CN105602972A - 基于CRICPR-Cas9体外改造腺病毒载体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于CRICPR-Cas9体外改造腺病毒载体的方法。本发明还提供了适于改造大质粒载体的分子克隆方法，包括如下：根据出发质粒的待改造位点设计合适的sgRNA，采用Cas9蛋白和sgRNA体外切割所述出发质粒，再基于同源重组的方法将被切割的出发质粒与目的基因相连接，从而完成改造。本发明所提供的方法有效的解决了大质粒载体用常规的分子生物学手段很难找到合适的限制性酶切位点对其进行改造的问题。该方法是点突变试剂盒的改进，点突变试剂盒一般就包括对目的蛋白进行点突变、构建结构域缺失的截短体等，本发明有效解决了点突变试剂盒对超过10kb的大载体进行突变时容易引起二次突变(由于PCR酶保真性引起的随机突变)的技术难点。

Description

基于CRICPR-Cas9体外改造腺病毒载体的方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种基于CRICPR-Cas9体外改造腺病毒载体的方法，特别涉及一种基于CRICPR-Cas9体外改造5型腺病毒纤毛基因的方法。
背景技术
5型腺病毒(Adenovirustype5，Ad5)是目前应用于各种重大疾病临床前治疗和临床治疗研究的主要运载工具。腺病毒的纤毛由尾巴、杆、头节3部分组成，在感染细胞过程中发挥重要的作用，腺病毒感染细胞的过程开始于纤毛的头节结合细胞表面的特异性受体，不同血清型的腺病毒所识别的细胞表面受体存在较大差异(NicklinSA,WuE,NemerowGR,etal.Theinfluenceofadenovirusfiberstructureandfunctiononvectordevelopmentforgenetherapy[J].MolTher.2005,12(3):384-393.)。通过将5型腺病毒中编码纤毛头节和杆区的基因与其他血清型腺病毒纤毛头节和杆区编码基因进行替换重组，形成嵌合型腺病毒载体，能够显著提高病毒感染特定类型细胞的效率。比如35型腺病毒结合细胞的天然受体是CD46，该分子在T淋巴细胞中有较高水平表达。Ad5F35嵌合型腺病毒能在保留Ad5的所有特性基础上显著提高感染T淋巴细胞的效率(SchroersR,HildebrandtY,HasenkampJ,etal.GenetransferintohumanTlymphocytesandnaturalkillercellsbyAd5/F35chimericadenoviralvectors[J].ExpHematol.2004,32(6):536-546.)。Ad5F11嵌合型腺病毒则能显著提高感染细胞因子诱导杀伤细胞(cytokine-inducedkillercells，CIK)的效率(StecherH,ShayakhmetovDM,StamatoyannopoulosG,etal.Acapsid-modifiedadenovirusvectordevoidofallviralgenes:assessmentoftransductionandtoxicityinhumanhematopoieticcells[J].MolTher.2001,4(1):36-44.)。然而腺病毒载体其基因组全长36Kb，用常规的分子生物学手段很难找到合适的限制性酶切位点对其进行改造。
规律成簇间隔短回文重复系统(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat；CRISPR-associated，CRISPR-Cas9)是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成DNA双链断裂(Double-strandbreaks，DSB)。这一技术由于能快速、简便、高效地靶向基因组任何基因，已被广泛用于细胞水平、动物水平研究。理论上Cas9蛋白在sgRNA(singleguideRNA)的引导下可以切割任何存在NGG(以及NAG)间隔相邻基序(protospaceradjacentmotif，PAM)的上游DNA。
目前，尚未有基于CRICPR-Cas9基因编辑技术体外改造5型腺病毒载体制备Ad5F35嵌合型腺病毒的方法。
发明内容
为了解决大质粒载体用常规的分子生物学手段很难找到合适的限制性酶切位点对其进行改造的问题，以及点突变试剂盒对超过10kb的大载体进行突变时容易引起二次突变(由于PCR酶保真性引起的随机突变)的技术难点，本发明提供一种适用于大质粒载体改造的分子克隆方法。
本发明所提供的分子克隆方法，具体可为如下三种中的任一种：
第一种：将出发质粒的靶标基因替换为目的基因得到重组环形质粒的方法，具体可包括如下步骤：
(a)以所述出发质粒上所述靶标基因的起始区域中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序列中的“NX”所示序列为靶序列1；以所述出发质粒上所述靶标基因的终止区域中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序列中的“NX”所示序列为靶序列2；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数(如X为18或20)，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；
针对所述靶序列1设计合成双链DNA1，所述双链DNA1中的一条链与所述靶序列1反向互补；针对所述靶序列2设计合成双链DNA2，所述双链DNA2中的一条链与所述靶序列2反向互补；
(b)将所述双链DNA1和所述双链DNA2分别构建至能够转录向导RNA的载体中，经体外转录获得特异于所述靶序列1的向导RNA1和特异于所述靶序列2的向导RNA2；
(c)采用Cas9蛋白、所述向导RNA1和所述向导RNA2切割所述出发质粒，获得切除了所述靶标基因的所述出发质粒的骨架片段；
(d)根据所述目的基因的上下游末端部分的序列，以及所述出发质粒的骨架片段的上下游末端部分的序列，设计并合成自5’端到3’端依次为上游同源臂、所述目的基因、下游同源臂的DNA片段；所述上游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的3’端序列相同；所述下游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的5’端序列相同；
(e)将步骤(d)获得的两端分别带有所述上游同源臂和所述下游同源臂的DNA片段与所述出发质粒的骨架片段进行同源重组，完成所述目的基因与所述出发质粒的骨架片段的连接，即获得将所述出发质粒的所述靶标基因替换为所述目的基因的重组环形质粒。
第二种：在出发质粒的靶标片段中插入目的基因得到重组环形质粒的方法，具体可包括如下步骤：
(a)以所述出发质粒上所述靶标片段中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序列中的“NX”所示序列为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数(如X为18或20)，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；
针对所述靶序列设计合成双链DNA，所述双链DNA中的一条链与所述靶序列反向互补；
(b)将所述双链DNA构建至能够转录向导RNA的载体中，经体外转录获得特异于所述靶序列的向导RNA；
(c)采用Cas9蛋白和所述向导RNA切割所述出发质粒，获得在所述靶标片段中被切开的线性出发质粒；
(d)根据所述目的基因的上下游末端部分的序列，以及所述线性出发质粒的上下游末端部分的序列，设计并合成自5’端到3’端依次为上游同源臂、所述目的基因、下游同源臂的DNA片段；所述上游同源臂的序列与所述线性出发质粒的3’端序列相同；所述下游同源臂的序列与所述线性出发质粒的5’端序列相同；
(e)将步骤(d)获得的两端分别带有所述上游同源臂和所述下游同源臂的DNA片段与所述线性出发质粒进行同源重组，完成所述目的基因与所述线性出发质粒的连接，即获得在所述出发质粒的所述靶标片段中插入所述目的基因的重组环形质粒。
第三种：将出发质粒的靶标基因缺失得到重组环形质粒的方法，具体可包括如下步骤：
(a)以所述出发质粒上所述靶标基因的起始区域中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序列中的“NX”所示序列为靶序列1；以所述出发质粒上所述靶标基因的终止区域中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序列中的“NX”所示序列为靶序列2；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数(如X为18或20)，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；
针对所述靶序列1设计合成双链DNA1，所述双链DNA1中的一条链与所述靶序列1反向互补；针对所述靶序列2设计合成双链DNA2，所述双链DNA2中的一条链与所述靶序列2反向互补；
(b)将所述双链DNA1和所述双链DNA2分别构建至能够转录向导RNA的载体中，经体外转录获得特异于所述靶序列1的向导RNA1和特异于所述靶序列2的向导RNA2；
(c)采用Cas9蛋白、所述向导RNA1和所述向导RNA2切割所述出发质粒，获得切除了所述靶标基因的所述出发质粒的骨架片段；
(d)根据所述出发质粒的骨架片段的上下游末端部分的序列，设计并合成自5’端到3’端依次为上游同源臂和下游同源臂的DNA片段；所述上游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的3’端序列相同；所述下游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的5’端序列相同；
(e)将步骤(d)获得的两端分别带有所述上游同源臂和所述下游同源臂的DNA片段与所述出发质粒的骨架片段进行同源重组，即获得将所述出发质粒的所述靶标基因缺失的重组环形质粒。
其中，所述向导RNA(或所述向导RNA1或所述向导RNA2)为由crRNA和tracrRNA通过部分碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA；所述crRNA含有能够与所述靶序列(或所述靶序列1或所述靶序列2)互补结合的RNA片段。
在上述方法的步骤(a)中，所述靶标基因的起始区域为：自所述靶标基因的5’末端核苷酸起，向上游方向延至80bp处(记为A点)，向下游方向延至80bp处(记为B点)；在所述出发质粒上自所述所述A点起至所述B点止，且包含所述靶标基因的片段即为所述靶标基因的起始区域；
所述靶标基因的终止区域为：自所述靶标基因的3’末端核苷酸起，向下游方向延至80bp处(记为C点)，向上游方向延至80bp处(记为D点)；在所述出发质粒上自所述C点起至所述D点止，且包含所述靶标基因的片段即为所述靶标基因的终止区域；
所述靶标基因的起始区域位于所述靶标基因的终止区域的上游。
在所述方法中，所述出发质粒具体可为全长10-50kb的环形质粒(如30-40kb，具体如34.8kb)。所述上游同源臂和所述下游同源臂的长度具体可为15-80bp(如20-40bp)。步骤(e)中，进行所述同源重组的方法具体可为Gibson连接法。
在所述方法中，设计所述上游同源臂和所述下游同源臂时需考虑对所述出发质粒进行改造时是否会产生移码突变的问题。在所述方法中，由于所述靶序列的选择所产生的改造位点的偏差可以通过后面设计同源臂的步骤进行弥补。
所述方法在改造腺病毒载体中的应用也属于本发明的保护范围。
在所述应用中，所述腺病毒载体可为5型腺病毒载体pAD/PL-DEST；所述靶标基因为5型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因；所述目的基因为35型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因。
更加具体的，所述5型腺病毒载体pAD/PL-DEST具体为Invitrogen公司生产的pAd/PL-DESTGatewayVectorKit中的产品，货号为V494-20。所述5型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因的核苷酸序列为GenBank：M18369.1(Update：1993-4-27)所示序列的第608-2218位；所述35型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因为GenBank：U10272.1(Update：1995-5-12)所示序列的第130-969位。
本发明具体提供了一种基于上述方法构建Ad5F35嵌合型腺病毒载体的方法。
本发明所提供的构建Ad5F35嵌合型腺病毒载体的方法，具体可包括如下步骤：
(1)采用Cas9蛋白、向导RNA1和向导RNA2切割5型腺病毒载体pAD/PL-DEST，回收所述5型腺病毒载体pAD/PL-DEST的骨架大片段；所述向导RNA1为序列表中序列7所示的单链RNA；所述向导RNA2为序列表中序列8所示的单链RNA；
其中，所述5型腺病毒载体pAD/PL-DEST具体为Invitrogen公司生产的pAd/PL-DESTGatewayVectorKit中的产品，货号为V494-20。
所述向导RNA1和所述向导RNA2分别依次特异于所述5型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因的起始区域和终止区域。所述向导RNA1针对的靶序列1为GenBank：M18369.1(Update：1993-4-27)所示序列的第626-607位；所述向导RNA2针对的靶序列2为GenBank：M18369.1(Update：1993-4-27)所示序列的第2234-2215位(因为是CCNPAM所以靶序列的位置是从高位到低位进行标注的)。
进行所述切割时，所述Cas9蛋白、所述向导RNA1、所述向导RNA2和所述5型腺病毒载体pAD/PL-DEST的配比为6μg：6μg：6μg：3μg。所述切割的条件具体可为37℃酶切12-16h(过夜)。切割体系为：NEBbuffer3.1缓冲液，50μl体系，其中所述Cas9蛋白、所述向导RNA1、所述向导RNA2和所述5型腺病毒载体pAD/PL-DEST的质量依次为6μg、6μg、6μg、3μg。
(2)以35型腺病毒纤毛基因(GenBank：U10272.1，Update：1995-5-12)为模板，采用由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，获得PCR产物；
其中，所述PCR产物自5’端到3’端依次为上游同源臂、所述35型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因和下游同源臂；所述上游同源臂与所述pAD-DEST5型腺病毒载体的骨架大片段的3’端序列相同，所述下游同源臂与所述pAD-DEST5型腺病毒载体的骨架大片段的5’端序列相同。所述上游同源臂的核苷酸序列具体为序列表中序列5的第1-21位；所述下游同源臂的核苷酸序列具体为序列表中序列6的第1-20位的反向互补序列。
(3)利用Gibson连接法将步骤(1)获得的所述pAD-DEST5型腺病毒载体的骨架大片段和步骤(2)获得的所述PCR产物进行同源重组拼接，所得产物即为Ad5F35嵌合型腺病毒载体。
在本发明中，进行所述Gibson连接具体是采用NEB公司生产的GibsonMasterMix进行的。
在所述方法的步骤(1)中，所述向导RNA1和所述向导RNA2是按照包括如下步骤的方法制备获得的：
(a1)合成名称为正向单链DNA1和名称为反向单链DNA1的两个单链DNA；所述正向单链DNA1的序列如序列表中序列1所示；所述反向单链DNA1的序列如序列表中序列2所示；合成名称为正向单链DNA2和名称为反向单链DNA2的两个单链DNA；所述正向单链DNA2的序列如序列表中序列3所示；所述反向单链DNA2的序列如序列表中序列4所示；
(a2)将所述正向单链DNA1和所述反向单链DNA1进行退火反应，得到双链DNA1；将所述正向单链DNA2和所述反向单链DNA2进行退火反应，得到双链DNA2；
(a3)将所述双链DNA1和所述双链DNA2分别构建至能够转录向导RNA的载体中，经体外转录获得所述向导RNA1和所述向导RNA2。
进一步，步骤(a3)中，所述“将所述双链DNA1和所述双链DNA2分别构建至能够转录向导RNA的载体中”为：将所述双链DNA1与线性化的pUC57-sgRNAexpressionvector连接获得pUC57-T7-pADsgRNA1质粒；将所述双链DNA2与所述线性化的pUC57-sgRNAexpressionvector连接获得pUC57-T7-pADsgRNA2质粒；所述线性化的pUC57-sgRNAexpressionvector为采用BsaI对pUC57-sgRNAexpressionvector进行酶切后的产物。
具体的，步骤(a3)中，将所述pUC57-T7-pADsgRNA1质粒和所述pUC57-T7-pADsgRNA2质粒分别经体外转录获得所述向导RNA1和所述向导RNA2，为：将所述pUC57-T7-pADsgRNA1质粒和所述pUC57-T7-pADsgRNA2质粒分别采用DraI限制性内切酶进行线性化，然后利用MEGAshortscriptTMT7TranscriptionKit(货号：AM1354)进行体外转录，从而获得所述向导RNA1和所述向导RNA2。
其中，所述pUC57-sgRNAexpressionvector为Addgene载体，编号为51132。
本发明是点突变试剂盒的改进，点突变试剂盒一般就包括对目的蛋白进行点突变、构建结构域缺失的截短体等，本发明所提供的适于改造大质粒载体的分子克隆方法，有效解决了点突变试剂盒对超过10kb的大载体进行突变时容易引起二次突变(由于PCR酶保真性引起的随机突变)的技术难点，同时也有效的解决了大质粒载体用常规的分子生物学手段很难找到合适的限制性酶切位点对其进行改造的问题。该方法非常简单、可靠高效，通过该方法可以有效实现不需考虑载体的酶切位点就可以得到大质粒载体克隆基因的目的，而且依此方法可以非常容易地完成大质粒载体中片段的替换、插入、缺失等。
附图说明
图1为Cas9体外实现定点切割断裂位点示意图。其中，阴影部分的碱基为切割断裂位点位置。
图2为pAD/PL-DEST载体上Ad5纤毛基因替换策略示意图。
图3为SpeI限制性内切酶鉴定pAD/PL-DEST载体纤毛基因改造结果图，随机挑取6个克隆摇菌扩增提取质粒后用SpeI鉴定纤毛基因是否改造成功。
图4为DNA测序证明纤毛基因改造成功，其中28856为反向测序。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
5型腺病毒载体pAD/PL-DEST：全长34.864kb，具体为Invitrogen公司生产的pAd/PL-DESTGatewayVectorKit中的产品，货号为V494-20。
pUC57-sgRNAexpressionvector：Addgene载体，编号为51132。
大肠杆菌DB3.1：北京博迈德公司产品，货号为CC2702。
大肠杆菌MatchT1，北京博迈德公司产品，货号为cc1003。
Cas9蛋白：PNABio(ThousandOaks,CA)公司产品，其产品目录号为CP01。也可用北京唯尚立德的Cas9核酸内切酶替代，货号#E025S。
实施例1、构建Ad5F35嵌合型腺病毒载体
本实施例以构建Ad5F35嵌合型腺病毒载体为例，具体说明为解决大质粒载体用常规的分子生物学手段很难找到合适的限制性酶切位点对其进行改造的问题，本发明所提供的对大质粒载体的具体改造方法。本实施例提供了相应的技术方案，基于CRICPR-Cas9技术(Cas9体外实现定点切割断裂位点示意图如图1所示)以将5型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因替换为35型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因，从而获得Ad5F35嵌合型腺病毒载体。pAD/PL-DEST载体上Ad5纤毛基因替换策略示意图如图2所示。
一、设计并合成针对5型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因的两个向导RNA(sgRNA)
1、DNAoligo引物的设计及双链寡核苷酸的获得
本实施例采用5型腺病毒载体pAD/PL-DEST，根据所述5型腺病毒载体pAD/PL-DEST上作为待替换基因的5型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因(核苷酸序列为GenBank：M18369.1所示序列的第608-2218位)的核苷酸序列，选择5型腺病毒纤毛尾部和杆区交界处以及纤毛基因终止密码子附近的符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序列中的“NX”所示序列为靶序列(N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸)，设计两对DNAoligo引物，具体序列如下：
sgRNA1Foligo：5’-taggCGCAAAGAGAGTACCCCA-3’(序列1)；
sgRNA1Roligo：5’-aaactggggtactctctttgcg-3’(序列2)。
sgRNA2Foligo：5’-taggCACAAACGATTCTTTATTCT-3’(序列3)；
sgRNA2Roligo：5’-aaacagaataaagaatcgtttgtg-3’(序列4)。
将合成的针对靶序列1的两条DNAoligo单链(序列1和序列2)退火，得到双链双链寡核苷酸1。其中，序列1和序列2中下划线部分为双链双链寡核苷酸1的粘性末端。靶序列1为GenBank：M18369.1(Update：1993-4-27)所示序列的第626-607位。将合成的针对靶序列2的两条DNAoligo单链(序列3和序列4)退火，得到双链双链寡核苷酸2。其中，序列3和序列4中下划线部分为双链双链寡核苷酸2的粘性末端。靶序列2为GenBank：M18369.1(Update：1993-4-27)所示序列的第2234-2215位。因为是CCNPAM所以靶序列的位置是从高位到低位进行标注的。
退火反应体系及退火反应条件均如下：
退火反应体系：1.5μlFoligo(10μM)；1.5μlRoligo(10μM)；2μlNEBbuffer2；15μl灭菌水。
退火反应条件：在PCR仪中按照touchdown程序运行：95℃，5min；95-85℃at-2℃/s；85-25℃at-0.2℃/s；holdat4℃。
2、向导RNA(sgRNA)的体外转录质粒的构建
取pUC57-sgRNAexpressionvector，采用BsaI进行线性化，所得pUC57-sgRNAexpressionvector的骨架大片段形成粘性末端，恰好与步骤1所得的两个双链双链寡核苷酸的粘性末端相符合，故可以直接用于连接实验。
将所述双链双链寡核苷酸1与所述pUC57-sgRNAexpressionvector的骨架大片段相连，所得质粒测序验证正确后命名为pUC57-T7-pADsgRNA1质粒。将所述双链双链寡核苷酸2与所述pUC57-sgRNAexpressionvector的骨架大片段相连，所得质粒测序验证正确后命名为pUC57-T7-pADsgRNA2质粒。
进一步，转化大肠杆菌MatchT1，并涂Kan+平板(100μg/ml)。用T7通用引物测序的方法鉴定阳性克隆。37℃摇床过夜并用OMEGAplasmidMiniKit(货号：D6943-01)抽提质粒，备用。
3、向导RNA(sgRNA)的体外转录
将步骤2获得的pUC57-T7-pADsgRNA1质粒和pUC57-T7-pADsgRNA2质粒分别采用DraI进行线性化，然后将线性化的产物用OMEGAGelExtractionKit(货号：D2500-01)回收纯化，再利用Ambion公司的MEGAshortscriptTMT7TranscriptionKit(货号：AM1354)进行体外转录，体外转录所得的sgRNA并用MEGAclearTMTranscriptionClean-UpKit(AM1908)纯化。以上各操作均参照试剂盒说明书进行，仅在sgRNA纯化最后一步改用无核酸酶水洗脱。
由pUC57-T7-pADsgRNA1质粒经体外转录所得的sgRNA记为sgRNA1，其具体为核苷酸序列如序列表中序列7所示的单链RNA；由pUC57-T7-pADsgRNA2质粒经体外转录所得的sgRNA记为sgRNA2，其具体为核苷酸序列如序列表中序列8所示的单链RNA。
二、Cas9-sgRNA体外切割pAD-DEST5型腺病毒载体
利用Cas9蛋白、步骤一获得的sgRNA1和sgRNA2切割5型腺病毒载体pAD/PL-DEST，并利用OMEGAUltra-SepGelExtractionkit(货号：D2501-01)纯化回收5型腺病毒载体pAD/PL-DEST的骨架大片段(约33kb)。
进行所述切割时，切割体系为：NEBbuffer3.1缓冲液，50μl体系，其中所述Cas9蛋白、sgRNA1、sgRNA2和pAD-DEST5型腺病毒载体的质量依次为6μg、6μg、6μg、3μg。切割的条件为：37℃切割过夜(12-16h)。
三、带有同源臂的35型腺病毒纤毛基因的获得
以35型腺病毒纤毛基因(GenBank：U10272.1所示序列的第130-969位)为模板，采用引物对F35-F和F35-R进行PCR扩增，获得PCR产物。
F35-F：5’-GGGTTTCAAGAGAGTCCCCCTGGAGTTCTTACTTTAAAATG-3’(序列5，下划线部分为上游同源臂，其后为35型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因序列)；
F35-R：5’-ATAACACAAACGATTCTTTAGTTGTCGTCTTCTGTAATGT-3’(序列6，下划线部分为下游同源臂，其后为35型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因序列)。
经测序证实，所得PCR产物自5’端到3’端依次为上游同源臂(序列5的第1-21位、所述35型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因(核苷酸序列为GenBank：U10272.1所示序列的第130-969位)和下游同源臂(序列6的第1-20位的反向互补序列)。
四、Gibson体外同源重组拼接
由于步骤三获得的PCR产物中的上游同源臂与步骤二获得的5型腺病毒载体pAD/PL-DEST的骨架大片段的3’端序列相同，下游同源臂与5型腺病毒载体pAD/PL-DEST的骨架大片段的5’端序列相同(为了保证不移码，载体3’末端为GGGTTTCAAGAGAGTCCCCCTGG，同源臂去掉了末端两个碱基，5’端也是类似的设计)，故而采用NEB公司生产的GibsonMasterMix试剂盒对其进行Gibson连接。具体操作按照试剂盒说明书进行。
将连接产物转化大肠杆菌DB3.1感受态细胞，涂Amp+平板(100μg/ml)。随机挑取6个克隆，采用SpeI酶切鉴定纤毛基因替换成功的阳性克隆(在原5型腺病毒载体pAD/PL-DEST上仅在25804位有一个SpeI位点，在改造后的载体上则有25084位和28669位两个位点，SpeI切割载体得到2865和31228两个目标片段，则证明改造成功)。6个克隆的SpeI酶切结果如图3所示，由图可见6个克隆的SpeI酶切鉴定结果均为阳性。
进一步，设计替换区域上下游两个测序引物，上游测序引物为accttcaaccccgtgtatcc位于原5型腺病毒载体pAD/PL-DEST的27912-27931位，下游反向测序引物为taagctatgtggtggtgggg位于原5型腺病毒载体pAD/PL-DEST的29720-29730位，采用测序的方法验证阳性克隆。阳性克隆的测序验证结果如图4所示。37℃摇床过夜并用OMEGAplasmidMiniKit(货号：D6943-01)抽提质粒。
最终所得重组质粒命名为pAD-Ad5F35-DEST，pAD-Ad5F35-DEST经测序后确定其载体结构描述如下：将pAD-DEST5型腺病毒载体中的5型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因(核苷酸序列为GenBank：M18369.1所示序列的第608-2218位)替换为35型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因(核苷酸序列为GenBank：U10272.1所示序列的第130-969位)后形成的重组质粒，即为Ad5F35嵌合型腺病毒载体。
上述实施例仅是以构建Ad5F35嵌合腺病毒载体为例阐明本发明所提供的改造大质粒载体的方法，本发明的保护范围包括但不限于以上构建Ad5F35嵌合腺病毒载体的方法。

Claims (10)

1.分子克隆方法，为将出发质粒的靶标基因替换为目的基因得到重组环形质粒，其特征在于：所述方法为包括如下步骤：
(a)以所述出发质粒上所述靶标基因的起始区域中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序列中的“NX”所示序列为靶序列1；以所述出发质粒上所述靶标基因的终止区域中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序列中的“NX”所示序列为靶序列2；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；
针对所述靶序列1设计合成双链DNA1，所述双链DNA1中的一条链与所述靶序列1反向互补；针对所述靶序列2设计合成双链DNA2，所述双链DNA2中的一条链与所述靶序列2反向互补；
(b)将所述双链DNA1和所述双链DNA2分别构建至能够转录向导RNA的载体中，经体外转录获得特异于所述靶序列1的向导RNA1和特异于所述靶序列2的向导RNA2；
(c)采用Cas9蛋白、所述向导RNA1和所述向导RNA2切割所述出发质粒，获得切除了所述靶标基因的所述出发质粒的骨架片段；
(d)根据所述目的基因的上下游末端部分的序列，以及所述出发质粒的骨架片段的上下游末端部分的序列，设计并合成自5’端到3’端依次为上游同源臂、所述目的基因、下游同源臂的DNA片段；所述上游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的3’端序列相同；所述下游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的5’端序列相同；
(e)将步骤(d)获得的两端分别带有所述上游同源臂和所述下游同源臂的DNA片段与所述出发质粒的骨架片段进行同源重组，完成所述目的基因与所述出发质粒的骨架片段的连接，即获得将所述出发质粒的所述靶标基因替换为所述目的基因的重组环形质粒。
2.分子克隆方法，为在出发质粒的靶标片段中插入目的基因得到重组环形质粒，其特征在于：所述方法为包括如下步骤：
(a)以所述出发质粒上所述靶标片段中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序列中的“NX”所示序列为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；
针对所述靶序列设计合成双链DNA，所述双链DNA中的一条链与所述靶序列反向互补；
(b)将所述双链DNA构建至能够转录向导RNA的载体中，经体外转录获得特异于所述靶序列的向导RNA；
(c)采用Cas9蛋白和所述向导RNA切割所述出发质粒，获得在所述靶标片段中被切开的线性出发质粒；
(d)根据所述目的基因的上下游末端部分的序列，以及所述线性出发质粒的上下游末端部分的序列，设计并合成自5’端到3’端依次为上游同源臂、所述目的基因、下游同源臂的DNA片段；所述上游同源臂的序列与所述线性出发质粒的3’端序列相同；所述下游同源臂的序列与所述线性出发质粒的5’端序列相同；
(e)将步骤(d)获得的两端分别带有所述上游同源臂和所述下游同源臂的DNA片段与所述线性出发质粒进行同源重组，完成所述目的基因与所述线性出发质粒的连接，即获得在所述出发质粒的所述靶标片段中插入所述目的基因的重组环形质粒。
3.分子克隆方法，为将出发质粒的靶标基因缺失得到重组环形质粒，其特征在于：所述方法为包括如下步骤：
(a)以所述出发质粒上所述靶标基因的起始区域中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序列中的“NX”所示序列为靶序列1；以所述出发质粒上所述靶标基因的终止区域中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序列中的“NX”所示序列为靶序列2；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；
针对所述靶序列1设计合成双链DNA1，所述双链DNA1中的一条链与所述靶序列1反向互补；针对所述靶序列2设计合成双链DNA2，所述双链DNA2中的一条链与所述靶序列2反向互补；
(b)将所述双链DNA1和所述双链DNA2分别构建至能够转录向导RNA的载体中，经体外转录获得特异于所述靶序列1的向导RNA1和特异于所述靶序列2的向导RNA2；
(c)采用Cas9蛋白、所述向导RNA1和所述向导RNA2切割所述出发质粒，获得切除了所述靶标基因的所述出发质粒的骨架片段；
(d)根据所述出发质粒的骨架片段的上下游末端部分的序列，设计并合成自5’端到3’端依次为上游同源臂和下游同源臂的DNA片段；所述上游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的3’端序列相同；所述下游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的5’端序列相同；
(e)将步骤(d)获得的两端分别带有所述上游同源臂和所述下游同源臂的DNA片段与所述出发质粒的骨架片段进行同源重组，即获得将所述出发质粒的所述靶标基因缺失的重组环形质粒。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，所述靶标基因的起始区域为：自所述靶标基因的5’末端核苷酸起，向上游方向延至80bp处，记为A点；向下游方向延至80bp处，记为B点；在所述出发质粒上自所述所述A点起至所述B点止，且包含所述靶标基因的片段即为所述靶标基因的起始区域；
所述靶标基因的终止区域为：自所述靶标基因的3’末端核苷酸起，向下游方向延至80bp处，记为C点；向上游方向延至80bp处，记为D点；在所述出发质粒上自所述C点起至所述D点止，且包含所述靶标基因的片段即为所述靶标基因的终止区域。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述出发质粒为全长10-50kb的环形质粒；或
所述上游同源臂和所述下游同源臂的长度为15-80bp；或
步骤(e)中，进行所述同源重组的方法为Gibson连接法。
6.权利要求1-5中任一所述的方法在改造腺病毒载体中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述腺病毒载体为pAD-DEST5型腺病毒载体；
所述靶标基因为5型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因；
所述目的基因为35型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因。
8.一种构建Ad5F35嵌合型腺病毒载体的方法，包括如下步骤：
(1)采用Cas9蛋白、向导RNA1和向导RNA2切割pAD-DEST5型腺病毒载体，回收所述pAD-DEST5型腺病毒载体的骨架大片段；所述向导RNA1为序列表中序列7所示的单链RNA；所述向导RNA2为序列表中序列8所示的单链RNA；
(2)以35型腺病毒纤毛基因为模板，采用由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，获得PCR产物；
(3)利用Gibson连接法将步骤(1)获得的所述pAD-DEST5型腺病毒载体的骨架大片段和步骤(2)获得的所述PCR产物进行同源重组拼接，所得产物即为Ad5F35嵌合型腺病毒载体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述向导RNA1和所述向导RNA2是按照包括如下步骤的方法制备获得的：
(a1)合成名称为正向单链DNA1和名称为反向单链DNA1的两个单链DNA；所述正向单链DNA1的序列如序列表中序列1所示；所述反向单链DNA1的序列如序列表中序列2所示；合成名称为正向单链DNA2和名称为反向单链DNA2的两个单链DNA；所述正向单链DNA2的序列如序列表中序列3所示；所述反向单链DNA2的序列如序列表中序列4所示；
(a2)将所述正向单链DNA1和所述反向单链DNA1进行退火反应，得到双链DNA1；将所述正向单链DNA2和所述反向单链DNA2进行退火反应，得到双链DNA2；
(a3)将所述双链DNA1和所述双链DNA2分别构建至能够转录向导RNA的载体中，经体外转录获得所述向导RNA1和所述向导RNA2。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤(a3)中，所述“将所述双链DNA1和所述双链DNA2分别构建至能够转录向导RNA的载体中”为：将所述双链DNA1与线性化的pUC57-sgRNAexpressionvector连接获得pUC57-T7-pADsgRNA1质粒；将所述双链DNA2与所述线性化的pUC57-sgRNAexpressionvector连接获得pUC57-T7-pADsgRNA2质粒；所述线性化的pUC57-sgRNAexpressionvector为采用BsaI对pUC57-sgRNAexpressionvector进行酶切后的产物。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106591369A (zh) * 2016-12-16 2017-04-26 广西壮族自治区水牛研究所(中国农业科学院水牛研究所) 一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18S rDNA基因的方法
CN108795963A (zh) * 2018-06-27 2018-11-13 青岛农业大学 对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法
CN111206044A (zh) * 2020-03-03 2020-05-29 南京启真基因工程有限公司 一种新的质粒载体构建方法
CN117025675A (zh) * 2023-08-10 2023-11-10 华中农业大学 一种提高Admax重组腺病毒包装系统的外源基因表达量的方法及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DMITRY M. SHAYAKHMETOV ET AL: "Efficient Gene Transfer into Human CD34+ Cells by a Retargeted Adenovirus Vector", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 *
JIA-WANG WANG ET AL: "CRISPR/Cas9 nuclease cleavage combined with Gibson assembly for seamless cloning", 《BIOTECHNIQUES》 *
TADAHIRO SUENAGA ET AL: "Engineering large viral DNA genomes using the CRISPR-Cas9 system", 《MICROBIOL IMMUNOL》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106591369A (zh) * 2016-12-16 2017-04-26 广西壮族自治区水牛研究所(中国农业科学院水牛研究所) 一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18S rDNA基因的方法
CN108795963A (zh) * 2018-06-27 2018-11-13 青岛农业大学 对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法
CN111206044A (zh) * 2020-03-03 2020-05-29 南京启真基因工程有限公司 一种新的质粒载体构建方法
CN117025675A (zh) * 2023-08-10 2023-11-10 华中农业大学 一种提高Admax重组腺病毒包装系统的外源基因表达量的方法及应用
CN117025675B (zh) * 2023-08-10 2024-02-09 华中农业大学 一种提高Admax重组腺病毒包装系统的外源基因表达量的方法及应用

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