JP2015180227A - トランスジェニック光合成微生物およびフォトバイオリアクター - Google Patents

トランスジェニック光合成微生物およびフォトバイオリアクター Download PDF

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Abstract

【課題】炭水化物を蓄積するように操作されたトランスジェニック細菌、及び、光合成微生物を培養するためのフォトバイオリアクターを提供する。
【解決手段】本明細書において、炭水化物、例えば二糖を蓄積するように操作されたトランスジェニック細菌が提供される。光合成微生物に栄養素および水分を提供するのに適した非ゼラチン質の固体培養担体ならびに前記培養担体の表面の少なくとも一部をおおう物理的バリアを含む、光合成微生物を培養するためのフォトバイオリアクターもまた提供される。フォトバイオリアクターを組み込んだ、光合成微生物の大規模連続培養のための装置および使用方法が開示されている。本発明のフォトバイオリアクターを用いる、光合成微生物からの発酵性糖の生産方法もまた開示されている。
【選択図】図１２

Description

関連出願の相互参照
本願は、米国仮特許出願第61/085,797号(出願日:2008年8月1日)および米国仮特許出願第61/018,798号(出願日:2008年1月3日)に基づく優先権を主張する(そのそれぞれは、参照により本願に組み込まれる)。
コンピュータ読み取り可能な形式で提出された資料の参照による組み込み
本開示の一部である配列表は、本発明のヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列を含むコンピュータ読み取り可能な形式および書面での配列表を含む。コンピュータ読み取り可能な形式で記録された配列表情報は、書面での配列表と同一である。配列表の対象物は、参照によりその全体が本願に組み込まれる。
技術分野
本発明は、一般に、トランスジェニック微生物ならびにその培養方法および培養装置に関する。
世界のエネルギー必要量の増加に取り組むために、化石燃料の使用の効率的で環境上適正な代替物が求められている。エタノールまたはバイオディーゼルなどの代替燃料は、植物バイオマスから生産できる。例えば、エタノール生産に用いられている現行プロセスの重要成分は発酵性糖と呼ばれている。ほとんどの場合、発酵性糖はスクロース、グルコースまたは高果糖コーンシロップの形態である。このようなバイオマスの生産のために現在栽培されている植物は、コーン、サトウキビ、ダイズ、カノーラ、ジャトロファなどを含む。しかしながら、発酵性糖の生産のために使用される植物バイオマスの多くは、大規模なエネルギー集約型の前処理を必要とする。さらにまた、このような植物バイオマスの使用は、土壌消耗、腐食および食料供給品の転用を引き起こす恐れがある。
シアノバクテリアの一部は、スクロースリン酸シンターゼおよびスクロースリン酸ホスファターゼの作用によってスクロースを生産することが知られ、これはもっぱら浸透圧保護剤として研究されてきた。耐塩性に関して、シアノバクテリアを3つのグループに分けることができる。低い耐性(700mM未満)を有する株は、スクロース(例えばシネココッカス・エロンガタス(Synechococcus elongatus)PCC 7942の場合)またはトレハロースとして知られる他の二糖のいずれかを合成する[Blumwald et al., Proc Natl Acd Sci USA (1983) 80:2599-2602 and Reed et al., FEMS Microbiol Rev (1986) 39:51-56]。中程度の耐塩性(0.7〜1.8mM)を有する株、例えばシネコシスチス(Synechocystis)種PCC 6803によりグルコシルグリセロールが生産される。高い耐塩性(〜2.5M)は、グリシンベタインまたはグルタミン酸ベタインのいずれかの蓄積の結果により生じる。しかしながら、Miaoら [FEMS Microbiol Lett (2003) 218:71-77]は、agp遺伝子の欠失によりグルコシルグリセロール生合成が阻害されるとき、シネコシスチス種PCC 6803は、その浸透圧保護剤としてスクロースを生産することを測定した。同様に、乾燥耐性シアノバクテリアは、マトリックス水ストレスに応じてスクロースおよびトレハロースを生産する[Hershkovitz et al., Appl Environ Microbiol (1991) 57:645-648]。
シネコシスチス種PCC 6803(ATCC 27184)およびシネココッカス・エロンガタスPCC 7942(ATCC 33912)は比較的よく研究されており、入手可能な遺伝子ツールがあり、それらのゲノム配列は既知である(例えば、Koksharova, O. A. and・Wolk, C. P. 2002. Appl Microbiol Biotechnol 58, 123-137; Ikeuchi1, M. and Satoshi Tabata, S. 2001. Photosynthesis Research 70, 73-83; Golden, S. S., Brusslan, J. and Haselkorn, R. 1987. Methods in Enzymology 153, 215-231; Friedberg, D. 1988. Methods in Enzymology 167, 736-747; Kaneko, T. et al. 1996. DNA Research 3, 109-136 を参照のこと)。
光合成微生物、例えば、スピルリナ・マキシマム(Spirulina maximum)、スピルリナ・プラテンシス(Spirulina platensis)、ドナリエラ・サリナ(Dunaliella salina)、ボトリオコックス・ブラウニイ(Botrycoccus braunii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ピレノイドーサ(Chlorella pyrenoidosa)、セレナストルム・カプリコミュータム(Serenastrum capricomutum)、セネデスムス・クアドリカウダ(Scenedesmus auadricauda)、ポルフィリディウム・クルエンタム(Porphyridium cruentum)、セネデスムス・アクタス(Scenedesmus acutus)、ドナリエラ(Dunaliella)種、セネデスムス・オブリカス(Scenedesmus obliquus)、アナベノプシス(Anabaenopsis)、アウロシラ(Aulosira)、キリンドロスペルムム(Cylindrospermum)、セネコッカス(Scenecoccus)種、セネシスティス(Scenecosystis)種およびトリポスリックス(Tolypothrix)の商業培養は、精製化学製品、医薬品、化粧品用顔料、脂肪酸、抗酸化剤、予防効果を有するタンパク質、増殖因子、抗生物質、ビタミンおよび多糖の生産を含む多数の用途に好ましい。藻類のバイオマスはまた、低用量で動物食品における抗生物質レベルの低下にまたはその代替として有用であることもでき、タンパク源として有用であることもできる。さらにまた、乾燥形態とは対照的に、湿潤形態で提供される藻類のバイオマスは、燃料の生産のために、培養または熱プロセスによって液化することができる。従って、このような生物の培養効率を上げる能力に大変興味が持たれる。
一般に、現行の光合成バイオリアクターは、バイオマスを生産するために、液相系における微生物の培養を必要とする。この系は、通例、開放型池型リアクターまたは密閉型タンク型リアクターである。しかしながら、密閉型バイオリアクターは、一般的には多くの点で池型リアクターよりも改善されていると考えられている。重要なことに、密閉系は、環境汚染に対するバリアを提供している。さらに、この系は、液体培地の温度およびガス含有量の良好な調節を可能にする。
それにもかかわらず、密閉型フォトバイオリアクターの使用は、光合成微生物の光要求性により限定される傾向がある(すなわち、化学線は、光合成微生物が二酸化炭素を固定して有機分子にするために必要なエネルギーを提供する)。従って、光合成微生物の十分な照射は、強固な必要条件である。それにもかかわらず、液相フォトバイオリアクターにおける細胞密度が増加するに従って、培地に達する光の能力は減少し、このことは、一般的には達成される細胞密度を限定する。さらに、微生物の好ましくない沈降を防ぐために、一般に、エネルギーの投入を必要とするプロセスである、液体培地のある種の撹拌を必要とする。
液相系における微生物に光をもたらす方法を発明するために、多数の試みがなされている。例えば、ある系は、透明な管を通して液体培地を循環させることを含む。他の試みは、放射線吸収を調節するために、培地内に光源を置くか、または培地に反射粒子を導入することを含む。これらの努力にもかかわらず、より高い細胞密度で液相系において微生物を培養する能力における顕著な増加はいまだに達成されていない。
前述の光要求性に加えて、液相フォトバイオリアクターの使用は、光合成のための十分な二酸化炭素を光合成微生物に供給することが負担となってきた。一般的には、これらの系は一般に、培地に溶存している二酸化炭素濃度を増加させるための、ある種のさらなる通気システムを組み込んでいる。通気の必要性を排除することにより、この系は著しく簡略化され、それにより操業費が抑えられると考えられる。
液相フォトバイオリアクターもまた、連続生産の常法には適切ではない傾向がある。一般に、大容量の液体の移動は複雑で厄介である。さらにまた、液相系は、通例循環、撹拌、通気などの仕組みを必要とするため、一般に、多数の小さな培養装置よりも、1個かまたは数個の大きな培養装置を操作するほうが、より簡単でより費用対効果が高い。従って、現在行われている方法は、比較的大規模なバッチの処理を含む(すなわち、光合成微生物のバッチを培養し、次いで得られる全バイオマスを収穫する)。
従って、当該技術分野において、光合成バイオリアクター設計における進歩が強く求められている。大容量の水または他の液体培地を用いず、十分な光および二酸化炭素を供給する前述の特別な手段を用いずに、合理的な費用で、比較的高密度の光合成微生物を効率的に培養し、収穫できる新しいタイプの光合成バイオリアクターを提供することは、当該技術分野での実質的進歩を意味し、産業および消費者が等しく利益を受けることになると考えられる。
本明細書において、炭水化物、例えば二糖を蓄積するように操作されたトランスジェニック細菌が提供される。光合成微生物に栄養素および水分を提供するのに適した非ゼラチン質の固体培養担体ならびに前記培養担体の表面の少なくとも一部をおおう物理的バリアを含む、光合成微生物を培養するためのフォトバイオリアクターもまた提供される。フォトバイオリアクターを組み込んだ、光合成微生物の大規模連続培養のための装置および使用方法が開示されている。本発明のフォトバイオリアクターを用いる、光合成微生物からの発酵性糖の生産方法もまた開示されている。
一側面は、光合成微生物を培養するためのフォトバイオリアクターを提供する。フォトバイオリアクターは、その表面の少なくとも一部の上にある光合成微生物に栄養素および水分を提供するのに適した非ゼラチン質の固体培養担体であって、前記表面の一部が非水平に向けられるとき、光合成微生物がそれに付着するのを可能にする形状（topography）を有する前記固体培養担体;ならびに、少なくとも前記培養担体の表面の一部をおおう物理的バリアであって、前記培養担体の表面の一部への接種、このような光合成微生物の培養に適した環境の形成および維持ならびにこのような培養した光合成微生物の収穫を可能にするように構成された前記物理的バリアを含む。
いくつかの実施形態において、フォトバイオリアクターは、前記培養担体の表面の一部の上にある光合成微生物を含む。いくつかの実施形態において、フォトバイオリアクターは、以下でより詳しく説明するが、二糖を蓄積するように操作された細胞であって、固体培養担体に付着した前記細胞をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記培養担体の表面の一部は、1リットル相当量当たり乾燥バイオマス少なくとも約50グラムの密度で光合成微生物を培養できる。
いくつかの実施形態において、培養担体は柔軟性（flexible）である。いくつかの実施形態において、培養担体は1以上の硬質材料を含む。いくつかの実施形態において、フォトバイオリアクターの培養担体は、少なくとも2つの層、すなわち第2層に隣接した第1層を含み、ここで少なくとも2つの層の材料は同一材料または異なる材料である。いくつかの実施形態において、第1層は高表面積の増殖材料を含み、第2層は透過型材料を含む。いくつかの実施形態において、フォトバイオリアクターの培養担体は、可撓的に連結された硬質部分であって、1以上の硬質材料で構成される前記硬質部分を含む。いくつかの実施形態において、フォトバイオリアクターは1つの培養担体を含む。いくつかの実施形態において、フォトバイオリアクターは複数の培養担体を含む。
いくつかの実施形態において、培養担体は布を含む。いくつかの実施形態において、布は天然繊維、改質天然繊維、合成繊維またはそれらの組み合わせで構成される。いくつかの実施形態において、布は織物、編物、フェルト、架橋繊維ポリマーのメッシュまたはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、天然繊維は、綿、羊毛、アサ、木繊維、他のセルロース系繊維およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、改質天然繊維は、ニトロセルロース、セルロースアセタート、セルローススルホナート、架橋デンプンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、合成繊維はポリエステル、ポリアクリラート、ポリアミン、ポリアミド、ポリスルホンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、培養担体は吸水性ポリマー（moisuture absorbent polymer）でコーティングされる。いくつかの実施形態において、布、布の繊維または両方は吸水性ポリマーでコーティングされる。いくつかの実施形態において、吸水性ポリマーは寒天、ポリアクリラート、ポリアミド、ポリアミン、ポリエチレングリコール、修飾デンプンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、フォトバイオリアクターの物理的バリアは、固体微粒子および液体に対して少なくとも実質的に不透過性であるが、前記培養担体の表面の一部に隣接する空間を往復するガスまたは蒸気の移動を妨げないばかりでなく、前記培養担体の表面の一部の化学線照射も妨げない。いくつかの実施形態において、湿らせた培養担体が十分な水分を保持するように、物理的バリアは水蒸気に対して十分に不透過性であり、それにより培養中に光合成微生物は適切に水和されたままである。いくつかの実施形態において、バリアは、光合成微生物の培養の少なくとも一部分において、培養担体およびその培養担体上の任意の光合成微生物を密閉し、かつ、取り外し可能（releasably）にシールされるように構成される。いくつかの実施形態において、物理的バリアは柔軟性である。いくつかの実施形態において、物理的バリアは、固体微粒子、液体、ガスおよび蒸気に対して少なくとも実質的に不透過性である第1の部分ならびに、ガスおよび蒸気に対して透過性であるが、固体微粒子および液体に対して少なくとも実質的に不透過性である第2の部分をさらに含む。いくつかの実施形態において、バリアの第2の部分は、少なくとも約5ガーレー秒から約10,000ガーレー秒以下までのガスまたは蒸気交換速度を有する。いくつかの実施形態において、バリアの第2の部分は、オレフィン繊維もしくはポリエチレン繊維材料、ポリテトラフルオロエチレン濾過媒体、セルロース系フィルター材料、ファイバーグラスフィルター材料、ポリエステルフィルター材料、ポリアクリラートフィルター材料、ポリスルホン膜またはナイロン膜を含む選択膜を含む。いくつかの実施形態において、第1の部分は化学線に対して少なくとも実質的に透過性であり、第2の部分は化学線に対して少なくとも実質的に透過性ではなく、第1および第2の部分の、互いに対する配置および少なくとも前記培養担体の表面の一部に対する配置は光合成微生物による光合成を維持するために十分な量の化学線およびガスが交換されるようなものである。
いくつかの実施形態において、フォトバイオリアクターは、培養担体と物理的バリアとの間に位置する化学線源をさらに含む。いくつかの実施形態において、物理的バリアは、培養担体と化学線源との間にあり、このような化学線に対し十分に透明であり、培養中に光合成微生物による光合成を可能にするために十分にガス透過性である。
いくつかの実施形態において、フォトバイオリアクターは、培養担体上、培養担体内または培養担体上および培養担体内に水、栄養素、またはそれらの組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態において、フォトバイオリアクターは、フォトバイオリアクターを構造物へ取り付けるための1以上の取り付け部分をさらに含む。いくつかの実施形態において、フォトバイオリアクターは、流体供給システム、栄養供給システム、ガス供給システムおよび微生物供給システムの少なくとも1つをさらに含む
他の側面は、光合成微生物を培養するための装置を提供する。前記装置は、前述の少なくとも1つのフォトバイオリアクターおよび少なくとも1つのフォトバイオリアクターの少なくとも1つの培養担体が非水平に向いた少なくとも1つのフォトバイオリアクターが取り付けられる構造物を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのフォトバイオリアクターは構造物から吊り下げられる。いくつかの実施形態において、構造物は物理的バリアによって実質的におおわれる。いくつかの実施形態において、構造物は、コンベヤシステムの経路に沿って少なくとも1つの培養担体を運搬することができるようにコンベヤシステムまたはその構成要素を含む。いくつかの実施形態において、装置は、以下の1つ、2つまたは3つ:各培養担体をコンベヤシステムの経路に沿って運搬しながら光合成微生物を接種できる接種ステーション;各培養担体をコンベヤシステムの経路に沿って運搬しながら、接種された各培養担体上の光合成微生物を培養するための培養ステーション;および培養した光合成微生物の少なくとも一部を各培養担体から収穫するために培養担体が運ばれる収穫ステーションをさらに含む。いくつかの実施形態において、接種ステーションおよび収穫ステーションは、実質的に互いに隣接しているかまたは実質的に同延である。いくつかの実施形態において、装置は、各培養担体上の光合成微生物による発酵性糖の合成を誘導するための誘導ステーションをさらに含む。いくつかの実施形態において、装置は、流体供給システム、栄養供給システム、ガス供給システムまたは微生物供給システムの少なくとも1つをさらに含む。いくつかの実施形態において、装置は、固体培養担体上に付着した光合成微生物をさらに含む。いくつかの実施形態において、装置は、以下でより詳しく説明するが、二糖を蓄積するように操作された細胞であって、固体培養担体に付着した前記細胞をさらに含む。
他の側面は、二糖を蓄積するように操作されたトランスジェニック光合成微生物細胞を提供する。トランスジェニック光合成微生物細胞は、転写の5'から3'の方向に作動可能に連結された構成要素として:光合成微生物細胞において機能するプロモーター;二糖リン酸シンターゼおよび二糖リン酸ホスファターゼからなる群から選択される、二糖生合成活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;ならびに転写終結配列;を含み、ここで前記トランスジェニック光合成微生物細胞は、前記DNA構築物を含まない光合成微生物細胞と比較して増加したレベルの二糖を蓄積する。
いくつかの実施形態において、トランスジェニック光合成微生物細胞は、二糖リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする第1ヌクレオチド配列および二糖リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする第2ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、二糖リン酸シンターゼ活性および二糖リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、二糖リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする第1ヌクレオチド配列;二糖リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする第2ヌクレオチド配列;ならびに二糖リン酸シンターゼ活性および二糖リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする第3ヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、トランスジェニック光合成微生物細胞のポリヌクレオチドは、(a)スクロースリン酸シンターゼおよびスクロースリン酸ホスファターゼ(ASF)活性を有する配列番号2またはそれに95%同一の配列;スクロースリン酸シンターゼ(SPS)活性を有する配列番号4またはそれに95%同一の配列;スクロースリン酸ホスファターゼ(SPP)活性を有する配列番号6またはそれに95%同一の配列;トレハロースリン酸シンターゼ(TPS)活性を有する配列番号77またはそれに95%同一の配列;トレハロースリン酸ホスファターゼ(TPP)活性を有する配列番号79またはそれに95%同一の配列;グルコシルグリセロールリン酸シンターゼ(GPS)活性を有する配列番号81またはそれに95%同一の配列;グルコシルグリセロールリン酸ホスファターゼ(GPP)活性を有する配列番号83またはそれに95%同一の配列;マンノシルフルクトースリン酸シンターゼ(MPS)活性を有する配列番号85またはそれに95%同一の配列;およびマンノシルフルクトースリン酸ホスファターゼ(MPP)活性を有する配列番号87またはそれに95%同一の配列;からなる群から選択されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
(b)スクロースリン酸シンターゼ/スクロースリン酸ホスファターゼ(ASF)活性をコードする配列番号1またはそれに95%同一の配列;スクロースリン酸シンターゼ(SPS)活性をコードする配列番号3またはそれに95%同一の配列;スクロースリン酸ホスファターゼ(SPP)活性をコードする配列番号5またはそれに95%同一の配列;トレハロースリン酸シンターゼ(TPS)活性をコードする配列番号76またはそれに95%同一の配列;トレハロースリン酸ホスファターゼ(TPP)活性をコードする配列番号78またはそれに95%同一の配列;グルコシルグリセロールリン酸シンターゼ(GPS)活性をコードする配列番号80またはそれに95%同一の配列;グルコシルグリセロールリン酸ホスファターゼ(GPP)活性をコードする配列番号82またはそれに95%同一の配列;マンノシルフルクトースリン酸シンターゼ(MPS)活性をコードする配列番号84またはそれに95%同一の配列;およびマンノシルフルクトースリン酸ホスファターゼ(MPP)活性をコードする配列番号86またはそれに95%同一の配列;を含む単離されたポリヌクレオチド;(c)単離されたポリヌクレオチドがASF活性を有するポリペプチドをコードする配列番号1;単離されたポリヌクレオチドがSPS活性を有するポリペプチドをコードする配列番号3;単離されたポリヌクレオチドがSPP活性を有するポリペプチドをコードする配列番号5;単離されたポリヌクレオチドがTPS活性を有するポリペプチドをコードする配列番号76;単離されたポリヌクレオチドがTPP活性を有するポリペプチドをコードする配列番号78;単離されたポリヌクレオチドがGPS活性を有するポリペプチドをコードする配列番号80;単離されたポリヌクレオチドがGPP活性を有するポリペプチドをコードする配列番号82;単離されたポリヌクレオチドがMPS活性を有するポリペプチドをコードする配列番号84;単離されたポリヌクレオチドがMPP活性を有するポリペプチドをコードする配列番号86;からなる群から選択される核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドであって、前記ストリンジェントな条件が6X SSC(0.9M塩化ナトリウムおよび0.09Mクエン酸ナトリウム)を含む溶液中65℃でのインキュベーションを含む前記単離されたポリヌクレオチド;ならびに(d)(a)、(b)または(c)のポリヌクレオチド配列に相補的な単離されたポリヌクレオチドからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、蓄積された二糖モノマーは細胞にとって内因性である。いくつかの実施形態において、蓄積された二糖のモノマー(単数または複数)は細胞にとって外因性であり、細胞にこのようなモノマー(単数または複数)の発現が操作される。
いくつかの実施形態において、細胞は、光合成細菌であるシアノバクテリア細胞;または緑藻である。いくつかの実施形態において、細胞はシアノバクテリア細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、シネココッカス(Synechococcus)およびシネコシスチスからなる群から選択されるシアノバクテリアである。
いくつかの実施形態において、プロモーターは誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、温度、pH、代謝物、光、浸透圧剤、重金属および抗生物質からなる群から選択される誘導剤で誘導できる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、carB、nirA、psbAII、dnaK、kaiAおよびλPRからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、細胞のDNA構築物は、配列番号19(asfをコードするpLybAL11);配列番号20(asfをコードするpLybAL12);配列番号44(asfをコードするpLybAL15);配列番号45(asfをコードするpLybAL16);配列番号46(asfをコードするpLybAL17);配列番号47(asfをコードするpLybAL18);配列番号48(asfをコードするpLybAL19);配列番号49(asfをコードするpLybAL21);配列番号50(asfをコードするpLybAL22);配列番号51(asfをコードするpLybAL13f);配列番号52(asfをコードするpLyAL13r);配列番号53(asfをコードするpLybAL14f);配列番号54(asfをコードするpLybAL14r);配列番号65(asfをコードするpLybAL7f);配列番号69(asfをコードするpLybAL8f);配列番号118(tpsおよびtppをコードするpLybAL23);配列番号121(tpsおよびtppをコードするpLybAL28);配列番号122(tpsおよびtppをコードするpLybAL29);配列番号123(tpsおよびtppをコードするpLybAL30);配列番号124(tpsおよびtppをコードするpLybAL31);配列番号125(tpsおよびtppをコードするpLybAL36);配列番号126(tpsおよびtppをコードするpLybAL37);配列番号130(tpsおよびtppをコードするpLybAL24);ならびに配列番号133(tpsおよびtppをコードするpLybAL33)からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、細胞は、1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり二糖を少なくとも約0.1マイクログラム蓄積する。いくつかの実施形態において、細胞は、1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり二糖を少なくとも約0.1マイクログラムから最大1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり二糖を約10マイクログラムまで蓄積する。
いくつかの実施形態において、配列番号70、配列番号72および配列番号74またはそれらに対する少なくとも95%の同一性およびインベルターゼ活性もしくはスクラーゼフェリドキシン(sucraseferridoxin)活性を有するそれらのヌクレオチドバリアントからなる群から選択されるヌクレオチド配列を細胞は含まない。いくつかの実施形態において、配列番号71、配列番号73および配列番号75またはそれらに対する少なくとも95%の同一性およびインベルターゼ活性もしくはスクラーゼフェリドキシン活性を有するそれらのポリペプチドバリアントからなる群から選択されるポリペプチド配列を細胞は発現しない。いくつかの実施形態において、配列番号70、配列番号72および配列番号74またはそれらに対する少なくとも95%の同一性およびインベルターゼ活性もしくはスクラーゼフェリドキシン活性を有するそれらのヌクレオチドバリアントからなる群から選択されるヌクレオチド配列に特異的な低分子干渉RNAを細胞は発現する。
いくつかの実施形態において、細胞は、活性ポリンポリペプチドをコードする配列番号94またはそれに95%同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチド;配列番号95またはそれに95%同一の配列を含みポリン活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド;または配列番号91(ポリンをコードするpLybAL32)を含む単離されたポリヌクレオチド;をさらに含み、ここで蓄積された二糖はスクロースであり、細胞はポリンを発現し、発現されたポリンは、蓄積されたスクロースを細胞から分泌させる。
他の側面は、人工DNA構築物を提供する。いくつかの実施形態において、人工DNA構築物は、配列番号19(asfをコードするpLybAL11);配列番号20(asfをコードするpLybAL12);配列番号44(asfをコードするpLybAL15);配列番号45(asfをコードするpLybAL16);配列番号46(asfをコードするpLybAL17);配列番号47(asfをコードするpLybAL18);配列番号48(asfをコードするpLybAL19);配列番号49(asfをコードするpLybAL21);配列番号50(asfをコードするpLybAL22);配列番号51(asfをコードするpLybAL13f);配列番号52(asfをコードするpLyAL13r);配列番号53(asfをコードするpLybAL14f);配列番号54(asfをコードするpLybAL14r);配列番号65(asfをコードするpLybAL7f);配列番号69(asfをコードするpLybAL8f);配列番号118(tpsおよびtppをコードするpLybAL23);配列番号121(tpsおよびtppをコードするpLybAL28);配列番号122(tpsおよびtppをコードするpLybAL29);配列番号123(tpsおよびtppをコードするpLybAL30);配列番号124(tpsおよびtppをコードするpLybAL31);配列番号125(tpsおよびtppをコードするpLybAL36);配列番号126(tpsおよびtppをコードするpLybAL37);配列番号130(tpsおよびtppをコードするpLybAL24);配列番号133(tpsおよびtppをコードするpLybAL33);配列番号91(ポリンをコードするpLybAL32);配列番号102(SS-UPPをコードするpLybAL3f);配列番号103(SE-UPPをコードするpLybAL5f);配列番号106(SE-UPPをコードするpLybAL4f);配列番号107(SE-UPPをコードするpLybAL9f);配列番号109(SE-UPPをコードするpLybAL6fb);配列番号110(SE-UPPをコードするpLybAL10fb);および配列番号91(ポリンをコードするpLybAL32)からなる群から選択される少なくとも1つの配列を含む。
他の側面は、光合成微生物の培養方法を提供する。光合成微生物の培養方法は、前述のフォトバイオリアクターまたは装置のいずれかを用いることができる。前記方法は、培養担体に光合成微生物を接種し;接種された培養担体で光合成微生物を培養し;培養担体から培養した光合成微生物の少なくとも一部を収穫することを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、物理的バリアがシールされている間、光合成微生物の培養の全部または実質的な部分が行われるように、培養担体の接種後にフォトバイオリアクターの物理的バリアをシールすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、物理的バリアは取り外し可能にシールされている。いくつかの実施形態において、前記方法は、接種ステーション、培養ステーションおよび収穫ステーションに各培養担体を運搬することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、培養担体に流体を供給すること;培養担体に栄養素を供給すること;または培養担体にガスを供給することの少なくとも1つをさらに含む。いくつかの実施形態において、光合成微生物は、1リットル相当量当たり乾燥バイオマス少なくとも約50グラムの密度まで培養される。いくつかの実施形態において、光合成微生物は、前述のように、二糖を蓄積するように操作されたトランスジェニック光合成微生物を含む。
他の側面は、発酵性糖の生産方法を提供する。発酵性糖の生産方法は、前述のフォトバイオリアクターまたは装置のいずれかを使用することができる。発酵性糖の生産方法は、発酵性糖を蓄積できる光合成微生物を培養担体に接種し;接種された培養担体で光合成微生物を培養し;蓄積された発酵性糖を単離することを含む。いくつかの実施形態において、発酵性糖は光合成微生物内に蓄積する。いくつかの実施形態において、蓄積された発酵性糖の単離は、培養担体からの、培養した光合成微生物の少なくとも一部を収穫し;収穫物からの発酵性糖を回収することを含む。いくつかの実施形態において、蓄積された発酵性糖は、光合成微生物から分泌され、培養培地から単離される。いくつかの実施形態において、蓄積された発酵性糖の単離は、培養培地からの蓄積された発酵性糖の単離を含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、物理的バリアがシールされている間、光合成微生物の培養の全部または実質的な部分が行われるように、培養担体の接種後にフォトバイオリアクターの物理的バリアを取り外し可能にシールすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、培養担体に流体を供給すること;培養担体に栄養素を供給すること;または培養担体にガスを供給することの少なくとも1つをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、接種ステーション、培養ステーションおよび収穫ステーションの少なくとも1つに各培養担体を運搬することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、光合成微生物による発酵性糖の合成の誘導をさらに含む。いくつかの実施形態において、発酵性糖の合成の誘導は、温度、pH、代謝物、光、浸透圧剤、重金属および抗生物質からなる群から選択される誘導剤に光合成微生物を暴露することを含む。いくつかの実施形態において、発酵性糖の合成の誘導は、光合成微生物を塩化合物で処理することを含む。いくつかの実施形態において、塩化合物は塩化ナトリウムである。いくつかの実施形態において、塩化合物は約0.01mM〜1.5Mまたは約0.2〜0.9Mの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、誘導剤はエアゾールスプレーによって増殖表面に塗布される。いくつかの実施形態において、光合成微生物は、1リットル相当量当たり乾燥バイオマス少なくとも約50グラムの密度まで培養される。いくつかの実施形態において、発酵性糖は、グルコース、フルクトース、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールおよびマンノシルフルクトースからなる群から選択される少なくとも1つの糖を含む。いくつかの実施形態において、発酵性糖はスクロースおよびトレハロースからなる群から選択される少なくとも1つの糖を含む。
いくつかの実施形態において、光合成微生物は天然に存在する光合成微生物を含む。いくつかの実施形態において、光合成微生物は遺伝子改変光合成微生物を含む。いくつかの実施形態において、光合成微生物はシアノバクテリアを含む。いくつかの実施形態において、光合成微生物は、シネココッカスまたはシネコシスチスからなる群から選択されるシアノバクテリアを含む。いくつかの実施形態において、光合成微生物は、前述のように、二糖を蓄積するように操作されたトランスジェニック光合成微生物を含む。
下文において、他の対象および特徴が部分的に明らかにされ、部分的に指摘される。
下記の図面が単に例示を目的としたものであることは、当業者には明らかであろう。これらの図面は、本教示の範囲をなんら限定するものではない。
固体培養担体、透明な外部保護バリア層、選択パネル、再シール可能なクロージャーおよび装置を吊り下げるための支持要素を含む、本発明のフォトバイオリアクターの正面図である。 固体培養担体、透明な外部保護バリア層、選択パネル、再シール可能なクロージャーおよび装置を吊り下げるための支持要素を含む、本発明のフォトバイオリアクターの側面図である。 フォトバイオリアクター農場を構成するための、共通の接種および収穫センターから放射状に外に広げられた複数の閉ループコンベヤシステムに沿った本発明の複数のフォトバイオリアクターまたは培養担体の配置を示す図である。 シアノバクテリアにおけるスクロースの光合成生産を示すイラストである。 シネコシスチス種PCC 6803(Ssp6803)スクロースリン酸シンターゼ(SPS)およびスクロースリン酸ホスファターゼ(SPP)タンパク質とシネココッカス・エロンガタスPCC 7942(Selo7942)活性融合SPS/SPP(ASF)とのポリペプチド配列のアラインメントである。Ssp6803は、SPSおよびSPP活性をコードする別々の遺伝子を含む。シネコシスチス種PCC 6803からのSPSタンパク質は、活性部位残基の多くが保存されていないので、おそらく不活性なSPPドメインを含む。カノニカルHAD加水分解酵素の活性部位残基をアラインメントの上部に示し、保存されたアミノ酸には下線を施し、保存されていない残基には二重下線を施した。シネコシスチス種PCC 6803SPSの不活性なSPPドメイン内の8つのアミノ酸挿入はイタリック体で印刷されている。方法論に関するさらなる詳細は、実施例4に示されている。 pLybAL11の概略図である。pLybAL11はシアノバクテリアDNAのライブラリーの構築およびプロモーター配列の選択を可能にする。プロモーターを含有しないasf遺伝子は、二方向性ターミネーターの後ろにあり、マルチクローニング部位(MCS)によって分離されている。oriVは、大部分のグラム陰性微生物におけるプラスミドの複製を可能にする。oriTは、pRK2013ヘルパープラスミドの助けにより、選択されたシアノバクテリア(または他の微生物)への大腸菌からのプラスミドの接合伝達を可能にする。大腸菌における選択のために、β-ラクタマーゼ遺伝子(bla)が存在している。シアノバクテリアゲノムDNAをMCSにクローニングすることによって、大腸菌内でDNAライブラリーを構築することができる。次いで、接合または直接形質転換によって、シアノバクテリアにプラスミドライブラリーを導入することができる。次いで、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(cat)の発現によるクロラムフェニコールに関する選択によって、活性プロモーターを単離することができる。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性に関するアッセイおよびスクロース生産の直接試験の両方によってプロモーターの強度を評価することができる。方法論に関するさらなる詳細は、実施例5に示されている。 pLybAL12の概略図である。pLybAL12は、asf発現を亢進するための、あらかじめ選択したプロモーターの能力の分析を可能にする。pLybAL12とpLybAL11の間の唯一の差異は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(cat)の前の活性プロモーターの存在である。PCRによって増幅されたシアノバクテリア染色体DNAから単離された特定のDNA配列をMCSにクローニングすることができる。大腸菌における選択のために、クロラムフェニコールおよびアンピシリンの両方を使用することができる。次いで、接合または直接形質転換によって、プラスミドライブラリーをシアノバクテリアに導入することができる。次いで、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(cat)の発現によるクロラムフェニコールに関する選択によって、プラスミドを含むシアノバクテリアを単離することができる。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性に関するアッセイおよびスクロース生産の直接試験の両方によってプロモーターの強度を評価することができる。方法論に関するさらなる詳細は、実施例5に示されている。 シアノバクテリアプロモーターライブラリーの構築を示すイラストである。方法論に関するさらなる詳細は、実施例8に示されている。 pSMART-LCKanを示す概略図である。方法論に関するさらなる詳細は、実施例8に示されている。 シネココッカス・エロンガタスPCC 7942asf内の可能なプロモーターを示す配列表である。シネココッカス・エロンガタスPCC 7942からのasf遺伝子を含む増幅されたPCR産物が示されている。これは、クロラムフェニコール耐性マーカーの上流にクローニングされた。スクロースリン酸シンターゼおよびスクロースリン酸ホスファターゼポリペプチド活性をコードするasf領域は、それぞれ一重下線および二重下線が施されている。全DNA配列領域はイタリック体で示され、上にラベルされている。StartおよびStopは、それぞれ開始コドンおよび終止コドンを示す。SDはシャイン・ダルガノ配列を示す。推定上のプロモーターの-35および-10領域は、グレーで強調表示されている。方法論に関するさらなる詳細は実施例8に示されている。 シアノバクテリアゲノムにおける遺伝子のマーカーレス欠失のための2ステッププロトコルを示す概略図である。この戦略は、使用されているシアノバクテリア株がそのupp遺伝子を欠失してしまっていることを仮定している。スクロース生合成遺伝子挿入の間に、upp遺伝子は欠失してしまっていると考えられる。欠失の標的とされた目的とする遺伝子を同定しなければならない。出発株は5-フルオロウラシルに耐性を示すが、カナマイシンに感受性を示す。カナマイシン耐性マーカーおよび活性uppを含むカセットの挿入によって遺伝子は完全にまたは部分的に欠失しており、その株はカナマイシンに耐性を示すようになるが、5-フルオロウラシルに感受性を示すようになる。次いで、uppおよびカナマイシン耐性マーカーを除去することができ、株は再度5-フルオロウラシルに耐性を示すようになるが、カナマイシンには感受性になる。方法論に関するさらなる詳細は、実施例12に示されている。 フォトバイオリアクター実施形態の概略図である。図12Aは正面図を示し、図12Bは側面図を示す。フォトバイオリアクターは、吊り下げ要素(6);培地供給(8);ガス供給(10);増殖表面(2);外部バリア層(7);クイックコネクタ;および産物収穫ライン(9)を含む。 1つの材料フォーマット(図13A)およびハイブリッド材料フォーマット(図13B)における増殖表面の概略図である。
発明の詳細な説明
本願は、発酵性糖蓄積光合成微生物、固相フォトリアクター装置およびそれぞれを用いる方法に関する。
発酵性糖蓄積光合成微生物においては、一般に光合成微生物に利用されず、従って培養したバイオマス中に蓄積されることができる二糖(例えば、スクロース、トレハロース)を生産することが好ましいと考えられる。いくつかの実施形態において、光合成微生物は、通常浸透圧ストレス経路に従って生産される二糖(例えば、スクロースまたはトレハロース)を合成するように遺伝子操作され、それにより、浸透圧ストレスの非存在下またはレベル低下において前記二糖が生産される。高等植物と比較して、光合成微生物の増殖は効率がよく、環境影響が少ないので、現行のバイオ燃料製造慣行と比較して、前記方法は持続可能性において重要な改良を提示する。好都合には、前述の二糖合成方法は、本発明のフォトバイオリアクター(単数または複数)内で行われるのに適合されてきた。
本明細書記載のフォトバイオリアクターは固体培養担体を用いる。好都合には、少なくとも一部分において、適切な光暴露を提供する困難さは軽減されている。フォトバイオリアクターにおける前述の固体培養担体を用いることにより、工業規模液相バイオリアクターの細胞密度を超える細胞密度(例えば、1リットル相当量当たり乾燥バイオマス200グラムを超える細胞密度)で光合成微生物を培養および増殖させることができる。さらに、本明細書記載のフォトバイオリアクターの種々の実施形態は、従来の工業規模液相フォトバイオリアクターと比較してより少ないエネルギーでより簡単に運転できる。
本明細書記載のフォトバイオリアクターの実施形態は、従来の液相フォトバイオリアクターと比較してさらなる利点を提供する。例えば、液体系は、一般的には、光合成微生物の増殖および光合成を維持するために、光合成微生物に適切な濃度/量の二酸化炭素を供給するための特別な装置を必要とする。対照的に、固体培養担体上で微生物を増殖させることによって、比較的簡単で金がかからない方法、例えば周囲の空気への暴露を用いて二酸化炭素を提供できる。さらなる二酸化炭素が所望される場合、例えば、培養担体の周囲の、またはそれに接触している大気(例えば、空気)に二酸化炭素を加えることにより容易に二酸化炭素を供給できる。他の利益は移動の容易さである。液相フォトバイオリアクターは、池(完全に不動である)またはかさのあるタンクまたは管の集合体である可能性がある。対照的に、種々の実施形態において、フォトバイオリアクターは平らで柔軟性であり、それによりそれまたはその多くを積み重ねる、巻き上げる、折りたたむ、および/または類似の方法で形成されて比較的容易に移動することができる。種々の実施形態において、フォトバイオリアクターはシステムから吊り下げられるように形成されることができ、それによりある場所から他の場所へフォトバイオリアクターの1以上のを容易に運送することが可能になる。この移動しやすさは、多数のフォトバイオリアクターの連続式での効率的な取り扱いおよび処理方法を工業規模で可能にするために利用することができる。
本願の一側面は、光合成微生物による発酵性糖供給原料の生産方法に関する。好ましくは、発酵性糖は発酵性二糖である。発酵性二糖の例は、限定するものではないが、スクロースおよびトレハロースを含む。発酵性糖は、一般に光合成微生物に利用されない二糖であることができる。例えば、トレハロースは、シアノバクテリアに一般に利用されず、従って、内因性代謝経路による実質的分解を受けずに、培養したバイオマス中に蓄積されることができる。発酵性糖は、光合成微生物に一般に利用される二糖であることができる。一次エネルギー源として用いられない二糖に関しては、内因性代謝経路の存在下であっても、多くの場合、二糖は十分な濃度まで蓄積されることができる。内因性分解経路が標的発酵性糖に特異的な場合、このような活性を低下させるかまたは除去するために光合成微生物を操作することができる。例えば、スクロースを蓄積するように操作されたシアノバクテリアは、スクロースインベルターゼ活性を低下させるかまたは除去するためにさらに操作されることができる。種々の実施形態において、浸透圧またはマトリックス水ストレスに応じて発酵性二糖を合成する光合成微生物株を用いることができる。他の実施形態において、浸透圧ストレスの非存在下またはレベル低下において、発酵性二糖を蓄積するように操作された光合成微生物トランスジェニック株がある。好都合には、前述の発酵性二糖合成方法は、本明細書記載のフォトバイオリアクターなしでも行われるように適合させることができる。
高等植物と比較して、光合成微生物の増殖は効率がよく、環境影響が少ないので、現行のバイオ燃料製造慣行と比較して、本明細書記載の組成物、装置および方法は、持続可能性において重要な改良を提示する。
光合成微生物
本明細書において、二糖を蓄積するように遺伝子操作された光合成微生物が提供される。光合成微生物は、例えば、シアノバクテリアなどの天然光合成微生物であることもでき、人工光合成細菌などの操作された光合成微生物であることもできる。蓄積された二糖の例は、限定するものではないが、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールおよびマンノシルフルクトースを含む。種々の実施形態において、所望の二糖の蓄積をもたらすために、宿主光合成微生物(例えば、シアノバクテリア)において、対応するリン酸化モノマーからの所望の二糖の生産に関与するタンパク質(単数または複数)をコードする1以上の遺伝子が操作される。いくつかの実施形態において、二糖を蓄積させるために、宿主光合成微生物の内因性経路が操作される。例えば、シアノバクテリアにおける浸透圧スクロース経路は、浸透圧ストレスの非存在下でスクロースを蓄積するように操作されることができる。いくつかの実施形態において、二糖を蓄積させるために、シアノバクテリアにおける外因性二糖経路が操作される。例えば、大腸菌(E.coli)由来の浸透圧トレハロース経路は、シアノバクテリアにおいてトレハロースを蓄積するように操作されることができる。
シンターゼおよびホスファターゼ
所望の二糖に対するシンターゼ活性およびホスファターゼ活性を有するように光合成微生物を形質転換することができる。例えば、シアノバクテリアは、スクロースリン酸シンターゼ活性およびスクロースリン酸ホスファターゼ活性を有するように操作されることができる。他の例として、シアノバクテリアは、トレハロースリン酸シンターゼ活性およびトレハロースリン酸ホスファターゼ活性を有するように操作されることができる。他の例として、シアノバクテリアは、グルコシルグリセロールリン酸シンターゼ活性およびグルコシルグリセロールリン酸ホスファターゼ活性を有するように操作されることができる。他の例として、シアノバクテリアは、マンノシルフルクトースリン酸シンターゼ活性およびマンノシルフルクトースリン酸ホスファターゼ活性を有するように操作されることができる。これらの活性は、他の光合成微生物においても同様に操作されることができると考えられる。
シンターゼ活性およびホスファターゼ活性は、シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つの遺伝子およびホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードするもう1つの遺伝子の各遺伝子を用いて、またはシンターゼ活性およびホスファターゼ活性の両方をコードする1つの遺伝子を用いて光合成微生物に操作されることができる。例えば、シンターゼ活性およびホスファターゼ活性は融合ポリペプチドに存在することができる。
所望の二糖の糖モノマーは、光合成微生物にとって内因性であることもでき、外因性であることもできる。所望の二糖の糖モノマーが内因性である場合、光合成微生物は増加したレベルのこのようなモノマーを生産するように操作されることができる。所望の二糖の糖モノマーが外因性である場合、光合成微生物はこのような外因性モノマーを生産するように操作されることができる。
光合成微生物は、ある発生状態の後に、あるいはその様に誘導された後に所望の二糖を継続的に合成し蓄積するように操作されることができる。二糖合成の誘導は、本明細書でさらに詳細に述べるように、コードされるシンターゼおよびホスファターゼと関連する誘導性プロモーターおよび誘導剤の作用に従うことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書記載の形質転換シアノバクテリアは、1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり二糖(例えば、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールまたはマンノシルフルクトース)少なくとも約0.1マイクログラムを蓄積することができる。いくつかの実施形態において、形質転換シアノバクテリアは、1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり二糖(例えば、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールまたはマンノシルフルクトース)少なくとも約0.1から最大約10マイクログラムまでを蓄積することができる。例えば、形質転換シアノバクテリアは、1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり少なくとも約0.2、少なくとも約0.3、少なくとも約0.4、少なくとも約0.5、少なくとも約0.6、少なくとも約0.7、少なくとも約0.8または少なくとも約0.9マイクログラムの二糖(例えば、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールまたはマンノシルフルクトース)を蓄積することができる。他の実施形態において、種々の形質転換光合成微生物は、同様な量の二糖を蓄積する。
種々の実施形態は、上記の所定の範囲の値で二糖(例えば、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールまたはマンノシルフルクトース)を蓄積すると考えられる。例えば、一部の形質転換シアノバクテリアは、1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり少なくとも約0.1から最大約0.9マイクログラムまでの二糖(例えば、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールまたはマンノシルフルクトース);1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり少なくとも約0.1から最大約0.8マイクログラムまでの二糖(例えば、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールまたはマンノシルフルクトース);1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり少なくとも約0.1から最大約0.7マイクログラムまでの二糖(例えば、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールまたはマンノシルフルクトース);などを蓄積することができる。同様に、一部の形質転換シアノバクテリアは、1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり少なくとも約0.2から最大約1.0マイクログラムまでの二糖(例えば、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールまたはマンノシルフルクトース);1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり少なくとも約0.3から最大約1.0マイクログラムまでの二糖(例えば、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールまたはマンノシルフルクトース);1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり少なくとも約0.4から最大約1.0マイクログラムまでの二糖(例えば、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールまたはマンノシルフルクトース);1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり少なくとも約0.5から最大約1.0マイクログラムまでの二糖(例えば、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールまたはマンノシルフルクトース);1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり少なくとも約0.6から最大約1.0マイクログラムまでの二糖(例えば、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールまたはマンノシルフルクトース);1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり少なくとも約0.7から最大約1.0マイクログラムまでの二糖(例えば、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールまたはマンノシルフルクトース);1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり少なくとも約0.8から最大約1.0マイクログラムまでの二糖(例えば、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールまたはマンノシルフルクトース);または1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり少なくとも約0.9から最大約1.0マイクログラムまでの二糖(例えば、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールまたはマンノシルフルクトース)を蓄積することができる。宿主細胞における糖蓄積のアッセイ方法は当業者に公知である(例えば、実施例10参照)。
宿主
二糖を蓄積するように遺伝子操作された宿主は、任意の光合成微生物であることができる。光合成微生物は、例えば、シアノバクテリアなどの天然光合成微生物であることもでき、人工光合成細菌などの操作された光合成微生物であることもできる。天然光合成微生物であるか、または操作して光合成微生物にすることができる典型的な微生物は、限定するものではないが、細菌;真菌;古細菌;原生生物;微小植物、例えば緑藻;ならびに動物、例えばプランクトン、プラナリアおよびアメーバを含む。天然に存在する光合成微生物の例は、限定するものではないが、スピルリナ・マキシマム、スピルリナ・プラテンシス、ドナリエラ・サリナ、ボトリオコックス・ブラウニイ、クロレラ・ブルガリス、クロレラ・ピレノイドーサ、セレナストルム・カプリコミュータム、セネデスムス・クアドリカウダ、ポルフィリディウム・クルエンタム、セネデスムス・アクタス、ドナリエラ種、セネデスムス・オブリカス、アナベノプシス、アウロシラ、キリンドロスペルムム、シネコッカス(Synechoccus)種、シネコシスチス種および/またはトリポスリックスを含む。
好ましくは、宿主光合成微生物はシアノバクテリアである。シアノバクテリア、別名藍藻は幅広い酸素発生型光合成独立栄養生物である。宿主シアノバクテリアは、藍色植物門(Cyanophyta)由来の任意の光合成微生物であることができる。宿主シアノバクテリアは、単細胞形態を有することもできるし、コロニー形態(例えば、フィラメント、シートまたはボール)を有することもできる。好ましくは、宿主シアノバクテリアは単細胞シアノバクテリアである。二糖を蓄積するように操作されることができるシアノバクテリアの例は、限定するものではないが、シネコシスチス、シネココッカス、サーモシネココッカス(Thermosynechococcus)、ノストック(Nostoc)、プロクロロコッカス(Prochlorococcu)、ミクロシスティス(Microcystis)、アナベナ(Anabaena)、スピルリナ(Spirulina)およびグロエオバクター(Gloeobacter)属を含む。好ましくは、宿主シアノバクテリアはシネコシスチス種またはシネココッカス種である。より好ましくは、宿主シアノバクテリアはシネココッカス・エロンガタスPCC 7942(ATCC33912)および/またはシネコシスチス種PCC 6803(ATCC27184)である。
スクロース
光合成微生物、例えばシアノバクテリアにおけるスクロースの生合成は、順次に作用するスクロースリン酸シンターゼ(sps)およびスクロースリン酸ホスファターゼ(spp)の2つの酵素活性の触媒作用によって達成できる(例えば、図4参照)。このよう活性は、浸透圧およびマトリックス水ストレスに対する順応としてシアノバクテリアの一部に存在する(例えば、Lunn, J. E. 2002. Plant Physiol 128, 1490-1500)。スクロースが蓄積されるように、これらの活性の一方または両方をシアノバクテリアに操作することができる。
スクロースを蓄積するように光合成微生物を操作するための特に興味がある遺伝子は、シネココッカス・エロンガタスPCC 7942からの活性融合SPS/SPP(asf)遺伝子である。asfは、spsおよびsppの両方の生合成機能を有する(例えば、実施例4)。いくつかの実施形態において、ASFをコードするヌクレオチド配列がその天然供給源(例えば、シネココッカス・エロンガタスPCC 7942)からクローニングされ、宿主シアノバクテリアに挿入される(例えば、実施例4〜9参照)。いくつかの実施形態において、形質転換宿主光合成微生物は、配列番号1のasfポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、光合成微生物は配列番号2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列asfで形質転換される。さらなる実施形態において、形質転換宿主光合成微生物は、配列番号1に対して少なくとも約80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列または、spsおよびspp活性を有し、配列番号2に対して少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。例として、シアノバクテリアなどの形質転換宿主光合成微生物は、配列番号1に対して少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、その形質転換宿主がASF、SPSおよび/もしくはSPP活性ならびに/またはスクロースの蓄積を示す前記ヌクレオチド配列を含むことができる。例として、形質転換宿主光合成微生物は、配列番号2に対して少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、その形質転換宿主がASF、SPSおよび/もしくはSPP活性ならびに/またはスクロースの蓄積を示す前記ヌクレオチド配列を含むことができる。他の例として、形質転換宿主光合成微生物は、配列番号1に対してストリンジェントな条件下で配列番号1の全長にわたってハイブリダイズし、活性融合SPS/SPP(ASF)ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。さらなる例として、形質転換宿主光合成微生物は、上記配列のいずれかに対する相補鎖を含むことができる。
いくつかの実施形態において、スクロースリン酸シンターゼ(sps)(例えば、sps遺伝子をコードする配列番号3およびSPSポリペプチドをコードする配列番号4参照)またはそのホモログが、形質転換光合成微生物において発現されるかまたは過剰発現されるように操作される。例えば、光合成微生物は、スクロースリン酸シンターゼを発現するように、配列番号3の配列を有するヌクレオチドで形質転換されることができる。他の例として、光合成微生物は、スクロースリン酸シンターゼを有するポリペプチドをコードする配列番号3に対して少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%の同一性パーセントを有するヌクレオチドで形質転換されることができる。他の例として、形質転換宿主光合成微生物は、配列番号4に対して少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、その形質転換宿主がSPS活性および/またはスクロースの蓄積を示す前記ヌクレオチド配列を含むことができる。
いくつかの実施形態において、スクロースリン酸ホスファターゼ(spp)(例えば、spp遺伝子をコードする配列番号5およびSPPポリペプチドをコードする配列番号6を参照のこと)またはそのホモログが、形質転換光合成微生物において発現されるかまたは過剰発現されるように操作される。例えば、シアノバクテリアなどの光合成微生物は、スクロースリン酸ホスファターゼを発現するように、配列番号5の配列を有するヌクレオチドで形質転換されることができる。他の例として、光合成微生物は、スクロースリン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号5に対して少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%同一性パーセントを有するヌクレオチドで形質転換されることができる。他の例として、形質転換宿主光合成微生物は、配列番号6に対して少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、その形質転換宿主がSPP活性および/またはスクロースの蓄積を示す前記ヌクレオチド配列を含むことができる。
いくつかの実施形態において、光合成微生物はASF、SPS、および/またはSPPの1以上を発現するように操作される。例えば、シアノバクテリアなどの光合成微生物は、ASFおよびSPS;ASFおよびSPP;SPSおよびSPP;またはASF、SPSおよびSPPを発現するように操作されることができる。
トレハロース
トレハロースの生合成は、順次に作用するトレハロースリン酸シンターゼ(tps)およびトレハロースリン酸ホスファターゼ(tpp)の2つの酵素活性の触媒作用により達成できる。
光合成微生物において、トレハロースが蓄積されるように、これらの活性の一方または両方が操作されることができる。トレハロースの生合成は、シアノバクテリアなどの一部の光合成微生物においては天然に生じない。
いくつかの実施形態において、トレハロースリン酸シンターゼ(tps)(例えば、tps遺伝子をコードする配列番号76およびTPSポリペプチドをコードする配列番号77を参照のこと)またはそのホモログが、形質転換光合成微生物において発現されるかまたは過剰発現されるように操作される。例えば、シアノバクテリアなどの光合成微生物は、トレハロースリン酸シンターゼを発現するように、配列番号76の配列を有するヌクレオチドで形質転換されることができる。他の例として、光合成微生物は、トレハロースリン酸シンターゼを有するポリペプチドをコードする配列番号76に対して少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%の同一性パーセントを有するヌクレオチドで形質転換されることができる。他の例として、形質転換宿主光合成微生物は、配列番号77に対して少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、その形質転換宿主がTPS活性および/またはトレハロースの蓄積を示す前記ヌクレオチド配列を含むことができる。
いくつかの実施形態において、トレハロースリン酸ホスファターゼ(tpp)(例えば、tpp遺伝子をコードする配列番号78およびTPPポリペプチドをコードする配列番号79を参照のこと)またはそのホモログが操作され、形質転換光合成微生物において発現されるかまたは過剰発現される。例えば、シアノバクテリアなどの光合成微生物は、トレハロースリン酸ホスファターゼを発現するように、配列番号78の配列を有するヌクレオチドで形質転換されることができる。他の例として、光合成微生物は、トレハロースリン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号78に対して少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%の同一性パーセントを有するヌクレオチドで形質転換されることができる。他の例として、形質転換宿主光合成微生物は、配列番号79に対して少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、その形質転換宿主がTPP活性および/またはトレハロースの蓄積を示す前記ヌクレオチド配列を含むことができる。
グルコシルグリセロール
いくつかの実施形態において、グルコシルグリセロールリン酸シンターゼ(gps)(例えば、gps遺伝子をコードする配列番号80およびGPSポリペプチドをコードする配列番号81を参照のこと)またはそのホモログが、形質転換光合成微生物において発現されるかまたは過剰発現されるように操作される。例えば、シアノバクテリアなどの光合成微生物は、グルコシルグリセロールリン酸シンターゼを発現するように、配列番号80の配列を有するヌクレオチドで形質転換されることができる。他の例として、光合成微生物は、グルコシルグリセロールリン酸シンターゼを有するポリペプチドをコードする配列番号80に対して、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%同一性パーセントを有するヌクレオチドで形質転換されることができる。他の例として、形質転換宿主光合成微生物は、配列番号81に対して少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、その形質転換宿主がGPS活性および/またはグルコシルグリセロールの蓄積を示す前記ヌクレオチド配列を含むことができる。
いくつかの実施形態において、グルコシルグリセロールリン酸ホスファターゼ(gpp)(例えば、gpp遺伝子をコードする配列番号82およびGPPポリペプチドをコードする配列番号83を参照のこと)またはそのホモログが、形質転換光合成微生物において発現されるかまたは過剰発現されるように操作される。例えば、シアノバクテリアなどの光合成微生物は、グルコシルグリセロールリン酸ホスファターゼを発現するように、配列番号82の配列を有するヌクレオチドで形質転換されることができる。他の例として、光合成微生物は、グルコシルグリセロールリン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号82に対して少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%同一性パーセントを有するヌクレオチドで形質転換されることができる。他の例として、形質転換宿主光合成微生物は、配列番号83に対して少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、その形質転換宿主がGPP活性および/またはグルコシルグリセロールの蓄積を示す前記ヌクレオチド配列を含むことができる。
マンノシルフルクトース
いくつかの実施形態において、マンノシルフルクトースリン酸シンターゼ(mps)(例えば、mps遺伝子をコードする配列番号84およびMPSポリペプチドをコードする配列番号85を参照のこと)またはそのホモログが、形質転換光合成微生物において発現されるかまたは過剰発現されるように操作される。例えば、シアノバクテリアなどの光合成微生物は、マンノシルフルクトースリン酸シンターゼを発現するように、配列番号84の配列を有するヌクレオチドで形質転換されることができる。他の例として、光合成微生物は、マンノシルフルクトースリン酸シンターゼを有するポリペプチドをコードする配列番号84に対して少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%の同一性パーセントを有するヌクレオチドで形質転換されることができる。他の例として、形質転換宿主光合成微生物は、配列番号85に対して少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、その形質転換宿主がMPS活性および/またはマンノシルフルクトースの蓄積を示す前記ヌクレオチド配列を含むことができる。
いくつかの実施形態において、マンノシルフルクトースリン酸ホスファターゼ(mpp)(例えば、mpp遺伝子をコードする配列番号86およびMPPポリペプチドをコードする配列番号87を参照のこと)またはそのホモログが、形質転換光合成微生物において発現されるかまたは過剰発現されるように操作される。例えば、シアノバクテリアなどの光合成微生物は、マンノシルフルクトースリン酸ホスファターゼを発現するように、配列番号86の配列を有するヌクレオチドで形質転換されることができる。他の例として、光合成微生物は、マンノシルフルクトースリン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号86に対して少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%同一性パーセントを有するヌクレオチドで形質転換されることができる。他の例として、形質転換宿主光合成微生物は、配列番号87に対して少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、その形質転換宿主がMPP活性および/またはマンノシルフルクトースの蓄積を示す前記ヌクレオチド配列を含むことができる。
分子工学
バリアントヌクレオチドの設計、作成および試験ならびに、asf配列に対する上記の所望される同一性パーセントを有し、発現タンパク質の所望される活性および/または糖蓄積表現型を保持する、バリアントヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、当業者の技術の範囲内である。例えば、進化分子工学(directed evolution)および変異体の迅速な単離は、限定するものではないが、Link et al. (2007) Nature Reviews 5(9), 680-688; Sanger et al. (1991) Gene 97(1), 119-123; Ghadessy et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98(8) 4552-4557を含む参考文献に記載されている方法に従うことができる。このように、当業者は、例えば本明細書記載の参照配列に対して少なくとも95〜99%の同一性を有する多数のヌクレオチド(例えば、asf、sps、spp、tps、tpp、gps、gpp、mps、もしくはmpp)および/またはポリペプチド(例えば、ASF、SPS、SPP、TPS、TPP、GPS、GPP、MPSもしくはMPP)バリアントを作成し、当該技術分野でルーチンな方法に従って、二糖蓄積を含む表現型に関してこれらをスクリーニングすることができる。一般に、所望される活性が保持される限りは、任意の位置で同類置換を行うことができる。
ヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列の同一性パーセント(%)は、2つの配列がアラインメントされるとき、参照配列と比較して、候補配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸残基と同一なヌクレオチドまたはアミノ酸残基の百分率として理解される。同一性パーセントを決定するために、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを挿入して最大配列同一性パーセントを得る。同一性パーセントを決定するための配列のアラインメント手順は当業者に公知である。多くの場合、配列をアラインメントするために、BLAST、BLAST2、ALIGN2またはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなどの公表されているコンピュータソフトウェアが用いられる。当業者は、比較される配列の完全長に関する最大アラインメントを得るために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。配列がアラインメントされる場合、所定の配列Bへの、との、またはに対する所定の配列Aの配列同一性パーセント(所定の配列Bへの、との、またはに対して特定の配列同一性パーセントを有するまたは含む所定の配列Aと言い換えることもできる)は、以下で算出できる:
配列同一性パーセント=X/Y100
(式中、Xは、AとBとの、配列のアラインメントプログラムまたはアルゴリズムのアラインメントにより一致としてスコアされる残基数であり、YはBにおける残基総数である)。配列Aの長さが配列Bの長さと等しくない場合、Bに対するAの配列同一性パーセントは、Aに対するBの配列同一性パーセントとは等しくない。
“高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”は、6X SSC緩衝液(すなわち、0.9M塩化ナトリウムおよび0.09Mクエン酸ナトリウム)における65℃でのハイブリダイゼーションと定義される。これらの条件が与えられれば、2つの配列間の二本鎖DNAの融解温度(Tm)を算出することにより、所定の配列の組がハイブリダイズするかどうかについて決定できる。特定の二本鎖が、6X SSCの塩条件下で65℃よりも低い融解温度を有する場合、これらの2つの配列はハイブリダイズしない。他方では、同じ塩条件下で融解温度が65℃より上の場合、これらの配列はハイブリダイズする。一般に、任意のハイブリダイズしたDNA:DNA配列の融解温度は、次式:
Tm=81.5℃+16.6(log10[Na+])+0.41(G/C含量分数)-0.63(%ホルムアミド)-(600/l)
を用いて決定できる。さらにまた、DNA:DNAハイブリッドのTmは、ヌクレオチドの同一性が1%減少するごとに1〜1.5℃減少する(例えば、Sambrook and Russel, 2006 を参照のこと)。
宿主細胞は、当業者に公知の種々の標準法を用いて形質転換されることができる(例えば、Sambrook and Russel (2006) Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879697717; Ausubel et al. (2002) Short Protocols in Molecular Biology, 5th ed., Current Protocols, ISBN-10: 0471250929; Sambrook and Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879695773; Elhai, J. and Wolk, C. P. 1988. Methods in Enzymology 167, 747-754 を参照のこと)。このような技術は、限定するものではないが、ウイルス感染、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、マイクロプロジェクタイル送達、受容体媒介性取り込み、細胞融合、エレクトロポレーションなどを含む。トランスフェクトされた細胞を選択し、増殖させて、宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれた発現ベクターを含む組換え宿主細胞を得ることができる。
プロモーター
上記したヌクレオチド配列(例えば、asf、sps、spp、tps、tpp、mps、mpp、gps、gpp)の1以上は、宿主光合成微生物において機能しうるプロモーターに作動可能に連結されることができる。宿主がシアノバクテリアの場合、プロモーターは、シアノバクテリアおよび細菌(大腸菌など)の両方において効率的に機能しうることが好ましい。プロモーターの選択により、種々の条件下で所望の遺伝子産物を発現させることが可能になる。
プロモーターは、ベクター構築物が挿入されるシアノバクテリアなどの光合成微生物宿主細胞において最適の機能を発揮するように選択されることができる。プロモーターは、その制御的特徴に基づいて選択されることもできる。このような特徴の例は、転写活性および誘導能の増強を含む。
プロモーターは、誘導性プロモーターであることができる。例えば、プロモーターは、温度、pH、ホルモン、代謝物(例えば、ラクトース、マンニトールおよびアミノ酸)、光(例えば、波長特異的)、浸透ポテンシャル(例えば、塩誘導)、重金属または抗生物質によって誘導されることができる。多数の標準的誘導性プロモーターが当業者に公知であろう。
いくつかの実施形態において、プロモーターは温度誘導性プロモーターである。例えば、λプロモーターは、シアノバクテリアにおいて機能しうる温度誘導性プロモーターである。驚くべきことに、λプロモーターは、大腸菌内で用いられるときとは異なる温度で機能する。大腸菌内では、λプロモーターは42℃において最も活性が高く、これはシアノバクテリアの通常の生存範囲以上の温度である。一般に、大腸菌内で、λプロモーターは、約30℃から35℃までで約5%〜10%の発現増加をしめし、約37℃においては約20%発現増加を示すが;約37℃から42℃までで約100%の発現増加を示す。シアノバクテリアにおいては、λプロモーターはおよそ30℃〜35℃で最も活性が高く、これはシアノバクテリアの理想的な増殖温度範囲であり、大腸菌内でのλプロモーターの最適発現よりもずっと低い範囲である。従って、λプロモーターは、シアノバクテリアにおいて二糖生合成活性の効果的な発現を提供する。
プラスミドに挿入されることができるプロモーターの例は、限定するものではないが、carB、nirA、psbAII、dnaK、kaiAおよびλPRを含む(例えば、実施例6参照)。いくつかの実施形態において、プロモーターは、シアノバクテリアおよび大腸菌の両方において効率的に機能しうる。いくつかの実施形態において、asfコード領域は、前記コード領域を含むプロモーターを含む(例えば、実施例8参照)。例えば、asfコード領域は、asfのSPPドメインの前にプロモーターを含むことができる(例えば、図10参照)。このような内部プロモーターは、asfコード領域の開始部位でのプロモーターの有り無しで存在しうる。
用語"キメラ"は、2以上の異なるポリヌクレオチド分子の部分の融合の産物を指すものと解される。"キメラプロモーター"は、既知のプロモーターまたは他のポリヌクレオチド分子の操作により製造されるプロモーターを指すものと解される。このようなキメラプロモーターは、例えば、第1プロモーターからの異種エンハンサードメインを、それ自身の部分的または完全な調節因子を有する第2プロモーターと融合させることにより、1以上のプロモーターまたは調節因子からの、遺伝子発現を付与または調節できるエンハンサードメインを結合することができる。従って、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現を調節するための、本明細書に開示された方法によるキメラプロモーターの設計、構築および使用は本発明に含まれる。
多くの方法によって、新規キメラプロモーターを設計することもできるし、操作することもできる。例えば、キメラプロモーターは、第1プロモーターからのエンハンサードメインを第2プロモーターに融合することにより製造できる。得られたキメラプロモーターは、第1または第2プロモーターに対して新規な発現特性を有することができる。新規キメラプロモーターは、第1プロモーターからのエンハンサードメインが、第2プロモーターに対して5'末端部位、3'末端部位または任意の内部位置で融合されるように構築されることができる。
構築物
前述の転写可能なポリヌクレオチド分子配列のいずれも構築物で提供できる。本発明の構築物は、一般に、二糖生合成のための、転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結された、シアノバクテリアなどの宿主光合成微生物におけるプロモーター配列(例えば、asf、sps、spp、tps、tpp、mps、mpp、gps、gpp)、例えば配列番号1、3、5、76、78、80、82、84および86ならびに上記のようなそれらのバリアントを含む。
典型的なプロモーターは上述した。1以上のさらなるプロモーターもまた組換え構築物で提供できる。これらのプロモーターは、前述の転写可能なポリヌクレオチド分子配列のいずれかに作動可能に連結されることができる。
用語"構築物"は、任意の供給源由来の、ゲノム組み込みまたは自律複製できる、1以上のポリヌクレオチド分子が機能的に連結された、すなわち作動可能に連結されたポリヌクレオチド分子を含む任意の組換えポリヌクレオチド分子、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス、自律的に複製するポリヌクレオチド分子、ファージまたは線状もしくは環状の一本鎖もしくは二本鎖のDNAもしくはRNAポリヌクレオチド分子を指すものと解される。用語"ベクター"または"ベクター構築物"は、形質転換、すなわちシアノバクテリアなどの宿主光合成微生物への異種DNA導入の目的で使用できる任意の組換えポリヌクレオチド構築物を指すものと解される。
さらに、構築物は、限定するものではないが、目的とする遺伝子の非翻訳領域からのさらなるポリヌクレオチド分子を含むことができる。これらのさらなるポリヌクレオチド分子は、構築物に存在する他の配列に対して天然または異種の供給源由来であることができる。
プラスミド
いくつかの実施形態において、シアノバクテリアなどの宿主光合成微生物は、プラスミドベースの発現系で形質転換される(例えば、実施例5参照)。好ましくは、目的とする遺伝子をコードするプラスミドは、プロモーター、例えば上記のプロモーターの1以上を含む。プラスミドベースの形質転換については、大腸菌およびシアノバクテリアに両方において機能しうる広い宿主域のプラスミドが好ましく、それらは、よく理解された急速に増殖する便利な系(大腸菌)で働き、最終宿主(シアノバクテリア)に効率的に導入されることができる利点を提供する。いくつかの実施形態において、プラスミドベースの形質転換および染色体組み込みは組み合わせて用いられる。ここでは、遺伝子バリアントの設計および試験のためにプラスミドプロトコルが用いられ、次に、同定されたバリアントの染色体組み込みが行われる。
本明細書記載のアプローチに従って開発された宿主株は、当該技術分野で公知の多くの手段で評価できる(例えば、Studier (2005) Protein Expr Purif. 41(1), 207-234; Gellissen, ed. (2005) Production of Recombinant Proteins: Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems, Wiley-VCH, ISBN-10: 3527310363; Baneyx (2004) Protein Expression Technologies, Taylor & Francis, ISBN-10: 0954523253 を参照のこと)。
本明細書において、sps、sppおよび/またはasfをコードするプラスミド構築物のためのヌクレオチド配列が提供される。sps、sppおよび/またはasfをコードするプラスミド構築物の例は、限定するものではないが、pLybAL11(配列番号19)(例えば、図6参照)およびpLybAL12(配列番号20)(例えば、図7参照)を含む。本明細書において、tpsおよびtppをコードするプラスミド構築物のためのヌクレオチド配列もまた提供される。tpsおよびtppをコードするプラスミド構築物の例は、限定するものではないが、pLybAL23(配列番号118)を含む。グルコシルグリセロールおよびマンノシルフルクトースなどの他の二糖の蓄積に必要な生合成遺伝子のための同様な構築物を作成できることは、当業者には明らかであろう。
いくつかの実施形態において、形質転換宿主光合成微生物は、pLybAL11(配列番号19)またはpLybAL12(配列番号20)を含む。いくつかの実施形態において、形質転換宿主光合成微生物はpLybAL23(配列番号118)を含む。例えば、形質転換シアノバクテリアは、pLybAL11(配列番号19)、pLybAL12(配列番号20)またはpLybAL23(配列番号118)を含むことができる。
二糖生合成遺伝子(単数または複数)を含むプラスミド構築物は、プロモーターを含むこともできる。プラスミド構築物の例は、sps、sppおよび/またはasfを含み、プロモーターは、限定するものではないが、pLybAL7f(配列番号65);pLybAL8f(カナマイシン耐性を含む)(配列番号69);pLybAL13f(配列番号51)、pLyAL13r(配列番号52)、pLybAL14f(配列番号53)、pLybAL14r(配列番号54)、pLybAL15(配列番号44)、pLybAL16(配列番号45)、pLybAL17(配列番号46)、pLybAL18(配列番号47)、pLybAL19(配列番号48)、pLybAL21(配列番号49)およびpLybAL22(配列番号50)を含む。プラスミド構築物の例は、tpsおよびtppを含み、プロモーターは、限定するものではないが、pLybAL23(配列番号118)、pLybAL28(配列番号121)、pLybAL29(配列番号122)およびpLybAL30(配列番号123)を含む。グルコシルグリセロールおよびマンノシルフルクトースなどの他の二糖の蓄積に必要な、同様なプロモーターを含む生合成遺伝子のための構築物を作成できることは、当業者には明らかであろう。
いくつかの実施形態において、形質転換宿主シアノバクテリアは、pLybAL7f(配列番号65);pLybAL8f(配列番号69);pLybAL13f(配列番号51)、pLyAL13r(配列番号52)、pLybAL14f(配列番号53)、pLybAL14r(配列番号54)、pLybAL15(配列番号44)、pLybAL16(配列番号45)、pLybAL17(配列番号46)、pLybAL18(配列番号47)、pLybAL19(配列番号48)、pLybAL21(配列番号49)およびpLybAL22(配列番号50)を含む。いくつかの実施形態において、形質転換宿主シアノバクテリアは、pLybAL28(配列番号121)、pLybAL29(配列番号122)、pLybAL30(配列番号123)およびpLybAL23(配列番号118)を含む。
糖分泌
種々の実施形態において、形質転換二糖蓄積光合成微生物は、蓄積された二糖を細胞内からその増殖環境に分泌することができる。二糖の分泌は、二糖を蓄積するように形質転換した光合成微生物の固有の結果であることもできるし、光合成微生物は分泌するするようにさらに操作されることもできる。例えば、トレハロースを蓄積するように形質転換されたいくつかのシアノバクテリアは、本来細胞からトレハロースを分泌する。(例えば、実施例19〜20参照)。他の例として、スクロースを蓄積するように形質転換されたシアノバクテリアは、細胞からスクロースを分泌するようにさらに操作されることができる(例えば、実施例16参照)。
シアノバクテリアなどの宿主光合成微生物は、二糖を分泌するようにさらに操作されることができる。いくつかの実施形態において、形質転換宿主光合成微生物は、操作されて、蓄積された二糖に特異的なポリンを発現する。例えば、スクロースを蓄積するように操作されたシアノバクテリアは、スクロースポリンを発現するように操作されることができる(例えば、実施例16参照)。一実施形態において、形質転換二糖蓄積シアノバクテリアは、配列番号94などのscrY核酸を含む。一実施形態において、形質転換二糖蓄積シアノバクテリアは、配列番号95などのscrYポリペプチドをコードする核酸を含む。一実施形態において、形質転換二糖蓄積シアノバクテリアは、pLybAL32(配列番号91)などのscrYを含むプラスミドを含む。他の光合成微生物または他の標的二糖に、同様なアプローチを適用できることが考えられる。
糖分解の調節
いくつかの実施形態において、シアノバクテリアなどの宿主光合成微生物は、分解活性の調節により二糖の生産が改善されるようにさらに操作される(例えば、実施例14参照)。
いくつかの実施形態において、形質転換光合成微生物において、インベルターゼホモログはダウンレギュレートされるかまたは除去されることができる。例えば、シネコシスチス種PCC 6803(ヌクレオチド配列配列番号70;ポリペプチド配列配列番号71)からのインベルターゼホモログは、形質転換シアノバクテリアにおいてダウンレギュレートされるかまたは除去されることができる。他の例として、シネココッカス・エロンガタスPCC 7942(ヌクレオチド配列配列番号72;ポリペプチド配列配列番号73)からのインベルターゼホモログは、形質転換シアノバクテリアにおいてダウンレギュレートされるか除去されることができる。いくつかの実施形態において、スクラーゼフェレドキシン様タンパク質は、形質転換シアノバクテリアにおいてダウンレギュレートされるかまたは除去されることができる。例えば、シネコシスチス種PCC 6803からのスクラーゼフェレドキシン様タンパク質(ヌクレオチド配列配列番号74;ポリペプチド配列配列番号75)(Machray G.C. et al. 1994. FEBS Lett 354, 123-127)は、形質転換シアノバクテリアにおいて、ダウンレギュレートされるかまたは除去されることができる。これらの遺伝子は、例えば、図11(例えば、実施例12〜13参照)に記載のマーカーレス欠失プロトコルを用いて欠失させることができる。
シアノバクテリアにおいて、他の二糖が蓄積されるように操作される同様なアプローチを用いることができる。
上記の遺伝子のダウンレギュレーションまたはサイレンシングの他の方法は当該技術分野で公知である。例えば、二糖分解活性は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質アプタマー、ヌクレオチドアプタマーおよびRNA干渉(RNAi)によりダウンレギュレートされるかまたは除去されることができる(例えば、低分子干渉RNA(siRNA)、短いヘアピンRNA(shRNA)およびマイクロRNA(miRNA)(例えば、Fanning and Symonds (2006) Handb Exp Pharmacol. 173, 289-303G(ハンマーヘッド型リボザイムおよび低分子ヘアピン型RNAを記載); Helene, C., et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36; Maher (1992) Bioassays 14(12): 807-15(デオキシリボヌクレオチド配列のターゲッティングを記載);Lee et al. (2006) Curr Opin Chem Biol. 10, 1-8(アプタマーを記載); Reynolds et al. (2004) Nature Biotechnology 22(3), 326 - 330(RNAiを記載); Pushparaj and Melendez (2006) Clinical and Experimental Pharmocology and Physiology 33(5-6), 504-510(RNAiを記載); Dillon et al. (2005) Annual Review of Physiology 67, 147-173(RNAiを記載); Dykxhoorn and Lieberman (2005) Annual Review of Medicine 56, 401-423(RNAiを記載)を参照のこと)。RNAi分子は、種々の供給元から市販されている(例えば,Ambion社(テキサス州);Sigma Aldrich社(ミズーリ州);Invitrogen社)。種々のアルゴリズムを用いるいくつかのsiRNA分子設計プログラムが当業者に公知である(例えば、Cenixアルゴリズム(Ambion社);BLOCK-iT(登録商標)RNAi Designer(Invitrogen社);siRNA Whitehead Institute Design Tools(Bioinofrmatics & Research Computing社)。最適のsiRNA配列を限定するのに影響のある形質は、siRNAの末端におけるG/C含量、siRNAの特定の内部ドメインのTm、siRNAの長さ、CDS(コード領域)内の標的配列の位置および3'オーバーハングのヌクレオチド含量を含む。
いくつかの実施形態において、宿主光合成微生物は、細胞からの二糖分泌を促進するようにさらに操作されることができる。例えば、シアノバクテリアは、細胞からのスクロース分泌を促進するようにさらに操作されることができる(例えば、実施例15〜16参照)。低い浸透圧環境においては、スクロースは、高塩環境から低塩環境に移行するとき、一部の微生物により浸透圧保護剤が処理されるように、自動的に細胞から削除されることができる(Schleyer, M., Schmidt, R. and Bakker, E. P. 1993. Arch Microbiol 160, 424-43; Koo, S. P., Higgins, C. F. and Booth, I. R. 1991. J Gen Microbiol 137, 2617-2625; Lamark, T., Styrvold, O. B. and Strgim, A. R. 1992. FEMS Microbiol. Lett 96, 149-154)。スクロースポリンは、形質転換シアノバクテリアにおいて発現されるように操作されることができる(例えば、実施例16参照)。これらの遺伝子をクローニングし、前述の技術に従ってシアノバクテリアを形質転換することができる。このようなアプローチは他の光合成微生物に適用することができる。
いくつかの実施形態において、宿主光合成微生物は、宿主の染色体への安定な組み込みで形質転換される。例えば、宿主シアノバクテリアは、宿主の染色体への安定な組み込みで形質転換されることができる(例えば、実施例11〜13参照)。染色体組み込みによって、プラスミドベースの遺伝子発現において時々生じる除去のリスクを冒さないで、標的遺伝子(単数または複数)を微生物に組み込むことが可能になる。染色体組み込みは、標的遺伝子を維持するための抗生物質の必要性を低下させるかまたは除去することもできる。
好ましくは、染色体組み込みの戦略は、染色体上のいわゆるupp遺伝子座への遺伝子挿入を標的とする(例えば、実施例11〜13参照)。この部位は、ピリミジン生合成におけるスカベンジャー酵素である酵素ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ(UPRTase)をコードする。この戦略を用いることにより、非組み込み型微生物を除去できる5-フルオロウラシル(5-FU)による候補選択が可能になる。分離方法は、一般にシアノバクテリア系において用いられる。なぜなら、これらの微生物は、それらの染色体の複数コピーを含むからである(例えば、シネコシスチス種PCC 6803については最大12、シネココッカス・エロンガタスPCC 7942については最大16)。この戦略は、シアノバクテリアにとって特に魅力的である。なぜなら、このアプローチは、分離成功のために選択圧および安定な組み込みに依存する旧来の分離技術の使用を避けることができるからである。スクリーニング剤としての5-FUの使用は、より効率的であることができる。なぜなら、それは、1つの活性upp遺伝子を含む微生物であっても、増殖を阻害できるからである。このように、旧来の技術に必要とされるプロセスと比較して、より少ない世代サイクルで、完全に組み込まれた候補を迅速に選択することができる。
固相光合成バイオリアクター
本明細書において、光合成微生物の増殖のための固相培養担体を含む、光合成微生物を培養するためのフォトバイオリアクターが提供される。固相培養担体または固体培養担体または固体担体などは、一般に、液体でもガスでもない培養担体を意味すると解される。担体自体は固体であるが、担体構造物は、それが液体(例えば、増殖培地)、ガスまたは両方を吸収するように選択されることができる。特定の好ましい実施形態において、以下にさらに詳細に説明するように、固体担体は、培養中微生物が使用するための水分を吸収することができる。
本明細書記載のフォトバイオリアクター(単数または複数)の種々の実施形態は、光合成微生物の増殖を維持することができる。フォトバイオリアクター中で増殖する光合成微生物は、例えば、シアノバクテリアなどの天然光合成微生物であることもでき、人工光合成細菌などの、操作された光合成微生物であることもできる。天然光合成微生物であるか、または操作されて光合成微生物になることができる典型的な微生物は、限定するものではないが、細菌;真菌;古細菌;原生生物;微小植物、例えば緑藻;ならびに動物、例えばプランクトン、プラナリアおよびアメーバを含む。天然に存在する光合成微生物の例は、限定するものではないが、スピルリナ・マキシマム、スピルリナ・プラテンシス、ドナリエラ・サリナ、ボトリオコックス・ブラウニイ、クロレラ・ブルガリス、クロレラ・ピレノイドーサ、セレナストルム・カプリコミュータム、セネデスムス・クアドリカウダ、ポルフィリディウム・クルエンタム、セネデスムス・アクタス、ドナリエラ種、セネデスムス・オブリカス、アナベノプシス、アウロシラ、キリンドロスペルムム、シネコッカス種、シネコシスチス種および/またはトリポスリックスを含む。
好ましくは、バイオリアクターは、前述のように、二糖を蓄積するように形質転換されたシアノバクテリアの接種、増殖、および/または収穫を維持するように構成される。
以下にさらに詳細に説明するように、フォトバイオリアクターは開放系であることもできるし、閉鎖系であることもできる。種々の実施形態において、フォトバイオリアクターは、固相培養担体、保護バリア層および吊り下げ要素を含む。フォトバイオリアクターのいくつかの実施形態は、ガス、流体、栄養素、および/または光合成微生物の供給および/または除去のためのシステムを含むことができる。供給システムは、例えば標準的な配管設備であることができる。種々のラインのどれも、クイックコネクト配管設備を含むことができる。フォトバイオリアクターは、例えば、二酸化炭素または通常の大気を供給できるガス供給ラインを備えることができる。フォトバイオリアクターは流体供給ラインを備えることができる。好ましくは、流体供給ラインは、流体(例えば、水)を固相培養担体へ運搬するトリクルシステムまたは滴下システムに接続する。フォトバイオリアクターは、栄養供給ラインを備えることができる。光合成微生物の増殖および維持のための栄養組成物の配合物は、当業者に公知である。いくつかの実施形態において、栄養および流体供給ラインは、例えば流体ベースの栄養混合物を供給するために結合することができる。いくつかの実施形態において、流体供給ラインまたは栄養供給ラインは、液体培地を増殖表面に分配するためのスプレー装置であることができる。このようなスプレー装置においては、フォトバイオリアクターは、例えば外層(バリア層など)と固相培養担体との間にスプレー装置を収納するのに十分な大きさを有する。通例、栄養素は水ベース組成物で供給される。水分および栄養レベルの独立制御を提供するために、異なる水供給ライン(単数または複数)および栄養供給ライン(単数または複数)を提供するのが有利な場合がある。フォトバイオリアクターは、光合成微生物および/または液体懸濁/可溶性産物の回収を提供するための産物収穫ラインを備えることができる。フォトバイオリアクターは、光合成微生物の接種を提供するための接種ラインを備えることができる。いくつかの実施形態において、流体、栄養、および/または接種ラインを結合することができる。
固相フォトバイオリアクターの一実施形態は、図1(正面図)および図2(側面図)に示されている。これらの実施形態において、固相培養担体2は保護バリア7によって密閉されている。図2は、固体培養担体が保護バリア7を含む保護バリア層3の間にあることを示している。固体培養担体2は、光合成微生物が培養される表面を提供する。保護バリア7を構成する保護バリア層3は、光合成微生物の増殖を維持するための固体培養担体2の表面に化学線を到達させるために透明である。再シール可能なクロージャー4により、保護バリア7が取り外し可能にシールされることが可能になる。ガスおよび蒸気の交換は、保護バリア7に組み込まれている材料である選択パネル5を介して行われる。フォトバイオリアクター1は、垂直または非水平配向を可能にする支持要素6によって吊り下げられることができる。
固相フォトバイオリアクターの他の実施形態を、図12A(正面図)および図12B(側面図)に示す。表面および/または配管の手入れおよび潜在的汚染の最小化に役立つことができるセグメント形式でリアクター1を設計できる。各セグメントは、種々の供給および産物収穫ラインの配管(例えば、クイックコネクト型配管)を介してリアクターに接続することができる。リアクターは、吊り下げ要素6、例えばリアクター1を空間につるし、各セグメントの迅速な手入れを助けるレールによって支えられることができる。外部保護バリア7は、増殖表面2上の光合成を促進する一方で環境汚染および蒸発による水分損失を防ぐ光透過を可能にする透明な材料であることができる。増殖表面2は、水分を保持し、栄養素を供給し、産物を取り除き、および/または光合成微生物の高密度増殖を可能にする材料で構成されることができる。液体培地による表面からの連続フィード/産物収穫を提供する配管により増殖表面2を手入れすることができる。培地管8は、液体が表面2へ染み出る多孔質ホースであることができ、これは重力により増殖表面2を浸透することができる。液体は、リアクター1からの移動のために産物および過剰の液体培地を回収するための収穫管9によってリアクターの底部で収穫することができる。二酸化炭素および空気などのガスは、ガス分散管10によりリアクターに供給できる。ガス供給管10は陽圧環境を提供でき、制御された効率的な方式で増殖に必要なガスを供給することが期待される。ガス供給ライン10は、流入ガス流を加湿することにより、水分損失を最小にするのを助けることもできる。リアクターからの過剰のガスは、ガスの通過が可能であるが、環境汚染を最小化するかまたは除去するための多孔性材料である通気性パネル5(逆側、図示せず)によって排出することができる。供給ライン10によって供給される流入ガスの濾過を通じて、リアクター1の陽圧配置によって汚染が最小化されることが期待される。陽圧はまた、ガス流の内側から外側への経路を提供することによって環境からの汚染を防ぐことができる。
図12Bに示す実施形態において、リアクター1の外観が増殖表面に対して1つの配向で示されている。リアクター1から過剰のガスが逃げるのを可能にする通気性パネル5は、増殖表面2を横切ってガスが移動するための経路を提供するために装置の底部の近くに位置することができる。バリア表面7の底部での通気性パネル5の設置はまた、空気に比較して高いその密度から生じる二酸化炭素の分離および蓄積の可能性を最小化または予防する。通気性パネル5の寸法は、培養表面2上の最適の増殖に必要なガス流速に基づいて決定できる。
固相培養担体
本明細書記載のフォトバイオリアクターの固相培養担体は、その表面上および/または表面内部で光合成微生物が増殖できる表面を提供する。好ましくは、固相培養担体は、増殖を促進および維持するために、微生物への水分および/または栄養素の提供および/または保持を提供または促進する材料を含む。本発明の実施形態は、培養できる光合成微生物の型または株に限定されない。細胞増殖に望ましい水分量および栄養素の組成物量は、光合成微生物の型または株およびそれが増殖される用途によって異なることは当業者には明らかであろう。光合成微生物の増殖に有害な効果を有する恐れがある材料(またはこれらの材料内または材料上に含まれる物質)は、一般に避けられる。
光合成微生物の1つもしくは複数の型または株を培養するために、1つのフォトバイオリアクターを用いることができる。さらにまた、固体培養担体は、培養サイクルの間の滅菌の有り無しで、1つの培養サイクルまたは複数の培養サイクルに適するような材料(単数または複数)を含むことができる。さらにまた、フォトバイオリアクターは、1つのまたは複数の固体担体上で、微生物の1つの型もしくは株または微生物の複数の型もしくは株を培養するように構成されることができる。いくつかの実施形態において、純粋培養の代わりに、種々の光合成微生物の群落または光合成および非光合成微生物の群落を、1つの培養担体上で同時に一緒に増殖させることができる。1つのフォトバイオリアクターはまた、複数の培養担体を含むこともできる。従って、他の実施形態において、1つの保護バリア内の複数の培養担体により、1以上の型または株の光合成微生物を同時に培養することができる。
固体培養担体は、好ましくは、比較的多孔性の材料を含む。比較的多孔性の材料は、一般に、増加した表面積を有し、比較的非多孔性の材料よりもより水分を保持するおよび/または吸収することができる。テクスチャ加工のまたはトポグラフィックな表面(単数または複数)を有する固体培養担体もまた好ましい。テクスチャ加工のまたはトポグラフィックな表面は、比較的非テクスチャ加工のまたはなめらかな表面と比較して細胞密度を増強させることができる。担体材料および表面形状の選択は、一般的には、担体への微生物の付着を増加させるように選択されるが、微生物の除去または収穫を妨げないように、微生物があまりきつく付着しないことが一般に望ましい。いくつかの実施形態において、固体培養担体は、微生物の付着および増殖に適した材料を含む。いくつかの実施形態において、固体培養担体は、生物膜形成を低下または除去する材料を含む。
本明細書記載のフォトバイオリアクターの固相担体は、当該技術分野で用いられてきた固体担体とは異なると考えられる(例えば、微生物の増殖のために最も一般に用いられる固相担体は寒天である)。寒天は、一般にペトリ皿などの硬質形に注型され、その中でその物理的完全性が維持されるように使用される。なぜなら、寒天は、最小レベルの応力、歪またはその両方を受けるとき、破裂または断裂する傾向があるからである。対照的に、培養担体の種々の実施形態は、十分に丈夫で耐久性があるため、フォトバイオリアクターに用いても、より丈夫で耐久性がある“フレーム”を必要とせずにその物理的完全性を維持することができる。別の言い方をすれば、先行技術は、複合材料が形成されるように、実質的により丈夫で、より耐久性がある材料(例えば、ペトリ皿)と接触した弱い寒天担体の十分な部分を必要とした。従って、フォトバイオリアクターの種々の実施形態の固相担体は、本質的に微生物の培養に適し、十分に丈夫で耐久性がある。
固相担体の他の望ましい物理的特性および/または運転パラメータを以下に示す。例えば、担体は、比較的平たく硬質である(プレートのような)こともでき、例えば、ヒンジ、ばね、ワイヤ、糸などによって可撓的に連結された複数の平たく硬質の断片からなることもできる。適切な硬質材料は、限定するものではないが、種々の金属、ポリマー、セラミックスおよびそれらの複合材料を含む。硬質材料は、好ましくは、それに対する光合成微生物の付着を増加させる表面トポグラフィーを有する。さらにまた、硬質材料は、光合成微生物へ水分および/または栄養素を供給する能力を増すために、所望のレベルの多孔性で形成されることができる。さらにまた、硬質材料は、吸収性または高吸水性ポリマー配合物でコーティングされることができる(下記参照)。あるいは、担体は、本質的に布などの柔軟性の材料からなることができる。固相担体に使用する布は、限定するものではないが、場合により吸収性または高吸水性ポリマー配合物でコーティングされた綿、ポリエステルおよび/または綿ポリエステルブレンドを含む。貯蔵、移動または取り扱いのために、培養担体を折り重ねる、撚り合わせる、掛ける、または巻くことが可能になるため、培養担体の柔軟性は極めて有利であることができる。
さらに、固相培養担体は、好ましくは、一般的にはオートクレーブ滅菌の間に遭遇する高温(例えば、約120℃以上)で構造的に安定であり、寒天のように溶融しない。従って、一実施形態において、培養担体をオートクレーブ処理で滅菌し、次いでそれを本発明の保護バリア内に入れることができる。他の実施形態において、培養担体を保護バリア内に入れ、次いで全フォトバイオリアクターをオートクレーブ処理することができる。オートクレーブ処理は滅菌のための1方法ではあるが、任意の他の適切な滅菌方法を用いうることは、当業者には明らかであろう。
本発明の固体培養担体は、光合成微生物の増殖を維持するのに任意の適切な材料を含むかまたはそれからできていることができる。例えば、担体は、天然材料、改質天然材料、合成材料、またはそれらの任意の組み合わせから構成されることができる。天然材料は、限定するものではないが、綿、羊毛、加工した織り植物繊維および天然多糖(例えば、寒天、デンプン、セルロース誘導体)を含むことができる。改質天然材料は、限定するものではないが、ニトロセルロースまたはセルロースエステルなどの化学修飾した植物繊維に加えて、ポリエステルまたはポリアミド繊維を重ね織りまたはブレンドした天然繊維を含むことができる。合成材料は、限定するものではないが、ナイロン、ファイバーグラス、ポリシロキサン、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリアミド、コポリエステルポリエチレン、ポリアクリレートまたはポリスルホナートで構成される繊維を含むことができる。固体培養担体材料のさらなる例は、ワイヤーメッシュ、ポリウレタンフォーム、ポリエチレンフォーム、ガラス状炭素発泡体、ポリエステル/ポリエチレンフォーム、ポリイミドフォーム、ポリイソシアナートフォーム、ポリスチレンフォームおよびポリエーテルフォームまたはそれらの組み合わせを含む。
種々の実施形態において、固体培養担体は布である。限定するものではないが、繊維またはポリマーを織る、編む、フェルト化するまたは架橋するなどの方法によって布を形成することができる。布の構築は、ゆるいまたは目の粗いものであることができる。あるいは、布の構築は目のつんだものであることができる。とは言っても、顕著なテクスチャー、表面積、トポグラフィックな変動性、および/または粗さを有する布は、培養担体への光合成微生物の機械的結合または付着をよりもたらすことができ、従って、特に、微生物を担体に接種するプロセスならびに/または微生物を増殖および/または収穫するプロセスの間にフォトバイオリアクターが処理される、移動されるまたはそれ以外の方法で移動される実施形態において好ましい場合がある。好ましくは、大部分の適用において、担体への微生物の付着は、収穫運転中に部生物の除去を過度に妨げないようにそれほど強くないようにすべきである。さらにまた、微生物が使用するための水分および/または栄養素を保持する布の能力は、一般に、疎水性、親水性の繊維またはこのような繊維の混合物を選択することにより調節できる。これらの特性は、表面で増殖する微生物に利用可能なように、水分および/またはそれに溶解している栄養素が固体担体に保持されるおよび/または移動されることを可能にする。
培養担体の特性、特に水分および/または栄養の保持は、光合成微生物の増殖を増加させるように選択された材料で担体をコーティングすることにより増加させることができる。例えば、培養担体は寒天でコーティングされることもできるし、修飾セルロースエステル、アクリラートまたはアクリラート/ポリアミンコポリマーブレンドなどの高吸水性ポリマーでコーティングされることもできる。これらのコーティング剤は、一般的には、水中において、その乾燥重量の10〜100倍を超えて吸収および保持することができる。いくつかの実施形態において、これらの材料は、イオンを含む培地成分の存在下で、その高吸収性特性を保持するように配合される。コーティング剤は、培養担体の表面をコーティングすることもできるし、布が用いられている場合はその繊維をコーティングすることもできるし、あるいはその両方をコーティングすることもできる。一実施形態において、培養担体として役立つテリークロスのスワッチが寒天でコーティングされる。固体培養担体がそのようにコーティングされる場合、培養担体の“表面”は、これに光合成微生物が付着したときのコーティングの表面を含む。培養担体を薄く、曲げやすく軽く保つためには、コーティングは、好ましくは、例えば約100ミクロン以下の薄さである。しかしながら、所望の適用または選択される固体培養担体およびコーティング剤の組み合わせに応じて、より薄いコーティングを用いることもできる。
固相培養担体は複合層状構造物であることができる。固相培養担体は、隣接するように配置された少なくとも2つの層を含むことができる。固相培養担体の複数の層は、結合、縫い合わせ、接着、圧縮または任意の他の適切な手段などでつなぐことができる。異なった層は、それぞれ独立して、上記のいくつかの材料の中から選択されることができる。例えば、固相培養担体は、合成発泡体の第2材料層に結合した布の第1材料層を含むことができる。他の例において、固相培養担体は、同一または異なる密度の合成発泡体の第2材料層に結合した合成発泡体の第1材料層を含むことができる。好ましくは、固相培養担体は、少なくとも、高表面積の増殖材料で構成される第1層および透過型材料で構成される第2層を含む複合層状構造物である。
水分、栄養素および付着面を供給することに加えて、培養担体は化学線を捕捉するための表面を提供できる。従って、いくつかの実施形態において、固体培養担体の寸法はシート状である。すなわち、担体の深さは、担体の長さおよび幅に対して小さい。一実施形態において、培養担体は、保護バリアのフィルム状層間のシート状層である。このような平らなバイオリアクターは、フラットパネル状にして吊り下げられることができる。他の実施形態において、培養担体は、フォトバイオリアクターの外部バリアにより密閉されたカーテンのように吊り下げられる。寒天などの旧来の固相担体の薄いシートは、引き裂かれやすく、そのように吊り下げられることができないと考えられる。従って、吊り下げられるとき、液体で浸された場合であっても、固体培養担体がその完全性が維持できることが好ましい。
本明細書に記載のように、テリークロスタイプ組織を有する布は、適切な固体担体を提供できる(例えば、実施例1参照)。他の天然、修飾天然および合成材料もまた許容されることは、当業者には明らかであろう。テリークロスは、本発明の固体担体において望ましいと考えられる属性の多くを提供する。例えば、テリークロスは柔軟性であり、通常条件下(例えば、温度)、非破壊手法(例えば、曲げ、折りたたみ、ひねりまたはローリング)に従って取り扱うとき、破れる、裂ける、破断する、または割れる傾向を有さない。同様に、テリークロスは、一般的には、適度に引っ張られたとき(液体で浸されているときであっても)、破れる、裂ける、または破断する傾向を有さない。さらに、テリークロスは、多くの繊維ループで構成されているため、高度にテクスチャ加工がおこなわれている。これにより、微生物が付着するための高表面積量が提供され、それによって、任意の所定のサイズの担体上で増殖できる微生物量が増す。さらにまた、綿テリークロスは、一般的には、自身の重量の少なくとも約3倍を吸収し、それにより、担体表面上で増殖する微生物に利用可能なように、布担体に水分および水分に溶解した任意の栄養素が保持されることが可能になる。従って、種々の実施形態は、薄いかまたは寸法がシート状であり、吊り下げられるとき、自身の湿重量を支えることができ、柔軟性で、曲げやすく、吸収性で、高度にテクスチャ加工の、またはそれらの任意の組み合わせの固体培養担体を提供する。
上記の担体は、繰り返して使用でき、好ましくは、多くの適用において繰り返して使用され、より好ましくは、構造的に堅固であり、単回使用後に処置された微生物の増殖を維持する適切な表面を提供する限り繰り返して使用され、それによって運転費および廃棄物を減らすことができる。とは言うものの、小有機分子または治療用タンパク質およびペプチドなどの医薬品の製造に有用な組換え光合成微生物の培養などの、単回使用担体が望ましい特定の適用が存在しうる。このような単回使用担体の費用を抑えるために、そしてこのような単回使用担体が再使用されない事実を考慮して、このような担体はそれほど耐久性がある必要はなく、従って、金がかからず、耐久性が低い方法および/または材料を用いて製造または構築されることができる。例えば、ペーパータオルの紙繊維と同様な紙繊維で構成される担体が適切な場合がある。
固相培養担体のいくつかの実施形態を図13に示す。図13Aで示される固相培養担体材料は、微生物の増殖、水分および栄養素への接近、微生物付着部位ならびに/または培養産物の除去のための持続可能な表面を提供できる1つの材料を示す。この材料は、表面と微生物との間の、栄養素、水分および産物を交換する液体浸透および平衡拡散を可能にする。この構造形態のレンダリングは、高表面積材料であるが、これは寸法および形状に関して最適化できる。図13Bに示す固相培養担体材料は、それぞれが増殖表面のために特定の機能を有する複数の材料で構成されるハイブリッド材料である。基層は、栄養素および水分の供給に加えて、材料を通してパーコレートする産物の除去を効率的に可能にする多孔性材料であることができる。基材は、増殖表面のための物理的担体を提供することもできる。外層(単数または複数)は、基層に取り付けられることが期待され、微生物の付着部位を提供するために最適化されることができる。表面積および培養した微生物との親和性に関して、表層は表面増殖環境をより調節することができる。
保護バリア
本明細書記載のフォトバイオリアクターは、汚染および/または水分損失から固体培養担体および増殖表面を保護するバリアを含むことができる。同時に、フォトバイオリアクターは、光合成微生物に到達する化学線(太陽光または人工光のいずれか)および二酸化炭素を提供する。種々の実施形態において、フォトバイオリアクターは、光合成微生物の培養のための少なくとも1つの固体担体および保護バリアを含む。
物理的取り扱いおよび/または汚染からの保護
汚染を防ぐために、物理的保護バリアは、固体培養担体を少なくとも部分的に覆うことができる。特定の実施形態において、物理的バリアは培養担体を密閉することができる。保護バリアは、少なくとも一部分において、フォトバイオリアクター内の担体および/または大気からの、フォトバイオリアクター外の大気への水分の損失を調節することもできる。所望の本発明の実施形態に応じて複数のタイプの材料のいずれかで保護バリアが構築されることができることは、当業者には明らかであろう。
保護バリアは、培養担体を完全に密閉することができる。保護バリアが永続的にシールされる場合、内部の培養担体に接近するためには、バリアは破ったり、切断したり、裂いたりしなければならない。従って、いくつかの実施形態において、培養担体および微生物が増殖している表面へ、保護バリアを介して接近される。
好ましい実施形態において、保護バリアは取り外し可能にシールされる。取り外し可能なシールは、限定するものではないが、Ziploc(登録商標)保存用バッグ(SC Johnson社)において見られるようなジッパータイプのクロージャー、hook-and-loop型のファスナー(例えば、Velcro USA社)、ツイストタイ、ジップタイ、スナップ、クリップ、感圧接着剤裏打ち面およびあらゆる分野で承認されているそれらの均等物を含む、多くのクロージャータイプのいずれかであることができる。しかしながら、完全なシールは必ずしも必要ではなく、外部バリアを完全にシールしないで、培養担体への接近を容易にしたほうが、寄り効率的な場合がある。
フォトバイオリアクターは、保護バリア内に1つの培養担体または複数の培養担体を含むことができる。いくつかの実施形態において、1つの保護バリア内に1つの培養担体が密閉されている。例えば、プラスチックバッグは、その中に1つの固体培養担体が密閉されている保護バリアを形成することができる(例えば、図1参照)。他の実施形態において、1つの保護バリアは、複数の固体培養担体を密閉することができる。例えば、温室タイプの構造物は、その中に複数の固体培養担体が密閉されている保護バリアを形成することができる。
化学線の透過
フォトバイオリアクターは、太陽光または人工光のいずれかで、光合成微生物への化学線の透過を提供できる。しかし、本発明の保護バリアは、必ずしも光に対して透明である必要はない。もしも光合成微生物の増殖のためにその中で十分な光源が提供されれば、いくつかの実施形態は、非透明な保護バリア内に密閉された培養担体を含むことができる。例えば、光源として太陽光を用いるための透明なバリアを提供することが、望ましく、より簡単で、より経済的であるなどが考えられる。
好ましい実施形態は、限定するものではないが、ガラスまたは透明なもしくは一般に可視光を透過するポリマー、例えばポリエチレン、アクリルポリマー、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレンもしくはそれらのコポリマーまたはそれらの組み合わせのいずれかのタイプなどの材料を含む透明なバリアを提供する。透明なバリアは、耐久性があり、裂ける、破れる、割れる、擦り切れる、細断される、または他のこのような物理的損害を受ける傾向を有さない材料から選択されることができる。透明なバリア材料は、オートクレーブ滅菌または他の温度極値への暴露に耐えるその能力に関して選択されることができる。さらにまた、透明なバリア材料は、退色または劣化せずに、日光または他の放射線への長期の暴露に耐えるように選択されることができる。光酸化に抵抗する特定のコーティングまたは配合物は、特に有用であることができることは、当業者には明らかであろう。さらに、本発明のフォトバイオリアクター内の熱の蓄積を低下させるおよび/または別なふうに調節するように、赤外反射コーティングまたは吸収コーティングを選択することができる。
透明なバリア材料の厚さは、スケールの機械的特性に応じて変化することは、当業者には明らかであろう。例えば、透明なバリア材料は、厚さ約10ミルの工業用/海用プラスチックのものであることもでき、およそ厚さ2ミルの家庭用プラスチックバッグに用いられるタイプのものであることもできる。一実施形態において、透明なバリア材料は薄く、柔軟性である。例えば、透明なバリア材料は約10ミル未満のものであることができる。
いくつかの実施形態において、バリアは、薄く柔軟性である固体培養担体の両面をおおう保護層またはフィルムを形成する。この実施形態の組み立てられたフォトバイオリアクターは柔軟性であり、貯蔵、移動、運搬または取り扱いのために、曲げる、回転させる、折り重ねる、撚り合わせるなどのことができる。他の実施形態において、透明なバリア材料は硬質である。例えば、バリアはガラス温室であることができる。たいがいは、温室ガラスの厚さは、好ましくは、建築慣行と合致するが、それを変更することも可能である。このような実施形態のフォトバイオリアクターは、実際的には固定されていると考えられるが、1つの透明な保護バリアの範囲内で、複数の固体担体を取り扱う、移動する、運ぶなどすることができるだろう。
光合成微生物の増殖のための十分な光を提供するように保護バリアが選択されることができるが、必ずしもすべてのバリアが透明である必要はない。従って、いくつかの実施形態において、バリアの一部、例えば1以上の縁は非透明な材料でできている。非透明な材料は、限定するものではないが、ポリエチレン繊維材料(Tyvek(登録商標))、ポリテトラフルオロエチレン濾過媒体、セルロース系フィルター材料、ファイバーグラスフィルター材料、ポリエステルフィルター材料およびポリアクリラートフィルター材料ならびにそれらの組み合わせを含む材料で構成されることができる。耐久性に関して非透明な材料を選択することができる。このような実施形態において、バリアの透明な部分は、さらに、耐久性がある非透明な部分によって、破れる、裂ける、擦り切れる、細断されるなどから保護されると考えられる。一実施形態において、非透明な部分は、取り付け部位または取り付け部分(例えば、孔、ループ、フック、グロメットもしくは他の分野での等価装置、開口部またはくぼみ)および/または構造物にフォトバイオリアクターを固定する仕組みをさらに含むことによってフォトバイオリアクターを吊り下げるための取り付け構造物および/または補強材を提供するまたは含む。このような任意の取り付け部位などが非透明な部分内もしくは上に位置する必要はないが、それらは、バリアの非透明な部分内もしくは上、バリアの透明な部分内もしくは上、またはバリアの非透明な部分および透明な部分内もしくは上に含まれることができる。取り付け構造物はまた、固体培養担体内もしくは上に含まれることもできるし、それを貫通することもできる。
いくつかの実施形態において、装置は識別できる前側および後側を有する。この装置の前側は、光源に面することを意味し、従って前側にあるバリアの部分は好ましくは透明であり、一方、光源に面していない側の保護バリアの部分は、必ずしも透明ではない。
ガス交換の提供
光合成の間、光合成微生物は二酸化炭素を消費して酸素を放出する。本明細書記載のフォトバイオリアクターは、所望の量の光合成が行われるのに十分な二酸化炭素を供給できる。フォトバイオリアクター内部に二酸化炭素を供給する1つの方法は、フォトバイオリアクターの内部の空気と周囲の空気との間で直接ガス交換させることである。このシステムが周囲の大気に開放されるように、例えば、孔、通気孔、窓または他のこのような開口部を保護バリアに提供できる。
しかしながら、このような開放形状は、光合成微生物の汚染が心配される場合、望ましくない可能性がある。このような心配に取り組むために、保護バリアは、その中に密閉された固体担体(単数または複数)を外気から完全にシールすることができる。このような実施形態において、所望の濃度の二酸化炭素は、囲い内にそれを導入することにより維持できる。例えば、圧縮二酸化炭素のタンクからの配管または管により、フォトバイオリアクター内に密閉された空気に二酸化炭素を混合させることが可能になることは、当業者には明らかであろう。さらに、工場、工業プラント、発電所などからの排気を光合成微生物の二酸化炭素供給源として利用することができ、従って二酸化炭素排出量を減らすことができる。一実施形態において、ガス供給ラインにより、増殖表面局部に二酸化炭素を提供することができる。
大気中の二酸化炭素を利用するために、ガス透過性の選択的バリアを提供することが、望ましく、より簡単で、より経済的であるなどが考えられる。従って、いくつかのフォトバイオリアクター実施形態は、保護バリア内に密閉された環境と周囲の空気との間のガスおよび蒸気交換を可能にするにもかかわらず、なお汚染に対するシールされた物理的バリアを提供する選択的バリアを提供する。このようなバリアは、少なくとも部分的にガス/蒸気透過性であることができ(例えば、従来の織物よりもずっと透過性は低く、プラスチックフィルムよりも高く、および/またはコーティングされた紙と同様である)、従って二酸化炭素および酸素などのガスの交換は可能であるが、さらに少なくとも部分的に、かつ好ましくは、固形物および液体に対して不透過性であると考えられる。いくつかの実施形態において、フォトバイオリアクターは、増殖表面付近の領域において上昇した二酸化炭素濃度を維持するために、半透性バリア層およびガス供給ラインを含むことができる。
いくつかの実施形態において、選択的バリアは、約10マイクロメートル以下の平均孔径または直径および、少なくとも約5から約10,000ガーレー秒以下までのガス交換速度を有することができる(ガーレー秒またはガーレーは、所定の圧力差で1.0平方インチの所定の材料を100立方センチメートルのガスが通過するのに必要な秒数を記載する単位である)。従って、ガス交換を可能にすることに加えて、選択的バリアは、密閉システムからの水分の損失を防ぐことができる。
保護バリアの選択的バリア部分は、スパンボンドオレフィンバリアなどの、任意の適切なポリマーベース材料で構成されることができる。種々の特性を有するスパンボンドオレフィンバリア(微細ポリエチレン繊維)は、Tyvek(登録商標)の商標名でDuPont社から容易に入手できる。このような材料は、物理的特性のその組み合わせの故に特に有利である。すなわち、これらの材料は、水などの液体の透過に抵抗する傾向があるが、それでもなお十分に高度のガス/蒸気透過性を有し;これらの材料は比較的丈夫で、水分をほとんど吸収せず、引き裂き抵抗力があり、著しい弾性を有し、高度に柔軟性である。MIT屈曲試験機(TAPPI法T-423)で試験するとき、スパンボンドオレフィンは20,000サイクルを超えることができる。さらに、スパンボンドオレフィンは大部分の酸、塩基および塩に不活性であるが、濃硝酸または過硫酸ナトリウムなどの酸化物質に対する長期の暴露は、強度の少しの低下の原因となる。スパンボンドオレフィンバリアは、一定温度、0〜100%相対湿度でシート寸法が0.01%未満の変化を示すことから、優れた寸法安定性を有する。特定の製品は、直接食品に接触する用途のためのアメリカ合衆国連邦規則集の規定21(21CFR177.1520)の必要条件を満たしている。スパンボンドオレフィンバリアはまた、優れたカビおよび糸状菌抵抗性を示し、中性のpHを有している。しかしながら、残念なことに、そのUV抵抗性は特に優れていない。とは言うものの、通例少なくとも1〜3ヶ月の有用な屋外寿命を予想することができる。さらに、そのUV抵抗性は、不透明なコーティングを用いるか、ポリマー繊維にUV阻害薬を含むことにより改善することができる。さらに、今日までに製造されたスパンボンドオレフィンは不透明であるため、このような材料を含む保護バリアの部分は、好ましくは、光合成微生物の培養を障害するように位置するおよび/または広すぎることがない。
特に、スパンボンドオレフィンは、“硬質”および“軟質”構造物で製造されることができる。“硬質”面接合品であるタイプ10は、なめらかで堅い無指向性紙様形状である。タイプ14および16は、“軟質”点接合品であり、型押し模様を有し、布切れのような柔軟性の担体を提供する。例えば、バリアに耐久性および通気性が所望される場合、タイプ14スタイル(またはその等価物)を使用できる。タイプ16スタイルは、5〜20ミル(0.13〜0.51mm)の孔の穴あきであり、タイプ14スタイルと比較して非常に高い空気および水分の透過性、さらなる柔軟性ならびにより大きな可撓性およびドレープを有するが、低い引き裂き強度およびバリア特性という犠牲を払っている。従って、選択的バリアの特定の特性は、スパンボンドオレフィン製品の1以上のタイプを選択することによりカスタマイズすることができる。
選択的ポリマーバリアの他の例は、限定するものではないが、ナイロン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、セルロース、ファイバーグラス、ポリエステルおよびポリアクリラートの膜およびフィルター材料ならびにそれらの組み合わせを含む。
光合成微生物の増殖にとって十分に選択的なバリアを提供するためには、保護バリアの全体がガス透過性である必要はない。適切なガス交換を可能にするのに十分な保護バリアの一部のみが、ガス透過性である必要がある。一実施形態において、選択的部分は保護バリアのパネルである(例えば、図1参照)。微生物の培養を過度に妨げることなく、特定の適用のための所望の量のガス交換を達成するために、担体表面の領域に関する選択パネルのサイズおよび配置は変更することができる。ガス透過性選択材料で構成される外部バリアの領域の百分率は、材料のガス透過速度に左右されることは、当業者には明らかであろう。実際、ガス透過性部分は、それを通しての水蒸気の移動もまた可能なので、種々の実施形態において、保護バリアのガス透過性部分のサイズは、酸素および二酸化炭素の十分な移動を可能にすると同時に、水分の損失を最小化するように選択される。
吊り下げおよび運搬システム
本明細書記載のフォトバイオリアクターは、例えば、取り扱いおよび運搬システムに組み込むことにより、大規模生産および/または収穫のために構成されることができる。図3は、多数のフォトバイオリアクターを連続工程で取り扱うための、フォトバイオリアクター農場の典型的な設計を上から見た図を示す。フォトバイオリアクターまたは培養パネル(個別には示さず)は、コンベヤシステム8に取り付けられている。コンベヤシステム8は、その経路に沿って培養パネルを移動させる。複数のコンベヤシステムは、中央に位置する接種および収穫センター9に集まる。このように、処理(例えば、採取および/または接種)可能な場合は、培養パネルを接種および収穫センター9に移動させ、次いで、接種後、バイオマスの培養期間中には、センターからパネルを離れさせる。次いで、収穫前の培養期間の後半に、センターに向けてパネルを移動させ、最終的に、バイオマスの成熟と共に収穫のためにセンターに戻される。次いで、このサイクルが繰り返される。さらなる処理のために、パイプライン10を通して収穫したバイオマスを移動させることができる。さらなるコンベヤシステムまたはさらなる接種および収穫センターを付け加えてバイオマス生産専用の隊列を形成させることにより、フォトバイオリアクター農場の能力を上げることができる。
フォトバイオリアクターの吊り下げ
光合成微生物に光を供給するためのフォトバイオリアクターの好ましい実施形態は、培養担体が薄いシート状である実施形態である。水平に向けられる場合、床面積の効率的利用は低下する傾向にあり、従って、本発明の特定の実施形態において、培養担体は非水平に向けられ、好ましくは実質的に垂直に向けられ、より好ましくは垂直に向けられる。それにもかかわらず、十分な量の化学線が微生物に到達できる限りは、培養担体は、本質的に任意の向きに向けられることができる。従って、フォトバイオリアクターが、保護バリアが固体担体の周りに密接に結びつけられたフィルムまたは層を形成するタイプのものである場合、全フォトバイオリアクターの好ましい配向は垂直であるが、任意の配向が許容される。明確にするために、前述の配向(例えば、垂直、水平、実質的に垂直、非水平など)は、培養担体の下部の床または地面に対してであり、床または地面が水平であると仮定している。
培養担体または全フォトバイオリアクターを所望の配向に向けるかまたは吊り下げるために、種々の構造物、組み立て台、スタンド、ラックなどを使用できる。特に、培養担体および/または保護バリアは、固体培養担体および/またはフォトバイオリアクターを吊り下げることができる、ロープ、ライン、フック、ケーブル、トラック、レール、鎖、棚板、ポール、管、組み立て台、スタンド、梁または任意の他のこのような構造物から吊り下げられることもできるし、これらに取り付けられることもできる。複数の培養担体および/またはフォトバイオリアクターは、物干し用ロープからぶら下がっているシートのような共通の構造物から吊り下げられることができる。培養担体(単数または複数)および/またはフォトバイオリアクター(単数または複数)は、静的に吊り下げられることもできるし、その移動を可能にする方式で吊り下げられることもできる。孔、ループ、フックなどの位置は、好ましくは、培養担体および/またはフォトバイオリアクターの重量を実質的に均等に分配する。
フォトバイオリアクターまたは培養担体の吊り下げは、特に垂直配向においては、空間効率が良く、取り扱い上の利点を提供できる。しかしながら、本発明のバイオリアクターまたは培養担体は、吊り下げられる必要はない。例えば、本発明の特定の実施形態において、培養担体は十分に硬質であり、非水平に、垂直にまたは実質的に垂直に向けられる場合(例えば、表面にまたはその上にその基部を固定または配置することにより;一実施形態において、担体は硬質プレート、パネル、グリッドなどのようなものである)、培養担体はその重量を支えることができ、その様に向けられ続ける。他の実施形態において、保護バリアは温室などのように独立型であり、複数の培養担体が吊り下げられるおよび/またはその中で独立している。
フォトバイオリアクターおよび/または培養担体の吊り下げ、特に垂直配向における吊り下げは、空間効率がよく、取り扱い上の利点を提供できる。しかしながら、本発明のバイオリアクターまたは培養担体は吊り下げられる必要はない。例えば、本発明の特定の実施形態において、培養担体は十分に硬質であり、非水平に、垂直にまたは実質的に垂直に向けられる場合(例えば、表面にまたはその上にその基部を固定または配置することにより;一実施形態において、担体は硬質プレート、パネル、グリッドなどのようなものである)、培養担体はその重量を支えることができ、その様に向けられ続ける。他の実施形態において、保護バリアは温室などのように独立型であり、複数の培養担体が吊り下げられるおよび/またはその中で独立している。
運搬
本明細書において、フォトバイオリアクター、フォトバイオリアクターの保護バリア内の培養担体またはそれらのいくつかの組み合わせをある場所から他の場所に運搬するためのシステムもまた記載されている。フォトバイオリアクターおよび/または培養担体を移動する能力は、種々の理由から有利であることができる。例えば、それは、光を受け取るためのそれらの位置(単数または複数)を最適化し、所望の温度またはガス含有量することを可能にすることができる。複数のフォトバイオリアクターまたは培養担体を、離散ステップ、例えば接種、培養、誘導および/または収穫にかける場合に、移動性は特に有利であることができる。なぜなら、定着したフォトバイオリアクターまたは培養担体に必要な材料および装置を移動させる代わりに、連続式プロセスでいくつかの割り当てられた場所にフォトバイオリアクターまたは培養担体を移動させることがより効率的と考えられる。
このように、培養担体単独または保護バリアに密閉された培養担体のいずれであろうと、増殖表面は、接種後でさえ運ばれることができる。産業上の利用に頻繁に使用される多数のタイプのコンベヤシステムは、当業者には明らかであろう。運搬システムは、それが1以上のフォトバイオリアクターまたは培養担体を移動させることができる限り、特定のタイプに限定されない。フォトバイオリアクターまたは培養担体とコンベヤシステムとの間の取り付けのタイプは、用いられる運搬システムのタイプによって異なり、培養担体および/または保護バリアの一部である任意の取り付け部位と協同して働くように選択されることは、当業者には明らかであろう。1以上のモーター(例えば、鎖および歯車の働きにより)によって、機械化された方式で培養担体(単数または複数)またはフォトバイオリアクター(単数または複数)が運ばれることが考えられるが、ヒトの行動によってそれらが運ばれることも可能である(例えば、レールに取り付けられた吊り下げられたバイオリアクターを、レールに沿って滑らせるベアリング機構にそって単に押すことにより)。
フォトバイオリアクター(単数または複数)および/または培養担体(単数または複数)を吊り下げるコンベヤシステムは、特に垂直配向においては空間効率がよく、取り扱い上の利点を提供できる。しかしながら、コンベヤシステムはフォトバイオリアクター(単数または複数)または培養担体(単数または複数)を吊り下げることに依存する必要はない。例えば、フォトバイオリアクターは、例えばローラーコンベヤ上を滑らすなど、コンベヤシステムの上部に沿って移動させることができる。一実施形態において、コンベヤシステムは、保護バリア内に密閉された培養担体を含むフォトバイオリアクターを移動させることができる。あるいは、フォトバイオリアクターの保護バリアは、複数の培養担体を移動させる1以上のコンベヤシステムを保護する大きな囲いであることができる。
フォトバイオリアクター農場
大規模用途のためには、十分なサイズの1つの培養担体を構築することは、実際的ではない場合がある。従って、フォトバイオリアクター“農場”で光合成微生物を培養するための、2つまたはいくつかまたは数十または数百または数千またはそれ以上の培養担体の使用が提供される。これらの培養担体は、すべて1つの保護バリア内にある、すなわち1つのフォトバイオリアクターを含むこともできるし、複数の培養担体は複数のフォトバイオリアクターの一部であることもできる。いずれの場合においても、取り扱いおよび処理を容易にし効率的にするために、複数のフォトバイオリアクターまたは培養担体をフォトバイオリアクター農場内で組織化することは有益であることができる。太陽などの光源から捕捉されるエネルギー量を最大化するためにそれらの配置を組織化することもまた有益であることができる。このような組織化は、例えば、限定するものではないが、列、縦列、同心円、格子、中心点から放射状に外に広げることなどの規則的なやり方で多数のフォトバイオリアクターまたは培養担体を配置することからなることができる。
種々の実施形態において、農場は、一般の構造物、例えばトラック、レール、鎖、ラインなどから吊り下げられる複数のフォトバイオリアクターまたは培養担体を含む。さらなる実施形態において、構造物はコンベヤシステムの一部であり、フォトバイオリアクターまたは培養担体は、コンベヤシステムの経路に沿ってある場所から他の場所へ移動する。
フォトバイオリアクター農場は、多数のフォトバイオリアクターまたは培養担体を取り扱う複数のコンベヤシステムの1つまたは配列を含むことができる。このような配列は、2つまたはいくつかまたは数十または数百または数千またはそれ以上のフォトバイオリアクターまたは培養担体を取り扱う、2つまたはいくつかまたは数十または数百または数千またはそれ以上のコンベヤシステムを含むように拡大することができる。コンベヤシステム(単数または複数)に加えて、フォトバイオリアクター農場は、光合成微生物の接種、培養、誘導および/または収穫などのステップを行うための所定の所定の領域、ステーションまたはセンターを含むことができる。このようなセンターは、特定のステップを行うための専門装置の場所であることができる。コンベヤシステムの経路は、特定のステップが行われるこのようなセンターへフォトバイオリアクターまたは培養担体をもたらすことができる。次いで、フォトバイオリアクターまたは培養担体は、順番における次の領域またはセンターに移動されることができる。コンベヤシステムに沿った異なるフォトバイオリアクターまたは培養担体は、経路に沿った異なるセンター位置することができ、従って異なるステップに同時にかけることができる。一実施形態において、コンベヤシステムの経路はループである。フォトバイオリアクターまたは培養担体は、ひとたび培養プロセスにおけるステップの1ラウンドを完了すれば、そのプロセスを繰り返すことができる。ユニットの一部が損害を受けたり、最終的に交替を必要とする場合もあるが、本質的に、同じフォトバイオリアクターまたは固体培養担体のセットを繰り返し用いることができる。
他の実施形態において、同じかまたはほぼ同じ場所で培養および収穫を行うことができる。この場所を接種および収穫センターと呼ぶ(例えば、図3参照)。フォトバイオリアクターおよび/または固体培養担体の接種は、接種および収穫センターで行われる。コンベヤシステムは、フォトバイオリアクターまたは培養担体を次に接種および収穫センターから移動させるループを形成する。次いで、フォトバイオリアクターまたは培養担体は、所望の量の細胞増殖に十分な時間、コンベヤシステムの経路に沿って移動する。次いで、コンベヤシステムは、収穫のためにフォトバイオリアクターまたは培養担体を接種および収穫センターに戻させる。複数のコンベヤシステムは、それから放射上に広がる共通の接種および収穫センターを共有できる。さらに高い能力を必要とする場合、フォトバイオリアクター農場は、複数のコンベヤシステムからのフォトバイオリアクターまたは培養担体を取り扱う複数の接種および収穫センターを含むことができる。能率の増加を実現できるとはいえ、接種および収穫の場所は、同じまたはほぼ同じ場所である必要はない。
フォトバイオリアクターの使用方法
光合成微生物の培養
本明細書記載の固相フォトバイオリアクターは、光合成微生物を培養するために使用することができる。固相フォトバイオリアクターにおいて増殖できる光合成微生物は、限定するものではないが、シアノバクテリアなどの天然光合成微生物または人工光合成細菌などの操作された光合成微生物を含む。天然光合成微生物であるか、または操作して光合成微生物にすることができる典型的な微生物は、限定するものではないが、細菌;真菌;古細菌;原生生物;微小植物、例えば緑藻;ならびに動物、例えばプランクトン、プラナリアおよびアメーバを含む。バイオリアクターにおいて増殖できる天然に存在する光合成微生物の例は、限定するものではないが、スピルリナ・マキシマム、スピルリナ・プラテンシス、ドナリエラ・サリナ、ボトリオコックス・ブラウニイ、クロレラ・ブルガリス、クロレラ・ピレノイドーサ、セレナストルム・カプリコミュータム、セネデスムス・クアドリカウダ、ポルフィリディウム・クルエンタム、セネデスムス・アクタス、ドナリエラ種、セネデスムス・オブリカス、アナベノプシス、アウロシラ、キリンドロスペルムム、シネコッカス種、シネコシスチス種、および/またはトリポスリックスを含む。
好ましくは、固相フォトバイオリアクターにおいて増殖する光合成微生物はシアノバクテリアを含む。バイオリアクターにおいて増殖するシアノバクテリアは、藍色植物門からの任意の光合成微生物であることができる。バイオリアクターにおいて増殖するシアノバクテリアは、単細胞形態を有することもできるし、コロニー形態(例えば、フィラメント、シートまたはボール)を有することもできる。好ましくは、バイオリアクターにおいて増殖するシアノバクテリアは単細胞シアノバクテリアである。バイオリアクターにおいて増殖できるシアノバクテリアの例は、限定するものではないが、シネコシスチス、シネココッカス、サーモシネココッカス、ノストック、プロクロロコッカス、ミクロシスティス、アナベナ、スピルリナおよびグロエオバクター属を含む。好ましくは、バイオリアクターにおいて増殖するシアノバクテリアは、シネコシスチス種またはシネココッカス種(例えば、シネココッカス・エロンガタスPCC 7942(ATCC33912)および/またはシネコシスチス種PCC 6803(ATCC27184))である。より好ましくは、バイオリアクターにおいて増殖する光合成微生物は、本明細書に記載の二糖を蓄積するように操作されたトランスジェニック光合成微生物である。
フォトバイオリアクターの固体培養担体は、光合成微生物を接種することに加えて、水分および、限定するものではないが、栄養素、塩、緩衝液、金属、窒素、リン酸、硫黄などを含む他の成分の添加を行うことができる。次いで、保護バリア内の培養担体を含むフォトバイオリアクターは、取り外し可能にシールされることができる。シールされたフォトバイオリアクターは、例えば、照射および温度の調節を可能にする位置および方式で吊り下げることによって配置されることができる。配置は静的であることもできるし、1日にわたって太陽の放射線への最大暴露を確実にするために、フォトバイオリアクターを移動させることもできる。光合成微生物は、所望の時間、培養することができる。時間の長さは、微生物のタイプおよび所望の細胞増殖密度に従って変化することは、当業者には明らかであろう。例えば、シアノバクテリアの特定の株に関しては、約4〜約7日間の範囲内の培養期間によって、1リットル相当量当たり乾燥バイオマス約50〜約250グラムの範囲内の細胞収量をもたらすことができる。培養期間後、取り外し可能なシールを開けることができ、光合成微生物を収穫することができる。
本明細書において、“1リットル相当量当たりの乾燥バイオマスのグラム数”は、培養表面上で増殖するバイオマス層の平均深さ(例えば、約150ミクロン)を算出し、その値に培養表面の長さおよび幅をかけ合わせることによって決定される単位である。この計算は体積を与える。次いで、培養表面から収穫したバイオマスの重量は、体積と関連づけられ、“1リットル相当量当たりの乾燥バイオマスのグラム数”として表すことができる。
連続培養法
例えばアセンブリラインの様に、もし光合成微生物の培養プロセスが連続で行われれば、より高い効率が実現できるであろう。一度に大量のバイオマスを取り扱う装置および能力を必要とし、それによりバッチ間で遊休させる代わりに、連続システムは、より少ない全能力しか必要とせず、連続作業によってより効率的にその能力を用いると考えられる。培養をより小さくより多数の構成要素に分割することにより、空間的に連続した配置に構成要素を組織化することができる。次いで、全生産プロセスの異なる離散ステップを同時に行うことができる。培養構成要素をプロセスステップにかけた後、構成要素をプロセスの前方に移動させ、一方でそのステップにおいて他の構成要素と交替させる。従って、最終産物の生産は、大量バッチの成熟に限定されず、各構成要素がアセンブリライン様プロセスを完了するにつれて定期的に行うことができる。さらにまた、1ラウンドのプロセスの完了後に、構成要素は、直ちにプロセスをやり直すことができ、それが繰り返される。
より具体的には、連続培養は、連続的に光合成微生物を培養するための運搬可能なフォトバイオリアクターまたは培養担体の使用方法に関する。連続または連続工程は、フォトバイオリアクターまたは固体培養担体を、培養プロセスのあるステップから他のステップに進行させることができる空間的関係として理解される。あるいは、1つの大型構造担体を連続工程に用いることが可能である。具体的には、担体は、巡回路(例えば、好ましくは垂直に配置されたコンベヤベルトのような)に沿って移動する様に作られた材料(例えば、テリークロス織物)のループであることができる。複数のフォトバイオリアクターまたは固体培養担体がそのプロセスを順次に繰り返し完了するにつれて、バイオマス生産が定期的に達成されうることが最終結果である。このタイプのプロセスは、大規模であるが、回数が少ないバッチでのバイオマス生産と比較して、効率の高い大規模用途において機会を与える。
好ましい実施形態において、連続した空間的関係はコンベヤシステムの経路に沿っている。運転方法はアセンブリラインに類似している。このようなコンベヤシステムは、いくつかの方法で運転することができる。例えば、コンベヤシステムは、フォトバイオリアクターまたは培養担体をある場所から他の場所へ移動させる間、中断なしに運転することができる。このような実施形態において、フォトバイオリアクターまたは培養担体が動いている間に接種、収穫などが行われる。あるいは、実施されるステップを可能にするためにコンベヤシステムを停止させ、次いで次のステップの場所へのフォトバイオリアクターまたは培養担体の移動を再開させることができる。さらにまた、コンベヤシステムは中断なしに運転でき、フォトバイオリアクターまたは培養担体は、処理のためにコンベヤシステムの移動からはずし、次いで運搬の流れの中に再び入れるために再装着することができる。この一般テーマの他の入れ替えもまた可能であることは、当業者には明らかであろう。
連続培養法の一実施形態において、コンベヤシステムに沿って、1つの場所で複数のフォトバイオリアクターが接種される。次いで、コンベヤシステムによって、光合成微生物の培養が行われる領域にフォトバイオリアクターが移動される。運搬のこの部分において、増殖および光合成を促進するための最適の照射を可能にするようにフォトバイオリアクターの位置を合わせることができる。次いで、光合成微生物を収穫できる場所にフォトバイオリアクターが到着する。次いで、このプロセスを再開するために、コンベヤシステムの経路に沿ってフォトバイオリアクターを接種地点に戻すことができる。効率を改善するために、フォトバイオリアクターが接種場所を離れ、収穫場所に到着する間の時間は、光合成微生物の所望の量の増殖が起こるのにかかる時間と一致するようにすることができる。このプロセスのステップは接種、培養および収穫に限定されない。さらなるステップは、所望産物を合成させるための細胞の誘導または滅菌を含むことができる。上記の実施形態は、運搬可能なフォトバイオリアクターシステムを説明しているが、複数の固体培養担体を運搬し処理する同じタイプの連続培養を、1つの保護バリア内で行うことができることは明らかであろう。
発酵性糖の生産方法
光合成微生物をより効率的に増殖させる能力から利益を得る技術の1つは、エタノールまたはバイオディーゼルなどの代替燃料のためのバイオマスの生産である。コーン、サトウキビ、ダイズ、カノーラ、ジャトロファなどの、バイオマスを生産するために現在栽培されている植物と比較して、シアノバクテリアなどの光合成微生物は、はるかに速い速度でバイオマスを生産し、これによりはるかに大きな生産性をもたらすことができる。さらに、微生物による二糖の直接生産により、発酵性糖を生産するために植物バイオマスを用いる大規模なエネルギー集約型の前処理の多くを避けられる。さらにまた、植物の代わりに光合成独立栄養微生物を使用することにより、土壌消耗、腐食および食料供給品の転用を引き起こすことなく、高収量の発酵性糖をもたらすことができる。炭素供給源(CO2)およびエネルギー(光)が環境から供給され、はるかに低コストで生産できるため、他の微生物と比較して、光合成独立栄養微生物が好ましい。さらに、光合成独立栄養微生物は、産業プロセスからの二酸化炭素排出量を消費するために利用することができ、従って、環境に対するさらなる利点を提供する。
光合成微生物からの大量の発酵性糖の生産に対する1つの障害は、光合成微生物が、一般に、生産した炭水化物を蓄積するよりもむしろ消費するからである。スクロースまたはトレハロースなどのいくつかの糖は、光合成微生物により一次炭素源として利用されないが、緩慢な同化機構が存在する。再加工機構にも関わらず、このような物質は代謝されずに蓄積されることができる。微生物を適切に操作すれば、同化機構を不活性化することができ、それにより高収量の糖の生産が可能になる。
本明細書において、発酵性糖、特に二糖の光合成微生物による生産方法が提供される。発酵性糖の例は、限定するものではないが、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールおよびマンノシルフルクトースを含む。好ましくは、発酵性糖はスクロースまたはトレハロースである。本方法は、生産の費用対効果を改善するために連続的に行うのに適応することができる。
本方法の種々の実施形態は、発酵性糖を合成できる光合成微生物を用いて実施できる。いくつかの実施形態は、発酵供給原料の生産のために浸透圧およびマトリックス水保護の天然現象を利用し、制御する。一実施形態において、発酵性糖の合成は誘導性である。他の実施形態において、発酵性糖の合成は、遺伝子操作により改変されて構成的に生産されることができる。
発酵性糖生産性光合成微生物は、好ましくはシアノバクテリアである。いくつかの実施形態において、シアノバクテリアは、内因性誘導経路によって二糖を蓄積する。いくつかの実施形態において、トランスジェニックシアノバクテリアは、操作された外因性経路によって二糖を蓄積する。内因性および外因性経路共に、上記でさらに詳細に説明されている。
好ましくは、トランスジェニック光合成微生物は、上記のトランスジェニック光合成微生物の1以上である。
限定するものではないが、二糖を蓄積できるシアノバクテリア株の2例として、シネココッカス・エロンガタスPCC 7942およびシネコシスチス種PCC 6803がある。天然に存在するシネココッカス・エロンガタスPCC 7942は、その許容限界である約700mMまでの塩濃度に暴露することによりスクロースを合成する。agp遺伝子の欠失によりグルコシルグリセロールの生合成がブロックされるとき、シネコシスチス種PCC 6803は、900mMにほぼ等しいその許容限界までの塩濃度に暴露することにより、その浸透圧保護剤としてスクロースを生産する。いくつかの実施形態において、塩誘導は、エアゾール化した生理食塩水を培養表面に直接に塗布することにより達成できる。このプロセスの1つの利点は、その品種の増殖時間に応じて増殖表面に沿って制御可能に塗布することができ、それによって、バイオマスの蓄積およびスクロースなどの二糖の生産のバランスが保たれることである。
発酵性糖を生産するために、固体培地上で、または液体もしくはゲル培地内で光合成微生物を培養できる。光合成微生物の培養および増殖は当該分野で公知である。従って、特記しない限り、光合成微生物の培養および増殖は、このような既知のプロセスに従って実施することができる。例えば、二糖を蓄積するように操作されたトランスジェニックシアノバクテリアは、液体培地内で培養し増殖させることができる。蓄積された糖は、細胞から放出される場合、このような液体培地から単離されることができる。蓄積された糖は、液体培地から収穫した光合成微生物から単離されることができる。一実施形態において、上記のように、トレハロースを蓄積するように操作されたトランスジェニックシアノバクテリアは液体培地内で培養され増殖される。トランスジェニックシアノバクテリアから分泌されるトレハロースは、液体培地から直接に単離されることができる。一実施形態において、上記のように、スクロースを蓄積するように操作されたトランスジェニックシアノバクテリアは、液体培地内で培養され増殖される。スクロースは、液体培地かた収穫した操作されたシアノバクテリアから直接に単離されることができる。一実施形態において、上記のように、スクロースを蓄積し分泌するように操作されたトランスジェニックシアノバクテリアは、液体培地内で培養され増殖される。トランスジェニックシアノバクテリアから分泌されるスクロースは、液体培地から直接に単離されることができる。
好ましくは、光合成微生物は、誘導の前に、1リットル相当量当たり乾燥バイオマス少なくとも約50グラムの比較的高い細胞密度まで培養される。このような比較的高い細胞密度は、本明細書記載の固相フォトバイオリアクターを用いて達成できる。次いで、溶液伝導率により測定される、培地における水の活性を変えるのに有効である適切な塩化合物の所定の濃度で蓄積されたバイオマスを処理することにより、二糖(例えば、スクロース)の生産を開始/誘導できる。さらに好ましい実施形態において、塩化ナトリウムが用いられる塩である。適切な反応期間(例えば、少なくとも約1時間から約48時間以下まで)後に、生産されたスクロースを単離し回収するために、スクロースを蓄積した細胞を収穫し処理することができる。一般的には、適切な反応期間は、少なくとも約5時間から約24時間以下までの範囲内である。より一般的には、適切な反応期間は、少なくとも約10時間から約20時間以下までの範囲内である。
一実施形態において、合成される二糖(例えば、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロール、マンノシルフルクトース)の大部分は、細胞内に蓄積される。他の実施形態において、二糖は細胞によって分泌され、次いでこれはフォトバイオリアクターから回収することができる。二糖が細胞内に存在するかまたは分泌されるかにかかわらず、限定するものではないが、培養表面に塗布される水性スプレー洗浄を含む任意の適切な収穫プロセスを用いて二糖を得ることができる。二糖を単離し回収するために、細胞および/または二糖を含む洗浄液を収穫し処理することができる。
本発明を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲において定義された本発明の範囲を逸脱することなく、修飾、変更および等価な実施形態が可能であることは明らかであろう。さらにまた、当然のことながら、本開示におけるすべての例は、限定するものではない例として提供される。
限定するものではない以下の実施例は、本発明をさらに詳細に説明するために提供される。以下の実施例において開示された技術は、本発明の実施において十分に機能すると本発明者が見出したアプローチを示すものであり、従ってその実施のための方式の例を構成すると考えることができることは、当業者には明らかであろう。しかしながら、本開示を考慮すれば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、なお同様で類似した結果が得られることは当業者には明らかであろう。
固相フォトバイオリアクター
Ziploc(登録商標)の再シール可能なクロージャーを有する2ミルポリエチレンバリア層で構成される静的な原型装置を構築した。60平方センチメートルの通気性パネルを1つの表面に組み込み、225平方センチメートルの綿織物培養担体表面を内部に入れた。この装置を70容量%の水性エタノールで処理することによって滅菌し、次いで、無菌濾過した空気流を用い、50℃で装置を乾燥した。滅菌BG-11培地30mlを培養担体上に吸収させ、次いで、エアゾールアプリケーターを用いて、シネココッカス・エロンガタスPCC 7942の前培養物を増殖表面に接種した。接種の前に、6℃で2日間、BG-11培地中で前培養物を増殖させた。33℃に維持され、白色蛍光ランプを用いて300マイクロアインシュタインで照射されているインキュベーションチャンバーにフォトバイオリアクターを入れた。2日後、リアクターは微生物の活発な増殖を示し、さらに2日間、増殖を継続させ、その後リアクターをインキュベーターからはずし、増殖表面を脱イオン水を洗浄した。蒸発によって水を除去し、乾燥重量254mgのバイオマスを得た。
光合成微生物によるスクロースの生産
以下は、フォトバイオリアクターと組み合わせた光合成微生物によるスクロースの生産方法を例示するための予言的実施例である。約15〜40℃の温度、約60〜300マイクロアインシュタインの照射下、約0.2〜15容量%の二酸化炭素濃度で、シネコシスチス種PCC 6803または操作されたシネコシスチス種のいずれかを用いて、おおよそ4〜7日間、少なくとも1つのフォトバイオリアクター、例えば実施例1または実施例3に記載されているような本発明のフォトバイオリアクターを運転することができる。最初の培養期間後に、エアゾールスプレーを用いて、約0.01〜1.5M、より好ましくは約0.2〜0.9Mの濃度範囲の水性塩溶液で増殖表面を処理できる。スクロースを生産させるために、おおよそさらに1日間から2日間培養を続けさせることができる。次いで、脱イオン水で表面を洗浄することによって、増殖表面を収穫することができる。他の実施形態において、洗浄水は滅菌新鮮培養培地であり、洗浄の厳密さは、約70〜90%の細胞塊が収穫される程度である。次いで、培養担体上に残っているバイオマスを、次のサイクルとして増殖を続けさせる。この培養の収量は、用いられる増殖表面材料および微生物に応じて、乾燥バイオマス約200〜600mgであることが期待される。
吸水性ポリマーでコーティングされた固体培養担体
BG-11培地に分散させた滅菌1.5重量パーセント寒天の加熱溶液で材料の滅菌乾燥表面をディップコーティングにより、実施例1に記載のタイプの静的なフォトバイオリアクターの増殖表面を調製した。コーティングされた増殖表面を冷却し硬化させ、次いで表面を滅菌保護バリアに挿入してフォトバイオリアクター装置を作成し、実施例1に記載の前培養で培養されているシネココッカス種を接種した。本質的に実施例1に記載されているようにして培養および収穫を行った。
asf遺伝子標的
スクロースリン酸シンターゼ(sps)およびスクロースリン酸ホスファターゼ(spp)活性の調節を通して、シアノバクテリアにおけるスクロースの生合成を研究した。浸透圧およびマトリックス水ストレスへの順応のために、このような活性は多くのシアノバクテリアに既に存在している(例えば、Lunn, J. E. 2002. Plant Physiol 128, 1490-1500 を参照のこと)。
Lunn, J. E. (2002. Plant Physiol 128, 1490-1500)は、シネコシスチス種PCC 6803およびシネココッカス・エロンガタスPCC 7942を含むいくつかの微生物のspsおよびspp遺伝子のゲノム構造を解析した。Lunnは、シネコシスチス種PCC 6803(配列番号3)のスクロースリン酸シンターゼ(SPS)が、不活性なスクロースリン酸ホスファターゼ(SPP様)ドメインおよび別個のSPP活性を有することを提案した。SPP様ドメインはsppと高レベルの同一性を有するが、ハロ酸デハロゲナーゼ(HAD)スーパーファミリーの保存された活性部位残基の多くを欠失している。シネココッカス・エロンガタスPCC 7942に関する研究はいまだになされていないが、Lunnは、両方の活性が1つの酵素に含まれていることを提案した。これらの酵素のアラインメントを図5に示す。
シネココッカス・エロンガタスPCC 7942ゲノムの研究により、染色体の他の部分では別個のsps遺伝子が明らかにならなかった。同義遺伝子発現の必要性を避けるために、シネココッカス・エロンガタスPCC 7942酵素(配列番号2)を用いた。PCC 7942からの遺伝子はspsと呼ばれているが、SPSおよびSPP活性の両方を有する1つの融合酵素であるため、活性融合SPS/SPP(配列番号1)の代わりにasfと名づけられた(別個のSPP酵素の可能な発現に関するさらなる情報については下記を参照のこと)。
シネココッカス・エロンガタスPCC 7942のasf遺伝子産物(配列番号2)の発現には2つのアプローチがある。
第1アプローチは、広宿主域ベクターpMMB67EH上に構築されたプラスミドベースの発現系である(Furste, J. P., Pansegrau, W., Frank, R., Blocker, H., Scholz, P., Bagdasarian, M. and Lanka, E. 1986. Gene 48, 119-131)。プラスミドpMMB67EHはRSF1010の誘導体であり、これは大部分のグラム陰性微生物において複製され、一部のグラム陽性微生物においてさえも複製されるため、大腸菌、シネコシスチス種PCC 6803、シネココッカス・エロンガタスPCC 7942および種々の他のシアノバクテリア内でのスクロース生産のプラスミドベースの解析が可能である(Kreps, S., Ferino, F., Mosrin, C., Gerits, J., Mergeay, M. and Thuriaux, P. 1990. Mol Gen Genet 221, 129-133; Marraccini, P., Bulteau, S., Cassier-Chauvat, C., Mermet-Bouvier, P. and Chauvat, F. 1993. Plant Molecular Biology 23, 905-909; Gormley, E. P. and Davies, J. 1991. J Bacteriology 173, 6705-8)。
第2アプローチは、upp(ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ)遺伝子座でのシネコシスチス種PCC 6803およびシネココッカス・エロンガタスPCC 7942の染色体への安定な組み込みである。upp遺伝子座は、下記の理由で選択した。
プラスミドベースの発現
asf遺伝子産物、pLybAL11(例えば、図6;配列番号19参照)およびpLybAL12(例えば、図7;配列番号20参照)のプラスミドベースの発現のために、2つのプラスミドを設計した。所定のプロモーターからの発現のためにプラスミドpLybAL12を構築し、無作為に選択されたプロモーターからの発現のためにpLybAL11を構築した。
2つのプラスミドを以下のように構築した。鋳型として全細胞を用い、オリゴヌクレオチド5'-AGACTACAATTGGGGCGTTTTCTGTGAG-3'(MfeI制限エンドヌクレアーゼ部位はヌクレオチド位置7〜12である)(配列番号7)および5'-CTTACGTGCCGATCAACGTCTCATTCTGAAAAGGTTAAGCGATCGCCTC-3'(配列番号8)を用いるPCRによりシネココッカス・エロンガタスPCC 7942からのasf遺伝子を増幅し、配列番号1の産物を得た。
上流プロモーターの有り無しでの、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子(cat)をpBeloBAC11(GenBankアクセッション番号U51113)から増幅した。
プロモーターを欠くcat遺伝子は、オリゴヌクレオチド5'-TTATCGCGATCGTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAG-3'(配列番号9)および5'-CGACCAATTCACGTGTTTGACAGCTTATC-3'(配列番号10)(PvuIおよびPmlI制限エンドヌクレアーゼ部位は、それぞれヌクレオチド位置4〜9および10〜15である)を用いるPCRによってpBeloBAC11から増幅し、配列番号11の産物を得た。
プロモーターを含むcat遺伝子は、オリゴヌクレオチド5'-TTTTGGCGATCGTGAGACGTTGATCGGCACGTAAG-3'(配列番号12)および5'-CGACCAATTCACGTGTTTGACAGCTTATC-3'(配列番号13)(PvuIおよびPmlI制限エンドヌクレアーゼ部位は、それぞれヌクレオチド位置7〜12および10〜15である)を用いるPCRによってpBeloBAC11から増幅し、配列番号14の産物を得た。
cat遺伝子を含むPCR産物をPvuIで消化し、T4 DNAポリメラーゼで末端を平滑化した。次いでこれらを、個別にasf PCR産物に連結した。得られた産物をアガロースゲル電気泳動で精製し、MfeIおよびPmlIで消化し、次いで、EcoRIおよびHpaIで消化したpMMB67EHの6.6Kbpの産物にT4 DNAリガーゼで連結した。ケミカルコンピテントNEB5α(New England Biolabs社;マサチューセッツ州イプスウィッチ)を連結産物で形質転換し、100μg/mlアンピシリンを添加したLB寒天上37℃で選択した。選択された候補をミニプレップのために100μg/mlアンピシリンを添加したLB中37℃で増殖させ、制限エンドヌクレアーゼ消化物で分析し、次いでオリゴヌクレオチド5'-GCTTCTGCGTTCTGATTTAATCTGTATCAG-3'(配列番号15)、5'-TATCACTTATTCAGGCGTAGCAACCAG-3'(配列番号16)、5'-GTCGTTAGTGACATCGACAACACACTG-3'(配列番号17)、および5'-GATCGCGATACTGATCGAGATAGGTC-3'(配列番号18)を用いる配列分析によって確認した。さらなる研究のために、候補番号5のpLybAL11(pLybAL11-5)(配列番号19)および候補番号1のpLybAL12(pLybAL12-1)(配列番号20)を選択した。
ミニプレップ中のプラスミド収量に基づけば、大腸菌株NEB Turbo(New England Biolabs社;マサチューセッツ州イプスウィッチ)内で増殖させるとき、これらのプラスミドのコピー数は著しく低下していると思われるため、これらのプラスミドのための宿主株の選択における重要性が示唆される。
プロモーター挿入
pLybAL12-5への挿入のために、6つのプロモーターを選択した。カルバモイルリン酸シンターゼをコードするシネコシスチス種PCC 6803 carBの推定プロモーター(遺伝子pyrRのすぐ上流に存在すると考えられ、それらはオペロンとして共転写されると考えられる)を選択した。なぜなら、ピリミジンおよびアルギニン生合成の両方におけるその役割により丈夫であると考えられるからである。シネコシスチス種PCC 6803(Aichi, M., Takatani, N. and Omata, T. 2001. J Bacteriol. 183, 5840-5847)およびシネココッカス・エロンガタスPCC 7942(Maeda, S-I. et al. 1998. J Bacteriol 180, 4080-4088)の両方からの硝酸レダクターゼ(nirA)プロモーターを、窒素供給源により制御されるそれらの能力のために選択した。シネココッカス・エロンガタスPCC 7942からの光化学系II D1タンパク質(psbAII)のための丈夫な明期プロモーター(Golden, S. S., Brusslan, J. and Haselkorn, R. 1986. EMBO Journal 5, 2789-2798)およびシネコシスチス種PCC 6803からの2つの暗期プロモーター[dnaK (Aoki, S., Kondo, T. and Ishiura M. 1995. J Bacteriol 177, 5606-11)およびkaiA(Kucho, K-I. et al. 2005. J Bacteriol 187, 2190-2199)]もまた、調節型シアノバクテリア由来プロモーターとして選択した。最後に、シアノバクテリアにおいて活性であることが示されているλPR温度調節型プロモーターを選択した(Ferino, F. and Chauvat, F. 1989. Gene 84, 257-66; Mermet-Bouvier, P. and Chauvat, F. 1994. Current Microbiology 28, 145-148)。
以下のオリゴヌクレオチドを用いて、鋳型として全細胞を用いるPCRによってプロモーターを増幅し、示されている産物を得た。クローニングに組み込まれている制限エンドヌクレアーゼ部位は、配列中に示されている。
それぞれがヌクレオチド位置7〜12に制限エンドヌクレアーゼ部位を有するオリゴヌクレオチド5'-CGGTGTGCATGCCGTTATTGATGGAATG-3'(配列番号21)および5'-TCACTAGGTACCTAAATTACCTGGGAAGCCAG-3'(配列番号22)を用いるPCRによって、シネコシスチス種PCC 6803 pyrR(SphI/KpnI)(配列番号23)を全細胞から増幅した。
それぞれがヌクレオチド位置7〜12に制限エンドヌクレアーゼ部位を有するオリゴヌクレオチド5'-CCCAAGGCATGCAGGAAAACAAGCTCAGAATGCTG-3'(配列番号24)および5'-TTTATTGGTACCAACGCTTCAAGCCAGATAACAGTAGAGATC-3'(配列番号25)を用いるPCRによって、シネコシスチス種PCC 6803 nirA(SphI/KpnI)(配列番号26)を全細胞から増幅した。
オリゴヌクレオチド5'-ATCTTTGCGTTCCGTGACGGCTACTG-3'(配列番号27)および5'-GCAGATGGTACCGGTCAGCAGAGTG-3'(ヌクレオチド位置7〜12に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する)(配列番号28)を用いるPCRによって、シネココッカス・エロンガタスPCC 7942 psbAII(SphI/KpnI)(配列番号29)を全細胞から増幅した。
それぞれがヌクレオチド位置7〜12に制限エンドヌクレアーゼ部位を有するオリゴヌクレオチド5'-CAGCCAGCATGCATAAATTTCTGTTTTGACCAAACCATCC-3'(配列番号30)および5'-GTGGCTGGTACCATGGATTCATCTGCCTACAAAG-3'(配列番号31)を用いるPCRによって、シネココッカス・エロンガタスPCC 7942 nirA(SphI/KpnI)(配列番号32)を全細胞から増幅した。
それぞれがヌクレオチド位置7〜12に制限エンドヌクレアーゼ部位を有するオリゴヌクレオチド5'-GTGCATTCTAGATGGCTACGAGGGCAGACAGTAAG-3'(配列番号33)および5'-TTCTGTGGTACCATATGGATCCTCCTTCTTAAGATGCAACCATTATCACC-3'(配列番号34)を用いるPCRによって、λPR(XbaI/KpnI)(配列番号35)を全細胞から増幅した。
それぞれがヌクレオチド位置7〜12に制限エンドヌクレアーゼ部位を有するオリゴヌクレオチド5'-GCCCCAGCATGCACCAGTAAACATAAATCTC-3'(配列番号36)および5'-ATTGGTGGTACCGAGGTCAATCCCAACAAC-3'(配列番号37)を用いるによって、シネコシスチス種PCC 6803 dnaK(SphI/KpnI)(配列番号38)を全細胞から増幅した。
それぞれがヌクレオチド位置7〜12に制限エンドヌクレアーゼ部位を有するオリゴヌクレオチド5'-GCCAGAGCATGCAAAGCTCACTAACTGG-3'(配列番号39)および5'-GGAAAAGGTACCTGAGTCTATGGGCAACGTG-3'(配列番号40)を用いるPCRによって、シネコシスチス種PCC 6803 kiaA(SphI/KpnI)(配列番号41)を全細胞から増幅した。
増幅後、PCR産物を上記で示されている制限エンドヌクレアーゼで消化し、ゲル精製し、同様に消化したpLybAL12-1に連結して、それぞれプラスミドpLybAL15(配列番号44)、pLybAL16(配列番号45)、pLybAL17(配列番号46)、pLybAL18(配列番号47)、pLybAL19(配列番号48)、pLybAL21(配列番号49)、およびpLybAL21(配列番号50)を得た。エレクトロコンピテントNEB5α(New England Biolabs社;マサチューセッツ州イプスウィッチ)を連結産物で形質転換し、100μg/mlアンピシリン、34μg/mlクロラムフェニコールおよび5%スクロースを添加したLB寒天上、30℃で選択した。選択された候補をミニプレップのために100μg/mlアンピシリン34μg/mlクロラムフェニコールおよび5%スクロースを添加したLB中30℃で増殖させ、制限エンドヌクレアーゼ消化物で分析し、次いでオリゴヌクレオチド5'-GCTTCTGCGTTCTGATTTAATCTGTATCAG-3'(配列番号42)および5'-ATGGGTCTGAATGTGCAGAATGTAGAG-3'(配列番号43)を用いる配列分析によって確認した。プラスミドpLybAL15(配列番号44)、pLybAL16(配列番号45)、pLybAL17(配列番号46)、pLybAL18(配列番号47)、pLybAL19(配列番号48)、pLybAL21(配列番号49)およびpLybAL21(配列番号50)のそれぞれに対し、候補6および7(pLybAL15-6およびpLybAL15-7)、2(pLybAL16-2)、4および5(pLybAL17-4およびpLybAL17-5)、1および2(pLybAL18-1およびpLybAL18-2)、1および2(pLybAL19-1およびpLybAL19-2)、3および5(pLybAL21-3およびpLybAL21-5)ならびに4および8(pLybAL22-4およびpLybAL22-8)を選択した。
スクロースおよび両抗生物質を添加したLB上でのこれらのプラスミドの選択および増殖は、クローンを得るためには大変重要であった。始めは、アンピシリンのみを添加したLB上で選択を行ったが、プロモーターを含むプラスミドは単離できなかった。単離物は、ベクターのみの再連結反応物であるか、または異なるサイズでクロラムフェニコールの存在下で増殖する能力を欠くものであった。細胞内スクロースが生産され、スクロース生産を防ぐ欠失をもたらす細胞に対する浸透圧ショックが生じたと考えられる。それに続く実験により、ひとたび単離されれば、プラスミドは、おそらくは結果として生じる浸透圧ストレス装置および/またはスクロース消費酵素の誘導により、スクロースの非存在下で安定であることができることを示している。
シネコシスチスおよびシネココッカスの形質転換
プロモーターを含有するプラスミド、pLybAL15(配列番号44)、pLybAL16(配列番号45)、pLybAL17(配列番号46)、pLybAL18(配列番号47)、pLybAL19(配列番号48)、pLybAL21(配列番号49)およびpLybAL21(配列番号50)に加えて、プロモーターを含有しないpLybAL12-1ベクター(配列番号20)(実施例5〜6参照)を、特記しない限り、Elhai,J.and Wolk,C.P.1988.Methods in Enzymology167,747-754に基づいて行う三親接合によって、シネコシスチス種PCC 6803およびシネココッカス・エロンガタスPCC 7942の両方に挿入した。
30℃で増殖させた、カーゴ株(導入されたプラスミドを含むNEB5α)の終夜培養物に加えて、ヘルパープラスミドpRK2013(ATCC37159)を含むHB101の終夜培養物を遠心分離でペレット化し、LBで2回洗浄し、次いで元の容量の10分の1のLBに再懸濁した。おおよそ0.5のOD730への一定の照度下で、微量元素をNitsch微量元素(Nitsch, J. P. and Nitsch, C. 1956. American Journal of Botany 43, 839-851)に置き換えた以外はBG11と同じであるBG11-Aを用いて、30℃で各シアノバクテリアを増殖させた。細胞を遠心分離でペレット化し、BG11-Aで2回洗浄し、7.5倍高い濃度でBG11-Aに再懸濁した。10-5まで、BG11-Aでシアノバクテリアの一連の10倍希釈液を調製した。各希釈液において、シアノバクテリア100μlを、大腸菌のカーゴ株およびヘルパー株のそれぞれ50μlと混合した。次いで、各混合物150μlを、5%LBを添加したBG11-A寒天(1.5%)プレート上にプレーティングした。一定の照度下、26〜28℃で16〜24時間、プレートをインキュベートした。各プレート上の寒天(およそ30ml)を移動させ、100Xクロラムフェニコール溶液300μlを加えた。クロラムフェニコールの最終濃度は、シネコシスチス種PCC 6803に関して25μg/mlであり、シネココッカス・エロンガタスPCC 7942に関しては7.5μg/mlであった。インキュベーションを8〜12日間続けた。接合伝達株の各コロニーを、再度、適切な量のクロラムフェニコールを添加したBG11-A上に再ストリークすることにより汚染した大腸菌を精製除去して単離されたコロニーを得た。
pLybAL11-5におけるプロモーターライブラリー
以下の実施例により、pLybAL11-5(配列番号19)を用いる、プロモーター選択のためのシアノバクテリアDNAのライブラリーの構築を説明する(実施例5参照)。Wilson, K. (1997. Preparation of Genomic DNA from Bacteria. In Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons Vol. 1, pp. 2.4.1-2.4.5)の染色体DNAの単離プロトコルの、改変されたスケールアップバージョンを用いたが、主な違いは、ずっと長いインキュベーション時間およびSDSをサルコシルで置き換えたことであった。単離されたDNAは、pLybAL11-5のBamHI部位への挿入のための部分Sau3AI消化のために十分な品質を有していた。図8に示すように、フラグメントのあるものはプロモーターを有し、他はプロモーターを有さないと考えられる。
ライブラリー構築のプロセス中に、asf遺伝子内の可能なプロモーターが見出された。プロモーターとして機能するためには、クローニングベクター、プラスミドpLybAL11-5(配列番号19)は、プロモーターがasf遺伝子の前に挿入されたときにのみ、クロラムフェニコールに耐性を示すはずである。なぜならこのマーカーは、その通常のプロモーターを欠き、asfの上流のプロモーターは含まれないからである。しかしながら、構築されるやいなや、このプラスミドにより付与されるクロラムフェニコール耐性を大腸菌内で試験した。pLybAL11-5を含むNEB5αを、34μg/mlクロラムフェニコールを添加したLB寒天(1.5%)上37℃で培養したとき、増殖が観察された。しかしながら、34μg/mlクロラムフェニコールを加えた液体LB培地で培養したとき、皆無かそれに近い増殖が観察された。pLybAL12-1(配列番号20)を含むNEB5αは、クロラムフェニコールの存在下、固体および液体LB培地の両方で増殖する。
asf遺伝子の上流であるが、転写ターミネーターの下流であるプロモーターが欠失したものがないか確かめるために、pLybAL11を作成するためにpMMB67EHに挿入したインサートを、Lucigen大腸菌株(E. cloni 10G)コンピテント細胞を含むLucigen's CloneSmartキットを用いるLucigen社(ウィスコンシン州ミドルトン)のpSMART-LCKan平滑末端クローニングベクターにクローニングした(例えば、図9参照)。これが平滑末端化クローニングであったため、インサートはいずれかの方向でプラスミドに連結することが可能であり、pLybAL13f(配列番号51)およびpLyAL13r(配列番号52)が作成された。このベクターは、クローニング部位をターミネーターで囲うことによって、ベクターからの読み通し転写を除去するように特に設計されている。対照として、pLybAL12を構築するために用いたインサートもまたこのベクターに挿入し、pLybAL14f(配列番号53)およびpLybAL14r(配列番号54)を作成した。これらのプラスミドはアガロースゲル上で適切なサイズと思われたが、クローンの完全性を確認されるためのDNA配列決定によりインサートは確認されなかった。しかしながら、pLybAL13およびpLybAL14を含むE.cloni 10Gに関して同様な結果が見られ(fまたはr方向のいずれかに連結されたクローニングされたDNAで)、またpLybAL11(配列番号19)およびpLybAL12(配列番号20)をそれぞれ含むNEB5αに関しても見られた。このことは、このプロモーターの活性が大腸菌内では弱いことを示している。
多くの大腸菌プロモーターは、シアノバクテリアでは機能しないし、逆もまた同様である。このプロモーター活性が、シネコシスチス種PCC 6803またはシネココッカス・エロンガタスPCC 7942では観察されない可能性がある。この事を確認するために、前述のように、接合によって、両方の微生物にpLybAL11-5(配列番号19)を挿入した。クロラムフェニコール(シネコシスチス種PCC 6803およびシネココッカス・エロンガタスPCC 7942に対して、それぞれ、25μg/mlおよび7.5μg/ml)を添加したBG11-A寒天(1.5%)上で増殖が観察された。
クロラムフェニコールを添加した液体BG11-A上で、pLybAL11-5(配列番号19)を含むこれらの微生物の増殖を試験した。この活性は大変弱く、多重コピープラスミドで存在する場合のみ観察される可能性がある。これは大腸菌での場合であって、シアノバクテリアではそうではないと思われる。RSF1010は、比較的低コピーのプラスミドであり、大腸菌内で12コピーのみを有する(Frey, J., Bagdasarian, M. M. and Bagdasarian, M. 1992). Gene 113,101-106)。急速な分裂を行っている大腸菌は、多くてその染色体を2コピー有し、従って少なくとも6倍のコピー数増加を有する。このプラスミドに関するシアノバクテリアにおける同等のコピー数は同様である。シネコシスチス種PCC 6803およびシネココッカス・エロンガタスPCC 7942の、それぞれ10〜12および16の染色体コピー数は類似している(Labarre, J., Chauvat, F. and Thuriaux, P. 1989. J Bacteriol 171, 3449-57)。上記の結果は、シアノバクテリアのasf遺伝子内のプロモーターの存在を示唆している。
図10は、asf遺伝子内のプロモーター(単数または複数)の可能な位置を示している。転写開始領域は、Curtis, S. E. [1994. The transcription apparatus and the regulation of transcription initiation. In The Molecular Biology of Cyanobacteria. Bryant, D. A. (ed). Kluwer Academic Publishers pp. 613-699] に記載されている。翻訳開始領域は、Sazuka, T. and Ohara, O. (1996. DNA Research 3, 225-232)によって定義されている。
既知のSPS酵素に対するアラインメントおよびただ2コドン上流の終止コドンの存在に基づいて、asf遺伝子の翻訳開始はGTG開始コドンで開始されると予想される。ATG開始コドンが最も一般的とはいえ、GTGおよびTTGはあまり一般的ではないがまれではない。アデニンヌクレオチドが、好ましくは開始コドンの第1ヌクレオチド9〜12bp離れた16S rRNAの3'末端に相補的な典型的な大腸菌様シャイン・ダルガノ配列(GGAGまたはGAGG)もまた、少し長めのスペースではあるが存在する。この配列は、SazukaおよびOharaによって研究された遺伝子の約半分において見出されている。あまり最適ではないスペースはまれではないが、多くの場合発現のレベル低下をもたらす。シャイン・ダルガノ配列の上流であってMfeI部位の下流には、プロモーターを組み込むためには配列が少なすぎる。部分プロモーターが組み込まれることは可能ではあるが、プロモーターの残りは3つのプラスミド(pLybAL11-5(配列番号19);pLybAL13f(配列番号51);およびpLybAL13r(配列番号52))のすべてのベクター配列により産生されなけらばならず、それはありそうもない。
従って、プロモーター活性はasf遺伝子内に位置すると考えられる。プロモーターがasf遺伝子内にあるとすれば、1つの可能な位置がasfのSPPドメインの前である。これは、シネコシスチス種PCC 6803からのものと同様な四次構造であるシネココッカス・エロンガタスPCC 7942のスクロース生合成酵素を与える。各微生物は、SPPと翻訳的に融合されたSPSドメインまたはSPP様ドメインおよび、互いに相互作用できる(できない)別個のSPPの2つのタンパク質を有すると考えられる。
第1に、asfのSPPドメインが別々に翻訳されうるかどうか決定した。図10および表1に示すように、シャイン・ダルガノ配列に先行するSPPドメインのすぐ上流のTTG開始コドンが存在する。
開始コドンの周囲の領域は、天然開始コドンとほぼ同様に、SazukaおよびOharaによって決定された72シアノバクテリア遺伝子のコンセンサスと一致する。プロモーターが大腸菌内で活性であると考えられることから、大腸菌プロモーターに関して確立されたルールに基づいてシアノバクテリアプロモーターを決定する一方で、典型的な-35および-10領域を調べた。図10に見られるように、2つの可能なプロモーターが同定された。asfの他の部分でのさらなるプロモーター(単数または複数)の可能性は残っている。
大腸菌からのプラスミドのシアノバクテリアへの導入
シアノバクテリアへのpMMB67EHベースプラスミドの導入のために接合を用いた。これらの微生物の形質転換のためのプロトコルは存在するが(Zang, X., Liu, B., Liu, S., Arunakumara, K. K. I. U. and Zhang, X. 2007. Journal of Microbiology 45, 241-245; Golden, S. S. and Sherman, L. A.1984. Journal of Bacteriology 158, 36-42)、天然形質転換を用いるシネコシスチス種PCC 6803およびシネココッカス・エロンガタスPCC 7942へこれらのプラスミドを挿入するこのようなアプローチは不成功に終わった。
シアノバクテリアにおけるプラスミドの存在は確認した。オリゴヌクレオチド5'-AGACTACAATTGGGGCGTTTTCTGTGAG-3'(配列番号7)および5'-GGTGGTTGTGTTTGACAGCTTATC-3'(配列番号55)を用いて、asf/cat遺伝子組み合わせのPCRによってプラスミドの存在に関して接合伝達株を分析し、3.1kbの産物を得た。さらに、プラスミドを単離し、分析した。クロラムフェニコール(前述の濃度で)を添加したBG11-A中で増殖させた細胞培養物を遠心分離でペレット化し、TEに再懸濁し、熱処理し、Promega Wizard SV Plusミニプレップキットでミニプレップした。しかしながら収率が低いので、直接のプラスミド分析は困難である。それとして、単離されたDNAを大腸菌NEB5αに形質転換し、Promega Wizard SV Plusミニプレップキットを用いて再単離し、制限エンドヌクレアーゼ分析にかけた。
スクロース生産アッセイおよび分析
スクロース蓄積に関して、pLybAL19またはpLybAL17を用いるシネココッカス形質転換をアッセイした(実施例7参照)。BioVision社(カリフォルニア州マウンテンビュー)のスクロースアッセイキットを用いてスクロースを用いて測定する。4時間の誘導期間(pLybAL17(配列番号46)に関する、50マイクロアインシュタインから180マイクロアインシュタインへの光の増強およびpLybAL19(配列番号48)に関する、26℃から39℃への温度の上昇)後にアッセイを行った。細胞内に存在するバックグラウンドのグルコースに関してデータを補正した。
pLybAL19(配列番号48)で形質転換したシネココッカスは、乾燥バイオマス1mg当たり0.78ナノモルのスクロースを蓄積したという結果が得られた。pLybAL17(配列番号46)で形質転換したシネココッカスは、乾燥バイオマス1mg当たり0.95ナノモルのスクロースを蓄積したという結果も得られた。
大腸菌、シネコシスチス種PCC 6803およびシネココッカス・エロンガタスPCC 7942におけるプラスミドベースのスクロース生産のさらなる分析を行った。細菌はスクロースを消費できるので、検出は困難な可能性がある。そのようなものとして、抑制条件下で細胞を増殖させ、誘導後直ちにアッセイした。pyrRプロモーターは、ウラシルを含む増殖により抑制され、ウラシルを欠く培地に移すことにより誘導されることができる。nirAプロモーターは、窒素源としてアンモニウムイオンを含む増殖により抑制され、窒素源として硝酸塩を含む培地に移すことにより誘導されることができる。psbAIIプロモーターは、微光から高照度へ移行させることができる。暗期プロモーターは、明から暗へ移行させることができる。そしてλPRプロモーターは、低温(25℃)から高温(39℃)へ移行させることができる。
安定な染色体組み込みによる発現
スクロース生合成遺伝子の挿入は、10-16染色体の不完全分離をもたらす細胞増殖への悪影響を引き起こす恐れがある。抗生物質耐性マーカーに関する通常の選択を用いても、マーカーのさらなるコピーを有することは、抗生物質の存在下で生き残る細胞の能力に劇的な影響を与えない。従って、陰性表現型に直面する場合、抗生物質選択を用いても、染色体の完全分離を達成することは困難な恐れがある。
大部分の生物において、upp遺伝子(ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする)の欠失は、さもなければ毒性の5-フルオロウラシルに対して耐性をもたらす。完全耐性を得るためには、upp遺伝子のすべてのコピーが欠失されなければならない。従って、シネコシスチス種PCC 6803(配列番号56)およびシネココッカス・エロンガタスPCC 7942(配列番号58)のupp遺伝子座への組み込みは、5-フルオロウラシル耐性をもたらし、陰性表現型の存在下であっても、完全分離の正の選択を可能にする。
upp/カナマイシン耐性カセット
upp/カナマイシン耐性カセットを用いるゲノム操作のための一般的戦略の概略を図11に示す。遺伝子の欠失が示されているが、この戦略は、“置換”ステップにおいて挿入および変異に容易に改変できる。
upp/カナマイシン耐性カセットを構築した。製造業者のプロトコルに従って、平滑末端クローニングベクターpCC1および大腸菌株EPI300を用いて、Epicentre Bioechnologies CopyControlクローニングキットでカセットを構築した。オリゴヌクレオチド5'-AAGAAGCAAGACAGCGTGTAGCTGCTCTGACTG-3'(配列番号60)および5'-TCCCGGGATTTGGTACCTTATTTTGTTCCAAACATGCGGTCACCCGCATC-3'(ヌクレオチド位置2〜7および12〜17に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する)(配列番号61)を持ちいて、全細胞からバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)168からのupp遺伝子を増幅して配列番号62の産物を得た。
PCR産物をpCC1にクローニングし、Epicentre Biotechnologies社のプロトコルの記載に従って、クロラムフェニコールを添加したLB上でインサートを含むものを選択した。制限エンドヌクレアーゼ消化物によって、lacZに対して順方向をスクリーニングして、pLybAL7f(配列番号65)を得た。インサートの正確な配列を、候補3および8(pLybAL7-3およびpLybAL7-8)に関して、オリゴヌクレオチド5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'(配列番号63)および5'-CACACAGGAAACAGCTATGACCAT-3'(配列番号64)を用いるDNA配列決定によって確認した。
LybradynベクターpLybAA1[そもそもはpACYC177に由来する(Rose,R.E.1988.Nucleic Acids Res.16、356]からのカナマイシン耐性マーカーを、オリゴヌクレオチド5'-GTCAGTGCACTGCTCTGCCAGTGTTACAACC-3'(ヌクレオチド位置5〜10でApaLI制限エンドヌクレアーゼ部位を有する)(配列番号66)および5'-CTCAGTGGCGCCAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTC-3'(配列番号67)(ヌクレオチド位置7〜12でNarI制限エンドヌクレアーゼ部位を有する)を用いて増幅し、配列番号68の産物を得た。
PCR産物をApaLIおよびNarIで消化し、同様に消化したpLybAL7fに連結して、pLybAL8f(配列番号69)を得た。50μg/mlネオマイシンを添加したLB上で適切なプラスミドを選択し、制限エンドヌクレアーゼ消化で試験した。
UPP欠失
スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールおよびマンノシルフルクトースを含む糖の発現のための染色体インサートの分離を強いる1つの戦略は、染色体からのuppの欠失を利用して、5-フルオロウラシルへの耐性を導くことである。このことは、多くの微生物(大腸菌および枯草菌など)において確立されているが、シネコシスチス種PCC 6803およびシネココッカス・エロンガタスPCC 7942などのシアノバクテリアに関しては、以前は確立されていなかった。
試験により、これらの微生物のそれぞれの増殖が、1μg/mlの5-フルオロウラシルにより完全に抑制されることが示された。シネコシスチス種PCC 6803の増殖は0.5μg/mlの5-フルオロウラシルによって完全に抑制され、0.1μg/mlの5-フルオロウラシルまで感受性を示した。
オリゴヌクレオチドSspupp-F(配列番号96)およびSspupp-R(配列番号97)を用いて、両方のシネコシスチス種PCC 6803のupp遺伝子および周囲の配列を増幅した。オリゴヌクレオチドSeloupp-F(配列番号98)およびSeloupp-R(配列番号99)を用いて、シネココッカス・エロンガタスPCC 7942のupp遺伝子および周囲の配列を増幅した。次いで、PCR産物(シネコシスチス種PCC 6803のupp、配列番号100;シネココッカス・エロンガタスPCC 7942のupp、配列番号101)を、製造業者の使用説明書により、Epicentre Biotechnologies社(ウィスコンシン州マディソン)平滑クローニングベクターpCC1にクローニングした。
PCR産物(配列番号100または配列番号101)は、pCC1にいずれかの方向で連結することができるが、lacプロモーターに対して順方向を選択し、それぞれ、pLybAL3f(配列番号102)(シネコシスチス種PCC 6803のuppを含む)およびpLybAL5f(配列番号103)(シネココッカス・エロンガタスPCC 7942のuppを含む)を得た。オリゴヌクレオチドT7long(配列番号104)およびM13rev(配列番号105)を用いてインサートを配列決定した。シネコシスチス種PCC 6803のuppのヌクレオチド配列は配列番号111で表され、ポリペプチド配列は配列番号112で表される。シネココッカス・エロンガタスPCC 7942のuppのヌクレオチド配列は配列番号113で表され、ポリペプチド配列は配列番号114で表される。
pLybAL3f(配列番号102)からBlpIおよびApaLIフラグメントを除去し、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化し、次いでT4 DNAリガーゼで再環状化して、プラスミドpLybAL4f(配列番号106)を作成した。次いで、pLybAL4fをAvrIIおよびSgfIで消化することによって、シネコシスチス種PCC 6803のupp遺伝子の一部を欠失させ、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化し、次いでT4 DNAリガーゼで再環状化して、pLybAL9f(配列番号107)を作成した。シアノバクテリアDNAを含むSacI/SphIフラグメント(配列番号108)をpLybAL9f(配列番号107)から切除し、同様に消化したpARO180(配列は完全には知られていない; Parke, D. 1990. Construction of mobilizable vectors derived from plasmids RP4, pUC18 and pUC19. Gene 93:135-137; ATCC 77123)に連結し、pLybAL25を作成した。pLybAL5fからSapIおよびApaLIフラグメントを除去し、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化し、次いでT4 DNAリガーゼで再環状化して、プラスミドpLybAL6fb(配列番号109)を作成した。次いで、BssHIIおよびBsaIでpLybAL6fbを消化することによってシネココッカス・エロンガタスPCC 7942のupp遺伝子の一部を欠失させ、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化し、次いでT4 DNAリガーゼで再環状化してpLybAL10fb(配列番号110)を作成した。pLybAL10fbからシアノバクテリアDNAを含むSacI/SphIフラグメント(配列番号138)を切除し、同様に消化したpARO180に連結してpLybAL26を作成した。
プラスミドpLybAL25およびpLybAL26を大腸菌S17-1(ATCC47055)に挿入した。プラスミドpLybAL25およびpLybAL26は、二親接合によってシネコシスチス種PCC 6803およびシネココッカス・エロンガタスPCC 7942に導入される予定である。これらのプラスミドはシアノバクテリア内で複製されないため、自殺ベクターとして機能し、染色体に乗り換え、染色体のコピーの1つにあるuppを欠失させるだろう。過剰の5-フルオロウラシルへの早期暴露による最適化されたプロトコルにより、細胞を致死させることなく分離の高速化が可能になると考えられる。
スクロース分解酵素の修飾
asfで形質転換されたシアノバクテリアが、スクロース分解活性の調節によってスクロース生産が改善されるように、さらに操作される。
本発明者らは、シネコシスチス種PCC 6803(ヌクレオチド配列配列番号70;ポリペプチド配列配列番号71)およびシネココッカス・エロンガタスPCC 7942(ヌクレオチド配列配列番号72;ポリペプチド配列配列番号73)の両方において、インベルターゼホモログをコードする遺伝子を同定した。シネコシスチス種PCC 6803はまた、スクラーゼフェレドキシン様タンパク質(ヌクレオチド配列配列番号74;ポリペプチド配列配列番号75)(Machray G.C. et al. 1994. FEBS Lett 354, 123-127)をコードする。
これらの遺伝子は、図11に示すマーカーレス欠失プロトコルを用いて欠失される。
スクロース分解酵素の修飾
asfで形質転換されたシアノバクテリアが、細胞からのスクロース分泌を促進するようにさらに操作される。
高塩環境から低塩環境へ移行するときに一部の微生物によって浸透圧保護剤が処理されるのと同様に、低い浸透圧環境においては、スクロースは細胞から自動的に削除される可能性がある(Schleyer, M., Schmidt, R. and Bakker, E. P. 1993. Arch Microbiol 160, 424-43; Koo, S. P., Higgins, C. F. and Booth, I. R. 1991. J Gen Microbiol 137, 2617-2625; Lamark, T., Styrvold, O. B. and Strgim, A. R. 1992. FEMS Microbiol. Lett 96, 149-154)。シアノバクテリアの操作によってこのようなプロセスを促進させることができる。
asfで形質転換されたシアノバクテリアが、スクロース透過酵素、例えば大腸菌およびサルモネラによって用いられているスクロース透過酵素または特定のシアノバクテリアの窒素固定包嚢へのスクロースの輸送におけるスクロース透過酵素を発現するようにさらに操作される(Jahreis K. et al. 2002. J Bacteriol 184, 5307-5316; Cumino, A. C. 2007. Plant Physiol 143, 1385-97)。これらの遺伝子をクローニングし、前述の技術に従ってシアノバクテリアを形質転換する。
ポリンで形質転換したシアノバクテリアによるスクロース分泌
シネコシスチス種PCC 6803およびシネココッカス・エロンガタスPCC 7942からのスクロース分泌は、スクロースポリンでの形質転換によって促進させることができる。
エンテロバクター・サカザキ(Enterobacter sakazakii)(ATCC BAA-894)からのスクロースポリンをコードする遺伝子(scrY)を、シネコシスチス種PCC 6803およびシネココッカス・エロンガタスPCC 7942における発現のためにクローニングした。この遺伝子の機能は、その配列およびその近傍の配列から推測されている。エンテロバクター・サカザキscrYは、オリゴヌクレオチドEsscrYBamHI-F(配列番号88)およびEsscrYSacI-R(配列番号89)を用いるPCRによって染色体DNAから増幅した。PCR産物(配列番号90)をBamHIおよびSacIで消化し、同様に消化したpLybAL19に連結し、NEB5αにクローニングし、pLybAL32(配列番号91)を作成した。次いで、オリゴヌクレオチドEsscrYmidseq-F(配列番号92)およびEsscrYmidseq-R(配列番号93)を用いてscrY遺伝子(核酸配列番号94;ポリペプチド配列、配列番号95)を配列決定した。宿主に導入されたとき、この構築物は、遺伝子scrYおよび温度誘導性プロモーターの調節下に有るasfの同時発現を可能にする。このプラスミドは、三親接合によって(前述のように)シネコシスチス種PCC 6803に導入された。スクロース分泌における有効性に関して、形質転換されたシネコシスチス種PCC 6803が試験される。シネココッカス・エロンガタスPCC 7942の同様な形質転換および試験が次に行われる。
トレハロース蓄積シアノバクテリアの作成
大腸菌からのトレハロースリン酸シンターゼおよびトレハロースリン酸ホスファターゼをコードするトレハロース生合成遺伝子(それぞれotsAおよびotsB)は、2遺伝子オペロン、otsBA(配列番号115)において見出される。オリゴヌクレオチドEcotsBA-F(配列番号116)およびEcotsBA-R(配列番号117)を用いる大腸菌K12ゲノムDNAのPCR増幅によってこのオペロンをクローニングした。このPCR産物をAflIIおよびNheIで消化し、pLybAL19(配列番号48)にクローニングし、asf遺伝子の大部分を置換した。新規プラスミド、pLybAL23(配列番号118)は、温度誘導性λPRプロモーターの調節下に有るトレハロース生合成遺伝子を含んでいる。オリゴヌクレオチドEcotsBAmidseq-F(配列番号119)およびEcotsBAmidseq-R(配列番号120)を用いてこの遺伝子を配列決定し、その完全性を確認した。次いで、AflII(T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化した)/otsBAオペロンを含むpLybAL23のNheIフラグメントをpLybAL15、pLybAL17、pLybAL21およびpLybAL22に連結し、SacI(T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化した)およびNheIで消化し、それぞれpLybAL28(配列番号121)、pLybAL29(配列番号122)、pLybAL30(配列番号123)、およびpLybAL31(配列番号124)を作成することによって、otsBAオペロンの発現をpyrR、psbAII、dnaKおよびkiaAプロモーターの調節下においた(前述のように)。
プラスミドpLybAL28(配列番号121)、pLybAL29(配列番号122)、pLybAL30(配列番号123)およびpLybAL31(配列番号124)のそれぞれを、三親接合(前述のように)によってシネコシスチス種PCC 6803に挿入した。
それぞれpLybAL36(配列番号125)およびpLybAL37(配列番号126)を作成することにより、他のプロモーターに関して記載したもの同様にして、pLybAL23からのotsBAオペロンの発現を、pLybAL16およびpLybAL18におけるシネコシスチス種PCC 6803およびシネココッカス・エロンガタスPCC 7942nirAプロモーター(前述のように)の調節下においた。
トレハロースアッセイ
バイオマスを、必要に応じて遠心分離により培養液を分離し、0.2ミクロンフィルターを用いる濾過により清澄化した培養液から残留バイオマスを除去した。減圧下で蒸発させることにより培養液を濃縮して残渣を得た。濃縮した培養液を脱イオン水1mlに溶解し、次いで、トレハロースアッセイにおいて溶液10マイクロリットルをサンプリングした。遠心分離によって回収したバイオマスを計量皿に移し、100℃に加熱して残った水分を除去した。乾燥バイオマスの重さを量り、次いで試料100mgを脱イオン水1mlに溶解した。次いでこの混合物を粉砕し、固形物を遠心分離で除去した。清澄化した上清試料10マイクロリットルを脱イオン水で100倍に希釈し、希釈サンプル10マイクロリットルをトレハロースに関して試験した。
トレハロースアッセイには、Biovision社から入手可能な市販のスクロースアッセイキットの改変手順を用いた。標準プロトコルの改変は、キットに付属しているインベルターゼ酵素溶液のためのトレハラーゼを置き換えることであった。このキットは、トレハロースをトレハラーゼで加水分解してグルコースを放出させることを含む。グルコースはグルコースオキシダーゼで酸化されて過酸化水素を生じ、これは呈色指示薬の存在下でペルオキシダーゼの作用によって検出される。570nmにおけるその特性吸収によって呈色指示薬を定量的に測定し、もとから試料中に存在したグルコースの濃度を得る。
Gutierrez C, Ardourel M, Bremer E, Middendorf A, Boos W, Ehmann U.Mol Gen Genet. 1989 Jun;217(2-3):347-54 の記載と同様な方法に従って、プラスミドに操作し、大腸菌宿主を形質転換した組換え大腸菌treA遺伝子からトレハラーゼ(トレハラーゼポリペプチド配列番号135をコードするtreA核酸配列番号134)を製造した。treAによりコードされるペリプラズムのトレハラーゼを大腸菌K12からクローニングした。treA PCR産物(配列番号127)をAflII/XbaIで消化し、次いで同様に消化したpLybCB6(強力な大腸菌trpプロモーターの構成的バージョンを含む登録商標プラスミド)に連結し、pLybAL24(配列番号130)を作成した。オリゴヌクレオチドEctreAmidseq-FおよびEctreAmidseq-Rで配列決定することによりインサートの完全性を分析した。
トレハラーゼのC末端His6タグ付きバージョンを構築した。オリゴヌクレオチドEctreA-F2(配列番号131)およびEctreA-R2(配列番号132)を用いるPCRで遺伝子を増幅した。次いでPCR産物(配列番号136)をAflII/XbaIで消化し、次いで同様に消化したpLybAL24に連結してpLybAL33(配列番号133)を作成した。
ペリプラズムのトレハラーゼの強力な構成発現は細胞に有害であり、37℃で強い増殖欠損を引き起こす。これは、30℃で細胞を増殖させることにより顕著に軽減させることができる。
カナマイシンを含む2xYT培地中で増殖させた大腸菌BW25113内で、プラスミドpLYBAL24(配列番号130)上のタンパク質を発現させた。ペリプラズムへのタンパク質の輸送を可能にするシグナルペプチドを含むタンパク質を、Trpプロモーターを用いて構成的に産生させた。発酵およびバイオマスの収穫後、洗浄し、再懸濁した細胞ペレットを2%v/vジクロロメタン/50mMトリス緩衝液(pH8)で処理することによる選択的ペリプラズム放出によって酵素を精製した。遠心分離によって細胞の破片から溶解物を分離し、10,000ダルトンの膜を備えたAmicon社のウルトラフィルターを用いる濃縮によってさらに処理した。濃縮された溶解物をアッセイに直接に用いることもでき、酵素(配列番号137)のC末端に操作された6Xポリヒスチジンタグを用いる金属イオンアフィニティークロマトグラフィーによって酵素をさらに精製することもできる。
トレハロースの固相生産
15cm x 15cmを有する増殖表面として使用される布層(DuPont社Sontara)に、培地/水分リザーバー(Foamex社Aquazone)として使用される担体フォームで構成される、固体複合布で覆われる親水性フォームを結合させた。70%エタノール水溶液に浸すことにより複合材料を滅菌し、次いで複合材料の頂部に溶液を供給するために垂直にされた垂直バイオリアクターにつるした。重力によって溶液を増殖複合材料表面に浸透させた。0.2ml/分の流速で滅菌脱イオン水を1リットル通過させることによって滅菌増殖表面から残留エタノールを除去した。0.2ml/分で、複合材料を通して10マイクログラム/mlのクロラムフェニコールを含むBG11A増殖培地0.5リットルを流すことによって、増殖表面を培地で平衡化した。
平衡化した滅菌増殖表面に、プラスミドpLYBAL23によって形質転換したシネコシスチス種PCC 6803の4日間前培養物10mlを表面に注ぐことにより接種した。30分間のインキュベーション後に垂直位置にリアクターを向け、発酵を開始させた。白色LEDアレイからの80マイクロアインシュタインの光でリアクターを照射した。バイオリアクターに取り付けられた抵抗加熱装置によって温度を28℃に維持した。リアクターには、0.2L/分で0.2ミクロンのろ過空気で連続的にパージし、増殖複合材料のフォーム層を通して、6時間毎に30分間0.2ml/分の速度でポンプおよび重力浸透によって新鮮培地を供給した。リアクターを連続的に4〜7日間運転し、その間に、複合材料の増殖表面は、シアノバクテリアの密集した芝生で覆われた。最初の培養期間後にバイオリアクターの温度を40℃に上げ、この温度にさらに24時間維持した。高温期間中、使用済の培養液を回収し、トレハロース測定のために処理した。発酵運転の完了時に、トレハロースアッセイのために処理することができる脱イオン水で増殖表面をすすぐことによりバイオマスを回収した。
固体表面に増殖するバイオマス中に生産され保持されるトレハロースの量は、温度誘導後にバイオリアクターから回収されるバイオマス全乾燥重量の最大2.5重量%までであった。温度誘導後の培地から、乾燥バイオマス相当量の0.8重量%のトレハロースを回収した。
トレハロース生産液相
Bioflowリアクター中で、10マイクログラム/mlの濃度までクロラムフェニコールを添加した滅菌BG11A培地1リットルを調製した。次いで、プラスミドpLYBAL23で形質転換したシネコシスチス種PCC 6803の4日間前培養物を5容量%リアクターに接種した。リアクターを28℃、300RPM、0.2L/分の0.2ミクロンろ過空気パージで運転し、蛍光電球アレイを用いて80マイクロアインシュタインの光で照射した。培養を4〜7日間維持し、次いで試料200mlを取り出し、処理およびトレハロースアッセイを行った。次いで発酵温度を24時間40℃に上げた。次いで試料200mlをバイオリアクターから取り出し、処理およびトレハロースアッセイを行った。
温度誘導後、乾燥バイオマスは最大3重量%までのトレハロースを産生したが、使用済の培養液は、バイオマスに対して0.3重量%トレハロース相当量を含んでいた。
引用文献
本願においては、すべての公報、特許、特許出願および他の引用文献は、あたかも個別の公報、特許、特許出願または他の引用文献が、個別具体的に示されて参照によりその全体が組み込まれるのと同じ様に、その全体が参照により本願に組み込まれる。本願における引用文献の引用は、これが本発明の先行技術であるという承認ではない。
SEQUENCE LISTING

<110> Proterro, Inc.

<120> TRANSGENIC PHOTOSYNTHETIC MICROORGANISMS AND PHOTOBIOREACTOR

<130> X1R-1460

<140> PCT/US2009/030162
<141> 2009-01-05

<150> US 61/018798
<151> 2008-01-03

<150> US 61/085797
<151> 2008-08-01

<160> 138

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 2204
<212> DNA
<213> Synechococcus PCC7942

<400> 1
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cattctgcac attcagaccc atggtctgct gcgagggcag aacttggaac tggggcgaga 120

tgccgacacc ggcgggcaga ccaagtacgt cttagaactg gctcaagccc aagctaaatc 180

cccacaagtc caacaagtcg acatcatcac ccgccaaatc accgaccccc gcgtcagtgt 240

tggttacagt caggcgatcg aaccctttgc gcccaaaggt cggattgtcc gtttgccttt 300

tggccccaaa cgctacctcc gtaaagagct gctttggccc catctctaca cctttgcgga 360

tgcaattctc caatatctgg ctcagcaaaa gcgcaccccg acttggattc aggcccacta 420

tgctgatgct ggccaagtgg gatcactgct gagtcgctgg ttgaatgtac cgctaatttt 480

cacagggcat tctctggggc ggatcaagct aaaaaagctg ttggagcaag actggccgct 540

tgaggaaatt gaagcgcaat tcaatattca acagcgaatt gatgcggagg agatgacgct 600

cactcatgct gactggattg tcgccagcac tcagcaggaa gtggaggagc aataccgcgt 660

ttacgatcgc tacaacccag agcgcaagct tgtcattcca ccgggtgtcg ataccgatcg 720

cttcaggttt cagcccttgg gcgatcgcgg tgttgttctc caacaggaac tgagccgctt 780

tctgcgcgac ccagaaaaac ctcaaattct ctgcctctgt cgccccgcac ctcgcaaaaa 840

tgtaccggcg ctggtgcgag cctttggcga acatccttgg ctgcgcaaaa aagccaacct 900

tgtcttagta ctgggcagcc gccaagacat caaccagatg gatcgcggca gtcggcaggt 960

gttccaagag attttccatc tggtcgatcg ctacgacctc tacggcagcg tcgcctatcc 1020

caaacagcat caggctgatg atgtgccgga gttctatcgc ctagcggctc attccggcgg 1080

ggtattcgtc aatccggcgc tgaccgaacc ttttggtttg acaattttgg aggcaggaag 1140

ctgcggcgtg ccggtggtgg caacccatga tggcggcccc caggaaattc tcaaacactg 1200

tgatttcggc actttagttg atgtcagccg acccgctaat atcgcgactg cactcgccac 1260

cctgctgagc gatcgcgatc tttggcagtg ctatcaccgc aatggcattg aaaaagttcc 1320

cgcccattac agctgggatc aacatgtcaa taccctgttt gagcgcatgg aaacggtggc 1380

tttgcctcgt cgtcgtgctg tcagtttcgt acggagtcgc aaacgcttga ttgatgccaa 1440

acgccttgtc gttagtgaca tcgacaacac actgttgggc gatcgtcaag gactcgagaa 1500

tttaatgacc tatctcgatc agtatcgcga tcattttgcc tttggaattg ccacggggcg 1560

tcgcctagac tctgcccaag aagtcttgaa agagtggggc gttccttcgc caaacttctg 1620

ggtgacttcc gtcggcagcg agattcacta tggcaccgat gctgaaccgg atatcagctg 1680

ggaaaagcat atcaatcgca actggaatcc tcagcgaatt cgggcagtaa tggcacaact 1740

accctttctt gaactgcagc cggaagagga tcaaacaccc ttcaaagtca gcttctttgt 1800

ccgcgatcgc cacgagactg tgctgcgaga agtacggcaa catcttcgcc gccatcgcct 1860

gcggctgaag tcaatctatt cccatcagga gtttcttgac attctgccgc tagctgcctc 1920

gaaaggggat gcgattcgcc acctctcact ccgctggcgg attcctcttg agaacatttt 1980

ggtggcaggc gattctggta acgatgagga aatgctcaag ggccataatc tcggcgttgt 2040

agttggcaat tactcaccgg aattggagcc actgcgcagc tacgagcgcg tctattttgc 2100

tgagggccac tatgctaatg gcattctgga agccttaaaa cactatcgct tttttgaggc 2160

gatcgcttaa ccttttcaga atgagacgtt gatcggcacg taag 2204


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<211> 709
<212> PRT
<213> Synechococcus PCC7942

<400> 2

Met Ala Ala Gln Asn Leu Tyr Ile Leu His Ile Gln Thr His Gly Leu
1 5 10 15


Leu Arg Gly Gln Asn Leu Glu Leu Gly Arg Asp Ala Asp Thr Gly Gly
20 25 30


Gln Thr Lys Tyr Val Leu Glu Leu Ala Gln Ala Gln Ala Lys Ser Pro
35 40 45


Gln Val Gln Gln Val Asp Ile Ile Thr Arg Gln Ile Thr Asp Pro Arg
50 55 60


Val Ser Val Gly Tyr Ser Gln Ala Ile Glu Pro Phe Ala Pro Lys Gly
65 70 75 80


Arg Ile Val Arg Leu Pro Phe Gly Pro Lys Arg Tyr Leu Arg Lys Glu
85 90 95


Leu Leu Trp Pro His Leu Tyr Thr Phe Ala Asp Ala Ile Leu Gln Tyr
100 105 110


Leu Ala Gln Gln Lys Arg Thr Pro Thr Trp Ile Gln Ala His Tyr Ala
115 120 125


Asp Ala Gly Gln Val Gly Ser Leu Leu Ser Arg Trp Leu Asn Val Pro
130 135 140


Leu Ile Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Arg Ile Lys Leu Lys Lys Leu
145 150 155 160


Leu Glu Gln Asp Trp Pro Leu Glu Glu Ile Glu Ala Gln Phe Asn Ile
165 170 175


Gln Gln Arg Ile Asp Ala Glu Glu Met Thr Leu Thr His Ala Asp Trp
180 185 190


Ile Val Ala Ser Thr Gln Gln Glu Val Glu Glu Gln Tyr Arg Val Tyr
195 200 205


Asp Arg Tyr Asn Pro Glu Arg Lys Leu Val Ile Pro Pro Gly Val Asp
210 215 220


Thr Asp Arg Phe Arg Phe Gln Pro Leu Gly Asp Arg Gly Val Val Leu
225 230 235 240


Gln Gln Glu Leu Ser Arg Phe Leu Arg Asp Pro Glu Lys Pro Gln Ile
245 250 255


Leu Cys Leu Cys Arg Pro Ala Pro Arg Lys Asn Val Pro Ala Leu Val
260 265 270


Arg Ala Phe Gly Glu His Pro Trp Leu Arg Lys Lys Ala Asn Leu Val
275 280 285


Leu Val Leu Gly Ser Arg Gln Asp Ile Asn Gln Met Asp Arg Gly Ser
290 295 300


Arg Gln Val Phe Gln Glu Ile Phe His Leu Val Asp Arg Tyr Asp Leu
305 310 315 320


Tyr Gly Ser Val Ala Tyr Pro Lys Gln His Gln Ala Asp Asp Val Pro
325 330 335


Glu Phe Tyr Arg Leu Ala Ala His Ser Gly Gly Val Phe Val Asn Pro
340 345 350


Ala Leu Thr Glu Pro Phe Gly Leu Thr Ile Leu Glu Ala Gly Ser Cys
355 360 365


Gly Val Pro Val Val Ala Thr His Asp Gly Gly Pro Gln Glu Ile Leu
370 375 380


Lys His Cys Asp Phe Gly Thr Leu Val Asp Val Ser Arg Pro Ala Asn
385 390 395 400


Ile Ala Thr Ala Leu Ala Thr Leu Leu Ser Asp Arg Asp Leu Trp Gln
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Cys Tyr His Arg Asn Gly Ile Glu Lys Val Pro Ala His Tyr Ser Trp
420 425 430


Asp Gln His Val Asn Thr Leu Phe Glu Arg Met Glu Thr Val Ala Leu
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Pro Arg Arg Arg Ala Val Ser Phe Val Arg Ser Arg Lys Arg Leu Ile
450 455 460


Asp Ala Lys Arg Leu Val Val Ser Asp Ile Asp Asn Thr Leu Leu Gly
465 470 475 480


Asp Arg Gln Gly Leu Glu Asn Leu Met Thr Tyr Leu Asp Gln Tyr Arg
485 490 495


Asp His Phe Ala Phe Gly Ile Ala Thr Gly Arg Arg Leu Asp Ser Ala
500 505 510


Gln Glu Val Leu Lys Glu Trp Gly Val Pro Ser Pro Asn Phe Trp Val
515 520 525


Thr Ser Val Gly Ser Glu Ile His Tyr Gly Thr Asp Ala Glu Pro Asp
530 535 540


Ile Ser Trp Glu Lys His Ile Asn Arg Asn Trp Asn Pro Gln Arg Ile
545 550 555 560


Arg Ala Val Met Ala Gln Leu Pro Phe Leu Glu Leu Gln Pro Glu Glu
565 570 575


Asp Gln Thr Pro Phe Lys Val Ser Phe Phe Val Arg Asp Arg His Glu
580 585 590


Thr Val Leu Arg Glu Val Arg Gln His Leu Arg Arg His Arg Leu Arg
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Leu Lys Ser Ile Tyr Ser His Gln Glu Phe Leu Asp Ile Leu Pro Leu
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275 280 285


Ile Val Ala Gly Asn Arg Asp Asp Ile Thr Asp Leu Asp Gln Gly Pro
290 295 300


Arg Glu Val Leu Thr Asp Leu Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Asp Leu
305 310 315 320


Tyr Gly Lys Val Ala Tyr Pro Lys Gln Asn Gln Ala Glu Asp Val Tyr
325 330 335


Ala Leu Phe Arg Leu Thr Ala Leu Ser Gln Gly Val Phe Ile Asn Pro
340 345 350


Ala Leu Thr Glu Pro Phe Gly Leu Thr Leu Ile Glu Ala Ala Ala Cys
355 360 365


Gly Val Pro Ile Val Ala Thr Glu Asp Gly Gly Pro Val Asp Ile Ile
370 375 380


Lys Asn Cys Gln Asn Gly Tyr Leu Ile Asn Pro Leu Asp Glu Val Asp
385 390 395 400


Ile Ala Asp Lys Leu Leu Lys Val Leu Asn Asp Lys Gln Gln Trp Gln
405 410 415


Phe Leu Ser Glu Ser Gly Leu Glu Gly Val Lys Arg His Tyr Ser Trp
420 425 430


Pro Ser His Val Glu Ser Tyr Leu Glu Ala Ile Asn Ala Leu Thr Gln
435 440 445


Gln Thr Ser Val Leu Lys Arg Ser Asp Leu Lys Arg Arg Arg Thr Leu
450 455 460


Tyr Tyr Asn Gly Ala Leu Val Thr Ser Leu Asp Gln Asn Leu Leu Gly
465 470 475 480


Ala Leu Gln Gly Gly Leu Pro Gly Asp Arg Gln Thr Leu Asp Glu Leu
485 490 495


Leu Glu Val Leu Tyr Gln His Arg Lys Asn Val Gly Phe Cys Ile Ala
500 505 510


Thr Gly Arg Arg Leu Asp Ser Val Leu Lys Ile Leu Arg Glu Tyr Arg
515 520 525


Ile Pro Gln Pro Asp Met Leu Ile Thr Ser Met Gly Thr Glu Ile Tyr
530 535 540


Ser Ser Pro Asp Leu Ile Pro Asp Gln Ser Trp Arg Asn His Ile Asp
545 550 555 560


Tyr Leu Trp Asn Arg Asn Ala Ile Val Arg Ile Leu Gly Glu Leu Pro
565 570 575


Gly Leu Ala Leu Gln Pro Lys Glu Glu Leu Ser Ala Tyr Lys Ile Ser
580 585 590


Tyr Phe Tyr Asp Ala Ala Ile Ala Pro Asn Leu Glu Glu Ile Arg Gln
595 600 605


Leu Leu His Lys Gly Glu Gln Thr Val Asn Thr Ile Ile Ser Phe Gly
610 615 620


Gln Phe Leu Asp Ile Leu Pro Ile Arg Ala Ser Lys Gly Tyr Ala Val
625 630 635 640


Arg Trp Leu Ser Gln Gln Trp Asn Ile Pro Leu Glu His Val Phe Thr
645 650 655


Ala Gly Gly Ser Gly Ala Asp Glu Asp Met Met Arg Gly Asn Thr Leu
660 665 670


Ser Val Val Val Ala Asn Arg His His Glu Glu Leu Ser Asn Leu Gly
675 680 685


Glu Ile Glu Pro Ile Tyr Phe Ser Glu Lys Arg Tyr Ala Ala Gly Ile
690 695 700


Leu Asp Gly Leu Ala His Tyr Arg Phe Phe Glu Leu Leu Asp Pro Val
705 710 715 720


<210> 5
<211> 735
<212> DNA
<213> Synechocystis PCC6803

<400> 5
atgcgacagt tattgctaat ttctgacctg gacaatacct gggtcggaga tcaacaagcc 60

ctggaacatt tgcaagaata tctaggcgat cgccggggaa atttttattt ggcctatgcc 120

acggggcgtt cctaccattc cgcgagggag ttgcaaaaac aggtgggact catggaaccg 180

gactattggc tcaccgcggt ggggagtgaa atttaccatc cagaaggcct ggaccaacat 240

tgggctgatt acctctctga gcattggcaa cgggatatcc tccaggcgat cgccgatggt 300

tttgaggcct taaaacccca atctcccttg gaacaaaacc catggaaaat tagctatcat 360

ctcgatcccc aggcttgccc caccgtcatc gaccaattaa cggagatgtt gaaggaaacc 420

ggcatcccgg tgcaggtgat tttcagcagt ggcaaagatg tggatttatt gccccaacgg 480

agtaacaaag gtaacgccac ccaatatctg caacaacatt tagccatgga gccgtctcaa 540

accctggtgt gtggggactc cggcaatgat attggcttat ttgaaacttc cgctcggggt 600

gtcattgtcc gtaatgccca gccggaatta ttgcactggt atgaccaatg gggggattct 660

cgtcattatc gggcccaatc gagccatgct ggcgctatcc tagaggcgat cgcccatttc 720

gattttttga gctga 735


<210> 6
<211> 244
<212> PRT
<213> Synechocystis PCC6803

<400> 6

Met Arg Gln Leu Leu Leu Ile Ser Asp Leu Asp Asn Thr Trp Val Gly
1 5 10 15


Asp Gln Gln Ala Leu Glu His Leu Gln Glu Tyr Leu Gly Asp Arg Arg
20 25 30


Gly Asn Phe Tyr Leu Ala Tyr Ala Thr Gly Arg Ser Tyr His Ser Ala
35 40 45


Arg Glu Leu Gln Lys Gln Val Gly Leu Met Glu Pro Asp Tyr Trp Leu
50 55 60


Thr Ala Val Gly Ser Glu Ile Tyr His Pro Glu Gly Leu Asp Gln His
65 70 75 80


Trp Ala Asp Tyr Leu Ser Glu His Trp Gln Arg Asp Ile Leu Gln Ala
85 90 95


Ile Ala Asp Gly Phe Glu Ala Leu Lys Pro Gln Ser Pro Leu Glu Gln
100 105 110


Asn Pro Trp Lys Ile Ser Tyr His Leu Asp Pro Gln Ala Cys Pro Thr
115 120 125


Val Ile Asp Gln Leu Thr Glu Met Leu Lys Glu Thr Gly Ile Pro Val
130 135 140


Gln Val Ile Phe Ser Ser Gly Lys Asp Val Asp Leu Leu Pro Gln Arg
145 150 155 160


Ser Asn Lys Gly Asn Ala Thr Gln Tyr Leu Gln Gln His Leu Ala Met
165 170 175


Glu Pro Ser Gln Thr Leu Val Cys Gly Asp Ser Gly Asn Asp Ile Gly
180 185 190


Leu Phe Glu Thr Ser Ala Arg Gly Val Ile Val Arg Asn Ala Gln Pro
195 200 205


Glu Leu Leu His Trp Tyr Asp Gln Trp Gly Asp Ser Arg His Tyr Arg
210 215 220


Ala Gln Ser Ser His Ala Gly Ala Ile Leu Glu Ala Ile Ala His Phe
225 230 235 240


Asp Phe Leu Ser



<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplificaiton of asf

<400> 7
agactacaat tggggcgttt tctgtgag 28


<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplificaiton of asf

<400> 8
cttacgtgcc gatcaacgtc tcattctgaa aaggttaagc gatcgcctc 49


<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Primer for amplifying cat gene from pBeloBAC11

<400> 9
ttatcgcgat cgtcaggagc taaggaagct aaaatggag 39


<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplificaiton of cat

<400> 10
cgaccaattc acgtgtttga cagcttatc 29


<210> 11
<211> 811
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> cat gene amplified from pBeloBAC11

<400> 11
ttatcgcgat cgtcaggagc taaggaagct aaaatggaga aaaaaatcac tggatatacc 60

accgttgata tatcccaatg gcatcgtaaa gaacattttg aggcatttca gtcagttgct 120

caatgtacct ataaccagac cgttcagctg gatattacgg cctttttaaa gaccgtaaag 180

aaaaataagc acaagtttta tccggccttt attcacattc ttgcccgcct gatgaatgct 240

catccggaat tccgtatggc aatgaaagac ggtgagctgg tgatatggga tagtgttcac 300

ccttgttaca ccgttttcca tgagcaaact gaaacgtttt catcgctctg gagtgaatac 360

cacgacgatt tccggcagtt tctacacata tattcgcaag atgtggcgtg ttacggtgaa 420

aacctggcct atttccctaa agggtttatt gagaatatgt ttttcgtctc agccaatccc 480

tgggtgagtt tcaccagttt tgatttaaac gtggccaata tggacaactt cttcgccccc 540

gttttcacca tgggcaaata ttatacgcaa ggcgacaagg tgctgatgcc gctggcgatt 600

caggttcatc atgccgtttg tgatggcttc catgtcggca gaatgcttaa tgaattacaa 660

cagtactgcg atgagtggca gggcggggcg taattttttt aaggcagtta ttggtgccct 720

taaacgcctg gttgctacgc ctgaataagt gataataagc ggatgaatgg cagaaattcg 780

atgataagct gtcaaacacg tgaattggtc g 811


<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplifying cat gene bearing the promoter from
pBeloBAC11

<400> 12
ttttggcgat cgtgagacgt tgatcggcac gtaag 35


<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplifying cat gene bearing the promoter from
pBeloBAC11

<400> 13
cgaccaattc acgtgtttga cagcttatc 29


<210> 14
<211> 901
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> cat gene bearing the promoter amplified from pBeloBAC11

<400> 14
ttttggcgat cgtgagacgt tgatcggcac gtaagaggtt ccaactttca ccataatgaa 60

ataagatcac taccgggcgt attttttgag ttatcgagat tttcaggagc taaggaagct 120

aaaatggaga aaaaaatcac tggatatacc accgttgata tatcccaatg gcatcgtaaa 180

gaacattttg aggcatttca gtcagttgct caatgtacct ataaccagac cgttcagctg 240

gatattacgg cctttttaaa gaccgtaaag aaaaataagc acaagtttta tccggccttt 300

attcacattc ttgcccgcct gatgaatgct catccggaat tccgtatggc aatgaaagac 360

ggtgagctgg tgatatggga tagtgttcac ccttgttaca ccgttttcca tgagcaaact 420

gaaacgtttt catcgctctg gagtgaatac cacgacgatt tccggcagtt tctacacata 480

tattcgcaag atgtggcgtg ttacggtgaa aacctggcct atttccctaa agggtttatt 540

gagaatatgt ttttcgtctc agccaatccc tgggtgagtt tcaccagttt tgatttaaac 600

gtggccaata tggacaactt cttcgccccc gttttcacca tgggcaaata ttatacgcaa 660

ggcgacaagg tgctgatgcc gctggcgatt caggttcatc atgccgtttg tgatggcttc 720

catgtcggca gaatgcttaa tgaattacaa cagtactgcg atgagtggca gggcggggcg 780

taattttttt aaggcagtta ttggtgccct taaacgcctg gttgctacgc ctgaataagt 840

gataataagc ggatgaatgg cagaaattcg atgataagct gtcaaacacg tgaattggtc 900

g 901


<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for sequence verification of cat/asf

<400> 15
gcttctgcgt tctgatttaa tctgtatcag 30


<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for sequence verification of cat/asf

<400> 16
tatcacttat tcaggcgtag caaccag 27


<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for sequence verification of cat/asf

<400> 17
gtcgttagtg acatcgacaa cacactg 27


<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for sequence verification of cat/asf

<400> 18
gatcgcgata ctgatcgaga taggtc 26


<210> 19
<211> 10577
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Plasmid pLybAL11 containing ASF gene from Synechococcus elongatus
PCC 7942

<400> 19
tgcatgcctg caggtcgact ctagaggatc cccgggtacc gagctcgaat tggggcgttt 60

tctgtgaggc tgactagcgc gtggcagctc aaaatctcta cattctgcac attcagaccc 120

atggtctgct gcgagggcag aacttggaac tggggcgaga tgccgacacc ggcgggcaga 180

ccaagtacgt cttagaactg gctcaagccc aagctaaatc cccacaagtc caacaagtcg 240

acatcatcac ccgccaaatc accgaccccc gcgtcagtgt tggttacagt caggcgatcg 300

aaccctttgc gcccaaaggt cggattgtcc gtttgccttt tggccccaaa cgctacctcc 360

gtaaagagct gctttggccc catctctaca cctttgcgga tgcaattctc caatatctgg 420

ctcagcaaaa gcgcaccccg acttggattc aggcccacta tgctgatgct ggccaagtgg 480

gatcactgct gagtcgctgg ttgaatgtac cgctaatttt cacagggcat tctctggggc 540

ggatcaagct aaaaaagctg ttggagcaag actggccgct tgaggaaatt gaagcgcaat 600

tcaatattca acagcgaatt gatgcggagg agatgacgct cactcatgct gactggattg 660

tcgccagcac tcagcaggaa gtggaggagc aataccgcgt ttacgatcgc tacaacccag 720

agcgcaagct tgtcattcca ccgggtgtcg ataccgatcg cttcaggttt cagcccttgg 780

gcgatcgcgg tgttgttctc caacaggaac tgagccgctt tctgcgcgac ccagaaaaac 840

ctcaaattct ctgcctctgt cgccccgcac ctcgcaaaaa tgtaccggcg ctggtgcgag 900

cctttggcga acatccttgg ctgcgcaaaa aagccaacct tgtcttagta ctgggcagcc 960

gccaagacat caaccagatg gatcgcggca gtcggcaggt gttccaagag attttccatc 1020

tggtcgatcg ctacgacctc tacggcagcg tcgcctatcc caaacagcat caggctgatg 1080

atgtgccgga gttctatcgc ctagcggctc attccggcgg ggtattcgtc aatccggcgc 1140

tgaccgaacc ttttggtttg acaattttgg aggcaggaag ctgcggcgtg ccggtggtgg 1200

caacccatga tggcggcccc caggaaattc tcaaacactg tgatttcggc actttagttg 1260

atgtcagccg acccgctaat atcgcgactg cactcgccac cctgctgagc gatcgcgatc 1320

tttggcagtg ctatcaccgc aatggcattg aaaaagttcc cgcccattac agctgggatc 1380

aacatgtcaa taccctgttt gagcgcatgg aaacggtggc tttgcctcgt cgtcgtgctg 1440

tcagtttcgt acggagtcgc aaacgcttga ttgatgccaa acgccttgtc gttagtgaca 1500

tcgacaacac actgttgggc gatcgtcaag gactcgagaa tttaatgacc tatctcgatc 1560

agtatcgcga tcattttgcc tttggaattg ccacggggcg tcgcctagac tctgcccaag 1620

aagtcttgaa agagtggggc gttccttcgc caaacttctg ggtgacttcc gtcggcagcg 1680

agattcacta tggcaccgat gctgaaccgg atatcagctg ggaaaagcat atcaatcgca 1740

actggaatcc tcagcgaatt cgggcagtaa tggcacaact accctttctt gaactgcagc 1800

cggaagagga tcaaacaccc ttcaaagtca gcttctttgt ccgcgatcgc cacgagactg 1860

tgctgcgaga agtacggcaa catcttcgcc gccatcgcct gcggctgaag tcaatctatt 1920

cccatcagga gtttcttgac attctgccgc tagctgcctc gaaaggggat gcgattcgcc 1980

acctctcact ccgctggcgg attcctcttg agaacatttt ggtggcaggc gattctggta 2040

acgatgagga aatgctcaag ggccataatc tcggcgttgt agttggcaat tactcaccgg 2100

aattggagcc actgcgcagc tacgagcgcg tctattttgc tgagggccac tatgctaatg 2160

gcattctgga agccttaaaa cactatcgct tttttgaggc gatcgcttaa ccttttcaga 2220

atgagacgtt gatcggcacg taagcgtcag gagctaagga agctaaaatg gagaaaaaaa 2280

tcactggata taccaccgtt gatatatccc aatggcatcg taaagaacat tttgaggcat 2340

ttcagtcagt tgctcaatgt acctataacc agaccgttca gctggatatt acggcctttt 2400

taaagaccgt aaagaaaaat aagcacaagt tttatccggc ctttattcac attcttgccc 2460

gcctgatgaa tgctcatccg gaattccgta tggcaatgaa agacggtgag ctggtgatat 2520

gggatagtgt tcacccttgt tacaccgttt tccatgagca aactgaaacg ttttcatcgc 2580

tctggagtga ataccacgac gatttccggc agtttctaca catatattcg caagatgtgg 2640

cgtgttacgg tgaaaacctg gcctatttcc ctaaagggtt tattgagaat atgtttttcg 2700

tctcagccaa tccctgggtg agtttcacca gttttgattt aaacgtggcc aatatggaca 2760

acttcttcgc ccccgttttc accatgggca aatattatac gcaaggcgac aaggtgctga 2820

tgccgctggc gattcaggtt catcatgccg tttgtgatgg cttccatgtc ggcagaatgc 2880

ttaatgaatt acaacagtac tgcgatgagt ggcagggcgg ggcgtaattt ttttaaggca 2940

gttattggtg cccttaaacg cctggttgct acgcctgaat aagtgataat aagcggatga 3000

atggcagaaa ttcgatgata agctgtcaaa cacaaccacc atcaaacagg attttcgcct 3060

gctggggcaa accagcgtgg accgcttgct gcaactctct cagggccagg cggtgaaggg 3120

caatcagctg ttgcccgtct cactggtgaa aagaaaaacc accctggcgc ccaatacgca 3180

aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg 3240

actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtaag ttagcgcgaa ttgcaagctg 3300

gccgacgcgc tgggctacgt cttgctggcg ttcgggagca gaagagcata catctggaag 3360

caaagccagg aaagcggcct atggagctgt gcggcagcgc tcagtaggca atttttcaaa 3420

atattgttaa gccttttctg agcatggtat ttttcatggt attaccaatt agcaggaaaa 3480

taagccattg aatataaaag ataaaaatgt cttgtttaca atagagtggg gggggtcagc 3540

ctgccgcctt gggccgggtg atgtcgtact tgcccgccgc gaactcggtt accgtccagc 3600

ccagcgcgac cagctccggc aacgcctcgc gcacccgctt gcggcgcttg cgcatggtcg 3660

aaccactggc ctctgacggc cagacatagc cgcacaaggt atctatggaa gccttgccgg 3720

ttttgccggg gtcgatccag ccacacagcc gctggtgcag caggcgggcg gtttcgctgt 3780

ccagcgcccg cacctcgtcc atgctgatgc gcacatgctg gccgccaccc atgacggcct 3840

gcgcgatcaa ggggttcagg gccacgtaca ggcgcccgtc cgcctcgtcg ctggcgtact 3900

ccgacagcag ccgaaacccc tgccgcttgc ggccattctg ggcgatgatg gataccttcc 3960

aaaggcgctc gatgcagtcc tgtatgtgct tgagcgcccc accactatcg acctctgccc 4020

cgatttcctt tgccagcgcc cgatagctac ctttgaccac atggcattca gcggtgacgg 4080

cctcccactt gggttccagg aacagccgga gctgccgtcc gccttcggtc ttgggttccg 4140

ggccaagcac taggccatta ggcccagcca tggccaccag cccttgcagg atgcgcagat 4200

catcagcgcc cagcggctcc gggccgctga actcgatccg cttgccgtcg ccgtagtcat 4260

acgtcacgtc cagcttgctg cgcttgcgct cgccccgctt gagggcacgg aacaggccgg 4320

gggccagaca gtgcgccggg tcgtgccgga cgtggctgag gctgtgcttg ttcttaggct 4380

tcaccacggg gcaccccctt gctcttgcgc tgcctctcca gcacggcggg cttgagcacc 4440

ccgccgtcat gccgcctgaa ccaccgatca gcgaacggtg cgccatagtt ggccttgctc 4500

acaccgaagc ggacgaagaa ccggcgctgg tcgtcgtcca caccccattc ctcggcctcg 4560

gcgctggtca tgctcgacag gtaggactgc cagcggatgt tatcgaccag taccgagctg 4620

ccccggctgg cctgctgctg gtcgcctgcg cccatcatgg ccgcgccctt gctggcatgg 4680

tgcaggaaca cgatagagca cccggtatcg gcggcgatgg cctccatgcg accgatgacc 4740

tgggccatgg ggccgctggc gttttcttcc tcgatgtgga accggcgcag cgtgtccagc 4800

accatcaggc ggcggccctc ggcggcgcgc ttgaggccgt cgaaccactc cggggccatg 4860

atgttgggca ggctgccgat cagcggctgg atcagcaggc cgtcagccac ggcttgccgt 4920

tcctcggcgc tgaggtgcgc cccaagggcg tgcaggcggt gatgaatggc ggtgggcggg 4980

tcttcggcgg gcaggtagat caccgggccg gtgggcagtt cgcccacctc cagcagatcc 5040

ggcccgcctg caatctgtgc ggccagttgc agggccagca tggatttacc ggcaccaccg 5100

ggcgacacca gcgccccgac cgtaccggcc accatgttgg gcaaaacgta gtccagcggt 5160

ggcggcgctg ctgcgaacgc ctccagaata ttgataggct tatgggtagc cattgattgc 5220

ctcctttgca ggcagttggt ggttaggcgc tggcggggtc actacccccg ccctgcgccg 5280

ctctgagttc ttccaggcac tcgcgcagcg cctcgtattc gtcgtcggtc agccagaact 5340

tgcgctgacg catccctttg gccttcatgc gctcggcata tcgcgcttgg cgtacagcgt 5400

cagggctggc cagcaggtcg ccggtctgct tgtccttttg gtctttcata tcagtcaccg 5460

agaaacttgc cggggccgaa aggcttgtct tcgcggaaca aggacaaggt gcagccgtca 5520

aggttaaggc tggccatatc agcgactgaa aagcggccag cctcggcctt gtttgacgta 5580

taaccaaagc caccgggcaa ccaatagccc ttgtcacttt tgatcaggta gaccgaccct 5640

gaagcgcttt tttcgtattc cataaaaccc ccttctgtgc gtgagtactc atagtataac 5700

aggcgtgagt accaacgcaa gcactacatg ctgaaatctg gcccgcccct gtccatgcct 5760

cgctggcggg gtgccggtgc ccgtgccagc tcggcccgcg caagctggac gctgggcaga 5820

cccatgacct tgctgacggt gcgctcgatg taatccgctt cgtggccggg cttgcgctct 5880

gccagcgctg ggctggcctc ggccatggcc ttgccgattt cctcggcact gcggccccgg 5940

ctggccagct tctgcgcggc gataaagtcg cacttgctga ggtcatgacc gaagcgcttg 6000

accagcccgg ccatctcgct gcggtactcg tccagcgccg tgcgccggtg gcggctaagc 6060

tgccgctcgg gcagttcgag gctggccagc ctgcgggcct tctcctgctg ccgctgggcc 6120

tgctcgatct gctggccagc ctgctgcacc agcgccgggc cagcggtggc ggtcttgccc 6180

ttggattcac gcagcagcac ccacggctga taaccggcgc gggtggtgtg cttgtccttg 6240

cggttggtga agcccgccaa gcggccatag tggcggctgt cggcgctggc cgggtcggcg 6300

tcgtactcgc tggccagcgt ccgggcaatc tgcccccgaa gttcaccgcc tgcggcgtcg 6360

gccaccttga cccatgcctg atagttcttc gggctggttt ccactaccag ggcaggctcc 6420

cggccctcgg ctttcatgtc atccaggtca aactcgctga ggtcgtccac cagcaccaga 6480

ccatgccgct cctgctcggc gggcctgata tacacgtcat tgccctgggc attcatccgc 6540

ttgagccatg gcgtgttctg gagcacttcg gcggctgacc attcccggtt catcatctgg 6600

ccggtgggtg cgtccctgac gccgatatcg aagcgctcac agcccatggc cttgagctgt 6660

cggcctatgg cctgcaaagt cctgtcgttc ttcatcgggc caccaagcgc agccagatcg 6720

agccgtcctc ggttgtcagt ggcgtcaggt cgagcaagag caacgatgcg atcagcagca 6780

ccaccgtagg catcatggaa gccagcatca cggttagcca tagcttccag tgccaccccc 6840

gcgacgcgct ccgggcgctc tgcgcggcgc tgctcacctc ggcggctacc tcccgcaact 6900

ctttggccag ctccacccat gccgcccctg tctggcgctg ggctttcagc cactccgccg 6960

cctgcgcctc gctggcctgc ttggtctggc tcatgacctg ccgggcttcg tcggccagtg 7020

tcgccatgct ctgggccagc ggttcgatct gctccgctaa ctcgttgatg cctctggatt 7080

tcttcactct gtcgattgcg ttcatggtct attgcctccc ggtattcctg taagtcgatg 7140

atctgggcgt tggcggtgtc gatgttcagg gccacgtctg cccggtcggt gcggatgccc 7200

cggccttcca tctccaccac gttcggcccc aggtgaacac cgggcaggcg ctcgatgccc 7260

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ttggcatggt cggcccatgc ctcgcgggtc tgctcaagcc atgccttggg cttgagcgct 7380

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tatcagaccg cttctgcgtt ctgatttaat ctgtatcagg ctgaaaatct tctctcatcc 10560

gccaaaacag ccaagct 10577


<210> 20
<211> 10667
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Plasmid pLybAL12 containing asf gene from Synechococcus elongatus
PCC 7942

<400> 20
tgcatgcctg caggtcgact ctagaggatc cccgggtacc gagctcgaat tggggcgttt 60

tctgtgaggc tgactagcgc gtggcagctc aaaatctcta cattctgcac attcagaccc 120

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ttaatgtaag ttagcgcgaa ttgcaagctg gccgacgcgc tgggctacgt cttgctggcg 3420

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cgcacaaggt atctatggaa gccttgccgg ttttgccggg gtcgatccag ccacacagcc 3840

gctggtgcag caggcgggcg gtttcgctgt ccagcgcccg cacctcgtcc atgctgatgc 3900

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ttgataggct tatgggtagc cattgattgc ctcctttgca ggcagttggt ggttaggcgc 5340

tggcggggtc actacccccg ccctgcgccg ctctgagttc ttccaggcac tcgcgcagcg 5400

cctcgtattc gtcgtcggtc agccagaact tgcgctgacg catccctttg gccttcatgc 5460

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tacacgtcat tgccctgggc attcatccgc ttgagccatg gcgtgttctg gagcacttcg 6660

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tgctcaagcc atgccttggg cttgagcgct tcggtcttct gtgccccgcc cttctccggg 7500

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tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 9420

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ccatccgtca ggatggcctt ctgcttaatt tgatgcctgg cagtttatgg cgggcgtcct 10320

gcccgccacc ctccgggccg ttgcttcgca acgttcaaat ccgctcccgg cggatttgtc 10380

ctactcagga gagcgttcac cgacaaacaa cagataaaac gaaaggccca gtctttcgac 10440

tgagcctttc gttttatttg atgcctggca gttccctact ctcgcatggg gagaccccac 10500

actaccatcg gcgctacggc gtttcacttc tgagttcggc atggggtcag gtgggaccac 10560

cgcgctactg ccgccaggca aattctgttt tatcagaccg cttctgcgtt ctgatttaat 10620

ctgtatcagg ctgaaaatct tctctcatcc gccaaaacag ccaagct 10667


<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplifying Synechocystis spp. PCC 6803 pyrR
(SphI/KpnI)

<400> 21
cggtgtgcat gccgttattg atggaatg 28


<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplifying Synechocystis spp. PCC 6803 pyrR
(SphI/KpnI)

<400> 22
tcactaggta cctaaattac ctgggaagcc ag 32


<210> 23
<211> 474
<212> DNA
<213> Synechocystis PCC6803

<400> 23
cggtgtgcat gccgttattg atggaatggg aagaagcaat ggtcacaata aactggaggt 60

tatgggtatg ttttttagcc ctaatgctcc aatcgccttg attgtatcga atgatgcagt 120

ctctaaaatt gtatccgtaa aagacctctg caccgccgac gggtctggat tatgggcaat 180

aatcacagtc gagccagact acccctggag gtaaactccg gggctggagc cataaagatt 240

aggaattcat taagaaatgt aacaatcgac gttctagatc ataccacgcc cccactgtcc 300

ggcagggtga acagaggaga ctttcccctg ttacagtgtc agtgacaaaa caactttttg 360

gcatcggtgc aggtggtgag ccatggcggc ccagatcatt gaaattcttt ccccggagga 420

aatccgacgt acccttaccc gtctggcttc ccaggtaatt taggtaccta gtga 474


<210> 24
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplifying Synechocystis spp. PCC 6803 nirA
(SphI/KpnI)

<400> 24
cccaaggcat gcaggaaaac aagctcagaa tgctg 35


<210> 25
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplifying Synechocystis spp. PCC 6803 nirA
(SphI/KpnI)

<400> 25
tttattggta ccaacgcttc aagccagata acagtagaga tc 42


<210> 26
<211> 384
<212> DNA
<213> Synechocystis PCC6803

<400> 26
cccaaggcat gcaggaaaac aagctcagaa tgctgcgggg agaagggcaa ctccccacca 60

gccccaaatt tttgctggcg ataaatattt ttcggtttaa ttgttcacaa agctttttga 120

atttgagttt atagaaattt attggctggt aatgcttttt tgcccccctg caggacttca 180

ttgatccttg cctataccat caatatcatt ggtcaataat gatgatgatt gactaaaaca 240

tgtttaacaa aatttaacgc atatgctaaa tgcgtaaact gcatatgcct tggctgagtg 300

taatttacgt tacaaatttt aacgaaacgg gaaccctata ttgatctcta ctgttatctg 360

gcttgaagcg ttggtaccaa taaa 384


<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplifying Synechococcus elongatus PCC 7942 psbAII
(SphI/KpnI)

<400> 27
atctttgcgt tccgtgacgg ctactg 26


<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplifying Synechococcus elongatus PCC 7942 psbAII
(SphI/KpnI)

<400> 28
gcagatggta ccggtcagca gagtg 25


<210> 29
<211> 676
<212> DNA
<213> Synechococcus PCC7942

<400> 29
atctttgcgt tccgtgacgg ctactgccag catgccgagc ctgatgtgtg acacctaaga 60

tcactccagt tctctttgga aactggctga tgagtgaaga caccatcttt ggcaagatca 120

tccggcgcga gattccagca gacattgttt atgaagatga tctctgtctg gcttttcgag 180

atgtggcacc ccaagcgccg gttcacattc tggtgattcc caagcaacca attgccaacc 240

ttttggaagc gacagcagaa catcaagcgc tgctgggtca tttgttgctg actgtaaagg 300

cgatcgcggc ccaagaagga ctcaccgagg gctaccgcac cgtgattaac acgggccctg 360

cgggtgggca aaccgtttac cacctgcata ttcacttact gggcgggcga tcgctggctt 420

ggccgcccgg ctgagaaaag tctgaaagtt ctttacaaaa ctcaatctgc ttgttagatt 480

ttactcacga ggctattaag tctcgtaaat agttcaacta aggactcatc gcaaaatgac 540

gactgcattg cagcggcgcg agagcgccag cctgtggcag cagttctgcg agtgggtaac 600

cagcaccgac aaccgcctct atgtgggttg gttcggcgtg ctgatgatcc ccactctgct 660

gaccggtacc atctgc 676


<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplifying Synechococcus elongatus PCC 7942 nirA

<400> 30
cagccagcat gcataaattt ctgttttgac caaaccatcc 40


<210> 31
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplifying Synechococcus elongatus PCC 7942 nirA

<400> 31
gtggctggta ccatggattc atctgcctac aaag 34


<210> 32
<211> 579
<212> DNA
<213> Synechococcus PCC7942

<400> 32
cagccagcat gcataaattt ctgttttgac caaaccatcc cgacataact cggtcagggc 60

ttgcaaaaca gcggggatgc gatcgtgctg ccagagactg caaaggtgag ccaataacca 120

ctgcgtctgc cagtcatcag gtatcgcttg gcagcgctgc aacccagctt cgaggacgcg 180

aacatcaact gttttggcca gttgctgaac ctgtcgccaa caatgttcaa aatcaccgct 240

tggccagccg tcactctctg caaacgctgc atcagtcatg tgcaatcaat acaggttaaa 300

aaccatgcta atggctccac ctaagcgggc ttcagagtca aggcttgtag caattgctac 360

taaaaactgc gatcgctgct gaaatgagct ggaattctgt ccctctcagc tcaaaaagta 420

tcaatgatta cttaatgttt gttctgcgca aacttcttgc agaacatgca tgatttacaa 480

aaagttgtag tttctgttac caattgcgaa tcgagaactg cctaatctgc cgagtatgca 540

agctgctttg taggcagatg aatccatggt accagccac 579


<210> 33
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplifying gammaPR (XbaI/KpnI)

<400> 33
gtgcattcta gatggctacg agggcagaca gtaag 35


<210> 34
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplifying gammaPR (XbaI/KpnI)

<400> 34
ttctgtggta ccatatggat cctccttctt aagatgcaac cattatcacc 50


<210> 35
<211> 1186
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> gammaPR (XbaI/KpnI) promoter

<400> 35
gtgcattcta gatggctacg agggcagaca gtaagtggat ttaccataat cccttaattg 60

tacgcaccgc taaaacgcgt tcagcgcgat cacggcagca gacaggtaaa aatggcaaca 120

aaccacccta aaaactgcgc gatcgcgcct gataaatttt aaccgtatga atacctatgc 180

aaccagaggg tacaggccac attaccccca cttaatccac tgaagctgcc atttttcatg 240

gtttcaccat cccagcgaag ggccatgcat gcatcgaaat taatacgacg aaattaatac 300

gactcactat agggcaattg ttatcagcta tgcgccgacc agaacacctt gccgatcagc 360

caaacgtctc ttcaggccac tgactagcga taactttccc cacaacggaa caactctcac 420

tgcatgggat cattgggtac tgtgggttta gtggttgtaa aaacacctga ccgctatccc 480

tgatcagttt cttgaaggta aactcatcac ccccaagtct ggctatgcag aaatcacctg 540

gctcaacagc ctgctcaggg tcaacgagaa ttaacattcc gtcaggaaag cttggcttgg 600

agcctgttgg tgcggtcatg gaattacctt caacctcaag ccagaatgca gaatcactgg 660

ctttcttggt tgtgcttacc catctctccg catcaccttt ggtaaaggtt ctaagcttag 720

gtgagaacat ccctgcctga acatgagaaa aaacagggta ctcatactca cttctaagtg 780

acggctgcat actaaccgct tcatacatct cgtagatttc tctggcgatt gaagggctaa 840

attcttcaac gctaactttg agaatttttg taagcaatgc ggcgttataa gcatttaatg 900

cattgatgcc attaaataaa gcaccaacgc ctgactgccc catccccatc ttgtctgcga 960

cagattcctg ggataagcca agttcatttt tctttttttc ataaattgct ttaaggcgac 1020

gtgcgtcctc aagctgctct tgtgttaatg gtttcttttt tgtgctcata cgttaaatct 1080

atcaccgcaa gggataaata tctaacaccg tgcgtgttga ctattttacc tctggcggtg 1140

ataatggttg catcttaaga aggaggatcc atatggtacc acagaa 1186


<210> 36
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplifying Synechocystis spp. PCC 6803 dnaK
(SphI/KpnI)

<400> 36
gccccagcat gcaccagtaa acataaatct c 31


<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplifying Synechocystis spp. PCC 6803 dnaK
(SphI/KpnI)

<400> 37
attggtggta ccgaggtcaa tcccaacaac 30


<210> 38
<211> 895
<212> DNA
<213> Synechocystis PCC6803

<400> 38
gccccagcat gcaccagtaa acataaatct ccccggcgac gcaaaaaacg ggtgaccatc 60

aagccggtgc gcttcggcat ttttctgctt tgcctagcag gcattgtggg gggggcaact 120

gccctaatta tcaatcgtac tggcgatccc ctaggtgggt tgctagaaga ccccctagat 180

gttttcctgg accaaccttc agaatttatc cccgatgaag ccacgagccg gaatttgatt 240

ctcagtcaac ccaacttcaa tcagcaagtg ggtcagatgg tagtacaagg ctggcttgat 300

agtaaaaagt tagcctttgg ccaaaactac gatgtcgggg cattgcagag tgttttagcc 360

cccaatctcc ttgcccaaca acggggtcgg gcccaacggg atcaagccca aaaggtctat 420

caccaatacg aacacaagtt gcagatttta gcctatcaag ttaaccccca agaccccaac 480

cgagccaccg ttactgcccg ggtagaagaa attagccagc cctttaccct aggtaatcaa 540

cagcagaagg gctccgccac caaagatgac ttgactgtgc gctatcagct agtacgacac 600

caaggggttt ggaaaattga ccaaatacaa gtggtaaatg gcccccgtta gtgcgtggcg 660

ttaactcccc ttttgaccaa tggcatacgg ctagatgccc ccataggtac ggaaacctgc 720

acttccgaga actaagcccc taccgtcact ataagagtgt gaacgtgtcg gccccaggca 780

atggattgga accatggctt ttcggcccat cgttgtgtct tatattctta cttgttaacg 840

ggagttaatt aaaattatgg gaaaagttgt tgggattgac ctcggtacca ccaat 895


<210> 39
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplifying Synechocystis spp. PCC 6803 kiaA
(SphI/KpnI)

<400> 39
gccagagcat gcaaagctca ctaactgg 28


<210> 40
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplifying Synechocystis spp. PCC 6803 kiaA
(SphI/KpnI)

<400> 40
ggaaaaggta cctgagtcta tgggcaacgt g 31


<210> 41
<211> 603
<212> DNA
<213> Synechocystis PCC6803

<400> 41
gccagagcat gcaaagctca ctaactgggc gggattttcc gggtccggtt gctgacggta 60

atagtcgtct aaaagtttgg ccacatccaa aaggctgtcg gcggggggat gctggccggc 120

gaggggatta attctgcttg tcatatacaa aaattgtaaa aaatggaggg cggcgatcag 180

gggcttagac acccaaatcc tagccaaaaa gggttaacta gccaagggct atccatgggc 240

aaagagataa aagaaaaagt ctccaaatcc ctggtcatag agaaaaaatt gccaaagtta 300

ccccaggcca tacacggccc agcgccaaga tggggagcac aaattcaaac tttgtaaaca 360

ggccggaagc tatccggcca aggagcactc agattgtgtt aacgttcagg ggagttgctt 420

aacacaattt tccaattaat agtattaata ttttcttaac ttgcaccgta ccatggtgag 480

aaagcctatc tgagccctta tttgattaac cttcgactga ttattgatcc cctgtgcagt 540

ctcccctctc cctctgtctt tttgctcccg aacacgttgc ccatagactc aggtaccttt 600

tcc 603


<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for sequence analysis of pLybAL

<400> 42
gcttctgcgt tctgatttaa tctgtatcag 30


<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for sequence analysis of pLybAL

<400> 43
atgggtctga atgtgcagaa tgtagag 27


<210> 44
<211> 11090
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> plasmid pLybAL15

<400> 44
tgcatgccgt tattgatgga atgggaagaa gcaatggtca caataaactg gaggttatgg 60

gtatgttttt tagccctaat gctccaatcg ccttgattgt atcgaatgat gcagtctcta 120

aaattgtatc cgtaaaagac ctctgcaccg ccgacgggtc tggattatgg gcaataatca 180

cagtcgagcc agactacccc tggaggtaaa ctccggggct ggagccataa agattaggaa 240

ttcattaaga aatgtaacaa tcgacgttct agatcatacc acgcccccac tgtccggcag 300

ggtgaacaga ggagactttc ccctgttaca gtgtcagtga caaaacaact ttttggcatc 360

ggtgcaggtg gtgagccatg gcggcccaga tcattgaaat tctttccccg gaggaaatcc 420

gacgtaccct tacccgtctg gcttcccagg taatttaggt accgagctcg aattggggcg 480

ttttctgtga ggctgactag cgcgtggcag ctcaaaatct ctacattctg cacattcaga 540

cccatggtct gctgcgaggg cagaacttgg aactggggcg agatgccgac accggcgggc 600

agaccaagta cgtcttagaa ctggctcaag cccaagctaa atccccacaa gtccaacaag 660

tcgacatcat cacccgccaa atcaccgacc cccgcgtcag tgttggttac agtcaggcga 720

tcgaaccctt tgcgcccaaa ggtcggattg tccgtttgcc ttttggcccc aaacgctacc 780

tccgtaaaga gctgctttgg ccccatctct acacctttgc ggatgcaatt ctccaatatc 840

tggctcagca aaagcgcacc ccgacttgga ttcaggccca ctatgctgat gctggccaag 900

tgggatcact gctgagtcgc tggttgaatg taccgctaat tttcacaggg cattctctgg 960

ggcggatcaa gctaaaaaag ctgttggagc aagactggcc gcttgaggaa attgaagcgc 1020

aattcaatat tcaacagcga attgatgcgg aggagatgac gctcactcat gctgactgga 1080

ttgtcgccag cactcagcag gaagtggagg agcaataccg cgtttacgat cgctacaacc 1140

cagagcgcaa gcttgtcatt ccaccgggtg tcgataccga tcgcttcagg tttcagccct 1200

tgggcgatcg cggtgttgtt ctccaacagg aactgagccg ctttctgcgc gacccagaaa 1260

aacctcaaat tctctgcctc tgtcgccccg cacctcgcaa aaatgtaccg gcgctggtgc 1320

gagcctttgg cgaacatcct tggctgcgca aaaaagccaa ccttgtctta gtactgggca 1380

gccgccaaga catcaaccag atggatcgcg gcagtcggca ggtgttccaa gagattttcc 1440

atctggtcga tcgctacgac ctctacggca gcgtcgccta tcccaaacag catcaggctg 1500

atgatgtgcc ggagttctat cgcctagcgg ctcattccgg cggggtattc gtcaatccgg 1560

cgctgaccga accttttggt ttgacaattt tggaggcagg aagctgcggc gtgccggtgg 1620

tggcaaccca tgatggcggc ccccaggaaa ttctcaaaca ctgtgatttc ggcactttag 1680

ttgatgtcag ccgacccgct aatatcgcga ctgcactcgc caccctgctg agcgatcgcg 1740

atctttggca gtgctatcac cgcaatggca ttgaaaaagt tcccgcccat tacagctggg 1800

atcaacatgt caataccctg tttgagcgca tggaaacggt ggctttgcct cgtcgtcgtg 1860

ctgtcagttt cgtacggagt cgcaaacgct tgattgatgc caaacgcctt gtcgttagtg 1920

acatcgacaa cacactgttg ggcgatcgtc aaggactcga gaatttaatg acctatctcg 1980

atcagtatcg cgatcatttt gcctttggaa ttgccacggg gcgtcgccta gactctgccc 2040

aagaagtctt gaaagagtgg ggcgttcctt cgccaaactt ctgggtgact tccgtcggca 2100

gcgagattca ctatggcacc gatgctgaac cggatatcag ctgggaaaag catatcaatc 2160

gcaactggaa tcctcagcga attcgggcag taatggcaca actacccttt cttgaactgc 2220

agccggaaga ggatcaaaca cccttcaaag tcagcttctt tgtccgcgat cgccacgaga 2280

ctgtgctgcg agaagtacgg caacatcttc gccgccatcg cctgcggctg aagtcaatct 2340

attcccatca ggagtttctt gacattctgc cgctagctgc ctcgaaaggg gatgcgattc 2400

gccacctctc actccgctgg cggattcctc ttgagaacat tttggtggca ggcgattctg 2460

gtaacgatga ggaaatgctc aagggccata atctcggcgt tgtagttggc aattactcac 2520

cggaattgga gccactgcgc agctacgagc gcgtctattt tgctgagggc cactatgcta 2580

atggcattct ggaagcctta aaacactatc gcttttttga ggcgatcgct taaccttttc 2640

agaatgagac gttgatcggc acgtaagcgt gagacgttga tcggcacgta agaggttcca 2700

actttcacca taatgaaata agatcactac cgggcgtatt ttttgagtta tcgagatttt 2760

caggagctaa ggaagctaaa atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat 2820

cccaatggca tcgtaaagaa cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata 2880

accagaccgt tcagctggat attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca 2940

agttttatcc ggcctttatt cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaattcc 3000

gtatggcaat gaaagacggt gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg 3060

ttttccatga gcaaactgaa acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc 3120

ggcagtttct acacatatat tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt 3180

tccctaaagg gtttattgag aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca 3240

ccagttttga tttaaacgtg gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgg 3300

gcaaatatta tacgcaaggc gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag gttcatcatg 3360

ccgtttgtga tggcttccat gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag tactgcgatg 3420

agtggcaggg cggggcgtaa tttttttaag gcagttattg gtgcccttaa acgcctggtt 3480

gctacgcctg aataagtgat aataagcgga tgaatggcag aaattcgatg ataagctgtc 3540

aaacacaacc accatcaaac aggattttcg cctgctgggg caaaccagcg tggaccgctt 3600

gctgcaactc tctcagggcc aggcggtgaa gggcaatcag ctgttgcccg tctcactggt 3660

gaaaagaaaa accaccctgg cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga 3720

ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg 3780

caattaatgt aagttagcgc gaattgcaag ctggccgacg cgctgggcta cgtcttgctg 3840

gcgttcggga gcagaagagc atacatctgg aagcaaagcc aggaaagcgg cctatggagc 3900

tgtgcggcag cgctcagtag gcaatttttc aaaatattgt taagcctttt ctgagcatgg 3960

tatttttcat ggtattacca attagcagga aaataagcca ttgaatataa aagataaaaa 4020

tgtcttgttt acaatagagt ggggggggtc agcctgccgc cttgggccgg gtgatgtcgt 4080

acttgcccgc cgcgaactcg gttaccgtcc agcccagcgc gaccagctcc ggcaacgcct 4140

cgcgcacccg cttgcggcgc ttgcgcatgg tcgaaccact ggcctctgac ggccagacat 4200

agccgcacaa ggtatctatg gaagccttgc cggttttgcc ggggtcgatc cagccacaca 4260

gccgctggtg cagcaggcgg gcggtttcgc tgtccagcgc ccgcacctcg tccatgctga 4320

tgcgcacatg ctggccgcca cccatgacgg cctgcgcgat caaggggttc agggccacgt 4380

acaggcgccc gtccgcctcg tcgctggcgt actccgacag cagccgaaac ccctgccgct 4440

tgcggccatt ctgggcgatg atggatacct tccaaaggcg ctcgatgcag tcctgtatgt 4500

gcttgagcgc cccaccacta tcgacctctg ccccgatttc ctttgccagc gcccgatagc 4560

tacctttgac cacatggcat tcagcggtga cggcctccca cttgggttcc aggaacagcc 4620

ggagctgccg tccgccttcg gtcttgggtt ccgggccaag cactaggcca ttaggcccag 4680

ccatggccac cagcccttgc aggatgcgca gatcatcagc gcccagcggc tccgggccgc 4740

tgaactcgat ccgcttgccg tcgccgtagt catacgtcac gtccagcttg ctgcgcttgc 4800

gctcgccccg cttgagggca cggaacaggc cgggggccag acagtgcgcc gggtcgtgcc 4860

ggacgtggct gaggctgtgc ttgttcttag gcttcaccac ggggcacccc cttgctcttg 4920

cgctgcctct ccagcacggc gggcttgagc accccgccgt catgccgcct gaaccaccga 4980

tcagcgaacg gtgcgccata gttggccttg ctcacaccga agcggacgaa gaaccggcgc 5040

tggtcgtcgt ccacacccca ttcctcggcc tcggcgctgg tcatgctcga caggtaggac 5100

tgccagcgga tgttatcgac cagtaccgag ctgccccggc tggcctgctg ctggtcgcct 5160

gcgcccatca tggccgcgcc cttgctggca tggtgcagga acacgataga gcacccggta 5220

tcggcggcga tggcctccat gcgaccgatg acctgggcca tggggccgct ggcgttttct 5280

tcctcgatgt ggaaccggcg cagcgtgtcc agcaccatca ggcggcggcc ctcggcggcg 5340

cgcttgaggc cgtcgaacca ctccggggcc atgatgttgg gcaggctgcc gatcagcggc 5400

tggatcagca ggccgtcagc cacggcttgc cgttcctcgg cgctgaggtg cgccccaagg 5460

gcgtgcaggc ggtgatgaat ggcggtgggc gggtcttcgg cgggcaggta gatcaccggg 5520

ccggtgggca gttcgcccac ctccagcaga tccggcccgc ctgcaatctg tgcggccagt 5580

tgcagggcca gcatggattt accggcacca ccgggcgaca ccagcgcccc gaccgtaccg 5640

gccaccatgt tgggcaaaac gtagtccagc ggtggcggcg ctgctgcgaa cgcctccaga 5700

atattgatag gcttatgggt agccattgat tgcctccttt gcaggcagtt ggtggttagg 5760

cgctggcggg gtcactaccc ccgccctgcg ccgctctgag ttcttccagg cactcgcgca 5820

gcgcctcgta ttcgtcgtcg gtcagccaga acttgcgctg acgcatccct ttggccttca 5880

tgcgctcggc atatcgcgct tggcgtacag cgtcagggct ggccagcagg tcgccggtct 5940

gcttgtcctt ttggtctttc atatcagtca ccgagaaact tgccggggcc gaaaggcttg 6000

tcttcgcgga acaaggacaa ggtgcagccg tcaaggttaa ggctggccat atcagcgact 6060

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cccttgtcac ttttgatcag gtagaccgac cctgaagcgc ttttttcgta ttccataaaa 6180

cccccttctg tgcgtgagta ctcatagtat aacaggcgtg agtaccaacg caagcactac 6240

atgctgaaat ctggcccgcc cctgtccatg cctcgctggc ggggtgccgg tgcccgtgcc 6300

agctcggccc gcgcaagctg gacgctgggc agacccatga ccttgctgac ggtgcgctcg 6360

atgtaatccg cttcgtggcc gggcttgcgc tctgccagcg ctgggctggc ctcggccatg 6420

gccttgccga tttcctcggc actgcggccc cggctggcca gcttctgcgc ggcgataaag 6480

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tcgtccagcg ccgtgcgccg gtggcggcta agctgccgct cgggcagttc gaggctggcc 6600

agcctgcggg ccttctcctg ctgccgctgg gcctgctcga tctgctggcc agcctgctgc 6660

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atatacacgt cattgccctg ggcattcatc cgcttgagcc atggcgtgtt ctggagcact 7080

tcggcggctg accattcccg gttcatcatc tggccggtgg gtgcgtccct gacgccgata 7140

tcgaagcgct cacagcccat ggccttgagc tgtcggccta tggcctgcaa agtcctgtcg 7200

ttcttcatcg ggccaccaag cgcagccaga tcgagccgtc ctcggttgtc agtggcgtca 7260

ggtcgagcaa gagcaacgat gcgatcagca gcaccaccgt aggcatcatg gaagccagca 7320

tcacggttag ccatagcttc cagtgccacc cccgcgacgc gctccgggcg ctctgcgcgg 7380

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ggctcatgac ctgccgggct tcgtcggcca gtgtcgccat gctctgggcc agcggttcga 7560

tctgctccgc taactcgttg atgcctctgg atttcttcac tctgtcgatt gcgttcatgg 7620

tctattgcct cccggtattc ctgtaagtcg atgatctggg cgttggcggt gtcgatgttc 7680

agggccacgt ctgcccggtc ggtgcggatg ccccggcctt ccatctccac cacgttcggc 7740

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cgggcgtcgt ggccagcccg ctctaatgcc cggttggcat ggtcggccca tgcctcgcgg 7860

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tccggcatgt gcccggattc ggcgtgcaag acttcatcca tgtcgcgggc atacttgcct 8280

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ccatgatagc ctacgagaca gcacattaac aatggggtgt caagatggtt aaggggagca 8580

acaaggcggc ggatcggctg gccaagctcg aagaacaacg agcgcgaatc aatgccgaaa 8640

ttcagcggga gcgggcaagg gaacagcagc aagagcgcaa gaacgaaaca aggcgcaagg 8700

tgctggtggg ggccatgatt ttggccaagg tgaacagcag cgagtggccg gaggatcggc 8760

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gctgggtttg caggtttggg ggcgtgacag ttattgcagg ggttcgtgac agttattgca 9240

ggggggcgtg acagttattg caggggttcg tgacagttag tacgggagtg acgggcactg 9300

gctggcaatg tctagcaacg gcaggcattt cggctgaggg taaaagaact ttccgctaag 9360

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ctggagcatg gctttctacg ggttcgctgc gagtcttgcc acgccgagca cctggtcgct 9660

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ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 9840

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gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 10200

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caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 10560

tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 10620

gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaaa gagtttgtag aaacgcaaaa 10680

aggccatccg tcaggatggc cttctgctta atttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt 10740

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caccgcgcta ctgccgccag gcaaattctg ttttatcaga ccgcttctgc gttctgattt 11040

aatctgtatc aggctgaaaa tcttctctca tccgccaaaa cagccaagct 11090


<210> 45
<211> 11000
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> plasmid pLybAL16

<400> 45
tgcatgcagg aaaacaagct cagaatgctg cggggagaag ggcaactccc caccagcccc 60

aaatttttgc tggcgataaa tatttttcgg tttaattgtt cacaaagctt tttgaatttg 120

agtttataga aatttattgg ctggtaatgc ttttttgccc ccctgcagga cttcattgat 180

ccttgcctat accatcaata tcattggtca ataatgatga tgattgacta aaacatgttt 240

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tacgttacaa attttaacga aacgggaacc ctatattgat ctctactgtt atctggcttg 360

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gcagtcggca ggtgttccaa gagattttcc atctggtcga tcgctacgac ctctacggca 1380

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ctgcactcgc caccctgctg agcgatcgcg atctttggca gtgctatcac cgcaatggca 1680

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tcggcgctgg tcatgctcga caggtaggac tgccagcgga tgttatcgac cagtaccgag 5040

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agcaccatca ggcggcggcc ctcggcggcg cgcttgaggc cgtcgaacca ctccggggcc 5280

atgatgttgg gcaggctgcc gatcagcggc tggatcagca ggccgtcagc cacggcttgc 5340

cgttcctcgg cgctgaggtg cgccccaagg gcgtgcaggc ggtgatgaat ggcggtgggc 5400

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gggttctcgc cgccaccggc atggatggcc agcgtatacg gcaggcgctc ggcaccggtc 7980

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<210> 46
<211> 11269
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> plasmid pLybAL17

<400> 46
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aggagctaag gaagctaaaa tggagaaaaa aatcactgga tataccaccg ttgatatatc 3000

ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc atttcagtca gttgctcaat gtacctataa 3060

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caaatattat acgcaaggcg acaaggtgct gatgccgctg gcgattcagg ttcatcatgc 3540

cgtttgtgat ggcttccatg tcggcagaat gcttaatgaa ttacaacagt actgcgatga 3600

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cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc 10680

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cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaaag agtttgtaga aacgcaaaaa 10860

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<211> 11195
<212> DNA
<213> Artificial

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<223> plasmid pLybAL18

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gctgactgga ttgtcgccag cactcagcag gaagtggagg agcaataccg cgtttacgat 1860

cgctacaacc cagagcgcaa gcttgtcatt ccaccgggtg tcgataccga tcgcttcagg 1920

tttcagccct tgggcgatcg cggtgttgtt ctccaacagg aactgagccg ctttctgcgc 1980

gacccagaaa aacctcaaat tctctgcctc tgtcgccccg cacctcgcaa aaatgtaccg 2040

gcgctggtgc gagcctttgg cgaacatcct tggctgcgca aaaaagccaa ccttgtctta 2100

gtactgggca gccgccaaga catcaaccag atggatcgcg gcagtcggca ggtgttccaa 2160

gagattttcc atctggtcga tcgctacgac ctctacggca gcgtcgccta tcccaaacag 2220

catcaggctg atgatgtgcc ggagttctat cgcctagcgg ctcattccgg cggggtattc 2280

gtcaatccgg cgctgaccga accttttggt ttgacaattt tggaggcagg aagctgcggc 2340

gtgccggtgg tggcaaccca tgatggcggc ccccaggaaa ttctcaaaca ctgtgatttc 2400

ggcactttag ttgatgtcag ccgacccgct aatatcgcga ctgcactcgc caccctgctg 2460

agcgatcgcg atctttggca gtgctatcac cgcaatggca ttgaaaaagt tcccgcccat 2520

tacagctggg atcaacatgt caataccctg tttgagcgca tggaaacggt ggctttgcct 2580

cgtcgtcgtg ctgtcagttt cgtacggagt cgcaaacgct tgattgatgc caaacgcctt 2640

gtcgttagtg acatcgacaa cacactgttg ggcgatcgtc aaggactcga gaatttaatg 2700

acctatctcg atcagtatcg cgatcatttt gcctttggaa ttgccacggg gcgtcgccta 2760

gactctgccc aagaagtctt gaaagagtgg ggcgttcctt cgccaaactt ctgggtgact 2820

tccgtcggca gcgagattca ctatggcacc gatgctgaac cggatatcag ctgggaaaag 2880

catatcaatc gcaactggaa tcctcagcga attcgggcag taatggcaca actacccttt 2940

cttgaactgc agccggaaga ggatcaaaca cccttcaaag tcagcttctt tgtccgcgat 3000

cgccacgaga ctgtgctgcg agaagtacgg caacatcttc gccgccatcg cctgcggctg 3060

aagtcaatct attcccatca ggagtttctt gacattctgc cgctagctgc ctcgaaaggg 3120

gatgcgattc gccacctctc actccgctgg cggattcctc ttgagaacat tttggtggca 3180

ggcgattctg gtaacgatga ggaaatgctc aagggccata atctcggcgt tgtagttggc 3240

aattactcac cggaattgga gccactgcgc agctacgagc gcgtctattt tgctgagggc 3300

cactatgcta atggcattct ggaagcctta aaacactatc gcttttttga ggcgatcgct 3360

taaccttttc agaatgagac gttgatcggc acgtaagcgt gagacgttga tcggcacgta 3420

agaggttcca actttcacca taatgaaata agatcactac cgggcgtatt ttttgagtta 3480

tcgagatttt caggagctaa ggaagctaaa atggagaaaa aaatcactgg atataccacc 3540

gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa cattttgagg catttcagtc agttgctcaa 3600

tgtacctata accagaccgt tcagctggat attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa 3660

aataagcaca agttttatcc ggcctttatt cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat 3720

ccggaattcc gtatggcaat gaaagacggt gagctggtga tatgggatag tgttcaccct 3780

tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa acgttttcat cgctctggag tgaataccac 3840

gacgatttcc ggcagtttct acacatatat tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac 3900

ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg 3960

gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt 4020

ttcaccatgg gcaaatatta tacgcaaggc gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag 4080

gttcatcatg ccgtttgtga tggcttccat gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag 4140

tactgcgatg agtggcaggg cggggcgtaa tttttttaag gcagttattg gtgcccttaa 4200

acgcctggtt gctacgcctg aataagtgat aataagcgga tgaatggcag aaattcgatg 4260

ataagctgtc aaacacaacc accatcaaac aggattttcg cctgctgggg caaaccagcg 4320

tggaccgctt gctgcaactc tctcagggcc aggcggtgaa gggcaatcag ctgttgcccg 4380

tctcactggt gaaaagaaaa accaccctgg cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg 4440

cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt 4500

gagcgcaacg caattaatgt aagttagcgc gaattgcaag ctggccgacg cgctgggcta 4560

cgtcttgctg gcgttcggga gcagaagagc atacatctgg aagcaaagcc aggaaagcgg 4620

cctatggagc tgtgcggcag cgctcagtag gcaatttttc aaaatattgt taagcctttt 4680

ctgagcatgg tatttttcat ggtattacca attagcagga aaataagcca ttgaatataa 4740

aagataaaaa tgtcttgttt acaatagagt ggggggggtc agcctgccgc cttgggccgg 4800

gtgatgtcgt acttgcccgc cgcgaactcg gttaccgtcc agcccagcgc gaccagctcc 4860

ggcaacgcct cgcgcacccg cttgcggcgc ttgcgcatgg tcgaaccact ggcctctgac 4920

ggccagacat agccgcacaa ggtatctatg gaagccttgc cggttttgcc ggggtcgatc 4980

cagccacaca gccgctggtg cagcaggcgg gcggtttcgc tgtccagcgc ccgcacctcg 5040

tccatgctga tgcgcacatg ctggccgcca cccatgacgg cctgcgcgat caaggggttc 5100

agggccacgt acaggcgccc gtccgcctcg tcgctggcgt actccgacag cagccgaaac 5160

ccctgccgct tgcggccatt ctgggcgatg atggatacct tccaaaggcg ctcgatgcag 5220

tcctgtatgt gcttgagcgc cccaccacta tcgacctctg ccccgatttc ctttgccagc 5280

gcccgatagc tacctttgac cacatggcat tcagcggtga cggcctccca cttgggttcc 5340

aggaacagcc ggagctgccg tccgccttcg gtcttgggtt ccgggccaag cactaggcca 5400

ttaggcccag ccatggccac cagcccttgc aggatgcgca gatcatcagc gcccagcggc 5460

tccgggccgc tgaactcgat ccgcttgccg tcgccgtagt catacgtcac gtccagcttg 5520

ctgcgcttgc gctcgccccg cttgagggca cggaacaggc cgggggccag acagtgcgcc 5580

gggtcgtgcc ggacgtggct gaggctgtgc ttgttcttag gcttcaccac ggggcacccc 5640

cttgctcttg cgctgcctct ccagcacggc gggcttgagc accccgccgt catgccgcct 5700

gaaccaccga tcagcgaacg gtgcgccata gttggccttg ctcacaccga agcggacgaa 5760

gaaccggcgc tggtcgtcgt ccacacccca ttcctcggcc tcggcgctgg tcatgctcga 5820

caggtaggac tgccagcgga tgttatcgac cagtaccgag ctgccccggc tggcctgctg 5880

ctggtcgcct gcgcccatca tggccgcgcc cttgctggca tggtgcagga acacgataga 5940

gcacccggta tcggcggcga tggcctccat gcgaccgatg acctgggcca tggggccgct 6000

ggcgttttct tcctcgatgt ggaaccggcg cagcgtgtcc agcaccatca ggcggcggcc 6060

ctcggcggcg cgcttgaggc cgtcgaacca ctccggggcc atgatgttgg gcaggctgcc 6120

gatcagcggc tggatcagca ggccgtcagc cacggcttgc cgttcctcgg cgctgaggtg 6180

cgccccaagg gcgtgcaggc ggtgatgaat ggcggtgggc gggtcttcgg cgggcaggta 6240

gatcaccggg ccggtgggca gttcgcccac ctccagcaga tccggcccgc ctgcaatctg 6300

tgcggccagt tgcagggcca gcatggattt accggcacca ccgggcgaca ccagcgcccc 6360

gaccgtaccg gccaccatgt tgggcaaaac gtagtccagc ggtggcggcg ctgctgcgaa 6420

cgcctccaga atattgatag gcttatgggt agccattgat tgcctccttt gcaggcagtt 6480

ggtggttagg cgctggcggg gtcactaccc ccgccctgcg ccgctctgag ttcttccagg 6540

cactcgcgca gcgcctcgta ttcgtcgtcg gtcagccaga acttgcgctg acgcatccct 6600

ttggccttca tgcgctcggc atatcgcgct tggcgtacag cgtcagggct ggccagcagg 6660

tcgccggtct gcttgtcctt ttggtctttc atatcagtca ccgagaaact tgccggggcc 6720

gaaaggcttg tcttcgcgga acaaggacaa ggtgcagccg tcaaggttaa ggctggccat 6780

atcagcgact gaaaagcggc cagcctcggc cttgtttgac gtataaccaa agccaccggg 6840

caaccaatag cccttgtcac ttttgatcag gtagaccgac cctgaagcgc ttttttcgta 6900

ttccataaaa cccccttctg tgcgtgagta ctcatagtat aacaggcgtg agtaccaacg 6960

caagcactac atgctgaaat ctggcccgcc cctgtccatg cctcgctggc ggggtgccgg 7020

tgcccgtgcc agctcggccc gcgcaagctg gacgctgggc agacccatga ccttgctgac 7080

ggtgcgctcg atgtaatccg cttcgtggcc gggcttgcgc tctgccagcg ctgggctggc 7140

ctcggccatg gccttgccga tttcctcggc actgcggccc cggctggcca gcttctgcgc 7200

ggcgataaag tcgcacttgc tgaggtcatg accgaagcgc ttgaccagcc cggccatctc 7260

gctgcggtac tcgtccagcg ccgtgcgccg gtggcggcta agctgccgct cgggcagttc 7320

gaggctggcc agcctgcggg ccttctcctg ctgccgctgg gcctgctcga tctgctggcc 7380

agcctgctgc accagcgccg ggccagcggt ggcggtcttg cccttggatt cacgcagcag 7440

cacccacggc tgataaccgg cgcgggtggt gtgcttgtcc ttgcggttgg tgaagcccgc 7500

caagcggcca tagtggcggc tgtcggcgct ggccgggtcg gcgtcgtact cgctggccag 7560

cgtccgggca atctgccccc gaagttcacc gcctgcggcg tcggccacct tgacccatgc 7620

ctgatagttc ttcgggctgg tttccactac cagggcaggc tcccggccct cggctttcat 7680

gtcatccagg tcaaactcgc tgaggtcgtc caccagcacc agaccatgcc gctcctgctc 7740

ggcgggcctg atatacacgt cattgccctg ggcattcatc cgcttgagcc atggcgtgtt 7800

ctggagcact tcggcggctg accattcccg gttcatcatc tggccggtgg gtgcgtccct 7860

gacgccgata tcgaagcgct cacagcccat ggccttgagc tgtcggccta tggcctgcaa 7920

agtcctgtcg ttcttcatcg ggccaccaag cgcagccaga tcgagccgtc ctcggttgtc 7980

agtggcgtca ggtcgagcaa gagcaacgat gcgatcagca gcaccaccgt aggcatcatg 8040

gaagccagca tcacggttag ccatagcttc cagtgccacc cccgcgacgc gctccgggcg 8100

ctctgcgcgg cgctgctcac ctcggcggct acctcccgca actctttggc cagctccacc 8160

catgccgccc ctgtctggcg ctgggctttc agccactccg ccgcctgcgc ctcgctggcc 8220

tgcttggtct ggctcatgac ctgccgggct tcgtcggcca gtgtcgccat gctctgggcc 8280

agcggttcga tctgctccgc taactcgttg atgcctctgg atttcttcac tctgtcgatt 8340

gcgttcatgg tctattgcct cccggtattc ctgtaagtcg atgatctggg cgttggcggt 8400

gtcgatgttc agggccacgt ctgcccggtc ggtgcggatg ccccggcctt ccatctccac 8460

cacgttcggc cccaggtgaa caccgggcag gcgctcgatg ccctgcgcct caagtgttct 8520

gtggtcaatg cgggcgtcgt ggccagcccg ctctaatgcc cggttggcat ggtcggccca 8580

tgcctcgcgg gtctgctcaa gccatgcctt gggcttgagc gcttcggtct tctgtgcccc 8640

gcccttctcc ggggtcttgc cgttgtaccg cttgaaccac tgagcggcgg gccgctcgat 8700

gccgtcattg atccgctcgg agatcatcag gtggcagtgc gggttctcgc cgccaccggc 8760

atggatggcc agcgtatacg gcaggcgctc ggcaccggtc aggtgctggg cgaactcgga 8820

cgccagcgcc ttctgctggt cgagggtcag ctcgaccggc agggcaaatt cgacctcctt 8880

gaacagccgc ccattggcgc gttcatacag gtcggcagca tcccagtagt cggcgggccg 8940

ctcgacgaac tccggcatgt gcccggattc ggcgtgcaag acttcatcca tgtcgcgggc 9000

atacttgcct tcgcgctgga tgtagtcggc cttggccctg gccgattggc cgcccgacct 9060

gctgccggtt ttcgccgtaa ggtgataaat cgccatgctg cctcgctgtt gcttttgctt 9120

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tttctcgaag agaaaccggt aagtgcgccc tcccctacaa agtagggtcg ggattgccgc 9240

cgctgtgcct ccatgatagc ctacgagaca gcacattaac aatggggtgt caagatggtt 9300

aaggggagca acaaggcggc ggatcggctg gccaagctcg aagaacaacg agcgcgaatc 9360

aatgccgaaa ttcagcggga gcgggcaagg gaacagcagc aagagcgcaa gaacgaaaca 9420

aggcgcaagg tgctggtggg ggccatgatt ttggccaagg tgaacagcag cgagtggccg 9480

gaggatcggc tcatggcggc aatggatgcg taccttgaac gcgaccacga ccgcgccttg 9540

ttcggtctgc cgccacgcca gaaggatgag ccgggctgaa tgatcgaccg agacaggccc 9600

tgcggggctg cacacgcgcc cccacccttc gggtaggggg aaaggccgct aaagcggcta 9660

aaagcgctcc agcgtatttc tgcggggttt ggtgtggggt ttagcgggct ttgcccgcct 9720

ttccccctgc cgcgcagcgg tggggcggtg tgtagcctag cgcagcgaat agaccagcta 9780

tccggcctct ggccgggcat attgggcaag ggcagcagcg ccccacaagg gcgctgataa 9840

ccgcgcctag tggattattc ttagataatc atggatggat ttttccaaca ccccgccagc 9900

ccccgcccct gctgggtttg caggtttggg ggcgtgacag ttattgcagg ggttcgtgac 9960

agttattgca ggggggcgtg acagttattg caggggttcg tgacagttag tacgggagtg 10020

acgggcactg gctggcaatg tctagcaacg gcaggcattt cggctgaggg taaaagaact 10080

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ggcagagcag ggaaaggaat tgccgggcta tgtgcaacgg gaatttgaag aatttctcca 10320

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cctggtcgct ttcagaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 10440

caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 10500

gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 10560

gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 10620

ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 10680

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attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 11160

tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 11220

tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 11280

aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 11340

tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaaa gagtttgtag 11400

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cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc 11580

ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg gcagttccct actctcgcat 11640

ggggagaccc cacactacca tcggcgctac ggcgtttcac ttctgagttc ggcatggggt 11700

caggtgggac caccgcgcta ctgccgccag gcaaattctg ttttatcaga ccgcttctgc 11760

gttctgattt aatctgtatc aggctgaaaa tcttctctca tccgccaaaa cagccaagct 11820


<210> 49
<211> 11511
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> plasmid pLybAL21

<400> 49
tgcatgcacc agtaaacata aatctccccg gcgacgcaaa aaacgggtga ccatcaagcc 60

ggtgcgcttc ggcatttttc tgctttgcct agcaggcatt gtgggggggg caactgccct 120

aattatcaat cgtactggcg atcccctagg tgggttgcta gaagaccccc tagatgtttt 180

cctggaccaa ccttcagaat ttatccccga tgaagccacg agccggaatt tgattctcag 240

tcaacccaac ttcaatcagc aagtgggtca gatggtagta caaggctggc ttgatagtaa 300

aaagttagcc tttggccaaa actacgatgt cggggcattg cagagtgttt tagcccccaa 360

tctccttgcc caacaacggg gtcgggccca acgggatcaa gcccaaaagg tctatcacca 420

atacgaacac aagttgcaga ttttagccta tcaagttaac ccccaagacc ccaaccgagc 480

caccgttact gcccgggtag aagaaattag ccagcccttt accctaggta atcaacagca 540

gaagggctcc gccaccaaag atgacttgac tgtgcgctat cagctagtac gacaccaagg 600

ggtttggaaa attgaccaaa tacaagtggt aaatggcccc cgttagtgcg tggcgttaac 660

tccccttttg accaatggca tacggctaga tgcccccata ggtacggaaa cctgcacttc 720

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ctccgtaaag agctgctttg gccccatctc tacacctttg cggatgcaat tctccaatat 1260

ctggctcagc aaaagcgcac cccgacttgg attcaggccc actatgctga tgctggccaa 1320

gtgggatcac tgctgagtcg ctggttgaat gtaccgctaa ttttcacagg gcattctctg 1380

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gatcaacatg tcaataccct gtttgagcgc atggaaacgg tggctttgcc tcgtcgtcgt 2280

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gacatcgaca acacactgtt gggcgatcgt caaggactcg agaatttaat gacctatctc 2400

gatcagtatc gcgatcattt tgcctttgga attgccacgg ggcgtcgcct agactctgcc 2460

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agcgagattc actatggcac cgatgctgaa ccggatatca gctgggaaaa gcatatcaat 2580

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cagccggaag aggatcaaac acccttcaaa gtcagcttct ttgtccgcga tcgccacgag 2700

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actcgcgcag cgcctcgtat tcgtcgtcgg tcagccagaa cttgcgctga cgcatccctt 6000

tggccttcat gcgctcggca tatcgcgctt ggcgtacagc gtcagggctg gccagcaggt 6060

cgccggtctg cttgtccttt tggtctttca tatcagtcac cgagaaactt gccggggccg 6120

aaaggcttgt cttcgcggaa caaggacaag gtgcagccgt caaggttaag gctggccata 6180

tcagcgactg aaaagcggcc agcctcggcc ttgtttgacg tataaccaaa gccaccgggc 6240

aaccaatagc ccttgtcact tttgatcagg tagaccgacc ctgaagcgct tttttcgtat 6300

tccataaaac ccccttctgt gcgtgagtac tcatagtata acaggcgtga gtaccaacgc 6360

aagcactaca tgctgaaatc tggcccgccc ctgtccatgc ctcgctggcg gggtgccggt 6420

gcccgtgcca gctcggcccg cgcaagctgg acgctgggca gacccatgac cttgctgacg 6480

gtgcgctcga tgtaatccgc ttcgtggccg ggcttgcgct ctgccagcgc tgggctggcc 6540

tcggccatgg ccttgccgat ttcctcggca ctgcggcccc ggctggccag cttctgcgcg 6600

gcgataaagt cgcacttgct gaggtcatga ccgaagcgct tgaccagccc ggccatctcg 6660

ctgcggtact cgtccagcgc cgtgcgccgg tggcggctaa gctgccgctc gggcagttcg 6720

aggctggcca gcctgcgggc cttctcctgc tgccgctggg cctgctcgat ctgctggcca 6780

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acccacggct gataaccggc gcgggtggtg tgcttgtcct tgcggttggt gaagcccgcc 6900

aagcggccat agtggcggct gtcggcgctg gccgggtcgg cgtcgtactc gctggccagc 6960

gtccgggcaa tctgcccccg aagttcaccg cctgcggcgt cggccacctt gacccatgcc 7020

tgatagttct tcgggctggt ttccactacc agggcaggct cccggccctc ggctttcatg 7080

tcatccaggt caaactcgct gaggtcgtcc accagcacca gaccatgccg ctcctgctcg 7140

gcgggcctga tatacacgtc attgccctgg gcattcatcc gcttgagcca tggcgtgttc 7200

tggagcactt cggcggctga ccattcccgg ttcatcatct ggccggtggg tgcgtccctg 7260

acgccgatat cgaagcgctc acagcccatg gccttgagct gtcggcctat ggcctgcaaa 7320

gtcctgtcgt tcttcatcgg gccaccaagc gcagccagat cgagccgtcc tcggttgtca 7380

gtggcgtcag gtcgagcaag agcaacgatg cgatcagcag caccaccgta ggcatcatgg 7440

aagccagcat cacggttagc catagcttcc agtgccaccc ccgcgacgcg ctccgggcgc 7500

tctgcgcggc gctgctcacc tcggcggcta cctcccgcaa ctctttggcc agctccaccc 7560

atgccgcccc tgtctggcgc tgggctttca gccactccgc cgcctgcgcc tcgctggcct 7620

gcttggtctg gctcatgacc tgccgggctt cgtcggccag tgtcgccatg ctctgggcca 7680

gcggttcgat ctgctccgct aactcgttga tgcctctgga tttcttcact ctgtcgattg 7740

cgttcatggt ctattgcctc ccggtattcc tgtaagtcga tgatctgggc gttggcggtg 7800

tcgatgttca gggccacgtc tgcccggtcg gtgcggatgc cccggccttc catctccacc 7860

acgttcggcc ccaggtgaac accgggcagg cgctcgatgc cctgcgcctc aagtgttctg 7920

tggtcaatgc gggcgtcgtg gccagcccgc tctaatgccc ggttggcatg gtcggcccat 7980

gcctcgcggg tctgctcaag ccatgccttg ggcttgagcg cttcggtctt ctgtgccccg 8040

cccttctccg gggtcttgcc gttgtaccgc ttgaaccact gagcggcggg ccgctcgatg 8100

ccgtcattga tccgctcgga gatcatcagg tggcagtgcg ggttctcgcc gccaccggca 8160

tggatggcca gcgtatacgg caggcgctcg gcaccggtca ggtgctgggc gaactcggac 8220

gccagcgcct tctgctggtc gagggtcagc tcgaccggca gggcaaattc gacctccttg 8280

aacagccgcc cattggcgcg ttcatacagg tcggcagcat cccagtagtc ggcgggccgc 8340

tcgacgaact ccggcatgtg cccggattcg gcgtgcaaga cttcatccat gtcgcgggca 8400

tacttgcctt cgcgctggat gtagtcggcc ttggccctgg ccgattggcc gcccgacctg 8460

ctgccggttt tcgccgtaag gtgataaatc gccatgctgc ctcgctgttg cttttgcttt 8520

tcggctccat gcaatggccc tcggagagcg caccgcccga agggtggccg ttaggccagt 8580

ttctcgaaga gaaaccggta agtgcgccct cccctacaaa gtagggtcgg gattgccgcc 8640

gctgtgcctc catgatagcc tacgagacag cacattaaca atggggtgtc aagatggtta 8700

aggggagcaa caaggcggcg gatcggctgg ccaagctcga agaacaacga gcgcgaatca 8760

atgccgaaat tcagcgggag cgggcaaggg aacagcagca agagcgcaag aacgaaacaa 8820

ggcgcaaggt gctggtgggg gccatgattt tggccaaggt gaacagcagc gagtggccgg 8880

aggatcggct catggcggca atggatgcgt accttgaacg cgaccacgac cgcgccttgt 8940

tcggtctgcc gccacgccag aaggatgagc cgggctgaat gatcgaccga gacaggccct 9000

gcggggctgc acacgcgccc ccacccttcg ggtaggggga aaggccgcta aagcggctaa 9060

aagcgctcca gcgtatttct gcggggtttg gtgtggggtt tagcgggctt tgcccgcctt 9120

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ccggcctctg gccgggcata ttgggcaagg gcagcagcgc cccacaaggg cgctgataac 9240

cgcgcctagt ggattattct tagataatca tggatggatt tttccaacac cccgccagcc 9300

cccgcccctg ctgggtttgc aggtttgggg gcgtgacagt tattgcaggg gttcgtgaca 9360

gttattgcag gggggcgtga cagttattgc aggggttcgt gacagttagt acgggagtga 9420

cgggcactgg ctggcaatgt ctagcaacgg caggcatttc ggctgagggt aaaagaactt 9480

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ctggtcgctt tcagaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 9840

aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 9900

cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 9960

ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 10020

cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 10080

ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 10140

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gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 10320

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cagtctttcg actgagcctt tcgttttatt tgatgcctgg cagttcccta ctctcgcatg 11040

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ttctgattta atctgtatca ggctgaaaat cttctctcat ccgccaaaac agccaagct 11219


<210> 51
<211> 4962
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> plasmid pLybAL13f

<400> 51
cgaccaattc acgtgtttga cagcttatca tcgaatttct gccattcatc cgcttattat 60

cacttattca ggcgtagcaa ccaggcgttt aagggcacca ataactgcct taaaaaaatt 120

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ggaagccatc acaaacggca tgatgaacct gaatcgccag cggcatcagc accttgtcgc 240

cttgcgtata atatttgccc atggtgaaaa cgggggcgaa gaagttgtcc atattggcca 300

cgtttaaatc aaaactggtg aaactcaccc agggattggc tgagacgaaa aacatattct 360

caataaaccc tttagggaaa taggccaggt tttcaccgta acacgccaca tcttgcgaat 420

atatgtgtag aaactgccgg aaatcgtcgt ggtattcact ccagagcgat gaaaacgttt 480

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cgtctttcat tgccatacgg aattccggat gagcattcat caggcgggca agaatgtgaa 600

taaaggccgg ataaaacttg tgcttatttt tctttacggt ctttaaaaag gccgtaatat 660

ccagctgaac ggtctggtta taggtacatt gagcaactga ctgaaatgcc tcaaaatgtt 720

ctttacgatg ccattgggat atatcaacgg tggtatatcc agtgattttt ttctccattt 780

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aagggtgttt gatcctcttc cggctgcagt tcaagaaagg gtagttgtgc cattactgcc 1260

cgaattcgct gaggattcca gttgcgattg atatgctttt cccagctgat atccggttca 1320

gcatcggtgc catagtgaat ctcgctgccg acggaagtca cccagaagtt tggcgaagga 1380

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ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 3300

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<211> 4962
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tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 3420

tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 3480

tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 3540

tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 3600

gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagca tcgatttttg 3660

tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcaga aaggcccacc 3720

cgaaggtgag ccaggtgatt acatttgggc cctcatcaga ggttttcacc gtcatcaccg 3780

aaacgcgcga ggcagctgcg gtaaagctca tcagcgtggt cgtgaagcga ttcacagatg 3840

tctgcctgtt catccgcgtc cagctcgttg agtttctcca gaagcgttaa tgtctggctt 3900

ctgataaagc gggccatgtt aagggcggtt ttttcctgtt tggtcattta gaaaaactca 3960

tcgagcatca agtgaaactg caatttattc atatcaggat tatcaatacc atatttttga 4020

aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac tcaccgaggc agttccatag gatggcaaga 4080

tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt ccaacatcaa tacaacctat taatttcccc 4140

tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa tcaccatgag tgacgactga atccggtgag 4200

aatggcaaaa gcttatgcat ttctttccag acttgttcaa caggccagcc attacgctcg 4260

tcatcaaaat cactcgcacc aaccaaaccg ttattcattc gtgattgcgc ctgagcgaga 4320

cgaaatacgc gatcgccgtt aaaaggacaa ttacaaacag gaatcgaatg caaccggcgc 4380

aggaacactg ccagcgcatc aacaatattt tcacctgaat caggatattc ttctaatacc 4440

tggaatgctg ttttccctgg gatcgcagtg gtgagtaacc atgcatcatc aggagtacgg 4500

ataaaatgct tgatggtcgg aagaggcata aattccgtca gccagtttag cctgaccatc 4560

tcatctgtaa catcattggc aacgctacct ttgccatgtt tcagaaacaa ctctggcgca 4620

tcgggcttcc catacaatcg atagattgtc gcacctgatt gcccgacatt atcgcgagcc 4680

catttatacc catataaatc agcatccatg ttggaattta atcgcggcct cgagcaagac 4740

gtttcccgtt gaatatggct cattttagct tccttagctc ctgaaaatct cgataactca 4800

aaaaatacgc ccggtagtga tcttatttca ttatggtgaa agttggaacc tcttacgtgc 4860

cgatcaagtc aaaagcctcc ggtcggaggc ttttgacttt ctgctatgga ggtcaggtat 4920

gatttaaatg gtcagtattg agcgatatct agagaattcg tc 4962


<210> 53
<211> 5052
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> plasmid pLybAL14f

<400> 53
cgaccaattc acgtgtttga cagcttatca tcgaatttct gccattcatc cgcttattat 60

cacttattca ggcgtagcaa ccaggcgttt aagggcacca ataactgcct taaaaaaatt 120

acgccccgcc ctgccactca tcgcagtact gttgtaattc attaagcatt ctgccgacat 180

ggaagccatc acaaacggca tgatgaacct gaatcgccag cggcatcagc accttgtcgc 240

cttgcgtata atatttgccc atggtgaaaa cgggggcgaa gaagttgtcc atattggcca 300

cgtttaaatc aaaactggtg aaactcaccc agggattggc tgagacgaaa aacatattct 360

caataaaccc tttagggaaa taggccaggt tttcaccgta acacgccaca tcttgcgaat 420

atatgtgtag aaactgccgg aaatcgtcgt ggtattcact ccagagcgat gaaaacgttt 480

cagtttgctc atggaaaacg gtgtaacaag ggtgaacact atcccatatc accagctcac 540

cgtctttcat tgccatacgg aattccggat gagcattcat caggcgggca agaatgtgaa 600

taaaggccgg ataaaacttg tgcttatttt tctttacggt ctttaaaaag gccgtaatat 660

ccagctgaac ggtctggtta taggtacatt gagcaactga ctgaaatgcc tcaaaatgtt 720

ctttacgatg ccattgggat atatcaacgg tggtatatcc agtgattttt ttctccattt 780

tagcttcctt agctcctgaa aatctcgata actcaaaaaa tacgcccggt agtgatctta 840

tttcattatg gtgaaagttg gaacctctta cgtgccgatc aacgtctcac gttctgaaaa 900

ggttaagcga tcgcctcaaa aaagcgatag tgttttaagg cttccagaat gccattagca 960

tagtggccct cagcaaaata gacgcgctcg tagctgcgca gtggctccaa ttccggtgag 1020

taattgccaa ctacaacgcc gagattatgg cccttgagca tttcctcatc gttaccagaa 1080

tcgcctgcca ccaaaatgtt ctcaagagga atccgccagc ggagtgagag gtggcgaatc 1140

gcatcccctt tcgaggcagc tagcggcaga atgtcaagaa actcctgatg ggaatagatt 1200

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tggcgatcgc ggacaaagaa gctgactttg aagggtgttt gatcctcttc cggctgcagt 1320

tcaagaaagg gtagttgtgc cattactgcc cgaattcgct gaggattcca gttgcgattg 1380

atatgctttt cccagctgat atccggttca gcatcggtgc catagtgaat ctcgctgccg 1440

acggaagtca cccagaagtt tggcgaagga acgccccact ctttcaagac ttcttgggca 1500

gagtctaggc gacgccccgt ggcaattcca aaggcaaaat gatcgcgata ctgatcgaga 1560

taggtcatta aattctcgag tccttgacga tcgcccaaca gtgtgttgtc gatgtcacta 1620

acgacaaggc gtttggcatc aatcaagcgt ttgcgactcc gtacgaaact gacagcacga 1680

cgacgaggca aagccaccgt ttccatgcgc tcaaacaggg tattgacatg ttgatcccag 1740

ctgtaatggg cgggaacttt ttcaatgcca ttgcggtgat agcactgcca aagatcgcga 1800

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gtgccgaaat cacagtgttt gagaatttcc tgggggccgc catcatgggt tgccaccacc 1920

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tgatgctgtt tgggataggc gacgctgccg tagaggtcgt agcgatcgac cagatggaaa 2100

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agcgccggta catttttgcg aggtgcgggg cgacagaggc agagaatttg aggtttttct 2280

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tggagaattg catccgcaaa ggtgtagaga tggggccaaa gcagctcttt acggaggtag 2760

cgtttggggc caaaaggcaa acggacaatc cgacctttgg gcgcaaaggg ttcgatcgcc 2820

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caattgtagt ctaacgaatt caagcttgat atcattcagg acgagcctca gactccagcg 3120

taactggact gcaatcaact cactggctca ccttcacggg tgggcctttc ttcggtagaa 3180

aatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 3240

aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 3300

gaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag 3360

ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 3420

ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 3480

tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 3540

ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 3600

acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 3660

gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 3720

cgccacctct gacttgagca tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 3780

aaaaacgcca gcaacgcaga aaggcccacc cgaaggtgag ccaggtgatt acatttgggc 3840

cctcatcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagctgcg gtaaagctca 3900

tcagcgtggt cgtgaagcga ttcacagatg tctgcctgtt catccgcgtc cagctcgttg 3960

agtttctcca gaagcgttaa tgtctggctt ctgataaagc gggccatgtt aagggcggtt 4020

ttttcctgtt tggtcattta gaaaaactca tcgagcatca agtgaaactg caatttattc 4080

atatcaggat tatcaatacc atatttttga aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac 4140

tcaccgaggc agttccatag gatggcaaga tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt 4200

ccaacatcaa tacaacctat taatttcccc tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa 4260

tcaccatgag tgacgactga atccggtgag aatggcaaaa gcttatgcat ttctttccag 4320

acttgttcaa caggccagcc attacgctcg tcatcaaaat cactcgcacc aaccaaaccg 4380

ttattcattc gtgattgcgc ctgagcgaga cgaaatacgc gatcgccgtt aaaaggacaa 4440

ttacaaacag gaatcgaatg caaccggcgc aggaacactg ccagcgcatc aacaatattt 4500

tcacctgaat caggatattc ttctaatacc tggaatgctg ttttccctgg gatcgcagtg 4560

gtgagtaacc atgcatcatc aggagtacgg ataaaatgct tgatggtcgg aagaggcata 4620

aattccgtca gccagtttag cctgaccatc tcatctgtaa catcattggc aacgctacct 4680

ttgccatgtt tcagaaacaa ctctggcgca tcgggcttcc catacaatcg atagattgtc 4740

gcacctgatt gcccgacatt atcgcgagcc catttatacc catataaatc agcatccatg 4800

ttggaattta atcgcggcct cgagcaagac gtttcccgtt gaatatggct cattttagct 4860

tccttagctc ctgaaaatct cgataactca aaaaatacgc ccggtagtga tcttatttca 4920

ttatggtgaa agttggaacc tcttacgtgc cgatcaagtc aaaagcctcc ggtcggaggc 4980

ttttgacttt ctgctatgga ggtcaggtat gatttaaatg gtcagtattg agcgatatct 5040

agagaattcg tc 5052


<210> 54
<211> 5052
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> plasmid pLybAL14r

<400> 54
agactacaat tggggcgttt tctgtgaggc tgactagcgc gtggcagctc aaaatctcta 60

cattctgcac attcagaccc atggtctgct gcgagggcag aacttggaac tggggcgaga 120

tgccgacacc ggcgggcaga ccaagtacgt cttagaactg gctcaagccc aagctaaatc 180

cccacaagtc caacaagtcg acatcatcac ccgccaaatc accgaccccc gcgtcagtgt 240

tggttacagt caggcgatcg aaccctttgc gcccaaaggt cggattgtcc gtttgccttt 300

tggccccaaa cgctacctcc gtaaagagct gctttggccc catctctaca cctttgcgga 360

tgcaattctc caatatctgg ctcagcaaaa gcgcaccccg acttggattc aggcccacta 420

tgctgatgct ggccaagtgg gatcactgct gagtcgctgg ttgaatgtac cgctaatttt 480

cacagggcat tctctggggc ggatcaagct aaaaaagctg ttggagcaag actggccgct 540

tgaggaaatt gaagcgcaat tcaatattca acagcgaatt gatgcggagg agatgacgct 600

cactcatgct gactggattg tcgccagcac tcagcaggaa gtggaggagc aataccgcgt 660

ttacgatcgc tacaacccag agcgcaagct tgtcattcca ccgggtgtcg ataccgatcg 720

cttcaggttt cagcccttgg gcgatcgcgg tgttgttctc caacaggaac tgagccgctt 780

tctgcgcgac ccagaaaaac ctcaaattct ctgcctctgt cgccccgcac ctcgcaaaaa 840

tgtaccggcg ctggtgcgag cctttggcga acatccttgg ctgcgcaaaa aagccaacct 900

tgtcttagta ctgggcagcc gccaagacat caaccagatg gatcgcggca gtcggcaggt 960

gttccaagag attttccatc tggtcgatcg ctacgacctc tacggcagcg tcgcctatcc 1020

caaacagcat caggctgatg atgtgccgga gttctatcgc ctagcggctc attccggcgg 1080

ggtattcgtc aatccggcgc tgaccgaacc ttttggtttg acaattttgg aggcaggaag 1140

ctgcggcgtg ccggtggtgg caacccatga tggcggcccc caggaaattc tcaaacactg 1200

tgatttcggc actttagttg atgtcagccg acccgctaat atcgcgactg cactcgccac 1260

cctgctgagc gatcgcgatc tttggcagtg ctatcaccgc aatggcattg aaaaagttcc 1320

cgcccattac agctgggatc aacatgtcaa taccctgttt gagcgcatgg aaacggtggc 1380

tttgcctcgt cgtcgtgctg tcagtttcgt acggagtcgc aaacgcttga ttgatgccaa 1440

acgccttgtc gttagtgaca tcgacaacac actgttgggc gatcgtcaag gactcgagaa 1500

tttaatgacc tatctcgatc agtatcgcga tcattttgcc tttggaattg ccacggggcg 1560

tcgcctagac tctgcccaag aagtcttgaa agagtggggc gttccttcgc caaacttctg 1620

ggtgacttcc gtcggcagcg agattcacta tggcaccgat gctgaaccgg atatcagctg 1680

ggaaaagcat atcaatcgca actggaatcc tcagcgaatt cgggcagtaa tggcacaact 1740

accctttctt gaactgcagc cggaagagga tcaaacaccc ttcaaagtca gcttctttgt 1800

ccgcgatcgc cacgagactg tgctgcgaga agtacggcaa catcttcgcc gccatcgcct 1860

gcggctgaag tcaatctatt cccatcagga gtttcttgac attctgccgc tagctgcctc 1920

gaaaggggat gcgattcgcc acctctcact ccgctggcgg attcctcttg agaacatttt 1980

ggtggcaggc gattctggta acgatgagga aatgctcaag ggccataatc tcggcgttgt 2040

agttggcaat tactcaccgg aattggagcc actgcgcagc tacgagcgcg tctattttgc 2100

tgagggccac tatgctaatg gcattctgga agccttaaaa cactatcgct tttttgaggc 2160

gatcgcttaa ccttttcaga acgtgagacg ttgatcggca cgtaagaggt tccaactttc 2220

accataatga aataagatca ctaccgggcg tattttttga gttatcgaga ttttcaggag 2280

ctaaggaagc taaaatggag aaaaaaatca ctggatatac caccgttgat atatcccaat 2340

ggcatcgtaa agaacatttt gaggcatttc agtcagttgc tcaatgtacc tataaccaga 2400

ccgttcagct ggatattacg gcctttttaa agaccgtaaa gaaaaataag cacaagtttt 2460

atccggcctt tattcacatt cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccggaa ttccgtatgg 2520

caatgaaaga cggtgagctg gtgatatggg atagtgttca cccttgttac accgttttcc 2580

atgagcaaac tgaaacgttt tcatcgctct ggagtgaata ccacgacgat ttccggcagt 2640

ttctacacat atattcgcaa gatgtggcgt gttacggtga aaacctggcc tatttcccta 2700

aagggtttat tgagaatatg tttttcgtct cagccaatcc ctgggtgagt ttcaccagtt 2760

ttgatttaaa cgtggccaat atggacaact tcttcgcccc cgttttcacc atgggcaaat 2820

attatacgca aggcgacaag gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat catgccgttt 2880

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agggcggggc gtaatttttt taaggcagtt attggtgccc ttaaacgcct ggttgctacg 3000

cctgaataag tgataataag cggatgaatg gcagaaattc gatgataagc tgtcaaacac 3060

gtgaattggt cgaacgaatt caagcttgat atcattcagg acgagcctca gactccagcg 3120

taactggact gcaatcaact cactggctca ccttcacggg tgggcctttc ttcggtagaa 3180

aatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 3240

aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 3300

gaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag 3360

ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 3420

ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 3480

tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 3540

ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 3600

acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 3660

gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 3720

cgccacctct gacttgagca tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 3780

aaaaacgcca gcaacgcaga aaggcccacc cgaaggtgag ccaggtgatt acatttgggc 3840

cctcatcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagctgcg gtaaagctca 3900

tcagcgtggt cgtgaagcga ttcacagatg tctgcctgtt catccgcgtc cagctcgttg 3960

agtttctcca gaagcgttaa tgtctggctt ctgataaagc gggccatgtt aagggcggtt 4020

ttttcctgtt tggtcattta gaaaaactca tcgagcatca agtgaaactg caatttattc 4080

atatcaggat tatcaatacc atatttttga aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac 4140

tcaccgaggc agttccatag gatggcaaga tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt 4200

ccaacatcaa tacaacctat taatttcccc tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa 4260

tcaccatgag tgacgactga atccggtgag aatggcaaaa gcttatgcat ttctttccag 4320

acttgttcaa caggccagcc attacgctcg tcatcaaaat cactcgcacc aaccaaaccg 4380

ttattcattc gtgattgcgc ctgagcgaga cgaaatacgc gatcgccgtt aaaaggacaa 4440

ttacaaacag gaatcgaatg caaccggcgc aggaacactg ccagcgcatc aacaatattt 4500

tcacctgaat caggatattc ttctaatacc tggaatgctg ttttccctgg gatcgcagtg 4560

gtgagtaacc atgcatcatc aggagtacgg ataaaatgct tgatggtcgg aagaggcata 4620

aattccgtca gccagtttag cctgaccatc tcatctgtaa catcattggc aacgctacct 4680

ttgccatgtt tcagaaacaa ctctggcgca tcgggcttcc catacaatcg atagattgtc 4740

gcacctgatt gcccgacatt atcgcgagcc catttatacc catataaatc agcatccatg 4800

ttggaattta atcgcggcct cgagcaagac gtttcccgtt gaatatggct cattttagct 4860

tccttagctc ctgaaaatct cgataactca aaaaatacgc ccggtagtga tcttatttca 4920

ttatggtgaa agttggaacc tcttacgtgc cgatcaagtc aaaagcctcc ggtcggaggc 4980

ttttgacttt ctgctatgga ggtcaggtat gatttaaatg gtcagtattg agcgatatct 5040

agagaattcg tc 5052


<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for detection of plasmid in cyanobacteria

<400> 55
ggtggttgtg tttgacagct tatc 24


<210> 56
<211> 651
<212> DNA
<213> Synechocystis PCC6803

<400> 56
atggcttctc aattacgtgt ttatgtgccg gagcatcctc taattaagca ttggttgggg 60

gtagctaggg atgaaaacac gccgccggtt ttgtttaaaa ctgccatggg ggaattggga 120

cgttggttga cctatgaggc cgctcgttat tggttgccga cggtggatac ggaagtgaaa 180

actcccctgg cgatcgccaa ggccagtctt attgaccccc aaacgccctt tgtcattgtg 240

cccattttgc gggcggggtt ggctctggtg gaaggggccc aggggttgtt gcccctggca 300

aaaatttacc atctgggttt agtgcgcaat gaaactaccc tggaacctag tctgtatctg 360

aacaagttgc cggagcggtt tgcccccggt acccatcttt tgttgctaga tcccatgttg 420

gctacgggta ataccatcat ggctgctttg gatttgctga tggcccggga cattgatgcc 480

aatttaatcc gtttggtctc cgtggtggcc gcccccactg ccctgcaaaa attaagtaat 540

gcccatccca atttgaccat ctacaccgcc atgattgacg aacaactcaa tgaccggggt 600

tacattgtgc ccggcctagg ggatgcaggc gatcgttgct ttggtacttg a 651


<210> 57
<211> 216
<212> PRT
<213> Synechocystis PCC6803

<400> 57

Met Ala Ser Gln Leu Arg Val Tyr Val Pro Glu His Pro Leu Ile Lys
1 5 10 15


His Trp Leu Gly Val Ala Arg Asp Glu Asn Thr Pro Pro Val Leu Phe
20 25 30


Lys Thr Ala Met Gly Glu Leu Gly Arg Trp Leu Thr Tyr Glu Ala Ala
35 40 45


Arg Tyr Trp Leu Pro Thr Val Asp Thr Glu Val Lys Thr Pro Leu Ala
50 55 60


Ile Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Pro Gln Thr Pro Phe Val Ile Val
65 70 75 80


Pro Ile Leu Arg Ala Gly Leu Ala Leu Val Glu Gly Ala Gln Gly Leu
85 90 95


Leu Pro Leu Ala Lys Ile Tyr His Leu Gly Leu Val Arg Asn Glu Thr
100 105 110


Thr Leu Glu Pro Ser Leu Tyr Leu Asn Lys Leu Pro Glu Arg Phe Ala
115 120 125


Pro Gly Thr His Leu Leu Leu Leu Asp Pro Met Leu Ala Thr Gly Asn
130 135 140


Thr Ile Met Ala Ala Leu Asp Leu Leu Met Ala Arg Asp Ile Asp Ala
145 150 155 160


Asn Leu Ile Arg Leu Val Ser Val Val Ala Ala Pro Thr Ala Leu Gln
165 170 175


Lys Leu Ser Asn Ala His Pro Asn Leu Thr Ile Tyr Thr Ala Met Ile
180 185 190


Asp Glu Gln Leu Asn Asp Arg Gly Tyr Ile Val Pro Gly Leu Gly Asp
195 200 205


Ala Gly Asp Arg Cys Phe Gly Thr
210 215


<210> 58
<211> 654
<212> DNA
<213> Synechococcus PCC7942

<400> 58
atggctcctc aactgcgtat cttcgtgccg ccccatccct taattcggca ctggctgggc 60

attgcccgcg atcgccagac gccgacgcct ctgtttcgca ccgcgatcgc agagctgggc 120

cgctggctcg cctatgaggc tgtgcgggaa tggctaccaa cgattccagc ggcggtgcaa 180

actcctcttg cagaaacccc agcggagttc gtcgattttt cgcaaccctt ggcgatcgtg 240

ccgattctgc gcgcaggtct gggtttagtg gagtctgtcc aacaggtttt gccgactgcc 300

cgcatttttc acgtgggtct caagcgggat gaagtcagtc ttgaaccgcg ctgctacctc 360

aatcacctgc cagagcaact tgaagtgaac agtcgcgttc tggttctcga cccgatgctg 420

gcgacaggtg gctcgctgct ctataccctt gatttgctgc gcgatcgcgg tgtctctgct 480

gagcaagtgc gggtgctttc aattgtggct gccccgccag cgctacaaaa actcagtcaa 540

gcctacccgg cgttgacgat ttacagcgcc atcattgatg agcagctgaa cgacaaaggc 600

tttatcgtgc cggggctggg ggatgctggc gatcgcctgt ttggtactcc ttga 654


<210> 59
<211> 217
<212> PRT
<213> Synechococcus PCC7942

<400> 59

Met Ala Pro Gln Leu Arg Ile Phe Val Pro Pro His Pro Leu Ile Arg
1 5 10 15


His Trp Leu Gly Ile Ala Arg Asp Arg Gln Thr Pro Thr Pro Leu Phe
20 25 30


Arg Thr Ala Ile Ala Glu Leu Gly Arg Trp Leu Ala Tyr Glu Ala Val
35 40 45


Arg Glu Trp Leu Pro Thr Ile Pro Ala Ala Val Gln Thr Pro Leu Ala
50 55 60


Glu Thr Pro Ala Glu Phe Val Asp Phe Ser Gln Pro Leu Ala Ile Val
65 70 75 80


Pro Ile Leu Arg Ala Gly Leu Gly Leu Val Glu Ser Val Gln Gln Val
85 90 95


Leu Pro Thr Ala Arg Ile Phe His Val Gly Leu Lys Arg Asp Glu Val
100 105 110


Ser Leu Glu Pro Arg Cys Tyr Leu Asn His Leu Pro Glu Gln Leu Glu
115 120 125


Val Asn Ser Arg Val Leu Val Leu Asp Pro Met Leu Ala Thr Gly Gly
130 135 140


Ser Leu Leu Tyr Thr Leu Asp Leu Leu Arg Asp Arg Gly Val Ser Ala
145 150 155 160


Glu Gln Val Arg Val Leu Ser Ile Val Ala Ala Pro Pro Ala Leu Gln
165 170 175


Lys Leu Ser Gln Ala Tyr Pro Ala Leu Thr Ile Tyr Ser Ala Ile Ile
180 185 190


Asp Glu Gln Leu Asn Asp Lys Gly Phe Ile Val Pro Gly Leu Gly Asp
195 200 205


Ala Gly Asp Arg Leu Phe Gly Thr Pro
210 215


<210> 60
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplifying upp gene from Bacillus subtilis 168

<400> 60
aagaagcaag acagcgtgta gctgctctga ctg 33


<210> 61
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplifying upp gene from Bacillus subtilis 168

<400> 61
tcccgggatt tggtacctta ttttgttcca aacatgcggt cacccgcatc 50


<210> 62
<211> 849
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis

<400> 62
aagaagcaag acagcgtgta gctgctctga ctgataaatt tcctttatat aaagaattag 60

attattaaga tcctaaaacc cgcttgggct tatgcccggc gggttttttg acgatgttct 120

tgaaactcaa tgtctttttt tgtagaatca atagaagtgt gtaattgttg atgggacaat 180

aaaaaaggag ctgaaacaca gtatgggaaa ggtttatgta tttgatcatc ctttaattca 240

gcacaagctg acatatatac ggaatgaaaa tacaggtacg aaggatttta gagagttagt 300

agatgaagtg gctacactca tggcatttga aattacccgc gatcttcctc tggaagaagt 360

ggatatcaat acaccggttc aggctgcgaa atcgaaagtc atctcaggga aaaaactcgg 420

agtggttcct atcctcagag caggattggg aatggttgac ggcattttaa agctgattcc 480

tgcggcaaaa gtgggacatg tcggccttta ccgtgatcca gaaaccttaa aacccgtgga 540

atactatgtc aagcttcctt ctgatgtgga agagcgtgaa ttcatcgtgg ttgacccgat 600

gctcgctaca ggcggttccg cagttgaagc cattcacagc cttaaaaaac gcggtgcgaa 660

aaatatccgt ttcatgtgtc ttgtagcagc gccggagggt gtggaagaat tgcagaagca 720

tcattcggac gttgatattt acattgcggc gctagatgaa aaattaaatg aaaaaggata 780

tattgttcca ggtctcggag atgcgggtga ccgcatgttt ggaacaaaat aaggtaccaa 840

atcccggga 849


<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for sequence verification of pLybAL7f

<400> 63
gtaatacgac tcactatagg gc 22


<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for sequence verification of pLybAL7f

<400> 64
cacacaggaa acagctatga ccat 24


<210> 65
<211> 8988
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> plasmid pLybAL7f

<400> 65
gcggccgcaa ggggttcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 60

cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 120

gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt cagctgcgca actgttggga 180

agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc 240

aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc 300

cagtgaattg taatacgact cactataggg cgaattcgag ctcggtaccc ggggatccca 360

ctcccgggat ttggtacctt attttgttcc aaacatgcgg tcacccgcat ctccgagacc 420

tggaacaata tatccttttt catttaattt ttcatctagc gccgcaatgt aaatatcaac 480

gtccgaatga tgcttctgca attcttccac accctccggc gctgctacaa gacacatgaa 540

acggatattt ttcgcaccgc gttttttaag gctgtgaatg gcttcaactg cggaaccgcc 600

tgtagcgagc atcgggtcaa ccacgatgaa ttcacgctct tccacatcag aaggaagctt 660

gacatagtat tccacgggtt ttaaggtttc tggatcacgg taaaggccga catgtcccac 720

ttttgccgca ggaatcagct ttaaaatgcc gtcaaccatt cccaatcctg ctctgaggat 780

aggaaccact ccgagttttt tccctgagat gactttcgat ttcgcagcct gaaccggtgt 840

attgatatcc acttcttcca gaggaagatc gcgggtaatt tcaaatgcca tgagtgtagc 900

cacttcatct actaactctc taaaatcctt cgtacctgta ttttcattcc gtatatatgt 960

cagcttgtgc tgaattaaag gatgatcaaa tacataaacc tttcccatac tgtgtttcag 1020

ctcctttttt attgtcccat caacaattac acacttctat tgattctaca aaaaaagaca 1080

ttgagtttca agaacatcgt caaaaaaccc gccgggcata agcccaagcg ggttttagga 1140

tcttaataat ctaattcttt atataaagga aatttatcag tcagagcagc tacacgctgt 1200

cttgcttctt gtgggatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg agtattctat 1260

agtctcacct aaatagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 1320

atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg 1380

cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 1440

gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgaacccctt gcggccgccc 1500

gggccgtcga ccaattctca tgtttgacag cttatcatcg aatttctgcc attcatccgc 1560

ttattatcac ttattcaggc gtagcaacca ggcgtttaag ggcaccaata actgccttaa 1620

aaaaattacg ccccgccctg ccactcatcg cagtactgtt gtaattcatt aagcattctg 1680

ccgacatgga agccatcaca aacggcatga tgaacctgaa tcgccagcgg catcagcacc 1740

ttgtcgcctt gcgtataata tttgcccatg gtgaaaacgg gggcgaagaa gttgtccata 1800

ttggccacgt ttaaatcaaa actggtgaaa ctcacccagg gattggctga gacgaaaaac 1860

atattctcaa taaacccttt agggaaatag gccaggtttt caccgtaaca cgccacatct 1920

tgcgaatata tgtgtagaaa ctgccggaaa tcgtcgtggt attcactcca gagcgatgaa 1980

aacgtttcag tttgctcatg gaaaacggtg taacaagggt gaacactatc ccatatcacc 2040

agctcaccgt ctttcattgc catacgaaat tccggatgag cattcatcag gcgggcaaga 2100

atgtgaataa aggccggata aaacttgtgc ttatttttct ttacggtctt taaaaaggcc 2160

gtaatatcca gctgaacggt ctggttatag gtacattgag caactgactg aaatgcctca 2220

aaatgttctt tacgatgcca ttgggatata tcaacggtgg tatatccagt gatttttttc 2280

tccattttag cttccttagc tcctgaaaat ctcgataact caaaaaatac gcccggtagt 2340

gatcttattt cattatggtg aaagttggaa cctcttacgt gccgatcaac gtctcatttt 2400

cgccaaaagt tggcccaggg cttcccggta tcaacaggga caccaggatt tatttattct 2460

gcgaagtgat cttccgtcac aggtatttat tcgcgataag ctcatggagc ggcgtaaccg 2520

tcgcacagga aggacagaga aagcgcggat ctgggaagtg acggacagaa cggtcaggac 2580

ctggattggg gaggcggttg ccgccgctgc tgctgacggt gtgacgttct ctgttccggt 2640

cacaccacat acgttccgcc attcctatgc gatgcacatg ctgtatgccg gtataccgct 2700

gaaagttctg caaagcctga tgggacataa gtccatcagt tcaacggaag tctacacgaa 2760

ggtttttgcg ctggatgtgg ctgcccggca ccgggtgcag tttgcgatgc cggagtctga 2820

tgcggttgcg atgctgaaac aattatcctg agaataaatg ccttggcctt tatatggaaa 2880

tgtggaactg agtggatatg ctgtttttgt ctgttaaaca gagaagctgg ctgttatcca 2940

ctgagaagcg aacgaaacag tcgggaaaat ctcccattat cgtagagatc cgcattatta 3000

atctcaggag cctgtgtagc gtttatagga agtagtgttc tgtcatgatg cctgcaagcg 3060

gtaacgaaaa cgatttgaat atgccttcag gaacaataga aatcttcgtg cggtgttacg 3120

ttgaagtgga gcggattatg tcagcaatgg acagaacaac ctaatgaaca cagaaccatg 3180

atgtggtctg tccttttaca gccagtagtg ctcgccgcag tcgagcgaca gggcgaagcc 3240

ctcggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag 3300

aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccggcc gccggcgttg tggatacctc 3360

gcggaaaact tggccctcac tgacagatga ggggcggacg ttgacacttg aggggccgac 3420

tcacccggcg cggcgttgac agatgagggg caggctcgat ttcggccggc gacgtggagc 3480

tggccagcct cgcaaatcgg cgaaaacgcc tgattttacg cgagtttccc acagatgatg 3540

tggacaagcc tggggataag tgccctgcgg tattgacact tgaggggcgc gactactgac 3600

agatgagggg cgcgatcctt gacacttgag gggcagagtg ctgacagatg aggggcgcac 3660

ctattgacat ttgaggggct gtccacaggc agaaaatcca gcatttgcaa gggtttccgc 3720

ccgtttttcg gccaccgcta acctgtcttt taacctgctt ttaaaccaat atttataaac 3780

cttgttttta accagggctg cgccctgtgc gcgtgaccgc gcacgccgaa ggggggtgcc 3840

cccccttctc gaaccctccc ggtcgagtga gcgaggaagc accagggaac agcacttata 3900

tattctgctt acacacgatg cctgaaaaaa cttcccttgg ggttatccac ttatccacgg 3960

ggatattttt ataattattt tttttatagt ttttagatct tcttttttag agcgccttgt 4020

aggcctttat ccatgctggt tctagagaag gtgttgtgac aaattgccct ttcagtgtga 4080

caaatcaccc tcaaatgaca gtcctgtctg tgacaaattg cccttaaccc tgtgacaaat 4140

tgccctcaga agaagctgtt ttttcacaaa gttatccctg cttattgact cttttttatt 4200

tagtgtgaca atctaaaaac ttgtcacact tcacatggat ctgtcatggc ggaaacagcg 4260

gttatcaatc acaagaaacg taaaaatagc ccgcgaatcg tccagtcaaa cgacctcact 4320

gaggcggcat atagtctctc ccgggatcaa aaacgtatgc tgtatctgtt cgttgaccag 4380

atcagaaaat ctgatggcac cctacaggaa catgacggta tctgcgagat ccatgttgct 4440

aaatatgctg aaatattcgg attgacctct gcggaagcca gtaaggatat acggcaggca 4500

ttgaagagtt tcgcggggaa ggaagtggtt ttttatcgcc ctgaagagga tgccggcgat 4560

gaaaaaggct atgaatcttt tccttggttt atcaaacgtg cgcacagtcc atccagaggg 4620

ctttacagtg tacatatcaa cccatatctc attcccttct ttatcgggtt acagaaccgg 4680

tttacgcagt ttcggcttag tgaaacaaaa gaaatcacca atccgtatgc catgcgttta 4740

tacgaatccc tgtgtcagta tcgtaagccg gatggctcag gcatcgtctc tctgaaaatc 4800

gactggatca tagagcgtta ccagctgcct caaagttacc agcgtatgcc tgacttccgc 4860

cgccgcttcc tgcaggtctg tgttaatgag atcaacagca gaactccaat gcgcctctca 4920

tacattgaga aaaagaaagg ccgccagacg actcatatcg tattttcctt ccgcgatatc 4980

acttccatga cgacaggata gtctgagggt tatctgtcac agatttgagg gtggttcgtc 5040

acatttgttc tgacctactg agggtaattt gtcacagttt tgctgtttcc ttcagcctgc 5100

atggattttc tcatactttt tgaactgtaa tttttaagga agccaaattt gagggcagtt 5160

tgtcacagtt gatttccttc tctttccctt cgtcatgtga cctgatatcg ggggttagtt 5220

cgtcatcatt gatgagggtt gattatcaca gtttattact ctgaattggc tatccgcgtg 5280

tgtacctcta cctggagttt ttcccacggt ggatatttct tcttgcgctg agcgtaagag 5340

ctatctgaca gaacagttct tctttgcttc ctcgccagtt cgctcgctat gctcggttac 5400

acggctgcgg cgagcgctag tgataataag tgactgaggt atgtgctctt cttatctcct 5460

tttgtagtgt tgctcttatt ttaaacaact ttgcggtttt ttgatgactt tgcgattttg 5520

ttgttgcttt gcagtaaatt gcaagattta ataaaaaaac gcaaagcaat gattaaagga 5580

tgttcagaat gaaactcatg gaaacactta accagtgcat aaacgctggt catgaaatga 5640

cgaaggctat cgccattgca cagtttaatg atgacagccc ggaagcgagg aaaataaccc 5700

ggcgctggag aataggtgaa gcagcggatt tagttggggt ttcttctcag gctatcagag 5760

atgccgagaa agcagggcga ctaccgcacc cggatatgga aattcgagga cgggttgagc 5820

aacgtgttgg ttatacaatt gaacaaatta atcatatgcg tgatgtgttt ggtacgcgat 5880

tgcgacgtgc tgaagacgta tttccaccgg tgatcggggt tgctgcccat aaaggtggcg 5940

tttacaaaac ctcagtttct gttcatcttg ctcaggatct ggctctgaag gggctacgtg 6000

ttttgctcgt ggaaggtaac gacccccagg gaacagcctc aatgtatcac ggatgggtac 6060

cagatcttca tattcatgca gaagacactc tcctgccttt ctatcttggg gaaaaggacg 6120

atgtcactta tgcaataaag cccacttgct ggccggggct tgacattatt ccttcctgtc 6180

tggctctgca ccgtattgaa actgagttaa tgggcaaatt tgatgaaggt aaactgccca 6240

ccgatccaca cctgatgctc cgactggcca ttgaaactgt tgctcatgac tatgatgtca 6300

tagttattga cagcgcgcct aacctgggta tcggcacgat taatgtcgta tgtgctgctg 6360

atgtgctgat tgttcccacg cctgctgagt tgtttgacta cacctccgca ctgcagtttt 6420

tcgatatgct tcgtgatctg ctcaagaacg ttgatcttaa agggttcgag cctgatgtac 6480

gtattttgct taccaaatac agcaatagta atggctctca gtccccgtgg atggaggagc 6540

aaattcggga tgcctgggga agcatggttc taaaaaatgt tgtacgtgaa acggatgaag 6600

ttggtaaagg tcagatccgg atgagaactg tttttgaaca ggccattgat caacgctctt 6660

caactggtgc ctggagaaat gctctttcta tttgggaacc tgtctgcaat gaaattttcg 6720

atcgtctgat taaaccacgc tgggagatta gataatgaag cgtgcgcctg ttattccaaa 6780

acatacgctc aatactcaac cggttgaaga tacttcgtta tcgacaccag ctgccccgat 6840

ggtggattcg ttaattgcgc gcgtaggagt aatggctcgc ggtaatgcca ttactttgcc 6900

tgtatgtggt cgggatgtga agtttactct tgaagtgctc cggggtgata gtgttgagaa 6960

gacctctcgg gtatggtcag gtaatgaacg tgaccaggag ctgcttactg aggacgcact 7020

ggatgatctc atcccttctt ttctactgac tggtcaacag acaccggcgt tcggtcgaag 7080

agtatctggt gtcatagaaa ttgccgatgg gagtcgccgt cgtaaagctg ctgcacttac 7140

cgaaagtgat tatcgtgttc tggttggcga gctggatgat gagcagatgg ctgcattatc 7200

cagattgggt aacgattatc gcccaacaag tgcttatgaa cgtggtcagc gttatgcaag 7260

ccgattgcag aatgaatttg ctggaaatat ttctgcgctg gctgatgcgg aaaatatttc 7320

acgtaagatt attacccgct gtatcaacac cgccaaattg cctaaatcag ttgttgctct 7380

tttttctcac cccggtgaac tatctgcccg gtcaggtgat gcacttcaaa aagcctttac 7440

agataaagag gaattactta agcagcaggc atctaacctt catgagcaga aaaaagctgg 7500

ggtgatattt gaagctgaag aagttatcac tcttttaact tctgtgctta aaacgtcatc 7560

tgcatcaaga actagtttaa gctcacgaca tcagtttgct cctggagcga cagtattgta 7620

taagggcgat aaaatggtgc ttaacctgga caggtctcgt gttccaactg agtgtataga 7680

gaaaattgag gccattctta aggaacttga aaagccagca ccctgatgcg accacgtttt 7740

agtctacgtt tatctgtctt tacttaatgt cctttgttac aggccagaaa gcataactgg 7800

cctgaatatt ctctctgggc ccactgttcc acttgtatcg tcggtctgat aatcagactg 7860

ggaccacggt cccactcgta tcgtcggtct gattattagt ctgggaccac ggtcccactc 7920

gtatcgtcgg tctgattatt agtctgggac cacggtccca ctcgtatcgt cggtctgata 7980

atcagactgg gaccacggtc ccactcgtat cgtcggtctg attattagtc tgggaccatg 8040

gtcccactcg tatcgtcggt ctgattatta gtctgggacc acggtcccac tcgtatcgtc 8100

ggtctgatta ttagtctgga accacggtcc cactcgtatc gtcggtctga ttattagtct 8160

gggaccacgg tcccactcgt atcgtcggtc tgattattag tctgggacca cgatcccact 8220

cgtgttgtcg gtctgattat cggtctggga ccacggtccc acttgtattg tcgatcagac 8280

tatcagcgtg agactacgat tccatcaatg cctgtcaagg gcaagtattg acatgtcgtc 8340

gtaacctgta gaacggagta acctcggtgt gcggttgtat gcctgctgtg gattgctgct 8400

gtgtcctgct tatccacaac attttgcgca cggttatgtg gacaaaatac ctggttaccc 8460

aggccgtgcc ggcacgttaa ccgggctgca tccgatgcaa gtgtgtcgct gtcgacgagc 8520

tcgcgagctc ggacatgagg ttgccccgta ttcagtgtcg ctgatttgta ttgtctgaag 8580

ttgtttttac gttaagttga tgcagatcaa ttaatacgat acctgcgtca taattgatta 8640

tttgacgtgg tttgatggcc tccacgcacg ttgtgatatg tagatgataa tcattatcac 8700

tttacgggtc ctttccggtg atccgacagg ttacggggcg gcgacctcgc gggttttcgc 8760

tatttatgaa aattttccgg tttaaggcgt ttccgttctt cttcgtcata acttaatgtt 8820

tttatttaaa ataccctctg aaaagaaagg aaacgacagg tgctgaaagc gagctttttg 8880

gcctctgtcg tttcctttct ctgtttttgt ccgtggaatg aacaatggaa gtccgagctc 8940

atcgctaata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta tattcgat 8988


<210> 66
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplifying kanamycin resistance marker vector pLybAA1

<400> 66
gtcagtgcac tgctctgcca gtgttacaac c 31


<210> 67
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer for amplifying kanamycin resistance marker vector pLybAA1

<400> 67
ctcagtggcg ccaaaactca cgttaaggga ttttggtc 38


<210> 68
<211> 950
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> kanamycin resistance marker from vector pLybAA1, originally
derived from pACYC177

<400> 68
gtcagtgcac tgctctgcca gtgttacaac caattaacca attctgatta gaaaaactca 60

tcgagcatca aatgaaactg caatttattc atatcaggat tatcaatacc atatttttga 120

aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac tcaccgaggc agttccatag gatggcaaga 180

tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt ccaacatcaa tacaacctat taatttcccc 240

tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa tcaccatgag tgacgactga atccggtgag 300

aatggcaaaa gcttatgcat ttctttccag acttgttcaa caggccagcc attacgctcg 360

tcatcaaaat cactcgcatc aaccaaaccg ttattcattc gtgattgcgc ctgagcgaga 420

cgaaatacgc gatcgctgtt aaaaggacaa ttacaaacag gaatcgaatg caaccggcgc 480

aggaacactg ccagcgcatc aacaatattt tcacctgaat caggatattc ttctaatacc 540

tggaatgctg ttttcccggg gatcgcagtg gtgagtaacc atgcatcatc aggagtacgg 600

ataaaatgct tgatggtcgg aagaggcata aattccgtca gccagtttag tctgaccatc 660

tcatctgtaa catcattggc aacgctacct ttgccatgtt tcagaaacaa ctctggcgca 720

tcgggcttcc catacaatcg atagattgtc gcacctgatt gcccgacatt atcgcgagcc 780

catttatacc catataaatc agcatccatg ttggaattta atcgcggcct cgagcaagac 840

gtttcccgtt gaatatggct cataacaccc cttgtattac tgtttatgta agcagacagt 900

tttattgttc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttgg cgccactgag 950


<210> 69
<211> 9864
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> plasmid pLybAL8f (kanamycin resistance marker plus pLybAL7f)

<400> 69
gcggccgcaa ggggttcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 60

cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc actgctctgc cagtgttaca accaattaac 120

caattctgat tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg 180

attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag 240

gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc 300

aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg 360

agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagcttatgc atttctttcc agacttgttc 420

aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat 480

tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac 540

aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga 600

atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag tggtgagtaa 660

ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt 720

cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg 780

tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg tcgcacctga 840

ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt 900

taatcgcggc ctcgagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt 960

actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 1020

ggcgccattc gccattcagc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc 1080

gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc 1140

agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact 1200

atagggcgaa ttcgagctcg gtacccgggg atcccactcc cgggatttgg taccttattt 1260

tgttccaaac atgcggtcac ccgcatctcc gagacctgga acaatatatc ctttttcatt 1320

taatttttca tctagcgccg caatgtaaat atcaacgtcc gaatgatgct tctgcaattc 1380

ttccacaccc tccggcgctg ctacaagaca catgaaacgg atatttttcg caccgcgttt 1440

tttaaggctg tgaatggctt caactgcgga accgcctgta gcgagcatcg ggtcaaccac 1500

gatgaattca cgctcttcca catcagaagg aagcttgaca tagtattcca cgggttttaa 1560

ggtttctgga tcacggtaaa ggccgacatg tcccactttt gccgcaggaa tcagctttaa 1620

aatgccgtca accattccca atcctgctct gaggatagga accactccga gttttttccc 1680

tgagatgact ttcgatttcg cagcctgaac cggtgtattg atatccactt cttccagagg 1740

aagatcgcgg gtaatttcaa atgccatgag tgtagccact tcatctacta actctctaaa 1800

atccttcgta cctgtatttt cattccgtat atatgtcagc ttgtgctgaa ttaaaggatg 1860

atcaaataca taaacctttc ccatactgtg tttcagctcc ttttttattg tcccatcaac 1920

aattacacac ttctattgat tctacaaaaa aagacattga gtttcaagaa catcgtcaaa 1980

aaacccgccg ggcataagcc caagcgggtt ttaggatctt aataatctaa ttctttatat 2040

aaaggaaatt tatcagtcag agcagctaca cgctgtcttg cttcttgtgg gatcctctag 2100

agtcgacctg caggcatgca agcttgagta ttctatagtc tcacctaaat agcttggcgt 2160

aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 2220

tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 2280

taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 2340

aatgaatcgg ccaacgcgaa ccccttgcgg ccgcccgggc cgtcgaccaa ttctcatgtt 2400

tgacagctta tcatcgaatt tctgccattc atccgcttat tatcacttat tcaggcgtag 2460

caaccaggcg tttaagggca ccaataactg ccttaaaaaa attacgcccc gccctgccac 2520

tcatcgcagt actgttgtaa ttcattaagc attctgccga catggaagcc atcacaaacg 2580

gcatgatgaa cctgaatcgc cagcggcatc agcaccttgt cgccttgcgt ataatatttg 2640

cccatggtga aaacgggggc gaagaagttg tccatattgg ccacgtttaa atcaaaactg 2700

gtgaaactca cccagggatt ggctgagacg aaaaacatat tctcaataaa ccctttaggg 2760

aaataggcca ggttttcacc gtaacacgcc acatcttgcg aatatatgtg tagaaactgc 2820

cggaaatcgt cgtggtattc actccagagc gatgaaaacg tttcagtttg ctcatggaaa 2880

acggtgtaac aagggtgaac actatcccat atcaccagct caccgtcttt cattgccata 2940

cgaaattccg gatgagcatt catcaggcgg gcaagaatgt gaataaaggc cggataaaac 3000

ttgtgcttat ttttctttac ggtctttaaa aaggccgtaa tatccagctg aacggtctgg 3060

ttataggtac attgagcaac tgactgaaat gcctcaaaat gttctttacg atgccattgg 3120

gatatatcaa cggtggtata tccagtgatt tttttctcca ttttagcttc cttagctcct 3180

gaaaatctcg ataactcaaa aaatacgccc ggtagtgatc ttatttcatt atggtgaaag 3240

ttggaacctc ttacgtgccg atcaacgtct cattttcgcc aaaagttggc ccagggcttc 3300

ccggtatcaa cagggacacc aggatttatt tattctgcga agtgatcttc cgtcacaggt 3360

atttattcgc gataagctca tggagcggcg taaccgtcgc acaggaagga cagagaaagc 3420

gcggatctgg gaagtgacgg acagaacggt caggacctgg attggggagg cggttgccgc 3480

cgctgctgct gacggtgtga cgttctctgt tccggtcaca ccacatacgt tccgccattc 3540

ctatgcgatg cacatgctgt atgccggtat accgctgaaa gttctgcaaa gcctgatggg 3600

acataagtcc atcagttcaa cggaagtcta cacgaaggtt tttgcgctgg atgtggctgc 3660

ccggcaccgg gtgcagtttg cgatgccgga gtctgatgcg gttgcgatgc tgaaacaatt 3720

atcctgagaa taaatgcctt ggcctttata tggaaatgtg gaactgagtg gatatgctgt 3780

ttttgtctgt taaacagaga agctggctgt tatccactga gaagcgaacg aaacagtcgg 3840

gaaaatctcc cattatcgta gagatccgca ttattaatct caggagcctg tgtagcgttt 3900

ataggaagta gtgttctgtc atgatgcctg caagcggtaa cgaaaacgat ttgaatatgc 3960

cttcaggaac aatagaaatc ttcgtgcggt gttacgttga agtggagcgg attatgtcag 4020

caatggacag aacaacctaa tgaacacaga accatgatgt ggtctgtcct tttacagcca 4080

gtagtgctcg ccgcagtcga gcgacagggc gaagccctcg gctggttgcc ctcgccgctg 4140

ggctggcggc cgtctatggc cctgcaaacg cgccagaaac gccgtcgaag ccgtgtgcga 4200

gacaccgcgg ccggccgccg gcgttgtgga tacctcgcgg aaaacttggc cctcactgac 4260

agatgagggg cggacgttga cacttgaggg gccgactcac ccggcgcggc gttgacagat 4320

gaggggcagg ctcgatttcg gccggcgacg tggagctggc cagcctcgca aatcggcgaa 4380

aacgcctgat tttacgcgag tttcccacag atgatgtgga caagcctggg gataagtgcc 4440

ctgcggtatt gacacttgag gggcgcgact actgacagat gaggggcgcg atccttgaca 4500

cttgaggggc agagtgctga cagatgaggg gcgcacctat tgacatttga ggggctgtcc 4560

acaggcagaa aatccagcat ttgcaagggt ttccgcccgt ttttcggcca ccgctaacct 4620

gtcttttaac ctgcttttaa accaatattt ataaaccttg tttttaacca gggctgcgcc 4680

ctgtgcgcgt gaccgcgcac gccgaagggg ggtgcccccc cttctcgaac cctcccggtc 4740

gagtgagcga ggaagcacca gggaacagca cttatatatt ctgcttacac acgatgcctg 4800

aaaaaacttc ccttggggtt atccacttat ccacggggat atttttataa ttattttttt 4860

tatagttttt agatcttctt ttttagagcg ccttgtaggc ctttatccat gctggttcta 4920

gagaaggtgt tgtgacaaat tgccctttca gtgtgacaaa tcaccctcaa atgacagtcc 4980

tgtctgtgac aaattgccct taaccctgtg acaaattgcc ctcagaagaa gctgtttttt 5040

cacaaagtta tccctgctta ttgactcttt tttatttagt gtgacaatct aaaaacttgt 5100

cacacttcac atggatctgt catggcggaa acagcggtta tcaatcacaa gaaacgtaaa 5160

aatagcccgc gaatcgtcca gtcaaacgac ctcactgagg cggcatatag tctctcccgg 5220

gatcaaaaac gtatgctgta tctgttcgtt gaccagatca gaaaatctga tggcacccta 5280

caggaacatg acggtatctg cgagatccat gttgctaaat atgctgaaat attcggattg 5340

acctctgcgg aagccagtaa ggatatacgg caggcattga agagtttcgc ggggaaggaa 5400

gtggtttttt atcgccctga agaggatgcc ggcgatgaaa aaggctatga atcttttcct 5460

tggtttatca aacgtgcgca cagtccatcc agagggcttt acagtgtaca tatcaaccca 5520

tatctcattc ccttctttat cgggttacag aaccggttta cgcagtttcg gcttagtgaa 5580

acaaaagaaa tcaccaatcc gtatgccatg cgtttatacg aatccctgtg tcagtatcgt 5640

aagccggatg gctcaggcat cgtctctctg aaaatcgact ggatcataga gcgttaccag 5700

ctgcctcaaa gttaccagcg tatgcctgac ttccgccgcc gcttcctgca ggtctgtgtt 5760

aatgagatca acagcagaac tccaatgcgc ctctcataca ttgagaaaaa gaaaggccgc 5820

cagacgactc atatcgtatt ttccttccgc gatatcactt ccatgacgac aggatagtct 5880

gagggttatc tgtcacagat ttgagggtgg ttcgtcacat ttgttctgac ctactgaggg 5940

taatttgtca cagttttgct gtttccttca gcctgcatgg attttctcat actttttgaa 6000

ctgtaatttt taaggaagcc aaatttgagg gcagtttgtc acagttgatt tccttctctt 6060

tcccttcgtc atgtgacctg atatcggggg ttagttcgtc atcattgatg agggttgatt 6120

atcacagttt attactctga attggctatc cgcgtgtgta cctctacctg gagtttttcc 6180

cacggtggat atttcttctt gcgctgagcg taagagctat ctgacagaac agttcttctt 6240

tgcttcctcg ccagttcgct cgctatgctc ggttacacgg ctgcggcgag cgctagtgat 6300

aataagtgac tgaggtatgt gctcttctta tctccttttg tagtgttgct cttattttaa 6360

acaactttgc ggttttttga tgactttgcg attttgttgt tgctttgcag taaattgcaa 6420

gatttaataa aaaaacgcaa agcaatgatt aaaggatgtt cagaatgaaa ctcatggaaa 6480

cacttaacca gtgcataaac gctggtcatg aaatgacgaa ggctatcgcc attgcacagt 6540

ttaatgatga cagcccggaa gcgaggaaaa taacccggcg ctggagaata ggtgaagcag 6600

cggatttagt tggggtttct tctcaggcta tcagagatgc cgagaaagca gggcgactac 6660

cgcacccgga tatggaaatt cgaggacggg ttgagcaacg tgttggttat acaattgaac 6720

aaattaatca tatgcgtgat gtgtttggta cgcgattgcg acgtgctgaa gacgtatttc 6780

caccggtgat cggggttgct gcccataaag gtggcgttta caaaacctca gtttctgttc 6840

atcttgctca ggatctggct ctgaaggggc tacgtgtttt gctcgtggaa ggtaacgacc 6900

cccagggaac agcctcaatg tatcacggat gggtaccaga tcttcatatt catgcagaag 6960

acactctcct gcctttctat cttggggaaa aggacgatgt cacttatgca ataaagccca 7020

cttgctggcc ggggcttgac attattcctt cctgtctggc tctgcaccgt attgaaactg 7080

agttaatggg caaatttgat gaaggtaaac tgcccaccga tccacacctg atgctccgac 7140

tggccattga aactgttgct catgactatg atgtcatagt tattgacagc gcgcctaacc 7200

tgggtatcgg cacgattaat gtcgtatgtg ctgctgatgt gctgattgtt cccacgcctg 7260

ctgagttgtt tgactacacc tccgcactgc agtttttcga tatgcttcgt gatctgctca 7320

agaacgttga tcttaaaggg ttcgagcctg atgtacgtat tttgcttacc aaatacagca 7380

atagtaatgg ctctcagtcc ccgtggatgg aggagcaaat tcgggatgcc tggggaagca 7440

tggttctaaa aaatgttgta cgtgaaacgg atgaagttgg taaaggtcag atccggatga 7500

gaactgtttt tgaacaggcc attgatcaac gctcttcaac tggtgcctgg agaaatgctc 7560

tttctatttg ggaacctgtc tgcaatgaaa ttttcgatcg tctgattaaa ccacgctggg 7620

agattagata atgaagcgtg cgcctgttat tccaaaacat acgctcaata ctcaaccggt 7680

tgaagatact tcgttatcga caccagctgc cccgatggtg gattcgttaa ttgcgcgcgt 7740

aggagtaatg gctcgcggta atgccattac tttgcctgta tgtggtcggg atgtgaagtt 7800

tactcttgaa gtgctccggg gtgatagtgt tgagaagacc tctcgggtat ggtcaggtaa 7860

tgaacgtgac caggagctgc ttactgagga cgcactggat gatctcatcc cttcttttct 7920

actgactggt caacagacac cggcgttcgg tcgaagagta tctggtgtca tagaaattgc 7980

cgatgggagt cgccgtcgta aagctgctgc acttaccgaa agtgattatc gtgttctggt 8040

tggcgagctg gatgatgagc agatggctgc attatccaga ttgggtaacg attatcgccc 8100

aacaagtgct tatgaacgtg gtcagcgtta tgcaagccga ttgcagaatg aatttgctgg 8160

aaatatttct gcgctggctg atgcggaaaa tatttcacgt aagattatta cccgctgtat 8220

caacaccgcc aaattgccta aatcagttgt tgctcttttt tctcaccccg gtgaactatc 8280

tgcccggtca ggtgatgcac ttcaaaaagc ctttacagat aaagaggaat tacttaagca 8340

gcaggcatct aaccttcatg agcagaaaaa agctggggtg atatttgaag ctgaagaagt 8400

tatcactctt ttaacttctg tgcttaaaac gtcatctgca tcaagaacta gtttaagctc 8460

acgacatcag tttgctcctg gagcgacagt attgtataag ggcgataaaa tggtgcttaa 8520

cctggacagg tctcgtgttc caactgagtg tatagagaaa attgaggcca ttcttaagga 8580

acttgaaaag ccagcaccct gatgcgacca cgttttagtc tacgtttatc tgtctttact 8640

taatgtcctt tgttacaggc cagaaagcat aactggcctg aatattctct ctgggcccac 8700

tgttccactt gtatcgtcgg tctgataatc agactgggac cacggtccca ctcgtatcgt 8760

cggtctgatt attagtctgg gaccacggtc ccactcgtat cgtcggtctg attattagtc 8820

tgggaccacg gtcccactcg tatcgtcggt ctgataatca gactgggacc acggtcccac 8880

tcgtatcgtc ggtctgatta ttagtctggg accatggtcc cactcgtatc gtcggtctga 8940

ttattagtct gggaccacgg tcccactcgt atcgtcggtc tgattattag tctggaacca 9000

cggtcccact cgtatcgtcg gtctgattat tagtctggga ccacggtccc actcgtatcg 9060

tcggtctgat tattagtctg ggaccacgat cccactcgtg ttgtcggtct gattatcggt 9120

ctgggaccac ggtcccactt gtattgtcga tcagactatc agcgtgagac tacgattcca 9180

tcaatgcctg tcaagggcaa gtattgacat gtcgtcgtaa cctgtagaac ggagtaacct 9240

cggtgtgcgg ttgtatgcct gctgtggatt gctgctgtgt cctgcttatc cacaacattt 9300

tgcgcacggt tatgtggaca aaatacctgg ttacccaggc cgtgccggca cgttaaccgg 9360

gctgcatccg atgcaagtgt gtcgctgtcg acgagctcgc gagctcggac atgaggttgc 9420

cccgtattca gtgtcgctga tttgtattgt ctgaagttgt ttttacgtta agttgatgca 9480

gatcaattaa tacgatacct gcgtcataat tgattatttg acgtggtttg atggcctcca 9540

cgcacgttgt gatatgtaga tgataatcat tatcacttta cgggtccttt ccggtgatcc 9600

gacaggttac ggggcggcga cctcgcgggt tttcgctatt tatgaaaatt ttccggttta 9660

aggcgtttcc gttcttcttc gtcataactt aatgttttta tttaaaatac cctctgaaaa 9720

gaaaggaaac gacaggtgct gaaagcgagc tttttggcct ctgtcgtttc ctttctctgt 9780

ttttgtccgt ggaatgaaca atggaagtcc gagctcatcg ctaataactt cgtatagcat 9840

acattatacg aagttatatt cgat 9864


<210> 70
<211> 1470
<212> DNA
<213> Synechocystis PCC6803

<400> 70
atgaaatccc cccaggctca acaaatccta gaccaggccc gccgtttgct ctacgaaaaa 60

gccatggtca aaatcaatgg gcaatacgtg gggacggtgg cggccattcc ccaatcggat 120

caccatgatt tgaactatac ggaagttttc attcgggaca atgtgccggt gatgatcttc 180

ttgttactgc aaaatgaaac ggaaattgtc caaaactttt tggaaatttg cctcaccctc 240

caaagtaagg gctttcccac ctacggcatt tttcccacta gttttgtgga aacggaaaac 300

catgaactca aggcagacta tggccaacgg gcgatcggtc gagtttgctc ggtggatgcg 360

tccctctggt ggcctatttt ggcctattac tacgtgcaaa gaaccggcaa tgaagcctgg 420

gctagacaaa cccatgtgca attggggcta caaaagtttt taaacctcat tctccatcca 480

gtctttcggg atgcacccac tttgtttgtg cccgacgggg cctttatgat tgaccgcccc 540

atggatgtgt ggggagcgcc gttggaaatc caaaccctgc tctacggagc cctgaaaagt 600

gcggcggggt tactgttaat cgacctcaag gcgaagggtt attgcagcaa taaagaccat 660

ccttttgaca gcttcacgat ggagcagagt catcaattta acctgagtgt ggattggctc 720

aaaaaactcc gcacctatct gctcaagcat tattggatta attgcaatat tgtccaagct 780

ctccgccgcc gtcccacgga acagtacggt gaagaagcca gcaacgaaca taatgtccac 840

acagaaacca ttcccaactg gctccaggat tggctcggcg atcggggagg ctatttaatc 900

ggcaatatcc gcacgggtcg ccccgatttt cgctttttct ccctgggtaa ttgcttgggg 960

gcaattttcg atgtcactag cttggcccag caacgttcct ttttccgttt ggtattaaat 1020

aatcagcggg agttatgtgc ccaaatgccc ctgaggattt gccatccccc cctcaaagat 1080

gacgattggc gcagtaaaac cggctttgac cgcaaaaatt taccctggtg ctaccacaac 1140

gccggccatt ggccctgttt attttggttt ctggtggtgg cggtgctccg ccatagctgc 1200

cattccaact acggcacggt ggagtatgcg gaaatgggga acctaattcg caataactat 1260

gaggtgcttt tgcgccgttt gcccaagcat aaatgggctg aatattttga tggccccacg 1320

ggcttttggg tcgggcaaca atcccgttcc taccaaacct ggaccattgt gggcctattg 1380

ctagtacacc atttcacaga agttaacccc gacgatgctt tgatgttcga tttgcctagt 1440

ttgaaaagtt tgcatcaagc gctgcattaa 1470


<210> 71
<211> 489
<212> PRT
<213> Synechocystis PCC6803

<400> 71

Met Lys Ser Pro Gln Ala Gln Gln Ile Leu Asp Gln Ala Arg Arg Leu
1 5 10 15


Leu Tyr Glu Lys Ala Met Val Lys Ile Asn Gly Gln Tyr Val Gly Thr
20 25 30


Val Ala Ala Ile Pro Gln Ser Asp His His Asp Leu Asn Tyr Thr Glu
35 40 45


Val Phe Ile Arg Asp Asn Val Pro Val Met Ile Phe Leu Leu Leu Gln
50 55 60


Asn Glu Thr Glu Ile Val Gln Asn Phe Leu Glu Ile Cys Leu Thr Leu
65 70 75 80


Gln Ser Lys Gly Phe Pro Thr Tyr Gly Ile Phe Pro Thr Ser Phe Val
85 90 95


Glu Thr Glu Asn His Glu Leu Lys Ala Asp Tyr Gly Gln Arg Ala Ile
100 105 110


Gly Arg Val Cys Ser Val Asp Ala Ser Leu Trp Trp Pro Ile Leu Ala
115 120 125


Tyr Tyr Tyr Val Gln Arg Thr Gly Asn Glu Ala Trp Ala Arg Gln Thr
130 135 140


His Val Gln Leu Gly Leu Gln Lys Phe Leu Asn Leu Ile Leu His Pro
145 150 155 160


Val Phe Arg Asp Ala Pro Thr Leu Phe Val Pro Asp Gly Ala Phe Met
165 170 175


Ile Asp Arg Pro Met Asp Val Trp Gly Ala Pro Leu Glu Ile Gln Thr
180 185 190


Leu Leu Tyr Gly Ala Leu Lys Ser Ala Ala Gly Leu Leu Leu Ile Asp
195 200 205


Leu Lys Ala Lys Gly Tyr Cys Ser Asn Lys Asp His Pro Phe Asp Ser
210 215 220


Phe Thr Met Glu Gln Ser His Gln Phe Asn Leu Ser Val Asp Trp Leu
225 230 235 240


Lys Lys Leu Arg Thr Tyr Leu Leu Lys His Tyr Trp Ile Asn Cys Asn
245 250 255


Ile Val Gln Ala Leu Arg Arg Arg Pro Thr Glu Gln Tyr Gly Glu Glu
260 265 270


Ala Ser Asn Glu His Asn Val His Thr Glu Thr Ile Pro Asn Trp Leu
275 280 285


Gln Asp Trp Leu Gly Asp Arg Gly Gly Tyr Leu Ile Gly Asn Ile Arg
290 295 300


Thr Gly Arg Pro Asp Phe Arg Phe Phe Ser Leu Gly Asn Cys Leu Gly
305 310 315 320


Ala Ile Phe Asp Val Thr Ser Leu Ala Gln Gln Arg Ser Phe Phe Arg
325 330 335


Leu Val Leu Asn Asn Gln Arg Glu Leu Cys Ala Gln Met Pro Leu Arg
340 345 350


Ile Cys His Pro Pro Leu Lys Asp Asp Asp Trp Arg Ser Lys Thr Gly
355 360 365


Phe Asp Arg Lys Asn Leu Pro Trp Cys Tyr His Asn Ala Gly His Trp
370 375 380


Pro Cys Leu Phe Trp Phe Leu Val Val Ala Val Leu Arg His Ser Cys
385 390 395 400


His Ser Asn Tyr Gly Thr Val Glu Tyr Ala Glu Met Gly Asn Leu Ile
405 410 415


Arg Asn Asn Tyr Glu Val Leu Leu Arg Arg Leu Pro Lys His Lys Trp
420 425 430


Ala Glu Tyr Phe Asp Gly Pro Thr Gly Phe Trp Val Gly Gln Gln Ser
435 440 445


Arg Ser Tyr Gln Thr Trp Thr Ile Val Gly Leu Leu Leu Val His His
450 455 460


Phe Thr Glu Val Asn Pro Asp Asp Ala Leu Met Phe Asp Leu Pro Ser
465 470 475 480


Leu Lys Ser Leu His Gln Ala Leu His
485


<210> 72
<211> 1392
<212> DNA
<213> Synechococcus PCC7942

<400> 72
atgcccgatt ctgttgtgct gcccgctacg ctgcagaccg cgctgcaaac agcggagcag 60

ttactttggg atcgggcctt ggttcgctat cacgatcagt gggcgggggc gatcgcggca 120

ctgcctgaag atcaggagtt ggcggcagcg aactaccgcg aaatctttat tcgcgacaac 180

gtgccggtga tgctctacct gctgttgcag ggcaaaactg acgttgtccg cgacttcttg 240

caactgtcgc tttctctcca gagccaggca ctgcaaacct atggcattct gccgaccagt 300

ttcgtctgtg aggaaaccca ctgcgttgct gactatggtc agcgggcgat cgggcgggtg 360

gtttctgctg accctagcct ttggtggccg gtgctgctac aggcctatcg gcgggcctcc 420

catgatgatg cctttgtcca cagtccgact gttcagcagg ggttacagcg gttgctggct 480

ttcctgctgc gtccggtttt caaccaaaac ccactgctcg aggtgcccga tggggccttc 540

atggtcgatc gtcccttgga tgtggcgggc gcacctttag aaattcaagt cctgctctac 600

ggggcactgc gggcttgtgg gcagttgctg caatacaccg aagcggccaa tgctgcccat 660

gtgcaagccc gtcgcctgcg gcagtatctc tgctggcact actgggtgac gcccgatcgc 720

ctgcgacgct ggcagcagtg gcccaccgaa gaatttggcg atcgcagcca taacccctac 780

aacattcagc cgatcgccat ccctgactgg gttgaacctt ggctgggtga gtcgggtggc 840

tacttcctag ggaacatacg ggcaggacgt cctgacttcc gcttttttag ccttggcaat 900

ttgctggcga tcgttttcga tgtgcttccg ctcaatcagc agggtgcgat tctgcgcttg 960

attttgcaga acgaagccca gattttgggc caagtgccgt tgcggctctg ctatcccgct 1020

ttaaccggat cggcgtggaa aatcctgacg ggttgcgatc ctaaaaatca gccttggtcc 1080

tatcacaacg gtggtagttg gccatccctg ctttggtatc tcagtgcggc ggtcttgcac 1140

taccaacagc ggggaggcga tcgcaatctc tgtcaggtct ggctgaataa gcttcagcac 1200

taccacactc agcagtgcga gcaactccct ggcgatgagt ggccagagta ctacgagggt 1260

caggactcgg tccagattgc tactcgcgcc tgccgttatc agacttggac gtttacggga 1320

ttgctgctga atcacgcact gctctcgcag ccccagggca ttcaactgct gagtctgcgg 1380

ggcttaccct aa 1392


<210> 73
<211> 463
<212> PRT
<213> Synechococcus PCC7942

<400> 73

Met Pro Asp Ser Val Val Leu Pro Ala Thr Leu Gln Thr Ala Leu Gln
1 5 10 15


Thr Ala Glu Gln Leu Leu Trp Asp Arg Ala Leu Val Arg Tyr His Asp
20 25 30


Gln Trp Ala Gly Ala Ile Ala Ala Leu Pro Glu Asp Gln Glu Leu Ala
35 40 45


Ala Ala Asn Tyr Arg Glu Ile Phe Ile Arg Asp Asn Val Pro Val Met
50 55 60


Leu Tyr Leu Leu Leu Gln Gly Lys Thr Asp Val Val Arg Asp Phe Leu
65 70 75 80


Gln Leu Ser Leu Ser Leu Gln Ser Gln Ala Leu Gln Thr Tyr Gly Ile
85 90 95


Leu Pro Thr Ser Phe Val Cys Glu Glu Thr His Cys Val Ala Asp Tyr
100 105 110


Gly Gln Arg Ala Ile Gly Arg Val Val Ser Ala Asp Pro Ser Leu Trp
115 120 125


Trp Pro Val Leu Leu Gln Ala Tyr Arg Arg Ala Ser His Asp Asp Ala
130 135 140


Phe Val His Ser Pro Thr Val Gln Gln Gly Leu Gln Arg Leu Leu Ala
145 150 155 160


Phe Leu Leu Arg Pro Val Phe Asn Gln Asn Pro Leu Leu Glu Val Pro
165 170 175


Asp Gly Ala Phe Met Val Asp Arg Pro Leu Asp Val Ala Gly Ala Pro
180 185 190


Leu Glu Ile Gln Val Leu Leu Tyr Gly Ala Leu Arg Ala Cys Gly Gln
195 200 205


Leu Leu Gln Tyr Thr Glu Ala Ala Asn Ala Ala His Val Gln Ala Arg
210 215 220


Arg Leu Arg Gln Tyr Leu Cys Trp His Tyr Trp Val Thr Pro Asp Arg
225 230 235 240


Leu Arg Arg Trp Gln Gln Trp Pro Thr Glu Glu Phe Gly Asp Arg Ser
245 250 255


His Asn Pro Tyr Asn Ile Gln Pro Ile Ala Ile Pro Asp Trp Val Glu
260 265 270


Pro Trp Leu Gly Glu Ser Gly Gly Tyr Phe Leu Gly Asn Ile Arg Ala
275 280 285


Gly Arg Pro Asp Phe Arg Phe Phe Ser Leu Gly Asn Leu Leu Ala Ile
290 295 300


Val Phe Asp Val Leu Pro Leu Asn Gln Gln Gly Ala Ile Leu Arg Leu
305 310 315 320


Ile Leu Gln Asn Glu Ala Gln Ile Leu Gly Gln Val Pro Leu Arg Leu
325 330 335


Cys Tyr Pro Ala Leu Thr Gly Ser Ala Trp Lys Ile Leu Thr Gly Cys
340 345 350


Asp Pro Lys Asn Gln Pro Trp Ser Tyr His Asn Gly Gly Ser Trp Pro
355 360 365


Ser Leu Leu Trp Tyr Leu Ser Ala Ala Val Leu His Tyr Gln Gln Arg
370 375 380


Gly Gly Asp Arg Asn Leu Cys Gln Val Trp Leu Asn Lys Leu Gln His
385 390 395 400


Tyr His Thr Gln Gln Cys Glu Gln Leu Pro Gly Asp Glu Trp Pro Glu
405 410 415


Tyr Tyr Glu Gly Gln Asp Ser Val Gln Ile Ala Thr Arg Ala Cys Arg
420 425 430


Tyr Gln Thr Trp Thr Phe Thr Gly Leu Leu Leu Asn His Ala Leu Leu
435 440 445


Ser Gln Pro Gln Gly Ile Gln Leu Leu Ser Leu Arg Gly Leu Pro
450 455 460


<210> 74
<211> 966
<212> DNA
<213> Synechocystis PCC6803

<400> 74
atgattaatt gtcaattttg ttccgttatt tccaaatcta acggggaaga tcctatcggc 60

acagcaaatt caagtgatcg ttggttaatt atggaattac cccaaccttg gacagaggaa 120

cgctttcatc atgaccccat tcttaaacca attcatgatc tttttcatca actttctgat 180

caaggagtta aagtatctcc aatggcgatc gcctcagatc acgagtattc tcaatcagga 240

tttagtcgta ttattcacta ccaaaagttt aatttgctct tttccagttt tataaaagaa 300

gaatatttag ttcctgatga tcaaaggtgg gatcttatca aaaatttatg ttatcaatct 360

ccagagttag aaaattttcg taactataaa ctgtcagatg ttgttgatcg agatatgatg 420

gtatgtactc atggaaacat tgatgtggct tgttcgagat ttggttatcc tatttataaa 480

caattacgac aaaaatatgc atcaaaaaat ttaagaatat ggcgctgctc tcattttggg 540

ggacatcagt ttgctccgac tttaattgat tttccaaatg ggcaagtttg gggacatctt 600

gagtctgaag ttttagataa tctggtaagg caagaaggtc aagttaaaca actttataaa 660

ttttatcgag gttgggtagg cgtaacaaaa tttgcccaga ttgttgagcg tgaaatttgg 720

actcaacgag gttggcaatg gttaaattat caaaaatcag ctcaaatatt gaacatggat 780

gataatcagc atgatcccaa ttgggtagag gttcaatttg attttatttc tcccgataaa 840

gttaaaggag cttattttgc aagagttgaa gtcaatgggt cagtgatgac tgctagaaat 900

tcaggagatg aacttatttc tgtcaagcag tatagtgtca gctacttaaa agaaattgat 960

aaataa 966


<210> 75
<211> 321
<212> PRT
<213> Synechocystis PCC6803

<400> 75

Met Ile Asn Cys Gln Phe Cys Ser Val Ile Ser Lys Ser Asn Gly Glu
1 5 10 15


Asp Pro Ile Gly Thr Ala Asn Ser Ser Asp Arg Trp Leu Ile Met Glu
20 25 30


Leu Pro Gln Pro Trp Thr Glu Glu Arg Phe His His Asp Pro Ile Leu
35 40 45


Lys Pro Ile His Asp Leu Phe His Gln Leu Ser Asp Gln Gly Val Lys
50 55 60


Val Ser Pro Met Ala Ile Ala Ser Asp His Glu Tyr Ser Gln Ser Gly
65 70 75 80


Phe Ser Arg Ile Ile His Tyr Gln Lys Phe Asn Leu Leu Phe Ser Ser
85 90 95


Phe Ile Lys Glu Glu Tyr Leu Val Pro Asp Asp Gln Arg Trp Asp Leu
100 105 110


Ile Lys Asn Leu Cys Tyr Gln Ser Pro Glu Leu Glu Asn Phe Arg Asn
115 120 125


Tyr Lys Leu Ser Asp Val Val Asp Arg Asp Met Met Val Cys Thr His
130 135 140


Gly Asn Ile Asp Val Ala Cys Ser Arg Phe Gly Tyr Pro Ile Tyr Lys
145 150 155 160


Gln Leu Arg Gln Lys Tyr Ala Ser Lys Asn Leu Arg Ile Trp Arg Cys
165 170 175


Ser His Phe Gly Gly His Gln Phe Ala Pro Thr Leu Ile Asp Phe Pro
180 185 190


Asn Gly Gln Val Trp Gly His Leu Glu Ser Glu Val Leu Asp Asn Leu
195 200 205


Val Arg Gln Glu Gly Gln Val Lys Gln Leu Tyr Lys Phe Tyr Arg Gly
210 215 220


Trp Val Gly Val Thr Lys Phe Ala Gln Ile Val Glu Arg Glu Ile Trp
225 230 235 240


Thr Gln Arg Gly Trp Gln Trp Leu Asn Tyr Gln Lys Ser Ala Gln Ile
245 250 255


Leu Asn Met Asp Asp Asn Gln His Asp Pro Asn Trp Val Glu Val Gln
260 265 270


Phe Asp Phe Ile Ser Pro Asp Lys Val Lys Gly Ala Tyr Phe Ala Arg
275 280 285


Val Glu Val Asn Gly Ser Val Met Thr Ala Arg Asn Ser Gly Asp Glu
290 295 300


Leu Ile Ser Val Lys Gln Tyr Ser Val Ser Tyr Leu Lys Glu Ile Asp
305 310 315 320


Lys



<210> 76
<211> 1425
<212> DNA
<213> Escherichia coli

<400> 76
atgagtcgtt tagtcgtagt atctaaccgg attgcaccac cagacgagca cgccgccagt 60

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ggctggagtg gtgaaacagg gaatgaggat cagccgctaa aaaaggtgaa aaaaggtaac 180

attacgtggg cctcttttaa cctcagcgaa caggaccttg acgaatacta caaccaattc 240

tccaatgccg ttctctggcc cgcttttcat tatcggctcg atctggtgca atttcagcgt 300

cctgcctggg acggctatct acgcgtaaat gcgttgctgg cagataaatt actgccgctg 360

ttgcaagacg atgacattat ctggatccac gattatcacc tgttgccatt tgcgcatgaa 420

ttacgcaaac ggggagtgaa taatcgcatt ggtttctttc tgcatattcc tttcccgaca 480

ccggaaatct tcaacgcgct gccgacatat gacaccttgc ttgaacagct ttgtgattat 540

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ctgacccgcg tcacgacacg tagcgcaaaa agccatacag cctggggcaa agcatttcga 660

acagaagtct acccgatcgg cattgaaccg aaagaaatag ccaaacaggc tgccgggcca 720

ctgccgccaa aactggcgca acttaaagcg gaactgaaaa acgtacaaaa tatcttttct 780

gtcgaacggc tggattattc caaaggtttg ccagagcgtt ttctcgccta tgaagcgttg 840

ctggaaaaat atccgcagca tcatggtaaa attcgttata cccagattgc accaacgtcg 900

cgtggtgatg tgcaagccta tcaggatatt cgtcatcagc tcgaaaatga agctggacga 960

attaatggta aatacgggca attaggctgg acgccgcttt attatttgaa tcagcatttt 1020

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<210> 77
<211> 474
<212> PRT
<213> Escherichia coli

<400> 77

Met Ser Arg Leu Val Val Val Ser Asn Arg Ile Ala Pro Pro Asp Glu
1 5 10 15


His Ala Ala Ser Ala Gly Gly Leu Ala Val Gly Ile Leu Gly Ala Leu
20 25 30


Lys Ala Ala Gly Gly Leu Trp Phe Gly Trp Ser Gly Glu Thr Gly Asn
35 40 45


Glu Asp Gln Pro Leu Lys Lys Val Lys Lys Gly Asn Ile Thr Trp Ala
50 55 60


Ser Phe Asn Leu Ser Glu Gln Asp Leu Asp Glu Tyr Tyr Asn Gln Phe
65 70 75 80


Ser Asn Ala Val Leu Trp Pro Ala Phe His Tyr Arg Leu Asp Leu Val
85 90 95


Gln Phe Gln Arg Pro Ala Trp Asp Gly Tyr Leu Arg Val Asn Ala Leu
100 105 110


Leu Ala Asp Lys Leu Leu Pro Leu Leu Gln Asp Asp Asp Ile Ile Trp
115 120 125


Ile His Asp Tyr His Leu Leu Pro Phe Ala His Glu Leu Arg Lys Arg
130 135 140


Gly Val Asn Asn Arg Ile Gly Phe Phe Leu His Ile Pro Phe Pro Thr
145 150 155 160


Pro Glu Ile Phe Asn Ala Leu Pro Thr Tyr Asp Thr Leu Leu Glu Gln
165 170 175


Leu Cys Asp Tyr Asp Leu Leu Gly Phe Gln Thr Glu Asn Asp Arg Leu
180 185 190


Ala Phe Leu Asp Cys Leu Ser Asn Leu Thr Arg Val Thr Thr Arg Ser
195 200 205


Ala Lys Ser His Thr Ala Trp Gly Lys Ala Phe Arg Thr Glu Val Tyr
210 215 220


Pro Ile Gly Ile Glu Pro Lys Glu Ile Ala Lys Gln Ala Ala Gly Pro
225 230 235 240


Leu Pro Pro Lys Leu Ala Gln Leu Lys Ala Glu Leu Lys Asn Val Gln
245 250 255


Asn Ile Phe Ser Val Glu Arg Leu Asp Tyr Ser Lys Gly Leu Pro Glu
260 265 270


Arg Phe Leu Ala Tyr Glu Ala Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Gln His His
275 280 285


Gly Lys Ile Arg Tyr Thr Gln Ile Ala Pro Thr Ser Arg Gly Asp Val
290 295 300


Gln Ala Tyr Gln Asp Ile Arg His Gln Leu Glu Asn Glu Ala Gly Arg
305 310 315 320


Ile Asn Gly Lys Tyr Gly Gln Leu Gly Trp Thr Pro Leu Tyr Tyr Leu
325 330 335


Asn Gln His Phe Asp Arg Lys Leu Leu Met Lys Ile Phe Arg Tyr Ser
340 345 350


Asp Val Gly Leu Val Thr Pro Leu Arg Asp Gly Met Asn Leu Val Ala
355 360 365


Lys Glu Tyr Val Ala Ala Gln Asp Pro Ala Asn Pro Gly Val Leu Val
370 375 380


Leu Ser Gln Phe Ala Gly Ala Ala Asn Glu Leu Thr Ser Ala Leu Ile
385 390 395 400


Val Asn Pro Tyr Asp Arg Asp Glu Val Ala Ala Ala Leu Asp Arg Ala
405 410 415


Leu Thr Met Ser Leu Ala Glu Arg Ile Ser Arg His Ala Glu Met Leu
420 425 430


Asp Val Ile Val Lys Asn Asp Ile Asn His Trp Gln Glu Cys Phe Ile
435 440 445


Ser Asp Leu Lys Gln Ile Val Pro Arg Ser Ala Glu Ser Gln Gln Arg
450 455 460


Asp Lys Val Ala Thr Phe Pro Lys Leu Ala
465 470


<210> 78
<211> 746
<212> DNA
<213> Escherichia coli

<400> 78
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tatcagggcg ctcaatggtg gagcttgacg cactggcaaa accttatcgc ttcccgttag 180

cgggcgtgca tggggcggag cgccgtgaca tcaatggtaa aacacatatc gttcatctgc 240

cggatgcgat tgcgcgtgat attagcgtgc aactgcatac agtcatcgct cagtatcccg 300

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ttgcagcttt tatgcaggaa gctcccttta tcgggcgaac gcccgtattt ctgggcgatg 540

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atgagtcgtt tagtcgtagt atctaa 746


<210> 79
<211> 266
<212> PRT
<213> Escherichia coli

<400> 79

Met Thr Glu Pro Leu Thr Glu Thr Pro Glu Leu Ser Ala Lys Tyr Ala
1 5 10 15


Trp Phe Phe Asp Leu Asp Gly Thr Leu Ala Glu Ile Lys Pro His Pro
20 25 30


Asp Gln Val Val Val Pro Asp Asn Ile Leu Gln Gly Leu Gln Leu Leu
35 40 45


Ala Thr Ala Ser Asp Gly Ala Leu Ala Leu Ile Ser Gly Arg Ser Met
50 55 60


Val Glu Leu Asp Ala Leu Ala Lys Pro Tyr Arg Phe Pro Leu Ala Gly
65 70 75 80


Val His Gly Ala Glu Arg Arg Asp Ile Asn Gly Lys Thr His Ile Val
85 90 95


His Leu Pro Asp Ala Ile Ala Arg Asp Ile Ser Val Gln Leu His Thr
100 105 110


Val Ile Ala Gln Tyr Pro Gly Ala Glu Leu Glu Ala Lys Gly Met Ala
115 120 125


Phe Ala Leu His Tyr Arg Gln Ala Pro Gln His Glu Asp Ala Leu Met
130 135 140


Thr Leu Ala Gln Arg Ile Thr Gln Ile Trp Pro Gln Met Ala Leu Gln
145 150 155 160


Gln Gly Lys Cys Val Val Glu Ile Lys Pro Arg Gly Thr Ser Lys Gly
165 170 175


Glu Ala Ile Ala Ala Phe Met Gln Glu Ala Pro Phe Ile Gly Arg Thr
180 185 190


Pro Val Phe Leu Gly Asp Asp Leu Thr Asp Glu Ser Gly Phe Ala Val
195 200 205


Val Asn Arg Leu Gly Gly Met Ser Val Lys Ile Gly Thr Gly Ala Thr
210 215 220


Gln Ala Ser Trp Arg Leu Ala Gly Val Pro Asp Val Trp Ser Trp Leu
225 230 235 240


Glu Met Ile Thr Thr Ala Leu Gln Gln Lys Arg Glu Asn Asn Arg Ser
245 250 255


Asp Asp Tyr Glu Ser Phe Ser Arg Ser Ile
260 265


<210> 80
<211> 1500
<212> DNA
<213> Synechocystis PCC6803

<400> 80
atgaattcat cccttgtgat cctttaccac cgtgagccct acgacgaagt tagggaaaat 60

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ttttggccca ttctccactc tttcccctgg cagttcacct acgattcttc tgattgggat 360

aattttcagc acattaaccg cttatttgcc gaggcggcct gtgccgatgc cgatgacaat 420

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aagcccaacg ccaagattgc ctttttccac cacaccccct tccccagcgt tgatattttc 540

aatattttgc cctggcggga ggcgatcgta gaaagcttgc tggcctgtga tctctgtggt 600

tttcatattc cccgctacgt agaaaatttt gtcgccgtgg cccgtagtct caagccggtg 660

gaaatcacca gacgggttgt ggtagaccaa gcctttaccc cctacggtac ggccctggcg 720

gaaccggaac tcaccaccca gttgcgttat ggcgatcgcc tcattaacct cgatgcgttt 780

cccgtgggca ccaatccggc aaatatccgg gcgatcgtgg ccaaagaaag tgtgcaacaa 840

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cgctttgcca aactgtcctg gacaccagtg atgctgttca cctctccttt agcctatgag 1140

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ctaaacctgg tggctaagga gtatgtggtg gctaaaaatg gcgaagaagg agttctgatc 1260

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<210> 81
<211> 499
<212> PRT
<213> Synechocystis PCC6803

<400> 81

Met Asn Ser Ser Leu Val Ile Leu Tyr His Arg Glu Pro Tyr Asp Glu
1 5 10 15


Val Arg Glu Asn Gly Lys Thr Val Tyr Arg Glu Lys Lys Ser Pro Asn
20 25 30


Gly Ile Leu Pro Thr Leu Lys Ser Phe Phe Ala Asp Ala Glu Gln Ser
35 40 45


Thr Trp Val Ala Trp Lys Gln Val Ser Pro Lys Gln Lys Asp Asp Phe
50 55 60


Gln Ala Asp Met Ser Ile Glu Gly Leu Gly Asp Arg Cys Thr Val Arg
65 70 75 80


Arg Val Pro Leu Thr Ala Glu Gln Val Lys Asn Phe Tyr His Ile Thr
85 90 95


Ser Lys Glu Ala Phe Trp Pro Ile Leu His Ser Phe Pro Trp Gln Phe
100 105 110


Thr Tyr Asp Ser Ser Asp Trp Asp Asn Phe Gln His Ile Asn Arg Leu
115 120 125


Phe Ala Glu Ala Ala Cys Ala Asp Ala Asp Asp Asn Ala Leu Phe Trp
130 135 140


Val His Asp Tyr Asn Leu Trp Leu Ala Pro Leu Tyr Ile Arg Gln Leu
145 150 155 160


Lys Pro Asn Ala Lys Ile Ala Phe Phe His His Thr Pro Phe Pro Ser
165 170 175


Val Asp Ile Phe Asn Ile Leu Pro Trp Arg Glu Ala Ile Val Glu Ser
180 185 190


Leu Leu Ala Cys Asp Leu Cys Gly Phe His Ile Pro Arg Tyr Val Glu
195 200 205


Asn Phe Val Ala Val Ala Arg Ser Leu Lys Pro Val Glu Ile Thr Arg
210 215 220


Arg Val Val Val Asp Gln Ala Phe Thr Pro Tyr Gly Thr Ala Leu Ala
225 230 235 240


Glu Pro Glu Leu Thr Thr Gln Leu Arg Tyr Gly Asp Arg Leu Ile Asn
245 250 255


Leu Asp Ala Phe Pro Val Gly Thr Asn Pro Ala Asn Ile Arg Ala Ile
260 265 270


Val Ala Lys Glu Ser Val Gln Gln Lys Val Ala Glu Ile Lys Gln Asp
275 280 285


Leu Gly Gly Lys Arg Leu Ile Val Ser Ala Gly Arg Val Asp Tyr Val
290 295 300


Lys Gly Thr Lys Glu Met Leu Met Cys Tyr Glu Arg Leu Leu Glu Arg
305 310 315 320


Arg Pro Glu Leu Gln Gly Glu Ile Ser Leu Val Val Pro Val Ala Lys
325 330 335


Ala Ala Glu Gly Met Arg Ile Tyr Arg Asn Ala Gln Asn Glu Ile Glu
340 345 350


Arg Leu Ala Gly Lys Ile Asn Gly Arg Phe Ala Lys Leu Ser Trp Thr
355 360 365


Pro Val Met Leu Phe Thr Ser Pro Leu Ala Tyr Glu Glu Leu Ile Ala
370 375 380


Leu Phe Cys Ala Ala Asp Ile Ala Trp Ile Thr Pro Leu Arg Asp Gly
385 390 395 400


Leu Asn Leu Val Ala Lys Glu Tyr Val Val Ala Lys Asn Gly Glu Glu
405 410 415


Gly Val Leu Ile Leu Ser Glu Phe Ala Gly Cys Ala Val Glu Leu Pro
420 425 430


Asp Ala Val Leu Thr Asn Pro Tyr Ala Ser Ser Arg Met Asp Glu Ser
435 440 445


Ile Asp Gln Ala Leu Ala Met Asp Lys Asp Glu Gln Lys Lys Arg Met
450 455 460


Gly Arg Met Tyr Ala Ala Ile Lys Arg Tyr Asp Val Gln Gln Trp Ala
465 470 475 480


Asn His Leu Leu Arg Glu Ala Tyr Ala Asp Val Val Leu Gly Glu Pro
485 490 495


Pro Gln Met



<210> 82
<211> 1269
<212> DNA
<213> Synechocystis PCC6803

<400> 82
atggtattac accaacaacg tttctccctc gaccatggag ctttttgtca aaccttagcc 60

caaactgaaa atttactcat tgtccaagac ttggatgggg tctgcatgga attagtgcaa 120

gatcccctca gtcgccgcct ggatgccgat tatgtccggg ccaccaccct gtttgctgaa 180

catttttacg tgttgaccaa tggggagcac gtgggaaaaa gaggagtaca gggcattgtg 240

gaacaatcct ttggggatgc ttcctttgtg caacaggaag gcctatattt gcccggtttg 300

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ttttttggcg atcgccccca ttccctatcc ccagagcaat tacaaacggg cattgaagct 480

tcggttttag ataatgtggc ttcccccacc gccaatttaa ataccttggc caatctgtta 540

caagactttc cgcaaattta ccgagatttg caggaaacca tggctcaatt attggatcag 600

ttgatggcgg aagccgttgc ccagggtttg gggaatagtt tttttgtcca ctatgctccc 660

aatttaggta gggatgaacg aggtaaggaa attattcgtt gggccaaagc tggggattcc 720

ggcaccaccg attttcaatt tatgttgcgg ggtggggtca aagaagccgg ggttttggct 780

ttgctaaatc gttactatca caatcggaca gggcaatatc ctctgggaga aagttttagt 840

gctcgccaag cgcccccatc ccaccaggac ttgttgcatt tggtgaaagc gcaatttgat 900

ccggccttga tgccgctgat cattggagtt ggggatacgg tcaccagtca ggtggatgaa 960

gctaccgggg aaattcgacg tggcgggagc gatcgccaat ttttgcaatt aatccaagat 1020

ttgggggatt ggggaaatca cggtaactta gtggtgtatg tggacagttc ccagggggag 1080

gtgaaaaatc gccaacctct acaactagaa accgtggcgg ggcaaaccca agtggtggct 1140

ggccctgggg atatgcggga cagggaagag ccattgaaga tcaatgtggc ttttcctggt 1200

ggccatgacc aatatgtagc ggcgtttaag caggcggccc agcgccgaag agtccatttt 1260

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<210> 83
<211> 422
<212> PRT
<213> Synechocystis PCC6803

<400> 83

Met Val Leu His Gln Gln Arg Phe Ser Leu Asp His Gly Ala Phe Cys
1 5 10 15


Gln Thr Leu Ala Gln Thr Glu Asn Leu Leu Ile Val Gln Asp Leu Asp
20 25 30


Gly Val Cys Met Glu Leu Val Gln Asp Pro Leu Ser Arg Arg Leu Asp
35 40 45


Ala Asp Tyr Val Arg Ala Thr Thr Leu Phe Ala Glu His Phe Tyr Val
50 55 60


Leu Thr Asn Gly Glu His Val Gly Lys Arg Gly Val Gln Gly Ile Val
65 70 75 80


Glu Gln Ser Phe Gly Asp Ala Ser Phe Val Gln Gln Glu Gly Leu Tyr
85 90 95


Leu Pro Gly Leu Ala Ala Gly Gly Val Gln Trp Gln Asp Arg His Gly
100 105 110


Lys Val Ser His Pro Gly Val Gly Gln Thr Glu Leu Glu Phe Leu Ala
115 120 125


Ala Val Pro Glu Lys Ile Thr Asn Cys Leu Lys Thr Phe Phe Gly Asp
130 135 140


Arg Pro His Ser Leu Ser Pro Glu Gln Leu Gln Thr Gly Ile Glu Ala
145 150 155 160


Ser Val Leu Asp Asn Val Ala Ser Pro Thr Ala Asn Leu Asn Thr Leu
165 170 175


Ala Asn Leu Leu Gln Asp Phe Pro Gln Ile Tyr Arg Asp Leu Gln Glu
180 185 190


Thr Met Ala Gln Leu Leu Asp Gln Leu Met Ala Glu Ala Val Ala Gln
195 200 205


Gly Leu Gly Asn Ser Phe Phe Val His Tyr Ala Pro Asn Leu Gly Arg
210 215 220


Asp Glu Arg Gly Lys Glu Ile Ile Arg Trp Ala Lys Ala Gly Asp Ser
225 230 235 240


Gly Thr Thr Asp Phe Gln Phe Met Leu Arg Gly Gly Val Lys Glu Ala
245 250 255


Gly Val Leu Ala Leu Leu Asn Arg Tyr Tyr His Asn Arg Thr Gly Gln
260 265 270


Tyr Pro Leu Gly Glu Ser Phe Ser Ala Arg Gln Ala Pro Pro Ser His
275 280 285


Gln Asp Leu Leu His Leu Val Lys Ala Gln Phe Asp Pro Ala Leu Met
290 295 300


Pro Leu Ile Ile Gly Val Gly Asp Thr Val Thr Ser Gln Val Asp Glu
305 310 315 320


Ala Thr Gly Glu Ile Arg Arg Gly Gly Ser Asp Arg Gln Phe Leu Gln
325 330 335


Leu Ile Gln Asp Leu Gly Asp Trp Gly Asn His Gly Asn Leu Val Val
340 345 350


Tyr Val Asp Ser Ser Gln Gly Glu Val Lys Asn Arg Gln Pro Leu Gln
355 360 365


Leu Glu Thr Val Ala Gly Gln Thr Gln Val Val Ala Gly Pro Gly Asp
370 375 380


Met Arg Asp Arg Glu Glu Pro Leu Lys Ile Asn Val Ala Phe Pro Gly
385 390 395 400


Gly His Asp Gln Tyr Val Ala Ala Phe Lys Gln Ala Ala Gln Arg Arg
405 410 415


Arg Val His Phe Ser Gln
420


<210> 84
<211> 1365
<212> DNA
<213> Agrobacterium tumefaciens

<400> 84
ttggaaaaat ttaccaagat gggacccatg acaaccacga gcgaaactga acgctatccg 60

cggatagctc tcatatcgac gcatggctat gtcgccgcac acccgcccct gggcgctgcc 120

gataccgggg ggcaggtggt ttatgtgctt gagcttgcac gaaaactcgg ccaactcggt 180

tataccgtcg atctttacac ccgacgcttc gaagaccagc cggaattcga cgaggtcgat 240

gagcgcgtcc gtgtggtgcg cattccctgc ggcgggcgcg atttcattcc caaggaatat 300

ctgcaccggc acctgatgga atggtgcgag aacgcgctac gcttcatcaa aaaaaacgac 360

ctcaattact ccttcatcaa cagccactac tgggatgccg gcgtggccgg gcagcggctc 420

tccgaagcac tgaaaatccc ccatctgcac acgccgcact cgctcggcat ctggaagaag 480

cgccagatgg agaccgatta tccggaaaag gccgatacgt tcgagcttga gttcaacttc 540

aaggagcgca tccagcacga gctgatcatc tatcgcagct gcgacatggt gatcgccacc 600

acgccggtgc agctggacgt gctgatcgaa gattatggcc tgaagcgcaa acatatccac 660

atgatcccgc cgggttatga cgacaaccgc ttcttccccg tctcggatgc gacgcgtcag 720

atgatccggc agcgtttcgg ttttgaaggc aaagtggtgc tggcactcgg tcggctcgcc 780

accaacaagg gctacgacct gctgatcgac ggcttttccg tgcttgccga gcgcgagccg 840

gaagcccgcc tgcatctggc cgtcggcggc gagaatatgg acgagcagga aaccaccatt 900

ctcaaccagc tgaaggagcg ggtgaaatcg ctcgggctgg aagacaaggt ggctttctct 960

ggttatgtcg cggacgagga tttgccggat atctatcggg ctgccgatct cttcgtgctt 1020

tccagccgct acgagccctt cggcatgacc gccatcgagg ccatggcgag cggcacgccg 1080

accgtcgtca ccatccatgg cgggctgttc cgcgccatca gctatgggcg acatgcgctg 1140

tttgccgatc ctttcgacaa ggaagatctc ggcattacca tgatgaagcc gttcaagcat 1200

gaacggctct acgggcggct ttcgcgcatg ggagcccaca aggcacgcag cctgttcaca 1260

tggaccggaa ttgcccagca acttctcgcg ctcgtggaag gcaggaccat gatgccggtt 1320

ctggaagaag ccgactgggc cgaaccatgg aatgacggcg attga 1365


<210> 85
<211> 454
<212> PRT
<213> Agrobacterium tumefaciens

<400> 85

Met Glu Lys Phe Thr Lys Met Gly Pro Met Thr Thr Thr Ser Glu Thr
1 5 10 15


Glu Arg Tyr Pro Arg Ile Ala Leu Ile Ser Thr His Gly Tyr Val Ala
20 25 30


Ala His Pro Pro Leu Gly Ala Ala Asp Thr Gly Gly Gln Val Val Tyr
35 40 45


Val Leu Glu Leu Ala Arg Lys Leu Gly Gln Leu Gly Tyr Thr Val Asp
50 55 60


Leu Tyr Thr Arg Arg Phe Glu Asp Gln Pro Glu Phe Asp Glu Val Asp
65 70 75 80


Glu Arg Val Arg Val Val Arg Ile Pro Cys Gly Gly Arg Asp Phe Ile
85 90 95


Pro Lys Glu Tyr Leu His Arg His Leu Met Glu Trp Cys Glu Asn Ala
100 105 110


Leu Arg Phe Ile Lys Lys Asn Asp Leu Asn Tyr Ser Phe Ile Asn Ser
115 120 125


His Tyr Trp Asp Ala Gly Val Ala Gly Gln Arg Leu Ser Glu Ala Leu
130 135 140


Lys Ile Pro His Leu His Thr Pro His Ser Leu Gly Ile Trp Lys Lys
145 150 155 160


Arg Gln Met Glu Thr Asp Tyr Pro Glu Lys Ala Asp Thr Phe Glu Leu
165 170 175


Glu Phe Asn Phe Lys Glu Arg Ile Gln His Glu Leu Ile Ile Tyr Arg
180 185 190


Ser Cys Asp Met Val Ile Ala Thr Thr Pro Val Gln Leu Asp Val Leu
195 200 205


Ile Glu Asp Tyr Gly Leu Lys Arg Lys His Ile His Met Ile Pro Pro
210 215 220


Gly Tyr Asp Asp Asn Arg Phe Phe Pro Val Ser Asp Ala Thr Arg Gln
225 230 235 240


Met Ile Arg Gln Arg Phe Gly Phe Glu Gly Lys Val Val Leu Ala Leu
245 250 255


Gly Arg Leu Ala Thr Asn Lys Gly Tyr Asp Leu Leu Ile Asp Gly Phe
260 265 270


Ser Val Leu Ala Glu Arg Glu Pro Glu Ala Arg Leu His Leu Ala Val
275 280 285


Gly Gly Glu Asn Met Asp Glu Gln Glu Thr Thr Ile Leu Asn Gln Leu
290 295 300


Lys Glu Arg Val Lys Ser Leu Gly Leu Glu Asp Lys Val Ala Phe Ser
305 310 315 320


Gly Tyr Val Ala Asp Glu Asp Leu Pro Asp Ile Tyr Arg Ala Ala Asp
325 330 335


Leu Phe Val Leu Ser Ser Arg Tyr Glu Pro Phe Gly Met Thr Ala Ile
340 345 350


Glu Ala Met Ala Ser Gly Thr Pro Thr Val Val Thr Ile His Gly Gly
355 360 365


Leu Phe Arg Ala Ile Ser Tyr Gly Arg His Ala Leu Phe Ala Asp Pro
370 375 380


Phe Asp Lys Glu Asp Leu Gly Ile Thr Met Met Lys Pro Phe Lys His
385 390 395 400


Glu Arg Leu Tyr Gly Arg Leu Ser Arg Met Gly Ala His Lys Ala Arg
405 410 415


Ser Leu Phe Thr Trp Thr Gly Ile Ala Gln Gln Leu Leu Ala Leu Val
420 425 430


Glu Gly Arg Thr Met Met Pro Val Leu Glu Glu Ala Asp Trp Ala Glu
435 440 445


Pro Trp Asn Asp Gly Asp
450


<210> 86
<211> 747
<212> DNA
<213> Agrobacterium tumefaciens

<400> 86
ttgaaaccgc ttcgtcttct ttccaccgat cttgacggaa ccgtcgtcgg cgataatgac 60

gccacgcggc ggttccgcga tttctggcac gcactgccgg atgatcttcg cccggttctg 120

gtcttcaaca gcggccggtt gatcgacgat cagcttgccc ttttggaaga ggtgccgctg 180

ccgcagccgg actacatcat cggcggtgtc ggcaccatgc tgcatgcaaa aaaacgcagc 240

gaactggaaa ccgcctatac acagtcgctc ggcaccggtt ttgacccgcg gaagattgcc 300

gatgtcatga accgcattgc gggcgtgacg atgcaggagg agcgttatca gcacggcctg 360

aaatcgagct ggttcctgca tgacgccgat gccgccgcgc tcggcgagat cgaggccgcg 420

cttctggccg ccgatattga cgctcgtatc gtttattcca gcgatcgcga cctcgacata 480

ttgccgaagg ccgccgacaa aggcgcggca cttgcatggt tgtgtggaca attgcgcatc 540

ggcctcgacg aatcagtggt ctcgggtgat actggcaatg accgtgcgat gtttgagttg 600

aagactatcc gcggcgtgat cgtgggcaat gccctgcctg agcttgtctc gctggcgcat 660

caggacaatc gcttttttca ctcgaccgcg aaagaagcgg atggcgtgat cgaaggcctg 720

cggcactggg gactgaaccc ccgctaa 747


<210> 87
<211> 248
<212> PRT
<213> Agrobacterium tumefaciens

<400> 87

Met Lys Pro Leu Arg Leu Leu Ser Thr Asp Leu Asp Gly Thr Val Val
1 5 10 15


Gly Asp Asn Asp Ala Thr Arg Arg Phe Arg Asp Phe Trp His Ala Leu
20 25 30


Pro Asp Asp Leu Arg Pro Val Leu Val Phe Asn Ser Gly Arg Leu Ile
35 40 45


Asp Asp Gln Leu Ala Leu Leu Glu Glu Val Pro Leu Pro Gln Pro Asp
50 55 60


Tyr Ile Ile Gly Gly Val Gly Thr Met Leu His Ala Lys Lys Arg Ser
65 70 75 80


Glu Leu Glu Thr Ala Tyr Thr Gln Ser Leu Gly Thr Gly Phe Asp Pro
85 90 95


Arg Lys Ile Ala Asp Val Met Asn Arg Ile Ala Gly Val Thr Met Gln
100 105 110


Glu Glu Arg Tyr Gln His Gly Leu Lys Ser Ser Trp Phe Leu His Asp
115 120 125


Ala Asp Ala Ala Ala Leu Gly Glu Ile Glu Ala Ala Leu Leu Ala Ala
130 135 140


Asp Ile Asp Ala Arg Ile Val Tyr Ser Ser Asp Arg Asp Leu Asp Ile
145 150 155 160


Leu Pro Lys Ala Ala Asp Lys Gly Ala Ala Leu Ala Trp Leu Cys Gly
165 170 175


Gln Leu Arg Ile Gly Leu Asp Glu Ser Val Val Ser Gly Asp Thr Gly
180 185 190


Asn Asp Arg Ala Met Phe Glu Leu Lys Thr Ile Arg Gly Val Ile Val
195 200 205


Gly Asn Ala Leu Pro Glu Leu Val Ser Leu Ala His Gln Asp Asn Arg
210 215 220


Phe Phe His Ser Thr Ala Lys Glu Ala Asp Gly Val Ile Glu Gly Leu
225 230 235 240


Arg His Trp Gly Leu Asn Pro Arg
245


<210> 88
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR primer


<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(12)
<223> BamHI restriction site

<400> 88
tctcagggat cccataccat gattaaaaaa agtac 35


<210> 89
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR primer


<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(12)
<223> SacI restriction site

<400> 89
ggccgtgagc tcagaaccag gtttcc 26


<210> 90
<211> 1546
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR product


<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(12)
<223> BamHI restriction site

<220>
<221> misc_feature
<222> (1535)..(1540)
<223> SacI restriction site

<400> 90
tctcagggat cccataccat gattaaaaaa agtacgcttg cccttaccct tggcttaatg 60

gccggtactc ccgccgcctt tgccgacagc aatatgtcca gcattgaggc gcgtctcgcc 120

gcgctggaac aacgtcttca ggcggctgaa cagcgcgcca gcgcggcgga aacccgcgct 180

gaagccgcag agcgtcaggc acaggcgctt gccgcgcaac aaaaagcgca gccgccggtt 240

cagcctgtcg ccgcgcaacc tgcgccgcag cccgccacgc aaacggcgga taacagcggg 300

tttgaattcc acggctacgc ccgctcgggc ctgctgatga acgattccgc cgcgaaaacg 360

cagggcggcc cgtccttcac gccagcgggt gaaaccggcg gtcacgtcgg gcgtctcggc 420

aatgagccgg acacttacct tgaaatgaac ctagagcaca aacagacgct cgcgaacggc 480

gccaccacgc gctttaaagt gatggtcgct gacggtcagc gcagctataa cgactggacg 540

gcctccacca gcgatctcaa cgtgcgccag gcgtttaccg aactcggcca cctgccgacc 600

ttcatcggcg cgtttaaaga tgccaccgtc tgggccggta aacgcttcga tcgtgataac 660

ttcgatatcc actggattga ctccgacgtg gtgttcctcg ccggtacggg tgcgggtatc 720

tacgacatgc gctggagcga taacgcccgc agtaacttct cgctgtatgg ccgcaccttc 780

ggcgatatcg aaaacagcga aaacaccgcc cagaactata tccttacgct taataactac 840

gtcgggccgg tacagctgat ggtgagcggg atgcgcgcca aagataacga agaccgcgtg 900

gatatcgagg gtaaccgcgt gaaaaaagac gcggcggaag atggcgtgca tgcgctgctc 960

ggcctgcata acgacagctt ctacggtctg agcgacggct cctcgaaaac cgcactgctg 1020

tatggacatg gcctgggcgc ggaagtgaaa tccatcggct ccgatggcgc gctgctgccg 1080

caggccgata cctggcgtct cgcgacctac ggcatgacac cgctcggcgg cggctggcat 1140

atcgcaccgg cggtgctggc gcagagcagt aaagatcgct acgtcaaagg cgacagctac 1200

cagtgggcga ccgccaacct gcgcctcatt caggagatta accagaactt tgagctgcag 1260

tatgagggca gctatcagta catggatctg cgcccgaaag gttacaacga ccgcaacgcg 1320

gtcagcggca acttctataa gctgaccttt gcgccgacgc tgaaagcggg cgacgtgggc 1380

gaattcctca agcgtcctga actgcgcctg ttcgccacct ggatggactg ggatcatcgc 1440

ctggataact acgccagcaa tgatgccttt ggcagcaccg gctttaccgc cggcggtgaa 1500

tggaacttcg gcgtacagat ggaaacctgg ttctgagctc acggcc 1546


<210> 91
<211> 13332
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> artifical plasmid pLybAL32 containing scrY

<400> 91
aggcccagtc tttcgactga gcctttcgtt ttatttgatg cctggcagtt ccctactctc 60

gcatggggag accccacact accatcggcg ctacggcgtt tcacttctga gttcggcatg 120

gggtcaggtg ggaccaccgc gctactgccg ccaggcaaat tctgttttat cagaccgctt 180

ctgcgttctg atttaatctg tatcaggctg aaaatcttct ctcatccgcc aaaacagcca 240

agcttgcatg cctgcaggtc gactctagat ggctacgagg gcagacagta agtggattta 300

ccataatccc ttaattgtac gcaccgctaa aacgcgttca gcgcgatcac ggcagcagac 360

aggtaaaaat ggcaacaaac caccctaaaa actgcgcgat cgcgcctgat aaattttaac 420

cgtatgaata cctatgcaac cagagggtac aggccacatt acccccactt aatccactga 480

agctgccatt tttcatggtt tcaccatccc agcgaagggc catgcatgca tcgaaattaa 540

tacgacgaaa ttaatacgac tcactatagg gcaattgtta tcagctatgc gccgaccaga 600

acaccttgcc gatcagccaa acgtctcttc aggccactga ctagcgataa ctttccccac 660

aacggaacaa ctctcactgc atgggatcat tgggtactgt gggtttagtg gttgtaaaaa 720

cacctgaccg ctatccctga tcagtttctt gaaggtaaac tcatcacccc caagtctggc 780

tatgcagaaa tcacctggct caacagcctg ctcagggtca acgagaatta acattccgtc 840

aggaaagctt ggcttggagc ctgttggtgc ggtcatggaa ttaccttcaa cctcaagcca 900

gaatgcagaa tcactggctt tcttggttgt gcttacccat ctctccgcat cacctttggt 960

aaaggttcta agcttaggtg agaacatccc tgcctgaaca tgagaaaaaa cagggtactc 1020

atactcactt ctaagtgacg gctgcatact aaccgcttca tacatctcgt agatttctct 1080

ggcgattgaa gggctaaatt cttcaacgct aactttgaga atttttgtaa gcaatgcggc 1140

gttataagca tttaatgcat tgatgccatt aaataaagca ccaacgcctg actgccccat 1200

ccccatcttg tctgcgacag attcctggga taagccaagt tcatttttct ttttttcata 1260

aattgcttta aggcgacgtg cgtcctcaag ctgctcttgt gttaatggtt tcttttttgt 1320

gctcatacgt taaatctatc accgcaaggg ataaatatct aacaccgtgc gtgttgacta 1380

ttttacctct ggcggtgata atggttgcat cttaagaagg aggatcccat accatgatta 1440

aaaaaagtac gcttgccctt acccttggct taatggccgg tactcccgcc gcctttgccg 1500

acagcaatat gtccagcatt gaggcgcgtc tcgccgcgct ggaacaacgt cttcaggcgg 1560

ctgaacagcg cgccagcgcg gcggaaaccc gcgctgaagc cgcagagcgt caggcacagg 1620

cgcttgccgc gcaacaaaaa gcgcagccgc cggttcagcc tgtcgccgcg caacctgcgc 1680

cgcagcccgc cacgcaaacg gcggataaca gcgggtttga attccacggc tacgcccgct 1740

cgggcctgct gatgaacgat tccgccgcga aaacgcaggg cggcccgtcc ttcacgccag 1800

cgggtgaaac cggcggtcac gtcgggcgtc tcggcaatga gccggacact taccttgaaa 1860

tgaacctaga gcacaaacag acgctcgcga acggcgccac cacgcgcttt aaagtgatgg 1920

tcgctgacgg tcagcgcagc tataacgact ggacggcctc caccagcgat ctcaacgtgc 1980

gccaggcgtt taccgaactc ggccacctgc cgaccttcat cggcgcgttt aaagatgcca 2040

ccgtctgggc cggtaaacgc ttcgatcgtg ataacttcga tatccactgg attgactccg 2100

acgtggtgtt cctcgccggt acgggtgcgg gtatctacga catgcgctgg agcgataacg 2160

cccgcagtaa cttctcgctg tatggccgca ccttcggcga tatcgaaaac agcgaaaaca 2220

ccgcccagaa ctatatcctt acgcttaata actacgtcgg gccggtacag ctgatggtga 2280

gcgggatgcg cgccaaagat aacgaagacc gcgtggatat cgagggtaac cgcgtgaaaa 2340

aagacgcggc ggaagatggc gtgcatgcgc tgctcggcct gcataacgac agcttctacg 2400

gtctgagcga cggctcctcg aaaaccgcac tgctgtatgg acatggcctg ggcgcggaag 2460

tgaaatccat cggctccgat ggcgcgctgc tgccgcaggc cgatacctgg cgtctcgcga 2520

cctacggcat gacaccgctc ggcggcggct ggcatatcgc accggcggtg ctggcgcaga 2580

gcagtaaaga tcgctacgtc aaaggcgaca gctaccagtg ggcgaccgcc aacctgcgcc 2640

tcattcagga gattaaccag aactttgagc tgcagtatga gggcagctat cagtacatgg 2700

atctgcgccc gaaaggttac aacgaccgca acgcggtcag cggcaacttc tataagctga 2760

cctttgcgcc gacgctgaaa gcgggcgacg tgggcgaatt cctcaagcgt cctgaactgc 2820

gcctgttcgc cacctggatg gactgggatc atcgcctgga taactacgcc agcaatgatg 2880

cctttggcag caccggcttt accgccggcg gtgaatggaa cttcggcgta cagatggaaa 2940

cctggttctg agctcgaatt ggggcgtttt ctgtgaggct gactagcgcg tggcagctca 3000

aaatctctac attctgcaca ttcagaccca tggtctgctg cgagggcaga acttggaact 3060

ggggcgagat gccgacaccg gcgggcagac caagtacgtc ttagaactgg ctcaagccca 3120

agctaaatcc ccacaagtcc aacaagtcga catcatcacc cgccaaatca ccgacccccg 3180

cgtcagtgtt ggttacagtc aggcgatcga accctttgcg cccaaaggtc ggattgtccg 3240

tttgcctttt ggccccaaac gctacctccg taaagagctg ctttggcccc atctctacac 3300

ctttgcggat gcaattctcc aatatctggc tcagcaaaag cgcaccccga cttggattca 3360

ggcccactat gctgatgctg gccaagtggg atcactgctg agtcgctggt tgaatgtacc 3420

gctaattttc acagggcatt ctctggggcg gatcaagcta aaaaagctgt tggagcaaga 3480

ctggccgctt gaggaaattg aagcgcaatt caatattcaa cagcgaattg atgcggagga 3540

gatgacgctc actcatgctg actggattgt cgccagcact cagcaggaag tggaggagca 3600

ataccgcgtt tacgatcgct acaacccaga gcgcaagctt gtcattccac cgggtgtcga 3660

taccgatcgc ttcaggtttc agcccttggg cgatcgcggt gttgttctcc aacaggaact 3720

gagccgcttt ctgcgcgacc cagaaaaacc tcaaattctc tgcctctgtc gccccgcacc 3780

tcgcaaaaat gtaccggcgc tggtgcgagc ctttggcgaa catccttggc tgcgcaaaaa 3840

agccaacctt gtcttagtac tgggcagccg ccaagacatc aaccagatgg atcgcggcag 3900

tcggcaggtg ttccaagaga ttttccatct ggtcgatcgc tacgacctct acggcagcgt 3960

cgcctatccc aaacagcatc aggctgatga tgtgccggag ttctatcgcc tagcggctca 4020

ttccggcggg gtattcgtca atccggcgct gaccgaacct tttggtttga caattttgga 4080

ggcaggaagc tgcggcgtgc cggtggtggc aacccatgat ggcggccccc aggaaattct 4140

caaacactgt gatttcggca ctttagttga tgtcagccga cccgctaata tcgcgactgc 4200

actcgccacc ctgctgagcg atcgcgatct ttggcagtgc tatcaccgca atggcattga 4260

aaaagttccc gcccattaca gctgggatca acatgtcaat accctgtttg agcgcatgga 4320

aacggtggct ttgcctcgtc gtcgtgctgt cagtttcgta cggagtcgca aacgcttgat 4380

tgatgccaaa cgccttgtcg ttagtgacat cgacaacaca ctgttgggcg atcgtcaagg 4440

actcgagaat ttaatgacct atctcgatca gtatcgcgat cattttgcct ttggaattgc 4500

cacggggcgt cgcctagact ctgcccaaga agtcttgaaa gagtggggcg ttccttcgcc 4560

aaacttctgg gtgacttccg tcggcagcga gattcactat ggcaccgatg ctgaaccgga 4620

tatcagctgg gaaaagcata tcaatcgcaa ctggaatcct cagcgaattc gggcagtaat 4680

ggcacaacta ccctttcttg aactgcagcc ggaagaggat caaacaccct tcaaagtcag 4740

cttctttgtc cgcgatcgcc acgagactgt gctgcgagaa gtacggcaac atcttcgccg 4800

ccatcgcctg cggctgaagt caatctattc ccatcaggag tttcttgaca ttctgccgct 4860

agctgcctcg aaaggggatg cgattcgcca cctctcactc cgctggcgga ttcctcttga 4920

gaacattttg gtggcaggcg attctggtaa cgatgaggaa atgctcaagg gccataatct 4980

cggcgttgta gttggcaatt actcaccgga attggagcca ctgcgcagct acgagcgcgt 5040

ctattttgct gagggccact atgctaatgg cattctggaa gccttaaaac actatcgctt 5100

ttttgaggcg atcgcttaac cttttcagaa tgagacgttg atcggcacgt aagcgtgaga 5160

cgttgatcgg cacgtaagag gttccaactt tcaccataat gaaataagat cactaccggg 5220

cgtatttttt gagttatcga gattttcagg agctaaggaa gctaaaatgg agaaaaaaat 5280

cactggatat accaccgttg atatatccca atggcatcgt aaagaacatt ttgaggcatt 5340

tcagtcagtt gctcaatgta cctataacca gaccgttcag ctggatatta cggccttttt 5400

aaagaccgta aagaaaaata agcacaagtt ttatccggcc tttattcaca ttcttgcccg 5460

cctgatgaat gctcatccgg aattccgtat ggcaatgaaa gacggtgagc tggtgatatg 5520

ggatagtgtt cacccttgtt acaccgtttt ccatgagcaa actgaaacgt tttcatcgct 5580

ctggagtgaa taccacgacg atttccggca gtttctacac atatattcgc aagatgtggc 5640

gtgttacggt gaaaacctgg cctatttccc taaagggttt attgagaata tgtttttcgt 5700

ctcagccaat ccctgggtga gtttcaccag ttttgattta aacgtggcca atatggacaa 5760

cttcttcgcc cccgttttca ccatgggcaa atattatacg caaggcgaca aggtgctgat 5820

gccgctggcg attcaggttc atcatgccgt ttgtgatggc ttccatgtcg gcagaatgct 5880

taatgaatta caacagtact gcgatgagtg gcagggcggg gcgtaatttt tttaaggcag 5940

ttattggtgc ccttaaacgc ctggttgcta cgcctgaata agtgataata agcggatgaa 6000

tggcagaaat tcgatgataa gctgtcaaac acaaccacca tcaaacagga ttttcgcctg 6060

ctggggcaaa ccagcgtgga ccgcttgctg caactctctc agggccaggc ggtgaagggc 6120

aatcagctgt tgcccgtctc actggtgaaa agaaaaacca ccctggcgcc caatacgcaa 6180

accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga 6240

ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtaagt tagcgcgaat tgcaagctgg 6300

ccgacgcgct gggctacgtc ttgctggcgt tcgggagcag aagagcatac atctggaagc 6360

aaagccagga aagcggccta tggagctgtg cggcagcgct cagtaggcaa tttttcaaaa 6420

tattgttaag ccttttctga gcatggtatt tttcatggta ttaccaatta gcaggaaaat 6480

aagccattga atataaaaga taaaaatgtc ttgtttacaa tagagtgggg ggggtcagcc 6540

tgccgccttg ggccgggtga tgtcgtactt gcccgccgcg aactcggtta ccgtccagcc 6600

cagcgcgacc agctccggca acgcctcgcg cacccgcttg cggcgcttgc gcatggtcga 6660

accactggcc tctgacggcc agacatagcc gcacaaggta tctatggaag ccttgccggt 6720

tttgccgggg tcgatccagc cacacagccg ctggtgcagc aggcgggcgg tttcgctgtc 6780

cagcgcccgc acctcgtcca tgctgatgcg cacatgctgg ccgccaccca tgacggcctg 6840

cgcgatcaag gggttcaggg ccacgtacag gcgcccgtcc gcctcgtcgc tggcgtactc 6900

cgacagcagc cgaaacccct gccgcttgcg gccattctgg gcgatgatgg ataccttcca 6960

aaggcgctcg atgcagtcct gtatgtgctt gagcgcccca ccactatcga cctctgcccc 7020

gatttccttt gccagcgccc gatagctacc tttgaccaca tggcattcag cggtgacggc 7080

ctcccacttg ggttccagga acagccggag ctgccgtccg ccttcggtct tgggttccgg 7140

gccaagcact aggccattag gcccagccat ggccaccagc ccttgcagga tgcgcagatc 7200

atcagcgccc agcggctccg ggccgctgaa ctcgatccgc ttgccgtcgc cgtagtcata 7260

cgtcacgtcc agcttgctgc gcttgcgctc gccccgcttg agggcacgga acaggccggg 7320

ggccagacag tgcgccgggt cgtgccggac gtggctgagg ctgtgcttgt tcttaggctt 7380

caccacgggg cacccccttg ctcttgcgct gcctctccag cacggcgggc ttgagcaccc 7440

cgccgtcatg ccgcctgaac caccgatcag cgaacggtgc gccatagttg gccttgctca 7500

caccgaagcg gacgaagaac cggcgctggt cgtcgtccac accccattcc tcggcctcgg 7560

cgctggtcat gctcgacagg taggactgcc agcggatgtt atcgaccagt accgagctgc 7620

cccggctggc ctgctgctgg tcgcctgcgc ccatcatggc cgcgcccttg ctggcatggt 7680

gcaggaacac gatagagcac ccggtatcgg cggcgatggc ctccatgcga ccgatgacct 7740

gggccatggg gccgctggcg ttttcttcct cgatgtggaa ccggcgcagc gtgtccagca 7800

ccatcaggcg gcggccctcg gcggcgcgct tgaggccgtc gaaccactcc ggggccatga 7860

tgttgggcag gctgccgatc agcggctgga tcagcaggcc gtcagccacg gcttgccgtt 7920

cctcggcgct gaggtgcgcc ccaagggcgt gcaggcggtg atgaatggcg gtgggcgggt 7980

cttcggcggg caggtagatc accgggccgg tgggcagttc gcccacctcc agcagatccg 8040

gcccgcctgc aatctgtgcg gccagttgca gggccagcat ggatttaccg gcaccaccgg 8100

gcgacaccag cgccccgacc gtaccggcca ccatgttggg caaaacgtag tccagcggtg 8160

gcggcgctgc tgcgaacgcc tccagaatat tgataggctt atgggtagcc attgattgcc 8220

tcctttgcag gcagttggtg gttaggcgct ggcggggtca ctacccccgc cctgcgccgc 8280

tctgagttct tccaggcact cgcgcagcgc ctcgtattcg tcgtcggtca gccagaactt 8340

gcgctgacgc atccctttgg ccttcatgcg ctcggcatat cgcgcttggc gtacagcgtc 8400

agggctggcc agcaggtcgc cggtctgctt gtccttttgg tctttcatat cagtcaccga 8460

gaaacttgcc ggggccgaaa ggcttgtctt cgcggaacaa ggacaaggtg cagccgtcaa 8520

ggttaaggct ggccatatca gcgactgaaa agcggccagc ctcggccttg tttgacgtat 8580

aaccaaagcc accgggcaac caatagccct tgtcactttt gatcaggtag accgaccctg 8640

aagcgctttt ttcgtattcc ataaaacccc cttctgtgcg tgagtactca tagtataaca 8700

ggcgtgagta ccaacgcaag cactacatgc tgaaatctgg cccgcccctg tccatgcctc 8760

gctggcgggg tgccggtgcc cgtgccagct cggcccgcgc aagctggacg ctgggcagac 8820

ccatgacctt gctgacggtg cgctcgatgt aatccgcttc gtggccgggc ttgcgctctg 8880

ccagcgctgg gctggcctcg gccatggcct tgccgatttc ctcggcactg cggccccggc 8940

tggccagctt ctgcgcggcg ataaagtcgc acttgctgag gtcatgaccg aagcgcttga 9000

ccagcccggc catctcgctg cggtactcgt ccagcgccgt gcgccggtgg cggctaagct 9060

gccgctcggg cagttcgagg ctggccagcc tgcgggcctt ctcctgctgc cgctgggcct 9120

gctcgatctg ctggccagcc tgctgcacca gcgccgggcc agcggtggcg gtcttgccct 9180

tggattcacg cagcagcacc cacggctgat aaccggcgcg ggtggtgtgc ttgtccttgc 9240

ggttggtgaa gcccgccaag cggccatagt ggcggctgtc ggcgctggcc gggtcggcgt 9300

cgtactcgct ggccagcgtc cgggcaatct gcccccgaag ttcaccgcct gcggcgtcgg 9360

ccaccttgac ccatgcctga tagttcttcg ggctggtttc cactaccagg gcaggctccc 9420

ggccctcggc tttcatgtca tccaggtcaa actcgctgag gtcgtccacc agcaccagac 9480

catgccgctc ctgctcggcg ggcctgatat acacgtcatt gccctgggca ttcatccgct 9540

tgagccatgg cgtgttctgg agcacttcgg cggctgacca ttcccggttc atcatctggc 9600

cggtgggtgc gtccctgacg ccgatatcga agcgctcaca gcccatggcc ttgagctgtc 9660

ggcctatggc ctgcaaagtc ctgtcgttct tcatcgggcc accaagcgca gccagatcga 9720

gccgtcctcg gttgtcagtg gcgtcaggtc gagcaagagc aacgatgcga tcagcagcac 9780

caccgtaggc atcatggaag ccagcatcac ggttagccat agcttccagt gccacccccg 9840

cgacgcgctc cgggcgctct gcgcggcgct gctcacctcg gcggctacct cccgcaactc 9900

tttggccagc tccacccatg ccgcccctgt ctggcgctgg gctttcagcc actccgccgc 9960

ctgcgcctcg ctggcctgct tggtctggct catgacctgc cgggcttcgt cggccagtgt 10020

cgccatgctc tgggccagcg gttcgatctg ctccgctaac tcgttgatgc ctctggattt 10080

cttcactctg tcgattgcgt tcatggtcta ttgcctcccg gtattcctgt aagtcgatga 10140

tctgggcgtt ggcggtgtcg atgttcaggg ccacgtctgc ccggtcggtg cggatgcccc 10200

ggccttccat ctccaccacg ttcggcccca ggtgaacacc gggcaggcgc tcgatgccct 10260

gcgcctcaag tgttctgtgg tcaatgcggg cgtcgtggcc agcccgctct aatgcccggt 10320

tggcatggtc ggcccatgcc tcgcgggtct gctcaagcca tgccttgggc ttgagcgctt 10380

cggtcttctg tgccccgccc ttctccgggg tcttgccgtt gtaccgcttg aaccactgag 10440

cggcgggccg ctcgatgccg tcattgatcc gctcggagat catcaggtgg cagtgcgggt 10500

tctcgccgcc accggcatgg atggccagcg tatacggcag gcgctcggca ccggtcaggt 10560

gctgggcgaa ctcggacgcc agcgccttct gctggtcgag ggtcagctcg accggcaggg 10620

caaattcgac ctccttgaac agccgcccat tggcgcgttc atacaggtcg gcagcatccc 10680

agtagtcggc gggccgctcg acgaactccg gcatgtgccc ggattcggcg tgcaagactt 10740

catccatgtc gcgggcatac ttgccttcgc gctggatgta gtcggccttg gccctggccg 10800

attggccgcc cgacctgctg ccggttttcg ccgtaaggtg ataaatcgcc atgctgcctc 10860

gctgttgctt ttgcttttcg gctccatgca atggccctcg gagagcgcac cgcccgaagg 10920

gtggccgtta ggccagtttc tcgaagagaa accggtaagt gcgccctccc ctacaaagta 10980

gggtcgggat tgccgccgct gtgcctccat gatagcctac gagacagcac attaacaatg 11040

gggtgtcaag atggttaagg ggagcaacaa ggcggcggat cggctggcca agctcgaaga 11100

acaacgagcg cgaatcaatg ccgaaattca gcgggagcgg gcaagggaac agcagcaaga 11160

gcgcaagaac gaaacaaggc gcaaggtgct ggtgggggcc atgattttgg ccaaggtgaa 11220

cagcagcgag tggccggagg atcggctcat ggcggcaatg gatgcgtacc ttgaacgcga 11280

ccacgaccgc gccttgttcg gtctgccgcc acgccagaag gatgagccgg gctgaatgat 11340

cgaccgagac aggccctgcg gggctgcaca cgcgccccca cccttcgggt agggggaaag 11400

gccgctaaag cggctaaaag cgctccagcg tatttctgcg gggtttggtg tggggtttag 11460

cgggctttgc ccgcctttcc ccctgccgcg cagcggtggg gcggtgtgta gcctagcgca 11520

gcgaatagac cagctatccg gcctctggcc gggcatattg ggcaagggca gcagcgcccc 11580

acaagggcgc tgataaccgc gcctagtgga ttattcttag ataatcatgg atggattttt 11640

ccaacacccc gccagccccc gcccctgctg ggtttgcagg tttgggggcg tgacagttat 11700

tgcaggggtt cgtgacagtt attgcagggg ggcgtgacag ttattgcagg ggttcgtgac 11760

agttagtacg ggagtgacgg gcactggctg gcaatgtcta gcaacggcag gcatttcggc 11820

tgagggtaaa agaactttcc gctaagcgat agactgtatg taaacacagt attgcaagga 11880

cgcggaacat gcctcatgtg gcggccagga cggccagccg ggatcgggat actggtcgtt 11940

accagagcca ccgacccgag caaacccttc tctatcagat cgttgacgag tattacccgg 12000

cattcgctgc gcttatggca gagcagggaa aggaattgcc gggctatgtg caacgggaat 12060

ttgaagaatt tctccaatgc gggcggctgg agcatggctt tctacgggtt cgctgcgagt 12120

cttgccacgc cgagcacctg gtcgctttca gaaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 12180

ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt 12240

tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt 12300

accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt 12360

atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc 12420

cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa 12480

tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg 12540

tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt 12600

gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc 12660

agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt 12720

aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg 12780

gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac 12840

tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc 12900

gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt 12960

tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg 13020

aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag 13080

catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa 13140

acaaaagagt ttgtagaaac gcaaaaaggc catccgtcag gatggccttc tgcttaattt 13200

gatgcctggc agtttatggc gggcgtcctg cccgccaccc tccgggccgt tgcttcgcaa 13260

cgttcaaatc cgctcccggc ggatttgtcc tactcaggag agcgttcacc gacaaacaac 13320

agataaaacg aa 13332


<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR primer

<400> 92
gcagtaactt ctcgctgtat g 21


<210> 93
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR primer

<400> 93
gtgttttcgc tgttttcgat atc 23


<210> 94
<211> 1518
<212> DNA
<213> Enterobacter sakazakii

<400> 94
atgattaaaa aaagtacgct tgcccttacc cttggcttaa tggccggtac tcccgccgcc 60

tttgccgaca gcaatatgtc cagcattgag gcgcgtctcg ccgcgctgga acaacgtctt 120

caggcggctg aacagcgcgc cagcgcggcg gaaacccgcg ctgaagccgc agagcgtcag 180

gcacaggcgc ttgccgcgca acaaaaagcg cagccgccgg ttcagcctgt cgccgcgcaa 240

cctgcgccgc agcccgccac gcaaacggcg gataacagcg ggtttgaatt ccacggctac 300

gcccgctcgg gcctgctgat gaacgattcc gccgcgaaaa cgcagggcgg cccgtccttc 360

acgccagcgg gtgaaaccgg cggtcacgtc gggcgtctcg gcaatgagcc ggacacttac 420

cttgaaatga acctagagca caaacagacg ctcgcgaacg gcgccaccac gcgctttaaa 480

gtgatggtcg ctgacggtca gcgcagctat aacgactgga cggcctccac cagcgatctc 540

aacgtgcgcc aggcgtttac cgaactcggc cacctgccga ccttcatcgg cgcgtttaaa 600

gatgccaccg tctgggccgg taaacgcttc gatcgtgata acttcgatat ccactggatt 660

gactccgacg tggtgttcct cgccggtacg ggtgcgggta tctacgacat gcgctggagc 720

gataacgccc gcagtaactt ctcgctgtat ggccgcacct tcggcgatat cgaaaacagc 780

gaaaacaccg cccagaacta tatccttacg cttaataact acgtcgggcc ggtacagctg 840

atggtgagcg ggatgcgcgc caaagataac gaagaccgcg tggatatcga gggtaaccgc 900

gtgaaaaaag acgcggcgga agatggcgtg catgcgctgc tcggcctgca taacgacagc 960

ttctacggtc tgagcgacgg ctcctcgaaa accgcactgc tgtatggaca tggcctgggc 1020

gcggaagtga aatccatcgg ctccgatggc gcgctgctgc cgcaggccga tacctggcgt 1080

ctcgcgacct acggcatgac accgctcggc ggcggctggc atatcgcacc ggcggtgctg 1140

gcgcagagca gtaaagatcg ctacgtcaaa ggcgacagct accagtgggc gaccgccaac 1200

ctgcgcctca ttcaggagat taaccagaac tttgagctgc agtatgaggg cagctatcag 1260

tacatggatc tgcgcccgaa aggttacaac gaccgcaacg cggtcagcgg caacttctat 1320

aagctgacct ttgcgccgac gctgaaagcg ggcgacgtgg gcgaattcct caagcgtcct 1380

gaactgcgcc tgttcgccac ctggatggac tgggatcatc gcctggataa ctacgccagc 1440

aatgatgcct ttggcagcac cggctttacc gccggcggtg aatggaactt cggcgtacag 1500

atggaaacct ggttctga 1518


<210> 95
<211> 505
<212> PRT
<213> Enterobacter sakazakii

<400> 95

Met Ile Lys Lys Ser Thr Leu Ala Leu Thr Leu Gly Leu Met Ala Gly
1 5 10 15


Thr Pro Ala Ala Phe Ala Asp Ser Asn Met Ser Ser Ile Glu Ala Arg
20 25 30


Leu Ala Ala Leu Glu Gln Arg Leu Gln Ala Ala Glu Gln Arg Ala Ser
35 40 45


Ala Ala Glu Thr Arg Ala Glu Ala Ala Glu Arg Gln Ala Gln Ala Leu
50 55 60


Ala Ala Gln Gln Lys Ala Gln Pro Pro Val Gln Pro Val Ala Ala Gln
65 70 75 80


Pro Ala Pro Gln Pro Ala Thr Gln Thr Ala Asp Asn Ser Gly Phe Glu
85 90 95


Phe His Gly Tyr Ala Arg Ser Gly Leu Leu Met Asn Asp Ser Ala Ala
100 105 110


Lys Thr Gln Gly Gly Pro Ser Phe Thr Pro Ala Gly Glu Thr Gly Gly
115 120 125


His Val Gly Arg Leu Gly Asn Glu Pro Asp Thr Tyr Leu Glu Met Asn
130 135 140


Leu Glu His Lys Gln Thr Leu Ala Asn Gly Ala Thr Thr Arg Phe Lys
145 150 155 160


Val Met Val Ala Asp Gly Gln Arg Ser Tyr Asn Asp Trp Thr Ala Ser
165 170 175


Thr Ser Asp Leu Asn Val Arg Gln Ala Phe Thr Glu Leu Gly His Leu
180 185 190


Pro Thr Phe Ile Gly Ala Phe Lys Asp Ala Thr Val Trp Ala Gly Lys
195 200 205


Arg Phe Asp Arg Asp Asn Phe Asp Ile His Trp Ile Asp Ser Asp Val
210 215 220


Val Phe Leu Ala Gly Thr Gly Ala Gly Ile Tyr Asp Met Arg Trp Ser
225 230 235 240


Asp Asn Ala Arg Ser Asn Phe Ser Leu Tyr Gly Arg Thr Phe Gly Asp
245 250 255


Ile Glu Asn Ser Glu Asn Thr Ala Gln Asn Tyr Ile Leu Thr Leu Asn
260 265 270


Asn Tyr Val Gly Pro Val Gln Leu Met Val Ser Gly Met Arg Ala Lys
275 280 285


Asp Asn Glu Asp Arg Val Asp Ile Glu Gly Asn Arg Val Lys Lys Asp
290 295 300


Ala Ala Glu Asp Gly Val His Ala Leu Leu Gly Leu His Asn Asp Ser
305 310 315 320


Phe Tyr Gly Leu Ser Asp Gly Ser Ser Lys Thr Ala Leu Leu Tyr Gly
325 330 335


His Gly Leu Gly Ala Glu Val Lys Ser Ile Gly Ser Asp Gly Ala Leu
340 345 350


Leu Pro Gln Ala Asp Thr Trp Arg Leu Ala Thr Tyr Gly Met Thr Pro
355 360 365


Leu Gly Gly Gly Trp His Ile Ala Pro Ala Val Leu Ala Gln Ser Ser
370 375 380


Lys Asp Arg Tyr Val Lys Gly Asp Ser Tyr Gln Trp Ala Thr Ala Asn
385 390 395 400


Leu Arg Leu Ile Gln Glu Ile Asn Gln Asn Phe Glu Leu Gln Tyr Glu
405 410 415


Gly Ser Tyr Gln Tyr Met Asp Leu Arg Pro Lys Gly Tyr Asn Asp Arg
420 425 430


Asn Ala Val Ser Gly Asn Phe Tyr Lys Leu Thr Phe Ala Pro Thr Leu
435 440 445


Lys Ala Gly Asp Val Gly Glu Phe Leu Lys Arg Pro Glu Leu Arg Leu
450 455 460


Phe Ala Thr Trp Met Asp Trp Asp His Arg Leu Asp Asn Tyr Ala Ser
465 470 475 480


Asn Asp Ala Phe Gly Ser Thr Gly Phe Thr Ala Gly Gly Glu Trp Asn
485 490 495


Phe Gly Val Gln Met Glu Thr Trp Phe
500 505


<210> 96
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR primer

<400> 96
ccacaatgga ctgccagccg tcaaaggatg 30


<210> 97
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR primer

<400> 97
gcccaactgg tcacggacat cgtcgataac 30


<210> 98
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR primer

<400> 98
tgcaatggct ccaggaagcc cgatcgatg 29


<210> 99
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR primer

<400> 99
ggcagcatta cggctcagac cttggtcatg 30


<210> 100
<211> 1246
<212> DNA
<213> Synechocystis PCC6803

<400> 100
ccacaatgga ctgccagccg tcaaaggatg gttgtttgct cataatgctt gcctgtctgt 60

cgttgaactt gggggaaatc cctgcccaaa gtatggcaga aaacctttcc cttcccaatg 120

ccccaacttc cggtaacccg atctgagcta cagtggagtt ccgcggtgaa ttgttaccga 180

cggtgagacc acgtcctaac ttttagccca tttttcggtt ccccaacggc caagattaac 240

aaaattaaat tttagatatt aacttttaag ttttcccatg gcttctcaat tacgtgttta 300

tgtgccggag catcctctaa ttaagcattg gttgggggta gctagggatg aaaacacgcc 360

gccggttttg tttaaaactg ccatggggga attgggacgt tggttgacct atgaggccgc 420

tcgttattgg ttgccgacgg tggatacgga agtgaaaact cccctggcga tcgccaaggc 480

cagtcttatt gacccccaaa cgccctttgt cattgtgccc attttgcggg cggggttggc 540

tctggtggaa ggggcccagg ggttgttgcc cctggcaaaa atttaccatc tgggtttagt 600

gcgcaatgaa actaccctgg aacctagtct gtatctgaac aagttgccgg agcggtttgc 660

ccccggtacc catcttttgt tgctagatcc catgttggct acgggtaata ccatcatggc 720

tgctttggat ttgctgatgg cccgggacat tgatgccaat ttaatccgtt tggtctccgt 780

ggtggccgcc cccactgccc tgcaaaaatt aagtaatgcc catcccaatt tgaccatcta 840

caccgccatg attgacgaac aactcaatga ccggggttac attgtgcccg gcctagggga 900

tgcaggcgat cgttgctttg gtacttgata acaccattaa actagtgatc aaataattac 960

aaattcaccc ccaaacgtta acaacaggag taaagtcatg gctcaaaaag ataacttcgc 1020

cggaggattt ttattaggta cggtcattgg tggcgtagtg gggggaattt tgggttctgt 1080

cctggccaat cgagctgcta cccaaagccc cgaccgggaa aaattagaca ctgagggggt 1140

aggaaatctc gatagtgagg aaaatattga gttggctcgc cgtcgcctgg aagacaaaat 1200

tgcccaactt aatttggtta tcgacgatgt ccgtgaccag ttgggc 1246


<210> 101
<211> 1281
<212> DNA
<213> Synechococcus PCC7942

<400> 101
tgcaatggct ccaggaagcc cgatcgatgg gatttcaagt cgctttagat gattttggga 60

cgggttattc cagccttggt tacctcaagc gtttgcccat caatgctctc aaaattgatc 120

gcagctttat tcgcgatctg ccgcacgacc atgacgatca agcgatcgtg caggcgattg 180

ttgcaatggc caaggtcttg aaacttcgca cgatcgcaga aggcgtagaa cgcctcgagc 240

aagccgcctt cttagaagcg attggttgtg atgctgtgca agggttcttc tatggcccac 300

cactgcccga agcagaagcg cttgccttcc tgcaccgttc cgcttcccct ggggtctgaa 360

cgttaaaatc aggagctgtc ttctgctgat tggcatggct cctcaactgc gtatcttcgt 420

gccgccccat cccttaattc ggcactggct gggcattgcc cgcgatcgcc agacgccgac 480

gcctctgttt cgcaccgcga tcgcagagct gggccgctgg ctcgcctatg aggctgtgcg 540

ggaatggcta ccaacgattc cagcggcggt gcaaactcct cttgcagaaa ccccagcgga 600

gttcgtcgat ttttcgcaac ccttggcgat cgtgccgatt ctgcgcgcag gtctgggttt 660

agtggagtct gtccaacagg ttttgccgac tgcccgcatt tttcacgtgg gtctcaagcg 720

ggatgaagtc agtcttgaac cgcgctgcta cctcaatcac ctgccagagc aacttgaagt 780

gaacagtcgc gttctggttc tcgacccgat gctggcgaca ggtggctcgc tgctctatac 840

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<213> Artificial Sequence

<220>
<223> plasmid pLybAL3f containing Synechocystis upp gene

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<220>
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gcggccgcaa ggggttcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 60

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gcgactactg acagatgagg ggcgcgatcc ttgacacttg aggggcagag tgctgacaga 4080

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atatttataa accttgtttt taaccagggc tgcgccctgt gcgcgtgacc gcgcacgccg 4260

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cacgatccca ctcgtgttgt cggtctgatt atcggtctgg gaccacggtc ccacttgtat 8700

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taacttaatg tttttattta aaataccctc tgaaaagaaa ggaaacgaca ggtgctgaaa 9300

gcgagctttt tggcctctgt cgtttccttt ctctgttttt gtccgtggaa tgaacaatgg 9360

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<210> 104
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR primer

<400> 104
gtaatacgac tcactatagg gc 22


<210> 105
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR primer

<400> 105
cacacaggaa acagctatga ccat 24


<210> 106
<211> 5641
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> plasmid pLybAL4f containing Synechocystis upp gene

<400> 106
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cctgcaagcg gtaacgaaaa cgatttgaat atgccttcag gaacaataga aatcttcgtg 3420

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ggaaacagcg gttatcaatc acaagaaacg taaaaatagc ccgcgaatcg tccagtcaaa 4620

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cgttgaccag atcagaaaat ctgatggcac cctacaggaa catgacggta tctgcgagat 4740

ccatgttgct aaatatgctg aaatattcgg attgacctct gcggaagcca gtaaggatat 4800

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gtggttcgtc acatttgttc tgacctactg agggtaattt gtcacagttt tgctgtttcc 5400

ttcagcctgc atggattttc tcatactttt tgaactgtaa tttttaagga agccaaattt 5460

gagggcagtt tgtcacagtt gatttccttc tctttccctt cgtcatgtga cctgatatcg 5520

ggggttagtt cgtcatcatt gatgagggtt gattatcaca gtttattact ctgaattggc 5580

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a 5641


<210> 107
<211> 5218
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> plasmid pLybAL9f containing partially deleted Synechocystis upp
gene

<400> 107
tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc 60

gccattcgcc attcagctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct 120

attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg 180

gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata 240

gggcgaattc gagctcggta cccggggatc ccacgcccaa ctggtcacgg acatcgtcga 300

taaccaaatt aagttgggca attttgtctt ccaggcgacg gcgagccaac tcaatatttt 360

cctcactatc gagatttcct accccctcag tgtctaattt ttcccggtcg gggctttggg 420

tagcagctcg attggccagg acagaaccca aaattccccc cactacgcca ccaatgaccg 480

tacctaataa aaatcctccg gcgaagttat ctttttgagc catgacttta ctcctgttgt 540

taacgtttgg gggtgaattt gtaattattt gatcactagt ttaatggtgt tatcaagtac 600

caaagcaacg atcgcctgca tcccctagcg ccaggggagt tttcacttcc gtatccaccg 660

tcggcaacca ataacgagcg gcctcatagg tcaaccaacg tcccaattcc cccatggcag 720

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atctaaaatt taattttgtt aatcttggcc gttggggaac cgaaaaatgg gctaaaagtt 900

aggacgtggt ctcaccgtcg gtaacaattc accgcggaac tccactgtag ctcagatcgg 960

gttaccggaa gttggggcat tgggaaggga aaggttttct gccatacttt gggcagggat 1020

ttcccccaag ttcaacgaca gacaggcaag cattatgagc aaacaaccat cctttgacgg 1080

ctggcagtcc attgtgggtg ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aagcttgagt 1140

attctatagt ctcacctaaa tagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga 1200

aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc 1260

tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 1320

cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcga accccttgcg 1380

gccgcccggg ccgtcgacca attctcatgt ttgacagctt atcatcgaat ttctgccatt 1440

catccgctta ttatcactta ttcaggcgta gcaaccaggc gtttaagggc accaataact 1500

gccttaaaaa aattacgccc cgccctgcca ctcatcgcag tactgttgta attcattaag 1560

cattctgccg acatggaagc catcacaaac ggcatgatga acctgaatcg ccagcggcat 1620

cagcaccttg tcgccttgcg tataatattt gcccatggtg aaaacggggg cgaagaagtt 1680

gtccatattg gccacgttta aatcaaaact ggtgaaactc acccagggat tggctgagac 1740

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ggcaagaatg tgaataaagg ccggataaaa cttgtgctta tttttcttta cggtctttaa 2040

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tgcctcaaaa tgttctttac gatgccattg ggatatatca acggtggtat atccagtgat 2160

ttttttctcc attttagctt ccttagctcc tgaaaatctc gataactcaa aaaatacgcc 2220

cggtagtgat cttatttcat tatggtgaaa gttggaacct cttacgtgcc gatcaacgtc 2280

tcattttcgc caaaagttgg cccagggctt cccggtatca acagggacac caggatttat 2340

ttattctgcg aagtgatctt ccgtcacagg tatttattcg cgataagctc atggagcggc 2400

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tcaggacctg gattggggag gcggttgccg ccgctgctgc tgacggtgtg acgttctctg 2520

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cacaaagtta tccctgctta ttgactcttt tttatttagt gtgacaatct aaaaacttgt 4500

cacacttcac atggatctgt catggcggaa acagcggtta tcaatcacaa gaaacgtaaa 4560

aatagcccgc gaatcgtcca gtcaaacgac ctcactgagg cggcatatag tctctcccgg 4620

gatcaaaaac gtatgctgta tctgttcgtt gaccagatca gaaaatctga tggcacccta 4680

caggaacatg acggtatctg cgagatccat gttgctaaat atgctgaaat attcggattg 4740

acctctgcgg aagccagtaa ggatatacgg caggcattga agagtttcgc ggggaaggaa 4800

gtggtttttt atcgccctga agaggatgcc ggcgatgaaa aaggctatga atcttttcct 4860

tggtttatca aacgtgcgca cagtccatcc agagggcttt acagtgtaca tatcaaccca 4920

tatctcattc ccttctttat cgggttacag aaccggttta cgcagtttcg gcttagtgaa 4980

acaaaagaaa tcaccaatcc gtatgccatg cgtttatacg aatccctgtg tcagtatcgt 5040

aagccggatg gctcaggcat cgtctctctg aaaatcgact ggatcataga gcgttaccag 5100

ctgcctcaaa gttaccagcg tatgcctgac ttccgccgcc gcttcctgca ggtctgtgtt 5160

aatgagatca acagcagaac tccaatgcgc ctctcataca ttgagaaaaa gaaaggccgc 5220

cagacgactc atatcgtatt ttccttccgc gatatcactt ccatgacgac aggatagtct 5280

gagggttatc tgtcacagat ttgagggtgg ttcgtcacat ttgttctgac ctactgaggg 5340

taatttgtca cagttttgct gtttccttca gcctgcatgg attttctcat actttttgaa 5400

ctgtaatttt taaggaagcc aaatttgagg gcagtttgtc acagttgatt tccttctctt 5460

tcccttcgtc atgtgacctg atatcggggg ttagttcgtc atcattgatg agggttgatt 5520

atcacagttt attactctga attggctatc cgcgtgtgta cctctacctg gagtttttcc 5580

cacggtggat atttcttctt gcgctgagcg taagagctat ctgacagaac agttcttctt 5640

tgcttcctcg ccagttcgct cgctatgctc ggttacacgg ctgcggcgag cgctagtgat 5700

aataagtgac tgaggtatgt gctcttctta t 5731


<210> 111
<211> 651
<212> DNA
<213> Synechocystis PCC6803

<400> 111
atggcttctc aattacgtgt ttatgtgccg gagcatcctc taattaagca ttggttgggg 60

gtagctaggg atgaaaacac gccgccggtt ttgtttaaaa ctgccatggg ggaattggga 120

cgttggttga cctatgaggc cgctcgttat tggttgccga cggtggatac ggaagtgaaa 180

actcccctgg cgatcgccaa ggccagtctt attgaccccc aaacgccctt tgtcattgtg 240

cccattttgc gggcggggtt ggctctggtg gaaggggccc aggggttgtt gcccctggca 300

aaaatttacc atctgggttt agtgcgcaat gaaactaccc tggaacctag tctgtatctg 360

aacaagttgc cggagcggtt tgcccccggt acccatcttt tgttgctaga tcccatgttg 420

gctacgggta ataccatcat ggctgctttg gatttgctga tggcccggga cattgatgcc 480

aatttaatcc gtttggtctc cgtggtggcc gcccccactg ccctgcaaaa attaagtaat 540

gcccatccca atttgaccat ctacaccgcc atgattgacg aacaactcaa tgaccggggt 600

tacattgtgc ccggcctagg ggatgcaggc gatcgttgct ttggtacttg a 651


<210> 112
<211> 216
<212> PRT
<213> Synechocystis PCC6803

<400> 112

Met Ala Ser Gln Leu Arg Val Tyr Val Pro Glu His Pro Leu Ile Lys
1 5 10 15


His Trp Leu Gly Val Ala Arg Asp Glu Asn Thr Pro Pro Val Leu Phe
20 25 30


Lys Thr Ala Met Gly Glu Leu Gly Arg Trp Leu Thr Tyr Glu Ala Ala
35 40 45


Arg Tyr Trp Leu Pro Thr Val Asp Thr Glu Val Lys Thr Pro Leu Ala
50 55 60


Ile Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Pro Gln Thr Pro Phe Val Ile Val
65 70 75 80


Pro Ile Leu Arg Ala Gly Leu Ala Leu Val Glu Gly Ala Gln Gly Leu
85 90 95


Leu Pro Leu Ala Lys Ile Tyr His Leu Gly Leu Val Arg Asn Glu Thr
100 105 110


Thr Leu Glu Pro Ser Leu Tyr Leu Asn Lys Leu Pro Glu Arg Phe Ala
115 120 125


Pro Gly Thr His Leu Leu Leu Leu Asp Pro Met Leu Ala Thr Gly Asn
130 135 140


Thr Ile Met Ala Ala Leu Asp Leu Leu Met Ala Arg Asp Ile Asp Ala
145 150 155 160


Asn Leu Ile Arg Leu Val Ser Val Val Ala Ala Pro Thr Ala Leu Gln
165 170 175


Lys Leu Ser Asn Ala His Pro Asn Leu Thr Ile Tyr Thr Ala Met Ile
180 185 190


Asp Glu Gln Leu Asn Asp Arg Gly Tyr Ile Val Pro Gly Leu Gly Asp
195 200 205


Ala Gly Asp Arg Cys Phe Gly Thr
210 215


<210> 113
<211> 654
<212> DNA
<213> Synechococcus PCC7942

<400> 113
atggctcctc aactgcgtat cttcgtgccg ccccatccct taattcggca ctggctgggc 60

attgcccgcg atcgccagac gccgacgcct ctgtttcgca ccgcgatcgc agagctgggc 120

cgctggctcg cctatgaggc tgtgcgggaa tggctaccaa cgattccagc ggcggtgcaa 180

actcctcttg cagaaacccc agcggagttc gtcgattttt cgcaaccctt ggcgatcgtg 240

ccgattctgc gcgcaggtct gggtttagtg gagtctgtcc aacaggtttt gccgactgcc 300

cgcatttttc acgtgggtct caagcgggat gaagtcagtc ttgaaccgcg ctgctacctc 360

aatcacctgc cagagcaact tgaagtgaac agtcgcgttc tggttctcga cccgatgctg 420

gcgacaggtg gctcgctgct ctataccctt gatttgctgc gcgatcgcgg tgtctctgct 480

gagcaagtgc gggtgctttc aattgtggct gccccgccag cgctacaaaa actcagtcaa 540

gcctacccgg cgttgacgat ttacagcgcc atcattgatg agcagctgaa cgacaaaggc 600

tttatcgtgc cggggctggg ggatgctggc gatcgcctgt ttggtactcc ttga 654


<210> 114
<211> 217
<212> PRT
<213> Synechococcus PCC7942

<400> 114

Met Ala Pro Gln Leu Arg Ile Phe Val Pro Pro His Pro Leu Ile Arg
1 5 10 15


His Trp Leu Gly Ile Ala Arg Asp Arg Gln Thr Pro Thr Pro Leu Phe
20 25 30


Arg Thr Ala Ile Ala Glu Leu Gly Arg Trp Leu Ala Tyr Glu Ala Val
35 40 45


Arg Glu Trp Leu Pro Thr Ile Pro Ala Ala Val Gln Thr Pro Leu Ala
50 55 60


Glu Thr Pro Ala Glu Phe Val Asp Phe Ser Gln Pro Leu Ala Ile Val
65 70 75 80


Pro Ile Leu Arg Ala Gly Leu Gly Leu Val Glu Ser Val Gln Gln Val
85 90 95


Leu Pro Thr Ala Arg Ile Phe His Val Gly Leu Lys Arg Asp Glu Val
100 105 110


Ser Leu Glu Pro Arg Cys Tyr Leu Asn His Leu Pro Glu Gln Leu Glu
115 120 125


Val Asn Ser Arg Val Leu Val Leu Asp Pro Met Leu Ala Thr Gly Gly
130 135 140


Ser Leu Leu Tyr Thr Leu Asp Leu Leu Arg Asp Arg Gly Val Ser Ala
145 150 155 160


Glu Gln Val Arg Val Leu Ser Ile Val Ala Ala Pro Pro Ala Leu Gln
165 170 175


Lys Leu Ser Gln Ala Tyr Pro Ala Leu Thr Ile Tyr Ser Ala Ile Ile
180 185 190


Asp Glu Gln Leu Asn Asp Lys Gly Phe Ile Val Pro Gly Leu Gly Asp
195 200 205


Ala Gly Asp Arg Leu Phe Gly Thr Pro
210 215


<210> 115
<211> 2184
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR product


<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(12)
<223> AflI restriction site

<220>
<221> misc_feature
<222> (2173)..(2178)
<223> NheI restriction site

<400> 115
ttgcatctta agaaggagga tccatatgat cttgatggaa cgctggcgga aatcaaaccg 60

catcccgatc aggtcgtcgt gcctgacaat attctgcaag gactacagct actggcaacc 120

gcaagtgatg gtgcattggc attgatatca gggcgctcaa tggtggagct tgacgcactg 180

gcaaaacctt atcgcttccc gttagcgggc gtgcatgggg cggagcgccg tgacatcaat 240

ggtaaaacac atatcgttca tctgccggat gcgattgcgc gtgatattag cgtgcaactg 300

catacagtca tcgctcagta tcccggcgcg gagctggagg cgaaagggat ggcttttgcg 360

ctgcattatc gtcaggctcc gcagcatgaa gacgcattaa tgacattagc gcaacgtatt 420

actcagatct ggccacaaat ggcgttacag cagggaaagt gtgttgtcga gatcaaaccg 480

agaggtacca gtaaaggtga ggcaattgca gcttttatgc aggaagctcc ctttatcggg 540

cgaacgcccg tatttctggg cgatgattta accgatgaat ctggcttcgc agtcgttaac 600

cgactgggcg gaatgtcagt aaaaattggc acaggtgcaa ctcaggcatc atggcgactg 660

gcgggtgtgc cggatgtctg gagctggctt gaaatgataa ccaccgcatt acaacaaaaa 720

agagaaaata acaggagtga tgactatgag tcgtttagtc gtagtatcta accggattgc 780

accaccagac gagcacgccg ccagtgccgg tggccttgcc gttggcatac tgggggcact 840

gaaagccgca ggcggactgt ggtttggctg gagtggtgaa acagggaatg aggatcagcc 900

gctaaaaaag gtgaaaaaag gtaacattac gtgggcctct tttaacctca gcgaacagga 960

ccttgacgaa tactacaacc aattctccaa tgccgttctc tggcccgctt ttcattatcg 1020

gctcgatctg gtgcaatttc agcgtcctgc ctgggacggc tatctacgcg taaatgcgtt 1080

gctggcagat aaattactgc cgctgttgca agacgatgac attatctgga tccacgatta 1140

tcacctgttg ccatttgcgc atgaattacg caaacgggga gtgaataatc gcattggttt 1200

ctttctgcat attcctttcc cgacaccgga aatcttcaac gcgctgccga catatgacac 1260

cttgcttgaa cagctttgtg attatgattt gctgggtttc cagacagaaa acgatcgtct 1320

ggcgttcctg gattgtcttt ctaacctgac ccgcgtcacg acacgtagcg caaaaagcca 1380

tacagcctgg ggcaaagcat ttcgaacaga agtctacccg atcggcattg aaccgaaaga 1440

aatagccaaa caggctgccg ggccactgcc gccaaaactg gcgcaactta aagcggaact 1500

gaaaaacgta caaaatatct tttctgtcga acggctggat tattccaaag gtttgccaga 1560

gcgttttctc gcctatgaag cgttgctgga aaaatatccg cagcatcatg gtaaaattcg 1620

ttatacccag attgcaccaa cgtcgcgtgg tgatgtgcaa gcctatcagg atattcgtca 1680

tcagctcgaa aatgaagctg gacgaattaa tggtaaatac gggcaattag gctggacgcc 1740

gctttattat ttgaatcagc attttgaccg taaattactg atgaaaatat tccgctactc 1800

tgacgtgggc ttagtgacgc cactgcgtga cgggatgaac ctggtagcaa aagagtatgt 1860

tgctgctcag gacccagcca atccgggcgt tcttgttctt tcgcaatttg cgggagcggc 1920

aaacgagtta acgtcggcgt taattgttaa cccctacgat cgtgacgaag ttgcagctgc 1980

gctggatcgt gcattgacta tgtcgctggc ggaacgtatt tcccgtcatg cagaaatgct 2040

ggacgttatc gtgaaaaacg atattaacca ctggcaggag tgcttcatta gcgacctaaa 2100

gcagatagtt ccgcgaagcg cggaaagcca gcagcgcgat aaagttgcta cctttccaaa 2160

gcttgcgtag gagctagcaa tctc 2184


<210> 116
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR primer


<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(12)
<223> AflI restriction site

<400> 116
ttgcatctta agaaggagga tccatatgat cttgatggaa cgctgg 46


<210> 117
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR primer


<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(12)
<223> NheI restriction site

<400> 117
gagattgcta gctcctacgc aagctttg 28


<210> 118
<211> 12051
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> plasmid pLybAL23 containing otsBA operon

<400> 118
aggcccagtc tttcgactga gcctttcgtt ttatttgatg cctggcagtt ccctactctc 60

gcatggggag accccacact accatcggcg ctacggcgtt tcacttctga gttcggcatg 120

gggtcaggtg ggaccaccgc gctactgccg ccaggcaaat tctgttttat cagaccgctt 180

ctgcgttctg atttaatctg tatcaggctg aaaatcttct ctcatccgcc aaaacagcca 240

agcttgcatg cctgcaggtc gactctagat ggctacgagg gcagacagta agtggattta 300

ccataatccc ttaattgtac gcaccgctaa aacgcgttca gcgcgatcac ggcagcagac 360

aggtaaaaat ggcaacaaac caccctaaaa actgcgcgat cgcgcctgat aaattttaac 420

cgtatgaata cctatgcaac cagagggtac aggccacatt acccccactt aatccactga 480

agctgccatt tttcatggtt tcaccatccc agcgaagggc catgcatgca tcgaaattaa 540

tacgacgaaa ttaatacgac tcactatagg gcaattgtta tcagctatgc gccgaccaga 600

acaccttgcc gatcagccaa acgtctcttc aggccactga ctagcgataa ctttccccac 660

aacggaacaa ctctcactgc atgggatcat tgggtactgt gggtttagtg gttgtaaaaa 720

cacctgaccg ctatccctga tcagtttctt gaaggtaaac tcatcacccc caagtctggc 780

tatgcagaaa tcacctggct caacagcctg ctcagggtca acgagaatta acattccgtc 840

aggaaagctt ggcttggagc ctgttggtgc ggtcatggaa ttaccttcaa cctcaagcca 900

gaatgcagaa tcactggctt tcttggttgt gcttacccat ctctccgcat cacctttggt 960

aaaggttcta agcttaggtg agaacatccc tgcctgaaca tgagaaaaaa cagggtactc 1020

atactcactt ctaagtgacg gctgcatact aaccgcttca tacatctcgt agatttctct 1080

ggcgattgaa gggctaaatt cttcaacgct aactttgaga atttttgtaa gcaatgcggc 1140

gttataagca tttaatgcat tgatgccatt aaataaagca ccaacgcctg actgccccat 1200

ccccatcttg tctgcgacag attcctggga taagccaagt tcatttttct ttttttcata 1260

aattgcttta aggcgacgtg cgtcctcaag ctgctcttgt gttaatggtt tcttttttgt 1320

gctcatacgt taaatctatc accgcaaggg ataaatatct aacaccgtgc gtgttgacta 1380

ttttacctct ggcggtgata atggttgcat cttaagaagg aggatccata tgatcttgat 1440

ggaacgctgg cggaaatcaa accgcatccc gatcaggtcg tcgtgcctga caatattctg 1500

caaggactac agctactggc aaccgcaagt gatggtgcat tggcattgat atcagggcgc 1560

tcaatggtgg agcttgacgc actggcaaaa ccttatcgct tcccgttagc gggcgtgcat 1620

ggggcggagc gccgtgacat caatggtaaa acacatatcg ttcatctgcc ggatgcgatt 1680

gcgcgtgata ttagcgtgca actgcataca gtcatcgctc agtatcccgg cgcggagctg 1740

gaggcgaaag ggatggcttt tgcgctgcat tatcgtcagg ctccgcagca tgaagacgca 1800

ttaatgacat tagcgcaacg tattactcag atctggccac aaatggcgtt acagcaggga 1860

aagtgtgttg tcgagatcaa accgagaggt accagtaaag gtgaggcaat tgcagctttt 1920

atgcaggaag ctccctttat cgggcgaacg cccgtatttc tgggcgatga tttaaccgat 1980

gaatctggct tcgcagtcgt taaccgactg ggcggaatgt cagtaaaaat tggcacaggt 2040

gcaactcagg catcatggcg actggcgggt gtgccggatg tctggagctg gcttgaaatg 2100

ataaccaccg cattacaaca aaaaagagaa aataacagga gtgatgacta tgagtcgttt 2160

agtcgtagta tctaaccgga ttgcaccacc agacgagcac gccgccagtg ccggtggcct 2220

tgccgttggc atactggggg cactgaaagc cgcaggcgga ctgtggtttg gctggagtgg 2280

tgaaacaggg aatgaggatc agccgctaaa aaaggtgaaa aaaggtaaca ttacgtgggc 2340

ctcttttaac ctcagcgaac aggaccttga cgaatactac aaccaattct ccaatgccgt 2400

tctctggccc gcttttcatt atcggctcga tctggtgcaa tttcagcgtc ctgcctggga 2460

cggctatcta cgcgtaaatg cgttgctggc agataaatta ctgccgctgt tgcaagacga 2520

tgacattatc tggatccacg attatcacct gttgccattt gcgcatgaat tacgcaaacg 2580

gggagtgaat aatcgcattg gtttctttct gcatattcct ttcccgacac cggaaatctt 2640

caacgcgctg ccgacatatg acaccttgct tgaacagctt tgtgattatg atttgctggg 2700

tttccagaca gaaaacgatc gtctggcgtt cctggattgt ctttctaacc tgacccgcgt 2760

cacgacacgt agcgcaaaaa gccatacagc ctggggcaaa gcatttcgaa cagaagtcta 2820

cccgatcggc attgaaccga aagaaatagc caaacaggct gccgggccac tgccgccaaa 2880

actggcgcaa cttaaagcgg aactgaaaaa cgtacaaaat atcttttctg tcgaacggct 2940

ggattattcc aaaggtttgc cagagcgttt tctcgcctat gaagcgttgc tggaaaaata 3000

tccgcagcat catggtaaaa ttcgttatac ccagattgca ccaacgtcgc gtggtgatgt 3060

gcaagcctat caggatattc gtcatcagct cgaaaatgaa gctggacgaa ttaatggtaa 3120

atacgggcaa ttaggctgga cgccgcttta ttatttgaat cagcattttg accgtaaatt 3180

actgatgaaa atattccgct actctgacgt gggcttagtg acgccactgc gtgacgggat 3240

gaacctggta gcaaaagagt atgttgctgc tcaggaccca gccaatccgg gcgttcttgt 3300

tctttcgcaa tttgcgggag cggcaaacga gttaacgtcg gcgttaattg ttaaccccta 3360

cgatcgtgac gaagttgcag ctgcgctgga tcgtgcattg actatgtcgc tggcggaacg 3420

tatttcccgt catgcagaaa tgctggacgt tatcgtgaaa aacgatatta accactggca 3480

ggagtgcttc attagcgacc taaagcagat agttccgcga agcgcggaaa gccagcagcg 3540

cgataaagtt gctacctttc caaagcttgc gtaggagcta gctgcctcga aaggggatgc 3600

gattcgccac ctctcactcc gctggcggat tcctcttgag aacattttgg tggcaggcga 3660

ttctggtaac gatgaggaaa tgctcaaggg ccataatctc ggcgttgtag ttggcaatta 3720

ctcaccggaa ttggagccac tgcgcagcta cgagcgcgtc tattttgctg agggccacta 3780

tgctaatggc attctggaag ccttaaaaca ctatcgcttt tttgaggcga tcgcttaacc 3840

ttttcagaat gagacgttga tcggcacgta agcgtgagac gttgatcggc acgtaagagg 3900

ttccaacttt caccataatg aaataagatc actaccgggc gtattttttg agttatcgag 3960

attttcagga gctaaggaag ctaaaatgga gaaaaaaatc actggatata ccaccgttga 4020

tatatcccaa tggcatcgta aagaacattt tgaggcattt cagtcagttg ctcaatgtac 4080

ctataaccag accgttcagc tggatattac ggccttttta aagaccgtaa agaaaaataa 4140

gcacaagttt tatccggcct ttattcacat tcttgcccgc ctgatgaatg ctcatccgga 4200

attccgtatg gcaatgaaag acggtgagct ggtgatatgg gatagtgttc acccttgtta 4260

caccgttttc catgagcaaa ctgaaacgtt ttcatcgctc tggagtgaat accacgacga 4320

tttccggcag tttctacaca tatattcgca agatgtggcg tgttacggtg aaaacctggc 4380

ctatttccct aaagggttta ttgagaatat gtttttcgtc tcagccaatc cctgggtgag 4440

tttcaccagt tttgatttaa acgtggccaa tatggacaac ttcttcgccc ccgttttcac 4500

catgggcaaa tattatacgc aaggcgacaa ggtgctgatg ccgctggcga ttcaggttca 4560

tcatgccgtt tgtgatggct tccatgtcgg cagaatgctt aatgaattac aacagtactg 4620

cgatgagtgg cagggcgggg cgtaattttt ttaaggcagt tattggtgcc cttaaacgcc 4680

tggttgctac gcctgaataa gtgataataa gcggatgaat ggcagaaatt cgatgataag 4740

ctgtcaaaca caaccaccat caaacaggat tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac 4800

cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca 4860

ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg 4920

gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg 4980

caacgcaatt aatgtaagtt agcgcgaatt gcaagctggc cgacgcgctg ggctacgtct 5040

tgctggcgtt cgggagcaga agagcataca tctggaagca aagccaggaa agcggcctat 5100

ggagctgtgc ggcagcgctc agtaggcaat ttttcaaaat attgttaagc cttttctgag 5160

catggtattt ttcatggtat taccaattag caggaaaata agccattgaa tataaaagat 5220

aaaaatgtct tgtttacaat agagtggggg gggtcagcct gccgccttgg gccgggtgat 5280

gtcgtacttg cccgccgcga actcggttac cgtccagccc agcgcgacca gctccggcaa 5340

cgcctcgcgc acccgcttgc ggcgcttgcg catggtcgaa ccactggcct ctgacggcca 5400

gacatagccg cacaaggtat ctatggaagc cttgccggtt ttgccggggt cgatccagcc 5460

acacagccgc tggtgcagca ggcgggcggt ttcgctgtcc agcgcccgca cctcgtccat 5520

gctgatgcgc acatgctggc cgccacccat gacggcctgc gcgatcaagg ggttcagggc 5580

cacgtacagg cgcccgtccg cctcgtcgct ggcgtactcc gacagcagcc gaaacccctg 5640

ccgcttgcgg ccattctggg cgatgatgga taccttccaa aggcgctcga tgcagtcctg 5700

tatgtgcttg agcgccccac cactatcgac ctctgccccg atttcctttg ccagcgcccg 5760

atagctacct ttgaccacat ggcattcagc ggtgacggcc tcccacttgg gttccaggaa 5820

cagccggagc tgccgtccgc cttcggtctt gggttccggg ccaagcacta ggccattagg 5880

cccagccatg gccaccagcc cttgcaggat gcgcagatca tcagcgccca gcggctccgg 5940

gccgctgaac tcgatccgct tgccgtcgcc gtagtcatac gtcacgtcca gcttgctgcg 6000

cttgcgctcg ccccgcttga gggcacggaa caggccgggg gccagacagt gcgccgggtc 6060

gtgccggacg tggctgaggc tgtgcttgtt cttaggcttc accacggggc acccccttgc 6120

tcttgcgctg cctctccagc acggcgggct tgagcacccc gccgtcatgc cgcctgaacc 6180

accgatcagc gaacggtgcg ccatagttgg ccttgctcac accgaagcgg acgaagaacc 6240

ggcgctggtc gtcgtccaca ccccattcct cggcctcggc gctggtcatg ctcgacaggt 6300

aggactgcca gcggatgtta tcgaccagta ccgagctgcc ccggctggcc tgctgctggt 6360

cgcctgcgcc catcatggcc gcgcccttgc tggcatggtg caggaacacg atagagcacc 6420

cggtatcggc ggcgatggcc tccatgcgac cgatgacctg ggccatgggg ccgctggcgt 6480

tttcttcctc gatgtggaac cggcgcagcg tgtccagcac catcaggcgg cggccctcgg 6540

cggcgcgctt gaggccgtcg aaccactccg gggccatgat gttgggcagg ctgccgatca 6600

gcggctggat cagcaggccg tcagccacgg cttgccgttc ctcggcgctg aggtgcgccc 6660

caagggcgtg caggcggtga tgaatggcgg tgggcgggtc ttcggcgggc aggtagatca 6720

ccgggccggt gggcagttcg cccacctcca gcagatccgg cccgcctgca atctgtgcgg 6780

ccagttgcag ggccagcatg gatttaccgg caccaccggg cgacaccagc gccccgaccg 6840

taccggccac catgttgggc aaaacgtagt ccagcggtgg cggcgctgct gcgaacgcct 6900

ccagaatatt gataggctta tgggtagcca ttgattgcct cctttgcagg cagttggtgg 6960

ttaggcgctg gcggggtcac tacccccgcc ctgcgccgct ctgagttctt ccaggcactc 7020

gcgcagcgcc tcgtattcgt cgtcggtcag ccagaacttg cgctgacgca tccctttggc 7080

cttcatgcgc tcggcatatc gcgcttggcg tacagcgtca gggctggcca gcaggtcgcc 7140

ggtctgcttg tccttttggt ctttcatatc agtcaccgag aaacttgccg gggccgaaag 7200

gcttgtcttc gcggaacaag gacaaggtgc agccgtcaag gttaaggctg gccatatcag 7260

cgactgaaaa gcggccagcc tcggccttgt ttgacgtata accaaagcca ccgggcaacc 7320

aatagccctt gtcacttttg atcaggtaga ccgaccctga agcgcttttt tcgtattcca 7380

taaaaccccc ttctgtgcgt gagtactcat agtataacag gcgtgagtac caacgcaagc 7440

actacatgct gaaatctggc ccgcccctgt ccatgcctcg ctggcggggt gccggtgccc 7500

gtgccagctc ggcccgcgca agctggacgc tgggcagacc catgaccttg ctgacggtgc 7560

gctcgatgta atccgcttcg tggccgggct tgcgctctgc cagcgctggg ctggcctcgg 7620

ccatggcctt gccgatttcc tcggcactgc ggccccggct ggccagcttc tgcgcggcga 7680

taaagtcgca cttgctgagg tcatgaccga agcgcttgac cagcccggcc atctcgctgc 7740

ggtactcgtc cagcgccgtg cgccggtggc ggctaagctg ccgctcgggc agttcgaggc 7800

tggccagcct gcgggccttc tcctgctgcc gctgggcctg ctcgatctgc tggccagcct 7860

gctgcaccag cgccgggcca gcggtggcgg tcttgccctt ggattcacgc agcagcaccc 7920

acggctgata accggcgcgg gtggtgtgct tgtccttgcg gttggtgaag cccgccaagc 7980

ggccatagtg gcggctgtcg gcgctggccg ggtcggcgtc gtactcgctg gccagcgtcc 8040

gggcaatctg cccccgaagt tcaccgcctg cggcgtcggc caccttgacc catgcctgat 8100

agttcttcgg gctggtttcc actaccaggg caggctcccg gccctcggct ttcatgtcat 8160

ccaggtcaaa ctcgctgagg tcgtccacca gcaccagacc atgccgctcc tgctcggcgg 8220

gcctgatata cacgtcattg ccctgggcat tcatccgctt gagccatggc gtgttctgga 8280

gcacttcggc ggctgaccat tcccggttca tcatctggcc ggtgggtgcg tccctgacgc 8340

cgatatcgaa gcgctcacag cccatggcct tgagctgtcg gcctatggcc tgcaaagtcc 8400

tgtcgttctt catcgggcca ccaagcgcag ccagatcgag ccgtcctcgg ttgtcagtgg 8460

cgtcaggtcg agcaagagca acgatgcgat cagcagcacc accgtaggca tcatggaagc 8520

cagcatcacg gttagccata gcttccagtg ccacccccgc gacgcgctcc gggcgctctg 8580

cgcggcgctg ctcacctcgg cggctacctc ccgcaactct ttggccagct ccacccatgc 8640

cgcccctgtc tggcgctggg ctttcagcca ctccgccgcc tgcgcctcgc tggcctgctt 8700

ggtctggctc atgacctgcc gggcttcgtc ggccagtgtc gccatgctct gggccagcgg 8760

ttcgatctgc tccgctaact cgttgatgcc tctggatttc ttcactctgt cgattgcgtt 8820

catggtctat tgcctcccgg tattcctgta agtcgatgat ctgggcgttg gcggtgtcga 8880

tgttcagggc cacgtctgcc cggtcggtgc ggatgccccg gccttccatc tccaccacgt 8940

tcggccccag gtgaacaccg ggcaggcgct cgatgccctg cgcctcaagt gttctgtggt 9000

caatgcgggc gtcgtggcca gcccgctcta atgcccggtt ggcatggtcg gcccatgcct 9060

cgcgggtctg ctcaagccat gccttgggct tgagcgcttc ggtcttctgt gccccgccct 9120

tctccggggt cttgccgttg taccgcttga accactgagc ggcgggccgc tcgatgccgt 9180

cattgatccg ctcggagatc atcaggtggc agtgcgggtt ctcgccgcca ccggcatgga 9240

tggccagcgt atacggcagg cgctcggcac cggtcaggtg ctgggcgaac tcggacgcca 9300

gcgccttctg ctggtcgagg gtcagctcga ccggcagggc aaattcgacc tccttgaaca 9360

gccgcccatt ggcgcgttca tacaggtcgg cagcatccca gtagtcggcg ggccgctcga 9420

cgaactccgg catgtgcccg gattcggcgt gcaagacttc atccatgtcg cgggcatact 9480

tgccttcgcg ctggatgtag tcggccttgg ccctggccga ttggccgccc gacctgctgc 9540

cggttttcgc cgtaaggtga taaatcgcca tgctgcctcg ctgttgcttt tgcttttcgg 9600

ctccatgcaa tggccctcgg agagcgcacc gcccgaaggg tggccgttag gccagtttct 9660

cgaagagaaa ccggtaagtg cgccctcccc tacaaagtag ggtcgggatt gccgccgctg 9720

tgcctccatg atagcctacg agacagcaca ttaacaatgg ggtgtcaaga tggttaaggg 9780

gagcaacaag gcggcggatc ggctggccaa gctcgaagaa caacgagcgc gaatcaatgc 9840

cgaaattcag cgggagcggg caagggaaca gcagcaagag cgcaagaacg aaacaaggcg 9900

caaggtgctg gtgggggcca tgattttggc caaggtgaac agcagcgagt ggccggagga 9960

tcggctcatg gcggcaatgg atgcgtacct tgaacgcgac cacgaccgcg ccttgttcgg 10020

tctgccgcca cgccagaagg atgagccggg ctgaatgatc gaccgagaca ggccctgcgg 10080

ggctgcacac gcgcccccac ccttcgggta gggggaaagg ccgctaaagc ggctaaaagc 10140

gctccagcgt atttctgcgg ggtttggtgt ggggtttagc gggctttgcc cgcctttccc 10200

cctgccgcgc agcggtgggg cggtgtgtag cctagcgcag cgaatagacc agctatccgg 10260

cctctggccg ggcatattgg gcaagggcag cagcgcccca caagggcgct gataaccgcg 10320

cctagtggat tattcttaga taatcatgga tggatttttc caacaccccg ccagcccccg 10380

cccctgctgg gtttgcaggt ttgggggcgt gacagttatt gcaggggttc gtgacagtta 10440

ttgcaggggg gcgtgacagt tattgcaggg gttcgtgaca gttagtacgg gagtgacggg 10500

cactggctgg caatgtctag caacggcagg catttcggct gagggtaaaa gaactttccg 10560

ctaagcgata gactgtatgt aaacacagta ttgcaaggac gcggaacatg cctcatgtgg 10620

cggccaggac ggccagccgg gatcgggata ctggtcgtta ccagagccac cgacccgagc 10680

aaacccttct ctatcagatc gttgacgagt attacccggc attcgctgcg cttatggcag 10740

agcagggaaa ggaattgccg ggctatgtgc aacgggaatt tgaagaattt ctccaatgcg 10800

ggcggctgga gcatggcttt ctacgggttc gctgcgagtc ttgccacgcc gagcacctgg 10860

tcgctttcag aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 10920

cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 10980

actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc 11040

aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 11100

cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa 11160

ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc 11220

cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg 11280

ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 11340

cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 11400

ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 11460

tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc 11520

ggcgtcaaca cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 11580

aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat 11640

gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg 11700

gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 11760

ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 11820

catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaaagagtt tgtagaaacg 11880

caaaaaggcc atccgtcagg atggccttct gcttaatttg atgcctggca gtttatggcg 11940

ggcgtcctgc ccgccaccct ccgggccgtt gcttcgcaac gttcaaatcc gctcccggcg 12000

gatttgtcct actcaggaga gcgttcaccg acaaacaaca gataaaacga a 12051


<210> 119
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR primer

<400> 119
ttcattatcg gctcgatctg gtg 23


<210> 120
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR primer

<400> 120
caacaggtga taatcgtgga tccag 25


<210> 121
<211> 11348
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> plasmid pLybAL28 containing otsBA operon

<400> 121
aggcccagtc tttcgactga gcctttcgtt ttatttgatg cctggcagtt ccctactctc 60

gcatggggag accccacact accatcggcg ctacggcgtt tcacttctga gttcggcatg 120

gggtcaggtg ggaccaccgc gctactgccg ccaggcaaat tctgttttat cagaccgctt 180

ctgcgttctg atttaatctg tatcaggctg aaaatcttct ctcatccgcc aaaacagcca 240

agcttgcatg ccgttattga tggaatggga agaagcaatg gtcacaataa actggaggtt 300

atgggtatgt tttttagccc taatgctcca atcgccttga ttgtatcgaa tgatgcagtc 360

tctaaaattg tatccgtaaa agacctctgc accgccgacg ggtctggatt atgggcaata 420

atcacagtcg agccagacta cccctggagg taaactccgg ggctggagcc ataaagatta 480

ggaattcatt aagaaatgta acaatcgacg ttctagatca taccacgccc ccactgtccg 540

gcagggtgaa cagaggagac tttcccctgt tacagtgtca gtgacaaaac aactttttgg 600

catcggtgca ggtggtgagc catggcggcc cagatcattg aaattctttc cccggaggaa 660

atccgacgta cccttacccg tctggcttcc caggtaattt aggtaccgtt aagaaggagg 720

atccatatga tcttgatgga acgctggcgg aaatcaaacc gcatcccgat caggtcgtcg 780

tgcctgacaa tattctgcaa ggactacagc tactggcaac cgcaagtgat ggtgcattgg 840

cattgatatc agggcgctca atggtggagc ttgacgcact ggcaaaacct tatcgcttcc 900

cgttagcggg cgtgcatggg gcggagcgcc gtgacatcaa tggtaaaaca catatcgttc 960

atctgccgga tgcgattgcg cgtgatatta gcgtgcaact gcatacagtc atcgctcagt 1020

atcccggcgc ggagctggag gcgaaaggga tggcttttgc gctgcattat cgtcaggctc 1080

cgcagcatga agacgcatta atgacattag cgcaacgtat tactcagatc tggccacaaa 1140

tggcgttaca gcagggaaag tgtgttgtcg agatcaaacc gagaggtacc agtaaaggtg 1200

aggcaattgc agcttttatg caggaagctc cctttatcgg gcgaacgccc gtatttctgg 1260

gcgatgattt aaccgatgaa tctggcttcg cagtcgttaa ccgactgggc ggaatgtcag 1320

taaaaattgg cacaggtgca actcaggcat catggcgact ggcgggtgtg ccggatgtct 1380

ggagctggct tgaaatgata accaccgcat tacaacaaaa aagagaaaat aacaggagtg 1440

atgactatga gtcgtttagt cgtagtatct aaccggattg caccaccaga cgagcacgcc 1500

gccagtgccg gtggccttgc cgttggcata ctgggggcac tgaaagccgc aggcggactg 1560

tggtttggct ggagtggtga aacagggaat gaggatcagc cgctaaaaaa ggtgaaaaaa 1620

ggtaacatta cgtgggcctc ttttaacctc agcgaacagg accttgacga atactacaac 1680

caattctcca atgccgttct ctggcccgct tttcattatc ggctcgatct ggtgcaattt 1740

cagcgtcctg cctgggacgg ctatctacgc gtaaatgcgt tgctggcaga taaattactg 1800

ccgctgttgc aagacgatga cattatctgg atccacgatt atcacctgtt gccatttgcg 1860

catgaattac gcaaacgggg agtgaataat cgcattggtt tctttctgca tattcctttc 1920

ccgacaccgg aaatcttcaa cgcgctgccg acatatgaca ccttgcttga acagctttgt 1980

gattatgatt tgctgggttt ccagacagaa aacgatcgtc tggcgttcct ggattgtctt 2040

tctaacctga cccgcgtcac gacacgtagc gcaaaaagcc atacagcctg gggcaaagca 2100

tttcgaacag aagtctaccc gatcggcatt gaaccgaaag aaatagccaa acaggctgcc 2160

gggccactgc cgccaaaact ggcgcaactt aaagcggaac tgaaaaacgt acaaaatatc 2220

ttttctgtcg aacggctgga ttattccaaa ggtttgccag agcgttttct cgcctatgaa 2280

gcgttgctgg aaaaatatcc gcagcatcat ggtaaaattc gttataccca gattgcacca 2340

acgtcgcgtg gtgatgtgca agcctatcag gatattcgtc atcagctcga aaatgaagct 2400

ggacgaatta atggtaaata cgggcaatta ggctggacgc cgctttatta tttgaatcag 2460

cattttgacc gtaaattact gatgaaaata ttccgctact ctgacgtggg cttagtgacg 2520

ccactgcgtg acgggatgaa cctggtagca aaagagtatg ttgctgctca ggacccagcc 2580

aatccgggcg ttcttgttct ttcgcaattt gcgggagcgg caaacgagtt aacgtcggcg 2640

ttaattgtta acccctacga tcgtgacgaa gttgcagctg cgctggatcg tgcattgact 2700

atgtcgctgg cggaacgtat ttcccgtcat gcagaaatgc tggacgttat cgtgaaaaac 2760

gatattaacc actggcagga gtgcttcatt agcgacctaa agcagatagt tccgcgaagc 2820

gcggaaagcc agcagcgcga taaagttgct acctttccaa agcttgcgta ggagctagct 2880

gcctcgaaag gggatgcgat tcgccacctc tcactccgct ggcggattcc tcttgagaac 2940

attttggtgg caggcgattc tggtaacgat gaggaaatgc tcaagggcca taatctcggc 3000

gttgtagttg gcaattactc accggaattg gagccactgc gcagctacga gcgcgtctat 3060

tttgctgagg gccactatgc taatggcatt ctggaagcct taaaacacta tcgctttttt 3120

gaggcgatcg cttaaccttt tcagaatgag acgttgatcg gcacgtaagc gtgagacgtt 3180

gatcggcacg taagaggttc caactttcac cataatgaaa taagatcact accgggcgta 3240

ttttttgagt tatcgagatt ttcaggagct aaggaagcta aaatggagaa aaaaatcact 3300

ggatatacca ccgttgatat atcccaatgg catcgtaaag aacattttga ggcatttcag 3360

tcagttgctc aatgtaccta taaccagacc gttcagctgg atattacggc ctttttaaag 3420

accgtaaaga aaaataagca caagttttat ccggccttta ttcacattct tgcccgcctg 3480

atgaatgctc atccggaatt ccgtatggca atgaaagacg gtgagctggt gatatgggat 3540

agtgttcacc cttgttacac cgttttccat gagcaaactg aaacgttttc atcgctctgg 3600

agtgaatacc acgacgattt ccggcagttt ctacacatat attcgcaaga tgtggcgtgt 3660

tacggtgaaa acctggccta tttccctaaa gggtttattg agaatatgtt tttcgtctca 3720

gccaatccct gggtgagttt caccagtttt gatttaaacg tggccaatat ggacaacttc 3780

ttcgcccccg ttttcaccat gggcaaatat tatacgcaag gcgacaaggt gctgatgccg 3840

ctggcgattc aggttcatca tgccgtttgt gatggcttcc atgtcggcag aatgcttaat 3900

gaattacaac agtactgcga tgagtggcag ggcggggcgt aattttttta aggcagttat 3960

tggtgccctt aaacgcctgg ttgctacgcc tgaataagtg ataataagcg gatgaatggc 4020

agaaattcga tgataagctg tcaaacacaa ccaccatcaa acaggatttt cgcctgctgg 4080

ggcaaaccag cgtggaccgc ttgctgcaac tctctcaggg ccaggcggtg aagggcaatc 4140

agctgttgcc cgtctcactg gtgaaaagaa aaaccaccct ggcgcccaat acgcaaaccg 4200

cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg 4260

aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtaagttagc gcgaattgca agctggccga 4320

cgcgctgggc tacgtcttgc tggcgttcgg gagcagaaga gcatacatct ggaagcaaag 4380

ccaggaaagc ggcctatgga gctgtgcggc agcgctcagt aggcaatttt tcaaaatatt 4440

gttaagcctt ttctgagcat ggtatttttc atggtattac caattagcag gaaaataagc 4500

cattgaatat aaaagataaa aatgtcttgt ttacaataga gtgggggggg tcagcctgcc 4560

gccttgggcc gggtgatgtc gtacttgccc gccgcgaact cggttaccgt ccagcccagc 4620

gcgaccagct ccggcaacgc ctcgcgcacc cgcttgcggc gcttgcgcat ggtcgaacca 4680

ctggcctctg acggccagac atagccgcac aaggtatcta tggaagcctt gccggttttg 4740

ccggggtcga tccagccaca cagccgctgg tgcagcaggc gggcggtttc gctgtccagc 4800

gcccgcacct cgtccatgct gatgcgcaca tgctggccgc cacccatgac ggcctgcgcg 4860

atcaaggggt tcagggccac gtacaggcgc ccgtccgcct cgtcgctggc gtactccgac 4920

agcagccgaa acccctgccg cttgcggcca ttctgggcga tgatggatac cttccaaagg 4980

cgctcgatgc agtcctgtat gtgcttgagc gccccaccac tatcgacctc tgccccgatt 5040

tcctttgcca gcgcccgata gctacctttg accacatggc attcagcggt gacggcctcc 5100

cacttgggtt ccaggaacag ccggagctgc cgtccgcctt cggtcttggg ttccgggcca 5160

agcactaggc cattaggccc agccatggcc accagccctt gcaggatgcg cagatcatca 5220

gcgcccagcg gctccgggcc gctgaactcg atccgcttgc cgtcgccgta gtcatacgtc 5280

acgtccagct tgctgcgctt gcgctcgccc cgcttgaggg cacggaacag gccgggggcc 5340

agacagtgcg ccgggtcgtg ccggacgtgg ctgaggctgt gcttgttctt aggcttcacc 5400

acggggcacc cccttgctct tgcgctgcct ctccagcacg gcgggcttga gcaccccgcc 5460

gtcatgccgc ctgaaccacc gatcagcgaa cggtgcgcca tagttggcct tgctcacacc 5520

gaagcggacg aagaaccggc gctggtcgtc gtccacaccc cattcctcgg cctcggcgct 5580

ggtcatgctc gacaggtagg actgccagcg gatgttatcg accagtaccg agctgccccg 5640

gctggcctgc tgctggtcgc ctgcgcccat catggccgcg cccttgctgg catggtgcag 5700

gaacacgata gagcacccgg tatcggcggc gatggcctcc atgcgaccga tgacctgggc 5760

catggggccg ctggcgtttt cttcctcgat gtggaaccgg cgcagcgtgt ccagcaccat 5820

caggcggcgg ccctcggcgg cgcgcttgag gccgtcgaac cactccgggg ccatgatgtt 5880

gggcaggctg ccgatcagcg gctggatcag caggccgtca gccacggctt gccgttcctc 5940

ggcgctgagg tgcgccccaa gggcgtgcag gcggtgatga atggcggtgg gcgggtcttc 6000

ggcgggcagg tagatcaccg ggccggtggg cagttcgccc acctccagca gatccggccc 6060

gcctgcaatc tgtgcggcca gttgcagggc cagcatggat ttaccggcac caccgggcga 6120

caccagcgcc ccgaccgtac cggccaccat gttgggcaaa acgtagtcca gcggtggcgg 6180

cgctgctgcg aacgcctcca gaatattgat aggcttatgg gtagccattg attgcctcct 6240

ttgcaggcag ttggtggtta ggcgctggcg gggtcactac ccccgccctg cgccgctctg 6300

agttcttcca ggcactcgcg cagcgcctcg tattcgtcgt cggtcagcca gaacttgcgc 6360

tgacgcatcc ctttggcctt catgcgctcg gcatatcgcg cttggcgtac agcgtcaggg 6420

ctggccagca ggtcgccggt ctgcttgtcc ttttggtctt tcatatcagt caccgagaaa 6480

cttgccgggg ccgaaaggct tgtcttcgcg gaacaaggac aaggtgcagc cgtcaaggtt 6540

aaggctggcc atatcagcga ctgaaaagcg gccagcctcg gccttgtttg acgtataacc 6600

aaagccaccg ggcaaccaat agcccttgtc acttttgatc aggtagaccg accctgaagc 6660

gcttttttcg tattccataa aacccccttc tgtgcgtgag tactcatagt ataacaggcg 6720

tgagtaccaa cgcaagcact acatgctgaa atctggcccg cccctgtcca tgcctcgctg 6780

gcggggtgcc ggtgcccgtg ccagctcggc ccgcgcaagc tggacgctgg gcagacccat 6840

gaccttgctg acggtgcgct cgatgtaatc cgcttcgtgg ccgggcttgc gctctgccag 6900

cgctgggctg gcctcggcca tggccttgcc gatttcctcg gcactgcggc cccggctggc 6960

cagcttctgc gcggcgataa agtcgcactt gctgaggtca tgaccgaagc gcttgaccag 7020

cccggccatc tcgctgcggt actcgtccag cgccgtgcgc cggtggcggc taagctgccg 7080

ctcgggcagt tcgaggctgg ccagcctgcg ggccttctcc tgctgccgct gggcctgctc 7140

gatctgctgg ccagcctgct gcaccagcgc cgggccagcg gtggcggtct tgcccttgga 7200

ttcacgcagc agcacccacg gctgataacc ggcgcgggtg gtgtgcttgt ccttgcggtt 7260

ggtgaagccc gccaagcggc catagtggcg gctgtcggcg ctggccgggt cggcgtcgta 7320

ctcgctggcc agcgtccggg caatctgccc ccgaagttca ccgcctgcgg cgtcggccac 7380

cttgacccat gcctgatagt tcttcgggct ggtttccact accagggcag gctcccggcc 7440

ctcggctttc atgtcatcca ggtcaaactc gctgaggtcg tccaccagca ccagaccatg 7500

ccgctcctgc tcggcgggcc tgatatacac gtcattgccc tgggcattca tccgcttgag 7560

ccatggcgtg ttctggagca cttcggcggc tgaccattcc cggttcatca tctggccggt 7620

gggtgcgtcc ctgacgccga tatcgaagcg ctcacagccc atggccttga gctgtcggcc 7680

tatggcctgc aaagtcctgt cgttcttcat cgggccacca agcgcagcca gatcgagccg 7740

tcctcggttg tcagtggcgt caggtcgagc aagagcaacg atgcgatcag cagcaccacc 7800

gtaggcatca tggaagccag catcacggtt agccatagct tccagtgcca cccccgcgac 7860

gcgctccggg cgctctgcgc ggcgctgctc acctcggcgg ctacctcccg caactctttg 7920

gccagctcca cccatgccgc ccctgtctgg cgctgggctt tcagccactc cgccgcctgc 7980

gcctcgctgg cctgcttggt ctggctcatg acctgccggg cttcgtcggc cagtgtcgcc 8040

atgctctggg ccagcggttc gatctgctcc gctaactcgt tgatgcctct ggatttcttc 8100

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<211> 11527
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<213> Artificial Sequence

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<223> plasmid pLybAL29 containing otsBA operon

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tcccctctcc ctctgtcttt ttgctcccga acacgttgcc catagactca ggtaccgtta 840

agaaggagga tccatatgat cttgatggaa cgctggcgga aatcaaaccg catcccgatc 900

aggtcgtcgt gcctgacaat attctgcaag gactacagct actggcaacc gcaagtgatg 960

gtgcattggc attgatatca gggcgctcaa tggtggagct tgacgcactg gcaaaacctt 1020

atcgcttccc gttagcgggc gtgcatgggg cggagcgccg tgacatcaat ggtaaaacac 1080

atatcgttca tctgccggat gcgattgcgc gtgatattag cgtgcaactg catacagtca 1140

tcgctcagta tcccggcgcg gagctggagg cgaaagggat ggcttttgcg ctgcattatc 1200

gtcaggctcc gcagcatgaa gacgcattaa tgacattagc gcaacgtatt actcagatct 1260

ggccacaaat ggcgttacag cagggaaagt gtgttgtcga gatcaaaccg agaggtacca 1320

gtaaaggtga ggcaattgca gcttttatgc aggaagctcc ctttatcggg cgaacgcccg 1380

tatttctggg cgatgattta accgatgaat ctggcttcgc agtcgttaac cgactgggcg 1440

gaatgtcagt aaaaattggc acaggtgcaa ctcaggcatc atggcgactg gcgggtgtgc 1500

cggatgtctg gagctggctt gaaatgataa ccaccgcatt acaacaaaaa agagaaaata 1560

acaggagtga tgactatgag tcgtttagtc gtagtatcta accggattgc accaccagac 1620

gagcacgccg ccagtgccgg tggccttgcc gttggcatac tgggggcact gaaagccgca 1680

ggcggactgt ggtttggctg gagtggtgaa acagggaatg aggatcagcc gctaaaaaag 1740

gtgaaaaaag gtaacattac gtgggcctct tttaacctca gcgaacagga ccttgacgaa 1800

tactacaacc aattctccaa tgccgttctc tggcccgctt ttcattatcg gctcgatctg 1860

gtgcaatttc agcgtcctgc ctgggacggc tatctacgcg taaatgcgtt gctggcagat 1920

aaattactgc cgctgttgca agacgatgac attatctgga tccacgatta tcacctgttg 1980

ccatttgcgc atgaattacg caaacgggga gtgaataatc gcattggttt ctttctgcat 2040

attcctttcc cgacaccgga aatcttcaac gcgctgccga catatgacac cttgcttgaa 2100

cagctttgtg attatgattt gctgggtttc cagacagaaa acgatcgtct ggcgttcctg 2160

gattgtcttt ctaacctgac ccgcgtcacg acacgtagcg caaaaagcca tacagcctgg 2220

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caaaatatct tttctgtcga acggctggat tattccaaag gtttgccaga gcgttttctc 2400

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attgcaccaa cgtcgcgtgg tgatgtgcaa gcctatcagg atattcgtca tcagctcgaa 2520

aatgaagctg gacgaattaa tggtaaatac gggcaattag gctggacgcc gctttattat 2580

ttgaatcagc attttgaccg taaattactg atgaaaatat tccgctactc tgacgtgggc 2640

ttagtgacgc cactgcgtga cgggatgaac ctggtagcaa aagagtatgt tgctgctcag 2700

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acgtcggcgt taattgttaa cccctacgat cgtgacgaag ttgcagctgc gctggatcgt 2820

gcattgacta tgtcgctggc ggaacgtatt tcccgtcatg cagaaatgct ggacgttatc 2880

gtgaaaaacg atattaacca ctggcaggag tgcttcatta gcgacctaaa gcagatagtt 2940

ccgcgaagcg cggaaagcca gcagcgcgat aaagttgcta cctttccaaa gcttgcgtag 3000

gagctagctg cctcgaaagg ggatgcgatt cgccacctct cactccgctg gcggattcct 3060

cttgagaaca ttttggtggc aggcgattct ggtaacgatg aggaaatgct caagggccat 3120

aatctcggcg ttgtagttgg caattactca ccggaattgg agccactgcg cagctacgag 3180

cgcgtctatt ttgctgaggg ccactatgct aatggcattc tggaagcctt aaaacactat 3240

cgcttttttg aggcgatcgc ttaacctttt cagaatgaga cgttgatcgg cacgtaagcg 3300

tgagacgttg atcggcacgt aagaggttcc aactttcacc ataatgaaat aagatcacta 3360

ccgggcgtat tttttgagtt atcgagattt tcaggagcta aggaagctaa aatggagaaa 3420

aaaatcactg gatataccac cgttgatata tcccaatggc atcgtaaaga acattttgag 3480

gcatttcagt cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcagctgga tattacggcc 3540

tttttaaaga ccgtaaagaa aaataagcac aagttttatc cggcctttat tcacattctt 3600

gcccgcctga tgaatgctca tccggaattc cgtatggcaa tgaaagacgg tgagctggtg 3660

atatgggata gtgttcaccc ttgttacacc gttttccatg agcaaactga aacgttttca 3720

tcgctctgga gtgaatacca cgacgatttc cggcagtttc tacacatata ttcgcaagat 3780

gtggcgtgtt acggtgaaaa cctggcctat ttccctaaag ggtttattga gaatatgttt 3840

ttcgtctcag ccaatccctg ggtgagtttc accagttttg atttaaacgt ggccaatatg 3900

gacaacttct tcgcccccgt tttcaccatg ggcaaatatt atacgcaagg cgacaaggtg 3960

ctgatgccgc tggcgattca ggttcatcat gccgtttgtg atggcttcca tgtcggcaga 4020

atgcttaatg aattacaaca gtactgcgat gagtggcagg gcggggcgta atttttttaa 4080

ggcagttatt ggtgccctta aacgcctggt tgctacgcct gaataagtga taataagcgg 4140

atgaatggca gaaattcgat gataagctgt caaacacaac caccatcaaa caggattttc 4200

gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga 4260

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gaagcaaagc caggaaagcg gcctatggag ctgtgcggca gcgctcagta ggcaattttt 4560

caaaatattg ttaagccttt tctgagcatg gtatttttca tggtattacc aattagcagg 4620

aaaataagcc attgaatata aaagataaaa atgtcttgtt tacaatagag tggggggggt 4680

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cagcccagcg cgaccagctc cggcaacgcc tcgcgcaccc gcttgcggcg cttgcgcatg 4800

gtcgaaccac tggcctctga cggccagaca tagccgcaca aggtatctat ggaagccttg 4860

ccggttttgc cggggtcgat ccagccacac agccgctggt gcagcaggcg ggcggtttcg 4920

ctgtccagcg cccgcacctc gtccatgctg atgcgcacat gctggccgcc acccatgacg 4980

gcctgcgcga tcaaggggtt cagggccacg tacaggcgcc cgtccgcctc gtcgctggcg 5040

tactccgaca gcagccgaaa cccctgccgc ttgcggccat tctgggcgat gatggatacc 5100

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gccccgattt cctttgccag cgcccgatag ctacctttga ccacatggca ttcagcggtg 5220

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tcatacgtca cgtccagctt gctgcgcttg cgctcgcccc gcttgagggc acggaacagg 5460

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ggcttcacca cggggcaccc ccttgctctt gcgctgcctc tccagcacgg cgggcttgag 5580

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gctcacaccg aagcggacga agaaccggcg ctggtcgtcg tccacacccc attcctcggc 5700

ctcggcgctg gtcatgctcg acaggtagga ctgccagcgg atgttatcga ccagtaccga 5760

gctgccccgg ctggcctgct gctggtcgcc tgcgcccatc atggccgcgc ccttgctggc 5820

atggtgcagg aacacgatag agcacccggt atcggcggcg atggcctcca tgcgaccgat 5880

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cagcaccatc aggcggcggc cctcggcggc gcgcttgagg ccgtcgaacc actccggggc 6000

catgatgttg ggcaggctgc cgatcagcgg ctggatcagc aggccgtcag ccacggcttg 6060

ccgttcctcg gcgctgaggt gcgccccaag ggcgtgcagg cggtgatgaa tggcggtggg 6120

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cggtggcggc gctgctgcga acgcctccag aatattgata ggcttatggg tagccattga 6360

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accgagaaac ttgccggggc cgaaaggctt gtcttcgcgg aacaaggaca aggtgcagcc 6660

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taacaggcgt gagtaccaac gcaagcacta catgctgaaa tctggcccgc ccctgtccat 6900

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ggcctgctcg atctgctggc cagcctgctg caccagcgcc gggccagcgg tggcggtctt 7320

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cttgcggttg gtgaagcccg ccaagcggcc atagtggcgg ctgtcggcgc tggccgggtc 7440

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gatttcttca ctctgtcgat tgcgttcatg gtctattgcc tcccggtatt cctgtaagtc 8280

gatgatctgg gcgttggcgg tgtcgatgtt cagggccacg tctgcccggt cggtgcggat 8340

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gcctcgctgt tgcttttgct tttcggctcc atgcaatggc cctcggagag cgcaccgccc 9060

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gaaaggccgc taaagcggct aaaagcgctc cagcgtattt ctgcggggtt tggtgtgggg 9600

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aatttgatgc ctggcagttt atggcgggcg tcctgcccgc caccctccgg gccgttgctt 11400

cgcaacgttc aaatccgctc ccggcggatt tgtcctactc aggagagcgt tcaccgacaa 11460

acaacagata aaacgaa 11477


<210> 125
<211> 11258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> plasmid pLybAL36 containing otsBA operon

<400> 125
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aatttacgtt acaaatttta acgaaacggg aaccctatat tgatctctac tgttatctgg 600

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aaatcaaacc gcatcccgat caggtcgtcg tgcctgacaa tattctgcaa ggactacagc 720

tactggcaac cgcaagtgat ggtgcattgg cattgatatc agggcgctca atggtggagc 780

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cataatgaaa taagatcact accgggcgta ttttttgagt tatcgagatt ttcaggagct 3180

aaggaagcta aaatggagaa aaaaatcact ggatatacca ccgttgatat atcccaatgg 3240

catcgtaaag aacattttga ggcatttcag tcagttgctc aatgtaccta taaccagacc 3300

gttcagctgg atattacggc ctttttaaag accgtaaaga aaaataagca caagttttat 3360

ccggccttta ttcacattct tgcccgcctg atgaatgctc atccggaatt ccgtatggca 3420

atgaaagacg gtgagctggt gatatgggat agtgttcacc cttgttacac cgttttccat 3480

gagcaaactg aaacgttttc atcgctctgg agtgaatacc acgacgattt ccggcagttt 3540

ctacacatat attcgcaaga tgtggcgtgt tacggtgaaa acctggccta tttccctaaa 3600

gggtttattg agaatatgtt tttcgtctca gccaatccct gggtgagttt caccagtttt 3660

gatttaaacg tggccaatat ggacaacttc ttcgcccccg ttttcaccat gggcaaatat 3720

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ggcggggcgt aattttttta aggcagttat tggtgccctt aaacgcctgg ttgctacgcc 3900

tgaataagtg ataataagcg gatgaatggc agaaattcga tgataagctg tcaaacacaa 3960

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tctctcaggg ccaggcggtg aagggcaatc agctgttgcc cgtctcactg gtgaaaagaa 4080

aaaccaccct ggcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa 4140

tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat 4200

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agcgctcagt aggcaatttt tcaaaatatt gttaagcctt ttctgagcat ggtatttttc 4380

atggtattac caattagcag gaaaataagc cattgaatat aaaagataaa aatgtcttgt 4440

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aaggtatcta tggaagcctt gccggttttg ccggggtcga tccagccaca cagccgctgg 4680

tgcagcaggc gggcggtttc gctgtccagc gcccgcacct cgtccatgct gatgcgcaca 4740

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ccgtccgcct cgtcgctggc gtactccgac agcagccgaa acccctgccg cttgcggcca 4860

ttctgggcga tgatggatac cttccaaagg cgctcgatgc agtcctgtat gtgcttgagc 4920

gccccaccac tatcgacctc tgccccgatt tcctttgcca gcgcccgata gctacctttg 4980

accacatggc attcagcggt gacggcctcc cacttgggtt ccaggaacag ccggagctgc 5040

cgtccgcctt cggtcttggg ttccgggcca agcactaggc cattaggccc agccatggcc 5100

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cgcttgaggg cacggaacag gccgggggcc agacagtgcg ccgggtcgtg ccggacgtgg 5280

ctgaggctgt gcttgttctt aggcttcacc acggggcacc cccttgctct tgcgctgcct 5340

ctccagcacg gcgggcttga gcaccccgcc gtcatgccgc ctgaaccacc gatcagcgaa 5400

cggtgcgcca tagttggcct tgctcacacc gaagcggacg aagaaccggc gctggtcgtc 5460

gtccacaccc cattcctcgg cctcggcgct ggtcatgctc gacaggtagg actgccagcg 5520

gatgttatcg accagtaccg agctgccccg gctggcctgc tgctggtcgc ctgcgcccat 5580

catggccgcg cccttgctgg catggtgcag gaacacgata gagcacccgg tatcggcggc 5640

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gccgtcgaac cactccgggg ccatgatgtt gggcaggctg ccgatcagcg gctggatcag 5820

caggccgtca gccacggctt gccgttcctc ggcgctgagg tgcgccccaa gggcgtgcag 5880

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cagcatggat ttaccggcac caccgggcga caccagcgcc ccgaccgtac cggccaccat 6060

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tgtgcgtgag tactcatagt ataacaggcg tgagtaccaa cgcaagcact acatgctgaa 6660

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ccgcgcaagc tggacgctgg gcagacccat gaccttgctg acggtgcgct cgatgtaatc 6780

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gtgcccggat tcggcgtgca agacttcatc catgtcgcgg gcatacttgc cttcgcgctg 8700

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<210> 126
<211> 11453
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> plasmid pLybAL37 containing otsBA operon

<400> 126
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agcttgcatg cataaatttc tgttttgacc aaaccatccc gacataactc ggtcagggct 300

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gctcttgcgc tgcctctcca gcacggcggg cttgagcacc ccgccgtcat gccgcctgaa 5580

ccaccgatca gcgaacggtg cgccatagtt ggccttgctc acaccgaagc ggacgaagaa 5640

ccggcgctgg tcgtcgtcca caccccattc ctcggcctcg gcgctggtca tgctcgacag 5700

gtaggactgc cagcggatgt tatcgaccag taccgagctg ccccggctgg cctgctgctg 5760

gtcgcctgcg cccatcatgg ccgcgccctt gctggcatgg tgcaggaaca cgatagagca 5820

cccggtatcg gcggcgatgg cctccatgcg accgatgacc tgggccatgg ggccgctggc 5880

gttttcttcc tcgatgtgga accggcgcag cgtgtccagc accatcaggc ggcggccctc 5940

ggcggcgcgc ttgaggccgt cgaaccactc cggggccatg atgttgggca ggctgccgat 6000

cagcggctgg atcagcaggc cgtcagccac ggcttgccgt tcctcggcgc tgaggtgcgc 6060

cccaagggcg tgcaggcggt gatgaatggc ggtgggcggg tcttcggcgg gcaggtagat 6120

caccgggccg gtgggcagtt cgcccacctc cagcagatcc ggcccgcctg caatctgtgc 6180

ggccagttgc agggccagca tggatttacc ggcaccaccg ggcgacacca gcgccccgac 6240

cgtaccggcc accatgttgg gcaaaacgta gtccagcggt ggcggcgctg ctgcgaacgc 6300

ctccagaata ttgataggct tatgggtagc cattgattgc ctcctttgca ggcagttggt 6360

ggttaggcgc tggcggggtc actacccccg ccctgcgccg ctctgagttc ttccaggcac 6420

tcgcgcagcg cctcgtattc gtcgtcggtc agccagaact tgcgctgacg catccctttg 6480

gccttcatgc gctcggcata tcgcgcttgg cgtacagcgt cagggctggc cagcaggtcg 6540

ccggtctgct tgtccttttg gtctttcata tcagtcaccg agaaacttgc cggggccgaa 6600

aggcttgtct tcgcggaaca aggacaaggt gcagccgtca aggttaaggc tggccatatc 6660

agcgactgaa aagcggccag cctcggcctt gtttgacgta taaccaaagc caccgggcaa 6720

ccaatagccc ttgtcacttt tgatcaggta gaccgaccct gaagcgcttt tttcgtattc 6780

cataaaaccc ccttctgtgc gtgagtactc atagtataac aggcgtgagt accaacgcaa 6840

gcactacatg ctgaaatctg gcccgcccct gtccatgcct cgctggcggg gtgccggtgc 6900

ccgtgccagc tcggcccgcg caagctggac gctgggcaga cccatgacct tgctgacggt 6960

gcgctcgatg taatccgctt cgtggccggg cttgcgctct gccagcgctg ggctggcctc 7020

ggccatggcc ttgccgattt cctcggcact gcggccccgg ctggccagct tctgcgcggc 7080

gataaagtcg cacttgctga ggtcatgacc gaagcgcttg accagcccgg ccatctcgct 7140

gcggtactcg tccagcgccg tgcgccggtg gcggctaagc tgccgctcgg gcagttcgag 7200

gctggccagc ctgcgggcct tctcctgctg ccgctgggcc tgctcgatct gctggccagc 7260

ctgctgcacc agcgccgggc cagcggtggc ggtcttgccc ttggattcac gcagcagcac 7320

ccacggctga taaccggcgc gggtggtgtg cttgtccttg cggttggtga agcccgccaa 7380

gcggccatag tggcggctgt cggcgctggc cgggtcggcg tcgtactcgc tggccagcgt 7440

ccgggcaatc tgcccccgaa gttcaccgcc tgcggcgtcg gccaccttga cccatgcctg 7500

atagttcttc gggctggttt ccactaccag ggcaggctcc cggccctcgg ctttcatgtc 7560

atccaggtca aactcgctga ggtcgtccac cagcaccaga ccatgccgct cctgctcggc 7620

gggcctgata tacacgtcat tgccctgggc attcatccgc ttgagccatg gcgtgttctg 7680

gagcacttcg gcggctgacc attcccggtt catcatctgg ccggtgggtg cgtccctgac 7740

gccgatatcg aagcgctcac agcccatggc cttgagctgt cggcctatgg cctgcaaagt 7800

cctgtcgttc ttcatcgggc caccaagcgc agccagatcg agccgtcctc ggttgtcagt 7860

ggcgtcaggt cgagcaagag caacgatgcg atcagcagca ccaccgtagg catcatggaa 7920

gccagcatca cggttagcca tagcttccag tgccaccccc gcgacgcgct ccgggcgctc 7980

tgcgcggcgc tgctcacctc ggcggctacc tcccgcaact ctttggccag ctccacccat 8040

gccgcccctg tctggcgctg ggctttcagc cactccgccg cctgcgcctc gctggcctgc 8100

ttggtctggc tcatgacctg ccgggcttcg tcggccagtg tcgccatgct ctgggccagc 8160

ggttcgatct gctccgctaa ctcgttgatg cctctggatt tcttcactct gtcgattgcg 8220

ttcatggtct attgcctccc ggtattcctg taagtcgatg atctgggcgt tggcggtgtc 8280

gatgttcagg gccacgtctg cccggtcggt gcggatgccc cggccttcca tctccaccac 8340

gttcggcccc aggtgaacac cgggcaggcg ctcgatgccc tgcgcctcaa gtgttctgtg 8400

gtcaatgcgg gcgtcgtggc cagcccgctc taatgcccgg ttggcatggt cggcccatgc 8460

ctcgcgggtc tgctcaagcc atgccttggg cttgagcgct tcggtcttct gtgccccgcc 8520

cttctccggg gtcttgccgt tgtaccgctt gaaccactga gcggcgggcc gctcgatgcc 8580

gtcattgatc cgctcggaga tcatcaggtg gcagtgcggg ttctcgccgc caccggcatg 8640

gatggccagc gtatacggca ggcgctcggc accggtcagg tgctgggcga actcggacgc 8700

cagcgccttc tgctggtcga gggtcagctc gaccggcagg gcaaattcga cctccttgaa 8760

cagccgccca ttggcgcgtt catacaggtc ggcagcatcc cagtagtcgg cgggccgctc 8820

gacgaactcc ggcatgtgcc cggattcggc gtgcaagact tcatccatgt cgcgggcata 8880

cttgccttcg cgctggatgt agtcggcctt ggccctggcc gattggccgc ccgacctgct 8940

gccggttttc gccgtaaggt gataaatcgc catgctgcct cgctgttgct tttgcttttc 9000

ggctccatgc aatggccctc ggagagcgca ccgcccgaag ggtggccgtt aggccagttt 9060

ctcgaagaga aaccggtaag tgcgccctcc cctacaaagt agggtcggga ttgccgccgc 9120

tgtgcctcca tgatagccta cgagacagca cattaacaat ggggtgtcaa gatggttaag 9180

gggagcaaca aggcggcgga tcggctggcc aagctcgaag aacaacgagc gcgaatcaat 9240

gccgaaattc agcgggagcg ggcaagggaa cagcagcaag agcgcaagaa cgaaacaagg 9300

cgcaaggtgc tggtgggggc catgattttg gccaaggtga acagcagcga gtggccggag 9360

gatcggctca tggcggcaat ggatgcgtac cttgaacgcg accacgaccg cgccttgttc 9420

ggtctgccgc cacgccagaa ggatgagccg ggctgaatga tcgaccgaga caggccctgc 9480

ggggctgcac acgcgccccc acccttcggg tagggggaaa ggccgctaaa gcggctaaaa 9540

gcgctccagc gtatttctgc ggggtttggt gtggggttta gcgggctttg cccgcctttc 9600

cccctgccgc gcagcggtgg ggcggtgtgt agcctagcgc agcgaataga ccagctatcc 9660

ggcctctggc cgggcatatt gggcaagggc agcagcgccc cacaagggcg ctgataaccg 9720

cgcctagtgg attattctta gataatcatg gatggatttt tccaacaccc cgccagcccc 9780

cgcccctgct gggtttgcag gtttgggggc gtgacagtta ttgcaggggt tcgtgacagt 9840

tattgcaggg gggcgtgaca gttattgcag gggttcgtga cagttagtac gggagtgacg 9900

ggcactggct ggcaatgtct agcaacggca ggcatttcgg ctgagggtaa aagaactttc 9960

cgctaagcga tagactgtat gtaaacacag tattgcaagg acgcggaaca tgcctcatgt 10020

ggcggccagg acggccagcc gggatcggga tactggtcgt taccagagcc accgacccga 10080

gcaaaccctt ctctatcaga tcgttgacga gtattacccg gcattcgctg cgcttatggc 10140

agagcaggga aaggaattgc cgggctatgt gcaacgggaa tttgaagaat ttctccaatg 10200

cgggcggctg gagcatggct ttctacgggt tcgctgcgag tcttgccacg ccgagcacct 10260

ggtcgctttc agaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 10320

tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 10380

tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 10440

gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 10500

gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 10560

aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 10620

gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 10680

ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 10740

tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 10800

atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 10860

ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 10920

ccggcgtcaa cacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 10980

ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 11040

atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 11100

gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 11160

tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 11220

ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaaagag tttgtagaaa 11280

cgcaaaaagg ccatccgtca ggatggcctt ctgcttaatt tgatgcctgg cagtttatgg 11340

cgggcgtcct gcccgccacc ctccgggccg ttgcttcgca acgttcaaat ccgctcccgg 11400

cggatttgtc ctactcagga gagcgttcac cgacaaacaa cagataaaac gaa 11453


<210> 127
<211> 1754
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR product


<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(12)
<223> AflII restriction site

<220>
<221> misc_feature
<222> (1743)..(1748)
<223> XbaI restriction site

<400> 127
tattcgctta agccaaagga gaatgattga tgaaatcccc cgcaccttct cgcccgcaaa 60

aaatggcgtt aattccagcc tgtatctttt tgtgtttcgc tgcgctatcg gtgcaggcag 120

aagaaacacc ggtaacacca cagccgcctg atattttatt agggccgctg tttaatgatg 180

tgcaaaacgc caaacttttt ccggaccaaa aaacctttgc cgatgccgtg ccgaacagcg 240

atccgctgat gatccttgct gattatcgga tgcagcaaaa ccagagcgga tttgatctgc 300

gccatttcgt taacgtcaat ttcaccctgc cgaaagaagg cgagaaatat gttccgccag 360

aggggcagtc actgcgcgaa catattgacg gactttggcc ggtattaacg cgttctaccg 420

aaaacaccga aaaatgggat tctctgttac cgctgccgga accttatgtc gtgccgggcg 480

gacgctttcg cgaggtatat tactgggaca gttacttcac catgttagga cttgccgaaa 540

gcggtcactg ggataaagtc gcggatatgg tggccaattt tgctcatgaa atagacactt 600

acggtcatat tcccaacggc aaccgcagtt actatttaag ccgctcgcaa ccgcccttct 660

ttgccctgat ggtagagtta ctggcgcagc atgaaggcga tgccgcgttg aagcaatacc 720

tgccgcaaat gcaaaaagaa tatgcttact ggatggacgg tgttgaaaac ctgcaagccg 780

gacaacagga aaaacgcgtt gtcaaacttc aggatggtac ccttctcaac cgctactggg 840

acgatcgcga tacgccacga ccagagtcat gggtggaaga tattgccacc gccaaaagca 900

atccgaatcg acctgccact gaaatttacc gcgacctgcg ctctgccgct gcgtctggct 960

gggatttcag ctcgcgctgg atggacaacc cgcagcagtt aaatacctta cgcaccacca 1020

gcatcgtacc ggtcgatctg aacagcctga tgtttaaaat ggaaaaaatc ctcgcccgcg 1080

ccagcaaagc tgccggagat aacgcgatgg caaaccagta cgaaacgctg gcaaatgccc 1140

gtcaaaaagg gatcgaaaaa tacctgtgga acgatcaaca aggctggtat gccgattacg 1200

acctgaaaag tcataaagtg cgcaatcagt taaccgcggc cgccctgttc ccgctgtacg 1260

tcaatgcggc agcgaaagat cgcgccaaca aaatggcgac ggcgacgaaa acacatctgc 1320

tgcaacccgg cggcctgaac accacgtcgg tgaaaagtgg gcaacaatgg gatgcgccaa 1380

atggctgggc accgttacag tgggtcgcga cagaaggatt acaaaactac gggcaaaaag 1440

aggtggcgat ggacattagc tggcacttcc tgaccaatgt tcagcacacc tatgaccggg 1500

agaaaaagct ggtggaaaaa tatgatgtca gcaccaccgg aacggggggc ggcggtggcg 1560

aatatccatt acaggatggc tttggctgga ccaatggcgt gacgctgaaa atgctggatt 1620

tgatctgccc gaaagagcaa ccgtgtgaca atgttccggc gacgcgtccg accgttaagt 1680

cagcaacgac gcaaccctca accaaagagg cacaacccac accttaacca gcgcttactc 1740

cgtctagatc attc 1754


<210> 128
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR primer


<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(12)
<223> AflII restriction site

<400> 128
tattcgctta agccaaagga gaatgattg 29


<210> 129
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR primer


<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(12)
<223> XbaI restriction site

<400> 129
gaatgatcta gacggagtaa gcgctgg 27


<210> 130
<211> 6282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> plasmid pLybAL24 containing treA

<400> 130
tagtcatgcc ccgcgcccac cggaaggagc tgactgggtt gaaggctctc aagggcatcg 60

gtcgataaat attctgaaat gagctgttga caattaatca tcgaactagt taacttttac 120

gcaagttctt aagccaaagg agaatgattg atgaaatccc ccgcaccttc tcgcccgcaa 180

aaaatggcgt taattccagc ctgtatcttt ttgtgtttcg ctgcgctatc ggtgcaggca 240

gaagaaacac cggtaacacc acagccgcct gatattttat tagggccgct gtttaatgat 300

gtgcaaaacg ccaaactttt tccggaccaa aaaacctttg ccgatgccgt gccgaacagc 360

gatccgctga tgatccttgc tgattatcgg atgcagcaaa accagagcgg atttgatctg 420

cgccatttcg ttaacgtcaa tttcaccctg ccgaaagaag gcgagaaata tgttccgcca 480

gaggggcagt cactgcgcga acatattgac ggactttggc cggtattaac gcgttctacc 540

gaaaacaccg aaaaatggga ttctctgtta ccgctgccgg aaccttatgt cgtgccgggc 600

ggacgctttc gcgaggtata ttactgggac agttacttca ccatgttagg acttgccgaa 660

agcggtcact gggataaagt cgcggatatg gtggccaatt ttgctcatga aatagacact 720

tacggtcata ttcccaacgg caaccgcagt tactatttaa gccgctcgca accgcccttc 780

tttgccctga tggtagagtt actggcgcag catgaaggcg atgccgcgtt gaagcaatac 840

ctgccgcaaa tgcaaaaaga atatgcttac tggatggacg gtgttgaaaa cctgcaagcc 900

ggacaacagg aaaaacgcgt tgtcaaactt caggatggta cccttctcaa ccgctactgg 960

gacgatcgcg atacgccacg accagagtca tgggtggaag atattgccac cgccaaaagc 1020

aatccgaatc gacctgccac tgaaatttac cgcgacctgc gctctgccgc tgcgtctggc 1080

tgggatttca gctcgcgctg gatggacaac ccgcagcagt taaatacctt acgcaccacc 1140

agcatcgtac cggtcgatct gaacagcctg atgtttaaaa tggaaaaaat cctcgcccgc 1200

gccagcaaag ctgccggaga taacgcgatg gcaaaccagt acgaaacgct ggcaaatgcc 1260

cgtcaaaaag ggatcgaaaa atacctgtgg aacgatcaac aaggctggta tgccgattac 1320

gacctgaaaa gtcataaagt gcgcaatcag ttaaccgcgg ccgccctgtt cccgctgtac 1380

gtcaatgcgg cagcgaaaga tcgcgccaac aaaatggcga cggcgacgaa aacacatctg 1440

ctgcaacccg gcggcctgaa caccacgtcg gtgaaaagtg ggcaacaatg ggatgcgcca 1500

aatggctggg caccgttaca gtgggtcgcg acagaaggat tacaaaacta cgggcaaaaa 1560

gaggtggcga tggacattag ctggcacttc ctgaccaatg ttcagcacac ctatgaccgg 1620

gagaaaaagc tggtggaaaa atatgatgtc agcaccaccg gaacgggggg cggcggtggc 1680

gaatatccat tacaggatgg ctttggctgg accaatggcg tgacgctgaa aatgctggat 1740

ttgatctgcc cgaaagagca accgtgtgac aatgttccgg cgacgcgtcc gaccgttaag 1800

tcagcaacga cgcaaccctc aaccaaagag gcacaaccca caccttaacc agcgcttact 1860

ccgtctagac atcaccatca ccatcattaa ttaagtttgt gtttaaactg caggcatgca 1920

agcttctgtt ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc 1980

agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac 2040

cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat 2100

gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc 2160

ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg 2220

agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata 2280

aactgccagg catcaaatta agcagaaggc catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct 2340

acaaactctt ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgaaaaaaa 2400

atccttacgt ttcgctaagg atgtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac 2460

caattctgat tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg 2520

attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag 2580

gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc 2640

aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg 2700

agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagcttatgc atttctttcc agacttgttc 2760

aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat 2820

tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac 2880

aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga 2940

atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag tggtgagtaa 3000

ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt 3060

cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg 3120

tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg tcgcacctga 3180

ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt 3240

taatcgcggc ctcgagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt 3300

actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 3360

cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 3420

ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 3480

tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 3540

taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 3600

caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 3660

agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 3720

gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 3780

gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 3840

ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 3900

acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 3960

tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 4020

ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt 4080

ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga 4140

ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc 4200

ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta caatctgctc 4260

tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg ggtcatggct 4320

gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca 4380

tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg 4440

tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc gtgaagcgat 4500

tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag aagcgttaat 4560

gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt ggtcacttga 4620

tgcctccgtg taagggggaa tttctgttca tgggggtaat gataccgatg aaacgagaga 4680

ggatgctcac gatacgggtt actgatgatg aacatgcccg gttactggaa cgttgtgagg 4740

gtaaacaact ggcggtatgg atgcggcggg accagagaaa aatcactcag ggtcaatgcc 4800

agcgcttcgt taatacagat gtaggtgttc cacagggtag ccagcagcat cctgcgatgc 4860

agatccggaa cataatggtg cagggcgctg acttccgcgt ttccagactt tacgaaacac 4920

ggaaaccgaa gaccattcat gttgttgctc aggtcgcaga cgttttgcag cagcagtcgc 4980

ttcacgttcg ctcgcgtatc ggtgattcat tctgctaacc agtaaggcaa ccccgccagc 5040

ctagccgggt cctcaacgac aggagcacga tcatgcgcac ccgtggccag gacccaacgc 5100

tgcccgagat gcgccgcgtg cggctgctgg agatggcgga cgcgatggat atgttctgcc 5160

aagggttggt ttgcgcattc acagttctcc gcaagaattg attggctcca attcttggag 5220

tggtgaatcc gttagcgagg tgccgccggc ttccattcag gtcgaggtgg cccggctcca 5280

tgcaccgcga cgcaacgcgg ggaggcagac aaggtatagg gcggcgccta caatccatgc 5340

caacccgttc catgtgctcg ccgaggcggc ataaatcgcc gtgacgatca gcggtccagt 5400

gatcgaagtt aggctggtaa gagccgcgag cgatccttga agctgtccct gatggtcgtc 5460

atctacctgc ctggacagca tggcctgcaa cgcgggcatc ccgatgccgc cggaagcgag 5520

aagaatcata atggggaagg ccatccagcc tcgcgtcgcg aacgccagca agacgtagcc 5580

cagcgcgtcg gccgccatgc cggcgataat ggcctgcttc tcgccgaaac gtttggtggc 5640

gggaccagtg acgaaggctt gagcgagggc gtgcaagatt ccgaataccg caagcgacag 5700

gccgatcatc gtcgcgctcc agcgaaagcg gtcctcgccg aaaatgaccc agagcgctgc 5760

cggcacctgt cctacgagtt gcatgataaa gaagacagtc ataagtgcgg cgacgatagt 5820

catgccccgc gcccaccgga aggagctgac tgggttgaag gctctcaagg gcatcggtcg 5880

acgctctccc ttatgcgact cctgcattag gaagcagccc agtagtaggt tgaggccgtt 5940

gagcaccgcc gccgcaagga atggtgcatg ctcgatggct acgagggcag acagtaagtg 6000

gatttaccat aatcccttaa ttgtacgcac cgctaaaacg cgttcagcgc gatcacggca 6060

gcagacaggt aaaaatggca acaaaccacc ctaaaaactg cgcgatcgcg cctgataaat 6120

tttaaccgta tgaataccta tgcaaccaga gggtacaggc cacattaccc ccacttaatc 6180

cactgaagct gccatttttc atggtttcac catcccagcg aagggccatg catgcatcga 6240

aattaatacg acgaaattaa tacgactcac tatagggcaa tt 6282


<210> 131
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR primer


<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(14)
<223> AflII restriction site

<400> 131
cgcaagttct taagccaaag gagaatg 27


<210> 132
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR primer


<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(12)
<223> XbaI restriction site

<400> 132
aagcgctcta gaaggtgtgg gttgtg 26


<210> 133
<211> 6264
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> plasmid pLybAL33 containing 6-His tagged treA

<400> 133
tagtcatgcc ccgcgcccac cggaaggagc tgactgggtt gaaggctctc aagggcatcg 60

gtcgataaat attctgaaat gagctgttga caattaatca tcgaactagt taacttttac 120

gcaagttctt aagccaaagg agaatgattg atgaaatccc ccgcaccttc tcgcccgcaa 180

aaaatggcgt taattccagc ctgtatcttt ttgtgtttcg ctgcgctatc ggtgcaggca 240

gaagaaacac cggtaacacc acagccgcct gatattttat tagggccgct gtttaatgat 300

gtgcaaaacg ccaaactttt tccggaccaa aaaacctttg ccgatgccgt gccgaacagc 360

gatccgctga tgatccttgc tgattatcgg atgcagcaaa accagagcgg atttgatctg 420

cgccatttcg ttaacgtcaa tttcaccctg ccgaaagaag gcgagaaata tgttccgcca 480

gaggggcagt cactgcgcga acatattgac ggactttggc cggtattaac gcgttctacc 540

gaaaacaccg aaaaatggga ttctctgtta ccgctgccgg aaccttatgt cgtgccgggc 600

ggacgctttc gcgaggtata ttactgggac agttacttca ccatgttagg acttgccgaa 660

agcggtcact gggataaagt cgcggatatg gtggccaatt ttgctcatga aatagacact 720

tacggtcata ttcccaacgg caaccgcagt tactatttaa gccgctcgca accgcccttc 780

tttgccctga tggtagagtt actggcgcag catgaaggcg atgccgcgtt gaagcaatac 840

ctgccgcaaa tgcaaaaaga atatgcttac tggatggacg gtgttgaaaa cctgcaagcc 900

ggacaacagg aaaaacgcgt tgtcaaactt caggatggta cccttctcaa ccgctactgg 960

gacgatcgcg atacgccacg accagagtca tgggtggaag atattgccac cgccaaaagc 1020

aatccgaatc gacctgccac tgaaatttac cgcgacctgc gctctgccgc tgcgtctggc 1080

tgggatttca gctcgcgctg gatggacaac ccgcagcagt taaatacctt acgcaccacc 1140

agcatcgtac cggtcgatct gaacagcctg atgtttaaaa tggaaaaaat cctcgcccgc 1200

gccagcaaag ctgccggaga taacgcgatg gcaaaccagt acgaaacgct ggcaaatgcc 1260

cgtcaaaaag ggatcgaaaa atacctgtgg aacgatcaac aaggctggta tgccgattac 1320

gacctgaaaa gtcataaagt gcgcaatcag ttaaccgcgg ccgccctgtt cccgctgtac 1380

gtcaatgcgg cagcgaaaga tcgcgccaac aaaatggcga cggcgacgaa aacacatctg 1440

ctgcaacccg gcggcctgaa caccacgtcg gtgaaaagtg ggcaacaatg ggatgcgcca 1500

aatggctggg caccgttaca gtgggtcgcg acagaaggat tacaaaacta cgggcaaaaa 1560

gaggtggcga tggacattag ctggcacttc ctgaccaatg ttcagcacac ctatgaccgg 1620

gagaaaaagc tggtggaaaa atatgatgtc agcaccaccg gaacgggggg cggcggtggc 1680

gaatatccat tacaggatgg ctttggctgg accaatggcg tgacgctgaa aatgctggat 1740

ttgatctgcc cgaaagagca accgtgtgac aatgttccgg cgacgcgtcc gaccgttaag 1800

tcagcaacga cgcaaccctc aaccaaagag gcacaaccca caccttctag acatcaccat 1860

caccatcatt aattaagttt gtgtttaaac tgcaggcatg caagcttctg ttttggcgga 1920

tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg tctgataaaa 1980

cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc gaactcagaa 2040

gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg gggtctcccc atgcgagagt agggaactgc 2100

caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg 2160

tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgc 2220

gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaat 2280

taagcagaag gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt ctacaaactc ttttgtttat 2340

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgaaaaa aaatccttac gtttcgctaa 2400

ggatgtcagc gtaatgctct gccagtgtta caaccaatta accaattctg attagaaaaa 2460

ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt 2520

ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc 2580

aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt 2640

cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg 2700

tgagaatggc aaaagcttat gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg 2760

ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc 2820

gagacgaaat acgcgatcgc tgttaaaagg acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg 2880

gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa 2940

tacctggaat gctgttttcc cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt 3000

acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac 3060

catctcatct gtaacatcat tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg 3120

cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg 3180

agcccattta tacccatata aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg gcctcgagca 3240

agacgtttcc cgttgaatat ggctcataac accccttgta ttactgttta tgtaagcaga 3300

cagttttatt gttcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 3360

accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 3420

gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 3480

caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc 3540

tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 3600

ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 3660

tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 3720

gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 3780

tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 3840

gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 3900

gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 3960

ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 4020

ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta 4080

ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag 4140

tgagcgagga agcggaagag cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta 4200

tttcacaccg catatatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag 4260

ccagtataca ctccgctatc gctacgtgac tgggtcatgg ctgcgccccg acacccgcca 4320

acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct 4380

gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg 4440

aggcagctgc ggtaaagctc atcagcgtgg tcgtgaagcg attcacagat gtctgcctgt 4500

tcatccgcgt ccagctcgtt gagtttctcc agaagcgtta atgtctggct tctgataaag 4560

cgggccatgt taagggcggt tttttcctgt ttggtcactt gatgcctccg tgtaaggggg 4620

aatttctgtt catgggggta atgataccga tgaaacgaga gaggatgctc acgatacggg 4680

ttactgatga tgaacatgcc cggttactgg aacgttgtga gggtaaacaa ctggcggtat 4740

ggatgcggcg ggaccagaga aaaatcactc agggtcaatg ccagcgcttc gttaatacag 4800

atgtaggtgt tccacagggt agccagcagc atcctgcgat gcagatccgg aacataatgg 4860

tgcagggcgc tgacttccgc gtttccagac tttacgaaac acggaaaccg aagaccattc 4920

atgttgttgc tcaggtcgca gacgttttgc agcagcagtc gcttcacgtt cgctcgcgta 4980

tcggtgattc attctgctaa ccagtaaggc aaccccgcca gcctagccgg gtcctcaacg 5040

acaggagcac gatcatgcgc acccgtggcc aggacccaac gctgcccgag atgcgccgcg 5100

tgcggctgct ggagatggcg gacgcgatgg atatgttctg ccaagggttg gtttgcgcat 5160

tcacagttct ccgcaagaat tgattggctc caattcttgg agtggtgaat ccgttagcga 5220

ggtgccgccg gcttccattc aggtcgaggt ggcccggctc catgcaccgc gacgcaacgc 5280

ggggaggcag acaaggtata gggcggcgcc tacaatccat gccaacccgt tccatgtgct 5340

cgccgaggcg gcataaatcg ccgtgacgat cagcggtcca gtgatcgaag ttaggctggt 5400

aagagccgcg agcgatcctt gaagctgtcc ctgatggtcg tcatctacct gcctggacag 5460

catggcctgc aacgcgggca tcccgatgcc gccggaagcg agaagaatca taatggggaa 5520

ggccatccag cctcgcgtcg cgaacgccag caagacgtag cccagcgcgt cggccgccat 5580

gccggcgata atggcctgct tctcgccgaa acgtttggtg gcgggaccag tgacgaaggc 5640

ttgagcgagg gcgtgcaaga ttccgaatac cgcaagcgac aggccgatca tcgtcgcgct 5700

ccagcgaaag cggtcctcgc cgaaaatgac ccagagcgct gccggcacct gtcctacgag 5760

ttgcatgata aagaagacag tcataagtgc ggcgacgata gtcatgcccc gcgcccaccg 5820

gaaggagctg actgggttga aggctctcaa gggcatcggt cgacgctctc ccttatgcga 5880

ctcctgcatt aggaagcagc ccagtagtag gttgaggccg ttgagcaccg ccgccgcaag 5940

gaatggtgca tgctcgatgg ctacgagggc agacagtaag tggatttacc ataatccctt 6000

aattgtacgc accgctaaaa cgcgttcagc gcgatcacgg cagcagacag gtaaaaatgg 6060

caacaaacca ccctaaaaac tgcgcgatcg cgcctgataa attttaaccg tatgaatacc 6120

tatgcaacca gagggtacag gccacattac ccccacttaa tccactgaag ctgccatttt 6180

tcatggtttc accatcccag cgaagggcca tgcatgcatc gaaattaata cgacgaaatt 6240

aatacgactc actatagggc aatt 6264


<210> 134
<211> 1698
<212> DNA
<213> Escherichia coli

<400> 134
atgaaatccc ccgcaccttc tcgcccgcaa aaaatggcgt taattccagc ctgtatcttt 60

ttgtgtttcg ctgcgctatc ggtgcaggca gaagaaacac cggtaacacc acagccgcct 120

gatattttat tagggccgct gtttaatgat gtgcaaaacg ccaaactttt tccggaccaa 180

aaaacctttg ccgatgccgt gccgaacagc gatccgctga tgatccttgc tgattatcgg 240

atgcagcaaa accagagcgg atttgatctg cgccatttcg ttaacgtcaa tttcaccctg 300

ccgaaagaag gcgagaaata tgttccgcca gaggggcagt cactgcgcga acatattgac 360

ggactttggc cggtattaac gcgttctacc gaaaacaccg aaaaatggga ttctctgtta 420

ccgctgccgg aaccttatgt cgtgccgggc ggacgctttc gcgaggtata ttactgggac 480

agttacttca ccatgttagg acttgccgaa agcggtcact gggataaagt cgcggatatg 540

gtggccaatt ttgctcatga aatagacact tacggtcata ttcccaacgg caaccgcagt 600

tactatttaa gccgctcgca accgcccttc tttgccctga tggtagagtt actggcgcag 660

catgaaggcg atgccgcgtt gaagcaatac ctgccgcaaa tgcaaaaaga atatgcttac 720

tggatggacg gtgttgaaaa cctgcaagcc ggacaacagg aaaaacgcgt tgtcaaactt 780

caggatggta cccttctcaa ccgctactgg gacgatcgcg atacgccacg accagagtca 840

tgggtggaag atattgccac cgccaaaagc aatccgaatc gacctgccac tgaaatttac 900

cgcgacctgc gctctgccgc tgcgtctggc tgggatttca gctcgcgctg gatggacaac 960

ccgcagcagt taaatacctt acgcaccacc agcatcgtac cggtcgatct gaacagcctg 1020

atgtttaaaa tggaaaaaat cctcgcccgc gccagcaaag ctgccggaga taacgcgatg 1080

gcaaaccagt acgaaacgct ggcaaatgcc cgtcaaaaag ggatcgaaaa atacctgtgg 1140

aacgatcaac aaggctggta tgccgattac gacctgaaaa gtcataaagt gcgcaatcag 1200

ttaaccgcgg ccgccctgtt cccgctgtac gtcaatgcgg cagcgaaaga tcgcgccaac 1260

aaaatggcga cggcgacgaa aacacatctg ctgcaacccg gcggcctgaa caccacgtcg 1320

gtgaaaagtg ggcaacaatg ggatgcgcca aatggctggg caccgttaca gtgggtcgcg 1380

acagaaggat tacaaaacta cgggcaaaaa gaggtggcga tggacattag ctggcacttc 1440

ctgaccaatg ttcagcacac ctatgaccgg gagaaaaagc tggtggaaaa atatgatgtc 1500

agcaccaccg gaacgggggg cggcggtggc gaatatccat tacaggatgg ctttggctgg 1560

accaatggcg tgacgctgaa aatgctggat ttgatctgcc cgaaagagca accgtgtgac 1620

aatgttccgg cgacgcgtcc gaccgttaag tcagcaacga cgcaaccctc aaccaaagag 1680

gcacaaccca caccttaa 1698


<210> 135
<211> 565
<212> PRT
<213> Escherichia coli

<400> 135

Met Lys Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Gln Lys Met Ala Leu Ile Pro
1 5 10 15


Ala Cys Ile Phe Leu Cys Phe Ala Ala Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu
20 25 30


Thr Pro Val Thr Pro Gln Pro Pro Asp Ile Leu Leu Gly Pro Leu Phe
35 40 45


Asn Asp Val Gln Asn Ala Lys Leu Phe Pro Asp Gln Lys Thr Phe Ala
50 55 60


Asp Ala Val Pro Asn Ser Asp Pro Leu Met Ile Leu Ala Asp Tyr Arg
65 70 75 80


Met Gln Gln Asn Gln Ser Gly Phe Asp Leu Arg His Phe Val Asn Val
85 90 95


Asn Phe Thr Leu Pro Lys Glu Gly Glu Lys Tyr Val Pro Pro Glu Gly
100 105 110


Gln Ser Leu Arg Glu His Ile Asp Gly Leu Trp Pro Val Leu Thr Arg
115 120 125


Ser Thr Glu Asn Thr Glu Lys Trp Asp Ser Leu Leu Pro Leu Pro Glu
130 135 140


Pro Tyr Val Val Pro Gly Gly Arg Phe Arg Glu Val Tyr Tyr Trp Asp
145 150 155 160


Ser Tyr Phe Thr Met Leu Gly Leu Ala Glu Ser Gly His Trp Asp Lys
165 170 175


Val Ala Asp Met Val Ala Asn Phe Ala His Glu Ile Asp Thr Tyr Gly
180 185 190


His Ile Pro Asn Gly Asn Arg Ser Tyr Tyr Leu Ser Arg Ser Gln Pro
195 200 205


Pro Phe Phe Ala Leu Met Val Glu Leu Leu Ala Gln His Glu Gly Asp
210 215 220


Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Leu Pro Gln Met Gln Lys Glu Tyr Ala Tyr
225 230 235 240


Trp Met Asp Gly Val Glu Asn Leu Gln Ala Gly Gln Gln Glu Lys Arg
245 250 255


Val Val Lys Leu Gln Asp Gly Thr Leu Leu Asn Arg Tyr Trp Asp Asp
260 265 270


Arg Asp Thr Pro Arg Pro Glu Ser Trp Val Glu Asp Ile Ala Thr Ala
275 280 285


Lys Ser Asn Pro Asn Arg Pro Ala Thr Glu Ile Tyr Arg Asp Leu Arg
290 295 300


Ser Ala Ala Ala Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg Trp Met Asp Asn
305 310 315 320


Pro Gln Gln Leu Asn Thr Leu Arg Thr Thr Ser Ile Val Pro Val Asp
325 330 335


Leu Asn Ser Leu Met Phe Lys Met Glu Lys Ile Leu Ala Arg Ala Ser
340 345 350


Lys Ala Ala Gly Asp Asn Ala Met Ala Asn Gln Tyr Glu Thr Leu Ala
355 360 365


Asn Ala Arg Gln Lys Gly Ile Glu Lys Tyr Leu Trp Asn Asp Gln Gln
370 375 380


Gly Trp Tyr Ala Asp Tyr Asp Leu Lys Ser His Lys Val Arg Asn Gln
385 390 395 400


Leu Thr Ala Ala Ala Leu Phe Pro Leu Tyr Val Asn Ala Ala Ala Lys
405 410 415


Asp Arg Ala Asn Lys Met Ala Thr Ala Thr Lys Thr His Leu Leu Gln
420 425 430


Pro Gly Gly Leu Asn Thr Thr Ser Val Lys Ser Gly Gln Gln Trp Asp
435 440 445


Ala Pro Asn Gly Trp Ala Pro Leu Gln Trp Val Ala Thr Glu Gly Leu
450 455 460


Gln Asn Tyr Gly Gln Lys Glu Val Ala Met Asp Ile Ser Trp His Phe
465 470 475 480


Leu Thr Asn Val Gln His Thr Tyr Asp Arg Glu Lys Lys Leu Val Glu
485 490 495


Lys Tyr Asp Val Ser Thr Thr Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly Glu Tyr
500 505 510


Pro Leu Gln Asp Gly Phe Gly Trp Thr Asn Gly Val Thr Leu Lys Met
515 520 525


Leu Asp Leu Ile Cys Pro Lys Glu Gln Pro Cys Asp Asn Val Pro Ala
530 535 540


Thr Arg Pro Thr Val Lys Ser Ala Thr Thr Gln Pro Ser Thr Lys Glu
545 550 555 560


Ala Gln Pro Thr Pro
565


<210> 136
<211> 1738
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> PCR product


<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(14)
<223> AflII restriction site

<220>
<221> misc_feature
<222> (1727)..(1732)
<223> XbaI restriction site

<400> 136
cgcaagttct taagccaaag gagaatgatt gatgaaatcc cccgcacctt ctcgcccgca 60

aaaaatggcg ttaattccag cctgtatctt tttgtgtttc gctgcgctat cggtgcaggc 120

agaagaaaca ccggtaacac cacagccgcc tgatatttta ttagggccgc tgtttaatga 180

tgtgcaaaac gccaaacttt ttccggacca aaaaaccttt gccgatgccg tgccgaacag 240

cgatccgctg atgatccttg ctgattatcg gatgcagcaa aaccagagcg gatttgatct 300

gcgccatttc gttaacgtca atttcaccct gccgaaagaa ggcgagaaat atgttccgcc 360

agaggggcag tcactgcgcg aacatattga cggactttgg ccggtattaa cgcgttctac 420

cgaaaacacc gaaaaatggg attctctgtt accgctgccg gaaccttatg tcgtgccggg 480

cggacgcttt cgcgaggtat attactggga cagttacttc accatgttag gacttgccga 540

aagcggtcac tgggataaag tcgcggatat ggtggccaat tttgctcatg aaatagacac 600

ttacggtcat attcccaacg gcaaccgcag ttactattta agccgctcgc aaccgccctt 660

ctttgccctg atggtagagt tactggcgca gcatgaaggc gatgccgcgt tgaagcaata 720

cctgccgcaa atgcaaaaag aatatgctta ctggatggac ggtgttgaaa acctgcaagc 780

cggacaacag gaaaaacgcg ttgtcaaact tcaggatggt acccttctca accgctactg 840

ggacgatcgc gatacgccac gaccagagtc atgggtggaa gatattgcca ccgccaaaag 900

caatccgaat cgacctgcca ctgaaattta ccgcgacctg cgctctgccg ctgcgtctgg 960

ctgggatttc agctcgcgct ggatggacaa cccgcagcag ttaaatacct tacgcaccac 1020

cagcatcgta ccggtcgatc tgaacagcct gatgtttaaa atggaaaaaa tcctcgcccg 1080

cgccagcaaa gctgccggag ataacgcgat ggcaaaccag tacgaaacgc tggcaaatgc 1140

ccgtcaaaaa gggatcgaaa aatacctgtg gaacgatcaa caaggctggt atgccgatta 1200

cgacctgaaa agtcataaag tgcgcaatca gttaaccgcg gccgccctgt tcccgctgta 1260

cgtcaatgcg gcagcgaaag atcgcgccaa caaaatggcg acggcgacga aaacacatct 1320

gctgcaaccc ggcggcctga acaccacgtc ggtgaaaagt gggcaacaat gggatgcgcc 1380

aaatggctgg gcaccgttac agtgggtcgc gacagaagga ttacaaaact acgggcaaaa 1440

agaggtggcg atggacatta gctggcactt cctgaccaat gttcagcaca cctatgaccg 1500

ggagaaaaag ctggtggaaa aatatgatgt cagcaccacc ggaacggggg gcggcggtgg 1560

cgaatatcca ttacaggatg gctttggctg gaccaatggc gtgacgctga aaatgctgga 1620

tttgatctgc ccgaaagagc aaccgtgtga caatgttccg gcgacgcgtc cgaccgttaa 1680

gtcagcaacg acgcaaccct caaccaaaga ggcacaaccc acaccttcta gagcgctt 1738


<210> 137
<211> 573
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> treA with 6-His tag

<400> 137

Met Lys Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Gln Lys Met Ala Leu Ile Pro
1 5 10 15


Ala Cys Ile Phe Leu Cys Phe Ala Ala Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu
20 25 30


Thr Pro Val Thr Pro Gln Pro Pro Asp Ile Leu Leu Gly Pro Leu Phe
35 40 45


Asn Asp Val Gln Asn Ala Lys Leu Phe Pro Asp Gln Lys Thr Phe Ala
50 55 60


Asp Ala Val Pro Asn Ser Asp Pro Leu Met Ile Leu Ala Asp Tyr Arg
65 70 75 80


Met Gln Gln Asn Gln Ser Gly Phe Asp Leu Arg His Phe Val Asn Val
85 90 95


Asn Phe Thr Leu Pro Lys Glu Gly Glu Lys Tyr Val Pro Pro Glu Gly
100 105 110


Gln Ser Leu Arg Glu His Ile Asp Gly Leu Trp Pro Val Leu Thr Arg
115 120 125


Ser Thr Glu Asn Thr Glu Lys Trp Asp Ser Leu Leu Pro Leu Pro Glu
130 135 140


Pro Tyr Val Val Pro Gly Gly Arg Phe Arg Glu Val Tyr Tyr Trp Asp
145 150 155 160


Ser Tyr Phe Thr Met Leu Gly Leu Ala Glu Ser Gly His Trp Asp Lys
165 170 175


Val Ala Asp Met Val Ala Asn Phe Ala His Glu Ile Asp Thr Tyr Gly
180 185 190


His Ile Pro Asn Gly Asn Arg Ser Tyr Tyr Leu Ser Arg Ser Gln Pro
195 200 205


Pro Phe Phe Ala Leu Met Val Glu Leu Leu Ala Gln His Glu Gly Asp
210 215 220


Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Leu Pro Gln Met Gln Lys Glu Tyr Ala Tyr
225 230 235 240


Trp Met Asp Gly Val Glu Asn Leu Gln Ala Gly Gln Gln Glu Lys Arg
245 250 255


Val Val Lys Leu Gln Asp Gly Thr Leu Leu Asn Arg Tyr Trp Asp Asp
260 265 270


Arg Asp Thr Pro Arg Pro Glu Ser Trp Val Glu Asp Ile Ala Thr Ala
275 280 285


Lys Ser Asn Pro Asn Arg Pro Ala Thr Glu Ile Tyr Arg Asp Leu Arg
290 295 300


Ser Ala Ala Ala Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg Trp Met Asp Asn
305 310 315 320


Pro Gln Gln Leu Asn Thr Leu Arg Thr Thr Ser Ile Val Pro Val Asp
325 330 335


Leu Asn Ser Leu Met Phe Lys Met Glu Lys Ile Leu Ala Arg Ala Ser
340 345 350


Lys Ala Ala Gly Asp Asn Ala Met Ala Asn Gln Tyr Glu Thr Leu Ala
355 360 365


Asn Ala Arg Gln Lys Gly Ile Glu Lys Tyr Leu Trp Asn Asp Gln Gln
370 375 380


Gly Trp Tyr Ala Asp Tyr Asp Leu Lys Ser His Lys Val Arg Asn Gln
385 390 395 400


Leu Thr Ala Ala Ala Leu Phe Pro Leu Tyr Val Asn Ala Ala Ala Lys
405 410 415


Asp Arg Ala Asn Lys Met Ala Thr Ala Thr Lys Thr His Leu Leu Gln
420 425 430


Pro Gly Gly Leu Asn Thr Thr Ser Val Lys Ser Gly Gln Gln Trp Asp
435 440 445


Ala Pro Asn Gly Trp Ala Pro Leu Gln Trp Val Ala Thr Glu Gly Leu
450 455 460


Gln Asn Tyr Gly Gln Lys Glu Val Ala Met Asp Ile Ser Trp His Phe
465 470 475 480


Leu Thr Asn Val Gln His Thr Tyr Asp Arg Glu Lys Lys Leu Val Glu
485 490 495


Lys Tyr Asp Val Ser Thr Thr Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly Glu Tyr
500 505 510


Pro Leu Gln Asp Gly Phe Gly Trp Thr Asn Gly Val Thr Leu Lys Met
515 520 525


Leu Asp Leu Ile Cys Pro Lys Glu Gln Pro Cys Asp Asn Val Pro Ala
530 535 540


Thr Arg Pro Thr Val Lys Ser Ala Thr Thr Gln Pro Ser Thr Lys Glu
545 550 555 560


Ala Gln Pro Thr Pro Ser Arg His His His His His His
565 570


<210> 138
<211> 1269
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> sequence of partially deleted Synechococcus upp

<400> 138
gagctcggta cccggggatc ccacggcagc attacggctc agaccttggt catgccctcg 60

acaacagatc tctacttcac cccagaggat tgtgaggccg aagcgcagtt gattcctaag 120

gcgcactatt gcccaattcc ctcgatctgg ggtcaccgcg cgggcaaccc cagccaaaat 180

ccgcaggatg aaagcttcat tcggcaggcc gttcaggctt tgctcaacgc tgaagcctag 240

cgaattcagt cagcagatca aggagtacca aacaggcgat cgccagcatc ccccagcccc 300

ggcacgataa agcctttgtc gttcagctgc tcatcaatga tggcgctgta aatcgtcaac 360

gccgggtagg cttgactgag tttttgtagc gctggcgggg cagccacaat tgaaagcacc 420

cgcacttgct cagcagagac accgcgatcg cgcagcaaat caagggtata gagcagcgag 480

ccacctgtcg ccagcatcgg gtcgagaacc agaacgcgac tgttcacttc aagttgctct 540

ggcaggtgat tgaggtagca gcgcggttca agactgactt catcccgctc gcgcagaatc 600

ggcacgatcg ccaagggttg cgaaaaatcg acgaactccg ctggggtttc tgcaagagga 660

gtttgcaccg ccgctggaat cgttggtagc cattcccgca cagcctcata ggcgagccag 720

cggcccagct ctgcgatcgc ggtgcgaaac agaggcgtcg gcgtctggcg atcgcgggca 780

atgcccagcc agtgccgaat taagggatgg ggcggcacga agatacgcag ttgaggagcc 840

atgccaatca gcagaagaca gctcctgatt ttaacgttca gaccccaggg gaagcggaac 900

ggtgcaggaa ggcaagcgct tctgcttcgg gcagtggtgg gccatagaag aacccttgca 960

cagcatcaca accaatcgct tctaagaagg cggcttgctc gaggcgttct acgccttctg 1020

cgatcgtgcg aagtttcaag accttggcca ttgcaacaat cgcctgcacg atcgcttgat 1080

cgtcatggtc gtgcggcaga tcgcgaataa agctgcgatc aattttgaga gcattgatgg 1140

gcaaacgctt gaggtaacca aggctggaat aacccgtccc aaaatcatct aaagcgactt 1200

gaaatcccat cgatcgggct tcctggagcc attgcagtgg gatcctctag agtcgacctg 1260

caggcatgc 1269
引用文献
本願においては、すべての公報、特許、特許出願および他の引用文献は、あたかも個別の公報、特許、特許出願または他の引用文献が、個別具体的に示されて参照によりその全体が組み込まれるのと同じ様に、その全体が参照により本願に組み込まれる。本願における引用文献の引用は、これが本発明の先行技術であるという承認ではない。

本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕光合成微生物を培養するためのフォトバイオリアクターにおいて、
その表面の少なくとも一部の上にある光合成微生物に栄養素および水分を提供するのに適した非ゼラチン質の固体培養担体であって、前記表面の一部が非水平に向けられるとき、光合成微生物がそれに付着するのを可能にする形状を有する前記固体培養担体;ならびに少なくとも前記培養担体の表面の一部をおおう物理的バリアであって、前記培養担体の表面の一部への接種、このような光合成微生物の培養に適した環境の形成および維持ならびにこのような培養した光合成微生物の収穫を可能にするように構成された前記物理的バリアを含む前記フォトバイオリアクター。
〔２〕前記培養担体の表面の一部の上にある付着した光合成微生物をさらに含む、前記〔1〕記載のフォトバイオリアクター。
〔３〕前記培養担体の表面の一部が、1リットル相当量当たり乾燥バイオマス少なくとも約50グラムの密度で光合成微生物を培養できる、前記〔1〕または前記〔2〕記載のフォトバイオリアクター。
〔４〕培養担体が柔軟性である、前記〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
〔５〕培養担体が1以上の硬質材料を含む、前記〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載にフォトバイオリアクター。
〔６〕培養担体が少なくとも2つの層、すなわち第2層に隣接した第1層を含み、ここで少なくとも2つの層の材料が同一材料または異なる材料である、前記〔1〕〜〔5〕のいずれか1つに記載のフォトバイオリアクター。
〔７〕第1層が高表面積の増殖材料を含み、第2層が透過型材料を含む、前記〔6〕記載のフォトバイオリアクター。
〔８〕培養担体が、可撓的に連結された硬質部分であって、1以上の硬質材料で構成される前記硬質部分を含む、前記〔1〕〜〔7〕のいずれか1つに記載のフォトバイオリアクター。
〔９〕物理的バリアが、固体微粒子および液体に対して少なくとも実質的に不透過性であるが、前記培養担体の表面の一部に隣接する空間を往復するガスまたは蒸気の移動を妨げないばかりでなく、前記培養担体の表面の一部の化学線照射も妨げない、前記〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
〔１０〕培養担体と物理的バリアとの間に位置する化学線源をさらに含む、前記〔1〕〜〔9〕のいずれか1つに記載のフォトバイオリアクター。
〔１１〕物理的バリアが、培養担体と化学線源との間にあり、このような化学線に対し十分に透明であり、培養中に光合成微生物による光合成を可能にするために十分にガス透過性である、前記〔1〕〜〔9〕のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
〔１２〕湿らせた培養担体が十分な水分を保持するように、物理的バリアが水蒸気に対して十分に不透過性であり、それにより培養中に光合成微生物が適切に水和されたままである、前記〔1〕〜〔11〕のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
〔１３〕バリアが、光合成微生物の培養の少なくとも一部分において、培養担体およびその培養担体上の任意の光合成微生物を密閉し、かつ、取り外し可能にシールされるように構成される、前記〔1〕〜〔12〕のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
〔１４〕フォトバイオリアクターが1つの培養担体を含む、前記〔1〕〜〔13〕のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
〔１５〕フォトバイオリアクターが複数の培養担体を含む、前記〔1〕〜〔13〕のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
〔１６〕物理的バリアが柔軟性である、前記〔1〕〜〔15〕のいずれか1つに記載のフォトバイオリアクター。
〔１７〕物理的バリアが、固体微粒子、液体、ガスおよび蒸気に対して少なくとも実質的に不透過性である第1の部分ならびに、ガスおよび蒸気に対して透過性であるが、固体微粒子および液体に対して少なくとも実質的に不透過性である第2の部分をさらに含む、前記〔1〕〜〔16〕のいずれか1つに記載のフォトバイオリアクター。
〔１８〕バリアの第2の部分が、少なくとも約5ガーレー秒から約10,000ガーレー秒以下までのガスまたは蒸気交換速度を有する、前記〔17〕記載のフォトバイオリアクター。
〔１９〕バリアの第2の部分が、オレフィン繊維もしくはポリエチレン繊維材料、ポリテトラフルオロエチレン濾過媒体、セルロース系フィルター材料、ファイバーグラスフィルター材料、ポリエステルフィルター材料、ポリアクリラートフィルター材料、ポリスルホン膜またはナイロン膜を含む選択膜を含む、前記〔17〕記載のフォトバイオリアクター。
〔２０〕第1の部分が化学線に対して少なくとも実質的に透過性であり、第2の部分が化学線に対して少なくとも実質的に透過性ではなく、第1および第2の部分の、互いに対する配置および少なくとも前記培養担体の表面の一部に対する配置が光合成微生物による光合成を維持するために十分な量の化学線およびガスが交換されるようなものである、前記〔17〕〜〔19〕のいずれか1つに記載のフォトバイオリアクター。
〔２１〕培養担体が布を含む、前記〔1〕〜〔20〕のいずれか1つに記載のフォトバイオリアクター。
〔２２〕布が天然繊維、改質天然繊維、合成繊維またはそれらの組み合わせで構成される、前記〔21〕記載のフォトバイオリアクター。
〔２３〕布が織物、編物、フェルト、架橋繊維ポリマーのメッシュまたはそれらの組み合わせである、前記〔21〕記載のフォトバイオリアクター。
〔２４〕天然繊維が綿、羊毛、アサ、木繊維、他のセルロース系繊維およびそれらの組み合わせからなる群から選択され;
改質天然繊維がニトロセルロース、セルロースアセタート、セルローススルホナート、架橋デンプンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され;
合成繊維がポリエステル、ポリアクリラート、ポリアミン、ポリアミド、ポリスルホンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、
前記〔22〕記載のフォトバイオリアクター。
〔２５〕培養担体が吸水性ポリマーでコーティングされる、前記〔1〕〜〔24〕のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
〔２６〕布、布の繊維または両方が吸水性ポリマーでコーティングされる、前記〔21〕〜〔25〕のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
〔２７〕前記吸水性ポリマーが寒天、ポリアクリラート、ポリアミド、ポリアミン、ポリエチレングリコール、修飾デンプンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記〔25〕〜〔26〕のいずれか1つに記載のフォトバイオリアクター。
〔２８〕培養担体上、培養担体内または培養担体上および培養担体内に水、栄養素、またはそれらの組み合わせをさらに含む、前記〔1〕〜〔27〕のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
〔２９〕フォトバイオリアクターを構造物へ取り付けるための1以上の取り付け部分をさらに含む、前記〔1〕〜〔28〕のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
〔３０〕固体培養担体が、培養担体を取り付けるための1以上の取り付け部分をさらに含む、前記〔1〕〜〔29〕のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
〔３１〕流体供給システム、栄養供給システム、ガス供給システムおよび微生物供給システムの少なくとも1つをさらに含む、前記〔1〕〜〔30〕のいずれか1つに記載のフォトバイオリアクター。
〔３２〕前記〔42〕〜〔55〕のいずれか1つに記載の細胞であって、固体培養担体に付着した前記細胞をさらに含む、前記〔1〕〜〔31〕のいずれか1つに記載のフォトバイオリアクター。
〔３３〕前記〔1〕〜〔32〕のいずれかに記載の少なくとも1つのフォトバイオリアクター;および
少なくとも1つのフォトバイオリアクターの少なくとも1つの培養担体が非水平に向いた少なくとも1つのフォトバイオリアクターが取り付けられる構造物
を含む、光合成微生物を培養するための装置。
〔３４〕少なくとも1つのフォトバイオリアクターが構造物から吊り下げられる、前記〔33〕記載の装置。
〔３５〕構造物が物理的バリアによって実質的におおわれる、前記〔33〕〜〔34〕のいずれか1つに記載の装置。
〔３６〕構造物が、コンベヤシステムの経路に沿って少なくとも1つの培養担体を運搬することができるようにコンベヤシステムまたはその構成要素を含む、前記〔33〕〜〔35〕のいずれか1つに記載の装置。
〔３７〕各培養担体をコンベヤシステムの経路に沿って運搬しながら光合成微生物を接種できる接種ステーション;
各培養担体をコンベヤシステムの経路に沿って運搬しながら、接種された各培養担体上の光合成微生物を培養するための培養ステーション;および
培養した光合成微生物の少なくとも一部を各培養担体から収穫するために培養担体が運ばれる収穫ステーション
をさらに含む、前記〔36〕記載の装置。
〔３８〕接種ステーションおよび収穫ステーションが、実質的に互いに隣接しているかまたは実質的に同延である、前記〔37〕記載の装置。
〔３９〕各培養担体上の光合成微生物による発酵性糖の合成を誘導するための誘導ステーションをさらに含む、前記〔33〕〜〔38〕のいずれか1つに記載の装置。
〔４０〕流体供給システム、栄養供給システム、ガス供給システムまたは微生物供給システムの少なくとも1つをさらに含む、前記〔33〕〜〔39〕のいずれか1つに記載の装置。
〔４１〕前記〔42〕〜〔55〕のいずれか1つに記載の細胞であって、固体培養担体に付着した前記細胞をさらに含む、前記〔33〕〜〔40〕のいずれかに記載の装置。
〔４２〕転写の5'から3'の方向に作動可能に連結された構成要素として:
光合成微生物細胞において機能するプロモーター;
二糖リン酸シンターゼおよび二糖リン酸ホスファターゼからなる群から選択される、二糖生合成活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;ならびに
転写終結配列;
を含む人工DNA構築物を含むトランスジェニック光合成微生物細胞であって、前記DNA構築物を含まない光合成微生物細胞と比較して増加したレベルの二糖を蓄積する前記トランスジェニック光合成微生物細胞。
〔４３〕(i)二糖リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする第1ヌクレオチド配列および二糖リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする第2ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたは(ii)二糖リン酸シンターゼ活性および二糖リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、前記〔42〕記載の細胞。
〔４４〕二糖生合成活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが:
(a)スクロースリン酸シンターゼおよびスクロースリン酸ホスファターゼ(ASF)活性を有する配列番号2またはそれに95%同一の配列;
スクロースリン酸シンターゼ(SPS)活性を有する配列番号4またはそれに95%同一の配列;
スクロースリン酸ホスファターゼ(SPP)活性を有する配列番号6またはそれに95%同一の配列;
トレハロースリン酸シンターゼ(TPS)活性を有する配列番号77またはそれに95%同一の配列;
トレハロースリン酸ホスファターゼ(TPP)活性を有する配列番号79またはそれに95%同一の配列;
グルコシルグリセロールリン酸シンターゼ(GPS)活性を有する配列番号81またはそれに95%同一の配列;
グルコシルグリセロールリン酸ホスファターゼ(GPP)活性を有する配列番号83またはそれに95%同一の配列;
マンノシルフルクトースリン酸シンターゼ(MPS)活性を有する配列番号85またはそれに95%同一の配列;および
マンノシルフルクトースリン酸ホスファターゼ(MPP)活性を有する配列番号87またはそれに95%同一の配列;
からなる群から選択されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
(b)スクロースリン酸シンターゼ/スクロースリン酸ホスファターゼ(ASF)活性をコードする配列番号1またはそれに95%同一の配列;
スクロースリン酸シンターゼ(SPS)活性をコードする配列番号3またはそれに95%同一の配列;
スクロースリン酸ホスファターゼ(SPP)活性をコードする配列番号5またはそれに95%同一の配列;
トレハロースリン酸シンターゼ(TPS)活性をコードする配列番号76またはそれに95%同一の配列;
トレハロースリン酸ホスファターゼ(TPP)活性をコードする配列番号78またはそれに95%同一の配列;
グルコシルグリセロールリン酸シンターゼ(GPS)活性をコードする配列番号80またはそれに95%同一の配列;
グルコシルグリセロールリン酸ホスファターゼ(GPP)活性をコードする配列番号82またはそれに95%同一の配列;
マンノシルフルクトースリン酸シンターゼ(MPS)活性をコードする配列番号84またはそれに95%同一の配列;および
マンノシルフルクトースリン酸ホスファターゼ(MPP)活性をコードする配列番号86またはそれに95%同一の配列;
を含む単離されたポリヌクレオチド;
(c)単離されたポリヌクレオチドがASF活性を有するポリペプチドをコードする配列番号1;単離されたポリヌクレオチドがSPS活性を有するポリペプチドをコードする配列番号3;
単離されたポリヌクレオチドがSPP活性を有するポリペプチドをコードする配列番号5;
単離されたポリヌクレオチドがTPS活性を有するポリペプチドをコードする配列番号76;
単離されたポリヌクレオチドがTPP活性を有するポリペプチドをコードする配列番号78;
単離されたポリヌクレオチドがGPS活性を有するポリペプチドをコードする配列番号80;
単離されたポリヌクレオチドがGPP活性を有するポリペプチドをコードする配列番号82;
単離されたポリヌクレオチドがMPS活性を有するポリペプチドをコードする配列番号84;
単離されたポリヌクレオチドがMPP活性を有するポリペプチドをコードする配列番号86;
からなる群から選択される核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドであって、前記ストリンジェントな条件が6X SSC(0.9M塩化ナトリウムおよび0.09Mクエン酸ナトリウム)を含む溶液中65℃でのインキュベーションを含む前記単離されたポリヌクレオチド;ならびに
(d)(a)、(b)または(c)のポリヌクレオチド配列に相補的な単離されたポリヌクレオチド
からなる群から選択される、前記〔42〕〜〔43〕のいずれか1つに記載の細胞。
〔４５〕蓄積された二糖モノマーが細胞にとって内因性である、前記〔42〕〜〔44〕のいずれか1つに記載の細胞。
〔４６〕細胞が、光合成細菌であるシアノバクテリア細胞;または緑藻である、前記〔42〕〜〔45〕のいずれか1つに記載の細胞。
〔４７〕細胞がシアノバクテリア細胞である、前記〔42〕〜〔46〕のいずれか1つに記載の細胞。
〔４８〕細胞がシネココッカスおよびシネコシスチスからなる群から選択されるシアノバクテリアである、前記〔42〕〜〔47〕のいずれか1つに記載の細胞。
〔４９〕プロモーターが誘導性プロモーターである、前記〔42〕〜〔48〕のいずれか1つに記載の細胞。
〔５０〕プロモーターがcarB、nirA、psbAII、dnaK、kaiAおよびλ PR からなる群から選択される、前記〔42〕〜〔49〕のいずれか1つに記載の細胞。
〔５１〕DNA構築物が、配列番号19(asfをコードするpLybAL11);配列番号20(asfをコードするpLybAL12);配列番号44(asfをコードするpLybAL15);配列番号45(asfをコードするpLybAL16);配列番号46(asfをコードするpLybAL17);配列番号47(asfをコードするpLybAL18);配列番号48(asfをコードするpLybAL19);配列番号49(asfをコードするpLybAL21);配列番号50(asfをコードするpLybAL22);配列番号51(asfをコードするpLybAL13f);配列番号52(asfをコードするpLyAL13r);配列番号53(asfをコードするpLybAL14f);配列番号54(asfをコードするpLybAL14r);配列番号65(asfをコードするpLybAL7f);配列番号69(asfをコードするpLybAL8f);配列番号118(tpsおよびtppをコードするpLybAL23);配列番号121(tpsおよびtppをコードするpLybAL28);配列番号122(tpsおよびtppをコードするpLybAL29);配列番号123(tpsおよびtppをコードするpLybAL30);配列番号124(tpsおよびtppをコードするpLybAL31);配列番号125(tpsおよびtppをコードするpLybAL36);配列番号126(tpsおよびtppをコードするpLybAL37);配列番号130(tpsおよびtppをコードするpLybAL24);ならびに配列番号133(tpsおよびtppをコードするpLybAL33)からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、前記〔42〕〜〔50〕のいずれか1つに記載の細胞。
〔５２〕細胞が、1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり二糖を少なくとも約0.1マイクログラム蓄積する、前記〔42〕〜〔51〕のいずれかに記載の細胞。
〔５３〕細胞が、1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり二糖を少なくとも約0.1マイクログラムから最大1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり二糖を約10マイクログラムまで蓄積する、前記〔42〕〜〔52〕のいずれか1つに記載の細胞。
〔５４〕以下:
配列番号70、配列番号72および配列番号74またはそれらに対する少なくとも95%の同一性およびインベルターゼ活性もしくはスクラーゼフェリドキシン活性を有するそれらのヌクレオチドバリアントからなる群から選択されるヌクレオチド配列を細胞が含まない;
配列番号71、配列番号73および配列番号75またはそれらに対する少なくとも95%の同一性およびインベルターゼ活性もしくはスクラーゼフェリドキシン活性を有するそれらのポリペプチドバリアントからなる群から選択されるポリペプチド配列を細胞が発現しない;または
配列番号70、配列番号72および配列番号74またはそれらに対する少なくとも95%の同一性およびインベルターゼ活性もしくはスクラーゼフェリドキシン活性を有するそれらのヌクレオチドバリアントからなる群から選択されるヌクレオチド配列に特異的な低分子干渉RNAを細胞が発現する
の少なくとも1つを満足させる、前記〔42〕〜〔53〕のいずれかに記載の細胞。
〔５５〕活性ポリンポリペプチドをコードする配列番号94またはそれに95%同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチド;
配列番号95またはそれに95%同一の配列を含みポリン活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド;または
配列番号91(ポリンをコードするpLybAL32)を含む単離されたポリヌクレオチド;
をさらに含む前記〔42〕〜〔54〕のいずれか1つに記載の細胞であって、蓄積された二糖がスクロースであり、細胞がポリンを発現し、発現されたポリンが、蓄積されたスクロースを細胞から分泌させる前記細胞。
〔５６〕配列番号19(asfをコードするpLybAL11);配列番号20(asfをコードするpLybAL12);配列番号44(asfをコードするpLybAL15);配列番号45(asfをコードするpLybAL16);配列番号46(asfをコードするpLybAL17);配列番号47(asfをコードするpLybAL18);配列番号48(asfをコードするpLybAL19);配列番号49(asfをコードするpLybAL21);配列番号50(asfをコードするpLybAL22);配列番号51(asfをコードするpLybAL13f);配列番号52(asfをコードするpLyAL13r);配列番号53(asfをコードするpLybAL14f);配列番号54(asfをコードするpLybAL14r);配列番号65(asfをコードするpLybAL7f);配列番号69(asfをコードするpLybAL8f);配列番号118(tpsおよびtppをコードするpLybAL23);配列番号121(tpsおよびtppをコードするpLybAL28);配列番号122(tpsおよびtppをコードするpLybAL29);配列番号123(tpsおよびtppをコードするpLybAL30);配列番号124(tpsおよびtppをコードするpLybAL31);配列番号125(tpsおよびtppをコードするpLybAL36);配列番号126(tpsおよびtppをコードするpLybAL37);配列番号130(tpsおよびtppをコードするpLybAL24);配列番号133(tpsおよびtppをコードするpLybAL33);配列番号91(ポリンをコードするpLybAL32);配列番号102(SS-UPPをコードするpLybAL3f);配列番号103(SE-UPPをコードするpLybAL5f);配列番号106(SE-UPPをコードするpLybAL4f);配列番号107(SE-UPPをコードするpLybAL9f);配列番号109(SE-UPPをコードするpLybAL6fb);配列番号110(SE-UPPをコードするpLybAL10fb);および配列番号91(ポリンをコードするpLybAL32)からなる群から選択される少なくとも1つの配列を含む人工DNA構築物。
〔５７〕前記〔1〕〜〔41〕のいずれかに記載のフォトバイオリアクターまたは装置を用いる光合成微生物の培養方法であって、
培養担体に光合成微生物を接種し;
接種された培養担体で光合成微生物を培養し;
培養担体から培養した光合成微生物の少なくとも一部を収穫すること
を含む前記方法。
〔５８〕物理的バリアがシールされている間、光合成微生物の培養の全部または実質的な部分が行われるように、培養担体の接種後にフォトバイオリアクターの物理的バリアをシールすることをさらに含む前記〔57〕記載の方法。
〔５９〕物理的バリアが取り外し可能にシールされている、前記〔58〕記載の方法。
〔６０〕接種ステーション、培養ステーションおよび収穫ステーションに各培養担体を運搬することをさらに含む、前記〔57〕〜〔59〕のいずれか1つに記載の方法。
〔６１〕培養担体に流体を供給すること;培養担体に栄養素を供給すること;または培養担体にガスを供給することの少なくとも1つをさらに含む、前記〔57〕〜〔60〕のいずれか1つに記載の方法。
〔６２〕光合成微生物が、1リットル相当量当たり乾燥バイオマス少なくとも約50グラムの密度まで培養される、前記〔57〕〜〔61〕のいずれかに記載の方法。
〔６３〕光合成微生物が、前記〔42〕〜〔55〕のいずれか1つに記載の細胞を含む、前記〔57〕〜〔62〕のいずれか1つに記載の方法。
〔６４〕前記〔1〕〜〔41〕記載のいずれかに記載のフォトバイオリアクターまたは装置を用いる発酵性糖の生産方法であって、
発酵性糖を蓄積できる光合成微生物を培養担体に接種し;
接種された培養担体で光合成微生物を培養し;
蓄積された発酵性糖を単離すること
を含む前記方法。
〔６５〕発酵性糖が光合成微生物内に蓄積する、前記〔64〕記載の方法。
〔６６〕蓄積された発酵性糖の単離が、
培養担体からの、培養した光合成微生物の少なくとも一部を収穫し;
収穫物からの発酵性糖を回収すること
を含む前記〔64〕〜〔65〕のいずれか1つに記載の方法。
〔６７〕蓄積された発酵性糖が、光合成微生物から分泌され、培養培地から単離される、前記〔64〕〜〔66〕のいずれかに記載の方法。
〔６８〕蓄積された発酵性糖の単離が、培養培地からの蓄積された発酵性糖の単離を含む、前記〔64〕〜〔67〕のいずれかに記載の方法。
〔６９〕物理的バリアがシールされている間、光合成微生物の培養の全部または実質的な部分が行われるように、培養担体の接種後にフォトバイオリアクターの物理的バリアを取り外し可能にシールすることをさらに含む、前記〔64〕〜〔68〕のいずれか1つに記載の方法。
〔７０〕培養担体に流体を供給すること;培養担体に栄養素を供給すること;または培養担体にガスを供給することの少なくとも1つをさらに含む、前記〔64〕〜〔69〕のいずれか1つに記載の方法。
〔７１〕培養担体を接種ステーション、培養ステーションおよび収穫ステーションの少なくとも1つに運搬することをさらに含む、前記〔64〕〜〔70〕のいずれか1つに記載の方法。
〔７２〕光合成微生物による発酵性糖の合成の誘導をさらに含む、前記〔64〕〜〔71〕のいずれか1つに記載の方法。
〔７３〕発酵性糖の合成の誘導が、温度、pH、代謝物、光、浸透圧剤、重金属および抗生物質からなる群から選択される誘導剤に光合成微生物を暴露することを含む、前記〔72〕記載の方法。
〔７４〕発酵性糖の合成の誘導が、光合成微生物を塩化合物で処理することを含む、前記〔72〕〜〔73〕のいずれか1つに記載の方法。
〔７５〕塩化合物が塩化ナトリウムである、前記〔74〕記載の方法。
〔７６〕塩化合物が約0.01mM〜1.5Mまたは約0.2〜0.9Mの濃度で添加される、前記〔74〕〜〔75〕のいずれか1つに記載の方法。
〔７７〕エアゾールスプレーによって増殖表面に誘導剤が塗布される、前記〔73〕〜〔76〕のいずれか1つに記載の方法。
〔７８〕光合成微生物が、1リットル相当量当たり乾燥バイオマス少なくとも約50グラムの密度まで培養される、前記〔64〕〜〔77〕のいずれかに記載の方法。
〔７９〕発酵性糖が、グルコース、フルクトース、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールおよびマンノシルフルクトースからなる群から選択される少なくとも1つの糖を含む、前記〔64〕〜〔78〕のいずれかに記載の方法。
〔８０〕発酵性糖が、スクロースおよびトレハロースからなる群から選択される少なくとも1つの糖を含む、前記〔64〕〜〔79〕のいずれか1つに記載の方法。
〔８１〕光合成微生物が天然に存在する光合成微生物を含む、前記〔64〕〜〔81〕のいずれか1つに記載の方法。
〔８２〕光合成微生物が遺伝子改変光合成微生物を含む、前記〔64〕〜〔81〕のいずれか1つに記載の方法。
〔８３〕光合成微生物がシアノバクテリアを含む、前記〔64〕〜〔82〕のいずれかに記載の方法。
〔８４〕光合成微生物がシネココッカスまたはシネコシスチスからなる群から選択されるシアノバクテリアを含む、前記〔64〕〜〔83〕のいずれか1つに記載の方法。
〔８５〕光合成微生物が前記〔42〕〜〔52〕のいずれか1つに記載の細胞を含む、前記〔64〕〜〔84〕のいずれか1つに記載の方法。

Claims (85)

  1. 光合成微生物を培養するためのフォトバイオリアクターにおいて、
    その表面の少なくとも一部の上にある光合成微生物に栄養素および水分を提供するのに適した非ゼラチン質の固体培養担体であって、前記表面の一部が非水平に向けられるとき、光合成微生物がそれに付着するのを可能にする形状を有する前記固体培養担体;ならびに少なくとも前記培養担体の表面の一部をおおう物理的バリアであって、前記培養担体の表面の一部への接種、このような光合成微生物の培養に適した環境の形成および維持ならびにこのような培養した光合成微生物の収穫を可能にするように構成された前記物理的バリア
    を含む前記フォトバイオリアクター。
  2. 前記培養担体の表面の一部の上にある付着した光合成微生物をさらに含む、請求項1記載のフォトバイオリアクター。
  3. 前記培養担体の表面の一部が、1リットル相当量当たり乾燥バイオマス少なくとも約50グラムの密度で光合成微生物を培養できる、請求項1または請求項2記載のフォトバイオリアクター。
  4. 培養担体が柔軟性である、請求項1〜3のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
  5. 培養担体が1以上の硬質材料を含む、請求項1〜3のいずれかに記載にフォトバイオリアクター。
  6. 培養担体が少なくとも2つの層、すなわち第2層に隣接した第1層を含み、ここで少なくとも2つの層の材料が同一材料または異なる材料である、請求項1〜5のいずれか1つに記載のフォトバイオリアクター。
  7. 第1層が高表面積の増殖材料を含み、第2層が透過型材料を含む、請求項6記載のフォトバイオリアクター。
  8. 培養担体が、可撓的に連結された硬質部分であって、1以上の硬質材料で構成される前記硬質部分を含む、請求項1〜7のいずれか1つに記載のフォトバイオリアクター。
  9. 物理的バリアが、固体微粒子および液体に対して少なくとも実質的に不透過性であるが、前記培養担体の表面の一部に隣接する空間を往復するガスまたは蒸気の移動を妨げないばかりでなく、前記培養担体の表面の一部の化学線照射も妨げない、請求項1〜8のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
  10. 培養担体と物理的バリアとの間に位置する化学線源をさらに含む、請求項1〜9のいずれか1つに記載のフォトバイオリアクター。
  11. 物理的バリアが、培養担体と化学線源との間にあり、このような化学線に対し十分に透明であり、培養中に光合成微生物による光合成を可能にするために十分にガス透過性である、請求項1〜9のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
  12. 湿らせた培養担体が十分な水分を保持するように、物理的バリアが水蒸気に対して十分に不透過性であり、それにより培養中に光合成微生物が適切に水和されたままである、請求項1〜11のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
  13. バリアが、光合成微生物の培養の少なくとも一部分において、培養担体およびその培養担体上の任意の光合成微生物を密閉し、かつ、取り外し可能にシールされるように構成される、請求項1〜12のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
  14. フォトバイオリアクターが1つの培養担体を含む、請求項1〜13のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
  15. フォトバイオリアクターが複数の培養担体を含む、請求項1〜13のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
  16. 物理的バリアが柔軟性である、請求項1〜15のいずれか1つに記載のフォトバイオリアクター。
  17. 物理的バリアが、固体微粒子、液体、ガスおよび蒸気に対して少なくとも実質的に不透過性である第1の部分ならびに、ガスおよび蒸気に対して透過性であるが、固体微粒子および液体に対して少なくとも実質的に不透過性である第2の部分をさらに含む、請求項1〜16のいずれか1つに記載のフォトバイオリアクター。
  18. バリアの第2の部分が、少なくとも約5ガーレー秒から約10,000ガーレー秒以下までのガスまたは蒸気交換速度を有する、請求項17記載のフォトバイオリアクター。
  19. バリアの第2の部分が、オレフィン繊維もしくはポリエチレン繊維材料、ポリテトラフルオロエチレン濾過媒体、セルロース系フィルター材料、ファイバーグラスフィルター材料、ポリエステルフィルター材料、ポリアクリラートフィルター材料、ポリスルホン膜またはナイロン膜を含む選択膜を含む、請求項17記載のフォトバイオリアクター。
  20. 第1の部分が化学線に対して少なくとも実質的に透過性であり、第2の部分が化学線に対して少なくとも実質的に透過性ではなく、第1および第2の部分の、互いに対する配置および少なくとも前記培養担体の表面の一部に対する配置が光合成微生物による光合成を維持するために十分な量の化学線およびガスが交換されるようなものである、請求項17〜19のいずれか1つに記載のフォトバイオリアクター。
  21. 培養担体が布を含む、請求項1〜20のいずれか1つに記載のフォトバイオリアクター。
  22. 布が天然繊維、改質天然繊維、合成繊維またはそれらの組み合わせで構成される、請求項21記載のフォトバイオリアクター。
  23. 布が織物、編物、フェルト、架橋繊維ポリマーのメッシュまたはそれらの組み合わせである、請求項21記載のフォトバイオリアクター。
  24. 天然繊維が綿、羊毛、アサ、木繊維、他のセルロース系繊維およびそれらの組み合わせからなる群から選択され;
    改質天然繊維がニトロセルロース、セルロースアセタート、セルローススルホナート、架橋デンプンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され;
    合成繊維がポリエステル、ポリアクリラート、ポリアミン、ポリアミド、ポリスルホンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、
    請求項22記載のフォトバイオリアクター。
  25. 培養担体が吸水性ポリマーでコーティングされる、請求項1〜24のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
  26. 布、布の繊維または両方が吸水性ポリマーでコーティングされる、請求項21〜25のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
  27. 前記吸水性ポリマーが寒天、ポリアクリラート、ポリアミド、ポリアミン、ポリエチレングリコール、修飾デンプンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項25〜26のいずれか1つに記載のフォトバイオリアクター。
  28. 培養担体上、培養担体内または培養担体上および培養担体内に水、栄養素、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項1〜27のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
  29. フォトバイオリアクターを構造物へ取り付けるための1以上の取り付け部分をさらに含む、請求項1〜28のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
  30. 固体培養担体が、培養担体を取り付けるための1以上の取り付け部分をさらに含む、請求項1〜29のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
  31. 流体供給システム、栄養供給システム、ガス供給システムおよび微生物供給システムの少なくとも1つをさらに含む、請求項1〜30のいずれか1つに記載のフォトバイオリアクター。
  32. 請求項42〜55のいずれか1つに記載の細胞であって、固体培養担体に付着した前記細胞をさらに含む、請求項1〜31のいずれか1つに記載のフォトバイオリアクター。
  33. 請求項1〜32のいずれかに記載の少なくとも1つのフォトバイオリアクター;および
    少なくとも1つのフォトバイオリアクターの少なくとも1つの培養担体が非水平に向いた少なくとも1つのフォトバイオリアクターが取り付けられる構造物
    を含む、光合成微生物を培養するための装置。
  34. 少なくとも1つのフォトバイオリアクターが構造物から吊り下げられる、請求項33記載の装置。
  35. 構造物が物理的バリアによって実質的におおわれる、請求項33〜34のいずれか1つに記載の装置。
  36. 構造物が、コンベヤシステムの経路に沿って少なくとも1つの培養担体を運搬することができるようにコンベヤシステムまたはその構成要素を含む、請求項33〜35のいずれか1つに記載の装置。
  37. 各培養担体をコンベヤシステムの経路に沿って運搬しながら光合成微生物を接種できる接種ステーション;
    各培養担体をコンベヤシステムの経路に沿って運搬しながら、接種された各培養担体上の光合成微生物を培養するための培養ステーション;および
    培養した光合成微生物の少なくとも一部を各培養担体から収穫するために培養担体が運ばれる収穫ステーション
    をさらに含む、請求項36記載の装置。
  38. 接種ステーションおよび収穫ステーションが、実質的に互いに隣接しているかまたは実質的に同延である、請求項37記載の装置。
  39. 各培養担体上の光合成微生物による発酵性糖の合成を誘導するための誘導ステーションをさらに含む、請求項33〜38のいずれか1つに記載の装置。
  40. 流体供給システム、栄養供給システム、ガス供給システムまたは微生物供給システムの少なくとも1つをさらに含む、請求項33〜39のいずれか1つに記載の装置。
  41. 請求項42〜55のいずれか1つに記載の細胞であって、固体培養担体に付着した前記細胞をさらに含む、請求項33〜40のいずれかに記載の装置。
  42. 転写の5’から3’の方向に作動可能に連結された構成要素として:
    光合成微生物細胞において機能するプロモーター;
    二糖リン酸シンターゼおよび二糖リン酸ホスファターゼからなる群から選択される、二糖生合成活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;ならびに
    転写終結配列;
    を含む人工DNA構築物を含むトランスジェニック光合成微生物細胞であって、前記DNA構築物を含まない光合成微生物細胞と比較して増加したレベルの二糖を蓄積する前記トランスジェニック光合成微生物細胞。
  43. (i)二糖リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする第1ヌクレオチド配列および二糖リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする第2ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたは(ii)二糖リン酸シンターゼ活性および二糖リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、請求項42記載の細胞。
  44. 二糖生合成活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが:
    (a)スクロースリン酸シンターゼおよびスクロースリン酸ホスファターゼ(ASF)活性を有する配列番号2またはそれに95%同一の配列;
    スクロースリン酸シンターゼ(SPS)活性を有する配列番号4またはそれに95%同一の配列;
    スクロースリン酸ホスファターゼ(SPP)活性を有する配列番号6またはそれに95%同一の配列;
    トレハロースリン酸シンターゼ(TPS)活性を有する配列番号77またはそれに95%同一の配列;
    トレハロースリン酸ホスファターゼ(TPP)活性を有する配列番号79またはそれに95%同一の配列;
    グルコシルグリセロールリン酸シンターゼ(GPS)活性を有する配列番号81またはそれに95%同一の配列;
    グルコシルグリセロールリン酸ホスファターゼ(GPP)活性を有する配列番号83またはそれに95%同一の配列;
    マンノシルフルクトースリン酸シンターゼ(MPS)活性を有する配列番号85またはそれに95%同一の配列;および
    マンノシルフルクトースリン酸ホスファターゼ(MPP)活性を有する配列番号87またはそれに95%同一の配列;
    からなる群から選択されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
    (b)スクロースリン酸シンターゼ/スクロースリン酸ホスファターゼ(ASF)活性をコードする配列番号1またはそれに95%同一の配列;
    スクロースリン酸シンターゼ(SPS)活性をコードする配列番号3またはそれに95%同一の配列;
    スクロースリン酸ホスファターゼ(SPP)活性をコードする配列番号5またはそれに95%同一の配列;
    トレハロースリン酸シンターゼ(TPS)活性をコードする配列番号76またはそれに95%同一の配列;
    トレハロースリン酸ホスファターゼ(TPP)活性をコードする配列番号78またはそれに95%同一の配列;
    グルコシルグリセロールリン酸シンターゼ(GPS)活性をコードする配列番号80またはそれに95%同一の配列;
    グルコシルグリセロールリン酸ホスファターゼ(GPP)活性をコードする配列番号82またはそれに95%同一の配列;
    マンノシルフルクトースリン酸シンターゼ(MPS)活性をコードする配列番号84またはそれに95%同一の配列;および
    マンノシルフルクトースリン酸ホスファターゼ(MPP)活性をコードする配列番号86またはそれに95%同一の配列;
    を含む単離されたポリヌクレオチド;
    (c)単離されたポリヌクレオチドがASF活性を有するポリペプチドをコードする配列番号1;単離されたポリヌクレオチドがSPS活性を有するポリペプチドをコードする配列番号3;
    単離されたポリヌクレオチドがSPP活性を有するポリペプチドをコードする配列番号5;
    単離されたポリヌクレオチドがTPS活性を有するポリペプチドをコードする配列番号76;
    単離されたポリヌクレオチドがTPP活性を有するポリペプチドをコードする配列番号78;
    単離されたポリヌクレオチドがGPS活性を有するポリペプチドをコードする配列番号80;
    単離されたポリヌクレオチドがGPP活性を有するポリペプチドをコードする配列番号82;
    単離されたポリヌクレオチドがMPS活性を有するポリペプチドをコードする配列番号84;
    単離されたポリヌクレオチドがMPP活性を有するポリペプチドをコードする配列番号86;
    からなる群から選択される核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドであって、前記ストリンジェントな条件が6X SSC(0.9M塩化ナトリウムおよび0.09Mクエン酸ナトリウム)を含む溶液中65℃でのインキュベーションを含む前記単離されたポリヌクレオチド;ならびに
    (d)(a)、(b)または(c)のポリヌクレオチド配列に相補的な単離されたポリヌクレオチド
    からなる群から選択される、請求項42〜43のいずれか1つに記載の細胞。
  45. 蓄積された二糖モノマーが細胞にとって内因性である、請求項42〜44のいずれか1つに記載の細胞。
  46. 細胞が、光合成細菌であるシアノバクテリア細胞;または緑藻である、請求項42〜45のいずれか1つに記載の細胞。
  47. 細胞がシアノバクテリア細胞である、請求項42〜46のいずれか1つに記載の細胞。
  48. 細胞がシネココッカスおよびシネコシスチスからなる群から選択されるシアノバクテリアである、請求項42〜47のいずれか1つに記載の細胞。
  49. プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項42〜48のいずれか1つに記載の細胞。
  50. プロモーターがcarB、nirA、psbAII、dnaK、kaiAおよびλPRからなる群から選択される、請求項42〜49のいずれか1つに記載の細胞。
  51. DNA構築物が、配列番号19(asfをコードするpLybAL11);配列番号20(asfをコードするpLybAL12);配列番号44(asfをコードするpLybAL15);配列番号45(asfをコードするpLybAL16);配列番号46(asfをコードするpLybAL17);配列番号47(asfをコードするpLybAL18);配列番号48(asfをコードするpLybAL19);配列番号49(asfをコードするpLybAL21);配列番号50(asfをコードするpLybAL22);配列番号51(asfをコードするpLybAL13f);配列番号52(asfをコードするpLyAL13r);配列番号53(asfをコードするpLybAL14f);配列番号54(asfをコードするpLybAL14r);配列番号65(asfをコードするpLybAL7f);配列番号69(asfをコードするpLybAL8f);配列番号118(tpsおよびtppをコードするpLybAL23);配列番号121(tpsおよびtppをコードするpLybAL28);配列番号122(tpsおよびtppをコードするpLybAL29);配列番号123(tpsおよびtppをコードするpLybAL30);配列番号124(tpsおよびtppをコードするpLybAL31);配列番号125(tpsおよびtppをコードするpLybAL36);配列番号126(tpsおよびtppをコードするpLybAL37);配列番号130(tpsおよびtppをコードするpLybAL24);ならびに配列番号133(tpsおよびtppをコードするpLybAL33)からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項42〜50のいずれか1つに記載の細胞。
  52. 細胞が、1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり二糖を少なくとも約0.1マイクログラム蓄積する、請求項42〜51のいずれかに記載の細胞。
  53. 細胞が、1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり二糖を少なくとも約0.1マイクログラムから最大1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり二糖を約10マイクログラムまで蓄積する、請求項42〜52のいずれか1つに記載の細胞。
  54. 以下:
    配列番号70、配列番号72および配列番号74またはそれらに対する少なくとも95%の同一性およびインベルターゼ活性もしくはスクラーゼフェリドキシン活性を有するそれらのヌクレオチドバリアントからなる群から選択されるヌクレオチド配列を細胞が含まない;
    配列番号71、配列番号73および配列番号75またはそれらに対する少なくとも95%の同一性およびインベルターゼ活性もしくはスクラーゼフェリドキシン活性を有するそれらのポリペプチドバリアントからなる群から選択されるポリペプチド配列を細胞が発現しない;または
    配列番号70、配列番号72および配列番号74またはそれらに対する少なくとも95%の同一性およびインベルターゼ活性もしくはスクラーゼフェリドキシン活性を有するそれらのヌクレオチドバリアントからなる群から選択されるヌクレオチド配列に特異的な低分子干渉RNAを細胞が発現する
    の少なくとも1つを満足させる、請求項42〜53のいずれかに記載の細胞。
  55. 活性ポリンポリペプチドをコードする配列番号94またはそれに95%同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチド;
    配列番号95またはそれに95%同一の配列を含みポリン活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド;または
    配列番号91(ポリンをコードするpLybAL32)を含む単離されたポリヌクレオチド;
    をさらに含む請求項42〜54のいずれか1つに記載の細胞であって、蓄積された二糖がスクロースであり、細胞がポリンを発現し、発現されたポリンが、蓄積されたスクロースを細胞から分泌させる前記細胞。
  56. 配列番号19(asfをコードするpLybAL11);配列番号20(asfをコードするpLybAL12);配列番号44(asfをコードするpLybAL15);配列番号45(asfをコードするpLybAL16);配列番号46(asfをコードするpLybAL17);配列番号47(asfをコードするpLybAL18);配列番号48(asfをコードするpLybAL19);配列番号49(asfをコードするpLybAL21);配列番号50(asfをコードするpLybAL22);配列番号51(asfをコードするpLybAL13f);配列番号52(asfをコードするpLyAL13r);配列番号53(asfをコードするpLybAL14f);配列番号54(asfをコードするpLybAL14r);配列番号65(asfをコードするpLybAL7f);配列番号69(asfをコードするpLybAL8f);配列番号118(tpsおよびtppをコードするpLybAL23);配列番号121(tpsおよびtppをコードするpLybAL28);配列番号122(tpsおよびtppをコードするpLybAL29);配列番号123(tpsおよびtppをコードするpLybAL30);配列番号124(tpsおよびtppをコードするpLybAL31);配列番号125(tpsおよびtppをコードするpLybAL36);配列番号126(tpsおよびtppをコードするpLybAL37);配列番号130(tpsおよびtppをコードするpLybAL24);配列番号133(tpsおよびtppをコードするpLybAL33);配列番号91(ポリンをコードするpLybAL32);配列番号102(SS-UPPをコードするpLybAL3f);配列番号103(SE-UPPをコードするpLybAL5f);配列番号106(SE-UPPをコードするpLybAL4f);配列番号107(SE-UPPをコードするpLybAL9f);配列番号109(SE-UPPをコードするpLybAL6fb);配列番号110(SE-UPPをコードするpLybAL10fb);および配列番号91(ポリンをコードするpLybAL32)からなる群から選択される少なくとも1つの配列を含む人工DNA構築物。
  57. 請求項1〜41のいずれかに記載のフォトバイオリアクターまたは装置を用いる光合成微生物の培養方法であって、
    培養担体に光合成微生物を接種し;
    接種された培養担体で光合成微生物を培養し;
    培養担体から培養した光合成微生物の少なくとも一部を収穫すること
    を含む前記方法。
  58. 物理的バリアがシールされている間、光合成微生物の培養の全部または実質的な部分が行われるように、培養担体の接種後にフォトバイオリアクターの物理的バリアをシールすることをさらに含む請求項57記載の方法。
  59. 物理的バリアが取り外し可能にシールされている、請求項58記載の方法。
  60. 接種ステーション、培養ステーションおよび収穫ステーションに各培養担体を運搬することをさらに含む、請求項57〜59のいずれか1つに記載の方法。
  61. 培養担体に流体を供給すること;培養担体に栄養素を供給すること;または培養担体にガスを供給することの少なくとも1つをさらに含む、請求項57〜60のいずれか1つに記載の方法。
  62. 光合成微生物が、1リットル相当量当たり乾燥バイオマス少なくとも約50グラムの密度まで培養される、請求項57〜61のいずれかに記載の方法。
  63. 光合成微生物が、請求項42〜55のいずれか1つに記載の細胞を含む、請求項57〜62のいずれか1つに記載の方法。
  64. 請求項1〜41記載のいずれかに記載のフォトバイオリアクターまたは装置を用いる発酵性糖の生産方法であって、
    発酵性糖を蓄積できる光合成微生物を培養担体に接種し;
    接種された培養担体で光合成微生物を培養し;
    蓄積された発酵性糖を単離すること
    を含む前記方法。
  65. 発酵性糖が光合成微生物内に蓄積する、請求項64記載の方法。
  66. 蓄積された発酵性糖の単離が、
    培養担体からの、培養した光合成微生物の少なくとも一部を収穫し;
    収穫物からの発酵性糖を回収すること
    を含む請求項64〜65のいずれか1つに記載の方法。
  67. 蓄積された発酵性糖が、光合成微生物から分泌され、培養培地から単離される、請求項64〜66のいずれかに記載の方法。
  68. 蓄積された発酵性糖の単離が、培養培地からの蓄積された発酵性糖の単離を含む、請求項64〜67のいずれかに記載の方法。
  69. 物理的バリアがシールされている間、光合成微生物の培養の全部または実質的な部分が行われるように、培養担体の接種後にフォトバイオリアクターの物理的バリアを取り外し可能にシールすることをさらに含む、請求項64〜68のいずれか1つに記載の方法。
  70. 培養担体に流体を供給すること;培養担体に栄養素を供給すること;または培養担体にガスを供給することの少なくとも1つをさらに含む、請求項64〜69のいずれか1つに記載の方法。
  71. 培養担体を接種ステーション、培養ステーションおよび収穫ステーションの少なくとも1つに運搬することをさらに含む、請求項64〜70のいずれか1つに記載の方法。
  72. 光合成微生物による発酵性糖の合成の誘導をさらに含む、請求項64〜71のいずれか1つに記載の方法。
  73. 発酵性糖の合成の誘導が、温度、pH、代謝物、光、浸透圧剤、重金属および抗生物質からなる群から選択される誘導剤に光合成微生物を暴露することを含む、請求項72記載の方法。
  74. 発酵性糖の合成の誘導が、光合成微生物を塩化合物で処理することを含む、請求項72〜73のいずれか1つに記載の方法。
  75. 塩化合物が塩化ナトリウムである、請求項74記載の方法。
  76. 塩化合物が約0.01mM〜1.5Mまたは約0.2〜0.9Mの濃度で添加される、請求項74〜75のいずれか1つに記載の方法。
  77. エアゾールスプレーによって増殖表面に誘導剤が塗布される、請求項73〜76のいずれか1つに記載の方法。
  78. 光合成微生物が、1リットル相当量当たり乾燥バイオマス少なくとも約50グラムの密度まで培養される、請求項64〜77のいずれかに記載の方法。
  79. 発酵性糖が、グルコース、フルクトース、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールおよびマンノシルフルクトースからなる群から選択される少なくとも1つの糖を含む、請求項64〜78のいずれかに記載の方法。
  80. 発酵性糖が、スクロースおよびトレハロースからなる群から選択される少なくとも1つの糖を含む、請求項64〜79のいずれか1つに記載の方法。
  81. 光合成微生物が天然に存在する光合成微生物を含む、請求項64〜81のいずれか1つに記載の方法。
  82. 光合成微生物が遺伝子改変光合成微生物を含む、請求項64〜81のいずれか1つに記載の方法。
  83. 光合成微生物がシアノバクテリアを含む、請求項64〜82のいずれかに記載の方法。
  84. 光合成微生物がシネココッカスまたはシネコシスチスからなる群から選択されるシアノバクテリアを含む、請求項64〜83のいずれか1つに記載の方法。
  85. 光合成微生物が請求項42〜52のいずれか1つに記載の細胞を含む、請求項64〜84のいずれか1つに記載の方法。
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