CN102149809A - 转基因光合微生物和光生物反应器 - Google Patents

Abstract

本文提供工程改造以累积碳水化合物，例如二糖的转基因细菌。还提供培养光合微生物的光生物反应器，其包括适合于为光合微生物提供营养物和水分的非凝胶的固体培养支持物和覆盖所述培养支持物表面的至少一部分的物理屏障。还公开了整合有光生物反应器的大规模和连续培养光合微生物的装置以及使用方法。还公开了利用本发明的光生物反应器从光合微生物产生可发酵糖的方法。

Description

转基因光合微生物和光生物反应器

相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时申请序列号61/085,797(2008年8月1日提交)和美国临时申请序列号61/018,798(2008年1月3日提交)的优先权，二者各自通过引用全文纳入本文。

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发明领域

本发明总体上涉及转基因微生物和它们培养的方法及装置。

背景

为满足全球增加的能源需求，要寻求化石燃料应用的有效而环境上合理的替代方案。可从植物生物量生产替代燃料，例如乙醇或生物柴油。例如，当前方法中用于生产乙醇的关键成分称为可发酵糖。最常见的可发酵糖是蔗糖、葡萄糖或高果糖玉米糖浆的形式。目前培养以产生这种生物量的植物包括玉米、甘蔗、大豆、油菜、麻风树(jatropha)，等等。然而，用于产生可发酵糖的许多植物生物量需要大量能量密集型预处理。此外，利用这种植物生物量会导致土壤耗竭、侵蚀和食物供应的转变。

已知一些蓝细菌通过蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸酶的作用产生蔗糖，其作为渗透保护剂(osmoprotectant)而得到广泛研究。对于盐耐受性，蓝细菌可分成三组。耐受性低(低于700mM)的菌株合成蔗糖(例如，细长聚球蓝细菌(Synechococcus elongatus)PCC 7942)或称为海藻糖的另一种二糖[Blumwald等，Proc Natl Acd Sci USA(1983)80：2599-2602和Reed等，FEMS MicrobiolRev(1986)39：51-56]。具有中等耐卤性(halotolerance)(0.7-1.8mM)的菌株，例如集胞蓝细菌(Synechocystis sp.)PCC 6803产生葡糖基甘油。甘氨酸甜菜碱(glycine betaine)或谷氨酸甜菜碱(glutamate betaine)的累积导致高盐耐受性(高达2.5M)。然而，Miao等人[FEMS Microbiol Lett(2003)218：71-77]测定到，当agp基因缺失阻断葡糖基甘油的生物合成时，集胞蓝细菌PCC6803产生蔗糖作为其渗透保护剂。干旱耐受性蓝细菌在对基质水分应激(matric water stress)的反应中也产生蔗糖和海藻糖[Hershkovitz等，ApplEnviron Microbiol(1991)57：645-648]。

对集胞蓝细菌PCC 6803(ATCC 27184)和细长聚球蓝细菌PCC 7942(ATCC 33912)研究较多，有遗传学工具可用并且已知它们的基因组序列(参见，例如Koksharova，O.A.和Wol k，C.P.2002.Appl Microbiol Biotechnol58，123-137；Ikeuchil，M.和Satoshi Tabata，S.2001.PhotosynthesisResearch 70，73-83；Golden，S.S.，Brusslan，J.和Haselkorn，R.1987.Methods in Enzymology 153，215-231；Friedberg，D.1988.Methods inEnzymology 167，736-747；Kaneko，T.等.1996.DNA Research 3，109-136)。

许多应用需要商品化培养光合微生物，所述光合微生物例如是：极大螺旋藻(Spirulina maximum)、钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、布朗葡萄藻(Botrycoccus braunii)、小球藻(Chlorellavulgaris)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、羊角月芽藻(Serenastrumcapricomutum)、四尾栅藻(Scenedesmus auadricauda)、紫球藻(Porphyridium cruentum)、急尖柵藻(Scenedesmus acutus)、杜氏藻(Dunaliella sp.)、斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、项圈藻(Anabaenopsis)、管链藻属(Aulosira)、柱孢藻属(Cylindrospermum)、Scenecoccus sp.、Scenecosystis sp.和底栖蓝藻(Tolypothrix)，所述应用包括精细化学品、药物、化妆颜料、脂肪酸、抗氧化剂、具有预防作用的蛋白质、生长因子、抗生素、维生素和多糖的生产。低剂量的藻类生物量(algic biomass)也可用于替代或降低动物饲料中的抗生素水平或用作蛋白质来源。此外，可通过热处理使得以湿润形式(与干燥形式相对)提供的藻类生物量发酵或液化以提供燃料。因此，增加这种有机体的培养效率的能力极其令人感兴趣。

一般而言，目前的光合生物反应器依赖于在液相系统中培养微生物以产生生物量。这些系统通常是露天池型反应器(open-air pond-type reactor)或封闭的罐型反应器(tank-type reactor)。然而，通常认为封闭的生物反应器在许多方面比池型反应器有改进。重要的是，封闭系统提供了抵御环境污染的屏障。此外，这些系统能更好地控制液体介质的温度和气体含量。

封闭的光生物反应器的应用仍受限于光合微生物对光的需求(即，光化射线提供光合微生物将二氧化碳固定成有机分子所需的能量)。因此，光化微生物的充足照射是必须满足的要求。然而，随着液相光生物反应器中细胞密度的增加，光线透射入介质的能力降低，从而通常限制了可能达到的细胞密度。此外，为防止有机体的不良沉降，通常需要对液体介质作某些类型的搅拌，该过程需要能量输入。

现已作了多种尝试来设计将光线带到液相系统中有机体的方法。例如，一些系统包括使液体培养基经透明管道循环。其它尝试包括将光源置于介质内或者将反射颗粒引入培养基以调节该培养物的射线吸收度(radiationabsorbance)。尽管作出了这些尝试，但在细胞密度较高时，液相系统中培养有机体的能力尚未达到显著增加。

除了上述对光的需求，液相光生物反应器的应用还需要为光合微生物提供足够的二氧化碳以供光合作用。这些系统通常整合了某些类型的额外通气系统以增加溶解于介质的二氧化碳浓度。如果无需通气将极大简化该系统，从而降低操作成本。

液相光生物反应器还往往不能良好适用于常规的连续生产方法。大体积液体的转移通常是复杂而繁重的。此外，由于液相系统通常需要循环、搅拌、通气等机械装置，只操作一个或少数几个大型培养装置而非多个较小的装置通常更简单而且成本效率更高。因此，目前实施的方法涉及处理较大的批次(即，培养一批光合微生物，然后收获得到的所有生物量)。

因此，本领域极其需要推进光合生物反应器的设计。提供的新型光合生物反应器能有效培养并收获较高密度的光合微生物而无需大量水或其它液体介质，无需上述非常措施来供应充足光线和二氧化碳，并且成本合理，这代表了本领域的实质性进步，并有助于工业和消费者，等等。

发明概述

本文提供经工程改造以积累碳水化合物，例如二糖的转基因细菌。还提供了培养光合微生物的光生物反应器，其包括适于为光合微生物提供营养物和水分的非胶状的固体培养支持物和覆盖该培养支持物表面的至少一部分的物理屏障。公开了整合有光生物反应器的大规模和连续培养光合微生物的装置以及使用方法。还公开了利用本发明的光生物反应器从光合微生物产生可发酵糖的方法。

一方面提供了培养光合微生物的光生物反应器。该光生物反应器包括非胶状的固体培养支持物，该支持物适于为在其表面的至少一部分上的光合微生物提供营养物和水分，其中当该表面的所述部分非水平定位时，该表面的所述部分的形状允许光合微生物粘附其上；以及覆盖该培养支持物表面的至少所述部分的物理屏障，其中该物理屏障设置成允许接种该培养支持物表面的所述部分，形成并维持适于培养这种光合微生物和收获这种培养的光合微生物的环境。

在一些实施方式中，该光生物反应器包含在该培养支持物表面的所述部分上的光合微生物。在一些实施方式中，该光生物反应器还包含经工程改造以累积二糖的细胞，如下文进一步描述，其中该细胞粘附于该固然培养支持物。在一些实施方式中，该培养支持物表面的所述部分能以每升当量至少约50克干生物量的密度培养光合微生物。

在一些实施方式中，该培养支持物是柔性的。在一些实施方式中，该培养支持物包含一种或多种刚性材料。在一些实施方式中，该光生物反应器的培养支持物包含至少两层，第一层毗连第二层，其中所述至少两层的材料是相同或不同的材料。在一些实施方式中，所述第一层包含高表面积生长材料，所述第二层包含可渗透的材料。在一些实施方式中，该光生物反应器的培养支持物包含柔性连接的刚性部分，其中所述刚性部分由一种或多种刚性材料构成。在一些实施方式中，该光生物反应器包含单个培养支持物。在一些实施方式中，该光生物反应器包含多个培养支持物。

在一些实施方式中，该培养支持物包含织物。在一些实施方式中，所述织物由天然的、改性天然的、合成的纤维或它们的组合构成。在一些实施方式中，所述织物是纺织织物、编织织物、毡、交联纤维聚合物构成的筛网或它们的组合。在一些实施方式中，所述天然纤维选自：棉花、羊毛、大麻纤维、树纤维、其它纤维素纤维和它们的组合。在一些实施方式中，所述改性天然纤维选自：硝酸纤维素、醋酸纤维素、磺酸纤维素、交联的淀粉和它们的组合。在一些实施方式中，所述合成纤维选自：聚酯、聚丙烯酸酯、聚胺、聚酰胺、聚砜和它们的组合。

在一些实施方式中，该培养支持物包被有水分吸附聚合物。在一些实施方式中，所述织物、织物的纤维或二者包被有水分吸附聚合物。在一些实施方式中，水分吸附聚合物选自：琼脂、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚胺、聚乙二醇、改性淀粉和它们的组合。

在一些实施方式中，光生物反应器的物理屏障对于固体颗粒和液体至少是实质性不可渗透的，但不阻止气体或蒸气向和从培养支持物表面所述部分附近的空间的运输，也不阻止培养支持物表面的所述部分的光化射线。在一些实施方式中，物理屏障对于水蒸气的不渗透性足够，从而润湿的培养支持物会保留足够的水分，因此光合微生物在培养期间能维持充分的水合。在一些实施方式中，所述屏障设置成封闭培养支持物和其上的任何光合微生物，并设置成能在至少光合微生物的培养的部分期间可松脱地密封。在一些实施方式中，物理屏障是柔性的。在一些实施方式中，物理屏障还包含对于固体颗粒、液体、气体和蒸气至少基本上不可渗透的第一部分，和对于气体和蒸气可渗透，但对于固体颗粒和液体至少基本上不可渗透的第二部分。在一些实施方式中，屏障的第二部分的气体或蒸气交换率是至少约5葛尔莱秒(Gurley second)到不超过约10,000葛尔莱秒。在一些实施方式中，屏障的第二部分包含选择性膜，该选择性膜含有烯烃纤维或聚乙烯纤维材料、聚四氟乙烯过滤介质、纤维素过滤材料、纤维玻璃过滤材料、聚酯过滤材料、聚丙烯酸酯过滤材料、聚砜膜或尼龙膜。在一些实施方式中，第一部分对于光化射线至少是基本上透明的，且第二部分对于光化射线不是至少基本上透明的，以及第一和第二部分相对于彼此和培养支持物表面的至少所述部分的设置应具有充足量的光化射线和气体交换以支持光合微生物的光合作用。

在一些实施方式中，光生物反应器还包括置于培养支持物和物理屏障之间的光化射线源。在一些实施方式中，物理屏障在培养支持物和光化射线源之间，其对于这种光化射线足够透明并具有足够的气体透过性从而允许光合微生物在培养期间进行光合作用。

在一些实施方式中，光生物反应器还包括在培养支持物上、其内或同时在其上和其内的水、营养物或它们的组合。在一些实施方式中，光生物反应器还包括一个或多个连接点以便连接所述光生物反应器与某构件。在一些实施方式中，固体培养支持物还包括一个或多个连接点以便连接该培养支持物。在一些实施方式中，光生物反应器还包括液体供应系统、营养物供应系统、气体供应系统和微生物供应系统中的至少一种。

另一方面提供培养光合微生物的装置。此类装置包括至少一个上述光生物反应器和与所述至少一个光生物反应器相连的构件，该构件将所述至少一个光生物反应器的至少一个培养支持物非水平地定位。在一些实施方式中，所述至少一个光生物反应器悬挂在该构件上。在一些实施方式中，物理屏障基本上覆盖该构件。在一些实施方式中，该构件包括传送系统或其组件，从而所述至少一个培养支持物能沿着该传送系统的路径传送。在一些实施方式中，该装置还包括以下的一个、两个或三个：接种站，从而在各培养支持物沿着传送系统的路径传送时可用光合微生物接种；培养站，从而在各培养支持物沿着传送系统的路径传送时培养各接种的培养支持物上的光合微生物；和将培养支持物传送到的收获站，从而可自各培养支持物收获培养的光合微生物的至少一部分。在一些实施方式中，接种站和收获站基本上彼此毗连或者基本上是共存的(coextensive)。在一些实施方式中，该装置还包括诱导站以诱导各培养支持物上的光合微生物合成可发酵糖。在一些实施方式中，该装置还包括液体供应系统、营养物供应系统、气体供应系统或微生物供应系统中的至少一种。在一些实施方式中，该装置还包括粘附于固体培养支持物上的光合微生物。在一些实施方式中，该装置还包括经工程改造以累积二糖的细胞，如下所述，其中该细胞粘附于所述固体培养支持物。

另一方面提供经工程改造以累积二糖的转基因光合微生物细胞。所述转基因光合微生物细胞包含以5’到3’的转录方向操作性相连的组分：在光合微生物细胞中起作用的启动子；包含编码具有二糖生物合成活性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽选自二糖磷酸合酶或二糖磷酸磷酸酶(disaccharidephosphate phosphatase)；和转录终止序列；其中与不含DNA构建物的光合微生物细胞相比，该转基因光合微生物细胞累积的二糖水平增高。

在一些实施方式中，该转基因光合微生物细胞包含含有第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的多核苷酸，所述第一核苷酸序列编码具有二糖磷酸合酶活性的多肽，而所述第二核苷酸序列编码具有二糖磷酸磷酸酶活性的多肽。在一些实施方式中，其包含含有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码具有二糖磷酸合酶活性和二糖磷酸磷酸酶活性的多肽。在一些实施方式中，其包含编码具有二糖磷酸合酶活性的多肽的第一核苷酸序列；编码具有二糖磷酸磷酸酶活性的多肽的第二核苷酸序列；和编码具有二糖磷酸合酶活性和二糖磷酸磷酸酶活性的多肽的第三核苷酸序列。

在一些实施方式中，该转基因光合微生物细胞的多核苷酸选自：(a)包含编码选自下列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：具有蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸酶(ASF)活性的SEQ ID NO：2或与其95％相同的序列；具有蔗糖磷酸合酶(SPS)活性的SEQ ID NO：4或与其95％相同的序列；具有蔗糖磷酸磷酸酶(SPP)活性的SEQ ID NO：6与其95％相同的序列；具有海藻糖磷酸合酶(TPS)活性的SEQ ID NO：77或与其有95％相同的序列；具有海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)活性的SEQ ID NO：79或与其有95％相同的序列；具有葡糖基甘油磷酸合酶(GPS)活性的SEQ ID NO：81或与其有95％相同的序列；具有葡糖基甘油磷酸磷酸酶(GPP)活性的SEQ ID NO：83或与其有95％相同的序列；具有甘露糖基果糖磷酸合酶(MPS)活性的SEQ ID NO：85或与其有95％相同的序列；和具有甘露糖基果糖磷酸磷酸酶(MPP)活性的SEQ ID NO：87或与其有95％相同的序列；(b)分离多核苷酸，其包含：编码蔗糖磷酸合酶/蔗糖磷酸磷酸酶(ASF)活性的SEQ ID NO：1或与其有95％相同的序列；编码蔗糖磷酸合酶(SPS)活性的SEQ ID NO：3或与其有95％相同的序列；编码蔗糖磷酸磷酸酶(SPP)活性的SEQ ID NO：5或与其有95％相同的序列；编码海藻糖磷酸合酶(TPS)活性的SEQ ID NO：76或与其有95％相同的序列；编码海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)活性的SEQ ID NO：78或与其有95％相同的序列；编码葡糖基甘油磷酸合酶(GPS)活性的SEQID NO：80或与其有95％相同的序列；编码葡糖基甘油磷酸磷酸酶(GPP)活性的SEQ ID NO：82或与其有95％相同的序列；编码甘露糖基果糖磷酸合酶(MPS)活性的SEQ ID NO：84或与其有95％相同的序列；和编码甘露糖基果糖磷酸磷酸酶(MPP)活性的SEQ ID NO：86或与其有95％相同的序列；(c)在严格条件下与选自如下的核酸序列杂交的分离多核苷酸：SEQ IDNO：1，其中该分离多核苷酸编码具有ASF活性的多肽；SEQ ID NO：3，其中该分离多核苷酸编码具有SPS活性的多肽；SEQ ID NO：5，其中该分离多核苷酸编码具有SPP活性的多肽；SEQ ID NO：76，其中该分离多核苷酸编码具有TPS活性的多肽；SEQ ID NO：78，其中该分离多核苷酸编码具有TPP活性的多肽；SEQ ID NO：80，其中该分离多核苷酸编码具有GPS活性的多肽；SEQ ID NO：82，其中该分离多核苷酸编码具有GPP活性的多肽；SEQ ID NO：84，其中该分离多核苷酸编码具有MPS活性的多肽；SEQID NO：86，其中该分离多核苷酸编码具有MPP活性的多肽；其中所述严格条件包括在65℃下，在包含6X SSC(0.9M氯化钠和0.09M柠檬酸钠)的溶液中温育；和(d)分离多核苷酸，其与(a)、(b)或(c)所示多核苷酸序列互补。

在一些实施方式中，所累积二糖的单体对于细胞是内源性的。在一些实施方式中，所累积二糖的一种或多种单体对于细胞是外源性的，且这些单体的表达经工程改造进入细胞。

在一些实施方式中，所述细胞是蓝细菌细胞、光合细菌或绿藻。在一些实施方式中，所述细胞是蓝细菌细胞。在一些实施方式中，所述细胞是选自聚球蓝细菌或集胞蓝细菌的蓝细菌。

在一些实施方式中，所述启动子是诱导型启动子。在一些实施方式中，所述启动子可由选自温度、pH、代谢物、光、渗透剂、重金属或抗生素等因素诱导。在一些实施方式中，所述启动子选自carB、nirA、psbAII、dnaK、kaiA和λ_PR。

在一些实施方式中，所述细胞的DNA构建物包含选自下列的核苷酸序列：SEQ ID NO：19(编码asf的pLybAL11)；SEQ ID NO：20(编码asf的pLybAL12)；SEQ ID NO：44(编码asf的pLybAL15)；SEQ ID NO：45(编码asf的pLybAL16)；SEQ ID NO：46(编码asf的pLybAL17)；SEQ ID NO：47(编码asf的pLybAL18)；SEQ ID NO：48(编码asf的pLybAL 19)；SEQID NO：49(编码asf的pLybAL21)；SEQ ID NO：50(编码asf的pLybAL22)；SEQ ID NO：51(编码asf的pLybAL13f)；SEQ ID NO：52(编码asf的pLyAL13r)；SEQ ID NO：53(编码asf的pLybAL14f)；SEQ ID NO：54(编码asf的pLybAL14r)；SEQ ID NO：65(编码asf的pLybAL7f)；SEQ ID NO：69(编码asf的pLybAL8f)；SEQ ID NO：118(编码tps和tpp的pLybAL23)；SEQ ID NO：121(编码tps和tpp的pLybAL28)；SEQ ID NO：122(编码tps和tpp的pLybAL29)；SEQ ID NO：123(编码tps和tpp的pLybAL30)；SEQID NO：124(编码tps和tpp的pLybAL31)；SEQ ID NO：125(编码tps和tpp的pLybAL36)；SEQ ID NO：126(编码tps和tpp的pLybAL37)；SEQ IDNO：130(编码tps和tpp的pLybAL24)；和SEQ ID NO：133(编码tps和tpp的pLybAL33)。

在一些实施方式中，细胞累积至少约0.1微克二糖/分钟/克干生物量。在一些实施方式中，细胞累积至少约0.1微克二糖/分钟/克干生物量到多达约10微克二糖/分钟/克干生物量。

在一些实施方式中，所述细胞不包含选自下列的核苷酸序列：SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：74，或与它们有至少95％相同，还且具有转化酶活性或蔗糖酶铁氧还蛋白(sucraseferridoxin)活性的核苷酸变体。在一些实施方式中，所述细胞不表达选自如下的多肽序列：SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：75，或与它们有至少95％相同，且具有转化酶活性或蔗糖酶铁氧还蛋白活性的多肽变体。在一些实施方式中，所述细胞表达小干扰RNA，所述小干扰RNA对选自下列的核苷酸序列有特异性：SEQID NO：70、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：74，或与它们有至少95％相同，且具有转化酶活性或蔗糖酶铁氧还蛋白活性的核苷酸变体。

在一些实施方式中，所述细胞还包含分离多核苷酸，该多核苷酸包含编码活性通道蛋白多肽的SEQ ID NO：94或与其有95％相同的序列；编码多肽的分离多核苷酸，该多肽包含SEQ ID NO：95或与其有95％相同的序列并具有通道蛋白活性；或包含SEQ ID NO：91(编码通道蛋白的pLybAL32)的分离多核苷酸；其中累积的二糖是蔗糖，该细胞表达通道蛋白，且表达的通道蛋白将累积的蔗糖从细胞中分泌。

另一方面提供人工DNA构建物。在一些实施方式中，人工DNA构建物包含至少一条选自如下的序列：SEQ ID NO：19(编码asf的pLybAL11)；SEQID NO：20(编码asf的pLybAL12)；SEQ ID NO：44(编码asf的pLybAL15)；SEQ ID NO：45(编码asf的pLybAL16)；SEQ ID NO：46(编码asf的pLybAL17)；SEQ ID NO：47(编码asf的pLybAL18)；SEQ ID NO：48(编码asf的pLybAL19)；SEQ ID NO：49(编码asf的pLybAL21)；SEQ ID NO：50(编码asf的pLybAL22)；SEQ ID NO：51(编码asf的pLybAL 13f)；SEQID NO：52(编码asf的pLyAL13r)；SEQ ID NO：53(编码asf的pLybAL14f)；SEQ ID NO：54(编码asf的pLybAL14r)；SEQ ID NO：65(编码asf的pLybAL7f)；SEQ ID NO：69(编码asf的pLybAL8f)；SEQ ID NO：118(编码tps和tpp的pLybAL23)；SEQ ID NO：121(编码tps和tpp的pLybAL28)；SEQ ID NO：122(编码tps和tpp的pLybAL29)；SEQ ID NO：123(编码tps和tpp的pLybAL30)；SEQ ID NO：124(编码tps和tpp的pLybAL31)；SEQ ID NO：125(编码tps和tpp的pLybAL36)；SEQ ID NO：126(编码tps和tpp的pLybAL37)；SEQ ID NO：130(编码tps和tpp的pLybAL24)；SEQ ID NO：133(编码tps和tpp的pLybAL33)；SEQ ID NO：91(编码通道蛋白的pLybAL32)；SEQ ID NO：102(编码SS-UPP的pLybAL3f)；SEQ ID NO：103(编码SE-UPP的pLybAL5f)；SEQ ID NO：106(编码SE-UPP的pLybAL4f)；SEQ ID NO：107(编码SE-UPP的pLybAL9f)；SEQ ID NO：109(编码SE-UPP的pLybAL6fb)；SEQ ID NO：110(编码SE-UPP的pLybAL10fb)；和SEQ ID NO：91(编码通道蛋白的pLybAL32)。

另一方面提供培养光合微生物的方法。培养光合微生物的方法可利用上述的任何光生物反应器或装置。该方法包括用光合微生物接种培养支持物；在接种的培养支持物上培养该光合微生物；和从该培养支持物上收获至少一部分培养的光合微生物。在一些实施方式中，该方法还包括接种培养支持物后密封光生物反应器的物理屏障，从而在培养光合微生物的全部或实质性部分的同时维持物理屏障密封。在一些实施方式中，该物理屏障可松脱地密封。在一些实施方式中，该方法还包括将各培养支持物输送至接种站、培养站和收获站。在一些实施方式中，该方法还包括以下的至少一种：为培养支持物提供液体；为培养支持物供应营养物；或为培养支持物供气。在一些实施方式中，光合微生物培养至每升当量至少约50克干生物量的密度。在一些实施方式中，光合微生物包含经工程改造以累积二糖的转基因光合微生物，如上所述。

另一方面提供产生可发酵糖的方法。产生可发酵糖的方法可利用上述任何光生物反应器或装置。产生可发酵糖的方法包括用能累积可发酵糖的光合微生物接种培养支持物；在接种的培养支持物上培养光合微生物；分离累积的可发酵糖。在一些实施方式中，可发酵糖累积在光合微生物内。在一些实施方式中，分离累积的可发酵糖包括：从培养支持物上收获至少一部分培养的光合微生物；和从收获物回收可发酵糖。在一些实施方式中，累积的可发酵糖从光合微生物分泌，并从培养基中分离。在一些实施方式中，分离累积的可发酵糖包括从培养基分离累积的可发酵糖。在一些实施方式中，该方法还包括在接种培养支持物后可松脱地密封光生物反应器的物理屏障，从而在培养光合微生物的全部或实质性部分的同时维持物理屏障密封。在一些实施方式中，该方法还包括以下的至少一种：为培养支持物供应液体；为培养支持物供应营养物；或为培养支持物供气。在一些实施方式中，该方法还包括将各培养支持物输送至接种站、培养站和收获站中的至少一种。

在一些实施方式中，该方法还包括通过光合微生物诱导可发酵糖合成。在一些实施方式中，诱导可发酵糖合成包括使光合微生物接触选自以下的诱导因素：温度、pH、代谢物、光、渗透剂、重金属和抗生素。在一些实施方式中，诱导可发酵糖合成包括用盐化合物处理光合微生物。在一些实施方式中，盐化合物是氯化钠。在一些实施方式中，盐化合物的添加浓度是约0.01mM-1.5M或约0.2-0.9M。在一些实施方式中，通过气溶胶喷雾将诱导因素施加于生长表面。在一些实施方式中，将光合微生物培养至每升当量至少约50克干生物量的密度。在一些实施方式中，可发酵糖包括选自下列的至少一种糖：葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油和甘露糖基果糖。在一些实施方式中，可发酵糖包括选自蔗糖或海藻糖的至少一种糖。

在一些实施方式中，所述光合微生物包括天然光合微生物。在一些实施方式中，所述光合微生物包括遗传修饰的光合微生物。在一些实施方式中，所述光合微生物包括蓝细菌。在一些实施方式中，所述光合微生物包括选自聚球蓝细菌或集胞蓝细菌的蓝细菌。在一些实施方式中，所述光合微生物包括经工程改造以累积二糖的转基因光合微生物，如上所述。

从下文可部分明白并部分指出了其它目的和特征。

附图简述

本领域技术人员应知道下述附图只是出于说明目的。附图不是要以任何方式限制本发明教导的范围。

图1显示本发明光生物反应器的正视图，包括固体培养支持物、透明的保护性外屏障层、选择面板、可再密封的闭合器和用于悬挂该装置的支持部件。

图2显示本发明光生物反应器的侧视图，包括固体培养支持物、透明的保护性外屏障层、选择面板、可再密封的闭合器和用于悬挂该装置的支持部件。

图3显示多个本发明光生物反应器或培养支持物的一种配置，这些光生物反应器或培养支持物沿着多个闭环输送系统从共同的接种和收获中心向外辐射状扩散，从而构成光生物反应器场(photobioreactor farm)。

图4是描绘蓝细菌中光合产生蔗糖的草图。

图5是集胞蓝细菌PCC 6803(Ssp6803)蔗糖磷酸合酶(SPS)和蔗糖磷酸磷酸酶(SPP)蛋白与细长聚球蓝细菌PCC 7942(Selo7942)活性SPS/SPP融合物(ASF)的多肽序列比对。Ssp6803含有编码SPS和SPP活性的不同基因。集胞蓝细菌PCC 6803的SPS蛋白具有推定的无活性SPP结构域，因为许多活性残基不是保守的。经典的HAD水解酶活性位点残基示于以上比对，其中保守性氨基酸如下划线所示和非保守性残基则标上双下划线。斜体字显示了集胞蓝细菌PCC 6803 SPS的无活性SPP结构域内的八氨基酸插入。关于方法的其它细节见实施例4。

图6是pLybAL11的示意图。pLybAL11能构建蓝细菌DNA文库并选择启动子序列。无启动子的asf基因在双向终止子后，由多克隆位点(MCS)隔开。oriV能在大多数革兰氏阴性生物中进行质粒复制。oriT能在pRK2013辅助质粒的帮助下将大肠杆菌的质粒接合转移至选择的蓝细菌(或其它有机体)。存在β-内酰胺酶基因(bla)以供在大肠杆菌中选择。可将蓝细菌基因组DNA克隆入MCS而在大肠杆菌中构建DNA文库。然后可通过接合或直接转化将该质粒文库转移至蓝细菌。随后可通过氯霉素乙酰转移酶基因(cat)表达选择氯霉素抗性来分离活性启动子。可通过检验氯霉素乙酰转移酶活性和直接检测蔗糖产量来评估启动子强度。关于方法的其它细节见实施例5。

图7是pLybAL12的示意图。pLybAL12能分析预先选择的启动子驱动asf表达的能力。pLybAL12和pLybAL11之间的唯一差别是在氯霉素乙酰转移酶基因(cat)之前有活性启动子存在。可将从PCR扩增的蓝细菌染色体DNA中分离的特定DNA序列克隆入MCS。氯霉素和氨苄青霉素均可用于在大肠杆菌中选择。然后可通过接合或直接转化将该质粒文库转移至蓝细菌。随后可通过氯霉素乙酰转移酶基因(cat)表达选择氯霉素抗性来分离携带质粒的蓝细菌。可通过检验氯霉素乙酰转移酶活性和直接检测蔗糖产量来评估启动子强度。关于方法的其它细节见实施例5。

图8是描绘构建蓝细菌启动子文库的草图。关于方法的其它细节见实施例8。

图9是描绘pSMART-LCKan的示意图。关于方法的其它细节见实施例8。

图10是显示细长聚球蓝细菌PCC 7942asf中可能的启动子的序列表。显示的是含有克隆到氯霉素抗性标记上游的细长聚球蓝细菌PCC 7942的asf基因的扩增PCR产物。分别以单下划线和双下划线显示编码蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸酶多肽活性的asf区域。所有DNA元件以斜体字显示并在上方标出。起始和终止分别表示起始和终止密码子。SD表示Shine-Delgarno序列。推定启动子的-35和-10区域以灰色突出显示。关于方法的其它细节见实施例8。

图11是描绘蓝细菌基因组中基因无标记缺失的两步方法的示意图。该方案假定所用的蓝细菌菌株缺失其upp基因。upp基因在蔗糖生物合成插入期间缺失。必须鉴定已靶向缺失的感兴趣基因。起始菌株耐受5-氟尿嘧啶，但对卡那霉素敏感。通过插入含有卡那霉素抗性标记和活性upp的表达盒来完全或部分删除该基因，从而使得该菌株耐受卡那霉素，但对5-氟尿嘧啶敏感。然后可除去upp和卡那霉素抗性标记，从而使得该菌株再次对5-氟尿嘧啶耐受，但对卡那霉素敏感。关于方法的其它细节见实施例12。

图12是光生物反应器实施方式的示意图。图12A是正视图，而图12B是侧视图。该光生物反应器包括悬挂元件(6)；培养基供应(8)；气体供应(10)；生长表面(2)；外屏障层(7)；快速连接器；和产物收获管线(9)。

图13是单一材料形式(图13A)和杂合材料形式(图13B)的生长表面示意图。

发明详述

本申请涉及可发酵糖累积性光合微生物，固相光反应器装置和各自的使用方法。

在累积可发酵糖的光合微生物中，优选产生二糖，其通常不被该光合微生物利用因而能累积在培养的生物量内(例如，蔗糖、海藻糖)。在一些实施方式中，光合微生物经遗传工程改造以合成通常按照渗透应力途径产生的二糖(例如，蔗糖或海藻糖)，从而该糖能在没有渗透应力存在下或其水平降低下产生。与较高等植物相比，由于培养光合微生物的效率更高而环境影响更低，该方法在可持续性上相对于目前的生物燃料生产实践有重要改进。有利的是，合成二糖的以上方法已适于在本发明光生物反应器内进行。

本文所述光生物反应器利用固体培养支持物。有利的是，提供充足光照的困难至少部分缓解。在光生物反应器中利用上述固体培养支持物能培养和生长光合微生物，其细胞密度高于商业规模的液相生物反应器(例如，细胞密度超过每升当量200克干生物量)。此外，与常规商业规模液相光生物反应器相比，本文所述光生物反应器的各种实施方式操作起来使用更少的能源并且更简便。

与常规液相光生物反应器相比，本文所述光生物反应器的诸实施方式提供额外的益处。例如，液相系统通常需要特定的设备以递送足够浓度/量的二氧化碳至光合微生物以支持它们的生长和光合作用。相比之下，通过在固体培养支持物上培养微生物，可以相对简单、成本较低的方式提供二氧化碳，例如接触周围的空气。如果需要额外的二氧化碳，可容易地通过，例如将其加入围绕或接触培养支持物的气氛(例如，空气)中来递送。另一益处是便于输送。液相光生物反应器可以是池(完全固定的)或大体积的槽或多个管道。相比之下，在各种实施方式中，光生物反应器是平坦而柔性的，从而能将其或多个生物反应器堆叠、卷起、折叠和/或以相似方式配置从而较易运输。在各种实施方式中，光生物反应器的配置方式应使其自某系统悬挂下来从而允许便于将一个或多个光生物反应器从一个位置输送至另一位置。可在商业规模上利用这种便携性，从而能采用有效方法以连续方式处理和加工大量光生物反应器。

本申请一方面涉及利用光合微生物产生可发酵糖原料的方法。可发酵糖优选可发酵二糖。可发酵二糖的例子包括但不限于蔗糖和海藻糖。可发酵糖可以是光合微生物通常不利用的二糖。例如，蓝细菌通常不利用海藻糖，因此可累积在培养的生物量内而不被内源性代谢途径实质性降解。可发酵糖可以是光合微生物通常可利用的二糖。对于不用作基础能源的二糖，即使有内源性代谢途径存在，该二糖亦常可累积至足够水平。如果内源性降解途径是目标可发酵糖特异性的，可工程改造该光合微生物以降低或消除这种活性。例如，可对经工程改造以累积蔗糖的蓝细菌作进一步改造以降低或消除蔗糖转化酶活性。在各种实施方式中，可利用对渗透或基质水分应激起反应而合成可发酵二糖的光合微生物菌株。在其它实施方式中，光合微生物的转基因菌株经工程改造从而在没有渗透应力存在或其水平降低情况下累积可发酵二糖。有利的是，合成可发酵二糖的前述方法可适于在本文所述光生物反应器内进行。

与较高等植物相比，由于培养光合微生物的效率更高而环境影响更低，本文所述的组合物、装置和方法在可持续性上相对于目前的生物燃料生产实践有重要改进。

光合微生物

本文提供经遗传学改造以累积二糖的光合微生物。所述光合微生物可以是，例如天然光合微生物，如蓝细菌，或工程改造的光合微生物，如人工光合细菌。累积的二糖的例子包括但不限于：蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油和甘露糖基果糖。在各种实施方式中，在宿主光合微生物(例如，蓝细菌)中工程改造一种或多种基因从而导致所需二糖的累积，所述基因编码负责从相应的磷酸化单体产生所需二糖的蛋白质。在一些实施方式中，工程改造宿主光合微生物的内源性途径从而累积二糖。例如，可工程改造蓝细菌中的渗透蔗糖途径从而在没有渗透应力下累积蔗糖。在一些实施方式中，在蓝细菌中工程改造外源性二糖途径从而累积二糖。例如，可工程改造大肠杆菌的渗透海藻糖途径以在蓝细菌中累积海藻糖。

合酶和磷酸酶

可转化光合微生物使之具有用于所需二糖的合酶活性和磷酸酶活性。例如，可工程改造蓝细菌使之具有蔗糖磷酸合酶活性和蔗糖磷酸磷酸酶活性。再例如，可工程改造蓝细菌使之具有海藻糖磷酸合酶活性和海藻糖磷酸磷酸酶活性。再例如，可工程改造蓝细菌使之具有葡糖基甘油磷酸合酶活性和葡糖基甘油磷酸磷酸酶活性。再例如，可工程改造蓝细菌使之具有甘露糖基果糖磷酸合酶活性和甘露糖基果糖磷酸磷酸酶活性。预计可在其它光合微生物中类似地工程改造这些活性。

可借助各基因，一种编码具有合酶活性的多肽而另一种编码具有磷酸酶活性的多肽；或通过同时编码合酶活性和磷酸酶活性的一个基因而将合酶活性和磷酸酶活性工程改造入光合微生物。例如，合酶活性或磷酸酶活性可存在于融合多肽中。

所需二糖的单体糖可以是光合微生物内源性或外源性的。如果所需二糖的单体糖是内源性的，可工程改造该光合微生物以产生水平升高的这种单体。如果所需二糖的单体糖是外源性的，可工程改造该光合微生物以产生这种外源性单体。

可工程改造光合微生物从而在一定发育阶段后，或经诱导后连续合成和累积所需二糖。根据诱导型启动子的作用，诱导二糖合成可与本文进一步详细讨论的所编码的合酶或磷酸酶和诱导剂相关。

在一些实施方式中，本文所述的转化蓝细菌可累积每分钟每克干生物量至少约0.1微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)。在一些实施方式中，转化的蓝细菌可累积每分钟每克干生物量至少约0.1到高达约10微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)。例如，转化的蓝细菌可累积每分钟每克干生物量至少约0.2、至少约0.3、至少约0.4、至少约0.5、至少约0.6、至少约0.7、至少约0.8、或至少约0.9微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)。在其它实施方式中，各种转化的光合微生物累积相似量的二糖。

预计各种实施方式将累积以上限定的数值范围内的二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)。例如，一些转化的蓝细菌可累积每分钟每克干生物量至少约0.1到高达约0.9微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；每分钟每克干生物量至少约0.1到高达约0.8微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；每分钟每克干生物量至少约0.1到约0.7微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)，等等。类似地，一些转化的蓝细菌可累积每分钟每克干生物量至少约0.2到高达约1.0微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；每分钟每克干生物量至少约0.3到高达约1.0微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；每分钟每克干生物量至少约0.4到高达约1.0微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；每分钟每克干生物量至少约0.5到高达约1.0微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；每分钟每克干生物量至少约0.6到高达约1.0微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；每分钟每克干生物量至少约0.7到高达约1.0微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；每分钟每克干生物量至少约0.8到高达约1.0微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)；或每分钟每克干生物量至少约0.9到高达约1.0微克二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油或甘露糖基果糖)。测定宿主细胞中糖累积的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如实施例10)。

宿主

经遗传工程改造以累积二糖的宿主可以是任何光合微生物。所述光合微生物可以是，例如天然光合微生物，如蓝细菌，或工程改造的光合微生物，如人工光合细菌。天然具有光合作用或经工程改造具有光合作用的示范性微生物包括但不限于：细菌；真菌；古细菌；原生生物；微观植物，例如绿藻；和动物，例如浮游生物、涡虫(planarian)和变形虫。天然光合微生物的例子包括但不限于：极大螺旋藻、钝顶螺旋藻、盐生杜氏藻、布朗葡萄藻、小球藻、蛋白核小球藻、羊角月芽藻、四尾栅藻、紫球藻、急尖柵藻、杜氏藻、斜生栅藻、项圈藻、管链藻属、柱孢藻属、Scenecoccus sp.、Scenecosystis sp.和/或底栖蓝藻。

宿主光合微生物优选蓝细菌。蓝细菌也称为蓝-绿藻，其是广泛的产氧光自养生物。宿主蓝细菌可以是蓝藻门的任何光合微生物。宿主蓝细菌可以是单细胞或菌落(例如，丝状、片状或球状)形态。宿主蓝细菌优选是单细胞蓝细菌。可工程改造以累积二糖的蓝细菌的例子包括但不限于以下属：集胞蓝细菌、聚球蓝细菌、热聚球蓝细菌(Thermosynechococcus)、念珠蓝细菌(Nostoc)、原绿球藻(Prochlorococcu)、微囊蓝细菌(Microcystis)、鱼腥蓝细菌(Anabaena)、螺旋蓝细菌(Spirulina)和粘杆菌(Gloeobacter)。宿主蓝细菌优选集胞蓝细菌或聚球蓝细菌。宿主蓝细菌更优选细长聚球蓝细菌PCC 7942(ATCC 33912)和/或集胞蓝细菌PCC 6803(ATCC 27184)。

蔗糖

可通过依次起作用的两种酶活性，蔗糖磷酸合成酶(sps)和蔗糖磷酸磷酸酶(spp)的催化作用实现在光合微生物，例如蓝细菌中生物合成蔗糖(参见，例如图4)。这种活性存在于适应渗透和基质水分应激的一些蓝细菌(参见，例如Lunn，J.E.2002.Plant Physiol 128，1490-1500)。可在蓝细菌中工程改造这些活性之一或二者从而导致蔗糖累积。

工程改造光合微生物以累积蔗糖的特别感兴趣的基因是细长聚球蓝细菌PCC 7942的活性sps/spp融合(asf)基因。Asf具有sps和spp生物合成功能(参见，例如实施例4)。在一些实施方式中，ASF-编码核苷酸序列从其天然来源(例如细长聚球蓝细菌PCC 7942)克隆，并插入宿主蓝细菌(参见，例如实施例4-9)。在一些实施方式中，转化的宿主光合微生物包含SEQ ID NO：1所示asf多核苷酸。在一些实施方式中，用编码SEQ ID NO：2所示ASF多肽的核苷酸序列转化光合微生物。在另外的实施方式中，转化的宿主光合微生物包含与SEQ ID NO：1有至少约80％序列同一性的核苷酸序列或编码具有sps和spp活性并与SEQ ID NO：2有至少约80％序列同一性的多肽的核苷酸序列。例如，转化的宿主光合微生物，如蓝细菌可包含与SEQ ID NO：1有至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％序列同一性的核苷酸序列，其中该转化的宿主显示ASF、SPS和/或SPP活性和/或累积蔗糖。例如，转化的宿主光合微生物可包含编码与SEQ ID NO：2有至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中该转化的宿主显示ASF、SPS和/或SPP活性和/或累积蔗糖。再例如，转化的宿主光合微生物可包含在严谨性杂交条件下在SEQ ID NO：1的全长上与SEQ ID NO：1杂交的核苷酸序列，该核苷酸序列编码活性SPS/SPP融合(ASF)多肽。再例如，转化的宿主光合微生物可包含任何上述序列的互补序列。

在一些实施方式中，蔗糖磷酸合酶(sps)(参见，例如SEQ ID NO：3编码sps基因，SEQ ID NO：4编码SPS多肽)或其同源物经工程改造而在转化的光合微生物中表达或过量表达。例如，可用具有SEQ ID NO：3所示序列的核苷酸转化光合微生物，从而表达蔗糖磷酸合酶。再例如，可用与SEQ IDNO：3具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同一性百分比的核苷酸转化光合微生物，所述SEQ ID NO：3编码具有蔗糖磷酸合酶的多肽。再例如，转化的宿主光合微生物可包含编码与SEQID NO：4具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述转化的宿主显示SPS活性和/或累积蔗糖。

在一些实施方式中，蔗糖磷酸磷酸酶(spp)(参见，例如SEQ ID NO：5编码spp基因和SEQ ID NO：6编码SPP多肽)或其同源物经工程改造而在转化的光合微生物中表达或过量表达。例如，可用具有SEQ ID NO：5所示序列的核苷酸转化光合微生物，如蓝细菌，从而表达蔗糖磷酸磷酸酶。再例如，可用与SEQ ID NO：5具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同一性百分比的核苷酸转化光合微生物，所述SEQ ID NO：5编码具有蔗糖磷酸磷酸酶活性的多肽。再例如，转化的宿主光合微生物可包含编码与SEQ ID NO：6具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述转化的宿主显示SPP活性和/或累积蔗糖。

在一些实施方式中，光合微生物经工程改造以表达ASF、SPS和/或SPP中的一种或多种。例如，可工程改造光合微生物，如蓝细菌，以表达ASF和SPS；ASF和SPP；SPS和SPP；或ASF、SPS和SPP。

海藻糖

可通过依次起作用的两种酶活性，海藻糖磷酸合成酶(tps)和海藻糖磷酸磷酸酶(tpp)的催化作用实现生物合成海藻糖。可在光合微生物中工程改造这些活性之一或二者从而导致海藻糖累积。一些光合微生物，例如蓝细菌中天然不发生海藻糖的生物合成。

在一些实施方式中，海藻糖磷酸合酶(tps)(参见，例如SEQ ID NO：76编码tps基因，SEQ ID NO：77编码TPS多肽)或其同源物经工程改造而在转化的光合微生物中表达或过量表达。例如，可用具有SEQ ID NO：76所示序列的核苷酸转化光合微生物，如蓝细菌，从而表达海藻糖磷酸合酶。再例如，可用与SEQ ID NO：76具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同一性百分比的核苷酸转化光合微生物，所述SEQ ID NO：76编码具有海藻糖磷酸合酶的多肽。再例如，转化的宿主光合微生物可包含编码与SEQ ID NO：77具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述转化的宿主显示TPS活性和/或累积海藻糖。

在一些实施方式中，海藻糖磷酸磷酸酶(tpp)(参见，例如SEQ ID NO：78编码tpp基因，SEQ ID NO：79编码TPP多肽)或其同源物经工程改造而在转化的光合微生物中表达或过量表达。例如，可用具有SEQ ID NO：78所示序列的核苷酸转化光合微生物，如蓝细菌，从而表达海藻糖磷酸磷酸酶。再例如，可用与SEQ ID NO：78具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同一性百分比的核苷酸转化光合微生物，所述SEQ ID NO：78编码具有海藻糖磷酸磷酸酶活性的多肽。再例如，转化的宿主光合微生物可包含编码与SEQ ID NO：79具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述转化的宿主显示TPP活性和/或累积海藻糖。

葡糖基甘油

在一些实施方式中，葡糖基甘油磷酸合酶(gps)(参见，例如SEQ ID NO：80编码gps基因，SEQ ID NO：81编码GPS多肽)或其同源物经工程改造而在转化的光合微生物中表达或过量表达。例如，可用具有SEQ ID NO：80所示序列的核苷酸转化光合微生物，如蓝细菌，从而表达葡糖基甘油磷酸合酶。再例如，可用与SEQ ID NO：80具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同一性百分比的核苷酸转化光合微生物，所述SEQ ID NO：80编码具有葡糖基甘油磷酸合酶的多肽。再例如，转化的宿主光合微生物可包含编码与SEQ ID NO：81具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述转化的宿主显示GPS活性和/或累积葡糖基甘油。

在一些实施方式中，葡糖基甘油磷酸磷酸酶(gpp)(参见，例如SEQ IDNO：82编码gpp基因，SEQ ID NO：83编码GPP多肽)或其同源物经工程改造而在转化的光合微生物中表达或过量表达。例如，可用具有SEQ ID NO：82所示序列的核苷酸转化光合微生物，如蓝细菌，从而表达葡糖基甘油磷酸磷酸酶。再例如，可用与SEQ ID NO：82具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同一性百分比的核苷酸转化光合微生物，所述SEQ ID NO：82编码具有葡糖基甘油磷酸磷酸酶活性的多肽。再例如，转化的宿主光合微生物可包含编码与SEQ ID NO：83具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述转化的宿主显示GPP活性和/或累积葡糖基甘油。

甘露糖基果糖

在一些实施方式中，甘露糖基果糖磷酸合酶(mps)(参见，例如SEQ IDNO：84编码mps基因，SEQ ID NO：85编码MPS多肽)或其同源物经工程改造而在转化的光合微生物中表达或过量表达。例如，可用具有SEQ ID NO：84所示序列的核苷酸转化光合微生物，如蓝细菌，从而表达甘露糖基果糖磷酸合酶。再例如，可用与SEQ ID NO：84具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同一性百分比的核苷酸转化光合微生物，所述SEQ ID NO：84编码具有甘露糖基果糖磷酸合酶的多肽。再例如，转化的宿主光合微生物可包含编码与SEQ ID NO：85具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述转化的宿主显示MPS活性和/或累积甘露糖基果糖。

在一些实施方式中，甘露糖基果糖磷酸磷酸酶(mpp)(参见，例如SEQ IDNO：86编码mpp基因，SEQ ID NO：87编码MPP多肽)或其同源物经工程改造而在转化的光合微生物中表达或过量表达。例如，可用具有SEQ ID NO：86所示序列的核苷酸转化光合微生物，如蓝细菌，从而表达甘露糖基果糖磷酸磷酸酶。再例如，可用与SEQ ID NO：86具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同一性百分比的核苷酸转化光合微生物，所述SEQID NO：86编码具有甘露糖基果糖磷酸磷酸酶活性的多肽。再例如，转化的宿主光合微生物可包含编码与SEQ ID NO：87具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述转化的宿主显示MPP活性和/或累积甘露糖基果糖。

分子工程改造

本领域技术人员能设计、制备和检验与asf序列具有以上所需同一性百分比并保留所表达蛋白质的所需活性和/或糖累积表型的变体核苷酸和它们编码的多肽。例如，可根据参考文献所述方法进行突变体的定向进化和快速分离，所述参考文献包括但不限于：Link等.(2007)Nature Reviews 5(9)，680-688；Sanger等.(1991)Gene 97(1)，119-123；Ghadessy等.(2001)Proc Natl AcadSci USA 98(8)4552-4557。因此，本领域技术人员能制备大量与本文所述参比序列具有，例如至少95-99％同一性的核苷酸(例如，asf、sps、spp、tps、tpp、gps、gpp、mps或mpp)和/或多肽(例如，ASF、SPS、SPP、TPS、TPP、GPS、GPP、MPS或MPP)变体，并根据本领域的常规方法从其中筛选包括二糖累积在内的表型。通常可在任何位置作出保守性取代，只要能保留所需活性。

核苷酸和/或氨基酸序列同一性百分比(％)应理解为当比对两条序列时，相比于参比序列，与候选序列中的核苷酸或氨基酸残基相同的核苷酸或氨基酸残基百分比。为测定同一性百分比，可比对序列，且如果需要，可引入空位以实现最大序列同一性百分比。测定同一性百分比的序列比对方法是本领域技术人员熟知的。可利用公众常可用的计算机软件，例如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)软件比对序列。本领域技术人员可决定检测比对的合适参数，包括在所比较序列的全长获得最大比对所需的任何算法。比对序列时，给定序列A与给定序列B的序列同一性百分比(或可表述成与给定序列B具有或包含与给定序列A的一定序列同一性百分比)可计算为：序列同一性百分比＝X/Y100，其中X是通过比对A和B的序列比对程序或算法评分为相同匹配的残基数，Y是B中的残基总数。如果序列A的长度不等于序列B的长度，A相对于B的序列同一性百分比不等于B相对于A的序列同一性百分比。

“高严谨性杂交条件”定义为在65℃，在6X SSC缓冲液(即，0.9M氯化钠和0.09M柠檬酸钠)中杂交。在这些条件下，通过计算两条序列之间的DNA双螺旋的解链温度(T_m)可测定给定的一组序列是否会杂交。如果在6XSSC的盐条件下，特定双螺旋的解链温度低于65℃，则两条序列不会杂交。另一方面，如果相同盐条件下的解链温度高于65℃，则序列会杂交。通常可利用下式测定任何杂交的DNA:DNA序列的解链温度：T_m＝81.5℃+16.6(log₁₀[Na⁺])+0.41(G/C含量分数)-0.63(％甲酰胺)-(600/l)。此外，核苷酸同一性每降低1％，DNA:DNA杂交体的T_m降低1-1.5℃(参见，例如Sambrook和Russel，2006)。

可采用本领域已知的各种标准技术转化宿主细胞(参见，例如Sambrook和Russel(2006)Condensed Protocols from Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆的精简方案：实验室手册)，冷泉港实验室出版社，ISBN-10：0879697717；Ausubel等.(2002)Short Protocols in MolecularBiology(分子生物学简便方案)，第5版，Current Protocols(最新方案)，ISBN-10：0471250929；Sambrook和Russel(2001)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第3版，冷泉港实验室出版社，ISBN-10：0879695773；Elhai，J.和Wolk，C.P.1988.Methods in Enzymology167，747-754)。此类技术包括但不限于：病毒感染、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染、微量注射介导的递送、受体介导的摄取、细胞融合、电穿孔等。可选择和繁殖转染的细胞以提供包含稳定整合入宿主细胞基因组的表达载体的重组宿主细胞。

启动子

可将上述核苷酸序列中(例如，asf、sps、spp、tps、tpp、mps、mpp、gps、gpp)的一种或多种操作性连接于可在宿主光合微生物中起作用的启动子。如果宿主是蓝细菌，启动子最好可在蓝细菌和细菌，例如大肠杆菌中有效起作用。启动子选择能在各种条件下表达所需的基因产物。

可在其中插入载体构建物的光合微生物宿主细胞，例如蓝细菌中选择起最佳作用的启动子。还可根据它们的调节特征选择启动子。此类特征的例子包括转录活性和可诱导性升高。

启动子可以是诱导型启动子。例如，可根据温度、pH、激素、代谢物(例如，乳糖、甘露糖、氨基酸)、光(例如，波长特异性的)、渗透势(例如，盐诱导的)、重金属或抗生素诱导启动子。本领域技术人员已知许多标准的诱导型启动子。

在一些实施方式中，启动子是温度诱导型的启动子。例如，λ启动子是可在蓝细菌中起作用的温度诱导型启动子。令人意外的是，λ启动子起作用的温度不同于当其在大肠杆菌中起作用时的温度。在大肠杆菌中，λ启动子在42℃最有活性，该温度高于蓝细菌的正常存活范围。一般而言，在大肠杆菌中，约30℃-35℃时，λ启动子的表达增加约5％-10％，约37℃时，表达增加约20％；但在约37℃-42℃，表达增加约100％。在蓝细菌中，λ启动子在约30℃-35℃最有活性，其是蓝细菌的理想生长温度范围，并且该范围远低于λ启动子在大肠杆菌中的最佳表达。因此，λ启动子在蓝细菌中提供二糖生物合成活性的有效表达。

可插入质粒的启动子的例子包括但不限于：carB、nirA、psbAII、dnaK、kaiA和λ_PR(参见，例如实施例6)。在一些实施方式中，启动子可在蓝细菌和大肠杆菌中有效起作用。在一些实施方式中，asf编码区包含启动子及所述编码区(参见，例如实施例8)。例如，asf编码区可在asf的SPP结构域之前包含启动子(参见，例如图10)。这种内部启动子可在asf编码区起点处携带或不携带启动子。

术语“嵌合的”应理解为指两个或更多个不同多核苷酸分子的部分的融合产物。“嵌合启动子”应理解为指通过操作已知启动子或其它多核苷酸分子产生的启动子。例如，可通过融合第一启动子的异源增强子结构域与第二启动子及其自身的部分或完整调节元件，从而将此类嵌合启动子与可赋予或调节一个或多个启动子或调节元件的基因表达的增强子结构域组合。因此，本发明包括按照本文公开的方法设计、构建和利用嵌合启动子以调节操作性连接的多核苷酸序列的表达。

可通过多种方法设计或工程改造新型嵌合启动子。例如，可通过融合第一启动子的增强子与第二启动子来产生嵌合启动子。相对于该第一或第二启动子，得到的嵌合启动子可具有新型表达特性。可构建新型嵌合启动子使得第一启动子的增强子结构域融合在第二启动子5’端、3’端或内部任何位置。

构建物

可在构建物中提供任何上述可转录多核苷酸分子序列。本发明构建物通常包含在宿主光合微生物，例如蓝细菌中起作用的，操作性连接于上述二糖生物合成的可转录多核苷酸分子(例如，asf、sps、spp、tps、tpp、mps、mpp、gps、gpp)，例如SEQ ID NO：1、3、5、76、78、80、82、84和86所示及其变体的启动子。

示范性启动子如上所述。还可在重组构建物中提供一个或多个额外的启动子。这些启动子可操作性与上述任何可转录的多核苷酸分子序列连接。

术语“构建物”应理解为指任何重组多核苷酸分子，例如质粒、粘粒、病毒、自主复制的多核苷酸分子、噬菌体、或线形或环状的单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子，它们衍生自任何来源，能进行基因组整合或自主复制并包含多核苷酸分子，其中一个或多个多核苷酸分子已按照功能上的操作性方式连接，即操作性连接。术语“载体”或“载体构建物”应理解为指可为转化目的使用的任何重组多核苷酸构建物，即，将异源DNA引入宿主光合微生物，例如蓝细菌中。

此外，构建物可包括但不限于：来自感兴趣基因的非翻译区的额外多核苷酸分子。这些额外的多核苷酸分子可衍生自相对于构建物中存在的其它元件为天然或异源的来源。

质粒

在一些实施方式中，用基于质粒的表达系统转化宿主光合微生物，例如蓝细菌(参见，例如实施例5)。编码感兴趣基因的质粒优选包含启动子，例如上述那些中的一个或多个。对于基于质粒的转化，优选能在大肠杆菌和蓝细菌中起作用的宿主范围广的质粒，该质粒提供在能有效转移入最终宿主(蓝细菌)的方便快速生长熟知系统(大肠杆菌)中起作用的优势。在一些实施方式中，可联用基于质粒的转化和染色体整合，其中质粒方案用于设计和检验基因变体，然后进行所鉴定变体的染色体整合。

可通过本领域已知的许多方法(参见，例如Studier(2005)Protein ExprPurif.41(1)，207-234；Gellissen编，(2005)Production of RecombinantProteins：Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems(重组蛋白生产：新型微生物和真核表达系统)，Wiley-VCH，ISBN-10：3527310363；Baneyx(2004)Protein Expression Technologies(蛋白质表达技术)，Taylor和Francis，ISBN-10：0954523253)评估按照本文所述方法开发的宿主菌株。

本文提供用于编码sps、spp和/或asf的质粒构建物的核苷酸序列。编码sps、spp和/或asf的质粒构建物的例子包括但不限于：pLybAL11(SEQ ID NO：19)(参见，例如图6)和pLybAL12(SEQ ID NO：20)(参见，例如图7)。本文还提供用于编码tps和tpp的质粒构建物的核苷酸序列。编码tps和tpp的质粒构建物的例子包括但不限于：pLybAL23(SEQ ID NO：118)。技术人员应知道可为累积其它二糖，例如葡糖基甘油和甘露糖基果糖所需的生物合成基因制备类似构建物。

在一些实施方式中，转化的宿主光合微生物包含pLybAL11(SEQ ID NO：19)或pLybAL12(SEQ ID NO：20)。在一些实施方式中，转化的宿主光合微生物包含pLybAL23(SEQ ID NO：118)。例如，转化的蓝细菌可包含pLybAL11(SEQ ID NO：19)、pLybAL12(SEQ ID NO：20)或pLybAL23(SEQ ID NO：118)。

包含二糖生物合成基因的质粒构建物还可包含启动子。包含sps、spp和/或asf及启动子的质粒构建物的例子包括但不限于：pLybAL7f(SEQ ID NO：65)；pLybAL8f，包含卡那霉素抗性(SEQ ID NO：69)；pLybAL13f(SEQ IDNO：51)，pLyAL13r(SEQ ID NO：52)，pLybAL14f(SEQ ID NO：53)，pLybAL14r(SEQ ID NO：54)，pLybAL15(SEQ ID NO：44)，pLybAL16(SEQ ID NO：45)，pLybAL17(SEQ ID NO：46)，pLybAL18(SEQ ID NO：47)，pLybAL19(SEQ ID NO：48)，pLybAL21(SEQ ID NO：49)和pLybAL22(SEQ ID NO：50)。包含tps和tpp及启动子的质粒构建物的例子包括但不限于：pLybAL23(SEQ ID NO：118)、pLybAL28(SEQ ID NO：121)、pLybAL29(SEQ ID NO：122)和pLybAL30(SEQ ID NO：123)。技术人员应知道可为累积其它二糖，例如葡糖基甘油和甘露糖基果糖所需的生物合成基因制备类似的含启动子构建物。

在一些实施方式中，转化的宿主蓝细菌包含pLybAL7f(SEQ ID NO：65)；pLybAL8f(SEQ ID NO：69)；pLybAL13f(SEQ ID NO：51)，pLyAL13r(SEQ ID NO：52)，pLybAL14f(SEQ ID NO：53)，pLybAL14r(SEQ ID NO：54)，pLybAL15(SEQ ID NO：44)，pLybAL16(SEQ ID NO：45)，pLybAL17(SEQ ID NO：46)，pLybAL18(SEQ ID NO：47)，pLybAL19(SEQ ID NO：48)，pLybAL21(SEQ ID NO：49)和pLybAL22(SEQ ID NO：50)。在一些实施方式中，转化的宿主蓝细菌包含pLybAL28(SEQ ID NO：121)、pLybAL29(SEQ ID NO：122)、pLybAL30(SEQ ID NO：123)和pLybAL23(SEQ ID NO：118)。

糖分泌

在各种实施方式中，转化的二糖累积的光合微生物可将累积的二糖自细胞内分泌入其生长环境。二糖分泌可以是转化光合微生物以累积二糖的固有作用，或者可进一步工程改造光合微生物以分泌二糖。例如，经转化以累积海藻糖的一些蓝细菌本身从细胞中分泌海藻糖(参见，例如实施例19-20)。再例如，可进一步工程改造经转化以累积蔗糖的蓝细菌以从细胞中分泌蔗糖(参见，例如实施例16)。

可进一步工程改造宿主光合微生物，例如蓝细菌以分泌二糖。在一些实施方式中，转化的宿主光合微生物经工程改造以表达所累积二糖特异性的通道蛋白。例如，可进一步工程改造经工程改造以累积蔗糖的蓝细菌，从而表达蔗糖通道蛋白(参见，例如实施例16)。在一个实施方式中，转化的二糖累积性蓝细菌包含scrY核酸，例如SEQ ID NO：94。在一个实施方式中，转化的二糖累积性蓝细菌包含编码scrY多肽，例如SEQ ID NO：95的核酸。在一个实施方式中，转化的二糖累积性蓝细菌包含含有scrY的质粒，例如pLybAL32(SEQ ID NO：91)。预计类似的方法可应用于其它光合微生物或其它靶二糖。

糖降解的调节

在一些实施方式中，进一步工程改造宿主光合微生物，例如蓝细菌，通过调节降解活性以提高二糖产量(参见，例如实施例14)。在一些实施方式中，可下调或消除转化的光合微生物中的转化酶同源物。例如，可下调或消除转化的蓝细菌中集胞蓝细菌PCC 6803的转化酶同源物(核苷酸序列SEQ ID NO：70；多肽序列SEQ ID NO：71)。再例如，可下调或消除转化的蓝细菌中细长聚球蓝细菌PCC 7942的转化酶同源物(核苷酸序列SEQ ID NO：72；多肽序列SEQ ID NO：73)。在一些实施方式中，下调或消除转化的蓝细菌中蔗糖酶铁氧还蛋白-样蛋白。例如，可下调或消除转化的蓝细菌中集胞蓝细菌PCC 6803的蔗糖酶铁氧还蛋白-样蛋白(核苷酸序列SEQ ID NO：74；多肽序列SEQ ID NO：75)(Machray G.C.等.1994.FEBS Lett 354，123-127)。可采用，例如图11所述的无标记缺失方案(参见，例如实施例12-13)删除这些基因。经工程改造以在蓝细菌中累积的其它二糖可采取类似的方法。

本领域已知下调以上基因或使之沉默的其它方法。例如，可利用反义寡核苷酸、蛋白质适配体、核苷酸适配体和RNA干扰(RNAi)(例如，小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和微小RNA(miRNA)(参见，例如Fanning和Symonds(2006)Handb Exp Pharmacol.173，289-303G，描述了锤头核酶和小发夹RNA；Helene，C.等，(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-36；Maher(1992)Bioassays 14(12)：807-15，描述了靶向脱氧核糖核苷酸序列；Lee等.(2006)Curr Opin Chem Biol.10，1-8，描述了适配体；Reynolds等，(2004)Nature Biotechnology 22(3)，326-330，描述了RNAi；Pushparaj和Melendez(2006)Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 33(5-6)，504-510，描述了RNAi；Dillon等.(2005)Annual Review of Physiology 67，147-173，描述了RNAi；Dykxhoorn和Lieberman(2005)Annual Review ofMedicine 56，401-423，描述了RNAi)下调或消除二糖降解活性。RNAi分子可商品化购自各种来源(例如，德克萨斯州安变公司(Ambion，TX)；密苏里州西格玛阿尔德里奇公司(Sigma Aldrich，MO)；英杰公司(Invitrogen))。采用各种算法的几种siRNA分子设计程序是本领域已知的(参见，例如Cenix算法，安变公司；BLOCK-iT^TM RNAi Designer，英杰公司；siRNAWhitehead Institute Design Tools，生物信息学和研究计算公司(Bioinofrmatics&Research Computing))。确定最佳siRNA序列的特性影响包括siRNA末端的G/C含量、siRNA的特定内部结构域的Tm、siRNA长度、CDS(编码区)内靶序列的位置和3’突出端的核苷酸含量。

在一些实施方式中，可进一步工程改造宿主光合微生物以促进二糖从细胞中分泌。例如，可进一步工程改造蓝细菌以促进蔗糖从细胞中分泌(参见，例如实施例15-16)。处于低渗环境时，蔗糖可从细胞中自动除去，如一些生物从高盐转入低盐环境时渗透保护剂所作的那样(Schleyer，M.，Schmidt，R.和Bakker，E.P.1993.Arch Microbiol 160，424-43；Koo，S.P.，Higgins，C.F.和Booth，I.R.1991.J Gen Microbiol 137，2617-2625；Lamark，T.，Styrvold，O.B.和Strgim，A.R.1992.FEMS Microbiol.Lett 96，149-154)。可工程改造蔗糖通道蛋白使之在转化的蓝细菌中表达(参见，例如实施例16)。可按照上述技术克隆这些基因并转化入蓝细菌。这些方法可适用于其它光合微生物。

在一些实施方式中，通过稳定整合入宿主的染色体来转化宿主光合微生物。例如，宿主蓝细菌通过稳定整合入宿主的染色体来转化(参见，例如实施例11-13)。染色体整合可确保靶基因安装在有机体内而没有采用质粒基因表达有时会发生的逐出风险。染色体整合还可降低或消除为维持靶基因而对抗生素的需求。

染色体整合方案优选将基因靶向插入染色体中称为upp的基因座(参见，例如实施例11-13)。该位点编码尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(UPRT酶)，其是嘧啶生物合成中的清除酶。采用该方案允许通过可除去未整合有机体的5-氟尿嘧啶(5-FU)选择候选对象。通常在蓝细菌系统中采用分离方法，因为这些有机体含有它们的染色体的多个拷贝(例如，对于集胞蓝细菌PCC 6803多达12拷贝，对于细长聚球蓝细菌PCC 7942是16拷贝)。该方案对于蓝细菌特别有吸引力，因为该方法可避免采用依赖用于成功分离的选择性压力和统计学积分的传统分离技术。利用5-FU作为筛选剂更有效，因为它能防止哪怕含有一个活性upp基因的任何有机体生长。以此方式，与传统技术所需的过程相比，可在较少生长周期中快速选择完全整合的候选对象。

固相光合生物反应器

本文提供培养光合微生物的光生物反应器，其包括固相培养支持物以供光合微生物生长。固相培养支持物或固体培养支持物或固体支持物等通常理解成表示既非液体也非气体的培养支持物。虽然该支持物本身是固体的，但可选择该支持物结构以便吸附液体(例如，生长培养基)、气体或二者。在下文更全面描述的某些优选实施方式中，所述固体支持物可吸收水分以供微生物在培养期间使用。

本文所述光生物反应器的各种实施方式可支持光合微生物生长。在光生物反应器中生长的光合微生物可以是，例如天然光合微生物，例如蓝细菌，或工程改造的光合微生物，例如人工光合细菌。天然具有光合作用或经工程改造具有光合作用的示范性微生物包括但不限于：细菌；真菌；古细菌；原生生物；微观植物，例如绿藻；和动物，例如浮游生物、涡虫和变形虫。天然光合微生物的例子包括但不限于：极大螺旋藻、钝顶螺旋藻、盐生杜氏藻、布朗葡萄藻、小球藻、蛋白核小球藻、羊角月芽藻、四尾栅藻、紫球藻、急尖栅藻、杜氏藻、斜生栅藻、项圈藻、管链藻属、柱孢藻属、聚球蓝细菌、集胞蓝细菌和/或底栖蓝藻。

优选配置生物反应器以支持接种、培养和/或收获如上所述经转化以累积二糖的蓝细菌。

所述光生物反应器可以是下文更全面描述的开放式或封闭式系统。在各种实施方式中，光生物反应器包括固相培养支持物、保护屏障层和悬挂元件。光生物反应器的一些实施方式可包括递送和/或除去气体、液体、营养物和/或光合微生物的系统。递送系统可以是，例如标准管道附件。各种管路的任一种可包括快速连接的管道附件。光生物反应器可具有气体递送管线，其能递送例如递送二氧化碳或普通空气。光生物反应器可具有液体递送管线。液体递送管线优选与滴流或滴液系统连接，所述滴流或滴液系统将液体(例如，水)运送至固相培养支持物。光生物反应器可具有营养递送管线。本领域普通技术人员能配制用于光合微生物生长和维持的营养组合物。在一些实施方式中，可以合并营养和液体递送管线，例如以供应基于液体的营养混合物。在一些实施方式中，液体递送管线或营养递送管线可以是将液体培养基分配在生长表面上的喷雾装置。在这种喷雾装置中，光生物反应器应足够大，从而能，例如在外层，如屏障层和固相培养支持物之间容纳喷雾装置。营养物通常以水基组合物供应。可有利地提供不同的水递送管线和营养物递送管线以便独立控制水分和营养物水平。光生物反应器可具有产物收获管线以便收集光合微生物和/或液体悬浮/可溶性产物。光生物反应器可具有接种管线以便接种光合微生物。在一些实施方式中，可合并液体、营养物和/或接种管线。

图1(正视图)和图2(侧视图)描述了固相光生物反应器的一个实施方式。在这些实施方式中，保护屏障7包围固相培养支持物2。图2显示固体培养支持物在构成保护屏障7的保护屏障层3之间。固体培养支持物2提供在其上培养光合微生物的表面。构成保护屏障7的保护屏障层3是透明的，从而光化射线能达到固体培养支持物2的表面以支持光合微生物生长。可重复密封的外罩4使得保护屏障7可松脱地密封。气体和蒸气交换通过结合入保护屏障7的材料的选择性面板5进行。可通过支持元件6将光生物反应器1悬挂成垂直或非水平方向。

固相光生物反应器的另一实施方式描述于图12A(正视图)和图12B(侧视图)中。可将反应器1设计成分段形式，这种形式有助于维修和将表面和/或管路的污染可能性降低到最小。各段可经各种供应和产物收获管线的管路(例如，快速连接形管路)与反应器连接。可通过悬挂元件6将反应器支撑在，例如轨道上，从而反应器1能悬在空中并有助于各段的快速维修。外部保护屏障7可以是能使光线穿透的透明材料，从而有助于生长表面2上的光合作用，且防止环境污染和水分因蒸发而损失。生长表面2可由能保持水分、供应营养物、除去产物和/或能使光合微生物高密度生长的材料构成。可通过管路供应生长表面2，该管路通过液体培养基提供连续补料/从该表面收获产物。培养基管道8可以是将液体渗至表面2的多孔软管，培养基可因重力而滤过生长表面2。液体可通过收获管9在反应器底部收获，该管收获产物和过量的液体培养基以运出反应器1。可通过气体分散管10将气体，例如二氧化碳和空气供应给反应器。气体供应管10可提供正压环境，预计能以受控而有效的方式提供生长所需的气体。气体供应管线10还可通过湿化进入的气流而有助于将水分损失降至最少。反应器中的过量气体可由可呼吸面板5(在相反侧，未示出)排出，该面板是能使气体通过但最小化或消除环境污染的多孔材料。通过过滤供应管线10递送的进入气体，反应器1的正压配置预计能使污染程度最小化。正压还通过提供给气流由内向外的途径而能防止环境污染。

在图12B描述的实施方式中，反应器1的结构元件以相对于生长表面的方向描述。允许过量气体溢出反应器1的可呼吸面板5可面向该装置的底部安置，以提供气体穿过生长表面2转移的途径。将可呼吸面板5定位在屏障表面7底部还能最小化或防止二氧化碳因其密度高于空气而隔开和聚集的可能性。可根据培养表面2上最佳生长要求的气体流动速度来确定可呼吸面板5的尺寸。

固相培养支持物

本文所述光生物反应器的固相培养支持物提供光合微生物在其上和/或其中能生长的表面。固相培养支持物优选包含为有机体提供水分和/或营养物或有助于提供和/或保留水分和/或营养物的材料，从而促进和维持生长。本发明的实施方式不限于可培养的光合微生物的类型或菌株。本领域普通技术人员将知道细胞生长所需的水分的量和营养物的用量及组成将根据待培养的光合微生物的类型或菌株和应用而变化。通常应避免对光合微生物的生长具有有害作用的材料(或那些材料中或其上所含的物质)。

可采用单光生物反应器培养一种类型或多种类型或菌株的光合微生物。此外，固体培养支持物可包含适合一个培养周期或多个培养周期的一种或多种材料，培养周期之间可以进行或不进行灭菌。还有，可将光生物反应器配置成在一个或多个固体支持物上培养一种类型或菌株的微生物或多种类型或菌株的微生物。在一些实施方式中，可以在一个培养支持物上同时培养不同光合微生物的群体，或光合和非光合微生物的群体，而不是纯性培养。单光生物反应器还可包含多个培养支持物。因此，在另一实施方式中，单保护屏障内的多个培养支持物可同时培养一种或多种类型或菌株的光合微生物。

固体培养支持物优选包含相对多孔的材料。相对多孔的材料通常具有较大表面积，可比相对非多孔的材料保留和/或吸附更多水分。还优选具有质地粗糙或形貌(topographical)表面的固体培养支持物。与质地相对不粗糙或平滑的表面相比，质地粗糙或形貌表面能提高细胞密度。虽然通常对支持材料和表面形貌作出选择以增强微生物与支持物的粘附作用，但通常需要该生物不是非常紧密地粘附以致于妨碍它们的移动或收获。在一些实施方式中，固体培养支持物包含适合微生物粘附和生长的材料。在一些实施方式中，固体培养支持物包含减少或消除生物膜形成的材料。

据信，本文所述光生物反应器的固相支持物不同于本领域所用的固体支持物(例如，微生物生长最常用的固相支持物是琼脂)。琼脂通常浇铸在刚性形态的物体中，例如培养皿，并在其中使用以维持其物理完整性，因为琼脂在接触最低水平的应力、应变或二者时易破碎或撕裂。相比之下，所述培养支持物的各种实施方式足够强且耐用，从而能用于光生物反应器中同时维持其物理完整性而无需更强、更耐用的“框架”。或者从另一方面讲，现有技术涉及与实质上更强、更耐用材料(例如，培养皿)接触，从而形成复合体的弱琼脂支持物的充足部分。因此，所述光生物反应器的各种实施方式的固相支持物本身适合于培养微生物，并且足够强而耐用。

下文描述了固相支持物的其它所需的物理特征和/或操作参数。例如，支持物可以是相对平坦和刚性的(类似平板)，或者其可由通过，例如绞链、弹簧、金属丝、丝带等柔性连接的多个平坦而刚性的部件构成。合适的刚性材料包括但不限于：各种金属、聚合物、陶瓷及其复合材料。刚性材料优选具有提高光合微生物与其粘附性的表面形貌。此外，刚性材料可以所需水平的多孔性形成，以增强递送水分和/或营养物至光合微生物的能力。此外，刚性材料可包被有吸附剂或超级吸附聚合物制剂(见下文)。或者，支持物可基本上由柔性材料，例如织物构成。用于固相支持物中的织物包括但不限于：棉、聚酯和/或棉聚酯掺混物，任选包被有吸附剂或超级吸附剂聚合物制剂。培养支持物的柔性是极为有利的，因为它使得培养支持物可以折叠、扭转、悬挂或卷起以便储存、运输或处理。

此外，固相培养支持物优选其结构在高温下(例如，约120℃和更高)稳定，例如高压灭菌器消毒期间通常会遇到的，并且不会如琼脂般融化。因此，在一个实施方式中，可通过高压灭菌法消毒该培养支持物，然后置于本发明的保护屏障内。在另一实施方式中，该培养支持物可置于保护屏障内，然后高压灭菌整个光生物反应器。虽然高压灭菌是一种消毒方法，但本领域技术人员应知道可采用任何其它合适的消毒方法。

本发明的固体培养支持物可包含支持光合微生物生长的任何材料或由其制备。例如，该支持物可由天然材料、修饰的天然材料、合成材料或它们的任何组合构成。天然材料包括但不限于：棉、羊毛、加工的纺织植物纤维和天然多糖(例如，琼脂、淀粉、纤维素)。修饰的天然材料可包括但不限于：化学修饰的植物纤维，例如硝酸纤维素或纤维素酯，除与聚酯或聚酰胺纤维共同纺织的或掺混的天然纤维外。合成材料包括但不限于：由尼龙、纤维玻璃、聚硅氧烷、聚酯、聚烯烃、聚酰胺、共聚酯、聚乙烯、聚丙烯酸酯或聚磺酸酯构成的纤维。固体培养支持物材料的其它例子包括但不限于：丝网、聚氨酯泡沫、氯乙烯泡沫、玻璃碳泡沫、聚酯/聚乙烯泡沫、聚酰亚胺泡沫、聚异氰酸酯泡沫、聚苯乙烯泡沫和聚酯泡沫或它们的组合。

在各种实施方式中，固体培养支持物是织物。可通过以下方法形成织物，例如，但不限于：纺织、编织、制毡和将纤维或聚合物键合或交联在一起。可以构建松散的或开放式的织物。或者，可以紧密构建织物。即，具有明显质地、表面积、形貌可变性和/或粗糙度的织物可将光合微生物更多地机械键合或粘附于培养支持物，因此在用有机体接种支持物和/或其培养和/或收获过程期间对光生物反应器进行操作、运输或者移动的实施方式中是特别优选的。在大多数情况中，有机体与基板的粘附性不宜太大，以致于过分阻碍在收获操作期间移动它们。此外，可通过选择通常是疏水性、亲水性织物或这些织物的混合物来控制织物保留有机体所用水分和/或营养物的能力。这些特性使得固体支持物能保留和/或运送水分和/或溶解于其中的营养物，从而这些水分和/或营养物能为表面生长的微生物所用。

可选用能增强光合微生物生长的材料包被支持物来提高培养支持物的特性，特别是水分和/或营养物保留。例如，可用琼脂或超级吸附剂聚合物，如修饰的纤维素酯、丙烯酸酯或丙烯酸酯/多胺共聚物掺混物包被培养支持物。这些包被材料通常能吸附和保留超过其干重10-100倍的水。在一些实施方式中，这些材料配制成在离子性培养基组分存在下将保留它们的超级吸附特性。包被材料可包被培养支持物表面，或织物的纤维(如果使用的话)，或二者。在一个实施方式中，在琼脂中包被作为培养支持物的毛巾布样品。当如此包被固体培养支持物时，如果光合微生物与其相连，则培养支持物的“表面”包括包被物的表面。为使培养支持物薄、柔软和轻，包被物优选薄的，例如不超过约100微米。然而，还可依据所需应用，或固体培养支持物和所选包被材料的组合利用较厚包被物。

所述固相培养支持物可以是复合分层结构。固相培养支持物可包含布置成毗邻的至少两层。多层固相培养支持物可偶联，例如通过键合、缝合、粘合、压制或任何其它合适的方法。各层可各自独立选自上述几种材料。例如，所述固相培养支持物可包含织物第一材料层，其键合至合成泡沫第二材料层。再例如，所述固相培养支持物可包含合成泡沫第一材料层，其键合至密度相同或不同的合成泡沫第二材料层。所述固相培养支持物优选复合分层结构，该结构至少包含由高表面积生长材料构成的第一层和由可渗透型材料构成的第二层。

除了提供水分、营养物和表面以供附着，培养支持物可提供捕获光化射线的表面。因此，在一些实施方式中，固体培养支持物的尺寸是片状的。即，所述支持物的深度小于支持物的长度和宽度。在一个实施方式中，所述培养支持物是保护屏障的薄膜样层之间的片状层。这种平的生物反应器可如平板那样悬挂。在另一实施方式中，培养支持物恰如光生物反应器的外层屏障所封闭的幕布那样悬挂。传统固相支持物，例如琼脂的薄片易裂开，可能不能如此悬挂。因此，优选单独的固体培养支持物在悬挂时，甚至在用液体饱和时能维持其完整性。

如本文所示，毛巾布类型编织的织物可提供合适的固体支持物(参见，例如实施例1)。本领域技术人员应知道其它天然的、经修饰天然的和合成材料也可接受。毛巾布提供许多据信是本发明固体支持物的理想特性。例如，当在常规条件下(例如，温度)，采用非破坏性技术(例如，弯曲、折叠、扭转或卷曲)操作时，其柔软，不易撕裂、扯开、破碎或破裂。类似地，当适度拉伸时(甚至用液体饱和时)，毛巾布通常不易撕裂、扯开或破碎。此外，毛巾布常是高度质地粗糙的，因为其由许多纤维环构成。这为微生物粘附提供了大表面积，从而增加了可在任何给定尺寸的支持物上生长的微生物数量。此外，棉毛巾布通常吸附至少约3倍其本身的重量，从而织物支持物能保留水分和溶解于其中的任何营养物，使得它们为支持物表面生长的微生物所用。因此，各种实施方式提供固体培养支持物，该固体培养支持物是薄的或片状尺寸，悬挂时能支持其本身的湿重，柔性的，易弯曲的、具有吸附性、质地高度粗糙或它们的任何组合。

上述支持物可以(在许多应用中优选)反复使用，更优选的是，只要它们结构合理并提供足以支持单次使用后沉积的微生物生长的表面，从而能降低操作成本和废料。即，某些应用中可以优选单用支持物，例如培养用于产生药物产品，如小有机分子或治疗蛋白和肽的重组光合微生物。为降低这种单用支持物的成本以及鉴于不会再使用它们的事实，此类支持物无需耐用，因此可用成本较低和耐用性较差的方法和/或材料制备或构建。例如，由类似于纸巾纤维的纸纤维构成的支持物可能适合。

固相培养支持物的几种实施方式描述于图13。图13A描述的固相培养支持物材料是可提供可维持表面以供有机体生长、水分和营养物通路、有机体附着点和/或除去培养产物的一种材料。该材料允许液体渗滤和平衡扩散，从而在表面和有机体之间交换营养物、水分和产物。该结构构造图是可作尺寸和形状优化的高表面积材料的一种实例。图13B所述固相培养支持物材料是由各自对于生长表面具有特定功能的多层材料组成的混合材料。基底层可以是使得经材料渗滤而有效供应营养物和水分以及除去产物的多孔材料。基底材料还可为生长表面提供物理支持。外层要求与基底层连接，并可作优化以提供有机体的附着点。就表面积和与培养的微生物的相容性而言，表面层可更多地控制表面生长环境。

保护屏障

本文所述的光生物反应器可包含保护固体培养支持物和生长表面免遭污染和/或水分丧失的屏障。同时，光生物反应器将光化射线(阳光或人工光)和二氧化碳提供给光合微生物。在各种实施方式中，光生物反应器包括培养光合微生物的至少一个固体支持物和保护屏障。

保护免遭物理操作和/或污染

为防止污染，保护性物理屏障可至少部分覆盖固体培养支持物。在某些实施方式中，物理屏障可包含培养支持物。保护性屏障还可控制(至少部分控制)水分从支持物和/或光生物反应器内的空气中散失到光生物反应器外的空气中。本领域技术人员应知道，可依据所需的本发明实施方式从多种类型的材料中的任一种构建保护屏障。

所述保护屏障可完全包围培养支持物。如果保护屏障是永久密封的，必须破坏、切割、撕开屏障，或作相似处理才能取得其内的培养支持物。因此，在一些实施方式中，从保护屏障到培养支持物和微生物生长表面提供了通路。

在优选的实施方式中，保护屏障可松脱地密封。可松脱密封可以是多种密封类型中的任一种，包括但不限于：拉链-型密封，例如

储存袋(SC强生公司(SC Johnson Company))、钩环型扣件(例如，威克罗美国公司(Velcro USA，Inc.))、扭结(twist ties)、尼龙扣条(zipties)、揿钮、夹具、压敏背衬粘合剂表面(pressure sensitive adhesive backed surfaces)和该领域已知的所有等同方式。然而，不一定需要完全密封；不完全密封外层屏障可能更有效，从而更易于取得培养支持物。

光生物反应器可在保护屏障内包含一个培养支持物或多个培养支持物。在一些实施方式中，在一个保护屏障内包含一个培养支持物。例如，塑料袋可形成其中包含了一个固体培养支持物的保护屏障(参见，例如图1)。在其它实施方式中，一个保护屏障可包含多个固体培养支持物。例如，温室型结构可形成其中包含了多个固体培养支持物的保护屏障。

光化射线的传递

光生物反应器可将光化射线(阳光或人工光)传递至光合微生物。但本发明的保护屏障无需透光。如果其中提供光合微生物生长所需的足够光源，一些实施方式可包含包围在不透明保护屏障内的培养支持物。提供透明的屏障以利用阳光，例如作为光源可能更理想、更简单、更经济等。

优选的实施方式提供包含以下材料的透明屏障，例如但不限于：玻璃或任何类型的透明或通常可见光能穿透的聚合物，例如聚乙烯、丙烯酸聚合物、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯或它们的共聚物或它们的组合。透明屏障可以选自耐用且不易扯开、撕裂、破裂、磨损、粉碎或其它类似物理损坏的材料。可依据耐受高压灭菌器消毒或其它接触极端温度的能力选择透明屏障材料。此外，可选择耐受长期接触阳光或其它辐射而不脱色或退化的透明屏障材料。本领域技术人员应知道耐受光氧化的特定涂层或制剂可能特别有用。此外，可选择红外反射或吸收涂层以降低和/或调节本发明光生物反应器内的温度累积。

本领域技术人员应知道透明屏障材料的厚度会根据机械性能规模而有所不同。例如，透明屏障材料可以为约10mil厚度的工业/海运业类型塑料，或者可以为家用塑料袋类型，即，约2mil厚。在一个实施方式中，透明屏障材料薄而柔韧。例如，透明屏障材料可以低于约10mil。

在一些实施方式中，屏障形成覆盖薄的、柔韧的固体培养支持物两侧的保护层或薄膜。该实施方式的装配光生物反应器将是柔韧的，可以弯曲、卷曲、折叠、扭转等以便储存、运输、运送或处理。在另一实施方式中，透明屏障材料是刚性的。例如，屏障可以是玻璃温室。温室玻璃的厚度最可能优选与建筑实践相一致，但也可能改变。出于实践目的，此类实施方式的光生物反应器将是固定的，但可在一个保护性透明屏障的空间内对多个固体支持物进行操作、运输、运送，等等。

虽然可选择保护屏障以提供足够的光线供光合微生物生长，但无需整个屏障是透明的。因此，在一些实施方式中，屏障的诸部分，例如一条或多条边缘由非透明材料制成。所述非透明材料可以由以下材料构成，包括但不限于：聚乙烯纤维材料

聚四氟乙烯过滤介质、纤维素过滤材料、玻璃纤维过滤材料、聚酯过滤材料和聚丙烯酸酯过滤材料和它们的组合。可因耐用性选择非透明材料。在此类实施方式中，可进一步保护屏障的透明部分以免被耐用的非透明部分导致的撕裂、撕开、磨损、脱落等等。在一个实施方式中，非透明部分提供或包含连接结构和/或加强结构，从而通过进一步包含安装或连接点(例如，孔、环、钩、索环或其它技术上的等同装置、开口或凹槽)和/或将该光生物反应器固定于某结构的某机构而悬挂该光生物反应器。虽然任何此类安装点不一定要位于非透明部分中或其上，但它们可包含在该屏障的非透明部分内或其上，屏障的透明部分内或其上，或屏障的非透明和透明部分内或其上。该连接结构还可包含在该固体培养支持物内或其上，或穿过该固体培养支持物。

在一些实施方式中，该装置具有可分辨的前侧和后侧。该装置的前侧表示面对光源，因此前侧上的屏障部分优选透明的，而偏离光源侧的保护屏障部分不必需是透明的。

提供气体交换

在光合作用期间，光合微生物消耗二氧化碳并释放氧。本文所述的光生物反应器可提供足以产生所需量的光合作用的二氧化碳。将二氧化碳供应到光生物反应器内的一种方式是允许在该光生物反应器内的空气和其周围空气之间的直接气体交换。例如，可在保护屏障中提供洞、通气孔、窗或其它此类开口，从而该系统对于周围的空气是开放的。

但当考虑到光合微生物的污染时，这种开放式构形可能不理想。为解决该问题，保护屏障可将一个或多个固体支持物完全密封在内以隔开外部空气。在此类实施方式中，可通过将二氧化碳引入该封闭外壳中来维持所需浓度。例如，本领域技术人员将知道来自二氧化碳压缩罐的管路或管道使得二氧化碳混合入封闭在光生物反应器内的空气中。此外，已知可利用工厂、工业设备、发电站等的排放物作为光合微生物的二氧化碳源，因而能减少碳排放。在一个实施方式中，供气管线可将二氧化碳提供至生长表面局部区域。

提供气体可透过的选择性屏障来利用大气二氧化碳可能是理想的、更简单、更经济等。因此，一些光生物反应器实施方式提供选择性屏障，其允许在保护屏障内封闭的环境与周围空气之间交换气体和蒸气，但仍能提供密封物理屏障以免污染。此类屏障可以是至少部分气体/蒸气可透过的(例如，透过性远低于常规纺织织物、高于塑料膜和/或类似于铜版纸)，因此能交换气体，例如二氧化碳和氧，但对于固体和液体至少是部分透过的，优选不透过。在一些实施方式中，光生物反应器可包含半透屏障层和气体供应管线以在生长表面周围或附近区域维持高二氧化碳浓度。

在一些实施方式中，选择性屏障的平均孔径或直径不大于约10微米，气体交换率至少约5，不大于约10,000葛尔莱秒(葛尔莱秒或葛尔莱是描述在给定压力差下100立方厘米气体经过1.0平方英寸的给定材料所需秒数的单位)。因此，除了允许气体交换，所述选择性屏障可防止水分从封闭的系统中流失。

保护屏障的选择性屏障部分可由任何合适的聚合物材料构成，例如纺丝粘合烯烃屏障(spunbonded olefin barrier)。可从杜邦公司(DuPont)容易地购得商标

的具有各种特性的纺丝粘合烯烃屏障(极细的聚乙烯纤维)。此类材料因组合了多种物理特性而尤其有利，即，它们能阻止液体传递，例如水，但具有高度气体/蒸气透过性；它们强度较高，吸附少量或不吸附水分，耐撕裂，具有明显的弹性和高度柔韧性。当在MIT弯曲测试仪(flex tester)(TAPPI方法T-423)上测试时，纺丝粘合烯烃可超过20,000轮。此外，它们对大多数酸、碱和盐呈惰性，虽然长期接触氧化物质，例如浓硝酸或过硫酸钠会导致强度有一定丧失。纺丝粘合烯烃屏障具有良好的尺寸稳定性，即，恒温，0-100％相对湿度下，薄片尺寸的改变小于0.01％。某些产物符合美国联邦规则法典第21条(Title 21 of the United States Code of Federal Regulations)(21 CFR177.1520)对于直接食品接触应用的要求。它们还具有优秀的霉菌和发霉抗性；以及中性pH。然而，遗憾的是，它们的UV抗性不好。即，通常预期室外使用寿命至少1-3个月。此外，可用不透明涂层或通过在聚合物纤维中包含入UV抑制剂来改进它们的UV抗性。此外，由于迄今为止生产的纺丝粘合烯烃是不透明的，包含这种材料的保护屏障部分优选不存在和/或不多从而不会损害光合微生物的培养。

具体地说，可以产生“硬”和“软”结构类型的纺丝粘合烯烃。10型是“硬的”面-粘合产品，其是光滑的、硬的非定向的纸-样形式。14和16型是“软的”点-粘合产品，其具有浮雕花纹以提供织物-样柔性基材。14型(或其等价物)可在，例如要求屏障的耐用性和呼吸性的情况下使用。16型是穿有5-20mil(0.13-0.51mm)孔的针，从而给予它们比14型更高的空气和水分透过性，额外的柔软度和更高的柔韧性和悬垂性，但撕裂强度和屏障特性较低。因此，可通过选择一种或多种类型的纺丝粘合烯烃产品来定制选择性屏障的特定特性。

选择性聚合物屏障的其它例子包括但不限于：尼龙、聚砜、聚四氟乙烯、纤维素、玻璃纤维、聚酯和聚丙烯酸酯膜和过滤材料以及它们的组合。

保护屏障的整体无需是气体透过性的，从而提供对于光合微生物的生长具有充分选择性的屏障。只需足够进行充分气体交换的保护屏障部分是气体透过性的。在一个实施方式中，所述选择性部分是保护屏障面板(参见，例如图1)。可改变与支持物表面面积相关的选择性面板的大小和位置以获得特定应用所需的气体交换量而不会过度阻碍微生物的培养。本领域技术人员应知道由气体可透过的选择性材料构成的外部屏障面积百分比将取决于该材料的气体透过率。事实上，由于气体可透过部分将仍允许水蒸气穿过其运送，在各种实施方式中，选择该保护屏障的气体可透过部分的大小以充分运送氧和二氧化碳，同时使水分流失最小化。

悬挂和传送系统

可将本文所述的光生物反应器构建为用于大规模生产和/或通过，例如整合入操控和传送系统来收获。图3显示用于以连续方法操控大量光生物反应器的光生物反应器场(photobioreactor farm)的示范性设计的俯视图。将该光生物反应器或培养面板(未单独显示)连接于传送系统8。传送系统8将培养面板沿着它们的路径移动。多个传送系统汇聚到位于中心的接种和收获中心9。因此，培养面板移入接种和收获中心9，在此处对它们进行加工(例如，收获和/或接种)，然后在接种后以及生物量的培养期间将面板移离中心。随后在收获前的培养后期将面板移回中心，最终携带用于收获的成熟生物量到达中心。然后重复该周期。收获的生物量可经管道10运送以便进一步加工。可通过加入额外传送系统或额外接种和收获中心来提高光生物反应器场的性能以形成专用于生物量产生的大阵列。

光生物反应器的悬挂

为给光合微生物提供光，光生物反应器的优选实施方式中的培养支持物是薄的，片状的。当水平定位时，底层空间(floor space)的充分利用率易降低，因此，在本发明的某些实施方式中，培养支持物是非水平定位的，优选基本上垂直的，或者更优选垂直的。然而，培养支持物基本上可以任何方式定位，只要足够量的光化射线可达到微生物。因此，当光生物反应器的类型是保护屏障在固体支持物周围形成紧密结合的膜或层时，整个光生物反应器的优选方向是垂直的，但任何方向均可接受。为清楚起见，上述方向(例如，垂直、水平、基本上垂直、非水平等)是相对于培养支持物下方的底层或底面而言，假定该底层或底面是水平的。

可利用各种结构、支架、平台、搁物架等以所需方向放置或悬挂培养支持物或整个光生物反应器。具体地说，培养支持物和/或保护屏障可悬挂在能悬挂固体培养支持物和/或光生物反应器的绳、线、钩、缆绳、轨道、钢轨、链、架子、杆、管、支架、平台、梁或任何其它此类结构上，或与其相连。多个培养支持物和/或光生物反应器可悬挂在同一结构上，类似晾衣绳上悬挂的被单。可静态，或以允许它们移动的方式悬挂培养支持物和/或光生物反应器。孔、环、钩等的位置优选将培养支持物和/或光生物反应器的重量基本上平均分布。

悬挂光生物反应器或培养支持物(尤其是以垂直方向)在空间上高效，并可提供操作优势。然而，本发明的生物反应器或培养支持物无需悬挂。例如，在本发明的某些实施方式中，所述培养支持物具有足够的刚性，如果以非水平、垂直或基本上垂直(例如，在支持物类似于刚性平板、面板、栅格等的实施方式中，通过将其基底固定或安置于某表面或其上)定位，其可支持其本身重量并将维持如此定位。在另一实施方式中，保护屏障自由树立，例如温室，多个培养支持物在其内悬挂和/或自由树立。

悬挂光生物反应器和/或培养支持物(特别是以垂直方向)在空间上高效，可能提供操作优势。然而，本发明的生物反应器或培养支持物无需悬挂。例如，在本发明的某些实施方式中，所述培养支持物具有足够的刚性，如果以非水平、垂直或基本上垂直(例如，在支持物类似于刚性平板、面板、栅格等的实施方式中，通过将其基底固定或安置于某表面或其上)定位，其可支持其本身重量并将维持如此定位。在另一实施方式中，保护屏障自由树立，例如温室，多个培养支持物在其内悬挂和/或自由树立。

传送

本文还描述了将光生物反应器、光生物反应器的保护屏障内的培养支持物或它们的某些组合从一个位置传送至另一位置的系统。对于各种原因，可运送光生物反应器和/或培养支持物的能力是有利的。例如，可以优化它们的位置以便接受光线，维持所需温度或气体含量。当多个光生物反应器或培养支持物分属不连续步骤，例如接种、培养、诱导和/或收获时，运送能力可特别有利，因为可能采用连续型方法将光生物反应器或培养支持物更有效地移动至数个指定的位置，而不是将所需材料和设备运送至固定的光生物反应器或培养支持物。

因此，即使在接种后，亦可传送生长表面，无论是单独传送培养支持物或封闭在保护屏障中的培养支持物。本领域技术人员熟悉常用于工业应用的多种类型的传送系统。该传送系统不限于任何特定类型，只要其能移动一个或多个光生物反应器或培养支持物。本领域技术人员应知道光生物反应器或培养支持物与传送系统之间的连接类型会依据所用传送系统的类型而有所不同，可作出选择与作为培养支持物和/或保护屏障一部分的任何固定点共同起作用。虽然预想能通过一个或多个马达驱动的机械方式(例如，通过链条和齿轮的作用)传送培养支持物或光生物反应器，但还可用人力传送它们(例如，简单地推动悬挂的生物反应器，所述生物反应器通过沿着轨道滑动的轴承机构连接于轨道)。

悬挂光生物反应器和/或培养支持物(特别是以垂直方向)的传送系统在空间上高效，可能提供操作优势。但传送系统无需依赖于将光生物反应器或培养支持物悬挂起来。例如，光生物反应器可沿着传送系统的顶部移动，例如通过在滚筒传送带上滑动。在一个实施方式中，该传送带系统可移动包含封闭在保护屏障中的培养支持物的光生物反应器。或者，光生物反应器的保护屏障可以是保护一个或多个移动多个培养支持物的传送带系统的大封闭外壳。

光生物反应器场

对于大规模应用，构建具有足够大小的单个培养支持物可能不实际。因此提供了利用两个或数个或数十或数百或数千或更多个培养支持物以便在光生物反应器“场”中培养光合微生物。这些培养支持物可均位于单个保护屏障内，因此包含单个光生物反应器，或者多个培养支持物可以是多个光生物反应器的一部分。在任一情况中，将多个光生物反应器或培养支持物组织在光生物反应器场内以便有效操作和处理是有利的。组织它们的配置以最大程度得到从光源，例如太阳获取的能量也是有利的。这种组织可包括以有序方式配置多个光生物反应器或培养支持物，所述方式例如但不限于：行、列、同心圆、栅格形式，从中点向外辐射，等等。

在各种实施方式中，该场包括悬挂在同一结构上，例如轨道、钢轨、链、线等的多个光生物反应器或培养支持物。在进一步的实施方式中，该结构是传送系统的一部分，且该光生物反应器或培养支持物沿着传送系统的路径从一个位置移动至另一位置。

光生物反应器场可包括一个传送系统或经配置的多个传送系统，从而操控多个光生物反应器或培养支持物。这种配置能放大以便同时包括两个或数个或数十或数百或数千或更多个传送系统，从而操控两个或数个或数十或数百或数千或更多个光生物反应器或培养支持物。除了传送系统外，光生物反应器场可包括指定的区域、站或中心以便执行诸如接种、培养、诱导和/或收获光合微生物等步骤。这些中心可以是执行某些步骤的专门设备的位置。传送系统的路径可将光生物反应器或培养支持物带至执行特定步骤的此类中心。然后该光生物反应器或培养支持物可沿之移动至序列中的下一区域或中心。沿传送系统的不同光生物反应器或培养支持物可沿着该路径位于不同中心，因此可同时进行不同步骤。在一个实施方式中，传送系统的路径是环。一旦光生物反应器或培养支持物完成一轮培养过程中的步骤，其可重复该过程。留出要被破坏或者最终需要替换的一些单位，基本上可反复使用同一套光生物反应器或固体培养支持物。

在进一步的实施方式中，可在相同或几乎相同的位置进行培养和收获。该位置称为接种和收获中心(参见，例如图3)。在接种和收获中心接种光生物反应器和/或固体培养支持物。传送系统形成环，然后运送光生物反应器或培养支持物离开接种和收获中心。所述光生物反应器或培养支持物随后沿着传送系统的路径移动足以获得所需细胞生长量的时间。然后传送系统将光生物反应器或培养支持物返回接种和收获中心收获。多个传送系统可共有它们自此辐射出去的同一接种和收获中心。如果还需要更大的生产力，光生物反应器场可包括多个接种和收获中心以操作多个传送系统的光生物反应器或培养支持物。虽然可实现效率提高，但接种和收获位置无需是相同的或几乎相同的位置。

光生物反应器的使用方法

培养光合微生物

本文所述的固相光生物反应器可用于培养光合微生物。可在固相光生物反应器中培养的光合微生物包括但不限于：天然光合微生物，例如蓝细菌，或工程改造的光合微生物，例如人工光合细菌。天然具有光合作用或经工程改造具有光合作用的示范性微生物包括但不限于：细菌；真菌；古细菌；原生生物；微观植物，例如绿藻；和动物，例如浮游生物、涡虫和变形虫。天然光合微生物的例子包括但不限于：极大螺旋藻、钝顶螺旋藻、盐生杜氏藻、布朗葡萄藻、小球藻、蛋白核小球藻、羊角月芽藻、四尾栅藻、紫球藻、急尖柵藻、杜氏藻、斜生栅藻、项圈藻、管链藻属、柱孢藻属、聚球蓝细菌、集胞蓝细菌和/或底栖蓝藻。

在固相光生物反应器中生长的光合微生物优选包括蓝细菌。可在生物反应器中生长的蓝细菌可以是蓝藻门的任何光合微生物。在生物反应器中生长的蓝细菌可以是单细胞或菌落(例如，丝状、片状或球状)形态。在生物反应器中生长的蓝细菌优选是单细胞蓝细菌。可在生物反应器中生长的蓝细菌的例子包括但不限于以下属：集胞蓝细菌、聚球蓝细菌、热聚球蓝细菌、念珠蓝细菌、原绿球藻、微囊蓝细菌、鱼腥蓝细菌、螺旋蓝细菌和粘杆菌。在生物反应器中生长的蓝细菌优选集胞蓝细菌或聚球蓝细菌(例如，细长聚球蓝细菌PCC7942(ATCC 33912)和/或集胞蓝细菌PCC 6803(ATCC 27184))。在生物反应器中生长的光合微生物更优选如本文公开的经工程改造以累积二糖的转基因光合微生物。

可给光生物反应器的固体培养支持物接种光合微生物，以及添加水分和其它组分，包括但不限于：营养物、盐、缓冲剂、金属、氮、磷酸、硫等。然后可松脱地密封该光生物反应器，其中培养支持物在保护屏障内。例如，通过悬挂而将密封的光生物反应器以能控制光照和温度的位置和方式安置。安置可以是静态的，或者光生物反应器可移动，例如以确保在一天时间中最大程度接触太阳辐射。光合微生物可培养所需的时间。本领域技术人员应知道时间长度应根据微生物类型和所需的细胞生长密度而有所不同。例如，对于某些蓝细菌菌株，约4-约7天内的培养期可提供每升当量约50-约250克干生物量的细胞产量。一段培养时间后，可打开可松脱密封并收获光合微生物。

本文所用的“每升当量干生物量的克数”是通过计算在所述培养表面生长的生物量层的平均深度(例如，约150微米)并乘以培养表面的长度和宽度值来确定的单位。该计算得到的是体积。然后，使自培养表面收集的生物量的重量与该体积相关，表示为“每升当量干生物量的克数”。

连续培养方法

如果培养光合微生物的过程可以连续进行，例如流水线那样，则能实现更高的效率。与要求设备和生产力能一次操控大量生物量，然后在批次之间无事可做不同，连续系统要求的总生产力不高，但通过连续操作能更有效地利用生产力。通过将培养分成更小但更多的组分，可将诸组分组织成空间上连续的配置。然后可以同时进行总体生产工艺中的不同离散步骤。培养组分经历某一工艺步骤后，该组分在工艺中向前移动，而另一组分代替其在该步骤中。因此，终产物的产生不限于大批次的完成，而可随着各组分完成该流水线样工艺而定期产生。此外，一轮工艺完成后，诸组分可立即再次开始该工艺，如此反复。

更具体地说，连续培养涉及利用可传送光生物反应器或培养支持物以采用连续方式培养光合微生物的方法。连续工艺应理解成允许光生物反应器或固体培养支持物从培养工艺的一个步骤前进至另一步骤的空间关系。或者，可将一个大的结构支持物用于连续工艺中。具体地说，支持物可以是沿某线路(例如，类似于优选垂直布置的传送带)运行的环状材料(例如毛圈织物)。最终的结果是随着多个光生物反应器或固体培养支持物顺序而反复完成该工艺，可实现定期产生生物量。该类工艺表示大规模应用有机会在大但频率低的批次中产生生物量的过程中提高效率。

在优选的实施方式中，连续空间关系沿着传送系统的路径。操作方式类似于流水线。可以各种方式操作此类传送系统。例如，可不间断地操作传送系统，同时将光生物反应器或培养支持物从一个位置移动至另一位置。在此类实施方式中，进行接种、收获等的同时光生物反应器或培养支持物在移动。或者，可停止传送系统以实施诸步骤，然后光生物反应器或培养支持物重新移动至下一步骤的位置。此外，可不间断地操作传送系统，将光生物反应器或培养支持物与传送系统的移动相脱离以进行处理，然后重新连接从而再次进入传送流程。本领域技术人员应知道该通用方案也可能有其它排列。

在连续培养方法的一个实施方式中，在沿着传送系统的一个位置接种多个光生物反应器。然后传送系统将光生物反应器移动至进行光合微生物培养的区域。在传送的该部分，可以最佳光照而定位该光生物反应器以促进生长和光合作用。随后，光生物反应器到达可收获光合微生物的位置。然后光生物反应器可沿传送系统的路径回到接种点以再次开始该工艺。为提高效率，可使光生物反应器离开接种位置和到达收获位置之间的时间与光合微生物产生的所需生长量的时间一致。该工艺步骤不限于接种、培养和收获；其它步骤可包括诱导细胞合成所需产物或灭菌。虽然，以上实施方式描述了可传送光生物反应器的系统，但应该知道可在一个保护屏障内实施相同类型的连续培养以便传送和处理多个固体培养支持物。

产生可发酵糖的方法

可从更有效地培养光合微生物中获益的一种技术是为替代燃料，例如乙醇或生物柴油而产生生物量。与目前培养以产生生物量的植物，例如玉米、甘蔗、大豆、油菜籽、麻风树等相比，光合微生物，例如蓝细菌产生生物量的速率更快，从而可导致更高的生产率。此外，通过微生物直接产生二糖避免了利用植物生物量产生可发酵糖的大量能量密集型预处理。此外，利用光养微生物替代植物可获得较高的可发酵糖产率而没有土壤耗竭、侵蚀和食物供应转变。与其它微生物相比，优选光养微生物，因为可从环境中供应它们的碳源(CO₂)和能源(光)，从而能极其廉价地培养它们。此外，可利用光养微生物消耗工业过程的碳排放，因而提供了进一步的环境益处。

从光合微生物产生大量可发酵糖的一个难点是它们通常消耗产生的碳水化合物而非累积它们。虽然某些糖，例如蔗糖或海藻糖不为光合微生物用作主要碳源，但仍有缓慢同化的机制。尽管有再处理机制(reprocessing mechanism)，此类材料可累积而不代谢。如果能适当工程改造生物，则可灭活同化机制，从而能产生高产量的糖。

本文提供由光合微生物产生可发酵糖，特别是二糖的方法。可发酵糖的例子包括但不限于：蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油和甘露糖基果糖。所述可发酵糖优选蔗糖或海藻糖。该方法适用于连续方式，从而提高生产的成本效率。

可利用能合成可发酵糖的光合微生物实施该方法的各种实施方式。一些实施方式利用和控制渗透-和基质水保护作用(matric water protection)等天然现象以产生发酵原料。在一个实施方式中，可发酵糖的合成诱导型的。在另一实施方式中，可通过遗传操作修饰可发酵糖的合成使之组成地产生。

产生可发酵糖的光合微生物优选蓝细菌。在一些实施方式中，蓝细菌根据诱导型内源性途径累积二糖。在一些实施方式中，转基因蓝细菌根据工程改造的外源性途径累积二糖。上文进一步详细讨论了内源性和外源性途径。

转基因光合微生物优选上文讨论的一种或多种。

能累积二糖的蓝细菌菌株的两个非限制性例子是细长聚球蓝细菌PCC7942和集胞蓝细菌PCC 6803。天然细长聚球蓝细菌PCC 7942接触高达约700mM(其耐受上限)的盐浓度后合成蔗糖。当通过删除agp基因阻断葡糖基甘油生物合成时，集胞蓝细菌PCC 6803在接触其耐受上限(可高达900mM)的盐浓度后产生蔗糖作为其渗透保护剂。在一些实施方式中，可通过将雾化盐溶液直接施加于培养表面进行盐诱导。该方法的优点之一是根据品种的生长时间沿着生长表面可控制地引入施加物，从而能平衡生物量的累积和二糖，例如蔗糖的产生。

为产生可发酵糖，可在固体培养基上或在液体或凝胶培养基中培养和生长光合微生物。本领域熟知光合微生物的培养和生长。因此，除了本文另有注释，可根据此类已知的方法进行光合微生物的培养和生长。例如，经工程改造以累积二糖的转基因蓝细菌可在液体培养基中培养和生长。可从此类液体培养基中分离累积的糖，如果其从细胞中分泌的话。可从自液体培养基收获的光合微生物中分离累积的糖。在一个实施方式中，经工程改造以累积海藻糖(如上所述)的转基因蓝细菌在液体培养基中培养和生长。可从液体培养基中直接分离从转基因蓝细菌中分泌出的海藻糖。在一个实施方式中，经工程改造以累积蔗糖(如上所述)的转基因蓝细菌在液体培养基中培养和生长。可从自液体培养基收获的工程改造蓝细菌直接分离蔗糖。在一个实施方式中，经工程改造以累积和分泌蔗糖(如上所述)的转基因蓝细菌在液体培养基中培养和生长。可从液体培养基中直接分离转基因蓝细菌分泌的蔗糖。

优选在诱导之前将光合微生物培养至每升当量至少约50克干生物量的较高细胞密度。可采用本文所述的固相光生物反应器实现这种较高的细胞密度。然后可用浓度确定的合适盐化合物处理累积的生物量来启动/诱导二糖(例如，蔗糖)产生，所述合适盐的浓度能有效改变通过溶液电导率测得的培养基中水活性。在进一步优选的实施方式中，氯化钠是所用的盐。合适的响应时期后(例如，至少约1小时到不超过约48小时)，可收获载有蔗糖的细胞，并处理以分离和回收产生的蔗糖。合适的响应期通常在至少约5小时到不超过约24小时以内。更常见的合适响应期在至少约10小时到不超过约20小时以内。

在一个实施方式中，合成的大多数二糖(例如，蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油、甘露糖基果糖)累积在细胞内。在另一实施方式中，所述细胞分泌所述二糖，然后从光生物反应器中回收。无论二糖是在细胞内还是分泌的，可采用任何合适的收获方法获得该二糖，所述方法包括但不限于施加于培养表面的水性喷雾洗涤液。可收集包含细胞和/或二糖的洗涤液，并处理以分离和回收该二糖。

现已详细描述了本发明，应该明白可能有改型、变型和等同的实施方式而不脱离随附权利要求所限定的本发明范围。此外，应该知道本说明书中提供的所有实施例是非限制性实施例。

实施例

提供以下非限制性实施例是为了进一步说明本发明。本领域技术人员应知道以下实施例公开的技术代表了发明人已经发现的能良好实施本发明的方法，因此可视作构成其实施方式的实例。然而，本领域技术人员鉴于本文公开应知道可在公开的具体实施方式中作出许多改变并仍能获得类似或相似的结果而不脱离本发明的构思和范围。

实施例1：固相光生物反应器

构建的静态样机装置包括2mil聚乙烯屏障层和

可释放外套。将60cm²可呼吸面板整合入一面，将225cm²编织的棉织物培养支持物表面置于其中。用70体积％水性乙醇处理，然后在50℃用无菌过滤空气流干燥使该装置灭菌。将30ml无菌BG-11培养基吸附到培养支持物上，然后利用气溶胶点样器将细长聚球蓝细菌PCC 7942的预培养物接种于生长表面。在26℃下，在BG-11培养基中使预培养物生长2天，然后接种。将光生物反应器置于维持在33℃的孵育室中，用冷白荧光灯以300微爱因斯坦(microeinstein)照射。2天后，反应器显示出有机体的活性生长，继续生长2天，随后从培养箱中取出该反应器，用去离子水洗涤生长表面。蒸发除去水从而获得254mg干重生物量。

实施例2：通过光合微生物产生蔗糖

以下是说明通过联用光合微生物和光生物反应器产生蔗糖的方法的预言性实施例可用。可在约15-40℃的温度范围内，约60-300微爱因斯坦照射下，二氧化碳浓度为约0.2-15体积％的条件下，用集胞蓝细菌PCC 6803或工程改造的集胞蓝细菌运行至少一个光生物反应器，例如如实施例1或3所述得本发明的光生物反应器约4-7天。初始培养期后，可利用气溶胶喷雾，以浓度范围约0.01-1.5M，更优选约0.2-0.9M的水性盐溶液处理该生长表面。再培养约1-2天以使蔗糖产生。然后用去离子水洗涤表面以收获生长表面。在进一步的实施方式中，洗涤水是无菌的新鲜培养基，洗涤强度应能收集约70-90％的细胞质量。然后可继续培养保留在培养支持物上的生物量作为后续周期。根据所用的生长表面材料和有机体，估计这些培养的产量应是约200-600mg干生物量。

实施例3：用吸附剂聚合物包被的固体培养支持物

用分散于BG-11培养基中的无菌1.5重量％琼脂的热溶液浸渍涂布实施例1所述类型的静态光生物反应器的生长表面。使涂布的生长表面冷却和硬化，随后将该表面插入灭菌的保护屏障内以形成光生物反应器装置并用实施例1所述得在预培养物中生长的细长聚球蓝细菌接种。基本上按照实施例1所述进行培养和收获。

实施例4：ASF基因靶

通过调控蔗糖磷酸合酶(sps)和蔗糖磷酸磷酸酶(spp)活性来研究蓝细菌中蔗糖的生物合成。许多蓝细菌中早已具有此类活性以便适应渗透和基质水分应激(参见，例如Lunn，J.E.2002.Plant Physiol 128，1490-1500)。

Lunn，J.E.(2002.Plant Physiol 128，1490-1500)分析了包括集胞蓝细菌PCC 6803和细长聚球蓝细菌PCC 7942在内的几种生物的sps和spp基因的基因组构成。Lunn提出集胞蓝细菌PCC 6803的蔗糖磷酸合酶(SEQ ID NO：3)具有无活性的蔗糖磷酸磷酸酶(SPP-样)结构域和不同的SPP活性。该SPP-样结构域与spp的同一性水平高，但缺失卤代酸脱卤素酶(haloaciddehalogenase)(HAD)超家族的许多保守性活性位点残基。虽然还未对细长聚球蓝细菌PCC 7942作研究，但Lunn提出两种活性均包含在一种酶中。这些酶的比对示于图5。

检索细长聚球蓝细菌PCC 7942基因组未在染色体上其它处显示有不同的sps基因。利用细长聚球蓝细菌PCC 7942酶(SEQ ID NO：2)，从而无需多基因表达。虽然PCC 7942的基因称为sps，但由于它是携带SPS和SPP活性的一种酶融合体，其根据活性SPS/SPP融合体而称为asf(SEQ ID NO：1)(不同SPP酶的可能表达的进一步信息见下文)。

表达细长聚球蓝细菌PCC 7942asf基因产物(SEQ ID NO：2)有两种方法。

第一种方法是根据宽范围宿主的载体pMMB67EH构建的基于质粒的表达系统(Furste，J.P.，Pansegrau，W.，Frank，R.，Blocker，H.，Scholz，P.，Bagdasarian，M.和Lanka，E.1986.Gene 48，119-131)。质粒pMMB67EH是RSF1010的衍生物，其在大多数革兰氏阴性，甚至在一些革兰氏阳性有机体中复制，因而能对大肠杆菌、集胞蓝细菌PCC 6803、细长聚球蓝细菌PCC7942和各种其它蓝细菌中的蔗糖产生作基于质粒的分析(Kreps，S.，Ferino，F.，Mosrin，C.，Gerits，J.，Mergeay，M.和Thuriaux，P.1990.Mol Gen Genet221，129-133；Marraccini，P.，Bulteau，S.，Cassier-Chauvat，C.，Mermet-Bouvier，P.和Chauvat，F.1993.Plant Molecular Biology 23，905-909；Gormley，E.P.和Davies，J.1991.J Bacteriology 173，6705-8)。

第二种方法是稳定整合入集胞蓝细菌PCC 6803和细长聚球蓝细菌PCC7942的染色体的upp(尿嘧啶磷酸核糖基转移酶)基因座。出于下述原因选择upp基因座。

实施例5：基于质粒的表达

为基于质粒表达asf基因产物设计两种质粒：pLybAL11(参见，例如图6；SEQ ID NO：19)和pLybAL12(参见，例如图7；SEQ ID NO：20)。构建质粒pLybAL12以便从预定的启动子表达，构建pLybAL11以便从随机选择的启动子表达。

如下所示构建两种质粒。采用全细胞作为模板，利用以下寡核苷酸，通过PCR扩增细长聚球蓝细菌PCC 7942的asf基因，从而产生SEQ ID NO：1所示产物：5′-AGACTACAATTGGGGCGTTTTCTGTGAG-3′(MfeI限制性核酸内切酶位点是在核苷酸位置7-12)(SEQ ID NO：7)和5′-CTTACGTGCCGATCAACGTCTCATTCTGAAAAGGTTAAGCGATCGCCTC-3′(SEQ ID NO：8)。

在含和不含上游启动子的情况下，从pBeloBAC11(GenBank登录号U51113)扩增编码氯霉素乙酰基转移酶的基因(cat)。

利用以下寡核苷酸，通过PCR从pBeloBAC11扩增缺乏启动子的cat基因，从而产生SEQ ID NO：11所示产物：5′-TTATCGCGATCGTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAG-3′(SEQ ID NO：9)和5′-CGACCAATTCACGTGTTTGACAGCTTATC-3′(SEQ ID NO：10)(PvuI和PmlI限制性核酸内切酶位点分别是在核苷酸位置4-9和10-15)。

利用以下寡核苷酸，通过PCR从pBeloBAC11扩增携带启动子的cat基因，从而产生SEQ ID NO：14所示产物：5′-TTTTGGCGATCGTGAGACGTTGATCGGCACGTAAG-3′(SEQ  IDNO：12)和5′-CGACCAATTCACGTGTTTGACAGCTTATC-3′(SEQ IDNO：13)(PvuI和PmlI限制性核酸内切酶位点分别在核苷酸位置7-12和10-15)。

用PvuI消化携带cat基因的PCR产物，用T4DNA聚合酶填平末端。然后将它们分别与asf PCR产物连接。通过琼脂糖凝胶电泳纯化得到的产物，用MfeI和PmlI消化，然后用T4DNA连接酶连接于用EcoRI和HpaI消化的pMMB67EH的6.6Kbp产物。将连接产物转化入化学感受态的NEB5α(马萨诸塞州伊普斯威奇新英格兰生物实验室(New England Biolabs；Ipswich，MA))，37℃下，在补加了100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂上作选择。37℃下，在补加了100微克/毫升氨苄青霉素的LB中培养所选的候选物以便小量制备，通过限制性核酸内切酶消化分析，然后利用以下寡核苷酸通过序列分析验证：

5′-GCTTCTGCGTTCTGATTTAATCTGTATCAG-3′(SEQ ID NO：15)、

5′-TATCACTTATTCAGGCGTAGCAACCAG-3′(SEQ ID NO：16)、

5′-GTCGTTAGTGACATCGACAACACACTG-3′(SEQ ID NO：17)和

5′-GATCGCGATACTGATCGAGATAGGTC-3′(SEQ ID NO：18)。选择pLybAL 11的候选号5(pLybAL11-5)(SEQ ID NO：19)和pLybAL12的候选号1(pLybAL12-1)(SEQ ID NO：20)作进一步研究。

根据小量制备期间的质粒产量，在大肠杆菌菌株NEB Turbo(马萨诸塞州伊普斯威奇新英格兰生物实验室)中增殖时，这些质粒的拷贝数显示极大减少，提示宿主菌株的选择对这些质粒的重要性。

实施例6：启动子插入

选择6个启动子插入pLybAL12-5。选择编码氨基甲酰磷酸合酶的集胞蓝细菌PCC 6803carB的推定启动子，因为它在嘧啶和精氨酸生物合成中的作用而可能是强启动子，其可能紧邻基因pyrR的上游，在此情况中它们作为操纵子共同转录。集胞蓝细菌PCC 6803(Aichi，M.，Takatani，N.和Omata，T.2001.J Bacteriol.183，5840-5847)和细长聚球蓝细菌PCC 7942(Maeda，S-I.等.1998.J Bacteriol 180，4080-4088)的硝酸盐还原酶(nirA)启动子因为能通过氮源调节而选择。还选择细长聚球蓝细菌PCC 7942的光系统II D1蛋白(psbAII)的强光照阶段启动子(Golden，S.S.，Brusslan，J.和Haselkorn，R.1986.EMBO Journal 5，2789-2798)和集胞蓝细菌PCC 6803的两个暗阶段启动子[dnaK(Aoki，S.，Kondo，T.和Ishiura M.1995.J Bacteriol 177，5606-11)和kaiA(Kucho，K-I.等.2005.J Bacteriol187，2190-2199)]作为调节的蓝细菌衍生启动子。最后，选择已显示在蓝细菌中有活性的λ_PR温度调节启动子(Ferino，F.和Chauvat，F.1989.Gene 84，257-66；Mermet-Bouvier，P.和Chauvat，F.1994.Current Microbiology 28，145-148)。

采用全细胞作为模板，利用以下寡核苷酸通过PCR扩增启动子，从而产生所示产物。引入用于克隆的限制性核酸内切酶位点示于序列中。

利用以下寡核苷酸，通过PCR从全细胞扩增集胞蓝细菌PCC 6803 pyrR(SphI/KpnI)(SEQ ID NO：23)：

5′-CGGTGTGCATGCCGTTATTGATGGAATG-3′(SEQ ID NO：21)和

5′-TCACTAGGTACCTAAATTACCTGGGAAGCCAG-3′(SEQ ID NO：22)，二者的限制性核酸内切酶位点在核苷酸位置7-12。

利用以下寡核苷酸，通过PCR从全细胞扩增集胞蓝细菌PCC 6803nirA(SphI/KpnI)(SEQ ID NO：26)：

5′-CCCAAGGCATGCAGGAAAACAAGCTCAGAATGCTG-3′(SEQ IDNO：24)和

5′-TTTATTGGTACCAACGCTTCAAGCCAGATAACAGTAGAGATC-3′(SEQ ID NO：25)，二者的限制性核酸内切酶位点在核苷酸位置7-12。

利用以下寡核苷酸，通过PCR从全细胞扩增细长聚球蓝细菌PCC 7942psbAII(SphI/KpnI)(SEQ ID NO：29)：

5′-ATCTTTGCGTTCCGTGACGGCTACTG-3′(SEQ ID NO：27)和

5′-GCAGATGGTACCGGTCAGCAGAGTG-3′(在核苷酸位置7-12具有限制性核酸内切酶位点)(SEQ ID NO：28)。

利用以下寡核苷酸，通过PCR从全细胞扩增细长聚球蓝细菌PCC 7942nirA(SphI/KpnI)(SEQ ID NO：32)：

5′-CAGCCAGCATGCATAAATTTCTGTTTTGACCAAACCATCC-3′(SEQ ID NO：30)和

5′-GTGGCTGGTACCATGGATTCATCTGCCTACAAAG-3′(SEQ ID NO：31)，二者在核苷酸位置7-12具有限制性核酸内切酶位点。

利用以下寡核苷酸，通过PCR从全细胞扩增λ_PR(XbaI/KpnI)(SEQ IDNO：35)：5′-GTGCATTCTAGATGGCTACGAGGGCAGACAGTAAG-3′(SEQ ID NO：33)和

5′-TTCTGTGGTACCATATGGATCCTCCTTCTTAAGATGCAACCATTATCACC-3′(SEQ ID NO：34)，二者在核苷酸位置7-12具有限制性核酸内切酶位点。

利用以下寡核苷酸，通过PCR从全细胞扩增集胞蓝细菌PCC 6803 dnaK(SphI/KpnI)(SEQ ID NO：38)：5′-GCCCCAGCATGCACCAGTAAACATAAATCTC-3′(SEQ ID NO：36)和

5′-ATTGGTGGTACCGAGGTCAATCCCAACAAC-3′(SEQ ID NO：37)，二者在核苷酸位置7-12具有限制性核酸内切酶位点。

利用以下寡核苷酸，通过PCR从全细胞扩增集胞蓝细菌PCC 6803 kiaA(SphI/KpnI)(SEQ ID NO：41)：

5′-GCCAGAGCATGCAAAGCTCACTAACTGG-3′(SEQ ID NO：39)和

5′-GGAAAAGGTACCTGAGTCTATGGGCAACGTG-3′(SEQ ID NO：40)，二者在核苷酸位置7-12具有限制性核酸内切酶位点。

扩增后，用以上显示的限制性核酸内切酶消化PCR产物，凝胶纯化并连接入类似消化的pLybAL12-1，从而分别产生质粒pLybAL15(SEQ ID NO：44)、pLybAL16(SEQ ID NO：45)、pLybAL17(SEQ ID NO：46)、pLybAL18(SEQ ID NO：47)、pLybAL19(SEQ ID NO：48)、pLybAL21(SEQ ID NO：49)和pLybAL21(SEQ ID NO：50)。将连接产物转化入电感受态NEB5α(马萨诸塞州伊普斯威奇新英格兰生物实验室)，30℃下，在补加了100微克/毫升氨苄青霉素、34微克/毫升氯霉素和5％蔗糖的LB琼脂上作选择。30℃下，在补加了100微克/毫升氨苄青霉素、34微克/毫升氯霉素和5％蔗糖的LB中培养所选的候选物以便小量制备，通过限制性核酸内切酶消化分析，然后利用以下寡核苷酸通过序列分析验证：

5′-GCTTCTGCGTTCTGATTTAATCTGTATCAG-3′(SEQ ID NO：42)和

5′-ATGGGTCTGAATGTGCAGAATGTAGAG-3′(SEQ ID NO：43)。分别为质粒pLybAL15(SEQ ID NO：44)、pLybAL16(SEQ ID NO：45)、pLybAL17(SEQ ID NO：46)、pLybAL18(SEQ ID NO：47)、pLybAL19(SEQ ID NO：48)、pLybAL21(SEQ ID NO：49)和pLybAL21(SEQ ID NO：50)选择候选物6和7(pLybAL15-6和pLybAL15-7)、2(pLybAL16-2)、4和5(pLybAL17-4和pLybAL17-5)、1和2(pLybAL18-1和pLybAL18-2)、1和2(pLybAL19-1和pLybAL19-2)、3和5(pLybAL21-3和pLybAL21-5)及4和8(pLybAL22-4和pLybAL22-8)，

在补加了蔗糖和两种抗生素的LB上选择和生长这些质粒对于获得克隆是必要的。最初在只补加氨苄青霉素的LB上进行选择，但不能分离含有启动子的质粒。分离物或者仅是载体的重新连接，或者大小不一并且在氯霉素存在下缺乏增殖的能力。据认为，不断产生的内部蔗糖对细胞产生渗透压休克，从而导致阻止蔗糖产生的缺失。随后的实验表明，一旦分离，质粒在没有蔗糖存在下稳定，可能通过最终诱导渗透应激机制和/或蔗糖消耗酶。

实施例7：集胞蓝细菌和聚球蓝细菌的转化

除非利用表述，与Elhai，J.和Wolk，C.P.1988.Methods in Enzymology167，747-754所述一样，通过三亲代接合(triparental conjugation)将含启动子的质粒pLybAL15(SEQ ID NO：44)、pLybAL16(SEQ ID NO：45)、pLybAL17(SEQ ID NO：46)、pLybAL18(SEQ ID NO：47)、pLybAL19(SEQ ID NO：48)、pLybAL21(SEQ ID NO：49)和pLybAL21(SEQ ID NO：50)以及无启动子的pLybAL12-1载体(SEQ ID NO：20)(参见实施例5-6)置于集胞蓝细菌PCC 6803和细长聚球蓝细菌PCC 7942中。

离心沉淀在30℃培养的负荷菌株(cargo strain)(携带带转移质粒的NEB5α)的过夜培养物以及携带辅助质粒pRK2013(ATCC 37159)的HB101的过夜培养物，用LB洗涤两次，然后以1/10的原始体积重悬在LB中。30℃下，在恒定照射下用BG11-A使各蓝细菌生长至OD₇₃₀约为0.5，所述BG11-A与BG11相同，除了痕量元素替换为Nitsch痕量元素(Nitsch，J.P.和Nitsch，C.1956.American Journal of Botany 43，839-851)。离心沉淀的细胞成小团，用BG11-A洗涤两次，重悬在含浓度增加7.5-倍的BG11-A中。制备BG11-A的蓝细菌10倍系列稀释液直至10^-5。将100微升各稀释液的蓝细菌与各50微升的大肠杆菌负荷和辅助菌株混合。然后将150微升的各混合物涂布到补加5％LB的BG11-A琼脂(1.5％)平板上。在26-28℃，恒定照射下温育诸平板16-24小时。抬起各平板上的琼脂(约30ml)，加入300微升100X氯霉素溶液。对于集胞蓝细菌PCC 6803氯霉素的终浓度是25μg/ml，对于细长聚球蓝细菌PCC 7942是7.5μg/ml。继续温育8-12天。在补加了适当量的氯霉素的BG11-A上反复划线从污染大肠杆菌中纯化转化接合子的各菌落，从而再次获得分离的菌落。

实施例8：pLybAL11-5中的启动子文库

以下实施例描述了利用pLybAL11-5(SEQ ID NO：19)(参见实施例5)构建蓝细菌DNA文库以选择启动子。采用改进、放大的Wilson，K.(1997.Preparation of Genomic DNA from Bacteria(制备细菌的基因组DNA).刊于Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学方法).约翰威利父子公司(John Wiley and Sons)第1卷，第2.4.1-2.4.5页)的染色体DNA分离方案，其中主要的不同在于温育时间更长和用肌氨酰(Sarkosyl)替代SDS。分离的DNA数量足以进行部分Sau3AI消化以插入pLybAL11-5的BamHI位点。如图8所示，一些片段具有启动子，而另一些没有。

在文库构建过程中，在基因asf内发现可能的启动子。要起到启动子克隆载体的作用，当启动子插入asf基因之前时，质粒pLybAL11-5(SEQ ID NO：19)应只耐受氯霉素，因为该标记缺乏其正常的启动子并且不包括asf上游的启动子。然而，一旦构建，在大肠杆菌中检查该质粒赋予的氯霉素抗性。在37℃下，在补加了34微克/毫升氯霉素的LB琼脂(1.5％)上培养携带pLybAL11-5的NEB5α时，观察到生长。然而，在补加了34微克/毫升氯霉素的液体LB培养基中培养时，生长几乎未观察到至未观察到。携带pLybAL12-1(SEQ ID NO：20)的NEB5α在有氯霉素存在时，在固体和液体LB培养基中生长。

为验证asf基因上游没有缺失的启动子，而在转录终止子下游，利用卢西根公司的克隆轻松试剂盒(Lucigen CloneSmart kit)与大肠杆菌的卢西根菌株(E.cloni 10G)感受态细胞将置于pMMB67EH中以制备pLybAL11的插入物克隆入威斯康星州米德尔顿的卢西根公司(Lucigen Corp.，Middleton，WI)的pSMART-LCKan平端克隆载体(参见图9)。由于是平端克隆，该插入物可以任一方向与质粒连接，从而产生pLybAL13f(SEQ ID NO：51)和pLyAL13r(SEQ ID NO：52)。通过用终止子围绕克隆位点将该载体专门设计成从载体消除转录通读。作为对照，用于构建pLybAL12的插入物也置于该载体中，从而产生pLybAL14f(SEQ ID NO：53)和pLybAL14r(SEQ IDNO：54)。这些质粒在琼脂糖凝胶上看起来大小合适，但插入物未经DNA测序验证来证实克隆的完整性。然而，携带pLybAL13和pLybAL14(携带以正向或反向连接的克隆DNA)的E.cloni10G观察到类似结果，分别与携带pLybAL11(SEQ ID NO：19)和pLybAL12(SEQ ID NO：20)的NEB5α观察到的一样。这表明该启动子在大肠杆菌中的活性弱。

许多大肠杆菌启动子在蓝细菌中不起作用，反之亦然。可能是该启动子活性在集胞蓝细菌PCC 6803或细长聚球蓝细菌PCC 7942中观察不到。为检查这一点，如上所述通过接合将pLybAL11-5(SEQ ID NO：19)插入两种有机体中。在补加了氯霉素(对于集胞蓝细菌PCC 6803和细长聚球蓝细菌PCC 7942分别是25μg/ml和7.5μg/ml)的BG11-A琼脂(1.5％)上观察到生长。

检测携带pLybAL11-5(SEQ ID NO：19)的这些有机体在含氯霉素的液体BG11-A上的生长。该活性可能非常弱，仅在存在于多拷贝质粒上时观察到。对于大肠杆菌可能是这种情况，但对于蓝细菌可能不是。RSF1010是较低拷贝的质粒，在大肠杆菌中仅有12拷贝(Frey，J.，Bagdasarian，M.M.和Bagdasarian，M.1992).Gene 113，101-106)。经历快速分裂的大肠杆菌具有最多2拷贝的其染色体，因此拷贝数增加至少6-倍。该质粒在蓝细菌中可能有相当的拷贝数。集胞蓝细菌PCC 6803和细长聚球蓝细菌PCC 7942的染色体拷贝数类似，分别是10-12和16(Labarre，J.，Chauvat，F.和Thuriaux，P.1989.J Bacteriol 171，3449-57)。以上结果提示蓝细菌的asf基因中存在启动子。

图10显示asf基因中启动子(或多个启动子)可能的位置。Curtis，S.E.[1994.The transcription apparatus and the regulation of transcriptioninitiation(转录装置和转录起始的调控).刊于The Molecular Biology ofCyanobacteria(蓝细菌的分子生物学).Bryant，D.A.(编).克鲁维学术出版社(Kluwer Academic Publishers)第613-699页]描述了转录起始元件。Sazuka，T.和Ohara，O.(1996.DNA Research 3，225-232)限定了翻译起始元件。

根据与已知SPS酶的比对和终止密码子仅存在于上游两个密码子处，预计asf基因的翻译起始开始于GTG起始密码子处。虽然ATG起始密码子是最常用的，GTG和TTG是较不常用的，但不是罕用的。除了间隔略远一些，还存在与16S rRNA的3’-端互补的典型大肠杆菌-样Shine-Delgarno序列(GGAG或GAGG)，其中腺嘌呤核苷酸最好离也存在的起始密码子的第一个核苷酸9-12bp。该序列见于Sazuka和Ohara研究的约一半基因中。略差的最适间隔并不罕见，但常导致表达水平降低。Shine-Delgarno序列上游但在MfeI位点下游的序列太短从而不能引入启动子。可能引入部分启动子，但启动子的其余部分必须由所有三种质粒(pLybAL11-5(SEQ ID NO：19)；pLybAL13f(SEQ ID NO：51)和pLybAL13r(SEQ ID NO：52))的载体序列产生，这是不可能的。

因此，启动子活性可能位于asf基因内。如果该启动子在asf基因内，一个可能的位置是在asf的SPP结构域之前。这样会得到细长聚球蓝细菌PCC 7942的蔗糖生物合成酶，其四级结构类似于集胞蓝细菌PCC 6803的那些。各有机体具有彼此可能相互作用(或不相互作用)的两种蛋白质，带翻译稠合的SPP或SPP样结构域的SPS结构域以及不同的SPP。

首先测定asf的SPP结构域是否甚至分别翻译。从图10和表1可以看出，TTG起始密码子紧邻SPP结构域上游，其前是Shine-Delgarno序列。

表1：直接围绕提出的spp起始密码子的核苷酸。直接围绕提出的spp起始密码子的核苷酸与72个蓝细菌基因的共有序列比较。匹配共有序列的核苷酸以斜体字显示，而与共有序列不匹配的核苷酸以下划线显示。相对于起始密码子的第一核苷酸给核苷酸编号。

围绕起始密码子的区域几乎与Sazuka和Ohara测定的72个蓝细菌基因的共有序列以及天然起始密码子匹配。虽然根据大肠杆菌启动子建立的规则测定了蓝细菌启动子，但仍检索了典型的-35和-10元件，因为启动子确实在大肠杆菌显示活性。鉴定了两种可能的启动子，如图10所示。asf中其它处还可能有其它启动子。

实施例9：将质粒从大肠杆菌转移至蓝细菌

采用接合将基于pMMB67EH的质粒转移入蓝细菌。已有方法转化这些有机体(Zang，X.，Liu，B.，Liu，S.，Arunakumara，K.K.I.U.和Zhang，X.2007.Journal of Microbiology 45，241-245；Golden，S.S.和Sherman，L.A.1984.Journal of Bacteriology 158，36-42)，但这些方法未能采用天然转化将这些质粒成功置于集胞蓝细菌PCC 6803和细长聚球蓝细菌PCC 7942中。

验证蓝细菌中是否存在质粒。通过asf/cat基因与以下寡核苷酸的组合的PCR产生3.1kb产物来分析转化接合子中是否存在质粒：5′-AGACTACAATTGGGGCGTTTTCTGTGAG-3′(SEQ ID NO：7)和5′-GGTGGTTGTGTTTGACAGCTTATC-3′(SEQ ID NO：55)。此外，分离并分析质粒。离心沉淀在补加了氯霉素(浓度如上所述)的BG11-A中生长的细胞培养物，在TE中重悬，热处理并利用普罗美加大师SV+小量制备试剂盒(Promega Wizard SV Plus miniprep kit)小量制备。但由于产量差，难以直接分析质粒。如此，分离的DNA转化入大肠杆菌NEB5α，利用普罗美加大师SV+小量制备试剂盒再分离，然后进行限制性核酸内切酶分析。

实施例10：蔗糖产生测定和分析

测定用pLybAL19或pLybAL17转化的聚球蓝细菌(参见实施例7)的蔗糖累积情况。利用加利福尼亚州山景市的生物视点公司的蔗糖测定试剂盒(BioVision，Inc.，Mountain View，CA)检测蔗糖。诱导4小时后进行测定(对于pLybAL17(SEQ ID NO：46)将光照从50微爱因斯坦增加至180微爱因斯坦，对于pLybAL19(SEQ ID NO：48)将温度从26增加至39℃)。根据细胞中存在的背景葡萄糖校正数据。

结果显示用pLybAL19(SEQ ID NO：48)转化的聚球蓝细菌累积0.78纳摩尔蔗糖/毫克干生物量。结果还显示用pLybAL17(SEQ ID NO：46)转化的聚球蓝细菌累积0.95纳摩尔蔗糖/毫克干生物量。

进一步分析大肠杆菌、集胞蓝细菌PCC 6803和细长聚球蓝细菌PCC7942中基于质粒的蔗糖产生。由于细菌可消耗蔗糖，检测可能困难。因此，在抑制条件下培养细胞，然后在诱导后立刻测定。可利用尿嘧啶培养来抑制pyrR启动子，并通过转移缺乏尿嘧啶的培养基诱导。可利用铵离子作为氮源培养来抑制nirA启动子，并通过转移至硝酸盐作为氮源的培养基诱导。可将psbAII启动子从低光移至高光。可将暗阶段启动子从光亮移至黑暗。可将λ_PR启动子从低温(25℃)移至高温(39℃)。

实施例11：通过稳定染色体整合的表达

插入蔗糖生物合成基因可对细胞生长产生负面影响，导致难以完全分离10-16个染色体。对于抗生素抗性标记的常规选择，具有额外拷贝的标记不会显著影响细胞在有抗生素存在下的存活。因此，但面临负表型时，采用抗生素选择难以获得完全染色体分离。

在大多数有机体中，删除upp基因(编码尿嘧啶磷酸核糖基转移酶)导致对其它情况中毒性5-氟尿嘧啶有抗性。为获得完全抗性，必须删除所有拷贝的upp基因。因此，整合入集胞蓝细菌PCC 6803(SEQ ID NO：56)和细长聚球蓝细菌PCC 7942(SEQ ID NO：58)的upp基因座将导致5-氟尿嘧啶抗性并能正选择完全分离，即使有负表型存在。

实施例12：UPP/卡那霉素抗性表达盒

利用upp/卡那霉素抗性表达盒的基因组操作的通用方案概述于图11。描述了基因删除，但该方案不难在插入和突变的“替代”步骤作改变。

构建了upp/卡那霉素抗性表达盒。按照生产商的方案，用埃匹中心生物技术公司的拷贝控制克隆试剂盒(Epicentre Biotechnologies CopyControlcloning kit)，以平端克隆载体pCC1和大肠杆菌菌株EPI300构建该表达盒。利用以下寡核苷酸从全细胞扩增枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的upp基因从而产生SEQ ID NO：62所示产物：

5′-AAGAAGCAAGACAGCGTGTAGCTGCTCTGACTG-3′(SEQ ID NO：60)和

5′-TCCCGGGATTTGGTACCTTATTTTGTTCCAAACATGCGGTCACCCGCATC-3′(在核苷酸位置2-7和12-17具有限制性核酸内切酶位点)(SEQID NO：61)。

如埃匹中心生物技术公司方案所述，将PCR产物克隆入pCC1，利用补加了氯霉素的LB选择携带插入物的那些。相对于lacZ，通过限制性核酸内切酶消化作正向筛选，产生pLybAL7f(SEQ ID NO：65)。利用候选物3和8(pLybAL7-3和pLybAL7-8)的以下寡核苷酸，通过DNA测序验证插入物的确切序列：5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′(SEQ ID NO：63)和5′-CACACAGGAAACAGCTATGACCAT-3′(SEQ ID NO：64)。

利用以下寡核苷酸扩增Lybradyn载体pLybAA1[最初衍生自pACYC177(Rose，R.E.1988.Nucleic Acids Res.16，356]的卡那霉素抗性标记，从而产生SEQ ID NO：68所示产物：5′-GTCAGTGCACTGCTCTGCCAGTGTTACAACC-3′(在核苷酸位置5-10处具有ApaLI限制性核酸内切酶位点)(SEQ ID NO：66)和5′-CTCAGTGGCGCCAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTC-3′(SEQID NO：67)(在核苷酸位置7-12处具有NarI限制性核酸内切酶位点)。

用ApaLI和NarI消化PCR产物，连接入类似消化的pLybAL7f，从而产生pLybAL8f(SEQ ID NO：69)。用补加了50μg/ml新霉素的LB选择合适的质粒，并通过限制性核酸内切酶消化检查。

实施例13：UPP缺失

迫使染色体插入物分离以表达包括蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油和甘露糖基果糖的糖的一种方案采用删除染色体的upp，从而导致耐受5-氟尿嘧啶。虽然已在许多有机体中(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)建立了该方案，但对于蓝细菌，例如集胞蓝细菌PCC 6803和细长聚球蓝细菌PCC 7942，以前未建立该方案。

测试显示1μg/ml 5-氟尿嘧啶完全抑制这些有机体各自的生长。0.5μg/ml5-氟尿嘧啶完全抑制集胞蓝细菌PCC 6803的生长，该蓝细菌对低至0.1μg/ml的5-氟尿嘧啶亦敏感。

用寡核苷酸Sspupp-F(SEQ ID NO：96)和Sspupp-R(SEQ ID NO：97)扩增集胞蓝细菌PCC 6803的upp基因和周围序列。用寡核苷酸Seloupp-F(SEQ ID NO：98)和Seloupp-R(SEQ ID NO：99)扩增细长聚球蓝细菌PCC7942的upp基因和周围序列。然后按照生产商的使用说明书，将PCR产物(集胞蓝细菌PCC 6803的upp，SEQ ID NO：100；细长聚球蓝细菌PCC 7942的upp，SEQ ID NO：101)克隆入威斯康辛州麦迪逊市埃匹中心生物技术公司的平端克隆载体pCC1。

虽然将PCR产物(SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101)可以任一方向连接入pCC1，但选择相当于lac启动子的正向，从而分别产生pLybAL3f(SEQ ID NO：102)(含有集胞蓝细菌PCC 6803的upp)和pLybAL5f(SEQ IDNO：103)(含有细长聚球蓝细菌PCC 7942的upp)。利用寡核苷酸T7long(SEQ ID NO：104)和M13rev(SEQ ID NO：105)测序插入物。集胞蓝细菌PCC 6803的upp的核苷酸序列如SEQ ID NO：111所示，多肽序列如SEQ IDNO：112所示。细长聚球蓝细菌PCC 7942的upp的核苷酸序列如SEQ ID NO：113所示，多肽序列如SEQ ID NO：114所示。

通过除去BlpI和ApaLI片段，用T4DNA聚合酶填平末端，然后用T4DNA连接酶再环化而从pLybAL3f(SEQ ID NO：102)产生质粒pLybAL4f(SEQ ID NO：106)。然后用AvrII和SgfI消化pLybAL4f，用T4DNA聚合酶填平末端，随后用T4DNA连接酶再环化删除集胞蓝细菌PCC 6803的部分upp基因，从而产生pLybAL9f(SEQ ID NO：107)。从pLybAL9f(SEQ IDNO：107)切下携带蓝细菌DNA的SacI/SphI片段(SEQ ID NO：108)，连接入类似消化的pARO180(序列未完全知晓；Parke，D.1990.Construction ofmobilizable vectors derived from plasmids RP4，pUC18 and pUC19(衍生自质粒RP4、pUC18和pUC19的可移动载体的构建).Gene 93：135-137；ATCC77123)，从而产生pLybAL25。通过除去SapI和ApaLI片段，用T4DNA聚合酶填平末端，然后用T4DNA连接酶再环化而从pLybAL5f产生质粒pLybAL6fb(SEQ ID NO：109)。然后用BssHII和BsaI消化pLybAL6fb，用T4DNA聚合酶填平末端，随后用T4DNA连接酶再环化删除细长聚球蓝细菌PCC 7942的部分upp基因，从而产生pLybAL10fb(SEQ ID NO：110)。从pLybAL10fb切下携带蓝细菌DNA的SacI/SphI片段(SEQ ID NO：138)，连接入类似消化的pARO180，从而产生pLybAL26。

将质粒pLybAL25和pLybAL26置于大肠杆菌S17-1(ATCC 47055)中。质粒pLybAL25和pLybAL26有待通过双亲接合转移至集胞蓝细菌PCC6803和细长聚球蓝细菌PCC 7942。由于这些质粒不在蓝细菌中复制，它们应能起到自杀载体的作用，横穿进入染色体，从而删除染色体拷贝之一上的upp。优化方案能加速分离而不会因过早接触太多的5-氟尿嘧啶而杀伤细胞。

实施例14：蔗糖降解酶的修饰

进一步工程改造用asf转化的蓝细菌以便通过调控蔗糖降解活性来提高蔗糖产量。

本发明人鉴定了集胞蓝细菌PCC 6803(核苷酸序列SEQ ID NO：70；多肽序列SEQ ID NO：71)和细长聚球蓝细菌PCC 7942(核苷酸序列SEQ IDNO：72；多肽序列SEQ ID NO：73)中编码转化酶同源物的基因。集胞蓝细菌PCC 6803还编码蔗糖酶铁氧还蛋白-样蛋白(核苷酸序列SEQ ID NO：74；多肽序列SEQ ID NO：75)(Machray G.C.等.1994.FEBS Lett 354，123-127)。

采用图11所述的无标记删除方案删除这些基因。

实施例15：蔗糖降解酶的修饰

进一步工程改造用asf转化的蓝细菌以促进细胞分泌蔗糖。

当处于低渗环境中时，蔗糖可以从细胞中自动除去，如一些生物从高盐转入低盐环境时渗透保护剂所做的那样(Schleyer，M.，Schmidt，R.和Bakker，E.P.1993.Arch Microbiol 160，424-43；Koo，S.P.，Higgins，C.F.和Booth，I.R.1991.J Gen Microbiol 137，2617-2625；Lamark，T.，Styrvold，O.B.和Strgim，A.R.1992.FEMS Microbiol.Lett 96，149-154)。工程改造蓝细菌可促进该过程。

进一步工程改造用asf转化的蓝细菌以表达蔗糖通透酶，例如大肠杆菌和沙门氏菌所用或将蔗糖转运至某些蓝细菌的固氮孢囊中所用的那些(Jahreis K.等.2002.J Bacteriol 184，5307-5316；Cumino，A.C.2007.Plant Physiol 143，1385-97)。按照上述技术将这些基因克隆并转化入蓝细菌。

实施例16：通道蛋白转化的蓝细菌的蔗糖分泌

可用蔗糖通道蛋白转化来促进集胞蓝细菌PCC 6803和细长聚球蓝细菌PCC 7942的蔗糖分泌。

克隆阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)ATCC BAA-894的编码蔗糖通道蛋白的基因(scrY)以便在集胞蓝细菌PCC 6803和细长聚球蓝细菌PCC7942中表达。该基因的功能是从其序列及其邻近序列推导得到。利用寡核苷酸EsscrYBamHI-F(SEQ ID NO：88)和EsscrYSacI-R(SEQ ID NO：89)，通过PCR从染色体DNA扩增阪崎肠杆菌scrY。用BamHI和SacI消化PCR产物(SEQ ID NO：90)，连接入类似消化的pLybAL19并克隆入NEB5α，从而产生pLybAL32(SEQ ID NO：91)。然后用寡核苷酸EsscrYmidseq-F(SEQ ID NO：92)和EsscrYmidseq-R(SEQ ID NO：93)测序scrY基因(核酸SEQ ID NO：94；多肽序列，SEQ ID NO：95)。引入宿主中时，该构建物在温度诱导型启动子的控制下能共同表达基因scrY和asf。通过三-亲代接合(如上所述)将该质粒转移入集胞蓝细菌PCC 6803中。检验转化的集胞蓝细菌PCC 6803蔗糖分泌的效率。随后对细长聚球蓝细菌PCC 7942作类似转化和检验。

实施例17：海藻糖累积性蓝细菌生成

大肠杆菌的编码海藻糖磷酸合酶和海藻糖磷酸磷酸酶的海藻糖生物合成基因(分别是otsA和otsB)发现在双基因操纵子otsBA(SEQ ID NO：115)中。利用寡核苷酸EcotsBA-F(SEQ ID NO：116)和EcotsBA-R(SEQ ID NO：117)，通过PCR扩增大肠杆菌K12基因组DNA来克隆该操纵子。用AflII和NheI消化PCR产物，将其克隆入pLybAL19(SEQ ID NO：48)中，从而替代大多数asf基因。新质粒pLybAL23(SEQ ID NO：118)将海藻糖生物合成基因置于温度诱导型λ_PR启动子的控制下。用寡核苷酸EcotsBAmidseq-F(SEQ ID NO：119)和EcotsBAmidseq-R(SEQ ID NO：120)测序这些基因以验证它们的完整性。然后通过将携带otsBA操纵子的pLybAL23的AflII(用T4DNA聚合酶填平)/NheI片段连接入用SacI(用T4DNA聚合酶填平)和NheI消化的pLybAL15、pLybAL17、pLybAL21和pLybAL22中，分别产生pLybAL28(SEQ ID NO：121)、pLybAL29(SEQ ID NO：122)、pLybAL30(SEQ ID NO：123)和pLybAL31(SEQ ID NO：124)，从而将otsBA操纵子的表达置于pyrR、psbAII、dnaK和kiaA启动子的控制下(如上所述)。

通过三-亲代接合将质粒pLybAL28(SEQ ID NO：121)、pLybAL29(SEQ ID NO：122)、pLybAL30(SEQ ID NO：123)和pLybAL31(SEQ ID NO：124)各自移入集胞蓝细菌PCC 6803中(如上所述)。

采用与其它启动子所述相同的方法，pLybAL23的otsBA操纵子的表达置于pLybAL16和pLybAL18中集胞蓝细菌PCC 6803和细长聚球蓝细菌PCC 7942nirA启动子(如上所述)的控制下，从而分别产生pLybAL36(SEQID NO：125)和pLybAL37(SEQ ID NO：126)。

实施例18：海藻糖测定

有必要通过离心分开生物量和培养液，经0.2微米滤器过滤从澄清培养液中除去残留的生物量。减压蒸发将培养液浓缩成残留物。将该浓缩的培养液溶解于1ml去离子水中，然后在海藻糖测定中取样10微升溶液。将离心收集的生物量转移至称重碟，加热至100℃以除去残留的水分。称重干生物量，然后将100mg样品溶解于1ml去离子水中。然后研磨该混合物，离心除去固体。用去离子水将澄清上清液的10微升样品稀释100倍，检验10微升稀释样品的海藻糖。

海藻糖测定利用可从生物生物视点公司获得的商品化提供的蔗糖测定试剂盒的改进方法。标准方法的改进之处是用海藻糖酶取代试剂盒提供的转化酶溶液。该试剂盒包括用海藻糖酶水解海藻糖以释放葡萄糖。该葡萄糖经葡萄糖氧化酶氧化以产生过氧化氢，过氧化氢在有着色指示剂存在下通过过氧化物酶作用检测。通过其在570nm处的特征性吸光度定量检测着色指示剂，从而得到样品中最初存在的葡萄糖浓度。

通过Gutierrez C，Ardourel M，Bremer E，Middendo rf A，Boos W，Ehmann U.Mol Gen Genet.1989年6月；217(2-3)：347-54所述的相似方法，从工程改造入质粒并转化入大肠杆菌宿主的重组大肠杆菌treA基因制备海藻糖酶(treA核酸SEQ ID NO：134编码海藻糖酶多肽SEQ ID NO：135)。从大肠杆菌K12克隆treA编码的周质海藻糖酶。用AflII/XbaI消化treA PCR产物(SEQ ID NO：127)，然后连接入类似消化的pLybCB6(含有组成型强大肠杆菌trp启动子的专有质粒)中，从而产生pLybAL24(SEQ ID NO：130)。通过寡核苷酸EctreAmidseq-F和EctreAmidseq-R测序分析插入物的完整性。

构建C-末端His6-标记的海藻糖酶。利用寡核苷酸EctreA-F2(SEQ IDNO：131)和EctreA-R2(SEQ ID NO：132)，通过PCR扩增该基因。然后用AflII/XbaI消化该PCR产物(SEQ ID NO：136)，随后连接入类似消化的pLybAL24中，从而产生pLybAL33(SEQ ID NO：133)。

周质海藻糖酶的组成型表达强对细胞有害，在37℃下导致强烈的生长缺陷。这可通过在30℃下培养细胞显著减轻。

该蛋白在携带质粒pLYBAL24(SEQ ID NO：130)的大肠杆菌BW25113中表达，所述大肠杆菌在含有卡那霉素的2xYT培养基中培养。该蛋白利用Trp启动子组成型产生并含有使该蛋白转运至周质的信号肽。发酵和生物量收获后，用在50mM Tris缓冲液pH 8中的2％v/v二氯甲烷处理经洗涤和重悬的细胞团，通过选择性周质释放纯化该酶。离心分离裂解液与细胞碎片，利用装有10,000道尔顿膜的Amicon超滤器浓缩作进一步加工。浓缩的裂解液可直接用于测定，或者可利用该酶C-末端上的工程改造6X多聚组氨酸标签(SEQ ID NO：137)，通过金属离子亲和层析进一步纯化该酶。

实施例19：固相海藻糖产生

固体复合织物覆盖的由基底泡沫(substrate foam)构成的亲水性泡沫用作培养基/水分储器(FA公司(Foamex Aquazone))，将该泡沫粘合于用作15cmx15cm见方生长表面的织物层(DuPont Sontara)。将该复合材料浸在70％乙醇水溶液中灭菌，然后悬挂在垂直生物反应器中，该生物反应器垂直悬挂以将溶液递送至复合材料的顶部。该溶液因重力渗滤过生长复合表面。将1升灭菌的去离子水以0.2毫升/分钟流过来除去灭菌的生长表面中的残留乙醇。将0.5升含10微克/毫升氯霉素的BG11A生长培养基以0.2毫升/分钟流过该复合材料以用培养基平衡该生长表面。

通过用质粒pLYBAL23转化的集胞蓝细菌PCC 6803的10ml 4天预培养物注满平衡的灭菌生长表面以接种该表面。温育30分钟后，将反应器转成垂直位置，开始发酵。用白色LED阵列的80微爱因斯坦光照射该反应器。利用与生物反应器相连的电阻加热装置(resistive heating device)将温度维持在28℃。用0.2微米过滤的空气以0.2升/分钟连续吹扫反应器，每6小时供应新鲜的培养基，用泵和经生长复合物的泡沫层重力渗滤，速度为0.2毫升/分钟，持续30分钟。反应器持续操作4-7天，在此期间，复合物的生长表面铺满了稠密的蓝细菌菌苔。最初的培养期后，将生物反应器的温度提高至40℃，在该温度再维持24小时。在升温期间，收集用过的培养基，经处理以作海藻糖测定。发酵结束时，用去离子水洗涤生长表面来收集生物量，可对其加工以便用于海藻糖测定。

产生的和保留在固体表面生长的生物量内的海藻糖量占温度诱导后从生物反应器中回收的生物量总干重的多达2.5重量％。温度诱导后，从培养基回收0.8重量％的干生物量当量海藻糖。

实施例20：海藻糖产生液相

在Bioflow反应器中制备1升无菌的BG11A培养基，向其中加入氯霉素至10微克/毫升的浓度。然后用5体积％的质粒pLYBAL23转化的集胞蓝细菌PCC 6803的4天预培养物接种该反应器。该反应器的运行条件如下：28℃，300RPM，0.2升/分钟的0.2微米过滤空气吹扫，利用荧光灯阵列的80微爱因斯坦光照射。培养维持4-7天，然后取200ml样品用于加工和海藻糖测定。然后将发酵温度升高至40℃，持续24小时。随后从生物反应器中取出200ml样品用于加工和海藻糖测定。

温度诱导后，干燥的生物量产生多达3重量％海藻糖，而相对于生物量，用过的培养基含有0.3重量％当量的海藻糖。

参考文献

就如同各出版物、专利、专利申请或其它参考文献专门而单独表明出于所有目的通过引用全文纳入本文的程度一样，本申请引用的所有出版物、专利、专利申请和其它参考文献出于所有目的通过引用全文纳入本文。本文引用参考文献不应理解为承认其是本发明的现有技术。

Claims (85)

1.一种培养光合微生物的光生物反应器，该光生物反应器包括：

非胶状的固体培养支持物，该支持物适于为在其表面的至少一部分上的光合微生物提供营养物和水分，其中当该表面的所述部分非水平定位时，该表面的所述部分的形状允许光合微生物与其粘附；以及

覆盖该培养支持物表面的至少所述部分的物理屏障，其中该物理屏障设置成允许接种该培养支持物表面的所述部分，形成并维持适于培养这种光合微生物和收获这种培养的光合微生物的环境。

2.如权利要求1所述的光生物反应器，其特征在于，在培养支持物表面的所述部分上还包括光合微生物。

3.如权利要求1或2所述的光生物反应器，其特征在于，培养支持物表面的所述部分能以每升当量至少约50克干生物量的密度培养光合微生物。

4.如权利要求1-3中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述培养支持物是柔性的。

5.如权利要求1-3中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述培养支持物包含一种或多种刚性材料。

6.如权利要求1-5中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述培养支持物包含至少两层，第一层毗连第二层，其中所述至少两层的材料是相同或不同的材料。

7.如权利要求6所述的光生物反应器，其特征在于，所述第一层包含高表面积生长材料，所述第二层包含可渗透型材料。

8.如权利要求1-7中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述培养支持物包含柔性连接的刚性部分，其中所述刚性部分由一种或多种刚性材料构成。

9.如权利要求1-8中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述物理屏障对于固体颗粒和液体至少是基本上不可渗透的，但不阻止气体或蒸气向和从培养支持物表面的所述部分附近的空间运输，也不阻止培养支持物表面的所述部分的光化射线。

10.如权利要求1-9中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述光生物反应器还包括位于培养支持物和物理屏障之间的光化射线源。

11.如权利要求1-9中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述物理屏障在培养支持物和光化射线源之间，其对于这种光化射线足够透明并具有足够的气体透过性从而光合微生物在培养期间能进行光合作用。

12.如权利要求1-11中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述物理屏障对水蒸气充分不渗透，从而润湿后所述培养支持物将保留足够的水分，因此光合微生物在培养期间能维持充分的水合。

13.如权利要求1-12中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述屏障设置成包含所述培养支持物和其上的任何光合微生物，以及设置成在光合微生物的至少部分培养期间可松脱地密封。

14.如权利要求1-13中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述光生物反应器包含单个培养支持物。

15.如权利要求1-13中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述光生物反应器包含多个培养支持物。

16.如权利要求1-15中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述物理屏障是柔性的。

17.如权利要求1-16中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述物理屏障还包含对于固体颗粒、液体、气体和蒸气至少基本上不可渗透的第一部分，和对于气体和蒸气可渗透，但对于固体颗粒和液体至少基本上不可渗透的第二部分。

18.如权利要求17所述的光生物反应器，其特征在于，所述屏障的第二部分的气体或蒸气交换率是至少约5葛尔莱秒到不超过约10,000葛尔莱秒。

19.如权利要求17所述的光生物反应器，其特征在于，所述屏障的第二部分包含选择性膜，该选择性膜含有烯烃纤维或聚乙烯纤维材料、聚四氟乙烯过滤介质、纤维素过滤材料、纤维玻璃过滤材料、聚酯过滤材料、聚丙烯酸酯过滤材料、聚砜膜或尼龙膜。

20.如权利要求17-19中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述第一部分对于光化射线至少是基本上透明的，且所述第二部分对于光化射线至少基本上不透明，所述第一和第二部分相对于彼此和培养支持物表面的至少所述部分的设置具有充足量的光化射线和气体交换从而支持光合微生物的光合作用。

21.如权利要求1-20中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述培养支持物包含织物。

22.如权利要求21所述的光生物反应器，其特征在于，所述织物由天然的、改性天然的、合成的纤维或它们的组合构成。

23.如权利要求21所述的光生物反应器，其特征在于，所述织物是纺织织物、编织织物、毡、交联纤维聚合物构成的筛网或它们的组合。

24.如权利要求22所述的光生物反应器，其特征在于：

天然纤维选自：棉花、羊毛、大麻纤维、树纤维、其它纤维素纤维和它们的组合；

改性天然纤维选自：硝酸纤维素、醋酸纤维素、磺酸纤维素、交联的淀粉和它们的组合；

合成纤维选自：聚酯、聚丙烯酸酯、聚胺、聚酰胺、聚砜和它们的组合。

25.如权利要求1-24中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述培养支持物包被有水分吸附聚合物。

26.如权利要求21-25中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述织物、织物的纤维或二者包被有水分吸附聚合物。

27.如权利要求25-26中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述水分吸附聚合物选自：琼脂、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚胺、聚乙二醇、改性淀粉和它们的组合。

28.如权利要求1-27中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述光生物反应器还在培养支持物上、其内或同时在其上和其内包含水、营养物或它们的组合。

29.如权利要求1-28中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述光生物反应器还包括一个或多个连接点以连接所述光生物反应器与一构件。

30.如权利要求1-29中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述固体培养支持物还包括一个或多个连接点以连接该培养支持物。

31.如权利要求1-30中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述光生物反应器还包括液体供应系统、营养物供应系统、气体供应系统和微生物供应系统中的至少一种。

32.如权利要求1-31中任一项所述的光生物反应器，其特征在于，所述光生物反应器还包含权利要求42-55中任一项所述的细胞，其中所述细胞粘附于所述固体培养支持物。

33.一种培养光合微生物的装置，包括：

至少一个权利要求1-32中任一项所述的光生物反应器；和

与所述至少一个光生物反应器相连的构件，该构件将所述至少一个光生物反应器的至少一个培养支持物非水平地定位。

34.如权利要求33所述的装置，其特征在于，所述至少一个光生物反应器悬挂在该构件上。

35.如权利要求33-34中任一项所述的装置，其特征在于，所述构件基本上被所述物理屏障覆盖。

36.如权利要求33-35中任一项所述的装置，其特征在于，所述构件包括传送系统或其组件，从而所述至少一个培养支持物能沿着该传送系统的路径传送。

37.如权利要求36所述的装置，其特征在于，所述装置还包括：

接种站，其在各培养支持物沿着传送系统的路径传送时可用光合微生物接种；

培养站，其在各培养支持物沿着传送系统的路径传送时培养各接种的培养支持物上的光合微生物；和

收获站，将培养支持物传送到此处，从而可自各培养支持物收获培养的光合微生物的至少一部分。

38.如权利要求37所述的装置，其特征在于，所述接种站和收获站基本上彼此毗连或者基本上是共存的。

39.如权利要求33-38中任一项所述的装置，其特征在于，所述装置还包括诱导站以诱导各培养支持物上的光合微生物合成可发酵糖。

40.如权利要求33-39中任一项所述的装置，其特征在于，所述装置还包括液体供应系统、营养物供应系统、气体供应系统或微生物供应系统中的至少一种。

41.如权利要求33-40中任一项所述的装置，其特征在于，所述装置还包含权利要求42-55中任一项所述的细胞，其中所述细胞粘附于所述固体培养支持物。

42.一种包含人工DNA构建物的转基因光合微生物细胞，所述构建物包含以5’到3’的转录方向操作性相连的以下组分：

在所述光合微生物细胞中起作用的启动子；

包含编码具有二糖生物合成活性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽选自二糖磷酸合酶或二糖磷酸磷酸酶；和

转录终止序列；

其中与不含DNA构建物的光合微生物细胞相比，所述转基因光合微生物细胞累积的二糖水平升高。

43.如权利要求42所述的细胞，其特征在于，所述细胞包含(i)含有第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的多核苷酸，所述第一核苷酸序列编码具有二糖磷酸合酶活性的多肽，而所述第二核苷酸序列编码具有二糖磷酸磷酸酶活性的多肽，或(ii)含有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码具有二糖磷酸合酶活性和二糖磷酸磷酸酶活性的多肽。

44.如权利要求42-43中任一项所述的细胞，其特征在于，包含编码具有二糖生物合成活性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸选自如下：

(a)包含编码选自如下的多肽的核苷酸序列的多核苷酸：

具有蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸酶(ASF)活性的SEQ ID NO：2或与其有95％相同的序列；

具有蔗糖磷酸合酶(SPS)活性的SEQ ID NO：4或与其有95％相同的序列；

具有蔗糖磷酸磷酸酶(SPP)活性的SEQ ID NO：6与其有95％相同的序列；

具有海藻糖磷酸合酶(TPS)活性的SEQ ID NO：77或与其有95％相同的序列；

具有海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)活性的SEQ ID NO：79或与其有95％相同的序列；

具有葡糖基甘油磷酸合酶(GPS)活性的SEQ ID NO：81或与其有95％相同的序列；

具有葡糖基甘油磷酸磷酸酶(GPP)活性的SEQ ID NO：83或与其有95％相同的序列；

具有甘露糖基果糖磷酸合酶(MPS)活性的SEQ ID NO：85或与其有95％相同的序列；和

具有甘露糖基果糖磷酸磷酸酶(MPP)活性的SEQ ID NO：87或与其有95％相同的序列；

(b)分离的多核苷酸，其包含：

编码蔗糖磷酸合酶/蔗糖磷酸磷酸酶(ASF)活性的SEQ ID NO：1或与其有95％相同的序列；

编码蔗糖磷酸合酶(SPS)活性的SEQ ID NO：3或与其有95％相同的序列；

编码蔗糖磷酸磷酸酶(SPP)活性的SEQ ID NO：5或与其有95％相同的序列；

编码海藻糖磷酸合酶(TPS)活性的SEQ ID NO：76或与其有95％相同的序列；

编码海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)活性的SEQ ID NO：78或与其有95％相同的序列；

编码葡糖基甘油磷酸合酶(GPS)活性的SEQ ID NO：80或与其有95％相同的序列；

编码葡糖基甘油磷酸磷酸酶(GPP)活性的SEQ ID NO：82或与其有95％相同的序列；

编码甘露糖基果糖磷酸合酶(MPS)活性的SEQ ID NO：84或与其有95％相同的序列；和

编码甘露糖基果糖磷酸磷酸酶(MPP)活性的SEQ ID NO：86或与其有95％相同的序列；

(c)在严格条件下与选自如下的核酸序列杂交的分离多核苷酸：

SEQ ID NO：1，其中该分离多核苷酸编码具有ASF活性的多肽；

SEQ ID NO：3，其中该分离多核苷酸编码具有SPS活性的多肽；

SEQ ID NO：5，其中该分离多核苷酸编码具有SPP活性的多肽；

SEQ ID NO：76，其中该分离多核苷酸编码具有TPS活性的多肽；

SEQ ID NO：78，其中该分离多核苷酸编码具有TPP活性的多肽；

SEQ ID NO：80，其中该分离多核苷酸编码具有GPS活性的多肽；

SEQ ID NO：82，其中该分离多核苷酸编码具有GPP活性的多肽；

SEQ ID NO：84，其中该分离多核苷酸编码具有MPS活性的多肽；

SEQ ID NO：86，其中该分离多核苷酸编码具有MPP活性的多肽；

其中所述严格条件包括65℃下，在包含6X SSC(0.9M氯化钠和0.09M柠檬酸钠)的溶液中温育；和

(d)与(a)、(b)或(c)所示多核苷酸序列互补的分离的多核苷酸。

45.如权利要求42-44中任一项所述的细胞，其特征在于，所述累积二糖的单体对于细胞是内源性的。

46.如权利要求42-45中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞是蓝细菌细胞、光合细菌或绿藻。

47.如权利要求42-46中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞是蓝细菌细胞。

48.如权利要求42-47中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞是选自聚球蓝细菌或集胞蓝细菌的蓝细菌。

49.如权利要求42-48中任一项所述的细胞，其特征在于，所述启动子是诱导型启动子。

50.如权利要求42-49中任一项所述的细胞，其特征在于，所述启动子选自：carB、nirA、psbAII、dnaK、kaiA和λ_PR。

51.如权利要求42-50中任一项所述的细胞，其特征在于，所述DNA构建物包含选自如下的核苷酸序列：SEQ ID NO：19(编码asf的pLybAL11)；SEQ ID NO：20(编码asf的pLybAL12)；SEQ ID NO：44(编码asf的pLybAL 15)；SEQ ID NO：45(编码asf的pLybAL 16)；SEQ ID NO：46(编码asf的pLybAL17)；SEQ ID NO：47(编码asf的pLybAL18)；SEQ ID NO：48(编码asf的pLybAL19)；SEQ ID NO：49(编码asf的pLybAL21)；SEQID NO：50(编码asf的pLybAL22)；SEQ ID NO：51(编码asf的pLybAL13f)；SEQ ID NO：52(编码asf的pLyAL13r)；SEQ ID NO：53(编码asf的pLybAL 14f)；SEQ ID NO：54(编码asf的pLybAL14r)；SEQ ID NO：65(编码asf的pLybAL7f)；SEQ ID NO：69(编码asf的pLybAL8f)；SEQ IDNO：118(编码tps和tpp的pLybAL23)；SEQ ID NO：121(编码tps和tpp的pLybAL28)；SEQ ID NO：122(编码tps和tpp的pLybAL29)；SEQ ID NO：123(编码tps和tpp的pLybAL30)；SEQ ID NO：124(编码tps和tpp的pLybAL31)；SEQ ID NO：125(编码tps和tpp的pLybAL36)；SEQ ID NO：126(编码tps和tpp的pLybAL37)；SEQ ID NO：130(编码tps和tpp的pLybAL24)；和SEQ ID NO：133(编码tps和tpp的pLybAL33)。

52.如权利要求42-51中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞累积至少约0.1微克二糖/分钟/克干生物量。

53.如权利要求42-52中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞累积至少约0.1微克二糖/分钟/克干生物量至多达约10微克二糖/分钟/克干生物量。

54.如权利要求42-53中任一项所述的细胞，其特征在于，至少满足以下一条：

所述细胞不包含选自如下的核苷酸序列：SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：74，或与它们有至少95％相同，且具有转化酶活性或蔗糖酶铁氧还蛋白活性的核苷酸变体；

所述细胞不表达选自如下的多肽序列：SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：75，或与它们有至少95％相同，且具有转化酶活性或蔗糖酶铁氧还蛋白活性的多肽变体；或

所述细胞表达对选自如下的核苷酸序列有特异性的小干扰RNA：SEQ IDNO：70、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：74，或与它们有至少95％相同，且具有转化酶活性或蔗糖酶铁氧还蛋白活性的核苷酸变体。

55.如权利要求42-54中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞还包含：

编码活性通道蛋白多肽的分离的多核苷酸，该多核苷酸包含SEQ ID NO：94或与其有95％相同的序列；

编码多肽的分离多核苷酸，该多肽包含SEQ ID NO：95或与其有95％相同的序列并具有通道蛋白活性；或

包含SEQ ID NO：91的分离多核苷酸(编码通道蛋白的pLybAL32)；

其中累积的二糖是蔗糖，所述细胞表达通道蛋白，且表达的通道蛋白将累积的蔗糖从细胞中分泌。

56.一种人工DNA构建物，其包含至少一条选自如下的序列：SEQ ID NO：19(编码asf的pLybAL11)；SEQ ID NO：20(编码asf的pLybAL12)；SEQID NO：44(编码asf的pLybAL15)；SEQ ID NO：45(编码asf的pLybAL16)；SEQ ID NO：46(编码asf的pLybAL17)；SEQ ID NO：47(编码asf的pLybAL18)；SEQ ID NO：48(编码asf的pLybAL19)；SEQ ID NO：49(编码asf的pLybAL21)；SEQ ID NO：50(编码asf的pLybAL22)；SEQ ID NO：51(编码asf的pLybAL13f)；SEQ ID NO：52(编码asf的pLyAL13r)；SEQID NO：53(编码asf的pLybAL14f)；SEQ ID NO：54(编码asf的pLybAL14r)；SEQ ID NO：65(编码asf的pLybAL7f)；SEQ ID NO：69(编码asf的pLybAL8f)；SEQ ID NO：118(编码tps和tpp的pLybAL23)；SEQID NO：121(编码tps和tpp的pLybAL28)；SEQ ID NO：122(编码tps和tpp的pLybAL29)；SEQ ID NO：123(编码tps和tpp的pLybAL30)；SEQ ID NO：124(编码tps和tpp的pLybAL31)；SEQ ID NO：125(编码tps和tpp的pLybAL36)；SEQ ID NO：126(编码tps和tpp的pLybAL37)；SEQ ID NO：130(编码tps和tpp的pLybAL24)；SEQ ID NO：133(编码tps和tpp的pLybAL33)；SEQ ID NO：91(编码通道蛋白的pLybAL32)；SEQ ID NO：102(编码SS-UPP的pLybAL3f)；SEQ ID NO：103(编码SE-UPP的pLybAL5f)；SEQ ID NO：106(编码SE-UPP的pLybAL4f)；SEQ ID NO：107(编码SE-UPP的pLybAL9f)；SEQ ID NO：109(编码SE-UPP的pLybAL6fb)；SEQ ID NO：110(编码SE-UPP的pLybAL10fb)；和SEQ ID NO：91(编码通道蛋白的pLybAL32)。

57.一种培养光合微生物的方法，所述方法利用权利要求1-41中任一项所述的光生物反应器或装置，所述方法包括：

用光合微生物接种培养支持物；

在接种的培养支持物上培养该光合微生物；和

从该培养支持物上收获至少一部分培养的光合微生物。

58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述方法还包括接种该培养支持物后密封该光生物反应器的物理屏障，从而在培养光合微生物的全部或实质性部分的同时密封该物理屏障。

59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述物理屏障可松脱地密封。

60.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将各培养支持物输送至接种站、培养站和收获站。

61.如权利要求57-60中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下的至少一种：为培养支持物供水；为培养支持物供应营养物；或为培养支持物供气。

62.如权利要求57-61中任一项所述的方法，其特征在于，所述光合微生物培养至每升当量至少约50克干生物量的密度。

63.如权利要求57-62中任一项所述的方法，其特征在于，所述光合微生物包含权利要求42-55中任一项所述的细胞。

64.一种产生可发酵糖的方法，所述方法利用权利要求1-41中任一项所述的光生物反应器或装置，所述方法包括：

用能累积可发酵糖的光合微生物接种培养支持物；

在接种的培养支持物上培养该光合微生物；

分离累积的可发酵糖。

65.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述可发酵糖在所述光合微生物内累积。

66.如权利要求64-65中任一项所述的方法，其特征在于，所述分离累积的可发酵糖包括：

从培养支持物上收获至少一部分培养的光合微生物；和

从收获物回收可发酵糖。

67.如权利要求64-66中任一项所述的方法，其特征在于，累积的可发酵糖从所述光合微生物分泌，并从培养基中分离。

68.如权利要求64-67中任一项所述的方法，其特征在于，分离累积的可发酵糖包括从培养基分离累积的可发酵糖。

69.如权利要求64-68中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在接种培养支持物后可松脱地密封该光生物反应器的物理屏障，从而在培养光合微生物的全部或实质性部分的同时密封该物理屏障。

70.如权利要求64-69中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下的至少一种：为培养支持物供应液体；为培养支持物供应营养物；或为培养支持物供气。

71.如权利要求64-70中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将培养支持物传送至接种站、培养站和收获站中的至少一个。

72.如权利要求64-71中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括诱导光合微生物合成可发酵糖。

73.如权利要求72所述的方法，其特征在于，诱导可发酵糖合成包括使光合微生物接触选自以下的诱导因素：温度、pH、代谢物、光、渗透剂、重金属和抗生素。

74.如权利要求72-73中任一项所述的方法，其特征在于，诱导可发酵糖合成包括用盐化合物处理所述光合微生物。

75.如权利要求74所述的方法，其特征在于，所述盐化合物是氯化钠。

76.如权利要求74-75中任一项所述的方法，其特征在于，所述盐化合物的添加浓度是约0.01mM-1.5M或约0.2-0.9M。

77.如权利要求73-76中任一项所述的方法，其特征在于，通过气溶胶喷雾将诱导剂施加于生长表面。

78.如权利要求64-77中任一项所述的方法，其特征在于，将所述光合微生物培养至每升当量至少约50克干生物量的密度。

79.如权利要求64-78中任一项所述的方法，其特征在于，所述可发酵糖包括选自如下的至少一种糖：葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、葡糖基甘油和甘露糖基果糖。

80.如权利要求64-79中任一项所述的方法，其特征在于，所述可发酵糖包括选自蔗糖或海藻糖的至少一种糖。

81.如权利要求64-81中任一项所述的方法，其特征在于，所述光合微生物包括天然光合微生物。

82.如权利要求64-81中任一项所述的方法，其特征在于，所述光合微生物包括遗传修饰的光合微生物。

83.如权利要求64-82中任一项所述的方法，其特征在于，所述光合微生物包括蓝细菌。

84.如权利要求64-83中任一项所述的方法，其特征在于，所述光合微生物包括选自聚球蓝细菌或集胞蓝细菌的蓝细菌。

85.如权利要求64-84中任一项所述的方法，其特征在于，所述光合微生物包含权利要求42-52中任一项所述的细胞。

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