CN106591369A - 一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18S rDNA基因的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向编辑水牛18S rDNA基因的技术领域，特别涉及一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18S rDNA基因的方法，发明利自主构建的18S基因编辑载体对水牛的18S rDNA基因进行编辑，构建的腺病毒载体包含Cas9蛋白和sgRNA，再将载体进行腺病毒包装。利用Cas9编辑基因的准确高效性、腺病毒对外源基因承载能力强和腺病毒对原代细胞感染能力强的特性对水牛的18S rDNA基因进行编辑，克服水牛原代细胞难转染的瓶颈，所包装的腺病毒，能高效率地感染水牛原代乳腺上皮细胞并高效编辑水牛18SrDNA基因。

Description

一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18S rDNA基因的方法
【技术领域】
本发明涉及靶向编辑水牛18S rDNA基因的技术领域，特别涉及一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18S rDNA基因的方法。
【背景技术】
水牛具有耐高温高湿、抗病、耐粗饲、易饲养的生物学特性，适合在中国南方进行养殖。广西广泛养殖水牛，由于水牛具有泌乳量低、产仔率低等特点，近年来，在分子生物学领域通过利用基因工程技术对水牛相关基因进行编辑，从而达到提高水牛泌乳量、产仔率的目的研究越来越多，而在分子生物学领域往往通过基因导入载体主要分为病毒载体和非病毒载体。而腺病毒载体由于外源基因承载能力强，且可感染处于静止期的细胞，病毒滴度高，不整合基因组，使其在转基因方面应用越来越广泛。
例如，本发明人在《中国畜牧兽医》2016,43(10)：2661-2665的《腺病毒载体转染水牛不同原代体细胞的效果比较》一文中就有关于用腺病毒载体转染水牛乳腺上皮细胞、卵丘细胞、成纤维细胞的研究，但是，该项技术并没有披露关于利用人工构建的腺病毒载体靶向编辑水牛的18S rDNA的任何描述，由于核糖体基因18S rRNA基因序列及二级结构高度保守,在蛋白质合成中具有重要的功能，是至今发现的DNA序列中最为保守的一类，一般认为，如果某个基因编辑方法能对18S rDNA进行编辑，则证明该编辑该方法同样能对其它基因有着良好的基因编辑能力。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要提供一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18S rDNA基因的方法，能安全、高效的对水牛的18S rDNA基因进行有效编辑。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18S rDNA基因的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)含有水牛18S基因片段的sn468-18S-1人工载体和sn468-18S-2人工载体构建：所述构建方法包括sn468载体的制备和sn468-18S-1、sn468-18S-2人工载体构建2个步骤；
所述sn468载体的制备包括如下步骤：
①用Sal Ⅰ酶和Nhe Ⅰ酶对pUC57-U6质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得U6-Bsmb Ⅰ-gRNA目的基因片段，U6-Bsmb Ⅰ-gRNA的基因序列如序列表13所示；
②用Sal Ⅰ酶和Xba Ⅰ酶对pDC316质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得线性化的pDC316质粒；
③将步骤①的U6-Bsmb Ⅰ-gRNA目的基因片段和步骤②线性化的pDC316质粒进行T4连接，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，提取质粒进行序列测定，得到pDC316-U6载体。
④用Xba Ⅰ酶和Bamh Ⅰ酶对步骤③的pDC316-U6载体进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得线性化的pDC316-U6载体；
⑤用Xba Ⅰ酶和Bamh Ⅰ酶对sncas9载体进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得cas9目的基因片段；
⑥将步骤④线性化的pDC316-U6载体和步骤⑤的cas9目的基因片段进行T4连接，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，提取质粒进行序列测定，得到载体sn468，载体sn468的序列如序列表14所示，用BsmBI酶对载体sn468进行酶切，得到带有BsmBI(粘性末端)的线性化sn468载体；
所述sn468-18S-1、sn468-18S-2人工载体构建方法为：从基因数据库中下载水牛18S基因的核苷酸序列，得到18s基因的两个靶序列，分别命名为：18S靶序列1和18S靶序列2；根据gRNA的PAM设计原则，分别合成18S靶序列1和18S靶序列2的两对引物，引物分别命名为18S-1和18S-2，将18S-1和18S-2两对引物的上下游序列在10×LA PCR Buffer缓冲液、95℃水浴的条件下处理10min，然后经过自然降温3h，分别得到带有BsmBI(粘性末端)的18S-1引物二聚体和18S-2引物二聚体；将带有BsmBI(粘性末端)的18S-1引物二聚体和18S-2引物二聚体分别与步骤⑥带有BsmBI(粘性末端)的线性化sn468载体进行T4连接，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，得到sn468-18S-1人工载体和sn468-18S-2人工载体；
所述18S靶序列1的序列为：5’-GAGGCCATGATTAAGAGGGA-3’；
所述18S-1的上游引物序列为：5’-ACCGGAGGCCATGATTAAGAGGGA-3’；
所述18S-1的下游引物序列为：5’-AAACTCCCTCTTAATCATGGCCTC-3’；
所述18S靶序列2的序列为：5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’；
所述18S-2的上游引物序列为：5’-ACCGGCGGCGCAATACGAATGCCCC-3；
所述18S-2的下游引物序列为：5’-AAACGGGGCATTCGTATTGCGCCGC-3’；
(2)将步骤(1)的sn468-18S-1人工载体和sn468-18S-2人工载体与报告载体ERG进行连接，构建成ERG-#18S-1报告载体和ERG-#18S-2报告载体，并将步骤(1)的sn468-18S-1人工载体和sn468载体分别与人工报告载体进行混合、培养48h后进行荧光表达验证；
所述构建ERG-#18S-1和ERG-#18S-2报告载体的方法为：
合成与18S靶序列1和18S靶序列2相对应的ERG报告载体的2对引物，分别命名为#18S-1和#18S-2；分别将#18S-1和#18S-2两对引物的上下游序列在95℃的温度条件下处理15min，然后经过自然降温、过夜退火，分别得到带有EcoR Ⅰ(粘性末端)和BamH Ⅰ(粘性末端)的#18S-1引物二聚体和#18S-2引物二聚体；用EcoR Ⅰ酶和BamH Ⅰ酶对ERG报告载体进行线性化，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得带有EcoR Ⅰ(粘性末端)和BamH Ⅰ(粘性末端)的线性化ERG载体；用T4连接酶将带有EcoR Ⅰ(粘性末端)和BamH Ⅰ(粘性末端)的#18S-1引物二聚体和#18S-2引物二聚体分别与带有EcoR Ⅰ(粘性末端)和BamH Ⅰ(粘性末端)的线性化ERG载体进行连接，将连接产物导入感受态细胞进行转化，挑取单菌落培养，提取重组质粒，并通过测序验证，获得所述ERG-#18S-1和ERG-#18S-2报告载体；
所述#18S-1的上游引物序列为：5’-AATTCGAGGCCATGATTAAGAGGGACGGG-3’；
所述#18S-1的下游引物序列为：5’-GATCCCCGTCCCTCTTAATCATGGCCTCG-3’；
所述#18S-2的上游引物序列为：5’-AATTCGCGGCGCAATACGAATGCCCCCGG-3’；
所述#18S-2的下游引物序列为：5’-GATCCCGGGGGCATTCGTATTGCGCCGCG-3’；
(3)筛选经过步骤(2)荧光表达验证后有编辑能力的sn468-18S-1和sn468-18S-2人工载体进行进行腺病毒包装，腺病毒包装方法为：将有编辑能力的sn468-18S-1和sn468-18S-2人工载体分别放入不含FBS的DMEM培养基中进行培养，然后与pBHGloxdeltaE13cre腺病毒骨架进行混合，并加入罗氏转染试剂混匀、静置，然后将混合物放入含有传代293细胞的培养基中进行培养，所述293细胞的汇合度为50-70％，培养到293细胞出现空斑后，收集感染之后的293细胞得到sn468-18S-1人工载体腺病毒和sn468-18S-2人工载体腺病毒；
(4)感染水牛乳腺上皮细胞：将步骤(3)sn468-18S-1人工载体腺病毒和sn468-18S-2人工载体腺病毒分别放入含有FBS的DMEM培养基中进行培养，然后放入含有水牛乳腺上皮细胞的培养基中进行培养，所述水牛乳腺上皮细胞的汇合度为70％，培养3d后，收集感染之后的水牛乳腺上皮细胞，提取水牛乳腺上皮细胞的基因组，对水牛18S基因敲除效果进行检测，完成应用腺病毒系统靶向编辑水牛18S rDNA基因的方法。
进一步的，所述步骤(1)中对pUC57-U6质粒、pDC316质粒、pDC316-U6载体和sncm3载体进行酶切的酶切反应条件为37℃，孵育3h，
所述对pUC57-U6质粒进行酶切的反应体系为：3μg的pUC57-U6质粒、5μL的10×FastDigest酶切缓冲液、3μL的Sal Ⅰ酶、3μL的Nhe Ⅰ酶；
所述对pDC316质粒进行酶切的反应体系为：3μg的pDC316质粒、5μL的10×FastDigest酶切缓冲液、3μL的Sal Ⅰ酶、3μL的Xba Ⅰ酶；
所述对pDC316-U6载体和sncas9载体进行酶切的反应体系为：3μg的pDC316-U6载体或3μg的sncas9载体、5μL的10×FastDigest酶切缓冲液、3μL的Xba Ⅰ酶、3μL的BamH Ⅰ酶。
进一步的，所述步骤③U6-Bsmb Ⅰ-gRNA目的基因片段和线性化的pDC316质粒T4连接的连接体系为：1μL的T4连接酶、1μL的10×T4ligase Buffer、30ng的线性化pDC316质粒，30ng的U6-Bsmb Ⅰ-gRNA目的基因片段，加水至10μL。
进一步的，所述步骤⑥线性化的pDC316-U6载体和cas9目的基因片段T4连接的连接体系为：1μL的T4连接酶、1μL的10×T4ligase Buffer、30ng的线性化pDC316载体片段，60ng的cas9目的基因片段，加水至10μL。
进一步的，所述带有BsmBI(粘性末端)的18S-1引物二聚体和18S-2引物二聚体分别与带有BsmBI(粘性末端)的线性化sn468载体T4连接的连接体系为：1μL的T4连接酶、1μL的10×T4 ligase Buffer、1μL的线性化sn468载体，5μL的18S-1引物二聚体或18S-2引物二聚体，加水至10μL。
进一步的，所述步骤(4)水牛18S基因敲除效果的检测方法为：以被sn468-18S-1人工载体腺病毒和sn468-18S-2人工载体腺病毒感染之后的水牛乳腺上皮细胞基因组为模板，以buf18S为检测引物进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收PCR扩增产物，将PCR扩增产物与检测载体连接，转入感受态细胞进行培养，培养后通过挑取单克隆细菌，对单克隆细菌基因序列进行测序，对18S基因突变进行检测；
所述buf18S检测引物的上游序列为：5’-CCCGAAGCGTTTACTTTG-3’；
buf18S检测引物的下游序列为：5’-GGTTTCCCGTGTTGAGTC-3’；
所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min后再进行95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延30s共35个循环，之后进行72℃再延伸7min，然后在4℃条件下终止反应。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明构建的18S基因编辑载体包含Cas9，特异识别18S基因的20bp的小片段sgRNA(single guide RNA)，改造过的Cas9/sgRNA系统通过sgRNA(short guide RNA)引导Cas9蛋白识别并剪切18S rDNA基因，从而精确、高效并多位点的编辑DNA，提高基因编辑的效率；本发明的编辑载体还经过腺病毒包装，形成特有的腺病毒载体，腺病毒的外源基因承载能力强，且可感染处于静止期的细胞，病毒滴度高，不整合基因组，由此，本发明所使用的编辑水牛18S rDNA的方法，能对水牛18S rDNA进行有效编辑，克服水牛原代细胞难转染的瓶颈，能高效率地感染水牛原代乳腺上皮细胞。
【附图说明】
图1是本发明构建的sn468载体结构示意图；
图2是本发明的18s基因多物种同源比对结果图；
图3是本发明的打靶效率荧光表达检测结果图；
图4是本发明包装的腺病毒感染水牛乳腺上皮细胞和脂质体转染水牛乳腺上皮细胞效果的对比图；其中，A是脂质体转染的常光图；B是脂质体转染的荧光图；C是腺病毒感染的常光图；D是腺病毒感染的荧光图；
图5是本发明的水牛乳腺上皮细胞18S基因突变测序结果图；
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例：
本发明主要通过以下方法进行水牛18S的基因编辑：
一、含有水牛18S基因片段的sn468-18S-1人工载体和sn468-18S-2人工载体构建：所述构建方法包括sn468载体的制备和sn468-18S-1、sn468-18S-2人工载体构建2个步骤；
(一)其中，sn468载体的制备方法如下：
1、用Sal Ⅰ酶和Nhe Ⅰ酶对pUC57-U6质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得U6-Bsmb Ⅰ-gRNA目的基因片段，U6-Bsmb Ⅰ-gRNA的基因序列如序列表13所示；其中，酶切体系为：酶切体系为pUC57-U6质粒3μg，10×FastDigest 5μL，3μL Sal Ⅰ，3μL Nhe Ⅰ，加水至50μL，37℃孵育3h；将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，目的片段切胶回收，测定浓度，存于-20℃，备用；
2、用Sal Ⅰ酶和Xba Ⅰ酶对pDC316质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得线性化的pDC316质粒；酶切体系为：酶切体系为pDC316质粒3μg，10×FastDigest 5μL，3μL Xba Ⅰ，3μL Sal Ⅰ，加水至50μL，37℃孵育3h；将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，测定浓度，存于-20℃，备用；
3、将步骤1的U6-Bsmb Ⅰ-gRNA目的基因片段和步骤2线性化的pDC316质粒进行T4连接，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，提取质粒进行序列测定，得到pDC316-U6载体，连接体系：1μL T4 ligase(Fermentas)，1μL 10×T4ligase Buffer(Fermentas)，线性化的pDC316载体片段30ng，U6-Bsmb Ⅰ-gRNA片段30ng，加水至10μL，16℃过夜连接。
4、用Xba Ⅰ酶和Bamh Ⅰ酶对步骤3的pDC316-U6载体进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得线性化的pDC316-U6载体，酶切体系为：酶切体系为pDC316-U6质粒3μg，10×FastDigest 5μL，3μL Xba Ⅰ，3μL Bamh Ⅰ，加水至50μL，37℃孵育3h；将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，测定浓度，存于-20℃，备用；
5、用Xba Ⅰ酶和Bamh Ⅰ酶对sncas9载体进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得cas9目的基因片段；酶切体系为：酶切体系为sncas9质粒3μg，10×FastDigest 5μL，3μL Xba Ⅰ，3μL Bamh Ⅰ，加水至50μL，37℃孵育3h；将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，测定浓度，存于-20℃，备用；
6、将步骤4线性化的pDC316-U6载体和步骤5的cas9目的基因片段进行T4连接，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，提取质粒进行序列测定，得到载体sn468，其中，T4连接连接体系为：1μL T4 ligase(Fermentas)，1μL 10×T4 ligase Buffer(Fermentas)，线性化的pDC316-U6载体片段30ng，cas9片段60ng，加水至10μL，16℃过夜连接。将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，提取质粒并进行序列测定，得到sn468载体，载体序列见序列表14，载体示意图见说明书附图1，用BsmBI酶对载体sn468进行酶切，得到带有BsmBI(粘性末端)的线性化sn468载体；酶切体系为sn468质粒3μg，10×NEBBuffer3 5μL，3μL BsmBI，加水至50μL，55℃孵育3h；将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，测定浓度，存于-20℃，备用；
(二)sn468-18S-1、sn468-18S-2人工载体构建步骤为：
1、从NCBI数据库中下载水牛18s基因的核苷酸序列，得到18s基因的两个靶序列，分别命名为：18S靶序列1和18S靶序列2；
其中，18s靶序列1为：5’-GAGGCCATGATTAAGAGGGA-3’；
18S靶序列2的序列为：5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’；
2、根据gRNA的PAM设计原则，分别合成18S靶序列1和18S靶序列2的两对引物，引物分别命名为18S-1和18S-2；
其中，所述18S-1的上游引物序列为：5’-ACCGGAGGCCATGATTAAGAGGGA-3’；
所述18S-1的下游引物序列为：5’-AAACTCCCTCTTAATCATGGCCTC-3’；
所述18S-2的上游引物序列为：5’-ACCGGCGGCGCAATACGAATGCCCC-3；
所述18S-2的下游引物序列为：5’-AAACGGGGCATTCGTATTGCGCCGC-3’；
3、将18S-1和18S-2两对引物的上下游序列各取4.5μL，再加入1μL的10×LA PCRBuffer缓冲液、在95℃水浴的条件下处理10min，然后经过自然降温3h，分别得到带有BsmBI(粘性末端)的18S-1引物二聚体和18S-2引物二聚体；
将上述带有BsmBI(粘性末端)的18S-1引物二聚体和18S-2引物二聚体分别与步骤⑥带有BsmBI(粘性末端)的线性化sn468载体进行T4连接，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，得到sn468-18S-1人工载体和sn468-18S-2人工载体；连接体系为：1μL线性化质粒sn468，1μL 10×T4 ligase Buffer(Fermentas)，靶序列及其互补序列形成的双链DNA 5μL，加水至10μL，16℃过夜连接。将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，提取质粒并进行序列测定，得到sn468-18s-1和sn468-18s-2载体。
二、基因敲除效率的验证
将上述的sn468-18S-1人工载体和sn468-18S-2人工载体与报告载体ERG进行连接，构建成ERG-#18S-1报告载体和ERG-#18S-2报告载体，并将上述sn468-18S-1人工载体和sn468载体分别与人工报告载体进行混合、培养48h后进行荧光表达验证；
1、构建ERG-#18S-1和ERG-#18S-2报告载体的方法为：
合成与18S靶序列1和18S靶序列2相对应的ERG报告载体的2对引物，分别命名为#18S-1和#18S-2；
其中，#18S-1的上游引物序列为：5’-AATTCGAGGCCATGATTAAGAGGGACGGG-3’；
#18S-1的下游引物序列为：5’-GATCCCCGTCCCTCTTAATCATGGCCTCG-3’；
#18S-2的上游引物序列为：5’-AATTCGCGGCGCAATACGAATGCCCCCGG-3’；
#18S-2的下游引物序列为：5’-GATCCCGGGGGCATTCGTATTGCGCCGCG-3’；
分别将#18S-1和#18S-2两对引物的上下游序列在95℃的温度条件下处理15min，然后经过自然降温、过夜退火，分别得到带有EcoR Ⅰ(粘性末端)和BamH Ⅰ(粘性末端)的#18S-1引物二聚体和#18S-2引物二聚体；
用EcoR Ⅰ酶和BamH Ⅰ酶对ERG报告载体进行线性化，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得带有EcoR Ⅰ(粘性末端)和BamH Ⅰ(粘性末端)的线性化ERG载体；酶切体系为：ERG质粒3μg，10×Buffer K 5μL，3μL EcoRI，3μL BamHI，加水至50μL，37℃孵育3h；将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，目的片段切胶回收，测定浓度，存于-20℃，备用。
用T4连接酶将带有EcoR Ⅰ(粘性末端)和BamH Ⅰ(粘性末端)的#18S-1引物二聚体和#18S-2引物二聚体分别与带有EcoR Ⅰ(粘性末端)和BamH Ⅰ(粘性末端)的线性化ERG载体进行连接，将连接产物导入感受态细胞进行转化，挑取单菌落培养，提取重组质粒，并通过测序验证，获得所述ERG-#18S-1和ERG-#18S-2报告载体；
2、sn468-18S-1人工载体和sn468载体进行荧光表达验证的方法为：
取传代的HEK-293T细胞于4个培养皿中；准备4个离心管编号为1、2、3、4，每个管分别加入不含FBS的DMEM；然后，1号管加sn468-18s-1和ERG-#18s-1；2号管加sn468和ERG-#18s-1；3号管加sn468-18s-2和ERG-#18s-2；4号管加sn468和ERG-#18s-2；最后每个管中加入罗氏转染试剂，混匀，室温静置后，将混合液分别加入培养皿，并于37℃、5％CO2培养箱中培养，48h观察荧光表达情况(见说明书附图3)。荧光观察显示，sn468-18s-1和sn468-18s-2的红色荧光的表达明显多于阴性对照sn468，表明sn468-18s-1和sn468-18s-2能有效地引起DSBs，造成水牛18s基因突变。
三、筛选经过荧光表达验证后有编辑能力的sn468-18S-1和sn468-18S-2人工载体进行进行腺病毒包装。
1、第一天，取传代的293细胞于2个35mm的培养皿中；
2、第二天，待293细胞汇合度为50％时(本实施例只是列举一个可以实施的范围，当293细胞的汇合度为50％-70％时都能达到本发明的效果)，进行质粒转染。取2个离心管，编号为1、2，每个管分别加入不含FBS的DMEM；
3、1号管加sn468-18s-1和pBHGloxdeltaE1,3cre腺病毒骨架；2号管加sn468-18s-2和pBHGloxdeltaE1,3cre腺病毒骨架；最后每个管中加入罗氏转染试剂，混匀，室温静置后，将混合液分别加入培养皿，并于培养箱中培养13天左右，待细胞出现空斑后，收集sn468-18s-1和sn468-18s-2腺病毒。
四、感染水牛乳腺上皮细胞。
1、第一天，取传代的水牛乳腺上皮细胞于2个35mm的培养皿中；
2、第二天，待水牛乳腺上皮细胞汇合度为70％时，进行病毒感染。取2个离心管，编号为1、2，先加入1mL的含10％FBS的DMEM培养基，然后分别加入10μL sn468-18s-1腺病毒和10μL sn468-18s-2腺病毒、空白对照，混匀后，分别滴加到35mm的培养皿中。
3、第三天，吸掉35mm培养皿中的液体，换成2mL的新鲜的含10％FBS的DMEM培养基。
4、第四天，荧光表达观察腺病毒感染水牛乳腺上皮细胞的情况，表达效果见说明书附图4的C、D图，用细胞刮刀收集水牛乳腺上皮细胞，提取基因组，合成水牛18s基因敲除检测引物buf18s，
其中，buf18S的上游引物为：5’-CCCGAAGCGTTTACTTTG-3’；
buf18S的下游引物为：5’-GGTTTCCCGTGTTGAGTC-3’；
扩增长度为473bp，以10μL sn468-18s-1腺病毒和10μL sn468-18s-2腺病毒感染的细胞基因组为模板，进行PCR扩增，PCR体系为：25μL HS(Premix)(Takara)，DNA模板1μL，上下游引物各0.5μL，水补至50μL。反应程序为：95℃预变性3min后再进行95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延30s共35个循环，之后进行72℃再延伸7min，然后在4℃条件下终止反应。取上述PCR反应的50μL PCR产物，直接进行2％的琼脂糖凝胶电泳，电压120V，时间约30min。将PCR产物切胶，回收，连接，转化，挑取单克隆，进行测序，PCR扩增产物连接入-Blunt Cloning Vector载体中，并通过挑取单克隆细菌，测序，对18s基因突变进行检测，测试结果见说明书附图5，表明sn468-18s-1和sn468-18s-2能有效地对水牛乳腺上皮细胞18s基因进行编辑。
对比情况：
将本发明的腺病毒感染水牛乳腺上皮细胞的荧光表达情况与脂质体转染法转染水牛乳腺上皮细胞的荧光表达情况进行对比，对比情况见图4(其中，A是脂质体转染的常光图；B是脂质体转染的荧光图；C是腺病毒感染的常光图；D是腺病毒感染的荧光图)，由对比图发现，腺病毒感染效率基本为100％，极显著高于脂质体法转染水牛乳腺上皮细胞的效率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广西壮族自治区水牛研究所
<120> 一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18S rDNA基因的方法
<130> 2016
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 18S靶序列1
<400> 1
gaggccatga ttaagaggga 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 18S-1的上游引物序列
<400> 2
accggaggcc atgattaaga ggga 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 18S-1的下游引物序列
<400> 3
aaactccctc ttaatcatgg cctc 24
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 18S靶序列2
<400> 4
gcggcgcaat acgaatgccc c 21
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 18S-2的上游引物序列
<400> 5
accggcggcg caatacgaat gcccc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 18S-2的下游引物序列
<400> 6
aaacggggca ttcgtattgc gccgc 25
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> #18S-1的上游引物序列
<400> 7
aattcgaggc catgattaag agggacggg 29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> #18S-1的下游引物序列
<400> 8
gatccccgtc cctcttaatc atggcctcg 29
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> #18S-2的上游引物序列
<400> 9
aattcgcggc gcaatacgaa tgcccccgg 29
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> #18S-2的下游引物序列
<400> 10
gatcccgggg gcattcgtat tgcgccgcg 29
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> buf18S检测引物的上游序列
<400> 11
cccgaagcgt ttactttg 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> buf18S检测引物的下游序列
<400> 12
ggtttcccgt gttgagtc 18
<210> 13
<211> 385
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> U6-BsmbⅠ-gRNA序列
<400> 13
gctagcgagg gcctatttcc catgattcct tcatatttgc atatacgata caaggctgtt 60
agagagataa ttggaattaa tttgactgta aacacaaaga tattagtaca aaatacgtga 120
cgtagaaagt aataatttct tgggtagttt gcagttttaa aattatgttt taaaatggac 180
tatcatatgc ttaccgtaac ttgaaagtat ttcgatttct tggctttata tatcttgtgg 240
aaaggacgaa acaccgagag acgttttttt tttcgtctca gttttagagc tagaaatagc 300
aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 360
ttttctagaa caaggatccg tcgac 385
<210> 14
<211> 9561
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> sn468载体序列
<400> 14
ttcatcaata atatacctta ttttggattg aagccaatat gataatgagg gggtggagtt 60
tgtgacgtgg cgcggggcgt gggaacgggg cgggtgacgt agtagtgtgg cggaagtgtg 120
atgttgcaag tgtggcggaa cacatgtaag cgacggatgt ggcaaaagtg acgtttttgg 180
tgtgcgccgg tgtacacagg aagtgacaat tttcgcgcgg ttttaggcgg atgttgtagt 240
aaatttgggc gtaaccgagt aagatttggc cattttcgcg ggaaaactga ataagaggaa 300
gtgaaatctg aataattttg tgttactcat agcgcgtaat atttgtctag ggccgcgggg 360
actttgaccg tttacgtgga gactcgccca ggtgtttttc tcaggtgttt tccgcgttcc 420
gggtcaaagt tggcgtttta ttattatagt cagtctagcg agggcctatt tcccatgatt 480
ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct gttagagaga taattggaat taatttgact 540
gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag 600
tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag 660
tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac gaaacaccga gagacgtttt 720
ttttttcgtc tcagttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc 780
aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct tttttttcta gaggtacccg ttacataact 840
tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaatagt 900
aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca 960
cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg 1020
taaatggccc gcctggcatt gtgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca 1080
gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtcgag gtgagcccca cgttctgctt 1140
cactctcccc atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt 1200
attttgtgca gcgatggggg cggggggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg 1260
gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc 1320
gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag 1380
cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgacgct gccttcgccc cgtgccccgc tccgccgccg 1440
cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg agcgggcggg 1500
acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc tgagcaagag gtaagggttt aagggatggt 1560
tggttggtgg ggtattaatg tttaattacc tggagcacct gcctgaaatc actttttttc 1620
aggttggacc ggtgccacca tggactataa ggaccacgac ggagactaca aggatcatga 1680
tattgattac aaagacgatg acgataagat ggccccaaag aagaagcgga aggtcggtat 1740
ccacggagtc ccagcagccg acaagaagta cagcatcggc ctggacatcg gcaccaactc 1800
tgtgggctgg gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccc agcaagaaat tcaaggtgct 1860
gggcaacacc gaccggcaca gcatcaagaa gaacctgatc ggagccctgc tgttcgacag 1920
cggcgaaaca gccgaggcca cccggctgaa gagaaccgcc agaagaagat acaccagacg 1980
gaagaaccgg atctgctatc tgcaagagat cttcagcaac gagatggcca aggtggacga 2040
cagcttcttc cacagactgg aagagtcctt cctggtggaa gaggataaga agcacgagcg 2100
gcaccccatc ttcggcaaca tcgtggacga ggtggcctac cacgagaagt accccaccat 2160
ctaccacctg agaaagaaac tggtggacag caccgacaag gccgacctgc ggctgatcta 2220
tctggccctg gcccacatga tcaagttccg gggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa 2280
ccccgacaac agcgacgtgg acaagctgtt catccagctg gtgcagacct acaaccagct 2340
gttcgaggaa aaccccatca acgccagcgg cgtggacgcc aaggccatcc tgtctgccag 2400
actgagcaag agcagacggc tggaaaatct gatcgcccag ctgcccggcg agaagaagaa 2460
tggcctgttc ggaaacctga ttgccctgag cctgggcctg acccccaact tcaagagcaa 2520
cttcgacctg gccgaggatg ccaaactgca gctgagcaag gacacctacg acgacgacct 2580
ggacaacctg ctggcccaga tcggcgacca gtacgccgac ctgtttctgg ccgccaagaa 2640
cctgtccgac gccatcctgc tgagcgacat cctgagagtg aacaccgaga tcaccaaggc 2700
ccccctgagc gcctctatga tcaagagata cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct 2760
gaaagctctc gtgcggcagc agctgcctga gaagtacaaa gagattttct tcgaccagag 2820
caagaacggc tacgccggct acattgacgg cggagccagc caggaagagt tctacaagtt 2880
catcaagccc atcctggaaa agatggacgg caccgaggaa ctgctcgtga agctgaacag 2940
agaggacctg ctgcggaagc agcggacctt cgacaacggc agcatccccc accagatcca 3000
cctgggagag ctgcacgcca ttctgcggcg gcaggaagat ttttacccat tcctgaagga 3060
caaccgggaa aagatcgaga agatcctgac cttccgcatc ccctactacg tgggccctct 3120
ggccagggga aacagcagat tcgcctggat gaccagaaag agcgaggaaa ccatcacccc 3180
ctggaacttc gaggaagtgg tggacaaggg cgcttccgcc cagagcttca tcgagcggat 3240
gaccaacttc gataagaacc tgcccaacga gaaggtgctg cccaagcaca gcctgctgta 3300
cgagtacttc accgtgtata acgagctgac caaagtgaaa tacgtgaccg agggaatgag 3360
aaagcccgcc ttcctgagcg gcgagcagaa aaaggccatc gtggacctgc tgttcaagac 3420
caaccggaaa gtgaccgtga agcagctgaa agaggactac ttcaagaaaa tcgagtgctt 3480
cgactccgtg gaaatctccg gcgtggaaga tcggttcaac gcctccctgg gcacatacca 3540
cgatctgctg aaaattatca aggacaagga cttcctggac aatgaggaaa acgaggacat 3600
tctggaagat atcgtgctga ccctgacact gtttgaggac agagagatga tcgaggaacg 3660
gctgaaaacc tatgcccacc tgttcgacga caaagtgatg aagcagctga agcggcggag 3720
atacaccggc tggggcaggc tgagccggaa gctgatcaac ggcatccggg acaagcagtc 3780
cggcaagaca atcctggatt tcctgaagtc cgacggcttc gccaacagaa acttcatgca 3840
gctgatccac gacgacagcc tgacctttaa agaggacatc cagaaagccc aggtgtccgg 3900
ccagggcgat agcctgcacg agcacattgc caatctggcc ggcagccccg ccattaagaa 3960
gggcatcctg cagacagtga aggtggtgga cgagctcgtg aaagtgatgg gccggcacaa 4020
gcccgagaac atcgtgatcg aaatggccag agagaaccag accacccaga agggacagaa 4080
gaacagccgc gagagaatga agcggatcga agagggcatc aaagagctgg gcagccagat 4140
cctgaaagaa caccccgtgg aaaacaccca gctgcagaac gagaagctgt acctgtacta 4200
cctgcagaat gggcgggata tgtacgtgga ccaggaactg gacatcaacc ggctgtccga 4260
ctacgatgtg gaccatatcg tgcctcagag ctttctgaag gacgactcca tcgacaacaa 4320
ggtgctgacc agaagcgaca agaaccgggg caagagcgac aacgtgccct ccgaagaggt 4380
cgtgaagaag atgaagaact actggcggca gctgctgaac gccaagctga ttacccagag 4440
aaagttcgac aatctgacca aggccgagag aggcggcctg agcgaactgg ataaggccgg 4500
cttcatcaag agacagctgg tggaaacccg gcagatcaca aagcacgtgg cacagatcct 4560
ggactcccgg atgaacacta agtacgacga gaatgacaag ctgatccggg aagtgaaagt 4620
gatcaccctg aagtccaagc tggtgtccga tttccggaag gatttccagt tttacaaagt 4680
gcgcgagatc aacaactacc accacgccca cgacgcctac ctgaacgccg tcgtgggaac 4740
cgccctgatc aaaaagtacc ctaagctgga aagcgagttc gtgtacggcg actacaaggt 4800
gtacgacgtg cggaagatga tcgccaagag cgagcaggaa atcggcaagg ctaccgccaa 4860
gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt tttcaagacc gagattaccc tggccaacgg 4920
cgagatccgg aagcggcctc tgatcgagac aaacggcgaa accggggaga tcgtgtggga 4980
taagggccgg gattttgcca ccgtgcggaa agtgctgagc atgccccaag tgaatatcgt 5040
gaaaaagacc gaggtgcaga caggcggctt cagcaaagag tctatcctgc ccaagaggaa 5100
cagcgataag ctgatcgcca gaaagaagga ctgggaccct aagaagtacg gcggcttcga 5160
cagccccacc gtggcctatt ctgtgctggt ggtggccaaa gtggaaaagg gcaagtccaa 5220
gaaactgaag agtgtgaaag agctgctggg gatcaccatc atggaaagaa gcagcttcga 5280
gaagaatccc atcgactttc tggaagccaa gggctacaaa gaagtgaaaa aggacctgat 5340
catcaagctg cctaagtact ccctgttcga gctggaaaac ggccggaaga gaatgctggc 5400
ctctgccggc gaactgcaga agggaaacga actggccctg ccctccaaat atgtgaactt 5460
cctgtacctg gccagccact atgagaagct gaagggctcc cccgaggata atgagcagaa 5520
acagctgttt gtggaacagc acaagcacta cctggacgag atcatcgagc agatcagcga 5580
gttctccaag agagtgatcc tggccgacgc taatctggac aaagtgctgt ccgcctacaa 5640
caagcaccgg gataagccca tcagagagca ggccgagaat atcatccacc tgtttaccct 5700
gaccaatctg ggagcccctg ccgccttcaa gtactttgac accaccatcg accggaagag 5760
gtacaccagc accaaagagg tgctggacgc caccctgatc caccagagca tcaccggcct 5820
gtacgagaca cggatcgacc tgtctcagct gggaggcgac aaaaggccgg cggccacgaa 5880
aaaggccggc caggcaaaaa agaaaaagga attcgagggc agaggaagtc tgctaacatg 5940
cggtgacgtg gaggagaatc ccggccctat ggcccagtcc aagcacggcc tgaccaagga 6000
gatgaccatg aagtaccgca tggagggctg cgtggacggc cacaagttcg tgatcaccgg 6060
cgagggcatc ggctacccct tcaagggcaa gcaggccatc aacctgtgcg tggtggaggg 6120
cggccccttg cccttcgccg aggacatctt gtccgccgcc ttcatgtacg gcaaccgcgt 6180
gttcaccgag tacccccagg acatcgtcga ctacttcaag aactcctgcc ccgccggcta 6240
cacctgggac cgctccttcc tgttcgagga cggcgccgtg tgcatctgca acgccgacat 6300
caccgtgagc gtggaggaga actgcatgta ccacgagtcc aagttctacg gcgtgaactt 6360
ccccgccgac ggccccgtga tgaagaagat gaccgacaac tgggagccct cctgcgagaa 6420
gatcatcccc gtgcccaagc agggcatctt gaagggcgac gtgagcatgt acctgctgct 6480
gaaggacggt ggccgcttgc gctgccagtt cgacaccgtg tacaaggcca agtccgtgcc 6540
ccgcaagatg cccgactggc acttcatcca gcacaagctg acccgcgagg accgcagcga 6600
cgccaagaac cagaagtggc acctgaccga gcacgccatc gcctccggct ccgccttgcc 6660
ctgaggatcc gtcgacttcg agcaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa 6720
gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt 6780
tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggatcgt ctagcatcga agatccaata 6840
acttcgtata gcatacatta tacgaagtta taagtagctt ggcgtaatca tggtcatagc 6900
tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca 6960
taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct 7020
cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 7080
gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 7140
tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 7200
tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 7260
ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 7320
agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 7380
accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 7440
ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcaa tgctcacgct 7500
gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 7560
ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 7620
gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 7680
taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag 7740
tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 7800
gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 7860
cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 7920
agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 7980
cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 8040
cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 8100
ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 8160
taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 8220
tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 8280
ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 8340
atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 8400
gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 8460
tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 8520
cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 8580
taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 8640
ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa cacgggataa taccgcgcca catagcagaa 8700
ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 8760
cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 8820
ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 8880
gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 8940
gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 9000
aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca 9060
ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac tctaggcaaa atagcaccct 9120
cccgctccag aacaacatac agcgcttcac agcggcagcc taacagtcag ccttaccagt 9180
aaaaaagaaa acctattaaa aaaacaccac tcgacacggc accagctcaa tcagtcacag 9240
tgtaaaaaag ggccaagtgc agagcgagta tatataggac taaaaaatga cgtaacggtt 9300
aaagtccaca aaaaacaccc agaaaaccgc acgcgaacct acgcccagaa acgaaagcca 9360
aaaaacccac aacttcctca aatcgtcact tccgttttcc cacgttacgt aacttcccat 9420
tttaagaaaa ctacaattcc caacacatac aagttactcc gccctaaaac ctacgtcacc 9480
cgccccgttc ccacgccccg cgccacgtca caaactccac cccctcatta tcatattggc 9540
ttcaatccaa aataaggtat a 9561

Claims (6)

1.一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18S rDNA基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)含有水牛18S基因片段的sn468-18S-1人工载体和sn468-18S-2人工载体构建：所述构建方法包括sn468载体的制备和sn468-18S-1、sn468-18S-2人工载体构建2个步骤；
所述sn468载体的制备包括如下步骤：
①用Sal Ⅰ酶和Nhe Ⅰ酶对pUC57-U6质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得U6-Bsmb Ⅰ-gRNA目的基因片段；
②用Sal Ⅰ酶和Xba Ⅰ酶对pDC316质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得线性化的pDC316质粒；
③将步骤①的U6-Bsmb Ⅰ-gRNA目的基因片段和步骤②线性化的pDC316质粒进行T4连接，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，提取质粒进行序列测定，得到pDC316-U6载体。
④用Xba Ⅰ酶和Bamh Ⅰ酶对步骤③的pDC316-U6载体进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得线性化的pDC316-U6载体；
⑤用Xba Ⅰ酶和Bamh Ⅰ酶对sncas9载体进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得cas9目的基因片段；
⑥将步骤④线性化的pDC316-U6载体和步骤⑤的cas9目的基因片段进行T4连接，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，提取质粒进行序列测定，得到载体sn468，用BsmBI酶对载体sn468进行酶切，得到带有BsmBI(粘性末端)的线性化sn468载体；
所述sn468-18S-1、sn468-18S-2人工载体构建方法为：从基因数据库中下载水牛18S基因的核苷酸序列，得到18s基因的两个靶序列，分别命名为：18S靶序列1和18S靶序列2；根据gRNA的PAM设计原则，分别合成18S靶序列1和18S靶序列2的两对引物，引物分别命名为18S-1和18S-2，将18S-1和18S-2两对引物的上下游序列在10×LA PCR Buffer缓冲液、95℃水浴的条件下处理10min，然后经过自然降温3h，分别得到带有BsmBI(粘性末端)的18S-1引物二聚体和18S-2引物二聚体；将带有BsmBI(粘性末端)的18S-1引物二聚体和18S-2引物二聚体分别与步骤⑥带有BsmBI(粘性末端)的线性化sn468载体进行T4连接，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，得到sn468-18S-1人工载体和sn468-18S-2人工载体；
所述18S靶序列1的序列为：5’-GAGGCCATGATTAAGAGGGA-3’；
所述18S-1的上游引物序列为：5’-ACCGGAGGCCATGATTAAGAGGGA-3’；
所述18S-1的下游引物序列为：5’-AAACTCCCTCTTAATCATGGCCTC-3’；
所述18S靶序列2的序列为：5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’；
所述18S-2的上游引物序列为：5’-ACCGGCGGCGCAATACGAATGCCCC-3；
所述18S-2的下游引物序列为：5’-AAACGGGGCATTCGTATTGCGCCGC-3’；
(2)将步骤(1)的sn468-18S-1人工载体和sn468-18S-2人工载体与报告载体ERG进行连接，构建成ERG-#18S-1报告载体和ERG-#18S-2报告载体，并将步骤(1)的sn468-18S-1人工载体和sn468载体分别与人工报告载体进行混合、培养48h后进行荧光表达验证；
所述构建ERG-#18S-1和ERG-#18S-2报告载体的方法为：
合成与18S靶序列1和18S靶序列2相对应的ERG报告载体的2对引物，分别命名为#18S-1和#18S-2；分别将#18S-1和#18S-2两对引物的上下游序列在95℃的温度条件下处理15min，然后经过自然降温、过夜退火，分别得到带有EcoR Ⅰ(粘性末端)和BamH Ⅰ(粘性末端)的#18S-1引物二聚体和#18S-2引物二聚体；用EcoR Ⅰ酶和BamH Ⅰ酶对ERG报告载体进行线性化，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得带有EcoR Ⅰ(粘性末端)和BamH Ⅰ(粘性末端)的线性化ERG载体；用T4连接酶将带有EcoR Ⅰ(粘性末端)和BamH Ⅰ(粘性末端)的#18S-1引物二聚体和#18S-2引物二聚体分别与带有EcoR Ⅰ(粘性末端)和BamH Ⅰ(粘性末端)的线性化ERG载体进行连接，将连接产物导入感受态细胞进行转化，挑取单菌落培养，提取重组质粒，并通过测序验证，获得所述ERG-#18S-1和ERG-#18S-2报告载体；
所述#18S-1的上游引物序列为：5’-AATTCGAGGCCATGATTAAGAGGGACGGG-3’；
所述#18S-1的下游引物序列为：5’-GATCCCCGTCCCTCTTAATCATGGCCTCG-3’；
所述#18S-2的上游引物序列为：5’-AATTCGCGGCGCAATACGAATGCCCCCGG-3’；
所述#18S-2的下游引物序列为：5’-GATCCCGGGGGCATTCGTATTGCGCCGCG-3’；
(3)筛选经过步骤(2)荧光表达验证后有编辑能力的sn468-18S-1和sn468-18S-2人工载体进行进行腺病毒包装，腺病毒包装方法为：将有编辑能力的sn468-18S-1和sn468-18S-2人工载体分别放入不含FBS的DMEM培养基中进行培养，然后与pBHGloxdeltaE13cre腺病毒骨架进行混合，并加入罗氏转染试剂混匀、静置，然后将混合物放入含有传代293细胞的培养基中进行培养，所述293细胞的汇合度为50-70％，培养到293细胞出现空斑后，收集感染之后的293细胞得到sn468-18S-1人工载体腺病毒和sn468-18S-2人工载体腺病毒；
(4)感染水牛乳腺上皮细胞：将步骤(3)sn468-18S-1人工载体腺病毒和sn468-18S-2人工载体腺病毒分别放入含有FBS的DMEM培养基中进行培养，然后放入含有水牛乳腺上皮细胞的培养基中进行培养，所述水牛乳腺上皮细胞的汇合度为70％，培养3d后，收集感染之后的水牛乳腺上皮细胞，提取水牛乳腺上皮细胞的基因组，对水牛18S基因敲除效果进行检测，完成应用腺病毒系统靶向编辑水牛18S rDNA基因的方法。
2.根据权利要求1所述的一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18S rDNA基因的方法，其特征在于，所述步骤(1)中对pUC57-U6质粒、pDC316质粒、pDC316-U6载体和sncas9载体进行酶切的酶切反应条件为37℃，孵育3h，
所述对pUC57-U6质粒进行酶切的反应体系为：3μg的pUC57-U6质粒、5μL的10×FastDigest酶切缓冲液、3μL的Sal Ⅰ酶、3μL的Nhe Ⅰ酶；
所述对pDC316质粒进行酶切的反应体系为：3μg的pDC316质粒、5μL的10×FastDigest酶切缓冲液、3μL的Sal Ⅰ酶、3μL的Xba Ⅰ酶；
所述对pDC316-U6载体和sncas9载体进行酶切的反应体系为：3μg的pDC316-U6载体或3μg的sncas9载体、5μL的10×FastDigest酶切缓冲液、3μL的Xba Ⅰ酶、3μL的Bamh Ⅰ酶。
3.根据权利要求1所述的一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18S rDNA基因的方法,其特征在于，所述步骤③U6-Bsmb Ⅰ-gRNA目的基因片段和线性化的pDC316质粒T4连接的连接体系为：1μL的T4连接酶、1μL的10×T4ligase Buffer、30ng的线性化pDC316质粒，30ng的U6-Bsmb Ⅰ-gRNA目的基因片段，加水至10μL。
4.根据权利要求1所述的一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18S rDNA基因的方法，其特征在于，所述步骤⑥线性化的pDC316-U6载体和cas9目的基因片段T4连接的连接体系为：1μL的T4连接酶、1μL的10×T4ligase Buffer、30ng的线性化pDC316载体片段，60ng的cas9目的基因片段，加水至10μL。
5.根据权利要求1所述的一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18S rDNA基因的方法，其特征在于，所述带有BsmBI(粘性末端)的18S-1引物二聚体和18S-2引物二聚体分别与带有BsmBI(粘性末端)的线性化sn468载体T4连接的连接体系为：1μL的T4连接酶、1μL的10×T4ligase Buffer、1μL的线性化sn468载体，5μL的18S-1引物二聚体或18S-2引物二聚体，加水至10μL。
6.根据权利要求1所述的一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18S rDNA基因的方法，其特征在于，所述步骤(4)水牛18S基因敲除效果的检测方法为：以被sn468-18S-1人工载体腺病毒和sn468-18S-2人工载体腺病毒感染之后的水牛乳腺上皮细胞基因组为模板，以buf18S为检测引物进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收PCR扩增产物，将PCR扩增产物与检测载体连接，转入感受态细胞进行培养，培养后通过挑取单克隆细菌，对单克隆细菌基因序列进行测序，对18S基因突变进行检测；
所述buf18S检测引物的上游序列为：5’-CCCGAAGCGTTTACTTTG-3’；
buf18S检测引物的下游序列为：5’-GGTTTCCCGTGTTGAGTC-3’；
所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min后再进行95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延30s共35个循环，之后进行72℃再延伸7min，然后在4℃条件下终止反应。
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