JP3862752B2 - 全身性エリテマトーデス治療用の合成ベプチドおよびこれを含有する薬剤組成物 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、ヒトの全身性エリテマトーデス治療に有用な合成ペプチドおよびこれを含有する薬剤組成物に関する。
発明の背景
自己免疫疾患は、自己抗原に対する免疫応答により特徴付けられる。この応答は、自己反応性Ｔリンパ球の継続的な活性化により維持される。Ｔリンパ球は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面上の自己の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子産物との複合体としての外来および／または自己抗原の認識により、特異的に活性化される。
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、その起源および治療法が不明の自己免疫疾患である。ＳＬＥの誘導と進展を引き起こしている機構についての広範な研究にもかかわらず、一方ではＳＬＥ患者の不均一性と、他方では疾患の誘導を調節できる実験モデルがないために、この疾患の病因についての情報は非常に限定されている。
ＳＬＥの原因は不明であり、多様な臨床症状を示す。さらに、ＳＬＥの予防または治療を目指した具体的な治療法はない。ＳＬＥの誘導を引き起こしている機構についての広範な研究にもかかわらず、この疾患の病因についての情報は非常に限定されている。ＳＬＥに関する研究は、最近まで異なる臨床段階で種々の治療プロトコール下の患者の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を用いて行われてきた。あるいは、自発性ＳＬＥ様の疾患を示すマウス系統が、ＳＬＥのモデルとして研究された。この種の分析は主に、一方では患者の不均一性と、他方ではマウスＳＬＥ系統の疾患の誘導相の調節が不可能なため、疾患の誘導または維持における種種の免疫学的および非免疫学的因子の役割の解釈を不完全で混乱するものとした。
数年前、本発明者の一人の研究室で、ＳＬＥの動物モデルが樹立された。イディオタイプネットワークの概念に基づくこのモデルは、広範囲のループス関連自己抗体と臨床症状を示した（メンドロビック（Mendlovic）ら、１９８８）。誘導は、自発的自己免疫疾患を示さないマウス系統を、１６／６Ｉｄと呼ぶ共通イディオタイプ（シェーンフェルト（Shoenfeld）ら、１９８３）を有するヒト抗ＤＮＡモノクローナル抗体（ｍＡｂ）で免疫して行った。免疫後、マウスは１６／６Ｉｄに特異的な抗体、１６／６Ｉｄを有する抗体、および異なる核抗原（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、Ｓｍ、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、Ｒｏ、Ｌａなど）に対する抗体を産生した。血清学的知見は、白血球減少、赤血球沈降速度の上昇、タンパク尿、腎臓中の免疫複合体の増加および糸球体の硬化（メンドロビック（Mendlovic）ら、１９８８）であり、これらはＳＬＥの典型的な症状である。本発明者らはさらに、この実験的疾患が、マウス抗１６／６ＩｄｍＡｂ（メンドロビック（Mendlovic）ら、１９８９）およびマウス抗−抗１６／６Ｉｄ（１６／６Ｉｄ＋）ｍＡｂ（ワイスマン（Waisman）ら、１９９３）により誘導できることを証明した。疾患の誘導は遺伝学的に制御されており、従って系統に依存する（メンドロビック（Mendlovic）ら、１９９０）。この実験的ＳＬＥ誘導のためのユニークなモデルは、ＳＬＥの誘導と進展に関与する異なる工程および関連する免疫パラメータを明確に区別する手段を与える。
ＳＬＥは、ＤＮＡ、Ｓｍ、Ｒｏ、Ｌａ、ＲＮＰ、カルジオリピンおよびヒストンのような自己抗原に対する自己抗体の生成を特徴とする。ＳＬＥの病因は不明であるが、これらの自己抗原が発生する機構を理解することは、この問題に対する情報を与えるかも知れない。この目的のために本発明者らは、実験的ＳＬＥを誘導したＣ３Ｈ．ＳＷマウスから得た種々のモノクローナル自己抗体を産生させた。概して、１６／６Ｉｄを有するかまたはこれと反応する抗体を誘発することができるモノクローナル自己抗体は、病原性があり、従って実験的ＳＬＥを誘導することができることが見いだされた（フリッケ（Fricke）ら、１９９０；ステーガー（Sthoeger）ら、１９９３）。後に、実験的ＳＬＥを有するＣ３Ｈ．ＳＷマウスから単離したＤＮＡまたはＨｅｌａ核抽出物（ＮＥ）に結合する９つの自己抗体の可変（Ｖ）領域の配列が決定された（ワイスマン（Waisman）とモーゼス（Mozes）、１９９３）。異なる自己抗体間の関係を求めるために、異なる特異性を有するモノクローナル抗体が分析された。３つのｍＡｂがＤＮＡに結合することが見いだされ、病原性抗ＤＮＡ抗体に特徴的な配列を示すことが示された。これらのｍＡｂの１つである２Ｃ４Ｃ２は、ループスに罹りやすいマウス、すなわち（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ1から単離した抗ＤＮＡ ｍＡｂのＶＨと同一の重（Ｈ）鎖Ｖ領域遺伝子（ＶH）を利用することが証明された。ｍＡｂ ２Ｃ４Ｃ２の軽（Ｌ）鎖Ｖ領域遺伝子（ＶL）は、これも（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ1から単離された別の抗ＤＮＡ ｍＡｂのＶLと９８％の相同性がある。他の２つの抗ＤＮＡ ｍＡｂ（５Ｇ１２−４と５Ｇ１２−６と呼ぶ）は、ｍＡｂ ２Ｃ４Ｃ２のＶH配列と９３％を共有する。６つのｍＡｂは、ＨｅＬａ ＮＥのタンパク質に結合した。この９つのｍＡｂは、全部で５つのＶHと４つのＶL生殖細胞系遺伝子を使用し、実験的ＳＬＥを有するマウスで誘導した自己抗体は、１つのＢ細胞クローンに由来するのではないことを証明している。９つのＶHとＶLのうち３つは、生殖細胞系遺伝子と配列が同一であり、別の少なくとも３つは体細胞突然変異を有していた。後者は、これらの自己抗体が、既存（免疫前）のＢ細胞の使用により、および抗原が支配するプロセスにより、マウスで発生することを示唆する。さらに、実験的ＳＬＥを有するマウスで見いだされる自己抗体は、自発的にループスを発症するマウス系統から単離されるｍＡｂにより使用されるものと同様の遺伝要素を使用するようである。
Ｔ細胞は、実験的ＳＬＥの誘導と進展に重要な役割を果たす。すなわち１６／６Ｉｄに特異的なＴ細胞株およびクローンは、１６／６抗体と同様に、同系の受容体における実験的ＳＬＥを誘導することが証明された。従ってこの株の活性化細胞の接種後、マウスは、ＳＬＥに典型的な血清学と腎障害を発症した（フリッケ（Fricke）ら、１９９１）。さらに、Ｃ３Ｈ．ＳＷ起源の１６／６Ｉｄ特異的Ｔ細胞株は、１６／６Ｉｄまたは抗１６／６Ｉｄ ｍＡｂ（メンドロビック（Mendlovic）ら、１９９０）を注射後ＳＬＥの誘導に耐性であることが証明されたＣ５７ＢＬ／６マウスでＳＬＥを誘導した。
１６／６Ｉｄの病原性領域を同定するために、１６／６Ｉｄ ｍＡｂのＦ(ab')2断片を調製し、これが全１６／６Ｉｄ分子の特異性と病原性を保持することが見いだされた（ルイズ（Ruiz）ら、１９９４）。
実験的ＳＬＥを有するマウスから単離され、ＤＮＡに結合し１６／６Ｉｄを有することが証明されたｍＡｂ ５Ｇ１２は、マウスで実験的ＳＬＥを誘導することができる（ワイスマン（Waisman）ら、１９９３）。増殖によりｍＡｂに特異的に反応するＴ細胞は、おそらく相補性決定領域（ＣＤＲ）からの配列を示すペプチドに反応している。同じ定常領域を有するが異なる特異性を有する他の抗体とは反応しないため、Ｔ細胞は上記抗体のＶ領域を認識する可能性が高い。可変領域内で、ＣＤＲは種々の抗体の間で最も大きく異なる領域であるため、認識される可能性が最も高い領域はＣＤＲである。マウスでＳＬＥを誘導する前述の９つの病原性マウスｍＡｂのＶH配列のＣＤＲ領域は、ワイスマン（Waisman）とモーゼス（Mozes）、１９９３、の図１で四角で囲ってあり、そこでは９つのｍＡｂのＶＨの完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列が提示されている。
発明の要約
本発明の目的は、ＳＬＥ患者の具体的な治療のために手段を提供することである。
この目的のために、本発明は、実験的ＳＬＥを有するマウスから単離された病原性モノクローナル自己抗体のＣＤＲ領域に基づくペプチドおよびその類似体を提供する。
すなわち１つの面において本発明は、
（ｉ）マウスで全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）様疾患を誘導する病原性抗ＤＮＡモノクローナル抗体の重鎖または軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）に基づく少なくとも１２個かつ多くとも３０個のアミノ酸残基のペプチド（以後、ＣＤＲベースのペプチド）、その塩または化学的誘導体；
（ii）（ｉ）で定義したＣＤＲベースのペプチドの類似体、その塩または化学的誘導体；
（iii）直接または短い結合鎖を介してたがいに共有結合した（ｉ）の２つのペプチドまたは（ii）の２つの類似体からなる２重合成ペプチド；
（iv）ペプチド（ｉ）またはその類似体（ii）の複数の配列からなるペプチドポリマー；および
（ｖ）巨大分子担体に結合したペプチドポリマー（iv）
よりなる群から選択される合成ペプチドに関する。
この面の１つの実施態様において、合成ペプチドは、
（ｉ）ＳＬＥ誘導性の自己抗体に対する高応答動物であるマウスのＴリンパ球の増殖性応答およびサイトカイン分泌を特異的に阻害することができるか、または
（ii）病原性自己抗体によるＳＬＥ誘導に対して感受性であるマウスのＳＬＥの進展を阻害することができる。
本発明の合成ペプチドおよびその類似体は、本明細書の配列Ｉ〜Ｖを有するペプチドよりなる群から選択され、ここで
（ｉ）配列Ｉのペプチドは、式：
ＴＧＹＹＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＳＰＥＫＳＬＥＷＩＧ ［Ｉ］
（式中、Ｘ1はＭｅｔ、ＡｌａまたはＶａｌであり、Ｘ2はＧｌｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＡｒｇであり、Ｘ3はＴｒｐまたはＡｌａであり、Ｘ4はＶａｌまたはＳｅｒであり、そしてＸ5はＬｙｓ、ＧｌｕまたはＡｌａである）を有し、
（ii）配列IIのペプチドは、式：
ＥＩＮＰＳＴＧＧＸ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＫＡＫＡＴ ［II］
（式中、Ｘ6とＸ7は各Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＡｌａであり、Ｘ8はＴｙｒまたはＰｈｅであり、Ｘ9はＡｓｎまたはＡｓｐであり、Ｘ10はＧｌｎまたはＧｌｕであり、Ｘ11はＬｙｓまたはＧｌｕであり、そしてＸ12はＰｈｅまたはＴｙｒである）を有し、
（iii）配列IIIのペプチドは、式：
ＹＹＣＡＲＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16ＰＹＡＸ17Ｘ18ＹＷＧＱＧＳ ［III］
（式中、Ｘ13はＰｈｅ、ＴｈｒまたはＧｌｙであり、Ｘ14はＬｅｕ、ＡｌａまたはＳｅｒであり、Ｘ15はＴｒｐまたはＡｌａであり、Ｘ16はＧｌｕまたはＬｙｓであり、Ｘ17はＭｅｔまたはＡｌａであり、そしてＸ18はＡｓｐ、ＬｙｓまたはＳｅｒである）を有し、
（iv）配列IVのペプチドは、式：
ＧＹＮＸ19Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＳＨＧＸ25Ｘ26ＬＥＷＩＧ ［IV］
（式中、Ｘ19はＭｅｔまたはＡｌａであり、Ｘ20はＡｓｎ、ＡｓｐまたはＡｒｇであり、Ｘ21はＴｒｐまたはＡｌａであり、Ｘ22はＶａｌまたはＳｅｒであり、
Ｘ23はＬｙｓまたはＧｌｕであり、Ｘ24はＧｌｎまたはＡｌａであり、Ｘ25はＬｙｓまたはＧｌｕであり、そしてＸ26はＳｅｒまたはＡｌａである）を有し、そして
（ｖ）配列Ｖのペプチドは、式：
ＹＹＣＡＲＸ27Ｘ28Ｘ29ＹＧＸ30Ｘ31Ｘ32ＧＱＧＴＬ ［Ｖ］
（式中、Ｘ27はＳｅｒまたはＰｈｅであり、Ｘ28はＧｌｙまたはＡｌａであり、Ｘ29はＡｒｇ、ＡｌａまたはＧｌｕであり、Ｘ30はＡｓｎまたはＡｓｐであり、Ｘ31はＴｙｒまたはＰｈｅであり、そしてＸ32はＴｒｐ、ＨｉｓまたはＡｌａである）を有する。
好適な実施態様において、ペプチドＩ〜Ｖは配列Ｉａ〜Ｖａ：
ＴＧＹＹＭＱＷＶＫＱＳＰＥＫＳＬＥＷＩＧ （Ｉａ）
ＥＩＮＰＳＴＧＧＴＴＹＮＱＫＦＫＡＫＡＴ （IIａ）
ＹＹＣＡＲＦＬＷＥＰＹＡＭＤＹＷＧＱＧＳ （IIIａ）
ＧＹＮＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧ （IVａ）
ＹＹＣＡＲＳＧＲＹＧＮＹＷＧＱＧＴＬ （Ｖａ）
を有する。
ペプチドＩａ〜IIIａは、ｍＡｂ ５Ｇ１２のＶH鎖のそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に基づき、ペプチドIVａとＶａは、ｍＡｂ ２Ｃ４Ｃ２のＶH鎖のそれぞれＣＤＲ１およびＣＤＲ３に基づく（ワイスマン（Waisman）とモーゼス（Mozes）、１９９３）。
別の面において本発明は、本発明の合成ペプチドまたはペプチドポリマーおよび薬剤学的に許容される担体からなる、ＳＬＥの治療のための薬剤組成物に関する。
さらに別の面において本発明は、本発明の合成ペプチドまたはペプチドポリマーの有効量をＳＬＥ患者に投与することよりなる、ＳＬＥ患者の治療方法に関する。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ〜Ｂは、ｍＡｂ ５Ｇ１２、ペプチド１ａとIIIａおよび対照ペプチド２７８で免疫したかまたは免疫していないＳＪＬ（１Ａ）およびＢＡＬＢ／ｃ（１Ｂ）マウスの血清中の抗ＤＮＡ抗体の存在を示す。記載した抗原のいずれか１つで免疫し、追加免疫注射の３ヶ月後に採取した各ＳＪＬまたはＢＡＬＢ／ｃマウスの血清、および年齢の一致した免疫していないマウスの血清を、抗ｓｓＤＮＡ抗体の力価について試験した。希釈した血清とインキュベートした後、ペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）を加えた。結果を、各マウス群の平均ＯＤとして示した。
図２Ａ〜Ｂは、図１と同じ抗原で免疫したＳＪＬ（２Ａ）およびＢＡＬＢ／ｃ（２Ｂ）マウスの血清中のＨｅＬａ抗核抽出物（ＮＥ）抗体の存在を示す。
図３Ａ〜Ｂは、ペプチドＩａとIIIａまたは対照ペプチド２７８で免疫したＳＪＬ（３Ａ）およびＢＡＬＢ／ｃ（３Ｂ）マウスおよび正常マウスの血清中の、抗ＲＮＰ、Ｓｍ、ＲｏおよびＬａ抗体の存在を示す。
図４Ａ〜Ｂは、ペプチドＩａまたは対照ペプチドｐ３０７で寛容誘導し、ペプチドＩａまたはｍＡｂ ５Ｇ１２で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清中の抗ＤＮＡ（４Ａ）および抗ＨｅＬａ ＮＥ（４Ｂ）抗体の存在を示す。
図５ａ〜ｂは、ＣＤＲベースのペプチドIIIａで治療後の、それぞれＩａとIIIａに対するＢＡＬＢ／ｃ（５ａ）とＳＪＬ（５ｂ）マウスにおける、リンパ節細胞（ＬＮＣ）増殖応答のインビボ阻害を示す。
図６ａ〜ｂは、それぞれペプチドＩａとIIIａで治療したＢＡＬＢ／ｃ（６ａ）またはＳＪＬ（６ｂ）マウス中のｍＡｂ ５Ｇ１２に対するＬＮＣのインビボ阻害を示す。
図７ａ〜ｂは、それぞれペプチドＩａとIIIａで治療したＢＡＬＢ／ｃ（７ａ）またはＳＪＬ（７ｂ）マウス中のヒトモノクローナル抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ抗体に対するＬＮＣ増殖のインビボ阻害を示す。
図８は、異なるマウス系統の脾臓抗原提示細胞の表面へのペプチドＩａとIIIａの結合を示す。
図９は、ペプチドＩａ、IIａおよびIIIａ、またはｍＡｂ ５Ｇ１２または対照ペプチドに結合する能力について血清を試験することによる、ＳＬＥ患者および健常人対照の血清中の抗体力価を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、実験的ＳＬＥを有するマウスから単離されたモノクローナル病原性自己抗体のＣＤＲに基づく合成ペプチドに関する。このようなモノクローナル抗体は、例えば抗１６／６Ｉｄ ｍＡｂで免疫したＣ３Ｈ．ＳＷマウスの脾臓細胞をＸ６３．６５３形質細胞腫細胞と融合して産生されるハイブリドーマの上清から得られる（ワイスマン（Waisman）とモーゼス（Mozes）、１９９３）。
このようなペプチドの例は、それぞれｍＡｂ ５Ｇ１２の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、およびｍＡｂ ２Ｃ４Ｃ２（ワイスマン（Waisman）とモーゼス（Mozes）、１９９３）の重鎖のＣＤＲ１とＣＤＲ３領域、およびその類似体に基づく、本明細書の式Ｉａ〜Ｖａのものである。
本発明で企図される親ペプチドＩａ〜Ｖａの類似体は、本明細書に記載の置換、欠失および付加類似体がある。置換類似体は異なる位置でアミノ酸置換を有し、これらの置換は、アミノ酸の大きさ、疎水性−親水性パターンおよび電荷に基づいて作成される。
アミノ酸は、大きさ、疎水性−親水性パターンおよび電荷によって分類される。大きさについては、最も大きいアミノ酸はＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＭｅｔおよびＨｉｓであり、最も小さいものはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、ＴｈｒおよびＰｒｏであり、他のものはその中間であることは、当業者には容易に理解できるであろう。
疎水性−親水性パターンについては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＭｅｔおよびＴｒｐは疎水性であり、残りのすべてが親水性であることは公知である。親水性アミノ酸のうち、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、およびＴｙｒは電荷がなく、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＨｉｓおよびＡｓｎは陽性電荷を有し、ＡｓｐとＧｌｕは陰性電荷を有する。
ＳＬＥ誘導性自己抗体に対する高応答動物であるマウスのＴリンパ球の増殖性応答を阻害する能力について試験されるペプチドを選択する場合、置換体は累積して、非置換親ペプチドの対応する部分の大きさ、疎水性−親水性パターンおよび電荷を実質的に変化させないものから選択することが重要である。すなわち、全体の作用が、対応する非置換親ペプチドの大きさ、疎水性−親水性パターンおよび電荷を実質的に変化させない限り、疎水性残基は親水性残基で置換してもよく、またはその逆を行っても良い。
ペプチドおよびその類似体の他の修飾も本発明において企図されることは理解すべきである。すなわち、本発明のペプチドまたは類似体は、Ｔ細胞増殖性応答および自己免疫疾患を防止または阻害するのに利用できるペプチドの機能の少なくとも一部を保持するその「化学的誘導体」も含む。
本発明のペプチドまたは類似体の「化学的誘導体」は、通常はペプチドの一部ではない追加の化学的残基を含有する。ペプチドの共有結合的修飾は、本発明の範囲に含有される。このような修飾は、ペプチドの標的アミノ酸残基を、選択する側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることにより、分子中に導入することができる。
また本発明の範囲には、本発明のペプチドおよび類似体の塩が含まれる。本明細書において「塩」という用語は、ペプチド分子のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、当該分野で公知の手段により作成され、例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、第二鉄塩または亜鉛塩などの無機塩、および例えばトリエチルアミン、アルギニン、またはリジン、ペピリジン、プロカインなどのアミンと作成される有機塩基との塩がある。酸付加塩は、例えば塩酸または硫酸のような無機酸との塩、および例えば酢酸またはシュウ酸のような有機酸との塩がある。このような化学的誘導体および塩は、好ましくは安定性、溶解度などに関する限り、ペプチドの薬剤学的性質を修飾するために使用される。
ペプチドやその類似体の例には以下のものがある：
（ｉ）式のペプチドＩａ：
および、５位のＭｅｔはＡｌａまたはＶａｌで置換され、６位のＧｌｎはＡｓｐ、ＧｌｕまたはＡｒｇで置換され、７位のＴｒｐはＡｌａで置換され、８位のＶａｌはＳｅｒで置換され、そして９位のＬｙｓはＧｌｕまたはＡｌａで置換されているその置換類似体、および５つまでのアミノ酸残基が、ペプチドＩａのＣ−末端から欠失しているその欠失類似体。
（ii）式のペプチドIIａ：
および、９位と１０位のＴｈｒはそれぞれＶａｌまたはＡｌａで置換され、１１位のＴｙｒはＰｈｅで置換され、１２位のＡｓｎはＡｓｐで置換され、１３位のＧｌｎはＧｌｕで置換され、１４位のＬｙｓはＧｌｕで置換され、そして１５位のＰｈｅはＴｙｒで置換されているその置換類似体、および５つまでのアミノ酸残基が、ペプチドIIａのＣ−末端から欠失しているその欠失類似体。
（iii）式のペプチドIIIａ：
および、６位のＰｈｅはＴｈｒまたはＧｌｙで置換され、７位のＬｅｕはＡｌａまたはＳｅｒで置換され、８位のＴｒｐはＡｌａで置換され、９位のＧｌｕはＬｙｓで置換され、１３位のＭｅｔはＡｌａで置換され、そして１４位のＡｓｐはＬｙｓまたはＳｅｒで置換されているその置換類似体、および５つまでのアミノ酸残基が、ペプチドIIIａのＣ−末端から欠失しているその欠失類似体。
（iv）式のペプチドIVａ：
および、４位のＭｅｔはＡｌａで置換され、５位のＡｓｎはＡｓｐまたはＡｒｇで置換され、６位のＴｒｐはＡｌａで置換され、７位のＶａｌはＳｅｒで置換され、８位のＬｙｓはＧｌｕで置換され、９位のＧｌｎはＡｌａで置換され、１３位のＬｙｓはＧｌｕで置換され、そして１４位のＳｅｒはＡｌａで置換されているその置換類似体、および５つまでのアミノ酸残基が、ペプチドIVａのＣ−末端から欠失しているその欠失類似体。
（ｖ）式のペプチドＶａ：
および、６位のＳｅｒはＰｈｅで置換され、７位のＧｌｙはＡｌａで置換され、８位のＡｒｇはＡｌａまたはＧｌｕで置換され、１１位のＡｓｎはＡｓｐで置換され、１２位のＴｙｒはＰｈｅで置換され、そして１３位のＴｒｐはＨｉｓまたはＡｌａで置換されているその置換類似体、および５つまでのアミノ酸残基が、ペプチドＶａのＣ−末端から欠失しているその欠失類似体。
本発明の類似体がいったん産生されると、ＳＬＥ誘導性自己抗体に対する高応答動物であるマウスのＴリンパ球の増殖性応答を阻害する能力は、当業者は本明細書に記載のような試験を用いて、不適当な実験をすることなく容易に測定できる。容易に実施できる１つの試験は、ＳＬＥ誘導性自己抗体に特異的ないくつかのＴ細胞株およびクローンの増殖性応答をインビトロで阻害する置換ペプチドの能力についての試験である。Ｔ細胞株とクローンは、例えば既に記載されている方法（アクセルロッド（Axelrod）とモーゼス（Mozes）、１９８６）によりマウスの免疫したリンパ節細胞から樹立した１６／６Ｉｄ ｍＡｂ（フリッケ（Fricke）ら、１９９１）に特異的なＴ細胞株とクローンでもよい。細胞を、強化培地の存在下で放射線照射した同系脾臓細胞上に提示された刺激性抗体に２週間毎に暴露する。Ｔ細胞株は、標準的な限界希釈法によりクローン化する。これらのＴ細胞株とクローンの増殖性応答は、例えば本明細書のセクション（ｇ）の材料と方法に記載の方法により試験される。
所望の活性を有する類似体を選択するために行われる別の試験は、親ペプチドの存在下でペプチド特異的Ｂ細胞を援助するＴ細胞株とクローンの能力を阻害する置換ペプチドの能力についての試験である。置換されたペプチドはまた、ビオチン化後に、関連株の抗原提示細胞上のＭＨＣクラスII産物に直接結合する能力について試験される。この目的のために、関連するペプチドのＮ−末端ビオチン化が、過剰のビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド水溶液で０℃で行われる（モーゼス（Mozes）ら、１９８９）。マウス脾臓吸着細胞またはヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）吸着細胞（１×１０6／試料）を、０．１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ）中で３７℃で２０分間インキュベートし、フィコエリトリン−ストレプトアビジンで４℃で３０分間インキュベートする。次に、ＦＡＣＳｃａｎを用いてフローサイトメトリーで細胞を解析する。各解析において、最低５０００個の細胞を調べる（上記方法については、モーゼス（Mozes）ら、１９８９、ジスマン（Zisman）ら、１９９１を参照）。
実施されるさらなる試験は、ＳＬＥ誘導性自己抗体に対する高応答動物であるマウスのリンパ節のＴ細胞株またはＴリンパ球によるサイトカイン分泌を阻害する類似体の能力についての試験である。サイトカインは以下のように検出される：ＩＬ−１活性は、捕捉抗体と検出抗体の対を用いるＥＬＩＳＡ（後述のＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０に対するように）によるか、またはＬＢＲＭ−３３（１Ａ５）測定法（コンロン（Conlon）、１９８３）（１Ａ５細胞は、ＩＬ−２を分泌させるために種々の濃度の上清もしくは組換えＩＬ−１で植物性血球凝集素（ＰＨＡ）の存在下で刺激される）を用いて評価する。一晩インキュベーション後、１Ａ５細胞の上清を、ＩＬ−２依存性細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬＬ）株に移す。3［Ｈ］−チミジンの取り込みにより２４時間後にＩＬ−２によるＣＴＬＬ株の刺激を測定する。ＩＬ−２は、ＩＬ−２依存性ＣＴＬＬ株を用いて直接検出するかまたはＥＬＩＳＡにより検出する。上清中のＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮγおよびＴＮＦαのレベルは、種々のサイトカインに対する抗体（ファミンゲン（Phamingen）、サンジエゴ、カリホルニア州、米国）を用いるＥＬＩＳＡにより製造業者の説明書に従って測定する。
これらのインビトロ試験の１つまたはそれ以上で陽性になったペプチドは、当然インビボでも活性があることが期待される。しかし、不適当な実験をすることなくインビボ試験を実施できる。例えば、成体マウスに、−３日または０日に候補ペプチドを注射する。次に疾患誘導性自己抗体またはペプチドでマウスを免疫する。１０日後、マウスのリンパ節細胞を、候補ペプチドの阻害能力を見いだすために免疫原に対して増殖する能力を試験する。
別のインビボ動物試験では、前述のようにＳＬＥの発生についてインビボでマウスモデルの治療活性を直接測定する。異なる経路で異なる投与量でそして異なる時間スケジュールで実験的ＳＬＥを誘導したマウスに、ペプチドを注射する。類似体の薬物動態パラメータ（分布容量、抗原提示細胞への摂取、およびクリアランスを含む）を測定するために、類似体のビオチン化誘導体を使用することができる。種々の体液での類似体の可溶性画分の濃度は、アビジン被覆プレートと特異的抗ペプチド抗体を用いてＥＬＩＳＡにより測定することができる。細胞結合類似体は、蛍光色素結合アビジンまたはストレプトアビジンを用いてＦＡＣＳにより分析することができる。さらに、自己抗体応答に対する、およびＳＬＥ誘導性自己抗体によるマウスで誘導した疾患症状に対するペプチドの効果を測定するために、処理したマウスを定期的に試験することができる。
別のインビボの方法では、マウスの新生児を候補ペプチドで寛容誘導し、次に病原性自己抗体（例えば、１６／６Ｉｄ＋）もしくは同じ抗体でマウスを免疫し、症状（例えば、白血球減少、赤血球沈降速度上昇、タンパク尿、腎臓における多量の免疫複合体および糸球体の硬化）が現れる。
従って本明細書の例で実機能することが示された好適な実施態様以外に、当業者は不適当な実験をすることなく、本明細書に記載の指示に従って機能する追加の類似体を決定することができるであろう。
特定のＳＬＥ患者に対する特定の置換ペプチドの予測される治療効果を評価するために、比較的簡単なインビトロ試験を実施することができる。適当なＭＨＣクラスII分子に高親和性で結合するがＴ細胞をさらに活性化することのないペプチドを産生するという最終目標を評価するために、ビオチン化後ＳＬＥ患者の末梢血リンパ球中の抗原提示細胞上のＨＬＡクラスII産物に直接結合する能力についてペプチドを評価してもよい。その特異性を証明するために、このような測定法では健常対照ドナーと対照ペプチドが使用される。
好適な型の本発明の治療薬剤は、ペプチドＩａ〜Ｖａおよびその置換類似体および／または欠失類似体を含む、本明細書の式Ｉ〜Ｖのペプチドの群から選択されるペプチドである。
本発明の別の好適な型の治療薬剤は、多重エピトープ単一ペプチドの型である。すなわち好適な実施態様において、本明細書の式Ｉ〜Ｖのペプチドの群から選択される２つの異なるペプチドより構成される２重ペプチドは、アラニン残基の短い鎖またはカテプシンによるタンパク分解の推定部位によるように、たがいに共有結合される。例えば、このような部位については米国特許第５，１２６，２４９号およびヨーロッパ特許第４９５，０４９号を参照されたい。これは、２つの所望の類似体への好適な型の部位特異的タンパク分解を誘導するであろう。あるいは、本発明の多くの同じまたは異なるペプチドは、例えば０．１％グルタルアルデヒドのような適切な重合物質でペプチドを重合することにより、ペプチドポリマーに形成してもよい（アウディベルト（Audibert）ら（１９８１）、Ｎａｔｕｒｅ ２８９：５９３）。ポリマーは好ましくは５〜２０個のペプチド残基を含有する。このようなペプチドポリマーはまた、ペプチドを架橋するかもしくは複数のペプチドを巨大分子担体に架橋することにより形成される。適切な巨大分子担体は、例えばタンパク質（例えば、破傷風毒素）、およびアミノ酸の線状または分岐共重合体（例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リジンの線状共重合体、Ｌ−チロシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニンおよびＬ−リジンの分岐共重合体（Ｔ，Ｇ）−Ａ−Ｌ−、または多鎖ポリ−ＤＬ−アラニン）である（エム・セラ（M. Sera）ら、１９５５、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７７：６１７５）。結合体は例えば、ジー・エム・ムラー（Muller, G.M.）ら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５６９に記載のようにまずペプチドを水溶性カルボジイミド（例えば、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）に結合させ、次に巨大分子担体に結合させることにより得られる。各結合体中の結合ペプチドの含有量は、アミノ酸分析により担体のみの組成と比較して決定できる。
本発明の１つの実施態様によれば、１つまたはそれ以上の活性ペプチドは適切な巨大分子担体に結合できるか、またはグルタルアルデヒドの存在下重合できる。
ペプチド、そのポリマーまたは適切な巨大分子担体とのその結合体は、治療に適するようにバイオアベイラビリティを確保する型で患者に投与される。２つ以上のペプチド類似体が充分な阻害活性を有することがわかれば、これらの類似体を、ペプチドの混合物を含有する製剤中で患者に投与されるであろう。
本発明はさらに、本発明の少なくとも１つの合成ペプチド、適切な巨大分子担体とのその結合体、または随時薬剤学的に許容される担体とのそのポリマーからの薬剤組成物を含有する。
経口、静脈内、皮下、関節内、筋肉内、吸入、鼻腔内、クモ膜下、腹腔内、皮内、経皮的または他の経路（例えば、腸内）を含む任意の適切な投与経路が、本発明に包含される。
本発明の組成物の投与の投与量範囲は、所望の作用を示すために充分に多量でなければならず、こうして例えばインビトロでＴ細胞により測定されるＳＬＥ誘導性自己抗体に対する免疫応答が実質的に防止または阻害され、そしてさらに疾患が有意に治療される。投与量は、副作用（例えば、好ましくない交差反応、全身性免疫抑制、アナフィラキシー反応など）を引き起こすほど多量であってはならない。
ＳＬＥを治療するために使用される本発明のペプチドの有効投与量は、約１μg〜１００mg/kg/体重の範囲である。投与される量は、患者の年齢、性、健康、および体重、併用されるならその治療の種類、治療頻度、および所望の作用の本質に依存する。
本発明の合成ペプチドと類似体、特に本明細書の配列Ｉ〜Ｖのものは、他の免疫応答に影響を与えることなくＳＬＥ患者の特異的抗原応答を阻害または抑制することを目的とする。ほとんど診断された患者は長年の治療を必要とする若い女性であり、ＳＬＥの現在の治療では非特異的および複数の副作用を有するコルチステロイドおよび／または細胞毒性薬剤のような免疫抑制剤を投与するため、このアプローチは特に重要である。
以下の例と添付の図面により本発明を詳細に説明する。
例
材料と方法
ａ）マウス：マウス（ＢＡＬＢ／ｃおよびＳＪＬ／Ｊ）は、ジャクソンラボラトリー（Jackson Laboratory）（バーハーバー（Bar Harbor）、メーン州、米国）とオラック（Olac）（ショーズファーム（Show's farm）、ビセスパーオキソン（Bicesper Oxon）、イングランド）から得た。マウスは６〜１２週齢で使用した。ある実験では新生児マウスを使用した。
ｂ）ヒトｍＡｂ１６／６Ｉｄ：ヒトｍＡｂ １６／６Ｉｄ：は、もともとＩｇＭイソタイプの抗ＤＮＡ抗体であり、培養してＩｇＧ１とした。このｍＡｂは患者由来であり、共通のイディオタイプ１６／６Ｉｄを発現する（シェーンフェルト（Shoenfeld）ら、１９８３；メンドロビック（Mendlovic）ら、１９８８）。このｍＡｂを分泌するハイブリドーマ細胞は普通に培養増殖させ、抗体は、セファロース（登録商標）に結合したプロテインＧの親和性カラムを用いて培養上清から単離した。
ｃ）マウスｍＡｂ ５Ｇ１２および２Ｃ４Ｃ２の産生：既に記載されているようにマウス抗１６／６Ｉｄ ｍＡｂ（メンドロビック（Mendlovic）ら、１９８９）で免疫してメスのＣ３Ｈ．ＳＷマウスで実験的ＳＬＥを誘導した。４ヶ月後２匹のマウスを屠殺して、その脾臓細胞をＸ６３．６５３形質細胞腫細胞と融合した。自己抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート中で限界希釈してクローン化した。９つのハイブリドーマクローンにより分泌された９つのモノクローナル自己抗体の配列の特徴を解析した（ワイスマン（Waisman）とモーゼス（Mozes）、１９９３）。５Ｇ１２と２Ｃ４Ｃ２と呼ぶｍＡｂを単離し、ヤギ抗マウスＩｇ−セファロース（登録商標）４Ｂカラムを用いてハイブリドーマ上清から親和性精製した。５Ｇ１２ ｍＡｂは１６／６Ｉｄを有する抗ＤＮＡ ｍＡｂであり、ＩｇＧ２ａイソタイプを有していた。２Ｃ４Ｃ２ ｍＡｂは抗ＤＮＡおよび抗カルジオリピンｍＡｂであり、ＩｇＭイソタイプであった。５Ｇ１２と２Ｃ４Ｃ２ ｍＡｂの両方のヌクレオチドと推定アミノ酸配列は、ワイスマン（Waisman）とモーゼス（Mozes）、１９９３の図１に記載されており、図中でＣＤＲ領域は四角で囲ってある。
ｄ）マウスでの実験的ＳＬＥの誘導：完全フロイントアジュバント中のヒトモノクローナル１６／６Ｉｄ（１μg／マウス）またはマウス１６／６Ｉｄ ｍＡｂ（例えば、ｍＡｂ ５Ｇ１２（２０μg／マウス））をマウスの後ろ足に注射した。注射の３週間後、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の同量の免疫抗体でマウスを追加免疫した。次に抗体産生と実験的ＳＬＥに特徴的な臨床症状について試験した。
ｅ）ＳＬＥ関連臨床症状の検出：ヘパリン化血液をＰＢＳで１：１に希釈して赤血球沈降速度を測定した。次に希釈した血液を微量サンプリングピペットに移し、６時間後沈降を測定した。白血球数は、ヘパリン化血液を溶解してから測定した。タンパク尿は、コンビスティックス（Combistix）キット（エームス（Ames）、ストークポーゲス（Stoke Poges）、スロー（Slough）、英国）を用いて、半定量的に測定した。固定した凍結切片をマウス免疫グロブリンに対するＦＩＴＣ標識抗体でインキュベートして免疫組織学的検査を行った。染色は、蛍光顕微鏡を用いて可視化した。
ｆ）酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）：実験マウスおよびヒトでの抗体の検出と定量のためにＥＬＩＳＡを利用した。ポリスチレン製マイクロタイタープレートを関連する抗原または抗体で被覆し、血清希釈物またはヒトまたはマウス細胞培養物から得た上清を、ブロッキングしたプレートに添加した。ペルオキシダーゼの結合した適切な免疫グロブリン（Ｉｇ）（例えば、ヤギ抗ヒトまたはヤギ抗マウスペルオキシダーゼ結合抗体）とペルオキシダーゼ基質の添加後、特異的結合を測定した。光学密度は、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４１４nmで読んだ。
ｇ）脾臓およびリンパ節細胞の増殖性応答：処理および未処理マウスの脾臓およびリンパ節から得た細胞（０．５×１０6／ウェル）を、異なる濃度の種々の免疫病原性自己抗体の存在下でマイクロタイタープレート中で培養した。９６時間インキュベーション後、０．５μCiの3Ｈ−チミジンをさらに１８時間添加し、その後細胞を採取し、放射能を計測した。
ｈ）実験マウスの処理：実験的ＳＬＥの誘導を防止するためにまたは病気にかかったマウスを治療するために、以下の方法を行った：（ｉ）新生児マウスを本発明のペプチドで寛容誘導を行った（ＰＢＳ中の１００μgのペプチド、出産後２４時間と７２時間後に腹腔内投与）。６週間後、マウスを病原性自己抗体（例えば、５Ｇ１２（１６／６Ｉｄ＋））で免疫し、症状の出現について調べた。
（ii）第１の群の成体マウスに、種々の濃度のペプチドを注射してから、病原性自己抗体または病原性Ｔ細胞株で疾患を誘導した。別の群にはペプチドを注射して、血清応答のピーク時の免疫後６週間後にその治療効果について試験した。さらに別の群は、明らかなＳＬＥが樹立してから免疫の４〜６ヶ月後処理した。ペプチドの注射の回数は、疾患の誘導と進行に対するその効果に基づき決定した。次にＴ細胞増殖、自己抗体産生および疾患の出現に対するペプチド処理の効果を評価した。
ｉ）Ｔ細胞株とクローンの増殖性応答：１６／６Ｉｄに特異的なＴ細胞株とクローンは、前述のように（アクセルロッド（Axelrod）とモーゼス（Mozes）、１９８６）免疫したリンパ節細胞から樹立した。細胞を、強化培地の存在下で放射線照射した同系脾臓細胞上に提示された刺激性抗体に２週間毎に暴露した。Ｔ細胞株は、標準的な限界希釈法によりクローン化した。細胞（１０4／ウェル）を、細胞株の異なる濃度の特異的刺激物質または対照試薬の存在下で０．５×１０6照射（３０００rad）同系脾臓細胞とともに培養した。４８時間のインキュベーションの最後に、０．５μCiの3Ｈ−チミジンをさらに１８時間添加し、その後細胞を採取し、放射能を計測した。
ｊ）末梢血リンパ球（ＰＢＬ）による増殖とサイトカイン産生：ヒトＳＬＥ患者と適切な対照ドナーからのＰＢＬ（２×１０5／ウェル）を、１０％プールＡＢ血清を含有する強化培地中のマイクロタイタープレートでヒトまたはマウスモノクローナル１６／６Ｉｄ抗体の存在下で、本発明のペプチドもしくは植物性血球凝集素（ＰＨＡ）の存在下で培養した。増殖速度は、細胞培養物中の3［Ｈ］−チミジンの取り込みにより評価した。関連のないペプチドを特異性対照として使用した。ＥＬＩＳＡ測定法でサイトカイン依存性株または適切な抗体対を用いて、上記培養物の上清中の抗原および分裂促進因子刺激サイトカイン産生を定量した。増殖性応答の阻害は、増殖性培養混合物に増加する濃度の試験ペプチド類似体を添加してインビトロで行った。
ｋ）ヒトＴ細胞株とクローン：ヒトまたはマウスマウスｍＡｂ １６／６Ｉｄまたはペプチドでインビトロで刺激後、ＳＬＥ患者または対照のＰＢＬから１６／６Ｉｄに特異的なヒトＴ細胞株を樹立した。細胞株の維持とクローニングは、マウスＴ細胞株について前述したのと同様に行ったが、刺激は自己の放射線照射細胞または自己ＰＢＬ（抗原提示細胞として使用される）のＥＢＶ−形質転換細胞株を用いて行った。
ｌ）ペプチドのビオチン化：ペプチドのＮ−末端ビオチン化は、０．１Ｎ重炭酸ナトリウム溶液中で室温で、１−メチル−２−ピロリドン（シグマ（Sigma））に溶解した過剰のビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）を用いて行った。
ｍ）ＡＰＣへのビオチン化ペプチドの直接結合：１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁した脾臓細胞を、シャーレ中で３７℃で６０分間インキュベートした。次に非吸着細胞を除去し、プレートを洗浄し、吸着細胞をゴムポリスマン（rubber policeman）（コスター（Costar）、マサチューセッツ州、米国）を用いてプレートから採取した。これらの細胞（１×１０6／１００μl／試験管）を、０．１％ＢＳＡ（高純度、アムレスコ（Amresco）、オハイオ州、米国）含有ＰＢＳ中のビオチン化ペプチドで３７℃で１６時間インキュベートし、次にフィコエリトリン（ＰＥ）−ストレプトアビジン（ジャクソン・イムノリサーチ（Jackson ImmunoResearch））で４℃で３０分間インキュベートした。次に試料をビオチン化抗ストレプトアビジン（１：６０、ベクターラボラトリーズ（Vector Laboratories）、バーリンゲーム（Burlingame）、カリホルニア州）でインキュベートし、さらにＰＥ−ストレプトアビジンでインキュベートした（すべて４℃で３０分間）。各インキュベーション後、細胞を冷ＰＢＳ／ＢＳＡ溶液で２回洗浄した。次にＦＡＣＳｏｒｔサイトメーターとセルクエスト（ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ）ソフトウェア（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、マンテンビュー（Mountain View）、カリホルニア州）を用いてフローサイトメトリーにより細胞を解析した。これらの実験で結合阻害のために３つの抗体を使用した：３４−５−３（抗−ＩＡb、ファルミンゲン（Pharmingen）、サンジエゴ、カリホルニア州）；ＭＫＤ６（抗−Ｉ−Ａd、ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson））および１０．３．６．２（抗−Ｉ−Ａｓ（ザンビル（Zamvil）ら、１９８８））。
例１．ペプチドの合成
ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）法（ケント（Kent）ら、１９８４；シュノルザー（Schnolzer）ら、１９９２）の製造業者のプロトコールを用いて自動合成機（アプライドバイオシステムズ（Aplied Biosystem）モデル４３０Ａ、ドイツ）で、式Ｉａ、IIａおよびIIIａの本発明の合成ペプチドならびに対照ペプチドを調製した。簡単に説明するとこの方法では、市販の側鎖保護アミノ酸を使用し、アミノ酸は各工程で少なくとも９９％の効率で加えた。保護基はペプチドから除去し、無水ＨＦを用いて樹脂から除去した。次に酢酸エチルまたは酢酸イソプロピルによる抽出とＨＰＬＣによりペプチドを精製した。次にこうして得られたペプチドＩａ、IIａおよびIIIａの純度をＨＰＬＣとアミノ酸分析により証明した。
本発明のペプチドIVａとＶａおよびペプチドＩａ〜Ｖａの類似体の調製のために、上記と同じ方法が使用できる。
次にペプチドＩａ、IIａおよびIIIａを、後述の例２〜１４に記載のようにその生物活性と他の特徴について解析した。試験しなかった他のペプチドも同じ解析ができることを理解されたい。
例２．ペプチドＩａとIIIａで免疫したマウスの血清中の抗ＤＮＡ抗体の検出
メスのＳＪＬ／ＪとＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）に、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）に乳化した２０μgの本発明のペプチドＩａまたはIIIａ、または対照ペプチドｐ２７８（ＰＣＴ国際出願ＷＯ９４／０３２０８号に記載のＰｅｐ２７８ｈと名付けたペプチド）またはｍＡｂ ５Ｇ１２を足蹠に免疫した。３週間後ＰＢＳ中の同量のペプチドまたはｍＡｂをマウスに追加免疫注射をした。次に２週間毎に血液を採取した。第５群は非免疫マウスを含有した。
図１は、追加免疫注射の３週間後のマウスの血清中の抗ＤＮＡ抗体を示し、後期に産生される自己抗体の量に非常によく似ている。
図１Ａに示すように、ペプチドIIIａで免疫したＳＪＬ／Ｊマウス（白丸）は高レベルの抗ＤＮＡ抗体を示し、これは全抗体５Ｇ１２（白四角）で免疫したマウスより高い。ペプチドＩａ（白菱形）、対照ペプチドｐ２７８（白三角）または正常非免疫マウス（十字をつけた四角）で免疫したＳＪＬ／Ｊマウスの血清では、低レベルの抗ＤＮＡ抗体が観察された。
図１Ｂに示すように、全抗体５Ｇ１２（白四角）またはペプチドＩａ（白菱形）で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスでは、血清中に抗ＤＮＡ抗体の存在を示す。しかしペプチドIIIａ（白丸）、ｐ２７８（白三角）のいずれかで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスまたは正常非免疫マウス（十字をつけた四角）の血清は、抗ＤＮＡ抗体の存在を示さなかった。
ＥＬＩＳＡを使用して、以下のようにマウスの血清中の抗ＤＮＡ抗体の存在を試験した：プレート（ヌンク（Nunc））を１０μg/mlのメチル化ＢＳＡで９０分間被覆した。次にプレートを洗浄（すべての洗浄はＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０（シグマ（Sigma））で３回行った）し、１０μg/mlの１本鎖ＤＮＡ（９０℃で１５分間加熱し急速に冷却した子牛胸腺ＤＮＡ（シグマ（Sigma））でさらに９０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＰＢＳ中１％オバルブミン（シグマ（Sigma））で一晩ブロッキングした。次にプレートを洗浄し、ブロッキング試薬で希釈したマウスの血清でインキュベートし、次に洗浄し、ペルオキシダーゼに結合した１：５００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃリセプター特異的）ポリクローナル抗体でインキュベートした。次にプレートを洗浄し、ＡＢＴＳ基質（シグマ（Sigma））で発色させ、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４１４nmで色を読んだ。結果は各マウス群（１群当たり５匹）の平均ＯＤとして表す。
例３．ペプチドＩａとIIIａで免疫したマウスの血清中の抗核抽出物（ＮＥ）抗体の検出
５群のマウスを例２に従って免疫し、その血清を抗ＮＥ抗体の存在について試験した。
図２Ａに示すように、ｍＡｂ ５Ｇ１２（白四角）またはペプチドIIIａ（白丸）で免疫したＳＪＬ／Ｊマウスは高レベルの抗ＮＥ抗体を産生し、一方ペプチドＩａ（白菱形）またはｐ２７８対照ペプチド（白三角）で免疫したマウスまたは正常非免疫マウス（十字をつけた四角）は、低レベルの抗ＮＥ抗体を産生した。
図２Ｂに示すように、ｍＡｂ ５Ｇ１２（白四角）またはペプチドＩａ（白菱形）で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスは高レベルの抗ＮＥ抗体を産生し、一方ペプチドIIIａ（白丸）で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清では非常に低レベルの抗ＮＥ抗体が検出された。ｐ２７８対照ペプチド（白三角）で免疫したマウスまたは正常非免疫マウス（十字をつけた四角）の血清では、抗ＮＥ抗体は検出されなかった。
ＥＬＩＳＡを使用して、以下のようにマウスの血清中の抗ＮＥ抗体の存在を試験した：プレート（ヌンク（Nunc））を５μg/mlのＨｅＬａ細胞ＮＥで９０分間被覆した。次にプレートを洗浄およびブロッキングし、翌日抗ＤＮＡ抗体について例２に記載のようにＥＬＩＳＡを続けた。
例４．ペプチドＩａとIIIａで免疫したマウスの血清中の抗ＲＮＰ、Ｓｍ、ＲｏおよびＬａ抗体の検出
抗ＲＮＰ、Ｓｍ、ＲｏおよびＬａ抗体の検出について、例２と３に記載のものと同じマウスの血清を使用した。
図３Ａに示すように、ペプチドIIIａ（線を引いた棒）で免疫したＳＪＬ／Ｊマウスは非常に高レベルの抗Ｒｏ抗体（ヒトのＳＬＥに典型的な抗体）を産生した。正常マウス（白い棒）または対照ペプチドｐ２７８（点々を入れた棒）に比較して、ペプチドIIIａ（線を引いた棒）のみでなくペプチドＩａ（黒い棒）で免疫したＳＪＬ／Ｊマウスでも、高レベルの抗ＲＮＰ、抗Ｓｍ、および抗Ｌａ抗体が検出された。
図３Ｂに示すように、ペプチドＩａ（黒い棒）またはペプチドIIIａ（線を引いた棒）で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスは高レベルの抗ＲＮＰ抗体を産生した。しかし血清中に検出可能な抗体を産生したペプチドＩａ（黒い棒）で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して、ペプチドIIIａ（線を引いた棒）で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスは非常に低レベルの抗Ｓｍ、抗Ｌａおよび抗Ｒｏ抗体を示した。
すでに被覆されたプレートとしてプレートを購入し、ＰＢＳ中１％オバルブミンで２時間ブロッキングした。次に前記例２のようにプレートを洗浄し、１：１０希釈血清で２重測定でインキュベートし、再度洗浄し、例２に記載のようにＥＬＩＳＡを行った。
例５．ペプチドＩａとIIIａで免疫したマウスのＳＬＥの臨床症状
ＢＡＬＢ／ｃとＳＪＬマウスをｍＡｂ ５Ｇ１２またはペプチドＩａとIIIａで免疫し、５ヶ月後ＳＬＥの２つの基準（白血球数（ＷＢＣ）とタンパク尿）でチェックした。
（ｉ）白血球数（ＷＢＣ）：マウスを出血させ、赤血球を排除するために血液を１％（容量／容量）酢酸で１：１０希釈し、通常の光学顕微鏡で白血球を計測した。
タンパク尿：マウスの尿をコンビスティックス（Combistix）（コンビスティックス（Combistix）キット、エームス（Ames））を用いてタンパク質の存在について試験した。尿中の高レベルのタンパク質は、ＳＬＥの典型的な症状である腎臓の損傷を示す。
ＷＢＣとタンパク尿の両方の結果を表１に示す。ｍＡｂ ５Ｇ１２またはペプチドＩａまたはIIIａで免疫したマウスは、非免疫マウスまたはｐ２７８対照ペプチドで免疫したマウスに比較して、ＷＢＣ数が少なかった。ｍＡｂ ５Ｇ１２で免疫したＢＡＬＢ／ｃとＳＪＬマウス、IIIａペプチドで免疫したＳＪＬマウスおよびＩａペプチドで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの尿では高レベルのタンパク質が測定されたが、対照ペプチドｐ２７８で免疫したマウス、IIIａで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＩａで免疫したＳＪＬマウスでは、タンパク質レベルのわずかな上昇が検出された。
例６．ペプチドに対するマウス応答の特異性
前例で示したように、全モノクローナル抗体での免疫と平衡して、ペプチドＩａとIIIａを異なるマウス系統のマウスの免疫のために使用した。流れ出るマウスのリンパ節は、マウス系統に依存して異なる程度に免疫性ペプチドに対して増殖した。すなわちＢＡＬＢ／ｃマウスはペプチドＩａに対して高応答動物であり、ＳＪＬマウスはペプチドIIIａに対して高応答動物であることが見いだされた。病原性自己抗体について使用したプロトコールを用いて、実験的ＳＬＥを誘導するために両方のペプチドを使用した。ペプチドIIIａで免疫したＳＪＬマウスとペプチドＩａで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスは、抗ＤＮＡ（図１）および抗ＮＥ抗体（図２）を含む高レベルの自己抗体を産生することが見いだされた。さらに、免疫されたマウスは、マウス抗ＤＮＡ、１６／６Ｉｄ＋病原性５Ｇ１２ ｍＡｂで実験的ＳＬＥを誘導したマウスと同様に白血球減少とタンパク尿（表１）を示した。ペプチドを注射したマウスの腎臓の解析では、マウスの一部に軽い免疫複合体沈着が証明された。これらの結果は、ペプチドＩａとIIIａが病原性自己抗体の全分子の重要なＴ細胞エピトープであることを示す。
本発明のペプチドとＴ細胞の間の相関を評価するために、ＳＪＬ起源のペプチドIIIａに特異的なＴ細胞株（ペプチドIIIａに対する高応答動物）を樹立した。この株のＴ細胞はペプチドIIIａに対して特異的に増殖したが、関連のない対照ペプチドｐ２７８に対しては増殖せず、ペプチドIIIａで刺激するとＴｈ１型サイトカイン（すなわち、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα）を分泌した。同系の健常マウスにＴ細胞株を注射すると自己抗体が産生され、実験的ＳＬＥを有するマウスに特徴的な臨床症状が発現した。これらの結果は、実験的ＳＬＥにおける本発明のＣＤＲベースのペプチドの役割を確認し、自己免疫疾患におけるペプチド特異的Ｔ細胞の役割を証明している。
例７．ペプチドＩａで寛容誘導しペプチドＩａまたはｍＡｂ ５Ｇ１２のいずれかで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清中の抗ＤＮＡ抗体および抗ＮＥ抗体の検出
ＳＬＥにおけるペプチドの役割をさらに解明するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスで寛容を誘導するためにペプチドＩａを使用した。新生児マウスにペプチドＩａまたは対照ペプチドを２回（１日目と３日目）注射した。すなわち、２４時間齢の新生児ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＰＢＳ中の１００μgのペプチドＩａまたは対照ペプチドｐ３０７（ＰＣＴ出願ＷＯ９４／００１４８号に記載されている重症筋無力症に関連するペプチド）を腹腔内（ｉｐ）に注射し、４８時間後同量のペプチドで第２回目の注射を行った。注射の６〜７週間後、ｍＡｂ ５Ｇ１２またはペプチドＩａで前記例２に記載のように免疫した。追加免疫の２週間後（および定期的に２週間毎に）にマウスを出血させて、マウスの血清を例１と２に記載のように抗ＤＮＡ抗体または抗ＮＥ抗体の存在について試験した。実験マウスの血清中のこれらの自己抗体力価を測定するために行った測定は、ペプチドＩａで寛容誘導したマウスはＤＮＡまたは核抽出物抗原に対して高力価の抗体を産生せず、ペプチドＩａまたはｍＡｂ ５Ｇ１２で免疫する前に対照ペプチド３０７に対して寛容誘導したマウスは、高い自己抗体力価を示した。
図４Ａ〜Ｂに示すように、ペプチドＩａで寛容誘導し次にｍＡｂ ５Ｇ１２で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス（半分黒い四角）、またはペプチドＩａで寛容誘導し次に同じペプチドＩａで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス（黒四角）は、関連の無いペプチドｐ３０７で寛容誘導し次にｍＡｂ ５Ｇ１２で免疫したマウス（黒三角）、またはペプチド３０７で寛容誘導し次にペプチドＩａで免疫したマウス（黒丸）に比較して、低レベルの抗ＤＮＡ抗体と抗ＮＥ抗体を産生した。
これは、ペプチドＩａによる新生児寛容は、ペプチドＩａまたはｍＡｂ ５Ｇ１２で後に免疫したマウスの血清中の自己抗体のレベルを低下させることを示す。
例８．ＣＤＲベースのペプチドＩａとIIIａに対するリンパ節細胞（ＬＮＣ）増殖応答のインビボ阻害
ＢＡＬＢ／ｃ（図５ａ）とＳＪＬ（図５ｂ）マウスを、それぞれペプチドＩａとIIIａ（ＣＦＡ中２０μg/マウスを後ろ足に）を免疫した。また免疫の３日後（白四角）、免疫の日（白丸）または両方の日（白三角）に、ＰＢＳ中の上記ペプチド２００μgをマウスに静脈内注射した。１０日後マウスを屠殺し、リンパ節を取り出し、異なる濃度の免疫ペプチドの存在下で増殖を試験した。対照群は、免疫したが処理しなかったマウス（黒四角）、または対照ペプチドｐ３０７で処理したマウス（半分黒い四角）から取ったＬＮＣである。培養物混合物を、１％正常マウス血清を含有する強化ＲＰＭＩ培地中で９６時間インキュベートしてから3Ｈ−チミジンを添加した。１６時間後細胞を採取し、放射能を計測した。結果は３重測定の平均ｃｐｍとして表す。ＳＤ値は１０％を越さなかった。
図５ａ〜ｂに示すように、ペプチドＩａ（５ａ）とIIIａ（５ｂ）は免疫の３日前または免疫の日に注射するとＢＡＬＢ／ｃおよびＳＪＬマウスのＬＮＣの増殖応答を阻害した。細胞の増殖能力の最大９５％がペプチドにより阻害された。ＣｏｎＡに対するＬＮＣの増殖応答はペプチドＩａとIIIａにより阻害されなかった（データは示していない）ため、この阻害は特異的であった。
例９．ｍＡｂ ５Ｇ１２で免疫しペプチドＩａとIIIａで処理したマウスのＬＮＣ増殖のインビボ阻害
ＢＡＬＢ／ｃ（図６ａ）とＳＪＬ（図６ｂ）マウスを、ｍＡｂ ５Ｇ１２（ＣＦＡ（同上）中２０μg/マウスを後ろ足に）で免疫し、それぞれペプチドＩａまたはIIIａを注射（ＰＢＳ中２００μg/マウスを静脈内に）した。また免疫し処理しなかったマウス（黒四角）、免疫と同時に対照ペプチドｐ３０７で処理したマウス（半分黒い四角）またはＣＤＲベースのペプチドＩａ（６ａ）またはIIIａ（６ｂ）で処理したマウス（白四角）から取ったＬＮＣ中で、ｍＡｂ ５Ｇ１２に対する増殖性応答を測定した。未処理マウス（黒丸）またはＣＤＲベースのペプチドＩａまたはIIIａで処理したマウス（白丸）から取ったＬＮＣ中の、免疫優性ＣＤＲベースのペプチドＩａとIIIａに対する増殖性応答も測定した。結果は３重測定の平均ｃｐｍとして表す。ＳＤ値は１０％を越さなかった。
図６ａ〜ｂに示すように、適切なＣＤＲベースのペプチドで処理したマウスから取ったＬＮＣのｍＡｂ ５Ｇ１２に対する増殖性応答は、未処理マウスの応答に比較して阻害された。
例１０．ヒトモノクローナル抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ抗体に対するＬＮＣ増殖のインビボ阻害
ＢＡＬＢ／ｃ（図７ａ）とＳＪＬ（図７ｂ）マウスを、ヒトｍＡｂ １６／６Ｉｄ（ＣＦＡ（同上）中１μg/マウスを後ろ足に）で免疫し、それぞれペプチドＩａまたはIIIａを注射（ＰＢＳ中２００μg／マウスを静脈内に）した。また免疫したが処理しなかったマウス（黒四角）、免疫と同時に対照ペプチドｐ３０７で処理したマウス（半分黒い四角）または適切なＣＤＲベースのペプチドＩａまたはIIIａで処理したマウス（白四角）から取ったＬＮＣ中で、ｍＡｂ １６／６Ｉｄに対する増殖性応答を測定した。１６／６Ｉｄ免疫した未処理マウス（黒丸）または適切なＣＤＲベースのペプチドＩａとIIIａで処理したマウス（白丸）から取ったＬＮＣの適切な免疫優性ＣＤＲベースのペプチドＩａまたはIIIａに対しても、増殖性応答が示された。結果は３重測定の平均ｃｐｍとして表す。ＳＤ値は１０％を越さなかった。
図７ａ〜ｂに示すように、適切なＣＤＲベースのペプチドＩａまたはIIIａで処理したマウスから取ったＬＮＣのｍＡｂ １６／６Ｉｄに対する増殖性応答は、免疫したが未処理のマウスまたは対照ペプチドｐ３０７で処理したマウスの応答に比較して阻害された。
例１１．脾臓抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面へのＣＤＲベースのペプチドＩａとIIIａの結合
ＢＡＬＢ／ｃ、ＳＪＬ、Ｃ３Ｈ．ＳＷまたはＣ５７ＢＬ／６マウスから単離された脾臓吸着細胞（１０６／１００μl／試験管）を、ビオチン化ＣＤＲベースのペプチドＩａまたはIIIａとともに１６時間インキュベートして、次にＰＥ−ストレプトアビジンと４℃で３０分インキュベートした。次に試料をビオチン化抗ストレプトアビジンでインキュベートし、さらにＰＥ−ストレプトアビジンとインキュベートした（すべて４℃で３０分）。洗浄後、細胞をＦＡＣＳｏｒｔサイトメーターとセルケスト（ＣＥＬＬＱｅｓｔ）ソフトウェアを用いて解析した。
結果を図８に示す：ビオチン化ＣＤＲベースのペプチドとインキュベートした細胞の染色を実線で示し、非ビオチン化ペプチドによるバックグランド染色を破線で示す。試験したマウス系統（ＳＬＥの誘導に耐性であるＣ５７ＢＬ／６マウスを除く）から得られた脾臓抗原提示細胞は、ＭＨＣクラスII産物へのＣＤＲベースのペプチドＩａとIIIａの有意の結合を示し、その結合能力がマウス系統のＳＬＥ誘導へのかかり安さと一致することを示している。
ＡＰＣへのＣＤＲベースのペプチドＩａとIIIａの結合は、本明細書の材料と方法に記載のように測定し、その結果を表２に示す。ペプチドＩａとIIIａとわずかにそれぞれ１９．３％と８．５％の結合を示したＣ５７ＢＬ／６系統からのＡＰＣを除いて、結合率はすべての系統について３８〜５３％であった。結合は関連する抗Ｉａ抗体により阻害され、ＭＨＣクラスII産物への結合の特異性を示していた。結果を表３に示す：結合の阻害は特異的であり、６０％〜１００％の範囲であった。
例１２．ＳＬＥ患者および健常人対照の血清中のペプチドＩａ、IIａおよびIIIａに対する抗体および抗１６／６Ｉｄ抗体の検出
ヒトＳＬＥ患者（３２名）を出血させて、その血清についてペプチドＩａ、IIａおよびIIIａ、対照ペプチドｐ１９５−２１２（ＰＣＴ公報ＷＯ９４／００１４８号に記載の筋無力性ペプチド）またはｍＡｂ ５Ｇ１２への結合能力をＥＬＩＳＡにより試験した。
ＰＢＳ中１０μg/mlのペプチドＩａ、IIａ、IIIａまたはｐ１９５−２１２またはｍＡｂ ５Ｇ１２で２時間被覆し、洗浄し、ＰＢＳ中１％オバルブミンでさらに２時間ブロッキングしたプレート上で、抗体の検出を行った。ペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体を用いて、前記例２でブロッキング後に記載のようにＥＬＩＳＡを続けた。
図９に示すように、健常人対照（ペプチドＩａ−健常、黒菱形；ペプチドIIａ−健常、十字を付けた丸；ペプチドIIIａ−健常、逆さの白三角；５Ｇ１２−健常、半分黒い四角）に比較して、ＳＬＥ患者は有意に高レベルのペプチドＩａ（白四角）、IIａ（白菱形）またはIIIａ（白丸）、またはｍＡｂ ５Ｇ１２（白三角）に結合する抗体を示した。関連のないペプチドｐ１９５−２１２で被覆したプレート上で患者血清または対照血清を試験した時、結合は観察されなかった（ｐ１９５−２１２−ＳＬＥ、十字を付けた四角；ｐ１９５−２１２−健常、半分黒い菱形）。結果は、抗体力価のレベルについて全抗体分子とＣＤＲベースのペプチドとの相関を示す。
例１３．ヒト１６／６Ｉｄ ｍＡｂとペプチドの存在下でのＳＬＥ患者と健常人対照からのＰＢＬの増殖
ＳＬＥ患者または健常人対照の血液からフィコール勾配を使用して末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を単離した。次に異なる濃度のペプチドＩａ、IIａもしくはIIIａまたはヒト１６／６Ｉｄ ｍＡｂの存在下で２４時間インキュベートし、ＩＬ−２測定のために試料を採取した。測定は合計７日間行い、最後の１６時間に3Ｈ−チミジンを添加した。細胞のＤＮＡに取り込まれた放射能の量を読んで増殖を検出した。
図４に示すように、健常人対照に比較してＳＬＥ患者から取ったＰＢＬの低比率がペプチドまたは１６／６Ｉｄ ｍＡｂと反応した。結果は応答動物の割合（第１行では３４％）と患者の実際の数（３２のうち１１名：１１／３２）で表す。
ペプチドまたは１６／６Ｉｄの存在下でＰＢＬにより産生されるＩＬ−２のレベルを試験すると、以下の例に示すように同様の結果が得られた。
例１４．ヒトｍＡｂ １６／６Ｉｄとペプチドの存在下でのＳＬＥ患者と健常人対照のＰＢＬによるＩＬ−２の産生
フィコール勾配を使用してＳＬＥ患者または健常人対照の血液からＰＢＬを単離し、例１３に記載のようにインキュベートした。測定の開始後５０μlの試料を取り、ＩＬ−２感受性細胞（ＣＴＬＤ）の存在下で２４時間インキュベートし、その後3Ｈ−チミジンを１６時間加え、プレートを採取し、ベータカウンターで計測した。
表４に示すように、健常人対照に比較した場合ＳＬＥ患者から取ったＰＢＬの低比率がペプチドまたは１６／６Ｉｄ ｍＡｂと反応し、ペプチドに対する応答が病原性ヒト抗体に対する患者のＴ細胞の応答に対応することを示している。
文献
配列リスト
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）宛名：イエーダ・リサーチ・アンド・デベロップメント社（YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD.）
（Ｂ）通り：ピー・オー・ボックス９５（P.O. Box95）
（Ｃ）市：レホボット（Rehovot）
（Ｅ）国：イスラエル
（Ｆ）郵便番号：７６１００
（Ｇ）電話番号：０１１−９７２−８−４７０６１８
（Ｈ）ファックス番号：０１１−９７２−８−４７０７３９
（Ｉ）テレックス番号：３８１３００
（Ａ）宛名：モーゼ、エドナ（Mozes, Edna）
（Ｂ）通り：５１ ハナシ・ハリション・ストリート（Hanassi Harishon Street）
（Ｃ）市：レホボット（Rehovot）
（Ｅ）国：イスラエル
（Ｆ）郵便番号：７６３０３
（Ａ）宛名：ワイスマン、アリ（Waisman, Ari）
（Ｂ）通り：２９Ｂ メーズ・ストリート（Maze Street）
（Ｃ）市：テルアビブ
（Ｅ）国：イスラエル
（Ｆ）郵便番号：６５２１４
（Ａ）宛名：リクス、アビゲール（RYCUS, Avigail）
（Ｂ）通り：１６キプニス・ストリート（Kipnis Street）
（Ｃ）市：レホボット（Rehovot）
（Ｅ）国：イスラエル
（Ｆ）郵便番号：７６３０５
（ii）発明の名称：全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）治療用の合成ペプチドおよびこれを含有する薬剤組成物
（iii）配列の数：１０
（iv）コンピューターで読める形式：
（Ａ）媒体の型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣコンパチブル
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃１．０（PatentIn Release#1.0）、バージョン＃１．３０（ＥＰＯ）
（vi）先行出願のデータ
（Ａ）出願番号：ＩＬ １１３，１５９
（Ｂ）出願日：１９９５年３月２８日
（２）配列番号：１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：／注＝５位のＸaaはＭｅｔ、ＡｌａまたはＶａｌであり、６位のＸaaはＧｌｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＡｒｇであり、７位のＸaaはＴｒｐまたはＡｌａであり、８位のＸaaはＶａｌまたはＳｅｒであり、そして９位のＸaaはＬｙｓ、ＧｌｕまたはＡｌａである。
（xi）配列：配列ＩＤ Ｎｏ．１：
（２）配列番号：２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：／注＝９位のＸaaはＴｈｒ、ＶａｌまたはＡｌａであり、１０位のＸaaはＴｈｒ、ＶａｌまたはＡｌａであり、１１位のＸaaはＴｙｒまたはＰｈｅであり、１２位のＸaaはＡｓｎまたはＡｓｐであり、１３位のＸaaはＧｌｎまたはＧｌｕであり、１４位のＸaaはＬｙｓまたはＧｌｕであり、そして１５位のＸaaはＰｈｅまたはＴｙｒである。
（xi）配列：配列ＩＤ Ｎｏ．２：
（２）配列番号：３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：／注＝６位のＸaaはＰｈｅ、ＴｈｒまたはＧｌｙであり、７位のＸaaはＬｅｕ、ＡｌａまたはＳｅｒであり、８位のＸaaはＴｒｐまたはＡｌａであり、９位のＸaaはＧｌｕまたはＬｙｓであり、１３位のＸaaはＭｅｔまたはＡｌａであり、そして１４位のＸaaはＡｓｐ、ＬｙｓまたはＳｅｒである。
（xi）配列：配列ＩＤ Ｎｏ．３：
（２）配列番号：４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：／注＝４位のＸaaはＭｅｔまたはＡｌａであり、５位のＸaaはＡｓｎ、ＡｓｐまたはＡｒｇであり、６位のＸaaはＴｒｐまたはＡｌａであり、７位のＸaaはＶａｌまたはＳｅｒであり、８位のＸaaはＬｙｓまたはＧｌｕであり、９位のＸaaはＧｌｎまたはＡｌａであり、１３位のＸaaはＬｙｓまたはＧｌｕであり、そして１４位のＸaaはＳｅｒまたはＡｌａである。
（xi）配列：配列ＩＤ Ｎｏ．４：
（２）配列番号：５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：／注＝６位のＸaaはＳｅｒまたはＰｈｅであり、７位のＸaaはＧｌｙまたはＡｌａであり、８位のＸaaはＡｒｇ、ＡｌａまたはＧｌｕであり、１１位のＸaaはＡｓｎまたはＡｓｐであり、１２位のＸaaはＴｙｒまたはＰｈｅであり、そして１４位のＸaaはＴｒｐ、ＨｉｓまたはＡｌａである。
（xi）配列：配列ＩＤ Ｎｏ．５：
（２）配列番号：６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列：配列ＩＤ Ｎｏ．６：
（２）配列番号：７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列：配列ＩＤ Ｎｏ．７：
（２）配列番号：８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列：配列ＩＤ Ｎｏ．８：
（２）配列番号：９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列：配列ＩＤ Ｎｏ．９：
（２）配列番号：１０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列：配列ＩＤ Ｎｏ．１０：
本発明は、ヒトの全身性エリテマトーデス治療に有用な合成ペプチドおよびこれを含有する薬剤組成物に関する。
発明の背景
自己免疫疾患は、自己抗原に対する免疫応答により特徴付けられる。この応答は、自己反応性Ｔリンパ球の継続的な活性化により維持される。Ｔリンパ球は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面上の自己の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子産物との複合体としての外来および／または自己抗原の認識により、特異的に活性化される。
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、その起源および治療法が不明の自己免疫疾患である。ＳＬＥの誘導と進展を引き起こしている機構についての広範な研究にもかかわらず、一方ではＳＬＥ患者の不均一性と、他方では疾患の誘導を調節できる実験モデルがないために、この疾患の病因についての情報は非常に限定されている。
ＳＬＥの原因は不明であり、多様な臨床症状を示す。さらに、ＳＬＥの予防または治療を目指した具体的な治療法はない。ＳＬＥの誘導を引き起こしている機構についての広範な研究にもかかわらず、この疾患の病因についての情報は非常に限定されている。ＳＬＥに関する研究は、最近まで異なる臨床段階で種々の治療プロトコール下の患者の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を用いて行われてきた。あるいは、自発性ＳＬＥ様の疾患を示すマウス系統が、ＳＬＥのモデルとして研究された。この種の分析は主に、一方では患者の不均一性と、他方ではマウスＳＬＥ系統の疾患の誘導相の調節が不可能なため、疾患の誘導または維持における種種の免疫学的および非免疫学的因子の役割の解釈を不完全で混乱するものとした。
数年前、本発明者の一人の研究室で、ＳＬＥの動物モデルが樹立された。イディオタイプネットワークの概念に基づくこのモデルは、広範囲のループス関連自己抗体と臨床症状を示した（メンドロビック（Mendlovic）ら、１９８８）。誘導は、自発的自己免疫疾患を示さないマウス系統を、１６／６Ｉｄと呼ぶ共通イディオタイプ（シェーンフェルト（Shoenfeld）ら、１９８３）を有するヒト抗ＤＮＡモノクローナル抗体（ｍＡｂ）で免疫して行った。免疫後、マウスは１６／６Ｉｄに特異的な抗体、１６／６Ｉｄを有する抗体、および異なる核抗原（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、Ｓｍ、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、Ｒｏ、Ｌａなど）に対する抗体を産生した。血清学的知見は、白血球減少、赤血球沈降速度の上昇、タンパク尿、腎臓中の免疫複合体の増加および糸球体の硬化（メンドロビック（Mendlovic）ら、１９８８）であり、これらはＳＬＥの典型的な症状である。本発明者らはさらに、この実験的疾患が、マウス抗１６／６ＩｄｍＡｂ（メンドロビック（Mendlovic）ら、１９８９）およびマウス抗−抗１６／６Ｉｄ（１６／６Ｉｄ＋）ｍＡｂ（ワイスマン（Waisman）ら、１９９３）により誘導できることを証明した。疾患の誘導は遺伝学的に制御されており、従って系統に依存する（メンドロビック（Mendlovic）ら、１９９０）。この実験的ＳＬＥ誘導のためのユニークなモデルは、ＳＬＥの誘導と進展に関与する異なる工程および関連する免疫パラメータを明確に区別する手段を与える。
ＳＬＥは、ＤＮＡ、Ｓｍ、Ｒｏ、Ｌａ、ＲＮＰ、カルジオリピンおよびヒストンのような自己抗原に対する自己抗体の生成を特徴とする。ＳＬＥの病因は不明であるが、これらの自己抗原が発生する機構を理解することは、この問題に対する情報を与えるかも知れない。この目的のために本発明者らは、実験的ＳＬＥを誘導したＣ３Ｈ．ＳＷマウスから得た種々のモノクローナル自己抗体を産生させた。概して、１６／６Ｉｄを有するかまたはこれと反応する抗体を誘発することができるモノクローナル自己抗体は、病原性があり、従って実験的ＳＬＥを誘導することができることが見いだされた（フリッケ（Fricke）ら、１９９０；ステーガー（Sthoeger）ら、１９９３）。後に、実験的ＳＬＥを有するＣ３Ｈ．ＳＷマウスから単離したＤＮＡまたはＨｅｌａ核抽出物（ＮＥ）に結合する９つの自己抗体の可変（Ｖ）領域の配列が決定された（ワイスマン（Waisman）とモーゼス（Mozes）、１９９３）。異なる自己抗体間の関係を求めるために、異なる特異性を有するモノクローナル抗体が分析された。３つのｍＡｂがＤＮＡに結合することが見いだされ、病原性抗ＤＮＡ抗体に特徴的な配列を示すことが示された。これらのｍＡｂの１つである２Ｃ４Ｃ２は、ループスに罹りやすいマウス、すなわち（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ1から単離した抗ＤＮＡ ｍＡｂのＶＨと同一の重（Ｈ）鎖Ｖ領域遺伝子（ＶH）を利用することが証明された。ｍＡｂ ２Ｃ４Ｃ２の軽（Ｌ）鎖Ｖ領域遺伝子（ＶL）は、これも（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ1から単離された別の抗ＤＮＡ ｍＡｂのＶLと９８％の相同性がある。他の２つの抗ＤＮＡ ｍＡｂ（５Ｇ１２−４と５Ｇ１２−６と呼ぶ）は、ｍＡｂ ２Ｃ４Ｃ２のＶH配列と９３％を共有する。６つのｍＡｂは、ＨｅＬａ ＮＥのタンパク質に結合した。この９つのｍＡｂは、全部で５つのＶHと４つのＶL生殖細胞系遺伝子を使用し、実験的ＳＬＥを有するマウスで誘導した自己抗体は、１つのＢ細胞クローンに由来するのではないことを証明している。９つのＶHとＶLのうち３つは、生殖細胞系遺伝子と配列が同一であり、別の少なくとも３つは体細胞突然変異を有していた。後者は、これらの自己抗体が、既存（免疫前）のＢ細胞の使用により、および抗原が支配するプロセスにより、マウスで発生することを示唆する。さらに、実験的ＳＬＥを有するマウスで見いだされる自己抗体は、自発的にループスを発症するマウス系統から単離されるｍＡｂにより使用されるものと同様の遺伝要素を使用するようである。
Ｔ細胞は、実験的ＳＬＥの誘導と進展に重要な役割を果たす。すなわち１６／６Ｉｄに特異的なＴ細胞株およびクローンは、１６／６抗体と同様に、同系の受容体における実験的ＳＬＥを誘導することが証明された。従ってこの株の活性化細胞の接種後、マウスは、ＳＬＥに典型的な血清学と腎障害を発症した（フリッケ（Fricke）ら、１９９１）。さらに、Ｃ３Ｈ．ＳＷ起源の１６／６Ｉｄ特異的Ｔ細胞株は、１６／６Ｉｄまたは抗１６／６Ｉｄ ｍＡｂ（メンドロビック（Mendlovic）ら、１９９０）を注射後ＳＬＥの誘導に耐性であることが証明されたＣ５７ＢＬ／６マウスでＳＬＥを誘導した。
１６／６Ｉｄの病原性領域を同定するために、１６／６Ｉｄ ｍＡｂのＦ(ab')2断片を調製し、これが全１６／６Ｉｄ分子の特異性と病原性を保持することが見いだされた（ルイズ（Ruiz）ら、１９９４）。
実験的ＳＬＥを有するマウスから単離され、ＤＮＡに結合し１６／６Ｉｄを有することが証明されたｍＡｂ ５Ｇ１２は、マウスで実験的ＳＬＥを誘導することができる（ワイスマン（Waisman）ら、１９９３）。増殖によりｍＡｂに特異的に反応するＴ細胞は、おそらく相補性決定領域（ＣＤＲ）からの配列を示すペプチドに反応している。同じ定常領域を有するが異なる特異性を有する他の抗体とは反応しないため、Ｔ細胞は上記抗体のＶ領域を認識する可能性が高い。可変領域内で、ＣＤＲは種々の抗体の間で最も大きく異なる領域であるため、認識される可能性が最も高い領域はＣＤＲである。マウスでＳＬＥを誘導する前述の９つの病原性マウスｍＡｂのＶH配列のＣＤＲ領域は、ワイスマン（Waisman）とモーゼス（Mozes）、１９９３、の図１で四角で囲ってあり、そこでは９つのｍＡｂのＶＨの完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列が提示されている。
発明の要約
本発明の目的は、ＳＬＥ患者の具体的な治療のために手段を提供することである。
この目的のために、本発明は、実験的ＳＬＥを有するマウスから単離された病原性モノクローナル自己抗体のＣＤＲ領域に基づくペプチドおよびその類似体を提供する。
すなわち１つの面において本発明は、
（ｉ）マウスで全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）様疾患を誘導する病原性抗ＤＮＡモノクローナル抗体の重鎖または軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）に基づく少なくとも１２個かつ多くとも３０個のアミノ酸残基のペプチド（以後、ＣＤＲベースのペプチド）、その塩または化学的誘導体；
（ii）（ｉ）で定義したＣＤＲベースのペプチドの類似体、その塩または化学的誘導体；
（iii）直接または短い結合鎖を介してたがいに共有結合した（ｉ）の２つのペプチドまたは（ii）の２つの類似体からなる２重合成ペプチド；
（iv）ペプチド（ｉ）またはその類似体（ii）の複数の配列からなるペプチドポリマー；および
（ｖ）巨大分子担体に結合したペプチドポリマー（iv）
よりなる群から選択される合成ペプチドに関する。
この面の１つの実施態様において、合成ペプチドは、
（ｉ）ＳＬＥ誘導性の自己抗体に対する高応答動物であるマウスのＴリンパ球の増殖性応答およびサイトカイン分泌を特異的に阻害することができるか、または
（ii）病原性自己抗体によるＳＬＥ誘導に対して感受性であるマウスのＳＬＥの進展を阻害することができる。
本発明の合成ペプチドおよびその類似体は、本明細書の配列Ｉ〜Ｖを有するペプチドよりなる群から選択され、ここで
（ｉ）配列Ｉのペプチドは、式：
ＴＧＹＹＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＳＰＥＫＳＬＥＷＩＧ ［Ｉ］
（式中、Ｘ1はＭｅｔ、ＡｌａまたはＶａｌであり、Ｘ2はＧｌｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＡｒｇであり、Ｘ3はＴｒｐまたはＡｌａであり、Ｘ4はＶａｌまたはＳｅｒであり、そしてＸ5はＬｙｓ、ＧｌｕまたはＡｌａである）を有し、
（ii）配列IIのペプチドは、式：
ＥＩＮＰＳＴＧＧＸ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＫＡＫＡＴ ［II］
（式中、Ｘ6とＸ7は各Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＡｌａであり、Ｘ8はＴｙｒまたはＰｈｅであり、Ｘ9はＡｓｎまたはＡｓｐであり、Ｘ10はＧｌｎまたはＧｌｕであり、Ｘ11はＬｙｓまたはＧｌｕであり、そしてＸ12はＰｈｅまたはＴｙｒである）を有し、
（iii）配列IIIのペプチドは、式：
ＹＹＣＡＲＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16ＰＹＡＸ17Ｘ18ＹＷＧＱＧＳ ［III］
（式中、Ｘ13はＰｈｅ、ＴｈｒまたはＧｌｙであり、Ｘ14はＬｅｕ、ＡｌａまたはＳｅｒであり、Ｘ15はＴｒｐまたはＡｌａであり、Ｘ16はＧｌｕまたはＬｙｓであり、Ｘ17はＭｅｔまたはＡｌａであり、そしてＸ18はＡｓｐ、ＬｙｓまたはＳｅｒである）を有し、
（iv）配列IVのペプチドは、式：
ＧＹＮＸ19Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＳＨＧＸ25Ｘ26ＬＥＷＩＧ ［IV］
（式中、Ｘ19はＭｅｔまたはＡｌａであり、Ｘ20はＡｓｎ、ＡｓｐまたはＡｒｇであり、Ｘ21はＴｒｐまたはＡｌａであり、Ｘ22はＶａｌまたはＳｅｒであり、
Ｘ23はＬｙｓまたはＧｌｕであり、Ｘ24はＧｌｎまたはＡｌａであり、Ｘ25はＬｙｓまたはＧｌｕであり、そしてＸ26はＳｅｒまたはＡｌａである）を有し、そして
（ｖ）配列Ｖのペプチドは、式：
ＹＹＣＡＲＸ27Ｘ28Ｘ29ＹＧＸ30Ｘ31Ｘ32ＧＱＧＴＬ ［Ｖ］
（式中、Ｘ27はＳｅｒまたはＰｈｅであり、Ｘ28はＧｌｙまたはＡｌａであり、Ｘ29はＡｒｇ、ＡｌａまたはＧｌｕであり、Ｘ30はＡｓｎまたはＡｓｐであり、Ｘ31はＴｙｒまたはＰｈｅであり、そしてＸ32はＴｒｐ、ＨｉｓまたはＡｌａである）を有する。
好適な実施態様において、ペプチドＩ〜Ｖは配列Ｉａ〜Ｖａ：
ＴＧＹＹＭＱＷＶＫＱＳＰＥＫＳＬＥＷＩＧ （Ｉａ）
ＥＩＮＰＳＴＧＧＴＴＹＮＱＫＦＫＡＫＡＴ （IIａ）
ＹＹＣＡＲＦＬＷＥＰＹＡＭＤＹＷＧＱＧＳ （IIIａ）
ＧＹＮＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧ （IVａ）
ＹＹＣＡＲＳＧＲＹＧＮＹＷＧＱＧＴＬ （Ｖａ）
を有する。
ペプチドＩａ〜IIIａは、ｍＡｂ ５Ｇ１２のＶH鎖のそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に基づき、ペプチドIVａとＶａは、ｍＡｂ ２Ｃ４Ｃ２のＶH鎖のそれぞれＣＤＲ１およびＣＤＲ３に基づく（ワイスマン（Waisman）とモーゼス（Mozes）、１９９３）。
別の面において本発明は、本発明の合成ペプチドまたはペプチドポリマーおよび薬剤学的に許容される担体からなる、ＳＬＥの治療のための薬剤組成物に関する。
さらに別の面において本発明は、本発明の合成ペプチドまたはペプチドポリマーの有効量をＳＬＥ患者に投与することよりなる、ＳＬＥ患者の治療方法に関する。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ〜Ｂは、ｍＡｂ ５Ｇ１２、ペプチド１ａとIIIａおよび対照ペプチド２７８で免疫したかまたは免疫していないＳＪＬ（１Ａ）およびＢＡＬＢ／ｃ（１Ｂ）マウスの血清中の抗ＤＮＡ抗体の存在を示す。記載した抗原のいずれか１つで免疫し、追加免疫注射の３ヶ月後に採取した各ＳＪＬまたはＢＡＬＢ／ｃマウスの血清、および年齢の一致した免疫していないマウスの血清を、抗ｓｓＤＮＡ抗体の力価について試験した。希釈した血清とインキュベートした後、ペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）を加えた。結果を、各マウス群の平均ＯＤとして示した。
図２Ａ〜Ｂは、図１と同じ抗原で免疫したＳＪＬ（２Ａ）およびＢＡＬＢ／ｃ（２Ｂ）マウスの血清中のＨｅＬａ抗核抽出物（ＮＥ）抗体の存在を示す。
図３Ａ〜Ｂは、ペプチドＩａとIIIａまたは対照ペプチド２７８で免疫したＳＪＬ（３Ａ）およびＢＡＬＢ／ｃ（３Ｂ）マウスおよび正常マウスの血清中の、抗ＲＮＰ、Ｓｍ、ＲｏおよびＬａ抗体の存在を示す。
図４Ａ〜Ｂは、ペプチドＩａまたは対照ペプチドｐ３０７で寛容誘導し、ペプチドＩａまたはｍＡｂ ５Ｇ１２で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清中の抗ＤＮＡ（４Ａ）および抗ＨｅＬａ ＮＥ（４Ｂ）抗体の存在を示す。
図５ａ〜ｂは、ＣＤＲベースのペプチドIIIａで治療後の、それぞれＩａとIIIａに対するＢＡＬＢ／ｃ（５ａ）とＳＪＬ（５ｂ）マウスにおける、リンパ節細胞（ＬＮＣ）増殖応答のインビボ阻害を示す。
図６ａ〜ｂは、それぞれペプチドＩａとIIIａで治療したＢＡＬＢ／ｃ（６ａ）またはＳＪＬ（６ｂ）マウス中のｍＡｂ ５Ｇ１２に対するＬＮＣのインビボ阻害を示す。
図７ａ〜ｂは、それぞれペプチドＩａとIIIａで治療したＢＡＬＢ／ｃ（７ａ）またはＳＪＬ（７ｂ）マウス中のヒトモノクローナル抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ抗体に対するＬＮＣ増殖のインビボ阻害を示す。
図８は、異なるマウス系統の脾臓抗原提示細胞の表面へのペプチドＩａとIIIａの結合を示す。
図９は、ペプチドＩａ、IIａおよびIIIａ、またはｍＡｂ ５Ｇ１２または対照ペプチドに結合する能力について血清を試験することによる、ＳＬＥ患者および健常人対照の血清中の抗体力価を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、実験的ＳＬＥを有するマウスから単離されたモノクローナル病原性自己抗体のＣＤＲに基づく合成ペプチドに関する。このようなモノクローナル抗体は、例えば抗１６／６Ｉｄ ｍＡｂで免疫したＣ３Ｈ．ＳＷマウスの脾臓細胞をＸ６３．６５３形質細胞腫細胞と融合して産生されるハイブリドーマの上清から得られる（ワイスマン（Waisman）とモーゼス（Mozes）、１９９３）。
このようなペプチドの例は、それぞれｍＡｂ ５Ｇ１２の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、およびｍＡｂ ２Ｃ４Ｃ２（ワイスマン（Waisman）とモーゼス（Mozes）、１９９３）の重鎖のＣＤＲ１とＣＤＲ３領域、およびその類似体に基づく、本明細書の式Ｉａ〜Ｖａのものである。
本発明で企図される親ペプチドＩａ〜Ｖａの類似体は、本明細書に記載の置換、欠失および付加類似体がある。置換類似体は異なる位置でアミノ酸置換を有し、これらの置換は、アミノ酸の大きさ、疎水性−親水性パターンおよび電荷に基づいて作成される。
アミノ酸は、大きさ、疎水性−親水性パターンおよび電荷によって分類される。大きさについては、最も大きいアミノ酸はＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＭｅｔおよびＨｉｓであり、最も小さいものはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、ＴｈｒおよびＰｒｏであり、他のものはその中間であることは、当業者には容易に理解できるであろう。
疎水性−親水性パターンについては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＭｅｔおよびＴｒｐは疎水性であり、残りのすべてが親水性であることは公知である。親水性アミノ酸のうち、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、およびＴｙｒは電荷がなく、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＨｉｓおよびＡｓｎは陽性電荷を有し、ＡｓｐとＧｌｕは陰性電荷を有する。
ＳＬＥ誘導性自己抗体に対する高応答動物であるマウスのＴリンパ球の増殖性応答を阻害する能力について試験されるペプチドを選択する場合、置換体は累積して、非置換親ペプチドの対応する部分の大きさ、疎水性−親水性パターンおよび電荷を実質的に変化させないものから選択することが重要である。すなわち、全体の作用が、対応する非置換親ペプチドの大きさ、疎水性−親水性パターンおよび電荷を実質的に変化させない限り、疎水性残基は親水性残基で置換してもよく、またはその逆を行っても良い。
ペプチドおよびその類似体の他の修飾も本発明において企図されることは理解すべきである。すなわち、本発明のペプチドまたは類似体は、Ｔ細胞増殖性応答および自己免疫疾患を防止または阻害するのに利用できるペプチドの機能の少なくとも一部を保持するその「化学的誘導体」も含む。
本発明のペプチドまたは類似体の「化学的誘導体」は、通常はペプチドの一部ではない追加の化学的残基を含有する。ペプチドの共有結合的修飾は、本発明の範囲に含有される。このような修飾は、ペプチドの標的アミノ酸残基を、選択する側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることにより、分子中に導入することができる。
また本発明の範囲には、本発明のペプチドおよび類似体の塩が含まれる。本明細書において「塩」という用語は、ペプチド分子のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、当該分野で公知の手段により作成され、例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、第二鉄塩または亜鉛塩などの無機塩、および例えばトリエチルアミン、アルギニン、またはリジン、ペピリジン、プロカインなどのアミンと作成される有機塩基との塩がある。酸付加塩は、例えば塩酸または硫酸のような無機酸との塩、および例えば酢酸またはシュウ酸のような有機酸との塩がある。このような化学的誘導体および塩は、好ましくは安定性、溶解度などに関する限り、ペプチドの薬剤学的性質を修飾するために使用される。
ペプチドやその類似体の例には以下のものがある：
（ｉ）式のペプチドＩａ：
（ii）式のペプチドIIａ：
（iii）式のペプチドIIIａ：
（iv）式のペプチドIVａ：
（ｖ）式のペプチドＶａ：
本発明の類似体がいったん産生されると、ＳＬＥ誘導性自己抗体に対する高応答動物であるマウスのＴリンパ球の増殖性応答を阻害する能力は、当業者は本明細書に記載のような試験を用いて、不適当な実験をすることなく容易に測定できる。容易に実施できる１つの試験は、ＳＬＥ誘導性自己抗体に特異的ないくつかのＴ細胞株およびクローンの増殖性応答をインビトロで阻害する置換ペプチドの能力についての試験である。Ｔ細胞株とクローンは、例えば既に記載されている方法（アクセルロッド（Axelrod）とモーゼス（Mozes）、１９８６）によりマウスの免疫したリンパ節細胞から樹立した１６／６Ｉｄ ｍＡｂ（フリッケ（Fricke）ら、１９９１）に特異的なＴ細胞株とクローンでもよい。細胞を、強化培地の存在下で放射線照射した同系脾臓細胞上に提示された刺激性抗体に２週間毎に暴露する。Ｔ細胞株は、標準的な限界希釈法によりクローン化する。これらのＴ細胞株とクローンの増殖性応答は、例えば本明細書のセクション（ｇ）の材料と方法に記載の方法により試験される。
所望の活性を有する類似体を選択するために行われる別の試験は、親ペプチドの存在下でペプチド特異的Ｂ細胞を援助するＴ細胞株とクローンの能力を阻害する置換ペプチドの能力についての試験である。置換されたペプチドはまた、ビオチン化後に、関連株の抗原提示細胞上のＭＨＣクラスII産物に直接結合する能力について試験される。この目的のために、関連するペプチドのＮ−末端ビオチン化が、過剰のビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド水溶液で０℃で行われる（モーゼス（Mozes）ら、１９８９）。マウス脾臓吸着細胞またはヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）吸着細胞（１×１０6／試料）を、０．１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ）中で３７℃で２０分間インキュベートし、フィコエリトリン−ストレプトアビジンで４℃で３０分間インキュベートする。次に、ＦＡＣＳｃａｎを用いてフローサイトメトリーで細胞を解析する。各解析において、最低５０００個の細胞を調べる（上記方法については、モーゼス（Mozes）ら、１９８９、ジスマン（Zisman）ら、１９９１を参照）。
実施されるさらなる試験は、ＳＬＥ誘導性自己抗体に対する高応答動物であるマウスのリンパ節のＴ細胞株またはＴリンパ球によるサイトカイン分泌を阻害する類似体の能力についての試験である。サイトカインは以下のように検出される：ＩＬ−１活性は、捕捉抗体と検出抗体の対を用いるＥＬＩＳＡ（後述のＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０に対するように）によるか、またはＬＢＲＭ−３３（１Ａ５）測定法（コンロン（Conlon）、１９８３）（１Ａ５細胞は、ＩＬ−２を分泌させるために種々の濃度の上清もしくは組換えＩＬ−１で植物性血球凝集素（ＰＨＡ）の存在下で刺激される）を用いて評価する。一晩インキュベーション後、１Ａ５細胞の上清を、ＩＬ−２依存性細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬＬ）株に移す。3［Ｈ］−チミジンの取り込みにより２４時間後にＩＬ−２によるＣＴＬＬ株の刺激を測定する。ＩＬ−２は、ＩＬ−２依存性ＣＴＬＬ株を用いて直接検出するかまたはＥＬＩＳＡにより検出する。上清中のＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮγおよびＴＮＦαのレベルは、種々のサイトカインに対する抗体（ファミンゲン（Phamingen）、サンジエゴ、カリホルニア州、米国）を用いるＥＬＩＳＡにより製造業者の説明書に従って測定する。
これらのインビトロ試験の１つまたはそれ以上で陽性になったペプチドは、当然インビボでも活性があることが期待される。しかし、不適当な実験をすることなくインビボ試験を実施できる。例えば、成体マウスに、−３日または０日に候補ペプチドを注射する。次に疾患誘導性自己抗体またはペプチドでマウスを免疫する。１０日後、マウスのリンパ節細胞を、候補ペプチドの阻害能力を見いだすために免疫原に対して増殖する能力を試験する。
別のインビボ動物試験では、前述のようにＳＬＥの発生についてインビボでマウスモデルの治療活性を直接測定する。異なる経路で異なる投与量でそして異なる時間スケジュールで実験的ＳＬＥを誘導したマウスに、ペプチドを注射する。類似体の薬物動態パラメータ（分布容量、抗原提示細胞への摂取、およびクリアランスを含む）を測定するために、類似体のビオチン化誘導体を使用することができる。種々の体液での類似体の可溶性画分の濃度は、アビジン被覆プレートと特異的抗ペプチド抗体を用いてＥＬＩＳＡにより測定することができる。細胞結合類似体は、蛍光色素結合アビジンまたはストレプトアビジンを用いてＦＡＣＳにより分析することができる。さらに、自己抗体応答に対する、およびＳＬＥ誘導性自己抗体によるマウスで誘導した疾患症状に対するペプチドの効果を測定するために、処理したマウスを定期的に試験することができる。
別のインビボの方法では、マウスの新生児を候補ペプチドで寛容誘導し、次に病原性自己抗体（例えば、１６／６Ｉｄ＋）もしくは同じ抗体でマウスを免疫し、症状（例えば、白血球減少、赤血球沈降速度上昇、タンパク尿、腎臓における多量の免疫複合体および糸球体の硬化）が現れる。
従って本明細書の例で実機能することが示された好適な実施態様以外に、当業者は不適当な実験をすることなく、本明細書に記載の指示に従って機能する追加の類似体を決定することができるであろう。
特定のＳＬＥ患者に対する特定の置換ペプチドの予測される治療効果を評価するために、比較的簡単なインビトロ試験を実施することができる。適当なＭＨＣクラスII分子に高親和性で結合するがＴ細胞をさらに活性化することのないペプチドを産生するという最終目標を評価するために、ビオチン化後ＳＬＥ患者の末梢血リンパ球中の抗原提示細胞上のＨＬＡクラスII産物に直接結合する能力についてペプチドを評価してもよい。その特異性を証明するために、このような測定法では健常対照ドナーと対照ペプチドが使用される。
好適な型の本発明の治療薬剤は、ペプチドＩａ〜Ｖａおよびその置換類似体および／または欠失類似体を含む、本明細書の式Ｉ〜Ｖのペプチドの群から選択されるペプチドである。
本発明の別の好適な型の治療薬剤は、多重エピトープ単一ペプチドの型である。すなわち好適な実施態様において、本明細書の式Ｉ〜Ｖのペプチドの群から選択される２つの異なるペプチドより構成される２重ペプチドは、アラニン残基の短い鎖またはカテプシンによるタンパク分解の推定部位によるように、たがいに共有結合される。例えば、このような部位については米国特許第５，１２６，２４９号およびヨーロッパ特許第４９５，０４９号を参照されたい。これは、２つの所望の類似体への好適な型の部位特異的タンパク分解を誘導するであろう。あるいは、本発明の多くの同じまたは異なるペプチドは、例えば０．１％グルタルアルデヒドのような適切な重合物質でペプチドを重合することにより、ペプチドポリマーに形成してもよい（アウディベルト（Audibert）ら（１９８１）、Ｎａｔｕｒｅ ２８９：５９３）。ポリマーは好ましくは５〜２０個のペプチド残基を含有する。このようなペプチドポリマーはまた、ペプチドを架橋するかもしくは複数のペプチドを巨大分子担体に架橋することにより形成される。適切な巨大分子担体は、例えばタンパク質（例えば、破傷風毒素）、およびアミノ酸の線状または分岐共重合体（例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リジンの線状共重合体、Ｌ−チロシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニンおよびＬ−リジンの分岐共重合体（Ｔ，Ｇ）−Ａ−Ｌ−、または多鎖ポリ−ＤＬ−アラニン）である（エム・セラ（M. Sera）ら、１９５５、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７７：６１７５）。結合体は例えば、ジー・エム・ムラー（Muller, G.M.）ら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５６９に記載のようにまずペプチドを水溶性カルボジイミド（例えば、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）に結合させ、次に巨大分子担体に結合させることにより得られる。各結合体中の結合ペプチドの含有量は、アミノ酸分析により担体のみの組成と比較して決定できる。
本発明の１つの実施態様によれば、１つまたはそれ以上の活性ペプチドは適切な巨大分子担体に結合できるか、またはグルタルアルデヒドの存在下重合できる。
ペプチド、そのポリマーまたは適切な巨大分子担体とのその結合体は、治療に適するようにバイオアベイラビリティを確保する型で患者に投与される。２つ以上のペプチド類似体が充分な阻害活性を有することがわかれば、これらの類似体を、ペプチドの混合物を含有する製剤中で患者に投与されるであろう。
本発明はさらに、本発明の少なくとも１つの合成ペプチド、適切な巨大分子担体とのその結合体、または随時薬剤学的に許容される担体とのそのポリマーからの薬剤組成物を含有する。
経口、静脈内、皮下、関節内、筋肉内、吸入、鼻腔内、クモ膜下、腹腔内、皮内、経皮的または他の経路（例えば、腸内）を含む任意の適切な投与経路が、本発明に包含される。
本発明の組成物の投与の投与量範囲は、所望の作用を示すために充分に多量でなければならず、こうして例えばインビトロでＴ細胞により測定されるＳＬＥ誘導性自己抗体に対する免疫応答が実質的に防止または阻害され、そしてさらに疾患が有意に治療される。投与量は、副作用（例えば、好ましくない交差反応、全身性免疫抑制、アナフィラキシー反応など）を引き起こすほど多量であってはならない。
ＳＬＥを治療するために使用される本発明のペプチドの有効投与量は、約１μg〜１００mg/kg/体重の範囲である。投与される量は、患者の年齢、性、健康、および体重、併用されるならその治療の種類、治療頻度、および所望の作用の本質に依存する。
本発明の合成ペプチドと類似体、特に本明細書の配列Ｉ〜Ｖのものは、他の免疫応答に影響を与えることなくＳＬＥ患者の特異的抗原応答を阻害または抑制することを目的とする。ほとんど診断された患者は長年の治療を必要とする若い女性であり、ＳＬＥの現在の治療では非特異的および複数の副作用を有するコルチステロイドおよび／または細胞毒性薬剤のような免疫抑制剤を投与するため、このアプローチは特に重要である。
以下の例と添付の図面により本発明を詳細に説明する。
例
材料と方法
ａ）マウス：マウス（ＢＡＬＢ／ｃおよびＳＪＬ／Ｊ）は、ジャクソンラボラトリー（Jackson Laboratory）（バーハーバー（Bar Harbor）、メーン州、米国）とオラック（Olac）（ショーズファーム（Show's farm）、ビセスパーオキソン（Bicesper Oxon）、イングランド）から得た。マウスは６〜１２週齢で使用した。ある実験では新生児マウスを使用した。
ｂ）ヒトｍＡｂ１６／６Ｉｄ：ヒトｍＡｂ １６／６Ｉｄ：は、もともとＩｇＭイソタイプの抗ＤＮＡ抗体であり、培養してＩｇＧ１とした。このｍＡｂは患者由来であり、共通のイディオタイプ１６／６Ｉｄを発現する（シェーンフェルト（Shoenfeld）ら、１９８３；メンドロビック（Mendlovic）ら、１９８８）。このｍＡｂを分泌するハイブリドーマ細胞は普通に培養増殖させ、抗体は、セファロース（登録商標）に結合したプロテインＧの親和性カラムを用いて培養上清から単離した。
ｃ）マウスｍＡｂ ５Ｇ１２および２Ｃ４Ｃ２の産生：既に記載されているようにマウス抗１６／６Ｉｄ ｍＡｂ（メンドロビック（Mendlovic）ら、１９８９）で免疫してメスのＣ３Ｈ．ＳＷマウスで実験的ＳＬＥを誘導した。４ヶ月後２匹のマウスを屠殺して、その脾臓細胞をＸ６３．６５３形質細胞腫細胞と融合した。自己抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート中で限界希釈してクローン化した。９つのハイブリドーマクローンにより分泌された９つのモノクローナル自己抗体の配列の特徴を解析した（ワイスマン（Waisman）とモーゼス（Mozes）、１９９３）。５Ｇ１２と２Ｃ４Ｃ２と呼ぶｍＡｂを単離し、ヤギ抗マウスＩｇ−セファロース（登録商標）４Ｂカラムを用いてハイブリドーマ上清から親和性精製した。５Ｇ１２ ｍＡｂは１６／６Ｉｄを有する抗ＤＮＡ ｍＡｂであり、ＩｇＧ２ａイソタイプを有していた。２Ｃ４Ｃ２ ｍＡｂは抗ＤＮＡおよび抗カルジオリピンｍＡｂであり、ＩｇＭイソタイプであった。５Ｇ１２と２Ｃ４Ｃ２ ｍＡｂの両方のヌクレオチドと推定アミノ酸配列は、ワイスマン（Waisman）とモーゼス（Mozes）、１９９３の図１に記載されており、図中でＣＤＲ領域は四角で囲ってある。
ｄ）マウスでの実験的ＳＬＥの誘導：完全フロイントアジュバント中のヒトモノクローナル１６／６Ｉｄ（１μg／マウス）またはマウス１６／６Ｉｄ ｍＡｂ（例えば、ｍＡｂ ５Ｇ１２（２０μg／マウス））をマウスの後ろ足に注射した。注射の３週間後、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の同量の免疫抗体でマウスを追加免疫した。次に抗体産生と実験的ＳＬＥに特徴的な臨床症状について試験した。
ｅ）ＳＬＥ関連臨床症状の検出：ヘパリン化血液をＰＢＳで１：１に希釈して赤血球沈降速度を測定した。次に希釈した血液を微量サンプリングピペットに移し、６時間後沈降を測定した。白血球数は、ヘパリン化血液を溶解してから測定した。タンパク尿は、コンビスティックス（Combistix）キット（エームス（Ames）、ストークポーゲス（Stoke Poges）、スロー（Slough）、英国）を用いて、半定量的に測定した。固定した凍結切片をマウス免疫グロブリンに対するＦＩＴＣ標識抗体でインキュベートして免疫組織学的検査を行った。染色は、蛍光顕微鏡を用いて可視化した。
ｆ）酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）：実験マウスおよびヒトでの抗体の検出と定量のためにＥＬＩＳＡを利用した。ポリスチレン製マイクロタイタープレートを関連する抗原または抗体で被覆し、血清希釈物またはヒトまたはマウス細胞培養物から得た上清を、ブロッキングしたプレートに添加した。ペルオキシダーゼの結合した適切な免疫グロブリン（Ｉｇ）（例えば、ヤギ抗ヒトまたはヤギ抗マウスペルオキシダーゼ結合抗体）とペルオキシダーゼ基質の添加後、特異的結合を測定した。光学密度は、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４１４nmで読んだ。
ｇ）脾臓およびリンパ節細胞の増殖性応答：処理および未処理マウスの脾臓およびリンパ節から得た細胞（０．５×１０6／ウェル）を、異なる濃度の種々の免疫病原性自己抗体の存在下でマイクロタイタープレート中で培養した。９６時間インキュベーション後、０．５μCiの3Ｈ−チミジンをさらに１８時間添加し、その後細胞を採取し、放射能を計測した。
ｈ）実験マウスの処理：実験的ＳＬＥの誘導を防止するためにまたは病気にかかったマウスを治療するために、以下の方法を行った：（ｉ）新生児マウスを本発明のペプチドで寛容誘導を行った（ＰＢＳ中の１００μgのペプチド、出産後２４時間と７２時間後に腹腔内投与）。６週間後、マウスを病原性自己抗体（例えば、５Ｇ１２（１６／６Ｉｄ＋））で免疫し、症状の出現について調べた。
（ii）第１の群の成体マウスに、種々の濃度のペプチドを注射してから、病原性自己抗体または病原性Ｔ細胞株で疾患を誘導した。別の群にはペプチドを注射して、血清応答のピーク時の免疫後６週間後にその治療効果について試験した。さらに別の群は、明らかなＳＬＥが樹立してから免疫の４〜６ヶ月後処理した。ペプチドの注射の回数は、疾患の誘導と進行に対するその効果に基づき決定した。次にＴ細胞増殖、自己抗体産生および疾患の出現に対するペプチド処理の効果を評価した。
ｉ）Ｔ細胞株とクローンの増殖性応答：１６／６Ｉｄに特異的なＴ細胞株とクローンは、前述のように（アクセルロッド（Axelrod）とモーゼス（Mozes）、１９８６）免疫したリンパ節細胞から樹立した。細胞を、強化培地の存在下で放射線照射した同系脾臓細胞上に提示された刺激性抗体に２週間毎に暴露した。Ｔ細胞株は、標準的な限界希釈法によりクローン化した。細胞（１０4／ウェル）を、細胞株の異なる濃度の特異的刺激物質または対照試薬の存在下で０．５×１０6照射（３０００rad）同系脾臓細胞とともに培養した。４８時間のインキュベーションの最後に、０．５μCiの3Ｈ−チミジンをさらに１８時間添加し、その後細胞を採取し、放射能を計測した。
ｊ）末梢血リンパ球（ＰＢＬ）による増殖とサイトカイン産生：ヒトＳＬＥ患者と適切な対照ドナーからのＰＢＬ（２×１０5／ウェル）を、１０％プールＡＢ血清を含有する強化培地中のマイクロタイタープレートでヒトまたはマウスモノクローナル１６／６Ｉｄ抗体の存在下で、本発明のペプチドもしくは植物性血球凝集素（ＰＨＡ）の存在下で培養した。増殖速度は、細胞培養物中の3［Ｈ］−チミジンの取り込みにより評価した。関連のないペプチドを特異性対照として使用した。ＥＬＩＳＡ測定法でサイトカイン依存性株または適切な抗体対を用いて、上記培養物の上清中の抗原および分裂促進因子刺激サイトカイン産生を定量した。増殖性応答の阻害は、増殖性培養混合物に増加する濃度の試験ペプチド類似体を添加してインビトロで行った。
ｋ）ヒトＴ細胞株とクローン：ヒトまたはマウスマウスｍＡｂ １６／６Ｉｄまたはペプチドでインビトロで刺激後、ＳＬＥ患者または対照のＰＢＬから１６／６Ｉｄに特異的なヒトＴ細胞株を樹立した。細胞株の維持とクローニングは、マウスＴ細胞株について前述したのと同様に行ったが、刺激は自己の放射線照射細胞または自己ＰＢＬ（抗原提示細胞として使用される）のＥＢＶ−形質転換細胞株を用いて行った。
ｌ）ペプチドのビオチン化：ペプチドのＮ−末端ビオチン化は、０．１Ｎ重炭酸ナトリウム溶液中で室温で、１−メチル−２−ピロリドン（シグマ（Sigma））に溶解した過剰のビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）を用いて行った。
ｍ）ＡＰＣへのビオチン化ペプチドの直接結合：１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁した脾臓細胞を、シャーレ中で３７℃で６０分間インキュベートした。次に非吸着細胞を除去し、プレートを洗浄し、吸着細胞をゴムポリスマン（rubber policeman）（コスター（Costar）、マサチューセッツ州、米国）を用いてプレートから採取した。これらの細胞（１×１０6／１００μl／試験管）を、０．１％ＢＳＡ（高純度、アムレスコ（Amresco）、オハイオ州、米国）含有ＰＢＳ中のビオチン化ペプチドで３７℃で１６時間インキュベートし、次にフィコエリトリン（ＰＥ）−ストレプトアビジン（ジャクソン・イムノリサーチ（Jackson ImmunoResearch））で４℃で３０分間インキュベートした。次に試料をビオチン化抗ストレプトアビジン（１：６０、ベクターラボラトリーズ（Vector Laboratories）、バーリンゲーム（Burlingame）、カリホルニア州）でインキュベートし、さらにＰＥ−ストレプトアビジンでインキュベートした（すべて４℃で３０分間）。各インキュベーション後、細胞を冷ＰＢＳ／ＢＳＡ溶液で２回洗浄した。次にＦＡＣＳｏｒｔサイトメーターとセルクエスト（ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ）ソフトウェア（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、マンテンビュー（Mountain View）、カリホルニア州）を用いてフローサイトメトリーにより細胞を解析した。これらの実験で結合阻害のために３つの抗体を使用した：３４−５−３（抗−ＩＡb、ファルミンゲン（Pharmingen）、サンジエゴ、カリホルニア州）；ＭＫＤ６（抗−Ｉ−Ａd、ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson））および１０．３．６．２（抗−Ｉ−Ａｓ（ザンビル（Zamvil）ら、１９８８））。
例１．ペプチドの合成
ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）法（ケント（Kent）ら、１９８４；シュノルザー（Schnolzer）ら、１９９２）の製造業者のプロトコールを用いて自動合成機（アプライドバイオシステムズ（Aplied Biosystem）モデル４３０Ａ、ドイツ）で、式Ｉａ、IIａおよびIIIａの本発明の合成ペプチドならびに対照ペプチドを調製した。簡単に説明するとこの方法では、市販の側鎖保護アミノ酸を使用し、アミノ酸は各工程で少なくとも９９％の効率で加えた。保護基はペプチドから除去し、無水ＨＦを用いて樹脂から除去した。次に酢酸エチルまたは酢酸イソプロピルによる抽出とＨＰＬＣによりペプチドを精製した。次にこうして得られたペプチドＩａ、IIａおよびIIIａの純度をＨＰＬＣとアミノ酸分析により証明した。
本発明のペプチドIVａとＶａおよびペプチドＩａ〜Ｖａの類似体の調製のために、上記と同じ方法が使用できる。
次にペプチドＩａ、IIａおよびIIIａを、後述の例２〜１４に記載のようにその生物活性と他の特徴について解析した。試験しなかった他のペプチドも同じ解析ができることを理解されたい。
例２．ペプチドＩａとIIIａで免疫したマウスの血清中の抗ＤＮＡ抗体の検出
メスのＳＪＬ／ＪとＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）に、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）に乳化した２０μgの本発明のペプチドＩａまたはIIIａ、または対照ペプチドｐ２７８（ＰＣＴ国際出願ＷＯ９４／０３２０８号に記載のＰｅｐ２７８ｈと名付けたペプチド）またはｍＡｂ ５Ｇ１２を足蹠に免疫した。３週間後ＰＢＳ中の同量のペプチドまたはｍＡｂをマウスに追加免疫注射をした。次に２週間毎に血液を採取した。第５群は非免疫マウスを含有した。
図１は、追加免疫注射の３週間後のマウスの血清中の抗ＤＮＡ抗体を示し、後期に産生される自己抗体の量に非常によく似ている。
図１Ａに示すように、ペプチドIIIａで免疫したＳＪＬ／Ｊマウス（白丸）は高レベルの抗ＤＮＡ抗体を示し、これは全抗体５Ｇ１２（白四角）で免疫したマウスより高い。ペプチドＩａ（白菱形）、対照ペプチドｐ２７８（白三角）または正常非免疫マウス（十字をつけた四角）で免疫したＳＪＬ／Ｊマウスの血清では、低レベルの抗ＤＮＡ抗体が観察された。
図１Ｂに示すように、全抗体５Ｇ１２（白四角）またはペプチドＩａ（白菱形）で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスでは、血清中に抗ＤＮＡ抗体の存在を示す。しかしペプチドIIIａ（白丸）、ｐ２７８（白三角）のいずれかで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスまたは正常非免疫マウス（十字をつけた四角）の血清は、抗ＤＮＡ抗体の存在を示さなかった。
ＥＬＩＳＡを使用して、以下のようにマウスの血清中の抗ＤＮＡ抗体の存在を試験した：プレート（ヌンク（Nunc））を１０μg/mlのメチル化ＢＳＡで９０分間被覆した。次にプレートを洗浄（すべての洗浄はＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０（シグマ（Sigma））で３回行った）し、１０μg/mlの１本鎖ＤＮＡ（９０℃で１５分間加熱し急速に冷却した子牛胸腺ＤＮＡ（シグマ（Sigma））でさらに９０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＰＢＳ中１％オバルブミン（シグマ（Sigma））で一晩ブロッキングした。次にプレートを洗浄し、ブロッキング試薬で希釈したマウスの血清でインキュベートし、次に洗浄し、ペルオキシダーゼに結合した１：５００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃリセプター特異的）ポリクローナル抗体でインキュベートした。次にプレートを洗浄し、ＡＢＴＳ基質（シグマ（Sigma））で発色させ、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４１４nmで色を読んだ。結果は各マウス群（１群当たり５匹）の平均ＯＤとして表す。
例３．ペプチドＩａとIIIａで免疫したマウスの血清中の抗核抽出物（ＮＥ）抗体の検出
５群のマウスを例２に従って免疫し、その血清を抗ＮＥ抗体の存在について試験した。
図２Ａに示すように、ｍＡｂ ５Ｇ１２（白四角）またはペプチドIIIａ（白丸）で免疫したＳＪＬ／Ｊマウスは高レベルの抗ＮＥ抗体を産生し、一方ペプチドＩａ（白菱形）またはｐ２７８対照ペプチド（白三角）で免疫したマウスまたは正常非免疫マウス（十字をつけた四角）は、低レベルの抗ＮＥ抗体を産生した。
図２Ｂに示すように、ｍＡｂ ５Ｇ１２（白四角）またはペプチドＩａ（白菱形）で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスは高レベルの抗ＮＥ抗体を産生し、一方ペプチドIIIａ（白丸）で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清では非常に低レベルの抗ＮＥ抗体が検出された。ｐ２７８対照ペプチド（白三角）で免疫したマウスまたは正常非免疫マウス（十字をつけた四角）の血清では、抗ＮＥ抗体は検出されなかった。
ＥＬＩＳＡを使用して、以下のようにマウスの血清中の抗ＮＥ抗体の存在を試験した：プレート（ヌンク（Nunc））を５μg/mlのＨｅＬａ細胞ＮＥで９０分間被覆した。次にプレートを洗浄およびブロッキングし、翌日抗ＤＮＡ抗体について例２に記載のようにＥＬＩＳＡを続けた。
例４．ペプチドＩａとIIIａで免疫したマウスの血清中の抗ＲＮＰ、Ｓｍ、ＲｏおよびＬａ抗体の検出
抗ＲＮＰ、Ｓｍ、ＲｏおよびＬａ抗体の検出について、例２と３に記載のものと同じマウスの血清を使用した。
図３Ａに示すように、ペプチドIIIａ（線を引いた棒）で免疫したＳＪＬ／Ｊマウスは非常に高レベルの抗Ｒｏ抗体（ヒトのＳＬＥに典型的な抗体）を産生した。正常マウス（白い棒）または対照ペプチドｐ２７８（点々を入れた棒）に比較して、ペプチドIIIａ（線を引いた棒）のみでなくペプチドＩａ（黒い棒）で免疫したＳＪＬ／Ｊマウスでも、高レベルの抗ＲＮＰ、抗Ｓｍ、および抗Ｌａ抗体が検出された。
図３Ｂに示すように、ペプチドＩａ（黒い棒）またはペプチドIIIａ（線を引いた棒）で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスは高レベルの抗ＲＮＰ抗体を産生した。しかし血清中に検出可能な抗体を産生したペプチドＩａ（黒い棒）で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して、ペプチドIIIａ（線を引いた棒）で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスは非常に低レベルの抗Ｓｍ、抗Ｌａおよび抗Ｒｏ抗体を示した。
すでに被覆されたプレートとしてプレートを購入し、ＰＢＳ中１％オバルブミンで２時間ブロッキングした。次に前記例２のようにプレートを洗浄し、１：１０希釈血清で２重測定でインキュベートし、再度洗浄し、例２に記載のようにＥＬＩＳＡを行った。
例５．ペプチドＩａとIIIａで免疫したマウスのＳＬＥの臨床症状
ＢＡＬＢ／ｃとＳＪＬマウスをｍＡｂ ５Ｇ１２またはペプチドＩａとIIIａで免疫し、５ヶ月後ＳＬＥの２つの基準（白血球数（ＷＢＣ）とタンパク尿）でチェックした。
（ｉ）白血球数（ＷＢＣ）：マウスを出血させ、赤血球を排除するために血液を１％（容量／容量）酢酸で１：１０希釈し、通常の光学顕微鏡で白血球を計測した。
タンパク尿：マウスの尿をコンビスティックス（Combistix）（コンビスティックス（Combistix）キット、エームス（Ames））を用いてタンパク質の存在について試験した。尿中の高レベルのタンパク質は、ＳＬＥの典型的な症状である腎臓の損傷を示す。
例６．ペプチドに対するマウス応答の特異性
前例で示したように、全モノクローナル抗体での免疫と平衡して、ペプチドＩａとIIIａを異なるマウス系統のマウスの免疫のために使用した。流れ出るマウスのリンパ節は、マウス系統に依存して異なる程度に免疫性ペプチドに対して増殖した。すなわちＢＡＬＢ／ｃマウスはペプチドＩａに対して高応答動物であり、ＳＪＬマウスはペプチドIIIａに対して高応答動物であることが見いだされた。病原性自己抗体について使用したプロトコールを用いて、実験的ＳＬＥを誘導するために両方のペプチドを使用した。ペプチドIIIａで免疫したＳＪＬマウスとペプチドＩａで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスは、抗ＤＮＡ（図１）および抗ＮＥ抗体（図２）を含む高レベルの自己抗体を産生することが見いだされた。さらに、免疫されたマウスは、マウス抗ＤＮＡ、１６／６Ｉｄ＋病原性５Ｇ１２ ｍＡｂで実験的ＳＬＥを誘導したマウスと同様に白血球減少とタンパク尿（表１）を示した。ペプチドを注射したマウスの腎臓の解析では、マウスの一部に軽い免疫複合体沈着が証明された。これらの結果は、ペプチドＩａとIIIａが病原性自己抗体の全分子の重要なＴ細胞エピトープであることを示す。
本発明のペプチドとＴ細胞の間の相関を評価するために、ＳＪＬ起源のペプチドIIIａに特異的なＴ細胞株（ペプチドIIIａに対する高応答動物）を樹立した。この株のＴ細胞はペプチドIIIａに対して特異的に増殖したが、関連のない対照ペプチドｐ２７８に対しては増殖せず、ペプチドIIIａで刺激するとＴｈ１型サイトカイン（すなわち、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα）を分泌した。同系の健常マウスにＴ細胞株を注射すると自己抗体が産生され、実験的ＳＬＥを有するマウスに特徴的な臨床症状が発現した。これらの結果は、実験的ＳＬＥにおける本発明のＣＤＲベースのペプチドの役割を確認し、自己免疫疾患におけるペプチド特異的Ｔ細胞の役割を証明している。
例７．ペプチドＩａで寛容誘導しペプチドＩａまたはｍＡｂ ５Ｇ１２のいずれかで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清中の抗ＤＮＡ抗体および抗ＮＥ抗体の検出
ＳＬＥにおけるペプチドの役割をさらに解明するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスで寛容を誘導するためにペプチドＩａを使用した。新生児マウスにペプチドＩａまたは対照ペプチドを２回（１日目と３日目）注射した。すなわち、２４時間齢の新生児ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＰＢＳ中の１００μgのペプチドＩａまたは対照ペプチドｐ３０７（ＰＣＴ出願ＷＯ９４／００１４８号に記載されている重症筋無力症に関連するペプチド）を腹腔内（ｉｐ）に注射し、４８時間後同量のペプチドで第２回目の注射を行った。注射の６〜７週間後、ｍＡｂ ５Ｇ１２またはペプチドＩａで前記例２に記載のように免疫した。追加免疫の２週間後（および定期的に２週間毎に）にマウスを出血させて、マウスの血清を例１と２に記載のように抗ＤＮＡ抗体または抗ＮＥ抗体の存在について試験した。実験マウスの血清中のこれらの自己抗体力価を測定するために行った測定は、ペプチドＩａで寛容誘導したマウスはＤＮＡまたは核抽出物抗原に対して高力価の抗体を産生せず、ペプチドＩａまたはｍＡｂ ５Ｇ１２で免疫する前に対照ペプチド３０７に対して寛容誘導したマウスは、高い自己抗体力価を示した。
図４Ａ〜Ｂに示すように、ペプチドＩａで寛容誘導し次にｍＡｂ ５Ｇ１２で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス（半分黒い四角）、またはペプチドＩａで寛容誘導し次に同じペプチドＩａで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス（黒四角）は、関連の無いペプチドｐ３０７で寛容誘導し次にｍＡｂ ５Ｇ１２で免疫したマウス（黒三角）、またはペプチド３０７で寛容誘導し次にペプチドＩａで免疫したマウス（黒丸）に比較して、低レベルの抗ＤＮＡ抗体と抗ＮＥ抗体を産生した。
これは、ペプチドＩａによる新生児寛容は、ペプチドＩａまたはｍＡｂ ５Ｇ１２で後に免疫したマウスの血清中の自己抗体のレベルを低下させることを示す。
例８．ＣＤＲベースのペプチドＩａとIIIａに対するリンパ節細胞（ＬＮＣ）増殖応答のインビボ阻害
ＢＡＬＢ／ｃ（図５ａ）とＳＪＬ（図５ｂ）マウスを、それぞれペプチドＩａとIIIａ（ＣＦＡ中２０μg/マウスを後ろ足に）を免疫した。また免疫の３日後（白四角）、免疫の日（白丸）または両方の日（白三角）に、ＰＢＳ中の上記ペプチド２００μgをマウスに静脈内注射した。１０日後マウスを屠殺し、リンパ節を取り出し、異なる濃度の免疫ペプチドの存在下で増殖を試験した。対照群は、免疫したが処理しなかったマウス（黒四角）、または対照ペプチドｐ３０７で処理したマウス（半分黒い四角）から取ったＬＮＣである。培養物混合物を、１％正常マウス血清を含有する強化ＲＰＭＩ培地中で９６時間インキュベートしてから3Ｈ−チミジンを添加した。１６時間後細胞を採取し、放射能を計測した。結果は３重測定の平均ｃｐｍとして表す。ＳＤ値は１０％を越さなかった。
図５ａ〜ｂに示すように、ペプチドＩａ（５ａ）とIIIａ（５ｂ）は免疫の３日前または免疫の日に注射するとＢＡＬＢ／ｃおよびＳＪＬマウスのＬＮＣの増殖応答を阻害した。細胞の増殖能力の最大９５％がペプチドにより阻害された。ＣｏｎＡに対するＬＮＣの増殖応答はペプチドＩａとIIIａにより阻害されなかった（データは示していない）ため、この阻害は特異的であった。
例９．ｍＡｂ ５Ｇ１２で免疫しペプチドＩａとIIIａで処理したマウスのＬＮＣ増殖のインビボ阻害
ＢＡＬＢ／ｃ（図６ａ）とＳＪＬ（図６ｂ）マウスを、ｍＡｂ ５Ｇ１２（ＣＦＡ（同上）中２０μg/マウスを後ろ足に）で免疫し、それぞれペプチドＩａまたはIIIａを注射（ＰＢＳ中２００μg/マウスを静脈内に）した。また免疫し処理しなかったマウス（黒四角）、免疫と同時に対照ペプチドｐ３０７で処理したマウス（半分黒い四角）またはＣＤＲベースのペプチドＩａ（６ａ）またはIIIａ（６ｂ）で処理したマウス（白四角）から取ったＬＮＣ中で、ｍＡｂ ５Ｇ１２に対する増殖性応答を測定した。未処理マウス（黒丸）またはＣＤＲベースのペプチドＩａまたはIIIａで処理したマウス（白丸）から取ったＬＮＣ中の、免疫優性ＣＤＲベースのペプチドＩａとIIIａに対する増殖性応答も測定した。結果は３重測定の平均ｃｐｍとして表す。ＳＤ値は１０％を越さなかった。
図６ａ〜ｂに示すように、適切なＣＤＲベースのペプチドで処理したマウスから取ったＬＮＣのｍＡｂ ５Ｇ１２に対する増殖性応答は、未処理マウスの応答に比較して阻害された。
例１０．ヒトモノクローナル抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ抗体に対するＬＮＣ増殖のインビボ阻害
ＢＡＬＢ／ｃ（図７ａ）とＳＪＬ（図７ｂ）マウスを、ヒトｍＡｂ １６／６Ｉｄ（ＣＦＡ（同上）中１μg/マウスを後ろ足に）で免疫し、それぞれペプチドＩａまたはIIIａを注射（ＰＢＳ中２００μg／マウスを静脈内に）した。また免疫したが処理しなかったマウス（黒四角）、免疫と同時に対照ペプチドｐ３０７で処理したマウス（半分黒い四角）または適切なＣＤＲベースのペプチドＩａまたはIIIａで処理したマウス（白四角）から取ったＬＮＣ中で、ｍＡｂ １６／６Ｉｄに対する増殖性応答を測定した。１６／６Ｉｄ免疫した未処理マウス（黒丸）または適切なＣＤＲベースのペプチドＩａとIIIａで処理したマウス（白丸）から取ったＬＮＣの適切な免疫優性ＣＤＲベースのペプチドＩａまたはIIIａに対しても、増殖性応答が示された。結果は３重測定の平均ｃｐｍとして表す。ＳＤ値は１０％を越さなかった。
図７ａ〜ｂに示すように、適切なＣＤＲベースのペプチドＩａまたはIIIａで処理したマウスから取ったＬＮＣのｍＡｂ １６／６Ｉｄに対する増殖性応答は、免疫したが未処理のマウスまたは対照ペプチドｐ３０７で処理したマウスの応答に比較して阻害された。
例１１．脾臓抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面へのＣＤＲベースのペプチドＩａとIIIａの結合
ＢＡＬＢ／ｃ、ＳＪＬ、Ｃ３Ｈ．ＳＷまたはＣ５７ＢＬ／６マウスから単離された脾臓吸着細胞（１０６／１００μl／試験管）を、ビオチン化ＣＤＲベースのペプチドＩａまたはIIIａとともに１６時間インキュベートして、次にＰＥ−ストレプトアビジンと４℃で３０分インキュベートした。次に試料をビオチン化抗ストレプトアビジンでインキュベートし、さらにＰＥ−ストレプトアビジンとインキュベートした（すべて４℃で３０分）。洗浄後、細胞をＦＡＣＳｏｒｔサイトメーターとセルケスト（ＣＥＬＬＱｅｓｔ）ソフトウェアを用いて解析した。
結果を図８に示す：ビオチン化ＣＤＲベースのペプチドとインキュベートした細胞の染色を実線で示し、非ビオチン化ペプチドによるバックグランド染色を破線で示す。試験したマウス系統（ＳＬＥの誘導に耐性であるＣ５７ＢＬ／６マウスを除く）から得られた脾臓抗原提示細胞は、ＭＨＣクラスII産物へのＣＤＲベースのペプチドＩａとIIIａの有意の結合を示し、その結合能力がマウス系統のＳＬＥ誘導へのかかり安さと一致することを示している。
ＡＰＣへのＣＤＲベースのペプチドＩａとIIIａの結合は、本明細書の材料と方法に記載のように測定し、その結果を表２に示す。ペプチドＩａとIIIａとわずかにそれぞれ１９．３％と８．５％の結合を示したＣ５７ＢＬ／６系統からのＡＰＣを除いて、結合率はすべての系統について３８〜５３％であった。結合は関連する抗Ｉａ抗体により阻害され、ＭＨＣクラスII産物への結合の特異性を示していた。結果を表３に示す：結合の阻害は特異的であり、６０％〜１００％の範囲であった。
ヒトＳＬＥ患者（３２名）を出血させて、その血清についてペプチドＩａ、IIａおよびIIIａ、対照ペプチドｐ１９５−２１２（ＰＣＴ公報ＷＯ９４／００１４８号に記載の筋無力性ペプチド）またはｍＡｂ ５Ｇ１２への結合能力をＥＬＩＳＡにより試験した。
ＰＢＳ中１０μg/mlのペプチドＩａ、IIａ、IIIａまたはｐ１９５−２１２またはｍＡｂ ５Ｇ１２で２時間被覆し、洗浄し、ＰＢＳ中１％オバルブミンでさらに２時間ブロッキングしたプレート上で、抗体の検出を行った。ペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体を用いて、前記例２でブロッキング後に記載のようにＥＬＩＳＡを続けた。
図９に示すように、健常人対照（ペプチドＩａ−健常、黒菱形；ペプチドIIａ−健常、十字を付けた丸；ペプチドIIIａ−健常、逆さの白三角；５Ｇ１２−健常、半分黒い四角）に比較して、ＳＬＥ患者は有意に高レベルのペプチドＩａ（白四角）、IIａ（白菱形）またはIIIａ（白丸）、またはｍＡｂ ５Ｇ１２（白三角）に結合する抗体を示した。関連のないペプチドｐ１９５−２１２で被覆したプレート上で患者血清または対照血清を試験した時、結合は観察されなかった（ｐ１９５−２１２−ＳＬＥ、十字を付けた四角；ｐ１９５−２１２−健常、半分黒い菱形）。結果は、抗体力価のレベルについて全抗体分子とＣＤＲベースのペプチドとの相関を示す。
例１３．ヒト１６／６Ｉｄ ｍＡｂとペプチドの存在下でのＳＬＥ患者と健常人対照からのＰＢＬの増殖
ＳＬＥ患者または健常人対照の血液からフィコール勾配を使用して末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を単離した。次に異なる濃度のペプチドＩａ、IIａもしくはIIIａまたはヒト１６／６Ｉｄ ｍＡｂの存在下で２４時間インキュベートし、ＩＬ−２測定のために試料を採取した。測定は合計７日間行い、最後の１６時間に3Ｈ−チミジンを添加した。細胞のＤＮＡに取り込まれた放射能の量を読んで増殖を検出した。
図４に示すように、健常人対照に比較してＳＬＥ患者から取ったＰＢＬの低比率がペプチドまたは１６／６Ｉｄ ｍＡｂと反応した。結果は応答動物の割合（第１行では３４％）と患者の実際の数（３２のうち１１名：１１／３２）で表す。
ペプチドまたは１６／６Ｉｄの存在下でＰＢＬにより産生されるＩＬ−２のレベルを試験すると、以下の例に示すように同様の結果が得られた。
フィコール勾配を使用してＳＬＥ患者または健常人対照の血液からＰＢＬを単離し、例１３に記載のようにインキュベートした。測定の開始後５０μlの試料を取り、ＩＬ−２感受性細胞（ＣＴＬＤ）の存在下で２４時間インキュベートし、その後3Ｈ−チミジンを１６時間加え、プレートを採取し、ベータカウンターで計測した。
表４に示すように、健常人対照に比較した場合ＳＬＥ患者から取ったＰＢＬの低比率がペプチドまたは１６／６Ｉｄ ｍＡｂと反応し、ペプチドに対する応答が病原性ヒト抗体に対する患者のＴ細胞の応答に対応することを示している。
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）宛名：イエーダ・リサーチ・アンド・デベロップメント社（YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD.）
（Ｂ）通り：ピー・オー・ボックス９５（P.O. Box95）
（Ｃ）市：レホボット（Rehovot）
（Ｅ）国：イスラエル
（Ｆ）郵便番号：７６１００
（Ｇ）電話番号：０１１−９７２−８−４７０６１８
（Ｈ）ファックス番号：０１１−９７２−８−４７０７３９
（Ｉ）テレックス番号：３８１３００
（Ａ）宛名：モーゼ、エドナ（Mozes, Edna）
（Ｂ）通り：５１ ハナシ・ハリション・ストリート（Hanassi Harishon Street）
（Ｃ）市：レホボット（Rehovot）
（Ｅ）国：イスラエル
（Ｆ）郵便番号：７６３０３
（Ａ）宛名：ワイスマン、アリ（Waisman, Ari）
（Ｂ）通り：２９Ｂ メーズ・ストリート（Maze Street）
（Ｃ）市：テルアビブ
（Ｅ）国：イスラエル
（Ｆ）郵便番号：６５２１４
（Ａ）宛名：リクス、アビゲール（RYCUS, Avigail）
（Ｂ）通り：１６キプニス・ストリート（Kipnis Street）
（Ｃ）市：レホボット（Rehovot）
（Ｅ）国：イスラエル
（Ｆ）郵便番号：７６３０５
（ii）発明の名称：全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）治療用の合成ペプチドおよびこれを含有する薬剤組成物
（iii）配列の数：１０
（iv）コンピューターで読める形式：
（Ａ）媒体の型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣコンパチブル
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃１．０（PatentIn Release#1.0）、バージョン＃１．３０（ＥＰＯ）
（vi）先行出願のデータ
（Ａ）出願番号：ＩＬ １１３，１５９
（Ｂ）出願日：１９９５年３月２８日
（２）配列番号：１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：／注＝５位のＸaaはＭｅｔ、ＡｌａまたはＶａｌであり、６位のＸaaはＧｌｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＡｒｇであり、７位のＸaaはＴｒｐまたはＡｌａであり、８位のＸaaはＶａｌまたはＳｅｒであり、そして９位のＸaaはＬｙｓ、ＧｌｕまたはＡｌａである。
（xi）配列：配列ＩＤ Ｎｏ．１：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：／注＝９位のＸaaはＴｈｒ、ＶａｌまたはＡｌａであり、１０位のＸaaはＴｈｒ、ＶａｌまたはＡｌａであり、１１位のＸaaはＴｙｒまたはＰｈｅであり、１２位のＸaaはＡｓｎまたはＡｓｐであり、１３位のＸaaはＧｌｎまたはＧｌｕであり、１４位のＸaaはＬｙｓまたはＧｌｕであり、そして１５位のＸaaはＰｈｅまたはＴｙｒである。
（xi）配列：配列ＩＤ Ｎｏ．２：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：／注＝６位のＸaaはＰｈｅ、ＴｈｒまたはＧｌｙであり、７位のＸaaはＬｅｕ、ＡｌａまたはＳｅｒであり、８位のＸaaはＴｒｐまたはＡｌａであり、９位のＸaaはＧｌｕまたはＬｙｓであり、１３位のＸaaはＭｅｔまたはＡｌａであり、そして１４位のＸaaはＡｓｐ、ＬｙｓまたはＳｅｒである。
（xi）配列：配列ＩＤ Ｎｏ．３：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：／注＝４位のＸaaはＭｅｔまたはＡｌａであり、５位のＸaaはＡｓｎ、ＡｓｐまたはＡｒｇであり、６位のＸaaはＴｒｐまたはＡｌａであり、７位のＸaaはＶａｌまたはＳｅｒであり、８位のＸaaはＬｙｓまたはＧｌｕであり、９位のＸaaはＧｌｎまたはＡｌａであり、１３位のＸaaはＬｙｓまたはＧｌｕであり、そして１４位のＸaaはＳｅｒまたはＡｌａである。
（xi）配列：配列ＩＤ Ｎｏ．４：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：／注＝６位のＸaaはＳｅｒまたはＰｈｅであり、７位のＸaaはＧｌｙまたはＡｌａであり、８位のＸaaはＡｒｇ、ＡｌａまたはＧｌｕであり、１１位のＸaaはＡｓｎまたはＡｓｐであり、１２位のＸaaはＴｙｒまたはＰｈｅであり、そして１４位のＸaaはＴｒｐ、ＨｉｓまたはＡｌａである。
（xi）配列：配列ＩＤ Ｎｏ．５：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列：配列ＩＤ Ｎｏ．６：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列：配列ＩＤ Ｎｏ．７：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列：配列ＩＤ Ｎｏ．８：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列：配列ＩＤ Ｎｏ．９：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列：配列ＩＤ Ｎｏ．１０：
Claims (10)
- （ｉ）マウスで全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）様疾患を誘導する病原性抗ＤＮＡモノクローナル抗体の重鎖または軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１２個かつ多くとも３０個のアミノ酸残基のペプチド、その塩または化学的誘導体；
（ii）直接または短い結合鎖を介してたがいに共有結合した（ｉ）の２つのペプチドを含む２重合成ペプチド；
（iii）（ｉ）のペプチドの複数の配列からなるペプチドポリマー；および
（iv）巨大分子担体に結合した（iii）のペプチドポリマー
よりなる群から選択される合成ペプチド。 - 以下の式の配列Ｉａからなる請求の範囲第１項記載のペプチド：
ＴＧＹＹＭＱＷＶＫＱＳＰＥＫＳＬＥＷＩＧ （Ｉａ）。 - 以下の式の配列IIａからなる請求の範囲第１項記載のペプチド：
ＥＩＮＰＳＴＧＧＴＴＹＮＱＫＦＫＡＫＡＴ （IIａ）。 - 以下の式の配列IIIａからなる請求の範囲第１項記載のペプチド：
ＹＹＣＡＲＦＬＷＥＰＹＡＭＤＹＷＧＱＧＳ （IIIａ）。 - 以下の式の配列IVａからなる請求の範囲第１項記載のペプチド：
ＧＹＮＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧ （IVａ）。 - 以下の式の配列Ｖａからなる請求の範囲第１項記載のペプチド：
ＹＹＣＡＲＳＧＲＹＧＮＹＷＧＱＧＴＬ （Ｖａ）。 - ペプチドＩａ〜Ｖａの２つの異なる配列が共有結合した、請求の範囲第１項記載の２重合成ペプチド。
- 配列Ｉａ〜Ｖａから選択される複数の同一配列を含有する、請求の範囲第１項記載のペプチドポリマー。
- 請求の範囲第１項から第８項までのいずれか１項に記載の合成ペプチドまたはペプチドポリマー、または請求の範囲第２項から第６項までのいずれか１項に記載の少なくとも２つの異なるペプチドの混合物、および薬剤学的に許容される担体からなる、薬剤組成物。
- 全身性エリテマトーデス治療用の医薬組成物を製造するための、請求の範囲第１項から第８項までのいずれか１項に記載のペプチドまたはペプチドポリマー、または請求の範囲第２項から第６項までのいずれか１項に記載の少なくとも２つの異なるペプチドの混合物の使用。
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