CN108795963A - 对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法 - Google Patents

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孙娇
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Abstract

本发明公开了对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法，首先进行克隆大肠杆菌gloA基因；再构建克隆载体gloA/pSMART‑LcKan；最后构建gloA/pSMART‑LcKan质粒。本发明为了验证ZmGlyI基因的功能，排除大肠杆菌中乙二醛酶同工酶基因gloA对试验干扰，运用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变，使之最终在验证ZmGlyI基因的功能过程中能够被敲除。

Description

对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法。
背景技术
非生物胁迫是导致农作物减产的重要原因之一，非生物胁迫可以影响植物的各种生化、生化反应，例如矿物-营养平衡、渗透压的变化、激素转导平衡、光合作用等，甚至会抑制植物的生长及发育。玉米是全世界最重要的经济作物之一，同时也是饲料、生物能源的一个重要来源，为了验证ZmGlyI基因的功能，排除大肠杆菌中乙二醛酶同工酶对试验干扰，运用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，通过构建pTargetF-gloA和gloAΔ/pSMART-LCKan载体，对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变，为了提高敲除效率，在Gibson克隆技术的基础上，通过多轮PCR反应，将两个gRNA连到gloA基因两侧导入同一个入门载体中，再将入门载体与含Cas9表达框的目标载体共电击转化，最终获得gloA缺失的大肠杆菌表达菌株。
发明内容
本发明的目的在于提供对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法，本发明为了验证ZmGlyI基因的功能，排除大肠杆菌中乙二醛酶同工酶基因gloA对试验干扰，运用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变，使之最终在验证ZmGlyI基因的功能过程中能够被敲除。
本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：
步骤1：克隆大肠杆菌gloA基因；
步骤2：构建克隆载体gloA/pSMART-LcKan；
步骤3：构建gloA/pSMART-LcKan质粒。
进一步，步骤1中所用引物
gloA△up F：ATCAAGCTTGAATTCGTTCAGGTATCGTCAATGATTTC
gloA△up R：GCAGGAGACTTTTTATCCTCAAAATGGC
gloA△down F：GGATAAAAAGTCTCCTGCCGGGCGTGAACT
gloA△down R：ATATCTAGAGAATTCGTCCAGCACAGCAGTGCGTTCGG。
进一步，步骤2中线性化pSMART-LcKan质粒方法如下，
pSmart-LcKan的ORI是pUC起源高拷贝，其中的rop基因是表达蛋白基因，采用Snapgene软件分析pSMART-LCKan载体序列，设计引物pSMART F/R进行载体线性化，引物信息如下：
pSMARTF：GACGAATTCTCTAGATATCGCTCAATAC
pSMARTR：AACGAATTCAAGCTTGATATCATTCAGG。
进一步，步骤3构建gloA/pSMART-LcKan质粒方法如下，
Gibson连接，需要在DNA片段的末端加上同源片段，然后将这些DNA片段和一种master mix混合孵育，这种master mix含有三种不同类型的酶：一种外切酶，从5’端开始对DNA进行消化，产生长的黏性末端，这样便于与另外的同源末端进行配对结合。一种聚合酶，用于修补gap一种DNA连接酶，实现无痕拼接，形成完整的DNA分子，Gibson连接E.coliBL21gDNAgloA△上下游序列与线性化的pSMART-LcKan PCR产物，从而构建gloA△/pSMART-LcKan。
附图说明
图1是pSMART-LCKan载体结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
1材料与方法
1.1克隆大肠杆菌BL21(DE3)gloA△基因
1.1.1引物设计
引物设计软件使用NCBI blast，导入全长E.coli BL21(DE3)序列。进行blast分析引物特性后，选出符合要求的引物，并委托擎科生物技术有限公司合成。
所用引物序列如下所示：
gloA△up F：ATCAAGCTTGAATTCGTTCAGGTATCGTCAATGATTTC
gloA△up R：GCAGGAGACTTTTTATCCTCAAAATGGC
gloA△down F：GGATAAAAAGTCTCCTGCCGGGCGTGAACT
gloA△down R：ATATCTAGAGAATTCGTCCAGCACAGCAGTGCGTTCGG
引物的各个参数均符合要求。
1.1.2BL21(DE3)gloA基因上、下游序列PCR反应体系如表1至表3所示。
表1 gloA△up反应体系
表2 gloA△down反应体系
表3 gloA△up/down PCR反应条件(Gadient)
PCR反应程序先进行10个循环合成小片段，后20个循环将前10个循环合成的小片段再进行拼接，最终形成目的片段。用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。电泳条件为150V，20min。
1.1.3PCR产物回收
扩增产物按照TIANquick Midi Purification kit普通DNA产物纯化试剂盒的使用说明进行回收(离心柱型)操作步骤如下：
①柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500ul的平衡液BL，12，000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。(请使用当天处理过得柱子)
②估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀。
③将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管。
④向吸附柱CB2中加入600ul漂洗液PW(使用前请按说明书加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
⑤重复操作步骤4。
⑥将吸附柱CB2放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的试验。
⑦将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50ul洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm(～13,400×g)离心2min收集DNA溶液。
回收产物检测：Nanodrop 2000测浓度及纯度并记录数据。
1.2构建克隆载体gloA△/pSMART-LcKan
1.2.1线性化pSMART-LcKan质粒
pSmart-LcKan的ORI是pUC起源高拷贝，其中的rop基因是表达蛋白基因，该基因降低了pSMART-LCKan质粒拷贝数，故pSMART-LCKan质粒比pUC小，拷贝数低，适合做基因克隆载体。Snapgene软件分析pSMART-LCKan载体序列，设计引物pSMARTF/R进行载体线性化并委托擎科生物科技有限公司合成引物。引物信息如下：
pSMARTF：GACGAATTCTCTAGATATCGCTCAATAC
pSMARTR：AACGAATTCAAGCTTGATATCATTCAGG
载体结构示意图见图1，表4为pSMART-LcKan质粒线性化反应体系；
表4
表5为pSMART-LcKan质粒线性化PCR程序。
表5
PCR产物凝胶电泳验证后，用普通DNA产物纯化试剂盒回收。
1.2.2构建gloA△/pSMART-LcKan质粒
Gibson连接，需要在DNA片段的末端加上同源片段(通过PCR法加上)然后，将这些DNA片段和一种master mix(含有三种酶)混合最多孵育一个小时。这种master mix含有三种不同类型的酶：一种外切酶，从5’端开始对DNA进行消化，产生长的黏性末端，这样便于与另外的同源末端进行配对结合。一种聚合酶，用于修补gap一种DNA连接酶，实现无痕拼接，形成完整的DNA分子。Gibson连接E.coli BL21(DE3)gDNA gloA△上下游序列与线性化的pSMART-LcKan PCR产物，从而构建gloA△/pSMART-LcKan。表6为gloA△/pSMART-LcKanGibson反应体系
表6
将设置好的反应体系轻轻吹打混匀，置于PCR仪，Gibson连接法多片段、大片段载体连接50℃连接1h，一般载体连接50℃，15min即可，完成对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变。
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (4)

1.对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法，其特征在于按照以下步骤进行：
步骤1：克隆大肠杆菌gloA基因；
步骤2：构建克隆载体gloA/pSMART-LcKan；
步骤3：构建gloA/pSMART-LcKan质粒。
2.按照权利要求1所述对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法，其特征在于：所述步骤1中所用引物
gloA△up F：ATCAAGCTTGAATTCGTTCAGGTATCGTCAATGATTTC
gloA△up R：GCAGGAGACTTTTTATCCTCAAAATGGC
gloA△down F：GGATAAAAAGTCTCCTGCCGGGCGTGAACT
gloA△down R：ATATCTAGAGAATTCGTCCAGCACAGCAGTGCGTTCGG。
3.按照权利要求1所述对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法，其特征在于：所述步骤2中线性化pSMART-LcKan质粒方法如下，
pSmart-LcKan的ORI是pUC起源高拷贝，其中的rop基因是表达蛋白基因，采用Snapgene软件分析pSMART-LCKan载体序列，设计引物pSMART F/R进行载体线性化，引物信息如下：
pSMART F：GACGAATTCTCTAGATATCGCTCAATAC
pSMART R：AACGAATTCAAGCTTGATATCATTCAGG。
4.按照权利要求1所述对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法，其特征在于：所述步骤3构建gloA/pSMART-LcKan质粒方法如下，
Gibson连接，需要在DNA片段的末端加上同源片段，然后将这些DNA片段和一种mastermix混合孵育，这种master mix含有三种不同类型的酶：一种外切酶，从5’端开始对DNA进行消化，产生长的黏性末端，这样便于与另外的同源末端进行配对结合。一种聚合酶，用于修补gap一种DNA连接酶，实现无痕拼接，形成完整的DNA分子，Gibson连接E.coli BL21 gDNAgloA△上下游序列与线性化的pSMART-LcKan PCR产物，从而构建gloA△/pSMART-LcKan。
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