JPH07502977A - 免疫関連疾患用治療薬としてのｔ細胞レセプターペプチド - Google Patents

免疫関連疾患用治療薬としてのｔ細胞レセプターペプチド

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JPH07502977A JP5500563A JP50056393A JPH07502977A JP H07502977 A JPH07502977 A JP H07502977A JP 5500563 A JP5500563 A JP 5500563A JP 50056393 A JP50056393 A JP 50056393A JP H07502977 A JPH07502977 A JP H07502977A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫関連疾患用治療薬としてのＴ細胞レセプターペプチド関連出願に対しての相 互磐照 これは１９９１年５月３１日に提出された米国特許出願に０７／７０８．０２２ の一部継続出願であり、そしてこのものは１９９０年７月１９日に提出された米 国特許出願Ｎａ０７１５５４．５２９の一部継続出願であり、そしてこのものは １９８９年７月１９日に提出された米国特許出願に０７／３８２．８０４の一部 継続出願であるところの１９９０年１月１９日に出願された米国特許出願隘０τ 、４６７．　０７７の一部継続出願である。
発明の背景 発明の分野 免疫学および免疫療法の分野における本発明は免疫関連疾患を予防し、抑制し、 そして処置することかできるペプチドおよびその薬学的組成物を志向している。
特に本発明は多発性硬化「の臨床的な改善をもたらす療法を提供する。
背景技術の説明 目己免疫疾吏はナストの組織の免疫系による希望しない警告のない攻撃により特 徴つけられる。これらの疾萄の進行の機構についてはよく理解されていないので 、少なくともこのような（そして他の）状況においては抗原の提示に関する詳細 の幾つかが明らかにされつつある。自己抗原を含む抗原は抗原を提供する細胞（ Ａ　Ｐ　Ｃ）と化学反応を行い、その結果生成するフラグメントが主たる組織適 合性複合体（ＭＨＣ）によりエンコードされた細胞表面タンパク質のうちの一つ とその場合に連結すると現在では考えられている。その結果ペプチド抗原を認識 することはＭＨＣに“限定される”と言われる。Ｍ　ＨＣ／抗原フラグメント複 合体かＴリッパ球の表面て相補的なＴ細胞レセプター（Ｔ　ＣＲ）と結合する時 には、クロー７の活性化や増殖あるいは特定のＴＣＲを有するＴリンパ球の再区 分か生しる。一度活性化が起きるとＴ細胞は化学反応した抗原を示す免疫系の他 の細胞を制御し、そして認識された抗原のエピトープを運搬する細胞あるいは組 織を破壊する。
Ａ＋ｈ＋−０＋ｂｉｉらの著した自己免疫疾患でのＴＣＲの役割に関する総説１ ＾ｎｎ、　Ｒｅｖ。
１ｍｍｕｎｏ１．　７：　３７１−４０５　ｆ１９８９））ては個体の免疫系て 使用てきるＴＣＲの凄ましい変化ならびに生殖系列遺伝子体制によるこのような 多様化とＴＣＲαおよびβの連鎖をエンコードするＤＮＡの転位反応が発生する ことについての討論が行われている。α連鎖は可変部（■）、接合部（Ｊ）およ び不変部（Ｃ）の領域遺伝子セグメントを様々に結合させてエンコードされる。
ＴＣＲβ連鎖は付加的に多様性（Ｄ）　ｆｌｉ域遺伝子セグメ７トによりエンコ ードされ、かくして転位したＶＤＪＣ配列を包含する。アレリック的除外を行う ためにＴ細胞のクローンは唯一のタイプのＴＣＲα−βヘテロニ量体を発現する 。
増加しつつあるヒト疾患は性質から自己免疫として分類がなされる（Ｔｈ＋ｏｌ ＋１ｏｐｏｕｌｕｉ、＾、Ｉｎ：　Ｄ、Ｐ、５ｌｉｌｔｉら出版、　Ｂｉ＋ｉｃ ！ｎａ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌｌａ＋ｍｕｎｏｌＢｙ、ＬｚｎＨＭｅｄｉｕｌ　Ｐｕ ｂｌｉｃ＋１ｉｏｎ＋、ロス・アルトス、カリフォルニア州。
１９８８年参照のこと）が、幾つかの例としてリウマチ性関節炎（ＲΔ）、重症 筋無力症（ＭＧ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全生物が感染する紅斑性狼［Ｆ（Ｓ ＬＥ）、自己免疫甲状腺炎（ハノモト甲状腺炎）、グレージス病、炎症性腸疾患 、自己免疫ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎およびあるタイプの糖尿病が挙げられる 。動物モデルか多くのこれらヒト自己免疫疾患に対して開発されている。最もよ く研究されたモデルとして実験的アレルギー性脳を髄炎（ＥＡＥ、　また実験的 自己免疫脳を髄炎と呼ばれる）が挙げられるか、これはＭＳに対するモデルであ る。
これらおよび他の自己免疫疾患が、そのＴＣＰがＭＨＣ／自己抗原（あるいは非 自己抗原）複合体に結合することにより刺激されたＴヘルパー細胞の作用を含む ものであることが今や公知のことであるから、ＭＨＣ／抗原複合体とＴＣＲの間 の相互作用に基つく予防および／あるいは処置が提案されてきている。Ｗｒｓｉ ｔｈ。
Ｄ、Ｃらはｆｃ＋１１．　５７：　７０９−７１５（１９８９））この原理に基 つく研究法を提案しているが・これにはＴ細胞全体（最初にｌ、　Ｒ，Ｃｏｂｕ の研究室により記述され、下記に記載されている）にワクチン注射すること、Ｔ ＣＨに結合している抗体を使用して受動的封鎖を行うこと、複合体のＭＨＣ部分 に結合している抗体を使用して受動的な封鎖を行うこと、Ｔヘルパー細胞マーカ ーであるＣＤ４と反応性がある抗体を投与すること、および関心のある抗原の擬 態を行い、そしてＭＭＣ分子あるいはＴＣＲ分子と結合することを競うペプチド を使用することが含まれる。
ミニリン塩基性タンパク質ＭＢＰはＥＡＥに包含される主要な自己抗原であり、 ＭＳに含まれる起脳炎原としての主たる候補である。
Ｈｅｂｕ−に＋＋＋グループ（Ｉｌｅｂｕ−Ｋｘｌ＋、Ｅら、　Ａｎｎ、　Ｎ、 　Ｙ、＾ｃ！ｄ、　Ｓｃｉ、　５４０：　５７６−５７７　ｆ１９８８）　：　 Ｏｖｂ＋＋ｈｉら、ｊ、ε＋ｐ、　Ｍｔｄ、１６８：　２１５３−２１６４（１ ９８８年１２月））はラットのＴ細胞によるＭＢＰエピトープの認識の特異性を 詳細に解析している。ＭＢＰにより免疫性を付与されたラットから得られるＴ細 胞がマウスのＴリンパ腫系列とハイブリットを形成し、クローン化がなされた時 には、クローンの７５％が反応して６８〜８８個の起脳炎性決定因子になるけれ ども、ＴＣＲＶβ遺伝子転位の詳細な特異性のパターンおよびサザンブロツティ ング分析ではポリクローナル的応答が示された。１０．１８として詳細に示され 、１個の起脳炎原性Ｔ細胞ハイブリドーマに向けられているモノクローナル抗体 （ｍＡｂ）はＭＢＰ６８−８８エピトープに対して特異性を示すＴ細胞クローン とのみ反応した抗イデイオタイプあるいは抗クロノタイプであることが証明され た。このｍＡｂは起脳炎原性のＭＢＰペプチドを場合によっては５日後に注射し た場合、ＥＡＥをブロックするか反転することができた。可溶性のｍＡｂｌｏ、 １８は特異なＴ細胞クローンをブロックし、そして固定化されたｍＡｂｌｏ、１ ８はその増殖を刺激する結果となった。ＭＢＰによるＥＡＥの誘発に従い、ｍＡ ｂｌｏ、１８に結合している細胞の比率は最初の非常に低い頻度から増大した。
著者らはｔｏ、１８＋Ｔ細胞がおそらくルイスラット中の主要な病原性Ｔ細胞レ パートリ−を示すものであると結論している。しかしながらｍＡｂｌｏ、１８が Ｖ領域あるいはイディオタイプ決定因子を認識したかどうかは未知のことであっ た。
ＴＣＲαβヘテロニ量体を発現するＴ細胞はＴ細胞の機能を制御することができ るイディオタイプおよびＶ遺伝子族に特異な抗体を誘発することができる（Ｏｖ ｂ！ｔｈｉ　ら、上記；　Ｇｏ＋ｏｉｇｎ＋　ら、ＰＩＯＣ，Ｎ！Ｉ１．　Ａｃ ５ｄ、Ｓｃｉ、、米国、　８４：　２９３６！１９８７１　：　Ｋｘｐｐｌ＋＋ 　ら、Ｎ＋ｌａ＋＋、３３２：　３５（ｌＮＢ］：　Ｋｔｐｐｌｕら、Ｃｅ１ｌ 、４９：　２６３ｆ１９ｇ？）：　ＭｘｃＤｏｎ＋ｌｄら、　ｊｌｚｌａ＋ｃ、 ３３２：　ｆＯ（１９８８）　）　ｏ例えばＴＣＲＶβ８配列を認識する抗体は マウスおよびラットにおいて自己免疫の予防および処置に効果的であったｆｏｖ ｈｕｈｉら、上記、＾ｃｌ＋＋−０＋ｂｅ＊ら、　Ｃａ１１．　５４：　２６３ −２７３（１９８８１：ＵｒｂＩｌｌら、　Ｃｅ１１．　５１：　５７７−５９ ２（１９８８））。■領域遺伝子に対して選択性を有するそのような抗体を得る ことは、関連するＶ遺伝子族によりエンコードされたＴＣＲを発現するＴ細胞ク ローンの利用可能性にずっと依存しており、特異性を確立するような細胞全体を 使用しての労力を要するスクリーニング操作を必要とする。
抗体がＭＨＣ分子およびＣＤ４分子を志向している抗体療法は一般に自己免疫性 の幾つかの動物モデルにおいて成功してきているのに対して、これらの研究法は 非特異的すぎるものであり、潜在的にはあまりにも抑制的であるが、それはＴ細 胞の７０％がＣＤ４マーカーを有し、そしてすべてのＴ細胞が媒介する応答およ び大抵の抗体の応答がＭ）（Ｃ関連抗原の提示を必要とするためである。
多発性硬化症（ＭＳ）は中枢神経系の単核細胞の浸透および脱髄を特徴とする免 疫媒介疾患である。ＭＳの病因は未知であるけれども、遺伝子的因子および環境 的因子が病気の過程で関係付けられてきている。遺伝子的疾病素質の主要な要素 として病気への次のものとの関連が含まれる、すなわち特別なりラス■主要組織 適合複合体（Ｍｌ（Ｃ）ハロタイプ、特にはＨＬＡ−ＤＲ２１およびＨＬＡ−Ｄ Ｑｗｌ　（丁ｕｉｔ＋ｉａら、５ｃｉｅｎｃｅ、１９３３：　１２４５−１２４ ７（１９７６）：　Ｈｏら、ｌ＋ｎｕｎｏｇｕｕｌｉｃ＋。
Ｉｓ：　５０９−５１７１１！２）：　ＳｐｔｅｌｍＪｎ　ら、Ｅｐｉｄ＋ｍ１ ｏ１．　Ｒｒｖ、４：　４５−６５（１９８２）：　Ｆ＋＋獅モ奄■ ら、　Ｌ＋ｎｃ＋ｌ、ｌ：　２１ド１９８６］：　Ｅｌｉｔｎ　ら、　Ｄｉ＋ｅ ｚｕ　Ｍｕｋｕｔ、５：　８９−９９（１９８７））であり、同様にＴ細胞レセ プター（ＴＣＲ）のα一連鎖およびβ一連鎖内部の一定の冬型性である（Ｂｃｚ ｌｌら、　Ｊ、Ｃａ１１．　Ｂｉｏｃｂ＋ｉ、、ＩＩＤ：　２２Ｈ１９８７１： 　Ｈｚｕｒｅｔ　ら。
］Ｉｌ＋ｕ＋ｏ１．．　８９：　２７５−２７７（１９８９）、５ｅｂｏａｎ　 ら、Ｃｔｌｌ、５７１　１０９５−１１００（１９０））。
■ れらの研究はこの疾ＷかαβＴＣＲを保持するＣＤ４＋Ｔ細胞を包含することを 示唆している。この考えを指示するような場合ＣＤ４＋Ｔ細胞は活性のある患者 の脳における単核細胞の主要成分を提示し、α一連鎖Ｔ細胞レセプターはＭＳの 患者の中枢神経組織内部に存在しており、対照には存在しない（Ｔｕ！＋ａｉｄ ら。
５ｃｕｎｃｔ、１９３：　１２４５−１２４７（１９７６１）。
ミニリン塩基性タンパク質を認識するＴリンパ球は動物体内で強力な脱髄作用お よび起脳炎原性作用を有することが示されてきている（Ｂｔｕ−Ｎｅｏら、　Ｅ ｕ、１１１Ｉｍｕｎｏ１．、ＩＩ：　１９５−１９９（１９８１）：　ｌｊ＊＋ Ｆ＊＋ｌｉｎら、ＮｅｖＥｎｇ、Ｉ、Ｍａｄ、、３０７：　１１８R− １１８８１１９１１２１　：　Ｍｏｋｈｌｕｉｚｎら、ＮＮｕｎ、３０９：　３ ５６−３５Ｈ１９８４１：　Ｖｚｎｄｕｂｕｋら、ｊ。
ｉ＋ｕａｎｏ１．、　１３５：　２２３−２２８（１９８５）＋　２＋５ｗ１ｌ 　ら、Ｎｚｔｕ＋＋、３１７：　３５５−３５Ｈ１９８５）■ Ｂｏｕ＋ｆｉｌｅ　ら、　Ｃｔｌｌ、ＩＩ！ｌ０ＩＩＯＩ、１１２：　３５１− ３６３（１９８８１）、蓄積した証拠事実はまたＢＰに特異なＴ細胞がＭＳの発 病に寄与するかもしれないことを示唆している。
かくしてｉｎ　ｖｉｖｏ活性化に基づいてＭＳ患者から選択された細胞はＢＰに 対して特異性を有している。ＢＰと反応するＴ細胞の頻度はまた、ＭＳ患者の血 液および脳を髄Ｊ＆（Ｃ３Ｆ）中においても通常の個体あるいは他の神経疾患を 持つ密番と比較して増大する。さらに最近の研究は個々のＭＳ患者と比較して相 対的にＣ３Ｆ中のＢＰと反応するＴ細胞の選択的な富化が著しいことを示してい る。
動物においてはＴＣＲのα一連鎖可変物（Ｖａ）およびβ一連鎖可変物（Ｖａ） の遺伝子の限定した組合わせがＢＰに対して特異なＴ細胞により利用されている 　（＾ｃｂ＋−０＋ｂｅｘら、Ｃｔｌｌ、５４１２６３−２７３ｆ１９Ｈ）：　 Ｕ＋ｂ＋ａら、Ｃｃｌｌ、５４：　５７７−５９２！１９８ｇ）　：　）ｌ＋ｂ ｕ−に！ｌ＋ら、１ｍｍｕｎｏ１．　Ｔｏｄａｙ、１０：　１６４−１６Ｈ１９ ８９１）、これらの領域に向けられたモノクローナル抗体あるいはこれらのＴＣ Ｒ可変可変域傾城通な配列を有する合成ペプチドは実験的自己免疫脳を５炎（Ｅ ＡＥ）の臨床的徴候を示す動物を保護することができるし、また処置することも できる（ＡｃｈＩ−０＋ｂｅｔら。
Ｃａ１ｌ、５４：　２６３−２７３（１９８８）、Ｕｔｂｕら、Ｃｅ１１．　５ ４：　５７７−５９２（１９８８）：　ＶＩｏｄ＋ｎｂｕｋ@ら。
Ｎａｔｕｌｅ、３４１：　５４１−５４４（１９８９）、ｔｌｏｗｔｌｌら、５ ｃｉｅｎｃｅ、２４６：　６Ｈ−６７０（１９８９））。類■ の研究法がＭＳＳ看者適用されるためには、潜在的に病原となるＴ細胞が優先的 に限定された組合わせのＶ領域遺伝子を利用するかどうか知ることがまた重要で ある。
１、Ｒ，Ｃｏｈｕの研究室はＥＡＥ、実験的自己免疫甲状腺炎（ＦＡＴ）　、お よび実験的関節炎を処置し、予防するためのワクチンとして生存しているかある いは毒性を減少させたＴリンパ球全体を利用する自己免疫の免疫に特異な処置に 対する研究法を開発した。この研究法はＣｏｂ＋ｎ、１．　Ｒ，、１ｍＩＩｕｎ ｏ１．　Ｒｅｙ、、　９４：　５−２１１１９８６＋に概説されているが、その 中では疾患に対して特異的なＴリンパ球を伴うワクチン注射が予防効果および治 療効果を生み出すために使用されてきていることを特徴とする自己免疫疾咀動物 モデルの幾つかについて討議されている。ワクチン注射の詳細な特異性はおそら ＜ＴＣＲと関係するＴ細胞の認識の詳細な特異性により表示されている。例えば ２個の異なる抗ＭＢＰのＴ細胞系列はそれぞれ異なるＭＢＰエピトープに対して 反応性を有しており、特定のエピトープにより特別に誘発されるＥＡＥに対して ワクチン注射を行うことが見出されているが、これは幾つかの形態の抗イデイオ タイプ免疫性を示すものである。しかしながら非りローノ細胞系列からＭＢＰに 特異的であるかあるいはチログロブリンに特異的であるＴ細胞（甲状腺炎モデル において）のクローンを単離する試みがなされた場合には、疾患を発生させるク ローンのみが得られ、耐性を有するものは得られない。このことは細胞膜の適切 な凝集あるいは硬化が静水圧かあるいは化学的栗橋により起こり、より以上に首 尾一貫して防御を誘発することができた細胞を生しるという発見につながること になった。同様にしてＭＢＰに特異的な細胞を（、起脳炎原性発現以下となるよ うな）少量使用してまた致死的なＥ　Ａ　Ｅの耐性を誘発することができた。こ の防御状態は“抗自己免疫”と称された。この状態には特異的にワクチン注射を するＴ細胞に対応して増殖することができ、１ｎｖｉｔｒｏてエフェクタークロ ーンを抑制することができ（非特異的でおそらく抑制リンホカインの放出により 起きるであろう）、そしてｉｎ　ｖｉｖｏて借用的に抗自己免疫を移動すること ができる。そのような抗自己免疫には特異的なエピトープに対する抑制した遅延 超高感度（Ｄ　Ｈ）な応答ならびに臨床疾咀の予防および寛解を伴う。
前述の研究法の主たる難点は十分な定義のなされた治療薬を含まない複雑な生物 学的プレパラートの使用を必要とすることである。そのようなプレパラートはＩ Ｉな生成および維持の要件か必要であり（例えば無菌状態および多数の“ワク千 グＴ細胞を生成するための大量の培地を必要とすること）、バッチからバッキに かけて再現性を欠いたものとなっている。Ｔ細胞“ワクチン”プレパラートはヒ トに対して有益となるためには同原であり、また個々には特異的すなわち独自に 各患者に対して調製されなければならない。さらに添加する抗原がそのようなＴ 細胞の表面に存在することによりより広い、おそらく有望である所望のＴ細胞ク ローンに限定されない免疫的応答を生じる結果となるかもしれない（Ｏｌｌｎｕ ら、Ｉ、Ｎｅｕ＋ｏｉｍｉｕｎｏ１．、　２１：　１３−２２（１９８９１）。
それゆえ標的となる自己免疫的応答に対する特異性、その選択における予測可能 性、調製の便宜と再現性、および投与量を正確に制御することのできる十分な認 識力のような性質を有する試薬および薬学的組成物に対する大きな需要が存在す る。
現在ではＭＳに対する効果的な処置は未知のものである（ＨＩＮ口００著。
Ｐ＋ｉｎ＋１ｐｌｔ＋　ｏｆ　１ｎｌｕｎｉｌ　Ｍｅａｉｅｉｎｅ、第１２版、 Ｗ山ｏｎら、　ＭｃＧｒｉｖ　Ｈｉ目社、　１９９１年）。治療効果は急性エピ ソードの改善、疾患の悪化あるいは進行の予防、および症状の寛解を志向したも のである。ＭＳを臨床的に明示することは脳幹、小脳あるいはを髄のいかなる神 経グループあるいは神経領域が包含されているかに依存している。を髄か包含さ れていることはＭＳの最も進行したケースにおける主要な特徴である。
疾患の急性エピソードではグルココルチコイド処理は症状および速度の回復の激 烈さを低下させる潜在能力を有することが示唆されてきているが、しかしながら その提供者でさえこの薬剤では最終的な挽回はされず、また永久的な作用不能状 態も変わらないことを指摘している。Ａ　ＣＴ　Ｈは臨床医の好ましいグルココ ルチコイドであるが、それはＭＳのエピソードおよび視神経炎症においてグルコ コルチコイド療法の効力かあることを示す単に制限された試みがこの薬剤により 行われたからである。しかしながら長期間ステロイドを使用することは勧められ ない。
アザチオプリンやシクロホスファミドのような免疫抑制剤は幾つかの系列におい て再発悪化の数を減少させるために挙げられてきているが、これらの薬剤の効力 についてはまだコンセンサスは得られていない。
ＭＳを処置するために現在推薦されていることは症状の悪化を避けるための試み について堂々巡りをしていることである。ｗ者は過度の疲労や極度の高温を避け ること、およびバランスのとれた食事をすることを忠告されている（上記の討論 は最初はＨｏｒｉｚｏｎ著、　Ｐ＋ｉｎ＋１ｐｌｕ　ｏｆ　Ｉｎ１ｕ＋ｎｌ　Ｍ ｅｄｉｃｉｎ＋、第１２版、　＋９９１の第３５６章から出典したものである。
）。
発明の要約 本発明は、最も進んだ免疫治療学的および免疫薬理学的な研究法を適用した場合 のように免疫性を全身的に抑制するようなことを引き起こさないで、クローンに 特異的なやり方で免疫関連疾患を予防し、抑制−そして処置することができる治 療薬および組成物が明確に必要とされたことに対応してなされたものである。
本発明は実際に自己免疫疾患を媒介する自己抗原に対して特異的なＴ細胞の系列 あるいはクローンは複雑な希釈記録による治療学に転換でき、疾患を予防しある いは処置するために動物に直接注射するという知見から展開されたものである。
このような今までの研究者の知見に基づく細胞免疫療法を達成するための発明者 の試みは最適の結果にまで到達するものではなかった。先行技術に開示されてい る希釈法を使用した場合に発明者は変化する予見できないレベルの予防が達成さ れ、そしてその結果得られる免疫性はクローン的には制限されたものであったが 、おそらくこれは細胞“ワクチン”全体が多様な抗原を取り入れるからであろう 。
一般的な研究法を単純化し、標準化し、そして疾患関連抗原を認識したＴ細胞の ようなりローンのみが影響を受けることを特徴とする高度に特異的な免疫性を達 成する試みにおいて、本発明者は本発明を考えついた。病気の過程に包含される Ｔ細胞のＴＣＲのような疾患関連の免疫学的“マーカー”を模倣する免疫原性の あるペプチドが合成できることが初めて本発明者により認識された。予期しない ことにペプチドを伴う検体の免疫化は“マーカー”に対するホストの免疫応答を 志向するものであり、それにより疾患の展開を予防するかあるいは抑制するか、 または進行する病気の処置を行う。
本発明の一つの特徴は、疾患と関連するマーカーＴＣＲのアミノ酸配列を同定す ることに基ついて免疫関連疾患を予防し、抑制し、あるいは処置するためにどの ペプチドを使用するかを選択し、幾つかの公知のアルゴリズムに基づいてＴＣＲ 配列のどのセグメントが免疫原性があるかを予知し、そして病気を予防する結果 に至るような免疫応答に対する適切な標的がＴＣＲ構造のどのような部位にある かを決定するための方法であることである。
本発明の一つの実施例は免疫関連疾患に相関するマーカーＴＣＰであるようなＴ ＣＲのアミノ酸配列を含む１５〜３０個のアミノ酸を有するペプチドである。
このペプチドあるいはその誘導体は疾患からの予防を引き出すことができる。
関連する実施例は次に示すペプチドの一つあるいは結合体（カクテル）を効果的 な量だけ処理することを含むＭＳ患者の処置方法である、すなわちＶＢ２．２　 （２６−４３）、ＶＢ２．２　（３９−５９）、ＶＢ２．　２　（５９−７８） 。
ＶＳ２．１　（１−２２）、ＶＳ２．１　（３９−５９）、ＶＳ２．１　（７０ −８８）。
ＶＢ２．２　（３９−５９）、ＶＢ２　（４４−５４）、ＶＢ２．６　（３９− ５９）および■α２である。
本発明の他の実施例は上記のペプチドを志向したものであり、その配列はＣＤＲ ２のようなＴＣＲの領域（ＣＤＲ）を決定する相補性の少なくとも一部である、 ＶＤＪ領域のようなＴＣＲＶ遺伝子かあるいは特異なＶ遺伝子の部分によりエン コードされている。本発明はまたペプチドの免疫原性を強めるために付加する異 種のアミノ酸配列のようなキャリアと接合したペプチドをも包含する。
本発明はまた薬学的に受け入れることができる結合剤との混和物中でペプチドお よびその誘導体を含む薬学的組成物を志向している。
このように本発明は疾患の過程の誘発あるいは促進に対して責任を宵する特異な 免疫学的応答を中絶するために、指定された免疫関連疾患に特異的に応用するこ とがてきる化学的に定義したペプチドおよび治療薬を提供する。
本発明が特に有用である疾患として、リウマチ性関節炎、アジュバント関節炎、 重症筋無力症、脳を５炎、多発性硬化症、甲状腺炎、糖尿病、炎症性の腸疾患、 全生物に関する紅斑性狼瘉のような自己免疫疾患か挙げられる。本発明はまたＴ ＣＲか腫瘍マーカーとして作用することを特徴とするＴ細胞白血病およびリンパ 種のような悪性疾患を志向している。
本発明は上記のＴＣＲペプチド、その機能性を有する誘導体あるいはペプチドを 含む薬学的組成物のうちの１個を投与することを含む免疫関連疾患を予防し、抑 制し、そして処置するための方法を提供する。
本発明の一実施例として次のものを含む免疫関連マーカーであるＴ細胞レセプタ ーのアミノ酸配列を何するペプチドを選択するための方法が挙げられる、すなわ ちこの方法は （ａ）疾もにかかりやすい検体からＴ細胞を除去し、（ｂ）自己抗原プレパラー トの存在下に培養物中のＴ細胞を展開し、（ｃ）展開したＴ細胞により発現され るＴＣＲＶ遺伝子を同定し、そして（ｄ）ＴＣＲのアミノ酸配列からペプチドを 選択することから成るものである。
ＴＣＲＶ遺伝子はＴＣＲに特異な抗体を使用することにより、あるいはＴＣＲの アミノ酸配列を決定することにより同定される。
本発明はさらに次のことを含む免疫関連疾患と関連するＴＣＲのアミノ酸配列を 有するペプチドを調製するための方法を提供する、すなわちこの方法は（ａ）上 記のようにペプチドを選択し、そして（ｂ）化学的手段あるいは組み替え手段に よりペプチドを合成することから成るものである。
本発明の他の実施例は、検体を免疫関連疾患から予防することができるＴＣＲペ プチドに対して特異性を有するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体あるい はキメラ抗体、ならびにそのような抗体を調製するための方法を志向している。
また本発明に包含されるものとしてリジン八連鎖のようなリポソーム阻害タンノ 々り質を含む、細胞障害剤に接合した抗体が挙げられる。
本発明にはまた上記の抗体プレパラートの内の１個との受動的な免疫化を行う二 とにより自己免疫疾患を予防し、抑制し、あるいは処置するための方法が含まれ る。
さらに付は加えられる実施例により自己免疫疾患を予防し、抑制し、あるいは処 置することができる防御的Ｔ細胞ならびに次のような過程を含むそのようなＴ細 胞を調製する方法が提供される、すなわち（ａ）疾更にかかりやすい検体からＴ ！ｌｌ胞を除去し、（ｂ）段階（ａ）のＴ細胞をＴＣＲペプチドのようなＴＣＲ を保持する物質の存在下に　培養物中に展開し、そして （ｃ）展開培養したＴ細胞から防御的Ｔ細胞を調製することから成るものである 。
図面の簡単な説明 図１．抗体の反応性のペプチドに特異的な阻害。ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９） ペプチドかあるいはＴＣＲペプチドとＧＰ−３４９Ｓ　ＭＢＰから由来した自己 抗原の結合体により免疫化した４匹のう・ソトから得られた抗血清をプールし、 ４０〜３６０倍に希釈した。この抗血清はマイクロプレートの窪みに塗り付けた ２５ｎｇのペプチドにより直接ＥＬＩＳＡ法で反応性の試験力（行われた。この ペプチドの量は１０ｐＭのＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）Ｃ分子量＝２３９０ダ ルトン）あるいは１５ｐ勅ＧＰ−３４９Ｓ　（分子量−１６３０ダルトン）と当 量である。阻害剤の濃度を変更してペプチドが１窪み当り０．００５〜５０■の 範囲で添加された。吸光度の測定は３個の窪みについて決定され、その反応性（ よ阻害されていない対照窪みの％として計算された。
図２．ＴＣＲＶβ８　（３９−５９）　ペプチド染料ｖβ８＋起脳炎原性Ｔ細胞 に対する抗体。普通の胸腺細胞（ＡおよびＣ）あるいはＧＰ−３４９ＳＩこ特異 的なＴ系列細胞（ＢおよびＤ）をウサギの抗体とインキュベートしてＴＣＲＶβ ８　（３９−５９）にし、次いでマウスの抗ウサギＴｇＧを促進する抗体および フルオレセインで標識したヤギの抗マウスＩｇＧ抗体でインキュベートした。
流通式着色細胞測定分析はＣｏｏｌｌｅ＋Ｅｐｉｃｔ社のＣ型細胞蛍光測定装置 を使用して行った。ＡおよびＣは細胞の大きさ対蛍光強度を表す１０．０００個 の細胞のドツトプロットを示し、モしてＢおよびＤは対応するヒストグラムを示 す。抗ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）抗体（〉９０％着色）により着色したＴ系 列細胞の蛍光強度この抗体で着色した普通の胸腺細胞の５％と比較して増大して （する。
抗ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）ＩｇＧに対して対照として普通のウサギのＩｇ Ｇによりインキュベートした胸腺細胞およびＴ系列細胞は両方とも着色のバソク グラウントレベルを示した（ボックスＤ中の点線）。
図３．５０ｕｇのＴＣＲＶＢ２−３！）５９ペプチド／ＣＦＡＩｍよるＥＡＥの 予防、抑制および処置。ラットに順番に、５０ｕｇのＧＰ−ＭＢＰ／ＣＦＡによ りＥＡＥを誘発させる４０日前、同時あるいは発病１２Ｂ後にＴＣＲペプチドを 注射した。
図４　耳の中に５０Ｉ＠のＧＰ−ＭＢＰ／ＣＦＡによりＥＡＥを誘発させると同 時あるいは７日または１１日後に付与した５０％ｇのＴＣＲＶａ８−３９−５９ によるＥＡＥの抑制。
図５．耳の中に５０■のＧＰ−ＭＢＰ／ＣＦＡによりＥＡＥを誘発させた後の臨 床的徴候（１２日）に対して付与した１０■あるいは５０■のＴＣＲＶａ８−３ ９−５９によるＥＡＥの処置。
図６．ＭＳ患者および通常人から得られたヒトＭＰＢに特異的なＴ細胞系列のペ プチド特異性。
図７．各ペプチドと反応する全クローンのパーセンテージと比較しての各ペプチ ドに向けられたＴ細胞系列の全増殖応答のパーセンテージ。
図８．ＥＡＥを回復し、ＴＣＲペプチドの免疫化を施したラットから得られたＴ ＣＲＶａ８および■β１４ペプチドに対する細胞の応答。ＤＴＨはｆｉ／１００ で、増殖はＣＰＭ／　１０００で、両方ともバックグラウンドを差し引いて示さ れる。
図９．逆行するＥＡＥのＴＣＲＶβ１７ペプチドによる処置。
図１０Ａ　患者のＭＲから得られるクローン＃４１中でのＴＣＲＶａの発現の解 析。オートラジオグラムはＰＣＨにより増大したＴＣＲ生成物を示す。
全ＲＮＡはクローニングしたＴ細胞から調製され、既述のように最初の連鎖ｃＤ ＮＡの合成に使用された（Ｃｈｏｉら、　Ｐｔｏｃ、　Ｎｘｔｌ、　Ａｃ１ｄ、 　Ｓｅｉ米国、８６８９１１−８９４５　ｆ１９８９＋　＋。各ＰＣＲ反応には Ｃα遺伝子セグメント（〜６００ｂｐ）と同様に提示された特定のＶβ遺伝子セ グメント（１７０〜２２０ｂｐ）を拡張するために特異なオリゴヌクレオチドブ ライマーが含まれていた。使用された特異なプライマーの配列およびＰＣＲの詳 細については既述されている（Ｃｂｏｉら、　Ｐ＋ｏｃＮ２１１　＾Ｃｏｄ、Ｓ Ｃｉ米国、　８６１　Ｂ９４１−８９４５（１９８９））。増加した生成物は２ ％のアガロース上で分離され、乾燥され、Ｘ線フィルムに露光させた。Ｐ３２に より末端が標識された３′　プライマー結合が増加した生成物を同定するために 使用された。
Ｖａ５．２ではこのオートラジオグラムは唯一の正のＶβバンドである。
Ｖａ５．２ｃＤＮＡの増加に使用されたプライマーはＶａ５．２および５．３に 共通な配列に対して特異なものである（Ｃｈｏｉら、　Ｐｔｏｃ、　Ｎ＋ｔ１． 　Ａｃ！ｄ、Ｓｃｉ、米国。
８６：　８９４１−８９４５ｆ１９８９１＋。ｃＤＮＡ鋳型を添加しな１．１テ Ｖβ５．　２１５．　３１：特異なオリゴマーを用いる対照のＰＣＲ反応では■ βバントは認められなかった。
図１０Ｂ、患者のＭＲから得られるクローン＃４１のＴＣＲＶα発現の解析。
既述のように（Ｏｋ＋ｃｎｂｕｇら、　Ｎ！ｌｏ＋ｅ、３４５：　３４４−３４ ６（１９９０））　Ｖａに特異的なプライマーを使用してＶａ　ｃＤＮＡが増加 した点を除外して図１０Ａに記述されたのと同様な方法が使用されている。さら にゲル分離の後にナイロン薄膜へ移した後、サザンブロツティングにより内部Ｃ α領域に相当する次に示すようなＰ３２−キナーゼプローブ（５’　−ＡＡＴＡ ＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴ−３”１を使用してハイブリッド形成が行 われ（Ｏｋｔｅｎｂｅ＋ｇら、　Ｌｌｕｅ、３４５：　３４４−３４６（１９９ ０））、そしてオートラジオグラフ測定が実施された。増加したＶα生成物のサ イズは約３２０−３４０塩基対にわたるものであったｆＯｋｕｎｂｕｇら、　Ｎ ！ｌｕｅ。
３１５：　３４４−３４６ｆ１９９０））。Ｖａ１はサザンブロツテイングにお いて唯一の正のノくンドてあった。幾つかの実験に対してサザンブロツテイング よりもむしろスロットブロッティングにより標識したＣαプローブによりノ＼イ ブリッド形成が行われた。
両方の検知技術から同一の結果が得られた。
図１１．ＭＳ患者および通常人から得られたＢＰと反応するＴ細胞クローンにお けるＶα遺伝子の使用に関する要約。方法は図ＩＢおよび表１１表２に記述した ものである。各クローンに対して優勢なＶαバンドのみがこの要約解析に含まれ る。幾つかのクローンはほとんど同一の強度の２個のバンドを有しているために 、多数のＶａの合計は解析したクローンの数より多いかもしれない。ＮＴはＶａ の発現の試験を行わなかったクローンの数を示す。
図１２．ＭＳＳ患者、Ｍ、の抗原と反応するＴ細胞の頻度。
図１３．Ｊ、Ｍ、　のＨ３Ｖ応答。
図１４．Ｍｓ、１９者Ｍ、Ｒ，の抗原と反応するＴ細胞の頻度。
図１５．ＳＪＬマウス中でのＴＣＲ処理。ＰＬＰ（プロテオリポタンパク′Ｍ） はＥＡＥを誘発させるために抗原として使用された。
図１６．Ｇｐ−ＢＰ−５５−６９による予備免疫化はＥＡＥの誘発を禁止させる 。ラットには１０％ｇのＧｐ−ＢＰ／ＣＦＡによる試みに先立って４週間にわた り１００■のＧｐ−ＢＰ−５５−６９／ＣＦＡかあるいはＣＦＡのみを注射した 。
臨床的ＥＡＥは毎日（実施例Ｘ■）の方法に記述された尺度に従って両方のグル ープで評価された。
図１７．クローンＣ４５５−６９の受動的移動によりＥＡＥの誘発は禁止される 。
ラットにはＧ　ｐ　−Ｂ　Ｐ／ＣＦ　Ａによる試みに先立って１４日間１０００ 万個の活性化しｔこＣ４あるいは０５Ｇｐ−ＢＰによりクローン化されたＴ細胞 を注射した。
図１８．抗ＭＢＰクローンにより利用されるＴＣＲ−Ｖβ連鎖のヌクレオチド（ 上部）。イタリック体で示される塩基１−２２はＰＣＲ増殖に使用されるオリゴ ヌクレオチドに由来する（実施例ＸｒＶの方法参照）。Ｄ領域中のアンダーライ ンを引いた塩基は生殖系列の配列を表示し、残りの塩基はＮ領域添加を表示する 。
下部は抗ＭＢＰクローンにより使用されるＴＣＲ−Ｖβ連鎖の予想されるアミノ 酸配列を表示している。Ｖａ８．２配列とは異なる塩基およびアミノ酸残基はク ローンＣ３ｃｐ−ａｐに対する配列の下に示されている。
図１９．ＥＡＥ回復ラットから得られる活性化されそして残っているＴ細胞クロ ーンの発現。細胞は０Ｘ−６で着色し、Ｇｐ−ＢＰ　（４ｇ−ｉ）による活性化 の３日後かあるいはｌ　Ｌ−２で富化した上清（４ｄ−ｆ）中てさらに７日間生 長させた後にＦＩＴＣ接合したヤギの抗ラットＩｇＧにより反対着色を行った。
図４ａ−ｃは同型対照抗体による着色のバックグラウンドレベルを表示する。
図２０．ＴＣＲＶａ８６　およびＴＣＲＶβ’　２３９−５０ペプチドによるＥ ＡＥの処置。ラットに対しては普通にはＧｐ−ＢＰ／′ＣＦＡの注射の１２日後 に臨床的発病の徴候の現れた最初の日に提示された分量のＴＣＲペプチドを皮下 （５ａ）かあるいは皮肉（５ｂ）に注射した。対照グループはＴＣＲＶβ１４３ ９−５９ペプチドを受け入れるかあるいはそうてない場合があった。
図２１．ＴＣＲＶβ８ペプチドにより能動的に誘発されたＥＡＥの処置。
図２２．ＴＣＲＶβ８ペプチドにより受動的に誘発されたＥＡＥの処置。
図２３．ＥＡＥに対抗してＴＣＲＶａ−４４−５４の移動の保護に対して特異的 なＴ系列細胞。
図２４．ＭＳ患者と対照のＣ３Ｆ中のミニリン抗原およびＨ３Ｖと反応するＴ細 胞の頻度。抗原に特異的なＣ５Ｆから得られるＴ細胞の頻度は各ドナーから回復 された抗原と反応するクローン数を分析するＣ３Ｆ　Ｔ細胞の総数で割ることに より計算した。提示された数値は分析対象の９人のＭＳ患者および６人のＯＮＤ 患者に対する平均の士標準偏差を表す。
図２５．ＭＳ患者および対照の血液中のミニリン抗原およびＨ３Ｖと反応するＴ 細胞の頻度。各月者の血液ＭＮＣはＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離法により分離 され、限定希釈分析を行ったｊＬｅｆｋｏｖ山ら、　ｌｌｌ１Ｉｏｎ、　Ｔｏｄ ＋ｙ、　５：　２６５−２６８．　２９５−２９８！１９８４＋）が、このうち で試験した細胞の希釈の範囲ではＢＰ（５０■／ｍｌ）およびＰＬＰ　（５０■ ／ｍｌ）に対しては窪み当り０．３１〜５．０ＸＩＯ５個の細胞があり、そして またＨ　Ｓ　Ｖ抗原に対しては窪み当り０．０１〜０．１６×１０５＠の細抱か ある（ストック溶液の１／　２００．Ｗｈｉｌｌ＊ｋｅ＋　、ベセスダ。
メリーランド州）。抗原に対して能動的増殖応答は３．０以上の刺激指数かある いは１．０００のデルタＣＰＭをバックグラウンド上に有する。すべてのドナー の非反応性のミクロ培養物の平均パーセンテージは各細胞希釈の度毎に計算され 、その負の対数がＸ軸上に、そしてＸ軸上に直線スケールで窪みごとの細胞イン プットがプロットされている。２個以上の実験点か原点（２０％）を通過する直 線に適合するように使用されているが、２個の相互作用する細胞のタイプを示す ものである。１個の前駆体の平均を含む細胞の数は３７％の非反応性培養物のレ ベルで決定される（Ｌ＋！ｋｏｖｉＮら、１ｍＩＩｕ口　丁ｏｄｘ７．　５：　 ２６５−２６８．２９５−２９８　ｆ１９８４＋　＋。
図２６．ＭＳ徂者のＣ３Ｆおよび血液中のＨｕ　−Ｂ　Ｐと反応するＴ細胞クロ ーンのペプチド特異性の比較。Ｃ３Ｆ　Ｔ細胞（１０００／窪み）は定量に先立 ってＨｕ−ＢＰ刺激を行わないで（，４，５００ラド）照射を受けた同厚のＭＮ Ｃ（１×１０５）によりＩＬ−２およびＩ　Ｌ−４により富化された培地中に拡 大されている。血液のＴ細胞クローンはＨｕ−ＢＰにより２回再刺激されている Ｈｕ−ＢＰを限定して希釈することにより得られた。Ｃ３Ｆおよび血液Ｔ細胞両 者の特異性は、抗原のない状態で、２ｇｇ／ｍｌコンカナバリンＡ、　５０ｇｇ ／ｍｌＨｕ　−ＢＰ、５０ｘｇ／Ｈｕ−ＢＰフラグメントすなわちＰＩ、Ｐ２お よびＰ４の存在下に丸底の９６個の窪みのあるマイクロ滴定プレート中で０．２ ｉ１の三重培養物中の１×１０５の照射（４，５００ラド）を受けた同厚のＭＮ Ｃにより２Ｘ１０’個のＴ細胞をインキュベートした７２時間後のチミジンの取 込みにより評価した。
すべてのクローンはバックグラウンド上〉３．０の刺激指数すなわち〉５００Ｃ ＰＭで反応した。データは９人のドナーからの７１個のＣ３Ｆ　Ｔ細胞および５ ０個の血液Ｔ細胞のベアを示している。
好適な実施例の説明 次の説明において、免疫学、細胞生物学および分子生物学の専門家に公知のあら ゆる方法論が参照されている。参照されているそのような公知の方法論について 説明した出版物や他の資料が十分説明された状態で全体としてここに付は加えら れている。
本発明の組成物、方法および生成物がヒトおよび獣医学関係に適用できる。
本発明のペプチドは免疫原性のある、すなわち検体中に注射されたとき免疫応答 を誘発することができる約１５〜３０個のアミノ酸を含む。
“機能的誘導体′は°フラグメント”、“異形”、“類縁体”もしくは“化学的 誘導体”を意味するが、これらの用語は下記で定義する。
本発明のペプチドを含むアミノ酸配列は単独で使用できるかあるいはより長鎖の ペプチドに結合しているか、もしくはその配列に取り込まれていることが理解さ れている。より長鎖のペプチドは関連したＴＣＲに由来する付加的な配列を有し ていてもよいし、またＴＣＰオリゴペプチドの免疫原性を強めるために使用され るキャリアタンパク質のような関連のないペプチド配列を含んでいてもよい。
そのようなキャリアは技術的には十分公知のことであり、例えば鍵穴カサガイの ヘモノアニン（ＫＬＨ）、ランの血清アルブミン、破傷風トキソイド等のような 異種構造のタンパク質を含んでいる。また本発明の範囲に含まれるものとして抗 体に接合したペプチド、そして毒素に接合したペプチドが挙げられる。本発明の 毒素は例えばリンンＡ連鎖もしくはツユ−トモナス毒素のようなリポソーム阻害 性タンパク質を含んでいる。
ここで使用されているように“マーカーＴＣＲ”は、自己免疫疾患あるいは悪性 疾患（例えば癌）のような詳細な説明のなされた免疫関連疾患に特有なＴＣＴ（ を意味する。
ここで使用されているような用語“免疫関連疾患“は、免疫系が疾患の発病に包 含されているか、あるいは適切に免疫系を刺激することにより疾患を予防するこ とができるような疾患を意味する。本発明が志向している免疫関連疾患の好適な 実例として自己免疫疾患が挙げられる。本発明の意図する自己免疫疾患の無制限 な実例として、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、重症筋無力症（ＭＧ）　、多発性硬 化症（ＭＳ）、全生物にわたる紅斑性狼癒（ＳＬＥ）、自己免疫甲状腺炎（１） シモト甲状腺炎）、グレージス病、炎症性腸疾患、自己免疫ブドウ膜網膜炎およ びあるタイプの糖尿病が挙げられる。
このようにＭＳに対するマーカーＴＣＲは自己ＭＨＣとＭＢＰフラグメントの間 の複合体（あるいはＭＢＰフラグメントのみ）と結合することができるＴＣＲで あり、ここでＭＢＰはこの疾患に特有な主要な自己抗原を含んでいる。他の自己 免疫疾患においては、他のＴＣＲはＭＨＣ分子とこれらの疾患に包含される自己 抗原の間の複合体に特異的であるのでマーカーとして役立つ。例えば重症筋無力 症（ＭＧ）においては自己抗原はニコチン酸アセチルコリンレセプター（ＡＣｈ Ｒ）であると考えられている。それゆえ自己ＭＨＣとの関係でＡＣｈＲと結合し くあるいは直接に）、そして病気を媒介したＡＣｈＲと反応するＴ細胞により発 現する同定できるＴＣＲはＭＧに対する“マーカーＴＣＲ”である。専門家はマ ーカーＴＣＲの決定および免疫原性のあるペプチドの決定は、本発明の教示が完 全に理解された場合に、技術的に十分公知であるスクリーニング法を使用して日 常技術を実施に移すことにより達成されるかもしれないと認識するであろう。
またここで使用されているような免疫関連疾患として意図されているのは、腫瘍 細胞が免疫系により認識され、反応することができる腫瘍抗原のような腫瘍マー カーを所持していることを特徴とする腫瘍の悪性度である。ＴＣＲはＴ細胞白血 病あるいはＴ細胞リンパＷ１細胞の腫瘍マーカーとして役立つことができる。
免疫関連疾患に苦しめられるかあるいはかかりやすい検体においては、マーカー ＴＣＲ部分のアミノ酸配列を有するペプチドを導入することにより、ＴＣＲを志 向した免疫応答の発生および免疫関連疾患からの防御が引き起こされる。
ここで使用されているような疾咀からの“防御”という用語により、疾患の“予 防”、°抑制”あるいは“処置”が意図される。“予防′は病気が誘発されるの に先立って防御性のある組成物を投与することを含むものである。このようにし て例えば動物モデルにおいてＥＡＥすなわち病気を誘発する起脳炎原体の注射に 先立って防御作用のある組成物を効果的に投与することにより疾患の“予防”が できる。
“抑制”は誘発作用の後ではあるが疾患の臨床的にみての出現に先立って組成物 を投与することを示す。またＥＡＥの例を使用して起脳炎原体の注射の後にでは あるが神経性徴候の出現に先立って防御作用のある組成物を効果的に投与するこ とは、疾咀の“抑制”を含むものである。
“処置”は発病後に防御作用のある組成物を投与することを含む。ＥＡＥの例で は起脳炎原体の注射の後で、臨床的徴候が現れた後に防御作用のある組成物を効 果的に投与することは、疾患の°処置′を示すものである。人体医学においては 、究極的な誘発効果は未知であり、潜伏性があり、あるいは徴候の発現の十分あ とになるまで確認されていないから“予防”および“抑制”を識別することはい つも可能であるとは限らないということが理解されよう。それゆえここで定義さ れているように″予防′と“抑制”の両者を包含する“処置”とは異なるような °予防措置”という用語を使用するのが普通である。
自己免疫疾患を志向する本発明の実施例に対しては、検体の免疫応答は自己免疫 疾患を媒介するＴ細胞をマークする特定のＴＣＲを志向しており、その結果致命 的であるＴ細胞の機能を禁止することになる。
一般にはペプチド配列はＴＣＲそれ自体の一部分を表すものであり、好適には＠ 抱外部にあり、抗体やあるいは他のＴ細胞に接触し、そしてＴＣＲを保持するＴ 細胞の活性における生物学的重要性を有するようなＴＣＲの部分に相当する。
本発明の目的に対しては、下記に定義するようにペプチドは免疫原性のあるもの でなければならない。
本発明のペプチドはＴＣＲのＶ　ｔｉＩ　＠　ｇ分に相当するものを含んでいる 。さらに好適にはペプチドはＴＣＲβ連鎖のＶ　Ｄ　Ｊ　領域あるいはＴＣＲα 連鎖のＶＪ領領域セグメントに相当する。好適な実施例においては、ペプチドは ２番目のＣＤＲ（ＣＤＲ２）のようなＴＣＲヘテロニ量体の領域（ＣＤＲ）を決 定する３個の相補体のうちの１個のものの少なくとも一部に相当する。また本発 明の範囲内で意図されるものは、ＴＣＲγ連鎖およびＴＣＲδ連鎖、そのｖｌ域 およびＣＤＲ構造あるいはγδヘテロニ量体における相同体の少なくとも一部に 相当するペプチドである（Ｓｌ＋ｏＩＩｉｎｇｏ、１．　Ｌ、、Ｃｔｌｌ、５７ ：　８９５−８９８（１９８９）およびＣｌｒｗｔｎら。
ＡｎｃＲｌｖ、１ｌＩｌｎｏｏｏ１．、６：　６２９−６６２（１９８８１参照 ）。
ＴＣＲのＣＤＲは、ＣＤＲが抗体に接触し、抗体結合部位の決定的な部分を構成 する変化が困難かあるいは容易な連鎖のアミノ酸配列を含むことを特徴とするイ ムノグロブリンの構造に類似したものとして定義される。３個のＴＣＲのＣＤＲ は抗体およびＭＨＣとの結合に関与しているものと考えられている（Ｄｒマ目１ Ｍ。
Ｍ　ら、Ｎｘ＋ｌｔｅ、３３４：　３９５−１０２（１９ｇＢ）；　Ｃｌｉｗｕ ｉｓら、１ｍ１ｕｎ、Ｔｏｄ＋７．　ＩＱ：　ＩＱ−１４ｆｌ！９＋）。本発明 の検体、防御的抗体あるいは防御的Ｔ細胞の“マーカーＴＣＲ”のＣＤＲのうち の１個に対抗する免疫応答を志向することにより、自己抗原および／′あるいは ＭＨＣの自己免疫性関！Ｔ細胞の相互間の必要な結合あるいは認識の結果を阻害 する可能性が増大する。
本発明のペプチドの“フラグメント”は、分子のどのような部分的集合をも、す なわち短鎖ペプチドを表す。
ペプチドの“変異型”はペプチド全体かまたはそのフラグメントに本質的に類似 した分子を表す。変異型ペプチドは便宜的には技術的に十分公知の方法を適用し て変異型ペプチドを直接に化学合成することにより調製してもかまわない。
さらにはペプチドのアミノ酸配列変異型は合成したペプチドをエンコードするＤ ＮＡにおける突然変異により調製することができる。そのような変異型は例えば アミノ酸配列内部の残基の１１１除、挿入あるいは置換を包含する。削除、挿入 および置換のどのような組合わせもまた、最終的な構成体が所望の活性を保持す るものと仮定すると、最終的な構成体に到達するように処置してもかまわない。
明らかに変異型ペプチドをニジコードするＤ　Ｎ　Ａ中で生しるような突然変異 は読取り枠を変更してはいけないし、また好適には二次的なｍＲＮＡ構造を生成 できるような補足的な領域を生み出すようなことはないであろう（ヨーロッパ公 開特許走ＥＰ７５，４４４参照）。
遺伝子的レベルにおいてはこれらの変異型は普通はペプチド分子をエンコードす るＤＮＡ分子中でヌクレオチドの部位を志向した突然変異により調製され、この ことにより変異型をエンコードするＤＮＡを生成し、その後に組替え細胞培養物 中でＤＮＡの発現を行う。変異型は典型的には非変異型ペプチドと同一の定性的 な生物学的活性を示す。
これに従ってのペプチド変異型の調製は好適には早期に調製された変異型あるい はＴＣＲタンパク質もしくはペプチドの非変異型バージョンをエンコードするＤ 　Ｎ　Ａの部位に対して特異性ををする変異の誘発により達成される。部位に対 して特異性を宵する変異を誘発する結果、十分な数量の隣接ペプチドと同様に所 望の突然変異を起こしたＤＮＡ配列をエンコードする特異なオリゴヌクレオチド 配列を使用することにより、ペプチド変異型が生成し、そのため横断している消 去結合の両側に安定な二重らせんを形成するための十分なサイズと配列の複雑さ を有するプライマー配列か提供される。部位に対して特異性を有する変異の誘発 技術は従来技術では十分に公知のことであり、＾ｄｅｌ＋ｕｎら、　ＤＮＡ、２ １１８３（＋９８３）により例示されているとおりである。部位に対する志向性 を有する変異の誘発に有用な典型的なベクターには、例えばＭｅ＋＋＋ｎｇら、 第３回巨大分子と組替え体クリーブランドンンボジウム、　Ｗｉｌｔｏｎ、　へ 編集、　Ｅｌ＋＋マｉｅ＋社、アスパルチル（１９８１）に開示されているよう にＭ１３ファージのようなベクターが含まれる。これらのファージは容易に購入 することができ、その使用は一般には専門家には十分に公知のことである。さら には一本鎖復製ファージ基本体を含むプラスミドベクターｔｈｉｎｓら、　Ｔｏ ｌｈ、Ｅｏ＋）ｍｏｌ、、１５３：　３（１９８７））は一本鎖ＤＮＡを得るた めに採用してもかまわない。
一般にはこのものと関連する部位に対して志向性を有する変異の誘発は、関連ペ プチドをエンコードするＤＮＡ配列をその配列中に含む一本鎖ベクターを最初に 得るために行われる。所望の突然変異を起こす配列を有するオリゴヌクレオチド プライマーか調製されるが、一般には合成的手法により行われ、その例としてＣ ｕ＋ら、ＰｒｏＣ，Ｎａｔｌ　＾ｃａａ、Ｓｃｉ、　（米国）　、　７５１５７ ６５ｆ１９７８１の方法が挙げられる。
このプライマーはその場合一本鎖のタンパク質配列を含むベクターによりアニー リングされ、大腸菌ポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｖフラグメントのようなり　Ｎ 　Ａのポリマー化を行う酵素の作用を受けて、突然変異が生じる鎖の合成が完結 する。
このように突然変異配列および第二の鎖は所望の突然変異を引き起こす。このヘ テロ二本鎖ベクターは適合した細胞の形質転換を行うために使用され、突然変異 した配列構造を有する組替え体ベクターを包含するクローンが選択される。
突然変異を起こしたタンパク質領域は除去しても、またタンパク質を生成するた めに適切なベクター中に置いてもかまわないが、このベクターは一般には適切な ホストの形質転換のために適用してもかまわないようなタイプの発現ベクターで ある。
末端への挿入の例として、ホスト細胞に対して異種構造であるかあるいは同種で あるかにはかかわらずペプチド分子末端にシグナル配列を融合させることにより 、組替え体ホストから得られる成熟したペプチド分子の分泌を促進させる。
変異型の他のグループとして、ペプチド分子の少なくとも１個のアミノ酸残基、 好適にはただ１個が除去され、異なる残基がその場所に挿入されるものが挙げら れる。そのような置換は好適にはペプチド分子の特性を詳細に制御することが所 望される場合に次に示す表に従って実施される。
最初の残基　典型的な置換基　最初の残基　典型的な置換基Ａｌａ　ｇｌｙ；ｓ ｅｒ　Ｌｅｕ　ｉｌｅ；ｖａｌＡｒｇ　ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ａｒｇ；ｇｌｎ：ｇｌ ｕＡｓｎ　ｇｌｙ；ｈｉｓ　Ｍｅｔ　ｌｅｕ；ｔｙｒ；１ｌｅＡｓｐ　ｇｌｕ　 Ｐｈｅ　ｍｅｔ；ｌｅｕ；ｔｙｒＣＹＳ　ｓ６ｒ　Ｓｅｒ　ｔｈｒ Ｇｌｎ　ａｓｎ　Ｔｈｒ　５ｅｒ Ｇｌｕ　ａｓｐ　Ｔｒｐ　ｔｙｒ Ｇｌｙ　ａｌａ；ｐｒｏ　Ｔｙｒ　ｔｒｐ；ｐｈｅＨｉｓ　ａｓｎ；ｇｌｎ　Ｖ ａｌ　ｉｌｅ；１ｅｕ１１ｅ　ｌｅｕ；ｖａｌ 機能的あるいは免疫学的な性質の本質的な変化は次のことにより生じる、すなわ ち上記の表のものよりも保存性が低い置換基を選択すること、つまり（ａ）ａ換 の範囲でのペプチドバックボーンの構造例えばンート状あるいはらせん状の配座 、（ｂ）標的部位における分子の荷電あるいは疎水性、あるいは（Ｃ）側鎖全体 を推持する際のそれらの効果がより本質的に異なるような残基を選択することで ある。一般に期待される置換には次のものか挙げられる、すなわち（ａ）グリノ ／および／′またはプロリンかもう１個のアミノ酸により置換されるか、消去さ れるか、あるいは挿入されている。（ｂ）例えばセリルあるいはスレオニルのよ うな親水性残基が、疎水性の例えばロイノル、イソロイシル、フェニルアラニル 、バニルあるいはアラニルのような残基に対して（あるいはこれらにより）置換 されている。（Ｃ）ンステイン残基が他の残基に対して（またはそれらにより） 置換されている。（ｄ）電気的に正の側鎖例えばリンル、アルギニルあるいはヒ ス千ノルが例えばグルタミルあるいはアスパルチルのような電気的に負の残基に 対して（またはこれらにより）置換されている。あるいは（ｅ）例えばフェニル アラニアのようなバルキーな側鎖を有する残基が例えばグリシジのような側鎖を 持たないものに対して（またはこれにより）置換されていることが挙げられる。
大抵の削除および挿入特に置換はペプチド分子の特性に急速な変化をもたらすも のとは考えられない。しかしながらそうすることに先んして置換、削除あるいは 挿入の正確な効果を予測することが困難な場合には、専門家はその効果が日常の スクリーニング検定により評価されるだろうと評価するであろう。例えば変異型 は典型的には、ペプチド分子をエンコードする核酸の部位に対して特異性を有す る変異の誘発、組替え体細胞培養物中ての変異型核酸の発現、および場合によっ ては例えば（少なくとも１個のエピトープにそれを結合させることにより変異型 を吸収するために）抗ペプ壬ト抗体カラム上での免疫親和性的な吸収により造ら れる。
細胞溶菌液あるいはｒａ製したペプチド変異型の活性はその場合適当なスクリー ニング検定により所望の特性を得るようにスクリーニングされる。例えば所定の 抗体に結合したよロナペブ壬ト分子の免疫学的性質の変化は競合タイプの免疫検 定により測定される。変異型ペプチドのＴ細胞の認忠の変化はｉｎ　ｖｉｖｏで はＤＨ検定により、あるいはｉｎ　ｖｉｔｒｏではＴ細胞増殖検定により測定さ 　′れる。レドックス安定性あるいは熱的安定性、疎水性、タンパク質加水分解 あるいはキャリアと凝集するかまたは多量体に移行する傾向のようなペプチドの 性質の修飾はもともとの専門家に十分に公知である方法により検定される。
ペプチドの“類似体”は分子全体かあるいはまたそのフラグメントに本質的に類 偏した天然のものでない分子のことをいう。
本発明の“化学的誘導体”は普通はペプチドの一部分てはなくて付加した化学的 に二つのものからなる一方のものを含んでいる。ペプチドを共有結合により変性 することは本発明の範囲内に含まれる。そのような変性は標的となるペプチドの アミノ酸残基を有機的に誘導した選択ずみの側鎖あるいは末端残基と反応させる ことのできる試薬との反応により分子中に導入してもかまわない。
ノステイニル残基を最も一般的にはクロル酢酸あるいはクロルアセトアミドのよ うなα−ハロ酢酸塩（および相当するアミン類）と反応させてカルボキンメチル 誘導体およびカルホキ／アミドメチル誘導体が得られる。ンステイニル残基はま たプロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドジイル）プロピ オン酸、クロルアセチルホスフェ−１−１Ｎ−アルキルマレイミド類、３−ニト ロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル−２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロ ロ水銀ベンゾエート、２−クロロ水銀−４−二トロフェノール、あるいはクロロ −７−ニドロベンゾー２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させることにより 誘導される。
ヒスチジル残基はｐＨ５，５〜７．０でジエチルプロカーボネートと反応させる ことにより誘導されるが、それはこの試薬が比較的ヒスチジル側鎖に対して特異 的であるからである。パラブロモフエナンルブロミドはまた有用なものである、 すなわち反応は好適にはｐＨ６，０でＯ，ＬＭのカコジル酸ナトリウム中で行わ れる。
υ／ニル末端残基およびアミノ末端残基をコハク酸無水物あるいは他のカルボン 酸無水物と反応させる。これらの試薬から誘導されるのはリジニル残基の荷電を 反転させる効果である。池の適当なα−アミノ基含有残基を誘導する試薬として 、メチルピコリンイミデートのようなイミドエステル類、ビリドキサルホスフニ ート、ピリドキサール、クロロポルハイドライド、トリニトロベンゼンスルホン 酸、Ｏ−メチリスウレア、２．４−ペンタンジオンおよびトランスアミナーセ触 媒によるグリオキシレートとの反応が挙げられる。
アルギニル残基は１個あるいは数個の通常の試薬との反応により変性されるが、 それらの試薬として、フェニルグリオキサール、２．３−ブタンジオン、ｌ、２ −シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンが挙げられる。アルギニン残基の誘 導体化にはグアニジン官能基のｐ　Ｋ　ａ　４ｔｉが高いために反応をアルカリ 条件下で実施することが必要となる。さらにはこれらの試薬はアルギニンのイプ シロンアミノ基と同様にリジンの基と反応させてもかまわない。
チロノル残基それ自体を特異的に変性することについて積極的に研究が行われて きているが、芳香族ジアゾニウム化合物あるいはテトラニトロメタンと反応させ ることによりスペクトル的標識物をチロノル残基に導入することに特別の関心が 払われている。さらに一般的にはＮ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロ メタンが０−アセチルチロノル種および３−ニトロ誘導体を形成するためにそれ ぞれ使用される。チロノル残基は■　あるいは、　＋３１を使用してヨウ素化し 、ラジオイムノアッセイに使用するために標識タンパク質を調製するが、クロラ ミ／工法が適当な方法である。
カルボキシル＠Ｉ鎖（アスパルチルあるいはグルタミル）は１−７クロへキシル −３−（２−モルフオリルー４−エチル）カルボジイミドあるいは１−エチル− ３−（４−アゾニア−４，４−ツメチルペンチル）カルボキシイミドのようなカ ルボッイミド類（Ｒ′−Ｎ−ＣＮ−Ｒ’　）との反応により選択的に変性される 。
さらにはアスパルチル残基およびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応 によりアスパラギニル残基およびグルラミニル残基に転換される。
グルラミニル残基およびアスパラギニル残基はしばしば脱アミド化されて相当す るグルタミル残基およびアスパルチル残基に転換される。さらにはこれらの残基 は温和な酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のどちらが一方の形が本 発明の範囲に入る。
二官能性試薬による誘導体化はペプチドを架橋して水に不溶性の支持マトリック スあるいは他の巨大分子キャリアに転換するのに有用である。普通に使用される 架橋剤として、例えば１．１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、 ゲルタールアルデヒド、例えば４−アジドサリチル酸とのエステルのようなＮ− ヒドロキシスクシンイミド、３，３′−ジチオビス（スクシンイミジルブロピオ ネート）のようなンスクシンイミジルエステルを含む均質二官能性イミドエステ ル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミ ドが挙げられる。メチル−３−（（ｐ−アジドファニル）ジチオ〕プロピオイミ デートのような誘導体化剤は光活性化ができる中間体で光照射下で架橋を形成す ることが可能なものを生成する。さらには可能性のあるシアノーゲンブロミド活 性化炭化水素のような反応性のある水に不溶性のマトリックスおよび米国特許隘 ３．９６９．２８７；３．６９１，０１６；４．１９５，１２８；４，２４７゜ ６４２；４．２２９，５３７および４．３３０，４４０にそれぞれ記載の反応性 基質かタンパク質の固定化に使用される。
池の変性としては、プロリンおよびリジンのヒトロキンル化、セリル残基および チオニル残基の水酸基のホスホリル化、リジン、アルギニン、ヒスチジン側鎖の α−アミノ基のメチル化（Ｔ、Ｅ、　Ｃ＋ｅｉｇｈｌｏｎ、タンパク質：構造お よび分子物性。
Ｆ＋＋５ｎｘｎ　＆　Ｃｏ、、サンフランシスコ、　７ｇＪ６　（１９１３１］ 、Ｎ−末端アミンのアセチル化、および幾つかの例としてＣ−末端カルボキシル 基のアミド化が挙げられる。
そのような誘導体化した二つの部分の一方が、ペプチドの溶解度、吸収、生物学 的半減期等を改善する作用がある。この一方の部分は今度はすべての望ましくな いペプチド等の副作用を除去し、また軽減させる。そのような効果を伝達するこ とができる片方の部分は例えばＲｅｉｉｎｇｌｏｃ’　ｔ　ＰｈｕＩＩ＋ｅｃｃ ａｔｉｕｌ　５ｃｉｕｃ＋ｓ、第１６版。
ｌＪ＋ｃｋ出版社、イーストン、ベンンルバニア州（１９８０１に開示されてい る。
悪性疾患 本発明の方法をまた受容することができるものとしてリンパ腫および白血病が挙 げられる。リンパｌおよび多くの白血病は制御できない増殖の起きている（例え ば悪性のもの）リンパ球から成る腫瘍である。幾つかのクラスの白血病およびリ ンパ腫は単一の悪性Ｔ細胞前駆体に由来するＴ細胞から成っており、腫瘍細胞は すべて同一のＴＣＲを保持し、このことが本発明の防御性のある組成物の標的と なることができる“腫瘍マーカー”として没立っている。同様に表面の免疫グロ ブリンはＢ細胞白血病あるいはＢ細胞リンパ腫に対する腫瘍マーカーとじて役立 つことができる。
本発明の一実施例は、１瘍マーカーそれ自身よりもむしろ“腫瘍マーカー”に対 抗して反応するＴ細胞のＴＣＲを標的とすることによって抗腫瘍応答を強めるこ とを志向している。このように腫瘍に対して特異的なＴ細胞上でのＴＣＲに向け られた免疫応答は、ホストの利益になるように抗腫瘍応答に対して高い制御作用 を及ぼすために使用することができる。
事実、細胞を同一の組織構造タイプの他の細胞と区別し、そしてまた異なる組繊 細胞タイプの細胞とも区別する表面分子を有する細胞を含むどのような疾患も特 徴的な“マーカー”を保持し、“マーカー”に免疫応答を誘発させる組成物によ る処理を受けやすくなり、その結果“マーカー“を保持する細胞の活性を変更さ せることになる。
本発明によれば、マーカー分子自身は相対的には非免疫原性であり、最低でも特 徴的な抗原エピトープを必要とする。このエピトープ自身元来免疫原性があって もかまわないし、あるいは免疫原性のあるキャリア分子との接合のような従来技 術で十分公知の処置により免疫原性のあるものとすることができる。このように してフリーなペプチドかあるいはまた免疫原性のあるものにする形態のマーカー タンパク質のエピトープは抗体応答、細胞媒介免疫応答あるいは両者を引き起こ すことかできるが、これらは本発明に含まれているとおりである。それゆえマー カータンパク質全体ではなくてむしろ免疫原性があるかあるいは抗原性のある特 異なベプ手ド領域を混合した組成物が、このマーカーを特徴とする免疫関連疾患 を処置するための有用なプレパラートを包含することになるであろう。
マーカーＴＣＰ保持Ｔ細胞の同定 本発明はＣＤＲ２のようにリガンド／ＭＨＣ結合に生物学的重要性のあるＴＣＲ の領域を示す合成ペプチドを利用するものであり、これはＴＣＲＶ遺伝子族に特 育のものである。それゆえ本発明はＴＣＲＶＨ域に特異な抗体あるいはＴｉ抱を １与るためのずっと簡単な研究法を提供する。ＴＣＲＶ領域に特異な抗体あるい はＴ細胞のスペクトルを誘発する同一のβ連鎖がら得られる他の配列を使用して 、専門家はＴＣＲの露出したエピトープを精密に描き、そして日常の技術を実施 することによりリガンド／ＭＨＣ結合注のこれらの領域の重要性を確立すること ができるであろう。
所定の疾患と関連するマーカーＴＣＲは公知の技術を使用することにより同定さ れる。ＭＧあるいはＭＳを保持することが公知の豐者を利用する遺伝的研究法は Ｏｋ＋ｅｎｂｅｔｇらによりＰ＋ｏｃ、Ｎａ１１．　Ａｃｘｄ、Ｓｃｉ、米国、 　８６：　９８８−９９Ｈ１９８９）に記載されている。適切なＴＣＲβ連鎖の 配列は、５ｅｂｏａｎら、　Ｃｅ１１．８７：　１０９５−１１００パ１り８９ １：　Ｂｕｎ＋　ら、　１．　Ｅｔｐ、Ｔｏｄ、、ｌ［ｉ９：　２７−３９（１ ９Ｈ１により記述されているように、特定の自己免疫疾患の感染率を有する族に おいて見出された限定フラグメント長の多形現象を使用してゲノム解析により得 られている。
このように本発明の目的に適うためには自己免疫疾患と関連のあるマーカーＴＣ Ｒの決定および免疫原性のある配列を含むペプチドの同定に自己抗原の特性づけ を行うことは必要でないことが理解されよう。（ａ）自己免疫疾患には病因とな る過程の必要な部分としてＴ細胞の媒介した免疫応答が含まれ、（ｂ）疾患は器 官、組織あるいは細胞に特異な標的を有することで十分である。実際に技術的に 公知であるように（例えば上記のＴｈｅｏｌｉｌｏｐｏａｌｏｔ、　＾、の文献 参照）、自己免疫疾患は誘発段階で自己抗原を全く含まず、むしろ細菌性あるい はウィルス性の抗原のような外因性の抗原に対する応答を示すことは構わない、 そしてこのことは自己抗原と相互反応し、あるいはホストに存在する外因性の抗 原を志向した免疫病理学的応答をもたらす結果となる。
自己抗原あるいは自己免疫疾患関連抗原（一定のウィルス性あるいは細菌性の抗 原）を認識するＴ細胞はクローニングされ、そして長期間のＴ細胞系列、Ｔ細胞 リンパ腫系列あるいはＴ細胞ハイブリドーマのような不滅化した細胞と融合して もかまわないし、また培養物中で生長させられる。培養された細胞は適当なＴＣ ＲをエンコードするｃＤＮＡの源として役立つ。そのようなｃＤＮＡはクローニ ングされ、技術的に十分公知の方法により発現される（例えばＭｕｉｕ口ら。
ｖｏｌｌ（０１！１　Ｃｌｏｎｉｎｇ実験室マニュアル（１９ｇ２＋）。
前述の研究法に加えて、自己免疫疾患と関連するＴＣＲ可変領域遺伝子座を同定 するための動物モデルの採用に利点があるかもしれないことが認識されるであろ う。多数の自己免疫疾患で、その限定サンプルとしてＥＡＥ、実験的ＭＧ、実験 的自己免疫甲状腺炎、アジュバント関節炎、コラーゲン誘発関節炎等の幾つかに 感染しやすい動物はｉｎ　ｖｉｔｒｏで同定することができる疾患と関連する特 定のＴＣＲ可変遺伝子座を持っている。
“疾患に感染しゃすい”という用語は、動物が疾患に関連することが公知の遺伝 子等を保持し、その結果その遺伝子等を宵する個体が一般的な集団と比較してそ の疾患を昂進させるであろうという状態を意味するものである。自己免疫疾患と 関連していることが公知の遺伝子として、例えばＭＨＣ遺伝子（特にクラス■） 、イムノグロブリンＶ遺伝子、ＴＣＲＶ遺伝子等が挙げられる。“感染しやすい °という用語はまた実際に疾患を持つ個体をも包含する。自己免疫疾患と特定の ＴＣＲの使用との間の完全な相関関係は成功のうちに本発明を実施するのに期待 されてもいないし、また必要でもないから、約６０〜７０％という高い相関が動 物での特定の可変領域遺伝子の存在あるいは発現および自己免疫疾患への感染し やすさに対して見出される。
本発明の別の実施例において、自己免疫疾患に感染しゃすいヒト、特に自己免疫 疾患を持つ感染しやすい個人から単離されたＴ細胞は培養物中に展開される。
Ｔ細胞展開の技術はｈｆｆｉｗ　ｉ　ｌら、　ＮＮａｒｃ、３１９：　３５５− ３５８（１１８５）：　ＮＮｕ＋、３２４：２５８−２６０１９８６）に記載さ れている。
この方法を使用した実施例において、患者の末梢血液リンパ球は除去され、自己 抗原あるいはそれに由来するかまたはそれと相関する特異なペプチドにより刺激 を受けるが、このものは自己抗原のものと比較できる刺激を及ぼすことができる 。自己抗原（あるいは関連ペプチド）はリンパ球培養物中に数日間添加される。
１実施例において細胞は５〜６日間自己抗原により刺激を受ける。刺激に要する 時間は、血液サンプル中の反応性細胞の比率、これらの細胞の活性化状態および 刺激用プレパラートの効力の関数であり、専門家により容易に決定できる種のも する照射を受けた）同厚の抗原提供細胞および約２０ｕｇの自己抗原（あるいは 関連ペプチド）による刺激を受ける。約７日間後に、生存できる細胞が捕集され 、限定希釈して、約１０〜１０６個の抗原を与える細胞、例えば約５×１０５個 の抗原を付与する細胞およびヒト［Ｌ−２もしくは粗製あるいは純粋なリンパ球 生長因子（例えばＩＬ−４のようなもの）の存在下にクローニングを行う。その ようなＴ細胞系列の細胞を組織培養フラスコ中で約１〜２週間生長させる。その ような系列は抗原提供細胞、自己抗原プレパラートおよびＩ　Ｌ−２により複合 した再刺激を受ける。再刺激は典型的には週１回実施される。所望であれば、そ のようなＴ細胞は技術的に公知の多数の方法によりクローン化されるが、その方 法は例えば限定希釈するかあるいは一般には再刺激を受けた約２日後に軟らかい 寒天中で生長しているコロニーから細胞をピックアップすることが挙げられる。
さらにもう一つの実施例においては、器官および体液から得られたリンパ球が最 初にＩＬ−２の存在下に培養される。このような条件下ではすでに活性化された 細胞に対しての選択が起こり、そのような細胞のみが生長する。従ってそのよう なＴ細胞は抗原提供細胞および自己抗原プレパラートにより刺激を受ける。この 研究法を使用して、ＭＢＰに特異的なＥＡＥによりラットのを髄から得られたＴ 細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで選択的に展開することができる。
本発明で使用されているように、“自己抗原”という用語は一定あるいは公知の 巨大分子に限ることを意図するものではない。例えばタイプＩ糖尿病の場合には 、■細胞媒介自己免疫応答の引き金あるいは標的となる抗原である膵島（すなわ ちベータ）細胞と関連する特定の抗原は未知のものである。本発明に対しては、 上記のようにｉｎ　ｖｉｖｏで細胞を刺激するために使用される抗原は膵島細胞 全体、そのような細胞に由来する粗製の膜プレパラート、部分的に精製された膜 成分、あるいは同定する場合に糖尿病発生自己抗原を包含することができる。同 一のことが単一の自己抗原がいまだ同定されていないような他の自己免疫疾患に も該当するが、それらの例としてハシモト甲状腺炎、自己抗原がコラーゲンでな いような関節炎、Ｓｉｏｇｔｅｎ病、多発性硬化症、動脈硬化症等が挙げられる 。専門家はＴ細胞が反応する免疫原性のある化学的に二つの部分からなるものの 片方が刺激プレパラート中に存在する限りては、本発明の方法は上記のように実 施することかできる。
クローン化した拡張Ｔ細胞集団中に自己抗原に特異な反応性を有するＴ細胞が存 在することは、自己抗原の存在下で活性化すべき細胞の能力を試験することによ り容易に決定できる。多くの検定法がＴ細胞活性化過程での早期および末期の挙 動を測定するために利用でき、また技術的に十分公知となっている。そのような 方法の実例として、それらに限定されるものではないが、（放射線標識したチミ ジンの摂取として測定できる）Ｔ細胞増殖、インターロイキン−２の分泌、細胞 内のカルシウムの流動、イノシトールリン酸塩代謝に包含される特定の膜酵素の 転位、および（流通式細胞測定法により決定できる）細胞表面分子の発現の変化 か挙げられる。
特定の自己抗原と反応するＴ細胞クローンにより発現されるＴＣＲは、ＴＣＲに 特異的な抗体を使用して、ＴＣＲ可変セグメントに対して特異的であるポリクロ ーナルか、そしてモノクローナルであるか、またはキメラ（下記参照）であるか について表面における発現を検知するために同定することができるが、採用され る技術としては蛍光顕微鏡法、流通式細胞測定法、免疫細胞化学、あるいは他の 公知技術が挙げられる。そのような抗体に対しては多数のＴＣＲαβ連鎖ＶＱ域 に対しての記載が挙げられる（例えば０ｖｂａ＋ｈｉら、上記１ＧＩＩｃｏｉｇ ｎｔら、上記。
Ｋｘｐｐｌｕ　ら、　１９８７．　１９８８　（上記）、およびＭｏＤｏｎａｌ ｄ、Ｈ，Ｒ，、上記参照）。
さらにはＴ細胞クローンのＤＮＡあるいはｍＲＮＡは、直接あるいはまたポリメ ラーゼ連鎖反応！５Ｖｎｈｔら、Ｓｃｉ＋ｎｃｅ、２３９：　１０２６（１９８ ８１：　５ｉｉｋｉ　ら、　Ｎｉ１ｕｕ。
３２Ｌ：　１８３・１９８６りにより、またあらゆるＴＣＲ遺伝子族に対して核 酸プローブによる特異なハイブリット形成による増殖の後で試験することができ るが、この場合技術的に十分公知のハイブリット形成法が適用されている。ＴＣ Ｒ配列あるいはその一部分はその場合増殖転位したＤＮＡあるいはｍＲＮＡから 直接に得ることができる。
特定のＴＣＰの発現はまた、例えばＴＣＲＶ遺伝子のクローニングを行った後に ＴＣＲの少なくとも一部をエンコードする核酸配列を決定することにより、ある いはまたＴＣＲタンパク質の少なくとも一部のアミノ酸配列を決定することによ り同定することかできる。上記の研究法のどのものも、また専門家に公知の追加 研究法を適用することによりＴ細胞またはクローンもしくはＴ細胞系列に発現さ れるＴＣＲの同定が行われる。この情報は本発明のペプチドあるいは薬学的プレ パラートを包含するアミノ酸配列の選択に必要とされる。
特異な自己抗原が同定されると、疾患と関連する解剖学的領域でのＴｗＪ胞のオ リゴクローナル性は反応するＴ細胞の富化のための基礎として使用することがで きる。例えば単独でリウマチ性関節炎と関連する細胞が接合部の関節液中に見出 される。単独にＭＳと関連する細胞は脳を髄液（ＣＳ　Ｆ）中に見出される。
そして疾患関連Ｔｌ１Ｉｌ胞は／’１ンモト関節炎およびグレージス病での甲状 腺組織に浸透する。これらの実例では、Ｔ細胞は関連する解剖学的局所から単離 され、ＩＢｌｔ２１は上記のように培養液中に展開される（またＬｏｎｄｅｉら 、　Ｓｃｉ＋ｎｅｅ、　２２８：　８５−８９　：１９８５）　：Ｌｏｎｄｔｉ 　ら、＾ｃｌｉ　Ｅｎｄｏｃ＋１ｎｏ１．、　１１５　（増刊２８１）　：　８ ６−８９　（１９１１V）　； Ｓｌｉｍｃｋｏｖｕら、　Ｐ＋ｏｃ、　！ｔａ１１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　 米国、　８５１１１７９−１１８３（１９８８）＋Ｌｉｐｏｌｄｏｖｔ　ら、］ 　人ｕｌｏｉａ＋ｍｕｎ、、２：　ｌ−１３（１９８９）：　Ｏｋｕｎｂｕｇ　 ら、上３己参照）。そのような細胞のＤＮＡあるいはｍ　ＲＮ　Ａは単離され、 ｃＤＮＡは調製され、そして可変性のＴＣＲ遺伝子座をエンコードするｃＤＮＡ の配列の相違は感染しな（λ検体と感染した検体を比較することにより確立した ものとなる。培養物中に細胞を展開することに対する替りのものとして細胞ＤＮ Ａあるいは好適にはｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡが、検体から単離されたＴ 細胞およびＰＣＲ反応により展開された核酸により上記したように直接得ること ができる。
多数のヒトおよび動物モデルの自己免疫疾患と関連する抗原は現在のところ公知 である。タイプ■コラーゲンおよび結核菌６５ｋＤヒートンヨツクタンノくり質 はリウマチ性関節炎と関連する抗原である。ＡＣｈＲはＭＧと関連し、またマウ スに誘発させることかできる実験的アレルギー性重症筋無力症（ＥＡＭＧ）と関 連している。千ログロブリンはマウスの実験的アレルギー性甲状腺炎（ＥＡＴ） と関連する抗原であることが公知である。類似の疾患であるノ１ンモト甲状腺炎 は甲状腺濾胞細胞での抗原に対する免疫応答を包含している。グレージス病では 免疫応答は甲状腺細胞での甲状腺刺激ホルモンを志向したものである。ミニリン 塩基タンパクｉ（ＭＢＰ）およびタンパク脂質タンパク質（Ｐ　Ｌ　Ｐ）はマウ スおよびラットの実験的アレルギー性脳を５炎（ＥＡＥ）と関連していることが 公知である。ＥＡＥはヒトの多発性硬化症の認識されたモデルである。
それゆえ専門家は、本発明はヒトおよび動物の疾患を予防しまた治療法に有益な ペプチドを同定することに一面では志向しているが、上記のことを包含していて もそれに限定するものではないことに対して評価している。
抗原ペプチドの選択 本発明の重要な実施例には、自己免疫疾咀に関連したＴＣＲを同定し、どのオリ ゴペプチド配列が疾徹の過程でＴ細胞の作用に対して免疫原性があり、また重要 であるかを決定し、そのペプチドを合成し、そしてそれを治療薬として使用する 組合わせ法が含まれている。
関連ＴＣＲ配列の範囲はそれらの予知された抗原性あるいは免疫原性に基づいた 合成に対して同定されるものである。“免疫原性がある”という用語の意図する ことは、Ｔ細胞関連、抗体のどちらかか、両方に免疫応答を誘発させるペプチド の容量である。“抗原性がある°という用語の意図することは、抗原に特異なＴ 細胞の場合に、抗体による自由な形態およびＭＨＣ分子との関係において認識さ れるべきペプチドの能力である。Ｔ細胞に対して免疫原性があるかあるいは抗原 性があると思われるタンパク質あるいはペプチドの領域は、例えばＭｕｇｚｌｉ ｌらの記述した研究法あるいはアルゴリズムを使用して同定される（１．　１ｍ ｍｕｎｏ１．。
１３ｇ：　２２１３−２２２９（１９８７）およびＲｏｌｈｂ＋＋ｄら、　ＥＭ ＢＯ１，、７：　９３−１００（１９８８））。
Ｍｕｇ！ｌｉｌらの研究法は両親媒性のらせんモデルに基つくアルゴリズムの展 開に結び付く免疫を支配するヘルパーＴ細胞の抗原性部位の分析を基準にしてい るが、このモデルでは抗原性部位は１個の極めて極性の強い面と１個の極めて非 極性の強い面を持つらせんであると仮定されている。Ｒｏｌｈｂｘｒｄらの研究 法では、ＴヘルパーあるいはＴ細胞毒となる細胞クローンにより優先的に認識さ れたエピトープに類似したモチーフを認めているが、これはＭＨＣのクラス■お よび■分子により認識されることができるタンパク質配列内部のエリアを正確に 予知することができ、そのような認識はＴ細胞の免疫原性および抗原性にとって 必要と考えられている。
ＴＣＲペプ千トを選択するための研究法では、（ＴＣＲの構造の現在のモデルお よび抗体の構造への類似性に基ついて）本発明の目的に対して免疫を制御する重 要性を持つＴＣＲの領域は、ＣＤＲ１，ＣＤＲ２あるいはＣＤＲ３の範囲に入る が、厳密にはＴＣＲの極度に変わりやすい領域ではＶβセグメントの残基３９− ４９のようなＣＤＲの厳密な一部分てはない（Ｄｉｗｉ＋ら、　ＮＮｏｕ、３３ ４３９５−４０２　＋１９８８）参照）。
ヒト徹者のＭＳおよびラットのＥＡＥを処置する際に使用するペプチド配列を選 択するために上記の研究法を使用することは、この研究法が成功することを例証 するものである。例えばルイスラットのＥＡＥに対するマーカーＴＣＲのＣＤＲ Ｉに対応する１６個のアミノ酸を含むペプチドでは、Ｖβ１４（２５−４１）は 上記のアルゴリズムによりＴ細胞に対しては免疫原性がないと予見された。実際 にこのペプチドはＴ細胞の免疫性を誘発することはなく、またルイスラットをＥ ＡＥから保護することはない。ＥＡＥとの関連性のない異なるＴＣＲβ連鎖のＣ ＤＲＩに相当するペプチドであるＶβ１４　（２５−４１）はＴ細胞に対しては 免疫原性があることが予見されており、事実ルイスラットにＴ細胞免疫性を誘発 することが見出されたが、予期したようにＥＡＥからの防御は行わなかった。同 様にＥＡＥとは関連しないＴＣＲに相当するＣＤＲ２ペプチドであるＶβ１４　 （３９−５９）は免疫原性があると予想され、免疫性をまさに誘発したが、再び ＥＡＥからの防御を示すことはなかった。本発明によれば、関連のあるＴＣＲの ＣＤＲ２関連ヘフチドであるｖβ８　（３９−５９）　は免疫原性とＥＡＥ防御 性の両方を有することが予想され、事実そのとおりであることが示された（下記 の実施例参照）。
本発明で使用するために選択されたペプチドのサイズは、Ｔ細胞あるいはペプチ ドに特異的な抗体が認識を行い、完全なＴ細胞上でＴＣＲと反応するように最小 のエピトープ構造を維持しながら免疫原性の要件によりまさに決定されるもので ある。例えば本発明のペプチドは、異なる長さのペプチドが予想されるけれども 、十分に免疫原性があるようにし、モしてＴ細胞の活性の変調に通じることがで きるＴＣＲの関連エピトープを包含する高い可能性を有するようにするために、 約１５〜３０個のアミノ酸を含む範囲内にある。本発明に従ってＥＡＥを処置す るためにＥＡＥと関連のあるＴＣＲβ連鎖に存在する２１個のアミノ酸ＴＣＲペ プチドを成功側に使用することは下記の実施例に十分に表記されている。
本発明に有用なペプチドの免疫原性は、動物中でＤＨ応答を使用するような十分 に公知である方法によりスクリーニングを実施できる。そのような応答では、適 当な分量の抗原、典型的には皮下（ＳＣ）に、そしてしばしば完全なＦ＋ｅａｎ ｄアジュバント（ＣＦＡ）のようなアジュバントを注射することにより動物は゛ 増感作用°を受ける。一般には約５〜１５日後に応答は動物に誘発作用を起こす ことにより“引き出される”が、それは適切な分量の抗原を典型的には塩類ある いは他の緩衝液中に溶かして、典型的には皮肉（ＩＤ）に注射することによる。
その応答は２４〜４８時間後と見積もられる。ＤＨを測定する検定法の無制限な 実施例として次のものが挙げられる、すなわち紅斑のサイズ（赤色度）および抗 原注射部位における硬化（膨潤）、耳の膨らみ、足裏の膨らみ、尾の膨らみ、系 統的に注射した１１２５て標識したヨウ素化デオキシウリジンの誘発部位への蓄 積、静脈（ＩＶ）内に注射した放射線標識血清タンパク質すなわちアルブミンの ようなものの誘発部位での蓄積、ＩＶ注射した誘発部位でのリンパ球あるいは好 中球のような標識ずみの炎症を起こした細胞である。例えば約０．１５〜０．２ ５ｍ。
好適には（ルイスラット中で）０．２０ｍの深さの耳介中での適切なＩＤ誘発の 際の耳の膨らみは正のＤＨ応答を示している。専門家はペプチドのサイズ、注入 量、ＤＨの増感あるいは引き出し作用のルート、使用したキャリア、使用したア ジュバント等はＤＨ応答のタイミングおよびその程度に影響を及ぼすものと理解 するであろう。
ここで意図したように免疫原性かあると考えられるペプチドに対しては、動物１ 匹当り約１０〜２００ｕｇ、好適には動物１匹当りペプチド２５〜１１００ｕの 注入量によりＤＨ応答に対して動物に対しての増感作用を行うことができるよう にすべきである。さらに増感作用を受けた動物ではペプチドの注入量が約１〜１ ００■、好適には５〜５０ｕｇでＩＤによる誘発を受けた際にＤＨ応答を引き前 述の方法で決定した配列を持つ、所望のペプチドは、原核細胞と真核細胞をホス トとする溶液と固相の連鎖的なアミノ酸接合と組換え型生産も含む、標準的す合 成テクニＩりを用いて準備する。準備したペプチドが免疫原性を有することの確 認は、前述したように、動物（例えば、マウスまたはラット）のＤＨ反応を用い て容易に決定できる。皮下注射てペプチドを投与して、約９〜１４日後に耳介に 感染量を投与する。抗原投与の２４または４８時間後に測定した耳の腫脹反応は 、ペプチドに対するＴ細胞介在の免疫性を証明する、簡単で信頼できる方法とし て用いることができる。
免疫原性ペプチドが自己免疫を実際に転心する能力の確認は、ＴＣＲ関連ペプチ ドの種間差を考慮に入れて、適切な動物モデルを用いて達成することができる。
例えば、人の治療にはヒト・マーカＴＣＲのＣＤＲ２を表現する配列を用いるこ とが好ましいが、動物の疾病には動物疾病モデル用のマーカＴＣＨの対応する領 域か用いられる。
疾病の予防または治療におけるペプチドの有効性を検査する動物モデルシステム は、前述したように、入手可能である。もちろん、同一のペプチドが疾病に関連 するヒトのＴＣＲの適切な部位に対応するとは限らず、また、ヒトでは十分な免 疫原性を示すとも限らないので、それらはヒトに対して有効とは限らな％ｓ０　 ヒトを含めて、他の種に属する被験体を治療するためには、特定の動物モデｌし で詳述されたペプチド配列の転心が要求されるであろう。例えば特定のＣＤＲ２ 関連のペプチド配列が特定疾病に対する予防効果があることの確認は、これらの モデルで得ることができ、対応するヒト配列はヒト治療用に有効なペプチドとし ての好ましい候補である、との予測が導かれる。このように、ヒト（またはヒト 以外の動物）の対応するＴＣＲ配列の決定は、上述のアプローチを用いて、ヒト （または池の種族）に用いるペプチドの転心を許す。
下記は、ヒト自己免疫疾病の動物疾病モデルの非排他的リストであるが、ＴＣＲ ペプチドが疾病を転心し、転移に際して疾病を転心てきる抗体とＴ細胞を誘発す る能力はこのリストを用いて評価することができる。Ｋｎｉｇｈｔ　ｃｌ　ｉｔ 、１．ＥＵｖｅａ、ｔ４７：　１６５３（１つ７８）およびＲ＋ｉｎｔ＋ｌｔ＋ ｎ　ｒｌｌ、、　Ｎ　εｎｇ、Ｉ、　Ｍｅｄ、　２９９：　５１５’１９７８＋ の発表に従い、全身性エリスマトーデス（Ｓ　Ｌ　Ｅ）をり弱性マウスで試験す る。ＳＪＬ／Ｊの雌のマウスに別の種から得た可溶性ＡＣｈＲタンｄり實で、Ｌ ｉｃａＮ＋ｏｃ　ｔＩ＋１．、：へｄｖ、１ｍ１ａｎｏ１．　４２：　２３３− ２８４ｆ１９８８）の記述に従い、疾病を誘発してＭＧを試験する。　５ｌｕｕ ｌ　ｅ口１．、＾ｎｎ、Ｒｕ、Ｉｍｕｎｏｌ、２：　１９９−２１８ｆ１９８４ ）に従い、り属性系統のマウスに■型コラーゲンを注射して関節炎を誘発する。
Ｖ＋ｎＥｊ＋ｎ　！Ｌ　１１．、Ｎｉ１ａｎ　３３１：　１７１−１７３（１９ ８８）の記述に従い、ミコノくクチリアの熱ノヨノクタンパク質を注射して、り 居住ラットにアジュノくント関節炎を誘発する。’！ｈ：ｏ冒１　＋ｉ、、１． 　Ｅｒｐ、　１Ｊｅｄ、１５２：　＋１１５−１１２０ｆ１９８Ｇ）に従い、マ ウスにサイログロブリンを投与して、甲状腺炎を誘発する。インスリン依存性糖 尿病（ＩＤＤＭ）は自然に発症するか、Ｋ＋ｎｓ＋ｉｎ　ｃｔ　ｘｔ、、　Ｄｉ ＋ｂｅｌｏｌｏｇ目２７：　＋１３＋１９８４）の記述にあるような、ある系統 のマウスに誘発することができる。他の系統のマウスには、この系統のリンパ球 を転移することにより、この疾病を発病させることができる。
マウスとラットのＥＡＥはヒトのＭＳのモデルとして用いることができる。
このモデルでは、脱髄病を誘発する。ミニリン塩基性タンパク５］（ＭＢＰ）ま たはプロテオリビドタンパク質（Ｐ　Ｌ　Ｐ）の投与、またはＰｚ（ｅｔｓｏｎ 、Ｐ、Ｙ、。
Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　１ｍ１ｎｏｐｘ＋ｈｏｌｏｇ７　ｆＭｉ＋ｃｈｕ　ｅ ｌ　１１．、＋ｄ＋、）、Ｇ＋ｕｎｃ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｌｏ氏B Ｎｔｗ　Ｙｏｔｋ、ｐｐ、１７９−２１ＨＩ９８６）、　Ｍ＋Ｆｕｌｉｎ、　Ｄ 、　Ｅ、、　ｃｔ　＋１．．５ｃｉｅｎｃｅ　１７９：　４V８− １８０ｆ１９７３）、ｓｉ＋ｏｈ、１．、ｃｔ　ｒｌ、、１．　ｌ＋ｎｏｎｏ１ ．　１３ｇ：　１７９−１８０１９８７１に従いサイラーウイルスを投与するこ とにより、脱髄病を誘発する。
当発明の組成の、ヒトに対する予防、抑制、治療上の利点を測るために、幾つか の臨床結果の尺度を用いる。例えばＭＳでは、下記の数量パラメータを含む。
（ａ）臨床的障害、（ｂ）研究中の病状再燃率、（ｃ）磁気共鳴画像（ＭＲ＋） 脳斑点荷重（これはＭＳ患者の評価に用いられる最近の重要なパラメータ）。
これらの尺度には、個別の盲検試験、または治療医師による盲検でない試験を含 んでいる。障害の独立決定因子として、認知障害の神経心理学的尺度を用いる。
臨床的障害は典型的にはｔｉｃ＾ｆｐｉｎ＋スケール、Ｋｕ＋ｌ＋ｋｅ評点、拡 大障害状態評点（ＥＤＳＳ）と呼ばれる修正Ｋｕ＋ｔ＋に＋評点で測定する。Ｅ ＤＳＳ　（範囲は１〜９）上で１７２単位の緩解は有意であると見なされる。一 つの臨床的尺度である患者の歩行能力は、歩行指数で評価し、１または１以上の 単位の緩解を有意と見なす。
これらの臨床的尺度はその分野ではよく知られており、下記の文献に詳しくｅ己 述されている。Ｍ（＾１ｐｉｎ＋　ｐｉ　ｉｌ、、　Ｍｏ１ｔｉｐｌ＋　５ｃｌ ｅ＋ｏ＋ｉｔ、Ｌｉマｉｎｇ＋ｌｏｎ　ＰｘＳＩ。
ＥｄｉｎｂｕＢｈ　ｊｉ９５５）：　Ｂｉｎｋ＋ｎ、Ｐ、１．　Ｎ　ａｌ、、　 ｆｌｉｎａｂｏｏｋ　ｏｆ　ｌｎｉ＋ｚｌ　Ｎ＋ｕ＋ｏｌｏ■V゜ Ｖｏｌｕｍｅ　９．　八ｏｚｔｕｄｉｍ−Ｎｏ＋＋ｈ　１ｌｏｌｌｉｎｊ　Ｐｕ ｂ１口ｈｕｔ、八ｍ＋１ｕｄｉｉ　１１９７０１　：　ドｉ@＋　ｌ　ｄ。
Ｅ、１．　ｔ＋　ｘｌ、、　ＭｕＮｉｐｌｅ　Ｓ＋１ｕｏｉｉ＋：　Ａ　Ｃｌ１ ｌｉｕｌ　Ｒ＋ｙｉ＋ｖ、　Ｍ、　Ｍ、　Ｔ、Ｐ　Ｐｕ１ｌB Ｌｔｄ、、Ｌ＋ｎｃａ＋Ｄ＋、　Ｅｎｇｌｚｎｄ　＋１９７７）ＲＡ緩解の測定 は、腫脹の消散または減退、起床時の硬直時間の短縮、赤血球および／またはＣ 反応性タンパク質沈降速度の低下、リウマチ様症状の慢性関節リウマチ小結節へ の消散、リンパ球数の減少を含む、第１期の臨床的終点の数に基ついている。第 ２期の終点は、患者と医師の評価による、疲労の低下と全身状態の向上を含む。
臨床結果は下記のように分類される。（ａ）完全な反応−関節腫脹、虚弱、起床 時の硬直が９０％以上軽減、（ｂ）著しい反応−関節腫脹、虚弱、起床時の硬直 が５０〜９０％以上軽減、（ｃ）適度の反応−関節腫脹、虚弱、起床時の硬直が ３０〜５０％以上軽減、（ｄ）反応なし一関節腫脹、虚弱、起床時の硬直の軽減 が３０％以下。
ペプチド、抗体、Ｔ細胞、当発明の他の組成の、その他の免疫関連の疾病におけ る、予防、抑制、治療上の効果を評価できる同様の測定値は、この分野の熟練家 達に知られているものである。
受動免疫 能動免疫法へのＴＣＲペプチドの使用の他にも、当発明の具体化には、抗ＴＣＲ 免疫の受動転移のために、ＴＣＲペプチドに活性化されるＴ細胞とＴＣＲペプチ ドに特異的な抗体も含まれる。抗体介在の受動免疫は、例えば抗体依存性細胞毒 性作用や補体依存性細胞毒性作用等の、幾つかの作動体メカニズムが含まれると 考えられる。代わりに、抗体は毒物をリノンＡ鎖等のような特異な方法で運搬す るのに用いられている。
受動的ワクチン接種では、後述するように、被験動物に適切なペプチドを注射し 、末梢血リンパ球または排出しているリンパ節等の他の器官からのリンパ球を採 取する。Ｔ細胞は免疫の転移に直接用いられていると考えられる。代わりに、Ｔ 細胞は、選択的刺激剤としてＴＣＲペプチドを含む培地で、ＩＬｉまたはこの分 野で知られている他のＴ細胞成長因子で拡大して培養し、Ｔ細胞系またはり。
ローノとして維持した後に、免疫の転移に用いられる。Ｂ細胞は、ＴＣＲペプチ ドで免疫化した動物の初代細胞集団から回収され、ＴＣＲペプチドに特異的な単 一クローン性抗体生産用ハイブリドーマを生産する標準的なテクニックを用いて 、細胞系融合パートナ−への融合により不朽化される。
適切な抗体を生産するハイブリドーマは、直接ＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定法等の従来の 免疫学的検定法で、ＴＣＲペプチド抗原または適切なＴ細胞との反応性を検査さ れ当発明のＴＣＲペプチドのような特定の抗原に対する単一クローン性抗体（、 ｍＡｂｓ）は、この分野の熟練家に知られている方法で得られると考える。
例えば、Ｋｏｈｌｕ　ｚｎｄ　ＭｉｌＮｔｉｎ、　Ｌ＋ｌｏｕ　２５６：　＋９ ５−４９７（１９７５）とＵ、Ｓ、Ｐｅｌｔ口１懇１、１７６、１１０を寥照の こと。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＭｇＧ、ＥｇＧ、ＡｇＧ。
ＤｇＧを含む、免疫グロブリンのクラスとそのサブクラスに属するものと考える 。
代わりに、抗体は、この分野で知られている種々の精製法を経て、ＴＣＲペプチ ドで免疫化した動物のポリクローン性抗血清から準備され、抗ＴＣＲ免疫の受動 転移に直接用いられる。
蕩歯類由来の単一クローン性抗体を、単一クローン性抗体のＶ領域をコード化し ているｃＤＮＡ分子をヒトの定常部分をコード化しているＤＮＡに結合させるこ とにより、「ヒ［・化」する。それには、下記の論文のいずれかの方法を用いる 。
Ｃ＋ｂｉｌ１７　ｔ＋　ｒｌ、、Ｕ、Ｓ、Ｐ！ｌ＋ｎｔ　ＬａＩ３．５６７　（ ３／２８／８９１　ｉｎｄ　Ｃｕｔ、Ｐ＋Ｉ＋ｎｌ　ＰｕｂAＥＰ １２５［３′ｌｂ’１４／８１１：　Ｔａｒ、１ｇｌ１ｃｌ＋ｉ　ｔ＋　Ｊｌ、 、　Ｃｕｔ、　Ｐａ１ｎｔ　Ｐｕｂ　ＥＰ　１７３４９４　狽R１５／８６）　 ； Ｎ＋ｕｂｕｇｕ　Ｎ　１１．、ＰＣＴ　Ｐｕｂ、　１０８６９１５３３（３／１ ３／８６）：　Ｋｕｄｏ　ｅｔ　ｒｌ、、　ＥＩＩｔ、ＰＮモ獅■ ？ｕｂ、　ＥＰ　１ｇ４Ｈ７’６／ＩＩ／’Ｈ）：　Ｒｏｂｉｎ＋ｏｎ　＋１　 ！＋、、ＰＣＴ　Ｐｕｂ、ＷＯ８７９２６７１！５／７／８V）； Ｃ１ｂ１ｉＨＪｌ　１１．、　ＰＩＯ（、Ｎａ１１　人＋＋１．　Ｓｋｉ、Ｕ、 Ｓ　＾　８１：　３２７３−３２７７　＋１９８４）。
騒ｏ＋＋ｉ＋ｏｎ　ｃｔ　ｒｌ、、　？ｒｏｃ、　Ｎ＋＋１．　Ａｕａ、　Ｓｅ ｉ、Ｉｌ、　Ｓ　＾　８１１　６８５１−６８５５’１９８S）： Ｂｏｕ１１＋ｏｎ＋　＋１１１．、’１１１１１１８１２：　６４３−６＋６（ １９８４）：　Ｍｏ＋＋１ｉｏｎ、Ｓ＋ｉ＋ｎｃ＋、２２９：２０２−１：０７ １ｉ１８５）ｌｌｔｕｏ＋＋ｇ！ｒ＋ｌ　ｒｌ、、Ｎｚｔｕｕ　８１４：　２６ ｇ−２７０ｆ１９８５）：　Ｔ＋に＋ｄ{ ＋ｔ　ｒｌ、、　Ｎ＋ｔｕ：＋　３１１．　１５２１５４ｉ１１８５）：　Ｔｘ ｎ　ｔｌ　ｈｌ、、　］、　ｌ＋ｎｍｕｎｏｌ、　＋３５１@３５６４− １５６：：１Ｈ５ｉ、　ｌｏｎ＋ｔ　ｌｌ　＋１．、　Ｎ＋１１１１！　３２１ ．５２２−５２５ｆ１９８６１：　Ｏｉ　ｃｌ　ｈｌ、。
ＢｉｏＴ＋＋ｈ＋ｉｑｕ＋ｉ　Ｉ：　、＋１１１１９８６）：　Ｓ＋ｇ＋ｎ　ｅ ｔ　ｒｌ、、Ｉ、ｌＩＩ＋ｕｎｏ１．　１３７：　１０６６|１０７４ １９８６１、　Ｓｕｎ　Ｎ　Ｉｌ、、１ｌｙｂｒ１ｄｏｎｉ　５　ｆｓｕｐｐ、 ｌ）：　５１７−５ＩＨ１９８６）：　Ｓｕｎ　ｔｌ　ｒｌA。
”：ｏ（”ｊａｉｌ、ＡＣＩＱ、Ｓｋｉ、Ｕ、Ｓ、　、ζ　ｇ４２１１−２１８ （１９８７）：　Ｌｉｕ　ｔｌ　＋１．　ＰＴＯＣＮｓｌｌB へ（ＩＣ，Ｓ（１，Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　ａＪ：　Ｈ３９−３４＋３ｆ１９８７） ：　Ｌｉａ　ｌ＋　＋１．．　ｉ、　１ｍ１ｕｎｏ１．　１R９ １５２１−３５２６！’＋９８７１８！ｔｔｃｒｔ＋　ｒｌ、、５ｃｉｅｎｃ＋ 　２４０：　１０４１０４ｌ−１０４３（２０，１９Ｈ１：Ｈｏ：ｔ１＋＋、Ｊ ｌ　１１．、Ｐ＋ＯＣ，Ｎ＋＋１．　：へｕ６．　Ｓｋｉ　υ　Ｓ、Ａ、８５　 ：　８６７６−８６８２　（１９８８１B キメラ状抗体の好ましい生産方法は下記の５つの要素の組み合わせである。
（１）単一クローン性抗体を生産する、マウスのＢ細胞ハイブリドーマ系か呟メ ソセンツヤ−ＲＮ　Ａ　（ｍ　ＲＮ　Ａ　）を分離。そこからクローン化により ｃＤＮＡを生産することになる。（２）精製ｍ　ＲＮ　ＡからｃＤＮＡの全ライ ブラリを準備。
そこからし鎖とＨ鎖の遺伝子の、適切な可変（Ｖ）部分の遺伝子セグメントを（ ｉ）適切なプローブで同定し、（ＩＩ）配列し、（ｉｉｉ）遺伝子セグメントの 定常（Ｃ）部分と共存させることができる。（３）遺伝子セグメントのＣ部分モ ジュールの、ｃＤＮＡ準備とクローン化による準備。（４）上記（２）のクロー ン化特異的免疫グロブリンのＶ部分遺伝子セグメントの、上記（３）のクローノ 化ヒトＣ部分遺伝子セグメントモジュールへの結合による、完全なＨ鎖またはＬ 鎖のコート配列の組み立て。（５）原核細胞と真核細胞を始めとする、選ばれた ホストてのキメラ状り鎖とＨ鎖の表現と生産。
哺乳類の細胞のＨ鎖とＬｊｊ！クローン化遺伝子を発現させるために利用できる ベクターンステムは多数あるｆＧｌｏｒｕ、Ｄ、　Ｍ、、ｃｄ、、ＤＮＡ　Ｃｌ ｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ、１１．　ｐｐＨ３−２３１１ＲＬ　ｈｉｓｓ、！９８５参 照）。完全なＨ２Ｌ２抗体を得る別のアプローチもある。
同し細胞のＨ鎖とＬ鎖を共に発現させて、細胞内のＨ鎖とＬ鎖の対合と結合を完 プラスミドを用いると、共存発現は起こり得る。Ｈ鎖とＬ鎖両方の遺伝子は同一 プラスミドに置いてから細胞内に転移できる。それにより、両方の鎖を発現する 細胞を直接選ぶ。代わりに、まず一方の鎖、例えばＬ鎖をコード化しているプラ スミドで細胞をトランスフエフ］・シ、次にその結果の細胞系を二次選択マーカ を含むＨ鎖プラスミドでトランスフェクトする。いずれかの経路で８２Ｌ２分子 を生産する細胞系は、ｇｌ＋の選択マーカと共に、■］鎖、Ｌ鎖、Ｈ鎖プラスＬ 鎖、のいずれかの別のコピーをコード化するプラスミドでトランスフェクトする ことができ、組み立てられたＨ２　Ｌ２抗体分子の生産向上やトランスフェクト された細胞系の安定性向上等の、強化された性質の細胞系を産生ずる。
この発見のキメラ状抗体は、ＴＣＲか認識するマウスのｍＡｂ？ｆ’ｙ性と、ヒ トの抗体の生物学的特性の両方を備えており、これらの特性には免疫原性低下と ヒトでのクリアランス抵抗性が含まれている（重複治療が可能になる）。
当発明の抗ＴＣＲペプチド抗体（ポリクローン性、単一クローン性、キメラ状） は免疫接合体として治療に用いることができる（Ｄｉｌｌｍｉｎ、　Ｒ，Ｏ，、 人ｎｎ、ＩｎｔＭａｄ、ｌ１１５９２−６０３（１９８９１を参照して検討のこ と）。それらは、腫瘍壊死因子等のタンパク質たけでなく、リッツＡ、シュード モナスの毒素、ジフテリアの毒素のようなリポソーム抑制タンパク質を始めとす る細胞毒性タンパク質に接合させることができる。抗体その他のりガントに接合 させる毒素はこの分野では周知である（例えば、Ｏｌ＋ｃｅ＋　ｅｉ　ｉｔ、、 １ｍａｕｎｏ１．　Ｔｏｄｉ７１０＋　２９１−２９５（１９Ｈ１を参照）。
そのような接合抗体の他の例は、Ｘｏ＋ｕＸＹＩｌｅ　ｆＲｌ　−ＣＤ５　Ｐｌ ｕｉで、これはりシン鎖に接合した抗ＣＤ５のｍＡｂである。これの準備は移植 片対ホストの疾病の予防法と治喰法に有効である。特にこの毒素接合抗体は大抵 のＴリンパ球とＢリンパ球サブセットに特異的である。ＣＤ５マーカを宵する細 胞は治療に対する反応が急速に低下する。ＴＣＲペプチドの抗体は全リンパ球の 比率よりもかなり低い比率のリンパ球で反応するので、リジンＡに接合した抗Ｔ ＣＲ抗体は高用量でも患者は耐え得る。逆に言えば、低い用量でも有効である。
ＴＣＲペプチドにリジンＡが接合した単一クローン性抗体の有効量は約０．００ ５〜０．５■／ｋｇ／ｄ＋ｙの範囲で、好ましい用量は約０．０５〜０，２■／ ’ｋｇ／′ｄｘ７の範囲である。
当発明の抗ＴＣＲペプチド抗体は、自己免疫、または悪性やリンパ球増殖性の＠ 者の治療用に、放射性核種、細胞毒性薬を始めとする他のタイプの治療成分に接 合させることができる。抗体に接合させてイノビトロで抗体部位にまで運搬２１ ２　１：１１　１８６ できる放射性核種は無数にあるが、例を挙げると　Ｂｉ、　Ｉ、　Ｒｅ。
９０Ｙ等がある。このような放射性核種は、放射線療法でよく知られているよう に、細胞を局所的に照射し、細胞内部の種々の損傷を引き起こして、その細胞毒 性作用を発揮する。
抗体に接合させてからインビボで治療に用いることができる細胞毒性薬には、ダ ウノルビノン、ドキソルビシン、メトトレキサート、マイトマイシンＣ等がある 。細胞毒性薬はＤ　Ｎ　Ａ、Ｒ，Ｎ　Ａ　、タンパク合成を始めとする重要な細 胞プロセスを干渉する。この分野で知られているこれらのクラスの薬剤とその作 用機序のさらに詳しい説明には、Ｇｏｏｄｍｘｎ　ｃｌ　ｒｌ、、Ｇｏｏｄｉ＋ ｎ　ｚｎｄ　Ｇｉｂｆｆｌａ＋＋’　ｓ　ＴｈｅＰｈ＋：ｍａＣｏｌｏｇｕ＋ｌ 　Ｂｘｉｉｉ　ｏｆ　Ｔｈｕｚｐｕｔｉｃｔ　７１ｈ　Ｅｄ、、　Ｍｏｍ１ｌｌ ＋ｎ　Ｐｕｂｌｉｉｈｉｎｇ@Ｃｏ、。
＋１９８５）を参照のこと。
当発明の断片または誘導体の抗体を用いた患者の治療は、その断片または誘導体 の抗体の１用量または複数用量の非経口投与から成る。有効量は個々の抗体、接 合治療薬の有無と性質、患者とその臨床状態の関数で、体重１ｋｇ当り約Ｌｏｎ ｇから１００■の範囲である。投与の経路はＩＶ、ＳＣ，筋肉内、肺内、腹腔内 （ＩＰ）、鼻腔内、鞘内、真皮内、経皮的、あるいはその他の既知の経路が含ま 疾病または疾患治療における当発明の前臨床・臨床の治療的使用は、熟練家が一 般に是認された診断と治療の原則を駆使することにより、最もよく目的が達成さ れる。そのような原則はこの分野ではよく知られており、例えばＢｒ１１ａｖ＊ ｌｄｕ　＋１．　ｒｄＳ、、Ｈｕ＋ｉ＋ｏｎ’＋　Ｐ＋ｉｎｃ＋ｐｌ＋＋　ｏｆ 　１ｎｌｅ＋ｎ！ｌ　ｉｌ＋ｄｉ＋ｉａｅ、１ｌｌｂ　Ｅｄ、。
Ｖ＋Ｇ＋＋ｗ−Ｈｉｌｌ、ｐａｂｌｉ＋ｈｕ、Ｎｅｗ　Ｙｏｌｋ、Ｎ、Ｙ。ｆ１ ９８７）で述べている。
ペプチドおよび当発明の組成、あるいはそれらの機能的誘導体は薬学組成の準備 によく適している。当発明の薬学的組成は、当発明の組成の利き目の恩恵にあず かる動物には投与できると考える。当発明の目的は限定されたものではないが、 そのような動物の最初に置かれるのは人間である。
当発明の薬学的組成は、その目的を達成するならどのような投与法でもよい。
例えば、非経口的、皮下、静脈内、真皮内、筋肉内、腹腔内（ＩＰ）、経皮的、 頬経由で投与される。代わりに、または同時に、投与は経口的でもよい。ペプチ ドと薬学的組成はポーラス注入で非経口的に、または逐次の潅流により、投与す ることができる。
投与量は、年齢、性別、健康状態、患者の体重、もしあれば併用治療、治療頻度 、所望の効果の性質に依存する。当発明の組成投与の用量範囲は、所望の効果を 得るに十分な量であり、例えば、ＤＨまたは抗体生産量で測定するペプチドに対 する免疫反応が達成さて、免疫関連の疾病がかなり予防、抑制、治療される量で ある。用量は、望ましくない交差反応、全身性免疫抑制、アナフィラキシ反応、 等の副作用を起こすほど多くてはいけない。
ヒトの好ましい用量は、体重１ｋｇ当り約０．００１〜２５■の範囲である。
それ自体で薬理学的活性のある当発明のペプチドの他に、薬学的組成は賦形剤と 補助的物質から成る、薬学的条件に合う適切なキャリアを含んでいることもある 。賦形剤と補助的物質は活性化合物を薬物学的に使用可能な調合物に加工するの に役立っている。好ましい組成はミョウバン等のアジュバント、またはこの分野 で知られている他のアジュバントを含む（例えば、Ｗ！ｕ＋ｎ　ｔｌ　ｉｆ、、 　＾ｎｎ、　ＲｅｖｌｌＩｍｏｎｏｌ、１：　３６９−３８Ｈ１９８６）：　Ｃ ）ｕｄｉｄ、　Ｌ、、Ｆｔａｕ、　Ｐ＋ｏＣ，４５：　２５３１−２５６０（１ X８６１ を参照）。
運搬や生物活性を強化するために、この分野で知られている方法と組成を用いて 、ペプチドをリポソームに取り込ませることができる。
錠剤またはカプセルの形で経口的に投与できる薬剤、坐剤等の直腸から投与でき る薬剤、注射や経口注入用に溶液の形の薬剤は、賦形剤と共に、約０．００１０ ６から約９９％、望ましくは約０．０１％から約９５％の能動組成を含んでいる 。
適切な賦形剤は、乳糖、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、セルロース調合 物等の糖類、および／′または脱弗リン鉱石、亜硫酸水素カルシウム等のリン酸 カル／ウム、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、じゃがいも澱粉、ゼラチン 、トラガカノトゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース 、カルボキノメチルセルロースナトリウム、および／′またはポリビニルピロリ ドン等の結合剤に用いるスターチ、等である。
経口的に用いることができる他の薬学的組成には、ゼラチン製のブツシュ・フィ ツトのカプセル、ゼラチンにグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤を 加えてつくる柔らかい封入カプセル、等がある。ブツシュ・フィツトのカプセル は顆粒の形で活性化合物を含むことができる。顆粒は、乳糖等の賦形剤、スター 羊等の結合剤、および／またはタルクやステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、 選択的に安定剤と混合することができる。ソフト・カプセルでは、活性化合物は 、脂肪油、液体パラフィン等の適切な溶液に溶解または懸濁することか望ましい 。さらに、安定剤を加えてもよい。
直腸から用いることができる薬学的調合物として可能なものは、例えば、１種以 」二の活性化合物を坐着ヘースに組み合わせである坐剤等がある。適切な坐着ベ ースには、例えば、天然または合成のトリグリセリド、またはパラフィン炭化水 素等がある。活性化合物をベースに組み合わせた、ゼラチンの直腸カプセルを用 いることも可能である。ベースの素材として可能性のあるものには、例えば、液 状トリグリセリド、ポリエチレングリコール、パラフィン炭化水素等がある。
非経口的投与に適する調剤には、水溶性ペプチドの溶液が含まれ、例えば、水溶 性の塩類がある。さらに、油懸濁注入用に適したペプチドの懸濁液を投与するこ とができる。適切な脂肪親和性溶液または賦形剤には、例えばごま油等の脂肪油 、エチルオレアートやトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル等がある。水性庄 人！濁液には粘性率を増加させる物質を用いており、カルボキシメチルセルロー スナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストラン等がある。選択によ り、懸濁液には安定剤を入れてもよい。
ペプチドは従来の薬学的基準に合う非経口的賦形剤を用いて注射による投与用に 調合される。これらの賦形剤は毒性がなく、治療作用があり、幾つかの調合例が Ｒ＋ｍ１ｎｇｔｏｎ’＋　Ｐｈａ＋１ｍ１ｃｕｔｉ＋ｉｌ　５ｃｉｅｎｃｅ（（ ｉａｐ＋ｉｌ　に示されている。賦形剤は多数あるが、その例は、水、食塩水、 リンガ−液、デキストロース溶液、バンクの平衡食塩水等である。当発明に従う 調合も等損性、生理学的ｐＨ１安定性を維持する物質等の添加剤を少量含むこと になるであろう。
当発明のペプチドは凝集塊や他のタンパク物質をかなり除去した精製された形で 調合されることか好ましく、濃度は約１．　Ｏｏｇ／ｖＡｌから約１００■／ｍ ｌであることが好ましい。
免疫関連の疾病の予防、抑制、治療に用いる当発明のペプチドの有効量は体重１ ｋｇ当り約ｌｏｇから１００■の範囲である。好ましい用量範囲は約１０１から １０■７′−の範囲である。さらに好ましい用量範囲は約１１００ｎから１■／ ｋｇの範囲である。
ペプチドの免疫原性は、長いペプチドまたは鎖にそれを含めること、または、標 準的結合テクニックを用いて、ＫＬＨ，血清アルブミン、破傷風トキソイド、等 の「免疫学的」キャリアにそれを接合させることにより、強化される。この分野 ではその種々の方法が知られている。例を挙げると、ノンクロへキンル力ルポ／ イミド等の縮合剤の使用、またはＰｉｃｔｃｔ　Ｃｈｅｍｉｃｉｌ　Ｃｏ、、Ｒ ｏ＋ｋｌｏ＋ｄ、　ＩＩから市販されているリンカ−の使用等である。
当発明の調合によるＴＣＲペプチド特異性Ｔ細胞での受動免疫には、採取された Ｔ細胞は、生理的平衡食塩水等の適切な賦形剤に懸濁し、１回の注射につき約５ つ １０〜１０　個の細胞を被験者に注射する。ＴＣＲペプチド特異性抗体の用量は 、抗体のもとのホスト、アイソタイプ、親和力、性質（ポリクローン性、単一ク ローン性、キメラ状）、および熟練家に知られている他の特性の関数であり、ば らつきがある。例えば、ＴＣＲペプチドに対する単一クローン性抗体は０．０１ 〜５０■／ｋｇの範囲の用量で投与される。
当発明の範囲で意図していることは、予防作用のあるＴ細胞とＴＣＲペプチド特 異抗体（ポリクローン性、単一クローン性、キメラ状）との組み合わせによる、 フリーまたは接合形態での受動免疫である。
下記の例は当発明の説明を意図したものであるか、当発明を限定するものではな い。
実施例Ｉ ヒトＭＳ患者のＴＣＲペプ千ドによる治療現在のところ、ＭＳに関する有効な治 療は知られていない。
（Ｈ＆＋＋ｉ＋ｏｎ’　ＩＰ＋１ｎｃｉｐｌ＋＋　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍ ｅｄｉｃｉｎｅ、第１２版、ウィルゝノンＪＷｉｌ＋ｏｎｉ呟マクグロー・ヒル ・インコーボレーテソド（ｌＪｃＧ＋＋ｖ　Ｈｉｌｌ、Ｉｎｃ、）。
＋９９１）治療努力は、急性エピソードの好転、疾患の再発または進行の予防お よび症状の軽減に向けられている。ＭＳの臨床的発現は、脳幹、小脳またはを髄 の神経群または６位のどれが関与するかによる。を髄関与はＭＳの最も進行した 症例における主要な特徴である。
疾ゑの嘗性エピソードにおいて、グルココルチコイド治療は症状の苛酷さを軽減 し且つ回復を促進する可能性を有すると示唆されてきたが、しかしながら、その 提唱者でさえも、最終的な回復はこの薬剤によって改善されないし、永久的０疾 の程度も変更されないということを指摘している。ＡＣＴＨは、ＭＳおよび視神 経炎のエピノードにおいてグルココルチコイド療法の何等かの有効性を実証した 唯一制御された試験がこの薬剤を用いて実施されたことから、臨床医にとって好 ましいグルココルチコイドである。しかしなから、長期間のステロイドの使用は 勧められない。
アザチオプリンおよびノクロホスファミド等の免疫抑制剤はいくつか連続する再 発回数を減少させると主張されてきたが、これらの薬剤の有効性についての見解 はいずれも一致していない。
ＭＳの治療に関して現在勧められることは、症状の悪化を避ける試みを考えるこ とである。患者は、過労および極端な温度を避ニブ且つ均衡食をとるように勧め られる（上記考察は主として、Ｈｏｒｉｚｏｎ’　＋　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌ＋＋　 ｏｆ　１ｎｌｅ＋ｕｌ　Ｍｔｄｉｃｉｅｔ。
第１２版、　１９９１年の第３５６章による）。
上記考察は、ＭＳの臨床的に有効な治療に対する要求が急を要していることを明 確に指摘している。
本実施例は、ＭＳ患者を臨床的に改善させる療法の最初の実証を提供する。提示 された臨床データは、インビボにおいてＴＣＲペプチドで治療された２人の患者 に由来する。その結果は、ペプチドＶβ５２および■β６．１がミニリン塩基性 タンパク質（Ｂ　Ｐ）に対する自己免疫応答を免疫系応答の同時抑制を伴うこと なく抑制するその能力を実証する。最も重要なこととして、そのデータは、ＭＳ 患者をＴＣＲで治療する臨床的有効性を実証している。
ＭＳ患者からの血液Ｔ細胞および対照をヒトＢＰに対する応答用に選択した。
応答個体であるＴ細胞系をクローン化し、そして各ＢＰ反応性クローンのＴＣＲ ■αおよびＶβ遺伝子の発現を分析した。試験されたＭＳ患者において、本発明 はＴＣＲＶＢ２．２およびＶＢ２１の優先的利用を発見したが、１人の対照ドナ ーでは１３クローンの内１１個がＶＢ１４を利用した。
データから、本発明者は、各患者のＢＰに対する応答においである限られた数（ １個または２個）のＶβ遺伝子が優先的に利用されたと予想した。
抗原性ペプチドの選択 この実施例において用いたペプチドの選択は、上記に記載した方法およびアルゴ リズムに従って行った。具体的には、適切なＴＣＲ配列の領域を、それらの予想 された抗原性または免疫原性および／またはＣＤＲ２領域でのそれらの分布基準 で合成用に識別した。Ｔ細胞に対して免疫原性または抗原性であると考えられた タフバク質またはペプチドの領域を、本明細書中に記載のアプローチおよびアル ゴリズムを用いて識別した。
」１紀アプローチを用いて、ヒトの多発性硬化症を治療するのに有用なペプチド 配列を選択した。この実施例で用いるために選択されたペプチドの寸法は、主と して免疫原性の必要条件によって決定されたが、同時に、ペプチドに特異的なＴ 細胞または抗体か自然なままのＴ細胞上のＴＣＲを認識し且つ反応するように最 小限のエピトープ構造を保持した。従って、治療に用いるためのマーカーＴＣＲ Ｖ遺伝子配列の抗原領域を識別することは重要であった。ヒトＴＣＲ■β遺伝子 からの多数のペプチドの配列がこの研究用に考えられた（ＴＣＲＶＢ２．２ペプ チド　■β−２６−４３、■β５．２−３９−５９、ＶＢ５２−５９−７８゜Ｔ ＣＲＶＢ２１ペプチド　■β６．１−１−２２、ＶＢ２．１３９−５９、ＶＢ２ ．１−７０−８８゜）。選択されたペプチドは、Ｍ　３　虫考からのＴ細胞によ って増大した認識基準てＶＢ２．２　（３１−５９）およびＶＢ２．１　（３９ −５９）であった。
ＮτＳ咀者の治療に用いるためのペプチド配列を選択する上記アプローチの使用 は、本明細書中に記載のこのアプローチの成功を例示している。例えば、ペプチ ドＶβ５．２　（３９−５９）およびＶＢ２．１　（３９−５９）は、上記アル ゴリズムにより、Ｔ細胞に対して免疫原性であると予想された。実際に、以下に 記載したように、これらのペプチドはＴ細胞免疫性を生したし、そしてＢＰに対 する自己免疫反応からＭＳ患者を保護していると考えられる。
ＴＣＲペプ千ドによる治療 選択されたペプチドの抗原性は、患者のＴ細胞からの応答の検出可能な頻度が存 在したかどうかを決定することによって検定された。具体的には、種々のペプチ ドに対して応答するＴ細胞の頻度の相違を検定した。次に、最強頻度の応答をも たらすペプチドを用いた。
各患者を、食塩水中のＴＣＲペプチド１１００ｕを週に１回４週間皮肉に用いて 治療した。も者の、インビトロおよびＤＴＨ応答での血液Ｔ細胞頻度分析によっ て測定されるペプチドに対する増大した応答の徴候を毎週評価した。ペプチドに 対する応答は、必要に応じてペプチドの周期的ブースター注射によって保持され た。さらに、患者の歩行指数およびクルツク（ＫＩＩ目＋１りスコアの変化を３ か月毎に臨床的に評価した。
測定されたパラメーター ＴＣＲペプチド■β５．２およびＶＢ２１塩基性タンパク質（ＢＰ）並びにＨ３ Ｖ　（単純庖疹ウィルス−リコール抗原として用いられる）に対するＴ細胞応答 を、リンパ球増殖によって評価した。患者Ｊ、Ｍ、　をＶＢ２１で治療し、モし てＴ細胞頻度を■β６．１並びに療法として与えられなかったＶＢ２．２双方に 応答して追跡した。患者Ｍ、Ｒ，を■β５．２て治療し、そしてＶＢ２２および ＶＢ２．１双方に対する応答を試験した。
両方の患者のＢＰに対する応答を、ＢＰまたはＰＬＰ反応性Ｔ細胞の頻度が正常 、神経学的または自己免疫対照の場合よりもＭＳ患者において高いという根拠ゆ えに評価した（アレグレソタ（Ａｌｌ！ｇ＋ｅｔｌ＋）ら、　Ｓｃｉ＋ｎｃ＋　 ２４７＋　７１８（１９９０）：す／り（Ｌｉｎｋ）ら、　’ｌ＋ｕ＋ｏｌｏｇ マ１０：　２８１０１９９０）　ｌおよびオーク（Ｏｌｉｌら、駄狂旦３４６１ １８３ｔ１９９０１）。この実施例において用いたような本発明のＴＣＲペプチ ドによって与えられた選択的免疫調節計画は、ミニリン塩基性タンパク質がＭＳ において適切な自己抗原であるという仮説に関する最初の試験を提供する。
Ｈ３Ｖに対する免疫応答を、ＴＣＲ療法が患者の全免疫応答を抑制するか否かを 決定するように追跡した。本発明者の実験モデルに基づいて、県者は投与された ＴＣＲペプチドに対する増大した応答を示した。ＴＣＲペプチドに対するこの増 大した応答は、ＢＰに対する減少した応答と対になっていた。さらに、患者はＨ ３Ｖまたは療法として用いられなかった他のＴＣＲペプチドに対する減少した応 答を示さなかった。
結果 得られたデータは、ＭＳ患者でのＴＣＲ療法の有用性を明確に実証している。
抗原反応性Ｔ細胞の頻度を測定するデータは以下のように要約することができる 。
すなわち、（ＴＣＲＶＢ２．１を与えられている）患者Ｊ、Ｍ、　は、ＶＢ６１ に対するＴ細胞応答が（治療後１週間で）４倍に増加し、それが（４週間で）予 備治療に対して約２倍の増加まで徐々に減少した。ミニリン塩基性タンパク質（ ＢＰ）細胞応答は、事実上、４週間まで検出不能（検定の限界未満）であった。
ＶＢ２．２に対する応答は（この患者がＶＢ２．２ペプチドを与えられたことが ないことがら′ｆ−想されたように）はぼ同一の状態であったが、Ｈ３Ｖに対す る応答は・１週間にわたって増大した。
（ＶＢ２．２ＴＣＲペプチドを与えられた）患者Ｍ、Ｒからのデータは、４週間 までのＢＰ反応性Ｔ細胞の事実上の消失とともに、ＶＢ２．２反応性（調節）Ｔ ！ｌｌ胞の３０倍増加を実証している。Ｍ、Ｒ，の、ＶＢ６．１（この患者はこ のペプチドを与えられたことがない）およびＨＳ　Ｖに対する応答はほぼ同一の 状態であった（図１２〜１４）。
抗原反応性Ｔ細胞の頻度の実証された増加に加えて、患者Ｊ、Ｍ、は歩行の劇的 好転も経験したし、患者ＭＲ０はスタミナの増加を報告している（疲労により衰 弱することなく４００ヤード歩くことができる）。
ＴＣＲペプチドによる治療前に、患者Ｊ、Ｍ、の歩行は漸進的に悪化していた。
２５フイートの時間測定歩行に関′して、この距離を歩＜Ｊ、Ｍ、の時間は７秒 間〜１２秒間、続いて２９秒間まで進行していた。
ＴＣＲペプチドによる治療の３か列後に、Ｊ、Ｍ、　は歩行の好転を実証した。
悪化が阻止されただけでなく、歩行時間が２９秒間〜２１秒間まで劇的に好転し た。
考察 データは、ＴＣＰ療法のＢＰに対する免疫応答を調節する劇的能力を実証し、そ れによって、ＭＳの治療法を提供する。ＶＢ２２およびＶＢ６．１の投与は、Ｍ 　Ｓ　、！！者におけるＴ細胞応答の増大を示した。ＢＰに対するＴ細胞応答の 対応する減少は、ＴＣＰペプチド療法のＭＳ患者に対する正の治療効果を示す。
さらに、Ｈ５Ｖに対する患者の応答が減少しないことは、免疫系がＴＣＲペプチ ド療法によって危険にさらされないことを実証している。
上記実施例は各患者に対して単一のペプチドを用いているが、本発明では、も者 を治療する場合の「カクテル」アプローチの使用が考えられる。カクテルアブロ ー千は、２＠以上のＶ遺伝子領域に対する反応性を実証するクローンを有するＷ 者において有用でありうるし、従って、Ｗ者に対して投与されたカクテルは、Ｓ ＪＬマウス実験において用いられたような２個以上の抗原性ペプチドを含むこと かできると考えられる（図１５．実施例Ｘ）。
実施例■ 対して反応性のヒトＴ細胞クローンの特異性４込 ミニリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）は極めて抗原性であり、種々の動物種にお いてアジュバントと一緒に注射された場合に実験的自己免疫脳を髄炎（ＥＡＥ） を引起こす（アルヴオード（Ａｌｙｕｄ）　、　Ｅ、　Ｃ，、ジュニ乙ｌｎ　Ｅ ｒｐｅ＋１ｓｅｎｌ＋ｌ入ｌｌｕｇｉｃ　Ｅｎｃ＋ｐｈｉｌｏｕ＋１ｉｌｉｔ　 多発性硬化症に有用なモデル（＾ｕ１ｅｌａｌ　ｍｏｄｅｌｉｏ「ｍｕｌ＋１ｐ ｌｅ　ｏｌｕｏｉｉ＋）、アルヴＡ−ド、Ｅ、Ｃ，、ジュニアら（監修）、アラ ン（人ｌ＋ｎ１．　Ｒ，リス・インコーボレーテ・ソド（Ｌｉｏ、ｌ＋ｃ、）、 ニューヨーク、　５２３−５３７頁（１９ｇ＋＋＋。
ＭＢＰの脳炎誘発性は、別個の数の免疫優性エピトープ（約１０個）中に包含さ れている。各系統中のこれらのエピトープの１個またはそれ以上が、利用可能な りラス［Ｉ　ＭＨＣ分子と一緒に、中枢神経系（ＣＮＳ）に帰るＣＤ４＋Ｔ工フ エクターリンパ球を誘導して、脈管周囲の炎症性病変および神経機能不全を引起 こす（ザンビル（２＋１ｖｉｌｌら、　１．　ｌ＋１ｌｕｎｏ１．　１３９：　 １Ｇ７５　ｆ１９８７１　ニオフナ−（ＯＩｌｎｅ＋）　。
Ｈｌら、１．　ＥＢ、Ｍｅｏ、１７Ｑ：　３５５（１９８９１）。
ＭＨＣおよび非ＭＭＣ遺伝子双方を含む遺伝学的背景は、ＭＢＰエピトープが脳 炎誘発性であること（ベロード（Ｂｅ＋ｕｄ）ら、　Ｉ、１ｍｍ１Ｉｎｏ１．１ ３６　泪＋１９８６＋　。
ザンビルら、　ｌ　Ｅ＋ｐ、　ｌＪ＋ｆ１．　１６２：　２１００１９８５）） 　、疾患の臨床的経過および苛酷さアン（ｌＪｏｋｈｌｕｉｚｎ）ら、　Ｎ＋ｌ ＋ｍ　（ｏンドン）　３０９：　３５６ｆ１９８４＋）　、脱Ｂ（モクタリアン ら、　回＋ｎｎ　（ロンドン）　３０９１３５６！１１８４））および耐性機序 （ベルナートＢｕｎａｒａｌ、Ｃ，Ｃ，、Ｃｌ１ｎ、Ｅ＋ｐ、ｌｌＩｍｕｎｏｌ 、　２９：　１００（１９７７１：ウエルチ（Ｗｅｌｃｈｌら。
及ぼす。
ＭＢＰ特異的Ｔ細胞によって誘導された臨床的および組織学的徴候のスペクトル は、多くのへて、ヒト疾患である多発性硬化症（ＭＳ）および急性播種注腸を１ ９ＨＢ。従って、ＭＩ３ＰのヒトＴ細胞認識はかなり興味深いものであった。
ＭＳの病因には、ヒトＭＢＰに特異的なものを含むＴ細胞の関与を示唆するいく つかの証拠がある。遺伝学的研究は、ＭＳの系統内（ハウザー（Ｈ！ｏｕ＋）ら 。
平衡失調を示している。しかしながら、ＭＳの病因におけるＭＢＰ反応性Ｔ細胞 の実際的な関与は、ＭＢＰｌｉ応性Ｔ細胞の選択的調節または除去が疾患経過に 影響を支はすことかある場合に実証することができるにすぎない。現在、このよ うな選択的調節はＥＡＥにおいて可能である。
本実施例において、合［ｆｆ１ＴＣＲペプチドを用いて、調節Ｔ細胞および、悪 性Ｔ細胞上のＴＣＲに対して向けられた抗体を誘導した。このアプローチはＥＡ Ｅの誘発を妨げた。さらに、前の実施例で実証したように、ＴＣＲペプチドを臨 床的に病気のラットに対して投与することは疾患の進行を阻止し且つ回復を促進 した。
＼丁Ｓｐ者において潜在的脳炎誘発性Ｔ細胞を調節するためのこのアプローチの 適用は、〜ｊＢＰ反応性Ｔ細胞がヒトＭＢＰの免疫優性エピトープに対する応答 においである限られた数のＴＣＲＶ領域遺伝子を優先的に利用するか否かによる 。
二の目的に対して、ＭＳを者および対照からのＴ細胞系を、免疫優性ＭＢＰエピ トープを認識するＴ細胞の出現を可能にする方法で選択した。これらの系統から 、１０９種類のＭＢ　Ｐ　Ｐｆ異的Ｔ細胞クローンを単離し且つ表現型、エピト ープ持異性、〜τＨＣ制限およびＴＣＲＶ遺伝子発現について特性を決定した。
そのデータは、Ｍ　Ｓ　４１．者からのＴ細胞か、正常ドナーからのＴ細胞が認 識するよりも多数の且つ種々の〜ｆＢＰエピトープを認識するということをクロ ーンレベルで実証している。さらに、疾患に関係した）ＩＬＡ−ＤＲ２／′ＤＱ ＷＩハロタイプを有する１人のＭＳドナーにおいて、試験された８種類のＴ細胞 クローンの内４種類がＶＢ２．２表現型を発現し、ＭＢＰに対する応答において ＴＣＲＶ遺伝子の優先的使用を示した。
ノズ１ユニバージティー　（Ｏｒ＋ｇｏｎ　Ｈｅ１ｌｌｈ　Ｓｃｉ＋ｎｃｅ＋　 Ｕｎｉ＋ｃ＋＋ｉ１７）ＭＳ診療室を訪れた臨床的にまたは検査室で確認された 明確なＭＳＳ看者１１人あった。女性７人および男性４人（平均年齢４６オ、年 齢範囲３４〜６７オ）であって、ＭＳ歴は６〜３５年間であった。患者の平均歩 行舟数（ＡＩ）は３．４±１．６（範囲１〜６）であり、平均クルツク（Ｋｕ＋ ｔ＋に＋）０疾状態スコア（ＫＤＳＳ）は４．３正常個体としては、ベテラノズ ・アフェアズ・メディカル・センター’Ｖ！＋！Ｔｉｆｉｌ＾ｔｆａｉｎ　Ｍｅ ｄｉｃｚｌ　Ｃｅｎｔｕ）およびオレゴン・ヘルス・サイエンシズ・ユニバー７ テイーの従業員である女性６人および男性３人（平均年齢３６オ、年齢範囲２５ 〜５５才）であった。これらの正常個体を、前記に記載したように、ヒトＭＢＰ に対する陽性のＰＢＬ増殖応答基準で選択した（ファンデンバーク’Ｖｉｎｄ＋ ｎｂｕｊ）ら、１．　Ｎ＋ｕｒｏ＋ｃｉ、Ｒｅｉ、２３：　２１ｆ１９８９）） 。
全被験者が、オレゴン・ヘルス・サイエンシズ・ユニパーツティー・トランスプ ランテーション・ラボラトリ−（Ｏｎｇｏｎ　Ｈｕｌｌｈ　Ｓｃｉ＋ｎｃ＋＋υ ｎ１ｔｕ＋１１７Ｔ＋ａｎｉｐｌ！ｎＤｌｉｏｎ　Ｌｚｂｏ＋＋ｉｏ＋７）で用 いられた標準的な血清学的方法により、Ｔ細胞系選択に遡及してＨＬＡ系であっ た。ＨＬＡクラス■アレレ（ＤＲ，ＤＱ）の頻度は、ＤＲ２に関して不均一な分 布を示しく患者１１人の内７人、すなわち６３９もがＤＲ２陽性であった：正常 の９人の内３人、すなわち３３％がＤＲ２陽性であった）、概して、それはこれ らの２群に予想された分布であった（チオフィロボウロス（Ｔｈ＋ｏｉｉｌｏｐ ｏｏｌｏ＋１．　Ａ、Ｎ、、８＋＋ｉｃ　＋ｎｄ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　１ｍｓｎ ｎｏｌｏｇ７．ステイノ（ＳｌｉＤｉ）ら（監修）、アンプルトン・アンド・レ ンジ・パブリッシャーズ（、八ｐｐｌｕｏｎ　ｘｎｄ　Ｌｚｎｇｅ　Ｐｕｂｌｉ ＋ｈｕ＋ｌ、ロス・アルトス、ＣＡ、１５１−１５４頁（アイラー（Ｅ７１ｕｊ ら、＾＋ｃｈ、Ｂｉｏｃｈｎ、ＢｉｏｐｈＬ＋、１３２：　３４（１９６９１） 。ＰＬ（残基４５−８９）、Ｐ２　（残基１−３８）およびＰ４（残基９Ｏ−１ ７０）を含むＨｕ　−Ｍ　Ｂ　Ｐのペプチドをベブノンによる開裂によって得、 そしてセファデックス（Ｓｅｐｈｗｄｅｔｌイオン交換クロマトグラフィーおよ び高速液体クロマトグラフィーによって精製した（ンユウ（Ｃｈｏａ）、Ｃ，Ｉ ｌ、−１ら、　１．　Ｎ＋ｏ＋ｏｃｈ＋ｓ、２Ｂ：　１１５ｆ１９７７））　、 　Ｈｕ　−ＭＢ　Ｐの配列１３−２８．３９−５４．５５−７４．７２−８４． ８７−９９．９０−１０９．１１０−１２９，１３０−１４９および１４９−１ ７０に対応する一連の合成ペプチドを、メリフィールド固相法によって合成し且 つ従来記載された方法に従ってＨＰＬＣによって精製した（ハンムリーニング試 験でＨｕ−ＭＢＰに反応性であった正常個体９人の血液から選択した（ファノデ ンバークら、　１．　Ｎ＋ｕ＋ｏ＋ｃｉ、　Ｒｅｄ、２３：　２１（１９８９） ）　、血液単核細胞（ＭＮＣ）をフィコール密度勾配遠心分離によって分離し、 そして完全培地（１０％ヒトヒト血清、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム および抗生物質を含むＲＰＭ＋　１６４０）中のｔ（ｕ　−ＭＢ　Ｐ　５０ｇｇ ／ｍｌと一緒に平底の９６おいて３７℃で５日間培養した。刺激された細胞を、 活性Ｔ細胞を増大させるｆ＝め（Ｄ２ｒＩ　Ｌ−２Ｒ地（Ｊｆ１ｍ体Ｉ　Ｌ−２ ，ＡＭＧＥＮ　バイオロジｈルズ（Ｂｉｏｌｏｇｉ＋ｚｌｉ１．サウザンド・オ ークス、ＣＡを５０　ｕ　／　ｍｌ含有）中に移した。ＩＬ−２中の増殖速度が 落ちた場合、Ｔ細胞を、照射末梢血液ＭＮＣ（４，５００ラド）中に１　：　１ ０　（Ｔ　＋ＭＮＣ）の比率で含まれたオートロガス単球によって与えられたＨ ｕ−ＭＢＰ２５＋＠／ｍｌで再刺激した。Ｔ細胞系は、細胞数がＭＢＰエピトー プ特異性、ＭＨＣ制限および表現型を評価するのに十分になるまで４〜５回再刺 激された。
Ｔ細胞クローニング　Ｔ細胞クローンは、Ｈｕ−ＭＢＰで２回再刺激されたＭＢ Ｐ特異的Ｔ細胞系の限界希釈によって得られた。Ｉ　Ｌ　−２に富む培地中で４ 日後に、■リンパ芽球を、Ｈｕ−ＭＢＰ　（５０Ｒ／ｍｌ）　、Ｉ　Ｌ−２（５ ０ｕ／ｎｌ）および照射ＭＮＣ（１，５Ｘ１０６個）を含む培地２０４当り細胞 １個、１０個および３０個まで希釈し、そして細胞混合物を６０ウエルタラサキ （Ｔｏ＋＋＊ｋｉ）微量試験トレー（ＮＵＮＣインコーボレーテソド（Ｉｎｃ、 ）　、ネイパービル、ＩＬ）の各ウェル中に入れた（ラム（Ｌ！ａｂ）ら、　１ ．　１ｍｆｆ１ａｎｏ１．　１２８：　２３３（１９８２））　ｏ　ヒトＭＢＰ ＊異的クローンの回収は、少なくとも１０個のＨｕ−ＭＢＰ反応性系細胞をウェ ル毎に播種した場合に最も効率がよく、回収率２０％を生じた。系統細胞１個だ けを播種した場合、回収率は２％であった。Ｈｕ−ＭＢＰ反応性Ｔ細胞を、細胞 １個／ウェルで播種することによって再度クローン化した。タラサキトレーを３ ７℃および５％ＣＯ２で７日間インキュベートした。再刺激のために、各陽性ウ ェルからの細胞を丸底の９６ウエルプレートの一つのウェルに移し、その中に、 Ｈｕ−ＭＢＰ２５■／ｍｌおよび照射ＭＮＣ２×１０５個を含む完全培地２００ ａを加えた。刺激後３日目に、ＩＬ、−２の５０■／ｍｌを細胞に加え、そして 細胞をＩＬ−２中においてさらに４日間維持した。細胞数が２〜４×１０５個に 達したら、培養物を２４ウエルプレート中のｌｉｌ中に移し、オートロガス照射 ＭＮＣ３Ｘ１０６個の存在下においてＨｕ−ＭＢＰで再刺激し、そして最後に、 富ＩＬ−２培地２ｍｌ中で増大させた。
オートロガス血液ＭＮＣＩＸ１０ｆとを、９６ウ工ル丸底微量滴定プレート中の 三重反復試験用培地０，２ｍｌ中において抗原不存在下並びにコンカナバリンＡ （Ｃｏ　ｎ　Ａ）　２＊／＋ｎｌ、Ｈｕ−ＭＢＰ５０Ｉ＠／ｍｌ、Ｈｕ−ＭＢＰ フラグメント（ＰＬ、Ｐ２およびＰ４）５０ｉ／ｍｌ、Ｈｕ−ＭＢＰの合成ペプ チド５０　ｑ／　ｍｌおよびｉ／２００希釈の単純庖疹ウィルス（ＨＳ　Ｖ）抗 原（ホイソタカ−（Ｊｈｉ＋ｔ＋ｋｅ＋）Ｍ、Ａ、バイオプロダクツ（ＢｉｏＢ ｏｄａｃｔ＋１．　ウォーカースピル。
ＶＤ）の存在下でインキュベートすることによって評価した。微量滴定培養物数 した。増殖は、刺激された培養物のＣＰＭ：！：ＳＤ　（バックグラウンドを減 じた）として表わされた。バックグラウンドは２００〜２．　０ＯＯＣＰＩＩで あった。
ＭＨＣ制限は、Ｈｕ−ＭＢＰ、Ｈｕ−ＭＢＰフラグメントまたはＨｕ−ＭＢＰの 合成ベブチーを加えたＴ細胞を、ＨＬＡ−ＤＰ、−ＤＱまたは−ＤＲ遺伝子座か らの分子のフレームワーク決定因子に特異的な抗体の存在下でインキュベートす ることによって評価された（抗体はベク［・ン・ディキンソン・）７−マソイテ イカルズ（Ｂｅｕｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎ＋ｏｎ　Ｐｈｕ＋ｎｘｃｕｔｉｕｌ＋）　 、　マウンテン°ビュ　、ＣＡから購入された）。
（抗ＣＤ４＋Ｔヘルパー）およびＬｅｕ２ａ　（抗ＣＤ８＋Ｔ細胞障害性／サブ １ノンサー）単クローン性抗体（ベクトン・ディキンソン）を用いて決定した。
Ｔ細胞クローンの表現型を、ＴＣＲＶβ鎖遺伝子産物の発現に関して、ヒトＴＣ ＲＶＤ５．２１５．３　（５Ａ）、ＶＳ２．３　（５Ｂ）、ＶＳ６．７゜ＶＢ２ １およびＶＳ１２に特異的なマウス単クローン性抗体（ＤＩＶＥＲ３Ｉ−ＴＩＩ ａβ　ＴＣＲスクリーニノグバネルＩＡ、Ｔセル・サイエンシズ・インコーボレ ーテソト（Ｃａｌｌ　５ｃｉｅｎｃｕ　Ｉｎｃ、）　、ケ／ブリッジ、ＭΔ）を 用いて決定した。Ｔ細胞２×１０５個を各抗体５ａと一緒に４℃で１時間インキ ュベートした後、５０６ヒトＡＢ血清を含む培地で３回洗浄し、さらに、ＦＩＴ Ｃ結合ヤギ抗マウスＩｇＧと一緒に３０分間インキュベーションを行った。２回 洗浄し且つ２０もホルムアルデヒドで固定した後、染色された細胞をＦＡＣスキ ャノフロー細胞細胞数計を用いる免疫蛍光法に関して評価した。
Ｈｕ−ＭＢＰ特異的Ｔ細胞系を、〜１ｓの患者１１人およびｔ（ｕ−ＭＢＰに対 する１殖応答が予め実証された正常トナー９人の血液から選択した。各系統は、 反復された全Ｈｕ　−Ｍ　Ｂ　Ｐによる刺激およびＴＩ、２による増大によって ３０００万〜５０００万個の血液細胞がら選択された。曜歯類動物Ｔｉ胞系を選 択する場合の従来の実験から、これらの条件は、免疫優性１−１１−１ｕ−エピ トープに対する代表的なＴ細胞応答の増大および集中を可能にすべきである。
ＭＳ＠者および正常トナーからのＴ細胞系は、Ｈ３Ｖ抗原に対して無視できる応 答を有するＨ　ｕ　−Ｍ　Ｂ　ＰおよびＣｏｎＡ双方に対して等しく十分に応答 した（図６）。Ｔ細胞系の、ＰＬ（残基４５−８９）　、Ｐ２　（残基１−３８ ）およびＰ４（残基９Ｏ−１７０）を含むＨｕ　ＭＢＰの完全な配列にわたる高 度に精製された酵素開裂フラグメントに対する応答を評価した。１１１種類のＭ Ｓ系統の内の８系統は３種類の［（ｕ−ＭＢＰフラグメント全部に応答し、２系 統は３種類のフラグメントの内の二つに応答し、そして１系統だけが単一のフラ グメントに応答した。これに対して、９種類の正常系統の内の５系統は単一のフ ラグメントに応答し、３系統は全部のフラグメントに応答し、モして１系統はい ずれのフラグメントにも応答しなかった。４５−８９フラグメントに対する応答 個体の割合は、ＭＳ群対対照において有意に大であったが、平均では、ＭＳ　Ｔ 細胞系はＨｕ−ＭＢＰの４５−８９　（ＰＬ）および１−３８　（Ｐ２）フラグ メント双方に対して有意に一層反応性であった（図６）。しかしながら、９０− １７０　（Ｐ４）フラグメントに対する応答の頻度または大きさには差がなかっ た。ヒトＴ細胞系はいずれもＣＤ４−およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合表現型を有し た。しかしながら、Ｍ　Ｓ　ｗ者からのＴ細胞系は、正常トナーと比較して比較 的高い割合のＣＤ４＋および低い割合のＣＤｓ↓サブボビュレ−ノヨンを有した （ＣＤ４＋細胞に関して７８±１３９石対５８二８％；ＣＤ８＋細胞に関して１ ５±６％対３０±１２％、免疫優性Ｔ細胞エピトープの［（ｕ−ＭＢＰ上の一般 的な範囲は、Ｔ細胞系のＨｕ−ＭＢＰペプチドに対する反応性パターンから推測 することができるが、Ｔ細胞認識の証拠をクローン分析から誘導する必要がある 。この目的に対して、７種類のＭＳ　Ｔ細胞系（５０クローン）および６種類の 正常Ｔ細胞系（５９クローノ）からの全部で１０９ｐｉ類のヒトＭＢＰ特異的Ｔ 細胞クローンの、Ｈｕ−ＭＢＰ並びにＨｕ−ＭＢＰフラグメントおよび合成ペプ チドに対する応答を評価した。Ｔ細胞系トナーは、ＨＬ　Ａ　−Ｄ　Ｒ２分布以 外は同等であった（正常の３３９カに対してＭＳ爬者の８６％がＤＲ２陽性であ った１表２を参照されたい）。
Ｔ細胞クローンはいずれもＨｕＭＢＰに対して応答したが、両方の群において同 様の応答レベルを有する単純庖疹ウィルス（Ｈ３Ｖ）抗原に対しては応答しなか った。総体的に、４８種類のＴ細胞クローン（二つの群の間に等しく分布した） の表現型をＣＤ４およびＣＤ８マーカーに関して決定した。これらの内、４５Ｎ 類のクローンはＣＤ　、４＋であり、（１人の正常ドナーからの）３種類はＣＤ ８−１−であった（表１）。このＣＤ４＋クローンの優越性は、ラットおよびマ ウスでの従来の経験から予想されたが、クローンが由来したＴ細胞系のこれらの サブセントの相対比率に反映されなかった（表１）。
クローン特異性はＴ細胞系応答パターンを反映するクローン分析の正当性を確立 するには、Ｔ細胞クローン特異性がいかに十分にＴ細胞系応答を示しているかを 評価することが重要である。比較するのに十分なりローンを生した系統において 、ＭＢＰの明白なフラグメントに対して特異的に応答するクローン数は、親Ｔ細 胞系のＨｕＭＢＰフラグメントに向けられた応答とｈ！の相関を示した（カイ自 乗試験と組合わされた、ｐ＜０．０５）。
３人のｙｖ１ｓｒナーおよび２人の正常ドナーからの代表的な比較を図７に示す 。
Ｔ細胞系応答パターンに基ついて、ＰｌおよびＰ２に反応性のクローンは対照系 統からよりも多数、ＭＳ　Ｔ細胞系から選択されるが、２４反応性クローンの頻 度は相対的に等しいと予想された。これは、実際、表２に示されているような場 合であった。意外にも、１０９種類のＭ　Ｂ　Ｐ反応性Ｔ細胞クローンの内４６ 種類が、ｌ（ｕ−ＭＢＰのいずれの単一フラグメントにも応答しなかったが、Ｈ ｕ−ＭＢＰに対する応答が活発だとしても、バックグラウンドがＬ　０００〜２ ．０００＋ｐ１１だけの１０，０００〜２７，０００＋ｐｍであった。この知見 は、概して１人の正常ドナーの基準で、ＭＳ群でよりも正常群で頻繁であった（ 表２）。
Ｐ４中の偏ったクローン特異性 ）（ｕ−ＭＢＰのＰ　４８ｉ域は分子のＣ末端半分を示しているが、Ｈｕ　ＭＢ Ｐペプチドに反応性のクローンの約２／３　（６３の内の４１種類）がこのフラ グメントに応答した。エピトープ特異性を確認するために、４人の正常トナーお よび４人のＭＳトナーからのこれらのクローンの２３種類を、Ｐ４１１Ｊｉ域の 種々の部分に対応する一連の合成ペプチドに対する増殖検定て試験した。表３で 示されるように、クローン分布は、正常ドナーでは１１０−１２９配列の方に偏 り、ＭＳドナーでは１３０−１４９配列の方に偏っていた。１４９−４７１配列 に対する応答は両方の群で同様であり、一つのＭＳクローンだけが８７−９９配 列に応答した（表３）。
ＨＬＡ−ＤＲ２は多数のＨｕ−ＭＢＰエピトープを制限しうるＭＳによるＨＬＡ −ＤＲ２／ＤＱｗｌハブロタイブの結合は、これらのクラス５分子、特に、ＤＲ ２が、ＣＮＳ自己抗原に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の応答を制限する場合に重要な役 割を果たしうるということを示唆している。この目的に対して、３人のＨＬＡ− ＤＲ２／ＤＱｗｌドナーからの１７種類のＴ細胞クローンによって認識されたＨ ｕ−ＭＢＰエピトープを表４に要約する。総体的に、この組のＴ細胞クローンは 、Ｐ２（３クローン）、Ｐｌ（１クローン）、Ｐ４（８クローン）またはペプチ ドなしく５クローン）を認識した。Ｐ４中の１種類のＭＳクローンは８７−９９ エピトープを認識し、１種類の正常クローンは１１〇−１２９エピトープを認識 し、１種類のＭＳクローンは１３０−１４９エピトープを認識し、そして４種類 のクローン（ＭＳ３種類および正常１種類）は１４９−１７１エピトープを認識 した。試験された７種類の２４反応性クローンの内の７種類の応答が抗ＨＬＡ− ＤＲ抗体によって阻害され、明らかに制限要素としてＤＲ２を関与させた（表４ ）。ＤＲ遺伝子座はＭＢＰに対するヒトＴ細胞の応答を制限する場合に主として 用いられるので、１０１１類の試験されなかったクローンの大部分もＤＲ２で制 限されたと考えられる。いずれにせよ、ＤＲ２がヒトにおいて種々のＨｕ−ＭＢ Ｐエピトープを制限することができることは明らかである。
Ｈｕ−ＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンによるＴＣＲＶβ遺伝子使用法ラットおよび マウスからの脳炎誘発性ＭＢＰ特異的Ｔ細胞によるＴＣＲＶαおよびＶβ遺伝子 系統の優先的使用は、悪性Ｔ細胞上の共通のＴＣＲ配列に対して向けられた予防 接種および治療計画を成功させた。それは、しかしながら、ヒトにおける同様の 機序がＭＢＰまたは他の抗原に対する応答においてＴＣＲＶ遺伝子の制限使用を もたらすならば不明である。ＴＣＲＶ遺伝子使用の分析を開始するには、３８種 類のＴ細胞クローン（各群から１９種類）の表現型をＶβ遺伝子産物の発現に関 して、ＶＢ２．　２．　ＶＢ２３．ＶＢ６．　７．　ＶＢ８．１およびＶＢ１２ に特異的な５個の単クローン性抗体のパネルを用いて決定した（表５）。ＴＣＲ Ｖ遺伝子発現は、全てＭＳドナーからの６種類のクローンで陽性に確認すること ができ、すなわち、これらのクローンの内２つはＶＢ２７を発現し、他の４つの クローンはＶＢ２．２を発現した。ＶＢ５２＋クローンの内、一つはＤＲ２，４ ドナーからであり、３つはＤＲ２同型接合トナーからであった。ＤＲ２同型接合 ドナーからのもう一つのクローンはＶＢ２２の転位ｍＲＮＡを発現して、この一 つ一つにおいて、分析された４／８クローンは、それぞれが明白なエピトープ特 異性を有しているとしても、１イＬＪ　−Ｍ　Ｂ　Ｐに対する応答において同一 のＴＣＲＶβ遺伝子を用いるということを示した（表５）。
Ｃ１考察 本実施例は、ＭＳ患者の免疫優性Ｈｕ　ＭＢＰエピトープのＴ細胞認識のパター ンか、正常１−（ｕ　−Ｍ　Ｂ　Ｐ応答個体よりも複雑で且つ変更されていると いうことをクローンレベルで明らかに実証している。これらのデータは、ＭＳｆ ｉ者での免疫原形態のＨｕ−ＭＢＰに対する増大した暴露によって脳炎誘発性Ｔ 細胞を誘導するまたは不滅にする可能性か増大することを示唆している。ＭＳ等 のヒトの麻酔状態におけるＨｕ−ＭＢＰのＴ細胞認識の潜在的な関連性は、動物 のＭＢＰ反応性ＴＳ抱の潜在的脳炎誘発性機能並びにＭＳ患者の血液およびＣ３ Ｆ中の活性ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の増大した頻度を考慮して考察する必要かある（ アレブレ！夕ら、Ｓ＋ｕｎｕ　２１？、　７１７１９９０）　：リンク（Ｌｉｎ ｋ）ら、　Ｎ＋ｕ＋ｏｌｏｇｒ　４０　（補遺Ｌ）　２ｇ３’＋９９０））。
本実験において評価したＴｌ［ｌ胞りローンは、インビトロで選択された）（ｕ −ＭＢＰ特異的Ｔ細抱細胞ら単離されて、免疫優性Ｈｕ　−Ｍ　Ｂ　Ｐエピトー プで支配された特異性の出現を可能にした。脳炎誘発決定因子は、ラットおよび マウスＴ細胞系の全ＭＢＰによる選択の際に免疫優性を示しくブールデソト（Ｂ ｏｕ＋ｄ＋＋＋ｅｌら。
Ｃ！Ｉ１．　ｉｍｍｏｎｏｌ、１１２．１５１ｔ１９８８）：７アンデンバーク ら、Ｉ、１ｍｍｎｎｏ１．　１３５：　２２９＋９８５１）　、そして免疫優性 Ｈｕ−ＭＢＰ決定因子に対するＴ細胞も許容状態下において脳炎誘発性でありう ると考えられる。この実験において、Ｔ細胞系応答から推測された免疫優性エピ トープは、クローン分析によって確認された特異性と有意の相関を示した（図７ ）。
これらの結果は、特異性を考慮する系統データから得られた結論の正当性を立証 し、そして選択操作で生き残ったクローンが、その系統中のＨｕ−ＭＢＰ応答性 Ｔ細胞集団を代表するものであったということを証明している。
しかしながら、クローンの表現型は、Ｔ細胞系全部が実質的な量のＣＤ８＋Ｔ細 胞を含んでいたとしても、（１人の正常ドナーからの３種類のクローンを除き） 一様にＣＤ４＋であった。それは、系統中のＣＤ８＋Ｔ細胞がＨｕ−ＭＢＰに特 異的であった場合、またはそれらが、培地に対して加えられた比較的高濃度のＩ Ｌ−２によって系統中に単純に生じた場合、明らかではない。しかしながら、正 常Ｔ細胞系が一貫してＭＳ系よりも高い百分率でＣＤｇ＋細胞を含んで（またと いうことは明らかてあった。ＣＤＳ＋クローンのうちの一つは、同一の正常ドナ ーからのＣＤ４±クローンのＭＢＰに誘導された増殖を阻害することができた。
このような調節ＣＤ８．−Ｔ細胞は、インビボにおいて増大した数で存在する場 合、Ｈｕ−ＭＢＰ反応性Ｔ細胞を有する正常個体が臨床的に罹患していないこと を説明することかできる。臨界的量のこれらのＣＤ８＋Ｔ細胞が、（マウスで観 察されたのと同様の）増大した量の付着性サプレッサー細胞に関連して、６０％ を越える正常ドナーからＨｕ　−ＭＢ　Ｐ特異的Ｔ細胞系を選択することができ ないことを説明することができると考えられる（ファンデンノく−クら。
１ＮｒｕｔｏＳｃｉ、Ｒｅｔ、２３：　２１’、１９８９１）。
これに対して、８０％を越えるＭＳＳ看者らＴ細胞系を選択することができる。
これらの調節細胞種は、他にも報告されたように（７％７ラー（ＨＪＩＩＩ＋） ら、Ｌｉｍ１ｏｕ１．　ｉ３９：　６８ｆ１９８７）　；リヒャルト（Ｒｉｃｈ ｅｓｔ）ら、１．　Ｎｅｕｏ、ｉｍｍｏｎｏｌ、２３５５ｆ１９８９１　；リヒ ャルトら、＾ｎｎ、’ｉｅｎ＋ｏ１．　２６：　３４２（１９８９１）　、予め 系統を選択することなく直接血液から限界希釈することによってＭＢＰ特異的Ｔ 細胞クローンを回収する能力に影響を及ぼさないと予想された。
ＭＳ咀者でのＨｕ−ＭＢＰに対するＴ細胞応答は、正常個体での応答よりも広範 囲の特異性を含んでいた（図６）。共通のエピトープの他に、ＭＳＳ前者らのＴ 細胞は、ＭＢＰのＮ末端半分に対するおよび分子のＣ末端半分の少なくとも一つ のエピトープに対する偏った応答を示した。ＭＳドナーおよび正常ドナー間で最 も一貫した応答の相違はＰＬ（残基４５−８９）に対してであった。従来の研究 により、ＭＳではＨｕ−ＭＢＰ様物質の免疫反応性フラグメントが脳を髄液（Ｃ Ｓ　Ｆ）中に存在し、優性抗原形態は残基４５−８９にわたることが分かった（ ホイノタカー、］、Ｎ、、１．　ｌＩｍｇｎｏｌ、１２９：　２７２９（１９ｇ ２））　。このフラグメントの検出可能な１度は中枢神経系損傷後のＣ３Ｆ中で 増加し、ＭＳ患者のＰ１反応性Ｔ細胞の増大した発生に可能な説明を提供する。
Ｒ２に対するおよびＲ４中の１３０−１４９エピトープに対するＭＳ応答の偏り は、さらに、脱髄中のＨｕ　−ＭＢＰの免疫活性フラグメントの放出によって説 明することができるが、ＭＨＣ制限作用は今までのところ除外することができな い。動物実験により、ＭＢＰによる長期の免疫感作は、ＭＨＣおよびＭＢＰエピ トープの次第に少なくなる優性組合わせに対するＴ細胞のレパートリ−の増大を もたらす（オフナー（Ｏｌｆｎｕ）ら、　１．　Ｅ＋ｐ、　Ｍａｄ、１７０：　 ：１５５！１９８９））。これらの追加のＴ細胞特異性は、同種ＭＢＰを認識す るそれらの能力に応して脳炎誘発性であってもよいし、またはそうでなくてもよ い。ＭＳ患者でのＨｕ−ＭＢＰ応答性Ｔ細胞特異性の増大した複雑度は、脱髄中 に放出されたＭＢＰの免疫原性フラグメントに対する増大した暴露と一致し、そ してＭＳの長期の慢性の性質は脳炎誘発性Ｔ細胞特異性の連続誘導または再刺激 を必要とするということが考えられる。
Ｈｕ−！ｖｆＢＰ反応性Ｔ細胞クローン、特に、正常Ｔ細胞系からのクローンの 約４０％は、Ｈｕ−ＭＢＰフラグメントのいずれにも応答しなかった。このよう な応答は、［−（ｕ　−Ｍ　Ｂ　Ｐの開裂部位にかかる結合エピトープ（例えば 、残基３〇−５５または８ｔ）−１００）、開裂によって破壊されたコンホメー ションエピトーブまたは、開裂フラグメント精製中に失われるＨｕ−ＭＢＰのイ ソ型若しくは翻訳後変異型を伴うことがあった。ヒトにおけるこれらの細胞の機 能は不明であるが、同様の細胞はＥＡＥから回復したルイスラットにおいて高頻 度（５０９６）で生しる。このようなＴ細胞は、ＭＢＰに対する遅延型過敏性応 答を転移させるが、ＥＡＥまたはＥＡＥに対する保護は転移しない。
〜ＩＳおよび正常のＴ細胞クローン双方での応答はＨＬＡ−ＤＲによって優先的 に制限されたか、任意の特異的エピトープおよびある与えられたＤＲアレレ間に は強力な関係は見られなかった。ＭＳ患者において過剰発現されるＨ　Ｌ　Ａ　 −Ｄ　Ｒ２は、Ｈｕ−ＭＢＰの多数のエピトープを制限することができ、そして 若干のエピトープ（例えば、１４９−１７１）をいくつかのＨＬＡ−ＤＲアレレ によって制限することができた。従来のＴ細胞系実験において（シュウ（Ｃｈｏ ａ）ら。
１、’１ｅｕｏｉｃｉ、　Ｒｔｓ、２３：　２０７（１９８９））、ＨＬＡ−Ｄ Ｒアレレは２６　／　３３　Ｈｕ　−ＭＢＰエピトープ特異的Ｔ細胞応答に限定 されると報告されたが、ＨＬＡ−ＤＱは組番においてのみ６／３３応答を制限し 、そしてＨＬＡ−ＤＰはＲ２に対する１人の正常トナ一応答を制限した。
Ｔ細胞クローンからのこのデータは、Ｈｕ−ＭＢＰ認識でのｌ（Ｔ−Ａ　−Ｄ　 Ｒ分子の圧倒的制限機能、並びに不確定のＨＬＡ−ＤＲアレレ（異なる正常ドナ ーからの、ＤＲ７？／ＤＱｗ２．３）の、３種類の個々のクローンによって認識 されたＨｕ−ＭＢＰの１−３８領域中のエピトープを制限する能力を確証する。
しかしながら、ＨＬ　Ａ　−Ｄ　Ｑで制限されたクローンは見られなかった。
ヒトにおけるＴ細胞応答を調節するＴＣＲＶβペプチドの使用を考える主要な問 題は、ＭＢＰ特異的Ｔ細胞がある限定された組の■遺伝子を用いるか否かという ことである。このデータは、ＴＣＲＶβレパートリ−の約１０分の１のみに特異 的な抗体を用いて、全てＭＳトナーからの６／３８クローンを陽性に確認した。
慢性の進行性ＭＳの１人のＨＬＡ−ＤＲ２／ＤＱｗｌ同型接合ドナーにおいて、 種々のＭｕ−ＭＢＰエピトープに特異的な８種類のＴ細胞クローンの内４種類は 、Ｔ細胞受容体において同一のＶＢ２．２遺伝子を発現しく表現型に関してＶＢ ２，２陽性クローンはいずれもＰＣＨによって確証された）、Ｈｕ−ＭＢＰに対 する応答におけるヒトによるＴＣＲＶ遺伝子の使用の偏りを初めて示唆した。種 々のＨｕ−ＭＢＰエピトープに対する応答での同一のＴＣＲＶ領域遺伝子の使用 は、ラットおよびマウスでのＭＢＰ応答と同様であり、ＴＣＲの選択がエピトー プを作動させないことを示している。
この観察の一つの重要な実際的意味は、ＴＣＲレパートリ−の偏りを、Ｍｒ３Ｐ 反応性クローンのエピトープ特異性を定義することなく確認することができると いうことである。表６は、ヒト間Ｓｗ者からのＭＢＰ特異的Ｔ細胞クローンがそ れらのＴＣＲＶβ遺伝子使用でゆがめられていることを実証するＰＣＲデータを 示す。全ｍＲＮＡを、ＭＳ憶者および正常トナーからのヒトＭＢＰに特異的な個 々のＴ細胞クローンから抽出し、そして転位ＴＣＲＶβメツセージをＰＣＲによ って増幅し且つ特異的プローブによって確認した。ＭＢＰ特異的Ｔ細胞クローン によるＭＳドナーＭＳ−１およびＭＳ−２でのＶＢ２２の優先的使用並びに正常 トナーＮ−１でのＶＢ２，４の優先的使用を実証した。これは、ヒトでもＶｆＪ 域遺伝子によってＭＢＰ等の自己抗原に対して優先的に反応したという結論にさ らに支持を与える。
実施例■ 多発性硬化症のも者からのミニリン塩基性タンパク質反応性■細胞クローンにお ける細胞受容体■β遺伝子の優先的使用導入 多発性硬化症（ＭＳ）は、ミエリノ塩基性タンパク質（Ｂ　Ｐ）に対して反応性 のＴリンパ球が中心的役割を果たすことがありうる自己免疫疾患である。従って 、本発明の有用性は、ＭＳ患者および正常個体の血液からのＢＰに特異的なＴ細 胞のクローニングに続いて、Ｔ細胞受容体（Ｔ　ＣＲ）可変（Ｖ）領域遺伝子の 分析および発現によって実証された。ＶＢ２．２およびより少ない程度までのＶ Ｂ２１の使用の顕著な偏りは、患者からのＢＰ特異的クローン中で観察されたが 、対照からは観察されなかった。関与したＶＢ２．２およびＶＢ２．１は、血液 由来のＢＰ特異的クローンが疾叡の病因に関連することがあるということを示唆 している。これらの知見は、ＭＳの治療に重要な意味を持っている。この実施例 では、ＭＳｉ者および正常個体の血液から選択されたＢＰ特異的Ｔ細胞において 発現されたＴＣＲＶαおよびＶβ遺伝子を分析する。
ＢＰに特異的なＴ細胞クローノおよび他の抗原はＭＳ患者および正常個体の末梢 血液単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来し、そして種々のＢＰ領領域対する応答に関し て特性決定された。これらのクローンにおけるＴＣＲＶβおよびＶα遺伝子８９ （１−８９４５ｆ１９８９）　）。検出されたＶβおよびＶα６発現代表的な例 を、図１０ΔおよびＩＯＨにそれぞれ示す。図１０ＡにおいてＶＢ２２と称した が、ＶＢ２２およびＶＢ２．３遺伝子産物は、これらのＶ遺伝子に共通の配列を プライマーとして用いたので区別することかできない。図１０で分析されたクロ ーンは、さらに、免疫蛍光性分析によって細胞表面ＴＣＲＶＢ２．　２１５．　 ３抗原を発現することが分かった（表５を参照されたい）。
３人のＭ　Ｓ　患者由来のクローンの詳細な分析を表７に示す。Ｗ者ＮＬからの ＢＰ特異的クローンは顕著な■β５．２の優先的使用を示した。意外にも、種々 のＢＰ決定因子の特異性は、この偏ったＴＣＲＶβ遺伝子使用とは無関係である と考えられた。例えば、ペプチド４５−８９および１−３８に特異的なりローン 並びにこれらのペプチドのいずれによっても刺激されなかったＢＰ特異的クロー ンは、ＶＢ２．２遺伝子を優先的に転位させた。Ｖα使用は４種類のＮＬクロー ンに関してのみ決定されたが、そのデータは、ＶαがＢＰペプチド特異性に対す る主要な因子でありうることを示唆している。従って、Ｖα８遺伝子発現はＢＰ ペプチド４５−８９に特異的な３種類のクローンで確認され、■α２はペプチド １−３８に特異的な１種類のクローンにおいて転位した。しかしながら、この限 られた分析では、主要因子であるα〜β鎖結全結合領域α、Ｄβ。
Ｊβ）を除外することはできない。■β５．２の共通使用にもかかわらず、多数 のＮＬクローンはクローンによって関係付けられるのではなく、ペプチド特異性 、■α発現および少数のＶβ遺伝子発現の基準で分離されると考えられる。いく つかの組の、例えば、ペプチド特異性が明白でなかった７種類のＶＢ２．２＋ク ローノのクローン近親関係は、現在のところ知られていない。Ｖα６発現決定お よび／′または結合領域の配列決定は、この問題に答える最も直接の方法であろ う。弘者ＭＲ由来の１０種類のＢＰ特異的クローンの内の４種類も■β５，２を 用いた。患者ＮＬの場合と同様に、３種類の異なるＢＰ特異性を有するクローン はこの問題のＶβ遺伝子を用いた。ＷＳからの６種類のクローンのうちの３種類 もＶＢ２．２遺伝子を発現し、その内の２種類は同一のＶαを利用し且つ同一の 特異性を有した。ＢＰ特異的であったＶＢ２．２＋クローンの頻繁な単離に対し て、他の抗原または非特異的であったクローンに反応性のクローンて■β５．２ を利用したものはなかった（表７）。
増幅されたＰＣＲ産物を有する試料の汚染を避は且つそれを知見に対する一因と して除外するように細心の注意を払ったことは強調されるへきである。従って、 いずれの場合にも、対照は、ＶＢ２．２およびＶＢ２１特異的オリゴマーとの反 応であるがＲＮＡ鋳型との反応ではない負の反応を含んだ。可能であればいって も、新たに製造されたＲＮＡを用いて、最初に陽性のＶＢ２２＋クローンを確認 した。さらに、異なる特異性を有し且つ異なる…者並びに正常個体からのクロー ンについて同様の時間で実験し、ＶＢ２．２の優先的使用は、ＭＳ患者からのＢ Ｐ特異的クローンにおいてのみ検出された（表７および表８を参照されたい）。
最後に、患者ＭＲからのクローンのＶＢ２．２決定の表面発現を、単りローノ性 抗■β５．２抗体および免疫蛍光性分析を用いて分析し、ＰＣＲによる遺伝子発 現と単クローン性抗体による細胞表面発現との完全な一致を観察した。
■β５．２およびより少ない程度までの■β６．１の顕著な優先的使用は、７人 の患者からであるが６人の正常ドナーからではないＢＰ特異的クローンにおいて 明らかであった（表８）。ＰＣＲによって■β８発現分析したＭＳ患者からの４ ８種類のＢＰ特異的クローンの内の２７種類はＶＢ２２を利用し、１５種類のＢ Ｐ非特異的クローンの内の０がＶＢ２．２＋てあった（フィッシャーの精度試験 でｐ＜０．００１）。これに対して、正常個体からの４１種類のＢＰ特異的クロ ーンの内の２種類のみかＶＢ２．２÷であった（カイ自乗分析てｐく０．０００ １）。これらの比較の統計的有意性は、患者ＮＬからのクローンを除外するなら ばなお明らかであり、患者におけるＶＢ２，２＋ＢＰ特異的クローンの頻度は３ □１の内１４であると考えられる（正常のＢＰ特異的クローンとの比較またはＢ Ｐ非特異的クローンとの比較に対してｐｒｏ、００１）。患者および対照からの クローンの比較に関して、実験された７人の患者の内の６人および６人の対照の 内の２人だけかＨＬ　Ａ　−Ｄ　Ｒ２を有しており、これは二つの集団における ＤＲ２の既知の頻度から子宮される。それてもなお、ＤＲ２＋対照からの１０挿 類のＢＰ特異的クローンの内の一つたけがＶＢ２２＋であった（ＭＳ患者での頻 度と比較されるｐ＜０．０１）。患者での５４％の頻度は、予想された末梢ａｌ 　１−７１３１１８９）　ｊ。対照と比較したまたはＢＰ非特異的クローンと比 較した患者からのＶＢ２　１ａＢｐ特異的クローンの全頻度は統計的に同しであ るが、頻度（２００４）は、それてもなお偶然に予想されたよりもはるかに大き い（ＰＣＲによって予測される末梢血液百分率は５〜１０９もである（チョイら 、　Ｐｔｏｃ、Ｍｉｌｌｂｈｃ、ＸＣｉ、ＵＳ＾８６：　８９４Ｌ’１９Ｈｉ０ さらに、ＶＢ２２を発現しないクローンだけを考える場合、対照と比較した患者 からのＢＰ特異的クローンでのＶβ６１発現頻度は統計的に異なる（ｐ　＜　０ ．　０２）。
〜゛β５．２＋β５．２＋クローンかかわらず、優先的Ｖβ使用は正常個体由来 のＢＰ特異的クローンで注目された（表８）。一つの個体において１３種類のク ローンの内１１種類がＶＢ１４を発現し、そして池の２種類ではＶＢ７が優性で あった。血清学的に決定されたＤＲ発現との関係は認められなかった。
図１１は、患者および対照からのＢＰ特異的クローンにおける■α利用の概要を 示している。Ｖβ使用とは対照的に、患者からのＢＰ特異的クローンはより一層 一般化された■α使用を示した。■αＬ　２．７．８および１０の系統は、分析 された３０種類のクローン中で十分に示された。Ｖβでの初期の重要性ゆえ１こ 、患者ＮＬからの４種類のクローンだけの■α発現が分析されたことに注目すべ きである。おそらく、それ以上のクローンの分析はより顕著なＶαゆがみを明ら かにすると考えられる。驚くべきことに、優先的Ｖα使用は、対照中のＢ特異的 クロー７においてより一層明らかであった。分析された２２種類のクローンの内 １２種類かＶα２を発現し且つ８種類が■α１５を発現した。
この報告において、末梢血液細胞はバルク培養において完全なヒトＢＰで刺激さ れた後に限界希釈によってクローニングすることにより最初に増大した。
ヴヒャブフエニソク（Ｗｕ＋ｈｕｐｌｕｎｉｎｇ）の実験（ヴヒヤブフエニツク ら、　Ｓｉ＋ｎｃ＋２１８、１０１６−＋０１９ｊ１９９Ｇ＋）での応答を支配 したＢＰペプチド８４−１０２に対する応答はこの実験においては特に希であっ た。さらに、この実施例での優先的Ｖβ５．２発現はＢＰエピトープ特異性とは 無関係であると考えられた。興味深いことに、これは、マウスおよびラットにお いて見出された優先的■β５．２発現とを用いて、ＭＳ患者からの脳試料中での ＴＣＲＶαおよびＶβ遺伝子の発現を直接的に分析した。ＶαおよびＶβ双方の 転写物の制限された不均一性が観察された。興味深いことに、ＤＲ２（ＤＷ２） 分子表現型が異なる８人を含む９人のＨＬＡ−ＤＲ２患者の内、脳疾患の部位に おいて８人は転位Ｖβ５．２遺伝子を実証し且つ７人は転位Ｖβ６．１を実証し た。この実施例における。患者の末梢血液由来のＢＰ特異的クローンてのＶＢ２ ．２およびＶＢ２．１の優先的使用についての知見との相互関係は注目に値する 。同時に、この実験は、末梢血液Ｔ細胞か中枢神経系損傷に関与した細胞を反映 するものであるということ、およびＢＰ反応性がＭＳにおける病原応答の成分で あるということを示唆する追加の証拠をりうるという意味は、限定されたＴＣＲ レパートリ−が治療的介入のための特異的標的を提供することを示唆している。
用いられる■領域に特異的な単クローン性抗体および合成ＴＣＲペプチド双方が このアプローチにおいて考えられる。
クローンのＶβおよび■α発現を、図１０に記載したようにＰＣＲおよびオー［ ・う／オグラフィーによって分析した。ヒトＢＰ反応性Ｔ細胞系を、従来記載さ れたように（シュウら、〕　ＮｔＩＩｔｏｈｃ＋、Ｒ＋＋、、印刷中ｆ１９９１ ））　Ｍｓ患者の血液から選択した。間単にいうと、末梢血液単核細胞（ＰＢＭ Ｃ）をヒトＢＰ５０■／１１と一緒に５日間培養した後に、富Ｉ　Ｌ、−２培地 中に移した。ｌ　Ｌ−２中での増殖か見られたら、Ｔ細胞を、照射オートロがス ＰＢＭＣによって与えられたＨ　ｕ　−Ｂ　Ｐ　２５■、／ｍｌで１回再刺激し 、そして記載されたように（シュウら。
および正常個体からの１５種類めクローンの内の１５種類がＣＤ４を発現した。
若干のクロー）に関して、２本以上のＶβまたはＶαバンドを確認することがで きたか、特に、少数のく２５〜３０）ＰＣＲサイクルを用いた場合、通常、一つ のバシトが強度において優性であった。ＢＰ、ＢＰペプチドまたは他の抗原にχ ４するＴ＠抱ツクローン特異性は、記載されたように（シュウら、　１．　Ｎｅ ｏ＋ｏ＋ｃｉ。
独）に対する増殖応答を実証することはてきなかった。ＢＰ反応性クローン全部 の、セレン・シュウ博士（Ｏｒ、Ｓｒｌ！ａｅ　Ｃｈｏｕｌにより記載されたよ うに、（シュウら、！、　’ｈ１１＋＊Ｃｈ！ｌ１１．　：８：　１１５−１１ ９　ｆ１９７７）ｌ！！造されたＢＰペプチド１−３８．４５−８９および９０ −１７０に対する応答を試験した。ＮＲは、問題のクローンはＢＰに対して反応 したがこれらのＢＰペプチドのいずれに対しても応答しなかったことを示す。” ＮＴは、試験されなかった。
ＴＣＲＶαおよびＶβ発現を、７人のＭＳ患者および６人の正常個体の血液から 選択されたＴ＠胞ツクローン関して分析した。患者はオレゴン・ヘルス・サイエ ノノズ・ユニパーツティーＭＳ診療室で診察され、臨床的におよび検査室で確認 された明確なＭＳに罹患していた。患者の平均歩行指数は３．２±２．０（範囲 ２６）であった。４人の患者の疾患は再発性／弛張性であり、３人の患者の疾Ｗ は慢性進行性であった。正常個体はベテランズ・アフェアズ・メディカル・セン ターから、培養中のヒ１−ＢＰに対するＰＢＭＣの陽性増殖応答基準で選択され た。全被験者が、オレゴン・ヘルス・サイエンシズ・ユニバージティー・トラ／ スプランテーンヨン・ラボラトリ−での標準的な血清学的方法によりＨＬＡ系で あった。ＨＬＡ　ＤＲ２発現の不均一な分布（７人の患者内６大尉６人の対照内 ２人）は、ＭＳ虫組番正常集団において予想された頻度を反映している。
この分析において、各クローンには優勢なＶβバンドだけが含まれている。しか しながら、若干のクローンでは、はとんど等しい強度の２バンドが両方とも記録 され、従って、Ｖβの全数は分析されたクローンの数よりも大きいことがある。
Ｖβ遺伝子発現は、記載されたＶβ特異的オリゴマーを用いるこれらのクローン では確認できなかった。これらのクローンの内の３種類が、Ｖβ５．　２１５． 　３゜■β６．　７．　Ｖβ８．１およびＶβ１２に向けられた単りローン性抗 Ｖβ抗体（カプラーら、５ｃｉｔｎ％２４４１　ａｌｌ−８１３＋１９８９＋＋ によって分析されただけであり、陰性であった。
ＣＤＲ２領域に関して予想され且つ観察された高水準の生物学的活性を考慮して 、本発明者は、相同性を検定するようにＣＤＲ２領域をさらに調査し且つペプチ ドを整列させることにした。
顕著な相同性はＮＨ２末端で証明された。８残基の内の６個が相同であり、Ｃ末 端にある２個の非相同残基は同類置換であった。この相同性は、後で考察される ように、Ｖβ６．１に対して選択されたクローンがＶβ５２エピトープを認識す ることができるので注目に値する。
ＣＤＲ２領域におけるＶ遺伝子系統間の関係をさらに解明する努力において、本 発明者は、さらに、Ｖβ１４エピトープをＶβ１２．２およびＶβ１７，１とて は相同性が劣り、９残基の内の４個が整列する。下記の表は配列相同性を示す。
表９ 本実施例は、Ｍ　Ｓ　患者の脳を髄液には未変性のＢＰに対して応答し、そして より低い程度でＰＬＰペプチドに対して応答するＴ細胞が、同じ患者の血液に見 出されるよりも、あるいは別の神経性疾患の患者（ＯＮＤ）のＣ３Ｆに見出され るよりも、有意に高い頻度で含まれていることを最初に示した例である。一方Ｍ Ｓ。
ＯＮＤのいずれの患者でも、処理された未変性のＢＰには見出されないＢＰの潜 在的なフラグメントのみに応答する、Ｃ５ＦのＴ細胞のレベルは同等のものであ る。すなわち別個の処理経路か窺われる。炎症レベルとなっているミニリン抗原 応答性Ｔ細胞が、標的器官に極めて近接していることは、ＭＳ疾患の過程にそれ が介在していることについての新たな裏付けである。
過去の研究より、末梢のミニリン抗原特異性のＴ細胞の出現頻度は、ＭＳで認め られる広範なミニリンのダメージを説明するには、あまりにも低すぎるのではな いかと示唆されてきた（Ａｌｌ＋ｇｎｌＨｃｌ　ｒｌ、、５ｃｉｅｎｃ＋　２４ ７：　７１Ｂ−７２１（１９９０））　：および（Ｏｔｘ　ｃｌ　＋１．、　Ｎ ｚ１ｕｒ！３４６：　１８３−１８７（１９９０））。しかし炎症性のＣＮＳ実 質に直接連絡しているＣ５Ｆ由来の、ミニリン抗原特異性Ｔ細胞の特性を同定し ようとした研究報告はほとんど存在していない。免疫処理された動物のＣＮＳを Ｉ　Ｌ−２に展開すると、ＢＰ−１およびＰＬＰ−特異性のＴ細胞が選択的に回 収される。すなわちそれらの脳炎誘発特性が、前もって活性化されることが示さ れた訳である。一方、リンパ節からはＩＬ−２展開後でも、ＢＰ−特異性Ｔ細胞 が回収されることはない。すなわちＣＮ５−誘導性Ｔ細胞は異なった活性化状態 にあることか窺われる。
予備的な検討ではＩＫ−２展開ステツプにより、ＭＳ患者のＣＮＳより回収され るＢＰ−特異性のＴ細胞数は、直接的な抗原刺激の場合の３倍となった。それに ｔｔして血液分析では、いずれの方法を用いた場合でも、得られた結果は同等で あった。ｌ　Ｌ−２展開ステツプは、Ｃ３Ｆからの活性化抗原特異性Ｔ細胞クロ ーンの回収に採用された。そして直接的抗原刺激は、ＭＳの確定された９名の患 者（Ｐｏ繋Ｉ　Ｎ　ｈ　１．、＾ｎｎ、　Ｎｅｕ＋ｏ１．　１３：　２２７−２ ３１ｆ１９８３））　；および（にｕ＋−１＋に＋、１．ＲＮｔｕ−ｔＯｏＨ３ ３：　１１４１−１４５２（１９８３１）　、その他の神経状態の６名の患者の 血液中Ｔ細胞の出現頻度の評価に用いられた。また４名のりウマチ性関節炎の患 者と６名の正常トナーでも、血液中Ｔ細胞の出現頻度が確定された。
表１０に示されているように、ＭＳトナーから得られたＣ３Ｆの細胞充実性は、 Ｕ当り０．５から１５．５の範囲にあった（平均３．５細胞／ｄ）。１名のトナ ー（ＮＩＳｌ）のみに、細胞カウントの上昇か認められた（〉５細胞／ｄ）。
総計５２８．０００のＣ３Ｆ細胞プレートより、合計して３００のｌ　Ｌ−２応 答性Ｔ細胞クローンが分離、そして同定された（回収率０．０６％）。次にＩＬ −２展開クローンの、未変性のヒトＢＰに対する特異的応答性（Ｅ７１ｚｔ　１ １　！１．．　＋Ｂ１ｏ１．　Ｃｈｕｍ、２１６．５７７０−５７８２（１１７ １））　、ＢＰフラグメント１−３８　（Ｐ２）。
４５−８９　（ＰＬ）、９０−１７０　（Ｐ、４）に対する特異的応答性（Ｃｈ ｏｕ　ｃｌ　ｉｌ、。
１、Ｎ＋ｕ＋ｏＣｈ＋ｉ、２１１１５−１１ＨＩ９７７１　）　、残基１３１− １５１に一致するＰＬＰペプチドに対する特異的応答性、そして単純ヘルペスウ ィルス（ＨＳ　Ｖ）に対する特異的応答性が評価された。ＰＬＰ　ペプチドが選 択されたのは、Ｍ　Ｓ　、９者の当初のスクリーニングにおいて、その広範な活 性が示されたためであり、またマウスにおいては脳炎誘発活性を呈することが示 されたためである（Ｔｏｏｈ７　ｅｌ　＋ｌ、、Ｊ、１ｍｍｕＩｌｏ１．　１１ ２：　１８６ｇ−１８７Ｈ１９Ｂｇ））　ｏ分析に回収された３００の活性化ク ローンのうちで、完全なりＰに対しては特異的に応答するか、ＰＬＰ　やＨ３Ｖ には応答しなかったクローンは７１例であった＋３９−１５１ （２４！％）。また別の３９のクローン（１３％）が、未変性のＢＰ分子には応 答しないが、ＢＰの３７ラグメノトのうちの一つに応答するものであった。さら に３９のクローン（１３％）がＰＬＰ　に特異的に応答した（表１０）。要する に合計してＢＰ−１およびＰＬＰ　特異性のクローンが、Ｃ３Ｆの活＋３９−１ ５１ 性化Ｔ細胞の５０％を占めていた。それに対してＨ３Ｖに特異的に応答したクロ ーンは、わずか１０例であった（３％）。テストに供された１４のＢＰ−特異的 クローンのすべてが、過去の結果と同じく、ＣＤ４表現型のものであった。
ＯＮＤグループに由来するＣ３Ｆは、多くの点でＭＳのＣ３Ｆに似通っていた。
ＯＮ　ＤのＳ　Ｎ　Ｆにはｄ当り０．５〜２２．５の細胞が含まれていた（平均 ５．３細胞／　ｕＩ）。また高い細胞カウントのドナーはわずか１名であった（ ＯＮＤ３）（表３８）。合計して１１２例のＩ　Ｌ−２応答性Ｔ細胞クローンが 分離され、そして総計２２３．０００の細胞プレートについて、抗原特異性のテ ストが行われた（回収率０．０５％）。この割合はＭＳのＣ３Ｆで得られた割合 と同程度てあった。しかし回収された１１２のクローンのうちで、未変性のＢＰ に応答したのはわずか３例に過ぎなかった。またＰＬＰ　には２例のみが応答し た。
＋３９−１５１ 総合してみると、ｌ　Ｌ−２応答性クローンのく５９６でしか、そのような特異 性は示されなかった。それに対してＭＳ＠者では３７％で認められた。一方、Ｂ Ｐフラグメントの一つには応答するが、未変性のＢＰ分子には応答しなかったク ローンか１９例存在した点は（１７％）、ＭＳ患者の場合と同様であった。
すなわち合計すると、ＯＮＤ虫者組番得られたＩＩ、−２応答性のクローンでは 、２１０６がＣＮＳ抗原に特異的であったのに対して、ＭＳ患者ではその割合は ５０％であった。加えて３７例のクローンかＨ５Ｖ抗原に応答したが（３３％） 、その割合はＭＳ患者の場合の１０倍近くであった（表１０）。
ＭＳも者では、Ｃ３Ｆ中の完全なりＰに特異的なＴ細胞の出現頻度は５．６から ４０Ｘ１０’の範囲にあった。そして出現頻度の平均は２２．ＩＸＬＯ−５、な いしは４．２２５のＣ５Ｆ細胞につき、一つというものであった（図２４）。
このＭＳのＣ５Ｆにおける、未変性ＢＰに対する応答の出現頻度は、ＯＮＤのＣ ３Ｆの場合の〉１８倍高であった。すなわちＯＮＤのＣ３Ｆでは、未変性の２４ ）。対照的に、ＢＰペプチドのうちの一つのみには応答するが、未変性のＢＰに は応答しないというＴ細胞クローンの出現頻度は、ＭＳ、ＯＮＤの患者とも同等 であった（１３．４ｖｓ１２．３Ｘ１０−”、図２４）、Ｈ３Ｖに応答するＴ細 胞の出現頻度は、ミニリン抗原に対する応答とは逆の関係にあった。すＢＰ−、 ＰＬＰ　、Ｈ３Ｖ一応答性Ｔ細胞の前駆体の出現頻度を確定す１３９−１５す るために、ＭＳ患者と対照患者から得た血液廿ンブルを、ペアとして限定稀釈ア Ｉセイで分析した（Ｌｒｔｋｕｉ＋ｉ　Ｉｌ　Ｉｌ、、１ｍＩＩＩｌｎｏ１．　 ＴｏｄＢ　５：　２６５−２６８　。
および２９５−２９８　ｌ１９８・１））。図２５に示されているように、ＭＳ 患者から得られたＷｊ環面中では、ＢＰ一応答性Ｔ細胞は０．６１Ｘ１０’とい う頻度で出現した（１６４．０００細胞につき、一つ）。この出現頻度は○ＮＤ 咀者、リウマ千性関節炎の型番、正常トナーの場合よりも、有意に高いものであ ったブ間に違いは認められなかった。
血液と比較した場合であるが、ＭＳのＣ３ＦではＢＰ一応答性Ｔ細胞の出現頻度 は３６倍であり＜ｐ＜：０．００１）　、ＰＬｐ　一応答性Ｔ細胞の出現＋３９ −１５１ 頻度は７３倍であった（ｐ＜０．００１）。ＯＮＤのＣ３Ｆても同様なりＰ−。
Ｐ　＋−Ｐ　一応答性Ｔ細胞の増加が存在した（それぞれ９倍、１９倍、ｐ〈０ ０５）。一方、ＭＳのＣ３Ｆ中のＨＳ　Ｖに特異的なＴ細胞は３分の１であった （ｐ＜０．０１）。ただしＯＮＤのＣ３Ｆでは、血液中の３倍であった（ｐ＜０ ０５）。ミニリン抗原特異性のＴ細胞の出現頻度の違いは、過小評価であるのか も知れない。すなわち限定稀釈分析で検出される血液中のＴ細胞は、到達可能な 最高の出現頻度を表しており、Ｃ５Ｆにおけるのと同様な、実際に回収されたも のの出現頻度を表している訳ではないためである。ＩＬ−２展開によって、抗原 特異性Ｔｌ１ｌ胞の回収効率が向上したＣ３Ｆの場合とは異なって、血液中のＴ 細胞の出現頻度は、ＩＬ−展開後に確定された場合でも、直接的な抗原刺激で確 定された場合でも同様であった。以上の結果より、末梢の抗原特異性Ｔ細胞も、 “活性化”状態にあることが窺われる。
本実施例で示された結果より、ＭＳを者のミニリン抗原一応答性Ｔ細胞の出現頻 度は、十分に麻痺や脱髄を誘導するものであるのだろうかという、決定的な疑問 か浮上してくる。本データは、Ｃ３Ｆ中のミニリン抗原一応答性Ｔ細胞（血液中 ではない）は、炎症を誘導する上では十分であることを強く示唆している。Ｃ３ ＦのＢＰ一応答性Ｔ細胞の出現頻度（２２／１００．０００）は、麻痺性ＥＡＥ のラットのＣＮＳ組織で見出される出現頻度（（ｏｌＩＢ　６ｔＨｉ、Ｃｅ１１ ．　１ｍｍｍｎｏｌ。
１０８：　２０３−２１３ｉ１９８７））　、およびＳＫ／ＳＤ、、ないしはＴ Ｔ応答性ドナーで認められるＴ細胞のレベル（Ｇ＋ｂｔ　Ｒ，Ｓ、　Ｃｌ１ｎ、 １１１１１１１１０１．　１ｍｍｕｎｏｐｚ＋ｈｏ１．　１９：　１９６−２０ ５ｉ９８１））　；　（Ｓｏｈｎｌ＋　Ｎ　１１．　１．　１ｌＩＩＩａｎｏ１ ．　１２７：　６１２−６１５（１９８１１１：　（Ｆｏ「ｄ@１ｌ ｒ１．、Ｃ＋１ｌｎｌ＋＋　１ｍｍｕｎｏ１．　７９：　３３４−３４４（１９ ８３））と同等である（４〜２２／１００．０００）。注目されるべき点に、供 試患者の血液中のＨ３Ｖ応答の出現頻度（６〜１２／１００．０００）も、この 範囲内に入ることがある。さらにＫｅ７ｈｏｌ＋　ｌｉωｐＨモンアニン（ＫＬ Ｈ）で免疫処理されたドナーの血液中における、特異的Ｔ細胞の出現頻度は４／ １００，０００であった（Ｆｏｒｄ　ｌｌ　ｉｆ、。
Ｃ＋１ｌｕｌｘ＋　ｌｌＩｍｕｎｏｌ、７９：　３３４−３４Ｎ１９８３））。
すなわちｉｎ　ｖｉｖｏ　３２．では、強烈な皮膚反応の引き金となり得るレベ ルである＜Ｂ＊Ｂｓｔ　ＣＩ　Ｉｌ、、　Ｃ＋１ｌｕｌ≧ｒｌａｍｕｎｏ１．２ ９：　４１Ｇ−４１６ｆ１９７７））。
しかし血液中のミニリン抗原応答性Ｔ細胞は、炎症性の出現頻度のものではなか った。ＭＳの血流中ＢＰ応応答性紙細胞レベル（０，６１／１００．０００）は 、ＯＮＤ、ＲＡ、正常ドナーの場合よりも有意に高かった（０．１０〜０、Ｌ４ ／ｌＯＯ，０００）。しかしＭＳの血液中Ｔ細胞レベルは、免疫処理を受けてい ない、皮膚テスト−陰性ドナーにおけるＫＬＨ特異性Ｔ細胞の出現頻度よりも、 若干高い程度に過ぎなかった（Ｆｏｒｄ　ｉｔ　ｘｔ、、Ｃ＋ｌ：ｕｌｕ　１ｍ ｍｕｎｏｌ′１９８３１−３０！１９８３１）　および（ＢｕＢ＋＋　ｌ＋　Ｉ ｌ、、　Ｃ＋１ｌｕｌｕ　１ｍ１ｉｎｏ１．２９：　４１０−４１６’１９７７ ））　ｉ　０．　３８／　１００．　ＯＯＯ）。本実施例では、いずれのグルー プのＰＬＰ　応答性Ｔ細胞のレベルも、比較的低いものであった（０．１１〜０ ．１６／１００．０００）。この“ベースライン”レベルは、別の研究者たちに よって報告されている、ＭＳ患者の血液より回収されるＩＭＰ−特異性Ｔ細胞ク ローンの出現頻度と同等であった（０．０４〜０．１１／１００．０００）（Ｊ 、１ｌＢｕｔｕ　ｉｔ　ｈｌ、、Ｓ＋ｉ：ｎｏ　２１７：　７１Ｂ−７２１！１ ９９０１　およびＯｆ＋　１１　！ｌ、、Ｎｉ１ｕ＋３４６　ｌ１３−ｌ８７　 ｌ１９９０）　）。要するに、ミニリン抗原に特異的なＴ細胞の血液中における 出現頻度は、１）ｉｎ　ｖｉｖｏで炎症反応を誘導するには、あまりにも低いよ うに見受けられ、１１）稀釈されたＣ３Ｆ応答を反映しているよってあり。
１１１）天然の、または交差応答性の決定因子による、全身的な免疫処理に由来 するものではないように見受けられる。これらの知見と関連するが、ＭＳ患者の Ｃ３Ｆでは、ＢＰ曝露後にＩＦＮ−γを分泌する単核球の出現頻度（１８５／１ ００．０００）は、その血液における出現頻度（３〜５／１００．０００）より も４０倍の高さであることが、最近報告されているｌ０ｌｉ＋ｏｎ　Ｎ　ｒｌ、 、Ｉ、　Ｃｌ１ｎｉｈｖ＋＋ｔ、８６：　９８１−９８５ｉ１９９０））。しか しそれらの応答性細胞のどれだけが、ＢＰに特異的なＴＣＲを保有したＴリッパ 球であるのかという点は、未解明である。
Ｃ５Ｆ中のＴ細胞による［３Ｐ認識には、二つの異なったパターンがある。未変 性のＢＰ分子内のエピトープを識別する１セントのクローンが、ＭＳ患者では一 般的であった（７１／”１１０クローン、６５％）。しかしＯＮ　Ｄ　患者ては それは稀であった（３／”２２り０−）、１３％）。ＭＳのクローンの特異性は 、ＢＰのＮ末端半分のエピトープに偏っていた。またＴ細胞クローンはＰＬ（残 基４５−８９）かｐ２（残基１−３８）に特異的であった。
それらを合算すると、そのクローンのタイプの６０９６以上が占められることに なった（４３／’７１）・図２６）。残りのクローンはＰ４に応答するか（残基 ９〇−１７０，２０’％）、いずれのペプチドにも応答しないものであった（２ ０％）。
比較として、同しＭＳ患者から得られた血液に由来するＢＰ一応答性Ｔ細胞クロ ー／て、ＰｌかＰ２に特異的なものはわずか３６％に過ぎなかった（図２６）。
ＢＰのＰＬ、Ｐ２フラグメントに対するＴ細胞応答の偏りは、とりわけ興味深（ １と言える。すなわち正常ＢＰ応答者の血液に由来するＢＰ−特異性Ｔ細胞クロ ーンには、それらのフラグメントはほとんどまったく認識されな（吹めである（ ５９も）。
Ｃ３ＦのＴ細胞クローンの２番目の変異セントは、ＢＰフラグメントの一つには 選択的に応答するが、未変性のＢＰそのものには応答しないというものであった 。またその出現頻度は、ＭＳ、ＯＮＤグループのいずれでも同等であった（図２ ４）。そのような未変性の抗原を処理した場合には保存されることがなく、そし てＭＨＣによって提示されるペプチド−特異性のエビト・−プは、“潜在性１（ ：１ｐ＋ｉ＋）＋と表記されている（Ｇ＊ｍ５ｏｎ　Ｎ　＊１．、　１ｍｍｏｏ ｏ１．　Ｒｅｖ、、　９ｇ：　５３−７３：１９８７）　）。その変異体のＴ細 胞クローンは、ＢＰフラグメントそれぞれの、そのような“潜在性”エピトープ を認識した訳である。すなわち残基４３−８９であり（ＭＳ、ＯＮＤ患者では、 ＢＰフラグメント特異的クローンのそれぞれ４１％と４２％）、１−３８であり （それぞれ３６％と２１％）　、９０−１７０である（それぞれ２３％と３７％ ）。
ラットを使った研究より、ＢＰ認識のそれらの二つの／＜ターンの重要性につ０ ての説明か得られている。同質性のＢＰをＴ細胞が認識することが、脳炎誘発プ ロセスが誘導される上での必要条件であると考えられる。未変性のＢＰで免疫処 理した後に誘導されるＴ細胞は、未変性のＢＰが付属１ｃｕ＋＋ｏ「Ｙ）細胞に よって“処理”される際にも保存される、免疫的には支配的な、脳炎誘発活性の あるＢＰエピトープに応答する（Ｃｈｏａ　ｔｌ　ｉｔ、、Ｉ、）ｆｌｌｔｏＩ ｃｉ、Ｒ＋＋、２３：　２０７−２１６１９８９））。一方、ラットに脳炎誘発 性エピトープの切断型ノく一ジョンである合成りＰフラグメントを免疫処理する と、異なった二つのセ・ソトのＴ細胞クローンカく誘導された（Ｏｆｉｎｕ　Ｃ １＋ｌ、、１．　１ｍ１ｏｎｏ１．　１４１：　３ｇ２８−３８３２１１９８８ ）ｌ　−ツのセットは合成ペプチドと未変性のＢＰとを認識し、そして脳炎誘発 性であった。２番目の変異Ｔ細胞のセットは合成ペプチドのみを認識し、未変性 のＢＰを認識するものではなかった。また脳炎誘発性でもなかった。要するに同 じペプチドが二つの異なった抗原性コ／フ才メーンヨンを呈し、そのうちの一つ のみが、未変性のＢＰ分子が自然に“処理°された場合に、保持されると見なさ れた。ヒトでも同様な二重の感作が生じるという説は、ヒトＢＰの残基５５−７ ４．８７−９９゜１１０−１２９に一致する合成ペプチドのすべてが、Ｃ３Ｆ由 来のＢＰ一応答性Ｔ細胞クローン、ペプチド−特異性Ｔ細胞クローンのいずれに よっても認識されたという事実で裏付けられよう。Ｒ４の中では、同じ患者から の血液−誘導性クローンは、ＢＰの１３０−１４９ペプチドと１４９−４７１ペ プチドには非常に高い頻度で応答したが、８７−９９と１１０−１２９エピトー プへの応答は稀であったという点は、注目に値するところである。
総合してみると、以上に示された結果は以下を物語っている：　１）ＭＳのｃｓ Ｆでは、脳炎誘発性ミエリノ抗原に特異的なＴ細胞が、活性化されたＩ　Ｌ−２ 応答性Ｔ細胞の５０％を占めている：２）ＭＳ患者のＣ３Ｆ中の、脳炎誘発性ミ ニリン抗原特異性のＴ細胞の出現頻度は、末梢におけるよりも非常に高いもので あり、しかもそれは炎症反応を十分に誘導することの可能なレベルである。３） 未変性のＢＰに対する認識性に基づくことで、ＭＳ＠者のＣ３ＦにおけるＢＰ応 答を、ＯＮ　Ｄ　患者の応答と区別することは可能である；４）ＭＳ咀者のＣ３ Ｆ中（ＢＰとＰＬＰ１３９−１５１　）、血液中（ＢＰのみ）のミニリン抗原応 答性クローンの出現頻度は、対照と比べて有意に高いものとなっている；５）Ｃ ３ＦクローンのＢＰエピトープの特異性は、Ｎ末端エピトープの側に大きく偏っ ている。
表１０　も者はＯｎｇｏｎ　Ｈｅａｌｔｈ　５ｃｉｅｎｃ＋ｉ　Ｕｎｉｕ＋１１ １７　ＶＳ　Ｃｅｎｔｕでケアを受けていた。Ｍ　Ｓ　１１．者は臨床的に明確 なＭＳであり、その平均年齢は４７歳で、年齢範囲は３５〜４８１であった。Ｍ 　Ｓ　、１！−者のうちの３名は安定した再発−緩和性疾患であり、６名は慢性 的な進行性疾患であった：試験期間中に臨床的な変化が生した川音は皆無であっ た。疾壱の平均期間は１６二８年であった（範囲６〜３２年）。を者の＾１Ｉｌ ｂｕｌｉｌｉｏｎ　ｌｎｄ＋ｒ　（Ａ　Ｉ）の平均は３．　８：２．　０であっ た（範囲２〜８）、またＫｕＮ＋ｋｅ　Ｄｉ＋＋ｂｉｌｉｔ７５ｌｉｌｕ＋　５ ＣＯＩ！　（ＫＤＳＳ）の平均は４．５＝２．１であった（範囲２〜７）。０Ｈ ８ＵのＴｌ１ｎｌｐｌａｎｔｌ１１ｏｎ　Ｌ！ｂｏＩｉｌｏＩｌの標準的な血清 学的方法によって、患者のＨＬＡ−タイプの分類が行われた。ＨＬＡ−タイプと は　ＭＳＩ、ＤＲＩ、２／’ＤＱＷＩ　；ＭＳ２、ＤＲ２，４／ＤＱｗ１゜３： ＭＳ３、ＤＲ２／ＤＱｗｌ　；ＭＳ４、ＤＲ２／ＤＱｗｌ　：ＭＳ５、ＤＲ２゜ ７／’ＤＱＷ１；ＭＳ６、ＤＲ２，６／′ＤＱＷ１　；ＭＳ７、ＤＲ２，４／Ｄ ＱＷｌ。
３、〜ＩＳ８、ＤＲ２／’ＤＱＷＩ　＋ＭＳ９、テストされず。ＱＮＤ患者の平 均年齢は１２ａであり、その範囲は２３〜６９歳であった。ＯＮ　Ｄ　患者の診 断とは０ＮＤＬ、下垂体性未分化胚細胞腫；　０ＮＤ２、ごく新しいウィルス性 髄膜炎。
０ＮＤ３、コクノ／ウム性髄膜炎と大脳袋孔、０ＮＤ４、糖尿病性の末梢性神経 症：０ＮＤ５、過去に推弓切除、慢性的な背中の痛み、０ＮＤ６、ＣＮＳ性脈管 炎と大脳骨折。＼４ＳとＯＮ　Ｄ　、１４１．者の各人につき、２０ｍ１のＣ３ Ｆを腰部穿刺によって、血液の夾雑を招くことなく採取した。２７５Ｘｇで１０ 分間円心分離してＣ５Ｆ細胞を集め、その一部を丸底の９６−ウェルのプレート で、１ウェル当り１．　０００１１［１胞トイう密度で、ＩＬ−２とＩＬ−４を 含む（各５ｏυ／ｍｌ、Ａ〜ｉＧ　Ｅ　Ｎ）培養ｒ＆（ＰＲＭｌ　１６４０．１ ０％ＡＢ血、青、１％Ｌ−グルタミ／、ビルヒノ酸ナトリウム、抗生物り中で平 板培養した。１４〜２１日間帳開した後、１０５の自己由来の照射（’、−４， ５００ラド）血液性単核球て立証された５　０　ｕｇｉ’　ｍｌの特異抗原でＴ 細胞を再度刺激し、７２時間後に応答性を３１］−Ｔｄｙの取り込みによって判 定した。抗原の一つに対する応答が３Ｘであるが、バックグラウンドを差し引い た後のＣＰＭか＞１．０００である場合に、クローンを陽性であると評５点した 。急速冷凍された脳より、ヒトＢＰ　（Ｈｕ−ＢＰ）を抽出し、精製した。ＰＬ （残基４５−８９）　、Ｒ２（残基１−３８）、Ｒ４（残基９Ｏ−１７０）を含 むＨｕ　−Ｂ　Ｐのフラグメントにつぃては、ペプシン開裂後に精製されたもの をＤｒ、Ｃｈｕｏｕ、Ｅｍｕ７　Ｕｎｉｙｍｉ１７．　Ａｌｌ＋ｎｌｉ、Ｇ＾よ り得た。
ＰＬＰ１３９−１５１の配列はＨＣＬＧＫＷＬ−ＧＨＰＤＫＦである。
実施例■ ＭＳのモデルとしてのＥＡＥに対する処置に、有用なペプチドの構成吃−！ ＥＡＥとはヒトの自己免疫疾虫である多発性硬化症の、よく知られたラットモデ ルである。そこで本発明の有用性を実証するに当って、ラットではＥＡＥのマー カーＴＣＲとなっている、ＴＣＨの適当なＣＤＲ２ペプチドに相当するペプチド をラットに投与した場合に、それらではＥＡＥが予防されることを示すこととし た。本モデルでは疾患は、被検ラットに対して、例えばモルモット塩基性’ｂｉ ｉｉｃ）蛋白（ＧＰ’ＢＰ）や、ＧＰＢＰの残基７２−８９に相当する合成ペプ チド（ＧＰ−ＢＰ　（７２−８９））といった、脳炎誘発形態のミニリン塩基性 蛋白を注射することて誘導される。フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）中の これらのペプチドのいずれかを注射すると、マウスＴＣＲのＶａ２とＶβ８遺伝 子の、ラットにおける相同体を選択的に利用する、脳炎誘発性のＴ細胞クローン が誘導されるようになる（Ｃｈｏｕ、Ｙ、　Ｋ、、ｃｔ　ｒｌ、、　１．　Ｎｅ ｕｒｏＩｃｉ、ＲＨ，２２１１８１−１８７１９８９１、Ｂｕ＋＊＋、　Ｆ、　 Ｒ，、１，Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１６９：　２７−３９（１９８９））。
発明者たちは、塩基性蛋白の主要な脳炎誘発性エピトープであるＧＰＢＰ（７ｉ ８９）に反応して用いられる（Ｂｕｎｋ、　Ｆ、　Ｒ，、ｃｔ　ｒｌ、、　上記 参照）、再配列ラットＴＣＲのα鎖、およびβ鎖遺伝子の完全なヌクレオチド配 列と、それから演鐸されるアミノ酸配列について報告した。ＴＣＲ内のＶβ８領 域、すなわち２１−アミノ酸の配列を識別し、合成した。それには２番目の補体 決定領域（ＣＤＲ２）が含まれていた。またＴ細胞に対する抗原性が備わってい ると予測５れた（ｖＩＢ＋ｌｉｌ　ｅｔ　ｒｌ　とＲｏｔｈｂｕＯｃｔ　ｒｌ　 のアルゴリズムに基づく　（上記参照））。
本ペプチドの配列は次の通りである　Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ −Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｈｉｓ−Ｔｒｙ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ −Ｖａ　ｌ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙｏそして“ＴＣ ＲＶＢ２　（３９−５９）”と名付ける。
マウスのＶβ１４系統とは相同な、別のＴＣＲのＶβ配列に対応する領域から、 対照のペプチドを合成したｆＪｉｌｌ＋＋ｍｔ　ｅ＋　ｉｆ、、上記参＠）。
ＴＣＲペプチドの特異的抗原性 ４　匹ノラノトＩ：、ＣＦＡ　（Ｌ００４）ｌＪｙｃｏｂｚｃｌｅ＋ｉａｍ／ラ ット）中４００ｕｇのＴＲＣを皮下（Ｓ　Ｃ）注射して、免疫処理を行った。そ してその３０日後にペプチド−特異的な免疫応答を判定した。ＴＣＲＶＢ２　（ ３９−５９）ペプチドに特異的な抗体を測定するに当っては、免疫処理されたラ ットから得られた血清を、直接的ＥＬＩＳＡでテストした。その際にはプラスチ ックのミクロプレートの表面上を、ＴＣＲペプチドで被覆した（ＴＣＲペプチド ２５ｎｇ／ウェル）。稀釈血清を加えてからプレートを２時間インキュベートし た。ＩｇＨとＬ鎖に特異的なパーオキシダーゼー結合抗体を加えて、反応を進行 させた。パーオキシダーゼの色素形成基質を加え、その呈色反応生成物を、比色 プレートリーダーを使って１．４０５ｎｏにおける吸光度（Ａ、ｏ５）として測 定した。
免疫血清の１２００稀釈液の吸光度は、０．６３±０．１２単位であった。
対照ペプチド（関連性のないＴＣＲ鎖の、対応するＣＤＲ２領域、すなわちＶＢ １４に由来する）て免疫処理さゎたラット由来の対照血清の反応は、わずか０． ０２±０．０１単位であった。すなわちＴＣＲペプチドに対する特異的な抗体反 応が得られた訳である。
さらにラットはｉｎ　ｖｉｖｏにおいて特異的なＴ細胞反応を呈した。すなわち ＶＢ２　（３９−５９）ＴＣＲペプチドをラットの皮肉（ＩＤ）に負荷すると、 遅延性過敏反応（ＤＨ）が生したが、Ｖβ１４ペプチドではそのような反応は生 しなかったことから、そのように判断された。
ＴＣＲペプチドに対する特異的免疫性を呈することに加えて、ペプチド−免疫処 理を受けたラットは、臨床性のＥＡＥがらも防御されることが見出された。
Ｌ＋ｗ１＋　ラットをＴＣＲＶβ１４ペプチドや生理食塩水ではなくて、ＴＣＲ Ｖβ８　（３’Ｊ−５９）ペプチドで免疫処理すると、ＥＡＥの誘導が完全に予 防された（図１１）、ＶＢ２（３９−５９）　−免疫処Ｅｌラノ）１．：は、Ｖ １３　（３９−５９）ペプチドに対する特異抗体が出現した。さらに０．１７＋ ａｍの耳の腫れという、５０■のＶＢ２　（３９−５９）ペプチドに対する、遅 延性過敏反応（Ｄ　Ｆ（）が生じた。対照のＶβ１４ペプチドも、それ自体に対 する特異的免疫性を誘導したが、ＥＡＥに対する防御作用を発揮するものではな かった。
ＴＣＲのペプチド−特異的免疫性は、特異性Ｔ細胞を発生させる抗体産生、ＤＨ ，ＥＡＥに対する防御作用が立証されたことに加えて、ＴＣＲペプチドは抗原− 特異性（すなわちＴＣＲペプチド−特異性）Ｔｉｌｌ胞を立証可能な程度に誘導 した。
ラットのＳＣに、ＣＦＡ　（１ｇＩｇのＭ、１ｏｂｕｃｎｌｏ＋ｉ＋を含む）中 ４００ＩＩｇのＴＣＲＶβ８　（３９−５９）ペプチドで免疫処理し、それと同 時にＣＦＡ中５０■のＧＰＢＰをＳＣに負荷した。あるいは免疫処理の３０日後 に、１００■のＧＰＢＰをＳＣ負荷した。同時的な負荷の２０日後に、ドレーン 中（４ｎｉｏｉｎＯのリンパ節（ＬＮ）を分離し、リンパ球懸濁液を調製した。
ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて抗原、またはミトゲンに対する細胞分画の増殖反応を テストした（５　Ｘ　１０”細胞／ウヱル）。
残りの細胞については大容量カルチャーとして（直径６ｃｎのペトリ皿中）、適 当なＴＣＲペプチド（５０■／ｍｌ）で３日間再刺激し、次にＩ　Ｌ−２に富む 培養液に移して、さらに４日間培養した。その後でそれらの細胞の抗原、または ミトゲンの刺激に対する増殖反応を、照射胸腺付属ｆｉｅｃｏ＋ｏ＋マ）細胞の 存在下（２×１０４細胞／ウエル）でテストした。ある種の例では、２■／ウエ ルのモノクローナル抗体の存在下で、ＴＣＲペプチドによる刺激をも実施した。
結果は表１２に示されている（下線が施された数値は、統計的に有意な反応であ ることを示している）。
防御処理が適用されたラットに由来する分離リンパ節（ＬＮ）は、ＴＣＲＶβ８ 　（３９−５９）ペプチドにも、またＧＰＢＰ、ＰＰＤ　（Ｍ、１ａｂｕｕｌｏ ＋ｉ＋の晴製蛋白誘導体）にも応答した。この結果は、ＴＣＲ−特異性Ｔ細胞の 応答性と、自己抗原特異性Ｔ細胞の応答性の双方が共存していることについての 、別の裏付けであった。
ＶＢ８　（３９−５９）ペプチドには特異的に応答するが、Ｖβ１４ペプチドに は応答しなかったという、防御処理が適用されたラットのＬＮより、Ｔ−細胞系 統を選択した（表１２）。ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）−特異性Ｔ細胞のＣＤ ４をマーカーとした場合の免疫蛍光は、強い陽性であった。ＣＤ８がマーカーで ある場合には、弱い陽性となった。ＶＢ８　（３９−５９）ペプチドに対する増 殖反応は、ＭＨＣのクラス１分子のみによって制限されていた。
ラットにＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）ペプチドとＧＰＢＰの双方て免疫処理し て、防御処理を施した訳であるが、それらよりＧＰＢＰ−特異性Ｔ−細胞系統を も選択した。脳炎誘発性の７２−８９ペプチドに対するその細胞系統の応答性は 、ＧＰＢＰに対する応答性と比へて、非特徴的な低さのものであった。ＴＣＲペ プチド−防御性ラットよりＧＰＢＰ−特異性ＴＩ［［ｌ胞系統の細胞を一旦選択 し、活性化すると、それは脳炎誘発性とな−だ（１０７の細胞が投与されたラッ トの３匹に、後肢の麻痺が生した）。すなわちＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）ペ プチドで免疫処理を行っても、それは脳炎誘発性Ｔ細胞の前駆体の消耗にはつな がらないことか示された訳である。
ＴＣＲＶβ８Ｃ３９−５９）−特異性Ｔ細胞と、ＢＰ−特異性Ｔ細胞を混合して も、ＧＰＢＰに対する応答は損なわれなかった。それはＴＣＲペプチドの存在下 でも同様であった（表１２）。しかしＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）−特異３Ｔ 細胞が存在することによって、脳炎誘発性の７２−８９の配列を例外として、Ｇ ＰＢＰのすへてのペプチドに対する応答性が増大した。すなわちＴＣＲペプチド 〜特異性Ｔｍ胞は、ＧＰＢＰ一応答性Ｔ細胞のペプチド認識パターンを変化させ た訳である。この結果は細胞−細胞の相互作用が存在することを裏付けている。
ＴＣＲベプ壬トー特異性Ｔ細胞）：ＢＰ−特異性子細胞の間の直接的相互作用免 疫処理されたラットのＬＮ由来のＴ細胞の、減衰■β８＋Ｔ細胞、ないしは−特 異性Ｔ細胞の存在下で３日間培養した（付属細胞は追加されなかった）。その終 わりの１８時間に３Ｈ−チミジンでパルスを発生させ、アイソトープの取り込み を液体／ンチレーノミン分光器で計測した。
刺激因子のＴ細胞系統の非存在下では、”パックグラウッド”の応答は７０００ 　＋ｐｍのオーダーであった（表１３）　。ＧＰＢＰの５７２−８９エピトープ に特異的な刺激因子系統を用いた場合、すなわち刺激系統がＶＢ２のＴＣＲを表 している場合では、応答は３１．０００＋９１１であった。しかし刺激因子系統 がＧＰＢＰ５５−７４ペプチドに特異的であった場合、つまりＶＢ２のＴＣＲを 表すものではない場合には、バックグラウンドを超える有意な応答は出現しなか った（８０００ｃｐｍｌ。ＴＣＲペプチドに特異的なＴ細胞で認識されたのは、 ■β８＋細胞のみであった。すなわち調節Ｖβ８−特異性Ｔ細胞による、ターゲ ットのＴ細胞上のＶβ８ペプチドへの、直接的な認識が存在することが示された 訳である。またこの結果は、刺激因子Ｔ細胞上表面のＴＣＲ配列が、直接的に認 識されることを示している。しかしＴＣＲペプチド特異性Ｔ細胞は、ＢＰ一応答 性ターゲット細胞に対して、細胞毒性を発揮するものではなかった。
ＴＣＲペプチド−特異性Ｔ細胞によるＥＡＥ防御作用の受動的転移Ｖβ８　（３ ９−５９）ペプチド−特異性Ｔ細胞の防御活性は、選択的移植によって確定され た。１０Ｔという少量のＶＢ２　（３９−５９）−特異性Ｔ細胞をラットに注射 すると、ＥＡＥは進行しなくなった（表１４）。防御作用の転移はＴ−細胞媒介 性であるように見受けられた。防御処置の施されたラットの血清中には、ＶＢ２ 　（３９−５９）−特異抗体は検出されなかった。ＤＴの結果（表１４）は、選 択的に移植されたＴ細胞にはＥＡＥの誘導を阻害する活性が備わっていること、 一方、その他の抗原に対するＴｉ胞の認識に錯綜をもたらすものではないことを 示していた。
防御処理が施されたラットに由来するＴ細胞系統の特異性（ａ）ｉｎ　ｖｉｔｒ ｏでＧＰＢＰ−特異性Ｔ細胞系統の応答パターンを変化させ、（ｂ）自然のまま のラットをＥＡＥから防御し、（ｃ）ｉｎ　ｖｉｖｏでＤＨ反応を抑えるという ＶＢ２　（３９−５９）−特異性Ｔ細胞の活性から、ＴＣＲペプチド−特異性Ｔ 細胞で防御されたラットでは、ＢＰエピトープに対する応答パターンに、変化が 生じているのではないかという示唆が得られた。表１５に示されているように、 ＥＡＥ−防御動物由来ＬＮ細胞の、ＧＰＢＰのＴＣＲペプチドに対する応答性は 、対照グループ由来のＬＮ細胞と比較した場合でも＋分なものであった。一方、 防御動物由来のＬＮ細胞は、ＢＰの８７−９９ペプチドに対して大きく応答した 。それに対して対照グループ由来のＬＮ細胞は、そのペプチドには応答しなかっ た。選択的に防御処理が施されたラットのＬＮより、ＴＣＲＶＢ２　（３９−５ ９）−特異性Ｔ細胞系統が選択されたことは（表１５）、ＴＣＲペプチド−特異 性Ｔ細胞が、ＧＰＢＰの注射部位をドレーンするＬＮに転移し、そこで存続した ことを示していた。
考察 以上の結果は、ＴＣＲのＣＤ　Ｒ２ｉｌｉ域に由来する合成ペプチドを用いれば 、ＥＡＥの誘導を阻害するＶＢ２−特異性調節Ｔ細胞が誘導されることを示した 、最初の実証例である。ＴＣＨ鎖、抗原ペプチド、ＭＭＣ制限分子という三成分 間の相互作用についてのコンピューターモデリングは、ＴＣＲがエネルギー的に 好ましいコノフォメーノタンに折り込まれている場合に、ペプチド／ＭＨＣ結合 にＣＤＲか包み込まれるという説を支持している（Ｄｘｖｉ＋　Ｉｌ　Ｉｌ　と Ｃ１ｕｕｉ＋　Ｎ　ｒｌ、。
上記参照）。ＣＤＲ２特異性のＴ細胞の調節作用は、その領域には生物学的な重 要性か備わっているとする見解を支持するものである。発明者たちは特定の理論 に束縛されることを意図している訳ではないが、応答性（ｎｔｐｏｎｄｕ）　Ｔ 細胞とターゲットのＴ細胞表面上のＴＣＲＶβ８分子との間に、直接的な相互作 用が存在するとは考えられていない。実際、考えられるところでは、内因性のＴ ＣＲペプチドは“処理”を受け、そしてＴ−細胞表面上でクラスフ分子と組合わ さって、選択的に発現されるのではないだろうか（Ｌｏｎｇ、　Ｅ、　０．、　 １ｗｍｕ＋ｏ１．　Ｔｏｄ＊７１Ｇ２３２−２３４　（１９ｇ９＋＋。天然形態 のＴＣＲペプチドかＴ細胞表面上でＭＨＣ分子と組合わさるのであるならば、相 互作用を発揮するＴＣＲ−特異性Ｔ細胞は、ＢＰエピトープによる正常Ｔ細胞の 活性化に干渉するのではないだろうか。
減衰Ｔ細胞によるワクチン処理とは、防御免疫性は、同一の疾患−誘導性エピト ープに特異的な、別のＴ細胞クローンに共有されたターゲット構造に対して誘導 されること、しかしＴＣＲを直接食むものではないことを意味している。ここで 立証されたＴＣＲＶＢ８鎖の限定された領域の、脳炎誘発性Ｔ細胞によって発現 されるイムノゲン性、免疫調節活性は、抗−イディオタイプ性調節を理解する上 での、先行的な重要なステップとなるものである。またペプチド免疫処理アプロ ーチによる防御作用についての、明快な説明となる。ＴＣＲペプチド−特異性抗 体を誘導するために合成ペプチドを使うという、今回の発明のアプローチは、Ｔ ＣＨの機能の面で重要な配列を評価するために、様々な高度に特異的な抗体を産 生させようとする上では、価値のあるものである。ＶＢ２　（３９−５９）ペプ チドに対して誘導された抗体の仮定的な調節特性が、実施例Ｈに示されている。
ＴＣＲペプチドによるワクチン処理は、共通したＴＣＲＶ−遺伝子を用いるとい う特徴が存在する、ヒトの自己免疫状態や、悪性状態に応用されるべきである。
表１１ ’　ＴＣＲペプチド（ないしは生理食塩水）による免疫処理の３０日後に、フロ イント完全アンユバント（ＣＦ　Ａ）中５０ｊｇＧＰＢＰ＋４００μｇｖ７＋ｏ ｂ＋＋ｌ＋＋ｉ＋をＳＣ負荷することて、ＥＡＥを誘導した。
′ラットに対して以下のいずれかをＳＣ注射した。（１）マウスＶβ８系統に相 同な、ラットｃ　Ｄ　Ｎ　ＡクローンＶβ５１０の、残基３９〜５９に相当する ＴＣＰペプチド（ＤＭＣＩ−（ＧＬＲＬ　ＩＨＹＳＤＶＮＳＴＥＫＧ　（頭文字 のコート））を１００ａｇ（Ｂｕｒｎｔ　ｕ　ａｌ、、１．　ＥＩ９．　ｌＪ＋ ｄ、１６９：　２７−３９’！９８９］）　＋　（２）マウス■β１４系統に相 同な、ラットｃＤＮＡクロー７ＣＲＴＢ１８８の、残基３９〜５９に相当するＴ ＣＲペプチド（ＡＰＧＧＴ　Ｌ　Ｑ　Ｑ　Ｌ　Ｆ　”Ｉ’　Ｓ　Ｆ　Ｎ　Ｖ　Ｇ 　Ｑ　Ｓ　Ｌ　Ｆ　］　を１１００ｕ　（Ｗｉｌｌｉｚｍｉ、Ｃ，Ｂｔｌａｌ、 、：、１ｍｍｕｎｏ１．　ｉ４２：　１Ｇ３７−１０３５　（１９８５１）　； 　（３）生理食塩水。注射を行う前に、ペプチド、生理食塩水を１１００ｊのＭ ７ｃｏｂｏｊｕｉ！を含むＣＦＡと、足金した。
３数値は最大のＥ　、Ａ　Ｅの程度を表している。０、徴候なし、０５、嗜眠。
体重減少、１、気の抜けた尻尾、２、後肢の弱り９３、後四分体の麻痺、失禁、 ・１、死亡。
表１３ Ｔ細胞系統を照射しく２．５０ＯＲ）、そして２Ｘ１０’の細胞（刺激因子とし て）を、３日間にわたって２×１０５のＴＣＲ−特異性の反応性Ｔ細胞と混合し た。その終わりの１８時間に、”Ｈ−チミジンでパルスを発生させ、細胞を採取 し、そして増殖を３Ｈ−千ミシンの取り込みとして評価した。ＧＰＢＰ　（Ｓ７ ２−８９）、およびＧＰＢＰ　（５５−７４）に特異的な照射Ｔ細胞の、増殖バ ックグラウンドは、それぞれ０．　１．　０．　２＋ｐｍｆｘ　１０’）であっ た。
表１５ 実施例■ 本実施例は、ＴＣＲＶＢ２　（３１−５９）ペプチドによる免疫処理が、脳炎誘 発性モルモット塩基性蛋白（ＧＰＢＰ）　、Ａ３７−９９で誘導されるＥＡＥに 及ぼす効果、ならびにＧＰＢＰペプチドの５４９Ｓ、または５８７−９９に対す る抗体反応に及ぼす効果を評価するものである。ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９） ペプチドに対する抗体反応を明らかにし、そしてそれらの抗体のＶβ８＋細胞に 反応する活性と、ＥＡＥの臨床徴候を抑える活性とを評価する。
結果はＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）ペプチドには、ＥＡＥに対する防御作用を 誘導する活性と、１ｅｖｉｉラツトでは脳炎誘発性である、いずれかのＧＰＢＰ エピトープに対する特異抗体の力価を高める活性とが備わっていることを示して いる。さらに抗−ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）抗体は、調節Ｔ細胞とは独立し てＥＡＥを抑えることが示されている。すなわちＴＣＲＶＢ２　（３９−５９） でＬ＋ｖｉｉラットを免疫処理すると、体液性調節メカニズムと、細胞性調節メ カニズムの双方が誘導される訳である。
本研究に用いたペプチドは、すへてＢｏａ−アミノ酸−樹脂−エステル（？＋ｎ １ｎｕｌ＋　Ｌ＋ｂｏ＋ａ−１ｏ＋ｉ＋ｔ、Ｓａｎ　Ｃａｔｌｏｓ、Ｃ＾）を用 いる固相法（Ｍｅ＋＋１ｌｉｓｌｄ　Ｉ＾ｍｕ、Ｃｂｔｍ、Ｓｏｃ、８５：　２ １４９　ｆ１９８３））を少し修正した方法より合成されたものである（Ｈｉ＋ ｈｉｍ　ｅｌ　ｉｌ、、１．　Ｎｅｕｏ＋＋ｉ、Ｒｅ１．　１６：　４６７　ｆ １９８６）ｌ。そのペプチドは、ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−グリシンー〇−樹脂エステル （０，６５ｓｓｏｌ／ｇ　：　０．　７８モル）よりスタートして、ｔ−Ｂｏａ −Ｌ−アミノ酸誘導体を使って合成された（表１６）。結合（ｃｏａｐｌｉｎｇ ）　、解離（ｄｓｂｌｏｃｋｉｎｇ）は、遊離のアミノ基を検出するためのＫ１ １ｏ＋テスト（Ｋｉｉ＋ｅ＋　ｌ＋　ｘｌ、、　＾ａ１１．　Ｂｉｏ＋ｈｕ、３ ４：　５９５　［１９７０１）によって、ルーティーンにモニターされた。本研 究に用いたすべてのペプチドの合成には、−回の解離と、随時の二重結合反応ス テップで十分であった。ペプチドＧＰ−３４９ＳはＧＰＢＰの領域６９−８４と 定義される。そのＣ−末端はグリノンである。本研究に用いたＧＰＢＰペプチド の残基数は、ウシミニリン塩基性蛋白に関して報告されている残基数に一致する （Ｅ７１ｓ＋　ｃｌ　Ｉｌ、、１．　８ｉｏｌ、　Ｃｔｕｓ２＋６．５７７０　 ｆ１９７１］）。
トリプトファンを含むペプチドを、まず１０％のピペリジンで３０分間処理して 、フォルミル遮断基を除去した。次にそれを他のあらゆるペプチドと同様に、ア ニソールの存在下、０℃下でＨＦを処理して、他の側鎖の保護を外すと同時に、 樹脂から開裂させた。ＨＦを除去してから樹脂−ペプチド混合物をエーテルで４ 回洗浄し、乾燥した。ペプチドを水で抽出し、凍結乾燥し、５％酢酸で平衡化さ れた５ｓｐｈｚｄｅｘ　Ｇ　１０カラム（２，５Ｘ１００ａｎ）でろ過した。流 出にはその５％酢酸を用いた。また酸不溶性ペプチドを、樹脂−ペプチド混合物 より０．０３Ｍ炭酸アンモニウムで抽出し、０．０３Ｍの重炭酸アンモニウムで 平衡化された５ｓｐｂｘｄｔｒＧ　１０カラムでろ過し、流出させ、そして凍結 乾燥した。それ以降のペプチドの精製については、０．　１％トリフルオロ（Ｔ 　Ｆ　Ａ）酢酸で平衡化されたＢｏｎ＋ＩＨ＋ｊＣ１８カラムを用いるＨＰＬＣ て行った。その際、ｏ　１％ＴＦＡを含むアセトニトリルを６０分間で４０％と する、直線的グラディエンドで流出を行った。ペプチドの純度を）ＴＰＬＣとア ミノ酸組成の分析で確認した。
２、テストペプチドと対照ペプチド Ｂｏ＋ｎ＋　ｅｌ　Ｉｌ、（］、　ε！１．　Ｍｅｄ、１６９：　２７（１９８ ９１）が同定した配列に従って、ＴＣＲＶβ８　（３８−５９）を合成した。Ｔ ＣＲＶβ遺伝子系統の特異性、およびＣＤＲ２の高変異性領域のための対照とし て、他にもペプチドを合成した。例えばＶβ１４遺伝子系統の、対応するＣＤＲ ２を構成するＴＣＲＶＢ１４（３９−５９）てあり（Ｗｉｌｌｉ＋ｍ＋　＋ｔ　 ｈｌ、、　１．　ｌｌｌｍｏｎｏｌ、１４２：　１０２７（１９８９１）　、ペ プチドＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）に隣接するＣＤＲＩ領域の配列に相当する 、ＴＣＲＶＢ２　（２５−４１）である（Ｂｕｒｎｔ　ｅｌ　！１．．　同上） 。その他の対照ペプチドとしては、ＧＰＢＰの特異的な領域を定義する一連のも のを設定した。ペプチドＧ　ｐ−Ｓ　＝４９　ＳとＧｐ−３８７−９９を、Ｌｅ ｖｉ＋ラット１こ対するメジャーな脳炎誘発性配列、マイナーな脳炎誘発性配列 と、それぞれに定義する。ペプチドＧｐ−３６７（残基６９−８１）（！：ＧＩ ）　−３５３（残基７５−８４）については、それぞれペプチドＧｐ−５４９Ｓ 　（残基６９−８４）に含まれる、メジャーな脳炎誘発性エピトープ内のＴ細胞 、およびＢ細胞エピトープと定義する。またペプチドＧｐ−３５５−７４を、ｂ Ｗ目ラうトにおける非−脳炎誘発性Ｔ細胞決定因子と定義（Ｏｆｆｎｅｔ　ｌｌ 　＋１．、　１．　Ｅｘｐ、　ｌＪ＋ｄ、１７０：　３５５　Ｌ１９８９））す る。Ｇｐ−ＮＡｃ−１−１６には、ＰＬ／Ｊ系統のマウスに対する脳炎誘発性配 列が含まれている（ｈｍ＋ｉｌ　＋ｔ　！ｌ、、Ｎｘ１ｕｓ　３２４：　２５８ 　（１９８６１）。
３、ペプチドのＫＬＨとの結合 Ｋｅｙｈｏｌ＋　ｌｉｍｐｅｌヘモノアニン（ＫＬＨ）　（ＣｔｌｂｉａＣｈｕ 　Ｃｏｒｐ、、　Ｌｘ　Ｉｏ由、ＣＡ）をリン酸緩衝生理食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ） に溶解し、４℃下で一晩ＰＢＳに対して透析し、凍結乾燥した。既知量のＫＬＨ （８■、ないしは１〜２μモル）とペプチド（１０Ｍモル）とを−緒にして、１ ｍｌの脱イオン水に溶解した。０．０１ＮのＨ（ＪでｐＨを４．５に調整してか ら、３７５■の１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボンイミ ド（Ｐｉｅ＋ｕ　Ｃｂｅｍｉｃｘｌ　Ｃｏ、、Ｒｏｃｋ＋ｏ＋ｄ、ＩＬ）を含む 水溶液、０．５を加え、室温下でその反応混合液を１時間撹拌した。次にその混 合液を透析バッグに入れ、４℃下でＰＢＳに対して透析を、そのＰＢＳを３回代 替しつつ行った。ＫＬＨに結合したペプチドの量を、Ｋ　Ｌ　Ｈの非−透析性部 分の質量の増加から算出した。
４、抗−ペプチド抗体の調製 体重が２００〜２５０ｇの雄のＬｅｔロラットに対して、１００ｇｇの遊離ペプ チドを単独投与することで免疫処理を行った。フロイント完全アジュバント（Ｃ ＦＥ）でペプチドを乳化し、それをＳＣに注射した。それぞれのラットは、１０ ０１ｇのペプチドと１００１１ｇの１１．　ｂ山＋ｉｅ＋１１を含んだ１００Ｍ のエマルジョンの投与を受けた訳である。同様にＬｃｖロラノトに対して、１１ ００ｊの特定のペプチドによる免疫処理を行った。その際にはそれと同時に、ま たはその後日に別のペプチドによる負荷を行った。免疫処理の前に、そして免疫 処理後には定期的に、免疫処理ラットの尾静脈より血液を予備的に採取した。
体重が６〜７　ｌｂ＋のＩＩＨＺＢｌｘｎｄ白ウサギを予備的に採血し、４■の ペプチドと２■の１４ｂｕ１７Ｔ１ｃｏｆｆｌを含む０．５ｍｌのＣＦＡエマル ジョンで免疫処理を行った。頚部の背面領域と尻尾の多数の部位に、そのエマル ジョンをＳＣ注射した。
ウサギには遊離のペプチドか、ＫＬＨに結合したペプチドのいずれかで、免疫処 理を行った。免疫処理ウサギに対して、７．１４．２１日目に、フロイント不完 全アジュバント中で乳化された１■のペプチドでブースター処理した。その際に はわき腹にＳＣ注射した。ウサギを拘束ケージに収容し、＋ｃ＋ｐ＋ｏｍｏ＋ｉ ｎで麻酔してから、それらの全類について、耳静脈からの採血を行った。血液量 の減少を防ぐために、採取された血液の量を無菌生理食塩水で置換した。ラット 、ウサギの番頭より、凝固血液を遠心分離することで血清を調製した。すべての 血清を５６℃下に３０分間置くことで非動化し、アフ化ナトリウムを加えて少量 ずつ凍結した。
５　免疫グロブリンの調製 公表されている方法（Ｓｔ＋１ｎｂｕｃｈ　ｅｌ　ａｌ、、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏ＋ ｈ＋ｍ、ＢｉｏｐＪｉ、１３４：　２７９’１９６］））に従って、血清よりＩ ｇＧを調製し、Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ−ｕｐｔｕｄｕを用いるイオン交換クロマトグラ フィーで精製した。血清を１容の０．０６Ｍ酢酸緩衝液で稀釈し、室温下でｐＨ を４８に調整した。３０分間にわたって強烈に撹拌しながら、６　８ｇｚ’１０ ０ｍ１血清という割合でカプリル酸を滴下した。次にその混合物を遠心分離し、 上澄み液のｐＨを５．７に調整し、それを脱イオン水に対して透析してから凍結 乾燥した。
６　抗体のアッセイ 抗体の反応性を、直接的酵素−結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のペプチド に対する適合性によってｔＨ＋＋ｈｉｃ、Ｇ＾、ｅｌ　＋１．、　１．　Ｎｅａ ＋ｏ＋ｃｉ、Ｒｈ、２＋：　２２２１１８９＋）　、またＣ１ｅｙ＋−１＋ｎｊ 、Ｗ、Ｌ、Ｉｌ　＋１．　（Ｍ＋＋ｈｏｊ　ｉｎ　Ｅｎ＋ｙｍｏｌ、１２１：　 ９５（１９８６j） の記述による阻害ＥＬＩＳＡによって判定した。パーオキシダーゼー標識つサギ 抗−ラノド、またはヤギ抗−ウサギ免疫グロブリ／（親和−精製されたＨ、Ｌ鎖 。
Ｃｏｏｐｕ　Ｂｉｏ＋ｕｄｉｕ１．　Ｍｉｌｖｕｎ、Ｐ＾）を、酵素基買である Ｏ−フェニレンジアミンと一緒に用いた。そして比色プレートリーダーの、４５ ０〜６５０ｎ１１のところで吸光度を測定した（Ｍｏｄ＋ｌ　Ｖ？！１．　Ｍｏ １ｅｃｕｌｕ　ｒｈマＩＣｅ＋、！ｊｅｎｌｏ、ＣＡ）。
７、ＥＡＥの誘導 記述（Ｈｚｔｂｉｌｌ！ｌ　ｒｌ、、Ｉ、Ｎ＋ｕ＋ｏｉ＋ｉ、Ｒ＋＋、２Ｌ　２ ２２（１９８９））の通りに、雄のＬ＋ｖｉ＋ラット（２２５〜２５０ｇ）にＥ ＡＥを誘導した。ラットの番頭に、１１００ｕのペプチドと１００＃ｇの１４． 　ｂｏｌｌ＋ｉｕ−を含むＣＦＡエマルジョンを単独ＳＣ注射した。ＥＡＥの臨 床徴候の有無に関して、免疫処理の施されたラフトを連日点検した。そして負荷 から２５日目から３０日目の間に、それらを層殺した。その時点で各ラットより 血清を採取し、また脳組織とを髄組織とを組織学的検査用に処理した。
８、　Ｌ＋ｖｉ＋ラットにおけるＥＡＥの予防と抑制雄のＬｅｗｉｉラットに対 して、ＣＦＡ中で乳化された１１００ｊのＴＣＲＶＢ２（３９−５９）ペプチド で免疫処理を行った。注射はＳＣであった。免疫処理が施されたラットの尾静脈 より血液を採取し、抗体測定に供した。またそれらのラットに１００μｇの脳炎 誘発性ペプチド（Ｇｐ−３４９Ｓか、Ｇｐ−３８７−９９）を負荷した。観察さ れた抗−ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）抗体の産生経過に基ついて、一群のラッ トへの負荷を免疫処理の当日か、その４０〜４１日後のいずれかに行った。
抗−ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）抗体によるＥＡＥの抑制を検討するために、 １１ｖｉｉラツトに対して脳炎誘発性ペプチドのＧｐ−３４９Ｓの負荷を行った 。そして腹腔内に生理食塩水（対照）か、またはＬｅｔロラット、ないしはウサ ギ抗−ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）抗体のいずれかを、１４日間にわたって１ 日おきに注射した。各ラットには合計して４９■か７０■のう・ソト、ないしは ウサギＩｇＧが、それぞれに投与された。そして負荷後の２４日目に層殺された 。１４日間にわたって無菌生理食塩水溶液として注射されたウサギＩｇＧは、移 植後の１２日目、２４日目にも、し／ピエントのラットの血流中には高レベルで 維持されていた。また抗−Ｇｐ−３４９Ｓ抗体の展開にも干渉しなかった。
９、ＶＢ２−１−とＶＢ２−Ｔ細胞ノ抗体染色正常動物、またはＴＣＲＶＢ２　 （３１−５９）免疫処理動物由来のラット、ウサギｌ　ｇＧ　（１０＃ｇ）を、 様々な濃度で１０６の正常シソ１４ｉ１腺細胞（はとんどがＶＢ２−であること が判明している）かＧｐ−３４９Ｓ一応答性、Ｇ１’ＢＰ−特異性Ｔ細胞系統（ ＶＢ２−であることが判明している）と−緒に３０分間インキュベートした。数 回の洗浄を行った後、さらに３０分間、増幅ステップとして細胞を１０Ｍｇのマ ウス抗−ラノド、または抗−ウサギＩｇＧと一緒にインキュベートした。洗浄を 行ってか呟細胞をフルオレセイン処理されたヤギ抗−マウスＩ’ｇＧ（ＨアＬ鎖 特異性）で染色し、洗浄し、２％ホルマリン中で固定しそしてＣｏａｌ＋ｕ　Ｅ ｐｉｅ＋　ＣＣ７１ｏ１１ａｏ＋ｏｇ＋＋ｐｈを使って、４８８ｎ１１の蛍光強 度を評価した。主だったリンパ球集団を含めるために、前角度対右角度の散布パ ターンに基ついて、細胞を電気的に選別（ｇａｔｅ）した。そしてＦＩＴＣ蛍先 の評価を様々な脳炎誘発性エピトープによって誘導されるＥＡＥに対する、抗− ＴＣＲＶβ８　（３９−５９）の免疫性による予防効果を評価するために、Ｌｅ ｔ目ラブラットずＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）ペプチドで免疫処理を行い、そ の４４日後にＧｐ−３４９Ｓか、Ｇｐ−３８７−９９のいずれかてＥＡＥを誘導 した。表１７に示されているように、ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）ペプチドに よる免疫処理では、Ｇｐ−３４９Ｓ−誘導性ＥＡＥの程度は著しく低減した。ま た５８７−９９−誘導性のＥＡＥは完全に予防された。いずれの防御グループで も組織学的スコアは低下した訳であるが、ＣＮＳの炎症に対するＴＣＲＶＢ２（ ３９−５９）ペプチドによる免疫処理の効果は、臨床的パラメーターに対する効 果よりも全般的に小さかった。
２、ＴＣＲＶβ８　（３９−５９）ペプチドの免疫処理によるＥＡＥの抑制ＥＡ Ｅの抑制作用を評価するために、ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）ペプチドを脳炎 誘発性用量のＧＰＢＰ、またはＧｐ−３４９Ｓと同時に投与した。表１７に示さ れているように、ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）ペプチドは、はとんどのラット でＧＰＢＰ−誘導性Ｅ　Ａ　Ｅを防止した。また池の動物でも、臨床上の程度を 著しく低下させた。Ｇｐ−３４９Ｓ−誘導性ＥＡＥでも同様な結果が得られた。
一方、ＴＣＲＶＢ１４　（３９−５９）の対照ペプチドは、ＥＡＥに対して抑制 作用を発揮しなかった（表１７）。再度記すが、ＥＡＥの組織学的徴候は、臨床 的徴候よりも、ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）免疫処理の影響を比較的受けにく 無処理のＴ細胞クローンに対して産生されたＴＣＲＶＢ２−特異性抗体１０ｔｈ ｉ＋ｈｉ、　Ｍ、、　ｔｌ　Ｉｌ、、　１．　Ｅ＋ｐ、　Ｔｏｄ、１６８：　２ １５３　（１９８８）：　Ｇｚ＋ｃｏｉｇｎｅ、　m、　Ｒ，１，。
＋ｔ　ｈｌ、、Ｐｔｏｃ、Ｎｚｔｌ　入ｃｘｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳ＾　８４：　２ ９３６　（１９Ｂ？］：　Ｋ凰ｐｐｌｕ、１．　Ｗ、、ｌ１１、ｉ、、　Ｎｙｌ ｏｎ　３３２：　３５　（１９８８）　；に！ｐｐｌｕ、１．　Ｗ、、ｅｌ　＋ １．　Ｃｅ１ｌ　４９：　２６３　（１X８７）； １１＋ｃＤｏｎｉｌｄ、　）１．　Ｒ，、＋ｔ　１１．、Ｎ１ｔｕｒｅ　３３２ ：　４０　（１９８８））は、Ｌｅｔロラット（Ｏｖｈｏｈ堰B ！＋　＋１．、１．　Ｅ！ｐ、　１Ｊｅｄ、１６８：　２１５３　（１９８８１ ）、ＰＬ／ＪＴウス（＾ｅｈｚ−０＋ｂｅ＊　ｃｌ　＋１．B Ｃｅ１ｌ　５４：　２６３（１９１１８］：　Ｕ＋ｂ！ｎ　ｃｌ　！１．．　Ｃ ａ１ｌ　５４：　５７７ｆ１９Ｈ１）のいずれでも、ＥＡＥの予防、処置に有効 であることが実証されている。そこで、合成ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）ペプ チドに対して抗体を産生させることが可能であるのかどうか、そしてそれが可能 であるならば、それが臨床的に有用であるのかどうかを判定することが、非常に 重要となって来た。
そのような抗体を産生させることは、実際可能であった。そして臨床的に効果的 であることが立証された。ＴＣＲＶＢ２　（３１５９）ペプチドに対する抗体は 、ＣＨＡ中１００ｊｌｌの遊離ペプチドを単独注射してから７日目にも、早くも 検出された（表１８）。抗体反応には高い程度の変異が認められたが、抗体力価 は経時的に徐々に高まった。ＴＣＲペプチド−免疫処理を受けたラットで、ＥＡ Ｅの何らかの徴候が進行したのは皆無であった。モして全類が４１日間の観察期 間を通して、健康な状態のまま推移した。
遊離、またはＫＬＨ−結合ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）ペプチドのいずれかで ウサギに免疫処理を行うと、ラットの場合よりもはるかに高い力価の抗体が産生 された（表１８）。抗体力価は６力月間にわたって高い状態のまま推移した。
すなわち１／３２０．０００という稀釈倍率に至るまで、反応は検出された。
４、脳炎誘発性ペプチドの５４９Ｓに対する抗体反応１（ｖｉｉラットに対して ＧＰＢＰ、またはＧＰ−５４９Ｓ　（、残基６９−８４）ペプチドで免疫処理す ると、いくつかの異なったエピトープを認識する抗体が誘導されて（る。その一 つは残基８２−８４　（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ）からＭ、ており、Ｇｐ−３５ ３（残基７５−８４）に結合する抗体によって明らかとなる（Ｄ！！　Ｉｌ　Ｉ Ｉ、、］、Ｎｅｏ＋ｏｌＣｉ、Ｒｅｔ、１８：　２１４　（１９８７）　；Ｈｚ ＋ｈｉａ、　Ｇ、Ａ、、ｌｌ　＋ｌ、。
Ｎ＋ｕ＋ｏ＋Ｃｉ、Ｒｅｉ、１７：　３７５（１９８７））　。それらの抗体反 応は、Ｔ細胞の協力に依存している。すなわちＧＰ−３４９Ｓに特異的な脳炎誘 発性Ｔ細胞からの協力作用である。ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）ペプチドで免 疫処理を行うと、ヘルパーの表現型のＧｐ−３４９Ｓ−特異性Ｔ細胞によって媒 介されるＥＡＥが予防され、また抑制される訳であるが、そのような免疫処理が 抗−３４９Ｓ抗体の形成に及ぼす効果を判定することは重要である。
Ｇ　ｐ　−Ｓ　、４９　Ｓに対する抗体反応は、ＣＦＡ中のＧｐ−３４９Ｓによ る免疫処理後の、早くも７日目にも検出された（表１９）。免疫処理が施された ラットからの定期的な採血より、その後の４８日間にわたって、Ｇｐ−３４９Ｓ とＧｐ−５５３の双方に対しての抗体力価が、著しく高まることが示された。抗 −ｃｙｐ−５５３の反応はＥＡＥが進行し１そして最終的に回復した後になって 、初めて出現した。
ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）で予備的免疫処理が施され、ＥＡＥに対する防御 作用が得られた後、２６日目のＧｐ−８４９ＳとＧｐ−３５３に対する抗体反応 は、ＴＣＰペプチドの処理が適用されなかったラットの場合の、２から４倍とナ ツタ（表１９）。同様に抗−３８７−９９の反応モ、ＴＣＲＶ１３　（３９−５ ９）ペプチドで予備的免疫処理が施され、防御されたラットでは〉４倍高となっ た（表１９）。すなわちＶβ８↑Ｔ細胞に向かった免疫反応により、実際上、Ｇ ＰＢＰのいくつかの異なったＢ細胞エピトープに対する抗体反応か高められた。
５　抗−ベブキト抗体の特異性 いくつかの抗血清の特異性を評価するために、合成ＴＣＲとＧＰＢＰペプチドの パネルに対する結合性を評価した。結果（表２０）はＧＰ−３４９Ｓと、そのＣ −末端フラグメントであるＧｐ−３５３を認識する抗−Ｇｐ−３４９は、Ｇｐ− ５４９のＮ−末端フラグメント（すなわちＧｐ−５６７）とも、その他のＧＰＢ Ｐの領域とも、さらにはあらゆるＴＣＲＶ領域のペプチドとも反応しなかったこ とを示している。同様にＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）ペプチドに対するラット 、ウサギの抗血清は、イムノゲンのみを認識し、他のＴＣＲ配列（ＴｃＲＶＢ８ 　（３９−５９）に存在する３つの重なった残基を含む＝Ａｓｐ−〜Ｓｅ　ｔ　 −Ｇ　ｌ　ｙ）やＧＰＢＰベブ千トを認識するものではなかった。ＴＣＲＶｄ８ 　（３９−５９）ペプチＦｌ：Ｇｐ−３４９Ｓ、　また１ｉＧｐ−３８７−９９ をプラスしたもので、同時に免疫処理されたラットからの抗血清の、各イムノゲ ンに対する特異性は、単独の免疫処理か施されたラット由来の抗血清の場合と、 同程度であることが認められた（表１５）。ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）ペプ チド、およびＧｐ−３４９Ｓに対する抗体反応の特異性は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡにお いて、ペプチド−特異的、用量依存的な結合阻害によって確認された（図１）。
５、ＴＣＲＶβ８　（３９−５９）に対する抗体は、■β８＋細胞を認識するＴ ＣＲＶＢ２　（３９−５９）に対する抗体による調節作用を解釈するには、ペプ チド−特異性の抗体が、Ｖβ８＋と直接的に相互作用するのかどうかを確定する ことが肝要であった。そのような反応性を評価するために、■β８＋性の脳炎誘 発性Ｔ細胞、またはＶＢ２−が主体である正常胸腺細胞をラット、またはウサギ 抗−ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）ＩｇＧ抗体と一緒にインキュベートし、その 後でマウスの抗−ラット、あるいは抗−ウサギ促進抗体と、フルオレセイン−標 識ヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体を加えた。図２に示されているように、ＫＬＨ−結 合ＴＣＲＶＢ３　（３９−５９）ペプチドに対して産生されたウサギＩｇＧは、 ＶＢ２−性脳炎誘発性Ｔ細胞集団の全体において、蛍光強度を高めた（対照の抗 血清に対して、＞　９０９６の陽性）。それに対して正常胸腺細胞集団では、お よそ５％であった。非結合性のＴＣＲペプチドに対して産生されたラットＴｇＧ 。
ウサギＩｇＧも、程度は小さいもののＶβ８＋性Ｔ細胞を選択的に染色した。以 上の結果は、ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）ペプチドに対する抗体は、Ｖβ８＋ 性Ｔ細胞に特異的に結合する能力を備えていることを示している。クロム放出、 染料排除の双方を指標とした場合では、補体の存在下でも、いずれの抗血清もＶ Ｂ２−性ＴＩＢ胞には細胞毒性を発揮しなかった。すなわち抗体結合は細胞を死 滅させることなく、Ｔ細胞機能を変化させることが窺われる。
７　抗−ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）　抗体１：よるＥＡＥの抑制ＴＣＲＶＢ ２　（３！Ｊ−５９）で免疫処理されたＬ＋ｖｉ＋ラットでは、ＥＡＥからの防 御が得られるだけてはなかった。免疫ペプチドに対して特異的な抗体が自流中に 出現した。それらの抗体のＥＡＥの下方−調節における役割を評価するために、 Ｌｕ１ｉラツトに対してＣＦＡ中のＧｌ）−８４９Ｓで負荷を行い、その後でＴ ＣＲＶＢ２　（３９−５９）−特異性１ｇＧによる処理を行った（ラット、また はウサギ）。１２日間にわたって隔日ごとにＬｃｖロラット由来由来１ゲＧ与さ れたラットでは、ＥＡＥの軽度な臨床徴候が進行し、そして脳の組織学的変性が 低下した。しかしを髄の病変は、対照と比へて広範であった（表２１）。ウサギ ＩｇＧの処理を受けたラットで進行した臨床的徴候は、最低度のものであった。
そして組織学的スコアはほとんど変化しなかった（表１６）。すなわち１２日間 にわたる抗−ＴＣＲＶβ（３９−５９）抗体の受動的な投与では、ＥＡＥの臨床 的徴候は抑制されたが、組織学的徴候は抑えられなかった。
Ｃ９考察 今回提示された結果は、合成ＴＣＲＶ−領域ペプチドには、ＥＡＥの誘導を抑制 する特異抗体を誘導する能力が備わっていることを、最初に立証した例である。
それらのＴＣＲＶβ８　（３９−５９）ペプチド−特異性抗体は、完全な、そし て未変性のＴＣＲを備えているＴ細胞に結合可能であるが、その際、それらの細 胞を分解することなく、その機能を変化させる。実施例■に示された結果と総合 してみると、それらの結果は、抗体と細胞−媒介性免疫反応の双方が、ＭＢＰの エピトープに反応して共通した■領域遺伝子を用いる、脳炎誘発性Ｔリンパ球に 対して、独立して免疫調節作用を発揮することを示していると言える。
両調節メカニズムとも、自己免疫性疾患の臨床的徴候の誘導に対して、有効な予 防的作用、抑制的作用を備えている。
Ｍ！＋ｇｘｌ＋ｌ　ｓｌ　！ｌ、およびＲｏｌｈｂ＊＋ａ　Ｅｌ　！１．　（上 記参照）のアルゴリズムに基づいて、優れたＴ細胞イムノゲノであることが予測 されていたＴＣＲＶβ８（３９−５９）ペプチドは、とりわけウサギでは有効な り細胞イムノゲンであることが立証された。抗体は免疫ペプチドに対して高度に 特異的であり（直接反応アッセイと阻害アッセイの双方による）、Ｖβ８＋性Ｔ 細胞のみを染色し、そして■β８↓性Ｔ細胞によって媒介されるＥＡＥを抑制し た。
結論として、合成ＴＣＲＶβ８　（３９−５９）ペプチドは、　Ｌｅマ１１ラッ トにおいてＴ細胞性免疫と抗体産生の双方を誘導した。Ｔ細胞と抗体には単独で 、また協同して、脳炎誘発性負荷に対する免疫応答を調節する能力が備わってい る。
調節Ｔ細胞と防御抗体を活性化する上でのこのＴＣＲ性ペジペプチド力は、それ がヒトの自己免疫性疾患の制御への有用なアプローチであることを物語っている 。
表　１６ ＶａｌＮＩｓＰｈｓＰｈｅＬｙｓ＾５ｎｌｌａＶａ１丁ｈｒＰｒｏＡｒｇＴｈｒ Ｐｒ。
Ｇｐ−ＮＡｃ　（１−１６） Ｈ−＾Ｃ−＾１　ａｓｅ　ｒＧ　ＩｎＬｙｓＡｒｇＰｒｏＳａｒＧ　Ｉ　ｎＡｒ ＢＮ　Ｉ　ｓＧ　Ｉ　ｙＳｅｒＬｙｓＴｙｒＬｅｕＡ　ｌ　■ ペプチドは、すべての方法のセク／ｇノに記述されている通り、固相法で合成さ れ、そしてゲルろ過、高圧液体クロマトグラフィーで精製されたものである。
ＴＣＲ由米のペプチドの番号は、Ｂｕ＋ｕ　ｔｌ　ｒｌ、（前記参照）とＷｉｌ ｌｉｕ＋　ｔｔ　ｒｌ。
（前記参照）に従ったものであり、モルモノトミエリノ塩基性蛋白（Ｇ　Ｐ　Ｂ 　Ｐ）ペプチドには、Ｅ山ｔ　ｒｌ　＋１．　ｆｌ　Ｂｉｏｌ、　Ｃｌｕｍ、２ ４６：　５７７０　（１９７１）ｌに準じた番号が付されている。ペプチドＧｔ ）−（Ｓ−５５−７４）では、６３位のアラニンにスレオニ／が変Ｈり的に置換 されている。
表１７ ＬＨマＩＳラットのグループに対して、表示された処理日（“１ｍｉ”）１こ、 １ノストされている抗原で免疫処理を行った。それぞれのラット１こ対し、１０ ０ｇｇの遊離ペプチドを含むＣＦＡ乳化物０１ｍｌのＳＣ注射を、尻尾の基部１ こ２回行つｔこ。
免疫処理が施されたラットに対し、表示された日（”Ｃｂ＋ｌｌ”）１こ、ＣＦ Ａエマル／ヨ／（０，１ｍ１）として脳炎誘発性ＧＰＢＰ　（５０μｇ）、Ｇｐ −３４９Ｓ（１００ｊｇ）　、Ｇｌ）−（Ｓ８７−９９）（１００μｇ）のし＋ ずれ力＼の注射を、フットパットに行った。疾患の臨床徴候を見るため１こ、ラ ットを連日、屯検した。負荷後２３から２６日にかけて、組織学的検査のため： こ組織を採取した。臨床スコアはグループのラット会頭の平均であり、表１１の 記述に従って評点されたものである。臨床スコアの範囲は括弧内に示されている 。ラットそれぞれの脳（Ｂｒ）、を髄（Ｓ　ｃ）の組織学的スコアは、病変数に 基づいている＋　１＝１−２の病変１２＝３−５　＋　３＝６−８　；　４＝９ 以上の病変が、ヘマトキノリン−染色がなされた脳の矢状方向切片、またはを髄 の全長に存在している。
表１８ ルイス（Ｌ＋ｖｉ＋ｌラット、およびウサギにおける、ＴＣＲＶβ８　（３９− ５９）ペプチドに対する抗体反応雄のＬ＋ｖｉｉラット（２２５〜２５０ｇ）に 対して、ＣＦＡ中１００μｇのＴＣＲＶβ８　（３９−５９）＋１００ｍｇのＭ 、ｂａ１７＋ｉｃａｍの負荷をｓｃｔこ行った。表示されている負荷後の日に、 それぞれのう・ソトの尾静脈より採血した。ウサギ（６１ｂｔ）には、材料と方 法のところで詳細が示されてｔする、一連の免疫処理を適用した。個々の血清の ＴＣＲＶβ８　（３９−５９）＋こ対する抗体反応性を、直接的括弧内はグルー プ当りのすへての抗血清の、抗体反応性の範囲である。すべての血清は、２５ｎ ｇの平板培養用のペプチドに対するア・ツセイに先だって、加熱非動化され、そ して稀釈されている。“Ｎｏｎｅ”と（１つ記述（よ、ＥＡＥの臨床徴候が完全 に欠落していることをｔ旨す。
表１９ ラットに対して１００μｇのＴＣＲＶβ８　（３９−５９）ペプチドによる免疫 処理か、生理食塩水の注射のいずれかを適用し、そして表示されている日に、Ｇ ｐ−５４９ＳかＧＰ　（Ｓ８７−９９）のいずれかを、１１００ｊのＭ、１Ｈ１ ７＋ｉｃｕｍを含んたＣＦＡエマルジョノとして、ＳＣに負荷した。そして表示 されている日に、ラットから採血を行った。ＴＣＲＶβ８　（３９−５９）で免 疫され、そしてＧ　ｐ　−Ｓ　、１９　ＳかＧＰ　（Ｓ８７−９９）のいずれか が負荷されたグループについては、負荷からそれぞれ２６日後と２１日後に屠殺 を行った。個々の血清の抗体反応性を（ペプチド２５ｎｇ／ウェルに対する結合 性）、直接的ＥＬＩＳＡで測定した。結果は、４５０〜６５０ｎ１１（バックグ ラウンドに対して自動的に補正）での平均的Ａｂ＋ｏ＋ｂａｎｃ＋　（Ｘ　１０ ”　）として表示されている。理論上のＡｂｉｏ＋ｂｘｎｃｅ＋　（括弧内に表 示）は、１４０の稀釈倍率に対して補正されたものである。後肢の麻痺（ＨＬＰ ）は失禁と関連していた。疾…が重度であったために、Ｇｐ−３４９Ｓ−負荷ラ ットのうちの２匹が、それぞれ１４日目と１８日目に死亡した。２〜３サンプル についてのグループ内変動は、５％以下であった。
表２０ フクイノトのアジュバントｆｌｏＯＢの−ｂｕｌｌ＋ｉ＋ｕａ）中のＬｏｏｍの Ｇｐ−３４９Ｓ、ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）　、あるいはこれらの双方で、 Ｌｔｖロラノトを免疫処理した。免疫処理後の５４から６２日の間に、抗血清を 調製した。そして２回から４回の免疫処理が施されたラットより、高力価の抗血 清プールを作製しｒコ。ウサギ抗血清については、ＫＬＨに結合したＴＣＲペプ チドで免疫処理を行ってから、４３日後に分離した。血清はすべて３０分間５７ ℃で、加熱−非動化されたものである。表示されている稀釈倍率における、様々 なペプチド抗原に対する抗体反応性を、パーオキシダーゼ標識−ウガギ抗−ラッ ト、もしくは板尾拌用のペプチドが存在Ｌｆｊい場合のバックグラウンドの反応 性に対して、自動的に補正されたものである。括弧内の数字は、１：１６０の稀 釈倍率上して算出された、理論上の＾ｂ＋ｏ＋ｂ＋ｎｕ値である。
表２１ 抗−ＴＣＲＶω８　（３９−５９）抗体が受動的に移植されたルイス　ラットに おける、ＥＡＥの抑制御 １　採血　０ロブ　１ｏ１６ Ｊ　採血　１２日月　５００　３４ １００ａｇのＧｐ−８４９ｓと、ｌ　Ｏ（ｂｇ）ｌＪ、Ｂｕ１７＋ｉ＋ｕｍを含 む１００ｇ／（Ｄエマルノヨノをフットバッドに注射することで、Ｌ＋ｖｉ＋ラ ットにＥＡＥを誘導した。
誘導の初日から１２日間にわたって隔日ごとに、試験グループに対して、ＴＣＲ Ｖβ８　（３９−５９）が免疫処理された個体に由来する、７■のＬａｗロラッ トＩ　ｇＧ　（１７Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ　Ｕｎ山／ｍｇ　ＩｇＧを含む）か、 または１０■ウサギＩｇＱ（６５７０Ａｂ＋ｏ＋ｂａｎｕ　（ｌｎｉｌ＋／ｍｇ 　ＩｇＧを含む）を投与した。ｒｇＧについては生理食塩水に溶解し、そして腹 腔内に注射した。非−免疫処理ラット、ウサギのＩｇＧは、ＥＡＥの経過に何ら 影響しなかった。ＥＡＥの臨床徴候に留意して、全類を連日点検した。また表示 されている日に、尾静脈からの採血を行った。直接的ＥＬ　Ｉ　ＳＡで、血清中 のＴＣＲ，またはＧＰＢＰに対する抗体の検査を行った（結果は＾ｂ＋ｏ＋ｂａ ｎｕ　ｘ　１０　である）。ＥＡＥ誘導後の２４日目に、全類を屠殺した。そし て脳（Ｂｒ）とを髄とを採取し、表１７の凡例中の詳細に準じた組織学的検査に 供した。
ＧＰＢＰにょるＥＡＥの誘導後様々な時に、疾病の経過を阻害するために、ＳＣ （ア／ユバント中）またはＩＤ（生理食塩水中）のいずれかに与えられた丁ＣＲ ＶＢ２　（３９−５９）の可能性を試験した（表２２）。実験１ては、ＴＣＲベ ブ壬トは１０日（ライン２）にまたは１つのグループ中の最初のラットの発症時 （ライン３及び４）にＥＡＥの臨床的な徴候を示したときに投与された。
どちらの場合も、ペプチドの注入の両方のルートで、疾病期間の大きな減少かあ ったか、発病度または発症時間においてはそうてはなかった。ＩＤルートを通し て生理食塩水中で与えられたペプチドの効率は人間の治療に対して特に重要てあ り、アノユバシト中のｓｃ注入よりも好ましい。
実験２では、ＴＣＰペプチドの１０投与の時間を投与ト共に、変化させた。
表２２に示されるように、０日（ＥＡＥ誘導日）、７日または１１１日に投与さ れた５＋１ｚｇのペプチドにより、疾病の期間の大きな減少があった。疾病の発 症の遅れち観察された。さらに、疾病の徴候を示す動物の割合が減少した。ペプ チドの投与ト多く　（２００μｇ）なると、投与ト少ない場合に比べ効率が悪く なるが、おそらく、ＴＣＰにχ・ｔヒて生した免疫応答を含むであろうペプチド の短期過負荷によるものであろう。無関ＪＴＣＲに対応する回し大きさのペプチ ドで処置すると、発症、発病度、ＥＡＥの発生率に何の効果もなかったか、幾分 期間は減少しなかもしれない（表２２の最終ライン）。
実施例■ 疾病誘導後１３Ｂ１：ＥＡＥＩ：対するＴＣＲＶＢ８（３９−５９）ペプチド処 置をしたラットの排水ＬＮ（膝か）におけるＴ細胞の増殖性応答及び特異性を試 験した（表２３）。０日に、ルイスラットは後ろ足にＧＰ−ＢＰ＋ＣＦＡ　ＳＣ のＥＡＥ−誘導摂生を受けた。１３日に、それらのラットを３つのグループに分 ケ、生理食塩水（列１）　、後口足ノｓ　Ｃ１：１００ａｇ＋７）ＴＣＲＶＢ２ （３９−５９）ペプチド（＋ＣＦＡ）　、または耳介のＩＤに生理食塩水中の５ ０μｇのＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）ペプチドのいずれかを受けた。２０日、 ＥＡＥの発症後約７日に、膝かＬＮが除去され、指示された抗原またはマイトジ ェンに対する応答におけるＴ細胞増殖活性が直接試験された。
対照標準ラットからのＬＮ細胞がＣｏｎＡ、ＰＰＤ、ＧＰＢＰおよびＧＰＢＰ（ ７２−８９）、およびＧＰＢＰ　（４５−８９）（７２−８９配列および別の免 疫原性であるが非−脳炎誘発性であるペプチドを含む）に対して最もよく応答し た。これとは対照的に、ＣＦＡ中のＴＣＲペプチドを投与されたラットからのＬ Ｎ細胞はＧＰＢＰまたはどのＢＰ断片に対しても重要な増殖性応答を示さなかっ た。ＴＣＲペプチドによりＩＤ処置されたラットからのＬＮ細胞は、ＧＰＢＰ　 （９０−１７０）に対する応答が減少した点を除いては、対照標準細胞と同様の 応答をした。さらに、後者のグループはＧＰＢＰ　（９０−１７０）　、脳炎誘 発性であるとは知られていない、に対して応答の増加を示した。これにより、エ ピトープスイノチノグが起きたことか示される。上記３グループのＬＮ細胞のそ れぞれのアリコツトをＧＰＢＰまたＴＣＲペプチドにより３日間、培養物中で刺 激し、細胞をさらに５日間［Ｌ−２中で膨張させた。これらの選択したＴ細胞の 様々な抗原およびマイトジェンに対する増殖性応答を以上のように試験した。
その結果を表２４に示す。
Ｘ、を昭標ｌｌ＄ａＴＷＥＪ胞（表２４、列Ｌ）　はＧＰＢＰ、ＧＰＢＰ　（７ ２−８９）、ＰＬおよびラットＢＰ（ＣＮＳ中ての相同の認識を示す）に対して よく応答した。表の最終ラインは、このグループのＴ細胞が特定の投薬を受けて いないラットに注入された場合、脳炎誘発性であったことを示す。
ＣＦＡ中、ＳＣのＴＣＲペプチドにより処置され、ＧＰＢＰを含む培養において 選択された動物のグループからのＴ細胞（列２）はＧＰＢＰ、ＧＰＢＰ　（７２ −８９）およびラットＢＰに対して、応答が不十分であった。ＧＰＢＰ　Ｐｌに 対する応答は、ＧＰＢＰ　（７２−８９）に対する応答が弱かったので、明らか に第２の（非−脳炎誘発性）エピトープによるものであった。７日暮ａ＜このペ プチドを用いてさらに選択はされない）と示されたＴＣＲペプチドに対する強い 応答は抗−ＴＣＲペプチド免疫に対しては十分であった。これらの細胞がＥＡＥ を伝達てきないという観察は非常に重要であり、脳炎誘発性クローンはＧＰＢＰ の存在下での培養中には選択することができないことを指示している。
上記ＴＣＲ−免疫動物からの細胞は、ＧＰＢＰ　（列３）よりむしろＴＣＲペプ チドを用いて生体外で選択された場合、ＴＣＲペプチド（およびもちろん、Ｔ細 胞マイトジェン、ＣｏｎＡ）に対してのみ応答するようであった。
最終的に、ＴＣＲペプチドＩＤで処置され、ＧＰＢＰを用いた培養において選択 されたラットからの細胞（列４）は、本質的には、対照標準細胞のような挙動を 示した。すなわち、それらはＧＰＢＰ　（７２−８９）脳炎誘発性エピトープを 認識しＥＡＥを伝達することができた。これにより、脳炎誘発性Ｔ細胞前駆物質 がまだこのようにして処置されたラット中に存在し、培養中に選択されることが できたことが示される。これにより、ＴＣＲペプチドＩＤで処置されたラットに おいて見られたＥＡＥの期間の減少（実施例３および表２２７照）はＬＮ細胞の 排水の調整を含まない可能性が示唆される。しかしながら、ＩＤ注入部位を排水 するＬＮ（すなわち、［）注入が耳介においてなされた時の頚ＬＮ）は異なる調 整特性を示す可能性があることに注意することが重要である。
表２３ ＴＣＲＶＢ２　（３９−５９）　３１　３９　３０ＧＰＢＰ　（４５−８９）　 ４８　５０　４９ＧＰＢＰ　（１−３８）　３０　４７　３４ＧＰＢＰ　（９０ −１７０）　３６　５４　４４の取り込みとして示される。
実施例Ｘ Ｔ細胞受容体Ｖ領域ベプ千ドによる実験的な自己免疫脳を賢夫の処置ミニリン塩 基性タンパク質（ＭＢＰ）によるラットおよびマウスの免疫化により制限された 範囲のＴ細胞受容体Ｖ領域遺伝子を示す脳炎誘発性Ｔ細胞が誘導される。前の実 施例では、はとんどの脳炎誘発性ラットＴ細胞クローンが共有するＶβ８配列か らの合成ペプチドは特異的な調節性Ｔ細胞および抗体を刺激することによりＥＡ Ｅに対する防御を誘発することが説明されている。この実施例では、同じＴＣＲ ペプチド、これはＶβ８配列の３９−５９残基に対応し第２の相補的な決定領域 を含むが、ＥＡＥに対する治療として高い効果を持つことを説明する。
ＴＣＲＶＢ２−３１５９は、中程度のＥＡＥを有するラットに対し完全なフロイ ノドアツユバント中でｓ、ｑ、　に与えられると、疾病の進行を停止さ仕、疾病 の過程を大いに短期化した。ＴＣＲペプチドが耳中のｉ、ｄ、に与えられると、 効果が１日遅れるが、再び、臨床的な徴候のより早い消散に導いた。処置された ラットからのＭＢＰ−選択Ｔ細胞ラインはＭＢＰに対する応答が不十分てあった が、ＴＣＲペプチドに対する反応性は残っており、通常の受容体に伝達すること ができなかった。ＴＣＲペプチドの迅速な臨床効果により、予め存在する調節ネ ットワークのトリガリングがＥＡＥの発生により喚起されることが示唆された。
この概念を支持するものとして、この実施例において、ＥＡＥにかがっている無 処置ラットにおけるＴＣＲペプチドのＴ細胞認識の直接の証拠を示す。
材料および方法 ｙ！！：６−８週の雌のルイスラットをＨ！山ｎ　Ｓｐ＋＋ｇｏ＋　Ｄｉｖｌｃ ｙｌｎｄｉ＋ｎ＋ｐｏｌｉｉ。
ＩＮ）から手に入れた。ラットは、連邦政府および施設のガイドラインに従って 、ボートラッドＶ　Ａ　Ｍ　Ｃ動物資源施設で、収容し、維持した。
ＫＲ：　Ｅ　ｙ　Ｉ　ａ　ｒ　（Ｅ７１ａ＋、Ｅ、　Ｈ，、達、生物化学ジャー ナル２＋６：　５７７Ｑｆ１９７１）１の方法に従い、ＧＰ−およびＲｔ−ＭＢ Ｐを抽出し、精製した。１−３７゜４３−８９および９０−１６９残基を取り囲 むＧＰ−ＭＢＰの酵素開裂断片、７２−８９残基に対応するＧＰ−ＭＢＰの合成 ペプチドおよびＴＣＲＶＢ２およびＴＣＲＶβ１４の３９−５９残基に対応する 合成ペプチドを、前述（Ｖ＋ｎｄ＋ｎｌ＋＋＋を違、ネイチ＋−３４１：　５４ １ｆ１９８９１：　５１ｕ達、生物化学’；ヤー＋ル。
：！＋６５７７０ｆ１９７１））のように合成し、精製した。これらのペプチド は高圧液体クロマトグラフィー分析では〉９０％の純度であった。
臨床プロトコル　ＥＡＥは、１１００ｊの熱で殺したＭ　結核菌Ｈ３７ＲＡ＋Ｄ ＩＦＣＯ，デトロイト、ミシガン）を含む完全なフロイノドアシュバット中の５ ０■のＧＰ−ＭＢＰの１つの後ろ足ての一度の皮下（ｓ、Ｑ、　）　ｕ射により 、全ての実験で誘導された。予防プロトコルでは、ラットは１１００ｊのＭ、結 核菌を含むＣＦＡ中の１１００ｊのＴＣＲＶＢ８−３９−５９またｌ！ＴＣＲＶ Ｂ１４−３９−５９により、ＥＡＥ誘導の４０日前に１つの後ろ足に皮下注射さ れた。抑制プロトコルでは、ＴＣＲペプチドが、ＧＰ−ＭＢＰにより誘発された 後に、同時に（ＣＦＡ中１００μｇが皮下に、または０．１ｉ１生理食塩水中５ ０μｇが耳の皮肉に）、７日（皮肉に）に、または１１日（皮肉に）に注入され た。処置プロトコルでは、ＴＣＲペプチドがＥＡＥの臨床的な徴候が見られた最 初の日（通常、ＢＰ−ＭＢＰによる誘発１２日後）に、ＣＦＡ中で皮下にまたは 耳の皮肉に与えられた。動物はＥＡＥの臨床的な徴候に対し、０〜４の評定尺度 を用いて、毎日、評点をつけた。評定尺度では、０＝徴候なし；１＝尾の弱り、 ２＝後ろ足の弱り、運動失調、３＝後四分体の完全麻痺、４＝前および後四分体 の完全麻痺、瀕死の状態である。処置グループは、生徒達の対になっていないｔ −テストにより、最大疾病発病度および臨床的の徴候の期間の違いに対して、対 照グループと比較された。遅れる型の過敏症反応は５０＃ｇの抗原の皮肉注射２ ４時間および４８時間後の耳の膨化分析（オフナー達、実験医学ジャーナル１７ ０：　３５５＋１９８９））により測定した。ＧＰ−ＭＢＰ特異Ｔ細胞ラインは 前述（ヴアンデンバーク達、免疫学ンヤーナル、１３５１２２．１！１９８５） ）　したＴＣＲペプチド処置ラッうおよび未処置ラットから選択した。１０００ 万のＢＰ−ＭＢＰ活性活性細線細胞脳炎誘発活性に対して試験するために投薬を 受けていないラットに、１．ｐ、で伝達され、活性化的に誘導されたＥＡＥに対 し上記のように評点がつけられた。
万の照射胸腺補助細胞の存在中で５００．０００のリンパ節または２０．０００ の線細胞が、０．５μＢｑの標識チミジンか添加される前に、１８時間の間マイ クロタイタウエル中で培地および抗原と共に培養された。細胞培養物はガラスフ ァイバフィルタとに取り入れられ、液体ノンチレーノヨン技術により計数された 。平均ＣＰＭか３つの培養物から計算された。復製培養物の標準偏差（ＳＤ）は 平均値から＜ｔｏ’ｓの変動たった。
Ｂ結果 ＴＣＲペプチドのＥＡＥに対する調節効果を評価するために、■β８−３１５９ ペプチド、対照ペプチドＶβ１４−３９−５９、あるいは生理食塩水を、脳炎誘 発性エマルノヨ７ＧＰ−ＭＢＰ／’ＣＦＡの注入の前に、と同時に、の後に注入 した。最も効果的な予防、抑制および処置プロトコルの平均の日々の評点を図３ 〜５に示す。試験した全てのグループは表２５にまとめる。
Ｔ　ＣＲｙ′ＣＦ　Ａの臨床効果　ＧＰ−ＭＢＰにより誘発される４０日前にＣ ＦＡ中のＶＢ２９−５９ペプチドを注入すると、臨床的なＥＡＥに対して完全な 予防か誘導された（図３）。さらに、脳炎誘発性エマルションと共にＣＦＡ中の ペプチドを同時注入すると、ＥＡＥが抑制され、発生率（処置グループ８／１３ に対しχ・１照グループ２６７・２６）、発病度（評点か１．３に対し３．４） および臨床的な疾病期間（２，０日に対し６６日）が減少した（図３、表２５） 。ＥＡＥ誘導の４０日前あるいはそれと同時にＣＦＡ中のＶＢ１４−３９−５９ ペプチド、またはＣＦ　Ａたけを注入されたラットは、対照とは異なるＥＡＥを 発現した（表２５）。
その治療的効果を評価するために、ＣＦＡ中のＴＣＲＶＢ２−３９−５９ペブ壬 トを、最初の日または臨床的な徴候の発症時にラットに皮下注射した。この処置 の時のラットは後ろ足の弱り、運動失調および失禁を示した（平均グレート１、 　８）。図３に示されるように、ＴＣＲペプチド／’ＣＦＡを用いた処置により 、臨床的な徴候がさらに進むことか阻止され、ＥＡＥの期間が６．６日（対照） から３５日に短期化した。ＴＣＲＶＢ１４−３９−５９またはＣＦＡだけて処置 すると臨床的なＥＡＥには何の効果もなかった（表２５）。
皮肉に与えられたＴＣＰペプチドの臨床効果　ＣＦＡの使用を避けるために、Ｔ ＣＲペプチドの生理食塩水を耳の皮肉に投与した場合のＥＡＥに関する効果につ いて評価した。脳炎誘発性誘発と同時に（０日）、誘発後（７日または１１日） に、５０日ｇのＴＣＲペプチドを皮内投与すると、全てＥＡＥに関し同様の抑制 効果を有し、最大臨床発病度が３．４から１７〜１．８に減少し、ＥＡＥの期間 が６．６日から３〜４日に短期化した（表２７）。
ＴＣＲペプチドが臨床的な徴候（平均臨床評点１．９）が始めて認められた日に 注入されると、最初の日にはＥＡＥに関する臨床効果は見られなかった；しかし ながら、その後の日にちの間に、ＥＡＥの発病度が対照に対し著しく減少した（ 図５）。対照に対する６、６に比べ、５０βｇ／ラット投与量のＴＣＲペプチド により、より低いＬｏｎｇ／ラット投与量のペプチド（４，０日）よりも、ＥＡ Ｅの消散かより早くなった（３．１日）。
臨床的なＥＡＥを消散させるＴＣＲＶＢ２−３９−５９ペプチドの迅速な効果に より、ペプチドによる処置が、最初にＥＡＥに対し誘導された、ＴＣＲに対する 再生応答を誘発する可能性があることが示唆された。生体内でこの可能性を証明 するために、Ｇ’Ｐ−ＭＢＰ／ＣＦＡ　（予め、ＴＣＲペプチドに暴露しない） により誘導されたＥＡＥを受けているまたはそれから回復したう・ソトはＶβ８ ペプチドに対しては重要なりＴＨ応答を有した（何の投薬も受けてないまたはＣ ＦＡ免疫化ラットに比べｐ＜０．０１）が、■β１４ペプチドに対しては有さな かった（表２６）。ＥＡＥにかかつているラットのＶβペプチドに対する応答の 大きさは、ＣＦＡ中のＴＣＲペプチドの防御摂生により予め免疫化されたラット における反応よりも明らかに小さい（表２６）。
防御う、・１・におけるＴ細胞応答　Ｔ細胞応答に関するＴＣＲＶβ８ペプチド 治療の効果を評価するために、ＧＰ−ＭＢＰ／ＣＦＡ注入部位を排水するリンノ く筋細胞（ＬＮＧ）を、抗原誘導増殖に対し試験し、その後Ｔ細胞ライン中に拡 大させた。表２７に示されるように、ＶＢ２−３９−５９で処置されたラットか らのＬＮＣは高レベルのバックグラウンド増殖（４７，ＯＯＯＣＰＭ］およびＧ Ｐ−ＭＢＰおよび他の試験抗原に対する同様の応答を有した。ＧＰ−ＭＢＰ（〜 ｉＢＰ／ＩＮ）により選択されたＴ細胞ラインは選択抗原に対して弱く応答し、 Ｒｔ−ＭＢＰおよびＧＰ−３７２−８９に対しては全く応答しなかった。このラ インの最も高い応答はＴＣＲＶＢ２−３９−５９ペプチドに対してである。弱い ＧＰ−ＭＢＰ認識および強いＴＣＲＶＢ２−３９−５９応答により、Ｔ細胞ライ ンがＥＡＥの臨床的な徴候を何の投薬も受けていないラットには伝達することが できないことは驚くに値しなかった（表２７）。同様のパターンの高いＴＣＲ応 答およびＧＰ−ＭＢＰおよび他の抗原に対する低い反応性がまた、ＴＣＲＶＢ２ −３１５９により選択されたＴ細胞ライン（Ｖβ８／１＋＋）で観察された（表 ２７）。
これとは対照的に、未処理のＥＡＥ−回復ラットからのＬＮＣはＧＰ−ＭＢＰ。
Ｒｔ−ＭＢＰおよびＧＰ−３７２−８９に対し予言通り応答した（表２７）。し かしながら、これらのＬＮＣがまた、ＴＣＲＶＢ２−３９−５９ペプチドに対し 反応し、より程度は低いがＴＣＲＶＢ１４−３９−５９に反応したのは予想外で あった。Ｇ　Ｐ　−Ｍ　Ｂ　Ｐを用いて選択された場合、その結果得られるＴ細 胞ラインはＭＢＰエピトープに強く反応し、ＴＣＲＶβ８ペプチドの低レベル残 存活性にも関わらず、ひどい臨床的なＥＡＥを何の投薬も受けていない受容体に 伝達した（表２７）。さらにＴＣＲＶβ８ペプチドを用いて選択すると、このＴ ＣＲペプチドに対する特異的な応答が増幅されるが、ＧＰ−ＭＢＰおよび３７２ −８９に対する低レベルの応答は持続された。さらに、ＴＣＲＶβ１４ペプチド を用いた選択により、Ｖβ１４活性Ｔ細胞だけが増幅された。このように、両方 のＴＣＲ−選択ラインでは、応答パターンがＥＡＥ−回復ラットのＬＮからのＴ ＣＲ活性Ｔ細胞の存在を証明した。図８に示されるように、強いＤＴＨおよび増 殖性応答が反応性ＴＣＰペプチド／’　ＣＦ　Ａにより予め免疫化した動物で見 られた。ＴＣＲＶβ１４ペプチドではなくてＴＣＲＶβ８ペプチドにより予め免 疫化されたラットはその後のＧＰ−ＭＢＰ／ＣＦＡによる誘発から防御された。
ＴＣＲＶβ８ペプチドに対する重要なりＴＨおよび強い増殖性応答はまた、合成 ペプチドにより決して免疫化されなかったＥＡＥから回復したラットにおいて見 られた。これにより、ＴＣＲＶＢ２−ペプチドに対する自然の調節性応答がＥＡ Ｅの疾病過程の結果、誘導されることが示された。
別のよく知られたＭＳモデルはマウスにおけるＥＡＥである。ラットとは対照的 に、臨床的な経過を再発させる特徴を有する。６　Ｓ　Ｊ　Ｌ／Ｊマウスのグル ープにＣＦＡ中のプロテオリビドアボ蛋白（Ｐ　Ｌ　Ｐ）の１３９−１５１ペプ チドを注入した。臨床的な徴候の発症の最初の日（１４日）に、マウスはｉ、ｖ 、、ｉ、ｄ。
によりまたはＳｑ、投与によりＴＣＲＶβ１７配列の１−１７残基に対応する５ ０ｊｇの合成ペプチドを受けた。図９に示されるように、ＴＣＲペプチドのｓ、 ｑ、およびｉ、ｄ、注射の両方により、最初のエピソードおよび再発ＥＡＥにお いて、発病度が減少し、疾病の期間が短期化した。
Ｃ１結論 この実施例は、ＥＡＥにおけるＴＣＲＶＢ２−３９−５９の治療上の投与につい て明確に説明しているが、ＥＡＥを予防し抑制する際のＴＣＲペプチドの効果を 実証する前の実施例と一致している。ＴＣＲペプチドに対するＤＴＨおよびリン パ球増殖応答と同様に、迅速な臨床効果により、ＴＣＲＶβ８ペプチドに対する Ｔ細胞応答が、意図的には合成ペプチドでは決して免疫化されなかったＥＡＥを 経験したラットにはすでに存在したことが示される。
Ｇ　Ｐ　−Ｍ　Ｂ　Ｐ誘発の４０日前にＣＦＡ中のＶβ８ペプチドで予め免疫化 したものが、試験した最も効果的なプロトコルであった（図３および表２５）。
この免疫化期間がＴＣＲＶβ８ペプチドに対する防御Ｔ細胞および抗体を誘導す るのに最適であるのは明らかである。ＧＰ−ＭＢＰ誘発と同時にＴＣＲＶβ８ペ プチドを注入すると、予備免疫化よりも防御性が低くなるが、このプロトコルは 依然として、３０％（６／１９）以上のラットにおいてＥＡＥの全ての臨床的な 徴候を完全に抑制した（表２５）。残りにおいては、ＥＡＥの臨床過程はより短 くより弱くなった。臨床的なＥＡＥの発症前ではなく、ＧＰ−ＭＢＰ誘発後にＴ ＣＲＶβ８ペプチドを注入することも効果的であり、完全に４／１９のラットに おいてＥＡＥの発症を予防し、残りにおいては、一般に疾病発病度が減少し、期 間が減少した（表２５）。
この実施例の驚くべき点は、病気の動物に注入されたＴＣＲＶβ８ペプチドの臨 床的効果がほとんど即時であることである。ＴＣＲペプチド治療を受けた全ての ラットが対照より早＜ＥＡＥから回復した。ＣＦＡ中のＴＣＲペプチドを注入さ れたものは、回復前に臨床的に進行しなかった。皮肉にＴＣＲペプチドを注入さ れたものは最初の日は進行したが、その後ＴＣＲ／ＣＦＡ注入ラットと同じ早さ で回復した。１０ａｇおよび５０ｇｇのペプチドの投与両方により、回復が早め られたがより投与量を高くすると、投与量の少ないものより１日早＜ＥＡＥが消 散された。
ＴＣＲペプチド治療はＧＰ−ＭＢＰの脳炎誘発性決定因子に対するＴ細胞応答を 下方調節することにより効果的になることは明らかたった。ＧＰ−ＭＢＰ誘発、 ＴＣＲペブ千ド処置ラットからのリンパ節細胞は高レベルの増殖性細胞を有した が、特異的なりＰ応答は有しなかった（表２７）。しかしながら、ＧＰ−ＭＢＰ により選択されたＴ細胞ラインはＧＰ−ＭＢＰおよびＴＣＲＶβ１４ペプチドで はなく、ＴＣＲＶβ８ペプチドの存在中で増殖したが、これ（こより、エフェク ターおよび調節Ｔ細胞特異性の両方の存在が示される。この細胞混合物かＥＡＥ を伝達することができなかったことは、ＧＰ−ＭＢＰ反応細胞（正味１２．００ ０ＣＰＭＩまたは５７２−８９反応細胞（正味３．　ＯＯＯＣＰＭＩに対するＴ ＣＲＶβ８３８反応細胞味４９．　ＯＯＯＣＰＭ）の見かけ上の優勢によるもの であろう。対照的に、最初にＧＰ−ＭＢＰにより誘発されたがＴＣＲＶβ８ペプ 壬トによりｆｆ１ｌ！されていないＥＡＥ回復ラットからのＬＮＣは、ＧＰ−Ｍ ＢＰ。
Ｒｔ−ＭＢＰ、３７２−８９お、Ｉ：びヨリ低い程度てＴＣＲＶＢ８およびＴＣ Ｒ■β目ペブ壬トを認識した（表２７）。ＧＰ−ＭＢＰにより選択されたＴ細胞 ラインは、おそら＜ＧＰ−ＭＢＰ反応性Ｔ細胞（正味８４．　０ＯＯＣＰ１１１ がＴＣＲＶβ８−反応性Ｔ細胞（正味９．　０ＯＯＣＰＩＩ）に対し優勢である ため、脳炎誘発性か高かった。（：；ｐ−ＭＢＰにより選択されたライン中のＴ ＣＲＶβペプチド反応性Ｔ細胞の持続性は、１つの抗原により選択されたＴ細胞 ラインは全ての他の抗原に対する応答を失うという点において、幾分普通ではな （１゜ＧＰ−ＭＢＰおよびＴＣＲＶβペプチドの間で、交差感受性は検出されな かった。
ルイスラフトは、Ｅ　Ａ　ＥかＭＢＰ／’ＣＦＡにより誘導されると、自然（こ 再発することはない。二のＥＡＥの一相性の過程のため、再発疾病に対するＴＣ ＲＶβ８−３９−５９ペプチド治療の試験ができないが、この系における強０回 復メカニズムがＴＣＲＶβ８ペプチドに対する免疫応答を含むか否かを決定する 機会は与えられる。ＭＢＰの脳炎誘発性決定因子（７２−８４または８７−９９ 配列〕のどちらかに応答するルイスラットＴ細胞はそれらのＴＣＲ中のＶα２／ Ｖβ８遺伝子結合を優先的に利用する。弱毒化脳炎誘発性Ｔ細胞の注入１こより 、イディオタイプおよびエルゴタイプ応答と共に、ＥＡＥに対する防御力く誘導 される。Ｅ・＼Ｅ中に誘導された脳炎誘発性Ｔ細胞の増加度数は調節ネットワー クを混乱させるのと同様の効果を有するであろう。また、このネットワークの少 なくとも一部が自然にＴＣＲＶＢ２−３９−５９に向けられていると考えられる 。
本データはこの主張を支持する。ＴＣＲＶβ８ペプチドを１．ｄ、投与された、 病気のまたは回復したラットはこのペプチドに対して小さいが重要なりＴＨ応答 を何したが、対応するＶβ１４ペプチドに対してはＤＴＨを有しなかった（表２ ６）。さらに、回復したラットからのリンパ節細胞はＶＢ３　ＴＣＲペプチドに 対する応答がよりよく、どちらかのペプチドに特異的なＴ細胞が生体外選択技術 により強化することができた（表２７）。同時に、これらの発見は脳炎誘発性Ｔ 細胞により表されるＴＣＲＶＢ２−３９−５９配列に対する免疫の自然誘導に対 する直接の証拠を提供する。しかしながら、これは、ＴＣＲαまたはβ鎖内の他 の配列もまた調節性Ｔ細胞および抗体を誘導するので、ＴＣＲに関する唯一の重 要な決定因子てはないだろう。ＴＣＲＶＢ２−３９−５９領域の防御、抑制およ び治療効果により明確に、それがＥＡＥのイディオタイプの調節に対する決定因 子として重要であることが証明される。
さらに、ＥＡＥの二相性臨床過程を経験する５ＪＩ１．／Ｊマウスに対し示され たデータにより、臨床的な徴候か発症した時にＴＣＲＶβ１７ペプチドを投与す ると、最初のエピソードおよび再発の両方の間の症状の発病度および期間が減少 することが証明される。これにより、ＥＡＥに代表される自己免疫疾病の処置に おける道具として、ＴＣＲＶβ領域のペプチドが重要であることがさらに支持さ れる。
表２６ ”ｌ）＜０．　０１　対　何の投薬も設けてないまたは生理食塩水／ＣＦＡ免疫 対照標準 ＤＴＨ応答は何の投薬も受けていないルイスラットまたは予めＴＣＲペプチドに 暴露せずにＧ　Ｐ　−Ｂ　Ｐ／ＣＦ　Ａあるいは生理食塩水／ＣＦＡで免疫化し たラットにおいて評価した。同様に、ＴＣＲＶＳ８−３１５９／ＣＦＡまたはＴ ＣＲＶβ１４−３９−５９／ＣＦＡにより免疫化されたラットをどちらかのペプ チドを用いて試験した。耳の膨潤応答（ＤＴＨ）をｉ、ｄ、注射４８時間後に測 定した。括弧内に、試験した動物の数を示す。
表２７の脚注 ａ　処置ラットには、ＧＰ−ＢＰ／ＣＦＡにより１２日前に誘導された臨床ＥＡ Ｅの最初の日に５０日ｇのＴＣＲＶＳ８−３−５９ペプチド／ＣＦＡを、Ｓ。
ｑ、注射した。未処置ラットはＧＰ−ＢＰ／ＣＦＡだけを受けた（図１参照）。
、ｂ　未処置グループがＥＡＥから回復した（２１日）後に収集したＩ、Ｗ、細 胞をＧＰ−ＢＰ、ＴＣＲＶｉａ−３９−５９ペプチドまたはＴｃＲＶＳ１４−３ ９−５９ペプチドにより刺激し、指示された抗原（ＢＰ／ｌ＋ｌ、Ｖβ８／ｌｔ ＋またはＶβ１４／ｉｌｌと指示）により再刺激する前にＩ　Ｌ−２中で膨張さ せた。ＥＡＥ伝達研究に対しては、処置（防御）および未処置グループからの１ ０２ＧＰ−ＢＰ活性化Ｔ細胞が何の投薬も受けていないう・ソトにｉ、ｐ、注入 された。
下線付きの値は対照培養に対する大きな差を示す。
ＳＪＬ／′Ｊマウスでは、ＰＬＰペプチド包囲残基、１３９−１５１は、全ＣＮ Ｓで優性決定基であり、重篤な再発生ＥＡＥを誘発する。生殖細胞系列Ｖβ遺伝 子のほぼ半数が、このマウス系統で検出されており、ミニリン塩素性タンパク質 に応じて他の逼歯系列が選択的に用いるＶＳ８も含まれる。このように、脳炎誘 発性Ｔ−細胞によって用いられる他の■遺伝子は多様にあるが偏倚は左程明白で ない。
ＰＬＰ１３９−１５１ペプチドに特異性の脳炎誘発性Ｔ細胞系列でのＴＣＲＶ遺 伝子の分析で、ＶＳ２．ＶＳ４およびＶＳ１７の存在が示され、その系列から得 たクローンは、このようなＶ　ｅｉ域遺伝子を表現することがわかった。この論 拠により、ＳＪＬ／Ｊマウスは、臨床症状の第１ロブに１００＃ｇＶβ４ペプチ ド（残基４２−６３）　、１００ｕＶβ１７ペプチド（残基１−１７）、両方の ペプチドの１１００ｊのいずれかて、皮下的に処置した（図１５）。
ＶＳ２−かＶＳ１７−ペプチド残基のいずれかで処置したマウスは、最初は重度 の低い疾患を発現していたが、後の方の臨床経過は、未処置の対照群と類似して いた。ＶＳ２とＶＳ１７の両方で処置したマウスでは、対照動物が重度のＥＡＥ を発現していた期間中は、臨床的な進行はなかった。その後この群は、対照群に 比して有意に低い疾病スコアを維持した（図１５）。
このようなデータは、多数のＶ領域遺伝が脳炎誘発性Ｔ細胞応答に巻き込まれる と、ＴＣＲＶ領域ペプチドのカクテルの方が、ペプチドの単品より効果的である ことを明示している。それゆえに、潜在的な脳炎誘発性分子への応答で、過度に 利用されたＴＣＲＶ領域ペプチドの混合物で、多発性硬化症のようなヒトの疾患 を治療するのは、単一のペプチドによる治療より有効であるかもしれない。
このような知見は、２つの異なるＶ遺伝子（Ｖβ５．２と６．１）がＭＳ患者か らのＢＰ−反応性Ｔ細胞により過剰利用されるという実施例ＸＩでの証明に基づ いて、特に重要かつ適切である。
ルイスｊＬｈｖ口）ラットでの実験的自己免疫脳を賢夫（ＥＡＥ）は、掻めて明 白に塩基性タンパク！（ＢＰ）である中枢神経系（ＣＮＳ）　ミニリン・タンパ ク質に特異的なＴリンパ球が介在する単相性自己限界性麻痺（性）疾患である！ Ｖｚｎｊｃｎｂｚ＋ｋ　ｕ　ｚｌ、、Ｐ＋ｏｇ、Ｌｉｏ　ｕｄ　ＢｉｏｌＢ、Ｒ Ｃｓ、３３６：　９Ｈ１９９［１）１モルモット（Ｇ　ｐ）　・ＢＰによる免疫 化は、（ｉ）Ｇｐ−ＢＰの７２−８９アミノ酸断片に培養で有力に反応しくＶ＋ ｎ＋ｂｎｂａ＋ｋ　ｃｌ　＋１．、　１．　１ｗＩＩｕｎｏ１．　１３５：　２ ２９．０ｌｌｎｕ、　Ｈ。
Ｎ　２１．、Ｉ、１ｉｓｏｎｏ１．　目１：　３ｇ２８．　＋ｎｄ　Ｃｈｏｕ　 ｔｌ　ｚｌ、、１．　Ｎ＋ｕｒｏ＋ｃ１．　Ｒｅｄ、　２２１８１）、（ｌｌ） 彼らのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）（の）に可変的な領域Ｖａ２とＶβ訊　２を表現 しくＢｎ＋ｎ＋　ｔｌ　ｒｌ、、１．　Ｅ！９．　Ｍｅｄ、１６９：　２７−３ ９）、（ｉｉｉ）　ＥＡＥの麻痺徴候を二次受容者に選択的に移すｆｃｈｏｕ　 ｃｌ　＋１．、　１．　Ｎ＋ａ＋ｏ＋ｃｉ、　Ｒｅｉ、２２：　１８１）Ｔｍ胞 亜集団の１０１コ後の出現を惹き起こす。照射か静水学的圧力ですでに減じられ たこのような特性をもっＴ細胞は、積極的に誘発されたＥＡＥへの保護的抵抗を 蒼き起こすべくワクチンとして用いることができる（Ｃｏｈ＋ｎ　ｃｌ　ｘｌ、 、ＩｎＰｌｏｇｕ＋＋　１ｎ　１ｍｍａｎｏｌｏｇ７−６、Ｐ＋ｏｃｅ＋ｄｉｎ ｇｉ　ｏｆ　ｌｔｕ　６１ｈ　１Ｎｕｎ＋Ｎｏｕｌ　Ｃｏｎｇｎ。
Ｏｔ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ａ〔ｈｄｔａｈｌｃ　Ｐｔ！Ｓｓ、　Ｎｏｖ　 Ｙｏｌｋ、　ＰＰ、１−１３　！ｎｄ　０Ｉｌｎｅ＋　ｅｌ@！１．．　＋ １１ｅｖｏｉｎｎｕｏｏ１．　２１：　１３　）。疾患へのこの信じ難い抵抗の 根拠は、疾患起因性細胞の免疫原性ＴＣＲエピトープに抗して向けられた宿主（ ホスト）による活発な自己調節免疫応答を必要とすると思われる　ｆ（Ｙｚｎｄ ｅｎｂｕｋ　ｔ＋　！ｌ、、　Ｎｚ１ｓ＋ｅ　３４＋５４１１：　ｆＨｚ＋ｈｉ ｉ　ｅｌ　！１．．　］、１１ｍ５ｏｎｏ１　１４４：　４６２１１：　（０１ ！ｎｅ＋　１１　！＋、、Ｐ「ｏi、Ｃｌ１ｎ。
Ｂｉｏｌｏｇ、　Ｒ１１，３３６１９３（ｉ９９０１１　ｉｎｄ　（ｌｉｏｔｅ ｌｔ　ｅｌ　！１．．５ＣｉｅＯｃｅ　２４６：　６６Ｂ／jＬ Ｇｐ−ＢＰによる免疫化後１４日以内すなわち、ＥＡＥからの回復はんの前の一 時期、付加的なＴ細胞並集団が抹消に出現するが（ＯＩＩｎｅ＋　ｅｌ　！ｌ、 、１．　Ｅｌ−。
Ｍａｄ、１７Ｇ：　３５５（１９８４））、ＣＮＳには現れない。この亜集団は 、（ｉ）Ｇｐ−Ｂｐの別のペプチド断片４３−６７に反応し、（１１）異なるＴ ＣＲＶβ可変的領域遺伝子を表現するが、ｔｉｉｉ）この集団のＴ細胞は、残留 基６０近くで広範な配列変動を含むうｙト（Ｒｔ）ＢＰを認識できないので、た ぶんラットでは脳炎誘発性ではない（＾１マｏｄｄ　ｌｌ　ｒｌｌＩｎ　Ｅ＋ｐ ｅ＋１ｉｅｎ＋＋ｌ　Ａ１１ｅ＋ｇｉｃ　Ｅｎｃｅｐｈｚｌｏｍ２ｅｌｉｌｉ＋ ：　`＋ ＋ｔｅｆａｌ　Ｍｏｄｅｌ　ｌｏｔ　１Ｊｕｌｔｉｐｌｅ　５ｃｌｕｏｔｉ＋、 ＾Ｉｎ　Ｒ，Ｌｉｏ、Ｉｎｃ、、ＮＹ、１４６：　５２３−５３７）。現行の実 施例について特に興味深いのは、この集団から最近分離されたＴ細胞クローンす なわち、Ｇｐ−ＢＰ４３−６７に反応性にしてそれ自身非脳炎誘発性のクローン Ｃ４は、Ｇｐ−ＢＰ７２−８９に反応性である他のクローンで惹き起こされたＥ ＡＥからの保護的抵抗を誘発するという知見である。このクローンは、同一の分 子の異なるエピトープに特異性の他のクローンの脳炎誘発（性）活性を下降調節 するために用いることができる自己抗原特異クローンの最初の性状を表わすので 重要である。この実施例は、クローンＣ４５５−６９がＥＡＥへの抵抗を誘発し 得る機序のよりよい理解を修得するべく計画した研究の結果であるＥＡＥから最 近回復したラット由来の３つの異なるＧｐ−ＢＰ特異性Ｔ細胞クローンの特異性 およびＴＣＲＶβ配列について比較を行った。クローンＣ３は、Ｇｐ−ＢＰ７２ −８９に反応性かつ脳炎誘発性である。クローンＣ４５５−６９は、非脳炎誘発 性ながらＥＡＥへの抵抗を誘発することが可能。クローンＣ５は、Ｇｐ−ＢＰに 反応性の無害のクローンであるが、Ｇｐ−ＢＰの３つの主要な酵素切断断片のい ずれにも反応性でない。この実施例は、残（留）基５５−６９がＧｐ−ＢＰの保 護的エピトープの役を勤めることを実証する。実施例は、このような３つの異な るＧｐ−ＢＰ反応性Ｔ細胞クローンで表現されるＴＣＰ、Ｖβ連鎖配列を強調す るものでもあるし、クローンＣ４のＥＡＥ保護作用は、大抵のＢＰ７２　８９特 異性脳炎誘発性Ｔ細胞が共有しているＴＣＲエピトープに対する交差反 応性免疫を誘発する（クローンＣ４の）能力に左右されることも実証している。
Ｎｎａ１＋ｎ＋ｐｏｌｉ＋、ＩＮ）から購入し、Ｐｏ＋１ｌｉｎｄ　ＶＡＭＣの 動物資源施設で関係協会がイトラインに準して収容飼育した。
抗原　ＧＰ−およびＲｔ−ＢＰは、Ｅｙｌｕ　らの方法に準して調整した（Ｅｙ ｌ暑【Ｎ　Ｉｆ、１．　Ｂｉｏｌ、Ｃｔｕｌ、　２１６：　５７７０）　。Ｇｐ −ＢＰのタンパク分解切断断片を得て、既述されたようなイオン交換クロマトグ ラフィーで、希望するペプチドの〉９５０もを含有するべく精製した（Ｃｈｏｕ 　ｅｌ　＋１．、　１．　ＮＩＩＩＩＯ，ｃｈｅｗ、２８：　１１５）　ｏ合成 ＭＢＰベブ壬トは、固相法て調整しくＨｉｉｈｉｍ　Ｎ　ａｔ、、］、　Ｎｔｕ ＋ｏ＋ｃｉ、　Ｒｈ、１６４６７）、ウノＢＰ配列に準して番号をつけた（Ｙｘ ｎｄｅｎｂ！＋ｋ　ｅｔ　ａｔ、、１．　１ｕａｎｏｌ。
１３５　：　２２３　’１９８５）　）。
Ｔ細胞系列とクローンの選択　Ｔ細胞系列は、ＥＡＥから回復後Ｇｐ−ＢＰで免 疫化したラントの除液リンパ節から既述されたようにして選択した（’Ｖ＋ｎｊ ＋ｎｂｕｔ　ｔ＋　ｒｌ、、１．　１ｍＩＩｏｎｏ１．　１３５：　２２３）。
ＣｏｎＡ被刺激ルイスラット牌臓細胞からの」二清液は、抗原披刺激Ｔ細胞を膨 張させるために用いるＩＬ−２の源として用いた。
Ｔ系列細胞は、既述された如く限定希釈でクローン化した（＾ｌｔｏ＋ｄ　ｌｌ 　ｈｌ、。
ｕ　Ｅ＋ｐｕｉｍ＋ｎｔ＋ｌ　Ａ旨＋ｒｇｉ＋　ＥｎｕｐｈｉｌｏｍＢｌｉｌｉ ｔ　＾　ｕｕｌｕｌ　！Ｊｏｄｅｌ　ｉｏｒ　Ｗａｌｌ：ｐPｔ Ｓ＋ｌ＋＋ｏｔｕ、１１６５２３−５３７１１９８４１１゜ＢＰで（７）刺激後 、細胞は、０．２成長培地中・１．　２．　ｔおよび０．５細胞／′＜ぼの密度 て丸底ミクロフィルターウェルに配置、・　て細胞を再刺激した。７２時間後、 新鮮な成長培地を各つニルに加えた。
クローン化効率を判定するためにプレートを審査し、膨張したクローンは、６０ °ｔｒ４性ウエル以下でプレートから引き出した。通常、１かＱ、５ｃ＋ｌｌｉ ／ａｌｌで初めに７−ドしたものである。ＢＰでのその後の再刺激は、１０６披 照射胸腺細胞／′ウエルを用いて９６−ウェル平坦底プレートで完遂した。刺激 の７２時間後、クローンは、成長培地を再供給し、続いて２４−ウェル平（坦） 底プレートに広げた。２４−ウェル・プレートでの再刺激は、１０６被照射胸腺 リンパ球と２５ｊｇＢＰの存在下で約４×１０５クローン化細胞を用いることで 完遂させた。
クローン化細胞は、最後には６ＣＺ１１．次に１０〔のプラスチノクペトリ・プ レート行った。２Ｘ１０　Ｔ細胞と１０４被照射胸腺１ルバ球／ウェルを、３７ Ｇ７％グラスファイバーフィルター上に回収し、液体ンンチレーションカウンタ ーで、ＴＣＲ取込みを査定した。平均ＣＰＭは、３通りに作成したウェルから算 出した。
復製ウェルからの標準偏差は、平均値からのく１０％変化した。
ＥＡＥの誘導　活性（の’）ＥＡＥは、１１００ｊヒト結核菌株Ｈ３７Ｒａ　（ Ｄｉｌｃ。
ＬｒｂｏｍｏＢｅＳ、Ｄｕ＋ｏｉｔ、　１ｌｉｌ）を含有するＣＦＡ（への）５ ０ｘｇＧｐ−ＢＰの皮下注入で誘発した。受動（性）ＥＡＥは、被照射胸腺リン パ球をＡＰＣとして用いる３日間ＢＰで刺激したＴ細胞クローンを腹腔内注入し て誘発した。ＥＡＥを発現するラットを、下記の尺度を用いて臨床徴候について 毎日評価した。〇−無徴候、１＝元気のない尾、２＝後肢虚弱、３；対麻痺、４ ＝前肢虚弱を伴う対麻痺、瀕死の状態。
Ｄ　Ｔ　Ｈの転移と保護　遅延型過敏性反応は、２０ｉｔ抗原のｉ、ｄ、注入の ２４および４８時間後、耳腫張アッセイ１ｏｆｌｏｕ　ｌｌ　＋１．、　１．　 ！ｌｅｕ＋ｏ、１ｉｓｏｎｏ１．　９：　１４）て測定した。活性的に誘発した ＥＡＥからの保護は、活性化した休止中の（ＩＬ−２依存性成長相の週末近＜） Ｔ細胞クローンの腹腔的移転後に評価した。
ように行った（０［ｆｎｅ＋　Ｎ　ｘｌ、、１．　１ＩＩｉａｎｏ１．　１３９ ：　２３９５））。Ｔリンパ球クローン（１×１０６）は、２％ＦＣ３と０．　 １％アジ化（合）物を含有する水冷ＰＢＳで洗浄し、Ｄａｄｅイムノフユージで 急速遠心してベレットにした。細胞ペレットを分離するために、ｐａｎ　Ｔ細胞 （Ｗ３／１３）　、ＣＤ４　（Ｗ３／２５）、ＣＤ８　（ＯＸ−８）、Ｉ−Ａ　 （ＯＸ−６）。ＩＥ　（ＯＸ−４７）＊たｌｉＭＨＣクラスＩ　（Ｏｘ−１８） に特異性のモノクローナル抗体（Ｂｉ呻＋ｏｄａｃｔ＋　ｆｏｒＳｃｉｅｎｃｅ 。
１ｎａｉ＋ｎｘｕｌｌｔ、ｌｎｄ、）を加えた。細胞は、冷たいＰＢＳで３回洗 浄し、渦巻回転して水上で３０分インキュベートした。細胞は、冷たいＰＢＳで ３回洗浄し、渦巻回転して氷上で３０分インキュベートした。細胞は、冷たいＰ ＢＳで３回洗浄し、水上で３０分間ＦＩＴＣＧＡＭを用いて染色してから再度洗 浄した。
リンパ球は、特徴的な高前方（対）底測方分散で確認でき、Ｂ＋ｃｌｉｎ−Ｄｉ ｏ＋に＋ｎ＋ｏｎＦＡＣＳアナライザー（Ｍｏｏｎｕｉｎ　Ｖｉｅｗ　ＣＡ）を 用いて４８８ｎｍレーザー光（線）で励起した後、緑と（か）赤の蛍光強度につ いて分析した。一方の細胞のヒストグラムを、各分析のために収集した。
塩化セ／ウムクッノヨンを介しての遠心で、Ｔ細胞クローンから分離した（Ｃｂ ＋ｔｇｗｌａ　Ｎ　ｈｌ、、　Ｂｉｏ＋ｈｔｌＩｉ＋ｌ「Ｔ１８：　５２９４） ）。６ｇｇの総ＲＮＡを１０μＭＭｅＭｇＯＨ（Ａｌｔ＋　Ｐｒｏｄｕｃｅ、　 Ｄｘｎｖｔｎ、　ＩＪ＾）で変性させてから、Ｔａｇポリメラーゼ緩１７８＆： ５０ｍＭ　ＭＣ１，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐ）１８．３．２．５ｄＭｇ Ｃ１、、，２０ユ＝、ｙトＲＮＡ　ｇｕａｒｄｆＰｈｕｉｚｃｉｔ　Ｐｉ＋ｃｘ ｌｉｖｚ７．　Ｍｌ）の存在下での００１％セラチン、４０ｍＭβ−メルカプト エタノール、０．　５１ｍＭｄＮＴＰｓ　１μＩＪｃβ特異性オリゴヌクレオチ ド・プライマーおよび５０μ　反応液中１５ユニットＡＭｖ逆転写酵素（Ｐｂｕ ｍ！＋ｉｘ、５ｖｔｄｓｏ）中でｃＤＮΔへ変換した。Ｃβオリゴヌクレオチド ブライマー、５’　ＣＡＴＡＧＡＡｔＴｃＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＴ ＧＧＴ３’　（Ｇｅｎｏ＋７＋、Ｔｉｎ　Ｗｏｏｄｌｕｄ＋、ＴＩ）は、ラット ＴｃＲＣβ１および２の両方に特異的である。小文字での塩基は、全部のＥｃｏ ＲＩ制限エン制限エンドヌクレアー側部位るべくなされたＴＣＲＣβ配９りから の順列を意味している。４２Ｃて９０分間のインキュベージジンに続いて、反応 液は、ＤＮＡ／’ＲＮＡ二重らせんを変性させるために９５Ｃで５分間過熱しヌ クレオチドプライマー、２ｊＭＶβ８系列特異性オリゴヌクレオチド、２００ａ ＭｄＮＴＰｓおよび２ユニットＴａｇ　ＤＮ八へリメラーゼ（Ｐｈｕａｉ＋ｉｉ ｌを含有する１００μ　増幅した。Ｖβ８特異性オリゴヌクレオチド、５’　Ｇ ＧＧＣＣＧＣＧＧＡＡＣＡＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴＣＡＣ３’　は、あ らゆる既知のラットＶβ８系列メンバーを増幅し、５’５ａｃ＝制限工ンドヌク レアーゼ部位を含有する。各試料は鉱物油に上敷きし、サーモサイクラ−で、９ ２Ｃで１分、５５Ｃで１．５分および７２Ｃで２分の３０増幅サイクルの対象と した（ＰｅｒｋｉｎＥ１ｍ＋＋、Ｎｏ＋ｖｉｌｋ　ＣＮ）。
ＤＮＡ配列化８増幅に続いて、試料は、鉱物油を除去するためにクロロホルム抽 出を行い、エタノール沈澱析出をし、Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　（Ｎｏｖ　Ｅｃｇｌｕ ｄ　８ｉｏ１！ｂ＋。
Ｂｅｖｅ「１１．　Ｍ＾）を加えた５ａｃ＝で温浸した。結果として生じたＤＮ Ａは、１．４％アガロースゲルで分離した。適当な大きさの生成物は、ＰｒｅＰ −Ａ−Ｇ　ｅ　ｎ　ｅ　（Ｂｉｏ−Ｒｉｄ、Ｒｉ＋ｈｉｏｎｄ、ＣＡ）を用いて アガロースから直接分離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＝　（Ｓｌｕ＋＋ｇｅｏｃ 、　Ｓｕｌｌｉｅｇｏ、　ＣＡ）の５ａｃ＝／ＥｃｏＲ１部位に連結させた。連 結混合物は、バクテリア菌株ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ（ＳＩ＋＋ｊＢｅｎｅｌへと転換 させた。Ｍｉｎｉｐ＋ｅｐＤＮＡは、標準法で（Ｍｕｉ＊Ｉｉ＋　ｅ＋　１１． 。
丁　Ｅ、Ｆ、Ｆ＋ｉ＋＋ｃｌ＋、　ｉｎａ　１．　Ｓｎｂ＋ｏｏｋ、　１９８９ ．　Ｍｏ１ｅｃｉｌｕ　ｃｌｏｎｉｎｇ　＾　１１ｂＧ＋！P０１７ ｍ！ｎｕ＋１．Ｓ＋＋ｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔｌｕ ｂｏ＋　Ｌｔｂｏ＋＋１ｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｔｌｕｂｏ＋、　ＮＹ ）　、無作為に選んだバクテリアコロニーがら作成し、５Ｂｌｌｅ口ＪＨ５ｅｑ ｕｅｎｃ１ｎｇ　＋７ｔｌ＋ｍ　ｆＵ、Ｓ、ＢｉｏｃｈｅＩＩｉ＋ｘ１．　ＣＩ ＋ｂｅｌｚｎｄ、ＯＨ）を用いるｄｉｄ＋ｏｔ７山ｉｎ　＋ｕｍｉｎｔｌ法（Ｓ ｚｎｇｕ　ｕ　ｉｆ、、　ＰＩＧ（、Ｎｚ１１．　Ａｃｘｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ ５Ａ　７Ｂ：　２０７２）でA 両方の路上に配列した。
者は、ＥＡＥから自然に回復したラットから得たクローンｃ４は、残（留）基４ ３−６７の範囲内で包囲されたＧｐ−ＢＰ特異性アミノ酸配列に反応すること。
Ｇｐ−ＢＰ／ＣＦＡのその後の注入によって誘発されたＥＡＥから、無垢なラッ トを保護できることを実証した。その特異性をさらに分析するために、クローン Ｃ４を、合成ペプチドの一式を用いて刺激した。
表８に示すように、クローンＣ４（ｉ、Ｇｐ−ＢＰ５０−６９と５５−６９ペプ チドには完全に反応したし、ボノノ３ン６３でのＡ置換のための５ｉａＩｌｃ　 ＴによるＧｐ−ＢＰ配列と異なる、ｍｏｄｉｆｉｅｄラット５５−７４配列とは 部分的に反応した。しかし、２０−ノＣ４は、この領域でのｃｐ−ｓｐとは３つ のアミノ配列を異にするＲｔ−ＢＰとは少しら反応しなかった（ＣＩＩＯ１目１ ．、　１．１１…ｌＣｈｍｓ２８　１１５ｔ１９Ｈ＋１このようなデータは、ク ローンＣ４によって認識された最小Ｇｐ−ＢＰエピトープ（残（留）基５５−６ ７）がＲｔ−ＢＰには欠けておりＲｔ−ＢＰでの免疫化後この特異性のＴ細胞ク ローンの誘導の欠如の要因となっていることを、断固として説明する。今後、ク ローンＣ４は、Ｃ４５５−６９と呼ばれるだろう。
Ｇｐ−ＢＰ５５−６９はルイスラットでのＥＡＥに対する保護的エピトープであ る。
Ｇｐ−ＢＰ５５−６９に反応性のＥＡＥ保護的クロりノの選択は、この合成エピ トープが、ＥＡＥのその後の誘導に対するより一般化された保護活性を有したか もしれないことを示唆した。事実Ｇｐ−ＢＰ／ＣＦＡでのチェレンジに先立つＧ ｐ−ＢＰ５５−６９での前免疫化は、９匹中３匹のラットで臨床的ＥＡＥの全徴 候を防いたし、残りの動物ではＥＡＥの重度と持続期間を有意に削減した（図Ｇ ｐ−ＢＰかＧｐ−ＢＰ５５−６９ペプチドでのｉｎ　ＶｉｔｒＯ活性化後３日目 か、ロブ−２に冨む澄液て成長が鈍化してしまった後で抗原刺激直前（休止中の 細胞）のいずれかで、１〜２０００万Ｃ４５５−６９”細胞を注入し、Ｔ細胞注 入から２週間後、Ｇｐ　−Ｂ　Ｐ　／ＣＦ　Ａで誘発した能動的ＥＡＥかあるい はａｐ−ＢＰ　（Ｃ３□２−Ｈ）の７２−８９配列に特異的な活性化したりＯ− ン３Ｔ細胞の転移後に誘発した能動的ＥＡＥに対する動物の抵抗について調べた 。表２９に示すように、腹腔内か静脈内かいずれかで投与したタローノＣ４５５ −６９細胞は、Ｔ細胞を用いた前注入を受けなかった対照動物に比べて、用量依 存様式に受給動物全部に能動的ＥＡＥに対する部分的乃至完全な保護を誘発した 。クローンＣ４５５−６９の注入後より軽度のＥＡＥを発現したこのようなラッ トでは、臨床的廃疾はより少なく疾病持続期間も短縮していた。休止中のクロー ンＣ４５５−６９細抱は、活性化した細胞よりある程度低効率ながら、保護を移 行することもできたく表２９）。クローンＣ４５５−５９とは対照的に、Ｇｐ− ＢＰには特異的だがＧｐ−ＢＰペプチドには特異的でない非脳炎誘発性クローン Ｃ３Ｇｐ−ＢＰは、ＥＡＥに対する最小の保護を発揮する（図１７）。クローン Ｃ４５５−６９Ｔ細胞は、能動的ＥＡＥより受動的ＥＡＥを防ぐ上でより有効で ある。表３０に示すように、単独であるいはクローンＣ３，の存在下で活性化さ れたクローンＣ４５５−６９＋２−８９ は、活性化したクローンＣ３゜２−８□細胞の転移の５〜６日後日照対照動物現 した臨床ＥＡＥに対して、全受給動物を保護した。
保護はクローンＣ４によるクローンＣ３７２−８９の活性化に帰すべきではない 。
惣像では、クローンＣ４の保護活性は、クローンＣ３７２−８９のような脳炎誘 発性ＴｗＩ胞の活性化を阻害する（各々のクローンの）能力に関係があったかも 知れない。この可能性を評価するために、各クローンを、個々にあるいは全Ｇｐ −ＢＰか、それぞれのエピトープの１つか２つとの混合培養で刺激した。表３０ に示すように、クローンＣ３とクローンＣ４５５−６９の両方の増殖応答は、個 別的な活性化レベルの合計に比へて、混合した培養での１つのエピトープか両方 のエピトープと活性化すると、ぎりぎり阻害された（２０〜２５％）。
このような成績は、各クローンが他のクローンの存在下できりぎりの削減された レベルで、おのおののエピトープに反応したことを暗示しており、クローンＣ− Ｌ、が、脳炎誘発性クローンＣ３７２−８９の活性化を阻害することでＥＡＥａ −６９ に対し保護をするという考えを支持するものではない。
ＣＮＳ組織学腎髄切片の評価から、クローンＣ４５５−６９保護動物と対照動物 のいずれにも脈管周囲の病変が多数あることが判明した。しかしながら、活性化 クローンＣ４５５−６９Ｔ細胞を注入しても、脳炎誘発性チャレンジがない時に は如何なる検出可能のＣＮＳ病変も誘発されなかった。
ＥＡＥから回復したラットからのクローンで表現されたＴＣＲＶβ遺伝子の特定 クローンＣ４５５−６９によってＥＡＥの臨床徴候から完全に保護されたラット でのＣＮＳ病変のがんこさは、Ｇｐ−ＢＰ７２−８９特異的脳炎誘発性Ｔ細胞り ローンによって共灯されたＴＣＲＶβ８３９−５９からの合成ペプチドでの免疫 化で誘発された保護を暗示したｆＶ＋ａ＋１ｆｆｉｏｂ＋＋ｋ　ｔ＋　＋１．、 　Ｎｉｌｗｎ　３４１：　５４１（１９０１：　５ａｄＨ＋＋ｈ１ｍ　Ｉｌ　Ｉ ｌ、、１．　１１１１＋口ｏｆ、ＮＬ　Ｊ６２Ｈ１９９０１）。ｃｐ−Ｂｐの６ ７エピトーブに反応性のＴＩＢ胞系列はＶＢ８２を表現しなかったけれども（＾ １マｏｄｄ　ｌｌ　＋１．。
Ｉｎ　Ｅ＋ｐｕ１ｕｎｌｘ１　＾ｌｌｕｇＩＣＥｎ＋＋ｐｈ＋１ａｓｌ＋１ｉｌ ｉ＋　＾　Ｕｕｌｗｌ　Ｍｏｄｔｌ　ｌｏｔ　１ｆｕｌｌｉ垂戟{ Ｓｃｌ＋・ｏ＋１＋、ＶＯＩ　１１６．　ｃｐ、５２３−５３７．　＾Ｉｚｎ　 Ｒ，ＬＩＩｓ　Ｉｎｔ、、Ｈｔｗ　Ｙｏ＋ｋｌ。関連した■領域遺伝子かＧｐ− ＢＰ４３−６７に特異的なＴＣＲで活用されたということや、交差反応性Ｔ　Ｃ ＲｔｄｉｏｌＯＤ＋が抗ＴＣＲＶβ”　３９−５９免疫を誘発したということは 考えられる。あるいはまたクローンＣ４５５−６９の活性化の間中現れる交差反 応性用Ｉ’ＣＲ決定因子（例えば”ｌＩｇｏｌｊｐｌｃ“エピトープ）によって 、調節（ｒｒｌυ１１１１ｏｎ）か誘導されたのかもしれない。
抗原認識や機能に関する’＋１１１１胞受容体遺伝子の用い方の重要性を査定す るために、ＴＣＲＶｆｉｊｉ域β趙系列を、３つの代表的Ｔ細胞クローンの各々 について特定した（図１８）。クローンＣ３７２４９とＣ３Ｇｐ−ＢＰはＶＢ８ ２とＤβ１配夕；１ｆ！：」（自したか、１３使用では違った。脳炎誘発性ムロ −／Ｃ３７２−ＨはＶＢ２．３を表現し、非脳炎誘発性クローンＣ３Ｇｐ−ＢＰ はＪβ］、１を表現した１図１８）。これとは対照的に、保護的クローンＣ４５ ５−６９はＶＢ２６およυＪβ２１を表現した。
クローンＣ４５５−６９はＶＢ２６＋とＶＢ８２＋Ｔ細胞の両方にＤＴＨ応答を ｙＮ発する。ＶＢ２２およびＶＢ２６配列の類似性のゆえに、我々は、クローン Ｃ４（ＶＢ２６↓）の注入がｉｎ　ｖｉｖｏ　ＶＢ２２＋Ｔ細胞のｌ１１１胞性 交差認識を誘発しただろうと、仮定した。この所説を確かめるために、減衰化ク ローンＣ３（ＶＢ２．２＋）とクローンＣ４５５−６９”細胞に対するＤＴＨ（ 耳腫脹）反応を、クローンＣ４５５−６９Ｔ細胞で受動的に免疫化したう、ｌ・ と駈垢な対照う、　ｌ−ムて調へた。表３２に示すように、Ｃ４５５−６９”細 胞２０−７で受動的に免疫化しｌ：らノドは、＋Ａ：照射Ｃ４５５−６９　と（ ＶＢ２６＋）Ｃ３，、（ＶＢ２　２−）ＴｗＩ胞の両方に同等のＤＴＨ反応を示 した。この、１−８９ 細胞性認識は、［活性化Ｊおよび「休止中の」クローンＣ３７２−８９細胞の両 方とり””５５ｉ９細胞のトに存在する交差反応性決定因子に主として向けられ ており（表３２）従って“ｅ１ｇｏｌ！ｐｉＣ＠エピトープによる最小限の貢献 を暗示していた。さらに、クローンＣ３７２−８９に対して認められたＤＴＨ応 答の多くは、ＶＢ２．２３９−５９ペプチドに帰することができた（表３２）。
クローンＣ４５５−６９による交差反応性ＤＴＨの潜在的誘発とは対照的に、ク ローンＣ３Ｇｐ−ＢＰはＶＢ２゜２を表現したがぎりぎり保護的であったが、Ｖ β”　２３９−５９ペプチドへの有意なりＴＨ応答を誘発することはできなかっ た（表３２）。
Ｖβ”　２３９−５９ペプチドに対する特異的ＤＴＨ応答を誘発する、活性化と 休止中両方のクローンＣ４５５−６９ノ能力とりｏ−ンＣ３Ｇｐ−ＢＰ　（ＶＢ ２．２＋である）の相対的不活性は、細胞表面マーカーの表現（で）のより精密 な検査を促進した。クローンＣ３，Ｃ４およびＣ５のＦＡＣ３分析は、ＣＤ４（ Ｗ３／２５モノクローナル抗体）ｏｐａｎＴ細胞マーカー（Ｗ３／１３）および Ｃｌ用　ＩＭＭＣ（ＯＸ−１８）の表現の類似したレベルを示した。
けれども、保護的クローンＣ４５５−６９は、休止期間中（図１９）と活性化後 （ＦＩＡ１９）の両方でクローンＣ３７２−８９かクローンＣ３Ｇｐ−ＢＰのい ずれかより有意高いレベルの活性化マーカー１−Ａ（ＯＸ、図１９）とＩ−Ｅ　 （ｏＸ−１７）を表現した。だから、保護の誘発と抗ＴＣＲ免疫へのＩ−ＡとＩ −Ｅの正確な貢献は未祥であるけれども、クローンｃ４５５−６９が他の２つの クローンに比べてこのような活性化マーカーのレベルをより高く維持するという のは明白である。
ＶＢ２．６３９−５９と■β８’　”３９−５９ペプチドは大いに交差反応性で ある。ＶＢ２．６対Ｖβ８．２配列の分析は、両親媒性α−へリックス（Ｍｕｇ ｌｌｉｌ　ｅｌ　Ｊｌ、。
１、ＩＩＩｍａｎｏｌ、１３ｇ：　２２１３１とＲｏｌｈｂｕｄ４！７１ｏ＋　 （ＲＴ）配列（ｌｏｌｂｂｕｄ　ｅｌ　！１．。
丁ｈ＋　ＥＩＩＢＯＩｏａ＋ｎｚｌ　７：　９３１）の存在によって決定された ように同類の予想されたＴ細胞エピトープはもちろん、残（留）基３９−５９の 範囲内にただ４つのアミノ酸差異を示した（図１８）。このような配列の範囲内 での考えられ得る交差反応性を検討するために、既に広範に特性決定されている ＴＣＲＶβ””　２３９−５９ペプチドと比較研究するため、ＴＣＲＶβ”’　 ”３９−５９ペプチドを合成した（Ｖａｎｄｅａｂｚｒｋ　ｓｔ　ａｌ、、　Ｎ ｘ（ａｔｅ　３４１：　５４４！１９ＨＩ　Ｈｚ山ａ　ｅｌ　！＋、、　１．　 Ｉｍｍａｎｏ戟@１４４　： １６２１（１９９０）　ｉｎｄ　ｔｌｉｇｇｉｎ＋　ｃｌ　ｈｌ、、１．　１ｍ １ｕｎｏ１．　１４０：　４４０（１９８８））。
ｉｎ　ｖｉｖｏで２つのＴＣＲペプチドの相同の交差認識を査定する直接手段は 、ＣＦＡの各ペプチドで免疫化することと、両方のペプチドに対するＤ丁Ｉ（を 測定することである。表３２に示すように、ＶＢ８．　６３９〜５９とＶＢ２９ 　ペプチドはｉｎ　ｖｉｖｏで大いに交差反応性であったし、免疫化′３９−５ ９ 対交差反応性ペプチドに対して認められた反応は、相対的に僅かに強いだけであ った。同様の交差反応性は、２つのＴＣＲペプチドに対する抗体についても認め られた。コノヨうなデータは、ＶＢ８．６＋Ｔ細胞かＴＣＲＶβ”、６３９−５ ９ベプ壬トのいずれての免疫化は、ＥＡＥへの保存作用と治療効果の両方がある ことが知られているＴＣＲＶβ８２３９．．５９の強いＴ細胞交差認識を誘発で きることを決定的に実証している（Ｖｘｎｄｅｎｂｓｔｋ　ｅｔ　Ｊｌ、、　Ｎ ＪＩＩＩｌｌ　３４１．５４１ｆ１９Ｈ）：Ｈｘｔｈｉｐ　＋ｔ　＋１．、　１ ．　１ｍ１ｕｎｏ１．　１１４：　４６２１（１９９０１：　ｉｎｄ　Ｈｉｇｇ ｉｎ＋　Ｉｌ　＋１．、@１ １ｍ１ｕｎｏ１．　１４０．４４０ｆ１９８ｇ）］。同様に、２つのペプチド間 の交差反応性も、ＴＣＲペプチドの両方に対するＥＬ　Ｉ　ＳＡで同等の反応性 をもたらしたＴＣＲＶＢ２　°　に特異的なウサギ抗体を用いて認めた（１／４ ０．０００血清希釈’１９−５９ て、ＴＣＲＶβ’　２３９−５９に対し０．　３１０．　Ｄ、ユニット、ＴＣＲ Ｖβ８’　＋９−５９に対し０．　３３０．　Ｄ、ユニット）。
〜′β８６１９−５９ペプチドでのＥＡＥの治療。ＶＢ２”　３９−５９　とＶ β’　”’１９−５９ペブモトの強い交差反応性は、ＶＢ８２ペプチドについて 既に示されているよう、ＶＢ２６ペプチドは、確定したＥＡＥのあるラットをう まく治療できる筈だと予測された（ＨＢｇ＋ｎ＋　ｔｊｒｌ、、１．　ｉｏｍｕ ｎｏｌ、１４０：　４４０ｉ１９８８））　ｏ図２０に示すように、臨床的ＥＡ Ｅの１日目に皮下か皮肉のいずれかで注入する生理食塩水中のＴＣＲＶＢ２”　 、＋９−５ｇは、■β１４３１−５９対照ペプチドを注入したラッ）・か未処置 の対照ラットと比較して、ＥＡＥの重度と持続期間が有意に削減した。
ＴＣＲＶβ８　Ｇ。　てのＥＡＥの消散は、ＴＣＲＶＢ２２　ペプ＋９−５９　 ３９−５９ キトの作用と同等である（図２０）。
考察 」二連した成績は、非脳炎誘発性Ｔ細胞りローン上に存在するＴＣＲＶ領域イデ イオトーブか、脳炎誘発性Ｔ細胞によって一般に活用される交差反応性ＴＣＲ決 定因子に向けられたＥＡＥ保護性免疫を誘発てきることを実証している。データ は以下の点を例証している。１）Ｇｐ−ＢＰの非脳炎誘発性５５−６９配列は、 ルイスラットでのＥＡＥに対する保護的エピトープを象徴する。２）このエピト ープに特異的なりローンＣ４５５−６９は無垢なラットへの注入後、能動的ＥＡ Ｅと受動的ＥＡＥに対する有力な保護を誘発できる。３）保護的クローンＣ４５ ５−６９はそのＴＣＲでＶＢ２．６を表現する。４ンＶβ８．６の３９−５９配 列は、ルイスラットで（の）脳炎誘発性Ｔ細胞により活用されたＶＢ２．２の３ ９−５９配列と交差反応的である（Ｂｕｒｎｔ　Ｎ　ａｔ、、１．　Ｅｔｐ、　 Ｍａｄ、１６９：　２７［１９８９１）　ｏ　５）Ｖβ８６３９−５９ペプチド は、確定したＥＡＥのあるラットを治療するためのＶβ’　２３９−５９に匹敵 する活性を有する。従って、５５−６９ペプチドを注入して誘発したＥＡＥに対 する保護は、５５−６９決定基（因子）に特異的な非脳炎誘発性Ｔ細胞でＴＣＲ Ｖβ””　６３９−５９上に表現された交差反応性ＴＣＲイディオトープに向け られた抗ＴＣＲ免疫を含めることも予想される。しかしながら、クローンＣ４５ ５−６９の阻害特性そのものはもちろん他の非ＴＣＲ決定基も、認められた保護 にも貢献できたろう。
保護は、脳炎誘発性Ｔ細胞特異性のＴＣＲに向けられた抗１ｄｉｏｔ７ｐｉｃ調 節のクローンＣ４５５−６９による効果的な誘発の結果生じていたのかもしれな い。
まず、クローンＣ４５５−６９で保護された臨床的に十分なラットは組織学的Ｅ ＡＥを発現した。すなわち、合成ＴＣＲＶＢ２．　２３．〜５９ペプチドで誘発 した保護と同しバター７である（Ｖ＋ｎｄｅｎｂｉ＋ｋ　ｅｌ　ｉｌ、、　Ｎ！ ｌｃｕ　３４１：　５４１（１９８９１：　ｆｂ＋ｂｉｉｅｌ　ｒｌ、、］、Ｉ ｍｍａｎｏｌ、１４４：　＋６２１（１９９０））。第二に、クローンＣ４５５ −６９は脳炎誘発性クローンＣ３１，と、クローンＣ３７２−８９によって表現 されたＴＣＲｌ、へ８９ ＶＢ２．２３９−５９配列の強力なＴ細胞認識を誘発した。配列分析は、クロー ンＣ，４５５，９がそのＴｃＲ＋：ＶＢ２．６を表現しタコとと、ＶＢ２．６と ＶＢ２゜２配列は類似していることを、明白に実証した。ＶＢ２，２とＶβとＶ Ｂ２．６ての同一のアミノ酸の最長範囲は残（留）基１−１１と４４−５４にあ ったが、後者のみＴ細胞エピトープであると予測され、より大きな既知の抗原性 ベブ壬トの範囲内に含まれる（すなわち残（留）基３９−５９）。第三に、合成 Ｖβ”　３９−５１ペプチドは、ｉｎ　ｖｉｖｏでＶβ””！９−５９と大いに 交差反応性てあったし、ＥＡＥを調節（モニュレート）する上で同等の作用を実 証しＣＩ−ＢＰ５５−６９特異性１−Ａ限定性クローン４は、Ｇｐ−ＢＰとＲｔ −ＢＰの７２−８９と８７−９９エピトープに特異的な脳炎誘発性Ｔ細胞によっ て優先的に活用されたＶＢ２．２遺伝子と密接な関係にある遺伝子、ＶＢ２．６ を活用することが報告された最初のクローンである（Ｂυ＋ｎｔ　Ｎ　！＋、、 １．　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ１６９１　２７ｆ１９１１９）　＾１ｗｏ＋ｄ　ｅｌ　 ＋ｌ　、　ＩｌＩ　Ｅｘｐｕｉｍｔｎｌｓｌ　人１１ｅ＋１ｉｃ　ＥｎｃＢｈｂ ｌｏ高Vｅｌｉｌｉ＋　： ＾１１ｕｉｕｌ　ｈｆｌ＋ｌ　！ｏｒ　Ｍａｌｌｉｐｌ＋　５ｃｌｕｏ＋口、Ｖ ｏｌ、１４６．　ｐｐ、５２３−５３７．　＾ｌ＋＋　ＲＬＩＩｔ　Ｉｎｃ、、 Ｎｓｖ　Ｙｏｌｋ；　ｚｎｄ　Ｗｉｌｌ目ＩＩｔ＋　＋１．、　１ｍｍｕＩｌｏ １．　Ｒｅｔ、７：　３３９−３５０’１ｇＨ）＋。この研究で評価された３つ のクローン、特にクローンＣ３７２−８９とＣ３Ｇｐ−ＢＰ　（ＶＢ２２の各ク ローンの使用では同一である）の特異性の違いの要因となるかもしれない。Ｖ− Ｄ−Ｊ接合点に注目することは一層興味深い。
実験的自己免疫脳髄塩（ＥＡＥ）での回復過程は、ミニリン塩基性タンパク質の 二次的エピトープで指示されたＴ細胞クローンの増大する多様性を特徴とする特 に興味深いのは、モルモット塩基性タンパク質（Ｇｐ−ＢＰ）の残（留）基５５ −６９が、ＥＡＥに対する保護を誘発することである。非脳炎誘発性Ｔｅｌ胞ク ローン、このエピトープに特異的なＣ４５５−６９は、能動的および受動的ＥＡ Ｅの両方に対する保護を転移させる。クローンＣ４５５−６９は、保護的抗１ｄ ｉｏｔマＰＩ（Ｔｌｆｌ胞と抗体を誘導することが知られているＶＢ２．２の対 応する３９−５９残（留）基と大いに交差反応性であることがわかっている。Ｔ ＣＲＶβ８２　ペプチドのようにＶβ”’、６３９−５９配列は、自己調節を誘 発し、＋９−５９ 確定したＥＡＥの有効な治療を可能にする。従って、Ｇｐ−ＢＰ５５−６９配列 のＥＡＥ保護作用は、交差反応性調節性イディオトープで指示された抗ＴＣＲ免 疫を能率的に誘導し得たＣ４５５−６９のようなＴ細胞クローンによって仲介さ れた可能性が最も高いようだった。
表２８ アミノ酸は単一文字で示す。（−）は付加的残留基を指示する。下線を１寸した 残（留）基は、相同Ｒｔ−ＢＰ配列に関係がある差を示す。５＃ｇ／ａ＋ｌ　Ｃ ｏｎ人か各Ｔ細胞クローンの受動的転移の２週間後、ラットをＧ　ｐ　−Ｂ　Ｐ ／ＣＦ　Ａでチャレンンした。（Ａ）は、細胞が抗原および胸腺へＰＣと３日間 活性化されたことを示す。（Ｒ）は、ＩＬ−２に富む培地で５〜９日間培養され て０た休止細胞を示す。＊は、対照動物に比して病気の持続期間か重度が有意に 短かいか低し）ことを示す（ｐ＜０．０５）。
表３０ ａクローンＣ３７２−８９とクローンＣ４５５−６９Ｔ細胞は別々に、胸腺補助 細胞を加えたＧｐ−ＢＰと、無垢なラットへの腹腔内単独転移に先立つ３日間刺 激した。
ｂ２．５ＸＩＯクローンＣ３７２−８９Ｔ細胞と２．５Ｘ１０　クローンＣ４５ ５−６９”細胞は、混合し、無垢なラットへの復腔内転移に先立つ３日間、胸腺 補助細胞を加えたＧｐ−ＢＰと同時的に刺激した。
表３１ 抗原５０ｊｇを、１００万の胸腺補助細胞の存在下で０．２ｍｌ培地で３日間刺 激した各クローンの１０，０００細胞に加えた。増殖は、３Ｈ−Ｔｄｙの取込み で測定した。抗原のないあるいは無関係のエピトープの存在下でのクローンの応 答は、０．１〜０．　３ＣＰＩＪ／１０００に及んだので０て表す。共存培養で の（）中は、応答の総数に比較した阻害のレベルを示す。
（ｉｎ＋１ｉｌｌｉｏａｉｌ　ｇｍｉｄ＋ｌｉｎ＋）に従ってボーランドＶＡＭ Ｃｉこお１する人ｎ１ｓｉｌＲｔＩｏｕｔｎ　Ｆｚｃｉｌｉ＋７に収容して、飼 育した。
近国　Ｅ山ｒらの方法によって、（、ｐ−ＢＰを贋製した（Ｅ山「ら、１．　Ｂ ｉｏｌＣｈｃｍ、２１６：　５７７０ｆ１９７１）ｌ。この明細書において既述 したような固相方法によって、合成ＴＣＲペプチドを調製した。
Ｔ細胞ラインとクローンとの選択：　ＥＡＥがら回収後のＧｐ−ＢＰ／ＣＦＡに よって免疫化したラットの排液（ｄ＋＋１ｎｉｎＯリンパ節がらＴ細胞ラインを 選択した。ＣｏｎＡ刺激ルイスラット牌臓細胞がらの上澄みを、抗原刺激Ｔ細胞 を展開させる（ｕｐｉｎｄ＋ｄ）ために用いるＩ　Ｔ−−２の供給源として用い た。
Ｔライン細胞をここに述べるように希釈を限定することによってクローン化した 。ＢＰによる刺激後に、細胞を増殖培地０．２ｍｌ中４．　２．　１および０． ５細胞／孔の密度て丸底マイクロタイタ一孔中に入れ、３７℃、７％ｃｏ２にお いてインキュベートした。７日後に、抗原提供細胞として照射（１５００Ｒａｄ ｌ同系胸新鮮な増殖培地を番孔に加えた。
プレートをスクリーニングして、クローン化効率を算出し、展開クローンを６０ ０も未満の膏効孔を有するプレートから導出した。これらの孔は通常、細胞１乃 至０５個／′孔を最初に接種したものである。続いてのＢＰによる再刺激は９６ 孔平底プレートにおいて照射胸腺細胞１０６個７′孔を用いて実施した。７２時 間の刺激後に、クローンに増殖培地を再供給し、続いて２４孔平底プレートに展 開させた。２４孔プレートにおける再刺激は照射胸腺細胞１０６個とＢＰ２５ａ ｇとの存在下でクローノ化細胞約４×１０５個を用いて実施した。クローン化細 胞を結局、６ＣｆｆＩプラスチノクペトリ皿に、次にＬｏａｎプラスチソクペト リ皿に展開させた。
増殖分析　増殖分析は９６孔マイクロタイタープレートにおいて実施した。
１ｉ１１激培地のみ、ＣｏｎＡまたは抗原と共にインキュベートした。培養物を ７２時間インキユベートシ、最後の１８時間は０　、　５８　Ｑ　３　ＨＴ　ｄ 　ｒの存在下でインキュベートした。細胞をガラス繊維フィルター上に回収し、 ＴＣＲ取り込み１ａｐｕｋ＋１を液体／ンチレーンヨンによって評価した。３通 りの孔から平均ＣＰＭを算出した。反復（「ＩｐｌｉｃＮ＋ｌ孔からの標準偏差 は平均値からく１０％の範囲であった。一部の実験では、アジドを含まない、Ｍ ＨＣＩ　（ＯＸ−１８）またはＭＨＣＩＩ　（ＯＸ−６，抗！−Ａと０Ｘ−１７ ，抗１−Ｅ）に対する抗体を培養物に加えて、ＴＣＲＶＢ２−４４−５４ペプチ ドに対するＴ細胞反応の制限にどのＭＨＣ分子が用いられたかを評価した。
ＥＡＥの誘導　結核菌株Ｈ３７Ｒａ　（Ｄｉｌｃｏ　Ｌｘｂｏ＋＋ｔｏ＋ｉｎ、 ミノガン州、デトロイト）１００ａｇを含むＣＦＡ中のＧｐ−ＢＰＩＯ〆ｇを皮 下注射することによって、能動ＥＡＥを誘導した。受動ＥＡＥはＡＰＣとして照 射胸腺細胞を用いてＢＰによって３日間刺激したＴ細胞クローンを腹腔内注入す ることによって誘導した。ＥＡＥを発現したラットは次のスケール　０＝無徴候 、１＝元気のない尾：２＝後肢衰弱：３一対麻痺、４＝対麻痺を伴う前肢衰弱、 瀕死症状、を用いて臨床徴候に関して毎日評価した。
ＤＴＨの伝達と保護　抗原２０μｇの皮肉注射後２４時間口と４８時間目とに耳 膨潤分析（０１ｔｎｅ＋ら、　ｌ　Ｎｔｕｒｏ　ｉｍｗｕｎｏｌ、９：　１４７ （１９８４１）によって遅延型過敏症反応を評価した。活性化または休止（ＩＬ −２依存性増殖期の最後近＜）Ｔ細胞クローンの腹腔内伝達後に、能動的に誘導 されたＥＡＥに対する保護を評価した。
表現型分類　ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩ　ｇＧ　（ａ　ｂ’　）　２　（ＣＡ Ｍ）抗体（ＴＡＧＯ，カリフォルニア州、バーリンゲーム）によって、既述され たように＜Ｏ！！ｎＣｔら、　１．　ｌｌｌ＠ｕｎｏ１．　１３９：　２３９Ｎ １９８７））、間接的な蛍光抗体法（ｉｍｉｏｏｏｆｌｕｏ＋ｅＩＣ＋ｎｃｅ） を実施した。Ｔリンパ球ラインまたはクローン（１×１０６）を２％ＦＣ３と０ ．１％アジドとを含む水冷ＰＢＳ中で洗浄し、Ｄａｄｅイムノフユージ（ｉｍＩ Ｉｕｎｏｆｏｇｅ）中での迅速遠心分離によってペレット化した。ｐａｎＴ細胞 （Ｗ３／’１３）、ＣＤ４　（Ｗ３／２５）、ＣＤ８　（ＯＸ−８）、ｌ−Ａ　 （ＯＸ−６）、Ｉ−Ｅ　（ＯＸ−１７）またはＭＨＣクラスエ（ＯＸ−１８）　 （Ｂｉｏｐ＋ｏｄｏｃｌｉ　ｌｏ「５ｃｉｕｕ　、　インディアナ州、インディ アナポリス）に対して特異的なモノクローナル抗体を加えて、細胞ペレットを分 離させ、渦運動させ（ｖｏｒｔｕ＋ｄ）　、氷上で３０分間インキュベートした 。細胞を冷ＰＢＳによって３回洗浄し、ＦＩＴＣ−ＧＡＭによって氷上で３０分 間染色し、再び洗浄した。リンパ球を特徴的な高前方対低側方散乱（ｈｉｇｈ　 （ｏｔｖｒｔｄマｕｌ＋ｌｌｏ豐１１６＋　＋【ｚ＋ｔｕ）によって同定し、４ ８８ａｍレーザー光線による励起後にＢ＋ｃｌｉｎ−Ｄ１ｃｋ１ｎ＋ｏｎ　Ｆ　 Ａ　ＣＳアナライザー（カリフォルニア州、マウンテンビュー）を用いて緑色お よび／″または赤色蛍光強度に関して分析した。各分析について１０．０００細 胞のヒストグラムを回収した。
ンヨ、・を通しての遠心分離とによって、Ｔ細胞クローンから全細胞ＲＮＡを単 離した’Ｃｂｌｔｇｕｎ　ら、Ｂｉｏｃｈ＋ｍ＋ＮＢ　１８：　５２９４１１９ ７９））。全ＲＮＡ６ｊｇを１０ｍＭＭ　ｅ　Ｍ　ｇ　Ｏｔ（！＾Ｈｚ　？ｏｄ ｕζｔ＋、マサチューセノツ州、ダンバース）中で変性させ、次にＴａｑポリメ ラーゼ緩衝液；５０ｍ１ｌ　ＫＣ５１０１１１１Ｔｒｉｓ　−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ８ ，３）　、２．５ＩｌＭ　ＭｇＣ１、，２０単位ＲＮＡガードｆｇｕｕｄ）（Ｐ ｈ＋＋ｍｘＣ目、ニューンヤーンー州、ビス力夕ウエイ）存在下での０．０１％ ゼラ壬〉、４０ＩＩＭβ−メルカプトエタノール、０．５ｉＭ　ｄＮＴＰ、１ｊ Ｍ　Ｃβ特巽的すリボヌクレオチド　プライマーおよび１５単位ＡＭＶ逆トラン スクリプターゼ（ＰｈｕｎＪ＋目スウェーデン）中で５０−反応においてｃＤＮ Ａに転化させた。Ｃβオリゴヌクレオチド　プライマー、５’　ＣＡＴＡＧＡＡ ｔＴｃＣＡＴＴＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＴＧＧＴ３’　：Ｇｐｎｏ＋７５　テキ サス州、ザ　ウノドランズ）は５Ｉｌ−ＴＣＲＣβ１と２に対して特異的である 。小文字での塩基はＥＣＯＲ■工／ドヌクレアーゼ部位を形成するように製造さ れたＴＣＲＣβ配列からの変化を意味する。１２℃にお（ブる９０分間のインキ ュベーション後に、反応混合物を９５℃において５分間加熱して、Ｄ　Ｎ　Ａ　 ／　ＲＮ　Ａ二本鎖を変性させた。
ＰＣＲｔｉｅ［：ｃＤＮＡを１．５ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ、Ｔａｑ緩衝液、２ｘｌｌ　 Ｃβオｊ１ゴヌクレオチド　プライマー、２．ＭＶβ８ファミリー特異的オリゴ ヌクレオ羊ト、２００ｊＭ　ｄＮＴＰおよび２単位Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ ＩＰｂｈｔ１ｍｚｃｉｉ）を含む１００ｄ量中で増幅させた。Ｖβ８特異的オリ ゴヌクレオチド、５′ＧＧＧＣＣＧＣＧＧＡＡＣＡＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡ ＧＴＣＡＣ３’　は全ての公知ラットＶβ８ファミリー要素を増幅させて、５’ ５ａｃＩｌ制限工ンドヌクレアーゼ部位を含む。各サンプルを鉱油で覆い、これ に対してサーモサイクラ−（ｔｈ＋：ｌ１ｏｃ７ｃｌｕ）　（Ｐｕｋｉｎ　ＥＩ Ｉｌｌ、コネティカット州、ノルウオーク）において９２℃において１分間、５ ５℃において１．５分間および７２℃において２分間の増幅サイクル３０回を実 施した。
ＤＮＡ配列決定、増幅後に、サンプルをクロロホルム抽出して、鉱油を除去し、 エタノール沈降させ、５ａｃ１１プラスＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　（Ｎｏｖ　Ｅｎｇｌ ｘｎｄ　Ｂｉｏｌｚｄ＋、７す壬ユセッツ州、ビバリー）によって消化させ、得 られたＤＮＡを１．４％アガロースゲル上に分離した。適当なサイズの生成物を Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒ＋ｄ　、　カリフォルニア州、リッチモン ド）を用いてアガロースから直接単離し、ｐＢｌｕ＋ｉｃ＋ｉｐｌ　ＩＩ　（Ｓ ｌ＋ａｌａｇｅｎ＋、カリフォルニア州、サンジエゴ）の５ａｃｎ　／　Ｅ　ｃ 　ｏ　Ｒ１部位に連結させた。この連結混合物をＸＬＩ−Ｂｌｕｅ菌株！Ｓｌ＋ ＮＢ＋ｎｅ）に形質転換させた。ランダムに選択された細菌コロニーから標準方 法（Ｍ＋ｎ１ａｔｉ＋ら、　鷺ｏ１ｅｃｕｌｕ　ｃｌｏｎｉｎｇ　＾１ｚｂｏ＋ １ｌｏｒｙ　ｍｘｎｕｌ、　第２版、　Ｃｏ１ｄＳｐ＋＋ｎｇ　Ｈ＋＋ｂｏ＋　 Ｌａｂｏ＋ｘｌｏ＋７．　：、−ヨーク州、コールドスプリング／＼−／＜　− ・１９））によって調製腰ジデオキシ　チェインターミネータ−法（ｄｉｄ＋ｏ ｘ７：ｈ＋ｉｎ　！＋＋ｍ１ｎａＮｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）ｉｓｉＢ！ｌら、ＰＴ ＯＣ，ＮＪＩＩ　＾ｃｉｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ＾　７８２０７２１９７７）　）によ って両方の鎖についてＳ＋ｑｕ＋ｎｘｕ塩基配列決定系（＋＋、　Ｓ。
Ｂｉｏ＋ｈｅｍｉ〔＋１．　オハイオ州、クリーブランド）を用いて配列決定し た。
ＢＰ反応性Ｔ細胞クローンによって発現されるＶＢ２．２−３９−５９ペプチド によってまたは非脳炎誘発性ＥＡＥ保護Ｔ細胞クローンによって発現されるＶＢ ２．６−３９−５９によって、臨床ＥＡＥを上首尾に治療することができたＥｗ ｌｕら、　Ｉ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｕｍ、２４６：　５７７Ｇｆ１９７１））　ｏこ れらの２種ペプチドの塩基配列（表３３）に基づいて、両Ｖ遺伝子の残基４４− ５４を含む共通配列を同定し、以後の研究に用いるために合成した。このペプチ ドはＶＢ２−４４−５４と名付ブチトかより大きいＶＢ２．２−３９−５９ペプ チドと交差反応性のＴ細胞エピトープを含むか否かを評価するために、ラットを ■β８−４４−５４ペプチドによって免疫化し、各ペプチドに対するＤＴＨ反応 性を耳膨潤分析によって評価した。表３４に示すように、両ペプチドに対して非 常に有意な耳膨潤が観察されたが、この反応はＶＢ２−４４−５４ペプチドに対 するよりもＶＢ２．２−３９−５９ペプチドに対する方がやや大きかった。
これに反して、ウサギにおいて■β８．２−３９−５９ペプチドとＶＢ２．６− ３９−５９ペプチドとに対して得られた抗血清はＥＬＩＳＡによって、両方の免 疫化用ペプチドに強く反応し、ＶＢ８　２−４９−５９ペプチドには軽度に反応 した。しかし、この抗血清は共通Ｖβ８−４４−５４ペプチドまたはＣＤＲＩ。
ＣＤＲ３もしくは■β１４ＴＣＲペプチドのいずれにも反応しなかった（表３５ ）。これらのデータは、■β８．２−３９−５９ペプチドとＶＢ２．６−３９− ５９ペプチドとに比へて、ＶＢ２−４４−５４ペプチドが交差反応性Ｔ細胞エピ トープを含むが、交差反応性Ｂ細胞エピトープを有さないことを明確に示す。
能動ＥＡＥと受動ＥＡＥとのＴＣＰペプチドによる治療：Ｖβ８−４４−５４ペ プチドが抗ＴＣＲ反応を刺激する親ペプチドの活性を保有するか否かを判定する ために、各ペプチドをＧ　ｐ　−Ｂ　Ｐ／ＣＦ人免疫化ラットに臨床ＥＡＥの第 １日に皮下注射した。図２１に示すように、ＶＢ２−４４−５４ペプチド１１０ ０ｊは能動的誘導ＥＡＥの重症度と期間との減少に関してＶＢ２．２−３９−５ ９ペプチドと■β８．６−３９−５９ペプチドとに匹敵する活性を有した。これ に比べて、ＶＢ２２配列のＣＤＲＩ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域からの他のペ プチドはＥＡＥに対して殆ど治療効果を有さなかった。
ＴＣＲペプチドは能動的誘導ＥＡＥに対して治療活性を明らかに有するが、受動 疾徽に対するこれらの効果は報告されていない。親Ｖβ８．２−３９−５９ペプ チド（図２２）またはより短いＶＢ８１４−５４ペプチドの注入は、ＢＰに対し て特異的なＶＢ２２＋Ｔ細胞ラインによる受動的誘導ＥＡＥの重症度と期間との 明白な減少を生じた。
ＶＢ２−４４−５４に特異的なＴ細胞の特徴つけ共通Ｖβ８−４４−５４ペプチ ドに対するＴ細胞反応を特徴づけるために、リンパ節細胞とＴ細胞ラインとを多 様なＴＣＲペプチドによって刺激した。ＣＦＡ中のＶＢ２−４４−５４ペプチド によって免疫化したラットからのリンパ節は、この共通ペプチドに有意に反応し 、ＶＢ２．２遺伝子とＶＢ２．６遺伝子の両方に表されるより長い３９−５９配 列並びにＰＰＤに対しては予想通りに軽度に反応した（表３４）。しかし、免疫 化用Ｖβ８−４４−５４ペプチドとの重複残基６個を有するＶＢ２．２−４９− ５９配列に対して、またはＶＢ２゜２−２５−４１ペプチド（ＣＤＲＩ領域）に 対して、またはＶＢ１４−３９−５９に対しては反応が観察されなかった。ＶＢ ２−４４−５４ペプチドによって反復刺激したＴライン細胞はこの特定ペプチド に最も良く反応し、より長いＶＢ２．６−３９−５９ペプチドとＶＢ２．２−３ ９−５９ペプチドとに対しては軽度に反応したが、試験した他のペプチドまたは 抗原に対しては反応しなかった（表３３）。
ＶＢ２−４４−５４反応に対するＴ細胞の反応は、ＭＨＣクラス１分子に対する 抗体の存在下では７６％阻害されるが、ＭＨＣクラス■分子に対する抗体によっ ては阻害されなかった（表３６）。Ｔライン細胞は、既述したように、〉９５％ ＣＤ４＋かつ弱ＣＤ８＋であった。
ＶＢ２−４４−５４反応性Ｔ細胞ラインによって伝達される保護　ＶＢ２−４４ −５４ペプチド特異性Ｔ細胞ライン内の保護活性を評価するために、ラットにＧ 　ｐ−Ｂ　Ｐ／ＣＦ　Ａの脳炎誘発量と活性化Ｔ細胞１２百万個とを同時に注入 した。図２３に示すように、ＴＣＲ特異性Ｔ細胞を受容したラットは、重度な臨 床徴候を発現した無処理対照に比べて、ＥＡＥの遅延型発現を示し、最小の徴候 を発現した。
ＶＢ２−４４−５４反応性Ｔ細胞クローンの単離　クローナルレベルで抗ＴＣＲ ペプチド反応を特徴づけるために、初期Ｔ細胞ラインからクローン１０個を単離 して特徴づけた。表３７に示すように、各クローンはＶβＬ−４４−５４ペプチ ドに対して１０ｘから１３００ｘまでの範囲の刺激率（出ｍｏｌｉｌｉｏｏ　１ ｎｄｅｘ）によって強く反応し、■β８．２−３９−５９またはＶＢ２．６−３ ９−５９ペプチドに対しては弱く反応するかまたは全く反応しなかった。３種の ペプチドの全てによって試験したクローン４個の中の３個が共通Ｖβ８−４４− ５４ペプチドに対して選択的に反応したが、１クローン（Ｂ７）のみはＶＢ２− ４４−５４＞■β８．２−３９−５９＞ＶＢ２．６−３９−５９の反応によって 特徴づけられるＴ細胞ライン反応パターンを示した（表３７）。クローンの生存 力の喪失はＥＡＥ保護活性の個々の試験を妨害した。
ＶＢ２−４４−５４反応性Ｔ細胞ラインとクローンの■遺伝子表現　出発Ｔ細胞 ラインと■β８−４４−５４β８−４４−５４反応性側細胞クローン３ＲＶβ遺 伝子表現をＰＣＲ法によって確認した。Ｔ細胞ラインはＶＢ２．２゜８、　６． 　１０．　１２．　１５および１つを含めて６種の検出可能なＶβ遺伝子を表現 した（表３６）。これらのＶβ遺伝子の中の２種は個別に分析したＴ細胞クロー ン３個のＴＣＰにおいて確認された（クローンＢ３はＶＢ１０を表現し、クロー ンＢ９とＤ４はＶＢ１２を表現した。表３６）。表３７に示すように、これらの ３クローンの各々はＶＤＪ領域を通して明確なヌクレオチドとアミノ酸の配シ１ ｊを賀した。
八−！ ｂａａデータは、抗原活性とＥ　Ａ、　Ｅ調節活性の両方がＶＢ２．２とＶＢ２ ．６ＣＲＤ２ペプチド中に見出される共通配列を表す１１残基ペプチド中に存在 することを決定的に実証する。この共通ペプチド、ＶＢ２−４４−５４は能動Ｅ ＡＥと受動ＥＡＥの両方の治療において同様な活性を有し、より長いＶＢ２．　 ２−３９−５９ペプチドと同様に、ＭＨＣＩによって制限される保護ＴＣＲペプ チド特異性ＣＤ、４−、ＣＤ８”″Ｔ細胞を刺激する。この実施例は、脳炎誘発 性ＢＰ反応性Ｔ細胞による■β８．２の偏った表現とは明確に対照的に、ＶＢ２ −４４−５１反応性Ｔｉ１ｌｌｌａクローンがそれらのＴＣＲにおいて多様なＶ β遺伝子を表現することを、初めて実証する。これらのデータは、一括して考慮 すると、ＶＢ２−４４−５４配列がＥＡＥにおける重要な自己調節性イデイオト ーブを構成することを確立する。
ＴＣＲＣＤペプチドの迅速な臨床効果は、明らかに抗ＴＣＲ免疫に対するＴＣＲ ペプチドの補助効果（ｂｏｏｉ＋ｉｎｇ　＋ｆｉｔｃ＋）によるものであり、こ の補助効果はＥＡＥ中にＶＢ２．２と脳炎誘発性Ｔ細胞クローンとの選択的増加 の結果として自転に発現する。想像では、ＴＣＲＶＢ２．２ペプチドによるＥＡ Ｅ治療はこの疾αの経過に影響することができるが、最大に免疫優性な（ｉｅｍ ａｎｏｄｏｌＩｉｎ＋ｎｌ）エピトープによる最大の活性が期待される。ＶＢ２ −４４−５４ペプチドはＣＤＲＩペプチド（残基２５−４１）、一部重複ＣＤＲ ２ペプチド（残基４９−５９）またはＣＤＲ３ペプチド（残基９３−１０１）よ りも非常に大きな治療活性を有した。ＶβＬ−４４−５４ペプチドの活性は、共 通ペプチドに明らかに存在しないＢ細胞決定因子に関係するのではなく、より長 い親ペプチドにも見出される優性なＴ細胞エピトープに主として関係した。■β ８．２ＣＤＲ１とＣＤＲ３ペプチドか予測されるＴ細胞エピトープを含まず（Ｍ ｕｇ！ｌｉｔ等、　１．　１ｍ１Ｉａｎ。
ｉ３８２２１３（１９ｇ？））　；　（Ｒｏｔｈｂｕｆｌら、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯ ｌｏａ＋ｎ＋ｌ　７：　９３［１９ｇ８１）　、’−１ずれ■ ペプチド免疫化ラットにおいて強い遅延型過敏症反応を誘導することができなか った（Ｏ［ｌｎｕら、　Ｐ＋ｏｇ、Ｃｌ１ｎ、Ｂｉｏｌｏｇ、Ｒｈ、３３６：　 ９３（１９９０１）ことは、注目に値する。これに反して、ＶＢ２．２−４９− ５９ペプチドは予測された抗原性と抗体決定因子とを有したが、ルイスラットに おいてごく弱いＤＴＨ反応を誘導した。付加的なＣＤＲ２ペプチド、■β８．２ −３９−５１は抗原活性または保護活性を有さなかった。これらの結果から、Ｖ Ｂ２−４４−５４配列がＣＤＲＩおよびＣＤＲ３に比べて免疫優性であるＣＤＲ ２ｆｌｉ域に主要Ｔ細胞エピトープを表すことは明らかである。
能動的誘導ＥＡＥに対するこのエピトープの免疫調節活性は明確に実証されてい る。しかし、受動的誘導ＥＡＥに関しては、この誘導期間が１２日間から３〜４ 日間にかなり短縮される。データ（図２２）は、転移Ｔ細胞への３〜４日間暴露 かレンピエント（＋＋ｃｉｐｉｅｎｌ）を能動ＥＡＥの治療中に観察されるもの と同じＴＣＲペプチド補助効果に感染しやすくなるという結論（ｌＬｏｖｅ　ｌ 　ｌら、　５ｃｉｅｎｃ＋　２４６６６８１１９８９１１を支持する。受動モデ ルで対処することができる付加的問題は、活性化Ｔ細胞の高用量で誘導される致 死ＥＡＥに対するＣＤＲ２ペプチドの効力である。この場合に、ＶＢ２．２−３ ９−５９ペプチドによる治療はレンピエノトの全てを致死ＥＡＥから保護しく図 ２１Ａ）、比較的軽症の疾患経過を可能にした。
あまり重症でないＥＡＥを生ずる低いＴ細胞用量では、ＶＢ８−４４−５４ペプ チドとＶＢ２．２−３９−５９ペプチドとの両方が同じような治療利益をもたら した。
発明者は、実施例■において既に、■β８．２−３９−５９ペプチドに対して特 異的な、ＥＡＥ保護Ｔ細胞ラインをペプチド免疫化ラットから選択できることを 実証した。これらの細胞は強＜　ＣＤ４＋であり、弱＜ＣＤＳ＋であり、ＣＤ８ 分子の利用可能性がＴＣＲペプチド認識の見かけのＭＨＣ−１制限の説明を容易 にした。同様に、この実施例はＶβ８ｉ４−５４ペプチドに対して特異的な、Ｅ ＡＥ保護Ｔ細胞ラインの選択を実証する（表３６）。このラインでは、ＶＢ８− ４　＝１−５４ペプチドの認識は、ＣＤ４＋、ＣＤ８””　Ｔ細胞に関係上これ らの細胞の反応は非常にペプチド特異的であり、ＭＨＣ−ｎにではなくＭＨＣ− １に対する抗体によって抑制可能である。ＶβＬ−４４−５４ペプチドに対して 特異的なＴ細胞ラインおよびクローンの単離（表３７）は、ＴＣＲイディオトー ブの認識に関与するＶ遺伝子レパートリ−（ｎｐｕｌｏｉｎ）の評価を初めて可 能にする。支配的なＶ遺伝子（ＶＢ１５）は調節された■遺伝子（ＶＢ８．２） から識別可能であった。しかし、抗Ｖβ８−４４−５４反応性ライン細胞の少な くとも一部もＶＢ２．２を表現し、これらの調節細胞自体が自己調節を受ける可 能性を高めた。二のようなＶＢ２．２＋Ｔ細胞の単なる存在が免疫調節機構とし てクローノ欠失を防止し、このことはＶＢ２．２＋細胞と抗Ｖβ８．１３９−５ ９特異的調節細胞との間の非細胞溶解性Ｔ−Ｔ相互作用を示す以前のデータを支 持する。
さらに一般的には、このデータは、ＴＣＲエピトープに対して特異的な自己反応 性Ｔ細胞か胸腺においてネガティブな選択を免れるのみてなく、偏ったＴＣＲＶ 遺伝子表現を含む非常に集中的な（Ｉｏｃｕ＋ｅｄ１反応を発現する動物におい て比較的容易に誘発されることができるという考えを支持する。これらのファク ターは、ＴＣＲペプチドの細胞と体液性との認識がｉｎ　ｖｉｖｏでの重要な自 己調節機構を表すことを実証し、この機構はヒトの免疫関連疾患の治療にも適用 される。
表３３ ＴＣＲＶＢ２２ペプチドと■β８．６ペプチドとの塩基配列Ｖ＃　８．２−２５ −１１　（ＣＤＲＩＩ　ＫＱＮＮＮＩＩＮＮＭＹｎＱＤＭＧ■β８．２−３９− ５９　（ＣＤＲＩＩ　ＤＭＧＩＩＧＬＲＬＩＩＩＹＳＹＤＶＮＳＴＥＫＧＶβ８ ．２−４４−５４　（ＣＤＲ２１ＬＲＬＩＩＩＹＳＹＤＹＮＶＢ　８．６−３９ −５９　（Ｃ［１Ｒ２１Ｎ、、ＤＥ、、、、、、、、、、Ｊ。
Ｖβｇ２４ｇ　５ｇ　ＹＳＹＤＶＮＳＴＥＫＧＶβ８２−Ｄβｌ−１βｌ−９３ −１０１ｊｃＤＲ３）　ＡＳＳＤＳＳＮＴＥ表３４ ＶＢ８１４−４５／ＣＦＡによって１４日間免疫化したう・ソトにおける■β８ ．２−３９−５９とＶＢ２．６−３９−５９とに数値は免疫化ラット６匹におけ る正味耳膨潤の平均埴土Ｓ、Ｄ、を表す。ネイティブなラットにおけるバックグ ラウンド耳膨潤は両ペプチドに対して６＋１ｍであった。
表３５ 抗血清は、完全Ｆｒｅｕｎｄアジ二ノ＜ンドによってエマルジーンイヒした遊離 ペプチドによる免疫化の過程を用いて、ウサギにおいて調製した。抗血清（！１ ・８０．０００希釈度で試９］−だ。最終抗体価はＥＬ　Ｉ　ＳＡによって！ｉ ！、録し、一連の血清希釈夏と、９６孔プレートにおける培養ペプチド２５ｎｔ ／孔とを用０て４５ＱｎｍｌこおいてＯ，Ｄ、ｍ位として表した。
表３６ ＶＢ２−４４−４５／ＣＦＡ免疫化ラツトからのＴ細胞の反応表３７ 増殖反応　（ＣＰＭ／１０００）　ＴＣＩＩ　Ｖβ遺伝子Ｂ３　１．６　５７　 １．１　１Ｊ　ＩＱＢ７　０．Ｉ　ＩＩ　３　６　ＮＣ Ｈ３０，１２ＮＤ　ＮＤ　１２ ８ＩＯ０，４１Ｎｌｌ　Ｎ［ｌ　ＮＤ Ｂｌｌ　Ｏ，２９０，７０，３１１Ｄ Ｃ１ｌ　０．２　１７　８Ｄ　Ｎ［Ｉ　ＮＤＣ１２０，１１０８Ｎｉｌ　ＩＩＤ 　Ｎ［１Ｃ１６０，３５Ｎｉｌ　ｔｉｌｌ　Ｎ［ｌＤｉ　Ｏ，＋　１３０　０． ８　０．８　１１ＤＤ４　０．５　８０　ＮＤ　ＮＤ　１２ライン　１０　２３ ８　１０２　１６２　８．２１．６；１０１２：１５：１９ 表３８ ＶβＥ１４４−４５決定因子に特異的なＴ細胞クローンのＴＣＲＶβＤβＪβ領 域のヌクレオチドとアミノ酸配列クローン　Ｖ　（Ｎ）　Ｄ　（Ｎ）　Ｊ実施例 ＸＩＶ ＴＣＲペプチドに対するトキシン結合抗体による自己免疫疾患の治療この実施例 では、ＴＣＲＶβ８　（３９−５９）ペプチドによってマウスを免疫化し、上述 のようなハイブリドーマ形成方法を実施することによってｍＡｂを生成した。次 に、このｍＡｂをリノンＡ鎖に結合させて、イムノトキシンを得た。
このトキシン結合抗体をＧＰＢＰの脳炎誘発量と同時にラットに注入しく予防） 、他のラットにＥへＥ発現後に注入する（治療）。リシンＡ鎖結合抗ＴＣＲペプ チド抗体による予防処置（０，０５〜０．２■／ｋｇの用量で１〜４回注入）は 、ＥＡＥの発生率と重症度との有意な減少を生ずる。この結合体の同様な用量に よる治療処置はこの疾患の持続期間の短縮と重症度の軽減とを生ずる。
この実施例は、本発明の組成物と方法とによってヒトの慢性関節リウマチがどの ように治療されるかを述べる。この実施例は下記２種の動物モデルによって設計 する　（１）■型コラーゲンの注入によって影響されやすいマウスに誘導した関 節炎（Ｓｌｕｕｌら、＾ａｎ、　Ｒｅｙ、１ｍｍｕｎｏ１．　２：　１９９−２ １Ｈ１９８４１）および（２）ミコバクテリア熱／ヨソクタンパク質（Ｈ３Ｐ） の注入によって影響されやすいマウスに誘導した関節炎（Ｖｚｎ　Ｅｄｅｎ、　 Ｗ　ら、　ＮＮｕｒ１３３１：　１７１−１７３（１９８８１）。コラーゲンま たはＨＳ　Ｐに反応し、この疾をを伝達することができる関節炎誘発性Ｔ細胞を 上記方法を用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでコラーゲンまたはＨ３Ｐの存在下で選択 する。疾虫仲介Ｔ細胞に関連するＴＣＲを確認し、推定アミノ酸配列を上述のよ うに核酸配列決定法によって決定する。１１ｕｇｚｌｉｌらとＲｏｌｈｂｕｉら （上記文献）のアルゴリズムを用いて、ＣＤＲまたは超可変部を含むＴＣＲの免 疫原部分を合成し、用いて、マウス（コラーゲン関節炎用）またはラット（アジ ュバント関節炎用）を免疫化する。
疾患誘導と共にＴＣＰペプチドによって処置した動物は、同時（ｉｏｉｎｔ）膨 潤と関節炎誘発体（ｕｌｔｕ目ｏｇ＋ｎ）に対するＴ細胞反応性とによる評価に よると、関節炎の発現からａ意に保護される。この疾患の発現後にＴＣＲペプチ ドによって治療した動物は関節炎の症状の持続期間の短縮と重症度の軽減とを示 す。
関節炎に関連するＴＣＲペプチドに対して誘導される抗体による受動免疫化も、 関節炎誘導に対して、同様な予防効果と治療効果とを示す。ポリクローナル抗体 、ｍＡｂ、キメラ抗体、およびイムノドキノン結合抗体によって上首尾な治療が 達成される。
関節炎関連ＴＣＲペプチドに特異的なＴ細胞による受動免疫化は、関節炎の発現 と進行とに対して予防的および治療的に保護免疫を誘導する。
橋本甲状腺炎とＧｒ＆ｖｅｉ病とを含めたヒト甲状腺炎を、この実施例に述べる ように、本発明の組成物と方法とによって治療する。標的自己抗原の正確な性質 は不明であるが、サイログロブリンとサイロトロフィン受容体とに対する免疫反 応は、それぞれ、これらの疾患を付随する。サイログロブリンの投与によってマ ウスに甲状腺炎を設計する（Ｍｚ＋ｏｎ、　Ｒ，ら、　１．　ＥＩ９．　Ｍｃ＋ １．　１５２：　１１１５−１１２０ｆ１９Ｈ１ｌ。サイログロブリンと甲状腺 濾胞細胞抗原とに反応性であり、この疾患を伝達することができるＴ細胞を、上 記方法を用いて、サイログロブリン、甲状腺細胞、または甲状腺細胞膜製剤のい ずれかの存在下でｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて選択する。
疾患仲介Ｔ細胞を付随するＴＣＲを確認し、推定アミノ酸配列を上述のように核 酸配列決定法によって決定する。Ｍｕｇｚｌｉｌ　らとＲｏｌｈｂｕｄら（上記 文献）のアルゴリズムを用いて、ＣＤＲまたは超可変部を含むＴＣＲの免疫原部 分を合成し、用いて、マウスを免疫化する。
疾患誘導と共にＴＣＲペプチドによって処置した動物は、甲状腺炎と甲状腺抗体 に対するＴ細胞反応性との発現から有意に保護される。この疾患の発現後にＴＣ Ｒペプチドによって治療した動物は甲状腺炎の症状の持続期間の短縮と重症度の 軽減とを示す。
甲状腺炎に関連するＴＣＲペプチドに対して誘導される抗体による受動免疫化も 、疾患誘導に対して、同様な予防効果と治療効果とを示す。ポリクローナル抗体 、ｍＡｂ１キメラ抗体、およびイムノドキノン結合抗体によって上首尾な治療が 達成される。
甲状腺炎関連ＴＣＲペプチドに特異的なＴ細胞による受動免疫化は、甲状腺炎の 発現と進行とに対して予防的および治療的に保護免疫を誘導する。
インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）または■型糖尿病はランゲルハンス 島（またはヘータ）細胞に対する免疫反応性を特徴とし、この細胞の破壊とイン ツユリン産生の停止とを生ずる自己免疫疾患である。この免疫作用の標的抗原は 確実にまだ特徴つけられていない。この実施例は、本発明の組成物と方法とによ ってＩＤＤＭがどのように治療されるかを述べる。
この疾患を、この疾患が自然に発生する動物に設計するか、またはマウスのある 種の系統に誘導することがてきる（Ｋａｎｉｔｘｖ＋ら、　Ｄｉ！ｂ＋ｌｏｌｏ ｇｉｘ　２７：　１１３１１９８１＋）。影響されやすい系統からリンパ球を転 移させることによって、他のマウスにこの疾患を発現させることができる。
ランゲルハンス島細胞抗原に反応性であり、この疾患を伝達することができるＴ 細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいてランゲルハンス島細胞抗原に反応性であり、こ の疾患を伝達することができるＴ細胞を、上記方法を用いて、ランゲル・・ノス 島細胞、またはランゲルハンス島細胞膜製剤のいずれかの存在下で１ｎｖｉｔｒ ｏにおいて選択する。疾患仲介Ｔ細胞に関連するＴＣＲを確認し、推定アミノ酸 配列を上述のように核酸配列決定法によって決定する。Ｖｕｇｘｌｉｌ　らとＲ ｏ＋ｈｂｕａ等（上記文献）のアルゴリズムを用いて、ＣＤＲまたは超可変部を 含むＴＣＰの免疫原部分を合成し、用いて、マウスを免疫化する。
疾患誘導と共にＴＣＲペプチドによって処置した動物は、糖尿病とランゲルハン ス島細胞抗原に対するＴ細胞反応性との発現から有意に保護される。この疾Ｗの 発現後にＴＣＲペプチドによって治療した動物は糖尿病の症状の持続期間の短縮 と重症度の軽減とを示す。
糖尿病に付随するＴＣＰペプチドに対して誘導される抗体による受動免疫化も、 疾Ｐｙ８導に対して、同様な予防効果と治療効果とを示す。ポリクローナル抗体 、ｍＡｂ、キメラ抗体、およびイムノドキノン結合抗体によって上首尾な治療が 達成される。
糖尿病関連ＴＣＲペプチドに特異的なＴ細胞による受動免疫化は、糖尿病の発現 と進行とに対して予防的および治療的に保護免疫を誘導する。
本発明をここで詳しく説明したが、本発明が同等のパラメータ、濃度および条件 の広い範囲内で、本発明の要旨と範囲とから逸脱せずに、過度な実験を行わずに 、実施され得ることは当業者によって理解されるであろう。
本発明をその特定の実施態様に関連して説明したが、本発明がこれ以外にも変更 可能であることは理解されよう。本出願は一般に、本発明の原理に従う、本発明 の如何なる変化、使用または適用をも含み、かつ本発明が関係する分野における 公知のもしくは慣習的な実施において生ずるような、また請求の範囲における通 りの、上記本質的な特徴に適用されるような、本発明の開示からの発展をも含む ように意図されるものである。
（％）　薗　に −どこと宋音 一、＝Ｃと峯奮 −メロ″ｒ：七靜 浄＠（内容に変更ない ■　増　殖　Ｏω　ロクローン゛（％ＪＦＩＧ、７ ＴＣＲＣＤＲ２ペプチドに対する応答 口ＴＣＲ／ＣＦＡ　巳ＢＰ／ＣＦＡ 図ｒｃＲ１ＣＦＡ爾ＢＰ／ＣＦＡ −を口と重両 ＦｆＧ、１０Ａ ＦＩＧ、１０Ｂ ｑ−ｇｏｔ　ｉ　珈 に−９０１配　丞 （ニー”０１　配　黴 −を口と↓奮槙士 つＶヨギ節　ｑフ ：　ζ■ 浄書（内容に変更なし） 浄斎（内容に変更なし） 浄書（内容１こ変更ない 浄３（内容（０変更な５） ＦＩＧ、２０Ａ ＦＩＧ、２０Ｂ 浄書（内容に変更なし） ｎＧ、２１Ａ ＦＩＧ、２１　Ｂ −１口と困■ 浄書（内容に変更ない ４　５　６　７　［１９１０１＋　１２移植後日数 ＦＩＧ、２３Ａ ＦＩＧ、２３Ｂ （％）８［らωく一ロ６玉り菫こ−８日平成　６年７月７８日

Claims (54)

    【特許請求の範囲】
  1. １．Ｔ細胞受容体のアミノ酸配列を含む約１５−３０アミノ酸を有するペプチド であって、該Ｔ細胞が免疫関連疾患に特有のマーカーＴ細胞受容体であり、該ペ プチドが核疾患からの防御を誘導することができる上記ペプチドまたは該ペプチ ドの機能的誘導体。
  2. ２．前記のアミノ酸配列がＴ細胞受容体Ｖ遺伝子によってコードされている請求 項１に記載のペプチド。
  3. ３．前記のアミノ酸配列が前記のＶ遺伝子のＶＤＪ領域によってコードされてい る請求項２に記載のペプチド。
  4. ４．前記のアミノ酸配列が前記のＶ遺伝子のＶＪ領域によってコードされている 請求項２に記載のペプチド。
  5. ５．前記のアミノ酸配列が相補性決定領域の少なくとも一部分を含む請求項２に 記載のペプチド。
  6. ６．前記の相補性決定領域が第二相補性決定領域ＣＤＲ２である請求項５に記載 のペプチド。
  7. ７．前記のアミノ酸配列が超可変領域の少なくとも一部分を含む請求項２に記載 のペプチド。
  8. ８．前記のアミノ酸配列が、【配列があります】である請求項１に記載のペ プチド。
  9. ９．担体に対して結合した請求項１に記載のペプチド。
  10. １０．抗体に対して結合した請求項１に記載のペプチド。
  11. １１．前記の抗体が単クローン性抗体である請求項１０に記載のペプチド。
  12. １２．請求項１〜１１のいずれかに記載のペプチドを薬学的に許容し得る賦形剤 と一緒に含む薬剤組成物。
  13. １３．前記の疾患が自己免疫疾患である請求項１に記載のペプチド。
  14. １４．前記の自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、アジュバント関節炎、重症筋 無力症、脳脊髄炎、多発性硬化症、甲状腺炎、糖尿病、炎症性腸疾患および全身 性エリテマトーデスから成る群より選択される請求項１３に記載のペプチド。
  15. １５．前記の疾患が悪性疾患である請求項１に記載のペプチド。
  16. １６．前記の悪性疾患がＴ細胞リンパ腫である請求項１５に記載のペプチド。
  17. １７．被験者に対して有効量の請求項１に記載のペプチドを投与することを含む 免疫関連疾患を予防する方法。
  18. １８．被験者に対して有効量の請求項１２に記載の薬剤組成物を投与することを 含む免疫関連疾患を予防する方法。
  19. １９．被験者に対して有効量の請求項１に記載のペプチドを投与することを含む 免疫関連疾患を抑制する方法。
  20. ２０．被験者に対して有効量の請求項１２に記載の薬剤組成物を投与することを 含む免疫関連疾患を抑制する方法。
  21. ２１．被験者に対して有効量の請求項１に記載のペプチドを投与することを含む 免疫関連疾患を治療する方法。
  22. ２２．被験者に対して有効量の請求項１２に記載の薬剤組成物を投与することを 含む免疫関連疾患を治療する方法。
  23. ２３．前記の疾患が自己免疫疾患である請求項１７〜２２のいずれかに記載の方 法。
  24. ２４．Ｔ細胞受容体のアミノ酸配列を有するペプチドを選択する方法であって、 該丁細胞が免疫関連疾患に特有のマーカーＴ細胞受容体であり、該ペプチドが該 疾患からの防御を誘導することができる、（ａ）該疾患に感受性の被験者からＴ 細胞を取出し；（ｂ）工程（ａ）の該Ｔ細胞を自己抗原標品の存在下の培養中で 増大させ；（ｃ）工程（ｂ）の該増大したＴ細胞によって発現された丁細胞受容 体を議別し；そして （ｄ）該ペプチドを議Ｔ細胞受容体のアミノ酸配列から選択する工程を含む上記 方法。
  25. ２５．前記の識別工程（ｃ）が、前記のＴ細胞受容体をコードするＶ遺伝子の少 なくとも一部分のヌクレオチド配列を決定することを含む請求項２４に記載の方 法。
  26. ２６．前記の識別工程（ｃ）が、前記のＴ細胞受容体の少なくとも一部分のアミ ノ酸配列を決定することを含む請求項２４に記載の方法。
  27. ２７．Ｔ細胞受容体のアミノ酸配列を有するペプチドを製造する方法であって、 該Ｔ細胞が免疫関連疾患に特有のマーカーＴ細胞受容体であり、該ペプチドが該 疾患からの防御を誘導することができる、（ａ）請求項２４〜２６のいずれかに 記載の方法に従ってペプチドを選択し；そして （ｂ）該ペプチドを合成する工程を含む上記方法。
  28. ２８．前記の合成が化学合成による請求項２７に記載の方法。
  29. ２９．前記の合成が、前記のペプ千ドをコードするヌクレオチド配列の発現によ る請求項２７に記載の方法。
  30. ３０．免疫関連疾患から被験者を防御することができる多クローン性抗体を製造 する方法であって、 （ａ）動物に対して請求項１または９に記載のペプチドを投与し；そして（ｂ） 該抗体を該動物の体液から製造することを含む上記方法。
  31. ３１．免疫関連疾患から被験者を防御することができる単クローン性抗体を製造 する方法であって、 （ａ）動物に対して請求項１または９に記載のペプチドを投与し；（ｂ）該動物 から脾臓細胞またはＢ細胞を取出し；（ｃ）該脾臓細胞またはＢ細胞を、該単ク ローン性抗体を分泌するハイブリドーマの生産を引起こす融合相手の細胞系と融 合し：そして（ｄ）該分泌された単クローン性抗体を製造することを含む上記方 法。
  32. ３２．前記の動物が前記の免疫関連疾患に対して感受性の被験者である請求項３ ０または３１に記載の方法。
  33. ３３．請求項１に記載のペプチドに特異的な抗体。
  34. ３４．多クローン性抗体である請求項３３に記載の抗体。
  35. ３５．単クローン性抗体である請求項３３に記載の抗体。
  36. ３６．キメラである請求項３３に記載の抗体。
  37. ３７．細胞障害性物質に対して結合した請求項３３〜３６のいずれかに記載の抗 体。
  38. ３８．前記の細胞障害性物質がリボソーム阻害タンパク質である請求項３７に記 載の抗体。
  39. ３９．前記のリボソーム阻害タンパク質がりシンＡ鎖である請求項３８に記載の 抗体。
  40. ４０．被験者に対して有効量の請求項３３〜３９のいずれかに記載の抗体を投与 することを含む免疫関連疾患を予防する方法。
  41. ４１．被験者に対して有効量の請求項３３〜３９のいずれかに記載の抗体を投与 することを含む免疫関連疾患を抑制する方法。
  42. ４２．被験者に対して有効量の請求項３３〜３９のいずれかに記載の抗体を投与 することを含む免疫関連疾患を治療する方法。
  43. ４３．免疫関連疾患から被験者を防御することができる防御Ｔ細胞を製造する方 法であって、 （ａ）該被験者からＴ細胞を取出し； （ｂ）工程（ａ）のＴ細胞を、請求項１に記載のペプチドの存在下の培養中で増 大させて防御Ｔ細胞を生じ： （ｃ）工程（ｂ）の該増大したＴ細胞から該防御Ｔ細胞を製造する工程を含む上 記方法。
  44. ４４．工程（ａ）の前に、前記の被験者に対して請求項１に記載のペプチドを投 与する工程をさらに含む請求項４４に記載の方法。
  45. ４５．被験者に対して有効量の請求項４３または４４に記載の方法に従って製造 された防御Ｔ細胞を投与することを含む免疫関連疾患を予防する方法。
  46. ４６．被験者に対して有効量の請求項４３または４４に記載の方法に従って製造 された防御Ｔ細胞を投与することを含む免疫関連疾患を抑制する方法。
  47. ４７．被験者に対して有効量の請求項４３または４４に記載の方法に従って製造 された防御Ｔ細胞を投与することを含む免疫関連疾患を治療する方法。
  48. ４８．被験者に対して有効量の請求項４３に記載の方法に従って製造された防御 Ｔ細胞および有効量の請求項３３に記載の抗体の組合わせを投与することを含む 免疫関連疾患を予防する方法。
  49. ４９．被験者に対して有効量の請求項４３に記載の方法に従って製造された防御 Ｔ細胞および有効量の請求項３３に記載の抗体の組合わせを投与することを含む 免疫関連疾患を抑制する方法。
  50. ５０．被験者に対して有効量の請求項４３に記載の方法に従って製造された防御 Ｔ細胞および有効量の請求項３３に記載の抗体の組合わせを投与することを含む 免疫関連疾患を治療する方法。
  51. ５１．前記の疾患が自己免疫疾患である請求項４３，４４，４８，４９または５ ０のいずれかに記載の免疫関連疾患を治療する方法。
  52. ５２．前記の自己免疫疾患が多発性硬化症である請求項５１に記載の方法。
  53. ５３．前記のペプチドが、 Ｖβ５．２（２６−４３）、Ｖβ５．２（３９−５９）、Ｖβ５．２（５９−７ ８）、Ｖβ６．１（１−２２）、Ｖβ６．１（３９−５９）、Ｖβ６．１（７０ −８８）、Ｖβ８．２（３９−５９）、Ｖβ８（４４−５４）、Ｖβ８．６（３ ９−５９）およびＶα２から成る群より選択される請求項１に記載のペプチド。
  54. ５４．被験者に対して有効量の請求項５３に記載のペプチドを１種類または組合 わせで投与することを含む多発性硬化症を治療する方法。
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