形式，其中12拷贝的Aβ寡聚体Aβ*56(56kDa)是最具毒性的分子。因此，本发明设想用外源通用型表位替代Aβ1-42中T细胞表位，设计了B细胞表位+外源性T细胞表位这种结构分子的6或12个串联以模拟Aβ1-42的寡聚体结构特征，即制备多聚体结构特性的6/12×(Aβ1-15-Th)重组抗原分子。与本团队先前报道的6Aβ15-T/TF和12Aβ15-TF等不同，它们均是6或12拷贝的Aβ1-15分子串联后，再融合一个分子的辅助性T细胞表位T或TF(Yu YZ,et al.,J.Alzheimers Dis.,2014,41:243-60；Yu YZ,et al.Clin.Immunol.,2018,193:12-23；周果、李庆丽等,生物技术通讯，29(2):189-93)，仅仅是B细胞表位的串联重复。另外，与国外Lu AF20513表位疫苗也不同(HaykDavtyan,et al，J.Neuroscience,2013,3(11):4923-34)，该Lu AF20513分子结构是Aβ1-12-P30-Aβ1-12-P2-Aβ1-12，3个Aβ1-12中含2个T细胞表位。以上重组表位抗原分子均不同于6/12×(Aβ1-15-Th)，无Aβ1-42样分子结构，没有模拟Aβ1-42的寡聚体结构特征。

本发明的目的是提供一种构象特异性的重组Aβ1-42样寡聚体抗原、其制备方法和应用。

第一方面，本发明要求保护重组Aβ1-42样寡聚体抗原。

本发明所要求保护的重组Aβ1-42样寡聚体抗原，可为如下任一：

(A1)由12个串联的基本单元组成；

(A2)由6个串联的所述基本单元组成；

(A3)在(A1)或(A2)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。

所述基本单元由依次串联的β淀粉样肽B细胞表位Aβ1-15和两个辅助性T细胞表位Th组成。该基本结构单位命名为Aβ1-15-Th。

其中，所述β淀粉样肽B细胞表位Aβ1-15的氨基酸序列具体如SEQ ID No.3的第1-15位所示。

其中，所述两个辅助性T细胞表位Th分别可为通用型DR辅助性T细胞表位PADRE和破伤风毒素人CD4⁺表位P2。

进一步地，所述通用型DR辅助性T细胞表位PADRE的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第16-28位所示。所述破伤风毒素人CD4⁺表位P2的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第29-42位所示。

更进一步地，(A1)中所述重组Aβ1-42样寡聚体抗原(即12×(Aβ1-15-Th))的氨基酸序列具体如SEQ ID No.4所示；(A2)中所述重组Aβ1-42样寡聚体抗原(即6×(Aβ1-15-Th))的氨基酸序列具体如SEQ ID No.3所示。

本发明所提供的重组Aβ1-42样寡聚体抗原包括6或12个串联的Aβ1-15-Th分子。其中每个Aβ1-15-Th多肽分子大小为42氨基酸，包含β淀粉样肽B细胞表位Aβ1-15和两个辅助性T细胞表位Th，相当于模拟Aβ1-42分子。而6×(Aβ1-15-Th)和12×(Aβ1-15-Th)嵌合抗原分子结构模拟了6体或12体的Aβ寡聚体结构特性。

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为His标签、Flag标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

第二方面，本发明要求保护编码前文所述重组Aβ1-42样寡聚体抗原的核酸分子。

其中，编码所述β淀粉样肽B细胞表位Aβ1-15的核酸分子可为SEQ ID No.1的第1-45位。编码所述通用型DR辅助性T细胞表位PADRE的核酸分子可为SEQ ID No.1的第46-74位。编码所述破伤风毒素人CD4⁺表位P2的核酸分子可为SEQ ID No.1的第75-126位。

进一步地，编码所述重组Aβ1-42样寡聚体抗原的核酸分子可为如下任一：

(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子(对应(A1))；

(B2)SEQ ID No.1所示的DNA分子(对应(A2))。

第三方面，本发明要求保护含有前文所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

第四方面，本发明要求保护一种制备前文所述重组Aβ1-42样寡聚体抗原的方法。

本发明所要求保护的制备前文所述重组Aβ1-42样寡聚体抗原的方法，可包括如下步骤：将前文所述核酸分子克隆到原核表达载体，然后通过原核表达系统获得所述重组Aβ1-42样寡聚体抗原(可溶性表达)。

在本发明的具体实施方式中，所述原核表达载体为pTIG-Trx，具体为将所述重组Aβ1-42样寡聚体抗原的编码基因(SEQ ID No.2或SEQ ID No.1)克隆到pTIG-Trx载体的酶切位点EcoR I和Xho I之间。所述原核表达系统具体为大肠杆菌表达系统。

本发明人工合成这些靶向Aβ寡聚体结构的重组嵌合抗原的基因，并通过原核表达系统获得表达，经纯化后的重组Aβ1-42样寡聚体抗原拥有寡聚体构象特异性表位，具有6体和12体的寡聚体结构特性，其免疫血清抗体能够特异结合Aβ寡聚体，并且体外中和Aβ寡聚体介导的神经毒性作用。因此，该重组Aβ1-42样寡聚体抗原具有强的寡聚体构象表位，能够诱导机体产生强的抗Aβ寡聚体抗体，是一种全新的重组抗原，具有独特的结构特性，因此该亚单位疫苗对于AD有新的免疫治疗效果和特征。

第五方面，本发明要求保护如下任一应用：

(C1)前文所述的重组Aβ1-42样寡聚体抗原在作为或制备阿尔茨海默病亚单位疫苗中的应用；

(C2)前文所述的重组Aβ1-42样寡聚体抗原在作为或制备用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用；

(C3)前文所述的重组Aβ1-42样寡聚体抗原在制备用于清除Aβ寡聚体(结合Aβ寡聚体)的产品(如药品)中的应用；

(C4)前文所述的重组Aβ1-42样寡聚体抗原在制备用于提高阿尔茨海默病患者学习记忆能力的产品(如药品)中的应用；

在本发明的具体实施方式中，是采用Morris水迷宫法来检测所述学习记忆能力的。

(C5)前文所述的重组Aβ1-42样寡聚体抗原在制备用于减少阿尔茨海默病患者脑内Aβ寡聚体(特别是6体和12体Aβ寡聚体)和/或可溶性Aβ含量的产品(如药品)中的应用；

(C6)前文所述的重组Aβ1-42样寡聚体抗原在制备用于降低阿尔茨海默病患者脑内钙蛋白酶活性的产品(如药品)中的应用；

(C7)前文所述的重组Aβ1-42样寡聚体抗原在制备用于上调阿尔茨海默病患者脑内与神经突触功能相关蛋白的表达量或者保护与神经突触功能相关蛋白降解的产品(如药品)中的应用；

其中，所述与神经突触功能相关蛋白具体为Dynamin 1蛋白、PSD-95蛋白、GluR1蛋白和/或spectrin蛋白。

(C8)前文所述核酸分子或重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备前文所述的重组Aβ1-42样寡聚体抗原中的应用。

第六方面，本发明要求保护一种用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的疫苗或药物。

本发明所要求保护的用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的疫苗或药物，其活性成分为前文所述的重组Aβ1-42样寡聚体抗原。

本发明的重组抗原分子真实地模拟Aβ*56分子结构，可能形成多聚体结构特性，作为疫苗免疫后可能产生针对Aβ*56结构的特异抗体，从而达到结合或清除它的目的。本发明的研究结果表明，通过原核表达获得了可溶性重组6/12×(Aβ1-15-Th)嵌合抗原蛋白，免疫血清抗体能够特异性结合Aβ寡聚体，并且中和它的毒性作用，表明该重组6/12×(Aβ1-15-Th)嵌合抗原具有寡聚体的表位结构，模拟了6或12体的Aβ寡聚体结构特性。低剂量少次数免疫普通和模型小鼠后都能够产生高水平Th2型抗Aβ抗体，而没有产生有害的针对Aβ1-42的T细胞免疫反应，并且减少了模型小鼠脑内Aβ(包括可溶性寡聚体)，上调了相关突触蛋白水平，改善了学习记忆能力。因此该靶向Aβ的寡聚体结构特征重组嵌合疫苗是下一代AD新型疫苗的研究方向，在阿尔茨海默病(AD)的预防中具有非常大的潜力和应用前景。

本发明的重组Aβ1-42样寡聚体抗原6×(Aβ1-15-Th)和12×(Aβ1-15-Th)亚单位疫苗具有如下优点与创新点：

1)重组Aβ1-42样寡聚体抗原的设计原理与结构特征。

一个安全有效的AD新型疫苗必须避免有副作用的Th1型炎症细胞反应，同时要求诱导产生的高水平抗体能够特异性中和或清除Aβ寡聚体，并且期待是一个能够特异性靶向Aβ寡聚体结构特征的重组嵌合疫苗。考虑到Aβ1-42的结构特征是B细胞表位+T细胞表位形式，其中12拷贝的Aβ寡聚体Aβ*56(56kDa)是最具毒性的分子。用两个不同的外源通用型表位替代Aβ1-42中两个T细胞表位，设计了B细胞表位+外源性T细胞表位这种结构分子Aβ1-15-Th，然后进行6或12个串联以模拟Aβ1-42的寡聚体结构特征，即6/12×(Aβ1-15-Th)结构。该设计和制备的重组Aβ1-42样寡聚体抗原6/12×(Aβ1-15-Th)具有独特的Aβ寡聚体结构，模拟了6体和12体的寡聚体结构，以期待能够特异性靶向Aβ寡聚体。

因此，该重组Aβ1-42样寡聚体抗原的结构特征不同于先前本团队和其他文献研究的重组表位抗原分子，它们仅仅是B细胞表位的串联重复，无Aβ1-42样分子结构，没有模拟Aβ1-42的寡聚体结构特征。

2)重组抗原免疫特性与效应：

重组Aβ1-42样寡聚体抗原6×(Aβ1-15-Th)和12×(Aβ1-15-Th)作为亚单位疫苗诱导普通小鼠和AD模型小鼠产生的高滴度特异性免疫血清抗体。该免疫原没有引起针对Aβ的T细胞增殖反应，其主要抗体亚型为IgG1型，说明引起的免疫完全偏向于Th2型免疫反应。以上结果表明，采用的Aβ1-42多肽的B淋巴细胞表位Aβ1-15，并加入了两个外源辅助性T细胞表位PADRE(T)和P2的重组嵌合抗原分子而融合成一段42肽模拟Aβ1-42多肽结构，确实刺激机体产生趋向于Th2型的T淋巴细胞反应，增加抗原Aβ1-15的免疫原性。特别是该疫苗在AD模型小鼠产生了高滴度特异性免疫血清抗体，这些结果表明此嵌合疫苗能够增强抗体反应，克服AD模型小鼠的免疫耐受)，达到高效的免疫应答效果。

更为重要的是，这些免疫血清抗体特异结合Aβ寡聚体，并且体内外中和Aβ寡聚体介导的神经毒性作用，这验证了本研究设计与制备的重组Aβ1-42样寡聚体抗原达到了预期的结构特征和构象表位特性。另外，其作为亚单位疫苗免疫3×Tg-AD模型小鼠后也减少脑组织中的Aβ寡聚体，特别是6体和12体Aβ寡聚体毒性分子。而这个结果进一步反映了该重组Aβ1-42样寡聚体抗原具有体内中和Aβ寡聚体的作用。因此，该重组Aβ1-42样寡聚体抗原具有强的寡聚体构象表位，能够诱导机体产生强的抗Aβ寡聚体抗体，是一种全新的重组抗原，具有独特的结构特性。

3)重组Aβ1-42样寡聚体抗原6×(Aβ1-15-Th)和12×(Aβ1-15-Th)作为AD免疫预防亚单位疫苗的效应与特性。

重组Aβ1-42样寡聚体抗原6×(Aβ1-15-Th)和12×(Aβ1-15-Th)作为亚单位疫苗免疫3×Tg-AD模型小鼠改善了学习记忆能力，减少脑组织中的Aβ寡聚体，特别是6体和12体Aβ寡聚体毒性分子。而这减少的Aβ寡聚体水平效应，可降低钙蛋白酶活性，进而上调与神经突触功能相关的蛋白，从而达到改善行为学能力，或保护神经突触功能。因此，本研究同时也从分子水平上验证了该疫苗的免疫治疗效应，明确了通过下调钙蛋白酶在该重组疫苗免疫的AD模型鼠中产生的效应，即保护了各突触蛋白分子的降解，缓解突触损伤和认识功能障碍，即而表明通过免疫治疗减少β寡聚体毒性分子，可恢复神经突触和认识功能。

总之，该靶向Aβ的寡聚体结构特征重组嵌合疫苗是下一代AD新型疫苗的研究方向，为疫苗的研发提出了许多新的思路，对寻找合适的针对AD病的疫苗具有重要的意义。

附图说明

图1为重组Aβ1-42样寡聚体抗原6/12×(Aβ1-15-Th)的制备和它在AD模型小鼠的免疫与评价方案示意图。A为Aβ1-42样寡聚体抗原6/12×(Aβ1-15-Th)的分子结构示意图。B为Aβ1-42样寡聚体抗原6/12×(Aβ1-15-Th)的原核表达载体结构示意图。C为重组Aβ1-42样寡聚体抗原6/12×(Aβ1-15-Th)蛋白纯化产物SDS-PAGE和Western Blot(WB)鉴定图。泳道1～2为6×(Aβ1-15-Th)；泳道3～4为12×(Aβ1-15-Th)。蛋白Marker 1(从上往下依次为:95、72、55、43、34、26kDa)；蛋白Marker 2(从上往下依次为:130、97、66、43、31kDa)，箭头示目的蛋白。D为重组Aβ1-42样寡聚体抗原6/12×(Aβ1-15-Th)嵌合疫苗在3×Tg AD模型小鼠的免疫与评价方案示意图。

图2为重组Aβ1-42样寡聚体抗原6×(Aβ1-15-Th)和12×(Aβ1-15-Th)嵌合疫苗免疫小鼠后体液和细胞免疫反应结果。A为两种重组Aβ1-42样寡聚体抗原免疫小鼠2-4次后的抗体滴度。B为两种重组Aβ1-42样寡聚体抗原免疫小鼠4次后的抗体亚型分析结果。C为多肽特异性刺激后的T淋巴细胞增殖反应结果。D-E为多肽特异性刺激后的T淋巴细胞产生的细胞因子分析。其中，D为细胞因子IL-4水平；E为细胞因子IFN-γ水平。Aβ42和Th是指分别用Aβ1-42和Th特异性刺激的T淋巴细胞产生的增殖反应与其分泌的细胞因子水平。

图3为重组Aβ1-42样寡聚体抗原6×(Aβ1-15-Th)和12×(Aβ1-15-Th)嵌合疫苗免疫AD模型小鼠后免疫血清中的抗体滴度及亚型分析结果。A为重组Aβ1-42样寡聚体抗原免疫AD模型小鼠后的各阶段的抗体水平。箭头示各次免疫的时间点。B为重组Aβ1-42样寡聚体抗原免疫AD模型小鼠三次后血清中的抗体亚型分析。

图4为重组Aβ1-42样寡聚体抗原6×(Aβ1-15-Th)和12×(Aβ1-15-Th)免疫血清结合不同形式Aβ分子特性及体外中和活性研究。A为免疫血清和不同抗体与不同状态Aβ结合的斑点杂交结果图。B为免疫血清和不同抗体与不同状态Aβ结合的ELISA结果图。C为免疫血清和不同抗体体外中和Aβ寡聚体介导的神经毒性作用。

图5为重组Aβ1-42样寡聚体抗原免疫组和对照组小鼠在Morris水迷宫的学习和记忆能力结果。A为隐藏平台获得实验训练时间为7天，分别为各组1-7天的潜伏期时间；B为动物初次到达平台的时间；C为动物到达平台的次数。B和C数据反映小鼠的学习记忆能力。

图6为重组Aβ1-42样寡聚体抗原亚单位疫苗免疫AD模型小鼠后脑组织中Aβ含量变化的分析结果。A为20月龄模型小鼠脑内海马区淀粉样斑块含量的脑组织切片免疫组化染色代表图；B为淀粉样斑块含量的脑组织切片免疫组化染色定量分析结果图。数据为各组的平均值，表示脑内海马区淀粉样斑块的负荷；C为ELISA测定各免疫组AD模型鼠脑组织中Aβ40含量。D为ELISA测定各免疫组AD模型鼠脑组织中Aβ42含量。

图7为重组Aβ1-42样寡聚体抗原亚单位疫苗减少了20月龄AD模型小鼠脑内可溶性Aβ寡聚体的含量。A和B为重组Aβ1-42样寡聚体抗原亚单位疫苗减少了20月龄AD模型小鼠脑内可溶性Aβ寡聚体的含量；A为点杂交染色图，B为定量分析结果；C、D和E为重组Aβ1-42样寡聚体抗原亚单位疫苗减少了20月龄AD模型小鼠脑内6体和12体Aβ寡聚体的含量；C为Western blot图，D为6体Aβ寡聚体定量分析结果，E为12体Aβ寡聚体定量分析结果。

图8为Western blot检测重组Aβ1-42样寡聚体抗原亚单位疫苗AD模型小鼠后脑组织中相关突触蛋白水平的表达情况。A为Western blot检测脑组织中的可溶性蛋白水平情况；B为Western blot检测脑组织中Calpain钙蛋白酶活性的定量分析结果；C为Westernblot检测脑组织中相关突触蛋白水平的定量分析结果。

注：实验数据均使用统计软件GraphPad Prism 5，以单因素方差的统计方法进行统计学分析，免疫组与阴性对照组或3×Tg-AD对照组小鼠进行比较(n＝8)，P＜0.05(*)则认为差异有统计学显著意义，P＜0.01(**)和P＜0.001(***)则认为差异有统计学极显著意义。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。DNA基因均由上海生物工程技术服务有限公司(上海)合成；所用引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。

实施例1、重组原核表达载体的构建及重组Aβ1-42样寡聚体抗原在大肠杆菌中的表达与纯化

一、6×(Aβ1-15-Th)和12×(Aβ1-15-Th)基因设计与合成

根据密码子简并性人工合成了编码6个拷贝串联的6×(Aβ1-15-Th)基因(见SEQID No.1)和12个拷贝串联的12×(Aβ1-15-Th)基因(见SEQ ID No.2)，直接合成克隆于pMD18-T(TaKaRa)T载体中，分别命名为pMD18-6×(Aβ1-15-Th)和pMD18-12×(Aβ1-15-Th)，分别编码6×(Aβ1-15-Th)和12×(Aβ1-15-Th)(氨基酸序列见SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4)，各个Aβ1-15-Th间用GS柔性肽连接(图1中A)。每个Aβ1-15-Th分子中，Aβ1-15是Aβ1-42分子的B细胞表位，序列为DAEFRHSGYEVHHQ；Th(DAEFRHDSGYEVHHQAKFVAAWTLKAAAQYIKANSK FIGITE)为辅助性T细胞表位，包括通用型DR辅助性T细胞表位PADRE序列(AKAVAAWTLKAAA，Pan-DR helper T cell epitopes)，记为T；和QYIKANSKFIGITE序列来源于破伤风毒素的人CD4⁺表位，记为P2。每个Aβ1-15-Th嵌合分子大小为42氨基酸，包括B和T表位，T和P2相当于原来Aβ1-42中两个T细胞表位(这两个T细胞表位位于Aβ1-42中16-42间)，完全模拟Aβ1-42。

以上基因设计采用大肠杆菌常用的密码子，同时兼顾真核细胞常用的密码子，并保证所编码的氨基酸残基序列不变。对于串联重复的Aβ1-15-Th基因采用不同密码子使之不完全一样，减少重复序列并提高基因的表达翻译水平。

二、重组原核表达载体的构建

用EcoR I和Xho I分别双酶切上述获得的质粒pMD18-6×(Aβ1-15-Th)和pMD18-12×(Aβ1-15-Th)，用DNA回收试剂盒分别回收长度约790和1580bp的目的片段，与经相同酶双酶切的原核表达载体pTIG-Trx(见专利：ZL200710089588.2)连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序，获得序列及插入位置均正确的重组原核表达载体，分别命名为pTIG-Trx-6×(Aβ1-15-Th)和pTIG-Trx-12×(Aβ1-15-Th)(图1中B)。

三、重组多肽抗原在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化

1.重组Aβ1-42样寡聚体抗原在大肠杆菌中的表达及表达产物的SDS-PAGE检测

将步骤二构建的2个重组原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(TIANGEN公司)，筛选阳性重组子，以转化有pTIG-Trx空载体的重组菌为阴性对照，然后按1:100的比例将阳性重组菌接种至含100mg/mL氨苄青霉素的500mL的LB液体培养基中，在37℃、250rpm下进行大量培养，培养至对数生长期(OD600约为0.6～1.0)时加入化学诱导剂IPTG至终浓度为0.4mmol/L，30℃220r/min振荡培养4～5小时或16℃220r/min培养12小时。培养结束后，离心收集菌体，重悬于20mM磷酸钠缓冲液中(pH 8.0)，超声打碎细胞，离心收集上清进行12％SDS-PAGE检测，结果表明，经诱导表达的重组蛋白都获得了表达并能够以可溶性方式存在，而未诱导的菌株和诱导的空载体对照未出现该目的蛋白带，说明所表达的蛋白可能就是目的蛋白即重组Aβ1-42样寡聚体抗原。

2.表达产物的纯化及鉴定

步骤1所表达的重组Aβ1-42样寡聚体抗原的C端含有六个组氨酸标签，因此用Ni-NTA亲和层析柱(法玛西亚公司)并参照说明书对可溶性表达产物进行纯化，得到洗脱纯化蛋白，然后对经纯化的蛋白进行12％SDS-PAGE检测，检测结果表明得到了纯化的目的蛋白。图1中C所示是2种目的蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图。

3.表达产物的Western blot和ELISA鉴定

以鼠源抗Aβ40单克隆抗体(Monoclonal Anti-β-Amyloid,BAM-10，sigma)为一抗，以辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG(Sigma公司)为二抗，对纯化的重组Aβ1-42样寡聚体抗原蛋白进行Western blot分析，结果显示表达目的蛋白与鼠抗Aβ抗体特异性结合，阳性条带大小位置与电泳位置一致，与6×(Aβ1-15-Th)和12×(Aβ1-15-Th)的理论大小(分别为约29kDa和约58kDa)相当，表明诱导表达或经纯化的重组蛋白即为目的蛋白(图1中C)。同时，通过ELISA确定了该抗体也能够与这些重组Aβ1-42样寡聚体抗原蛋白结合，而与空载体诱导表达产物不结合，进一步表明我们表达和纯化的多肽抗原含Aβ1-42或Aβ1-42的B细胞表位抗原Aβ1-15。

实施例2、重组Aβ1-42样寡聚体抗原诱导普通小鼠产生高水平的Th2型抗Aβ抗体反应

以实施例1中表达并经纯化的重组Aβ1-42样寡聚体抗原蛋白6×(Aβ1-15-Th)和12×(Aβ1-15-Th)作为免疫原即亚单位疫苗免疫小鼠，以检测其免疫原性。具体方法为：将C57/BL6小鼠(8周龄，雌性，SPF级，军事医学研究院实验动物中心)随机分为3组，每组8只，免疫5μg重组蛋白，而对照组(Control)免疫不含重组蛋白的PBS，共免疫四次。免疫前，将抗原稀释于终浓度为10％(V/V)铝佐剂(Alhydrogel^TM，Brenntag Biosector,Frederikssund,Denmark)。每只100μl进行肌肉注射免疫，加强免疫时，间隔3周，剂量和方法同上。每次免疫前，以及最后一次免疫后第3周，小鼠尾部采血，分离血清，用ELISA法测定特异性抗体水平。用酶联免疫板包被Aβ1-42(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA)或Aβ1-15(DAE FRHDSGYEVHHQ)抗原，浓度为2μg/mL，用分离的免疫小鼠血清为一抗，以HRP标记羊抗鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)为二抗测定血清抗体水平，终末稀释ELISA法测定免疫动物血清中的特异性抗体滴度。以空对照组小鼠血清为阴性对照(即N)，重组多肽抗原免疫组的OD₄₉₂值(即P值)达到0.2以上，并且P/N≥2.1为阳性。每组的平均抗体滴度以每组单个血清样品抗体滴度以几何平均数(GMT±SD)表示。同时，以HRP标记羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)为二抗测定血清抗体中各亚型抗体水平。另外，以鼠源抗Aβ40单克隆抗体为标准品，通过ELISA法制定标准曲线，并与标准品进行对比，也定量测定了血清抗体中特异性抗Aβ抗体的水平。

ELISA检测结果表明，随着免疫次数的增加，抗体滴度也得到相应提高，而对照组血清与免疫前相比始终为阴性，低于100，各次免疫后抗体滴度如图2中A；上述检测结果表明，重组Aβ1-42样寡聚体抗原蛋白6×(Aβ1-15-Th)和12×(Aβ1-15-Th)均产生高滴度的特异性抗体水平，平均抗体滴度2次免疫后可达到100000以上，3次可达到200000以上，4次可达到450000以上，其抗体亚型中没有产生明显的IgG2a抗体，主要为IgG1抗体，表明其免疫应答完全为Th2(图2中B)，这与其免疫后没有产生明显的针对Aβ1-42刺激的淋巴细胞增殖是一致的。

淋巴细胞的增殖能力是细胞免疫应答的一个重要指标，用MTS法测定淋巴细胞的增殖能力，方法为：最后一次免疫后第3周取脾细胞，制备浓度为10⁶个/mL的脾细胞悬液，在体外用抗原多肽Aβ1-42或T细胞表位(AKFVAAWTLKAAAQYIKANSKF IGITE)Th多肽，浓度为10μg/mL，进行刺激，4天后用MTS法检测T细胞增殖能力。淋巴细胞增殖能力的MTS法测定结果表明，6×(Aβ1-15-Th)和12×(Aβ1-15-Th)免疫组小鼠体内诱导产生了特异的针对T细胞表位多肽的T细胞免疫反应，但是没有产生针对Aβ1-42刺激的淋巴细胞增殖的T细胞免疫反应和细胞因子(图2中C和D)。Th特异性的IL-4和IFN-γ细胞因子测定的结果也表明其免疫类型为Th2型，产生了低水平的IFN-γ，并且IL-4/IFN-γ大于1。这两种抗原的免疫反应水平两者间无明显差异。

因此，上述实验结果表明，该重组Aβ1-42样寡聚体抗原可作为阿尔茨海默病(AD)候选疫苗，低剂量就能够诱导小鼠产生高水平抗Aβ抗体，并且免疫应答反应为Th2型。

实施例3、重组Aβ1-42样寡聚体抗原亚单位疫苗免疫3×Tg AD模型小鼠后诱导产生高水平的抗Aβ抗体

本发明进一步通过3×Tg AD模型小鼠评价该重组Aβ1-42样寡聚体抗原亚单位疫苗的免疫原性和免疫治疗效果(方案见图1中D)。具体方案如下，AD模型小鼠为3×Tg AD模型小鼠，是在敲入了早老素蛋白PS1^M146V基因的小鼠中显微注射包含Tau^P301L和APP^Swe的共基因序列，构建一种能够表达这三种蛋白的AD病理模型小鼠，这种模型小鼠的病程发展会随着鼠龄的增长表现出一定的渐进性，6月龄时就发生了胞内Aβ沉积，9月龄时能够观察突触体Tau病理特征，相比其他的单转基因小鼠，能够更全面更贴切地模拟AD患者的病变进程及病理特征，是用来研究AD主动免疫疫苗有效性的较合适小鼠模型(Oddo S.,et al.,Neuron,2003,39:409-21；Billings L.M.,et al.,Neuron,2005,45:675-88.)。该AD模型由本课题组从美国的Jackson Lab(MN)引进，并经授权保种繁殖使用。该亚单位疫苗与之前的制备和配制方法相同；转基因小鼠(6月龄，雌性，SPF级)随机分为3组，每组8只，50μg重组抗原与终浓度为10％(V/V)铝佐剂配制成疫苗，总体积100μl/只，阴性对照组为不含重组蛋白的PBS，共免疫五次，前三次间隔1个月，最后两次间隔4个月，每只100μl进行肌肉注射免疫，加强免疫时，剂量和方法同上。ELISA法测定免疫动物血清中的特异性抗体滴度的方法同上。另外，设置一组非转基因模型小鼠(转基因模型小鼠的母本C57/BL6)，用于评价行为学实验的阳性对照。

ELISA检测结果表明，随着免疫次数的增加，抗体水平也得到相应提高，经过三次免疫后就产生了高滴度的特异性抗体水平，平均滴度达到330000以上，这两种抗原免疫效果无差异，如图3中A。抗体亚型也主要为IgG1(如图3中B)，表明其免疫应答主要为Th2，这与先前在普通小鼠的结果是一致的。在观察了4个月后，模型动物血清抗体略有下降，经过两次加强免疫后，模型动物的抗体水平得到了增强，最高能够恢复到330000以上(6×(Aβ1-15-Th)和12×(Aβ1-15-Th)免疫组血清抗体定量水平分别达到600和800μg/ml)，并且最后高滴度的血清抗体水平能够一直维持20月龄，达到45000以上，即维持高滴度的血清抗体水平，更有利于清除体内的Aβ和寡聚体。

总之，研究结果表明，该重组嵌合抗原免疫后就能够诱导AD模型小鼠产生高水平抗Aβ抗体，并且免疫应答反应为Th2型。下一步对其行为学能力和脑组织中Aβ含量的变化进行评价，进一步证实该重组嵌合疫苗的药效学效果。

实施例4、重组Aβ1-42样寡聚体抗原诱导产生的血清抗体与不同形式Aβ42的特异性结合分析

Aβ寡聚体是Aβ从单体聚合成斑块过程中的一种中间形式，其无论在体内还是在体外均能产生较强的细胞毒性。目前，许多研究表明Aβ寡聚体才是导致阿尔茨海默病的主要原因，观察疫苗免疫后血清与不同状态Aβ结合状况以及其中和Aβ寡聚体的能力能够在一定程度上反映疫苗的治疗效果。

目的是使用斑点杂交方法测定血清中的抗体主要是与何种形式的Aβ1-42结合。斑点杂交简单步骤为：①先将合成的多肽Aβ1-42重悬到PBS中，终浓度为500μg/ml，分为7组，分别在37℃温箱中孵育0min，10min，12h，24h，36h，3d，6d；用TBS(配方：20mM Tris-HCl，pH7.5，0.8％NaCl)处理NC膜以备用。②将准备好的7组Aβ42滴加在处理后的NC膜上，每组20μl；并滴加相同浓度的BSA为对照。③使用5％脱脂奶粉封闭过夜。④将各组小鼠免疫后血清作为一抗，稀释度为1︰100，37℃温箱中反应1h。⑤使用PBS-T清洗5次，每次5min。⑥用1︰1000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的酶标IgG作为二抗，37℃温箱中反应0.5h。⑦使用PBS-T清洗5次，每次5min。⑧使用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒显色。首先我们通过电镜观察的结果表明多肽Aβ42放置后，在37℃条件下时，随着孵育时间的增加，会发生形态变化。从最初的单体状态逐渐聚集为寡聚体直至最终形成纤维状结构。电镜结果表明，新鲜的多肽主要以单体形式存在(0分钟)，孵育时间为10min时，除了单体外，多肽产生了明显的寡聚体。随着孵育时间的增加，寡聚体逐渐增多(12～36小时内)，3天后则聚集逐渐形成纤维状，6天为成熟纤维。分别取以上单体(M)、寡聚体(O)和纤维状(F)Aβ1-42进行下一步试验。

对普通小鼠的免疫血清抗体和AD模型小鼠的免疫血清抗体与不同状态Aβ进行Dot-blot和ELISA检测，如图4。由实验结果可证明，重组嵌合抗原免疫小鼠产生的抗体主要是与Aβ寡聚体结合，跟单体结合弱，和纤维状Aβ几乎不结合，与传统合成的Aβ1-42多肽产生的抗体及商业化抗体6E10(Covance,Emeryville,CA,USA)反应不相同，与A11(Invitrogen)这个Aβ寡聚体特异性抗体性质相同。

同时，对免疫血清抗体体外中和Aβ寡聚体的毒性效应进行了研究。采用MTT法检测Aβ寡聚体对PC12细胞的毒性及血清抗体对其的保护作用(图4中C)。2×10⁴/孔的PC12细胞接种在96孔板中，0.1μM(0.45mg/L)的Aβ寡聚体与各种抗体(1:10，～0.6M)进行混合，放置1小时后，100μl上述混合物加入到PC12细胞中。24小时后用MTT法观察细胞的活性，该活性率表示细胞的活性状态。结果表明，抗6×(Aβ1-15-Th)和12×(Aβ1-15-Th)的血清与阳性A11一样能够保护细胞毒性作用，这个结果与结合试验是一致的。而对照组中，抗Aβ1-42和6E10抗体则无明显的保护作用，表明它们是无特异性中和Aβ寡聚体的毒性作用。但抗12×(Aβ1-15-Th)血清更优于抗6×(Aβ1-15-Th)的血清抗体的体外中和效果。

基于这一免疫特性，提示本发明的重组嵌合抗原可能拥有强的寡聚体构象表位，用作疫苗能够产生与Aβ可溶性寡聚体具有高亲和力的抗体，提示本研究设计与制备的6/12×(Aβ1-15-Th)抗原达到了预期目的，模拟了6或12体Aβ寡聚体，具有重要的临床意义。并且这种寡聚体特异性的免疫反应特性可体内外中和清除寡聚体，可能具备良好的免疫治疗效果。

实施例5、重组Aβ1-42样寡聚体抗原亚单位疫苗免疫AD模型小鼠后的学习记忆能力评价

对重组嵌合抗原亚单位疫苗免疫的AD模型小鼠于最后一次加强免疫后4个月(即20个月龄)进行行为学能力的评价，采用Morris水迷宫方法。实验可分为隐藏平台获得实验和空间搜索实验两步。隐藏平台获得实验用于测量动物在水迷宫中的学习和记忆能力，实验历时7天。以非转基因C57BL/6小鼠为阳性对照(正常小鼠)，未免疫或PBS免疫的转基因模型小鼠为阴性对照(3×Tg AD模型小鼠-Control组)。其评价方法为：对每只小鼠分别从四个象限入水点放入，记录动物寻找并爬上平台所需时间即逃避潜伏期，计算每天各组4次逃避潜伏期的平均值。Morris水迷宫中的潜伏期是采用重复测量的数据取平均值评价。空间搜索实验用于测量动物对平台空间位置准确记忆，即记忆保持能力。隐藏平台获得实验后第8天撤除平台，将动物从任一入水点放人水中，评价动物在目标象限和其他各象限的游泳时间和穿越原平台位置次数等指标。如图5，各组小鼠在Morris水迷宫的学习和记忆能力结果(注：隐藏平台获得实验训练时间为7天，然后第8天进行空间搜索实验)表明，随着时间延长，除阴性对照(AD模型小鼠)外，其他各组动物的潜伏期时间相继缩短；到第4天时有明显的差异，第8天时具有明显的记忆能力(图5中B和C)。但是阴性对照(AD模型小鼠)组一直无明显变化，表明其学习能力弱和无记忆能力。总体上，两个重组嵌合抗原亚单位疫苗免疫后，AD模型小鼠的学习记忆能力都得到了明显的改善，其能力与正常的C57BL/6小鼠相当，提示疫苗达到了预期免疫预防AD病症的效果。

实施例6、重组Aβ1-42样寡聚体抗原亚单位疫苗免疫AD模型小鼠后脑组织中Aβ含量变化的分析

在完成以上AD模型动物行为学指标的观察后，然后对重组嵌合抗原亚单位疫苗免疫的AD模型小鼠于最后一次加强免疫后4个月(即20个月龄)进行病理组织切片及免疫组织化学染色以及蛋白分子水平的检测。检测方法：开颅取脑后固定、脱水等过程后，进行冠状冷冻切片。切片PBS冲洗，经过溶于PBST进行过氧化反应，封闭处理后，加入鼠源抗Aβ单克隆抗体(6E10，sigma)摇匀、孵育过夜。然后，在室温下加入羊抗鼠IgG二抗摇匀、孵育，室温摇匀、孵育，显色。最后，经过常规粘片、干燥、脱水、透明、封片，光学显微镜下观察并拍摄，其免疫组化结果如图6中A。AD模型对照组脑组织中有明显的淀粉样斑块存在，而重组嵌合抗原亚单位疫苗免疫的AD模型小鼠脑组织中的淀粉样斑块则明显相对少和小。使用QuantityOne-4.6.2通过分析染色点对结果进行定量分析，结果显示与对照组相比，免疫组有统计学显著差异(图6中B)。

另外，对脑内的Aβ含量也进行了测定。用ELISA试剂盒检测免疫组与对照组3×Tg-AD模型小鼠的脑提取蛋白液中Aβ40和Aβ42的含量。方法：首先提取脑组织蛋白。100μl脑组织匀浆液中加入Tris缓冲液(TBS)，经过超声处理后转移到超速离心管，用超低温超速离心机4℃100000g离心1h，收集上清即为可溶性脑组织蛋白，而沉淀用100μl pH 8.0的5×盐酸胍(5M guanidine HCl、50nM Tris-HCl)溶解，即为不可溶性脑组织蛋白。以上各样品，测定蛋白质浓度后，-20℃保存备用。取部分上述蛋白样品进行ELISA定量试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)检测人源Aβ40和Aβ42的含量。按说明书进行，首先利用标准品制定Aβ40和Aβ42标准曲线，然后测定各组样品值，通过标准曲线计算各样品中Aβ40和Aβ42的含量。检测的统计结果如图6中C和D，6/12×(Aβ1-15-TF-P2)免疫组与对照组相比可溶性Aβ40和Aβ42含量明显降低且具有极其显著的差异(P<0.01)，但不可溶性Aβ40和Aβ42含量有一定下降但没有明显统计学差异。以上结果表明，重组嵌合抗原亚单位疫苗免疫后AD模型小鼠脑组织中的淀粉样斑块或Aβ含量明显减少，提示疫苗免疫后抗体能够清除/中和小鼠脑组织中的淀粉样斑块或Aβ含量。这个结果与行为学指标结果一起表明，疫苗免疫后达到了减少模型小鼠脑内Aβ含量即病理特征和改善学习记忆能力。

实施例7、重组Aβ1-42样寡聚体抗原亚单位疫苗免疫AD模型小鼠后脑组织中Aβ寡聚体含量的分析

目前的学术观点进一步表明在Aβ分子中具毒性的是Aβ寡聚体，特别是12聚体Aβ42，即Aβ*56，与记忆能力和突触功能损伤相关，并且在AD病人和模型动物脑中已检测到了强毒性的Aβ寡聚体包括Aβ*56。无论针对主动免疫治疗还是被动免疫治疗，治疗阿尔茨海默病的着手点应该是消除AD病人脑中出现的可溶性Aβ及寡聚体。

本发明推测模拟6体和12体的重组Aβ1-42样寡聚体抗原疫苗可能对AD模型小鼠后脑组织中Aβ寡聚体具有特异性的免疫治疗作用，因此本研究取实施例6中的可溶性脑组织蛋白进行Aβ寡聚体总体水平和不同分子寡聚体水平的检测。检测方法为点杂交和WesternBlot。点杂交参照实施例4中的方法，用A11(1:2,000,Invitrogen)这个Aβ寡聚体特异性的抗体去检测可溶性脑组织蛋白中的总Aβ寡聚体水平，结果如图7中A和B。使用QuantityOne-4.6.2通过分析染色点对结果进行定量，6/12×(Aβ1-15-TF-P2)免疫组与对照组相比可溶性Aβ寡聚体含量明显减少(分别减少了65％和75％)且具有极其显著的差异(P<0.01)。

Western Blot方法：首先对可溶性脑组织蛋白进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后进行转膜，封闭后按适当比例加入6E10(1:1,000，sigma)一抗，室温2h或者4℃过夜孵育，与一抗反应结束后TBST洗膜，每次十分钟，共洗3次，用HRP标记的二抗在室温下孵育PVDF膜30min，用TBST洗五次，每次十分钟。配制一定量的显色液，滴到膜上，使用Image AnalysisSystem软件进行曝光，每个实验至少重复2次。曝光结束后，使用Quantity One-4.6.2通过分析目的条带对结果进行分析。检测结果如图7中C，模型动物组在28kDa和56kDa处有明显的两条带，分别为6体和12体Aβ寡聚体，这两种分子是Aβ寡聚体最为常见，最具毒性的分子，而免疫组则明显减少或无，定量结果也显示有极其显著的差异。因此，该重组嵌合抗原亚单位疫苗免疫AD模型小鼠后减少脑组织中的Aβ寡聚体，特别是6和12体Aβ寡聚体毒性分子减少得非常明显，相比对照组，6×(Aβ1-15-Th)免疫组分别减少了80％和65％，而12×(Aβ1-15-Th)免疫组则分别减少了90％和80％(P<0.001，具有极其显著的差异)，见图7中D和E。另外，12×(Aβ1-15-Th)疫苗组在减少6和12体Aβ寡聚体的效应上更优于6×(Aβ1-15-Th)疫苗组，提示该重组嵌合抗原可能具备更优的构象表位，更有利于清除6体和12体Aβ寡聚体，这将在今后的临床应用和效应上具有更好的效果。

实施例8、重组Aβ1-42样寡聚体抗原亚单位疫苗免疫AD模型小鼠后脑组织中各突触蛋白水平的分析

Aβ通过NMDAR造成持续的胞外钙流，激活钙蛋白酶(Calpain)活性，导致dynamin 1降解而下调；而PSD-95作为突触后膜上标记蛋白，钙蛋白酶激活也会导致PSD-95降解，从而造成神经功能障碍及认知能力下降。最近的研究结果强调了Aβ寡聚体通过NMDAR或AMPA受体诱导或介导了AD的突触功能损伤。PSD-95存在于神经元后突触区，对突触的稳定性极为重要。Dynamin 1主要存在突触前体，负责囊泡的循环。GluR1是AMPA受体的一种亚型，研究发现GluR1的活性降低，树突的生长也会受到抑制，从而影响神经元细胞之间的信号连接。因此，通过最模拟阿尔茨海默病的3×Tg AD模型小鼠来研究calpain、dynamin 1、PSD-95和GluR1等免疫治疗后的表达模式或变化情况，及其相互间的关联机制，对于评价AD免疫治疗的效应与作用制具有重要意义。

本研究对免疫治疗和对照组3×Tg-AD模型小鼠的脑蛋白进行Western blot检测。Spectrin蛋白是calpain钙蛋白酶活性指示蛋白。蛋白酶活性越高，spectrin蛋白降解越多，主要降解为150kDa的条带。因此，通过特异性抗体Western Blot检测Spectrin蛋白的降解来评价定量Calpain钙蛋白酶。方法：参照实施例7，一抗分别为anti-spectrin(AA6,1:1,500,Millipore,MA,USA)、anti-dynamin 1(C16,1:2,000,Santa Cruz Biotechnology,Inc.)、anti-PSD-95(1:500,Invitrogen)、anti-GluR1(1:500,Bioworld Technology,Inc.)和anti-β-actin(1:10,000,Sigma,MO,USA，作为内参对照)，用于检测各自蛋白。检测和定量结果如图8。对照组3×Tg-AD模型小鼠与C57BL/6小鼠相比，各种突触蛋白水平下调或降解，表明它们的认识功能障碍和认识能力发生了损伤，这与脑内富集Aβ寡聚体和行为学能力下降是直接相关的。重组嵌合抗原亚单位疫苗免疫组小鼠内Dynamin 1、PSD-95和GluR1的突触蛋白水平均得到了显著的上调(图8中C)，其水平与正常C57BL/6小鼠相当，而spectrin蛋白降解减少，表明免疫治疗抑制了spectrin蛋白降解，从而降低钙蛋白酶活性。因此，本研究结果提示通过重组嵌合抗原亚单位疫苗免疫减少3×Tg-AD模型小鼠Aβ水平，可降低钙蛋白酶活性，进而上调与神经突触功能相关的蛋白或保护了与神经突触功能相关蛋白的降解，从而保护神经突触功能，或改善行为学能力。

总之，本发明设计和制备的重组Aβ1-42样寡聚体抗原6/12×(Aβ1-15-Th)具有独特的Aβ寡聚体结构，模拟了6体和12体的寡聚体结构，能够特异性靶向Aβ寡聚体。其诱导机体产生的高滴度免疫血清抗体能够特异结合Aβ寡聚体，并且体内外中和Aβ寡聚体介导的神经毒性作用，这验证了本研究设计与制备的重组Aβ1-42样寡聚体抗原达到了预期的结构特征。因此，该重组Aβ1-42样寡聚体抗原具有强的寡聚体构象表位，能够诱导机体产生强的抗Aβ寡聚体抗体，是一种全新的重组抗原，具有独特的结构特性。其作为亚单位疫苗免疫3×Tg-AD模型小鼠改善了学习记忆能力，减少脑组织中的Aβ寡聚体，特别是6体和12体Aβ寡聚体毒性分子。而这种减少的Aβ水平，可降低钙蛋白酶活性，进而上调与神经突触功能相关的蛋白，从而达到保护神经突触功能，或改善行为学能力。特别是本研究同时也从分子水平上验证了该疫苗的免疫治疗效应，确定了通过下调钙蛋白酶在该重组疫苗免疫的AD模型鼠中产生的效应，即保护了各突触蛋白分子的降解，缓解突触损伤和认识功能障碍，即而表明通过免疫治疗减少β寡聚体毒性分子，可恢复神经突触和认识功能。总之，这些结果表明有望作为阿尔茨海默病的免疫预防和治疗的新型疫苗候选，具有良好的应用前景和研究价值。

对比例1、本发明Aβ1-42样寡聚体抗原6/12×(Aβ1-15-Th)与本团队研究的其他重组表位抗原效果比较1

本发明Aβ1-42样寡聚体抗原6/12×(Aβ1-15-Th)除与本团队先前报道的6Aβ15-T/TF和12Aβ15-TF等设计结构与思路不同外，它们在效果上也有很多优势。

对照1：6Aβ1-15-T，具体结构及制备方法参见ZL201110053130.8和Yu YZ,et al.,J.Alzheimers Dis.,2014,41:243-60。

对照2：6Aβ1-15-TF，具体结构及制备方法参见Yu YZ,et al.Clin.Immunol.,2018,193:12-23。

对照3：4Aβ1-15-T，具体结构及制备方法参见周果、李庆丽等,生物技术通讯，29(2):189-93。

对照4：12Aβ1-15-TF，具体结构及制备方法同对照2，仅仅是6个拷贝换成了12个拷贝的Aβ1-15(也可见硕士学位论文：李庆丽，阿尔茨海默病重组基因工程亚单位疫苗研究，指导教师：庞晓斌教授和余云舟副教授)。

1、在普通动物上产生的抗体水平比较

采用本发明的Aβ1-42样寡聚体抗原6/12×(Aβ1-15-Th)与上述4种对照重组表位抗原，分别依据实施例2相同的方法免疫普通动物，各组差别之处仅在于具体采用的重组抗原分子不同。

本发明的6/12×(Aβ1-15-Th)在普通动物上产生的抗体水平，平均抗体滴度2次免疫后可达到100000以上，3次可达到240000以上，4次可达到450000以上。在3×Tg AD模型小鼠上，经过三次免疫后就产生了高滴度的特异性抗体水平，平均滴度达到330000以上，在观察了4个月后，模型动物血清抗体略有下降，经过两次加强免疫后，模型动物的抗体水平得到了增强，恢复到330000以上；并且最后高滴度的血清抗体水平能够一直维持20月龄，达到45000以上，即维持高滴度的血清抗体水平，更有利于清除体内的Aβ和寡聚体。

而6Aβ1-15-TF在普通动物上，平均抗体滴度2次免疫后可达到35000以上，3次可达到86000以上，4次仅仅达到150000。免疫4次时在模型动物上仅仅为110000，2次加强后，提高到270000，最后抗体水平才10000。

6Aβ1-15-T抗原在普通动物上，平均抗体滴度2次免疫后可达到30000以上，3次可达到130000以上，4次后约为300000。免疫4次时在模型动物上仅仅为250000，加强1次维持250000，最后抗体水平才24000。

12Aβ1-15-TF抗原在普通动物上，平均抗体滴度2次免疫后可达到50000以上，3次可达到180000以上，4次后约为350000。免疫3次时在模型动物上仅仅为30000，2次加强后，提高到120000，最后抗体水平才10000。

4Aβ1-15-T抗原：4次免疫在普通动物上时120000；它在免疫模型动物试验未评价。

总之，该重组6×(Aβ1-15-Th)和12×(Aβ1-15-Th)产生抗体水平更高，并且免疫次数更少，特别是在模型动物上血清抗体水平能够维持高滴度水平。

2、在模型动物上的效应更好

采用本发明的6/12×(Aβ1-15-Th)与上述三种对照重组表位抗原，分别依据实施例7相同的方法免疫AD模型小鼠，各组差别之处仅在于具体采用的重组表位分子不同。

本发明的6/12×(Aβ1-15-Th)免疫AD模型小鼠后减少脑组织中的Aβ寡聚体，特别是6和12体Aβ寡聚体毒性分子减少得非常明显，相比对照组，6×(Aβ1-15-Th)免疫组分别减少了80％和65％，而12×(Aβ1-15-Th)免疫组则分别减少了90％和80％(P<0.001，具有极其显著的差异)。

而6Aβ1-15-TF疫苗，相比对照组，该免疫组分别减少了71％和61％的6和12体Aβ寡聚体毒性分子。

6Aβ1-15-T疫苗，相比对照组，该免疫组都仅仅减少了45％的6和12体Aβ寡聚体毒性分子。

12Aβ1-15-TF疫苗，相比对照组，该免疫组也减少了Aβ分子含量，但未进行Aβ寡聚体包括6和12体Aβ寡聚体毒性分子的检测。

以上结果表明，6-12×(Aβ1-15-Th)疫苗效应更好，特别是12×(Aβ1-15-Th)更有效果，与它们的独特设计是直接相关的。

对比例2、本发明Aβ1-42样寡聚体抗原6/12×(Aβ1-15-Th)与其他重组表位抗原效果比较2

对照：文献“Hayk Davtyan,et al.Immunogenicity,Efficacy,Safety,andMechanism of Action of Epitope Vaccine(Lu AF20513)for Alzheimer’s Disease:Prelude to a Clinical Trial，J.Neuroscience,2013,3(11):4923-4934”中的LuAF20513，其结构是Aβ1-12-P30-Aβ1-12-P2-Aβ1-12，原核包涵体表达的蛋白作亚单位疫苗。

本发明制备的Aβ1-42样寡聚体抗原6/12×(Aβ1-15-Th)为可溶性重组蛋白，结构特性为模拟Aβ*56分子，形成多聚体结构特性，不同于Lu AF20513疫苗，它无Aβ1-42样分子结构，没有模拟Aβ1-42的寡聚体结构特征。另外，它们在效果上也不同。本发明综合地评价各个指标，包括行为学、病理、寡聚体和突触蛋白等。而Lu AF20513疫苗则评价了免疫反应(抗体水平)和病理变化。

对照Lu AF20513免疫动物产生了抗Aβ的抗体和T细胞表位的细胞免疫反应。免疫AD模型动物(Tg2576)时，减少了Aβ方面病理损伤，主要是Aβ的水平。其免疫3-4次在小鼠产生的抗体水平仅仅为40μg/ml，而且在AD模型动物小鼠(Tg2576)免疫7-9次才30μg/ml，这个水平远远低于本课题组的前期研究水平(Yu YZ,et al.,J.Alzheimers Dis.,2014,41:243-60：6Aβ1-15-T疫苗在PDAPP和3×Tg-AD模型小鼠分别产生的抗体水平为187μg/ml和218μg/ml.)，更低于本发明中用6/12×(Aβ1-15-Th)免疫AD小鼠模型后产生的抗体水平(600-800μg/ml)。

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 构象特异性的重组Aβ1-42样寡聚体抗原、其制备方法和应用

<130> GNCLN192178

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 786

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gatgcagaat ttcgccatga tagcggttat gaagttcatc atcaggcaaa atttgttgcc 60

gcatggaccc tgaaagccgc cgcccagtat attaaggcca atagcaaatt cattggtatt 120

accgaaggca gcgatgccga atttcgccac gatagcggtt acgaagtgca tcatcaggcc 180

aaatttgttg cagcatggac cttaaaagcc gcagcacagt atatcaaagc aaatagcaaa 240

ttcattggca ttaccgaagg tagcgatgcc gagtttcgtc atgatagcgg ctatgaagtg 300

catcaccagg caaaattcgt ggcagcctgg accctgaagg cagccgcaca gtatattaag 360

gcaaatagca agtttatcgg tattaccgag ggcagcgatg cagaatttcg tcatgacagc 420

ggttatgagg tgcatcatca agccaaattt gtggcagcat ggacactgaa agccgcggcc 480

cagtacatta aggccaacag caaattcatt ggaattaccg aaggaagcga tgccgaattt 540

cgtcacgata gcggctacga agttcatcac caggcgaaat ttgtggccgc atggacactg 600

aaagcagccg cccagtacat taaggcaaac agtaaattca ttgggattac cgaagggagt 660

gatgccgaat ttcggcatga tagcggatat gaagtgcacc atcaggcaaa gtttgtggca 720

gcgtggaccc tgaaagcagc ggcacaatat attaaggcta atagtaaatt catcggcatt 780

accgag 786

<210> 2

<211> 1578

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

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aaatttgttg ccgcatggac cctgaaagcc gccgcccagt atattaaggc caatagcaaa 900

ttcattggta ttaccgaagg cagcgatgcc gaatttcgcc acgatagcgg ttacgaagtg 960

catcatcagg ccaaatttgt tgcagcatgg accttaaaag ccgcagcaca gtatatcaaa 1020

gcaaatagca aattcattgg cattaccgaa ggtagcgatg ccgagtttcg tcatgatagc 1080

ggctatgaag tgcatcacca ggcaaaattc gtggcagcct ggaccctgaa ggcagccgca 1140

cagtatatta aggcaaatag caagtttatc ggtattaccg agggcagcga tgcagaattt 1200

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ttcatcggca ttaccgag 1578

<210> 3

<211> 262

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Ala

1 5 10 15

Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gln Tyr Ile Lys

20 25 30

Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser Asp Ala Glu Phe

35 40 45

Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Ala Lys Phe Val Ala

50 55 60

Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys

65 70 75 80

Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser

85 90 95

Gly Tyr Glu Val His His Gln Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu

100 105 110

Lys Ala Ala Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile

115 120 125

Thr Glu Gly Ser Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val

130 135 140

His His Gln Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala

145 150 155 160

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser

165 170 175

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Ala

180 185 190

Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gln Tyr Ile Lys

195 200 205

Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser Asp Ala Glu Phe

210 215 220

Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Ala Lys Phe Val Ala

225 230 235 240

Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys

245 250 255

Phe Ile Gly Ile Thr Glu

260

<210> 4

<211> 526

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 4

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Ala

1 5 10 15

Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gln Tyr Ile Lys

20 25 30

Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser Asp Ala Glu Phe

35 40 45

Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Ala Lys Phe Val Ala

50 55 60

Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys

65 70 75 80

Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser

85 90 95

Gly Tyr Glu Val His His Gln Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu

100 105 110

Lys Ala Ala Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile

115 120 125

Thr Glu Gly Ser Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val

130 135 140

His His Gln Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala

145 150 155 160

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser

165 170 175

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Ala

180 185 190

Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gln Tyr Ile Lys

195 200 205

Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser Asp Ala Glu Phe

210 215 220

Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Ala Lys Phe Val Ala

225 230 235 240

Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys

245 250 255

Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser

260 265 270

Gly Tyr Glu Val His His Gln Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu

275 280 285

Lys Ala Ala Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile

290 295 300

Thr Glu Gly Ser Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val

305 310 315 320

His His Gln Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala

325 330 335

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser

340 345 350

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Ala

355 360 365

Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gln Tyr Ile Lys

370 375 380

Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser Asp Ala Glu Phe

385 390 395 400

Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Ala Lys Phe Val Ala

405 410 415

Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys

420 425 430

Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser

435 440 445

Gly Tyr Glu Val His His Gln Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu

450 455 460

Lys Ala Ala Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile

465 470 475 480

Thr Glu Gly Ser Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val

485 490 495

His His Gln Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala

500 505 510

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu

515 520 525

Claims (14)

1.重组Aβ1-42样寡聚体抗原，为如下任一：

（A1）由12个串联的基本单元组成；

（A2）由6个串联的所述基本单元组成；

（A3）在（A1）或（A2）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白；

所述基本单元由依次串联的β淀粉样肽B细胞表位Aβ1-15和两个辅助性T细胞表位Th组成；所述基本单元由42个氨基酸组成；

所述β淀粉样肽B细胞表位Aβ1-15的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第1-15位所示。

2.根据权利要求1所述的重组Aβ1-42样寡聚体抗原，其特征在于：所述两个辅助性T细胞表位Th分别为通用型DR辅助性T细胞表位PADRE和破伤风毒素人CD4⁺表位P2。

3.根据权利要求2所述的重组Aβ1-42样寡聚体抗原，其特征在于：所述通用型DR辅助性T细胞表位PADRE的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第16-28位所示。

4.根据权利要求2所述的重组Aβ1-42样寡聚体抗原，其特征在于：所述破伤风毒素人CD4⁺表位P2的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第29-42位所示。

5.根据权利要求1-4中任一所述的重组Aβ1-42样寡聚体抗原，其特征在于：（A1）中所述重组Aβ1-42样寡聚体抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；（A2）中所述重组Aβ1-42样寡聚体抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

6.编码权利要求1-5中任一所述的重组Aβ1-42样寡聚体抗原的核酸分子。

7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于：编码所述β淀粉样肽B细胞表位Aβ1-15的核酸分子为SEQ ID No.1的第1-45位。

8.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于：编码所述通用型DR辅助性T细胞表位PADRE的核酸分子为SEQ ID No.1的第46-74位。

9.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于：编码所述破伤风毒素人CD4⁺表位P2的核酸分子为SEQ ID No.1的第75-126位。

10.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于：编码所述重组Aβ1-42样寡聚体抗原的核酸分子为如下任一：

（B1）SEQ ID No.2所示的DNA分子；

（B2）SEQ ID No.1所示的DNA分子。

11.含有权利要求6-10中任一所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

12.一种制备权利要求1-5中任一所述的重组Aβ1-42样寡聚体抗原的方法，包括如下步骤：将权利要求6-10中任一所述核酸分子克隆到原核表达载体，然后通过原核表达系统获得所述重组Aβ1-42样寡聚体抗原。

13.如下任一应用：

（C1）权利要求1-5中任一所述的重组Aβ1-42样寡聚体抗原在制备阿尔茨海默病亚单位疫苗中的应用；

（C2）权利要求1-5中任一所述的重组Aβ1-42样寡聚体抗原在制备用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用；

（C3）权利要求1-5中任一所述的重组Aβ1-42样寡聚体抗原在制备用于提高阿尔茨海默病患者学习记忆能力的产品中的应用；

（C4）权利要求6-10中任一所述核酸分子或权利要求11所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备权利要求1-5中任一所述的重组Aβ1-42样寡聚体抗原中的应用。

14.一种用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的疫苗或药物，其活性成分为权利要求1-5中任一所述的重组Aβ1-42样寡聚体抗原。

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