KR102587454B1 - T 세포 수용체, t 세포 수용체를 포함하는 면역 세포 및 이를 이용하는 방법 - Google Patents

T 세포 수용체, t 세포 수용체를 포함하는 면역 세포 및 이를 이용하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 명세서에서는 항원 특이적 T-세포 수용체뿐만 아니라 핵산, 벡터 및 이를 포함하는 면역 세포 및 이를 이용하는 방법이 제공된다.

Description

T 세포 수용체, T 세포 수용체를 포함하는 면역 세포 및 이를 이용하는 방법{T CELL RECEPTORS, IMMUNE CELL COMPRISING T CELL RECEPTORS AND METHOD USING THE SAME}
본 발명은 T 세포 수용체, T 세포 수용체를 포함하는 NK 세포 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다.
2018년 기준 암치료를 위한 세포치료제는 길리어드, 노바티스와. MOLMED에서 개발된 혈액암 치료제인 Axicabtagene ciloleucel, Tisagenlecleucel, Immuncell-LC 등이 이미 시장에서 암치료에 활용되고 있고, phase 2/3에 진입한 세포치료제들도 임상시험을 진행중에 있다. 전체 세포치료제 개발의 50 % 이상이 북미 (USA)에서 진행되고 있으며(2018년 기준 344건), 중국에서도 상당한 부분 연구가 진행되고 있다(203건).
암세포의 표면을 인식하고 활성화되는데 적합한 CAR-T, TCR을 변형시킨 TCR-T, 종양의 항원을 인식하는 자가 T세포, TIL, 등 다양한 형태의 세포치료제가 개발되어 전임상 및 임상연구에 진행중이다. 특히, CD19를 타겟하는 세포치료제가 가장 많이 개발되고 있으며, TAA/TSA, BCMA, GD2, HER2 등이 뒤를 잇고 있다. 마켓까지 진출한 세포치료제로서는 CD19가 거의 유일하며, 현재 IND 프로세스가 대부분의 임상과 전임상 연구와 연계되어 진행중이다.
세포치료제를 현재 사용중인 면역관문억제제(Immune check point inhibitor)와 비교하였을 때, 종양 내 T세포의 결여에 의하여 면역관문억제제에 대한 효능이 충분하지 않다는 점과, 종양 내 T세포 중 종양의 항원을 타겟하는 T세포는 5% 내외로 적다는 점에서 면역치료제에 대한 한계점이 존재한다. 따라서, 종양을 타겟하는 면역세포만 증식하여 활용한다는 점에서 종양을 집중적으로 공격할 수 있는 세포치료제가 이점이 있다.
폐암의 경우 전 세계적으로 높은 사망률을 가지고 있으며, 특히 아시아 폐암환자가운데 EGFR 돌연변이 종양은 50%로 상당히 높은 편이며, 이 가운데 27%가 L858R에 대한 돌연변이를 가지고 있다. EGFR 돌연변이의 특징은 EGFR 표적치료제에 대한 효과가 초반에 잘 보이지만 8개월 내지 10개월 뒤에 대부분의 환자가 획득내성을 가지며, 획득내성 이후에 대한 치료제가 전무한 상태이다. 특히 면역관문억제제와의 병용치료에 대한 효과가 없음이 알려지면서, 새로운 치료제의 개발이 필요한 상태이다.
이에, 이러한 종양의 성장을 지시하는 결정적인 유전적 손상을 특이적으로 표적하는 치료제가 필요한 실정이다.
발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
한편, 자연 살해 세포(Natural Killer Cell, NK cell)는 선천성 면역계의 주요 성분을 구성하는 세포독성 림프구이다. 일반적으로 순환 림프구 중 약 10-15%를 나타내는 NK 세포는, 항원에 대해 비-특이적이며, 선행 면역 감작 없이 바이러스가 감염된 세포를 포함하는 많은 악성 세포들을 표적화하여 결합할 수 있으며, 나아가, 이들을 사멸시킬 수 있다. 이때, 표적화 세포의 사멸은 세포 용해를 유도함으로써 발생시킬 수 있다.
따라서, NK 세포는 치료 목적으로, 대상체의 말초 혈액 림프구로부터 단리되고, 단리된 NK 세포는 다시 세포 배양을 통하여 많은 수를 확보한 뒤, 대상체 내에 재주입되는 방식으로 사용되고 있다. 이러한, NK 세포의 치료 즉, 생체 외 및 생체 내 주입 요법은 감염 또는 종양 세포에 있어 매우 효과적인 세포 사멸을 유도할 수 있음에 따라, 각광을 받고 있다. 그러나, NK 세포 주입 요법은 표적에 제한적이라는 한계점을 가지고 있다.
이에, 본 발명의 발명자들은 이를 극복하기 위하여, 유전자 변형을 통한 NK 세포를 주목하였다. 보다 구체적으로, 종래의 NK 세포 기반의 세포 치료제는 Fc 수용체의 발현을 통하여 항체 의존 세포 독성 반응을 유도하거나, 키메라 항원 수용체의 발현을 통한 암 표적화 등의 전략을 세우고 있다. 그러나, 이러한 전략은 고형암의 치료에 있어 큰 효과를 얻지 못하고 있는 실정이다.
이에, 본 발명의 발명자들은 전술한 고형암 치료의 한계를 극복하기 위하여, 특정 항원에 특이적인 T 세포의 수용체를 주목하였고, 이를 통하여 NK 세포의 고형암에 대한 표적화를 증진시키고자 하였다.
결국, 본 발명의 발명자들은 고형암에 대한 특정 분자 변이를 인식할 수 있는 T 세포 수용체를 확인하였고, 이를 NK 세포(NK-92) 및 세포주에서 발현되도록 유전자를 변형시켜, 고형암에 대한 NK 세포의 표적화를 향상시킬 수 있었다.
나아가, 본 발명의 발명자들은 전술한 NK 세포에 Fc 수용체를 더 포함할 경우, 표적화된 고형암에 대한 면역 반응이 더욱 향상시킬 수 있다는 것을 인지하였으며, 이에 따라, 본 발명의 발명자들은 T 세포 수용체 및 Fc 수용체를 모두 포함하여, 고형암에 대한 표적화 및 이의 항암 효과가 더욱 향상된 NK 세포를 개발하였다.
보다 구체적으로, 본 발명의 발명자들은 암환자의 WES과 RNA seq 결과를 토대로 항원 예측율 90% 이상을 보여주는 분석 플렛폼을 확인하였다. 이때, 분석에 적용된 알고리즘은 Net-MHC 알고리즘을 기반으로 한 Neopepsee를 통해 항원 후보군을 확인하였다. 그 다음, 예측된 항원을 합성하여, DC 및 CD8 T세포에 처리하여 항원을 검증하는 과정을 수행하였다.
이에, L858R에 대한 항원을 인식할 수 있는 주요 HLA-A 대립 유전자(alleles)를 발견하였다. 그 결과, A*33:03에 대한 HVKITDFGR항원이결합 친화도(binding affinity)가 높을 뿐만 아니라, neopepsee에서 제공하는 10가지 이상의 파라메터의 기준에서 항원으로서 충분히 작용할 수 있음을 예측할 수 있었다.
이를 기반으로 종양 특이 항원을 예측할 수 있는 검증 플랫폼을 구축하여 항원에 대한 반응을 확인하였다. 검증 플렛폼은 HLA-A가 매칭되는 정상인의 말초 혈액 단색 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에서 수지상 세포(dendritic cell, DC)를 분화시켜 항원을 인식하고, 이를 기반으로 L858R에 대한 항원 반응도를 측정하였다.
그 결과, 예측된 바와 같이 L858R을 인식하는 HLA-A를 가진 환자에서 종양에 특이적으로 반응하는 T세포가 생산되어, 항원에 대한 반응(IFN-gamma ELISPOT)을 확인하였다.
또한, 전술한 과정에 의하여 확인된 T세포의 TCR이 면역 세포 내에서 발현할 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 암세포의 표면에 증가하는 MHC-1-L858R 신항원 복합체(neoantigen complex)를 타겟하는 TCR을 가진 T 세포 혹은 NK-92세포를 제공하여, 암세포를 직접적으로 사멸시킬 수 있는 EGFR- 돌연변이 타겟 세포치료제를 제공하는 것이다.
나아가, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 전술한 TCR을 가진 T 세포 혹은 NK-92세포에 Fc 수용체를 더 포함함으로써, 이에 대한 면역 반응을 더 향상시켜, 암세포에 대한 사멸기능이 더욱 향상된 세포치료제를 제공하는 것이다.
나아가, 전술한 HLA-A의 아시아인 비중은 20 % 이상으로서, EGFR의 돌연변이를 가지고 있는 상당한 환자들이 본 발명에 대한 혜택을 볼 수 있을 것으로 기대하고 있다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 T 세포 수용체(T cell receptor)로서,
(ⅰ) 아미노산 서열 CAFIGHGGSQGNLIF (서열번호 1) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
아미노산 서열 CASSMQGAMSEQFF(서열번호 13) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,
(ii) 아미노산 서열 CAATGTYKYIF (서열번호 2) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
아미노산 서열 CASSPEFARALDNQPQHF (서열번호 14) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,
(iii) 아미노산 서열 CAYGGGSEKLVF (서열번호 3) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
아미노산 서열 CASSSATGTQGYTF (서열번호 15) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,
(iv) 아미노산 서열 CALINARLMF (서열번호 4) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
아미노산 서열 CASSFTNTGELFF (서열번호 16) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,
(v) 아미노산 서열 CAVNGGSQGNLIF (서열번호 5) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
아미노산 서열 CASSMWQGNGEQYF (서열번호 17) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,
(vi) 아미노산 서열 CAMREGYGGATNKLIF (서열번호 6) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
아미노산 서열 CASSVGPGTTSYNEQFF (서열번호 18) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,
(vii) 아미노산 서열 CAYNNGDGGSQGNLIF (서열번호 7) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
아미노산 서열 CATSRDRSTDTQYF (서열번호 19) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,
(viii) 아미노산 서열 CATDGGSARQLTF (서열번호 8) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
아미노산 서열 CASSLGLSGYTF (서열번호 20) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,
(ix) 아미노산 서열 CATLYNTDKLIF (서열번호 9) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
아미노산 서열 CASSQSMNTEAFF (서열번호 21) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,
(x) 아미노산 서열 CAMRGPWRGSSGSARQLTF (서열번호 10) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
아미노산 서열 CASRTGLSYEQYF (서열번호 22) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,
(xi) 아미노산 서열 CALSVRGFKTSYDKVIF (서열번호 11) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
아미노산 서열 CASSFGSAYNEQFF (서열번호 23) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,
(xii) 아미노산 서열 CAVNMMDSSYKLIF (서열번호 12) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
아미노산 서열 CASSFPTARSNTEAFF (서열번호 24) 또는 이의 변이체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하는, T 세포 수용체를 제공한다.
본 발명의 특징에 따르면, T 세포 수용체는,HVKITDFGR (서열번호 49)의 아미노산 서열 또는 이의 MHC-결합 형태 내에 포함된 에피토프에 결합할 수 있으며, 에피토프는, HLA-A*33:03 및 HLA-A*31:01 중 적어도 하나와 결합 친화도(binding affinity)를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, T 세포 수용체는, EGFR L858R 돌연변이를 표적으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, TCR 알파 사슬 가변 영역은, 서열번호 55의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 서열번호 55는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, TCR 알파 사슬 가변 영역은, 서열번호 57의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 서열번호 57는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, TCR 베타 사슬 가변 영역은, 서열번호 56의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 서열번호 56는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, TCR 베타 사슬 가변 영역은, 서열번호 58의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 서열번호 58는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, T 세포 수용체는, 단일 사슬 유형(single chain type)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 상기 TCR 알파 사슬 가변 영역 및 상기 TCR 베타 사슬 가변 영역은, 링커 서열에 의해 연결될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은, 전술한 내용에 따른 TCR을 인코딩하는 핵산이 제공된다.
본 발명의 특징에 따르면, 핵산은, 서열번호 51 내지 54 중 적어도 하나의 핵산 서열; 또는 상기 서열번호 51 내지 54 중 적어도 하나의 핵산 서열과 적어도 80 % 이상의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
이때, 서열번호 51 및 53은, TCR 알파 사슬 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열을 의미할 수 있으며, 서열번호 52 및 54은, TCR 베타 사슬 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열을 의미할 수 있다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 핵산은, Furin, 2A 및 IRES 서열을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은, 전술한 내용에 따른 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다.
이때, 벡터는 발현 벡터로서, 렌티 바이러스 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에서 사용될 수 있는 발현 벡터를 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 특징에 따르면, 벡터는, 서열번호 50의 핵산 서열; 또는 상기 서열번호 50의 핵산 서열과 적어도 80 % 이상의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은, 전술한 내용에 따른 T 세포 수용체를 포함하는면역 세포가 제공된다.
이때, 면역 세포는 전술한 내용에 따른 TCR, 핵산 및 벡터를 포함할 수 있으며, NK-92 세포일 수 있다. 즉, 면역 세포는 전술한 내용에 따른 TCR, 핵산 및 벡터를 포함함에 따라, TCR이 발현된 NK-92일 수 있다.
나아가, 면역 세포는, NK-92 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, TCR이 삽입되어 변형될 수 있는 다양한 면역세포를 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 전술한 T 세포 수용체를 포함하는 면역세포를 포함하는 세포 치료제가 제공된다.
본 발명의 특징에 따르면, 세포 치료제는 효과 T 세포(effector T cell)를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 세포 치료제는, 고형암(solid tumor) 치료제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 49의 HVKITDFGR 항원을 포함하는 모든 암종에 대한 치료제일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 발명은, 획득 내성이 생긴 종양에 대한 새로운 치료제로 제안될수 있다. 보다 구체적으로, 종래의 폐암 치료제는 초반에는 효과가 잘 보이지만 8 내지 10 개월 뒤 대부분의 환자에서 획득 내성이 발생한다. 그러나, 이에 대한 대체 치료제가 전무한 상태이다.
이에, 본 발명은 이러한 한계점을 극복할 수 있는 새로운 치료제로 제안될 수 있다. 또한, 본 발명은 획득 내성뿐만 아니라 돌연변이가 발생하여 잠복한(harboring) EGFR을 표적하여 치료할 수 있는 효과가 있다.
나아가, 본 발명은, 반감기가 존재하는 약제들과는 달리 T 세포에 대한 초기 활성(activation)에 의하여 다른 면역 반응까지 함께 증가시킴으로서, 종양에 대한 살해 효과(killing effect)를 상승시킬 수 있는 효과가 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 메모리 T 세포의 분화 및 증식을 유도하여, 암 세포의 방어 기작을 피해 암 또는 종양성 상태를 치료, 재발, 진행, 및 전이를 예방할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 종래의 TKI 및 PD-1/PD-L1과 같은 치료제와 병행하여 각각 약제의 효과를 상승시키고, 이에, 환자의 생존률을 증가시킬 수 있는 효과가 있다.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.
도 1은 암환자의 항원을 예측하는 시스템 및 이를 근거로 TCR-T 또는 TCR-NK 세포 제조 방법을 예시적으로 도시한 것이다.
도 2는 Neopepsee로 예측된 항원 검증 과정을 예시적으로 도식한 것이다.
도 3은 검증 플랫폼으로 분석된 항원 특이적인 T 세포를 검증 결과를 도시한 것이다.
도 4a 내지 4b는 L858R를 타겟하는 HLA-A와 항원 서열 (sequences) 결과를 도시한 것이다.
도 5a 내지 5d는 EGFR-MT-L858R-HVKITDFGR-A*33:03 tetramer에 특이적으로 부착하는 종양 특이적 T 세포에 대한 결과이다.
도 6은 항원(EGFR-MT-L858R-HVKITDFGR-A*33:03 tetramer)에 특이적으로 활성이 유도된 T 세포의 세포 살상 인자에 대한 결과이다.
도 7은 항원(EGFR-MT-L858R-HVKITDFGR-A*33:03 tetramer)에 특이적으로 활성이 유도된 T 세포의 수용체에 대한 분포도이다.
도 8은 T 플라스크 배양 시 NK-92 세포 주에 대한 결과이다.
도 9는 FBS 및 IL-2의 농도에 따른 NK-92의 증식 효율에 대한 결과이다.
도 10은 배양 방법에 따른 NK-92 세포 주의 세포 증식 효율에 대한 결과이다.
도 11a 및 도 11b는 배양 조건에 따른 NK-92 세포 주 및 Fc 수용체를 발현하는 NK-92 세포 주의 활성 인자 및 독성 인자에 대한 결과이다.
도 12는 단백질 발현 promoter에 따른 NK-92 세포의 GFP 발현 효율에 대한 결과이다.
도 13 및 13b는 NK-92 세포에서 케모카인 수용체의 발현에 대한 결과이다.
도 14a 및 14b는 NK-92 세포에서의 CD3 분자 및 T 세포 수용체 분자의 발현에 대한 결과이다.
도 15a는 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR 서열을 발현시키기 위한 렌티바이러스 벡터맵이다.
도 15b는 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR 서열을 발현시키기 위한 CD3 분자 및 T 세포 수용체의 핵산 서열에 대한 모식도이다.
도 16a 및 16b는 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR의 세포 활성을 확인한 결과이다.
도 17a 및 17b는 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR을 포함하는 NK 세포에 대한 세포 살상 효과를 확인한 결과이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR을 포함하는 NK 세포의 종양 억제 효과를 확인한 결과이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 " T 세포 수용체 ( T-cell receptor, TCR ) " 는, 천연 (natural) TCR 뿐만 아니라 TCR 변이체, 단편, 및 구조물을 포함한다. 따라서, TCR은 선택적으로 추가의 도메인 및/또는 모이어티를 포함하여, TCR 알파 및 베타 사슬을 포함하는 헤테로다이머 뿐만 아니라 다량체 및 단일 사슬 구조물을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 에피토프 ( epitope ) " 는, 일반적으로 결합 도메인이 인식하는 항원, 전형적으로 (폴리-) 펩타이드 상의 부위를 의미한다. 이때, 결합 도메인은 항원 결합 부위를 의미한다. 즉, 항원 표적의 특정 에피토프와 결합 및 상호작용하는 분자의 도메인을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 자연 살해 세포 ( Natural killer cell, NK cell ) " 는, 특정한 항원 자극의 부재 하에, 주요 조직족합성 복합체 (MHC) 클래스에 따른 제한 없이 표적 세포를 사멸시키는 면역계의 세포이다. 표적 세포는 암 또는 종양 세포일 수 있다. NK 세포는 CD56의 존재 및 CD3 표면 마커의 부재를 특징으로 한다. 따라서 인위적으로 CD3-gamma, delta, zeta 등을 삽입하여 연구를 진행할 예정에 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 벡터 ( vector ) " 는, 형질전환 과정에 의해 허용 세포 내에 위치되는 경우, 벡터가 복제될 수 있도록 무손상 레플리콘을 포함하는 비 염색체 핵산을 지칭한다. 벡터는 박테리아에서 복제될 수 있으나, 포유류 세포에서는 제한된 복제 능력을 갖으며, 바이러스성 또는 비-바이러스성일 수 있다. 핵산을 전달하기 위한 비-바이러스 벡터는 네이키드 DNA, 단독 또는 양이온성 중합체와 조합하여 양이온성 지질과 복합체화된 DNA, 음이온성 및 양이온성 리포솜, 리포솜에 함유된 양이온성 중합체, 이종 폴리리신, 규정된 길이의 올리고 펩티드, 폴리에틸렌아민과 축합된 DNA를 포함하는 DNA 단백질 복합체 및 입자, 바이러스 및 폴리리신 DNA를 포함하는 3원 복합체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 면역 세포 " 는, T 세포, 자연 살해 T (natural killer T cell, NKT), 자연 살해 세포 (natural killer cell, NK), 인간 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 (hematopoietic stem cell, HSC) 및 유도 다능성 줄기 세포 (induced pluripotent stem cells, iPS)를 포함할 수 있다. 이때, T 세포는 세포독성 T 세포 (CTL), 조절 T 림프구, 염증성 T 림프구, 헬퍼 T 림프구 및 감마-델타 T 세포, 선천성 림프구 (ILC1, ILC2)일 수 있으며, 나아가, 전술한 T 세포는 CD4+, CD8+ 및 이들의 혼합 집단 일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 인간 백혈구 항원 ( human leukocyte antigen, HLA ) " 는, 면역계 조절의 원인이 되는 세포의 표면 상에서 주조직 적합성 복합체 (MHC) 단백질을 암호화하는 인간 유전자를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 수지상 세포 ( dendritic cells, DC ) " 는 림프성 또는 비-림프성 조직에서 발견되는 형태학적으로 유사한 세포 유형의 다양한 집단의 구성원을 의미한다. 이러한 세포는 이들의 독특한 형태, 및 항원 펩티드를 T 세포에 제시하는 단백질인 표면 MHC 클래스 I 및 II 분자의 높은 발현 수준을 특징으로 한다. DC를 포함한 APC (대식세포 등) 및 T 세포는 말초 혈액으로부터의 유래된 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC )와 같이 쳔리하게 말초 혈액 및 다수의 조직으로부터 단리되거나 유래 및 분화될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 치료 " 는 암의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 특이적(으로) 결합 "은, 일반적으로 TCR이 이의 항원 결합 부위를 통해 무작위의 무관한 비-표적 항원보다 이의 의도된 항원 표적에 더 쉽게 결합함을 의미한다. 나아가, "특이적으로 결합한다"는 이의 항원 표적에 대한 TCR의 결합 특이성이 비표적 항원에 대한 이의 결합 특이성보다 적어도 약 5배, 바람직하게는 10배, 보다 바람직하게는 25배, 보다 더 바람직하게는 50배 및 가장 바람직하게는 100배 이상 더 클 수 있음을 의미할 수 있다.
항원 예측 및 검증 과정
이하에서는, 도 1 내지 3b를 참조하여, Neopepsee를 통한 항원 예측 및 검증 과정을 설명한다.
도 1은 암환자의 항원을 예측하는 시스템 및 이를 근거로 TCR-T 또는 TCR-NK 세포 제조 방법을 예시적으로 도시한 것이다. 예를 들어, 환자의 종양으로부터 RNA sequencing, whole exome sequencing이 그리고 normal blood에서의 reference WES을 통해 환자종양에서 나타나는 체성돌연변이를 확보한 후, 환자로 부터 유래된 단핵구를 수지상세포로 분화하여, 앞서 확인된 돌연변이 유전자로 부터 확인되는 에피토프를 노출하여 항원제시를 통해 T세포를 증식시키고, 증식된 T세포의 반응도를 확인하고, 확인된 반응을 기반으로 T세포의 TCR sequencing을 통해 TCR의 CDR3서열을 확보한 뒤, 본 서열이 들어가 있는 유전자 전달체를 통해 T세포를 종양 특이적인 세포로 변형시킨다. 이에, 자가 T세포 혹은 NK-92 세포를 토대로 하여 세포치료제를 생성하고 검증할 수 있다.
보다 구체적으로, 먼저, 항원 예측은 종양에 대한 백신이나, 세포치료제를 개발하기에 앞서서 가장 앞서 선행 되어야한다. 항원 예측은 종양에 대한 돌연변이 분석 (WES: whole exome sequencing)에 의하여 확보된 비정상적인 돌연변이 단백질이며 RNA seq을 통해서 돌연변이 항원의 발현되는 것을 근거로 증명된다. 종양의 항원과 MHC-1과의 affinity가 높아지는 경우 면역세포에서 인식할 수 있는 항원으로서 가능성이 있는 것을 의미할 수 있다. 본 연구에서는 항원 분석을 위한 분석 파이프라인으로 Neopepsee를 사용하였다.
그 다음, 예측된 항원에 대한 peptide는 95%이상 고순도로 9개의 아미노산으로 합성/정제되어 항원을 녹이는데 가장많이 사용하는 DMSO를 용매로 하여 수지상 세포에 LPS와 함께 노출 mature DC로 분화된 이후, T 세포의 education을 진행한다.
그 다음, IFN-gamma의 발현 정도에 따른 검증이 수행된다.
기존에 항원을 분석할 수 있는 검증 플렛폼으로 pVAC seq이 가장 보편적으로 사용이 되며, 이는 리눅스와 파이썬 프로그램을 기반으로 한 open 분석 플렛폼이다. 이 프로그램의 중심 알고리즘으로서는 NetMHC-pan이라고 하는 HLA-A의 binding affinity를 수치화 시킬 수 있으며, pVAC seq에서는 추가적으로 RNA seq을 통해 종양항원의 발현 정도 포함한다. Neopepsee도 동일한 알고리즘을 포함하고 있고, 12가지 추가적인 파라메터가 포함되어 있어 보다 향상된 분석 플렛폼을 보여준다. 기존에 보고되어 있는 항원 검색프로그램간의 밴치마킹분석에서도 우월한 결과를 확보한 분석 플렛폼이다. Neopepsee는 open 소스 프로그램으로 최근 학술발표가 된 분석기술이다.
따라서 본 연구진은 EGFR에 대한 돌연변이를 가지고 있는 환자를 토대로 하여, L858R 및 E19Del에 대한 돌연변이 여부를 판단하여 실험을 진행하였다.
도 1을 참조하면, 먼저, 환자의 종양에 대한 WES, WES에서의 germline mutation 혹은 SNV를 위하여 matched normal blood를 이용하여 reference삼아 분석을 진행하였다. WES에서 돌연변이 여부를 판단하기 위하여 사용된 tool은 GATK2 파이프라인이며, hg38에 대한 mapping 데이터를 근거로 하여 분석을 진행하였다.
환자 혈액 50ml을 확보하고, IFNg ELISPOT 데이터를 근거로 혈액내에 존재하는 DC에 T세포를 통해 항원에 대한 인식률 검증을 수행하였다.
그 다음, 컴퓨터에 제시된 후보 항원에 대한 검증이 완료되면, T 세포의 TCR seq를 분석하여 종양의 항원을 가장 잘 인식할 수 있는 주요 TCR을 검증한다.
그 다음, 검증된 T 세포의 TCR seq를 통해 CDR3에 대한 재조합 TCR을 제작하여 자가/동종 T 세포 및 NK-92 세포에서 항원을 특이적으로 인식할 수 있는 세포 치료제를 생산하고 이를 검증한다.
도 2는 Neopepsee로 예측된 항원 검증 과정을 예시적으로 도시한 것이다. 이때, 전체적인 항원검증 과정은 약 21일 정도가 소요되며, 이는 상당히 짧은 기간내에 환자의 PBMC로부터 종양 특이적으로 반응하는 항원을 검증할 수 있는 플램폼이다. Neopepsee로 예측된 항원은 CD14로부터 분화된 iDC에서 합성된 9 mer 펩타이드 항원과 함께 mDC로 분화, 분화된 DC는 T세포와 함께 co-culture 후 항원 특이적인 T세포로 증식, IFN-gamma의 발현도를 근거로 검증한다. 각 단계에서 세포치료제 개발에 있어 중요한 단계 10가지에 대한 부분을 표기, QC 포인트를 지정하였다.
보다 구체적으로, 도 2를 참조하면, 먼저, 첫째 날 환자의 혈액으로부터 PBMC를 분리를 한다. 이때, PBMC를 분리하기 위하여 사용하는 protocol은 혈액내의 림프구와 단핵구를 확보할 수 있는 방법으로, CD14가 양성인 세포 즉, 단핵구를 자석과 항체-microbead 방법을 통해 확보할 수 있다.
그 다음, CD14+인 세포는 DC로 분화를 시키는 과정을 진행한다. 이때, GM-CSF, IL-4를 사용하여 imDC로의 분화를 유도한다.
그 다음, CD8+세포도 CD14-에서 동일한 방법으로 취한 뒤에 -80C에 보관을 한 뒤 항원을 제시할 수 있는 imDC에 co-culture를 위하여 사용한다.
그 다음, 7-8일차에 이미 기존에 합성한 종양항원 10 ug/ml과 함께 LPS를 처리하여 16시간동안 배양하여 DC에서의 종양항원이 충분히 인식될 수 있도록 배양을 한다.
그 다음, washing 과정을 거치고, CD8이 양성인 세포와 함께 배양을 한다.
그 다음, DC-CD8+세포의 공동 배양은 약 11일간 진행되며, IL-7/IL-15가 처리된 전용 media에서 배양을 한다.
그 다음, 11일 이후 확보된 T세포의 cell counting을 수행하고, cell counting이 완료된 이후 항원을 재 처리하여 T세포에서 발현되는 IFN-gamma의 발현여부를 ELISPOT을 통해 분석을 진행한다.
도 3은 검증 플랫폼으로 분석된 항원 특이적인 T 세포를 검증 결과를 도시한 것이다. 이때, Neopepsee에 대한 항원검증능력을 확인하기 위한 것으로서, 환자 20명 (HLA-A타입이 A*:24:02환자)에 대한 대표적인 항원을 수지상세포에 인식시키고 T세포를 교육시킨 뒤, 실제로 종양항원에 대한 반응이 있는지를 확인하기 위한 ELISPOT 검증실험을 수행하였다. 그 결과 90%이상의 항원 검증 능력이 있는것을 확인하였다.
보다 구체적으로, 전 세계적으로 가장 많은 비중을 차지하고 있는 HLA-A 타입인 A*24.02를 가지고 실험을 진행하였다. 20명의 환자를 대상으로 한 환자 별 특이항원을 Neopepsee로 예측하였고, 총 41개의 항원을 DC에 인식을 시켜주고 T세포를 교육시킨 이후에 이 항원에 대한 반응 정도를 check를 해 본 결과, 41개의 항원중에 3개를 제외하고 각각의 종양의 항원에 반응을 보였다. 나아가, 항원에 대한 IFN-gamma의 spot의 개수 및 표면적 (activity)으로 나타낼 수 있으며, IFN-gamma의 spot의 개수가 많을수록 항원에 대한 제시(presenting)가 잘된 것을 의미할 수 있으며, 표면적은 항원 대한 IFN-gamma의 양을 의미할 수 있다. 나아가, 아무것도 처리하지 않는 그룹에서의 T세포의 IFN-gamma의 발현정도를 cut-off로 하여 양성을 판단하였다.
이에, 도 3을 참조하면, Neopepsee에서 예측된 바와 같이 항원에 대한 IFN-gamma의 발현 예측도는 IFN-gamma의 발현을 기준으로 90 %이상의 예측률을 가지는 것으로 나타난다. 20명의 환자를 대상으로 한 환자 별 특이 항원을 Neopepsee로 예측하였고, 41가지 항원에 대한 반응도를 예측한 결과 90%이상 종양 항원에 대한 반응이 확인되었다
이상의 결과로, 예측력 높은 종양 특이 항원을 선별할 수 있으며, 이를 기반으로 세포 치료제의 개발 및 검증할 수 있다.
EGFR 돌연변이 종양에 대한 특이 항원 확보
이하에서는, 도 4a 및 4b를 참조하여, EGFR 돌연변이 종양에 대한 특이 항원에 대하여 설명한다.
도 4a 및 4b는 L858R를 타겟하는 HLA-A와 항원 서열(sequences) 결과를 도시한 것이다.
도 4a를 참조하면, EGFR에 대한 L858R 돌연변이를 인식할 수 있는 항원은 Neopepsee를 통하여 선별되었으며, EGFR에 대한 L858R 돌연변이 펩타이드와 야행성(wild, WT) 타입의 펩타이드를 생산하고, EGFR에 대한 L858R 돌연변이를 인식할 수 있는 항원을 12개의 major HLA-A에 적용하여 9 내지 11 mer에 대한 항원 예측정도를 MHC 결합 친화도(binding affinity)를 통하여 검증하였다.
전술한 과정에 의하여, HLA-A*2402, HLA-A*0201, HLA-A*3303, HLA-A*1101, HLA-A*0206 및 HLA-A*3101를 포함하는 HLA-A가 선별되었으며, 이들은 모두 5 % 이상의 높은 빈도를 가지는 것으로 나타나며, 이 중 10 % 이상의 빈도를 가지는 HLA-A*2402, HLA-A*0201 및 HLA-A*3303을 선택하여, EGFR에 대한 L858R 돌연변이를 포함하는 총 10명의 환자의 샘플로부터 항원을 도출하고자 하였다.
이에, 도 4b를 참조하면, EGFR에 대한 L858R 돌연변이를 포함하는 총 10명의 환자의 샘플은 HLA-A*2402 및 HLA-A*0201와 달리 모두 공통적으로 HLA-A*3303을 포함하는 것으로 나타남에 따라, HLA-A*3303가 선택되어 이에 대한 항원을 확인하였다.
결국, HLA-A*3303에 기초한 환자의 샘플에서 HVKITDFGR 서열의 항원이 동일한 반응(결과)를 갖는 것으로 나타남에 따라, EGFR에 대한 L858R 돌연변이에 대한 표적 항원을 HVKITDFGR로 선정하였다.
이상의 결과로, 예측력 높은 종양 특이 항원을 선별할 수 있으며, 이를 기반으로 세포 치료제의 개발 및 검증할 수 있다.
T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)
이하에서는, 도 5a 내지 도 7을 참조하여, EGFR 돌연변이 종양에 대한 특이 항원을 표적할 수 있는 TCR에 대하여 설명하도록 한다. 이때, EGFR 돌연변이 종양에 대한 특이 항원을 표적할 수 있는 TCR을 확인하기 위하여, EGFR-L858R에 특이적인 T세포를 생산하였고, 생산된 T세포를 Tetramer를 이용하여 분리(sorting)하였다. 나아가, 분리된 세포는 단일 세포 RNA 분석 기법을 통하여 분석되었다.
보다 구체적으로, 먼저, 개체의 혈액에서 CD14+ 양성 세포를 분리하여, EGFR-MT 항원(9mer)과 함께 배양하여 항원 제시를 유도한 뒤, 동일 개체의 CD8+ 양성 세포와도 14일간 공동 배양한 뒤, ELISPOT을 통하여 EGFR-L858R에 특이적인 T세포의 존재를 확인하였다. 나아가, Tetramer를 이용하여 EGFR-MT 9mer-MHC-1 complex와 결합할 수 있는 T 세포를 선별(sorting)한 뒤, scRNA seq/VDJ을 통하여, 이의 TCR에 대한 서열을 확보하였다.
먼저, 도 5a 내지 5d를 참조하여, EGFR L858R 돌연변이 항원에 특이적인 T 세포 선별 과정에 대하여 설명하도록 한다.
도 5a는 EGFR-MT-L858R-HVKITDFGR-A*33:03 tetramer에 특이적으로 부착하는 종양 특이적 T 세포에 대한 결과이다. 이때, 설명의 편의를 위하여, 도 5b 내지 5d를 참조하여 설명하도록 한다. 나아가, TCR의 확인을 위하여 A*33:03/A*02.06을 포함하는 개체로부터 시료가 수집되었다.
EGFR-MT-L858R-HVKITDFGR-A*33:03 tetramer에 특이적으로 부착되는 종양 특이적 T 세포(EGFR-L858R-A*33:03 tetramer positive T cells)는 기억 T 세포(memory T cells)로서, CD44+CCR7+ 중심기억세포 (central memory T cells, Tcm) 및 CD44+CCR7- 효과기억세포 (effector memory T cells, Tem)와 이들이 혼합된 세포(Tcm and Tem mixed, CD44+CCR7+/-)를 포함하는 것으로 나타난다.
보다 구체적으로, 도 5b 내지 5d를 참조하면, 1a에서 전술한 T세포에서의 세포 활성 인자에 대한 발현 결과가 도시된다.
먼저, 5b를 참조하면, EGFR-MT-L858R-HVKITDFGR-A*33:03 tetramer에 특이적으로 부착되는 종양 특이적 T 세포(EGFR-L858R-A*33:03 tetramer positive T cells)는 CD8a, CD4, CD44 및 CD62L을 발현하는 것으로 나타나며, 이는 성숙 T 세포 인자임에 따라, EGFR-MT-L858R-HVKITDFGR-A*33:03 tetramer에 특이적으로 부착되는 종양 특이적 T 세포(EGFR-L858R-A*33:03 tetramer positive T cells)가 성숙한 T 세포임을 의미할 수 있다.
그 다음, 5c를 참조하면, EGFR-MT-L858R-HVKITDFGR-A*33:03 tetramer에 특이적으로 부착되는 종양 특이적 T 세포(EGFR-L858R-A*33:03 tetramer positive T cells)는 CD25 및 CD69를 발현하는 것으로 나타나며, 이는 세포 활성 인자임에 따라, EGFR-MT-L858R-HVKITDFGR-A*33:03 tetramer에 특이적으로 부착되는 종양 특이적 T 세포(EGFR-L858R-A*33:03 tetramer positive T cells)는 활성화된 효과 T 세포임(effector T cel)을 의미할 수 있다.
그 다음, 5d를 참조하면, EGFR-MT-L858R-HVKITDFGR-A*33:03 tetramer에 특이적으로 부착되는 종양 특이적 T 세포(EGFR-L858R-A*33:03 tetramer positive T cells)는 CCR7, IFN-gamma 및 Granzyme-B을 발현하는 것으로 나타난다.
이때, CCR7는 기억 세포 인자임에 따라, EGFR-MT-L858R-HVKITDFGR-A*33:03 tetramer에 특이적으로 부착되는 종양 특이적 T 세포(EGFR-L858R-A*33:03 tetramer positive T cells)는 기억 T 세포로서, 장시간 체내에서 생존하며, 2차 면역 응답을 야기할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
나아가, IFN-gamma 및 Granzyme-B는 세포 독성 인자임에 따라, EGFR-MT-L858R-HVKITDFGR-A*33:03 tetramer에 특이적으로 부착되는 종양 특이적 T 세포(EGFR-L858R-A*33:03 tetramer positive T cells)는 사이토카인(cytokine)을 분비할 수 있는 T 세포임을 의미할 수 있다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 EGFR-MT-L858R-HVKITDFGR-A*33:03 tetramer에 특이적으로 부착되는 종양 특이적 T 세포(EGFR-L858R-A*33:03 tetramer positive T cells)는 L858R 돌연변이를 포함하는 종양에 대한 생체 내 면역 반응에 있어 활성화된 T 세포를 의미하며, 이에 따라, L858R 돌연변이를 포함하는 종양에 항암 효과를 가질 수 있다.
이하에서는, 도 6 및 7을 참조하여, EGFR L858R 돌연변이 항원에 특이적인 T 세포에 대한 수용체(TCR)에 대하여 설명하도록 한다. 이때, EGFR L858R 돌연변이 항원에 특이적인 T 세포에 대한 수용체 서열은, 도 5a 내지 5d의 과정을 통하여, 선별된 T 세포에서 세포 살상 인자의 발현에 기초하여 도출되었다.
보다 구체적으로, 도 6은 항원(EGFR-MT-L858R-HVKITDFGR-A*33:03 tetramer)에 특이적으로 활성이 유도된 T 세포의 세포 살상 인자에 대한 결과이다.
먼저, 도 6의 (a)를 참조하면, EGFR-MT-L858R-HVKITDFGR-A*33:03 tetramer에 특이적으로 부착되는 종양 특이적 T 세포(EGFR-L858R-A*33:03 tetramer positive T cells) 중 세포 살상 인자를 발현하는 세포는 약 800 개의 전체 세포 중 10 내지 15 % 정도를 차지하는 것으로 나타나며, 전체 활성된 세포 중에서는 약 27 % 정도의 비율을 차지하는 것으로 나타난다. 즉, EGFR-MT-L858R-HVKITDFGR-A*33:03 tetramer에 특이적으로 부착되는 종양 특이적 T 세포(EGFR-L858R-A*33:03 tetramer positive T cells)는 활성될 경우, 높은 비율로 세포 독성(살상) 인자를 발현할 수 있다는 것을 의미할 수 있으며, 이에 따라, 종양에 있어 효과적으로 세포 독성(살상) 효과를 가질 수 있다.
따라서, 도 6의 (b)를 참조하면, 전술한 세포 살상 인자를 발현하는 T 세포 중 세포 살상 인자를 가장 높게 발현하는 세포들만을 선별한 뒤, 이들의 상관 관계를 분석하였다.
이에, 도 7을 참조하면, 항원(EGFR-MT-L858R-HVKITDFGR-A*33:03 tetramer)에 특이적으로 활성이 유도된 T 세포의 수용체에 대한 분포도가 도시된다. 이때, T 세포의 수용체에 대한 분석은 도 2에서 선별된 세포에 기초하여 수행되었으며, 단일 세포 분석을 통하여 T 세포 수용체의 사슬에 대한 V, D, J 및 C 구성 서열을 분석하였으며, 이에 기초하여 CDR3 서열에 대한 서열 분석을 진행하였다. 먼저, 분석된 T 세포 수용체는 총 295가지의 다양성을 가졌으며, 이 중 상위 10 순위까지의 T 세포 수용체 사슬에 대한 분석 결과는 하기의 [표 1]에 표시되어 있으며, TRAV23/DV6 및 TRBV18에 대한 조합과 TRAV24 및 TRBV19에 대한 조합이 가장 높은 빈도를 가지는 것으로 나타난다.
rank frequency TCR-alpha TCR-beta
v_genes j_genes c_genes v_genes j_genes c_genes
1 7 TRAV23/DV6 TRAJ40 TRAC TRBV18 TRBJ1-5 TRBC1
2 7 TRAV24 TRAJ42 TRAC TRBV19 TRBJ2-1 TRBC2
3 6 TRAV16 TRAJ50 TRAC TRBV27 TRBJ2-1 TRBC2
4 5 TRAV8-1 TRAJ37 TRAC TRBV19 TRBJ2-3 TRBC2
5 4 TRAV12-3 TRAJ13 TRAC TRBV9 TRBJ2-3 TRBC2
6 4 TRAV3 TRAJ49 TRAC TRBV12-4 TRBJ1-3 TRBC1
7 3 TRAV12-2 TRAJ27 TRAC TRBV6-1 TRBJ1-2 TRBC1
8 3 TRAV13-1 TRAJ42 TRAC TRBV24-1 TRBJ1-1 TRBC1
9 3 TRAV16 TRAJ54 TRAC TRBV7-9 TRBJ2-1 TRBC2
10 3 TRAV27 TRAJ28 TRAC TRBV19 TRBJ1-5 TRBC1
나아가, 전술한 [표 1]의 분석 결과에 기초하여, 생성된 CDR3에 대한 서열은 하기의 [표 2]에 표시하였으며, 이들은 모두, 세포 살상 인자를 발현하는 T 세포에 기초하여 선별되었음에 따라, 서열번호 1 내지 12의 아미노산 서열로 구성된 TCR 알파 사슬 가변 영역의 CDR 3 및 서열번호 13 내지 24의 아미노선 서열로 구성된 TCR 베타 사슬 가변 영역의 CDR 3을 포함한 경우, EGFR L858R 돌연변이 종양에 대한 항암 효과를 가질 수 있다. 이때, [표 2]의 순서는 세포 살상 인자(IFN-gamma, Granzyme-B)의 발현율에 따라, 나열하였다(rank 1이 가장 높은 발현율).
나아가, EGFR L858R 돌연변이 종양에 대한 항암 효과가 보다 효과적인 TCR은 서열번호 1 내지 8의 아미노산 서열로 구성된 TCR 알파 사슬 가변 영역의 CDR 3 및 서열번호 13 내지 20의 아미노선 서열로 구성된 TCR 베타 사슬 가변 영역의 CDR 3을 포함한 TCR일 수 있다.
이때, 세포 살상 인자의 발현 수준(분비력)은 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열로 구성된 TCR 알파 사슬 가변 영역의 CDR 3 및 서열번호 13 및 14의 아미노선 서열로 구성된 TCR 베타 사슬 가변 영역의 CDR 3을 포함한 TCR이 가장 높은것으로 개시되었으나, 서열번호 3 내지 12의 아미노산 서열로 구성된 TCR 알파 사슬 가변 영역의 CDR 3 및 서열번호 15 및 24의 아미노선 서열로 구성된 TCR 베타 사슬 가변 영역의 CDR 3을 포함한 TCR의 세포 살상 인자에 대한 발현 수준은 유사한 것으로 나타난다.
이에, 서열번호 1 내지 12의 아미노산 서열로 구성된 TCR 알파 사슬 가변 영역의 CDR 3을 포함하는 TCR의 세포 살상 효과는 동일할 수 있으며, 서열번호 13 내지 24의 아미노선 서열로 구성된 TCR 베타 사슬 가변 영역의 CDR 3을 포함하는 TCR의 세포 살상 효과 또한 동일할 수 있다.
EGFR L858R 돌연변이 종양에 대한 항암 효과가 가장 효과적인 TCR은 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열로 구성된 TCR 알파 사슬 가변 영역의 CDR 3 및 서열번호 13 및 14의 아미노선 서열로 구성된 TCR 베타 사슬 가변 영역의 CDR 3을 포함한 TCR일 수 있다.
Rank chain CDR3 AA sequence 　SEQ. CDR3 NA sequence (5' - 3') SEQ.
1 TRA CAFIGHGGSQGNLIF 서열번호 1 TGTGCCTTTATAGGCCATGGAGGAAGCCAAGGAAATCTCATCTTT 서열번호 25
TRB CASSMQGAMSEQFF 서열번호 13 TGTGCCAGTAGTATGCAGGGGGCTATGAGTGAGCAGTTCTTC 서열번호 37
2 TRA CAATGTYKYIF 서열번호 2 TGTGCAGCAACAGGAACCTACAAATACATCTTT 서열번호 26
TRB CASSPEFARALDNQPQHF 서열번호 14 TGTGCCAGCTCACCGGAGTTTGCGAGGGCGCTGGACAATCAGCCCCAGCATTTT 서열번호 38
3 TRA CAYGGGSEKLVF 서열번호 3 TGTGCTTATGGCGGCGGATCTGAAAAGCTGGTCTTT 서열번호 27
TRB CASSSATGTQGYTF 서열번호 15 TGTGCCAGCAGCTCGGCCACAGGGACGCAGGGCTACACCTTC 서열번호 39
4 TRA CALINARLMF 서열번호 4 TGTGCTCTGATTAATGCCAGACTCATGTTT 서열번호 28
TRB CASSFTNTGELFF 서열번호 16 TGTGCCAGCAGTTTCACCAACACCGGGGAGCTGTTTTTT 서열번호 40
5 TRA CAVNGGSQGNLIF 서열번호 5 TGTGCCGTGAACGGAGGAAGCCAAGGAAATCTCATCTTT 서열번호 29
TRB CASSMWQGNGEQYF 서열번호 17 TGTGCCAGTAGTATGTGGCAGGGGAACGGCGAGCAGTACTTC 서열번호 41
6 TRA CAMREGYGGATNKLIF 서열번호 6 TGTGCAATGAGAGAGGGATATGGTGGTGCTACAAACAAGCTCATCTTT 서열번호 30
TRB CASSVGPGTTSYNEQFF 서열번호 18 TGTGCCAGCAGCGTAGGCCCAGGGACAACCTCCTACAATGAGCAGTTCTTC 서열번호 42
7 TRA CAYNNGDGGSQGNLIF 서열번호 7 TGTGCTTATAATAACGGGGATGGAGGAAGCCAAGGAAATCTCATCTTT 서열번호 31
TRB CATSRDRSTDTQYF 서열번호 19 TGTGCCACCAGCAGAGACCGTAGCACAGATACGCAGTATTTT 서열번호 43
8 TRA CATDGGSARQLTF 서열번호 8 TGTGCTACGGACGGGGGTTCTGCAAGGCAACTGACCTTT 서열번호 32
TRB CASSLGLSGYTF 서열번호 20 TGTGCCAGCAGCTTGGGATTAAGTGGCTACACCTTC 서열번호 44
9 TRA CATLYNTDKLIF 서열번호 9 TGTGCTACGTTATATAACACCGACAAGCTCATCTTT 서열번호 33
TRB CASSQSMNTEAFF 서열번호 21 TGTGCCAGCAGCCAGTCAATGAACACTGAAGCTTTCTTT 서열번호 45
10 TRA CAMRGPWRGSSGSARQLTF 서열번호 10 TGTGCAATGAGAGGGCCCTGGAGAGGGTCTTCTGGTTCTGCAAGGCAACTGACCTTT 서열번호 34
TRB CASRTGLSYEQYF 서열번호 22 TGTGCCAGCAGAACGGGACTCTCATACGAGCAGTACTTC 서열번호 46
11 TRA CALSVRGFKTSYDKVIF 서열번호 11 TGTGCTCTAAGTGTCAGGGGATTCAAAACCTCCTACGACAAGGTGATATTT 서열번호 35
TRB CASSFGSAYNEQFF 서열번호 23 TGTGCCAGCAGTTTTGGGTCAGCCTACAATGAGCAGTTCTTC 서열번호 47
12 TRA CAVNMMDSSYKLIF 서열번호 12 TGTGCCGTGAACATGATGGATAGCAGCTATAAATTGATCTTC 서열번호 36
TRB CASSFPTARSNTEAFF 서열번호 24 TGTGCCAGCAGTTTCCCGACAGCTCGATCGAACACTGAAGCTTTCTTT 서열번호 48
이상의 결과에 따라, 전술한 서열번호 1 내지 12의 아미노산 서열로 구성된 TCR 알파 사슬 가변 영역의 CDR 3 및 서열번호 13 내지 24의 아미노선 서열로 구성된 TCR 베타 사슬 가변 영역의 CDR 3을 포함하는 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR은 높은 빈도로 발현되는 CDR3을 포함함에 따라, EGFR-L858R 돌연변이 항원(HVKITDFGR-A*33:03)을 보다 정확하게 표적할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR은 세포 살상 인자의 발현 또한, 매우 높음에 따라, EGFR-L858R 돌연변이 항원을 포함하는 종양에 있어, 보다 효과적인 항암 반응(종양 세포 사멸 효과)을 가질 수 있다.
NK 세포
이하에서는, 8 내지 14b를 참조하여, EGFR 돌연변이 종양에 대한 특이 항원을 표적할 수 있는 TCR 및 Fc 수용체를 포함하는 NK 세포에 대하여 설명하도록 한다.
먼저, 도 8을 참조하면, T 플라스크 배양 시 NK-92 세포 주에 대한 결과가 도시된다. 이때, NK 세포는 NK-92 세포이며, X-vivo 10 media 또는 Xuri T cell media를 이용하여 배양되었으며, 보다 구체적으로, 배양액은 X-vivo 10 또는 Xuri T cell media에 1 내지 10% human AB serum, 100 내지 2000 U/ml IL-2, 0.1 내지 5 mM L-asparagine, 0.1 내지 5 mM L-glutamine, 0.1 내지 5 mM L-serine가 첨가되었었으며, 이들의 용량은 이에 제한되는 것은 아니다. 나아가, NK-92 세포는 2.5 x 105 cells/ml의 농도로 계대 배양되고, T 플라스크에 배양하였으며, 3일 간격으로 계대 배양되었다. 더 나아가, 세포 증식은 헤마토사이토미터기를 이용하여 세포 개수를 측정하였으며, 세포 생존율은 트리판 블루 염색 또는 세포 사멸 마커인 PI로 염색하여 유세포분석기를 이용하여 확인하였으며, 세포 증식 효율은 세포 증식 인자인 KI67으로 염색하여 유세포분석기를 이용하여 확인하였다. 전술한 과정은, 도 8 및 도 9에서 동일하게 수행되었다.
NK-92세포의 세포 밀도(cell density)는 계대 배양으로 인하여 배양 22일까지 1 x 105 내지 1 x 106 cells/ml으로 일정하게 유지된 것으로 나타나며, 이를 증식 배수(fold expansion)으로 보았을 경우, NK-92세포의 수는 배양 22일 동안 126 fold 증가한 것으로 나타난다. 나아가, 세포 생존율(cell viability)은 배양 22일까지 80 내지 100 %로 일정하게 유지되는 것으로 나타나며, 세포 분화력(cell proliferation) 또한 배양 22일까지 70 내지 85 %로 일정하게 유지되는 것으로 나타난다.
그 다음, 도 9을 참조하면, FBS 및 IL-2의 농도에 따른 NK-92의 증식 효율에 대한 결과가 도시된다.
먼저, 도 9의 (a) 및 (b)를 참조하면, FBS 농도에 따른 NK-92의 증식 효율은 FBS가 5 %로 첨가되었을 경우가 가장 좋은 것으로 나타난다. 나아가, 도 13의 (c) 및 (d)를 참조하면, IL-2 농도에 따른 NK-92의 증식 효율은 IL-2가 1000 U/ml로 첨가되었을 경우가 가장 좋은 것으로 나타난다. 즉, NK-92세포에 있어, FBS 및 IL-2가 높을수록, 증식 효율이 높아지는 것으로 나타나며, NK-92 세포의 증식 효율을 가장 바람직하게 높일 수 있는 FBS 및 IL-2의 농도는 각각 5 % 및 1000 U/ml일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
도 10을 참조하면, 배양 방법에 따른 NK-92 세포 주의 세포 증식 효율에 대한 결과가 도시된다. 이때, NK-92세포는, 효과적인 증식을 위하여 세포 증식 장비인 Xuri W-25 장비가 이용되어 배양되었다. 이때, NK-92의 배양액은 전술한 도 11 내지 15에서 사용된 배양액과 동일하며, Xuri W-25 장비에 2L 내지 10L 크기의 perfusion bag을 설치 후 배양액을 접종하여 안정화시켰다. 나아가, 배양액의 온도 및 pH가 안정화된 이후, 0.5~1.0 x 108 cells/bag의 NK-92 세포가 접종되었으며, 배양 환경 조건은 2에서 2 RPM으로 교반(shaking)되도록 설정되었다. 또한, 세포 생존율, 세포 증식율, 세포 개수는 세포 접종 이후, 12시간 마다 측정되었으며, 2일 간격으로 배양액의 절반을 필터를 통해 제거한 뒤, 새로운 배약액을 접종하여 최종적으로 2L perfusion bag에는 1L, 10L perfusion bag에는 5L의 배양액으로 세포를 배양하였다. 나아가, 0.5 내지 1.0 x 1010 세포 수에 도달하였을 때, 세포 수확 장비인 Sefia S-2000을 이용하여 NK-92세포를 수확한 뒤, 세포의 생존율, 세포 증식율, 세포의 개수를 측정하였다.
도 10의 (a)를 참조하면, 세포 밀도는 optimization 10L scale로 배양한 경우가, 가장 빠르게 1 * 102의 세포 밀도에 도달한 것으로 나타나며, 이때, 100배에 이르기까지의 시간은 일반적인 T 플라스크 배양보다 11일 단축된 것으로 나타난다. 나아가, 도 10의 (b)를 참조하면, 증식 배수는 optimization 10L scale로 배양한 경우가, 가장 빠르게 1 * 1010의 증식 배수에 도달한 것으로 나타나며, 이때, 1 * 1010에 이르기까지의 시간은 일반적인 T 플라스크 배양보다 11일 단축된 것으로 나타난다. 이에, NK-92 세포는 Xuri W-25 장비에서 optimization 10L scale 배양한 경우, 보다 빠른 시간 내에 많은 수를 획득할 수 있다.
도 11a 및 11b를 참조하면, 배양 조건에 따른 NK-92 세포 주 및 Fc 수용체를 발현하는 NK-92 세포 주의 활성 인자 및 독성 인자에 대한 결과가 도시된다. 이때, NK-92 세포의 세포 활성 표면 인자, 세포 독성 인자 및 케모카인 수용체의 확인을 위하여 각각의 안티바디로 염색 후 유세포분석기를 이용하여 확인하였다. 보다 구체적으로, 세포 활성 표면 인자는 NKG2D, NKp30, NKp44 및 NKp46을 이용하여 확인하였으며, 세포 독성 인자는 CD107, Granzyme B 및 Perforin을 통하여 확인하였다.
11a를 참조하면, 배양 조건에 따른 NK-92 세포 주의 활성 인자 및 독성 인자에 대한 결과가 도시된다. NK-92는 Xuri media로 배양된 경우, 세포 활성 표면 인자인 NKG2D, NKp30, NKp44 및 NKp46와 세포 독성 인자인 CD107, Granzyme B 및 Perforin이 모두 발현하는 것으로 나타난다. 이와 마찬가지로, NK-92는 X-vivo media로 배양된 경우, 세포 활성 표면 인자인 NKG2D, NKp30, NKp44 및 NKp46와 세포 독성 인자인 CD107, Granzyme B 및 Perforin이 모두 발현하는 것으로 나타난다.
나아가, 11b를 참조하면, 배양 조건에 따른 Fc 수용체를 발현하는 NK-92 세포 주의 활성 인자 및 독성 인자에 대한 결과가 도시된다. Fc 수용체를 발현하는 NK-92는 Xuri media로 배양된 경우, 세포 활성 표면 인자인 NKG2D, NKp30, NKp44 및 NKp46와 세포 독성 인자인 CD107, Granzyme B 및 Perforin이 모두 발현하는 것으로 나타난다. 이와 마찬가지로, Fc 수용체를 발현하는 NK-92는 X-vivo media로 배양된 경우, 세포 활성 표면 인자인 NKG2D, NKp30, NKp44 및 NKp46와 세포 독성 인자인 CD107, Granzyme B 및 Perforin이 모두 발현하는 것으로 나타난다.
이상의 결과에 따라, NK-92 세포 주 및 Fc 수용체를 발현하는 NK-92 세포 주는 Xuri media 및 X-vivo media 모두에서 배양될 경우, 세포의 활성 및 세포 독성을 기능을 모두 발현할 수 있다.
도 12를 참조하면, 단백질 발현 promoter에 따른 NK-92 세포의 GFP 발현 효율에 대한 결과가 도시된다. 이때, NK-92 세포에서 T 세포 수용체의 발현을 위한 프로모터의 선별을 위하여 각각의 프로모터에 따른 단백질 발현을 확인하였다. 보다 구체적으로, 전기천공법 및 pCAG-GFP, pEF-1α-GFP, pCMV-GFP 플라스미드를 이용하여 NK-92세포를 형질 전환시켰다. 이때, 플라스미드의 농도는 1 x 106 cell 당 2ug일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그 다음, 형질 도입 후 24시간 뒤에 유세포 분석기 및 CAG, EF-1α, CMV 등을 사용하여 GFP 단백질의 발현을 확인하였다.
GFP에 대한 발현율은 pCMV 프로모터가 가장 높은것으로 나타남에 따라, NK-92 세포에서 T 세포 수용체의 발현을 위한 프로모터는 pCMV가 가장 바람직할 수 있다.
도 13a 및 13b는, NK-92 세포에서 케모카인 수용체의 발현에 대한 결과를 도시한 것이다. 이때, 케모카인 수용체는 도 11a 내지 11b와 동일한 방법으로, 유세포 분석기 및 케모카인 수용체인 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CX3CR1을 통하여 발현이 확인되었다. 먼저, 13a를 참조하면, 전술한 배양 조건 및 방법에 따라 배양된 NK-92세포는 케모카인 수용체인 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8 및 CCR9를 발현하는 것으로 나타난다.
나아가, 도 13b를 참조하면, NK-92세포는 케모카인 수용체인 CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6 및 CX3CR1을 발현하는 것으로 나타난다.
이에, 전술한 배양 조건 및 방법에 따라 배양된 NK-92세포는 케모카인 수용체를 발현함에 따라, 후천면역 반응을 활성화시킬 수 있다.
도 14a 및 14b는 NK-92 세포에서의 CD3 분자 및 T 세포 수용체 분자의 발현에 대한 결과를 도시한 것이다. 이때, 전기 천공법 및 pCMV-CD3γT2AδF2AεP2Aζ 플라스미드와 pCMV-TCRαT2Aβ 플라스미드를 이용하여 NK-92 세포를 형질 전환시켰다. 이때, 플라스미드의 농도는 1 x 106 cell 당 2ug일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그 다음, 형질 도입 후 24시간 뒤에 유세포 분석기를 이용하여 CD3 분자 및 T 세포 수용체 분자의 발현을 확인하였다.
먼저, 도 14a를 참조하면, CD3 분자를 발현하는 NK-92 세포는 전체 NK-92 세포에 대하여 28.8%를 차지하는 것으로 나타난다. 즉, T세포 항원 수용체의 보조 단백질 사슬인 CD3가 NK-92세포에서 발현됨에 따라, 전술한 과정에 의하여 NK-92세포에 TCR이 안정적으로 형질 도입된 것을 의미할 수 있다.
그 다음, 도 14b를 참조하면, T 세포 수용체를 발현하는 NK-92 세포는 전체 NK-92 세포에 대하여 8.3%를 차지하는 것으로 나타난다. 즉, T세포 항원 수용체가 NK-92세포에서 발현됨에 따라, 전술한 과정에 의하여 NK-92세포에 TCR이 안정적으로 형질 도입된 것을 의미할 수 있다.
이상의 과정을 통하여, 본 발명은 고형암 특히, EGFR 돌연변이를 포함하는 폐암을 보다 효과적으로 표적화할 수 있는 TCR 및 이를 포함하는 면역 세포 즉, NK세포를 제공할 수 있으며, 이를 통하여 항암 효과를 향상시킬 수 있다.
결국, 본 발명의 면역세포는 전술한 TCR을 포함함에 따라, EGFR 돌연변이를 포함하는 폐암을 보다 효과적으로 표적화할 수 있음에 따라, 표적화된 암세포에 대한 항암 효과를 더욱 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 TCR 및 이를 포함하는 NK 세포
이하에서는, 15a 및 15b를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR(서열번호 1 내지 12의 아미노산 서열로 구성된 TCR 알파 사슬 가변 영역의 CDR 3 및 서열번호 13 내지 24의 아미노선 서열로 구성된 TCR 베타 사슬 가변 영역의 CDR 3을 포함하는 TCR 및 이를 포함하는 NK 세포의 구성에 대하여 구체적으로 설명하도록 한다.
도 15a는 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR 서열을 발현시키기 위한 렌티바이러스 벡터맵이다.
이때, NK-92 세포로의 형질 도입(EGFR-L858R 돌연변이 항원(HVKITDFGR-A*33:03)에 특이적으로 활성이 유도되는 TCR의 서열을 발현)을 위하여, 렌티바이러스 벡터가 이용되었으며, 형질 도입에 있어 사용될 수 있는 벡터는 렌티 바이러스 벡터에 한정되는 것은 아니며, 당업계에서 형질 도입에 사용될 수 있는 다양한 벡터가 모두 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 TCR의 서열 발현을 위한 렌티 바이러스 벡터 서열: 5'-ACGCGTGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCACTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAATTCAAAATTTTATCGATACTAGTATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTTTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCCACCATGGAACATAGCACGTTTCTCTCTGGCCTGGTACTGGCTACCCTTCTCTCGCAAGTGAGCCCCTTCAAGATACCTATAGAGGAACTTGAGGACAGAGTGTTTGTGAATTGCAATACCAGCATCACATGGGTAGAGGGAACGGTGGGAACACTGCTCTCAGACATTACAAGACTGGACCTGGGAAAACGCATCCTGGACCCACGAGGAATATATAGGTGTAATGGGACAGATATATACAAGGACAAAGAATCTACCGTGCAAGTTCATTATCGAATGTGCCAGAGCTGTGTGGAGCTGGATCCAGCCACCGTGGCTGGCATCATTGTCACTGATGTCATTGCCACTCTGCTCCTTGCTTTGGGAGTCTTCTGCTTTGCTGGACATGAGACTGGAAGGCTGTCTGGGGCTGCCGACACACAAGCTCTGTTGAGGAATGACCAGGTCTATCAGCCCCTCCGAGATCGAGATGATGCTCAGTACAGCCACCTTGGAGGAAACTGGGCTCGGAACAAGGGGTCCGGCGGAAGCGGAGAGGGCAGGGGATCTCTCCTTACTTGTGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGAACAGGGGAAGGGCCTGGCTGTCCTCATCCTGGCTATCATTCTTCTTCAAGGTACTTTGGCCCAGTCAATCAAAGGAAACCACTTGGTTAAGGTGTATGACTATCAAGAAGATGGTTCGGTACTTCTGACTTGTGATGCAGAAGCCAAAAATATCACATGGTTTAAAGATGGGAAGATGATCGGCTTCCTAACTGAAGATAAAAAAAAATGGAATCTGGGAAGTAATGCCAAGGACCCTCGAGGGATGTATCAGTGTAAAGGATCACAGAACAAGTCAAAACCACTCCAAGTGTATTACAGAATGTGTCAGAACTGCATTGAACTAAATGCAGCCACCATATCTGGCTTTCTCTTTGCTGAAATCGTCAGCATTTTCGTCCTTGCTGTTGGGGTCTACTTCATTGCTGGACAGGATGGAGTTCGCCAGTCGAGAGCTTCAGACAAGCAGACTCTGTTGCCCAATGACCAGCTCTACCAGCCCCTCAAGGATCGAGAAGATGACCAGTACAGCCACCTTCAAGGAAACCAGTTGAGGAGGAATGGGTCCGGCGGAAGCGGAGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGCAGTCGGGCACTCACTGGAGAGTTCTGGGCCTCTGCCTCTTATCAGTTGGCGTTTGGGGGCAAGATGGTAATGAAGAAATGGGTGGTATTACACAGACACCATATAAAGTCTCCATCTCTGGAACCACAGTAATATTGACATGCCCTCAGTATCCTGGATCTGAAATACTATGGCAACACAATGATAAAAACATAGGCGGTGATGAGGATGATAAAAACATAGGCAGTGATGAGGATCACCTGTCACTGAAGGAATTTTCAGAATTGGAGCAAAGTGGTTATTATGTCTGCTACCCCAGAGGAAGCAAACCAGAAGATGCGAACTTTTATCTCTACCTGAGGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCATGGAGATGGATGTGATGTCGGTGGCCACAATTGTCATAGTGGACATCTGCATCACTGGGGGCTTGCTGCTGCTGGTTTACTACTGGAGCAAGAATAGAAAGGCCAAGGCCAAGCCTGTGACACGAGGAGCGGGTGCTGGCGGCAGGCAAAGGGGACAAAACAAGGAGAGGCCACCACCTGTTCCCAACCCAGACTATGAGCCCATCCGGAAAGGCCAGCGGGACCTGTATTCTGGCCTGAATCAGAGACGCATCGGATCCGGGTCCGGCGGAAGCGGACAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAACCCTGGACCTATGAAGTGGAAGGCGCTTTTCACCGCGGCCATCCTGCAGGCACAGTTGCCGATTACAGAGGCACAGAGCTTTGGCCTGCTGGATCCCAAACTCTGCTACCTGCTGGATGGAATCCTCTTCATCTATGGTGTCATTCTCACTGCCTTGTTCCTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGGGAGGTCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGCGGGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGGGAAGAGTACGACGTCCTGGATAAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCTCGGCGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTATCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAACCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGC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GCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTG -3' (서열번호 50)
나아가, 벡터는 CD3 분자의 구성 요소와 TCR 알파 및 베타의 구성 요소를 포함할 수 있다.
이에, 도 15b를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR 서열을 발현시키기 위한 CD3 분자 및 T 세포 수용체의 핵산 서열에 대한 모식도가 도시된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 TCR 서열을 발현시키기 위한 CD3 분자 및 T 세포 수용체의 핵산 서열에 대한 구성 요소들은 각 요소들은 독립적인 발현을 위하여, Furin + x2A 서열 및 IRES 서열로 연결되어 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 TCR의 서열 발현을 위한 TCR alpha 핵산 서열 (TRAV23/DV6): 5'-ATGGAGACCCTCTTGGGCCTGCTTATCCTTTGGCTGCAGCTGCAATGGGTGAGCAGCAAACAGGAGGTGACGCAGATTCCTGCAGCTCTGAGTGTCCCAGAAGGAGAAAACTTGGTTCTCAACTGCAGTTTCACTGATAGCGCTATTTACAACCTCCAGTGGTTTAGGCAGGACCCTGGGAAAGGTCTCACATCTCTGTTGCTTATTCAGTCAAGTCAGAGAGAGCAAACAAGTGGAAGACTTAATGCCTCGCTGGATAAATCATCAGGACGTAGTACTTTATACATTGCAGCTTCTCAGCCTGGTGACTCAGCCACCTACCTC TGTGCAGCAACAGGAACCTACAAATACATCTTT GGAAGAGGAACCAGCCTTATTGTTCATCCGTATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC-3' (서열번호 51)
본 발명의 일 실시예에 따른 TCR의 서열 발현을 위한 TCR beta 핵산 서열 (TRBV18) : 5'-ATGAGCATCGGCCTCCTGTGCTGTGCAGCCTTGTCTCTCCTGTGGGCAGGTCCAGTGAATGCTGGTGTCACTCAGACCCCAAAATTCCAGGTCCTGAAGACAGGACAGAGCATGACACTGCAGTGTGCCCAGGATATGAACCATGAATACATGTCCTGGTATCGACAAGACCCAGGCATGGGGCTGAGGCTGATTCATTACTCAGTTGGTGCTGGTATCACTGACCAAGGAGAAGTCCCCAATGGCTACAATGTCTCCAGATCAACCACAGAGGATTTCCCGCTCAGGCTGCTGTCGGCTGCTCCCTCCCAGACATCTGTGTACTTC TGTGCCAGCTCACCGGAGTTTGCGAGGGCGCTGGACAATCAGCCCCAGCATTTT GGCCCAGGCACCCGGCTGACAGTGCTCGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTATGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAG-3' (서열번호 52)
이때, 서열번호 51 및 52는 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR인 서열번호 1 및 13의 아미노산 서열에 대한 핵산 서열(서열번호 25 및 37)을 포함하고 있으며, 서열번호 51 및 52에 대한 아미노산 서열은 하기의 서열번호 55 및 56과 같다(밑줄 및 굵은 글씨로 표시).
본 발명의 일 실시예에 따른 TCR의 서열 발현을 위한 TCR alpha 아미노산 서열 (TRAV23/DV6) : METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYL CAATGTYKYIF GRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(서열번호 55)
본 발명의 일 실시예에 따른 TCR의 서열 발현을 위한 TCR beta 아미노산 서열 (TRBV18) : MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYF CASSPEFARALDNQPQHF GPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG-3' (서열번호 56)
본 발명의 일 실시예에 따른 TCR의 서열 발현을 위한 TCR alpha 핵산 서열 (TRAV24): 5'-ATGGAGACCCTCTTGGGCCTGCTTATCCTTTGGCTGCAGCTGCAATGGGTGAGCAGCAAACAGGAGGTGACGCAGATTCCTGCAGCTCTGAGTGTCCCAGAAGGAGAAAACTTGGTTCTCAACTGCAGTTTCACTGATAGCGCTATTTACAACCTCCAGTGGTTTAGGCAGGACCCTGGGAAAGGTCTCACATCTCTGTTGCTTATTCAGTCAAGTCAGAGAGAGCAAACAAGTGGAAGACTTAATGCCTCGCTGGATAAATCATCAGGACGTAGTACTTTATACATTGCAGCTTCTCAGCCTGGTGACTCAGCCACCTACCTC TGTGCCTTTATAGGCCATGGAGGAAGCCAAGGAAATCTCATCTTT GGAAGAGGAACCAGCCTTATTGTTCATCCGTATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC-3' (서열번호 53)
본 발명의 일 실시예에 따른 TCR의 서열 발현을 위한 TCR beta 핵산 서열 (TRBV19) : 5'-ATGAGCATCGGCCTCCTGTGCTGTGCAGCCTTGTCTCTCCTGTGGGCAGGTCCAGTGAATGCTGGTGTCACTCAGACCCCAAAATTCCAGGTCCTGAAGACAGGACAGAGCATGACACTGCAGTGTGCCCAGGATATGAACCATGAATACATGTCCTGGTATCGACAAGACCCAGGCATGGGGCTGAGGCTGATTCATTACTCAGTTGGTGCTGGTATCACTGACCAAGGAGAAGTCCCCAATGGCTACAATGTCTCCAGATCAACCACAGAGGATTTCCCGCTCAGGCTGCTGTCGGCTGCTCCCTCCCAGACATCTGTGTACTTC TGTGCCAGTAGTATGCAGGGGGCTATGAGTGAGCAGTTCTTC GGCCCAGGCACCCGGCTGACAGTGCTCGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTATGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAG-3' (서열번호 54)
이때, 서열번호 53 및 54는 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR인 서열번호 2 및 14의 아미노산 서열에 대한 핵산 서열(서열번호 26 및 38)을 포함하고 있으며, 서열번호 53 및 54에 대한 아미노산 서열은 하기의 서열번호 57 및 58과 같다(밑줄 및 굵은 글씨로 표시).
본 발명의 일 실시예에 따른 TCR의 서열 발현을 위한 TCR alpha 아미노산 서열 (TRAV24) : METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYL CAFIGHGGSQGNLIF GRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS (서열번호 57)
본 발명의 일 실시예에 따른 TCR의 서열 발현을 위한 TCR beta 아미노산 서열 (TRBV19) : MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYF CASSMQGAMSEQFF GPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG (서열번호 58)
전술한 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR의 서열은 NK 세포뿐만 아니라, T 세포, 자연 살해 T (natural killer T cell, NKT), 인간 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 (hematopoietic stem cell, HSC) 및 유도 다능성 줄기 세포 (induced pluripotent stem cells, iPS)등을 포함하는 다양한 면역 세포에서 발현시켜 사용될 수 있으며, 이에 따라, 이러한 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR의 서열을 포함하는 면역 세포는 EGFR-L858R 돌연변이 항원(HVKITDFGR-A*33:03)을 포함하는 다양한 종양 세포에 대하여 보다 효과적인 면역 반응 및 항암 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 TCR 및 이를 포함하는 NK 세포에 대한 검증
이하에서는 도 16a 내지 18을 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR(서열번호 1 내지 12의 아미노산 서열로 구성된 TCR 알파 사슬 가변 영역의 CDR 3 및 서열번호 13 내지 24의 아미노선 서열로 구성된 TCR 베타 사슬 가변 영역의 CDR 3을 포함) 및 이를 포함하는 NK 세포의 항암 효과에 대하여 구체적으로 설명하도록 한다.
이때, NK 세포에 발현시킨 TCR은 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열로 구성된 TCR 알파 사슬 가변 영역의 CDR 3 및 서열번호 13 및 14의 아미노선 서열로 구성된 TCR 베타 사슬 가변 영역의 CDR 3을 포함하는 TCR이 이용되었으나, 이는 예시일 뿐이며, 서열번호 1 내지 12의 아미노산 서열로 구성된 TCR 알파 사슬 가변 영역의 CDR 3 및 서열번호 13 내지 24의 아미노선 서열로 구성된 TCR 베타 사슬 가변 영역의 CDR 3을 포함하는 TCR 간의 세포 살상 효과는 차이가 없음에 따라, 선택적으로 사용할 수 있다.
도 16a 및 16b는 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR의 세포 활성을 확인한 결과이다.
먼저, 도 16a를 참조하면, 비교예 1은 넉아웃(Knockout)된 Jurkat 세포가 이용되었으며(control, TCR KO), 비교예 2는 렌티 바이러스를 이용하여 넉아웃된 Jurkat 세포에 NY-ESO-1_HLA-A 02:01 항원에 특이적인 TCR을 발현시킨 세포(NY-ESO-1 2:01 TCR)가 이용되었다. 나아가, 실시예 1 (L858R 1 33: 03 TCR) 및 2(L858R 2 33: 03 TCR)로는 렌티 바이러스를 이용하여 넉아웃된 Jurkat 세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR을 발현시킨 세포가 이용되었다. 보다 구체적으로, 실시예 1(L858R 1 33: 03 TCR)은 서열번호 1 및 13(TRAV23/DV6 및 TRBV 18에 대한 서열번호 25 및 37의 핵산 서열)의 아미노산 서열을 포함하고 있는 서열번호 51 및 52의 핵산 서열에 기초한 TCR을 발현시킨 세포이며, 실시예 2(L858R 2 33: 03 TCR)는 서열번호 2 및 14(TRAV24 및 TRBV 19에 대한 서열번호 26 및 38의 핵산 서열)의 아미노산 서열을 포함하고 있는 서열번호 53 및 54의 핵산 서열에 기초한 TCR을 발현시킨 세포이다.
나아가, 실시예1 및 2 (L858R 1 33: 03 TCR 및 L858R 2 33: 03 TCR)의 경우, EGFR-L858R 돌연변이 항원(HVKITDFGR-A*33:03) tetramer에 특이적으로 반응하여 IFN-gamma과 같은 세포 살상인자가 분비될 수 있음에 따라, 비교예 1, 2 및 실시예 1, 2를 NY-ESO-1_HLA-A 02:01 항원 테트라머(Tetramer) 및 EGFR-L858R 돌연변이 항원(HVKITDFGR-A*33:03) 테트라머(Tetramer)에 노출시켜 IFN-gamma의 발현을 측정하였다.
이에, 도 16b를 참조하면, 비교예 1(TCR KO Jurkat T cell)의 경우, 항원을 인지할 수 있는 TCR을 포함하고 있지 않음에 따라, IFN-gamma 발현 세포(IFN-γ positive cells)가 없는 것으로 나타나며, 비교예 2(NY-ESO-1-TCR Jurkat T cell)의 경우, NY-ESO-1_HLA-A 02:01 항원만을 인지할 수 있는 TCR을 포함함에 따라, NY-ESO-1_HLA-A 02:01 항원에서만이 IFN-gamma 발현 세포가 존재하는 것으로 나타난다.
나아가, 실시예 1 및 2(L858R 1 33: 03 TCR 및 L858R 2 33: 03 TCR)의 경우, EGFR-L858R 돌연변이 항원(HVKITDFGR-A*33:03)을 인지할 수 있는 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR을 포함함에 따라, EGFR-L858R 돌연변이 항원(HVKITDFGR-A*33:03) tetramer에 특이적으로 반응하여 IFN-gamma이 발현하는 것으로 나타난다.
즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR은 면역 세포에 발현되어, EGFR-L858R 돌연변이 항원(HVKITDFGR-A*33:03)에 특이적으로 반응하여, IFN-gamma와 같은 세포 살상 인자(사이토카인)을 분비할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR은 EGFR-L858R 돌연변이 항원(HVKITDFGR-A*33:03) 이외의 NY-ESO-1_HLA-A 02:01 항원에서는 IFN-gamma의 발현을 유도하지 않음에 따라, 본 발명이 표적하고자하는 EGFR-L858R 돌연변이 항원(HVKITDFGR-A*33:03)에 고도의 표적화가 가능하다는 것을 의미할 수 있다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR은 EGFR-L858R 돌연변이 항원(HVKITDFGR-A*33:03)을 포함하는 종양에 있어, 보다 효과적으로 표적화가 가능함에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR을 포함하는 면역 세포는 향상된 항암 효과를 가질 수 있다.
도 17a 및 17b는 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR을 포함하는 NK 세포에 대한 세포 살상 효과를 확인한 결과이다. 이때, 세포 살상 효과 확인을 위하여, 실시간 세포 분석 기기(Real-Time Cell Analyzer, RTCA)가 이용되었으며, 종양 세포 시료로서, EGFR-L858R 돌연변이 항원(HVKITDFGR-A*33:03)을 발현하는 환자 유래 종양 세포주인 YU1154(항원 특이적 표적 세포) 및 YU1094(항원 비특이적 표적 세포, EGFRmut HLA11:01)가 사용되었다. 보다 구체적으로, 보다 구체적으로, 분석 기기의 세포 배양 플레이트에 전술한 환자 유래의 종양 세포주인 종양 세포(target cell, T)들을 배양 뒤, NK-92 세포(effector cell, E)와 일정 비율(T:E ratio)로 공배양하여, 배양 시간에 따른 세포 살상(cytolysis) 정도를 측정하였다. 이때, NK-92 세포는 야행성(wild type, WT) NK-92 세포와 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR(EGFRmut HLA33:03-TCR, DAAN-01)을 포함하는 NK-92 세포를 포함하며, 이들 간의 살상 정도를 비교하였다. 나아가, 이하에서는 설명의 편의를 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR을 포함하는 NK-92 세포를 실시예라고 명명하고, 야행성(wild type, WT) NK-92 세포를 비교예라고 명명하여 설명하도록 한다.
먼저, 도 17a를 참조하면, YU1154(항원 특이적 표적 세포)에 대한 세포 살상 효과가 도시되며, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR을 포함하는 NK 세포(TCR-NK) 즉, 실시예의 경우, 비교예(야행성 NK 세포)보다 높은 살상 효과를 가지는 것으로 나타난다.
보다 구체적으로, 도 17a의 (a)를 참조하면, 본 발명의 실시예는 표적 세포(종양 세포) 1에 대하여 10 및 50의 비율(TCR-NK 1:10, 1:50)로 공배양된 경우, 6시간 동안 약 60 % 이상의 살상 효과를 갖는 것으로 나타난다. 이에 반해, 비교예는 표적 세포(종양 세포)에 대한 비율과 상관없이 모두 50 % 이하의 살상 효과를 갖는 것으로 나타난다.
나아가, 도 17a의 (b)를 참조하면, 본 발명의 실시예는 표적 세포(종양 세포) 1에 대하여 10 및 50의 비율(TCR-NK 1:10, 1:50)로 공배양된 경우, 12시간 동안 약 70 % 이상의 살상 효과를 갖는 것으로 나타난다. 이에 반해, 비교예는 표적 세포(종양 세포)에 대한비율과 상관없이 모두 50 % 이하의 살상 효과를 갖는 것으로 나타난다.
더 나아가, 도 17a의 (c)를 참조하면, 본 발명의 실시예는 표적 세포(종양 세포) 1에 대하여 10 및 50의 비율(TCR-NK 1:10, 1:50)로 공배양된 경우, 72시간 동안 약 85 % 이상의 살상 효과를 갖는 것으로 나타난다. 이에 반해, 비교예는 표적 세포(종양 세포) 1에 대하여 50의 비율(WT-NK 1:50)로 공배양된 경우를 제외하곤, 모두 10 % 이하의 살상 효과를 갖는 것으로 나타나며, 표적 세포(종양 세포) 1에 대하여 50의 비율(WT-NK 1:50)로 공배양된 경우에도 전술한 본 발명의 실시예보다 낮은 약 80 %의 살상 효과만을 갖는 것으로 나타난다.
결국, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR을 포함하는 NK 세포는 EGFR-L858R 돌연변이 항원(HVKITDFGR-A*33:03)에 있어 보다 효과적으로 세포 살상을 유도할 수 있으며, 이에 따라, EGFR-L858R 돌연변이 항원(HVKITDFGR-A*33:03)을 포함하는 종양에 있어 향상된 항암 효과를 가질 수 있다.
그 다음, 도 17b를 참조하면, YU1094(항원 비특이적 표적 세포)에 대한 세포 살상 효과가 도시되며, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR을 포함하는 NK 세포(TCR-NK) 즉, 실시예의 경우, 비교예(야행성 NK 세포)보다 높은 살상 효과를 가지는 것으로 나타난다.
보다 구체적으로, 도 17b의 (a)를 참조하면, 본 발명의 실시예는 표적 세포(종양 세포) 1에 대하여 10 및 50의 비율(TCR-NK 1:10, 1:50)로 공배양된 경우, 6시간 동안 약 40 % 이상의 살상 효과를 갖는 것으로 나타난다. 이에 반해, 비교예는 표적 세포(종양 세포)에 대한 비율과 상관없이 모두 40 % 미만의 살상 효과를 갖는 것으로 나타난다.
나아가, 도 17b의 (b)를 참조하면, 본 발명의 실시예는 표적 세포(종양 세포) 1에 대하여 10 및 50의 비율(TCR-NK 1:10, 1:50)로 공배양된 경우, 12시간 동안 약 50 % 이상의 살상 효과를 갖는 것으로 나타난다. 이에 반해, 비교예는 표적 세포(종양 세포) 1에 대하여 50의 비율(WT-NK 1:50)로 공배양된 경우를 제외하곤, 모두 40 % 미만의 살상 효과를 갖는 것으로 나타난며, 표적 세포(종양 세포) 1에 대하여 50의 비율(WT-NK 1:50)로 공배양된 경우에도 전술한 본 발명의 실시예보다 약 5 % 정도 낮은 살상 효과를 갖는 것으로 나타난다.
더 나아가, 도 17b의 (c)를 참조하면, 본 발명의 실시예는 표적 세포(종양 세포) 1에 대하여 10 및 50의 비율(TCR-NK 1:10, 1:50)로 공배양된 경우, 72시간 동안 약 70 % 이상의 살상 효과를 갖는 것으로 나타난다. 이에 반해, 비교예는 모두 전술한 본 발명의 실시예(TCR-NK 1:10, 1:50)보다 낮은 살상 효과를 갖는 것으로 나타난다.
결국, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR을 포함하는 NK 세포는 EGFR-L858R 돌연변이 항원(HVKITDFGR-A*33:03)에 있어 보다 효과적으로 세포 살상을 유도할 수 있으며, 이에 따라, EGFR-L858R 돌연변이 항원(HVKITDFGR-A*33:03)을 포함하는 종양에 있어 향상된 항암 효과를 가질 수 있다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR을 포함하는 NK 세포의 종양 억제 효과를 확인한 결과이다. 이때, 종양 억제 효과는 EGFR-L858R 돌연변이 항원(HVKITDFGR-A*33:03)을 발현하도록 유도된 환자 유래 종양 동물 모델(NOG mice implanted lung adenocarcinoma)에서 확인되었으며, 종양 동몰 모델은 EGFR-L858R 돌연변이 항원(HVKITDFGR-A*33:03)을 포함하는 환자 유래 종양 조직을 이식한 뒤, 종양의 크기가 100 내지 150 mm3 이상되도록 4 내지 5달(month) 동안 사육한 뒤, 표적 크기에 도달하였을 때, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR을 포함하는 NK-92 세포를 주입(주사)하였다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR을 포함하는 NK 세포의 주입은 2회/주씩 총 4주간 진행되었으며, 주입량은 1회 주사 시 1 * 107 내지 5 * 107 범위에서 선택되었으며, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR을 포함하는 NK 세포의 주입 용량은 세포 치료제의 용법에 따라, 다양하게 선택되어 사용될 수 있다. 또한, 비교예로서, 야행성 NK-92 세포 및 항암 약물(competitive drug) 즉, CD16-NK-92 세포가 각각 주입되어 사용되었다.
도 18을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR을 포함하는 NK 세포(Daan NK cell therapy)를 주입한 경우, 동물 모델의 종양 볼륨(tumor volume)은 약 200 % 이하인 것으로 나타나며, 이는 항암 약물(competitive drug) 및 야행성 NK 세포의 처리보다 낮은 크기인 것으로 나타난다.
즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR을 포함하는 NK 세포는 종래의 항암 약물 및 일반적인 면역 세포의 주입보다 종양 억제에 있어 효과적인 것을 의미할 수 있으며, 특히, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCR을 포함하는 NK 세포는 일반 면역 세포의 주입에 비해 통계학적으로 유의미한 차이를 가짐에 따라(p<0.001), EGFR-L858R 돌연변이 항원(HVKITDFGR-A*33:03)을 포함하는 종양에 있어, 표적 항암(면역) 효과가 현저하게 향상된 것을 의미할 수 있다(* = p < 0.05, *** = p <0.001).
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시 예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industy-Academic Cooperation foundation Yonsei University <120> T CELL RECEPTORS, IMMUNE CELL COMPRISING T CELL RECEPTORS AND METHOD USING THE SAME <130> DP-2021-1428 <150> KR 10-2020-0129446 <151> 2020-10-07 <160> 58 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the CDR3 regions in TCR alpha <400> 1 Cys Ala Phe Ile Gly His Gly Gly Ser Gln Gly Asn Leu Ile Phe 1 5 10 15 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the CDR3 regions in TCR alpha <400> 2 Cys Ala Ala Thr Gly Thr Tyr Lys Tyr Ile Phe 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the CDR3 regions in TCR alpha <400> 3 Cys Ala Tyr Gly Gly Gly Ser Glu Lys Leu Val Phe 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the CDR3 regions in TCR alpha <400> 4 Cys Ala Leu Ile Asn Ala Arg Leu Met Phe 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT 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<400> 31 tgtgcttata ataacgggga tggaggaagc caaggaaatc tcatcttt 48 <210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the CDR3 regions in TCR alpha <400> 32 tgtgctacgg acgggggttc tgcaaggcaa ctgaccttt 39 <210> 33 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the CDR3 regions in TCR alpha <400> 33 tgtgctacgt tatataacac cgacaagctc atcttt 36 <210> 34 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the CDR3 regions in TCR alpha <400> 34 tgtgcaatga gagggccctg gagagggtct tctggttctg caaggcaact gaccttt 57 <210> 35 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the CDR3 regions in TCR alpha <400> 35 tgtgctctaa gtgtcagggg attcaaaacc tcctacgaca aggtgatatt t 51 <210> 36 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the CDR3 regions in TCR alpha <400> 36 tgtgccgtga acatgatgga tagcagctat aaattgatct tc 42 <210> 37 <211> 42 <212> DNA 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tgtgccagca gcgtaggccc agggacaacc tcctacaatg agcagttctt c 51 <210> 43 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the CDR3 regions in TCR beta <400> 43 tgtgccacca gcagagaccg tagcacagat acgcagtatt tt 42 <210> 44 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the CDR3 regions in TCR beta <400> 44 tgtgccagca gcttgggatt aagtggctac accttc 36 <210> 45 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the CDR3 regions in TCR beta <400> 45 tgtgccagca gccagtcaat gaacactgaa gctttcttt 39 <210> 46 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the CDR3 regions in TCR beta <400> 46 tgtgccagca gaacgggact ctcatacgag cagtacttc 39 <210> 47 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the CDR3 regions in TCR beta <400> 47 tgtgccagca gttttgggtc agcctacaat gagcagttct tc 42 <210> 48 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the CDR3 regions in TCR beta <400> 48 tgtgccagca gtttcccgac agctcgatcg aacactgaag ctttcttt 48 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 49 His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Arg 1 5 <210> 50 <211> 12458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lentiviral vector <400> 50 acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta 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1440 attacacaag cttaatacac tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg 1500 aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt aacataacaa 1560 attggctgtg gtatataaaa ttattcataa tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa 1620 tagtttttgc tgtactttct atagtgaata gagttaggca gggatattca ccattatcgt 1680 ttcagaccca cctcccaacc ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata gaagaagaag 1740 gtggagagag agacagagac agatccattc gattagtgaa cggatctcga cggtatcggt 1800 taacttttaa aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca 1860 taatagcaac agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa ttcaaaattt 1920 tatcgatact agtattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac 1980 atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 2040 cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 2100 agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 2160 ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggttt atataagcag agctcgttta 2220 gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagattc 2280 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ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc 9060 tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct 9120 ccctttgggc cgcctccccg cctggtacct ttaagaccaa tgacttacaa ggcagctgta 9180 gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg ggactggaag ggctaattca ctcccaacga 9240 agataagatc tgctttttgc ttgtactggg tctctctggt tagaccaaat cggagcctgg 9300 gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg 9360 cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc 9420 ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt agtagttcat gtcatcttat tattcagtat 9480 ttataacttg caaagaaatg aatatcagag agtgagagga acttgtttat tgcagcttat 9540 aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg 9600 cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gctctagcta 9660 tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt 9720 ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct attccagaag tagtgaggag 9780 gcttttttgg aggcctagac ttttgcagag acggcccaaa ttcgtaatca tggtcatagc 9840 tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca 9900 taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct 9960 cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 10020 gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 10080 tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 10140 tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 10200 ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 10260 agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 10320 accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 10380 ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 10440 gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 10500 ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 10560 gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 10620 taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag 10680 tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 10740 gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 10800 cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 10860 agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 10920 cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 10980 cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 11040 ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 11100 taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 11160 tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 11220 ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 11280 atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 11340 gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 11400 tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 11460 cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 11520 taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 11580 ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 11640 ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 11700 cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 11760 ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 11820 gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 11880 gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 11940 aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca 12000 ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc 12060 gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt 12120 gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg 12180 ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata 12240 tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc 12300 cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc 12360 agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc 12420 agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg ccaagctg 12458 <210> 51 <211> 810 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell receptor alpha TRAV23 DV6 <400> 51 atggagaccc tcttgggcct gcttatcctt tggctgcagc tgcaatgggt gagcagcaaa 60 caggaggtga cgcagattcc tgcagctctg agtgtcccag aaggagaaaa cttggttctc 120 aactgcagtt tcactgatag cgctatttac aacctccagt ggtttaggca ggaccctggg 180 aaaggtctca catctctgtt gcttattcag tcaagtcaga gagagcaaac aagtggaaga 240 cttaatgcct cgctggataa atcatcagga cgtagtactt tatacattgc agcttctcag 300 cctggtgact cagccaccta cctctgtgca gcaacaggaa cctacaaata catctttgga 360 agaggaacca gccttattgt tcatccgtat atccagaacc ctgaccctgc cgtgtaccag 420 ctgagagact ctaaatccag tgacaagtct gtctgcctat tcaccgattt tgattctcaa 480 acaaatgtgt cacaaagtaa ggattctgat gtgtatatca cagacaaaac tgtgctagac 540 atgaggtcta tggacttcaa gagcaacagt gctgtggcct ggagcaacaa atctgacttt 600 gcatgtgcaa acgccttcaa caacagcatt attccagaag acaccttctt ccccagccca 660 gaaagttcct gtgatgtcaa gctggtcgag aaaagctttg aaacagatac gaacctaaac 720 tttcaaaacc tgtcagtgat tgggttccga atcctcctcc tgaaagtggc cgggtttaat 780 ctgctcatga cgctgcggct gtggtccagc 810 <210> 52 <211> 948 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell receptor beta TRBV18 <400> 52 atgagcatcg gcctcctgtg ctgtgcagcc ttgtctctcc tgtgggcagg tccagtgaat 60 gctggtgtca ctcagacccc aaaattccag gtcctgaaga caggacagag catgacactg 120 cagtgtgccc aggatatgaa ccatgaatac atgtcctggt atcgacaaga cccaggcatg 180 gggctgaggc tgattcatta ctcagttggt gctggtatca ctgaccaagg agaagtcccc 240 aatggctaca atgtctccag atcaaccaca gaggatttcc cgctcaggct gctgtcggct 300 gctccctccc agacatctgt gtacttctgt gccagctcac cggagtttgc gagggcgctg 360 gacaatcagc cccagcattt tggcccaggc acccggctga cagtgctcga ggacctgaaa 420 aacgtgttcc cacccgaggt cgctgtgttt gagccatcag aagcagagat ctcccacacc 480 caaaaggcca cactggtatg cctggccaca ggcttctacc ccgaccacgt ggagctgagc 540 tggtgggtga atgggaagga ggtgcacagt ggggtcagca cagacccgca gcccctcaag 600 gagcagcccg ccctcaatga ctccagatac tgcctgagca gccgcctgag ggtctcggcc 660 accttctggc agaacccccg caaccacttc cgctgtcaag tccagttcta cgggctctcg 720 gagaatgacg agtggaccca ggatagggcc aaacccgtca cccagatcgt cagcgccgag 780 gcctggggta gagcagactg tggcttcacc tccgagtctt accagcaagg ggtcctgtct 840 gccaccatcc tctatgagat cttgctaggg aaggccacct tgtatgccgt gctggtcagt 900 gccctcgtgc tgatggccat ggtcaagaga aaggattcca gaggctag 948 <210> 53 <211> 822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell receptor alpha TRAV24 <400> 53 atggagaccc tcttgggcct gcttatcctt tggctgcagc tgcaatgggt gagcagcaaa 60 caggaggtga cgcagattcc tgcagctctg agtgtcccag aaggagaaaa cttggttctc 120 aactgcagtt tcactgatag cgctatttac aacctccagt ggtttaggca ggaccctggg 180 aaaggtctca catctctgtt gcttattcag tcaagtcaga gagagcaaac aagtggaaga 240 cttaatgcct cgctggataa atcatcagga cgtagtactt tatacattgc agcttctcag 300 cctggtgact cagccaccta cctctgtgcc tttataggcc atggaggaag ccaaggaaat 360 ctcatctttg gaagaggaac cagccttatt gttcatccgt atatccagaa ccctgaccct 420 gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 480 tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 540 actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 600 aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 660 ttccccagcc cagaaagttc ctgtgatgtc aagctggtcg agaaaagctt tgaaacagat 720 acgaacctaa actttcaaaa cctgtcagtg attgggttcc gaatcctcct cctgaaagtg 780 gccgggttta atctgctcat gacgctgcgg ctgtggtcca gc 822 <210> 54 <211> 936 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell receptor beta TRBV19 <400> 54 atgagcatcg gcctcctgtg ctgtgcagcc ttgtctctcc tgtgggcagg tccagtgaat 60 gctggtgtca ctcagacccc aaaattccag gtcctgaaga caggacagag catgacactg 120 cagtgtgccc aggatatgaa ccatgaatac atgtcctggt atcgacaaga cccaggcatg 180 gggctgaggc tgattcatta ctcagttggt gctggtatca ctgaccaagg agaagtcccc 240 aatggctaca atgtctccag atcaaccaca gaggatttcc cgctcaggct gctgtcggct 300 gctccctccc agacatctgt gtacttctgt gccagtagta tgcagggggc tatgagtgag 360 cagttcttcg gcccaggcac ccggctgaca gtgctcgagg acctgaaaaa cgtgttccca 420 cccgaggtcg ctgtgtttga gccatcagaa gcagagatct cccacaccca aaaggccaca 480 ctggtatgcc tggccacagg cttctacccc gaccacgtgg agctgagctg gtgggtgaat 540 gggaaggagg tgcacagtgg ggtcagcaca gacccgcagc ccctcaagga gcagcccgcc 600 ctcaatgact ccagatactg cctgagcagc cgcctgaggg tctcggccac cttctggcag 660 aacccccgca accacttccg ctgtcaagtc cagttctacg ggctctcgga gaatgacgag 720 tggacccagg atagggccaa acccgtcacc cagatcgtca gcgccgaggc ctggggtaga 780 gcagactgtg gcttcacctc cgagtcttac cagcaagggg tcctgtctgc caccatcctc 840 tatgagatct tgctagggaa ggccaccttg tatgccgtgc tggtcagtgc cctcgtgctg 900 atggccatgg tcaagagaaa ggattccaga ggctag 936 <210> 55 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell receptor alpha TRAV23 DV6 <400> 55 Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp 1 5 10 15 Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val 20 25 30 Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala 35 40 45 Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr 50 55 60 Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg 65 70 75 80 Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile 85 90 95 Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Ala Thr 100 105 110 Gly Thr Tyr Lys Tyr Ile Phe Gly Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val His 115 120 125 Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 130 135 140 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 145 150 155 160 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 165 170 175 Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 180 185 190 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 195 200 205 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys 210 215 220 Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn 225 230 235 240 Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val 245 250 255 Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 260 265 270 <210> 56 <211> 315 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell receptor beta TRBV18 <400> 56 Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu 20 25 30 Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His 35 40 45 Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro 65 70 75 80 Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg 85 90 95 Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Pro Glu Phe Ala Arg Ala Leu Asp Asn Gln Pro Gln His Phe Gly 115 120 125 Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro 130 135 140 Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr 145 150 155 160 Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His 165 170 175 Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val 180 185 190 Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser 195 200 205 Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln 210 215 220 Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser 225 230 235 240 Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile 245 250 255 Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu 260 265 270 Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu 275 280 285 Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu 290 295 300 Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly 305 310 315 <210> 57 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell receptor alpha TRAV24 <400> 57 Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp 1 5 10 15 Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val 20 25 30 Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala 35 40 45 Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr 50 55 60 Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg 65 70 75 80 Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile 85 90 95 Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Phe Ile 100 105 110 Gly His Gly Gly Ser Gln Gly Asn Leu Ile Phe Gly Arg Gly Thr Ser 115 120 125 Leu Ile Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln 130 135 140 Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp 145 150 155 160 Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr 165 170 175 Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser 180 185 190 Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn 195 200 205 Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro 210 215 220 Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp 225 230 235 240 Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu 245 250 255 Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp 260 265 270 Ser Ser <210> 58 <211> 311 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell receptor beta TRBV19 <400> 58 Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu 20 25 30 Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His 35 40 45 Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro 65 70 75 80 Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg 85 90 95 Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Met Gln Gly Ala Met Ser Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 130 135 140 Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr 145 150 155 160 Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 165 170 175 Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro 180 185 190 Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu 195 200 205 Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn 210 215 220 His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 225 230 235 240 Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu 245 250 255 Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln 260 265 270 Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala 275 280 285 Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val 290 295 300 Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly 305 310

Claims (24)

  1. T 세포 수용체(T cell receptor)로서,
    (ⅰ) 아미노산 서열 CAFIGHGGSQGNLIF (서열번호 1)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
    아미노산 서열 CASSMQGAMSEQFF(서열번호 13)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,

    (ii) 아미노산 서열 CAATGTYKYIF (서열번호 2)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
    아미노산 서열 CASSPEFARALDNQPQHF (서열번호 14)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,

    (iii) 아미노산 서열 CAYGGGSEKLVF (서열번호 3)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
    아미노산 서열 CASSSATGTQGYTF (서열번호 15)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,

    (iv) 아미노산 서열 CALINARLMF (서열번호 4)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
    아미노산 서열 CASSFTNTGELFF (서열번호 16)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,

    (v) 아미노산 서열 CAVNGGSQGNLIF (서열번호 5)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
    아미노산 서열 CASSMWQGNGEQYF (서열번호 17)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,

    (vi) 아미노산 서열 CAMREGYGGATNKLIF (서열번호 6)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
    아미노산 서열 CASSVGPGTTSYNEQFF (서열번호 18)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,

    (vii) 아미노산 서열 CAYNNGDGGSQGNLIF (서열번호 7)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
    아미노산 서열 CATSRDRSTDTQYF (서열번호 19)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,

    (viii) 아미노산 서열 CATDGGSARQLTF (서열번호 8)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
    아미노산 서열 CASSLGLSGYTF (서열번호 20)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,

    (ix) 아미노산 서열 CATLYNTDKLIF (서열번호 9)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
    아미노산 서열 CASSQSMNTEAFF (서열번호 21)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,

    (x) 아미노산 서열 CAMRGPWRGSSGSARQLTF (서열번호 10)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
    아미노산 서열 CASRTGLSYEQYF (서열번호 22)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,

    (xi) 아미노산 서열 CALSVRGFKTSYDKVIF (서열번호 11)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
    아미노산 서열 CASSFGSAYNEQFF (서열번호 23)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하거나,

    (xii) 아미노산 서열 CAVNMMDSSYKLIF (서열번호 12)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3, 및
    아미노산 서열 CASSFPTARSNTEAFF (서열번호 24)로 이루어진 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬 가변 영역의 상보 결정 영역 (CDR) 3을 포함하는, T 세포 수용체.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체는,
    HVKITDFGR (서열번호 49)의 아미노산 서열 또는 이의 MHC-결합 형태 내에 포함된 에피토프에 결합할 수 있는, T 세포 수용체.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 에피토프는,
    HLA-A*33:03 및 HLA-A*31:01 중 적어도 하나와 결합 친화도(binding affinity)를 가지는, T 세포 수용체.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체는,
    EGFR L858R 돌연변이를 표적으로 하는, T 세포 수용체.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 TCR 알파 사슬 가변 영역은,
    서열번호 55의 아미노산 서열로 이루어지고,
    상기 서열번호 55는
    서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, T 세포 수용체.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 TCR 알파 사슬 가변 영역은,
    서열번호 57의 아미노산 서열로 이루어지고,
    상기 서열번호 57은
    서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는, T 세포 수용체.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 TCR 베타 사슬 가변 영역은,
    서열번호 56의 아미노산 서열로 이루어지고,
    상기 서열번호 56은
    서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는, T 세포 수용체.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 TCR 베타 사슬 가변 영역은,
    서열번호 58의 아미노산 서열로 이루어지고,
    상기 서열번호 58은
    서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는, T 세포 수용체.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체는,
    단일 사슬 유형(single chain type)인, T 세포 수용체.
  10. 제 2항에 있어서,
    상기 TCR 알파 사슬 가변 영역 및 상기 TCR 베타 사슬 가변 영역은,
    링커 서열에 의해 연결되는, T 세포 수용체.
  11. 제 1 항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 기재된 T 세포 수용체를 인코딩하는, 핵산.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 핵산은,
    서열번호 51 내지 54 중 적어도 하나의 핵산 서열; 또는
    상기 서열번호 51 내지 54 중 적어도 하나의 핵산 서열과 적어도 80 % 이상의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 핵산
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 서열번호 51 및 53은,
    TCR 알파 사슬 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열인, 핵산.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 서열번호 52 및 54은,
    TCR 베타 사슬 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열인, 핵산.
  15. 제 11항에 있어서,
    상기 핵산은,
    Furin, 2A 및 IRES 서열을 더 포함하는, 핵산.
  16. 제 11 항에 기재된 핵산을 포함하는, 벡터.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 벡터는,
    발현 벡터인, 벡터.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 발현 벡터는,
    렌티 바이러스 벡터인, 벡터.
  19. 제 16항에 있어서,
    상기 벡터는,
    서열번호 50의 핵산 서열; 또는
    상기 서열번호 50의 핵산 서열과 적어도 80 % 이상의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 벡터
  20. 제 1 항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 기재된 T 세포 수용체를 포함하는, 분리된 면역 세포.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 면역 세포는,
    NK-92 세포주인, 분리된 면역 세포.
  22. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 T 세포 수용체를 포함하는 면역세포를 포함하는, 고형암 예방 또는 치료용 세포 치료제.
  23. 제 22항에 있어서,
    효과 T 세포(effector T cell)를 더 포함하는, 고형암 예방 또는 치료용 세포 치료제.
  24. 제 22항에 있어서,
    상기 고형암은,
    폐암인, 고형암 예방 또는 치료용 세포 치료제.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100304042B1 (ko) 1991-05-31 2001-09-24 데니스 제이. 카를로 면역-관련 질병용 치료제로서의 ｔ 세포 수용체 펩타이드
WO2018234319A1 (en) 2017-06-20 2018-12-27 Immunocore Limited LYMPHOCYTE T RECEPTORS
CN110128528B (zh) 2019-04-28 2020-04-03 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种针对egfr l858r基因突变的特异性t细胞受体及其应用
US20200237820A1 (en) 2017-10-12 2020-07-30 Board Of Regents, The University Of Texas System T cell receptors for immunotherapy

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201604492D0 (en) * 2016-03-16 2016-04-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Transfected t-cells and t-cell receptors for use in immunotherapy against cancers
ES2949342T3 (es) * 2016-06-17 2023-09-27 Medigene Immunotherapies Gmbh Receptores de células T y usos de los mismos

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100304042B1 (ko) 1991-05-31 2001-09-24 데니스 제이. 카를로 면역-관련 질병용 치료제로서의 ｔ 세포 수용체 펩타이드
WO2018234319A1 (en) 2017-06-20 2018-12-27 Immunocore Limited LYMPHOCYTE T RECEPTORS
US20200237820A1 (en) 2017-10-12 2020-07-30 Board Of Regents, The University Of Texas System T cell receptors for immunotherapy
CN110128528B (zh) 2019-04-28 2020-04-03 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种针对egfr l858r基因突变的特异性t细胞受体及其应用

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