CN116064657A - 一种腺嘌呤碱基编辑工具及其方法和应用 - Google Patents

一种腺嘌呤碱基编辑工具及其方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种腺嘌呤碱基编辑工具及其方法和应用。腺嘌呤碱基编辑工具包括NG‑ABE9e表达载体，所述NG‑ABE9e表达载体为质粒pCMV‑NG‑ABE9e，其序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过在NG‑ABE8e腺苷脱氨酶编码序列中引入关键突变信息，从而在保持高活性、高保真的基础上有效缩窄其编辑窗口，以提高ABE编辑的精确性以及增加其在生命领域的应用。

Description

一种腺嘌呤碱基编辑工具及其方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种编辑效率高、范围窄的腺嘌呤碱基编辑工具及其方法和应用。
背景技术
CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins)系统一经问世，便迅速成为了炙手可热的第三代基因编辑工具。但CRISPR/Cas系统编辑基因时并不十分精确，因此会产生不需要的编辑副产物。鉴于此，基于CRISPR/Cas系统发展起来的碱基编辑技术(base editing)应运而生。与CRISPR/Cas系统不同，碱基编辑技术发挥作用不依赖于DNA双链断裂(DSB)的产生，也不需要供体DNA的参与便可实现高效精准的单个碱基的编辑，因此保真性和安全性更高。针对这些特性，碱基编辑技术也被认为是更安全的第四代基因编辑工具。
目前，碱基编辑技术可分为DNA碱基编辑器和RNA碱基编辑器两大类。2016年，David Liu团队率先开发了第一种形式的DNA碱基编辑器——胞嘧啶碱基编辑器(cytosinebase editor，CBE)，实现了胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)的转换。2017年，该团队又创新性地开发了第二种形式的DNA碱基编辑器——腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor，ABE)，可实现腺嘌呤(A)到鸟嘌呤(G)的转换。其中，ABE主要由三个元件组成：sgRNA、改造的Cas9蛋白和人工进化的腺嘌呤脱氨酶(TadA)。与CBE作用原理相似，ABE系统首先在sgRNA的引导下，特异地与靶序列的互补链配对，然后经过nCas9的作用，非互补链便会逐渐暴露出来，此时，TadA便会将非互补链上一定活性窗口内的A水解脱氨生成肌苷(I)，由于DNA聚合酶活性位点的限制，I与C配对，进而被读取或复制为G，实现非互补链上A-to-G(或互补链上T-to-C)的碱基转换。
然而，现有的ABE系统普遍存在靶向范围广、编辑窗口宽的现象，在精准编辑方面仍存在缺陷，需要进一步优化。因此，需要开发出具有高活性、编辑窗口缩窄的ABE，从而极大地扩充基因编辑工具的应用，尤其是为临床疾病实现精准治疗提供强有力的研究工具。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种编辑效率高、范围窄的新型腺嘌呤碱基编辑工具及其方法和应用，以提高现有ABE编辑的精准性、缩小其编辑窗口以及增加其在生物医学领域的应用。
为实现该目的，本发明提供一种腺嘌呤碱基编辑工具，其特征在于，包括NG-ABE9e表达载体，所述的NG-ABE9e表达载体为质粒pCMV-NG-ABE9e，其序列如SEQ ID NO.1所示。质粒pCMV-NG-ABE9e用于编码表达突变型蛋白：R111T+N127K+Q154R。
所述腺嘌呤碱基编辑工具包括sgRNA表达载体。sgRNA表达载体针对不同基因靶点其序列不同。
所述sgRNA表达载体为序列如SEQ ID NO.2-13所示的序列中一条或多条。
所述sgRNA表达载体为序列如SEQ ID NO.14所示。
所述的腺嘌呤碱基编辑工具还包括真核细胞和基因转染、转导试剂。
所述NG-ABE9e表达载体编码的NG-ABE9e氨基酸序列，如SEQ ID NO.30所示。
本发明还提供一种腺嘌呤碱基编辑工具，包括NG-ABE9e氨基酸序列，如SEQ IDNO.30所示。
本发明还提供了上述的腺嘌呤碱基编辑工具的构建方法，其特征在于:利用含有相应突变信息的引物，从pCMV-NG-ABE8e载体上扩增出突变片段一、二、三、四；pCMV-NG-ABE8e载体酶切后得到骨架；将突变片段一、二、三、四搭桥后与骨架通过无缝克隆得到编码突变型蛋白的表达载体pCMV-NG-ABE9e。
利用如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.24所示的含有相应突变信息的引物序列获得突变片段一；利用如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.20所示的含有相应突变信息的引物序列获得突变片段二；利用如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.22所示的含有相应突变信息的引物序列获得突变片段三；利用如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.25所示的含有相应突变信息的引物序列获得突变片段四。
优选地，所述突变片段一、二、三、四序列如SEQ ID NO.26、27、28、29所示。
本发明还提供上述腺嘌呤碱基编辑工具在真核细胞单碱基编辑中的应用。
优选地，腺嘌呤碱基编辑工具用于对含突变的RHO基因的真核细胞的修复。
优选地，对含突变的RHO基因的真核细胞的修复方法包括如下步骤：
(1)根据mutRHO致病基因DNA靶点序列设计相应的sgRNA；
(2)将含有突变的RHO基因的真核细胞接种于12孔板，调整细胞密度；24h后将针对mutRHO致病基因DNA靶点的sgRNA分别与NG-ABE9e表达载体共转入HEK-293-mutRHO细胞中；48h后更换新鲜培养基；
(3)第3天收集细胞，进行DNA测序确定腺嘌呤碱基编辑结果。
本发明还提供了上述的新型腺嘌呤碱基编辑工具的应用方法，其特征在于:
(1)构建用于检测NG-ABE9e编辑效率和编辑窗口的EGFP报告系统，其利用的EGFP基因序列如SEQ ID NO.15、16所示；
(2)构建NG-ABE9e疾病修复模型HEK-293-mutRHO细胞系，其利用的mutRHO基因序列如SEQ ID NO.17所示；
(3)对于处理后的真核细胞消化过滤，进行流式细胞分析；或对处理后的真核细胞基因组DNA进行抽提，利用针对靶点的特异性引物进行PCR扩增，再利用基因组DNA的PCR产物构建高通量测序DNA文库，并进行高通量DNA测序。
与现有的技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过改造NG-ABE8e的腺苷脱氨酶编码序列，引入关键突变信息，从而在维持其较高编辑效率的同时，成功缩窄了编辑范围。为实现高效、精准和安全的碱基编辑提供了新的方法和思路。这将有助于促进基因组编辑在基础研究、临床治疗、微生物以及动植物育种等领域更为广拓的应用。
附图说明
图1为pCMV-NG-ABE9e质粒模式图；
图2为pSin-dEGFP1/2-IRES-Puro结构模式图以及相应的sgRNA序列；
图3为腺嘌呤碱基编辑器EGFP报告系统的建立流程图；
图4为NG-ABE8e和NG-ABE9e在不同A碱基位点的编辑效率比较图；
图5为pSin-dEGFP1-IRES-Puro质粒模式图；
图6为pSin-dEGFP2-IRES-Puro质粒模式图；
图7为疾病模型HEK-293-mutRHO细胞系的构建和修复图；
图8为sgRNA-RHO设计图；
图9为NG-ABE8e和NG-ABE9e针对突变RHO基因的修复效率和编辑副产物图。
图10为pSin-mutRHO-EGFP-IRES-Puro质粒模式图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为更进一步阐述本发明为实现预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，做进一步详细说明。
参照图1所示，本发明提供一种新型腺嘌呤碱基编辑工具，包括编码表达NG-ABE9e突变型蛋白的质粒pCMV-NG-ABE9e：R111T+N127K+Q154R，其序列如SEQ ID NO.1所示。腺嘌呤碱基编辑工具还包括sgRNA表达载体、真核细胞和基因转染、转导试剂。sgRNA表达载体针对不同基因靶点其序列不同。
本发明也提供NG-ABE9e蛋白，如SEQ ID NO.30所示。
上述新型腺嘌呤碱基编辑工具的构建方法，包括以下步骤:
(1)设计含有相应突变信息的引物(所述引物序列如SEQ ID NO.18-25所示)；
(2)从pCMV-NG-ABE8e载体上扩增出突变片段一、二、三、四，序列如SEQ ID NO.26、27、28、29所示；
(3)酶切pCMV-NG-ABE8e载体后得到骨架；
(4)将扩增的片段搭桥后与骨架通过无缝克隆得到编码突变型蛋白的表达载体pCMV-NG-ABE9e。
具体的，SEQ ID NO.18-25序列(人工合成)如下所示
突变片段一(SEQ ID NO.26)由以下引物合成
Figure BDA0003335978070000041
突变片段二(SEQ ID NO.27)由以下引物合成
Figure BDA0003335978070000042
突变片段三(SEQ ID NO.28)由以下引物合成
Figure BDA0003335978070000043
突变片段四(SEQ ID NO.29)由以下引物合成
Figure BDA0003335978070000051
上述新型腺嘌呤碱基编辑工具的应用，步骤如下：
(1)构建用于检测NG-ABE9e编辑效率和编辑窗口的EGFP报告系统，其利用dEGFP1和/或dEGFP2基因，序列如SEQ ID NO.15、16所示；
(2)构建NG-ABE9e疾病修复模型HEK-293-mutRHO细胞系，其利用的mutRHO基因序列如SEQ ID NO.17所示；
(3)对于处理后的真核细胞消化过滤，进行流式细胞分析；或对处理后的真核细胞基因组DNA进行抽提，利用针对靶点的特异性引物进行PCR扩增，再利用基因组DNA的PCR产物构建高通量测序DNA文库，并进行高通量DNA测序。
下面以具体实施例方式阐述：
实施例1：pCMV-NG-ABE9e质粒构建
(1)在引物上设置相应突变(引物序列如SEQ ID NO.18-25所示)，利用PCR的方法，在pCMV-NG-ABE8e载体上分别扩增含R111T、N127K、Q154R突变位点的序列，突变片段一、二、三、四，序列如SEQ ID NO.26、27、28、29所示。
(2)用SacII和BseRI酶切pCMV-NG-ABE8e载体，回收得到骨架。
(3)将扩增后的片段依次搭桥后分别与骨架通过In-Fusion无缝克隆技术(ClonExpressII One Step Cloning Kit)得到突变后载体pCMV-NG-ABE9e，如图1所示.
(4)质粒构建实验中所用到的PCR体系如下：
Template:10ng；Forward Primer:(10μM)1μL；Reverse Primer:(10μM)1μL；
dNTP:0.5μL；DNA polymerase(Vazyme,P501):0.5μL；5xBuffer:10μL；RNase-Water补齐至50μL。
PCR程序如下：
95℃，3min；95℃，15sec；60℃，15sec；72℃，1min；35cycles；72℃，5min。
(5)质粒构建实验中所用到的酶切体系如下：
Figure BDA0003335978070000052
Figure BDA0003335978070000061
实施例2：腺嘌呤碱基编辑器EGFP报告系统的建立(如图3所示)
(1)构建pSin-dEGFP1/2-IRES-Puro慢病毒载体，其包含dEGFP1/2基因(其序列如SEQ ID NO.15、16所示)，IRES和嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因。将pSin-dEGFP1-IRES-Puro质粒(如图5所示)、pSin-dEGFP2-IRES-Puro质粒(如图6所示)分别和辅助质粒pVSVg、psPAX2共转于HEK-293T细胞中，收集病毒上清液，0.45μm滤膜过滤，分别获得pSin-dEGFP1-IRES-Puro慢病毒载体和pSin-dEGFP2-IRES-Puro慢病毒载体，分装后于-80℃保存备用。
(2)HEK-293细胞复苏：将冻存的HEK-293细胞从液氮中取出，立即放入37℃水浴锅中，轻微摇动，待液体完全融化后(大概1～1.5min)，取出用75％的酒精擦拭消毒后放置于超净工作台；把上述细胞悬液转移至灭菌的离心管中，800rpm，离心2～3min；弃上清，加1ml完全培养基重悬细胞。将细胞转移至装有10ml完全培养基的10cm培养皿中轻轻摇动，使细胞均匀分布在培养皿中；将培养皿放入37℃，5％的CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后更换培养基。完全培养基的配制：DMEM(高糖)+10％FBS(胎牛血清)+1％Pen./Strep.(青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)。
(3)用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK-293细胞，细胞计数后接种于6孔板，调整细胞密度为3.0×105个细胞/孔；根据慢病毒滴度测定结果，分别感染适量的pSin-dEGFP1-IRES-Puro慢病毒载体和pSin-dEGFP2-IRES-Puro慢病毒载体，同时加入终浓度为4μg/ml的聚凝胺(polybrene)；感染慢病毒12h后换液，48h后传代到10cm皿，用1μg/ml浓度的抗生素Puromycin进行筛选；10d后，在显微镜下挑取单克隆细胞，分别获得整合有pSin-dEGFP1/2基因的单克隆HEK-293-dEGFP1/2的细胞系。
(4)单克隆HEK-293-dEGFP1/2细胞扩大培养，取部分单克隆细胞抽提基因，扩增出目的序列并送去测序鉴定。
辅助质粒为pVSVg和psPAX2(申请人实验室保存)。
慢病毒pSin-dEGFP1/2-IRES-Puro，保存于-80℃。
实施例3：pCMV-NG-ABE9e在EGFP报告系统中不同A位点编辑效率的测定
(1)pJET-U6-sgRNA设计：根据dEGFP1/2基因序列设计靶向不同A位点的sgRNA，序列如SEQ ID NO.2-13所示(图2显示了设计的方法)。如下表所示：
Figure BDA0003335978070000071
(2)将HEK-293-dEGFP1/2细胞计数后分别接种于12孔板，每孔的细胞密度为1.8×105个细胞/孔，于37℃，5％CO2培养箱内培养。
(3)细胞生长24h后通过转染试剂TurboFect(Thermo Fisher,#R0531)分别将pCMV-NG-ABE8e(对照组200ng)、pCMV-NG-ABE9e(实验组200ng)与相应的pJET-U6-sgRNAs(100ng)共同转入已构建的真核细胞系单克隆HEK-293-dEGFP1/2细胞中。
(4)真核细胞转染方法：将需要转染的质粒按比例混合好后，再混入含有1.5μl转染试剂TurboFect的50μL DMEM，吹打混匀，并在室温静置15min后，加入12孔板中进行转染(转染过程见图3后半部分)。
(5)转染后24h更换新鲜的培养基，48h后收集细胞，通过流式细胞术检测绿色荧光细胞的比率，根据比率判断NG-ABE9e在不同A位点的编辑效率以及编辑窗口的变化。
如图4所示，NG-ABE9e在A6位点的编辑效率与NG-ABE8e相当，而在A7之后的位点上明显降低。因此与NG-ABE8e相比，NG-ABE9e的编辑窗口有明显缩窄的现象。
实施例4：疾病模型HEK-293-mutRHO细胞系的构建和修复(如图7，图8)
(1)构建pSin-mutRHO-EGFP-IRES-Puro慢病毒载体(如图10所示),其包含突变的RHO基因(如SEQ ID NO.17所示)，EGFP、IRES和嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因；慢病毒感染HEK-293细胞方法同实施例2,获得HEK-293-mutRHO细胞系。
(2)根据mutRHO基因序列设计相应的sgRNA(如SEQ ID NO.14所示)。(如图8所示)
(3)用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK-293-mutRHO细胞计数后接种于12孔板，调整细胞密度为1.8×105个细胞/孔；24h后将针对mutRHO致病基因DNA靶点的sgRNA分别与NG-ABE8e、NG-ABE9e表达载体共转入HEK-293-mutRHO细胞中；48h后更换新鲜培养基，第3天收集细胞，并抽提细胞基因组DNA，然后利用针对靶点的特异性引物进行PCR扩增，利用基因组DNA的PCR产物构建高通量二代测序DNA文库，并进行高通量二代测序。分析二代数据显示NG-ABE8e对突变位点完全修复的效率是NG-ABE8e的1.79倍，并且其编辑产生的副产物也比NG-ABE8e明显减少，安全性更高(如图9所示)。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 温州医科大学
<120> 一种腺嘌呤碱基编辑工具及其方法和应用
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8217
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 60
cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 120
ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact 180
cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa 240
atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta 300
ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctggttt agtgaaccgt cagatccgct 360
agagatccgc ggccgctaat acgactcact atagggagag ccgccaccat gaaacggaca 420
gccgacggaa gcgagttcga gtcaccaaag aagaagcgga aagtctctga ggtggagttt 480
tcccacgagt actggatgag acatgccctg accctggcca agagggcacg ggatgagagg 540
gaggtgcctg tgggagccgt gctggtgctg aacaatagag tgatcggcga gggctggaac 600
agagccatcg gcctgcacga cccaacagcc catgccgaaa ttatggccct gagacagggc 660
ggcctggtca tgcagaacta cagactgatt gacgccaccc tgtacgtgac attcgagcct 720
tgcgtgatgt gcgccggcgc catgatccac tctaggatcg gccgcgtggt gtttggcgtg 780
aggaactcaa aaaccggcgc cgcaggctcc ctgatgaacg tgctgaacta ccccggcatg 840
aagcaccgcg tcgaaattac cgagggaatc ctggcagatg aatgtgccgc cctgctgtgc 900
gatttctatc ggatgcctag acgggtgttc aatgctcaga agaaggccca gagctccatc 960
aactccggag gatctagcgg aggctcctct ggctctgaga cacctggcac aagcgagagc 1020
gcaacacctg aaagcagcgg gggcagcagc ggggggtcag acaagaagta cagcatcggc 1080
ctggccatcg gcaccaactc tgtgggctgg gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccc 1140
agcaagaaat tcaaggtgct gggcaacacc gaccggcaca gcatcaagaa gaacctgatc 1200
ggagccctgc tgttcgacag cggcgaaaca gccgaggcca cccggctgaa gagaaccgcc 1260
agaagaagat acaccagacg gaagaaccgg atctgctatc tgcaagagat cttcagcaac 1320
gagatggcca aggtggacga cagcttcttc cacagactgg aagagtcctt cctggtggaa 1380
gaggataaga agcacgagcg gcaccccatc ttcggcaaca tcgtggacga ggtggcctac 1440
cacgagaagt accccaccat ctaccacctg agaaagaaac tggtggacag caccgacaag 1500
gccgacctgc ggctgatcta tctggccctg gcccacatga tcaagttccg gggccacttc 1560
ctgatcgagg gcgacctgaa ccccgacaac agcgacgtgg acaagctgtt catccagctg 1620
gtgcagacct acaaccagct gttcgaggaa aaccccatca acgccagcgg cgtggacgcc 1680
aaggccatcc tgtctgccag actgagcaag agcagacggc tggaaaatct gatcgcccag 1740
ctgcccggcg agaagaagaa tggcctgttc ggaaacctga ttgccctgag cctgggcctg 1800
acccccaact tcaagagcaa cttcgacctg gccgaggatg ccaaactgca gctgagcaag 1860
gacacctacg acgacgacct ggacaacctg ctggcccaga tcggcgacca gtacgccgac 1920
ctgtttctgg ccgccaagaa cctgtccgac gccatcctgc tgagcgacat cctgagagtg 1980
aacaccgaga tcaccaaggc ccccctgagc gcctctatga tcaagagata cgacgagcac 2040
caccaggacc tgaccctgct gaaagctctc gtgcggcagc agctgcctga gaagtacaaa 2100
gagattttct tcgaccagag caagaacggc tacgccggct acattgacgg cggagccagc 2160
caggaagagt tctacaagtt catcaagccc atcctggaaa agatggacgg caccgaggaa 2220
ctgctcgtga agctgaacag agaggacctg ctgcggaagc agcggacctt cgacaacggc 2280
agcatccccc accagatcca cctgggagag ctgcacgcca ttctgcggcg gcaggaagat 2340
ttttacccat tcctgaagga caaccgggaa aagatcgaga agatcctgac cttccgcatc 2400
ccctactacg tgggccctct ggccagggga aacagcagat tcgcctggat gaccagaaag 2460
agcgaggaaa ccatcacccc ctggaacttc gaggaagtgg tggacaaggg cgcttccgcc 2520
cagagcttca tcgagcggat gaccaacttc gataagaacc tgcccaacga gaaggtgctg 2580
cccaagcaca gcctgctgta cgagtacttc accgtgtata acgagctgac caaagtgaaa 2640
tacgtgaccg agggaatgag aaagcccgcc ttcctgagcg gcgagcagaa aaaggccatc 2700
gtggacctgc tgttcaagac caaccggaaa gtgaccgtga agcagctgaa agaggactac 2760
ttcaagaaaa tcgagtgctt cgactccgtg gaaatctccg gcgtggaaga tcggttcaac 2820
gcctccctgg gcacatacca cgatctgctg aaaattatca aggacaagga cttcctggac 2880
aatgaggaaa acgaggacat tctggaagat atcgtgctga ccctgacact gtttgaggac 2940
agagagatga tcgaggaacg gctgaaaacc tatgcccacc tgttcgacga caaagtgatg 3000
aagcagctga agcggcggag atacaccggc tggggcaggc tgagccggaa gctgatcaac 3060
ggcatccggg acaagcagtc cggcaagaca atcctggatt tcctgaagtc cgacggcttc 3120
gccaacagaa acttcatgca gctgatccac gacgacagcc tgacctttaa agaggacatc 3180
cagaaagccc aggtgtccgg ccagggcgat agcctgcacg agcacattgc caatctggcc 3240
ggcagccccg ccattaagaa gggcatcctg cagacagtga aggtggtgga cgagctcgtg 3300
aaagtgatgg gccggcacaa gcccgagaac atcgtgatcg aaatggccag agagaaccag 3360
accacccaga agggacagaa gaacagccgc gagagaatga agcggatcga agagggcatc 3420
aaagagctgg gcagccagat cctgaaagaa caccccgtgg aaaacaccca gctgcagaac 3480
gagaagctgt acctgtacta cctgcagaat gggcgggata tgtacgtgga ccaggaactg 3540
gacatcaacc ggctgtccga ctacgatgtg gaccatatcg tgcctcagag ctttctgaag 3600
gacgactcca tcgacaacaa ggtgctgacc agaagcgaca agaaccgggg caagagcgac 3660
aacgtgccct ccgaagaggt cgtgaagaag atgaagaact actggcggca gctgctgaac 3720
gccaagctga ttacccagag aaagttcgac aatctgacca aggccgagag aggcggcctg 3780
agcgaactgg ataaggccgg cttcatcaag agacagctgg tggaaacccg gcagatcaca 3840
aagcacgtgg cacagatcct ggactcccgg atgaacacta agtacgacga gaatgacaag 3900
ctgatccggg aagtgaaagt gatcaccctg aagtccaagc tggtgtccga tttccggaag 3960
gatttccagt tttacaaagt gcgcgagatc aacaactacc accacgccca cgacgcctac 4020
ctgaacgccg tcgtgggaac cgccctgatc aaaaagtacc ctaagctgga aagcgagttc 4080
gtgtacggcg actacaaggt gtacgacgtg cggaagatga tcgccaagag cgagcaggaa 4140
atcggcaagg ctaccgccaa gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt tttcaagacc 4200
gagattaccc tggccaacgg cgagatccgg aagcggcctc tgatcgagac aaacggcgaa 4260
accggggaga tcgtgtggga taagggccgg gattttgcca ccgtgcggaa agtgctgagc 4320
atgccccaag tgaatatcgt gaaaaagacc gaggtgcaga caggcggctt cagcaaagag 4380
tctatcaggc ccaagaggaa cagcgataag ctgatcgcca gaaagaagga ctgggaccct 4440
aagaagtacg gcggcttcgt cagccccacc gtggcctatt ctgtgctggt ggtggccaaa 4500
gtggaaaagg gcaagtccaa gaaactgaag agtgtgaaag agctgctggg gatcaccatc 4560
atggaaagaa gcagcttcga gaagaatccc atcgactttc tggaagccaa gggctacaaa 4620
gaagtgaaaa aggacctgat catcaagctg cctaagtact ccctgttcga gctggaaaac 4680
ggccggaaga gaatgctggc ctctgccaga ttcctgcaga agggaaacga actggccctg 4740
ccctccaaat atgtgaactt cctgtacctg gccagccact atgagaagct gaagggctcc 4800
cccgaggata atgagcagaa acagctgttt gtggaacagc acaagcacta cctggacgag 4860
atcatcgagc agatcagcga gttctccaag agagtgatcc tggccgacgc taatctggac 4920
aaagtgctgt ccgcctacaa caagcaccgg gataagccca tcagagagca ggccgagaat 4980
atcatccacc tgtttaccct gaccaatctg ggagccccta gggccttcaa gtactttgac 5040
accaccatcg accggaaggt gtacaggagc accaaagagg tgctggacgc caccctgatc 5100
caccagagca tcaccggcct gtacgagaca cggatcgacc tgtctcagct gggaggtgac 5160
tctggcggct caaaaagaac cgccgacggc agcgaattcg agcccaagaa gaagaggaaa 5220
gtctaaccgg tcatcatcac catcaccatt gagtttaaac ccgctgatca gcctcgactg 5280
tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 5340
aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 5400
gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 5460
aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa 5520
ccagctgggg ctcgataccg tcgacctcta gctagagctt ggcgtaatca tggtcatagc 5580
tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca 5640
taaagtgtaa agcctagggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct 5700
cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 5760
gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 5820
tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 5880
tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 5940
ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 6000
agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 6060
accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 6120
ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 6180
gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 6240
ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 6300
gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 6360
taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag 6420
tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 6480
gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 6540
cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacactc 6600
agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 6660
cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 6720
cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 6780
ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 6840
taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 6900
tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 6960
ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 7020
atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 7080
gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 7140
tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 7200
cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 7260
taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 7320
ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 7380
ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 7440
cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 7500
ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 7560
gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 7620
gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 7680
aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc gacggatcgg 7740
gagatcgatc tcccgatccc ctagggtcga ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat 7800
agttaagcca gtatctgctc cctgcttgtg tgttggaggt cgctgagtag tgcgcgagca 7860
aaatttaagc tacaacaagg caaggcttga ccgacaattg catgaagaat ctgcttaggg 7920
ttaggcgttt tgcgctgctt cgcgatgtac gggccagata tacgcgttga cattgattat 7980
tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatattgagt 8040
tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc 8100
cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 8160
gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatc 8217
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctagccctcg ctggtgtcgt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccctagccc tcgctggtgt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtgccctag ccctcgctgg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccgtgccct agccctcgct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcccgtgccc tagccctcgc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctgcccgtg ccctagccct 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
accctcgctg gtgtcgtcgc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgaccctcg ctggtgtcgt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gccctgaccc tcgctggtgt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgtgccctga ccctcgctgg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcccgtgccc tgaccctcgc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gctgcccgtg ccctgaccct 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgcccatcgc attggagaag 20
<210> 15
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctgaccctcg 180
ctggtgtcgt cgctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720
ggactcagat ctcgataa 738
<210> 16
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctgaccctcg 180
ctggtgtcgt cgctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720
ggactcagat ctcgataa 738
<210> 17
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atgaatggca cagaaggccc taacttctac gtgcccttct ccaatgcgat gggcgtggtg 60
cggagcccct tcgagcag 78
<210> 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcagatccgc tagagatccg cgg 23
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
taccccggca tgaagcaccg c 21
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtgcttcatg ccggggtagt tc 22
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tagacgggtg ttcaatgctc agaagaaggc 30
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttgaacaccc gtctaggcat ccgatagaaa tcgcac 36
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctcaaaaacc ggcgccgcag gct 23
<210> 24
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gcgccggttt ttgagttcct cacgccaaac ac 32
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tcagagccag aggagcctcc gctagat 27
<210> 26
<211> 451
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tcagatccgc tagagatccg cggccgctaa tacgactcac tatagggaga gccgccacca 60
tgaaacggac agccgacgga agcgagttcg agtcaccaaa gaagaagcgg aaagtctctg 120
aggtggagtt ttcccacgag tactggatga gacatgccct gaccctggcc aagagggcac 180
gggatgagag ggaggtgcct gtgggagccg tgctggtgct gaacaataga gtgatcggcg 240
agggctggaa cagagccatc ggcctgcacg acccaacagc ccatgccgaa attatggccc 300
tgagacaggg cggcctggtc atgcagaact acagactgat tgacgccacc ctgtacgtga 360
cattcgagcc ttgcgtgatg tgcgccggcg ccatgatcca ctctaggatc ggccgcgtgg 420
tgtttggcgt gaggaactca aaaaccggcg c 451
<210> 27
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ctcaaaaacc ggcgccgcag gctccctgat gaacgtgctg aactaccccg gcatgaagca 60
c 61
<210> 28
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
taccccggca tgaagcaccg cgtcgaaatt accgagggaa tcctggcaga tgaatgtgcc 60
gccctgctgt gcgatttcta tcggatgcct agacgggtgt tcaat 105
<210> 29
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tagacgggtg ttcaatgctc agaagaaggc ccagagctcc atcaactccg gaggatctag 60
cggaggctcc tctggctctg a 81
<210> 30
<211> 1605
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Met Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys
1               5                   10                  15
Arg Lys Val Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His
            20                  25                  30
Ala Leu Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val
        35                  40                  45
Gly Ala Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn
    50                  55                  60
Arg Ala Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala
65                  70                  75                  80
Leu Arg Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala
                85                  90                  95
Thr Leu Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met
            100                 105                 110
Ile His Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ser Lys
        115                 120                 125
Thr Gly Ala Ala Gly Ser Leu Met Asn Val Leu Asn Tyr Pro Gly Met
    130                 135                 140
Lys His Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala
145                 150                 155                 160
Ala Leu Leu Cys Asp Phe Tyr Arg Met Pro Arg Arg Val Phe Asn Ala
                165                 170                 175
Gln Lys Lys Ala Gln Ser Ser Ile Asn Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly
            180                 185                 190
Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
        195                 200                 205
Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly
    210                 215                 220
Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu
225                 230                 235                 240
Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg
                245                 250                 255
His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly
            260                 265                 270
Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr
        275                 280                 285
Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn
    290                 295                 300
Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser
305                 310                 315                 320
Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly
                325                 330                 335
Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr
            340                 345                 350
His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg
        355                 360                 365
Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe
    370                 375                 380
Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu
385                 390                 395                 400
Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro
                405                 410                 415
Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu
            420                 425                 430
Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu
        435                 440                 445
Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu
    450                 455                 460
Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu
465                 470                 475                 480
Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala
                485                 490                 495
Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu
            500                 505                 510
Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile
        515                 520                 525
Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His
    530                 535                 540
His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro
545                 550                 555                 560
Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala
                565                 570                 575
Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile
            580                 585                 590
Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys
        595                 600                 605
Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly
    610                 615                 620
Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg
625                 630                 635                 640
Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile
                645                 650                 655
Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala
            660                 665                 670
Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr
        675                 680                 685
Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala
    690                 695                 700
Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn
705                 710                 715                 720
Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val
                725                 730                 735
Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys
            740                 745                 750
Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu
        755                 760                 765
Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr
    770                 775                 780
Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu
785                 790                 795                 800
Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile
                805                 810                 815
Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu
            820                 825                 830
Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile
        835                 840                 845
Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met
    850                 855                 860
Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg
865                 870                 875                 880
Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu
                885                 890                 895
Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu
            900                 905                 910
Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln
        915                 920                 925
Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala
    930                 935                 940
Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val
945                 950                 955                 960
Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val
                965                 970                 975
Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn
            980                 985                 990
Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly
        995                 1000                1005
Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn
    1010                1015                1020
Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val
1025                1030                1035                1040
Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His
                1045                1050                1055
Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val
            1060                1065                1070
Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser
        1075                1080                1085
Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn
    1090                1095                1100
Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu
1105                1110                1115                1120
Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln
                1125                1130                1135
Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp
            1140                1145                1150
Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu
        1155                1160                1165
Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys
    1170                1175                1180
Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala
1185                1190                1195                1200
His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys
                1205                1210                1215
Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr
            1220                1225                1230
Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala
        1235                1240                1245
Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr
    1250                1255                1260
Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu
1265                1270                1275                1280
Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe
                1285                1290                1295
Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys
            1300                1305                1310
Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Arg Pro
        1315                1320                1325
Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
    1330                1335                1340
Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Val Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu
1345                1350                1355                1360
Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val
                1365                1370                1375
Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys
            1380                1385                1390
Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys
        1395                1400                1405
Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn
    1410                1415                1420
Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Arg Phe Leu Gln Lys Gly Asn
1425                1430                1435                1440
Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser
                1445                1450                1455
His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln
            1460                1465                1470
Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln
        1475                1480                1485
Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp
    1490                1495                1500
Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu
1505                1510                1515                1520
Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala
                1525                1530                1535
Pro Arg Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Val Tyr
            1540                1545                1550
Arg Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile
        1555                1560                1565
Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
    1570                1575                1580
Ser Gly Gly Ser Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Pro Lys
1585                1590                1595                1600
Lys Lys Arg Lys Val
                1605

Claims (10)

1.一种腺嘌呤碱基编辑工具，其特征在于，包括NG-ABE9e表达载体，所述NG-ABE9e表达载体为质粒pCMV-NG-ABE9e，其序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的腺嘌呤碱基编辑工具，其特征在于，包括sgRNA表达载体。
3.根据权利要求2所述的腺嘌呤碱基编辑工具，其特征在于，sgRNA表达载体，其序列如SEQ ID NO.14所示。
4.根据权利要求1-3所述的腺嘌呤碱基编辑工具，其特征在于，NG-ABE9e表达载体编码的NG-ABE9e氨基酸序列，如SEQ ID NO.30所示。
5.一种腺嘌呤碱基编辑工具，其特征在于，包括NG-ABE9e氨基酸序列，如SEQ ID NO.30所示。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的腺嘌呤碱基编辑工具的构建方法，其特征在于:利用含有相应突变信息的引物，从pCMV-NG-ABE8e载体上扩增出突变片段一、二、三、四；pCMV-NG-ABE8e载体酶切后得到骨架；将突变片段一、二、三、四搭桥后与骨架通过无缝克隆得到编码突变型蛋白的表达载体pCMV-NG-ABE9e。
7.根据权利要求6所述的腺嘌呤碱基编辑工具的构建方法，其特征在于，利用如SEQ IDNO.18和SEQ ID NO.24所示的含有相应突变信息的引物序列获得突变片段一；利用如SEQID NO.23和SEQ ID NO.20所示的含有相应突变信息的引物序列获得突变片段二；利用如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.22所示的含有相应突变信息的引物序列获得突变片段三；利用如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.25所示的含有相应突变信息的引物序列获得突变片段四。
8.根据权利要求7所述的腺嘌呤碱基编辑工具的构建方法，其特征在于，所述突变片段一、二、三、四序列如SEQ ID NO.26、27、28、29所示。
9.一种权利要求1-5任一项所述的腺嘌呤碱基编辑工具在真核细胞单碱基编辑中的应用。
10.一种权利要求9所述的腺嘌呤碱基编辑工具的应用，其特征在于：腺嘌呤碱基编辑工具用于对含突变的RHO基因的真核细胞的修复。
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