KR100304042B1 - 면역-관련 질병용 치료제로서의 ｔ 세포 수용체 펩타이드 - Google Patents

면역-관련 질병용 치료제로서의 ｔ 세포 수용체 펩타이드 Download PDF

Info

Publication number
KR100304042B1
KR100304042B1 KR1020007002105A KR20007002105A KR100304042B1 KR 100304042 B1 KR100304042 B1 KR 100304042B1 KR 1020007002105 A KR1020007002105 A KR 1020007002105A KR 20007002105 A KR20007002105 A KR 20007002105A KR 100304042 B1 KR100304042 B1 KR 100304042B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
tcr
cells
peptide
cell
eae
Prior art date
Application number
KR1020007002105A
Other languages
English (en)
Inventor
반덴바크아더알렌
Original Assignee
데니스 제이. 카를로
더 임뮨 리스판스 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 데니스 제이. 카를로, 더 임뮨 리스판스 코포레이션 filed Critical 데니스 제이. 카를로
Application granted granted Critical
Publication of KR100304042B1 publication Critical patent/KR100304042B1/ko

Links

Abstract

면역 관련된 질환을 예방, 억제 또는 치료할 수 있는 이러한 질환의 특징적인 마커 T 세포 수용체(TCR)의 면역원성 펩타이드를 함유하는 펩타이드 및 약제학적 조성물이 기술되어 있다. 바람직한 양태에서, 펩타이드의 아미노산 서열은 적어도 TCR의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 과가변성 영역의 부분에 상응한다. 수동 전달에 의해 면역 관련된 질환을 예방, 억제 또는 치료할 수 있는, TCR 펩타이드에 대해 면역학적으로 반응성인 항체 및/또는 T 세포도 기술되어 있다.

Description

면역-관련 질병용 치료제로서의 Ｔ 세포 수용체 펩타이드{T cell receptor peptides as therapeutics for immune-related disease}
본 발명은 면역학 및 면역치료학 분야에 있어서 면역-관련 질환을 예방하거나 억제하거나 치료할 수 있는, 펩타이드 및 약제학적 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 다발성 경화증(multiple sclerosis; MS) 환자를 임상적으로 개선시키는 치료요법을 제공한다.
자가면역 질환은 숙주 조직상에서 면역 시스템에 의한 바람직하지 않고 부당한 공격으로 특징지워진다. 이러한 질환 진행에 대한 메카니즘은 잘 밝혀지지는 않았으나, 항원 (및 다른) 맥락에서 항원 제시와 관련한 다소 상세한 사항이 밝혀지고 있다. 현재, 자가항원을 포함한 항원은 항원-제공 세포(antigen-presenting cell; APC)에 의해 프로세싱되며, 생성되는 단편은 이후 주요 조직 적합성 복합체(major histocompatability complex: MHC)에 의해 암호화되는 세포 표면 단백질중 하나와 관련되는 것으로 생각되고 있다. 그 결과, 펩타이드 항원의 인지는 MHC '제한된' 것으로 해석된다. MHC/항원 단편 복합체가 T 림파구의 표면상에서 상보성 T 세포 수용체(T cell receptor; TCR)에 결합하는 경우, 이는 특정 TCR을 생성하는 T 세포의 클론 또는 아집단을 활성화시키고 증식시킨다. 일단 활성화 되면, T 세포는 프로세싱된 항원을 제공하는 면역 시스템의 다른 세포를 조절하고 인지된 항원의 에피토프를 갖는 세포 또는 조직을 파괴시키는 능력을 갖는다.
자가 면역 질환에서 TCR의 역할에 대한 문헌[참조: Acha-Orbea et al., Ann. Rev. Immunol. 7: 371-405(1989)]에서는, 개체의 면역 시스템에 있어 이용가능한 TCR내 거대한 다양성 및 TCR α 및 β 쇄를 암호화하는 DNA의 점 라인(germ line) 유전자 구성 및 재배열에 의한 다양성의 발생을 논하고 있다. α 쇄는 가변(V) 영역, 연결(J) 영역 및 고정(C) 영역 유전자 단편들의 다양한 조합에 의해 암호화된다. TCR β 쇄는 추가로 다양성(D) 영역 유전자 단편에 의해 암호화되므로, 이는 재배열된 VDJC 서열을 포함한다. 대립형질을 배제하면, T 세포 클론은 단지 TCR α-β 이종이량체 유형 하나만을 발현한다.
다수의 사람 질환이 사실상 자가면역 질환으로 분류되었으며[참조: Theofilopoulos, A., In:D.P. Stites et al., eds., Basic and Clinical Immunology, Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 1988], 이들의 예에는류마티스 관절염(RA), 중증성근무력증(MG), 다발성 경화증(MS), 전신 홍반성 낭창(SLE), 자가면역 갑상선염(Hashimoto 갑상선 염), 그레비스(Graves) 질환, 장염 질환, 자가면역 포도막 망막염, 다근염 및 특정 유형의 당뇨병이 있다. 상기의 많은 사람 자가면역 질환에 대해 동물 모델이 개발되고 있다. 이중 최상의 연구용 모델은 MS에 대한 모델인, 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE, 실험실적 자가면역 뇌척수염으로도 불림) 모델이다.
현재 상기 자가면역 질환 및 다른 자가면역 질환은, MHC/자가항원(또는 비-자가항원)에 이들의 TCR이 결합함으로써 자극되는 T 헬퍼 세포의 작용을 수행한다는 사실이 밝혀져서, MHC/항원 복합체와 TCR간의 상호작용을 파괴하는 것을 기본으로 하는 예방 및/또는 치료 전략이 제시되었다. 문헌[참조: Wraith, D.C. et al., Cell 57:709-715(1989)]에서는, T 세포 전체를 사용한 백신처리(후술하는 바와 같이 I. R. Cohnen 실험실에서 최초 기술됨), TCR에 결합하는 항체를 사용한 수동 봉쇄, 복합체의 MHC 부위에 결합하는 항체를 사용하는 수동 봉쇄, T 헬퍼 세포 마커 CD4와 반응하는 항체의 투여, 및 대상 항원을 모사하고 MHC 또는 TCR 분자에 대한 결합시 경쟁하는 펩타이드의 사용을 포함하여, 이러한 원리에 기초한 신도를 제시하였다.
미엘린 기본 단백질인 MBP는 EAE에 수반되는 주요 자가항원이며, MS에 수반되는 뇌염발생원으로서 선두 후보 물질이다.
헤버-카츠 그룹[참조: Heber-Katz, E. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 540:576-577(1988); Owhashi et al., J. Exp. Med. 168: 2153-2164(Dec. 1988)]은,래트 T 세포에 의한 MBP 에피토프의 인지에 대한 정교한 특이성을 분석하였다. MBP로 면역화된 래트로부터의 T 세포를 마우스 T 임파종 세포주와 하이브리드화시키고 클로닝하는 경우, TCR Vβ 유전자 재배열에 대한 서던(Southern) 블롯 분석 및 정교한 특이성의 양상은, 비록 75%의 클론이 68-88 뇌염발생 결정인자와 반응했지만, 폴리클로날 반응을 나타냈다. 하나의 뇌염발생 T 세포 하이브리도마에서 지시된, 10.18로 지명되는 모노클로날 항체(mAb)는, MBP의 68-88 에피토프에 대해 특이적인 T 세포 클론과 유일하게 반응하는 항-이디오타입(anti-idiotype) 또는 항-클론형(anti-clonotype)인 것으로 판명되었다. 그러한 mAb는 뇌염발생의 MBP 펩타이드를 주사했을 때 한지 5일 후, EAE를 차단하거나 역전시킬 수 있었다. 가용성 mAb 10.18은 특정한 T 세포 클론을 차단시켰고, 고정화된 mAb 10.18은 이들의 증식을 자극시켰다. MBP로 EAE를 유도한 후, mAb 10.18-결합 세포의 비율이 초기에는 매우 낮은 빈도였지만, 증가되었다. 상기 저자들은, 10.18+T 세포가 루이스 래트(Lewis rat)내에서 EAE의 유력한 병원성 T 세포 레퍼토리를 나타낸다고 결론지었다. 그러나, mAb 10.18이 V 영역 또는 이디오타입 결정인자를 인지하는지는 밝혀지지 않았다.
TCR αβ 이종이량체를 발현하는 T 세포는 T 세포 작용을 조절할 수 있는 이디오타입 및 V 유전자계-특이적 항체를 유도할 수 있다[참조: Owhashi et al., supra; Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 84: 2936(1987); Kappler et al., Nature 332:35(1988); Kappler et al., Cell 49:263(1987); MacDonald etal., Nature 332:40(1988)]. 예를 들면, TCR Vβ8 서열을 인지하는 항체들은 마우스 및 래트에서 자가 면역을 예방하고 치료하는데 효과적이었다[참조: Owhashi et al., supra; Acha-Orbea et al., Cell 54:263-273(1988); Urban et al., Cell 54: 577-592(1988)]. V 영역 유전자 산물에 대해 선택적인 이러한 항체의 수득하는 것은, 관련 V 유전자계에 의해 암호화되는 TCR을 발현하는 T 세포 클론의 이용 가능성에 따르며, 특이성을 확립하는데 세포 전체를 사용하는 힘든 스크리닝 공정이 요구된다.
MHC 분자 및 CD4 분자에 대한 항체 치료 요법이 일반적으로 일부 자가면역성 동물 모델에서 성공적이었다 해도, T 세포 중 70%가 CD4 마커를 생성하며 모든 T 세포-매개된 반응 및 대부분의 항체 반응이 MHC-관련된 항원 제시를 필요로 하기 때문에, 이들 접근법은 매우 비특이적이며 잠정적으로 과도하게 억제될 수 있다.
다발성 경화증은 중추 신경계 단핵세포 침윤 및 탈수를 특징으로 하는 면역-매개된 질환이다. MS의 발병론은 밝혀지지 않았으나, 유전적 요인과 환경적 요인 모두가 이러한 질환의 진행에 관련되어 있다. 유전적 소인의 주요소는 특정한 제II형 주요 조직적합성 복합체(MHC) 할로형(halotype), 특히 HLA-DR21 및 -DQw1을 갖는 질환과 관련되며[참조: Terasaid et al., Science 1933: 1245-1247(976); Ho et al., Immunogenetics 15:509-517(1982); Spielman et al., Epidemiol. Rev. 4:45- 65(1982); Francis et al., Lancet 1:211(1986); Elian et al., Disease Markers 5:89-99(1987)], 또한 T 세포 수용체(TCR) α-쇄 및 β-쇄 유전자 복합체내의 특정한 다형성과도 관련된다[참조: Beall et al., J. Cell. Biochem. 11D:223(1987); Hauser et al., J. Neurol. 89:275-277(1989); Seboun et al., Cell 57:1095-1100(1989)]. 이들 연구는, 이 질환이 αβ TCR을 갖는 CD4+T-세포를 수반한다는 것을 제시한다. 이러한 고찰을 뒷바침하는 것으로써, CD4+T 세포가 활동성 환자 뇌의 단핵 세포중 주요 성분이며 α-쇄 T 세포 수용체가 MS 환자(대조군은 아님)의 중추신경계 조직내에 존재한다 [참조: Tearasaid et al., Science 193: 1245-1247(976)].
미엘린 기본 단백질(BP)를 인지하는 T 림파구는 동물에서 강력한 탈수화 및 뇌염발생 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다[참조: Ben-Nun et al., Eur. J. Immunol. 11: 195- 199(1981); McFarlin et al., New Eng. J. Med. 307:1183- 1188(1982); Mokhtarian et al., Nature 309:356-358(1984); Vandenbark et al., J. Immunol. 135: 223-228(1985); Zamvil et al., Nature 317:355-358(1985); Bourdette et al., Cell. Immunol. 112:351-363(1988)]. 축적된 증거들도 BP-특이적 T 세포가 MS의 발병에 관련될 수 있다는 것을 제시한다. 따라서, 생체내 활성화를 기본으로 하여 MS 환자들로부터 선택된 세포들은 BP에 대해 특이성을 갖는다. 정상 개체 또는 다른 신경 질환을 갖는 환자들과 비교할때 BP-반응성 T 세포의 빈도 또한 MS 환자들의 혈액 및 뇌척수액(CSF)에서 증가된다. 더우기, 최근 연구에서는 MS 환자 개인의 혈액에 비해 CSF 중에 BP-반응성 T 세포가 보다 현저하게 선택적으로 농축되어 있음이 입증되었다. 동물에서는, 제한된 세트의 TCR α-쇄 가변(Vα) 및 β-쇄 가변(Vβ) 유전가가 BP에 대해 특이적인 T 세포에 의해 이용된다[참조: Acha-Orbea et al., Cell 54:263-273(1988); Urban et al., Cell 54:577-592(1988); Burns et al., J. Exp. Med. 169:27-39(1989); Heber-Katz et al., Immunol. Today 10: 164-169(1989)]. 이들 TCR 가변 영역에 공통적인 서열을 갖는 이들 영역 또는 합성 펩타이드에 대해 지시된 모노클로날 항체는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)에 대한 임상적 시그날을 갖는 동물을 예방하고 치료할 수 있다[참조: Acha-Orbea et al., Cell 54:263-273(1988); Urban et al., Cell 54:577-592(1988); Vandenbark et al., Nature 341:541-544(1989); Howell et al., Science 246:668- 670(1989)]. 유사한 접근법이 MS 환자들에게 적용되기 위해서, 잠정적으로 병원성인 T 세포들도 또한 제한된 세트의 V 영역 유전자를 우선적으로 이용하는 지의 여부를 아는 것이 중요하다.
아이. 알. 코헨(I. R. Cohen) 실험실에서는 EAE, 실험적 자가면역 갑상선염(EAT), 및 실험적 관절염을 치료하거나 예방하기 위한 백신으로서 건강하게 살아있거나 약독화된 T 림파구를 사용하는 자가면역의 면역특이적 치료에 대한 접근법을 개발하였다. 이러한 접근법은 문헌[참조: Cohen, I. R., Immunol. Rev. 94:5-21(1986)]에 기술되어 있으며, 이 문헌에서는 질환-특이적 T 림파구를 사용한 백신처리가 예방 또는 치료 효과를 유발시키는데 이용되었던 자가면역 질환의 몇몇 동물 모델을 논의하고 있다. 백신처리의 정교한 특이성은 T 세포 인지의 정교한 특이성에 의해 지시되며 이는 아마도 TCR을 포함할 것이다. 예를 들어, 각각 MBP의 상이한 에피토프에 반응성인 2개의 다른 항-MBP T 세포주가 특정한 에피토프에 의해 특별히 유발되는 EAE에 대해 백신처리되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 항-이디오타입 면역성의 몇몇 형태를 나타낸다. 그러나, 비-클론성 세포주로부터(갑상선 염증 모델에서) MBP-특이적 T 세포 또는 티로글로불린-특이적 T 세포의 클론을 분리하기 위한 시도를 한 결과, 내성 클론을 제외하고는 질환을 유발시키는 클론만이 수득되었다. 이는, 수압 또는 화학적 가교결합에 의한 세포막의 적당한 응집 또는 경직화로 보다 일관되게 보호를 유도할 수 있는 세포가 수득된다는 발견을 가능케한다. 마찬가지로, 저 용량(아-뇌염발생성)의 MBP-특이적 세포가 또한 치명적힌 EAE에 대해 내성을 유도할 수 있다. 보호 상태는 '역-자가면역성(counter-antoimmunity)'으로 불린다. 이러한 보호 상태는, 백신처리되는 T 세포에 반응하여 특이적으로 증식할 수 있고 시험관내에서 유효기(effector) 클론을 억제할 수 있으며(비-특이적으로, 아마도 억제성 림포킨의 방출을 통해서), 생체내에서 역-자가면역성을 선택적으로(adoptively) 전달할 수 있는 T 세포 클론을 수반한다. 이러한 역-자가면역성은 특정 에피토프에 대한 억제되고 지연된 과감작(DH) 반응 및 임상적 질환의 예방 또는 경감을 수반한다.
앞선 접근법에서의 주요 난점은, 이들이 잘-규정된 치료제를 포함하지 않는 복잡한 생물학적 제제의 사용을 필요로 한다는 것이다. 이러한 제제는 생산 및 유지 요건이 복잡하고(예: 다수의 '백신' T 세포를 생성하는데 멸균 및 다량의 배지가 필요함), 배치에서 배치로의 재생산성이 결여된다. 사람에게 유용한, T 세포 '백신' 제제는 자가적이고(autologous) 개인별로 특이적이어야 하므로, 즉 각각의 환자에 대해서 독특하게 제조되어야 한다. 또한, 이러한 T 세포의 표면상에 추가의 항원이 존재하면 바람직한 T 세포 클론에 제한되지 않는 보다 광범위하고, 가능하게는 치명적인 면역 반응이 초래될 수 있다[참조: Offner et al., J. Neuroimmunol, 21:13-22(1989)].
따라서, 표적화된 자가면역 반응에 대한 특이성, 이들의 선별에 있어서 예측성, 제조의 편의성 및 재생산성, 및 정확한 용량 조절을 가능케하는 충부한 처방을 갖는, 제제 및 약제학적 조성물에 대한 요구가 크다.
현재, MS에 대한 효과적인 치료는 없다[참조: Harrison's Principles of Internal Medicine, 12th ed. Wilson et al., McGraw Hill, Inc. 1991]. 치료적 노력은 급성 에피소드의 개선, 질환의 재발 또는 진행의 방지, 및 증상의 완화에 치중된다. MS의 임상적인 증상은 뇌간, 소뇌 또는 척수의 신경 그룹 또는 영역이 수반되는가에 따른다. 척수의 수반은 대부분의 진행된 MS에 있어 유력한 특징이다.
질환의 급성 에피소드에 있어, 비록 글루코코르티코이드 약물의 사용으로 궁극적인 회복이 개선되거나 영구적인 무능(disability) 정도가 변화되지 않는다고 지적되었지만, 증후군의 중증도를 경감시키고 회복을 가속화하는데 효능이 있는 것으로서 글루코코르티코이드 치료가 제안되었다. MS 및 시신경염의 에피소드에 있어 글루코코르티코이드 치료 효능을 입증하는 조절된 시도가 ACTH 약물을 사용하여 수행되었으므로, ACTH가 임상의들에게는 바람직한 글루코코르티코이드이다. 그러나, 장기간의 스테로이드 사용은 권장되지 않는다.
아자티오프린 및 사이클로포스파이드와 같은 면역억제제가 몇몇 시리즈에서 많은 재발을 감소시키는 것으로 주장되었으나, 이들 약물의 효능에 대한 일치된 의견은 없다.
MS 치료를 위해 현재의 추천 방안은 증후군의 악화를 피하려는 쪽으로 선회되고 있다. 환자에게는 과도한 피로 및 극한 온도를 피하고 균형식이 권장된다[참조: Harrison's Principle of Internal Medicine, Chapter 356, 12th ed. 1991].
본 발명은 대부분의 현행 면역치료학적 접근법 및 면역약리학적 접근법의 경우에서와 같이, 면역의 일반화된 억제를 야기시키지 않으면서, 클론-특이적 방식으로 면역-관련 질환을 예방하거나, 억제하거나, 치료할 수 있는 치료제 및 조성물에 대한 명백한 요구에 따라 이루어졌다. 본 발명은 자가면역 질환을 실질적으로 중재한 자가항원에 대해 특이적인 T 세포주 또는 T 세포 클론이 복잡한 약독화 프로토콜에 의해 치료제로서 전환되고 직접적으로 동물에 주입되어 질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 인지하에 개발되었다.
본 발명자들은 이전의 연구자들의 교시에 기초하여 이러한 세포 면역 치료를 성취하려고 시도하였으나 최적 결과를 얻지 못했다. 선행 기술에서 기술된 약독화 방법을 사용하는 경우 보호 수준은 예측불가능하게 변화하였으며, 수득되는 면역성은 클론적으로 한정되지 않았는데, 이는 아마도 전체 세포 '백신'이 다양한 항원을 도입하기 때문인 것으로 여겨진다.
이러한 일반적 접근법을 단순화시키고 표준화시키며 질환-관련 항원을 인지하는 T 세포의 클론만이 영향받는 고도로 특이적인 면역성을 달성하려는 시도에서,본 발명을 생각하게 되었다. 먼저, 본 발명자들은 질환 진행시 수반되는 T 세포의 TCR과 같은 질환-관련된 면역학적 '마커'의 일부를 모사하는 면역원성 펩타이드를 합성할 수 있다는 것을 인지하였다. 놀랍게도, 펩타이드를 사용한 개체의 면역화는 '마커'에 대한 숙주 면역 반응을 지시함으로써 질환의 발생을 예방 또는 억제하거나 진행중인 질환을 치료한다.
도 1:항체 반응성의 펩타이드-특이적 억제.
TCR Vβ8(39-59) 펩타이드 단독 또는 TCR 펩타이드와 GP-S49S MBP-기원한 자가항원의 배합물로 면역화시킨 4마리의 래트로부터의 항혈청을 혼주시켜 40 내지 360배 희석시킨다. 항혈청을 미세평판 웰에 결합된 펩타이드 25ng을 사용하는 직접적인 ELISA로 반응성을 시험한다. 펩타이드의 양은 10pM TCR Vβ8(39-59)(분자량=2390달톤) 또는 15pM GP-S49S(MW=1630 달톤)에 상당한다. 다양한 농도의 억제제 펩타이드를 0.005 내지 50μg/웰의 범위로 가한다. 삼중 웰에서 흡광도를 측정하고, 반응성을 비억제된 대조군의 웰에 대한 %로서 계산한다.
도 2:TCR Vβ8(39-59) 펩타이드 Vβ8+뇌염발생 T 세포에 대한 항체.
정상 흡선 세포(A 및 C) 또는 GP-S49S-특이적 T 세포주(B 및 D)를 TCR Vβ8(39-59)에 대한 래비트 항체와 함께 항온처리한 후, 마우스 항-래비트 IgG 촉진 항체 및 플루오레세인-표지된 염소 항-마우스 IgG 항체와 함께 항온처리다. 염색에 대한 유동 세포 측정 분석을 계기(Coulter Epics C Cytofluorograph)를 사용하여 수행한다. A 및 C는 형광 강도에 대한 세포 크기를 나타내는 10,000개 세포에 대한 도트-플롯이고, B 및 D는 상응하는 히스토그램이다. 항-TCR Vβ8(39-59) 항체로 염색된 T 세포(90%초과 염색됨)의 형광 강도는 이러한 항체로 염색된 정상 흡선 세포 5%에 비교하여 증가된다. 항-TCR Vβ8(39-59)에 대한 대조군으로서 정상 래비트 IgG와 함께 항온처리된 흡선 세포 및 T 세포주 모두가 기저 수준의 염색(박스 D의 점선)을 나타냈다.
도 3:50μg TCR Vβ8-39-59 펩타이드/CFA를 사용한 EAE의 예방, 억제 및 치료.
래트에 50μ GP-MBP/CFA로 EAE를 유발시킨 후 질환 개시 40일전, 개시시, 개시 12일 만에 TCR을 피하 주사한다.
도 4:50μg GP-MBP/CFA으로 EAE를 유발시킨 후 동시에, 또는 7 또는 11일째에 귀에 경피 주입된 TCR Vβ8-39-59 펩타이드 50μg을 사용한 EAE의 억제.
도 5:50μg GP-MBP/CFA로 EAE를 유발시킨 후 임상적 증상 개시시에(12일) 귀에 경피 주입된 TCR Vβ8-39-59 펩타이드 10 또는 50μg을 사용한 EAE의 치료.
도 6:MS 환자 및 정상 개체로부터 사람 MPB-특이적 T 세포주의 펩타이드 특이성.
도 7:각각의 펩타이드에 대해 반응하는 전체 클론의 반응률(%)과 비교되는 각각의 펩타이드에서 지시된 T 세포주의 총 증식 반응률(%).
도 8:EAE-회복되고 TCR 펩타이드-면역화된 래트로부터의 TCR Vβ8- 및 Vβ14 펩타이드에 대한 세포 반응.
DTH는 mm/100, 증식은 CPM/1000으로 나타내며, 둘 모두에서 기저치(background)을 감한다.
도 9:TCR Vβ17 펩타이드를 사용한 재발된 EAE의 치료.
도 10a:환자 MR로부터의 클론 # 41에서 TCR Vβ 발현의 분석.
자동 방사선사진은 PCR에 의해 증폭된 TCR 산물을 나타낸다. 총 RNA를 클론화된 T 세포로부터 제조하여 문헌[참조: Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8942- 8945(1989)]에 기술된 바와 같이 제1본쇄 cDNA의 합성에 사용한다. 각각의 PCR 반응은 특정한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 포함함으로써 나타낸 Vβ 유전자 단편(170 내지 220개 bp) 뿐만 아니라 Cα 유전자 단편(약 600개 bp)을 연장시킨다. 사용된 특정 프라이머의 서열 및 PCR에 대한 상세한 설명이 문헌[참조: Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8941-8945(1989)]에 기술되어 있다. 증폭된 생성물을 2% 아가로즈 겔 상에서 분리시키고, 건조시킨 후, X-선 필름에 노출시킨다.32P 말단-표지된 3'-프라이머를 혼입시켜 증폭 생성물을 확인한다.
Vβ5.2는 이러한 자동 방사선사진에서 유일한 포지티브 Vβ 밴드이다. Vβ5.2 cDNA의 증폭에 사용되는 프라이머는 Vβ5.2 및 5.3에 공통된 서열에 대해 특이적이다[참조: Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8941-8945(1989)]. cDNA 주형은 첨가되지 않았으나 Vβ5.2/5.2에 대해 특이적인 올리고머를 사용한 대조군 PCR 반응은 Vβ 밴드를 나타내지 않았다.
도 10b:MS 환자로부터의 클론 # 41의 TCR Vα 발현의 분석.
자동방사선사진은 TCR-증폭된 Vα 생산물의 검출을 나타낸다. 이 방법은 문헌[참조: Oksenberg et al., Nature 345:344- 346(1990)]에 기술된 바와 같이 Vα-특이적 프라이머를 사용하여 Vα cDNA를 증폭시킨다는 것만을 제외하고는 도 10a에 대해 기술된 것과 유사하다. 또한, 겔 분리 및 나일론 막으로 이동시킨 후, 서던 블롯을 내부 Cα 영역에 상응하는32P-키나제 프로브(5'-AATATCCAGAACCCTGACCCT-3')-를 사용하여 하이브리드화하고 자동 방사선 사진을 찍는다[참조: Oksenberg et al., Nature 345:344-346(1990)]. 증폭된 Vα 산물의 크기는 약 320 내지 420 염기쌍 범위이다[참조: Oksenberg et al., Nature 345:344-346(1990)]. Vα 1이 이러한 서던 블롯에서 유일한 포지티브 밴드이다. 몇몇 실험에서는, 서던 블롯보다는 슬롯 블롯(slot blot)이 표지된 Cα 프로브와 하이브리드화 하였다. 두 검출기술 모두는 동일한 결과를 나타냈다.
도 11:MS 환자 및 정상 개체로부터의 BP-반응성 T 세포 클론중 Vα 유전자의 사용 요약.
이 방법은 제1B도 및 표 1 및 2에 기술된 바와 같다. 각각의 클론에 대해 단지 유력한 V 밴드만이 이러한 요점 분석에 포함된다. 몇몇 클론은 거의 동일한 강도의 2개의 밴드를 가지므로, Vα의 총수는 분석된 클론의 수보다 클 수 있다. NT는 Vα 발현에 대해 시험되지 않은 클론의 수를 나타낸다.
도 12:MS 환자 J.M.에서 항원 반응성 T 세포의 빈도.
도 13:J.M. 에서 HSV 반응.
도 14:MS 환자 M.R.에서 항원 반응성 T 세포의 빈도.
도 15:SJL 마우스에서 TCR 처리.
PLP(프로테오리포단백질: proteolipoprotein)을 항원으로 사용하여 EAE를 유발시킨다.
도 16:Gp-BP-55-69로 전-면역화시켜 EAE의 유발 억제.
래트에 10μg Gp-BP/CFA로 챌린지 하기 4주 전에 Gp-BP-55-69/CFA 또는 100μg CFA를 단독으로 주사한다. 임상적 EAE를 실시예 XIV의 방법에 기술된 규모에 따라 두 그룹 모두에서 매일 평가한다.
도 17:클론 C455-69의 수동 전달에 의한 EAE의 유도 억제.
래트에 Gp-BP/CFA로 챌린지하기 14일 전에 활성화된 C455-69또는 C5Gp-BP클론화된 T 세포 10,000,000개를 주사한다.
도 18:항-MBP 클론에 의해 이용되는 TCR-Vβ 쇄의 뉴클레오타이드(상단).
이탤릭체의 염기 1 내지 22는 PCR 증폭에서 사용되는 올리고뉴클레오타이드로부터 기원한다[참조: 실시예 XIV 방법]. D 영역에서 밑줄 그은 염기는 세균주 서열을 나타내고, 나머지 염기는 N 영역 첨가물을 나타낸다. 하단은 항-MBP 클론에 의해 사용되는 TCR-Vβ 쇄의 예측되는 아미노산 서열을 나타낸다. Vβ8.2 서열과 상이한 염기 및 아미노산 잔기는 클론 C5Gp-BP에 대한 서열 아래에 나타낸다.
도 19:EAE-회복된 래트로부터 활성화된 T 세포 클론 및 휴지 T 세포 클론에 의한 I-A의 발현.
세포를 OX-6으로 염색시키고, Gp-BP(4g-i)로 활성화시킨지 3일 후에 또는 IL-2가 풍부한 상등액(4d-f)에서 추가로 7일 동안 성장시킨 후 FITC-결합된 염소항-래트 IgG로 역염색(counterstain)한다. 제4a-c는 이소타입(isotype) 대조군 항체를 사용한 염색의 기저 수준을 나타낸다.
도 20:TCR Vβ8.639-59및 TCR Vβ8.239-59펩타이드를 사용한 EAE의 치료.
래트에 임상적 신호가 개시된지 1일째에, 통상 Gp-BP/CFA 주사후 12일째에 지정량의 TCR 펩타이드를 피하(5a) 또는 경피내(5b) 주입한다. 대조 그룹에게는 TCR Vβ1439-59펩타이드로 주입하거나 주입하지 않는다.
도 21:TCR Vβ8 펩타이드로 활성적 유도된 EAE의 치료.
도 22:TCR Vβ8 펩타이드로 수동적으로 유도된 EAE의 치료.
도 23:EAE에 대한 TCR Vβ-44-45 전달 보호에 특이적인 T 세포주.
도 24:MS 환자 및 대조군의 CSF에서 미엘린 항원 및 HSV 반응성 T 세포의 빈도.
CSF로부터의 항원 특이적 T 세포의 빈도는 각각의 공여자로부터 회수된 항원 반응성 클론의 수를 분석된 CSF T 세포의 총 수로 나누어 계산한다. 나타낸 값은 분석된 9명의 MS 환자 및 6명의 OND 환자에 대한 평균 ±S.D.를 나타낸다.
도 25:MS 환자 및 대조군의 혈액에서 미엘린 항원 및 HSV 반응 T 세포의 빈도.
각각의 환자의 혈액 MNC를 피콜 밀도 구배 원심분리로 분리하며, 제한 희석 분석한다[참조: Lefkovits et al., Immun. Today, 5: 265-268, 295-298(1984)]. 여기에서, 시험된 세포 희석 범위는 BP(50μg/ml) 및 PLP139-151(50μg/ml)에 대해서 0.31 내지 5.0 x 105개 세포/웰이고, HSV 항원(저장 용액의 1/200, Whittaker, Bethesda, MD)에 대해서 0.01 내지 0.16 x 105개 세포이다. 항원에 대한 양성 증식 반응은 3.0 이상의 자극 지수를 갖거나 기저치에 비해 1,000의 델타 CPM을 갖는다. 모든 공여자의 비-반응성 미세 배양물의 평균 퍼센트(%)를 각각의 세포 희석물에서 계산하고, 이의 네가티브 로그 값을 y축 상에 플로팅하고 직선 스케일상의 웰당 세포 주입수는 x축에 플로팅한다. 2개 이상의 실험 포인트를 이용하여 기원(20%)을 통과시켜 직선을 그어, 2개의 상호작용성 세포 형태를 나타낸다. 평균 하나의 전구체 세포를 갖는 세포수를 37% 비-반응 배양물 수준에서 측정한다[참조: Lefkovits et al., Immun. Today 5:265-268, 295-298(1984)].
도 26:MS 환자의 CSF 및 혈액에서 Hu-BP 반응 T 세포 클론의 펩타이드 특이성 비교.
CSF T 세포(1000개/웰)을 검정전에 Hu-BP 자극 없이 조사된(4,500rad) 자가 MNC(1 x 105개)와 함께 IL-2 및 IL-4가 농축된 배지내에서 증식시킨다. 혈액 T 세포 클론을 Hu-BP로 2회 재자극시킨 Hu-BP 특이적 T 세포주를 제한 희석시켜 수득한다. CSF와 혈액 T 세포 모두의 특이성은, 항원의 부재 및 콘카나발린 A 2μg/ml, Hu-Bp 50μg/ml, Hu-Bp 단편: P1, P2 및 P4 50μg/ml의 존재하에 환저 96-웰 미세역가 플레이트내의 0.2ml 삼중 배양액내에서 2 x 104개의 T 세포를 1 x 105개의 조사된(4,500rad) 자가 MNC와 함께 항온처리한지 72시간 후 티미딘 흡수에 의해 평가한다. 모든 클론은 3.0 초과의 자극 지수 또는 기저치에 비해 500CPM 초과로 반응하였다. 데이타는 9명의 공여자로부터의 71개의 CSF T 세포 클론 및 50개의 혈액 T 세포 클론에 대한 짝을 이룬 분석을 나타낸다.
본 발명의 한 양태는, 질환과 관련된 마커 TCR의 아미노산 서열을 확인하고, TCR 서열중 어떤 단편이 면역원성인가를 몇몇 공지된 알고리듬 방식에 기초하여 예측하고, TCR 구조중의 어떤 부위가 질환으로부터 보호할 수 있는 면역 반응을 위한 적합한 타겟인가를 결정함으로써, 면역-관련 질환을 예방하거나, 억제하거나 또는 치료하는데 사용하기 위한 펩타이드의 선별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 양태는, 면역-관련 질환과 관련된 마커 TCR인 TCR의 아미노산 서열을 포함하는 약 15 내지 30개의 아미노산을 갖는 펩타이드이다. 이 펩타이드 또는 이의 작용성 유도체가 질환으로부터 보호를 유도할 수 있다.
하나의 관련 양태는 하기 펩타이드중 하나 또는 배합물(콕테일: cocktail)의 유효량을 투여함을 포함하여 MS 환자를 치료하는 방법이다:
Vβ5.2(26-43), Vβ5.2(39-59), Vβ5.2(59-78), Vβ6.1(1-22), Vβ6.1(39-59), Vβ6.1(70-88), Vβ8.2(39-59), Vβ8(44-54), Vβ8.6(39-59) 및 Vα2.
본 발명의 다른 양태는, 펩타이드 서열이 TCR V 유전자 또는 V 유전자의 특정 부위(예: VDJ 영역), TCR의 상보성 결정 영역(CDR)의 적어도 일부분(예: CDR2) 또는 과가변 영역의 적어도 일부분에 의해 암호화되는 펩타이드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 펩타이드의 면역원성을 증진시키기 위해서 담체(예: 추가의 이종 아미노산 서열)에 결합된 펩타이드를 포함한다.
본 발명은 또한 펩타이드 또는 이의 작용성 유도체를 약제학적으로 허용되는 담체와의 혼합물로서 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 질환 진행을 유도하거나 촉진시키는데 관여하는 특이적 면역학적 반응을 파괴하기 위해 지정된 면역-관련 질환에 특이적으로 적용될 수 있는 화학적으로 규정된 펩타이드 및 치료제를 제공한다.
본 발명이 특히 유용한 질환은 자가면역 질환, 예를 들어 류마치스 관절염, 아주번트 관절염, 중증성 근무력증, 뇌척수염, 다발성 경화증, 갑상선염, 당뇨병, 장염 질환 및 전신 홍반성 낭창을 포함한다. 본 발명은 또한 TCR이 종양 마커로서 작용하는 악성 질환, 예를 들어 T 세포 백혈병 및 임파종에 관한 것이다.
본 발명은 TCR 펩타이드, 이의 작용성 유도체 또는 이러한 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여 면역-관련 질환을 예방하거나, 억제하거나 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 한 양태는
(a) 면역-관련 질환에 걸리기 쉬운 환자로부터 T 세포를 분리하는 단계,
(b) 자가항원 제제의 존재하에서 배양액 중에서 단계(a)의 T 세포를 증식시키는 단계,
(c) 단계(b)의 증식된 T 세포에 의해 발현된 TCR V 유전자를 동정하는 단계 및,
(d) TCR의 아미노산 서열로부터 펩타이드를 선택하는 단계를 포함하여 면역-관련 질환의 마커인 TCR의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 선별하는 방법에 관한 것이다.
TCR V 유전자는 TCR-특이적 항체를 사용하거나 TCR 아미노산 서열 측정함으로써 확인된다.
본 발명은 또한 (a) 상술한 바와 같이 펩타이드를 선별하는 단계 및 (b) 화학적 또는 재조합 방법으로 펩타이드를 합성하는 단계를 포함하여, 면역 관련 질환과 연관된 TCR의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 면역-관련 질환으로부터 개체를 보호할 수 있는 TCR 펩타이드에 대해 특이적인 폴리클로날, 모노클로날, 또는 키메릭(chimeric) 항체, 및 이러한 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 리보좀 억제 단백질(예: 리신 A 쇄)를 포함한 세포독성제에 결합된 항체를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 항체 제제중의 하나로 수동 면역화시켜 자가면역 질환을 예방하거나, 억제하거나 또는 치료하는 방법을 포함한다.
추가의 양태로서, 본 발명은
(a) 자가면역 질환에 걸리기 쉬운 개체로부터 T 세포를 분리하는 단계,
(b) TCR 펩타이드와 같은 TCR-보유 물질의 존재하에 배양액 중에서 단계(a)의 T 세포를 증식시키는 단계,
(c) 증식된 배양 T 세포로부터 보호성 T 세포를 제조하는 단계를 포함하여, 자가면역 질환을 예방하거나, 억제하거나 또는 치료할 수 있는 보호성 T 세포 및 이러한 T 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
하기 기술에서는, 면역학, 세포 생물학 및 분자 생물학 분야의 전문가에게 알려진 방법들을 제시하는 출판물 및 기타 재료들이 본원에 참조로 인용된다.
본 발명의 조성물, 방법 및 생성물은 사람 및 가축용으로 적용 가능하다.
본 발명의 펩타이드는 면역원성, 즉 개체에게 주입시 면역 반응을 유발시킬 수 있는 약 15개 내지 30개 아미노산의 서열을 포함한다.
'작용성 유도체'는 하기 정의되는 펩타이드의 '단편', '변이체' '동족체' 또는 '화학 유도체'를 의미한다.
본 발명의 펩타이드를 포함하는 아미노산 서열은 단독으로 사용되거나 보다 긴 펩타이드 서열에 결합되거나 여기에 포함될 수 있다. 보다 긴 펩타이드는 목적하는 TCR로부터 기원된 추가의 서열을 갖거나, TCR 올리고펩타이드의 면역원성을 증강시키기 위해 사용되는 담체 단백질과 같은 관련되지 않은 펩타이드의 서열을 포함할 수 있다. 이러한 담체는 당해 분야에 널리 알려져 있으며, 예를 들면 키홀 림페트 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin: KLH), 소혈청 알부민, 파상풍 톡소이드등과 같은 이종 단백질을 포함한다. 또한 본 발명의 범위내에서, 항체에 결합된 펩타이드 및 독소에 결합된 펩타이드로 포함된다. 본 발명의 독소는 리보좀 억제 단백질(예: 리신 A 쇄 또는 슈도모나즈 독소)을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 '마커 TCR'은 자가면역 질환 또는 악성 질환(즉,암)과 같은 특정 면역-관련 질환의 특징인 TCR을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '면역-관련 질환'은, 면역 시스템이 질환의 발병에 관련되거나 면역 시스템의 적당한 자극으로 질환으로부터 보호될 수 있는 질환을 말한다. 본 발명의 면역-관련 질환의 바람직한 예는 자가면역 질환이다. 본 발명에 의해 고려되는 자가면역 질환의 비-제한적 예는 류마티스성 관절염(RA), 중증성 근무력증(MG), 다발성 경화증(MS), 전신 홍반선 낭창(SLE), 자가면역 갑상선염(하시모토 갑상선염), 그라비스 질환, 장염 질환, 자가면역 포도막 망막염, 다조염 및 특정 유형의 당뇨병이 있다.
따라서, MS에 대한 마커 TCR은 MHC 자체와 MBP 단편간의 복합체(또는 MBP 단편 단독)를 결합시킬 수 있는 TCR이며, MBP는 이러한 질환의 특징인 주요 자가항원을 포함한다. 다른 자가면역 질환에서, 다른 TCR들은 MHC 분자와 이들 질환에 수반되는 자가항원간의 복합체에 대해 특이적이므로 마커로서 제공된다. 예를 들어, 중증성 근무력증(MG)에서, 자가항원은 니코틴산 아세틸콜린 수용체(AChR)인 것으로 생각된다. 따라서, MHC 자체내에서(또는 직접적으로) AChR을 결합하고, 질환을 중재하는 AChR-반응성 T 세포에 의해 발현되는 확인가능한 TCR이 MG에 대한 '마커 TCR'이다. 본 발명의 교시를 완전히 이해하는 경우, 마커 TCR 및 면역원성 펩타이드의 측정이 당 분야에 널리 공지된 스크리닝 방법을 이용하여 통상의 기술로 수행될 수 있다는 것을 전문가들은 인지할 것이다.
또한 종양 세포가 면역 시스템에 의해 인지되거나 이에 반응할 수 있는 종양 항원과 같은 종양 마커를 갖는 악성도 본원에서 사용되는 면역-관련 질환으로 간주된다. TCR은 T 세포 백혈병 또는 T-세포 임파종 세포에 대한 종양 마커로서 사용될 수 있다.
면역-관련 질환에 걸리거나 이에 걸리기 쉬운 개체에, 마커 TCR 일부의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 도입시키면 면역-관련 질환으로부터 보호 및 TCR에 대해 지시된 면역 반응이 생성된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 질환으로부터의 '보호'란 질환의 '예방', '억제', 또는 '치료'를 말한다. '예방'은 질환 유발전에 보호 조성물을 투여함을 포함하며, 따라서, 예를 들면 EAE 동물 모델에 있어 질환을 유발시키는 뇌염발생원의 주입전에 보호 조성물의 연속 투여로 질환이 '예방' 된다.
'억제'는 질환의 유발 후, 그러나 질환의 임상적 증상 발생전에 조성물을 투여하는 것을 수반한다. 예로 EAE 사용할때, 뇌염 발생원의 주입 후, 그러나 신경학적 증상이 나타나기 전에 보호적 조성물을 연속 투여하면 질환이 '억제' 된다.
'치료'는 질환의 출현 후 보호 조성물을 투여하는 것을 수반한다. EAE 예에서, 뇌염발생원 주입 및 임상적 증상이 전개된 후에 보호적 조성물의 연속 투여하면 질환이 '치료' 된다.
사람용 의약에서, '방지'와 '억제'를 항상 구별할 수는 없는데, 이는 유발 현상(들)이 밝혀지지 않거나, 잠복되어 있거나 유발 현상(들)이 발생한 후에도 상당히 오랜 기간 동안 환자들이 인지하지 못하기 때문이다. 따라서, '치료'와는 구별되는 용어로서 '예방'이란 용어는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 '방지'와 억제'를 포괄하여 사용되는 것이 통상적이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어'보호'는 '예방'이란 의미를 포함한다.
자가면역 질환에 관한 본 발명의 양태의 경우, 피검자의 면역 반응은 자가 면역 반응을 매개함으로써 유해한 T 세포의 작용을 억제시키는 T 세포를 표식하는 특정 TCR에 관련된 것이다.
일반적으로, 펩타이드 서열은 TCR 자체의 부분을 나타내고, 바람직하게는 항체 또는 기타 T 세포에 노출된 세포외적인 TCR의 부분이고 TCR을 보유하는 T 세포의 활성에 있어 생물학적으로 중요한 TCR의 부분에 상응한다. 본 발명의 목적을 위해, 상기 펩타이드는 다음에 정의하는 바와 같이 면역원성이어야 한다.
본 발명의 펩타이드는 TCR의 V 영역 부분에 해당 되는 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 당해 펩타이드는 TCR β쇄의 VDJ 영역 또는 TCR α 쇄의 VJ 영역의 단편에 해당된다. 바람직한 양태에 있어서, 당해 펩타이드는 TCR 이종이량체의 3개의 상보성 결정 영역(CDR)중 하나[예: 제2 CDR(CDR2)]의 적어도 일부분에 해당된다. 또한, TCR γ 및 TCR δ쇄, 이들의 V 영역, 및 CDR 구조물 또는 이들의 γδ 이종이량체에서의 동족체의 적어도 일부분에 상응하는 펩타이드가 본 발명의 범위내에 속한다[참조: Strominger, J.L., Cell 57:895-898(1989); 및 Clevers et al., Ann Rev. Immunol. 6:629-662(1988)].
TCR의 CDR은 면역 글로불린 분자 구조와 유사한 것으로 정의되는데, 여기서 CDRs는 항원과 접촉하고 항원 결합 부위의 중요한 부분을 차지하는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 3개의 TCR CDR 모두는 항원과 MHC에 대한 결합에 관여하는 것으로 여겨진다[참조: Davis, M.M. et al., Nature 334:395-402(1988); Claverie et al., Immun. Today 10:10-14(1989)]. 피검자의 면역 반응, 즉 '마커 TCR'의 CDR 중의 하나에 대해 본 발명의 보호 항체 또는 보호 T 세포를 지시함으로써, 자가 면역과 관련된 T 세포와 자가항원 및/또는 MHC간의 결합 또는 인지 현상에 필요한 파괴의 가능성이 증가하게 된다.
본 발명의 따르는 펩타이드의 '단편'은 분자의 모든 세브세트, 즉 보다 짧은 길이의 펩타이드를 지칭한다.
펩타이드의 '변이물'은 전체 펩타이드 또는 이의 단편과 실질적으로 유사한 분자를 지칭한다. 변이 펩타이드는 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 변이 펩타이드를 직접 화학적 합성 시킴으로써 편리하게 제조할 수 있다.
또 다른 방법으로는, 펩타이드의 아미노산 서열 변이체를, 합성된 펩타이드를 암호화하는 DNA 내에서 돌연변이시켜 제조할 수 있다. 이러한 변이체로는 아미노산 서열내의 잔기로부터 결실시키거나, 이를 삽입 또는 치환시킨 것을 포함한다. 최종 작제물은 목적하는 활성을 가지는 한, 결실, 삽입 및 치환의 어떠한 조합도 최종 작제물을 생성시킬 수 있다. 명백한 것은, 변이 펩타이드를 암호화하는 DNA 내에서 만들어질 돌연변이에 있어서 판독 프레임이 변경되지 말아야 하며 바람직하게는 제2의 mRNA 구조를 생성시킬 수도 있는 상보성 영역이 생성되지 않아야 한다[참조: 유럽특허공보 제75,444호].
유전학적 수준에서, 이들 변이체는 통상적으로 펩타이드 분자를 암호화하는 DNA 중의 뉴클레오티드를 부위 지시된 돌연변이 유발에 의해, 이러한 변이물을 암호화하는 DNA를 생성시킨 후, 이 DNA를 재조합 세포 배양물내에서 발현시킴으로써제조한다. 이러한 변이체는 통상적으로 비변이체 펩타이드와 동일한 정성적 생물학적 활성을 나타낸다.
본 발명에 따른 펩타이드 변이체는 앞서 제조한 변이체 또는 TCR 단백질 또는 펩타이드의 비변이체를 암호화하는 DNA를 부위 특이적 돌연변이 유발시켜 제조하는 것이 바람직하다. 부위 특이적 돌연변이 유발은 목적하는 정도로 돌연변이된 DNA 서열을 암호화하는 특이적 올리고뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라 충분한 수의 인접한 뉴클레오티드를 사용하여 펩타이드 변이체를 생성시켜 가로지르는 결실 접합부의 양쪽 쇄 상에 안정한 이본쇄를 형성하는 충분한 크기와 서열 복합성을 지닌 프라이머 서열을 제공할 수 있다. 부위 특이적 돌연변이 유발 기술은 문헌[참조: Adelman et al., DNA 2:183(1983)]에 의해 예시된 바와 같이, 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 부위 지시된 돌연변이 유발에 유용한 전형적인 벡터로는, 예를 들면, 문헌[참조: Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Walton, A., ed., Elsevier, Amsterdam(1981)]에 기재된 바와 같은 M13 파아지 등의 벡터를 포함한다. 이들 파아지는 입수가 용이하며 이들의 용도는 당해 분야의 전문가에게 널리 공지되어 있다. 또 다른 한편, 복제의 일본쇄 파아지 오리진(origin)을 포함하는 플라스미드 벡터[참조: Veira et al., Meth. Enzymol. 153:3 (1987)]가 일본쇄 DNA를 수득하는데 사용될 수 있다.
일반적으로, 본 발명에 따르는 부위 지시된 돌연변이는 먼저 자체 서열내에 관련 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 포함 하는 일본쇄 벡터를 수득함으로써 수행한다. 바람직하게 돌연변이된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머는,예를 들면, 문헌[참조: Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci(USA) 75: 5765 (1978)]의 방법에 의해 일반적으로 합성 제조된다. 이어서, 이 프라이머를 일본쇄 단백질 서열 함유 벡터와 어닐링시킨 다음, 이.콜라이(E. coli) 폴리머라제 I 클레노우 단편과 같은 DNA-중합 합성 효소를 작용시켜 돌연변이된 쇄의 합성을 완료한다. 따라서, 돌연변이된 서열과 제2의 쇄는 목적하는 돌연변이체를 갖는다. 이어서, 이러한 이종이본쇄 벡터를 사용하여 적당한 세포를 형질 전환시키고, 이와 같이 돌연변이된 서열 배열을 갖는 재조합 벡터가 포함된 클론을 선별한다.
돌연변이된 단백질 영역을 제거한 다음, 단백질 제조용으로 적당한 벡터, 일반적으로 적당한 숙주의 형질전환용으로 사용될 수도 있는 유형의 발현 벡터내에 놓아둔다.
말단 삽입의 한 예로는 시그날 서열이 숙주 세포에 대해 이종이든 동종이든지 간에 이를 펩타이드 분자의 N-말단에 융합 시켜 재조합 숙주로부터의 성숙한 펩타이드 분자의 분비를 촉진시킴을 포함한다.
또다른 변이체 그룹은 펩타이드 분자내의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 단지 1개의 아미노산 잔기가 제거되고 이 위치에 상이한 잔기가 삽입된 변이체이다. 이러한 치환은, 펩타이드 분자의 성상을 섬세하게 조절하고자 하는 경우, 다음의 목록에 따라서 수행하는 것이 바람직하다.
본래 잔기 예시되는 치환체 본래 잔기 예시되는 치환체
AlaArgAsnAspCysGlnGluGlyHisIle gly, serlysgly, hisgluserasnaspala; proasn; glnleu; val LeuLysMetPheSerThrTrpTyrVal ile; valarg; gln; gluleu; tyr; ilemet; leu; tyrthrsertyrtrp; pheile; leu
작용성 또는 면역학적 특성에 있어 실제적인 변화는 상기 목록에서의 치환체 보다 덜 보존적인 치환체를 선택함으로써, 즉 (a) 예를 들면, 시트 또는 나선 형태로서의, 치환 영역 내의 펩타이드 주쇄의 구조, (b) 타겟 부위에서 분자의 전하 또는 소수성 또는 (c) 측쇄의 벌크(bulk)를 유지하는데 있어서의 이들의 효과가 현저히 더 상이한 잔기를 선택함으로써 달성한다. 일반적으로 예상되는 치환은 (a) 글리신 및/또는 프롤린이 또 다른 아미노산으로 치환되거나, 결실 또는 삽입되는 경우; (b) 친수성 잔기(예: 세릴 또는 트레오닐)가 소수성 잔기(예: 루이실, 이소루이실, 페닐알라닐, 발릴 또는 알라닐)로 치환되는 경우; (c) 시스테인 잔기가 기타 모든 잔기로 치환되는 경우; (d) 전기 양성 측쇄를 갖는 잔기(예: 리실, 아르기닐 또는 히스티딜)가 전기음성 전하를 갖는 잔기(예: 글루타밀 또는 아스파틸)로 치환되는 경우; 또는 (e) 벌키 측쇄를 갖는 잔기(예: 페닐알라닌)이 이러한 벌키 측쇄를 갖지 않는 잔기(예: 글리신)로 치환되는 경우이다.
대부분의 결실 및 삽입 및 특히 치환은 펩타이드 분자의 성상에 급격한 변화를 가져오는 것으로 예상되지는 않는다.
그러나, 치환, 결실 또는 삽입을 수행하기에 앞서 이들의 정확한 효과를 예견하기가 어려운 경우, 당해 분야의 전문가는 이러한 효과가 통상의 스크리닝 검정에 의해 평가될 것이라는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 변이체는 통상적으로, 펩타이드 분자를 암호화하는 핵산을 부위 특이적 돌연변이 유발시키고, 이러한 변이체 핵산을 재조합 세포 배양물내에 발현시키고, 임의로(변이체를 적어도 하나의 에피토프에 결합시킴으로써 변이체를 흡수시키기 위하여) 항-펩타이드 항체 컬럼위에 면역 친화성 흡착 시켜 세포 배양물로부터 정제시켜 제조한다.
이어서, 목적하는 성상 확인을 위하여, 세포 융해물 또는 정제된 펩타이드 변이체의 활성을 적합한 스크리닝 검정법으로 스크리닝한다. 예를 들면, 펩타이드 분자의 면역학적 특성(예: 소정의 항체에 대한 결합)의 변화는 경쟁적 유형의 면역 검정법으로 측정한다. 변이체 펩타이드의 T 세포 인지 측면에서의 변화는 생체내 DH 검정법으로 측정하거나 시험관내에서 T 세포 증식 검정법으로 측정한다. 이러한 펩타이드 특성(예: 산화환원 반응, 열 안정성, 소수성, 단백질 분해에 대한 감도 또는 담체와 응집하거나 멀티머로 되는 경향)의 변형은 당해 분야의 통상의 전문가에게 널리 공지된 방법으로 검정한다.
펩타이드의 '유사체'는 전체 분자 또는 이의 단편과 실질적으로 유사한 인공 분자를 지칭한다.
본 발명에 따르는 펩타이드의 '화학적 유도체'는 통상적으로는 펩타이드의 일부분이 아닌 추가의 화학적 잔기를 포함한다. 당해 펩타이드의 공유적 변형도 본 발명의 범위내에 포함된다. 이러한 변형은 당해 펩타이드의 타겟된 아미노산잔기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응 시킴으로써 분자내로 도입시킬 수 있다.
시스테이닐 잔기는 가장 통상적으로 α-할로 아세테이트(및 상응하는 아민)(예: 클로로아세트산 또는 클로로아세트 아미드)와 반응시켜 카복시메틸 또는 카복시아미도메틸 유도체를 수득한다. 시스테이닐 잔기는 또한 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디설파이드, 메틸-2-피리딜 디설파이드, p-클로로머쿠리벤조에이트, 2-클로로머쿠리-4-니트로페놀 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과 반응시켜 이를 유도체화한다.
히스티딜 잔기는 pH 5.5 내지 7.0에서 디에틸프로카보 네이트와 반응시켜 유도체화시키는데, 이는 이러한 시약이 히스티딜 측쇄에 대해 비교적 특이적이기 때문이다. 파라-브로모펜아실 브로마이드도 또한 유용한데, 이러한 반응은 pH 6.0에서 0.1M 나트륨카코딜레이트중에서 수행하는 것이 바람직하다.
리시닐 및 아미노 말단 잔기는 석신산 또는 기타 카복실산 무수물과 반응시킨다. 이들 시약을 이용한 유도체화는 리시닐 잔기의 전하를 바꾸는 효과를 가져온다. α 아미노 함유 잔기를 유도체화하는데 적합한 기타 시약으로는 이미도에스테르, 예를 들면, 메틸 피콜린이미데이트; 피리독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로하이드라이드; 트리니트로벤젠설폰산; O-메틸 이소우레아; 2,4-펜탄디온; 및 글리옥실레이트와의 트랜스 아미나제 촉매된 반응을 포함한다.
아르기닐 잔기는 하나 또는 수개의 통상적인 시약(예: 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-사이클로헥산디온 및 닌하이드린)과 반응시켜 변형시킨다. 아르기닌 잔기의 유도체화 반응은 구아니딘 작용성 그룹의 높은 pKa 치로 인해 알칼리 조건하에서 수행되어야 한다. 더구나, 이들 시약은 리신 그룹 뿐만 아니라 아르기닌-아미노 그룹과도 반응할 수 있다.
티로실 잔기 자체를 특이적으로 변형시키는 것에 관한 연구가 광범위하게 진행되었는데, 특히 관심을 끈 것은 스펙트럼 표지를 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로 메탄과 반응시킴으로써 티로실 잔기내로 도입하는 방법이다. 가장 통상적으로, N-아세틸이미다졸과 테트라니트로 메탄을 사용하여 O-아세틸 티로실 잔기와 3-니트로 유도체 각각을 생성시킨다. 티로실 잔기는125I 또는131I를 사용 하여 요오드화시켜 방사성 면역검정에 사용하기 위한 표지된 단백질을 제조하는데, 이때 클로르아민 T 방법이 적합하다.
카복실 측쇄 그룹(아스파틸 또는 글루타밀)은 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리닐-(4-에틸)카보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸)카보디이미드 등의 카보디 이미드(R'-N-C-N-R')와 반응시킴으로써 선택적으로 변형시킨다. 더우기, 아스파틸과 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과 반응시킴 으로써 각각 아스파라기닐 잔기와 글루타미닐 잔기로 전환시킨다.
글루타미닐과 아스파라기닐 잔기는 종종 탈아미드화하여 상응하는 글루타밀 잔기와 아스파르틸 잔기로 된다. 또다른 방법으로는, 이들 잔기는 온화한 산성 조건하에서 탈아미드화 된다. 이들 잔기 형태중 어느 것도 본 발명의 범위내에 속한다.
이작용성 시약을 사용한 유도체화는 펩타이드를 수 불용성 지지체 매트릭스 또는 기타 거대분자 담체에 가교결합시키는데 유용하다. 통상적으로 사용되는 가교결합제로는, 예를 들면, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-하이드록시석신이미드 에스테르(예: 4-아지도살리실산과의 에스테르); 디석신이미딜 에스테르[예: 3,3'-디티오비스(석신이미딜프로피오네이트)]를 포함하는 동종 이작용성 이미도 에스테르; 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄 등의 이작용성 말레이미드가 있다. 메틸-3-[(p-아지도파닐)디티오]프로피오이미데이트 등의 유도체화제는 빛의 존재하에 가교결합물을 형성시킬 수 있는 광활성가능한 중간체를 생성시킨다. 또다른 한편, 반응성 수불용성 매트릭스(예: 시아노겐 브로마이드 활성화 탄수화물)와 미합중국 특허 제3,969,287호, 제3,691,016호, 제4,195,128호, 제4,247,642호, 제4,229,537호 및 제4,330,440호에 기술된 반응성 기질이 단백질 고정화에 사용된다.
기타 변형으로는 프롤린과 리신의 하이드록실화; 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실 그룹의 포스포릴화; 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노 그룹의 메틸화[참조: T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86(1983)]; N-말단 아민의 아세틸화 및 몇몇 경우에는 C-말단 카복실 그룹의 아미드화가 있다.
이와 같이 유도화된 잔기는 펩타이드의 용해도, 흡수, 생물학적 반감기 등을 증진시킬 수 있다. 이러한 잔기는 또한 펩타이드의 바람직하지 않은 어떠한 부작용도 제거시키거나 약화시킨다. 이러한 효과를 매개할 수 있는 잔기는, 예를 들면, 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(1980)]에 기술되어 있다.
악성 질환
본 발명의 방법의 대상이 되는 질환은 또한 임파종과 백혈병이다. 임파종과 수많은 백혈병은 조절불가능하게 증식되는(즉, 악성인) 림프구에 의해 생성된 종양이다. 여러 종류의 백혈병과 임파종이 단일의 악성 T 세포 전구체로부터 기원하는 T 세포로 이루어지기 때문에, 모든 종양 세포는 동일한 TCR을 가지며, 따라서 이는 본 발명에 따르는 보호 조성물의 타겟이 될 수 있는 '종양 마커'로서 작용한다. 유사하게, 표면 면역 글로불린은 B 세포 백혈병 또는 임파종에 대한 종양 마커로서 작용할 수 있다.
본 발명의 한 양태는 종양 마커 그 자체이기보다는 이러한 '종양 마커'에 대하여 반응하는 T 세포의 TCR을 타겟화함으로써 항 종양 반응을 증진시키는 것에 관한 것이다. 따라서, 종양 특이적 T 세포상의 TCR에 대해 지시된 면역 반응을 이용하여 숙주에게 이로운 항 종양 반응을 상승 조절할 수 있다.
사실상, 계통학적으로 동일한 유형의 다른 세포로부터 기원된 것과 계통학적으로 상이한 유형의 세포로부터 기원된 세포를 구별짓는 표면 분자를 갖는 세포와 연관된 모든 질환은 특징적인 '마커'를 함유하며, 이러한 '마커'에 대한 면역 반응을 유도함으로써 '마커'를 갖는 세포의 활성을 변경시키는 조성물에 의한 치료의대상이 될 것이라는 것을 인지할 수 있을 것이다.
본 발명에 따르면, 마커 분자 자체는 비교적 비면역원성일 수 있으며, 이는 최소한도의 특징적인 항원 에피토프를 필요로 한다. 이러한 에피토프 자체는 본래 면역원성일 수 있거나, 당해 분야에 널리 공지된 처리공정(예: 면역원성 담체 분자와의 접합)에 의해 면역원성이 될 수 있다. 따라서, 유리 펩타이드로서 또는 면역원성이 되게 하는 형태로서의 마커 단백질의 에피토프는 본 발명에서 유추해낼 수 있는 바와 같이, 항체 반응이나 세포 매개된 면역 반응 또는 둘 다의 반응을 유발시킬 수 있다. 따라서, 전체 마커 단백질은 아니지만, 면역원성 또는 항원성인 특이적 펩타이드 영역이 삽입된 조성물은 이러한 마커에 의해 성상확인된 면역 관련 질환을 치료하는데 유용한 제제를 포함할 것이다.
마커 TCR 보유 T 세포의 동정
본 발명은 리간드/MHC 결합에 있어서 생물학적으로 중요한 TCR의 영역(예: CDR2)을 나타내고 TCR V 유전자 군의 특징이 되는 합성 펩타이드를 이용한다. 따라서, 본 발명은 TCR V 영역 특이적 항체 또는 T 세포를 수득하기 위한 보다 간단한 접근법을 제공해준다. TCR V 영역 특이적 항체 또는 T 세포의 스펙트럼을 유도하는 동일한 β쇄로부터의 기타 서열을 사용하여, 당해 분야의 전문가는 통상의 기술을 발휘 하여 TCR의 노출된 에피토프를 맵핑할 수 있으며, 리간드/MHC 결합에 있어서 이들 영역의 중요성을 입증할 수 있을 것이다.
소정의 질환과 연관된 마커 TCR은 공지된 기술을 사용하여 동정한다. MG 또는 MS를 갖는 것으로 공지된 환자를 이용하는 유전학적 방법이 문헌[참조: Oksenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:988-992(1989)]에 기술되어 있다. 적당한 TCR β쇄의 서열은 문헌[참조: Seboun et al., Cell 87:1095-1100(1989); Burns et al., J. Exp. Med. 169:27-39 (1989)]에 기재된 바와 같이, 특정의 자가면역 질환이 우세한 가계에서 발견되는 제한 단편 길이 다형성을 이용한 게놈 분석법에 의해 수득되었다.
따라서, 본 발명의 목적을 위하여, 자가면역 질환과 연관된 마커 TCR을 측정하고 면역원성 서열을 포함하는 펩타이드를 동정하는 것에 있어 자가항원이 특징화될 필요는 없다는 것이 명백할 것이다. (a) 자가면역 질환이 병인성 과정의 필요한 일부분으로서 T-세포 매개된 면역 반응을 포함하고, (b) 이러한 질환이 기관, 조직 또는 세포 특이적 타겟을 갖는 것으로 충분하다. 사실상, 당해 분야에 공지된 바와 같이[참조: Theofilopoulos, A., 상기 참조], 자가 면역 질환은 유발 단계에서 전적으로 자가항원과 관련되는 것은 아니며, 오히려 항원 단독과 가교반응성인 외인성 항원(예: 세균성 또는 바이러스성 항원)에 대한 반응을 나타내거나 숙주내에 존재하는 외인성 항원에 대해 지시된 면역병리학적 반응을 가져올 수 있다.
자가항원 또는 자가면역 질환과 연관된 항원(예: 특정의 바이러스성 또는 세균성 항원)을 인지하는 T 세포를 클로닝 하고, 사멸되지 않는 세포(예: 장기간의 T 세포주, T 세포 임파종주 또는 T 세포 하이브리도마)와 융합시킬 수 있으며, 이를 배양물내에서 생장시킨다. 이와 같이 배양된 세포는 적당한 TCR을 암호화하는 cDNA의 공급원으로서 제공된다. 이러한 cDNA를 클로닝하고 당해 분야에 널리 공지된 방법으로 발현시킨다[참조: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1982)].
앞서의 접근법 이외에도, 동물 모델을 택하여 자가면역 질환과 연관되는 TCR 가변성 영역 부위를 동정하는 것이 유리할 수 있음을 인지할 수 있을 것이다. 수많은 어떠한 자가면역 질환(예: EAE, 실험용 MG, 실험용 자가면역 갑상선염, 아주번트 관절염, 콜라겐 유발된 관절염 등)에 걸리기 쉬운 동물은 시험관내에서 동정될 수 있는 질환과 연관된 특정의 TCR 가변성 부위를 갖는다.
'질환에 걸리기 쉬운'이란 용어는 동물이 질환과 연관될 것으로 공지된 유전자(들)를 가짐으로써, 이러한 유전자(들)를 갖는 개인이 일반적인 집단에 비하여 질환으로 전개할 위험이 증가된 상태를 의미한다. 자가면역 질환과 연관된 것으로 공지된 유전자로는, 예를 들면, MHC 유전자(특히, II 부류), 면역 글로불린 V 유전자, TCR V 유전자 등이 있다. 용어 '걸리기 쉬운'이란 실제적으로 질환에 걸린 개인을 포함한다. 자가면역 질환과 특정의 TCR의 역할간의 완전한 상관관계가 전혀 예측되지도 않고 또한 본 발명을 성공적으로 실시하는데 필요하지도 않지만, 특정의 가변적 영역 유전자가 존재 또는 발현의 경우 및 동물에서 자기 면역 질환에 대한 감응도의 경우 약 60 내지 70% 정도의 높은 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 자가면역 질환에 걸리기 쉬운 사람, 특히 자기면역 질환에 걸린 개개인으로부터 분리된 T 세포를 배양물내에서 증식시킨다. T 세포 증식에 대한 기술은 문헌[참조: Zamvil et al., Nature 319:355-358(1985) 및 Nature 324:258-260(1986)]에 기술되어 있다.
이러한 방법을 사용하는 한 양태에서는, 환자 말초혈 림프구를 제거한 다음, 자가항원 또는 이로부터 기원하거나 이와 관련된 특정 펩타이드(이는 자가항원의 것에 필적하는 정도로 자극 시킬 수 있다)를 사용하여 자극시킨다. 자가항원(또는 관련 펩타이드)을 림프구 배양물에 수일 동안 첨가한다. 한 양태에서는, 자가항원을 사용하여 세포를 5 내지 6일동안 자극시킨다. 다른 양태에서는, 더 긴 시간동안 세포를 자극시킨다. 자극에 필요한 시간은 혈액 샘플중의 반응성 세포의 비율, 이를 세포의 활성화 상태 및 자극성 제제의 효능의 함수이며, 당해 분야의 전문가에 의해 용이하게 측정 가능하다. 이러한 선택적 조건하에서 배양한 후, 약 5 x 105개의 생존 세포를 분리해내고 약 3 x 107개의 자가항원 제공 세포(이들의 증식을 억제하기 위해 약 2500 내지 4500rad로 조사됨)와 약 20μg/ml의 자가항원(또는 관련 펩타이드)으로 재자극시킨다. 약 7일후, 생존 세포를 수거하고, 약 103-106개의 항원 제공 세포(예: 약 5 x 105개의 항원 제공 세포)와 사람 IL-2 또는 림프구 성장 인자(예: IL-4)의 순수한 배합물의 존재하에 제한 희석시켜 클로닝한다. 이러한 T 세포주의 세포를 약 1주 내지 2주동안 조직 배양 플라스크속에서 증식 및 성장시킨다. 이러한 세포주는 항원 제공 세포, 자가항원 제제 및 IL-2를 사용하여 수회 재자극시킬 수 있다. 재자극은 통상적으로 1주에 1회 수행 할 수 있다. 경우에 따라, 이러한 T 세포를 당해 분야에 공지된 수많은 방법중 어떠한 방법, 예를 들면, 제한 희석법 또는 일반적으로 재자극한지 약 2일 후에 연질 한천속에서 성장 하는 콜로니로부터 세포를 집어내는 방법으로 클로닝시킬 수 있다.
또다른 양태에서는, 기관 또는 체액으로부터의 림프구를 먼저 IL-2의 존재하에 배양한다. 이들 조건하에서는, 이미 활성화된 세포에 대해서만 선별이 이루어지고 이러한 세포만이 성장할 것이다. 연속적으로, 이러한 T 세포를 항원 제공 세포와 자가항원 제제로 자극시킨다. 이러한 방법을 사용하여, EAE 래트의 척수로부터의 MBP 특이적인 T 세포를 시험관내에서 선택적으로 증식시킨다.
본 명세서에서 사용한 바와 같은 용어 '자가항원'은 정의되거나 공지된 거대 분자에만 제한되지는 않는다. 예를 들면, 타입 I 당뇨병의 경우, T 세포 매개된 자가면역 반응의 표적 항원 또는 트리거(trigger)인 췌장 소도(또는 β) 세포와 연관된 특정 항원은 공지되어 있지 않다. 본 발명의 경우, 위에서 언급된 바와 같이, 시험관 내에서 세포를 자극하기 위해 사용된 자가항원은 완전한 췌장 소도 세포, 이러한 세포로부터 기원한 막 제제, 부분 정제된 막 성분 또는 동정되는 경우 당뇨병원성 자가항원을 포함할 수 있다. 독특한 자가항원이 아직까지 동정되지 않았기 때문에, 하시모토 갑상선염, 자가항원이 콜라겐이 아닌 관절염, 쇼그렌병(Sjogren's disease), 다근염, 아테롬성 동맥경화증 등을 포함하는 기타 자가면역 질환에 대해서도 상기와 동일하게 적용할 수 있다. 전문가는 T 세포가 반응하는 면역원성 잔기가 자극성 제제에 존재하는 한, 본 발명의 방법을 언급한 바와 같이 수행할 수 있음을 인지할 것이다.
클로닝되고 확장된 T 세포 집단내의 자가항원 특이적 반응성 T 세포의 존재는 자가항원의 존재하에 활성화될 세포의 능력을 시험함으로써 용이하게 측정할 수 있다. T 세포 활성화 과정에서 초기 또는 말기 현상을 측정하기 위한 수많은 검정법이 시판중이고 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 방법의 예로는 T 세포 증식(이는 방사표지된 티미딘의 흡수율로서 측정될 수 있다), 인터루킨-2의 분비, 세포내 칼슘 고정화, 이노시톨 포스페이트 대사와 관련된 특정 막 효소의 전위 및 세포 표면 분자의 발현 변화(이는 유동 혈구 계산법으로 측정할 수 있다) 등이 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 자가항원에 반응하는 T 세포 클론에 의해 발현된 TCR은 TCR 가변성 단편에 대해 특이적인 폴리클로날, 모노 클로날 또는 키메릭(하기 참조)의 TCR 특이적 항체를 사용하여, 표면 발현을 검출하기 위해 형광 현미경, 유동 혈구계산법, 면역혈구화학 또는 당해 분야에 널리 공지된 기술을 사용함으로써 동정 할 수 있다. 이러한 항체는 수많은 TCR α β쇄 V 영역에 대해 기술되었다[참조: Owhashi et al., 상기 참조; Gascoigne et al., 상기 참조; Kappler et al., 1987, 1988(상기 참조); 및 MacDonald, H.R., 상기 참조].
또 다른 방법으로는, T 세포 클론의 DNA 또는 mRNA를 직접 프로브화 하거나, 당해 분야에 널리 공지된 하이브리드화 방법을 사용하여 각종 TCR 유전자 군에 대한 핵산 프로브와 특이적 하이브리드화하여 폴리머라제 연쇄 반응[참조: Synha et al., Science 239:1026(1988); Saiki et al., Nature 324:163(1986)]으로 증폭시킨 후에 프로브화할 수 있다. 이어서, TCR 서열 또는 이의 일부를 증폭되고 재배열된 DNA 또는 mRNA로부터 직접 수득할 수 있다.
특정 TCR의 발현은, 예를 들면, TCR V 유전자를 클로닝한 후, TCR의 적어도 일부를 암호화하는 핵산 서열을 측정하거나, TCR 단백질의 적어도 일부의 아미노산서열을 측정함으로써 동정할 수도 있다. 위에서 언급한 방법들중 어느 방법이나 당해 분야의 전문가에게 공지된 부가의 방법을 사용해도 T 세포 또는 T 세포의 클론 또는 주위에 발현된 TCR을 동정할 수 있을 것이라는 것이 명백하다. 이러한 정보는 본 발명의 펩타이드 또는 약제학적 제제를 포함하는 아미노산 서열을 선택하는데 필요하다.
특이적 자가항원이 전혀 동정되지 않은 경우, 질환과 연관된 해부학적 영역내의 T 세포의 올리고클로날성은 반응성 T 세포가 풍부한 것에 대한 기준으로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 류마티스성 관절염과 독특하게 연관된 세포는 관절 접합부의 활액에서 발견되고; MS와 독특하게 연관된 세포는 뇌 척수액(CSF)에서 발견되며; 질환 연관된 T 세포는 하시모토 갑상선염 및 그라비스병의 갑상선 조직에서 침윤되어 있다. 이들 경우에 있어서, T 세포는 관련 해부 학적 부위로부터 분리시킨 다음, 세포를 위에서 언급한 바와 같이 배양물 속에서 증식시킨다[참조: Londei et al., Science 228:85-89(1985); Londei et al., Acta Endocrinol. 115(suppl. 281):86-89(1987); Stamenkovic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:1179-1183(1988); Lipoldova et al., J. Autoimmun. 2:1-13(1989); Oksenberg et al., 상기 참조]. 이러한 세포의 DNA 또는 mRNA를 분리하고, cDNA를 제조한 다음, 이환된 피검자와 이환되지 않은 피검자를 비교함으로써 가변성 TCR 부위를 암호화하는 cDNA의 서열 차이를 확증한다. 세포를 배양물 내에서 증식시키는 대안으로서, 세포 DNA 또는 바람직하게는 mRNA로부터 제조된 cDNA를 피검자로부터 분리된 T 세포 및 위에서와 같이 PCR 반응에 의해 증식된 핵산으로부터 직접 수득 할 수 있다.
수많은 사람 및 동물 모델 자가면역 질환과 연관된 항원은 현재 공지되어 있다. 타입 II 콜라겐과 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 65 kD 열 쇽 단백질(heat shock protein)은 류마티스성 관절염과 연관된 항원이고; AChR은 MG와 연관된 항원이며 또한 마우스에서 유도될 수 있는 실험용 알레르기성 중증성 근무력증(EAMG)과 연관된 항원이다. 티로글로불린은 마우스에서 실험용 알레르기성 갑상선염 (EAT)과 연관된 항원인 것으로 공지되어 있다. 유사한 질환인 하시모토 갑상선염은 갑상선 포상 세포위의 항원에 대한 면역 반응과 관련이 있다. 그라비스병에서, 면역 반응은 갑상선 세포 상의 향갑상선성 호르몬 수용체와 관련이 있다. 미엘린 기본 단백질(MBP)과 프로테오리피드 단백질(PLP)은 래트와 마우스에서 실험용 알레르기성 뇌척수염(EAE)와 연관이 있는 것으로 공지되어 있다. EAE는 사람에게서 다발성 경화증에 대한 인지된 모델이다.
따라서, 당해 분야의 전문가는 본 발명이 한 국면에서는, 위에서 언급한 질환에 제한되는 것은 아니지만 이들을 포함하는 사람 및 동물 질환을 예방 또는 치료하는데 유용한 펩타이드의 동정에 관한 것임을 인지할 것이다.
항원성 펩타이드의 선택
본 발명의 중요한 양태는 자가면역 질환과 연관된 TCR을 동정하는 방법, TCR의 올리고펩타이드 서열이 질환 과정에서 T 세포 작용에 대해 중요하고도 면역원성이 되는지를 측정하는 방법, 이 펩타이드를 합성하는 방법 및 이를 치료제로서 사용하는 방법의 조합 방법을 포함한다.
관련 TCR 서열 영역은 이들의 예견된 항원성 또는 면역원성을 근거로 하여 합성하기 위해 확인된다. '면역원성'이란 용어는 면역 반응을 유발하는 특정 펩타이드(T 세포 매개되거나 항체, 또는 둘다)의 능력을 지칭한다. '항원성'이란 용어는 항체에 의해 유리 형태로 및 항원 특이적 T 세포의 경우 MHC 분자의 측면에서 펩타이드를 인식하는 능력을 지칭한다. 아마도 T 세포에 대해 면역원성 또는 항원성인 단백질 또는 펩타이드의 영역은, 예를 들면, 문헌[참조: Margalit et al., J. Immunol. 138:2213-2229(1987) 및 Rothbard et al., EMBO J. 7:93-100 (1988)]에 기술된 방법과 알고리듬을 사용하여 동정한다. 상기 문헌에 따르는 방법은 항원성 부위가 하나의 우세한 극성면과 하나의 우세한 비극성면을 갖는 나선인 것으로 가정되는 양쪽성 나선(amphipathic helix) 모델을 기준으로 한 알고리듬을 전개하는 면역우성 헬퍼 T 세포 항원 부위의 분석을 근거로 한 것이다. 로트바드(Rothbard) 등의 방법은 MHC 부류 I 및 II 분자에 의해 인식될 수 있는 단백질 서열 내의 영역을 정확하게 예견할 수 있는, T 헬퍼 또는 T 세포 독성 세포 클론에 의해 우선적으로 인지된 에피토프와 유사한 모티브를 인식하는데, 이러한 인식은 T 세포 면역원성과 항원성에 필요한 것으로 추정된다.
TCR 펩타이드를 선별하기 위한 하나의 접근법에서는, TCR의 구조와 항체 구조와 유사한 구조의 현 모델을 기준으로 하여 본 발명의 목적에 중요한 면역 조절 측면에서 TCR의 영역이 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에 속하거나, TCR 과가변성 영역 에서 CDR의 엄격히 제한 부분이 아닌 영역(예: Vβ 단편의 39-49번 잔기)이다[참조: Davis et al., Nature 334:395-402(1988)].
사람 환자에서의 MS와 래트에서의 EAE를 치료하는데 사용하기 위한 펩타이드 서열을 선택하는 상기 방법의 사용은 이러한 접근법의 성공을 예시해준다. 예를 들어, 루이스 래트 에서 EAE에 대한 마커 TCR의 CDR1에 상응하는 16개 아미노산을 포함하는 펩타이드 Vβ8(25-41)은 T 세포에 대해 면역원성이 아닌 것으로 상기 반응 순서에 의해 예건되었다. 사실상, 이러한 펩타이드는 T 세포 면역성을 유도하지 않고 EAE로부터 루이스 래트를 보호해주지도 못한다. EAE와 연관되지 않은 상이한 TCR β쇄의 CDR1에 상응하는 펩타이드 Vβ14(25-41)은 T 세포에 대해 면역원성인 것으로 예견되었으며, 실제로 루이스 래트에서 T 세포 면역성을 유도하는 것으로 밝혀졌지만, 예상된 바와 같이 EAE로부터 보호해주지는 못한다. 유사하게, EAE와 연관이 없는 TCR에 상응하는 CDR2 펩타이드 Vβ14(39-59)는 면역원성이며 면역성을 유도하였으나, EAE로부터의 보호해주지는 못하였다. 본 발명에 따르면, 관련 TCR의 CDR2 관련 펩타이드 Vβ8(39-59)는 면역원성이면서 동시에 EAE로부터 보호해주는 것으로 예견되었고, 실제로도 그렇게 하는 것으로 밝혀졌다(하기 실시예 참조).
본 발명에 사용하기 위해 선택된 펩타이드의 길이는 당해 펩타이드에 대해 특이적인 T 세포 또는 항체가 본래의 T 세포상의 TCR을 인지하여 이와 반응하도록 최소한도의 에피토프 구조는 유지하면서도, 면역원성에 대한 요구사항에 의해 대부분 결정 된다. 예를 들면, 본 발명의 펩타이드가 충분히 면역원성이고 T 세포 활성을 변화시킬 수 있는 TCR의 관련 에피토프를 포함하는 고 개연성을 가지기 위해서는 약 15 내지 30개의 아미노산의 범위여야 하지만, 상이한 길이의 펩타이드도또한 고려된다. 본 발명의 방법에 따라서 EAE를 치료하기 위한, 래트에서 EAE와 연관된 TCE β쇄 위에 존재하는 21개 아미노산 TCR 펩타이드의 성공적인 용도는 다음 실시예에서 충분히 입증된다.
본 발명에 유용한 펩타이드의 면역원성은 널리 공지된 방법, 예를 들면, 동물에서 DH 반응을 사용함으로써 스크리닝할 수 있다. 이러한 반응에서, 동물은 적당한 용량의 항원을 종종 보조제[예: 완전한 프로인트 보조제(CFA)]와 함께 통상 피하내(SC) 주입함으로써 '감작화'시킨다. 일반적으로, 약 5 내지 15일후에, 동물에게 통상 생리 식염수 또는 기타 완충액중의 적당한 용량의 항원을 피내(ID) 투여함으로써 반응을 유발시킨다. 이러한 반응은 24 내지 48시간후에 평가한다. DH를 측정하는 비제한적인 검정법의 예로는 항원 주입 부위에서 부종 (적색)과 경화(팽윤)의 크기, 귀 팽윤, 발가락 팽윤, 꼬리 팽윤, 챌린지 부위에서 전신 주입된125I 표지된 요오도데옥시우리딘의 축적, 챌린지 부위에서 정맥내(IV) 주입된 방사 표지된 혈청 단백질(예: 알부민)의 축적 및 챌린지 부위에서 IV 주입된 표지된 염증 세포(예: 림프구 또는 친핵체)의 축적을 측정하는 방법이 있다. 예를 들면, 약 0.15 내지 0.25mm, 바람직하게는 약 0.20mm의 귀 바퀴(루이스 래트에서)에서 적절히 피내 챌리지한 후 귀 팽윤 반응은 양성 DH 반응을 나타낸다. 당해 분야의 전문가는 펩타이드 크기, 용량, DH의 감작화 또는 유도 경로, 사용된 담체, 사용된 보조제 등이 DH 반응 시간과 정도에 영향을 미칠것이라는 것을 인식할 것이다.
본 발명에서 의도하는 바와 같이, 면역원성인 것으로 고려된 펩타이드의 경우, 동물당 약 10 내지 200μg, 바람직하게는 약 25 내지 100μg의 용량으로 동물을 DH 반응에 감작화시킬 수 있다. 더우기, 감작화된 동물에 있어서, 펩타이드 약 1 내지 100μg, 바람직하게는 약 5 내지 50μg의 용량으로 피내 챌린지시 DH 반응을 유발시킬 수 있다.
펩타이드 합성 및 검정
위에서 기술한 바와 같이 측정된 서열을 갖는 목적하는 펩타이드는 용액 및 고체상 연속 아미노산 접합 공정과 원핵 또는 진핵 숙주에서 재조합체 생성을 포함하는 표준 합성 기술을 사용 하여 제조한다. 제조된 펩타이드가 면역원성이라는 확증은 위에서 기재한 바와 같이 동물(예: 마우스 또는 래트)에서 DH 반응을 사용하여 용이하게 측정할 수 있다. 이러한 펩타이드를 피하 투여 하고, 약 9일 내지 14일 후에 귀 바퀴에 피내 챌린지한다. 챌린지한지 24시간 또는 48시간후에 측정한 귀 팽윤 반응은 펩타이드에 대한 T 세포 매개된 면역성이 존재하는지의 여부를 측정하는 간단하고도 신뢰성 있는 지수이다.
자가면역성을 실제적으로 조절하는 면역원성 펩타이드의 능력은 TCR 관련 펩타이드가 종마다 차이가 있다는 점을 고려하여, 적당한 동물 모델을 사용함으로써 확증한다. 예를 들어, 사람을 치료하는데 있어서 사람 마이커 TCR의 CDR2를 나타내는 서열을 사용하는 것이 바람직하지만, 동물 질환 모델에 대한 마커 TCR의 상응하는 영역이 동물 질환에 사용된다.
질환을 예방 또는 치료하는데 있어서 당해 펩타이드의 유효성을 스크리닝하는데 사용될 수 있는 동물 모델 시스템은 위에서 언급한 바와 같이 입수 가능하다. 물론, 동일한 펩타이드가 사람에게서 유효하지 않을 수 있는데, 이는 이들 펩타이드가 질환 연관된 사람 TCR의 적당한 부위에 상응하지 않거나, 사람에게서 충분하게 면역원성이 아닐 수 있기 때문이다. 특정 동물 모델에서 묘사된 펩타이드 서열의 변형은 사람을 포함한 기타종에 속하는 피검물을 치료하는데 필요할 수 있다는 것은 이해되어질 것이다. 따라서, 예를 들면, 특정의 CDR2 연관된 펩타이드 서열이 특정 질환으로부터 보호하는데 유효하다는 확증은 상응 하는 사람 서열이 사람에 대해 유효한 펩타이드 치료제로서 바람직한 대안물일 수 있다는 견해를 유도하는 이들 모델에서 획득할 수 있다. 따라서, 위에서 기재한 방법을 사용하여 사람 (또는 상이하고 사람이 아닌 동물종)에서의 상응하는 TCR 서열에 대한 결정으로 사람(또는 기타 종)에 사용하기 위한 펩타이드의 변형을 가져올 수 있다.
다음은 사람 자가면역 질환의 동물 질환 모델의 비제한적 예인데, 이를 사용하여 TCR 펩타이드가 질환을 변형 시키고, 전이시 질환을 변형시킬 수 있는 항체와 T 세포를 유도시키는지의 능력을 평가할 수 있다. 전신 홍반성낭창(SLE)은 문헌[참조: Knight et al., J. Exp. Med. 147:1653(1978) 및 Reinertsen et al., N. Eng. J. Med. 299:515(1978)]에 기재된 바와 같이 감응성 마우스에서 시험한다. MG는 문헌[참조: Lindstrom et al., Adv. Immunol. 42:233-284(1988)]에 기재된 바와 같이 또 다른 종으로부터의 가용성 AChR 단백질로 질환을 유발시킴으로써 SJL/J 암컷 마우스 에서 시험한다. 관절염은 문헌[참조: Stuart at el., Ann. Rev. Immunol. 2:199-218(1984)]에 기재된 바와 같이 타입 II 콜라겐을 주입함으로써 마우스의 감응성 균주내에서 유발시킨다. 아주번트 관절염은 문헌[참조: Van Eden et al., Nature 331:171-173 (1988)]에 기재된 바와 같이 미코박테리아 열 쇽 단백질을 주입함으로써 감응성 래트에서 유발시킨다. 갑상선염은 문헌[참조: Maron et al., J. Exp. Med. 152:1115-1120(1980)]에 기재된 바와 같이 티로글로불린을 투여함으로써 마우스에서 유발시킨다. 인슐린 의존성 진성 당뇨병(IDDM)은 자연적으로 발생하거나 문헌 [참조: Kanasawa et al., Diabetologia 27:113(1984)]에 기재된 바와 같은 특정 마우스 계통에서 유도시킬 수 있다. 기타 마우스 계통으로부터의 림프구를 이전시켜 다른 마우스 계통에서 이를 질환을 나타나게 할 수 있다.
마우스와 래트에서의 EAE는 사람에 있어서 MS에 대한 모델로 활용된다. 이 모델에서, 탈수성 질환은 문헌에 기술한 바와 같이 미엘린 기본 단백질(MBP) 또는 프로테오리피드 단백질(proteolipid protein: PLP) 또는 테일러 바이러스(Theiler's virus)를 투여하여 유발한다[참조: Paterson, P.Y., Textbook of Immunopathology (Mischer et al., eds.), Grune and Stratton, New York, pp. 179-213(1986); McFarlin, D.E., et al., Science 179: 478-480 (1973); and Satoh, J., et al., J. Immunol. 138:179-184 (1987)].
사람에서 본 발명 조성물의 예방적, 억제적 또는 치료적 장점을 측정하기 위해, 특정의 임상적 산출값을 사용한다. 예를 들어, MS에서, 정량적 파라메타로서 (a) 임상적 무력증, (b) 연구상 악화율 및 (c) 자기 공명 이미지화(MRI) 뇌 플라그 부하(이는 MS 환자를 평가하는데 사용되는 중요한 최근의 매개변수이다)가 있다. 이들 측정은 치료를 담당하는 의사의 별도의 맹검 시험 또는 비맹검 시험을 필요로한다. 무력증에 대한 독립적 결정요인으로서 인식손상의 신경심리학적 측정이 이용된다. 임상학적 무력증은 통상적으로 맥알핀 스케일 (McAlpine Scale), 쿠르츠케 스코어(Kurtzke Score), 확장된 무력증상태 스코어(Expanded Disability Status Score : EDSS)로 별칭되는 변형 쿠르츠케 스코어로 측정한다. EDSS에 대한 ½ 단위의 개선(1 내지 9 범위)을 유의성 있는 것으로 간주한다. 한 임상학적 측정에서, 환자의 보행능력은 보행지수로 측정하며, 또는 1 이상 단위의 증가를 유의성 있는 것으로 간주한다. 이런 임상학적 측정은 당해분야에 널리 공지되어 있으며 문헌에 상세히 기술되어 있다[참조: McAlpine et al., Multiple Sclerosis, Livingston Press, Edinburgh (1955); Binken, P.J. et al., Handbook of Clinical Neurology, Volume 9, Amsterdam- North Holland Publishers, Amsterdam (1970); and Field, E.J. et al., Multiple Sclerosis : A Critical Review, M.M.T.P. Press, Ltd, Lancaster, England (1977)].
RA에 있어서 개선의 측정은, 예를 들어, 부종의 해소 또는 감소, 새벽경직 지속의 감소, 감소된 적혈구 침강율 및/또는 C-반응성 단백질, 류마티스성 소결절로서 류마티스-관련 상태의 해소 및 백혈구 수 감소 등을 포함하는 여러가지 일차적 임상적 결과에 기초한다. 2차적 결과에는 환자 및 의사 모두에 의해 판단되는 전 상태에 있어 피로 감소와 모든 상태의 개선을 포함한다. 임상적 결과는 다음과 같이 분리된다: (a) 완전한 반응 - 관절부종, 감수성 및 새벽경직의 90% 초과 감소; (b) 현저한 반응 - 관절부종, 감수성 및 새벽경직의 50 내지 90% 감소; (c) 완만한 반응 - 관절부종, 감수성 및 새벽경직의 30 내지 50% 감소 및 (d) 무반응 -관절부종, 감수성 및 새벽경직의 30% 이하 감소.
추가의 면역-관련 질환에서 펩타이드, 항체, T 세포 및 본 발명의 기타 조성물의 예방, 억제 또는 치료효과를 평가하는 유사 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
수동 면역
능동 면역화를 위한 TCR 펩타이드의 이용외에, 본 발명의 다른 양태는, 항-TCR 면역성을 수동적으로 전달하기 위해, TCR 펩타이드로 활성화시킨 T세포 및 TCR 펩타이드에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 수동 항체-매개 면역성은, 예를 들어, 항체-의존성 세포성 세포 독성 또는 보체-의존성 세포 독성과 같은 다수의 어떠한 유효기 기작을 포함할 수도 있다. 달리는, 항체는 특이적 방법으로 독소원, 예를 들어, 리신 A 쇄를 전달하기 위해 사용된다.
수동 백신처리를 위해, 대상 동물에 하기의 적절한 펩타이드를 주입하고 말초혈액 림프구 또는 다른 기관으로부터 유출성 임파절과 같은 림프구를 수거한다. T세포는 면역성을 전달하는데 직접 사용할 수도 있다. 달리는, T세포를, 선택성 자극제로서 TCR 펩타이드 존재하에 배양물 중에서 성장시키고, 당해 분야에 공지된 IL-2 또는 기타 T세포 성장인자의 도움으로 증식시키며, T세포주 또는 클론으로서 유지시킨 다음 면역원성을 전달하는데 사용한다. B 세포는 TCR 펩타이드-면역화 동물로부터 취한 초기 세포 군으로부터 회수할 수 있으며 표준 기술을 사용하여 세포주 융합 파트너에 융합시킴으로써 고정화하여 TCR 펩타이드에 대해 특이적인 모노클로날 항체 제조용의 하이브리도마를 제조한다. 적절한 항체를 제조하는 하이브리도마는 TCR 펩타이드 항원 또는 관련 T세포와의 반응성에 대해 직접 ELISA 분석과 같은 통상적인 면역검정으로 스크리닝한다.
본 발명의 TCR 펩타이드와 같은 특이적 항원에 대한 모노클로날 항체(mAbs)는 당해 분야에 숙련가에게 공지된 방법에 따라 수득할 수 있다[참조: Kohler and Milstein, Nature 256:495-497(1975) 및 미합중국 특허 제4,376,110호]. 이같은 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD를 포함하는 모든 면역글로불린 부류 및 이의 어떠한 아부류도 될 수 있다.
달리는, 항체는 TCR 펩타이드로 면역화시킨 동물로부터 취한 폴리클로날 항혈청으로부터 제조할 수 있으며, 당해 분야에 널리 공지된 다양한 정제법에 적용시킬 수도 있으며, 또한 항-TCR 면역성을 수동적으로 전달하는데 직접 사용한다.
설치류기원의 모노클로날 항체는 mAb의 V영역을 암호화하고 있는 cDNA 분자를 문헌에 기술된 여러가지 방법을 사용하여 사람 고정 영역을 암호화하는 DNA에 결합시킴에 의해 '사람화'시킨다[참조: Cabilly et al., U.S. Patent 4,816,567(3/28/89) and Eur. Patent Pub. EP125023(11/14/84); Taniguchi et al., Eur. Patent Pub. EP171496(2/19/86); Morrison et al., Eur. Patent Pub. EP173494(3/5/86); Neuberger et al., PCT Pub. WO8601533(3/13/86); Kudo et al., Eur. Patent Pub. EP184187(6/11/86); Robinson et al., PCT Pub. WO 8702671(5/7/87); Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277(1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984);Boulianne et al, Nature 312:643-646 (1984); Morrison, Science, 229:1202-1207(1985); Neuberger et al., Nature 314:268-270(1985); Takeda et al., Nature 314:452-454(1985); Tan et al, J. Immunol. 135:3564-3567(1985); Jones et al., Nature 321:522-525(1986); Oi et al., BioTechnique 4:214(1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066-1074(1986); Sun et al., Hybridoma 5(Supp. 1):S17-S19(1986); Sun et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 84:214-218(1987); Liu et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 84:3439-3443(1987); Liu et al, J. Immunol 139:3521-3526(1987); Better et al., Science 240:1041-1043(May 20, 1988); and Horwitz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8676-8682(1988)].
키메라성 항체 제조의 바람직한 방법은 다섯가지 요소를 혼용한다: (1) 모노클로날 항체를 생성하는 마우스 B 세포 하이브리도마주로부터 전령 RNA(mRNA)의 분리, 클로닝 및 이로부터 cDNA의 제조; (2) 경쇄(L) 및 중쇄(H) 유전자의 적절한 가변(V) 영역 유전자 단편을 (i) 적절한 프로브로 동정할 수 있고, (ii) 서열화할 수 있으며 (iii) 고정(C) 영역 유전자 단편과 호환성이도록 할 수 있는 정제된 mRNA로부터 온전한 길이의 cDNA의 제조; (3) cDNA 제조 및 클로닝으로 C 영역 유전자 단편 단편의 제조; (4) 상기 (2)에 기술한 클로닝된 특이적 면역글로불린 V 영역 유전자 단편을 (3)에 기술한 클로닝시킨 사람 C 영역 유전자 단편 모듈에 연결시킴에 의한 완전한 H 또는 L쇄 암호화 서열의 작제 및 (5) 원핵 세포와 진핵 세포를 포함하는 선택 숙주내에서 키메라성 L 및 H쇄의 발현 및 제조.
포유동물 세포에서 클로닝된 H 및 L쇄 유전자의 발현을 위해 다수의 벡터 시스템이 이용될 수 있다[참조: Glover, D.M., ed., DNA Cloning, Vol. II, pp143-238, IRL Press, 1985]. 완전한 H2L2항체를 수득하기 위해 상이한 방법이 따를 수 있다. H 및 L쇄를 완전한 4량체 H2L2항체내로 세포내 연합 및 연결시키기 위해서 H 및 L쇄를 동일 세포내에서 동시 발현시키는 것이 가능하다. 이러한 동시 발현은 동일숙주 내에서 동일하거나 상이한 플라스미드를 사용하여 발생시킬 수도 있다. H 및 L쇄 모두에 대한 유전자는 동일 플라스미드에 위치할 수도 있으며, 이는 다시 세포내로 전이시킬 수도 있고, 이렇게 하여 두 쇄 모두를 발현시키는 세포에 대해 직접적 선택할 수도 있다. 달리는, 세포를 먼저, 예를 들어 L쇄를 암호화하는 한 플라스미드로 형질감염시킨 후 생성된 세포주를 제2의 선택성 마커를 함유하는 H쇄 플라스미드로 형질감염시킬 수 있다. 증강된 특성, 예를 들어 어셈블링된 H2L2항체 분자의 보다 높은 생산 또는 형질감염된 세포주의 증강된 안정성을 갖는 세포주를 생성시키기 위해, 어떠한 루트로나 H2L2모듈을 생성할 수 있는 세포주는, 추가의 선택성 마커와 연관지어 추가의 H, L 또는 H+L쇄를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시킬 수 있다.
본 발명의 키메라 항체는 마우스 mAb의 TCR-인지 특이성 및 사람 항체의 생물학적 특성 둘다를 갖는다(이는 사람에 있어서 제거 내성 및 보다 약한 면역원성을 포함한다-복수 처리를 허용함).
본 발명의 항-TCR 펩타이드 항체(폴리클로날, 모노클로날 및 키메라성)는 면역접합체로서 치료요법적으로 사용할 수 있다[참조: Dillman, R.O., Ann. Int.Med. 111:592-603(1989)]. 이들은 라이신-A, 슈도모나스 독소 및 디프테리아 독소와 같은 라이보즘 억제 단백질을 포함하는 세포독성 단백질 뿐만아니라 종양 괴사 인자와 같은 다른 단백질과 커플링시킬 수 있다. 항체 또는 다른 리간드에 접합시킨 독소가 당해분야에 공지되어 있다[참조: Olsnes et al., Immunol. Today 10:291-295(1989)]. 이와 같은 결합된 항체의 추가의 예는 XomaZymeR-CD5 Plus로서, 이는 리신 A쇄에 결합된 항-CD5 mAb이다. 이 제제는 사람에 있어서 이식체-대-숙주 질환 및 고질적 류마티스 관절염의 예방과 치료에 효과적이다. 이러한 특정의 독소-결합된 항체는 대부분의 T 림프구 및 B 림프구의 소단위에 특이적이다. CD5 마커를 가진 세포는 치료에 반응하여 신속하게 감소한다. TCR 펩타이드에 대항 항체가 총 림프구 훨씬 작은 부분과 반응할 것이므로, 리신 A에 결합된 항-TCR 항체의 고 투여량이 환자에게 허용될 수도 있으며, 또한 역으로는, 보다 낮은 투여량이 효과적일 수 있다. TCR 펩타이드에 대한 리신 A 결합된 모노클로날 항체의 유효 투여량은 약 0.005 내지 0.5mg/kg/일이며, 바람직하게는 약 0.05 내지 0.2mg/kg/일의 범위이다.
본 발명의 항-TCR 펩타이드 항체는, 자가면역성 또는 악성 또는 림프구증식성 질환의 환자를 치료하기 위해, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 방사 핵종 및 세포독성 약물을 포함하는 추가 형태의 치료적 수단에 접합시킬 수 있다. 항체와 커플링할 수 있으며 생체내에서 항원 부위로 전달될 수 있는, 비제한적인 방사 핵종의 예로는212Bi,131I,186Re 및90Y가 있다. 이와 같은 방사 핵종들은 방사 치료요법의 분야에 널리 공지된 바와 같이 세포를 국소 조사시키고 다양한 세포내 손상을 유발시켜 이들의 세포독성 효과를 발휘한다.
항체에 접합될 수 있으며 종종 생체내 치료요법으로 사용되는 세포독성 약물로는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 다우노루비신, 독소루비신, 메토트렉세이트 및 미토마이신 C가 포함된다. 세포독성 약물은 DNA, RNA 및 단백질 합성을 포함하는 중요한 세포적 과정들을 억제한다. 당해분야에 공지된 이들 약물 부류의 보다 완전한 설명 및 이의 작용기작을 알고자 한다면, 문헌을 참조한다[참조: Goodman et al., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed., Macmillan Publishing Co., (1985)].
본 발명의 항체, 단편 또는 유도체를 사용한 개체의 치료는 단일 또는 복수 투여량의 항체, 이의 단편 또는 이의 유도체의 비경구적 투여를 포함한다. 유효 투여량은 개개의 항체, 결합된 치료 요법제의 존재 및 특성, 환자 및 환자의 임상 상태의 함수이며, 체중 kg당 약 10ng 내지 체중 kg당 약 100mg 범위로 다양할 수 있다. 투여경로는 정맥내(i.v.), 피하(s.c.). 근육내, 폐내, 복강내(i.p.), 비강내, 구강내, 피내, 경피 또는 다른 공지된 루트일 수 있다.
펩타이드의 제제화
질환 또는 이상증 치료에 있어서 본 발명의 예비임상적 또는 임상적 치료요법적 사용은 허용되는 진단 및 치료원리를 사용하는 당해분야의 전문가에 의해 최대의 성과를 얻을 수 있게 된다. 이와 같은 원리는 당해 분야에 공지되어 있으며예를 들어 문헌중에 주어지고 있다[참조: Braunwald et al., eds., Harrison's Principles of Internal Medicine, 11th Ed., McGraw-Hill, Publisher, New York, N.Y.(1987).
본 발명의 펩타이드 및 조성물 또는 이의 작용적 유도체는 약제학적 조성물의 제조시 적합하다. 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명 조성물의 유효한 효과를 경험할 수 있는 모든 동물에게 투여할 수 있다. 이런 동물중 주요한 것은, 사람과 같은 동물체이며, 물론 본 발명이 이로써 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 의도하는 목적을 성취시킬 수 있는 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들어, 투여는 비경구, 피하, 정맥내, 피내, 근육내, 복강내, 피내 또는 구강 루트 등일 수 있다. 달리는, 또는 동시에, 투여는 경구투여일 수도 있다. 펩타이드 및 약제학적 조성물은 거환 주입 또는 시간에 따른 점진적 살포와 같이 비경구적으로 투여할 수도 있다.
투여량은 환자의 연령, 성별, 건강 및 체중, 병행치료의 종류 및, 있다면, 치료의 빈도 및 목적하는 효과의 특성등에 따라 결정된다. 본 발명 조성물의 투여량 범위는 목적하는 효과를 나타내기에 충분히 큰 양이면 되고, 이에 의해, 예를 들어, DH 또는 항체 생성에 의해 측정되는 바와 같은 펩타이드에 대한 면역 반응이 성취되며, 면역-관련 질환이 현저하게 예방되거나, 억제되거나 또는 치료되게 된다. 투여량이 지나치게 많아서 부작용, 예를 들어, 원치않는 교차 반응, 일반화된 면역 억제, 과민반응 등을 유발시켜서는 않된다.
사람에 대한 바람직한 투여량은 0.001 내지 25mg/kg 체중의 범위이다.
자체가 약리학적으로 활성인 본 발명의 펩타이드외에, 약제학적 조성물은, 활성 화합물을 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로의 가공을 촉진시켜주는, 부형제 및 보조제를 포함하는 약제학적으로 허용되는 적합한 담체를 함유할 수도 있다. 바람직한 조성물은 명반과 같은 보조제 또는 기타 당해 분야에 공지된 다른 보조제를 포함한다[참조: Warren et al., Ann. Rev. Immunol. 4:369-388(1986); Chedid, L., Feder. Proc. 45:2531-2560(1986)].
전달 또는 생활성을 증강시키기 위해, 펩타이드를 당해 분야에 공지된 방법 및 화합물을 사용하여 리포좀내에 혼입시킬 수도 있다.
정제 및 캡슐 형태로서 경구 투여 가능한 제제, 좌약과 같이 직장 투여 가능한 제제 및 주입 또는 경도 도입용의 액제와 같은 제제는 부형제와 함께 약 0.001 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 95%의 활성화합물(들)을 함유한다.
적절한 부형제는, 특히, 충진제, 예를 들어, 사카라이드(예를 들면 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 솔비톨), 셀룰로스 제제 및/또는 칼슘 포스페이트(예: 트리칼슘 포스페이트 또는 인산수소칼슘), 결합제(예: 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 및/또는 폴리비닐 피롤리돈을 사용하여 제조한 전분 페이스트) 등이다.
경구용으로 사용가능한 다른 약제학적 제제는 젤라틴으로 제조한 푸쉬-피트 캡슐(push-fit capsule) 뿐만 아니라, 젤라틴과 글리세롤 또는 솔비톨과 같은 가소제를 써서 제조한 연질 밀봉 캡슐이 포함된다. 푸쉬-피트 캡슐은 충전제(예: 락토스), 결합제(예: 전분) 및/또는 윤활제(예: 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트) 및 임의로 안정화제와 혼합시킬 수 있는 과립 형태의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물은 바람직하게는 예를 들어 지방오일 또는 액체 파라핀과 같은 적절한 액체중에 용해 또는 현탁시킨다. 또한 안정화제가 가해질 수도 있다.
직장으로 사용할 수 있는 가능한 약제학적 제제는, 예를 들어, 좌약 기재와 함께 하나 이상의 활성 화합물의 조합으로 이루어진 좌제를 포함한다. 적절한 좌약 기재는, 예를 들면, 천연 또는 합성 트리글리세라이드 또는 탄화수소 파라핀 등이다. 또한, 기재와 함께, 활성 화합물의 배합물로 이루어진 젤라틴 직장용 캡슐을 사용하는 것도 가능하다. 가능한 기재 물질로는 예를 들어, 액체 트리글리세라이드, 폴리에틸렌글리콜 또는 탄화수소 파리핀 등이다.
비경구 투여용으로 적합한 제제는 수용성 형태, 예를 들어, 수용성 염중의 펩타이드 수용액을 포함한다. 또한, 경우에 따라 유성 주사 현탁액과 같은 펩타이드의 현탁액이 투여될 수도 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클로는 지방 오일(예: 참깨 오일) 또는 합성 지방산 에스테르(예: 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드)가 있다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점성을 증가시키는 성분을 함유할 수 있으며, 여기에는, 예를 들면, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨 및/또는 덱스트란이 포함된다. 임의로 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수도 있다.
펩타이드는 주사로 투여하기에 적합한 통상적인 약제학적으로 허용되는 비경구 비히클을 사용하여 제형화한다. 이들 비히클은 비독성이고 치료적이어야 하며,다수의 제형은 상기 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Science, 상기 참조]중에 설정되어 있다. 부형제의 비제한적인 예로는 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 용액 및 행크의 벨런스 염 용액이 있다. 본 발명에 따른 제제는 또한 등장성, 생리학적 pH 및 안정성을 유지시키는 물질과 같은 소량의 첨가제를 함유할 수도 있다.
본 발명의 펩타이드는 바람직하게는 실질적으로 응집체 및 기타 단백질 물질을 실질적으로 함유하지 않는 정제형으로써, 바람직하게는 약 1.0ng/ml 내지 100mg/ml의 농도 범위로 제형화된다.
면역-관련 질환의 예방, 억제 및 치료를 위한, 본 발명의 펩타이드의 유효 투여량은 체중 kg당 약 1ng 내지 100mg의 범위이다. 바람직한 투여량 범위는 약 10ng 내지 10mg/kg이다. 보다 바람직한 투여량 범위는 약 100ng 및 1mg/kg 범위이다.
펩타이드의 면역원성은 이를 보다긴 펩타이드 또는 쇄중에 포함시키거나 또는 표준 연결 방법을 사용하여, 이를 '면역학적' 담체, 예를 들어, KLH, 혈청 알부민, 테타누스 독소 등에 접합시킴으로써 증강시킬 수가 있다. 이러한 여러가지 방법이 당해 분야에 널리 공지되어 있다: 디사이클로헥실 카보디이미드와 같은 축합제의 사용 또는 피어스 케미칼 캄파니 (일리노이 록포드 소재)에서 시판하는 링커의 사용 등.
본 발명의 TCR 펩타이드-특이적 T 세포 제형을 사용한 수동 면역화를 위해, 수거한 T 세포를 생리학적으로 완충된 염수와 같은 적절한 비히클중에 현탁시키고환자에게 1회 주입당 약 105내지 109개 세포수의 양을 주입한다. TCR 펩타이드-특이적 항체의 투여량은 항체종 기원, 이소타입, 친화도, 특성(폴리클로날, 모노클로날 및 키메라성) 및 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다른 특징의 함수로서 다양하다. 예를 들어, TCR 펩타이드에 대한 모노클로날 항체는 0.01 내지 50mg/kg의 범위로 투여될 수 있다.
본 발명의 범주내에서 고려되는 것은 또한, 유리 또는 접합 형태인, 보호성 T세포 및 TCR 펩타이드-특이적 항체(폴리클로날, 모노클로날 또는 키메라성) 배합물을 이용한 수동면역화 방법이다.
다음의 실시예는 예로 든 것이며, 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다.
실시예 I
TCR 펩타이드를 사용한 사람 MS 환자의 치료
현재까지 MS에 대한 효과적인 치료법은 알려진게 없다 [참조: Harrison, Principles of Internal Medicine, 12th ed. Wilson et al., McGraw Hill, Inc. 1991]. 치료학적 노력은 급성 애피소드의 개선, 질환의 재발 또는 진행의 억제 및 증상 완화에 주력되어 왔다. MS의 임상적 현시는 뇌간, 대뇌 또는 척수의 어떤 신경 그룹 또는 영역이 관련되어 있는가에 따라 결정된다. 척수가 관련된 것은 가장 많이 진행된 MS 케이스에서 우세한 특징이다.
질환의 급성 애피소드 상태에서는, 글루코코르티코이드 치료가 증상의 심각성을 경감시키고 회복을 가속화시키는데 있어 현저한 작용을 갖는 것으로 생각되어 왔으나, 이의 제안자 조차도 이 약제로는 궁극적으로 회복되지 않으며 어느것도 영구적인 무력증을 변화시킬 수 없음을 지적하였다. 임상학자에게는 ACTH가 바람직한 글루코코르티코이드인데, 이는 MS의 애피도프와 안신경염 증상에서 글루코코르티코이드 치료요법의 모든 효용성을 입증한, 조절된 시도에서만 이 약물을 사용하여 시도되었기 때문이다. 그러나, 장기간의 스테로이드 사용은 권장하고 있지 않다.
아자티오프린 및 사이클로포스파미드와 같은 면역억제제가 여러가지 일련의 증상에서 재발 횟수를 감소시킨다고 주장되어 왔으나, 이 약물의 효능에 대한 공감대가 형성되지 못하고 있다.
MS 치료에 대한 현재의 추천되는 방법은 증상악화를 막는 시도 정도이다. 환자에게는 과로를 피하고 고온을 삼가하며 균형식을 취할 것을 권장하고 있다(상기의 토론사항은 Harrison의 Principles of Internal Medicine, 12th ed. 1991의 356장에서 발췌한 것이다).
상기 토론사항은 MS에 대한 임상적으로 유효한 치료의 필연적 요구를 지적하고 있다.
본 실시예는 일차적으로 MS 환자를 임상적으로 호전시키는 치료법을 입증하는 것을 제공한다. 주어진 임상 데이터는 생체내에서 TCR 펩타이드로 치료한 2명의 환자로부터 얻어낸 것이다. 이에 따른 결과는, 동시수반되는 면역 시스템 반응을 억제시키지 않고, 미엘린 기본 단백질(BP)에 대한 자가면역 반응을 억제할 수있는 Vβ5.2 및 Vβ6.1 펩타이드의 능력을 입증해주고 있다. 무엇보다 중요하게, 이 데이터는 TCR 펩타이드를 사용한 MS 환자의 임상적 치료효과를 나타낸다.
방법
BP-특이적 T 세포에 의해 사용되는 TCR V 유전자의 동정
MS 환자와 대조군으로부터의 혈액 T세포를 사람 BP에 대한 반응으로 선별한다. 반응한 T 세포주를 클로닝시키고 각 BP-반응성 클론을 TCR Vα 및 Vβ 유전자의 발현에 대해 분석한다. 조사된 MS 환자에 있어서, 본 발명자들은 TCR Vβ5.2 및 Vβ6.1의 우선적 이용을 발견했으며, 한편 한 대조군 공여자에서는 13개 클론중 11개가 Vβ14를 이용하였다.
이 데이타로부터, 본 발명자는 각각의 환자가 BP에 반응하여 우선적으로 제한된수(1 또는 2)의 Vβ 유전자를 이용하리라는 것을 예측하였다.
항원성 펩타이드의 선별
이 실시예에서 사용된 펩타이드의 선별은 상술한 방법 및 알고리즘에 따라 수행한다. 특히, 관련 TCR 서열의 영역은, 합성을 위해, 이들의 예측되는 항원성 또는 면역원성 특성 및/또는 CDR2 영역에서 이들의 출현에 근거하여 동정한다. T 세포에 대해 면역원성이거나 항원성인 것으로 여겨지는 단백질 또는 펩타이드의 영역은 본원에 기술한 방법 및 알고리즘을 사용하여 동정한다.
상기의 방법은 사람에 있어서 다발성 경화증의 치료에 유용한 펩타이드 서열을 선별하기 위해 사용한다. 이 실시예에서 사용하기 위해 선별된 펩타이드의 크기는 최소의 에피토프 구조를 유지하면서, 주로 면역원성에 대한 필요성에 의해 결정되며, 이에 따라, 이 펩타이드에 대해 특이적인 T 세포 또는 항체는 온전한 T 세포상에 존재하는 TCR을 인지하고 이와 반응할 것이다. 따라서, 치료에 사용될 마커 TCR V 유전자 서열의 항원성 영역을 동정하는 것이 중요하다. 이 연구를 위해 사람 TCR Vβ 유전자로부터의 다수의 펩타이드 서열이 고려되었다(TCR Vβ5.2 펩타이드: Vβ-26-43, Vβ5.2-39-59, Vβ5.2-59-78. TCR Vβ6.1 펩타이드; Vβ6.1- 1-22, Vβ6.1-39-59, Vβ6.1-70-88). 선별된 펩타이드는 Vβ5.2(39-59) 및 Vβ6.1-(39-59)이며, 이는 MS 환자로부터의 T세포에 의한 이들의 증가된 인식에 근거한 것이다.
MS 환자 치료에 사용하기 위한 펩타이드를 선별하기 위한 상기 방법의 사용은 본원에 기술한 바와 같은 본 방법의 성공적인 면을 예시한다. 예를 들어, 펩타이드 Vβ5.2(39-59) 및 Vβ6.1(39-59)는 상기 알고리즘에 의해 T 세포에 대해 면역원성인 것으로 예측된다. 사실, 후술하는 바와 같이, 이들 펩타이드는 T세포 면역성을 나타내며 BP에 대한 자가면역 반응으로부터 MS 환자를 보호하는 것으로 나타났다.
TCR 펩타이드를 사용한 치료
선별된 펩타이드의 항원성은 환자의 T 세포로부터의 검출가능한 반응 빈도가 있느냐의 여부를 측정하여 검정한다. 특히, 다양한 펩타이드에 대해 반응하는 T세포의 빈도 차이를 검정한다. 그후 가장 강한 반응 빈도를 유발하는 펩타이드를 사용한다.
각각의 환자를, 4주동안 1주에 1회씩, 염수중의 TCR 펩타이드 100μg을 피내주사로 처리한다. 환자는, 시험관내 혈액 T세포 빈도분석 및 DTH 반응 측정을 통해, 펩타이드에 대한 증가된 반응의 증거에 대해 매주 평가한다. 펩타이드에 대한 반응은 필요에 따라 주기적 펩타이드 부스터 주사로 유지시킨다. 추가로, 환자를 임상적으로 보행지수 및 쿠르츠케 스코어에 대해 매 3개월마다 평가한다.
측정 파라메타
림프구 증식을 통해, TCR 펩타이드 Vβ5.2 및 Vβ6.1 기본 단백질(BP) 및 HSV[헤르페스 심플렉스 바이러스-리콜 항원(recall antigen)으로 사용]에 대한 T 세포 반응을 평가한다. 환자 J.M.을 Vβ6.1로 처리하고, Vβ6.1 뿐만 아니라 Vβ5.2에 대한 반응에 따른 T세포 빈도는 치료요법으로 나타내지 않았다. 환자 M.R.은 Vβ5.2로 처리하였고 Vβ5.2 및 Vβ6.1에 대한 반응에 대해 시험하였다.
두 환자 모두 BP에 대한 이들의 반응에 대해 평가하였는데, MS 환자의 경우에 이는 정상인, 신경학적 또는 자가면역 대조군에 비해 BP 또는 PLP 반응성 T세포의 빈도가 높다는 증거 때문이다[참조: Allegretta et al., Science 247:718 (1990); Link et al., Neurology 40:283(1990); and Ota et al., Nature 346:183(1990)]. 본 실시예에서 사용된 바와 같은, 본 발명의 TCR 펩타이드에 의해 제안된 선택적 면역조절 전략은, 미엘린 기본 단백질이 MS에서의 하나의 관련된자가항원이라는 가설에 대한 최초의 시험을 제공한다.
TCR 치료 요법이 환자의 면역반응 모두를 억제하는지를 알아보기 위해 HSV에 대한 면역 반응을 실시한다. 발명자의 실험적 모델에 근거하여, 환자는 투여된 TCR 펩타이드에 대해 증가된 반응을 보일 것이다. TCR 펩타이드에 대한 이같은 증가된 반응은 BP에 대한 감소된 반응과 커플링되어 나타난다. 또한, HSV 또는 다른 TCR 펩타이드에 대해 감소된 반응을 나타내지 않는 환자는 치료요법에 참여시키지 않는다.
결과
수득된 데이터는 MS 환자에 있어서 TCR 치료 요법의 유용성을 분명하게 입증한다. 항원-반응성 T세포의 번도를 측정한 데이터는 다음과 같이 요약될 수 있다: 환자 J.M.은 (TCR Vβ6.1 투여) Vβ6.1에 대한 T 세포 반응(후처리 1주째에)이 4배 증가되었으며 전처리에 비해 이는 약 2배 증가(4주째에)로 줄어든다. 미엘린 기본 단백질(BP) 세포 반응은 실질적으로 4주째까지는 검출불가능했다(검정 한계 이하). Vβ5.2에 대한 반응은 변함없이 유지되고 있으나(이 환자가 Vβ5.2 펩타이드를 전혀 투여받지 않은 것으로 예측되는 바와 같다), HSV에 대한 반응은 4주에 걸쳐 증가하였다.
M.R. 환자로부터의 데이터(Vβ5.2 TCR 펩타이드를 투여)는 4주째까지 BP 반응성 T세포의 가시적 소멸을 동반하여 Vβ5.2 반응성(조절성) T 세포에서 30-배 증가를 입증한다. Vβ6.1(이 환자는 이 펩타이드를 전혀 투여 받은바 없다) 및 HSV에 대한 M.R.의 반응은 거의 동일하게 유지되었다(도 12 내지 도 14 참조).
항원-반응성 T세포의 입증된 빈도 증가외에, J.M. 환자는 또한 보행에서 현격한 개선을 나타냈으나, M.R. 환자는 기력감퇴가 보고되었다(지쳐 쓰러지기전까지 400야드를 보행할 수 있음).
TCR 펩타이드의 처리전에, J.M. 환자의 보행은 점진적으로 악화되고 있었다. 25피트를 걷는 시간에 있어서, 이 거리를 보행하는 J.M. 환자의 시간은 7초에서 12초로 그후 29초까지 변화해갔다.
TCR 펩타이드로 치료한 3개월후, J.M. 환자에 있어 보행이 개선되었음을 입증하였다. 악화가 멈추었을 뿐만 아니라, 보행시간도 29초에서 21초로 현격하게 개선되었다.
토의
이 데이터는, BP에 대한 면역 반응을 조절함으로써, MS를 치료하기 위한 방법을 제공하는 TCR 치료 요법의 탁월한 능력을 입증한다. Vβ5.2 및 Vβ6.1의 투여는 MS 환자에서 T세포 반응의 증가를 나타낸다. BP에 대한 T세포 반응의 상응하는 감소는 MS 환자에 대한 TCR 펩타이드 치료 요법의 긍정적인 치료 효과를 나타낸다. 또한, HSV에 대한 환자 반응의 감소 부재는 면역체계가 TCR 펩타이드 치료 요법으로 타협되지 않음을 입증한다.
비록 상기 실시예가 각 환자에 대해 단일 펩타이드를 활용하고 있으나, 본 발명은 환자 치료에서 '칵테일' 방법의 사용도 고려하고 있다. 칵테일 방법은 하나 이상의 V유전자 영역에 대해 반응성을 입증해주는 클론을 갖는 환자에게서 유용할 수 있으며; 따라서, 환자에게 투여된 칵테일은 SJL 마우스 실험에서 사용된 것과 같은 하나 이상의 항원성 펩타이드를 포함할 수도 있다(참조: 도 15, 실시예 X).
실시예 II
미엘린 기본 단백질의 면역우성 에피토프와 반응성인 사람 T세포 클론의 특이성
도입
미엘린 기본 단백질(MBP)은 고도로 항원적이므로, 보조제와 함께 주사할 경우, 다수의 동물중에서 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유발시킨다[참조: Alvord, E.C., Jr., In Experimental Allergic Encephalomyelitis : A useful model for multiple sclerosis, Alvord. E.C., Jr., et al. (eds), Alan R. Liss, Inc., New York, pp. 523-537(1984)].
MBP의 뇌염발생적 특성은 별도 숫자의 면역우성 에피토프 (약 10개)내에 포함되어 있다. 각각의 종류내에, 유용한 II 부류 MHC 분자와 관련된 이들 에피토프중 하나 이상이, 중추신경계(CNS)가 출처인 CD4+ T 작용기 림프구를 유도하여 혈관 주변 염증성 질환 및 신경 기능이상을 유발한다[참조: Zamvil et al., J. Immunol. 139:1075(1987); Offner, H., et al., J. Exp. Med. 170:355(1989)].
MHC 및 비-MHC 유전자 둘다를 포함하는, 유전적 배경은 MBP 에피토프가 뇌염발생적[참조: Beraud et al., J. Immunol. 136:511(1986); Zamvil et al., J. Exp.Med. 162:2107(1985)], 질환의 임상적 경과 및 심각성[참조: Fritz et al., J. Immunol. 134:2328(1985); Hinrich et al., J. Exp. Med. 166:1906(1987); Linthicum et al., J. Exp. Med. 155:31 (1982); Dietsch et al., J. Immunol. 142:1476(1989); Mokhtarian et al., Nature(London) 309:356(1984)], 탈수[참조: Mokhtarian et al., Nature(London) 309:356(1984)] 및 내성 기작[참조: Bernard, C.C., Clin. Exp. Immunol. 29:100 (1977); Welch et al., J. Immunol. 125:186(1980); Varriale et al., J. Immunol. 125:186(1989); Whitham et al., Cell. Immunol. 126:290(1990)]인 경우 영향을 미친다.
MBP-특이적 T 세포에 의해 유도된 임상적 및 조직학적 징후의 스펙트럼은 여러가지로 사람 질환의 다발성 동화증(MS) 및 급성 전염 뇌염(ADE)과 유사하다[참조: Paterson, P.Y., Adv. Immunol. 5:131(1966); Waksman et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 175:282(1984)]. 결국, MBP의 사람 T세포 인지가 상당한 관심 거리가 되어 왔다.
MS의 병인에 있어서, 사람 MBP에 대해 특이적인 것을 포함하여, T세포의 관련을 암시하는 여러갈래의 증거가 있다. 유전학적 연구는 MS 가계내[참조: Hauser et al., Neurology 39:275(1985); Beall et al., J. Cell. Biochem. 11 D; 223(1987)] 또는 일반적인 환자 사이에서[참조: Oksenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:988(1989)] T 세포 수용체 V와 C 영역 유전자간의 결합 불균형을 지적하고 있다. 그러나, MS 병인에서 MBP-반응성 T세포의 실제적 관련은 MBP-반응성 T세포의 선택적 조절 또는 제거가 질환 과정에 영향을 줄수 있을 때만 입증될 수 있다. 이 같은 선택적 조절이 이제는 EAE에서 가능하다.
본 실시예에서, 조절성 T 세포 및 악성 T 세포상의 TCR에 대해 지시된 항체를 유도하기 위해 합성 TCR 펩타이드가 사용된다. 이 방법은 EAE의 유도를 억제한다. 게다가, 앞서의 실시예에서 입증된 바와 같이, TCR 펩타이드를 임상적으로 앓고 있는 래트에게 투여하는 것은 질환 진행을 정지시키고 회복 속도를 빠르게 한다. MS 환자에서 잠재적인 뇌염발생성 T세포를 조절하기 위한 이 방법의 적용은 MBP-반응성 T 세포가, 사람 MBP의 면역우성 에피토프에 반응하여 우선적으로 제한된 숫자의 TCR V 영역 유전자를 활용하는가의 여부에 달려있다.
이를 위해, MS 환자 및 대조군으로부터의 T 세포주는 면역우성 MBP 에피토프를 인지하는 T세포 출현을 허용하는 방법으로 선별한다. 이들 세포주로부터, 109개의 MBP-특이적 T세포 클론을 분리하고, 표현형, 에피토프 특이성, MHC 제한 및 TCR V 유전자 발현에 대해 특징화한다. 이 데이터는 클론적 수준에서, MS 환자로부터의 T세포는 정상인 공여체로부터의 T세포가 비해 보다 많고 상이한 MPB 에피토프를 인지하는 것을 입증해준다. 또한, 질환-관련 HLA-DR2/DQwl 하플로타입(haplotype)을 갖는 MS 공여자에서, 시험한 8개의 T 세포 클론중 4개가 Vβ5.2 표현형을 발현하며, 이는 MBP에 대한 반응시 우선적인 TCR V 유전자의 사용을 나타낸다.
A. 재료 및 방법
사람 환자:본 연구에 평가한 MS 환자에는 오레곤 헬쓰 사이언스 유니버시티MS 클리닉(Oregon Health Science University MS clinic) 주의하에 있던 임상적으로 또는 실험실적으로-지지되어 판정된 MS 환자 11명을 포함한다. 이들은 6 내지 35년 동안 MS를 겪은 7명의 여성 및 4명의 남성(평균 연령은 46세, 연령 범위는 34 내지 67세이다)이다. 환자의 평균 외래통원 지수(AI)는 3.4±1.6(1 내지 6의 범위) 이며 평균 쿠르츠케 무능력 상태 스코어(KDSS)는 4.3±2.0(2 내지 4의 범위)이다[참조: Kurtzke, J.F., Neurology 15:654 (1965)].
정상인은 베테란스 어페어스 메디칼 센터(Veterans Affairs Medical Center) 및 오레곤 헬쓰 사이언스 유니버시티로 부터 6명의 남성 및 3명의 여성 대상자(평균 연령 36, 연령 범위는 25 내지 55세이다)가 포함된다. 정상인은 전술한 바와 같이 사람 MBP에 대한 양성적인 PBL 증식 반응을 기본으로 선택 한다[참조: Vandenbark et al., J. Neurosci. Res. 23:21 (1989)].
모든 환자는 오레곤 헬쓰 사이언스 유니버시티 이식 연구소(Oregon Health Science University Transplantation Laboratory)가 사용한 표준 혈청학적 방법에 의한 T 세포주 선별에 대해서 HLA-유형 회귀성이다. HLA II 부류 대립형질의 빈도(DR, DQ)는 DR2에 대해 불균일한 분포를 나타내며[11명의 환자중 7명, 즉 63%가 DR2 양성이고; 9명의 정상인중 3명, 즉 33%가 DR2 양성이다], 일반적으로 이들 2그룹에 대한 기대된 빈도성을 나타낸다[참조: Theofilopoulos, A.N., in Basic and Clinical Immunology, Stites et al.(eds.), Appleton and Lange Publishers, Los Altos, CA, pp. 151 내지 154 (1987)].
항원:사람(Hu-) MBP를 추출하여 급히 동결된 사람 뇌로부터 정제한다[참조: Eylar et al., Arch. Biochem. Biophys. 132:34 (1969)]. P1 (잔기 45 내지 89), P2 (잔기 1 내지 38) 및 P4(잔기 90 내지 170)를 포함하는, Hu-MBP의 펩타이드는 단백분해로써 수득하고 세파덱스, 이온교환 크로마토그래피 및 고압 액체 크로마토그래피로써 정제한다[참조: Chou, C.H.J., et al., J. Neurochem. 28:115 (1977)]. Hu-MBP 서열 13 내지 28, 39 내지 54, 55 내지 74, 72 내지 84, 87 내지 99, 90 내지 109, 110 내지 129, 130 내지 149 및 149 내지 170에 상응하는 일련의 합성 펩타이드를 메리필드 고체-상 방법(Merrifield solid-phase method)으로 합성하고 전술한 바와 같은 방법에 따라서 HPLC에 의해 정제한다[참조: Hashim et al., J. Neurosci. Res. 16:467 (1986)].
T 세포주:사람 MBP-반응성 T 세포주는 전술한 스크리닝 시험[참조: Vandenbark et al., J. Neurosci. Res. 23:21 (1989)]에서 Hu-MBP에 대해 반응하는 11명의 MS 환자 및 9명의 정상인의 혈액으로부터 선택한다. 혈액 단핵 세포(MNC)를 피콜 농도구배 원심분리(Ficoll density gradient centrifugation)로 분리하고 완전 배지(RPMI 1640; 10% 사람 AB 혈청, L-글루타민, 나트륨 피루베이트 및 항생제 함유)중 50μg/ml의 Hu-MBP를 사용하여 세포밀도가 5x105/웰인 평평한-바닥의 96-웰 플레이트내에서 5일동안 5%의 CO2대기중 37℃에서 배양한다. 자극된 세포는 활성화된 T세포를 증식시키기 위하여 IL-2가 풍부한 배지(50μ/ml의 재조합 IL-2,AMGEN Biologicals 제조원, Thousand Oaks, CA 소재)내로 이전한다. IL-2내에서의 성장이 느린경우, T 세포는 1:10(T:MNC)의 비율에서 조사된 말초혈액 MNC(4,500rad)내에 함유된 자가 단핵세포로서 나타낸 25μg/ml의 Hu-MBP를 사용하여 재-자극한다. T 세포주는 세포수가 MBP 에피토프 특이성, MHC 제한 및 표현형을 추정하기에 충분하게 될때까지 4 내지 5배 재-자극한다.
T 세포 클로닝:T 세포 클론은 Hu-MBP로써 2회 재-자극한 MBP-특이적인 T 세포주의 한정된 희석시킴으로써 수득한다. IL-2가 풍부한 배지내에서 4일 후, T 림프구는 Hu-MBP (50μg/ml), IL-2(50μ/ml) 및 조사된 MNC(1.5x106)를 함유하는 배양배지 20㎕ 당 1, 10 및 30개 세포로 희석하고, 세포 혼합물을 60-웰 타라사키 미세시험 트레이(Tarasaki microtest tray, NUNC Inc. 제조원, Naperville, IL 소재) [참조: Lamb et al., J. Immunol. 128:233 (1982)]내에 둔다. 10개 이상의 Hu-MBP 반응성 세포주를 웰당 접종할 경우 사람 MBP-특이적인 클론의 회수가 가장 효과적이며, 회수율은 20%이다. 단지 하나의 세포주를 웰당 접종할 경우, 회수율은 2%이다. Hu-MBP 반응성 T 세포는 1개의 세포/웰에서 접종함으로써 재클로닝된다. 타라사키 트레이를 37℃ 및 5%의 CO2에서 7일동안 항온처리한다. 재자극을 위해, 각각의 양성 웰로부터의 세포를 25μg/ml의 Hu-MBP 및 2x105의 조사된 MNC가 있는 완전배지 200㎕가 가해진 환저 96-웰 플레이트의 단일 웰에 이전한다. 자극한지 3일 후 50㎕/ml의 IL-2를 세포에 가하고 이 세포를 IL-2내에서 다시 4일동안 유지시킨다. 세포수가 2 내지 4x105개에 이르면, 배양물은 24웰 플레이트내에 1ml로 이전시키고, 3x106개 자기 조사된 MNC의 존재하에 Hu-MBP를 사용하여 재-자극시키고, 후에 IL-2가 풍부한 배지 2mL중에서 증식시킨다.
증식 검정:세포 반응의 특이성은 2μg/ml의 ConA, 50μg/ml의 Hu-MBP, 50μg/ml의 Hu-BMP 단편(P1, P2 및 P4), 50μg/ml의 Hu-MBP의 합성 펩타이드, 및 1/200으로 희석된 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)항원(Whittaker M.A. Bioproducts 제조원: Walkersville, MD 소재)의 존재 및 항원의 부재하에 96웰, 환저 미세적정 플레이트내 3중 배양물 0.2ml 중에서 1x105개 조사된(4,500rad) 자가 혈액 MNC와 함께 2x104개 T 세포를 배양함으로써 평가한다. 미세적정 배양물은 37℃ 및 5%의 CO2에서 3일 동안 항온처리하고, 18시간 동안 계속해서 0.5uBq3H-TdR을 사용하여 펄스한다. 세포는 유리 섬유 필터상에서 하베스트하고 혼입된3H-TdR은 β-신틸레이션 카운터를 사용하여 계수한다. 증식은 자극된 배양물의 CPM±SD(감한 기저치)로써 나타낸다. 기저치의 범위는 200 내지 2,000CPM이다. MHC 제한은 HLA-DP, -DQ 또는 -DR 부위로부터의 분자의 구조 결정인자에 대해 특이적인 항체(이 항체는 Becton Dickinson Pharmaceuticals, Mountain View, CA로부터 입수한다)의 존재하에 T세포와 Hu-MBP, Hu-MBP 단편 또는 Hu-MBP의 합성 펩타이드를 항온처리함으로써 평가한다.
표현형 T세포:T세포주 및 클론은 Leu 3a(항-CD4+ T 헬퍼) 및 Leu 2a[항-CD8+ T 세포독성/리프레서(repressor)] 모노클로날 항체(Becton, Dickinson)를 사용하여, 전술한 바와 같이[참조: Vandenbark et al., J. Neuroimmunol. 8:103 (1985)] 표현형화한다. T세포 클론은 사람 TCR Vβ5.2/5.3(5A), Vβ5.3(5B), Vβ6.7, Vβ8.1 및 Vβ12(DIVERSI-Tmaβ TcR Screening Panel 1A, T Cell Science Inc., Cambridge, MA)에 대해 특이적인 마우스 모노클로날 항체를 사용하여 TCR Vβ쇄 유전자 산물의 발현에 대해 표현형화한다. 2x105개 T 세포를 각각의 항체 5㎕와 함께 1시간 동안 4℃에서 항온처리하고, 이어서 5%의 사람 AB 혈청을 함유하는 배지를 사용하여 3회 세척하고 추가로 FITC-결합된 염소 항-마우스 IgG와 함게 30분 동안 항온처리한다. 2회 세척 및 2% 포름 알데히드내에서 고정한 후, 염색된 세포의 면역형광성에 대해 FAC 스캔 유동 혈구계산기(FACScan Flow Cytometer)를 사용하여 평가한다.
B. 결과
MS 환자 및 정상인으로부터의 Hu-MBP 특이적인 T 세포주의 특성화
Hu-MBP 특이적인 T 세포주는 Hu-MBP에 대한 증식 반응이 이미 입증된 11명의 MS 환자 및 9명의 정상인의 혈액으로부터 선택한다. 각각의 세포주를 3000 내지5000만개의 혈액 세포로부터 전체 Hu-MBP를 사용한 반복된 자극 및 IL-2를 사용한 증식에 의해 선별한다. 설치류 T 세포주를 선택하는데 있어서의 전술한 실험으로부터, 이 조건은 면역우성 Hu-MBP 에피토프에 대한 대표적인 T 세포 반응의 확장 및 포커싱을 가능케한다.
MS 환자 및 정상인 공여자로부터의 T 세포주는 HSV 항원 (도 6)에 대해 거의 반응하지 않으면서 Hu-MBP 및 Con A 모두에 대해 균일하게 잘 반응한다. T 세포주는 P1 (잔기 45 내지 89), P2 (잔기 1 내지 38) 및 P4 (잔기 90 내지 170)를 포함하는 Hu-MBP의 전체 서열에 걸쳐서 고도로 정제된 효소적 분해에 대한 반응에 대해 평가된다. 11명의 MS 세포주중 8개가 3개의 Hu-MBP 단편 모두에 대해 반응하며, 2개의 세포주가 3개의 단편중 2개에 대해 반응하고, 단지 1개의 세포주만이 단일 단편에 대해 반응한다. 반대로, 9개의 정상인 세포주중 5개가 단일 단편에 대해 반응하며, 3개의 세포주가 모든 단편에 대해 반응하고 1개의 세포주는 어떠한 단편에도 반응하지 않는다. 45 내지 89개의 단편에 대한 반응자의 비는 대조군에 대해 MS 그룹에서 현저하게 크며, 평균적으로 MS T 세포주는 Hu-MBP(도 6)의 45 내지 89(P1) 단편 및 1 내지 38(P2) 단편 모두에 더욱더 현저하게 반응성이다. 그러나 90 내지 170(P4) 단편에 대한 반응의 빈도 또는 크기에 있어서 차이는 없다. 사람 T 세포주 모두는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합된 표현형을 지닌다. 그러나 MS 환자로부터의 T 세포주는 정상 공여자와 비교시 CD4+ 아집단의 비율이 상대적으로 더 높으며 CD8+ 아집단의 비율이 더욱 낮다(CD4+ 세포에 있어서 58±8%에 대해 78±13%이고 CD8+ 세포에 있어서 30±12%에 대해 15±6%이다; 표 1 참조).
Hu-MBP 특이적인 T 세포 클론의 선별 및 특성화
Hu-MBP상에서 면역우성 T 세포 에피토프의 일반적인 영역이 Hu-MBP 펩타이드에 대한 T 세포주의 반응성 양식보다 열등할 수 있다해도, T 세포 인식의 입증은 클론의 분석에서 기원해야만 한다. 이를 완결시키기 위해, 7개의 MS T 세포주(50클론) 및 6개의 T 세포주(59개 클론)으로부터 총 109개 사람 MBP 특이적인 T 세포 클론을 Hu-MBP 및 Hu-MBP 단편 및 합성 펩타이드에 대한 반응에 대해 평가한다. T 세포주 공여자는 HLA-DR2 분포를 제외하고는 비교가능하다(정상인 33%에 대해 MS 환자 86%가 DR2 양성이다; 표 2 참조).
T 세포 클론 모두는 Hu-MBP에 대해 반응하나 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 항원에 대해 반응하지 않으며 두 그룹에 있어서 반응 수준은 유사하다. 총 48개의 T 세포 클론(2 그룹 사이에서 균일하게 분포)은 CD4 및 CD8 마커에 대해 표현형화 한다. 이들중, 45개의 클론이 CD4+이고 (1명의 정상인 공여자로 부터의) 3개의 클론이 CD8+이다(표1). CD4+ 클론의 이러한 우성은 래트 및 마우스에 있어서 선행 실험으로부터 기대되었으나, 클론이 유도된 T 세포주내 이들의 일부 집단의 상대적인 비율을 반영하지는 않는다(표1).
T 세포주 반응의 양식을 반영하는 클론적 특이성
클론 분석의 유효성을 확립하기 위해서는, T 세포 클론적 특이성이 T 세포주 반응을 어떻게 잘 나타내는가에 대해 평가함이 중요하다. 비교용의 현저한 클론을생산하는 세포주에서, MBP의 정확한 단편에 대해 특이적으로 반응하는 클론의 수는 모 T 세포주의 Hu-MBP 단편-지시된 반응과의 현저한 상관 관계를 나타낸다(짝을 이룬 Chi Square 시험, p<0.05).
3명의 MS 및 2명의 정상인 공여자로부터의 대표적인 비교는 도 7에 나타낸다. T 세포주 반응 양식을 기본으로 하여, P1 및 P2에 대해 더욱 반응성인 클론이 대조군 세포주로부터의 T 세포주보다는 MS T 세포주로부터 선택되나, P4 반응성 클론의 빈도는 상대적으로 동일하다. 실제 이 경우는 표2에 나타낸다. 기대되지 않은 바와 같이, 109개의 MBP-반응성 T 세포 클론중 46개가 Hu-MBP의 어떠한 단일 단편과도 반응하지 않으며, 심지어 Hu-MBP에 대한 반응이 격렬하다해도, 이의 범위는 기저치가 단지 1,000 내지 2,000인 10,000 내지 27,000cpm 이다. 이러한 발견은 MS 그룹보다도 정상인 그룹에서, 크게는 단일 정상인 공여자를 기준으로 하여 더욱 흔하다.
P4내 엇갈린 클론 특이성
비록 Hu-MBP의 P4 영역이 분자의 C 말단 ½을 나타낸다 해도, Hu-MBP 펩타이드에 대해 반응성인 클론의 대략 2/3(63개중 41개)이 이 단편에 대해 반응한다. 에피토프 특이성을 동정하기 위해, 4명의 정상인 및 4명의 MS 공여자로부터의 이들 클론 23개를 P4 영역의 상이한 부위에 상응하는 일련의 합성 펩타이드에 대한 증식 검정을 시험한다. 표3에 나타낸 바와 같이, 클론 분포는 정상 공여자의 경우 110 내지 129 서열을 향하여 엇갈려 있으며, MS 공여자의 경우 130 내지 149 서열을 향하여 엇갈려있다. 149 내지 171에 대한 반응은 두 그룹 모두 유사하며 단지 하나의 MS 클론만이 87 내지 99 서열에 대해 반응한다(표3).
다수의 Hu-MBP 에피토프를 제한할 수 있는 HLA-DR2
HLA-DR2/DQwl 하플로타입과 MS의 연합은 II 부류 분자, 특히 DR2가 CNS 자가항원에 대한 CD4+ T 세포 반응을 제한하는데 중요한 역활을 할 수 있음을 제안한다. 이를 완료시키기 위해, 3명의 HLA-DR2/DQwl 공여자로부터의 17개 T 세포 클론으로써 인지된 Hu-MBP를 표4에 요악한다. 총, T 세포주 클론이 P2(3개의 클론), P1(1개의 클론), P4(8개의 클론)을 인지하거나 또는 펩타이드(5개의 클론)을 인지하지 못한다. P4내에서, 1개의 MS 클론은 87 내지 99번 에피토프를 인지하며, 1개의 정상 클론은 110 내지 129번 에피토프를 인지하고, 1개의 MS 클론은 130 내지 149번 에피토프를 인지하며, 4개의 클론(3개의 MS 및 1개의 정상 클론)은 149 내지 171번 클론을 인지한다. 시험한 7개의 P4-반응성 클론중 7개에서의 반응은 항-HLA-DR 항체에 의해 억제되며, 이것은 DR2가 제한 성분임을 내포한다(표4). DR 위치는 MBP에 대한 사람 T 세포 반응을 제한하는데 우세하게 사용되므로, 10개의 시험되지 않은 클론의 대부분이 또한 제한된 DR2이다. 어떤 경우이든 DR2가 사람에 있어 광범위한 Hu-MBP 에피토프를 제한할 수 있다는 것은 분명하다.
Hu-MBP 반응성 T 세포 클론에 의한 TCR Vβ 유전자 이용
래트 및 마우스로부터 뇌염발생의 MBP-특이적인 T 세포에 의한 TCR Vα 및 Vβ 유전자군의 바람직한 사용은 성공적인 백신처리 및 악성 T 세포상에서 일반적인 TCR 서열에 대해 지시된 치료 요법을 제공한다. 그러나, 사람에게서 유사한 메카니즘이 MBP 또는 다른 항원에 대한 반응시 TCR V 유전자의 제한된 사용을 가져오는지의 여부는 알려져 있지 않다. TCR V 유전자의 용도를 분석하기 위해서는, 38개의 T 세포 클론(각각의 그룹으로부터 19개)을 Vβ 5.2,Vβ 5.3, Vβ 6.7, Vβ 8.1 및 Vβ 12에 대해 특이적인 5개의 모노클로날 항체의 패널(표 5)을 사용하여, Vβ 유전자 산물의 발현에 대해 표현형화한다. TCR V 유전자 발현은 MS 공여자 모두로부터, 6개의 클론으로서 포지티브적으로 동정된다. 이들 클론중 2개는 Vβ 6.7을 발현하는 반면, 기타 4개의 클론은 Vβ 5.2를 발현한다. Vβ5.2 + 클론중, 1개는 DR 2,4 공여자로 부터 기원하며, 3개는 DR2 이소타입 접합체 공여자로부터 기원한다. DR2 이소타입 접합체 공여자로부터 기원한 1개의 추가 클론은 Vβ 5.2에 대해서 재배열된 mRNA를 발현하며, 이것은 개개인에 있어, 비록 각각 정확한 에피토프 특이성이 있다 해도, Hu-MBP에 대한 반응시 분석된 4/8 클론이 동일한 TCR Vβ 유전자를 사용함을 나타낸다(표5).
C. 토론
본 실시예는 클론 수준에서 MS 환자가 정상인의 Hu-MBP 반응자보다도 면역우성 Hu-MBP 에피토프의 T 세포 인지의 더욱 복잡하고 변경된 양식을 지님을 입증한다. 이 자료는 MS 환자에 있어 Hu-MBP의 면역원성 형에 대한 노출의 증가로 인하여 뇌염 발생의 T 세포를 유도하거나 영구화하는 경향성이 증가된다. MS와 같은사람의 마비성 상태에서 Hu-MBP의 T 세포 인지의 강력한 연관성은 동물에 있어서 MBP-반응성 T 세포의 강력한 뇌염발생 기능면, 및 혈액내 활성화된 MBP-반응성 T 세포의 출현율의 증가 및 MS 환자의 CSF 출현율 증가로써 입증되어야 한다[참조: Allegretta et al., Science 247: 718 (1990); Link et al., Neurology 40 (Suppl. 1 : 283 (1990)].
본 연구에서 평가한 T 세포 클론은 면역우성 Hu-MBP 에피토프에서 지시된 특이성의 출현을 허용하도록 시험관내에서 Hu-MBP 특이적인 T 세포주로부터 분리한다. 뇌염발생의 결정 인자는 전체의 MBP를 지닌 래트 및 마우스 T 세포주의 선별동안 면역우성을 나타내며[참조: Bourdette et al., Cell. Immunol. 112 : 351 (1988); Vandenbark et al., J. Immunol. 135 : 229 (1985)], 이것은 면역우성 Hu-MBP 결정인자에 대한 T 세포가 또한 허용되는 조건하에서 뇌염 발생성일 수 있다. 본 연구에서, T 세포주 반응으로부터 추론된 면역우성 에피토프는 클론 분석을 통해 동정된 특이성과 현저한 상관관계를 나타낸다(도 7).
이 결과는 특이성에 관한 세포주 자료로부터 유도된 결론, 및 선별 공정에서 생존한 클론이 세포주내에서 Hu-MBP 반응성 T 세포 집단을 대표한다는 사실을 확증한다.
그러나, 클론의 표현형은 T 세포주 모두가 실제적인 수준의 CD8+ T 세포를 함유한다 해도, 불균일한 CD4+ (단일의 정상 공여자로부터의 3개의 클론은 제외)이다. 세포주내 CD8+ T 세포가 Hu-MBP 특이적인지, 또는 이들이 배양물에 가해진 상대적으로 높은 농도의 IL-2에 의해서 세포주내에서 단순히 존재하는지는 분명치 않다. 그러나, 정상의 T 세포주가 MS 세포주보다 더욱 높은 %의 CD8+ 세포를 일정하게 함유하는 것은 분명하다. CD8+ 클론중 하나는 동일한 정상의 공여자로부터의 CD4+ 클론의 MBP-유도된 증식을 억제할 수 있다. 생체내에서 증가된 수로 존재할 경우, 이와 같은 조직 CD8+ T 세포는 Hu-MBP 반응성 T 세포를 지닌 정상인에서 임상적인 질환의 없다고 판단할 수 있다. 마우스에서 관측된 것과 유사한 고유의 억제 세포[참조: Whitham et al., Cell. Immunol. 126:290 (1990)]과 연합된 이들 CD8+ T 세포의 임계적인 농도로 60% 이상의 정상 공여자로부터 Hu-MBP 특이적인 T 세포주를 선별하기 위한 불가능성을 계산할 수 있다[참조; Vandenbark et al., J. Neurosci. Res. 23:21 (1989)].
대조적으로, T 세포주는 80% 이상의 MS 환자로부터 선별할 수 있다. 이들 조절 세포 유형은 기타 문헌[참조: Hafler et al., J. Immunol. 139 : 68 (1987); Richert et al., J. Neuroimmunol. 23 : 55 (1989); Richert et al., Ann. Neurol. 26 : 342 (1989)]에 보고된 바와 같이, 이전의 세포주 선별 없이도 혈액으로부터 직접 제한 희석함으로써 MBP-특이적인 T 세포 클론을 회수 효율에 영향을 미칠것으로 기대되지는 않는다.
MS 환자에게서 Hu-MBP에 대한 T 세포 반응은 정상인에서의 반응보다 특이성의 범위가 광범위하다(도 6). 일반적인 에피토프외에, MS 환자로부터의 T 세포는 MBP의 N 말단 ½에 대한 엇갈린 반응 및 분자의 C 말단 ½중에서 하나 이상의 에피토프에 대한 엇갈린 반응을 나타낸다. MS 및 정상 공여자 사이에서의 반응의 가장 주된 차이점은 P1 (잔기 45 내지 89)이다. 선행 연구는 MS에서, Hu-MBP-유형 물질의 면역 반응성 단편이 우세한 항원성 형태의 전장 잔기 45 내지 85와 함께, 뇌척수액(CSF)중에 존재함을 나타내고 있다[참조; Whitaker, J.N., J. Immunol. 129: 2729 (1982)]. CSF내에서 이러한 단편의 측정가능한 농도는 중추신경 시스템 손상 후 증가하며, 이는 MS 환자에게서 P1-반응성 T 세포의 증가된 출현에 대한 가능한 해석을 제공한다. P2 및 P4내 130 내지 149 에피토프에 대한 MS 반응성의 엇갈림은, 비록 MHC 제한 효과가 아직 조절되지 않는다해도, 탈수동안 Hu-MBP의 면역 반응성 단편의 방출로써 해석될 수 있다. 동물 연구로부터, MBP를 사용한 장기간의 면역화는 MHC 및 MBP 에피토프의 더욱 적은 우성 배합으로 T 세포의 확장된 보고를 가져온다[참조; Offner et al., J. Exp. Med. 170 : 355 (1989)]. 이들 추가의 T 세포 특이성은 동종의 MBP를 인지하는 이의 능력에 따라서 뇌염발생적이거나 뇌염발생적이지 않을 수 있다. MS 환자에 있어서 Hu-MBP 반응성 T 세포 특이성의 증가된 복잡성은 탈수동안 방출된 MBP의 면역원성 단편에 대해 증가된 노출과 일치하며, MS의 장기간의 만성적인 특성이 뇌염발생의 T 세포 특이성의 지속적인 유도 또는 재-자극을 포함하는 것으로 고려된다.
대략 40%의 Hu-MBP 반응성 T 세포 클론, 특히 정상 T 세포주로부터의 클론은 어떠한 Hu-MBP 단편에 대해서도 반응하지 않는다. 이러한 반응은 Hu-MBP의 분해 부위까지의 연결 에피토프(예: 잔기 30 내지 55 또는 80 내지 100), 분해에 의해 파괴된 구성적 에피토프, 또는 분해 단편의 정제동안 상실된 Hu-MBP의 이소타입 또는 후-해독 변이체를 포함할 수 있다. 비록 사람에 있어 이들 세포의 작용이 명백치 않다해도, 유사한 세포가 EAE-회복된 루이스 래트(Lewis rat)에서 매우흔하게(50%) 일어난다. 이와 같은 T 세포는 MBP에 대해 지연된 과감작성 반응을 이전시키나, EAE 또는 EAE에 대한 보호를 이전시키지는 않는다.
비록 어떠한 특이적인 에피토프 및 주어진 DR 대립형질 사이에서 강력한 연합이 발견되지 않는다해도, MS 및 정상 T 세포 클론에 있어서의 반응은 HLA-DR에 의해 주로 제한된다. MS 환자에게서 과도히 나타나는 HLA-DR2는 Hu-MBP의 다수 에피토프를 제한할 수 있으며, 일부 에피토프(예: 149 내지 171)는 몇몇의 HLA-DR 대립형질에 의해 제한될 수 있다. 선행의 T 세포주 연구 [참조: Chou et al., J. Neurosci. Res. 23 : 207 (1989)]에서, HLA-DR 대립 형질은 26/33 Hu-MBP 에피토프-특이적인 T 세포 반응을 제한하는 반면, HLA-DQ는 환자에 있어서 단지 6/33 반응만을 제한하고 HLA-DP는 P2에 대한 단일의 정상 공여자 반응을 제한한 것으로 보고되었다.
T 세포 클론으로부터의 이 보고는 Hu-MBP 인지에 있어서 HLA-DR 분자의 압도하는 제한 기능외에, 3명 개개의 클론에 의해 인지된 Hu-MBP 1 내지 38 영역내 에피토프를 제한하는 정의되지 않는 HLA-DP 대립형질(상이한 정상 공여자로부터 기원, DR7/DQw 2,3)의 능력을 확증하고 있다. 그러나 HLA-DQ 제한된 클론은 발견되지 않았다.
사람에게서 T 세포 반응을 조절하기 위한 TCR Vβ 펩타이드의 사용에 관한 주요 의문점은 MBP-특이적인 T 세포가 한정된 세트의 V 유전자를 이용하는지의 여부이다. TCR Vβ 레파토리의 10개중 약 1개에 대해서만 특이적인 항체를 사용하는 본 자료는 모든 MS 공여자로부터 38개 클론중 6개를 포지티브적으로 동정한다. 만성 진행성인 MS를 지닌 HLA-DR2/DQwl 동종 접합 공여자중 한명에서는, 상이한 Hu-MBP 에피토프에 대해 특이적인 T 세포 클론 8개중 4개가 T 세포 수용체중에서 동일한 Vβ 5.2 유전자를 발현하며(모든 표현형적으로 Vβ 5.2 포지티브 클론은 PCR로써 입증된다), 이는 Hu-MBP에 대한 반응시 사람에 의해 TCR V 유전자 사용의 대립성을 우선 제시한다. 상이한 Hu-MBP 에피토프에 대한 반응시 동일한 TCR V 영역 유전자의 사용은 래트 및 마우스에서의 MBP 반응과 유사하며, 이것은 TCR의 선택으로 에피토프가 유도되지 않음을 제시하고 있다.
본 관측의 한가지 중요한 실제적 암시는 TCR 레파토리에 있어서 대립성이 MBP-반응성 클론의 에피토프 특이성을 정의하지 않고도 추정할 수 있다는 것이다. 표6은 사람 MS 환자로부터의 MBP-특이적인 T 세포 클론이 이들의 TCR Vβ 유전자 사용에 있어 왜곡되어 있음을 입증하는 TCR 자료를 나타낸다. 총 mRNA는 MS 환자 및 정상 공여자로부터 사람 MBP에 대해 특이적인 개개의 T 세포 클론으로부터 추출하고, 재배열된 TCR Vβ 신호는 PCR로 증폭시켜 특이적인 프로브로써 동정한다. MS 공여자 MS-1 및 MS-2내에서 Vβ 5.2의 바람직한 사용 및 MBP-특이적인 T 세포 클론에 의한 정상 공여자 N-1에서 Vβ 14의 바람직한 사용을 입증한다. 이것은 또한 사람이 MBP와 같은 자가항원에 대한 V 영역 유전자와 함께 우선 반응한다는 결론을 지지한다.
실시예 III
다발성 경화증 환자로부터의 미엘린 기본 단백질 반응성 T 세포 클론중 바람직한세포수용체 Vβ 유전자 이용
도입
다발성 경화증(MS)는 미엘린 기본 단백질(BP)에 대해 반응성인 T 림프구가 중추역활을 하는 자가면역 질환이다. 따라서, 본 발명의 용도는 MS 환자 및 정상인의 혈액으로부터 BP에 대해 특이적인 T 세포를 클로닝한 후, T 세포 수용체(TCR) 가변성(V) 영역 유전자를 분석 및 발현시킴으로써 입증한다. Vβ 5.2 및 더욱 적은 농도의 Vβ 6.1의 사용에 대한 현저한 엇갈림은 환자로부터의 BP-특이적인 클론사이에서 관측되나 대조군에서는 그렇지 않다. 공유한 Vβ 5.2 및 Vβ 6.1은 혈액으로부터 기원한 BP-특이적인 클론이 질환 발생과 연관될 수 있음을 나타낸다. 이러한 발견은 MS 치료에 있어 중요한 연관이 있다. 이 실시예는 MS 환자 및 정상인의 혈액으로부터 선택된 BP-특이적인 T 세포내에서 발현된 TCR Vα 및 Vβ 유전자를 분석한다.
BP 및 기타 항원에 대해 특이적인 T 세포 클론은 MS 환자 및 정상인의 말초혈액 단핵세포(PBMC)로부터 기원하며 상이한 BP 영역에 대한 반응 측면으로써 특징화된다. 이 클론에서 TCR Vβ 및 Vα 유전자 발현은 PCR 증폭을 사용하여 측정한다[참조: Oksenberg et al., Nature 345 : 344-346(1990); Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86; 8941-8945 (1989)]. 검측된 Vβ 및 Vα 발현의 대표적인 예는 도 10a 및 도 10b에서 각각 나타낸다. 비록 도 10a에서 Vβ 5.2로서 언급했다해도, 이들 V 영역에 대해 일반적인 서열이 프라이머로서 사용되기 때문에 Vβ 5.2 및 Vβ 5.3 유전자 산물은 구별될 수 없다(표 5 참조). 또한, 도 10에 분석된 클론은 면역형광 분석에 의한 세포 표면 TCR Vβ5.2/5.3 항원이 발현된 것을 나타낸다(표 5).
3명의 MS 환자로부터 기원한 클론의 상세한 분석을 표7에 나타낸다. 환자 NL로부터의 BP-특이적인 클론은 Vβ 5.2의 매우 바람직한 용도를 나타낸다. 놀랍게도 상이한 BP 결정인자에 대한 특이성은 이 엇갈린 TCR Vβ 유전자 용도에 의존적인 것으로 여겨진다. 예를 들면, 펩타이드 45 내지 89 및 1 내지 38에 대해 특이적인 클론, 및 어떠한 이들 펩타이드에 의해서도 자극받지 않는 BP-특이적인 클론은 Vβ 5.2 유전자를 바람직하게 재배열 시킨다. 비록 Vα 용도가 단지 4개의 NL 클론에 대해서 측정된다 해도, 이 자료는 Vα가 BP 펩타이드 특이성에 대해 주요 공헌자임을 제시한다. 즉, Vα8 유전자 발현은 BP 펩타이드 45 내지 89에 대해 특이적인 3개의 클론내에서 동정되는 반면, Vα2는 펩타이드 1 내지 38에 대해 특이적인 하나의 클론내에서 재배열된다. 그러나, 이러한 제한 분석을 사용하여서는 α 내지 β쇄 연결 영역(Jα, Dβ, Jβ)로부터의 주요 공헌을 유출할 수 있다. Vβ 5.2의 일반적인 용도에도 불구하고, 많은 NL 클론은 클론적으로 관련이 없으며, 펩타이드 특이성, Vα 발현, 및 최소한의 Vβ 유전자 발현을 기준으로 하여 분리되는 것으로 여겨진다. 펩타이드 특이성이 분명치 않은 7개의 Vβ 5.2+ 클론의 특정 세트의 클론적 상관성은 현재 공지되어 있지 않다. Vα 발현을 결정하고/하거나 연결 영역을 서열분석함은 이러한 문제에 해답을 제공하는 가장 간단한 방법일 수 있다. MR 환자로부터 기원한 10개의 BP-특이적인 클론중 4개가 또한 Vβ 5.2를 이용한다. NL 환자에서와 같이, 3개의 BP 특이성을 지닌 클론도 특수한 Vβ 유전자를 사용한다. WS로부터의 6개 클론중 3개가 또한 Vβ 5.2 유전자를 발현하며, 이의 2개는 동일한 Vα를 이용하고 동일한 특이성을 지닌다. BP 특이성인 Vβ 5.2 + 클론의 흔한 분리와는 대조적으로, 비특이적인 기타의 항원 또는 클론에 대한 반응성인 클론 모두는 Vβ5.2를 이용하지 않는다(표7).
증폭된 PCR 산물에 의한 샘플의 오염을 방지하며 발견에 대한 공헌자로서 이를 배제하기 위해 큰 주의가 강조되어져야 한다. 즉, 모든 경우에 있어서 대조군은 Vβ 5.2 및 Vβ 6.1-특이적인 올리고머와 네가티브적으로 반응하나 RNA 주형과는 반응하지 않는다. 가능하다면, 새로이 제조한 RNA를 사용하여 초기에 포지티브인 Vβ 5.2+ 클론을 확인한다. 더우기, 특이성이 상이하고 다른 환자 및 정상인으로부터의 클론을 동일 시간에 연구하고 MS 환자로부터의 BP-특이적인 클론중에서 우세한 Vβ 5.2 사용만을 검출한다(표 7 및 표 8 참조). 최종적으로, 환자 MR로부터의 클론을 모노클로날 항- Vβ 5.2 항체 및 면역형광성 분석을 사용하여 결정하는 Vβ 5.2의 표면 발현, 및 PCR에 의한 유전자 발현 및 모노클로날 항체에 의한 세포 표면 발현 사이에서의 완전한 일치성을 관측한다.
Vβ 5.2 및 보다 적은 양의 Vβ 6.1의 우세한 사용은 7명의 환자로부터의 BP-특이적인 클론에서는 분명하나 6명의 정상 공여자로부터는 분명치 않다(표 8). MS 환자로부터의 BP 특이적인 클론 48개는 Vβ 발현용 PCR로써 분석하며 27개는 Vβ 5.2를 이용하고 15개의 비-BP-특이적인 클론중 0개가 Vβ 5.2+ (피셔의 정밀시험에 의해서 p<0.001)이다. 대조적으로 정상인으로부터 41개의 BP-특이적인 클론중 2개만이 Vβ 5.2+ [Chi-square 분석에 의해서 p<0.0001]이다. 이들 비교의 통계적인 중대성은 환자 NL로부터의 클론이 배제될 경우에도 입증되며, 환자에서 Vβ 5.2+ BP-특이적인 클론의 출현성은 34중 14인 것으로 고려된다(정상인에 대한 BP-특이적인 클론을 사용한 비교 또는 비-BP-특이적인 클론과의 비교시 p<0.001). 환자 및 대조군으로부터의 클론 비교와 관련하여, 연구한 7명의 환자중 6명 및 6명의 대조군중 2명만이 HLA-DR2로 이행되었으며 이것은 2개의 집단중 DR2의 공지된 출현성으로부터 예상된다. 아직도 DR2+ 대조군으로부터 10개의 BP-특이적인 클론중 하나만이 Vβ 5.2+이다(MS 환자중 출현성과 비교시 p<0.01). 환자에게서 54% 출현성은 예상된 말초 혈액 농도(2.5 내지 5.0%) 보다 훨씬 높다[참조: Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 8941-8945 (1989); Kappler et al., Science 244: 811-813 (1989)]. 비록 대조군으로부터의 것과 비교되거나 비-BP 특이적인 클론과 비교된 환자로부터의 Vβ 6.1 + BP-특이적인 클론의 과도한 출현성이 통계적으로 상이하지 않다해도, 출현성(20%)는 우연성 보다는 훨씬 크다[PCR에 의해 예견되는 말초 혈액 %는 5 내지 10%이다[참조: Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 8941 (1989)]. 더우기, Vβ 5.2를 발현하지 않는 클론만을 고려하더라도 대조군과 비교한 환자로 부터의 BP-특이적인 클론에 있어서 Vβ 6.1 발현의 출현성은 통계적으로 상이하다(p<0.02).
Vβ 5.2+ 클론의 부재에도 불구하고, 우세한 Vβ 사용이 정상인으로부터 기원한 BP-특이적인 클론에 대해 주목된다(표 8). 한명의 개인에 있어, 13개의 클론중 11개가 Vβ 14를 발현시키며, 다른 Vβ7중 2개가 우성이다. 혈청학적으로 측정한 DR 발현과의 상관관계는 식별 불가능하다.
도 11는 환자 및 대조군으로부터의 BP-특이적인 클론에 있어서 Vα 용도를 요약한 것이다. Vβ 용도와는 대조적으로, 환자로부터의 BP-특이적인 클론은 더욱 더 일반화된 Vα 용도를 나타낸다. Vα 1, 2, 7, 8 및 10군은 분석한 30개 클론중에서 잘-표현된다. Vβ상에서 초기 강조로 인해, 환자 NL로부터의 4개의 클론만이 Vα 발현에 대해 분석됨에 주목한다. 더욱 많은 클론의 분석은 더욱 현저한 Vα 오용을 드러낼 수 있다. 놀랍게도, 우세한 Vα 사용은 대조군중 BP-특이적인 클론내에서 더욱더 분명하다. 분석된 22개 클론중, 12개가 Vα2를 발현하며 8개가 Vα15를 발현한다.
본 보고에서는, 말초 혈액 세포를 초기에 제한 희석에 의한 클로닝 전에, 사람 BP와 접촉시키는 자극으로써 대량 배양에 의해 증식시킨다. 우례르프페닝 연구[Wucherpfenning study; Wucherpfenning et al., Science 248 : 1016-1019 (1990)]에서 반응을 지배하는 BP 펩타이드 84 내지 102에 대한 반응은, 본 연구에서 주목할 만큼 드물다. 더우기, 현 실시예에서 우세한 Vβ 5.2 발현은 BP-에피토프 특이성에 의존성인 것으로 여겨진다. 흥미있게도, 이것은 마우스 및 래트에서 발견된 우세한 Vβ 5.2 발현과 유사하다[참조: Heber-Katz et al., Immunol. Today 10 : 164-169 (1989)].
오크센버크(Oksenberg)등 [참조: Nature 345 : 344 (1990) 및 제출 원고]은 PCR을 사용하여 MS 환자로부터의 뇌 샘플중 TCR Vα 및 Vβ 유전자의 직접적인 발현을 분석하였다. Vα 및 Vβ 전사체 모두의 제한된 이질성을 관측한다. 흥미롭게도, DR2 (DW2) 분자 표현형이 상이한 8명을 포함하는 HLA-DR2 환자의 9명중 8명에서 재배열된 Vβ 5.2 유전자가 입증되었고 7명에서 뇌 질환부위에 재배열된 Vβ 6.1이 입증 되었다. 본 실시예에서 환자의 말초혈액으로부터 기원한 BP- 특이적인 클론에 있어 우세한 Vβ 5.2 및 Vβ 6.1 이용의 발견과의 상관성은 현저하다. 이와 함께 본 연구는 말초혈액 T 세포가 중추신경 시스템 손상에 포함된 세포의 반영이며, BP-반응성이 MS에서 병원성 반응의 성분임을 제안하는 추가의 확증을 제공한다.
요약하면, 나타낸 자료는 MS 환자의 혈액으로부터 기원한 BP-특이적인 클론중에서 우세한 Vβ 유전자 이용을 입증한다. 이 클론이 병원성적으로 중요할 수 있다는 암시는 제한된 TCR 레파토리가 치료학적 중재시 특이적인 타겟을 제공함을제안한다. 사용된 V 영역에 대해 특이적인 모노클로날 항체 및 합성 TCR 펩타이드 모두를 본 시도에서 고려할 수 있다.
표 7 : 클론은 PCR 및 도 10에 기술한 바와 같이 자동방사선 사진술에 의해서 Vβ 및 Vα 발현에 대해 분석한다. 사람 BP-반응성 T 세포주는 문헌[참조: Chou et al., J. Neurosci. Res., in press (1991)]에 기술한 바와 같이 MS 환자의 혈액으로부터 선택한다. 명확하게는, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 IL-2가 풍부한 배지내로 이동시키기 전에 50μg/ml의 사람 BP와 함께 5일 동안 배양한다. IL-2내에서 성장이 관측되면, T 세포를 조사된 자가 PBMC에 의해 표현된 25μg/ml의 Hu-BP와 함께 1회 재자극시키고, 문헌[참조: Chou et al., J. Neurosci. Res., in press (1991)]에 기술된 바와 같이 2회의 제한 희석에 의해 클로닝시킨다. MS-환자로부터의 클론 16개 모두 및 정상인으로 부터의 클론 15개 모두를 면역형광성 발현된 CD4에 의해 분석한다. 특히 낮은 수(25 내지 30회)의 PCR 주기를 사용하는 경우, 일반적으로 하나의 밴드가 강도면에서 우세하다 해도, 일부 클론에 대해서, 하나 이상의 Vβ 또는 Vα 밴드를 동정할 수 있다. BP, BP 펩타이드 또는 기타 항원에 대한 T 세포 클론의 특이성은 문헌[참조; Chou et al., J. Neurosci. Res., in press (1991)]에 기술된 바와 같이 증식으로써 추정한다. 비특이적인 것으로 표지된 클론은 BP 존재하에서 생성되나 기저치 (자극 세포 단독) 이상의 BP에 대한 증식 반응을 입증하지는 못했다. 모든 BP-반응성 클론은 문헌[참조: Chou et al., J. Neurochem. 28 : 115-119 (1977)]에 기술된 바와 같이 셀렌 초우 (Selene Chou)에 의해 제조된 BP 펩타이드 1 내지 38, 45 내지 89, 및 90 내지 170에 대한 반응을 시험한다. NR은 특수 클론이 이들 BP에 대해서 반응하나 BP 펩타이드의 어느것에 대해서도 반응하지 않음을 나타낸다. *NT - 시험되지 않음.
표 8 : TCR Vα 및 Vβ 발현은 7명의 MS 환자 및 6명의 정상인의 혈액으로부터 선택된 T 세포 클론에 대해 분석한다. 환자는 오레곤 헬쓰 사이언스 유니버시티 MS 클리닉에서 지원하며 임상적 및 실험실적으로 지지되어 판정된 MS 환자이다. 환자의 평균 보행 지표는 3.2±2.0(2.6 범위)이다. 4명의 질환이 재발/완화된 상태이고 3명의 환자는 만성 진행성 질환 상태이다. 정상인은 베테란스 어페어스 메디칼 센터(Veterans Affairs Medical Center)로부터 배양물중 사람 BP에 대한 PBMC의 포지티브 증식 반응을 기본으로 하여 선별한다. 모든 환자는 오레곤 헬쓰 사이언스 유니버시티 트랜스플랜테이션 레보러토리에서 표준 혈청학적 방법에 의해서 HLA-유형임이 판명되었다. HLA DR2 발현의 불균일한 분포(7명의 환자중 6명 대 6명의 대조군중 2명)는 정상집단에 대한 MS 환자에서 기대된 빈도를 반영한다.
이 분석에서는 각 클론에 대해 우세한 Vβ 밴드만이 포함된다. 그러나, 몇몇 클론에 있어서는, 강도가 거의 동일한 2개의 밴드가 모두 기록되므로, Vβ의 총수는 분석된 클론의 수보다 클 수 있다. Vβ 유전자 발현은 기술한 Vβ-특이적인 올리고머를 사용함에 의해 이들 클론에 대해 동정될 수 없다. 이들 클론중 3개는 Vβ 5.2/5.3, Vβ 6.7, Vβ 8.1 및 Vβ 12에 대해 지시된 모노클로날 항-Vβ 항체에 의해서만 분석되며[참조: Kappler et al., Science 244 : 811-813 (1989)], 네가티브이다.
실시예 IV
CDR2 영역내의 V 유전자군 간의 서열 상동성
CDR2 영역에 대한 예견되고 관측된 고 농도의 생물학적 활성의 견지에서, 본 발명자는 상동성에 대한 검정을 위해 CDR2 영역내로 추가로 관측하여 펩타이드에 선을 긋기로 결정하였다.
현저한 상동성이 NH2-말단에서 입증된다. 8개의 잔기중 6개가 보존적 치환 상태인 C-말단에서 2개의 비상동성인 잔기와 상동이다. 이 상동성은, 후술한 바와같이, Vβ 6.1에 대해 선별된 클론이 Vβ 5.2 에피토프를 인지할 수 있기 때문에 확실하다.
CDR2 영역내 V 유전자군 사이의 관계를 추가로 설명하기 위한 노력으로, 본 발명자는 또한 Vβ 12.2 및 Vβ 17.1에 대한 Vβ 14 에피토프를 비교한다. NH2-말단으로부터 첫번째 12개의 잔기중 10개가 상동이다. C-말단에서 상동성은 존재하지 않으며 9개의 잔기중 4개가 정렬로 위치된다. 하기 표는 서열 상동성을 나타낸다.
실시예 V
다발성 경화증 환자의 뇌척수액 중의 미엘린 항원의 명확한 T 세포 인지
본 실시예는 MS 환자의 뇌척수액이 동일한 환자의 혈액 또는 다른 신경학적 질환(OND)이 있는 환자의 CSF에서 발견되는 것 보다 완전한 BP 및, 낮은 정도로 PLP 펩타이드에 반응하는 훨씬 높은 빈도의 T 세포를 함유한다는 것을 처음으로 입증한다. 비교하면, MS 및 OND 환자 모두는 프로세싱된 완전한 BP에서 발견되지 않는 BP의 잠재 단편에만 반응하는 CSF T 세로를 필적한 만한 수준으로 함유하며, 이는 분명한 프로세싱 경로를 암시한다. 미엘린 항원 반응성 T 세포의 염증 수준의 표적 기관에의 밀접한 유사성은 이들이 MS 질환 과정에 관련이 있다는 것을 새로이 지지해 준다.
지금까지의 연구는 MS에서 관찰되는 광범위한 미엘린 손상을 설명하기에는 미엘린 항원에 특이적인 주변 T 세포의 빈도가 너무 낮다는 것을 보여준다[참조: Allegretta et al., Science 247:718-721(1970) and Ota et al., Nature 346:183-187 (1990)]. 그러나, 염증이 생긴 CNS 실질(parenchyma)과 직접 통하던 CSF로부터의 미엘린 항원 특이 T 세포를 특징지우는 보고는 거의 없다. BP- 및 PLP- 특이 T 세포는 바람직하게는 IL-2 중에서 중식시킨 후 면역화된 동물의 CNS로부터 회수하며, 이는 이들 뇌발생 특이성의 사전 활성화를 나타낸다. 이에 비해, 림프절로부터의 IL-L 증식 후에는 BP-특이 T 세포를 회수할 수 없으며, 이는 CNS-기원한 T-세포가 상이한 활성화 상태에 있음을 나타낸다.
예비 연구에서, 직접 항원 자극보다 MS 환자의 CSF로부터 BP- 특이성 T 세포를 3배 더 회수할 수 있게 한 IL-2 증식 단계를 2가지 방법 모두를 사용하여 필적할 만한 결과를 나타낸 혈액 분석과 비교하였다. IL-2 증식 단계를 사용하여 CSF로부터 활성화된 항원 특이적 T 세포 클론을 회수하고 직접 항원 자극법을 사용하여 명백한 MS가 있는 9명의 환자[참조: Poser et al., Ann. Neurol. 13: 227-231(1983) 및 Kurtzke, J. R. Neurology 33:1444 -1452(1983)] 및 다른 신경 질환이 있는 6명의 환자로부터 혈액 T 세포 빈도를 평가하였다. 4명의 류마티스성 관절염 환자 및 6명의 정상인에 대해서도 혈액 T 세포 빈도를 측정하였다.
표 10에서 보는 바와 같이, MS 공여자로부터의 CSF 세포 충실성은 μl당 0.5 내지 15.5 범위(평균 3.5개 세포/μl)로서, 한명의 공여자(MSI)만이 높은 세포수( > 5개 세포/ml)를 가졌다. 플레이팅된 총 528,000개의 CSF 세포로부터 총 300개의 IL-2 반응성 T 세포 클론을 분리하여 특성화하였다(회수율 0.06%). 그런 다음 IL-2 증식된 클론의 온전한 사람 BP(참조: Eylar et al., J. Biol. Chem. 246:5770-5782(1971)), BP 단편 1-38(P2), 45-89 (P1) 및 90-170(P4)[Chou et al., J. Neurochem. 28:115-119 (1977)], 잔기 139-151에 상응하는 PLP 펩타이드 및 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)에 대한 특이 반응을 평가한다. PLP139-151펩타이드를 MS 환자에서 최초 스크리닝시의 이의 광범위 활성 및 마우스에서의 입증된 뇌발생 활성에 의해 선택한다[참조: Tuohy et al., J. Immunol. 142:1868-1873(1988)]. 분석을 위해 회수한 300개의 활성화된 클론 중에서, 71개의 클론(24%)이 전체 BP에 특이적으로 반응하였으나 PLP139-151또는 HSV에는 반응하지 않았으며, 추가의 39개의 클론(13%)이 BP의 3개 단편 중 하나에 반응하였으나 완전한 BP 분자에는 반응하지 않았다(표 10). 또한, 39개의 클론(13%)이 PLP139-151에 특이적으로 반응하였다 (표 10). 이와 같이, BP- 및 PLP139-151특이적 클론은 활성화된 CSF T 세포의 총 50%를 차지하였다. 한편, HSV에는 10개의 클론(3%)만이 특이적으로 반응하였다. 시험한 14개의 BP- 특이적 클론 모두가 CD4 표현형으로서, 이는 상기 결과와 일치한다.
여러 측면에서, OND 그룹으로부터의 CSF는 MS CSF와 유사하다. OND CSF는μl당 0.5 내지 22.5개의 세포(평균 5.3개 세포/μl)를 포함하며, 단지 하나의 공여자(OND3)만이 증가된 세포수를 갖는다(표 38). 총 112개의 IL-2 반응성 T 세포 클론을 분리하여 MS CSF의 비율과 필적하는 비율로 플레이트된 총 223,000개 세포로부터 항원 특이성을 시험한다(0.05% 회수). 그러나, 회수된 112개 클론중, 단지 3개의 클론만이 완전한 BP에 반응하고 2개만이 PLP139-151에 반응하였다. 이와 함께, 이러한 특이성은 MS 환자의 경우인 37%에 대해 IL-2 반응 클론은 5% 미만을 나타내었다. 그러나, MS 환자와 유사하게, 19개 클론(17%)이 BP 단편중의 하나에 반응하였고 완전한 BP 분자와는 반응하지 않았다. 따라서, MS 환자의 경우 50%에 대해 OND 환자로 부터의 IL-2 반응 클론 21%이 CNS 항원에 특이적이다. 또한, 37개의 클론(33%)이 MS 환자에 대한 것보다 거의 10배 높은 비율로 HSV 항원에 반응하였다(표 10).
MS 환자중 전체 BP에 대해 특이적인 CSF T 세포의 빈도는 5.6 내지 40 x 10-5의 범위이며, 이는 4,525 CSF 세포당 22.1 x 10-5또는 1의 평균 빈도를 제공한다(도 24). MS CSF 중의 온전한 BP에 대한 반응 빈도는 OND CSF에 대한 것보다 18배 초과이며(p<0.01), 이때 단지 1.2 x 10-5(1/83,333) CSF 세포가 온전한 BP에 반응하였다. PLP139-151반응성 T 세포의 빈도는 또한 OND CSF과 비교하여 MS에서도 증가되었다(9.5대 2.1 x 10-5, p<0.05, 도 24). 이와는 반대로, BP 펩타이드 중의 하나에만 반응하고 완전한 BP와는 반응하지 않는 T 세포 클론의 빈도는 MS 및 OND 환자에서와 동일하다(13.4대 12.3 x 10-5, 도 24). HSV에 반응성인 T 세포의 빈도는 미엘린 항원에 대한 반응에 역으로 관련되며, MS CSF는 빈도가 감소하고(4.1 x 10-5) OND CSF은 BP 및 PLP139-151에 비해 빈도가 증가한다(30.5 x 10-5).
MS 환자 및 대조군으로부터의 짝을 이룬 혈액 샘플은 제한 희석 검정법으로 분석하여[참조: Lefkovits et al., Immun. Today 5:265-268 및 295-298 (1984)], BP-PLP139-151, 및 HSV-반응성 T 세포의 전구체 빈도를 확립한다. 도 25에 나타난 바와 같이, MS 환자로부터의 순환하는 BP- 반응성 T-세포는 0.61 x 10-5(1/164,000 세포)의 빈도로 발생한다. 이러한 빈도는 OND 환자, 류마티스성 관절염 환자, 또는 정상의 공여자(각각 0.14, 0.12 및 0.10 x 10-5)에서 보다 상당히 크다(p < 0.01). 이와는 반대로, PLP139-151(범위, 0.11 - 0.16 x 10-5) 또는 HSV (범위 6.4 - 12.3 x 10-5, 도 25)에 대한 혈액 T 세포 빈도에 있어서 환자들간에는 차이가 관측되지 않았다.
혈액과 비교하여, MS CSF 중의 BP-반응성 T 세포의 빈도는 36배 농축되고(p < 0.001), PLP139-151반응성 T 세포의 빈도는 73배 농축된다(p < 0.001). BP- 및 PLP139-151-반응성 T 세포에 대한 유사한 농축이 OND CSF에서 나타냈다(각각 9 및 19배, p < 0.05). 이와는 반대로, HSV에 특이적인 T 세포는 MS CSF에서 3배 감소하나(p < 0.001), 혈액(p < 0.05)와 비교하여 OND CSF에서는 3배 증가하였다. 제한 희석 분석에 의해 검출되는 혈액 T 세포 클론이 최대로 얻을 수 있는 빈도(CSF에서와 같은 실제 회수된 빈도가 아님)를 나타내므로, 미엘린 항원-특이적 T 세포 빈도의 차이가 과소평가될 수 있다. IL-2 증가가 항원 특이적 T 세포의 보다 효과적인 회수를 제공하는 CSF와는 다르게, IL-2 증가 또는 직접적 항원 자극후 확립된 혈액 T 세포 빈도는 유사 하였다. 이들 결과는 말초 항원 특이적 T 세포가 또한 '활성화된' 상태에 있을 수 있다는 것을 제시한다.
본 실시예에 주어진 결과에 의해 강조되는 중요한 문제점은 미엘린 항원-반응성 T 세포가 MS 환자에서 마비와 탈수을 유도하기에 충분한 빈도로발생하느냐하는 것이다. 현재의 데이터는 CSF에서의 미엘린 항원-반응성 T 세포(혈액은 제외)는 염증을 일으키기에 충분함을 강력히 시사하고 있다: CSF 중의 BP-반응성 T 세포 빈도(22/100,000)는 마비성 EAE를 갖는 래트의 CNS 조직에서 발견되는 것[참조: Cohen et al., Cell. Immunol. 108:203-(1987)](30/100,000) 및 SK/SD 또는 TT 반응성 공여자에서 관찰되는 T 세포 수준[참조: Geha, R. S. Clin, Immunol. Immunopathol. 19:196-205(1981); Sohnle et al., J. Immunol. 127:612-615(1981); Ford et al., Cellular Immunol. 79:334-344(1983)](4-22/100,000)에 필적한다. 조사된 환자 혈액 중에서 HSV에 대한 반응 빈도(6-12/100,000) 역시 이 범위내에 있다는 것은 주목할만하다. 또한, 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH) 면역화 공여자 혈액중의 특이적 T 세포의 빈도는 4/100,000[참조: Ford et al., Cellular Immunol. 79:334-344(1983)]로서, 생체내 32 개체에서 강한 피부 반응을 촉발시킬 수 있는수준에 해당한다[참조: Burger et al., Cellular Immunol. 29:410-416 (1977)].
그러나, 미엘린 항원 반응성 T 세포는 혈액 중에서 염증성 빈도로 발생하지는 않는다. BP에 대한 순환성 MS T 세포 수준은(0.61/100,000) OND, RA 또는 정상 공여자 보다는 현저하게 높으나(0.10-0.14/100,000), MS 혈액 T 세포 수준은, 미면역화된, 피부 테스트-네가티브 공여자에서 KLH에 대해 특이적인 T 세포의 빈도보다 약간 높은 뿐이다[참조: Ford et al., Cellular Immunol. 79: 334-344(1983); Burger et al., Cellular Immunol. 29:410-416(1977)(0.38/100,000)]. 이 실시예내의 모든 그룹은 비교가 될 만큼 낮은 농도의 PLP139-151반응성 T 세포(0.11- 0.16/100,000)를 가지며, 이 '기저선'은 다른 문헌[참조: Allegretta et al., Science 247:718-721 (1990); Ota et al., Nature 346:183-187 (1990)]에 보고된 바와 같이 MS 환자의 혈액으로부터 회수한 BP-특이적 T 세포 클론의 빈도(0.04-0.11/ 100,000)와 유사했다. 따라서, 미엘린 항원에 대한 혈액 T 세포 빈도는 i) 생체내에서 염증성 반응을 유발시키기에는 너무 낮으며; ii) 희석된 숫자에서 CSF 반응성을 반영할 수도 있으며 iii) 천연 또는 교차-반응성 결정 인자를 사용한 전신적 면역화로부터 기인한 것으로 나타나지는 않는다. 이런 발견과 관련하여, BP 노출후에 IFN-γ를 분비하는 40배 높은 빈도의 단핵 세포가 최근에 CSF(185/100,000) 대 MS 환자의 혈액(3 - 5/100,000)에서 보고된 바 있다[참조: Olsson et al., J. Clin. Invest. 86: 981-985 (1990)]. 그러나, 이들 반응 세포중 얼마나 많은 수가 BP에 특이적인 T 림프구 함유 TCR 인지는 불분명하다.
CSF에서 BP의 T 세포 인지는 두가지 서로다른 패턴을 내포한다. 완전한 BP 분자내의 에피토프를 인지하는 한 세트의 클론은 MS 환자에서 많이(71/110 클론, 65%) 발견되나 OND 환자에서는 덜 빈번하게 나타난다(3/22 클론, 13%). MS 클론의 특이성은 BP의 N 말단 ½에서 에피토프 쪽으로 쏠리게 되며, P1(잔기 45-89) 또는 P2(잔기 1-38)에 대해 특이적인 T 세포 클론과 함께 이런 클론 유형의 60%(43/71) 이상을 설명하고 있다(도 26 참조). 잔류 클론은 P4(잔기 90-170, 20%)에 반응 하거나 어느 펩타이드와도 반응하지 않는다(20%). 얼마간, 동일한 MS 환자의 혈액으로 부터의 BP-반응성 T 세포 클론의 단지 36% 만이 P1 또는 P2에 대해 특이적이다(도 26 참조). BP의 P1및 P2단편에 대한 편향된 T 세포 반응은 특히 주목 할만한데, 이는 이들 단편들이 정상 BP 반응자 혈액으로부터의 BP- 특이적 T 세포 클론에 의해 거의 완전하게 인지되지 못하기 때문(5%)이다.
CSF 중의 T 세포 클론의 제2 변이 세트는 BP 단편중 하나에 선택적으로 반응하지만, 순수한 BP 자체에는 반응하지 않으며, MS 및 OND 그룹 모두에서 유사한 빈도로 나타난다(도 24). 완전한 항원이 발현되어 MHC와 함께 나타난 경우 보존되지 않는 이러한 펩타이드-특이적 에피토프는 '크립틱(cryptic)'인 것으로서 기술되어 졌다[참조: Gammon et al., Immunol. Rev., 98:53-73(1987)]. 이중의 변이 T 세포 클론은 잔기 43-89(각각 MS 및 OND 환자로부터의 BP 단편 특이적 클론 41% 및 42%), 1-38(각각 36% 및 21%) 및 90-170(각각 23% 및 37%)을 포함하여 각각의 BP 단편 중의 이러한 '크립틱' 에피토프를 인지한다.
래트에 대한 연구는 이러한 2가지 양식의 BP 인지의 중요성을 설명한다. 동종 BP의 T 세포 인지는 뇌염 발생 과정의 유도를 위해 필수 불가결한 것으로 나타난다. 완전한 BP로 면역화된후 유도된 T 세포는 면역우성 및 완전한 BP가 부속 세포에 의해 '프로세싱'될 경우 보존되는 뇌염 발생성 BP 에피토프에 반응한다[참조: Chou et al., J. Neurosci. Res. 23:207-216(1989)]. 대조적으로, 래트에서 뇌염발생성 에프토프의 절단된 버젼을 나타내는 합성 BP 단편을 사용한 면역법은 2가지의 현저한 T 세포 클론 세트를 유도한다[참조: Offner et al., J. Immunol. 141:3828-3832(1988)]. 한 세트는 뇌염 발생성인 합성 펩타이드 및 완전한 BP를 인지한다. T 세포의 제2 변이 세트는 합성 에피토프만을 인지하고, 완전한 BP는 인지하지 않으며 뇌염 발생성이 아니다. 그러므로, 동일한 펩타이드는 2가지의 상이한 항원 형태로 나타나고, 이중 하나만이 완전한 BP 분자가 천연적으로 '프로세싱'될때 유지된다. 사람에게서 일어나는 유사한 이중 감작화는 사람 BP의 잔기 55-74, 87-99 및 110-129에 상응하는 합성 펩타이드가 CSF로부터의 BP-반응성 및 펩타이드-특이적 T 세포 클론 모두에 의해 인지된다는 관찰에 의해 지지된다. P4 내에서, 동일한 환자로부터의 혈액-기원한 클론은 PB의 130-149 및 149-171 펩타이드와 가장 빈번하게 반응하지만, 87-99 및 110-129 에피토프와는 거의 반응하지 않는다는 것을 주목할만 하다.
모두 종합하여, 상기한 결과는 다음을 입증한다: 1) 뇌염발생성 미엘린 항원에 대해 특이적인 T 세포는 MS CSF 중의 50%의 활성화 IL-2 반응성 T 세포를 포함한다. 2) 뇌염 발생성 미엘린 항원에 대해 특이적인 T 세포의 빈도는 말단 신경에 비해 MS 환자의 CSF에서 매우 풍부하며 염증성 반응을 촉진시킬 수 있는 수준으로 나타난다; 3) MS 환자에서의 CSF BP 반응은 완전한 BP의 인지을 기초로한 OND 환자 반응과는 구별될 수 있다; 4) 미엘린 항원 반응성 클론의 빈도는 MS 환자 대 대조군의 CSF(BP 및 PLP139-151) 및 혈액(BP 단독)에서 현저히 높다; 5) CSF 클론의 BP 에피토프 특이성은 N 말단 에피토프를 향해 심하게 편향된다.
표 10: 환자들은 오레곤 헬스 사이언시스 유니버시티 MS 센터(Oregon Health Sciences University MS Center)에 수용하여 돌본다. MS 환자들은 평균 연령이 47세이고 연령 범위가 34세 내지 58세인 임상적으로 명확한 MS 환자들이다. MS 환자들중 3명은 안정성 이장성-재발 질환(stable relapsing-remitting disease)을 앓으며 6명은 만성 진행성 질환(chronic progressive disease)을 앓으며 어떤 환자도 연구 동안 임상적으로 변화하지 않는다. 이러한 질환의 평균 지속기는 16 ± 8년(6 내지 32년의 범위)이다. 환자들의 평균 외래 통원 지수(AI)는 3.8 ± 2.0(2 내지 8의 범위)이고 평균 쿠르츠케 무능력 상태 스코어(KDSS)이 4.5 ± 2.1(2 내지 7의 범위)이다. 환자들은 OHSU의 이식 실험실에서 표준 혈청학적 방법에 의해 HLA-타입화 한다. HLA 타입은 하기와 같다: MS1, DR1, 2/DQw1; MS2, DR2,4/DQw1, 3; MS3, DR2/DQw1; MS4, DR2/DQw1; MS5, DR2,7/DQw1; MS6, DR2,6/DQw1; MS7, DR 2,4/DQw1,3; MS8, DR2/DQw1; MS9(시험되지 않음)이다. OND 환자들은 평균 연령이 42세이고 연령 범위는 23 내지 69세이다. OND 환자들에 대한 진단은 하기와 같다: OND1, 하수체 미분화세포종(pituitary dysgerminoma); OND2, 최근 바이러스성 수막염; OND3, 콕시디오이달 수막염(coccidioidal meningitis) 및 뇌누두성 경색(lacunar cerebral infarcts); OND4, 당뇨병성 말초 신경병; OND5, 선행 척추궁절제술 및 만성 배통; OND6, CNS 맥관염 및 뇌경색, 각 MS 및 OND 환자에서, 20ml의 CSF를 혈액 오염 없이 요추천자에 의해 수득한다. CSF 세포를 275xg에서 10분 동안 원심분리하여 수집하고 일부를 IL-2 및 IL-4(각각 50U/ml, AMGEN) 함유 배지(10% AB 혈청, 1% L-글루타민, 나트륨 티루베이트 및 항생제 함유 RPMI 1640)중에 환저 96-웰 플레이트의 웰당 1000개 세포의 밀도로 플레이팅한다. 14 내지21일 동안 증식시킨 후, T 세포를 자가 조사된 (4,500rad) 105개 혈액 단핵 세포에 의해 제공되는 특정 항원 50μg/ml을 사용하여 재자극시키고, 반응을 72시간 후3H-Tdy의 흡수에 의해 측정한다. 하나의 항원에 대한 반응이 기저치에 대해 3X 또는 >1000 CPM인 경우 포지티브로서 평가한다. 사람 BP(Hu-BP)를 급냉된 뇌로부터 추출하여 정제한다. P1(잔기 45 내지 89), P2(잔기 1 내지 38), 및 P4(잔기 90 내지 170)을 포함하는 Hu-BP의 단편을 단백분해 및 정제후 에모리 유니버시티(Emory University: Atlanta, GA 소재)의 셀렌 추오 박사(Dr. Selen Chou)로 부터 수득한다. PLP139-151의 서열은 HCLGKWLGHPDKF이다.
실시예 VI
MS의 모델로서 EAE를 치료하는데 유용한 펩타이드의 조성
서론
EAE는 사람 자기면역 질환인 다발성 경화증의 널리 인지된 래트 모델이다. 따라서, 본 발명의 유용성은 래트에서 EAE에 대한 마커 TCR인, TCR의 적당한 CDR2 펩타이드를 나타내는 펩타이드의 투여가 상기 래트에서 EAE를 억제한다는 것을 보여줌으로써 입증한다. 이 모델에서, 상기 질환은 뇌염 발생성 형태의 미엘린 기본 단백질, 예를 들어, 기니아 피그 기본 단백질(GPBP) 또는 GPBP의 잔기 72-89에 상응하는 합성 펩타이드[GPBP(72-89)]를 대상 래트에 주사함으로써 유발시킨다. 완전 프로인트 보조제(CFA) 중의 상기 펩타이드중 하나를 주사하여 마우스 TCR Vα 2및 Vβ8 유전자의 래트 동족체를 우선적으로 이용하는 뇌염발생성 T 세포 클론을 유도시킨다[참조: Chou, Y. K., et al., J. Neurosci. Res. 22: 181-187(1989); Burns, F. R., et al., J. Exp. Med. 169: 27-39(1989)].
본 발명자들은 기본 단백질의 주요 뇌염발생성 에피 토프인 GPBP(72-89)에 대한 반응에서 사용된 재배열된 래트 TCRα 및 β쇄 유전자에 대한 완전한 뉴클레오타이드 및 유추된 아미노산 서열(마우스 Vα2 및 Vβ8 군 각각에 대해 서열 동종이다)을 보고하였다[상기 참조: Burns, F.R., et al., 상기 참조]. TCR Vβ8 영역내에서, 제2의 상보성 결정 영역(CDR2)를 포함하는 21개 아미노산 서열이 확인되고 합성되었으며 T 세포에 대해 면역원성임이 예상되었다[참조: Margalit et al. 및 Rothbard et al(상기 참조)의 알고리듬 기준].
이 펩타이드는 하기 서열을 가지며 'TCR Vβ8(39-59)로 명명된다.
대조군 펩타이드는 마우스 Vβ14 군에 동종인 상이한 TCR Vβ 서열에 상응하는 영역으로부터 합성한다[상기 참조: Williams et al., 상기 참조].
TCR 펩타이드에 대한 특이 면역성
4마리의 래트를 CFA중 400μg의 TCR 펩타이드의 피하(SC) 주사[100μg의 마이코 박테리움(Mycobacterium)/래트)로 면역화시키고 펩타이드-특이적 면역 반응을 30일 후에 측정한다.
TCR Vβ8(39-59)에 대해 특이적인 항체를 측정하기 위해, 면역화시킨 래트로부터의 혈청을 직접 ELISA로 시험한다. TCR 펩타이드를 플라스틱 미세플레이트상에 도포한다(25ng의 TCR 펩타이드/웰). 혈청 희석액을 가하고 플레이트를 2시간 동안 항온 처리한다. Ig H 및 L 쇄에 대해 특이적인 퍼옥시다제-결합된 항체를 첨가하여 반응을 진행시킨다. 퍼옥시다제에 대한 색소 생성 기질을 가하고 발색된 반응 생성물을 비색정량 플레이트 판독기를 사용하여 405nm(A405)에서의 흡광도로서 측정한다.
면역 혈청의 1:200 희석액의 흡광도는 0.63 ± 0.12 유니트이다. 대조군 펩타이드(비관련 TCR 쇄인, Vβ14의 상응하는 CDR2영역으로부터 기원)로 면역시킨 래트로부터의 대조군 혈청의 흡광도는 단지 0.02 ± 0.01 유니트이다. 따라서 TCR 펩타이드에 대한 특이적 항체 반응이 수득된다.
또한, 래트는 Vβ8(39-59)을 사용한 피내(ID) 챌린지에 대한 지연된 과감작성(DH) 반응으로서 측정되는 경우 생체내에서 특이적 T 세포 반응을 나타내지만, Vβ14 펩타이드를 사용한 경우는 그렇지 않다.
임상적 EAE에 대한 TCR 펩타이드-특이적 면역 보호
TCR 펩타이드에 대한 특이 면역성을 보여주는 것 이외에, 펩타이드-면역화시킨 래트는 임상적 EAE에 대해 보호되는 것으로 밝혀졌다.
TCR Vβ8(39-59) 펩타이드를 사용한 루이스 래트의 면역화는 EAE의 유발을 완전히 억제하지만 TCR Vβ14 펩타이드 또는 염수를 사용한 경우는 그렇지 않다(표11). Vβ8(39-59)-면역화시킨 래트는 Vβ8(39-59) 펩타이드에 대한 특이 항체를 생성하며 50μg의 TCR Vβ8(39-59)에 대해 귀의 0.17mm 팽윤의 과감작성(DH) 반응을 지연시킨다. 대조군 Vβ14 펩타이드는 또한 자체로서 특이 면역성을 유도하지만 EAE에 대해서는 보호를 제공하지 않는다.
특이적 T 세포를 생성시키는 TCR 펩타이드-특이적 면역
EAE에 대한 항체 생성, DH, 및 보호에 대한 입증 이외에, TCR 펩타이드는 명백한 항원 특이적(즉, TCR 펩타이드-특이적) T 세포를 생성시킨다.
래트는 CFA[엠. 두베르쿨로시스(M. tuberculosis) 1mg 함유]중 400μg의 TCR Vβ8(39-59) 펩타이드로 피하 면역화하고 동시에 CFA중 50μg의 GPBP로 또는 30일 후에 100μg의 GPBP로 피하 챌린지한다. 동시 챌린지 후 20일 뒤에, 유출성 임파선(LN)을 제거하여 림프구 현탁액을 제조한다.
세포의 분획을 시험관 내에서 항원 또는 유사분열 물질에 대한 증식 반응에 대해 시험한다(5 x 105개 세포/웰).
세포의 나머지를 적당한 TCR 펩타이드(50μg/ml)를 사용하는 대량 배양(bulk culture)(직경 6cm의 페트리 디쉬)으로 3일 동안 제자극시킨 후 추가의 4일 동안 IL-2가 풍부한 배지로 옮긴다. 이어서, 이들 세포를 조사된 흉선 부세포(2 x 104개 세포/웰)의 존재하에서 재자극에 의해 항원 및/또는 유사분열 물질에 대한 증식 반응에 대해 시험한다. 몇몇 경우에, TCR 펩타이드에 의한 자극은 2μg/웰의 모노클로날 항체의 존재하에서 수행한다. 결과는 표 12(밑줄친 값은 통계학적으로 유의한 반응을 나타낸다)에 나타나 있다.
보호된 래트로부터 분리된 임파절(LN) 세포는 TCR Vβ8(39-59) 펩타이드 및, GPBP 및 PPD(엠. 투베르쿨로시스의 정제된 단백질 유도체)에 대해 반응한다. 이것은 TCR-특이적 및 자기항원-특이적 T 세포 반응성의 동시 존재를 추가로 입증한다.
T-세포주는 Vβ8(39-59) 펩타이드에 대해 특이적으로 반응하지만 Vβ14 펩타이드에 대해서는 반응하지 않는 보호된 래트의 LN으로부터 선별한다(표 12). TCR Vβ8(39-59)-특이적 T 세포는 면역 형광법에 의해 CD 4 마커에 대해서는 강력하게 포지티브이고 CD8 마커에 대해서는 약한 포지티브이다. Vβ8(39-59) 펩타이드에 대한 증식 반응은 MHC I 분류 분자에 의해서만 제한된다.
GPBP-특이적 T-세포주는 또한 TCR Vβ8(39-59) 펩타이드 및 GPBP 둘다로 면역시킨 보호된 래트로부터 선택한다. 이러한 세포주는 GPBP에 대한 반응성에 비하여 뇌염발생성 72-89 펩타이드에 대해서는 비특정적으로 낮은 반응을 나타낸다. TCR 펩타이드-보호된 래트로부터의 선별되고 활성화된, GPBP-특이적 T 세포주는 뇌염발생성(107개의 세포 투여가 3마리 래트에서 뒷다리 마비를 야기시킨다)이며, 이것은 TCR Vβ8(39-59) 펩타이드 면역화가 뇌염발생성 T 세포의 전구체의 결실을 초래하지 않음을 나타낸다.
TCR Vβ8(39-59)-특이적 및 BP-특이적 T 세포의 혼합은 TCR 펩타이드의 존재하에서조차 GPBP에 대한 반응을 손상시키지 않는다(표 12). 그러나, TCR Vβ8(39-59)-특이적 T 세포의 존재는 뇌염발생성 72-89 서열을 제외하고는 GPBP의 모든 펩타이드에 대해 증가된 반응을 야기시킨다. 그러므로 TCR 펩타이드 특이적 T 세포는 GPBP 반응성 T 세포의 펩타이드 인지 양상을 변형시키는데, 이것은 세포-세포 상호작용이 존재함을 입증한다.
TCR 펩타이드-특이적 T 세포와 BP-특이적 T 세포 사이의 직접적 상호작용
면역화시킨 래트의 LN으로부터의 T 세포를 약독화된 Vβ8+ 또는 Vβ8- T 세포에 대한 시험관내 반응성에 대해 시험한다. 자극인자 T 세포를 조사하고(2500R), 2 x 104개 세포를 2 x 105개의 분리된 TCR 특이적 T 세포와 함께 3일 동안 배양하고(추가의 부 세포의 부재하에),3H-티미딘으로 3일중 마지막 18시간 동안 펄스시킨 다음 동위원소 흡수를 액체 신틸레이션 분광 검사법으로 측정한다.
자극인자 T 세포주의 부재하에서, '기저치' 반응은 7000cpm으로 나타난다(표 13). 자극인자 세포 주가 GPBP S72-89 에피토프에 대해 특이적이어서, Vβ8 TCR을 발현시키는 경우 반응은 31,000cpm이다. 그러나, 자극인자 세포주가 GPBP 55-74 펩타이드에 특이적이어서, Vβ8 TCR을 발현시키지 않는 경우, 상기 기저치 이상의 유의한 반응이 나타나지 않는다(8000cpm). 따라서, 단지 Vβ8+ 세포만이 TCR 펩타이드에 특이적인 T 세포에 의해 인지될 수 있다는 것은 조절성 Vβ8-특이적 T 세포에 의한 표적 T 세포상에서 Vβ8 펩타이드의 직접적 인지가 있음을 나타낸다. 결과는 자극인자 T 세포의 표면상에서 TCR 서열의 직접적 인지를 나타낸다. 그러나, TCR 펩타이드 특이적-T 세포는 BP 반응성 표적 세포에 대해 세포 독성이 아니다.
TCR 펩타이드-특이적 T 세포에 의한 EAE 보호의 수동적 전이
Vβ8(39-59) 펩타이드 특이적 T 세포의 보호능은 적용적 전이에 의해 달성된다. 107개 Vβ8(39-59) 특이적-T 세포를 주사한 래트는 EAE로 진행되지 않는다(표 14). 전이된 보호는 T-세포 매개되는 것으로 나타나며; Vβ8(39-59)-특이적 항체는 보호된 래트의 혈청에서 검출될 수 없다. DT 결과(표 14)는 적용적으로 전이된 T 세포가 기타 항원의 T 세포 인지를 절충시킴없이 EAE의 유발을 억제할 수 있음을 나타낸다.
보호된 래트로부터 기원한 T 세포주의 특이성
(a) 시험관내에서 GPBP-특이적 T 세포주의 반응 양상을 변형시키고, (b) EAE로부터의 투약하지 않았던 래트를 보호하고, (c) 시험관내에서 DH 반응을 감소시키는 Vβ8(39-59)-특이적 T 세포의 능력은 BP 에피토프에 대한 반응의 양상이 TCR 펩타이드-특이적 T 세포에 의해 보호된 래트에서 변형될 수 있음을 의미한다. 표 15에서 나타나는 바와 같이, EAE 보호된 돌물로부터의 LN 세포는 대조군 그룹으로부터의 LN 세포와 비교하여 GPBP의 TCR 펩타이드에 대해 더 잘 반응한다. 이와는 반대로, 보호된 그룹으로부터의 LN 세포는 BP의 87-99 펩타이드에 대해 현저한 반응을 나타내는 반면, 대조군 그룹으로부터의 LN 세포는 이 펩타이드에 반응하지 않는다. 적용적으로 보호된 래트의 LN으로부터의 TCR Vβ8(39-59)-특이적 세포주의 선별(표 15)은 TCR 펩타이드-특이적 T 세포가 GPBP 주사 부위로 유출되는 LN으로 이주되어 LN내에서 유지됨을 나타낸다.
토의
상기 결과는 EAE의 유발을 억제하는 Vβ-특이적인 조절성 T 세포를 유도하기 위한 TCR의 CDR2 영역으로부터의 합성 펩타이드의 용도를 최초로 입증하였다. TCR 쇄, 항원성 펩타이드 및 MHC 제한 모델 사이의 3원 상호작용의 컴퓨터 모델링은 TCR이 에너지적으로 유리한 구조로 폴딩되는 경우 펩타이드/MHC 결합에서 CDR 병발과 일치한다[상기 참조: Davis et al. and Claverie et al., 상기 참조]. CDR2에 대해 특이적인 T 세포의 조절 작용은 이 영역이 생물학적으로 중요하다는 생각을 뒷받침한다. 발명자들이 특정 이론에 결부되도록 하려고 의도하지 않았음에도 불구하고, 반응 T 세포는 표적 T 세포 표면상의 기능적 TCR Vβ8 분자와 직접적으로 상호 작용하는 것 같지는 않다. 결국, 내인성 TCR 펩타이드가 '프로세싱'되어 우선적으로 I 부류 분자와 연합하여 T-세포 표면상에 우선적으로 발현된다고 생각할 수 있다[참조: Long, E.D., Immunol. Today 10:232-234(1989)]. TCR 펩타이드의 천연 형태가 T 세포 표면상의 MHC 분자와 연관되는 경우, 상호작용성 TCR-특이적 T 세포는 BP 에피토프에 의해 정상 T 세포 활성화를 방해할 수 있다.
약독화된 T 세포를 사용한 백신처리는 동일한 질환 유발성 에피토프에 대해특이적인 상이한 T 세포 클론에 의해 공유된 타게 구조물에 대해 보호 면역성을 유도하지만 TCR을 직접적으로 연류시키지는 않는다. 뇌염 발생성 T 세포에 의해 발현된 TCR Vβ8 쇄의 정의된 영역에 대한 본원에서 입증된 면역 원성 및 면역조절 활성은 항-이디오타입 조절을 이해하는데 있어서 중요한 단계이며 펩타이드 면역화 접근의 보호 효과에 대한 명백한 설명을 제공해준다. TCR 펩타이드-특이적 항체를 유도하기 위해 합성 펩타이드를 사용하는 본 발명의 접근은 TCR 기능에서 중요한 서열을 평가하기 위한 다양한 고도의 특이적 항체를 생성하는데에 있어서 중요하다. Vβ8(39-59) 펩타이드로 나타나는 항체의 잠재적 조절 특성은 실시예 II에서 설명한다.
통상의 TCR V-유전자 사용에 의해 특징지워지는 TCR 펩타이드 백신처리는 사람 자기면역 또는 악성 조건에서 사용한다.
실시예 VII
EAE를 억제하는 합성 TCR V 영역 펩타이드에 대한 항체
본 실시예는 뇌염발생성 기니아 피그 기본 단백질(GPBP) 펩타이드, S87-99로 유발된 EAE 및 GPBP 펩타이드 S49S 또는 S87-99에 대한 항체 반응에 있어 TCR Vβ8(39-59) 펩타이드를 사용한 면역화의 효과를 평가한 것이다. TCR Vβ8(39-59)에 대한 항체 반응을 기술하고 Vβ8+ T 세포와 반응하여 EAE의 임상적 징후를 억제하는 항체의 능력을 평가한다.
결과는 TCR Vβ8(39-59) 펩타이드가 EAE에 대한 보호 및 레비스 래트에서 뇌염발생성인 GPBP 에피토프중 하나에 특이적인 항체에 대한 상승된 역가를 유도할 수 있다. 더우기, 항-TCR Vβ8(39-59) 항체는 조절 T 세포에 의존적인 EAE를 억제하는 것으로 나타난다. 따라서, 체액성 및 세포성 조절 기작 모두는 TCR Vβ8(39-59) 펩타이드로 면역화한 후 발생한다.
A. 재료 및 방법
1. 펩타이드 합성 및 정제
이 연구에서 사용되는 모든 펩타이드는 Boc-아미노산-수지-에스테르(Peninsula Laboratories, San Carlos, CA)를 사용하여 고체상 방법[참조: Merrifield J. Amer. Chem. Soc. 85:2149(1963)]의 약간의 변형법[참조: Hashim et al., J. Neurosci. Res. 16: 467(1986)]으로 합성한다. 펩타이드(표 16)는 t-Boc-L-글리신-O-수지 에스테르(0.65mmole/g; 0.78mmol)로부터 출발하여 t-Boc-L-아미노산 유도체를 사용하여 합성한다. 커플링 및 탈차단반응은 유리 아미노 그룹에 대한 카이저 시험[참조: Kaiser et al., Anal. Biochem.34:595(1970)]에 의해 통상적으로 모니터한다. 단일 탈차단 및 임의의 이중 커플링 반응 단계는 본 연구에서 사용되는 모든 펩타이드의 합성을 위해 충분하다. 펩타이드 Gp-S49S는 GPBP의 영역 69-84로 한정되며 C-말단 글리신을 갖는다. 본 연구에서 사용된 GPBP 펩타이드의 잔기 수는 소 미엘린 기본 단백질에 대해 보고된 것에 상응한다[참조: Eylar et al., J. Biol. Chem. 246:5770(1971)].
트립토판을 함유하는 펩타이드는 우선 10% 피페리딘으로 30분 동안 처리하여 포르밀 차단 그룹을 제거한 다음 모든 기타 펩타이드 처럼 아니솔의 존재하에 0℃에서 HF로 처리하여 기타 측쇄 탈보호기와 함께 수지로부터 절단한다. HF를 제거한 후, 수지-펩타이드 혼합물을 에테르로 4회 세척하고 건조시킨다. 펩타이드를 물로 추출하고 동결건조하고 5% 아세트산으로 평형화되고 5% 아세트산으로 용출하는 세파텍스(Sephadex) G10 컬럼(2.5 x 100cm)을 통해 여과시킨다. 산 불용성 펩타이드를 0.03M 탄산암모늄과의 수지-펩타이드 혼합물로부터 추출하고 0.03M 중탄산암모늄으로 평형화하여 용출하는 세파덱스 G10 컬럼상에서 여과하고 동결건조시킨다. 펩타이드의 추가의 정제는 물중 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)를 함유하는 40% 이하의 아세토니트릴 선형 구배로 용출하는 본드팩(Bondpack) C18 컬럼을 사용한 HPLC를 60분 동안 하여 달성한다. 펩타이드의 순도는 HPLC 및 아미노산 조성 분석으로 제공한다.
2. 시험 및 대조군 펩타이드
TCR Vβ8(39-59) 펩타이드를 문헌[참조: Burns et al., J. Exp. Med.169:27(1989)]에 의해 확인된 서열에 따라 합성한다. TCR Vβ 유전자 군 특이성 및 CDR2 과가변 영역에 대한 대조군으로서, TCR Vβ14[Vβ14 유전자 군의 상응하는 CDR2를 포함함을 특징으로 한다[참조: Williams et al., J. Immunol. 142:1027(1989)] 및 펩타이드 TCR Vβ8(39-59)[참조: Burns et al., 상기 참조]에 인접한 CDR1 영역에 있는 서열에 상응하는 TCR Vβ8(25-41)을 포함하는 추가의 펩타이드를 합성한다. 기타 대조군 펩타이드는 GPBP의 특이 영역을 한정하는 계열을 포함한다. 펩타이드 Gp-S49S 및 Gp-S87-99는 각각 루이스 래트에 대한 주 및 부 뇌염 발생성 서열을 한정한다. 펩타이드 Gp-S67(잔기 69-81) 및 Gp-S53(잔기 75-84)은 펩타이드 Gp-S49S(잔기 69-84)내에 포함된 주 뇌염 발생성 에피토프내의 T 세포 및 B 세포를 각각 한정한다. 펩타이드 Gp-S55-74는 루이스 래트에서 비-뇌염발생성 T 세포 결정인자를 한정하고[참조: Offner et al., J. Exp. Med. 170:355(1989)] Gp-NAc-1-16은 마우스의 PL/J 균주에 대한 뇌염 발생성 서열을 포함한다[참조: Zamvil et al., Nature 324:258(1986)].
3. KLH에 대한 펩타이드 커플링
키홀 림펫 헤모시아닌(KLH; Calbiochem Corp., La Jolla, CA)을 인산염 완충염수(PSB)에 용해시키고 4℃에서 밤새 PBS에 대해 투석한 다음, 동결건조시킨다. KLH(8mg 또는 1-2μmol)를 커플링될 펩타이드(10μmol)와 함께 탈염수 1ml에 용해시킨다. 0.01N HCl을 사용하여 pH를 4.5로 조정한 후, 물 0.5ml중 1-에틸-3(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드(Pierce Chemical Co., Rockford, IL) 375mg을 가하고 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시킨다. 이어서 혼합물을 투석 백에 넣고 PBS를 3회 교체하면서 4℃에서 투석한 다음, 동결건조시킨다. KLH에 커플링된 펩타이드의 양은 KLH의 투석가능하지 않은 부분의 질량에 있어서의 증가분으로부터 산정한다.
4. 항-펩타이드 항체의 제조
체중 200 내지 250g의 수컷 루이스 래트를 단일 용량의 유리 펩타이드 100μg으로 면역화시킨다. 펩타이드를 완전 프로인트 보조제(CFA)에 유화시키고 피하 주사한다. 각각의 래트에 엠. 부티리쿰(M. butyricum) 100μg 및 펩타이드 100μg을 함유하는 유제 100μl를 공급한다. 유사하게, 루이스 래트를 특정 펩타이드 100μg으로 면역화시키고 동시에 또는 나중에 또다른 펩타이드를 주입한다. 면역화 전 및 면역화 후 간격을 두고 면역화시킨 래트의 꼬리정맥으로부터 미리 채혈한다.
체중 6 내지 7lb의 뉴질랜드 백색 토끼를 미리 채혈하고 펩타이드 4mg 및 엠. 부티리쿰 2mg을 함유하는 CFA 유제 0.5ml로 면역화시킨다. 유제를 꼬리 및 목의 척추 부분의 여러 위치에 피하 주사한다. 토끼를 유리 펩타이드 또는 KLH에 결합된 펩타이드로 면역화시킨다. 면역화시킨 토끼를 불완전 프로인트 보조제에 유화된 펩타이드 1mg으로 7,14 및 21일에 부스팅하고 옆구리에 피하 주사한다. 모든 토끼를 우리에 가두고 아세프로모진으로 진정시킨 후 귀정맥으로부터 채혈한다. 혈액량 감퇴증을 예방하기 위해 제거된 혈액량을 멸균 염수로 대체시킨다. 각각의래트 또는 토끼로부터의 혈청을 원심분리에 의해 응고혈로부터 준비한다. 모든 혈청을 56℃에서 30분 동안 보체를 제거시키고 소량으로 동결시킨 후 나트륨 아지드를 가한다.
5. 면역글로불린의 제조
IgG를 공지된 방법[참조: Steinbuch et al., Arch. Biochem, Biophys, 134:279(1969)]으로 혈청으로부터 제조하고 DEAE-세파덱스를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 혈청을 0.06M 아세테이트 완충제의 1용적으로 희석하고 pH를 실온에서 4.8로 조정한다. 혈청 100ml당 카프릴산 6.8g을 30분 동안 격렬히 교반하면서 적가한다. 이어서 혼합물을 원심 분리하고 상층액을 pH 5.7로 조정한 다음, 탈염수로 투석하고 동결건조시킨다.
6. 항체 검정
항체 반응성을 직접 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA)의 펩타이드에 대한 적응[참조: Hashim, G. A., et al., J. Neurosci. Res. 24:222(1989)] 및 문헌[참조: Cleveland, W. L., et al.,Method in Enzymol. 121:95(1986)]에 기술된 억제 ELISA에 의해 측정한다. 퍼옥시다제-표지된 토끼 항-래트 또는 염소 항-토끼 면역 글로불린[친화성-정제된 H 및 L 쇄, Cooper Biomedical, Malvern, PA]을 효소 기질 용으로 O-페닐렌디아민과 함께 사용하고, 광학 밀도를 비색계 플레이트 판독기(Model Vmax, Molecular Devices, Mento, CA)로 450 내지 650nm에서 측정한다.
7. EAE 유도
EAE를 문헌[참조: Hashim et al., J. Neurosci. Res. 24-222(1989)]에 기재된 바와 같이 수컷 루이스 래트(225 내지 250g)에서 유발시킨다. 각각의 래트에서 펩타이드 100μg 및 엠. 부티리쿰 100μg을 함유하는 CFA 유제를 단일 용량으로 피하 주사한다. 면역시킨 래트를 EAE의 임상 증세에 대해 매일 관찰하고 이어지는 25일과 30일 챌린지 사이에 종결한다. 이때, 각각의 래트로부터의 혈청을 수집하고 뇌 및 척수 조직을 조직학 용으로 처리한다.
8. 루이스 래트에서의 EAE의 예방 및 억제
수컷 루이스 래트를 CFA에 유화시킨 TCR Vβ8(39-59) 펩타이드 100μg으로 면역화시키고 피하 주사한다. 면역화시킨 래트의 꼬리에서 항체 측정용으로 채혈하고 뇌염발생성 펩타이드(Gp-S49S 또는 Gp-S87-99) 100μg으로 챌린지한다. 항-TCR Vβ8(39-59) 항체 생성의 관찰시간 과정을 기준으로, 래트 그룹을 면역화시킨 날 또는 면역 후 40 내지 41일째에 챌린지한다.
항-TCR Vβ8(39-59) 항체에 의한 EAE 억제를 연구하기 위해, 루이스 래트에 뇌염발생성 펩타이드 Gp-S49S를 챌린지하고, 14일 동안 격일로 염수(대조용) 또는 루이스 래트 또는 토끼 항-TCR Vβ8(39-59) IgG를 복막내 주사한다. 각각의 래트에게 래트 또는 토끼 IgG 총 49 또는 70mg 각각을 주입하고 챌린지한지 24일 후에종결한다. 14일 동안 멸균 염수를 주사한 경우, 주입 12 및 24일 후 수용체 래트의 순환에서 높은 수준으로 토끼 IgG가 잔류하며 항-Gp-S49S 항체 발생을 억제하지 않는다.
9. Vβ8+ 및 Vβ8- T 세포의 항체 염색
정상 또는 TCR Vβ8(39-59) 면역시킨 동물로부터 래트 또는 래비트 IgG(10μg)를 106개 정상 래트 흉선세포(통상 Vβ8-로 공지) 또는 Gp-S49S-반응성, GPBP-특이적 T 세포주(Vβ8+로 공지)과 함께 30분 동안 여러가지 농도로 배양한다. 수회 세척 후, 세포를 증폭 단계로서 10μg 마우스 항-래트 또는 항-래비트 IgG와 함께 추가의 30분 동안 배양한다. 추가로 세척한 후, 세포를 플루오레세인 처리된 염소 항-마우스 IgG(H + L 쇄 특이적)와 함께 염색시키고, 세척한 후, 2% 포르말린으로 고정시킨 다음 코울터 에픽스 C 세포형광그라프(Coulter Epics C Cytofluorograph)를 사용하여 488nm에서 형광 강도를 측정한다. 주 림프구 집단을 포함하는 전면 각 대 우측각 분산 패턴을 기준으로 하여 전자적으로 세포를 게이팅한 다음, FITC 형광성을 평가한다.
B. 결과
1. TCR Vβ8(39-59) 펩타이드 면역화에 의한 EAE의 예방
여러가지 뇌염발생성 에피토프에 의해 유발된 EAE 상의 항-TCR Vβ8(39-59)면역성의 예방 효과를 평가하기 위해서, 루이스 래트를 먼저 TCR Vβ8(39-59)로 면역화시키고 44일 후에 EAE를 Gp-S49S 또는 Gp S87-99로 유도한다. 표 17에서 나타난 바와 같이, TCR Vβ8(38-59) 펩타이드로 면역화시키면 Gp-S49S-유도된 EAE의 중증도가 현저히 감소되고 S87-99-유발된 EAE를 완전히 예방시킨다. 보호된 그룹 둘다에 있어서 조직학적 점수가 감소되었지만, CNS에서의 염증은 일반적으로 임상 파라미터보다 TCR Vβ8(39-59) 펩타이드 면역법에 의해 덜 영향 받는다.
2. TCR Vβ8(39-59) 펩타이드를 사용함 EAE의 억제
EAE의 억제를 평가하기 위해, TCR Vβ8(39-59) 펩타이드와 GPBP 또는 Gp-S49S의 뇌염발생성 용량을 동시에 주입한다. 표 17에서 나타난 바와 같이, TCR Vβ8(39-59) 펩타이드를 대부분의 래트에 있어서 GPBP-유발된 EAE를 예방하고 나머지 동물에서 임상적인 중증도를 현저히 감소시킨다. Gp-S49S-유발된 EAE를 사용하면 유사한 결과가 수득된다. 대조적으로, TCR Vβ14(39-59) 대조용 펩타이드는 EAE에 대한 억압 효과가 전혀 없다(표 17). 또한 EAE의 조직학적 증상은 임상 증상보다 TCR Vβ8(39-59) 면역화에 의해 비교적 덜 영향 받는다.
3. TCR Vβ8(39-59) 펩타이드에 대한 항체 반응
완전한 T 세포 클론에 대해 생성된 TCR Vβ8-특이적 항체[참조: Owhashi, M., et al., J. Exp. Med. 168-2153(1988); Gascoigne, M. R. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84-2936(1987); Kappler, J. W., et al., Nature332:35(1988); Kappler, J. W., et al., Cell 49:263(1987); MacDonald, H. R. et al., Nature 332:40(1988)]는 루이스 래트[참조: Owhashi et al., J. Exp. Med. 168:2153(1988)] 및 PL/J 마우스[참조: Acha-Orbea et al., Cell 54:263(1988)] 둘다에서 EAE의 예방 및 치료에 효능이 있는 것으로 입증되었다. 따라서 항체가 합성 TCR Vβ8(39-59) 펩타이드에 대해 생성될 수 있는지, 그 경우, 항체들은 임상적 유용성이 있는지의 여부를 측정하는 것이 매우 중요하다.
이러한 항체들은 실제로 생성되어 임상적으로 유효함이 밝혀졌다. TCR Vβ8(39-59)에 대한 항체는 CFA 중의 유리 펩타이드 100μg의 단일 주사후 7일째 루이스 래트의 혈청 중에서 검출한다(표 18 참조). 항체 반응에서 가변성이 매우 큰 것으로 관찰되었으나, 항체 역가는 시간에 경과에 따라 점차로 증가한다. TCR 펩타이드-면역화시킨 래트는 EAE의 증상을 전혀 나타내지 않았으며, 모두 41일의 관찰 기간에 걸쳐 건강한 상태를 유지했다.
유리 또는 KLH-결합된 TCR Vβ8(39-59) 펩타이드로 면역화시킨 래비트가 래트보다 항체 역가가 훨씬 크다(표 18 참조). 항체 역가는 1/320,000 이하의 희석에서 감지할만한 반응성을 나타내며 6개월 동안에 걸쳐 높은 상태를 유지한다.
4. 뇌염발생성 펩타이드 S49S에 대한 항체 반응
GPBP 또는 GP-S49S(잔기 69-84) 펩타이드로 루이스 래트를 면역화시키면 수개의 상이한 에피토프를 인지하는 항체가 유도되며, 이중 하나는 잔기 82-84(Asp-Glu-Asn)으로 이루어져 있고 Gp-S53(잔기 75-84)에 결합하는 항체에 의해입증된다[참조: Day et al., J. Neurosci. Res. 18:214(1987); Hashim, G. A., et al., J. Neurosci. Res. 17:375(1987)]. 이들 항체 반응은 T 세포에 좌우되는데, 이는 GP-S49S 펩타이드에 대해 특이적인 뇌염발생성 T 세포에 의해 제공될 수 있다. TCR Vβ8(39-59) 펩타이드를 사용한 면역화는 헬퍼 표현형의 Gp-S49S-특이적 T 세포에 의해 매개된 EAE를 예방하고 억압하지만, 항-S49S 항체 형성에 대한 이러한 면역화의 효과를 측정하는 것이 중요하다.
Gp-S49S에 대한 항체 반응을 CFA중 Gp-S49S를 사용한 면역화 후 7일 째에 검출한다(표 19 참조). 면역화된 래트를 주기적으로 채혈하면 그 다음 48일 동안 Gp-S49S 및 Gp-S53 둘다에 대한 항체 역가가 현저히 증가하며, 항-Gp-S53 반응은 EAE로부터의 진전 및 이후의 회수 후에만 나타난다.
TCR Vβ8(39-59)을 사용하여 EAE에 대한 예비 면역화 및 보호 후에, 26일째 Gp-S49S 및 Gp-S53에 대한 항체 반응은 TCR 펩타이드로 처리되지 않은 래트의 경우에서 보다 2 내지 4배 상승하였다(표 19). 유사하게, 항-S87-99 반응은 TCR Vβ8(39-59) 펩타이드로 보호되고 예비면역화시킨 래트에 있어서 4배 초과로 증가한다(표 19). 따라서, Vβ8+ T 세포에 대해 지시된 면역 반응은 GPBP의 수개의 독특한 B 세포 에피토프에 대한 항체 반응을 실제로 증가시킨다.
5. 항-펩타이드 항체의 특이성
수개의 항혈청의 특이성을 평가하기 위해서, 합성 TCR 및 GPBP 펩타이드의패널에 대한 결합을 평가한다. 결과(표 20)는 GP-S49S 및 그의 C-말단 단편 Gp-S53을 인지하는 항-Gp-S49 항혈청이 Gp-S49의 N-말단 단편(즉, Gp-S67), GPBP의 다른 부위 또는 TCR V 부위 펩타이드와 반응하지 않음을 나타낸다. 유사하게, TCR Vβ8(39-59) 펩타이드에 대한 래트 또는 토끼 항 혈청은 다른 TCR 서열[TCR Vβ8(25-41)상에 존재하는 3 중첩 잔기-AspMetGly-포함] 또는 GPBP 펩타이드가 아니라 면역원만을 인지한다. TCR Vβ8(39-59) 펩타이드와 Gp-S49S 또는 Gp-S87-99로 동시에 면역화시킨 래트로부터의 항혈청은 단일-면역화시킨 래트로부터의 항혈청과 면역원 각각에 대해 동일한 특이성을 입증해준다(표 15). TCR Vβ8(39-59) 및 Gp-S49S에 대한 항체 반응성의 특이성은 ElISA에 있어서 결합의 펩타이드 특이적, 용량 의존성 억제에 의해 확인된다(도 1).
6. Vβ8+ T 세포를 인지하는 TCR Vβ8(39-59)에 대한 항체
TCR Vβ8(39-59)에 대한 항체의 잠재적인 조절 효과를 해석하기 위해서, 펩타이드-특이적 항체가 Vβ8+ T 세포와 직접 상호작용하는지의 여부를 결정하는 것이 중요하다. 이러한 반응성을 평가하기 위해서, Vβ8+ 뇌염발생성 T 세포 또는 주로 Vβ8-인 정상 흉선 세포를 래트 또는 래비트 항-TCR Vβ8(39-59) IgG 항체, 이어서 마우스 항-래트 또는 항-토끼 촉진 항체, 및 플루오레세인-표지된 염소 항-마우스 IgG 항체와 함께 항온처리한다. 도 2에 도시된 바와 같이, KLH-결합된 TCR Vβ8(39-59) 펩타이드에 대해 생성된 토끼 IgG는, 정상 흉선 세포집단의 약 5%와대조적으로, 전체 Vβ8+ 뇌염발생성 T 세포 집단에 있어 형광 강도를 증가시킨다(90% 초과 포지티브 대 대조용 항혈청). 접합되지 않은 TCR 펩타이드에 대해 생성된 래트 IgG 및 래비트 IgG는, 또한 비록 강도는 작지만, Vβ8+ T 세포를 선택적으로 염색시킨다. 이러한 결과는 TCR Vβ8(39-59) 펩타이드가 Vβ8+ T 세포에 특이적으로 결합할 수 있음을 지시한다. 크롬 방출 또는 염료 배출에 의해 특정된 바와 같이, 항 혈청의 어떤 것도 보체의 존재하에는 Vβ8+ T 세포에 대해 세포 독성이 아니며 이는, 항체 결합이 세포를 사멸시키지 않고 T 세포의 작용을 변형시킴을 암시한다.
7. 항-TCR Vβ8(39-59) 항체를 사용한 EAE의 억제
TCR Vβ8(39-59)로 면역화시킨 루이스 래트는 EAE에 대해 보호될 뿐 아니라 면역 펩타이드에 대한 특이적 항체의 순환을 촉진시킨다. 조절 격감 EAE에 있어서의 이들 항체의 역할을 평가하기 위해서, 루이스 래트를 CFA중 GP-S49S로 챌린지한 다음, TCR Vβ8(39-59) 특이적 IgG(래트 또는 토끼)로 처리한다. 12일 동안 격일로 루이스 래트 IgG가 주입된 래트는 EAE의 임상 증상이 서서히 진전되었고 뇌에서 조직이 감소되었으나, 대조군에 비해 척수에 있어서의 병변은 더욱 확장되었다(표 21). 토끼 IgG가 주입된 래트는 최소한의 임상 증상이 진전되었고 조직학적 점수에 있어서의 변화는 거의 없었다(표 16). 따라서, 12일 기간 동안의 항-TCR Vβ8(39-59) 항체의 수동 투여는 EAE의 조직학적 증상이 아닌 임상적으로 억제한다.
C. 결론
여기에서 제시된 결과는 EAE의 유발을 억제할 수 있는 특이 항체를 유도하기 위한 합성적 TCR V-영역 펩타이드의 능력에 대한 제1 증거를 구성한다. 이들 TCR Vβ8(39-59) 펩타이드-특이적 항체는 전체의 완전한 TCR을 갖는 T 세포를 결합하여 이들을 용해시키지 않으면서 이들 세포의 기능을 변형시킬 수 있다. 실시예 I에 제시된 결과와 커플링시키는 경우, 이들 결과는, 항체 및 세포-매개된 면역 반응이 MBP의 에피토프에 반응하여 공통된 V 영역 유전자를 이용하는 뇌염발생성 T 림파구에 대한 독립적인 면역조절 작용을 제공할 수 있다는 것을 나타낸다. 조절 메카니즘 모두가 자가면역 질환의 임상적 표시의 유도에 대한 효능있는 예방 효과 및 억제 효과를 갖는다.
문헌[참조: Margalit et al. and Rothbard et al., 상기 참조]의 알고리듬에 기초한 양호한 T 세포 면역원인 것으로 예측되는, TCR Vβ8(39-59)이, 특히 래비트에서 효능있는 B 세포 면역원인 것으로 입증되었다. 항체는 면역화 펩타이드에 대해 고도로 특이적이며(직접 반응에 의해서 및 억제 검정에 의해서), 단지 Vβ8+ T 세포만을 염색시키고, Vβ8+ T 세포에 의해 매개되는 EAE를 억제한다.
결론적으로, 합성 펩타이드 TCR Vβ8(39-59)는 루이스 래트에서 T 세포 면역성과 항체 생성 모두를 유도하였다. T 세포와 항체 모두는, 단독으로 또는 함께, 뇌염발생성 챌린지에 대한 면역 반응을 조절할 수 있다. 조절 T 세포 및 보호 항체를 활성화시키는 이러한 TCR 펩타이드의 능력은 사람의 자가면역 질환을 조절하기 위한 이러한 접근법의 유용성을 입증한다.
모든 펩타이드는 방법란에서 기술된 바와 같이 고체상 방법으로 합성하고, 겔 여과 및 고압 액체 크로마토그래피로 정제하였다. TCR로부터의 펩타이드는 문헌[참조: Burns et al., 상기 참조 및 Williams et al., 상기 참조]에 따라 번호를 매기고, 기니아 피그 미엘린 기본 단백질(GPBP) 펩타이드는 문헌[참조: Eylar et al., J. Biol. Chem. 246:5770(1971)]에 따라 번호를 매겼다. 펩타이드 Gp-(S55-74)는 63 위치에 알라닌 치환으로 비천연 트레오닌을 갖는다.
루이스 래트의 그룹은 지정된 처리일('Imm')에 열거된 항원으로 면역화시켰다. 각각의 래트를 CFA중에 유화된 유리 펩타이드 100μg을 함유하는 0.1ml로 꼬리 기저부에 2회 피하주사하였다. 면역화된 래트를 지정일('Chall')에 뇌염발생성 GPBP(50μg), Gp-S49S(100μg) 또는 Gp-(S87-89)(100μg)으로 챌린지시키고, CFA중의 유액(0.1ml)로서 발바닥에 주사한다. 래트를 질환의 임상 표시에 대해 매일 조사한다. 챌린지 23 내지 26일 후 조직 구조를 조사하기 위해 조직을 취한다. 임상 스코어는 그룹당 모든 래버트의 평균이며, 표 11에 기술한 바와 같이 스코어를 매긴다. 임상 스코어의 범위는 괄호에 나타난다. 각각의 래트의 뇌(Br) 및척수(Sc)의 조직학 스코어는 뇌의 헤마톡실린-염색된 시상부 또는 척수의 전 길이에서의 병변의 수에 기초한 것으로 1=1 내지 2개의 병변, 2=3 내지 5개의 병변, 3=6 내지 8개의 병변 및 4=9개 이상의 병변이다.
숫컷 루이스 래트(225 내지 250g)을 CFA중의 TCR Vβ8(39-59) 100μg + 엠. 부트리쿰 100μg으로 피하 주입에 의해 챌린지한다. 챌린지 후 지정일에 각각의 래트의 꼬리 정맥으로부터 체혈한다. 래비트(blbs)는 물질 및 방법란에서 기술한 바와 같이 면역화한다. TCR Vβ8(39-59)에 대한 각각의 혈청의 항체 반응성을 직접적인 ELISA로 입증하고, 그룹당 각각의 혈청의 평균 반응성을 흡광 단위(x103)로 나타낸다. 그룹당 모든 항 혈청의 항체 반응성 범위는 ()안에 나타난다. 모든 혈청을 열-불활성화시키고, 플레이트된 펩타이드 25mg에 대한 검정전에 희석시킨다. 용어 '없음'은 EAE의 임상 표시가 완전히 없음을 나타낸다.
래트를 TCR Vβ8(39-59) 펩타이드 100μg으로 면역화시키거나 염수를 주사하고, 지정일에 CFA중에 엠. 브트리쿰 100μg을 포함하는 유액중의 Gp-S49S 또는 Gp(S87-99)를 피하로 챌린지시킨다. 래트에서 지정일에 채혈한다. TCR Vβ8(39-59)로 면역화시키고 Gp-S49S 또는 Gp(S87-99)로 챌린지된 그룹을 각각 감염 26일 및 21일 후에 종결시킨다. 각각의 혈청의 항체 반응성(펩타이드의 웰당 25ng 결합)을 직접적 ELISA로 측정한다. 결과는 450 내지 650nm에서의 평균 흡광도(x103)로 나타낸다(기저치는 자동적으로 보정시킴). 이론적 흡광도(괄호안에 나타냄)는 1:40 희석비에서 표준화되었다. 뒷다리 마비(HLP)가 불연속적으로 동반된다. 질환의 중증도에 의해서, Gp-S49S로 챌린지된 래트중 2마리가 각각 14일 및 18일에 절명하였다. 2 내지 3개의 샘플 그룹에서의 변화되는 5% 미만이었다.
루이스 래트를 프로인트 보조제(엠. 부티리쿰 100μg/래트)중의 Gp-S49S, TcR Vβ8(39-59) 또는 둘 모두 100μg로 피하 면역화시킨다. 항혈청을 면역화시킨지 54일 및 62일 사이에 제조하고, 고역가 항혈청 푸울을 2 내지 4개의 면역화된 래트로부터 제조한다. 래비트 항혈청을 KLH에 결합된 TCR 펩타이드로 면역화시킨지 43일째에 분리시킨다. 모든 항혈청을 57℃에서 30분 동안 열-불활성화시킨다. 지정 희석비에서 다양한 펩타이드 항원에 대한 항체 반응성을 표지된 래비트 항-래트 또는 염소 항-래비트 Ig(L+H)-퍼옥시다제를 사용하여 직접적 ELISA로 측정한다.나타낸 값은 450 내지 650nm(x103)에서의 흡광도 측정치이다. 모든 숫자는 플레이트된 펩타이드 부재하에서의 기저 반응성이 자동적으로 보정된 값이다. ()안의 수는 1:160 희석비에 대해 계산된 이론적 흡광치를 나타낸다.
루이스 래트의 발패드에 Gp-S49S 100μg 및 100μg의 엠 부티리쿰을 포함하는 유액 100μl를 주사하여 EAE를 유발시킨다. 유도개시 및 12일 동안 매일, 실험 그룹에 TcR V 8(39-59)로 면역화시킨 동물로부터의 래비트 IgG(6570 흡광 단위/mg의 IgG가 포함됨) 10mg 또는 루이스 래트 IgG(17 흡광 단위/mg의 IgG가 포함됨) 7mg을 투여한다. IgG를 멸균 염수에 용해시키고, 복강내 주사한다. 비-면역 래트 또는 래비트 IgG의 처리는 EAE의 경과에 영향을 미치지 않는다. 모든 동물을 EAE의 임상 표시에 대해 매일 조사하고, 지정일에 꼬리 정맥으로부터 채혈한다. 혈청을 직접적 ELISA로 TCR또는 GPBP 펩타이드에 대한 항체에 대해 시험한다(결과는 흡광도 x 10-3이다). 모든 동물을 EAE 유발 24일째에 절명시키고, 뇌(Br) 및 척수를 취하여 표 17의 설명에 기술된 바와 같이 조직학 평가를 수행한다.
실시예 VIII
질환 개시전 후에 Vβ8(39-59) 펩타이드로 처리된 래트에서의 임상적 EAE
GPBP로 EAE를 유발시킨후 다양한 시점에서 주입하여 질환 진행을 파괴시키는 피하(보존제중) 또는 피내(염수중)로 가해진 TCR Vβ8(39-59)의 능력을 시험한다(표 22). 실험 1에서, TCR 펩타이드를 10일(라인 2) 또는 발병시 그룹중의 래트가 처음으로 EAE의 임상 증상을 나타낼 때(라인 3 및 4) 투여한다. 두 경우 모두에서, 펩타이드 주사의 두 경로 모두로, 발병의 중증도 또는 발병 시간에서는 그렇지 않으나 질환의 지속 기간은 상당히 감소하였다. 보조제중의 피하 주사가 바람직한 것과 같이, 피내 경로를 통한 염수중의 펩타이드 효과가 사람의 치료요법에 특히 중요하다.
실험 2에서, TCR 펩타이드의 피내 투여시간은 용량과 같이 다양하다. 표 22에 나타난 바와 같이, 0일(EAE 유발일), 7일, 또는 14일에 투여된 펩타이드 50μg에 의해 질환의 지속 기간이 상당히 감소했다. 질환의 발병 지연도 또한 관측되었다. 더우기, 질환의 증상을 보이는 동물 비율(%)도 감소했다. 아마도 TCR에 대해생성된 면역 반응을 포함할 수 있는 펩타이드의 단기-과 적재에 의해서, 다용량의 펩타이드(200μg)가 저 용량보다 덜 효과적인 것으로 나타났다. 무관한 TCR에 상응하는 유사한 크기의 펩타이드로 처리시 EAE의 개시, 중증도 또는 발생에는 효과가 없었으나, 지속 기간은 다소 감소되었다(표 22의 마지막 라인).
실시예 IX
TCR 펩타이드 치료요법 받은 래트로부터의 LN 세포 및 TCR 펩타이드-선별된 T 세포주의 T 세포 반응
질환 유발 13일째에 EAE에 대해 TCR Vβ8(39-59) 펩타이드로 처리된 래트의 유출된 LN(슬와근)에서 T 세포의 증식 반응 및 특이성을 조사한다(표 23). 0일째에, 루이스 래트에게 이들의 뒷 발바닥내로 GP-BP+CFA SC의 EAE-유도 섭생을 투여한다. 13일에 3개의 그룹으로 나누어, 염수(컬럼 1), 뒷발 바닥에 TCR Vβ8(39-59) 펩타이드(+ CFA) 100μg의 피하 주사(컬럼 2) 또는 귀바퀴에 염수중의 TCR Vβ8(39-59) 50μg을 피내 주사한다. EAE 개시 약 7일후인 20일째에, 슬와근을 꺼내고, 지시된 항원 또는 유사분열 물질에 대한 반응으로 T 세포 증식 활성을 직접적으로 시험한다.
대조군으로부터의 LN 세포는 Con A, PPD, GPBP 및 GPBP(72-89) 및 GPBP(45-89)(이는 72-89 서열 및 다른 면역원성 펩타이드는 포함하나 뇌염발생성 펩타이드는 포함하지 않는다)에 최고로 반응하였다. 이와는 대조적으로, CFA중의 TCA 펩타이드를 피하로 주입시킨 래트로부터의 LN 세포는 GPBP 또는 BP 단편의 어떠한 것에도 유의한 증식 반응이 나타나지 않았다. TCR 펩타이드로 피내 처리된 래트로부터의 LN 세포는, GPBP(72-89)에 대한 반응의 감소를 제외하고는 대조군 세포와 유사하게 반응한다. 또한, 후자의 그룹은 GPBP(90-170)에 대한 반응 증가를 보였으나, 뇌염발생원성에 대해서는 알려지지 않았다. 이는, 에피토프 스위칭이 일어났다는 것을 나타낸다. 상기 3개 그룹의 LN 세포 각각의 분취량을 3일 동안 GPBP 또는TCR 펩타이드로 배양액중에서 자극시키고, 5일 동안 IL-2에서 세포를 증식시킨다. 이들 선별된 T 세포의 다양한 항원 및 유사분열 물질에 대한 증식 반응을 상기한 바와 같이 시험한다. 그 결과가 표 24에 나타나 있다.
대조군 T 세포(표 24, 컬럼 2)는 GPBP, GPBP(72-89), P1 및 래트 BP(CNS에서는 동종 인지를 나타냄)에 잘 반응하였다. 표의 마지막 라인은 이러한 그룹의 T 세포가 투여받지 않은 래트에 주입되는 경우, 뇌염발생원이라는 것을 나타낸다.
CFA중의 TCR 펩타이드로 피하 처리되고 GPBP를 갖는 배양액중에서 선별된 동물 그룹으로부터의 T 세포(컬럼 2)는 GPBP, GPBP(72-89) 및 래트 BP에 대해 반응했다. GPBP P1에 대한 반응은 GPBP(72-89) 에피토프에 대한 반응이 약하기 때문에 제2(비-뇌염발생성) 에지토프에 확실히 기인한다. TCR 펩타이드에 대한 강력한 반응은, 7일의 노출(이러한 펩타이드를 사용하여 추가로 선별하지 않음)이 항-TCR 펩타이드 면역성에 충분하다는 것을 나타낸다. 이들 세포가 EAE를 전달할 수 없다는 관측이 상당한 의미를 갖는데, 이는 뇌염발생성 클론이 GPBP 항원의 존재하에서 배양동안 선별될 수 없다는 것을 나타낸다.
GPBP로 보다는 TCR 펩타이드로 시험관내에서 자극되는 경우, 상기 TCR-면역화된 동물로부터의 세포(컬럼 3)은 TCR 펩타이드(및, 물론, T 세포 유사분열물질, Con A)에만 반응하는 것으로 나타났다.
마지막으로, TCR 펩타이드로 피내 처리되고 GPBP로 배양액 중에서 선별된 래트로부터의 세포(컬럼 4)는 대조군 세포와 실질적으로 유사하게 작용하였다. 즉, 이들은 GPBP(72-89) 뇌염발생성 에피토프를 인지하였고 EAE를 전달할 수 있었다.이는 뇌염발생 T 세포가 이러한 방식으로 처리된 래트에서 여전히 존재하고 배양물중에서 선별될 수 있다는 것을 나타낸다. 이는 TCR 펩타이드로 피내 처리된 래트에서 EAE의 감소된 지속 기간이(참조: 실시예 III 및 표 22) 유출된 LN 세포의 조절을 수반하지 않는다는 것을 제시한다. 그러나, 피내 주사 부위를 유출하는 LN(즉, 피내 주사가 귀바퀴인 경우 경부 LN)은 상이한 조절 특성을 나타낼 것이라는 것을 주목하는 것이 중요하다.
실시예 X
T 세포 수용체 V 영역 펩타이드를 사용한 실험적 자가면역 뇌척수염의 치료
미엘린 기본 단백질(MBP)로 래트 및 마우스를 면역화시키면 T 세포 수용체 V 영역 유전자의 제한된 레퍼토리를 발현하는 뇌염발생성 T 세포가 유도된다. 앞선 실시예들은, 대부분의 뇌염발생성 래트 T 세포에 의해 공유되는 Vβ8 서열로 부터의 합성 펩타이드가 특정 조절 T 세포 및 항체를 자극시켜 EAE에 대한 보호를 유도한다는 것을 입증한다. 본 실시예에서는, Vβ8 서열의 39-59 잔기에 상응하고 제2 상보성 결정 영역을 포함하는 동일한 TCR 펩타이드가 EAE에 대한 치료요법으로서 매우 효과적이라는 것을 입증한다.
TCR Vβ8-39-59 펩타이드는 경증의 EAE를 갖는 래트에 완전 프로인트 보조제중에 적량으로 주어지는 경우, 질환의 진행을 막고 경로를 상당히 단축시킨다. TCR 펩타이드를 귀에 피내로 주사하는 경우, 그 효과는 1일 동안 지연되나, 다시 임상 증상이 빠르게 진행된다. 처리된 래트로부터의 MBP-선별된 T 세포주는 MBP에 저조하게 반응하나, TCR 펩타이드에 대한 반응성은 보유하며 정상의 수용체에는 전달하지 못했다. TCR 펩타이드의 신속한 임상 효과는, EAE 진행에 반응하여 유발되는 기존 조절 네트워크의 트리거링을 제시하였다. 이러한 개념을 지지하게, EAE를 겪는 비처리된 래트에서 T 세포가 TCR 펩타이드를 인지하는 본 실시예로 직접적 증거가 제시된다.
A. 물질 및 방법
동물: 6 내지 8주된 암컷 루이스 래트를 Harlan Sprague Dawley(Indianapolis, IN)로부터 구입한다. 래트를 가두고 연방 및 기관의 지침에 따라 포틀랜드 VAMC 애니 및 리소스 퍼실리티(Portland VAMC Animal Resource Facility)에서 기른다.
항원: 에일러 방법에 따라 Gp- 또는 Rt-MBP를 추출 및 정제한다[참조: Eylar, E. H., et al., J. Biol. Chem. 246: 5770(1971)]. 잔기 1-37, 43-89 및 90-169을 함유하는 GP-MBP의 효소 분해 단편, 잔기 72-89에 상응하는 GP-MBP의 합성 펩타이드 및 TCR Vβ8 및 TCR Vβ14의 39-59 잔기에 상응하는 합성 펩타이드를합성하고 전술한 바와 같이[참조: Vandenbark et al., Nature 341:541(1989); Eylar et al., J. Biol. Chem. 246:5770(1971)] 합성 및 정제한다. 이들 펩타이드는 고압 액체 크로마토그래피 분석으로 90% 이상의 순도를 갖는다.
임상 프로토콜: EAE는 모든 실험에서 100μg의 열사멸시킨 엠. 튜베르쿨로시스 H37RA(DIFCO 제조, 디트로이트, 마이애미)를 함유하는 완전 프로인트 보조제중의 50μg의 GP-MBP를 한쪽 뒷다리 발바닥에 1회 피하주사하여 유발시킨다. 예방 프로토콜에서, EAE 유발 40일 전에, 100μg의 엠. 튜베르쿨로시스를 함유하는 CFA중의 100μg의 TCR Vβ8-39-59 또는 TCR Vβ14-39-59를 한쪽 뒷다리 발바닥에 피하 주사한다. 억제 프로토콜에서는, TCR 펩타이드를 동시에 주입하거나(CFA중 100μg 또는 0.1ml 염수중 50μg을 귀에 피하주사), GP-MBP 챌린지 7일(피내), 또는 11일(피내) 후에 주사한다. 치료 프로토콜의 경우는, EAE의 임상적 증상이 나타나는 첫날에 TCR 펩타이드를 CFA중에서 피하로 또는 귀에 피내 주사한다(일반적으로는 GP-MBP 시도후 12일째). 매일, 0 내지 4 범위의 스케일, 여기에서 0은 징후가 없음, 1은 꼬리 내림, 2는 뒷다리 약화, 운동실조, 3은 후지부 마비, 4는 전, 후지 마비의 반신 상태로 나타내는 스코어를 써서 EAE에 대한 임상적 증상을 표시한다. 처리 그룹과 대조 그룹은 스튜던트의 쌍을 이루지 않은 t 시험법을 써서 최대 질환 증증도 및 임상적 증상 지속시간에 대해 비교한다. 지연형 과감각반응성은 50μg의 항원을 피내 주사한 24 내지 48시간 후에 귀부종 검정[참조: Offner, H., et al., J. Exper. Med. 170:355(1989)]을 써서 측정한다. 전술[참조:Vandenbark et al., J. Immunol. 135:223(1985)]한 바와 같이, GP-MBP-특이적 T 세포주를 TCR 펩타이드 처리된 래트 및 미처리된 래트로부터 선별한다. GP-MBP 활성화된 100만개의 세포주를 뇌염발생능에 대해 시험하기 위해 투여받지 않은 래트에게 복강내 주사로 전달하고, 능동적으로 유발된 EAE에 대해 전술한 바와 같이 스코어를 매긴다.
림프구 증식: T 세포의 활성화는3H-티미딘 흡수로 측정한다. 100만개의 조사된 흉선 보조세포 존재하에 0.5μBq 표지된 티미딘 첨가전에 500,000개의 임파절 세포 또는 20,000개의 세포주를 18시간 동안 미세역가 웰중에서 배양 배지 및 항원과 배양한다. 세포 배양물을 유리 섬유 필터상에 수거하고 액체 신틸레이션법을 써서 카운팅한다. 3회 배양으로부터 평균 CPM을 계산한다. 2회 배양물로부터의 표준편차(SD)는 평균값으로 부터 <10%로 다양했다.
B. 결과
EAE에 대한 TCR 펩타이드의 조절 효과를 평가하기 위해, 뇌염발생성 유액 GP-MBP/CFA를 주입하기 전, 주입과 동시에 또는 주입 후에 Vβ8-39-59, 대조군 펩타이드 Vβ14-39-59 또는 염수를 주사한다. 가장 효과적인 예방, 억제, 및 치료 프로토콜의 일일 평균 임상적 스코어 값은 제3 내지 5도에 나타냈으며, 시험전 모든 그룹은 표 25에 요약하였다.
TCR/CFA의 임상 효과:GP-MBP로 챌린지하기 40일 전에 CFA중의 Vβ8-39-59 펩타이드의 주입은 임상적 EAE에 대한 완전한 예방을 유도한다(도 3 참조). 또한, 뇌염발생성 유액과 CFA중 펩타이드의 동시 주입은 EAE를 억제하고, 임상적 질환의 발생율(처리 그룹에서의 8/13 대 대조군에서의 26/26), 중증도(1.3 대 3.4의 스코어) 및 지속기간(2.0 대 6.6일)을 감소시킨다(참조, 도 3, 표 25). EAE 유발 40일전 또는 이와 동시에 CFA중의 Vβ14-39-59 또는 CFA 단독을 래트에게 주사하면 EAE가 발생되고 이는 대조군의 경우와 거의 구별되지 않는다(표 25 참조).
치료적 효과를 평가하기 위해, CFA중의 TCR Vβ8-39-59 펩타이드를 첫째날 또는 임상적 증상 시초에 래트에 피하 주사한다. 이 처리 시기의 래트는 후지 약화, 운동실조 및 실금을 나타낸다(1.8의 평균 등급). 도 3에 나타낸 바와 같이, TCR 펩타이드/CFA 처리는 임상적 증상의 추가 진행을 방지하고 EAE의 지속기를 6.6일(대조군)에서 3.5일로 단축시킨다. TCR Vβ14-39-59/CFA 또는 CFA 단독 처리는 임상 EAE에 효과가 없다(표 25 참조).
피내 주사한 TCR 펩타이드의 임상적 효과:CFA 사용을 피하기 위해, TCR 펩타이드의 염수 용액을 귀에 피내 투여함으로써 EAE에 대한 효과에 대해 평가한다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 뇌염발생성 챌린지와 동시(0일) 또는 챌린지한지 7일 또는 11일 후 50μg의 TCR 펩타이드의 피내 투여는, 모두가 EAE에 대해 유사한 억제효과, 최대 임상적 증증도의 3.4에서 1.7 내지 1.8로의 감소 및 EAE 지속기의 6.6일에서 3 내지 4일로의 단축등을 나타냈다(표 27 참조).
임상적 증상이 나타난 첫날에 TCR 펩타이드를 주사하면(평균 임상학적 스코어 1.9), 첫째날 동안에는 EAE에 대한 임상학적 효과가 관찰되지 않으나, 그 후일 동안에는 EAE의 심각성이 대조군에 비해 현저하게 감소한다(도 5 참조). TCR 펩타이드의 50μg/래트 투여량은, 대조군의 6.6일과 비교하여, 낮은 10μg/래트 펩타이드 투여량(4.0일) 보다 신속한(3.1일) EAE 완화를 유도한다.
임상학적 EAE를 완화시키는 TCR Vβ8-39-59 펩타이드의 신속한 효과는 펩타이드에 의한 치료가, 최초에는 EAE에 반응하여 유도되는, TCR에 대한 리콜(recall) 반응을 트리거링시킴을 암시하고 있다. 생체내에서 이 가능성을 입증하기 위해, GP-MBP/CFA로 유발된 EAE를 겪었거나 이로 부터 회복된 래트(TCR 펩타이드에 사전 노출됨이 없이)는 Vβ8 펩타이드에 대해서는 현저한 DTH 반응성(투여받지 않은 래트 또는 CFA 면역화된 래트와 비교하여 p<0.001)을 가지나, Vβ14 펩타이드에 대해서는 그렇지 않다(표 26 참조). EAE를 앓는 래트에서 Vβ8 펩타이드에 대한 반응성의 크기는, CFA중 보호량 범위의 TCR 펩타이드로 이미 면역화시킨 래트에서의 반응과 비교하여 납득할만하게 낮다(표 26 참조).
보호시킨 래트에서의 T 세포 반응:T 세포 반응에 대한 TCR Vβ8 펩타이드 치료요법의 효과를 평가하기 위해, GP-MBP/CFA 주입 부위를 유출시키는 임파절 세포(LNC)를 항원-유도된 증식에 대해 시험한 후, T 세포주내로 확장시킨다. 표 27에 나타낸 바와 같이, TCR Vβ8-39-59로 처리한 래트로 부터의 LNC는 고수준의 증식 기저치(47,000CPM)를 가지며 GP-MBP 및 다른 시험 항원에 대해 유사한 반응성을 갖는다. GP-MBP(MBP/lst)로 선별한 T 세포주는 선별 항원에 약하게 반응하며 모든 Rt-MBP 및 GP-S72-89에 반응하지 않는다. 이 세포주의 가장 높은 반응성은 TCR Vβ8-39-59 펩타이드에 대한 것이었다. 약한 GP-MBP 인지와 강한 TCR 반응을 놓고 볼 때, T 세포주는 투여받지 않은 래트에게 임상적 EAE 증상을 전달하지 못한다는 사실이 놀랄만한 것은 아니다(표 27 참조). GP-MBP 및 기타 항원에 대한 높은 TCR 반응 및 낮은 반응성의 유사한 패턴 또한 TCR Vβ8-39-59로 선별해낸 T 세포주(Vβ8/1st)에서도 관찰된다(표 27 참조).
이와 달리, 처리안한 EAE-회복 래트로부터의 LNC는 예측가능하게 GP-MBP, Rt-MBP 및 GP-S72-89와 반응한다(표 27 참조). 그러나, 놀랍게도, 이런 LNC 역시 TCR Vβ8-39-59 펩타이드에 반응하며 TCR Vβ14-39-59 펩타이드에 대해서는 낮은 정도로 반응한다. GP-MBP로 선별하면, 생성되는 T 세포주는 MBP 에피토프와 강하게 반응하며, TCR Vβ8 펩타이드에 대한 저 수준의 잔류활성에도 불구하고 다수의 임상적 EAE를 투여받지 않은 수용체에 전달한다(표 27 참조). TCR Vβ8 펩타이드로 추가 선별하게 되면, 비록 GP-MBP 및 S72-89에 대한 낮은 수준의 반응성이 지소되긴 하지만, 이 TCR 펩타이드에 대한 특이적 반응은 증폭되게 된다. TCR Vβ14 펩타이드에 의한 추가의 선별은 단지 Vβ14 반응성 T 세포만을 증폭시키게 된다. 따라서, 두 TCR-선택된 세포주에서, 반응 패턴은 EAE-회복된 래트의 LN으로부터 TCR 반응성 T 세포의 존재를 입증해주게 된다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 각각의TCR 펩타이드/CFA로 예비면역화시킨 동물체에서 강한 DTH 및 증식성 반응이 관찰된다. TCR Vβ8-Vβ14 펩타이드로 예비면역화시킨 래트는 후속 GP-MBP/CFA의 챌린지로부터 보호된다. 합성 펩타이드로 면역화된 바 없는 EAE로부터 회복된 래트에서도 관찰되는 TCR Vβ8-펩타이드에 대한 현저한 DTH 및 강한 증식 반응은 TCR Vβ8-펩타이드에 대한 자연적 조절 반응이 EAE 질환 진행 결과로서 유도된 것임을 나타낸다.
추가로 널리 공지된 MS 모델은 마우스에서의 EAE이며, 이는, 래트와 달리, 임상적 진행이 재발되는 것을 특징으로 한다. 6마리 SJL/J 마우스의 그룹에게 CFA중의 프로테오리피드단백질(PLP)의 139-151 펩타이드를 주사한다. 임상적 증상 개시 첫째 날에(14일째), 정맥내, 피내내 또는 피하 투여로 TCR Vβ17 서열의 1-17 잔기에 상응하는 50μg의 합성 펩타이드를 마우스에 주입한다. 도 9에 나타낸 바와 같이, TCR 펩타이드의 피하 또는 피내 주사 모두는 초기에 질환의 중증도를 경감시키고 초기 에피소드에 있어서 및 EAE 지연에 있어서 질환 지속시간을 단축시킨다.
C. 토의
이 예는 EAE에서의 TCR Vβ8-39-59 펩타이드의 치료학적 투여 효과를 분명하게 입증하는 것으로서, 이는 EAE의 예방과 억제에서 TCR 펩타이드의 유효성을 입증한 선행의 예와 일치한다. 신속한 임상적 효과 뿐만 아니라, TCR 펩타이드에 대한 DTH 및 림프구 증식 반응은 TCR Vβ8 펩타이드에 대한 T 세포 반응이 합성 펩타이드에 의해 고의로 면역화된 바 없는 EAE 상태의 래트중에 이미 존재함을 나타낸다.
CFA에서 GP-MBP 챌린지 40일 전에 Vβ8 펩타이드를 사용한 예비면역화가 시험된 가장 유효한 프로토콜이다(도 3 및 표 25 참조). 이 면역화 기간이 보호성 T 세포 및 TCR Vβ8 펩타이드에 대한 항체 모두의 유도에 최적인 것이 분명하다. GP-MBP 챌린지와 동시에 TCR Vβ8 펩타이드를 주입하는 것은 예비 면역화보다 덜 보호적이나, 이 프로토콜은 30%(6/19) 이상의 래트에서 여전히 EAE의 임상적 증상을 완전하게 억제한다(표 25 참조). 나머지에서도, EAE의 임상적 경과는 짧고 온미하다. GP-MBP 챌린지후, 임상적 EAE의 발생전 TCR Vβ8 펩타이드의 주입 또한 효과적이며, 19마리중 4마리의 래트에서 EAE의 발생을 완벽하게 예방했으며 나머지에서는 일반적으로 질환의 중증도와 지속기를 감소시켰다(표 25 참조).
이 예의 놀랄만한 측면은 병에 걸린 동물체에 주입한 TCR Vβ8 펩타이드의 거의 즉각적인 임상적 효과이다. TCR 펩타이드 요법을 투여받은 모든 래트는 대조군보다 신속하게 EAE로부터 회복된다. CFA중의 TCR 펩타이드를 주입한 것들은 회복전에 임상적으로 악화되지 않았다. TCR 펩타이드를 피내 투여받은 것들은 첫번째 날에 임상적 악화가 나타났으나, 그후 TCA/CFA 주입 래트에서와 같이 신속하게 회복되었다. 10μg 및 50μg의 펩타이드 투여량 모두가 신속하게 회복을 나타냈으나, 고 투여량은 저 투여량에 비해 하루정도 빠른 EAE 회복을 나타냈다.
TCR 펩타이드 치료요법은 GP-MBP의 뇌염발생성 결정인자에 대한 T 세포 반응을 하향-조절(down-regulating)함으로써 효과적인 것으로 보인다. GP-MBP-챌린지된, TCR 펩타이드-처리한 래트로부터의 임파절 세포는 현저한 수준의 증식성 세포를 가지나 특이적 BP 반응은 없다(표 27 참조). 그러나, GP-MBP 및 TCR Vβ8 펩타이드의 존재하에(단, TCR Vβ14 펩타이드 없이) 증식시킨, GP-MBP로 선별해낸 T 세포주는 작용기와 조절성 T 세포 특이성의 존재를 나타낸준다. 이 세포 혼합물이 EAE를 전달할 수 없는 것은 GP-MBP 반응성 세포(순 12,000CPM) 또는 S72-89 반응성 세포(순 3,000CPM)에 대한 TCR Vβ8 반응성 세포(순 49,000CPM)의 뚜렷한 우성에 기인하는 것으로 보인다. 이와 달리, TCR Vβ8 펩타이드로 처리하지는 않고 GP-MBP로 초기에 챌린지시킨 EAE-회복 래트로부터의 LNC는 GP-MBP, Rt-MBP 및 S72-89를 인지하며, 약한 정도이긴 하지만 TCR Vβ8 및 Vβ14 펩타이드도 인지한다(표 27 참조). GP-MBP로 선별해낸 T 세포주는, 가장 적당하게는, TCR Vβ8-반응성 T 세포(순 9,000CPM)에 대한 GP-MBP-반응 T 세포(순 84,000CPM)의 우성에 기인하여 고도로 뇌염발생적인 것으로 보인다. GP-MBP로 선별해낸 세포주중 TCR Vβ8-펩타이드-반응성 T 세포의 존속을 전형적으로 모든 다른 항원에 대한 반응을 상실한 하나의 항원으로 선택한 T 세포주에서는 약간 비정상적이다. GP-MBP와 TCR-Vβ8 펩타이드사이에 어떠한 교차-반응성도 검출된 바 없다.
루이스 래트는 MBP/CFA로 EAE가 유도되었을 때 재발하지 않는다. 물론 이같은 EAE의 단상적 경로가 재발성 질환에 있어 TCR Vβ8-39-59 펩타이드 치료요법의 시험을 허용하지는 않으나, 이 종류에서의 강한 회복 메카니즘이 TCR Vβ8 펩타이드에 대한 면역 반응을 포함할 때 이를 측정할 기회를 제공하게 된다. MBP의 어느 뇌염발생성 결정인자(72-84 또는 87-99 서열)에 반응하는 레비스 레트 T 세포는 이들의 TCR에서 Vα2/Vβ8 유전자 조합을 우선적으로 사용한다. 살아있거나 약독화시킨 뇌염발생성 T 세포의 주입은 EAE에 대한 보호 뿐만 아니라 이디오타입(idiotype) 및 '에르고타입: (ergotype)' 반응성을 유도할 수 있다. EAE중에 유도된 뇌염발생성 T 세포의 빈도 증가는 조절 네트워크를 교란시키는 동일한 효과를 가지며, 이 네트워크의 적어도 일부분이 자연적으로 TCR Vβ8-39-59 서열에서 지시되고 있다는 것을 확신할 수 있다.
이 데이타는 이 주장을 지지한다. TCR Vβ8 펩타이드를 피내 투여한 병중인 래트 또는 회복된 래트는 이 펩타이드에 대해 작지만 뚜렷한 DTH 반응을 나타내지만, 상응하는 Vβ14 펩타이드에는 DTH가 없다(표 26). 또한, 회복된 래트로부터의 림파절 세포는 Vβ8 TCR 펩타이드에 대해 반응이 더 좋고, 펩타이드에 특이적인 T 세포는 시험관내 선택 기술에 의해 풍부해질 수 있다(표 27). 이러한 발견들은 면역성이 뇌염발생성 T 세포에 의해 발현되는 TCR Vβ8-39-59 서열로 천연 유도된다는 직접적인 증거이다. 그러나, 이는 TCR α 또는 β 쇄내의 기타 서열이 또한 조절성 T 세포 및 항체를 유도하기 때문에 TCR에 대해서만 중요한 결정인자가 될 수 없다. TCR Vβ8-39-59 영역의 보호, 억제 및 치료 효과는 EAE의 이디오타입 조절에 대한 결정인자로서의 이의 중요성을 명백히 입증한다.
또한, 2가지 형태의 EAE 임상 과정을 거친 SJL/J 마우스에 대한 데이타는 임상적 징후가 나타난 초기에 TCR Vβ17 펩타이드를 투여한 결과 초기 에피소드와 재발 모두 동안에 징후의 중증도 및 기간이 감소됨을 나타낸다. 이는 TCR V 영역 펩타이드가 EAE에 의해 모델화된 자동면역 질환의 치료 방법으로서 중요함을 추가로지지한다.
DTH 반응을 TCR 펩타이드에 노출시키기 전 투여받지 않은 루이스 래트 또는 GP-BP/CFA 또는 염수/CFA로 면역화시킨 래트로 평가한다. 유사하게, TCR Vβ8-39-59/CFA 또는 TCR Vβ14-39-59/CFA로 면역화시킨 래트를 펩타이드로 시험한다. 귀 팽윤 반응(DTH)을 피내 주사한지 48시간 후에 측정한다. 괄호안의 숫자는 시험된 동물수를 나타낸다.
실시예 XI
SJL/J 마우스에서의 PLP-유도된 EAE의 TCR 치료
SJL/J 마우스에서, 139-151 잔기를 포함하는 PLP 펩타이드는 CNS 전체에서 우성 결정인자이고 중증의 EAE를 재발시킨다. 미엘린 기본 단백질에 대한 반응으로 다른 설치류에 의해 우선적으로 사용되는 Vβ8을 포함하여, 병원성 Vβ 유전자의 거의 반이 이 마우스류에서 결실된다. 그러므로, 보다 덜 치우치면서 뇌염발생성 T 세포에 의해 사용되는 각종의 다른 V 유전자가 존재한다.
PLP139-151펩타이드에 대해 특이적인 뇌염발생성 T 세포주에 사용되는 TCR V 유전자의 분석으로 Vβ2, Vβ4 및 Vβ17의 존재가 드러났고, 라인으로 부터 수득된 클론이 V 영역 유전자를 발현시킴을 밝혀냈다. 이를 근거로, SJL/J 마우스를 임상적 증상이 나타난 첫날에 100μg의 Vβ4 펩타이드(잔기 42-63), 100μg의 Vβ17 펩타이드(잔기 1-17) 또는 100μg의 두 펩타이드 모두로 피하 처리한다(도 15). Vβ4 또는 Vβ17 펩타이드로 치료된 마우스는 초기에 질환의 심각도가 덜하지만, 남은 임상 과정동안 비치료 대조군과 유사하다. Vβ4와 Vβ17 모두로 치료된 마우스는 대조군이 심각한 EAE로 진행되는 시간 동안 임상적으로 진행되지 않는다. 이후, 이 그룹은 대조군보다 질환이 현저히 경증인 상태로 유지된다(도 15).
이들 데이타는 다중 V 영역 유전자가 뇌염발생성 T 세포 반응에 포함될 경우, TCR V 영역 펩타이드의 콕테일이 단일 펩타이드보다 효과적임을 확실히 증명한다. 그러므로, 강력한 뇌염발생성 분자에 대한 반응에 과용된 TCR V 영역 펩타이드 혼합물로 다발성 경화증과 같은 사람 질환을 치료하면 단일 펩타이드로 치료하는 것보다 효과적일 수 있다. 이러한 발견들은 두 가지의 상이한 V 유전자(Vβ5.2및 6.1)가 MS 환자로부터의 BP-반응성 T 세포에 의해 과용되는 실시예 XI에서의 증명을 근거로 할때 특히 중요하고 확실한 것이다.
실시예 XII
EAE에 대한 보호
루이스 래트에서의 실험적 자동면역 뇌척수염(EAE)은 가장 공지된 염기성 단백질(BP)인 중추신경계(CNS) 미엘린 단백질에 특이적인 T 림프구에 의해 매개되는 단상 자기제한 마비 질환이다[참조: Vandenbark et al., Prog, Clin. and Biolog. Res. 336:93(1990)]. 기니아 피그(Gp)-BP를 사용한 면역화는, (i) Gp-BP의 72-89 아미노산 단편에 대해 배양액 중에서 현저히 반응하고[참조: Vandenbark et al., J. Immunol. 135:229; Offner, H., et al., J. Immunol. 141:3828; and Chou et al., J. Neurosci. Res. 22:181], (ii) 이들의 T 세포 수용체(TCR)에 변이 영역 Vα2 및 Vβ8.2를 발현시키며[참조: Burns et al., J. Exp. Med. 169:27-39] (iii) EAE의 마비 증상을 제2 수용체로 양자적 전이시키는[참조: Chou et al., J. Neurosci. Res. 22:181] T 세포 아집단이 10일 후에 나타난다. 조사 또는 정수압에 의해 약독화된, 이러한 특성을 갖는 T 세포는 활성적으로 유도된 EAE에 대해 보호 내성을 유발하는 백신으로서 효과적으로 사용할 수 있다[참조: Cohen et al., In Progressin Immunology-6. Proceedings of the 6th lnternational Congress of Immunology Academic Press, New York, pp. 1-13 and Offner et al., J. Neuroimmunol. 21:13]. 질환에 대한 이 유도 내성의 기초에는 질환을 일으키는 세포의 면역원성 TCR 에피토프에 대해 지시된, 숙주에 의한 활성 자가-조절 면역 반응을 포함하는 것으로 간주된다[참조: Vandenbark et al., Nature 341:541; Hashim, et al., J. Immunol. 144:4621; Offner et al., Prog. Clin. Biolog. Res. 336:93(1990) and Howell et al., Science 246: 668].
Gp-BP를 사용하여 면역한지 14일내 EAE로 부터 회복되기 바로 직전에, 추가의 T 세포 아집단이 말초신경에는 나타나지만[참조: Offner et al., J. Exp. Med. 170:355(1984)], CNS에는 나타나지 않는다. 이 아집단은 (i) Gp-BP의 다른 펩타이드 단편 43-67과 반응하고, (ii) 상이한 TCR Vβ 가변 영역 유전자를 발현시키며, (iii) 아집단의 T 세포가 잔기 60 근처에 광범위한 서열 변이를 함유하는 래트(Rt)-BP를 인지하지 못하기 때문에 래트에서 뇌염을 유발하지 않는다[참조: Alvord et al., In Experimental Allergic Encephalomyelitis: A Useful Model for Multiple Sclerosis. Alan R. Liss, Inc., NY, 146:523-537]. 일반적인 예중 특히 흥미가 있는 것은 이 집단으로부터 최근 분리된 T 세포 클론인, 클론 C4는 Gp-BP 43-67에 반응성이고 그 자체가 비-뇌염 유발성이며 Gp-BP 72-89에 반응성인 다른 클론에 의해 유발되는 EAE에 대해 보호 내성을 유도한다는 것이다. 이 클론은 동일한 분자의 상이한 에피토프에 대해 특이적인 다른 클론의 뇌염유발 활성을 하향 조절할 수 있는 자동-항원 특이 클론의 제1 전사를 나타내기 때문에 중요하다.
이 예는 EAE에 대한 내성을 유도할 수 있는 클론 C455-69를 통한 메카니즘을 보다 잘 이해하려고 했던 연구의 결과이다. 최근 EAE로부터 회복된 래트로부터 기원한 3가지의 상이한 Gp-BP 특이 T 세포 클론의 특이성 및 TCR Vβ 서열을 비교한다: Gp-BP 72-89 및 뇌염유발성인 클론 C3; 비-뇌염유발성이지만 EAE에 대한 내성을 유발할 수 있는 클론 C455-69및 Gp-BP에는 반응성인 클론이지만 Gp-BP의 3가지 주요 효소적 분해 단편중 어느 것도 아닌 클론 C5. 이 예는 잔기 55-69가 Gp-BP의 보호 에피토프로서 작용함을 보다 자세히 나타내고, 이 예는 또한 이들 3가지의 상이한 Gp-BP 반응성 T 세포 클론에 의해 발현된 TCR Vβ쇄 서열을 강조하며, 클론 C4의 EAE 보호 효과가 대부분의 BP 72-89 특이적 뇌염발생성 T 세포에 의해 공유된 TCR 에피토프에 대한 교차 반응 면역성을 유도하는 이의 능력에 좌우됨을 나타낸다.
물질 및 방법
동물: 루이스 암컷 래트(6 내지 8주된 것)를 할란 스프라그 돌리(Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN)로부터 구입하고, 우리에 가든 다음 연구 지침에 따라 포틀랜드 VAMC에서 동물 자원 시설(Animal Resource Facility)로 돌본다.
항원: Gp- 및 Rt-BP를 문헌[참조: Eylar et al., J. Biol. Chem. 246:5770]의 방법에 따라 제조한다. Gp-BP의 단백질분해성 분해 단편을 수득하고, 상기한 문헌[참조: Chou et al., J. Neurochem. 28:115]대로 이온 교환 크로마토그라피하여 목적한 펩타이드를 95% 이상 함유하도록 정제한다. 합성 MBP 펩타이드를 고체상 기술[참조: Hashim et al., J. Neurosci, Res. 16:467]로 제조하고 소 BP 서열에 따라 번호매김한다[참조: Vandenbark et al., J. Immunol. 135:223(1985)].
T 세포주 및 클론의 선택: T 세포주를, EAE로부터 회복된 후 Gp-BP/CFA로 면역화된 래트의 림프절을 유출시키므로써 상기 문헌[참조: Vandenbark et al., J. Immunol. 135:223]대로 선택한다. Con A 자극된 루이스 래트 비세포로부터의 상층액을 항원 자극된 T 세포를 증식시키는데 사용되는 IL-2의 원료로서 사용한다.
T 세포주는 상기한 대로 제한희석함으로써 클로닝시킨다[참조: Aalvord et al., In Experimental Allergic Encephalomyelitis; A Useful Model for Multiple Sclerosis, 146:523-537(1984)]. BP로 자극한 후, 세포를 성장 배지 0.2ml중에서 웰당 4, 2, 1 및 0.5 세포의 밀도로 환저 마이크로티터 웰에 넣고 37℃ 및 7% CO2중에서 배양한다. 7일 후, 세포를 항원 존재 세포와 같이 웰당 105개 조사된(1500Rad) 공통이디오타입 흉선 세포를 사용하여 50μg/ml BP로 재자극한다. 72시간 후, 신선한 성장 배지를 각각의 웰에 가한다.
플레이트를 스크리닝하여 클로닝 효율을 측정하고, 증가된 클론을 플레이트로부터 60% 미만의 포지티브 웰로 유도한 다음 보통 초기에는 1 또는 0.5개 세포/웰로 종균 배양한다. 이어서, 106개 조사된 흉선세포/웰을 사용하여 96-웰 평편 바닥 플레이트에서 BP로 재자극한다. 자극한 지 72시간 후, 클론에 성장 배지를 재공급한 다음 24-웰 평편 바닥 플레이트에서 증식시킨다. 106개 조사된 흉선세포 및 25μg BP의 존재하에 약 4x105개의 클로닝된 세포를 사용하여 24-웰 플레이트에서 재자극한다. 클로닝된 세포는 결국 6으로 증가한 다음 10cm 플라스틱 페트리 플레이트로 옮긴다.
증식 검정: 증식 검정은 96-웰 미세역가 플레이트에서 수행한다. 2x104개 T 세포 및 106개 조사된 흉선세포/웰을 37℃ 및 7% CO2중에서 Con A만의, 또는 항원만의 자극 배지를 사용하여 배양한다. 배양액을 72시간 동안 배양하고, 최종 18시간은 0.5Bq3H-Tdr의 존재하에서 배양한다. 세포를 유리 섬유 여과기상에 수거하고 TCR 흡수를 액체 신틸레이션으로 평가한다. 평균 CPM을 3중 웰로부터 계산한다. 복제 웰로부터의 표준 편차는 평균 값과 10% 미만의 차이를 보인다.
EAE의 유발: 마이코박테리움 투베르쿨로시스 균주 H37Ra(Difco Laboratories, Detroit, MI) 100μg을 함유하는 CFA중의 Gp-BP 50μg을 피하 주사하여 활성 EAE를 유발시킨다. 수동 EAE는 APC로서 조사된 흉선 세포를 사용하여 3일 동안 BP로 자극시킨 T 세포 클론을 복강내 주사하여 유발시킨다. EAE가 진행되는 래트를, 다음의 기준을 사용하여 매일 매일의 임상적 증상을 평가한다: 0=증상 없음; 1=꼬리가 흐느적 거림; 2=뒷다리 약화; 3=대마비; 4=앞다리 약화가 수반된대마비, 빈사상태.
DTH의 전이 및 보호: 지연된 유형의 고감작 반응은 귀 팽윤 검정[참조: Offner et al., J. Neuroimmunol. 9:147] 으로, 20μg의 항원을 피내 주사한 지 24시간 후 및 48시간 후에 측정한다. 활성적으로 유발된 EAE에 대한 보호는 활성 또는 휴지 T 세포 클론을 복강내 전이(IL-2 의존성 증가상의 말기 근처)시킨 후 평가한다.
표현형: 간접 면역형광법을 FITC-결합된 염소 항-마우스 IgG F(ab')2(GAM) 항체(TAGO, Burlingame, CA)를 사용하여 상기한 문헌[참조: Offner et al., J. Immunol, 139: 2395]대로 수행한다. T 림프구 클론(1x106)을, 2% FCS 및 0.1% 아지드를 함유하는 빙냉 PBS로 세척하고 데이드 임뮤노퓨지(Dade immunofuge)내에서 신속히 원심분리시켜 펠렛화한다. 팬(pan) T 세포(W3/13), CD4(W3/25), CD 8(OX-6), I-A(OX-6), I-E(OX-17) 또는 MHC I 부류(OX-18)(Bioproducts for Science, Indianapolis, Ind.)에 특이적인 모노클론성 항체를 각각의 세포 펠렛에 가하고, 와동시킨 다음 30분 동안 빙상에서 항온처리한다. 세포를 찬 PBS로 3회 세척하고, FITC-GAM으로 30분 동안 빙상에서 염색한 다음 다시 세척한다. 림프구를 특징적인 고 포워드 스캐터(high forward scatter) 대 저 사이드 스캐터(low side scatter)로 확인하고 벡틴-딕킨슨 FACS 분석기(Bectin-Dickinson FACS analyzer)(MountainView, CA)를 사용하여 488nm 레이저광으로 여기시킨 후 녹색 및/또는 적색 형광 강도에 대해 분석한다. 10,000개의 세포의 히스토그램을 각각 분석에 대해 수집한다.
TCR Vβ유용성 측정
cDNA 합성: 전체 세포 RNA를 구아니디늄 이소티시아네이트중에서 분해하여 염화세륨 쿠숀을 통해 원심분리하여 T 세포 클론으로부터 분리한다[참조; Chirgwin et al., Biochemistry 18:5294). 전체 RNA 6μg을 10mM MeMgOH(Alfa Products, Danvers, MA)중에서 변성시킨 후 20 유니트의 RNA 가드(Pharmacia, Piscataway, NJ), 40mM β-머캅토 에탄올, 0.5mM dNTP, 1μM Cβ 특이적 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 15 유니트의 AMV 역 전사효소(Pharmacia, Sweden) 존재하에 50μl 반응물로 Tag 폴리머라제 완충액[50mM KCl, 10mM 트리스-HCl pH 8.3, 2.5mM MgCl2, 0.01% 젤라틴]중에서 cDNA로 전환시킨다. Cβ 올리고뉴클레오타이드 프라이머[5'CATAGAAtTcCACTTGGCAGCGGAAGTGGT3'(Genosys, The Woodlands, TX)]는 래트 TCR Cβ1 및 2 모두에 있어 특이적이다. 소문자로 표시된 염기는 EcoR1 제한 엔도뉴클레아제 부위를 나타내도록 제조한 TCR Cβ 서열로부터의 변화 부위이다. 이후 42℃에서 90분 동안 항온처리한 후, 반응 혼합물을 95℃로 5분간 가열하여 DNA/RNA 이본쇄를 변성시킨다.
PCR 증폭: 1.5mM MgCl2Taq 완충액, 2μM Cβ 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 2μM Vβ8 군 특이적 올리고 뉴클레오타이드, 200μM dNTP 및 2 유니트의 Tag DNA 폴리머라제(Pharmacia)를 함유하는 100μl 용적중에서 cDNA를 증폭시킨다. Vβ8 특이적 올리고뉴클레오타이드[5'GGGCCGCGGAACACATGGAAGCTGCAGTCAC3']는 모든 공지된 래트 Vβ8 군을 증폭시키고 5' Sac II 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함한다. 각각을 샘플을 광유로 덮고 열순환기중 92℃에서 1분 55℃에서 1.5분 및 72℃에서 2분 30회 주기로 증폭시킨다(Perkin Elmer, Norwalk, CN).
DNA 서열분석: 증폭후, 샘플을 클로로포름 추출하여 광유를 제거하고, 에탄올 침전시키며, Sca II 및 EcoR1(New England Biolabs, Beverly, MA)로 분해한 후, 수득된 DNA를 1.4% 아가로스 겔 상에서 분리시킨다. 적절한 크기의 생성물을 Prep-A-Gene(Bio-Rad, Richmond, CA)를 사용하여 아가로스로부터 직접 분리하고 pBluescript II(Stratagene, San Diegc, CA)의 Sac II/EcoR1 부위로 연결시킨다. 연결 혼합물을 세균 균주 XL1-Blue(Stratagene)내로 형질전환시킨다. 미니프렙 DNA를 표준 방법에 의해, 무작위적으로 선택된 세균 콜로니로부터 제조하고[참조; Maniatis et al., T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY] 시쿼나제 시퀀싱 시스템(U.S. Biochemical, Cleveland, OH)을 사용하여 디데옥시 쇄 종결법[참조: Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA78:2072]으로 쇄 모두를 서열 분석한다.
결과
EAE-회복된 래트로부터 수득된 보호성 클론 C4 55-69 의 특이성
본 발명자는 EAE로부터 자발적으로 회수된 래트로부터 수득된 클론 C4가 잔기 43-67내에 포함된 Gp-BP 특이적 아미노산 서열에 반응하고 연속적인 Gp-BP/CFA 주사로 야기된 EAE로부터의 투여받지 않은 래트를 보호할 수 있음을 입증하였다. 이의 특이성을 좀더 분석하기 위하여, 클론 C4를 합성 펩타이드 배터리로 자극한다. 표 8에 나타난 바와 같이, 클론 C4는 Gp-BP 50-69 및 55-69 펩타이드에 완전히, 63 위치에서 단일 T가 A로 치환되어 GP-BP 서열과 상이한 변형된 래트 55-74 서열과는 부분적으로 반응한다. 하지만, 클론 C4는 상기 영역에서 Gp-BP와는 3개 아미노산이 상이한 Rt-BP와는 전혀 반응하지 않는다[참조; Chou et al., J. Neurochem. 28:115(1977)]. 이들 데이타는 결과적으로, 클론 C4에 의해 인지되는 최소 Gp-BP 에피토프(잔기 55-67)가 Rt-BP에는 부재하여, Rt-BP로 면역화한 후 이러한 특이성을 갖는 T 세포 클론의 유도가 결여됨을 설명하는데 입증된다. 하기, 클론 C4는 C455-69로 지명한다.
루이스 래트에서 EAE에 대한 보호성 에피토프인 Gp-BP-55-69
Gp-BP-55-69에 반응성인 EAE 보호성 클론의 선별은, 이러한 합성 에피토프가EAE의 연속적 유발에 대해 보다 통상적인 보호 활성을 가질 수 있음을 제시한다. 사실상, Gp-BP/CFA로 챌린지하기 전 Gp-BP-55-69로 예비면역화하여 9마리 래트중 3마리에서 임상적 EAE의 모든 증상이 예방되고 나머지에서는 EAE이 중증도와 지속시간이 현저하게 감소되었다(도 16).
능동 및 수동 EAE에 대해 보호하는 클론 C4 55-69
클론 C455-69의 보호 활성을 평가하기 위해 Gp-BP 또는 Gp-BP 55-69 펩타이드로 시험관내 활성화시킨지 3일 후, 또는 IL-2가 풍부한 상층액(휴지 세포)중에서 성장이 지연된 후 항원 재자극 직전에, 루이스 래트 그룹에 C455-69T 세포 100만 내지 2천만개를 주입한다. T 세포 주사한 지 2주후, 수용체 래트의 Gp-BP/CFA로 유발된 능동 EAE 또는 Gp-BP의 72-89 서열(C372-89)에 특이적인 활성화 클론 3T 세포의 이전 후 유발된 수동 EAE에 대한 내성을 시험한다. 표 29에 나타낸 바와 같이, 복강내 또는 정맥내 투여된 클론 C455-69세포는, T 세포를 예비 주사되지 않은 대조 래트와 비교하여 용량-의존적 방식으로, 모든 수용체에서 능동 EAE에 대해 부분적 내지 완전한 보호 반응을 유도하였다. 클론 C455-69를 주사한 후 약한 EAE로 진행된 래트는 임상적 장해가 덜하고 질환 지속기간이 보다 단축된다. 휴지 클론 C455-69T 세포 또한 보호를 전이시킬 수 있는데, 활성화 세포보다는 다소 덜 효율적이다(표 29). 클론 C455-69와는 달리, Gp-BP에 특이적인 비-뇌염발생성 클론 C5GP-BP은 EAE에대해 최소로 보호한다(도 17).
클론 C455-69T 세포는 능동 EAE 보다 수동 EAE를 예방하는데 훨씬 효율적이다. 표 30에 나타난 바와 같이, 독립적으로 또는 클론 C372-89의 존재하에 활성화된 클론 C455-69는 활성화된 클론 C372-89세포의 전이후 5 내지 6일만에 대조군 래트에서 진행되는 임상적 EAE에 대해 모든 수용체를 보호하였다.
클론 C4 55-69 에 의한 클론C3 72-89 의 불활성화에 기인하지 않는 보호
개념상, 클론 C455-69의 보호 활성은 클론 C372-89와 같은 뇌염발생성 T 세포의 활성화 억제능력과 관련되는 것 같다. 이러한 가능성을 평가하기 위하여, 각각의 클론을 개별적으로 또는 전체 Gp-BP와 또는 각각의 에피토프 하나 또는 둘다와 혼합 배양물중에서 자극한다. 표 30에 나타나 있는 바와 같이, 클론 C372-89및 클론 C455-69모두의 증식 반응은 그들 개개의 활성화 수준의 합계와 비교하여, 혼합 배양중 하나 또는 2개 에피토프로 활성화되는 경우 클론 C372-89및 클론 C455-69모두의 증식 반응은 겨우 억제된다(20-25%). 이들 결과는 각각의 클론이 다른 클론 존재하에 가까스로 감소된 수준으로 이의 각각의 에피토프와 반응함을 나타낼 뿐, 클론 C455-69가 뇌염 발생성 클론 C372-89의 활성화를 억제함으로써 EAE에 대해 클론 C455-69를 보호한다는 주장을 뒷받침하지는 않는다.
CNS 조직학
척수 단면의 평가는 클론 C455-69보호된 래트 및 대조군 래트 모두에서 풍부한 혈관주변의 병변을 나타낸다. 하지만, 활성화된 클론 C455-69T 세포 주사는 뇌염발생성 챌린지의 부재하에 어떠한 검출가능한 CNS 병변도 유발되지 않는다.
EAE-회복된 래트로부터의 클론에 의해 발현된 TCR Vβ유전자의 동정
클론 C455-69에 의한 EAE의 임상적 증상으로부터 완전히 보호된 래트에서 CNS 병변의 지속은 Gp-BP-72-89 특이적 뇌염발생성 T 세포 클론에 의해 공유된 TCR-Vβ839-59서열로부터의 합성 펩타이드로 면역화하여 유도된 보호의 표현이다[참조; Vandenbark et al., Nature 341:541(1989); and Hashim et al., J. Immunol. 144: 4621(1990)]. Gp-BP의 43-67 에피토프에 반응성인 T 세포주가 Vβ8.2를 발현하지 않는다해도[참조: Alvord et al., In Experimental Allergic Encephalomyelitis:A Useful Model for Multiple Sclerosis, Vol. 146, pp. 523-537, Alan R. Liss Inc., New York], 관련된 V 영역 유전자가 Gp-BP-43-67에 특이적인 TCR중에 사용되어 교차-반응성 TCR 이디오톱이 항-TCR-Vβ839-59면역성을 유도함을 예측할 수 있다. 달리, 클론 C455-69의 활성화중에 나타나는 교차-반응성 비-TCR 결정인자에 의해 조절이 유도될 수도 있다(예: '에르고타입' 에피토프).
항원 인지 및 작용에 대한 T 세포 수용체 유전자의 중요성을 평가하기 위하여, TCR V 영역 β쇄 군을 3개의 대표적인 T 세포 클론중 각각에 대해 동정한다(도 18). 클론 C372-89및 C5Gp-BP는 Vβ8.2 및 Dβ1 서열을 공유하지만, Jβ 용도, 뇌염발생성 클론 C372-89을발현하는 Jβ2.3 및 비-뇌염발생성 클론 C5Gp-BP을발현하는 Jβ1.1에 있어서는 상이하다(도 18). 반대로, 보호성 클론 C455-69는 Vβ8.6, Dβ2 및 Jβ2.1을 발현한다.
Vβ8.6+ 및 Vβ8.2+ T 세포 모두에 대한 DTH 반응을 유도하는 클론 C4 55-69
Vβ8.2 및 Vβ8.6 서열에 있어서의 유사성으로 인해, 본 발명자는 클론 C455-69(Vβ8.6+)의 주사로 생체내 Vβ8.2+ T 세포의 세포적 교차-인지성이 유도되어짐을 가정하였다. 이러한 주장을 시험하기 위하여, 약독화된 클론 C372-89(Vβ8.2+) 및 클론 C455-69T-세포에 대한 DTH(귀 팽윤) 반응을 클론 C455-69T 세포로 수동 면역화된 래트 및 면역화시키지 않은 래트에서 평가한다. 표 32에 나타난 바와 같이, C455-69T 세포 클론으로 수동 면역화된 래트는 조사된 C455-69(Vβ8.6+) 및 C372-89(Vβ8.2+) T 세포 모두에 대해 비교할만한 DTH 반응을 나타낸다. 이러한 세포 인지성은 주로 '활성화' 및 '휴지' 클론 C372-89및 클론 C455-69세포 모두에 존재하는 교차-반응성 결정인자에 대해 주로 유도됨으로써(표 32) '에르고타입' 에피토프에 의한 최소의기여를 나타낸다. 더구나, 클론 C372-89에 대해 관측되는 DTH 반응 다수는 Vβ8.239-59펩타이드 때문일 수 있다(표 32). 클론 C455-69에 의한 교차-반응성 DTH의 강력한 유도와는 달리, Vβ8.2를 발현하지만 최소 보호성인 클론 C5Gp-BP는 Vβ8.239-59펩타이드에 대해 상당한 DTH 반응을 유도하는데 실패하였다(표 32).
Vβ8.239-59펩타이드에 대한 특이적 DTH 반응을 유도하는 활성화 및 휴지 클론 C455-69모두의 능력 및 클론 C5GP-BP(Vβ8.2+)의 상대적 불활성은 세포 표면 마커의 발현을 보다 가까이 관망케 하였다. 클론 C3, C4 및 C5의 FACS 분석은 CD4(W3/25 모노클로날 항체), 팬 T 세포 마커(W3/13) 및 I 부류 MHC(OX-18)의 유사한 수준의 발현을 나타낸다. 하지만, 보호성 클론 C455-69는 휴지기 동안(도 19) 및 활성화 이후(도 19) 모두에 있어서 클론 C372-89또는 클론 C5Gp-BP보다 상당히 높은 수준의 활성화 마커 I-A(OX-6, 도 19) 및 I-E(OX-17)을 발현한다. 따라서, I-A 및 I-E의 보호 유도 및 항-TCR 면역성 유도에 대한 기여가 공지되어 있지 않다해도, 클론 C455-69가 다른 2개 클론보다 높은 수준의 이들 활성화 마커를 유지한다는 것은 명백하다.
고도로 교차-반응성인 Vβ8.6 39-59 및 Vβ8.2 39-59 펩타이드
Vβ8.6 대 Vβ8.2 서열의 분석은 잔기 39-59(도 18)에서 4개의 아미노산 차이, 양쪽성 알파 헬릭스[참조: Margalit et al., J. Immuno. 138:2213] 존재로 측정되는 유사한 예상된 T 세포 에피토프 및 로트바드-테일러(RT) 서열[참조: Rothbard et al., The EMBO Journal 7:93]을 나타낸다. 이들 서열내에서의 가능한 교차-반응성을 연구하기 위하여, TCR-Vβ8.639-59펩타이드를, 이미 광범위하게 특성화된 TCR-Vβ8.239-59펩타이드로 비교 연구하기 위하여 합성한다[참조; Vandenbark et al., Nature 341:541(1989); Hashim et al., J. Immunol. 144:4621(1990); and Higgins et al., J. Immunol. 140:440(1988)].
생체내에서 2개의 TCR 펩타이드의 상동성 및 교차-인지성을 평가하는 직접적인 방법은 CFA 내에서 각각의 펩타이드로 면역화하고 두 펩타이드에 대한 DTH를 측정하는 것이다. 표 32에 나타난 바와 같이, Vβ8.639-59및 Vβ8.239-59펩타이드는, 교차 반응성 펩타이드에 대해 약간 강력한 반응이 면역화에 있어 나타나면서 생체내에서 고도의 교차-반응성을 나타낸다. 유사한 교차 반응성이 2개 TCR 펩타이드에 대한 항체로도 관측된다. 이들 데이타는 결과적으로, Vβ8.6+ T 세포 또는 TCR-Vβ8.639-59펩타이드로 면역화하여, EAE에 보호효과 및 치료 효과 모두를 갖는 것으로 공지된 TCR-Vβ8.239-59의 강력한 T 세포 교차-인지성을 유도할 수 있음을 입증한다[참조; Vandenbark et al., Nature 341:541(1989); Hashim et al., J. Immunol. 144:4621 (1990); and Higgins et al., J. Immunol. 140:440(1988)]. 유사하게, 2개 펩타이드간의 교차 반응성은, TCR 펩타이드 모두에 대해 ELISA에 의한동등한 반응성(TCR Vβ8.239-59에서 0.31 O.D. 유니트 및 TCR Vβ8.639-59에서 0.33 O.D. 유니트, 1/40,000 혈청 희석)을 나타내는, TCR Vβ8.239-59에 특이적인 래비트 항체를 사용하여 관측된다.
Vβ8.6 39-59 펩타이드를 사용한 EAE의 치료
Vβ8.639-59및 Vβ8.239-59펩타이드의 강력한 교차 반응성은, Vβ8.2 펩타이드에 대해 미리 나타낸 바와 같이[참조; Higgins et al., J. Immunol. 140:440(1988)], Vβ8.6 펩타이드가 EAE가 확립된 래트를 성공적으로 치료해야 함을 예견하고 있다. 도 20에 도시한 바와 같이, 임상적 EAE 발병 1일째에 염수중 TCR-Vβ8.639-59펩타이드를 피하내 또는 피내 주사하면, Vβ1439-59대조군 펩타이드를 주사한 래트 또는 비처리 대조군 래트에 비해 EAE 중증도 및 지속시간이 상당히 저하된다. TCR-Vβ8.639-59를 사용한 EAE의 치료는 TCR-Vβ8.239-59펩타이드의 효과와 비견된다(도 20).
토의
상기 결과는 비-뇌염 발생성 T 세포 클론상에 존재하는 TCR V 영역 이디오톱이 뇌염발생성 T 세포에 의해 보편적으로 사용되는 교차-반응성 TCR 결정인자에서 지시되는 EAE-보호 면역성을 유도할 수 있음을 입증한다. 상기 데이타는, 1) Gp-BP의 비-뇌염발생성 55-69 서열이 루이스 래트에서 EAE에 대한 보호적 에피토프를 나타내고, 2) 이러한 에피토프에 특이적인 클론 C455-69가 투여받지 않았던 래트로의 주사후 능동 및 수동 EAE에 대해 강력하게 보호할 수 있으며, 3) 보호 클론 C455-69는 그의 TCR중에서 Vβ8.6을 발현하고, 4) Vβ8.6의 39-59 서열은 루이스 래트에서 뇌염발생성 T 세포에 의해 사용되는 Vβ8.2의 39-59 서열과 교차-반응적이며[참조; Burns et al., J. Exp. Med. 169:27(1989)], 5) Vβ8.639-59펩타이드는 확립된 EAE에 걸린 래트를 치료하는데 있어 Vβ8.239-59펩타이드와 비교되는 활성을 가짐을 설명한다. 따라서, 55-69 펩타이드를 주사함에 의한 유발된 EAE에 대한 보호는, 55-69 결정인자에 특이적인 비-뇌염발생성 T 세포에 의해 TCR Vβ8.639-59상에서 발현되는 교차-반응성 TCR 이디오톱에서 지시되는 항-TCR 면역성을 포함하는 것 같다. 하지만, 기타 비-TCR 결정인자 및 클론 C455-69의 억제적 특성 자체는 관측된 보호에 또한 기여할 수 있다.
보호는 뇌염발생성 T 세포 특이성의 TCR에서 지시된 항-이디오타입 조절의 클론 C455-69에 의한 효율적 유도로부터 기인할 수 있다. 먼저, 클론 C455-69에 의해 임상적으로 잘 보호된 래트는 조직학적 EAE, 즉 합성 TCR Vβ8.239-59펩타이드에 의해 유도되는 보호와 동일한 패턴을 나타낸다[참조: Vandenbark et al., Nature 341:541(1989); Hashim et al., J. Immunol. 144:4621(1990)]. 두번째로, 클론C455-69는 뇌염발생성 클론 C372-89와 클론 C372-89에 의해 발현되는 TCR Vβ8.239-59서열의 강력한 T 세포 인지성을 유도한다. 서열 분석은, TCR중 클론 C455-69가 Vβ8.6을 발현하고 Vβ8.6 및 Vβ8.2 서열이 유사함을 명백히 입증한다. Vβ8.2 및 Vβ8.6중 동일한 아미노산 최장 길이는 잔기 1-11 및 44-54이지만, 후자만이 T 세포 에피토프로서 보다 큰 공지의 항원성 펩타이드(예: 잔기 39-59)내에 포함되는 것으로 예상된다. 세번째로, 합성 Vβ8.639-59펩타이드는 생체내에서 Vβ8.235-59펩타이드와 고도로 교차 반응성이고 EAE 조절에 있어 비교할만한 효과를 나타낸다.
Gp-BP-55-69 특이적, I-A 제한된 클론 4는, Gp- 및 Rt-BP의 72-89 및 87-99 에피토프에 특이적인 뇌염발생성 T 세포에 의해 우선적으로 사용되는 Vβ8.2 유전자와 밀접하게 연관된 유전자인 Vβ8.6을 사용하는 것으로 보고된 첫번째 클론이다[참조; (Burns et al., J. Exp. Med. 169:27(1989); Alvord et al., In Experimental Allergic Encephalomyelitis;A Useful Model for Multiple Sclerosis, Vol. 146, pp. 523-537, Alan R. Liss Inc., New York; and Williams et al., Immunol. Res. 7:339-350(1988)]. V-D-J 결합부에서의 명백한 상이성을 주시함으로써, 본 연구에서 평가된 3개의 클론, 특히 클론 C372-89및 C5Gp-BP(Vβ8.2에 대한 이들의 용도는 동일)의 특이성 차이를 설명할 수 있다는 것은 흥미롭다.
실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 회복과정도, 미엘린 기본 단백질의 제2 에피토프에서 지시되는 다양한 T세포 클론의 증가로 특징지을 수 있다. 특히, 기니아피그 기본 단백질(Gp-BP)의 55-69 잔기는 EAE로부터 보호작용을 유도한다. 이러한에피토프에 대해 특이적인 비-뇌염발생성 T세포 클론 C455-69는 능동 및 수동 EAE 모두에 대해 보호작용을 한다. 클론 C455-69는 항원 수용체중 Vβ8.6을 발현하는 것으로 발견되었고, 이 서열의 39-59 잔기는 보호성 항-이디오타입 T 세포 및 항체를 유도하는 것으로 공지된 Vβ8.2의 상응하는 39-59 잔기와 고도로 교차 반응성인 것으로 밝혀졌다. TCR Vβ8.239-59펩타이드와 같이, Vβ8.639-59서열은 자가 조절을 유도하여 확립된 EAE를 효율적으로 치료한다. 따라서, Gp-BP-55-69 서열의 EAE-보호 효과는 교차-반응성 조절 이디오톱에서 지시되는 항-TCR 면역성을 효율적으로 유도할 수 있는 C455-69와 같은 T 세포 클론에 의해 매개되는 것이 거의 확실하다.
실시예 XIII
실험적인 뇌척수염에서의 보호성 이디오톱
뇌염 발생의 T 세포에 의해 발현된 합성 TCR 펩타이드는 실험적인 뇌척수염에 대해 보호하는 세포 및 체액성 반응 모두를 유도시킬 수 있다. 루이스 래트에서, 뇌염발생성 T 세포는 Vβ8.2를 우세하게 발현하며, 잔기 39 내지 59를 나타내는 CDR2 영역내 펩타이드는 EAE를 보호 및 치료할 수 있다. 유사하게, EAE-보호성 클론에 의해 발현된 Vβ8.6으로부터의 동종 및 가교 반응성 39 내지 59 잔기는 EAE에 대한 보호 및 치료 활성을 지닌다. 잔기 44 내지 54를 포함하는 Vβ8.2 및 Vβ8.6 펩타이드 사이의 컨센서스 서열(consensus sequence)은 보호성 이디오톱을 함유하는 것으로 추정된다. 본 실시예에서 발명자들은 Vβ8-44-54로 지명한 본 펩타이드가 능동 및 수동 EAE 모두를 치료하기 위한 더욱 긴 펩타이드 보다 비교되는 활성이 있음을 입증하였다. 더욱 긴 Vβ8.2-39-59 펩타이드와 유사하게, Vβ8-44-54 펩타이드는 MHC I에 의해 제한된 보호성 TCR 펩타이드-특이적인 CD4+, CD8dimT 세포를 자극한다. 본 실시예는 우선 TCR이 지시되는 Vβ15, 10, 및 8.2를 포함하며, TCR내에 다양한 Vβ 유전자를 발현하는 Vβ8-44-54 반응성 T 세포 클론의 회수를 나타낸다. 이와 함께, 이들 자료는 Vβ8-44-54 서열이 EAE에서 중요한 자가조절 이디오톱을 구성함을 입증하고 있다.
재료 및 방법
동물:루이스(Lewis) 암컷 래트(6 내지 8주 경과)를 하리안 스프라그 돌리(Harlan Sprague Dawley; Indianapolis, IN 소재)로부터 입수하고, 연구소 지시에 따라 포틀랜드 VAMC 소재의 기관(Animal Resource Facility)에서 가두고 사육한다.
항원;에일라(Eylar)등의 방법[참조: Eylar et al., J. Biol. Chem 246: 5770(1971)]에 따라 Gp-Bp를 제조한다. 합성 TCR 펩타이드는 전술한 바와 같이, 고체상 기술에 의해 제조한다.
T 세포주 및 클론의 선택: T 세포주는 EAE로부터 회복후 Gp-BP/CFA로 면역화시킨 래트의 유출된 임파절로부터 선택한다. ConA 자극한 루이스 래트 비장세포로부터의 상층액을 항원 자극시킨 T 세포를 확장시키는데 사용된 IL-2의 공급원으로서 사용한다.
T 세포주를 본원에서 기술한 바와 같이 제한 희석으로써 클로닝시킨다. BP로 자극한 후, 세포는 0.2ml의 성장 배지중 4, 2, 1, 및 0.5개 세포/웰의 밀도에서 환저 미세적정 웰에 둔다음 37℃ 및 7% CO2에서 배양한다. 7일후, 세포는 항원 존재 세포로서 웰당 105개의 조사된 (1500rad) 동동유전자계 흉선세포를 사용하여 50μg/ml BP로 재자극시킨다. 72시간 후, 각각의 웰에 신선한 성장 매질을 가한다.
플레이트를 선별하여 클로닝 효율을 측정하고 증식된 클론은 양성 웰 60% 보다 적은 플레이트로부터 기원하며, 일반적으로 이것은 초기에 1 또는 0.5세포/웰로 종균배양된 것이다. BP를 사용한 연속적인 재자극을 106개의 조사된 흉선세포/웰을 사용하여 96-웰 평평 바닥 플레이트내에서 달성한다. 자극한지 72시간후, 클론은 성장배지를 사용하여 재형성시키고 계속하여 24-웰 평평 바닥 플레이트내에서 증식시킨다. 24-웰 플레이트내 재자극은 106개의 조사된 흉선세포 및 25μg의 BP 존재하에 대략 4x105개의 클로닝된 세포를 사용하여 달성한다. 클로닝된 세포는 6 및 다음에는 10cm 플라스틱 페트리 디쉬로 증식시킨다.
증식검정: 증식검정은 96-웰 미세역가 플레이트 내에서 수행한다. 2x104개의 T 세포 및 106개의 조사된 흉선세포/웰은 자극배지 단독, ConA 또는 항원과 함께 7% CO2중 37℃에서 배양한다. 이 배양물을 72시간동안, 마지막 18시간은 0.5Bq3H-Tdr 존재하에 배양한다. 세포를 유리섬유 필터상에서 하베스트하고 TCR 흡수는 액체 신틸레이션으로 평가한다. 평균 CPM은 3개의 웰로부터 계산한다. 반복되는 웰로부터의 표준 편차는 평균치로부터 <10%에서 가변적이다. 몇몇 실험에서, MHCI(OX-18) 또는 MHCII(OX-6, 항-I-A 및 OX-17, 항-I-E)에 대한 아지드 유리된 항체를 배양물에 가하여 어느 MHC 분자가 TCR Vβ8-44-54 펩타이드에 대한 T 세포 반응을 제한하는데 사용되었는지를 평가한다.
EAE의 유발: 능동 EAE는 100μg의 마이코박테리움 투베르쿨로시스 균주 H37Ra(Difco Laboratories, Detroit, MI 판매원)를 함유하는 CFA중 10μg의 Gp-BP를 피하 주사하여 유발시킨다. 수동 EAE는 APC로서 조사된 흉선 세포를 사용하여 3일동안 BP로 자극시킨 T 세포 클론을 복강내 주사하여 유발시킨다. EAE로 진행되는 래트는 하기 범주를 이용하는 임상적 증상으로서 매일 평가한다: 0 = 증상없음; 1 = 처진 꼬리; 2 = 뒷발 약화; 3 = 마비; 4 = 앞발 약화와 함께 바비, 빈사 상태.
DTH의 전이 및 보호: 지연된 형태의 과감작성 반응은 20μg의 항원을 피내 주사한후 24 및 48시간만에 귀 팽윤 검정[참조: Offner et al., J. Neuroimmunol, 9:147(1984)]로써 평가한다. 능동적으로 유발된 EAE에 대한 보호는 활성화되거나 휴지기 상태(IL-2 의존성 성장상의 거의 말기)인 T 세포 클론을 복강내 투입으로 이전한 후 평가한다.
표현형: 직접적인 면역형광성은 문헌[참조: Offner et al., J. Immunol. 139: 2395(1987)]에 기술되어 있는 바와 같이 FITC-결합된 염소 항-마우스 IgG F(ab')2(GAM)항체(TAGO, Burlingame, CA 제조원)를 사용하여 수행한다. T 림프구 세포주 또는 클론(1x106개)을 2% FCS 및 0.1% 아지드를 함유하는 빙-냉 PBS중에서 세척하고 데이드 임뮤노퓨지(Dade immunofuge) 내에서 신속하게 원심분리하여 펠렛화한다. 팬 T 세포(W3/13), CD4(W3/25) CD8(OX-8), I-A(OX-6), I-E(OX-17), 또는 MHC I 부류(OX-18)에 대해 특이적인 모노클로날 항체(Bioproducts for Science, Indianapolis, Ind. 제조원)를 가하여 세포 펠렛을 분리시키고, 볼텍싱하여, 빙상에서 30분동안 배양한다. 이 세포를 냉 PBS로 3회 세척하고, 빙상에서 FITC GAM을 사용하여 30분동안 염색하며, 재세척한다. 림파구는 특징적으로 높은 전방 분산 대 낮은 측면 분산에 의해 동정하고 벡틴-디킨슨(Bectin-Dickinson) FACS 분석기(Mountain View, CA 제조원)를 사용하여 488nm 레이저광으로써 여기시킨후 녹색 및/또는 적색 형광성 강도에 대해 분석한다. 10,000개 세포의 히스토그램을 각각의 분석을 위해 수집한다.
TCR Vβ 용도의 측정:
cDNA 합성: 전체의 세포 RNA는 구아니디움 이소티시아네이트중에서 분해하고 염화세슘 쿠션을 통한 원심분리에 의해 T 세포 클론으로부터 분리한다[참조: Chirgwin et al., Biochemistry 18: 5294(1979)]. 6μg의 전체 RNA를 10mM의 MeMgOH(Alfa Products, Danvers, MA 제조원)중에서 변성시킨 다음 반응물 50μl중 20 유니트의 RNA 거드(guard)(Pharmacia, Piscataway, NJ 제조원), 40mM β-머캅토에탄올, 0.5mM dNTPs, 1μM Cβ 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 15 유니트의 AMV 리버스 트랜스크립타제(Pharmacia, Sweden 제조원) 존재하에 태크 폴리머라제(Taq polymerase) 완충액(50mM KCl, 10mM 트리스-HCl pH8.3, 2.5mM MgCl2,0.01% 젤라틴)중에서 cDNA로 전환시킨다. 이 Cβ 올리고뉴클레오타이드 프라이머 5'CATAGAAtTcCACTTGGCAGCGGAAGTGGT3'(Genosys, The Woodlands, TX 제조원)은 래트의 TCR Cβ1 및 2 모두에 대해 특이적이다. 소문자의 근원은 EcoR1 제한 엔도뉴클레아제 부위를 생성하기 위해 제조한 TCR Cβ 서열로부터의 변화를 나타낸다. 42℃에서 30분동안 항온처리한 후, 반응 혼합물은 95℃에서 5분동안 가열하여 DNA/RNA 이본쇄를 변성시킨다.
PCR 증폭:cDNA는 1.5mM MgCl2, 태크 완충액, 2μM Cβ 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 2μM Vβ8군 특이적인 올리고뉴클레오타이드, 200μM dNTPs 및 2 단위의 태크 DNA 폴리머라제(파마시아 제조원)를 함유하는 100μl 용량에서 증폭시킨다. Vβ8 특이적인 올리고뉴클레오타이드인, 5'GGGCCGCGGAACACATGGAAGCTGCAGTCAC3'는 모든 공지된 래트 Vβ8군 일원을 증폭시키며 5' SacII 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유한다. 각각의 샘플을 광오일로 덮고 열순환기(Perkin Elmer, Norwalk, CN 제조원)내에서 92℃에서 1분, 55℃에서 1.5분, 및 72℃에서 2분의 증폭 주기를 30회 반복한다.
DNA 서열분석: 증폭에 이어서, 샘플을 클로로포름으로 추출하여 광 오일을 제거하고, 에탄올 침전시키며, SaII+EcoR1(New England Biolabs, Berverly, MA)으로 분해하고, 수득되는 DNA는 1.4% 아가로즈 겔상에서 분리한다. 적절한 크기의산물을 Prep-A-유전자(Bio-Rad, Richmond, CA 제조원)를 사용하여 아가로즈로부터 직접 분리하고 pBluescript II(Stratagene, San Diego, CA 제조원)의 SacII/EcoR1 부위내로 연결시킨다. 연결 혼합물을 세균 균주 XL1-Blue(Stratagene)내에 형질전환시킨다. 미니프렙(Miniprep) DNA을 무작위적으로 선택한 세균 클로니로부터 표준방법[참조: Maniatis et al., Molecular cloning: A laboratory manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1989)]에 의해 제조한 다음 시쿼나제 서열분석 시스템(U.S. Biochemical, Cleveland, OH 제조원)을 사용하여 디데옥시 쇄 종결 방법[참조: Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072 (1977)]에 의해 2개의 쇄상에서 서열분석한다.
결과
2개의 보호성 Vβ8 펩타이드내에서 일반적인 TCR 서열의 동정
임상적 EAE는 뇌염 발생성의, Gp-BP 반응성 T 세포 클론에 의해 발현된 Vβ8.2-39-59 펩타이드, 또는 비-뇌염발생성의 EAE-보호성 T 세포 클론에 의해 발현된 Vβ8.6-39-59 펩타이드로써 완전히 처리한다[참조: Eylar et al., J. Biol. Chem. 246: 5770(1971)]. 이들 2개의 펩타이드 서열(표 33)을 기준으로 하여, V 유전자 모두의 잔기 44-54를 포함한 컨센서스 영역을 동정하여 연속적인 연구용으로 합성한다. 이 펩타이드를 Vβ8-44-54로 지정한다.
Vβ8-44-54 펩타이드내 T 세포 및 B 세포 에피토프
T 세포 에피토프를 함유한 커센서스 Vβ8-44-54 펩타이드가 더욱 큰 Vβ8.2-39-59 펩타이드와 가교 반응성인지의 여부를 평가하기 위해, 래트를 Vβ8-44-54 펩타이드로 면역화시키고 각각의 펩타이드에 대한 DTH 반응성을 귀 팽윤 검정으로써 추정한다. 표 34에서 알수 있는 바와 같이, 비록 반응이 Vβ8-44-54 펩타이드에 대해서 보다도 Vβ8.2-39-59 펩타이드에 대해 어느 정도 더 크다해도, 매우 현저한 귀 팽윤이 펩타이드 모두에서 관측된다.
한편, 래비트내에서 Vβ8.2-39-59 및 Vβ8.6-39-59 펩타이드에 대해 상승된 항혈청은 ELISA에 의해서 면역화 펩타이드 모두에 대해 강력하게 반응하며 Vβ8.2-49-59 펩타이드에 대해서는 더욱 적은 정도로 반응한다. 그러나 어떠한 항혈청도 컨센서스 Vβ8-44-54 펩타이드 또는 CDR1, CDR3 또는 Vβ14 TCR 펩타이드에 대해 반응하지 않는다(표 35). 이들 자료는 Vβ8-44-54 펩타이드가 가교-반응성 T 세포 에피토프를 함유하지만 Vβ8.2-39-59 및 Vβ8.6-39-59 펩타이드와 비교하여 가교반응성 B 세포 에피토프를 상실함을 명확히 나타내고 있다.
TCR 펩타이드를 사용한 능동 및 수동 EAE의 치료
Vβ8-44-54 펩타이드가 보호성 항-TCR 반응을 자극하기 위해서 모펩타이드의 활성을 보유하는지의 여부를 측정하기 위해서, 각각의 펩타이드를 임상적인 EAE의 첫쨋날에 Gp-BP/CFA 면역화된 래트내로 피하주사한다. 도 21에서 알수 있는 바와 같이, Vβ8-44-54 펩타이드 100μg은 중증도 감소 및 능동적으로 유도된 EAE의 지속기간에 있어서 Vβ8.2-39-59 및 Vβ8.6-39-59 펩타이드 모두에 대해 비교할만한활성이 있다. 비교결과, Vβ8.2 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역으로부터의 기타 펩타이드는 EAE에 대한 치료 효과가 거의 없다.
TCR 펩타이드가 활성적으로 유도된 EAE에 있어서 치료 활성을 있다해도, 수동성 질환에 있어서 이의 효과는 보고되어 있지 않다. 모 Vβ8.2-39-59 펩타이드(도 22) 또는 더욱 짧은 Vβ8-44-54 펩타이드의 주사로(도 22) BP에 대해 특이적인 Vβ8.2+ T 세포주에 의해 수동적으로 유발된 EAE의 중증도 및 지속기간에 있어서 현저한 감소가 이루어진다.
Vβ8-44-54에 특이적인 T 세포의 특성화
컨센서스 Vβ8-44-54 펩타이드에 대한 T 세포 반응을 특성화하기 위해서, 임파절 세포 및 T 세포주를 다양한 TCR 펩타이드로 자극한다. CFA중 Vβ8-44-54 펩타이드로 면역화시킨 래트로부터의 임파절은 컨센서스 펩타이드에 대해서 현저하게 반응하며 Vβ8.2 및 Vβ8.6 유전자 모두에서 나타나는 더욱 긴 39-59 서열 및 기대된 바와 같은 PPD에서 더욱 적은 정도로 반응한다(표 34).
그러나, 면역화된 Vβ8-44-54 펩타이드와 오우버랩된 잔기 6개를 지닌 Vβ8.2-49-59 서열, 또는 Vβ8.2-25-41(CDR1 영역) 펩타이드, 또는 Vβ14-39-59 펩타이드에 대해 어떠한 반응도 관측되지 않는다. Vβ8-44-54 펩타이드로 반복하여 자극시킨 T-세포주는 선별한 펩타이드에 대해 가장 잘 반응하며 더욱 긴 Vβ8.6-39-59 및 Vβ8.2-39-59 펩타이드에 대해 더욱 적은 정도로 반응하나, 시험한 기타의 펩타이드 또는 항원에 대해 반응하지 않는다(표 33). Vβ8-44-54 반응에 대한T 세포 반응은 MHC I 부류 분자에 대한 항체 존재하에 76%가 억제되나 MHC II 부류에 대한 항체에 의해서 억제되지는 않는다(표 36). T 세포주는 CD4+에 대해서 >95%이며 기술한 바와 같이 CD8+에 대해서는 약하게 반응한다.
Vβ8-44-54 반응성 T 세포주에 의해 전이된 보호
Vβ8-44-54 특이적인 T 세포주내 보호활성을 추정하기 위해서, 래트에 Gp-BP/CFA 및 12,000,000개의 활성화된 T 세포주의 뇌염발생성 용량을 주입한다. 도 23에 나타난 바와 같이, TCR-특이적인 T 세포를 주입받은 래트는 심각한 임상적 EAE로 진행된 비처리 대조군과 비교하여 EAE 발생 기간이 지연되어 있으며 최소로 진행된 EAE 증상을 나타낸다.
Vβ8-44-54 반응성 T 세포 클론의 분리
클론 수준상에서 항-TCR 펩타이드 반응을 특성화하기 위해, 10개의 클론을 분리하여 초기 T 세포주로부터 특성화한다. 표 37에 나타낸 바와 같이, 각각의 클론은 10X 내지 1300X 범위의 자극지수를 지닌 Vβ8-44-54 펩타이드에 대해 강력히 반응하며 Vβ8.2-39-59 또는 Vβ8.6-39-59 펩타이드에 대해 전혀 반응하지 않는다. 3개의 모든 펩타이드로 챌린지시킨 4개의 클론중 3개가 컨센서스 Vβ8-44-54 펩타이드에 대해 선택적으로 반응하는 반면, 반응의 T 세포주 양식을 반영한 클론(B7)단지 한개만이 Vβ8-44-54 > Vβ8.6-39-59 > Vβ8.2-39-59에 대한 반응으로서 특징화 된다(표 37). 클론의 생존력 상실로 EAE-보호 활성의 개개 시험은 제외된다.
항-TCR Vβ8-44-54 반응성 T 세포주 및 클론의 V 유전자 발현
TCR Vβ 유전자 발현은 PCR 기술을 사용하여, 출발 T 세포주 및 3개의 Vβ8-44-54 반응성 T 세포주 내에서 동정한다. T 세포주는 Vβ8.2, 8.6, 10, 12, 15 및 19(표36)을 포함하는 6개의 검측가능성 Vβ 유전자를 발현하며, Vβ 유전자중 2개가 개별적으로 분석된 3개의 T 세포 클론의 TCR 내에서 동정된다(클론 B3는 Vβ10을 발현하고 클론 B9 및 D4는 Vβ12를 발현한다(표 36). 표 37에서 나타낸 바와 같이, 3개의 클론 각각은 VDJ 영역을 통하여 뚜렷한 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열을 지닌다.
토의
상기 제시된 데이타는 결론적으로 항원 활성 및 EAE-조절 활성 모두가 Vβ8.2 및 Vβ8.6 CDR2 펩타이드내에서 발견되는 컨센서스 서열을 나타내는 11번 잔기 펩타이드에 기인한다는 것을 예증한다. 통상의 펩타이드 Vβ8-44-54는 능동 및 수동 EAE 치료시 필적할만한 활성을 나타내며 길이가 보다 긴 Vβ8.2-39-59 펩타이드와 유사하게 MHC I에 의한 제한되는 보호성 TCR 펩타이드-특이적 CD4+, CD8dimT 세포를 자극한다. 이러한 실례는 최초로, Vβ8-44-54 반응성 T 세포 클론이 이들의 TCR에 있어서 다양한 Vβ 유전자를 발현하며, 이는 뇌염발생성 VP-반응성 T 세포에 의해 Vβ8.2의 한쪽에 치우친 발현과 현저히 비교됨을 증명한다. 이들 데이타를 함께 고려하면, 이들은 Vβ8-44-54 서열이 EAE에 있어서 중요한 자가조절 이디오톱을 구성한다.
TCR 펩타이드 치료요법의 신속한 임상효과를 EAE도중 Vβ8.2+ 뇌염발생성 T 세포 클론의 결과로서 자연적으로 발생하는 항-TCR 면역성에 대한 TCR 펩타이드의 부스팅 효과(boosting effect)에 기인함이 명백하다. 생각컨대, TCR Vβ8.2 펩타이드에 의한 EAE의 치료는 질환경과에 영향을 미칠 수 있지만, 최대 활성은 대부분 면역우성 에피토프에 의한 것으로 기대될 수 있다. Vβ8-44-54 펩타이드는 CDR2 펩타이드(잔기 49-59) 또는 CDR3 펩타이드(잔기 93-101)과 부분적으로 오버랩되는 CDR1 펩타이드(잔기 25-44)에 비해 치료 활성이 더 높다. Vβ8-44-54 펩타이드의 활성은 동일한 펩타이드상에 명백하게 부재하는 B 세포 결정인자라기 보다는 주로 길이가 보다 긴 모 펩타이드상에서도 발견되는 우성 T 세포 에피토프에 관련된다. Vβ8.2 CDR1 및 CDR3 펩타이드는 예기되는 T 세포 에피토프도 함유하지 않으며[참조: Margalit et al., J. Immuno. 138:2213(1987); Rothbard et al., The EMBO Journal 7:93 (1988)], 또한 이들중 어떠한 것도 펩타이드 면역화된 래트에 있어서 강하게 지연되는 과감작 반응을 유발시키지 못한다[참조: Offner et al., Prog. Clin. Biolog. Res. 336:93(1990)]는 사실은 명백하다. 반면, Vβ8.2-49-59 펩타이드는 루이스 래트에 있어서 항원성 및 항체 결정인자를 예기하나 DTH 반응을 아주 약하게만 유발시킨다. 추가의 CDR2 펩타이드, Vβ8.2-39-51은 항원성 및 보호활성이 없다. 이들 결과로부터, Vβ8-44-54 서열이 CDR2 영역에 있어서 주요 T 세포 에피토프를 나타내며, 이는 CDR1 및 CDR3에 비해 면역 우성이다.
능동적으로 유발되는 EAE에 대한 에피토프의 면역조절 활성은 명확하게 증명되었다. 그러나, 능동-유발된 EAE에 있어 유발 기간은 12일로부터 3 내지 4일로 상당히 단기화된다. 당해 데이타(도 22 참조)는 형질전환된 T 세포에 3 내지 4일 노출시키는 경우 수용자에 대해 능동적 EAE의 치료동안 관찰되는 동일한 TCR 펩타이드 부스팅 효과에 기인하도록 한다는 결론을 지지한다[참조: Howell et al., Science 246:668(1989)]. 능동 모델에 치중될 수 있는 추가의 문제점은 활성화된 T 세포의 높은 투여량에 의해 유발되는 치사-EAE에 대한 CDR2 펩타이드의 효능이다. 이러한 경우에 있어서, Vβ8.2-39-59 펩타이드에 의한 치료는 모든 수용자를 치사 EAE로부터 보호하며(참조: 도 21a) 비교적 온화한 질환 과정을 유도한다. 보다 덜 심각한 EAE를 유발하는 보다 낮은 T 세포 투여량에 있어서는, Vβ8-44-54 및 Vβ8.2-39-59 펩타이드는 모두 현저한 치료 잇점을 갖는다.
전술한 실시예 IX에서, 본 발명자는 Vβ8.2-39-59 펩타이드에 대해 특이성인 EAE-보호성 T 세포주가 펩타이드-면역화된 래트로부터 선택될 수 있음을 증명하였다. 이들 세포는 강한 CD4+ 및 약한 CD8+이며 CD8 분자의 이용가능성은 TCR 펩타이드인지의 명백한 MHC-I 제한 설명을 돕는다. 유사하게, 이런 실례는 Vβ8-44-54 펩타이드에 대해 특이성인 EAE 보호성 T 세포주의 선택을 증명한다(참조 표 36). 이러한 세포주에 있어서, Vβ8-44-54 펩타이드 인지는 CD4+, CD8dimT 세포를 포함하며, 이들 T 세포의 반응은 고도의 펩타이드 특이성을 가지며 MHC-II가 아닌 MHC-I에 대한 항체에 의해 억제될 수 있다.
Vβ8-44-54 펩타이드에 대해 특이성인 T 세포주 및 클론의 분리는 처음으로 TCR 이디오톱의 인지에 관련된 V 유전자 레퍼토리를 평가할 수 있게 한다(참조 표 37). 우성 V 유전자(Vβ15)는 조절된 V 유전자(Vβ8.2)와 구별된다. 그러나, 적어도 몇몇 항-Vβ8-44-54 반응성 세포주는 또한 이들 조절 세포 자체가 자동조절될 수 있는 가능성을 증가시켜주는 Vβ8.2를 발현한다. 이러한 Vβ8.2+ T 세포의 단순한 존재는 Vβ8.2+ 세포 및 항-V 8.2-39-59 특이 조절 세포사이의 비-세포질 분해성 T-T 상호작용을 암시하는 전술한 데이타를 지지함에 있어서 면역조절 메카니즘으로서의 클론 결실을 배제한다.
보다 일반적으로, 이들 데이타는 TCR 에피토프에 대해 특이성인 자가반응성 T 세포가 흉선의 네가티브 선택을 회피할 뿐만아니라, 한쪽으로 치우친 TCR V 유전자 발현에 관련된 고도의 집중된 반응을 나타내는 동물에 있어서 상당히 용이하게 트리거될 수 있음을 지지한다. 이들 인자들은 TCR 펩타이드의 세포 및 체액성 인지가 사람의 면역 관련 질환의 치료에 적용되는 생체내 중요한 자가조절 메카니즘을 나타냄을 암시한다.
실시예 XIV
TCR 펩타이드에 대한 독소 접합 항체를 사용한 자가면역 질환의 치료
본 실시예에 있어서, mAb는 TCR Vβ8(39-59) 펩타이드로 마우스를 면역화시키고 상기 기술한 바와 같이 하이브리도마 제조방법을 수행하여 생성한다. 리신 A 쇄에 mAb를 접합시켜 면역 독소를 수득한다. 독소 접합 항체는 뇌염발생성 용량의 GPBP로서 래트에 동시 주사하고(예방용) EAE 발병후의 다른 래트에 주사(치료용)한다.
리신 A 쇄 결합된 항 TCR 펩타이드 항체로 예방적 치료(0.05 내지 0.2mg/kg의 양으로 1 내지 4회 주사)를 할 경우 EAE의 발병률 및 중증도를 현저하게 경감시킨다. 상기 접합물의 유사한 용량을 사용하여 치료학적으로 치료할 경우 발병 기간을 현저하게 단축시키고 질환의 중증도를 경감시킨다.
실시예 XV
TCR 펩타이드를 사용한 관절염의 치료
본 실시예에서는 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 사람의 류마티즘성 관절염을 치료하는 방법을 기술한다. 두가지의 동물 모델을 설정한다: (1) II 유형 콜라겐의 주사에 의해 감염되기 쉬운 마이스에서 유발시킨 관절염[참조: Stuart et al., Ann. Rev. Immunol. 2: 199-218 (1984)] 및 (2) 마이코박테리아성 열 쇼크 단백질(HSP)의 주사에 의해 감염되기 쉬운 래트에서 유발시킨 관절염[참조: Van Eden, W., et al., Nature 331: 171-173(1988)]. 콜라겐 또는 HSP에 민감하고 질환을 전염시킬 수 있는 관절염 유발성 T 세포를 상기 기술된 방법을 사용하여 콜라겐 또는 HSP의 존재하에서 실험실내에서 선택한다. 질환을 매개하는 T형 세포와 관련된 TCR은 상기한 바와 동일한 것으로 생각되며 추정적 아미노산 서열은 상기 핵산 서열에 의해 측정된다. 상기한 마가리트 및 로트바드 등의 알고리듬을 사용하여 CDR 또는 고가변성 영역을 포함하는 TCR의 면역원성 부분을 합성하고 콜라겐 관절염에 대해 마우스를 면역화시키거나 아주번트 관절염에 대해 래트를 면역화시킨다.
질환 유발과 관련하여 TCR 펩타이드로 치료한 동물은 관절 팽윤 및 관절염에 대한 T 세포의 반응성에 의해 측정되는 바와 같이, 관절염 발병으로부터 잘 보호된다. 발병후에 TCR 펩타이드로 치료한 동물에 있어 발병 기간은 현저하게 단축되며 관절염 증상의 중증도는 경감된다.
관절염과 관련된 TCR 펩타이드에 대하여 유도된 항체로 수동 면역시킬 경우에도 관절염 유발에 있어 치료 및 예방 효과를 보여준다. 폴리클로날 항체, mAbs,키메라 항체 및 면역독소 결합된 항체에 의해 성공적인 치료를 달성할 수 있다.
관절염 관련 TCR 펩타이드에 대하여 특이적인 T 세포로 수동 면역화시킬 경우 관절염 발생 및 진행에 대하여 보호 면역성, 즉 예방 및 치료 면역성을 유도한다.
실시예 XVI
TCR 펩타이드를 사용한 갑상선염의 치료
하시모토의 갑상선염 및 그레이브의 질환을 포함하는 사람 갑상선염은 본 실시예에서 기술된 대로 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 치료한다. 타겟 자항원의 정확한 특성이 불확실할지라도, 티로글로불린 및 티로트로핀 수용체 각각에 대한 면역 반응성은 상기한 질환들과 관련되어 있다. 갑상선염을 티오글로불린의 투여에 의해 마우스에서 모델화한다[참조: Maron, R., et al., J. Exp. Med. 152:1115-1120 (1980)]. 티로글로불린 및 갑상선 포상세포 항원에 대해 반응성이고 질환을 전염시킬 수 있는 T 세포는 상기 기술한 방법을 사용하여 티로글로블린, 갑상선 세포 또는 갑상선 세포막 제제의 존재하에서 생체내에서 선택한다. 질환 매개 T형 세포와 관련된 TCR은 상기한 바와 동일한 것으로 생각되며, 추정적 아미노산 서열은 핵산 서열분석에 의해 측정한다. 상기한 마가리트 및 로트바드 등의 알고리듬을 사용하여 CDR 또는 고가변영역을 포함하는 TCR의 면역원성 부위를 합성하고 마우스를 면역화하는데 사용한다.
질환 유발과 관련하여 TCR 펩타이드로 치료한 동물은 갑상선염 및 갑상선 항원에 대한 T 세포 반응성의 발생으로부터 현저하게 보호된다. 상기 질환 발병후의 TCR 펩타이드로 치료한 동물에서는 발병 기간이 현저하게 단축되고 갑상선염의 증상의 중증도가 현저하게 경감된다.
갑상선염과 관련된 TCR 펩타이드에 대하여 유도된 항체를 사용한 수동 면역화는 질환 유발에 있어 유사한 예방 및 치료학적 효과를 나타낸다. 폴리클로날 항체, mAbs, 키메라 항체 및 면역독소 접합 항체에 의해 성공적으로 치료할 수 있다.
갑상선염-연관 TCR 펩타이드에 대해 특이적인 T 세포로 수동 면역화하여 갑상선염의 진행과 악화에 대해 예방학적 및 치료학적 모두에서 보호 면역성을 유도한다.
실시예 XVII
TCR 펩타이드를 사용한 당뇨병의 치료
인슐린-의존성 진성 당뇨병(IDDM) 또는 I 유형 당뇨병은 췌장의 소도(또는 베타) 세포에 대해 지시된 면역 반응성에 의해 특징화되는 자가면역 질환이며, 세포파괴 및 인슐린 생성 중단을 초래한다. 이러한 면역 공격에 대한 타겟 항원은 확실히 특징화되지 않았다. 본 실시예에서는 IDDM이 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 어떻게 치료되는가를 설명한다.
자연적으로 발생하거나 마우스의 특정 균주[참조: Kanasawa et al., Diabetologia 27:113(1984)]로 유도시킬 수 있는 동물에서 당해 질환을 모델화한다. 감염되기 쉬운 마우스로부터 임파세포를 이전시킴으로써 다른 마우스에서 당해 질환이 유발되도록 할 수 있다.
췌장 소도 세포 항원에 반응성이며 당해 질환을 옮길 수 있는 T 세포를 소도 세포 존재하에 또는 상술한 방법을 사용하여 제조한 소도 세포막 제제하에 실험실에서 선택한다. 질환-매개 T 세포와 연관된 TCR을 확인하며 추정적인 아미노산 서열을 상술한 바와 같이 핵산 서열분석에 의해 측정한다. 문헌[참조: Margalit et al. and Rothbard et al., (supra)]의 알고리듬 방식을 사용하여 CDR 또는 과가변성 영역을 포함하는 TCR의 면역원성 부분을 합성하여 마우스를 면역화시키는데 사용한다.
질환 유발과 관련하여 TCR 펩타이드로 치료된 동물은 당뇨병의 진행 및 소도 세포 항원에 대한 T 세포의 반응성이 현저하게 보호된다. 질환 개시후에 TCR 펩타이드로 치료된 동물은 당뇨병 지속 시간이 상당히 감소하고 당뇨병 증상의 중증도가 완화된다.
당뇨병과 관련된 TCR 펩타이드에 대해 유도된 항체로 수동 면역화하면 질환 유발에 대한 유사한 예방학적 및 치료학적 효과를 나타낸다. 성공적인 치료는 폴리클로날 항체, mAbs, 키머라 항체 및 면역 독소 결합된 항체에 의해 달성된다.
당뇨병 관련 TCR 펩타이드에 대해 특이적인 T 세포로 수동 면역화하면 당뇨병의 진행과 악화에 대한 예방학적 및 치료학적 보호성 면역성이 유도된다.
본 발명은 면역 관련 질환을 예방, 억제 또는 치료할 수 있는 T 세포 수용체펩타이드를 제공한다.
상세히 설명된 본 발명에 의해서 본 발명의 취지 및 영역에서 벗어나지 않고 과도한 불필요한 실험없이 광범위한 동등의 매개변수, 농도 및 조건내에 동일한 발명을 수행할 수 있음은 당해 분야의 전문가에게 명백할 것이다.
본 발명을 이의 특정 양태와 관련하여 설명하였을지라도, 추가의 변형이 가능함을 이해할 수 있을 것이다. 본원은 본 발명의 모든 변형, 용도 및 응용을 포함하며, 첨부된 특허청구의 범위의 영역에서 제시된 필수적인 특성이 적용되는 당해 분야내에서 공지되거나 통상적인 실시를 포함할 것이다.

Claims (21)

  1. T 세포 매개된 질환의 특징적인 마커 T 세포 수용체로서의 T 세포 수용체 부분에 상응하는 아미노산 서열을 포함하며, 아미노산 서열이 PKSGHDTVSWYQQALGQG의 아미노산 서열을 갖는 Vβ5.2의 아미노산 잔기 26-43에 상응하는 사람 Vβ5.2(26-43), ALGQGPQFIFQYYEEEERQRG의 아미노산 서열을 갖는 Vβ5.2의 아미노산 잔기 39-59에 상응하는 사람 Vβ5.2(39-59), GNFPDRFSGHQFPNYSSELN의 아미노산 서열을 갖는 Vβ5.2의 아미노산 잔기 59-78에 상응하는 사람 Vβ5.2(59-78), TGAGVSQTPSNKVTEKGKYVEL의 아미노산 서열을 갖는 Vβ6.1의 아미노산 잔기 1-22에 상응하는 사람 Vβ6.1(1-22), SLGQGPEFLIYFQGTGAADDS의 아미노산 서열을 갖는 Vβ6.1의 아미노산 잔기 39-59에 상응하는 사람 Vβ6.1(39-59), RPEGSVSTLKIQRTERGDS의 아미노산 서열을 갖는 Vβ6.1의 아미노산 잔기 70-88에 상응하는 사람 Vβ6.1(70-88) 및 DPGLGLRQIYYSMNVEVTDKG의 아미노산 서열을 갖는 Vβ14의 아미노산 잔기 39-59에 상응하는 사람 Vβ14(39-59)로 이루어지는 그룹중에서 선택되고, 조절 T 세포를 자극할 수 있으며, T 세포 매개된 질환으로부터의 보호를 유도할 수 있는, 펩타이드 또는 이와 등가의 활성을 갖는 변이체 또는 화학적 유도체.
  2. T 세포 매개된 질환의 특징적인 마커 T 세포 수용체로서의 T 세포 수용체 부분에 상응하는 아미노산 서열을 포함하며, 아미노산 서열이 컨센서스 서열 LGQGPXFX(여기서, X는 아미노산이다)을 갖고, 조절 T 세포를 자극할 수 있으며, T 세포 매개된 질환으로 부터의 보호를 유도할 수 있는 펩타이드.
  3. T 세포 매개된 질환의 특징적인 마커 T 세포 수용체로서의 T 세포 수용체 부분에 상응하는 아미노산 서열 ALGQGPQFIFQYYEEEERQRG을 포함하며 조절 T 세포를 자극할 수 있고 T 세포 매개된 질환으로부터의 보호를 유도할 수 있는, 펩타이드 또는 이와 등가의 활성을 갖는 변이체 또는 화학적 유도체.
  4. T 세포 매개된 질환의 특징적인 마커 T 세포 수용체로서의 T 세포 수용체 부분에 상응하는 아미노산 서열 SLGQGPEFLIYFQGTGAADDS을 포함하며 조절 T 세포를 자극할 수 있고 T 세포 매개된 질환으로부터의 보호를 유도할 수 있는, 펩타이드 또는 이와 등가의 활성을 갖는 변이체 또는 화학적 유도체.
  5. T 세포 매개된 질환의 특징적인 마커 T 세포 수용체로서의 T 세포 수용체 부분에 상응하는 아미노산 서열 DPGLGLRQIYYSMNVEVTDKG을 포함하며 조절 T 세포를 자극할 수 있고 T 세포 매개된 질환으로부터의 보호를 유도할 수 있는, 펩타이드 또는 이와 등가의 활성을 갖는 변이체 또는 화학적 유도체.
  6. T 세포 매개된 질환의 특징적인 마커 T 세포 수용체로서의 T 세포 수용체 부분에 상응하는 아미노산 서열을 포함하며, 아미노산 서열이 컨센서스 서열 DPGXGLRXIXYSXXVXXTDKG (여기서, X는 아미노산이다)을 갖고, 조절 T 세포를 자극할 수 있으며, T 세포 매개된 질환으로 부터의 보호를 유도할 수 있는 펩타이드.
  7. 제18항에 있어서, 펩타이드가 아미노산 서열 MNVEVTDKG을 포함하는 펩타이드.
  8. 제2항에 있어서, 아미노산 서열이 LGQGPEFL인 펩타이드.
  9. 제2항에 있어서, 아미노산 서열이 LGQGPQFI인 펩타이드.
  10. 제1항, 제2항 및 제15항 내지 제21항중 어느 한 항에 있어서, 담체 또는 모노클로날 항체일 수 있는 항체에 결합된 펩타이드.
  11. 제1항, 제2항 및 제15항 내지 제21항중 어느 한 항에서 청구된 펩타이드와 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유하는, 자가 면역 질환의 예방, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물.
  12. 제22항에서 청구된 펩타이드와 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유하는, 자가 면역 질환의 예방, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물.
  13. 제1항, 제2항 및 제15항 내지 제21항중 어느 한 항에서 청구된 2개 이상의 상이한 펩타이드와 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유하는, 자가 면역 질환의 예방, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물.
  14. 제22항에서 청구된 2개 이상의 상이한 펩타이드와 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유하는, 자가 면역 질환의 예방, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물.
  15. 제1항, 제2항 및 제15항 내지 제21항중 어느 한 항에 있어서, 질환이 다발성 경화증인 펩타이드.
  16. 제22항에 있어서, 질환이 다발성 경화증인 펩타이드.
  17. T 세포 매개된 질환의 특징적인 마커 T 세포 수용체로서의 T 세포 수용체 부분에 상응하는 아미노산 서열 DPGHGLRLIHYSYGVKDTDKG을 포함하며 조절 T 세포를 자극할 수 있고 T 세포 매개된 질환으로부터의 보호를 유도할 수 있는, 펩타이드 또는 이와 등가의 활성을 갖는 변이체 또는 화학적 유도체.
  18. 제23항에 있어서, 질환이 다발성 경화증인 조성물.
  19. 제24항에 있어서, 질환이 다발성 경화증인 조성물.
  20. 제25항에 있어서, 질환이 다발성 경화증인 조성물.
  21. 제26항에 있어서, 질환이 다발성 경화증인 조성물.
KR1020007002105A 1991-05-31 2000-02-28 면역-관련 질병용 치료제로서의 ｔ 세포 수용체 펩타이드 KR100304042B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/708,022 1991-05-31
US07/735,612 1991-07-16

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019930703699 Division 1993-11-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR100304042B1 true KR100304042B1 (ko) 2001-09-24

Family

ID=

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022075784A1 (ko) * 2020-10-07 2022-04-14 연세대학교 산학협력단 T 세포 수용체, t 세포 수용체를 포함하는 면역 세포 및 이를 이용하는 방법

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022075784A1 (ko) * 2020-10-07 2022-04-14 연세대학교 산학협력단 T 세포 수용체, t 세포 수용체를 포함하는 면역 세포 및 이를 이용하는 방법
KR20220046506A (ko) * 2020-10-07 2022-04-14 연세대학교 산학협력단 T 세포 수용체, t 세포 수용체를 포함하는 면역 세포 및 이를 이용하는 방법
KR102587454B1 (ko) 2020-10-07 2023-10-11 주식회사 다안바이오테라퓨틱스 T 세포 수용체, t 세포 수용체를 포함하는 면역 세포 및 이를 이용하는 방법

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5614192A (en) T cell receptor peptides as therapeutics for immune-related disease
JP3072330B2 (ja) 自己免疫疾患および悪性疾患の治療のためのｔ細胞リセプターペプチド
AU674494B2 (en) T cell receptor peptides as therapeutics for immune-related disease
Steinman The development of rational strategies for selective immunotherapy against autoimmune demyelinating disease
EP0722738A2 (en) Vaccination and methods against diseases resulting from pathogenic responses by specific T cell populations
US6994976B1 (en) Tr3-specific binding agents and methods for their use
US20050282223A1 (en) TR3-specific binding agents and methods for their use
US6464978B1 (en) Vaccination and methods against multiple sclerosis resulting from pathogenic responses by specific T cell populations
Ramírez et al. Induction of resistance to active experimental allergic encephalomyelitis by myelin basic protein‐specific Th2 cell lines generated in the presence of glucocorticoids and IL‐4
Offner et al. Characterization of the immune response to a secondary encephalitogenic epitope of basic protein in Lewis rats. I. T cell receptor peptide regulation of T cell clones expressing cross-reactive V beta genes.
Klareskog What can we learn about rheumatoid arthritis from animal models?
EP0667908B1 (en) Soluble t-cell receptor alpha chain and derivatives used as prophylactic and therapeutic agents for autoimmune diseases
Richert Human T-cell recognition of myelin basic protein peptides
KR100304042B1 (ko) 면역-관련 질병용 치료제로서의 ｔ 세포 수용체 펩타이드
NZ282118A (en) Use of a v&lt;beta&gt;6.1, v&lt;beta&gt;6/6.7 or v&lt;beta&gt;14 containing t cell receptors to treat diabetes
OFFNER et al. Prevention, suppression, and treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis with a synthetic T cell receptor V region peptide
Chatenoud Tolerogenic antibodies and fusion proteins to prevent graft rejection and treat autoimmunity
van Laar et al. Towards T cell vaccination in rheumatoid arthritis
Bach The Immunology of Diabetes: Revolution of Concepts Over
Kirshner T cells specific to epitopes of the human acetylcholine receptor with relevance to myasthenia gravis
Christadoss Myasthenia Gravis: Disease Mechanism and Immunointervention
Wodzig Cyclosporine A-induced experimental autoimmunity
ABRAMOVICI et al. J. Autoimmune Diseases
BG63183B2 (bg) Анти-идиотипна ваксина срещу заболявания в резултат от патогенни отговори на специфични т-клетъчни популации
BG63182B2 (bg) Ваксиниране чрез специфични т- клетъчни популациисрещу заболявания в резултат на патогенни отговори