CN101896607A - 通过光合生物产生分子 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于通过光合生物生成产物的组合物及方法。所述光合生物被基因修饰，以引起产物的生成、分泌或两者。所述方法和组合物在石油化工工业中特别有用。

Description

通过光合生物产生分子

相关申请的交叉参考

本申请要求美国临时申请号60/971,418(2007年9月11日提交)、60/971,412(2007年9月11日提交)和61/130,892(2008年6月2日提交)的优先权和权益，它们在此通过引用被并入。

通过引用并入

本说明书中提到的所有出版物和专利申请在此通过引用被并入，其程度如同每一份单独的出版物或专利申请被特定且单独地指明通过引用而并入。

发明背景

燃料产品，如油料、石油化学产品及对石化产品生产有用的其它物质，对它们的需求不断增长。当今大多数燃料产品是从化石燃料中生产的，所述化石燃料被认为是不可再生的能量来源，因为它们是有机物质在上百万年的过程中被连续的沉积层覆盖的结果。也存在增长的减少对进口原油依赖的期望。关于污染和环境危害的公共意识也已经提高。因此，对生产燃料产品的替代方法，已经存在增长的兴趣和需要。所以，对开发燃料产品的替代方法存在紧迫的需要，所述燃料产品是可再生的，可持续的，并且对环境危害较小。

发明概述

本发明涉及使用光合生物生产产物的组合物及方法，所述产物例如类异戊二烯，其可以被用于多种用途(如燃料、燃料原料、香料和杀虫剂)。所述组合物包括包含一个或多个核苷酸序列的表达载体，所述核苷酸序列起始、提高或影响产物在无维管光合生物中的生产。

在一些情况中，这样的核苷酸序列编码甲羟戊酸途径(MVA途径)中的一个或多个多肽。MVA途径中多肽的实例包括，但不限于，硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸(phosphemevalonate)激酶或甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧酶。在另一些实施方式中，所述核苷酸序列编码非甲羟戊酸途径(MEP途径)中的一个多肽。该多肽可以是DOXP合成酶、DOXP还原酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶(4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol synthase)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶、2-C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸合成酶(2-C-methyl-D-erythritol 2，4，-cyclodiphosphatesynthase)、HMB-PP合成酶、HMB-PP还原酶和DOXP还原异构酶。

本发明的一个方面提供了一种载体，所述载体包含编码生产带有两个磷酸根的类异戊二烯的酶的核酸和被配置来在无维管光合生物(NVPO)的叶绿体中表达核酸的启动子，但该载体不包含叶绿体整个基因组。实际上，该载体插入叶绿体基因组中可以不破坏叶绿体的光合能力。在另一些实施方式中，本发明所述的载体进一步包含促进与叶绿体基因组同源重组的核酸序列。在一些实施方式中，通过这里公开的载体中编码的酶生产的类异戊二烯为GPP、IPP、FPP、GGPP或DMAPP。在这里公开的一些载体中，编码第二种酶的第二个核酸也存在于所述载体中，所述第二种酶修饰有两个磷酸根的类异戊二烯。可由本发明所述载体编码的第二种酶的具体实例包括，但不限于，葡萄烃(botryococcene)合成酶、苧烯(limonene)合成酶、桉叶油素(cineole)合成酶、蒎烯(pinene)合成酶、莰烯(camphene)合成酶、桧萜(sabinene)合成酶、月桂烯(myrcene)合成酶、松香二烯(abietadiene)合成酶、紫杉二烯(taxadiene)合成酶、FPP合成酶、红没药烯(bisabolene)合成酶、diapophytoene去饱和酶、diapophytoene合成酶、GPP合成酶、IPP异构酶、单萜合成酶、异松油烯(terpinolene)合成酶、姜烯(zingiberene)合成酶、罗勒烯(ocimene)合成酶、倍半萜合成酶、姜黄烯(curcumene)合成酶、法尼烯(farnesene)合成酶、忙牛儿基忙牛儿基还原酶、叶绿素酯水解酶(chlorophyllidohydrolase)、β-石竹烯(β-caryophyllene)合成酶、大根香叶烯A(germacrene A)合成酶、8-表雪松醇(8-epicedrol)合成酶、朱栾倍半萜(valencene)合成酶、(+)-δ-杜松烯((+)-δ-cadinene)合成酶、大根香叶烯C合成酶、(E)-β-法尼烯合成酶、蓖麻烯(casbene)合成酶、vetispiradiene合成酶、5-表-马兜铃烯(5-epi-aristolochene)合成酶、马兜铃烯(aristolchene)合成酶、α-葎草烯(α-humulene)、(E，E)-α-法尼烯合成酶、(-)-β-蒎烯合成酶、γ-松油烯合成酶、苧烯环化酶、沉香醇(linalool)合成酶、(+)-冰片二磷酸(bornyl diphosphate)合成酶、左旋海松二烯(levopimaradiene)合成酶、异海松二烯(isopimaradiene)合成酶、(E)-γ-红没药烯合成酶、柯巴基焦磷酸(copalyl pyrophosphate)合成酶、贝壳衫烯(kaurene)合成酶、长叶烯(longifolene)合成酶、γ-葎草烯合成酶、δ-蛇床烯(selinene)合成酶、β-水芹烯(phellandrene)合成酶、异松油烯(terpinolene)合成酶、(+)-3-蒈烯(carene)合成酶、顺-柯巴基二磷酸(syn-copalyl diphosphate)合成酶、α-松油醇(terpineol)合成酶、顺-海松-7，15-二烯(syn-pimara-7，15-diene)合成酶、反-山达海松二烯(sandaaracopimaradiene)合成酶、sterner-13-ene合成酶、E-β-罗勒烯、S-沉香醇合成酶、牻牛儿醇(geraniol)合成酶、γ-松油烯(gamma-terpinene)合成酶、沉香醇合成酶、E-β-罗勒烯合成酶、表-雪松醇(epi-cedrol)合成酶、α-姜烯合成酶、愈创木二烯(guaiadiene)合成酶、卡藜二烯(cascarilladiene)合成酶、顺-穆罗拉二烯(muuroladiene)合成酶、阿菲迪柯林-16b-醇(aphidicolan-16b-ol)合成酶、伊丽莎白三烯(elizabethatriene)合成酶、檀香醇(sandalol)合成酶、广藿香醇(patchoulol)合成酶、zinzanol合成酶、雪松醇合成酶、香紫苏醇(scareol)合成酶、柯巴醇(copalol)合成酶或泪柏醇(manool)合成酶。所述载体也可包含选择性标记。本发明所述的具体载体能够在微藻(microalga)中稳定转化。在一些实施方式中，所述海藻种为莱茵衣藻(C.reinhardtii)、盐生杜氏藻(D.salina)、雨生红球藻(H.pluvalis)、二形栅藻(S.dimorphus)、绿色杜氏藻(D.viridis)或杜氏盐藻(D.tertiolecta)。对于无维管光合微生物核酸和/或叶绿体的表达，编码酶的核酸序列可以是偏倚的(biased)。编码本发明中有用的酶的序列可以是这里具体公开的序列(如表5-8中的序列)或与其有60、65、70、75、80、85、90、95或更高同一性的序列中的任一序列。本发明所述的一些载体包含这里具体公开的序列(如表5-8中的序列)或与其有60、65、70、75、80、85、90、95或更高同一性的序列中的任一序列。

这里公开的另一载体包含编码生产带有两个磷酸根的类异戊二烯的酶的核酸，和编码叶绿体靶向分子的核酸，所述靶向分子用于将所述酶靶向叶绿体。这些载体可进一步包含选择性标记——促进与叶绿体或核基因组同源重组的核酸序列，或这些特征的组合。在一些实施方式中，由所述核酸编码的酶产生GPP、IPP、FPP、GGPP或DMAPP。这里公开的这些载体进一步包含编码第二种酶的核酸，所述第二种酶修饰带有两个磷酸根的类异戊二烯，和编码叶绿体靶向分子的核酸，所述靶向分子用于将所述第二种酶靶向到叶绿体。可由本发明所述载体编码的第二种酶的具体实例包括，但不限于，葡萄烃合成酶、苧烯合成酶、桉叶油素合成酶、蒎烯合成酶、莰烯合成酶、桧萜合成酶、月桂烯合成酶、松香二烯合成酶、紫杉二烯合成酶、FPP合成酶、红没药烯合成酶、diapophytoene去饱和酶、diapophytoene合成酶、GPP合成酶、IPP异构酶、单萜合成酶、异松油烯合成酶、姜烯合成酶、罗勒烯合成酶、倍半萜合成酶、姜黄烯合成酶、法尼烯合成酶、忙牛儿基忙牛儿基还原酶、叶绿素酯水解酶、β-石竹烯合成酶、大根香叶烯A合成酶、8-表雪松醇合成酶、朱栾倍半萜合成酶、(+)-δ-杜松烯合成酶、大根香叶烯C合成酶、(E)-β-法尼烯合成酶、蓖麻烯合成酶、vetispiradiene合成酶、5-表-马兜铃烯合成酶、马兜铃烯合成酶、α-葎草烯、(E，E)-α-法尼烯合成酶、(-)-β-蒎烯合成酶、γ-松油烯合成酶、苧烯环化酶、沉香醇合成酶、(+)-冰片二磷酸合成酶、左旋海松二烯合成酶、异海松二烯合成酶、(E)-γ-红没药烯合成酶、柯巴基焦磷酸合成酶、贝壳衫烯合成酶、长叶烯合成酶、γ-葎草烯合成酶、δ-蛇床烯合成酶、β-水芹烯合成酶、异松油烯合成酶、(+)-3-蒈烯合成酶、顺-柯巴基二磷酸合成酶、α-松油醇合成酶、顺-海松-7，15-二烯合成酶、反-山达海松二烯合成酶、sterner-13-ene合成酶、E-β-罗勒烯、S-沉香醇合成酶、牻牛儿醇合成酶、γ-松油烯合成酶、沉香醇合成酶、E-β-罗勒烯合成酶、表-雪松醇合成酶、α-姜烯合成酶、愈创木二烯合成酶、卡藜二烯合成酶、顺-穆罗拉二烯合成酶、阿菲迪柯林-16b-醇合成酶、伊丽莎白三烯合成酶、檀香醇合成酶、广藿香醇合成酶、zinzanol合成酶、雪松醇合成酶、香紫苏醇合成酶、柯巴醇合成酶或泪柏醇合成酶。对于NVPO的密码子，编码用于本发明的酶的核酸可以是偏倚的。本发明所述的具体载体能够在微藻中稳定转化。在一些实施方式中，所述海藻种为莱茵衣藻(C.reinhardtii)、盐生杜氏藻(D.salina)、雨生红球藻(H.pluvalis)、二形栅藻(S.dimorphus)、绿色杜氏藻(D.viridis)或杜氏盐藻(D.tertiolecta)。编码本发明中有用的酶的序列可以是这里具体公开的序列(如表5-8中的序列)或与其有60、65、70、75、80、85、90、95或更高同一性的序列中的任一序列。本发明所述的一些载体包含这里具体公开的序列(如表5-8中的序列)或与其有60、65、70、75、80、85、90、95或更高同一性的序列中的任一序列。

本公开也提供了宿主细胞，其包含：1)载体，其含有编码生产带有两个磷酸根的类异戊二烯的酶的核酸，和启动子，其被配置为在NVPO的叶绿体中表达所述核酸，但该载体不包含叶绿体整个基因组；或2)载体，其含有编码生产带有两个磷酸根的类异戊二烯的酶的核酸，和编码用于靶向酶到叶绿体的叶绿体靶向分子的核酸。所述宿主细胞可与载体中出现的一种或多种核酸同质。这里考虑的宿主细胞的一些实例包括蓝藻门、原绿藻门、红藻门、绿藻门、不等鞭毛门(heterokontophyta)、tribophyta、灰色藻门(glaucophyta)、丝足虫门(chlorarachniophytes)、裸藻门、眼虫藻(euglenoid)、定鞭藻门(haptophyta)、金藻门(chrysophyta)、隐藻门(cryptophyta)、隐滴虫(cryptomonad)、甲藻门(dinophyta)、腰鞭毛虫(dinoflagellata)、定鞭金藻(pyrmnesiophyta)、硅藻门(bacillariophyta)、黄藻门(xanthophyta)、黄绿藻(eustigmatophyte)、针胞藻类(raphidophyta)、褐藻门(phaeophyta)和浮游植物(phytoplankton)。宿主细胞的一些具体实例包括藻类种莱茵衣藻(C.reinhardtii)、盐生杜氏藻(D.salina)、雨生红球藻(H.pluvalis)、二形栅藻(S.dimorphus)、绿色杜氏藻(D.viridis)或杜氏盐藻(D.tertiolecta)。在一些实施方式中，叶绿素水平对宿主细胞在转化后能够光自养是足够的。在另一些实施方式中，所述宿主细胞可产生比相同生物的野生型株更高水平的至少一种天然生成的类异戊二烯。

在本发明的另一实施方式中，提供了一种宿主细胞，其包含本文所述的核苷酸序列(如，表5-8中)或具有与这些序列中任一序列至少70％同一性的核苷酸序列的至少两个拷贝。宿主细胞可以是无维管光合生物，特别地是莱茵衣藻(C.reinhardtii)、盐生杜氏藻(D.salina)、雨生红球藻(H.pluvalis)、二形栅藻(S.dimorphus)、绿色杜氏藻(D.viridis)或杜氏盐藻(D.tertiolecta)。在一些实施方式中，所述宿主细胞在核苷酸序列上是同型的。本公开也提供了含有载体的基因修饰叶绿体，所述载体包含编码产生带有两个磷酸根的类异戊二烯的酶的核酸，和启动子，该启动子被配置为在无维管光合生物(NVPO)的叶绿体中表达所述核酸。

本文也提供了用于生产含类异戊二烯的组合物的方法，其包括用编码产生带有两个磷酸根的类异戊二烯的酶的核酸转化无维管光合生物的叶绿体，和收集由所述被转化的NVPO产生的至少一种类异戊二烯的步骤。这样的方法可进一步包括在水性环境中生长所述生物，其中CO₂被提供给所述生物。提供的CO₂可至少部分从已燃烧的化石燃料中产生和/或可至少部分从烟道气(flue gas)中产生。这样的方法可包括GPP、IPP、FPP、GGPP或DMAPP的生产。在一些实施方式中，所述收集过程可包括以下的一步或多步：收集转化的NVPO，从细胞培养基中收集类异戊二烯；机械破碎被转化的生物；和化学破碎生物。微藻可被用于本发明的一些方面，并且所述微藻可以是莱茵衣藻(C.reinhardtii)、盐生杜氏藻(D.salina)、雨生红球藻(H.pluvalis)、二形栅藻(S.dimorphus)、绿色杜氏藻(D.viridis)或杜氏盐藻(D.tertiolecta)。

用于生产类异戊二烯的另一种方法也被描述，其中所述方法包括步骤：转化无维管光合生物的叶绿体以产生所述类异戊二烯，其中所述生物不是用异戊二烯合成酶或甲基-丁烯醇合成酶转化；和(b)收集所述类异戊二烯。该方法可进一步包括在水性环境中生长所述生物，其中CO₂被提供给所述生物。CO₂可至少部分由已燃烧的化石燃料和/或烟道气产生。这样的方法可包括GPP、IPP、FPP、GGPP或DMAPP的生产。该方法所述的叶绿体可用核酸转化，所述核酸编码葡萄烃合成酶、苧烯合成酶、桉叶油素合成酶、蒎烯合成酶、莰烯合成酶、桧萜合成酶、月桂烯合成酶、松香二烯合成酶、紫杉二烯合成酶、红没药烯合成酶、diapophytoene去饱和酶、diapophytoene合成酶、单萜合成酶、异松油烯合成酶、姜烯合成酶、罗勒烯合成酶、倍半萜合成酶、姜黄烯合成酶、法尼烯合成酶、忙牛儿基忙牛儿基还原酶、叶绿素酯水解酶、β-石竹烯合成酶、大根香叶烯A合成酶、8-表雪松醇合成酶、朱栾倍半萜合成酶、(+)-δ-杜松烯合成酶、大根香叶烯C合成酶、(E)-β-法尼烯合成酶、蓖麻烯合成酶、vetispiradiene合成酶、5-表-马兜铃烯合成酶、马兜铃烯合成酶、α-葎草烯、(E，E)-α-法尼烯合成酶、(-)-β-蒎烯合成酶、γ-松油烯合成酶、苧烯环化酶、沉香醇合成酶、(+)-冰片二磷酸合成酶、左旋海松二烯合成酶、异海松二烯合成酶、(E)-γ-红没药烯合成酶、柯巴基焦磷酸合成酶、贝壳衫烯合成酶、长叶烯合成酶、γ-葎草烯合成酶、δ-蛇床烯合成酶、β-水芹烯合成酶、异松油烯合成酶、(+)-3-蒈烯合成酶、顺-柯巴基二磷酸合成酶、α-松油醇合成酶、顺-海松-7，15-二烯合成酶、反-山达海松二烯合成酶、sterner-13-ene合成酶、E-β-罗勒烯、S-沉香醇合成酶、牻牛儿醇合成酶、γ-松油烯合成酶、沉香醇合成酶、E-β-罗勒烯合成酶、表-雪松醇合成酶、α-姜烯合成酶、愈创木二烯合成酶、卡藜二烯合成酶、顺-穆罗拉二烯合成酶、阿菲迪柯林-16b-醇合成酶、伊丽莎白三烯合成酶、檀香醇合成酶、广藿香醇合成酶、zinzanol合成酶、雪松醇合成酶、香紫苏醇合成酶、柯巴醇合成酶或泪柏醇合成酶。在一些实施方式中，所述收集过程可包括以下的一步或多步；收集转化的NVPO，从细胞培养基中收集异戊二烯；机械破碎被转化的生物；和化学破碎生物。微藻可被用于本发明的一些方面，并且所述微藻可以是莱茵衣藻(C.reinhardtii)、盐生杜氏藻(D.salina)、雨生红球藻(H.pluvalis)、二形栅藻(S.dimorphus)、绿色杜氏藻(D.viridis)或杜氏盐藻(D.tertiolecta)。

本发明的另一实施方式提供了含有基因修饰叶绿体的生物，其中所述叶绿体包含编码类异戊二烯产生酶的核酸，并且其中所述生物能够在高盐环境中生长。这样的生物可以是NVPO，特别地是盐生杜氏藻(D.salina)、绿色杜氏藻(D.viridis)或杜氏盐藻(D.tertiolecta)。在这样的实施方式中，所述高盐环境可包含约0.5-4.0摩尔氯化钠。也提供了用于制备类异戊二烯的方法，其包括用核酸转化生物以提高或起始所述类异戊二烯的生产，其中所述生物在高盐环境中生长；和收集所述类异戊二烯。这样的生物可以是NVPO，特别地是盐生杜氏藻(D.salina)、绿色杜氏藻(D.viridis)或杜氏盐藻(D.tertiolecta)。在这样的实施方式中，所述高盐环境可包含约0.5-4.0摩尔氯化钠。在一些实施方式中，所述转化步骤是叶绿体转化。在其它实施方式中，所述收集步骤包含以下步骤的一个或多个：(a)收集所述转化的生物；(b)从细胞培养基中收集所述类异戊二烯；(c)机械破碎所述生物；或(d)化学破碎所述生物。

本公开也提供了含有异源核酸的载体，所述异源核酸编码一种或多种类异戊二烯产生酶；和被配置为所述核酸在光合细菌中表达的启动子。在一些实施方式中，所述光合细菌为蓝藻(cyanobacterial)种，且可以是集胞藻属(Synechocystis)、聚球藻属(Synechococcus)和/或节旋藻属(Athrospira)中的成员。提供了包含这样载体的宿主细胞。宿主细胞可以是蓝藻种，且可以是集胞藻属(Synechocystis)、聚球藻属(Synechococcus)和/或节旋藻属(Athrospira)中的成员。

本公开进一步提供了载体，其包含：编码蛋白的第一核酸，编码选择性标记的第二核酸，其中所述第一和第二核酸包含一个开放读码框，和启动子，其被配置为所述第一和第二核酸在无维管光合生物中表达。在一些实施方式中，所述蛋白是类异戊二烯产生酶或生物物质降解酶。在其它实施方式中，所述类异戊二烯产生酶是葡萄烃合成酶、苧烯合成酶、桉叶油素合成酶、蒎烯合成酶、莰烯合成酶、桧萜合成酶、月桂烯合成酶、松香二烯合成酶、紫杉二烯合成酶、FPP合成酶、红没药烯合成酶、diapophytoene去饱和酶、diapophytoene合成酶、GPP合成酶、IPP异构酶、单萜合成酶、异松油烯合成酶、姜烯合成酶、罗勒烯合成酶、倍半萜合成酶、姜黄烯合成酶、法尼烯合成酶、忙牛儿基忙牛儿基还原酶、叶绿素酯水解酶、β-石竹烯合成酶、大根香叶烯A合成酶、8-表雪松醇合成酶、朱栾倍半萜合成酶、(+)-δ-杜松烯合成酶、大根香叶烯C合成酶、(E)-β-法尼烯合成酶、蓖麻烯合成酶、vetispiradiene合成酶、5-表-马兜铃烯合成酶、马兜铃烯合成酶、α-葎草烯、(E，E)-α-法尼烯合成酶、(-)-β-蒎烯合成酶、γ-松油烯合成酶、苧烯环化酶、沉香醇合成酶、(+)-冰片二磷酸合成酶、左旋海松二烯合成酶、异海松二烯合成酶、(E)-γ-红没药烯合成酶、柯巴基焦磷酸合成酶、贝壳衫烯合成酶、长叶烯合成酶、γ-葎草烯合成酶、δ-蛇床烯合成酶、β-水芹烯合成酶、异松油烯合成酶、(+)-3-蒈烯合成酶、顺-柯巴基二磷酸合成酶、α-松油醇合成酶、顺-海松-7，15-二烯合成酶、反-山达海松二烯合成酶、sterner-13-ene合成酶、E-β-罗勒烯、S-沉香醇合成酶、牻牛儿醇合成酶、γ-松油烯合成酶、沉香醇合成酶、E-β-罗勒烯合成酶、表-雪松醇合成酶、α-姜烯合成酶、愈创木二烯合成酶、卡藜二烯合成酶、顺-穆罗拉二烯合成酶、阿菲迪柯林-16b-醇合成酶、伊丽莎白三烯合成酶、檀香醇合成酶、广藿香醇合成酶、zinzanol合成酶、雪松醇合成酶、香紫苏醇合成酶、柯巴醇合成酶或泪柏醇合成酶。在其它实施方式中，所述生物物质降解酶是外切-β-葡聚糖酶、内切-β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、内切木聚糖酶(endoxylanase)或木质酶。本文所述的一些载体包括第一或第二核酸，其中存在至少一个密码子被优化为在无维管光合生物的核中表达。

在一些实施方式中，本文所述的载体包含第三核酸，其编码符合所述第一和第二核酸读码框的剪切部分。所述剪切部分可以是自剪切蛋白酶，并且可具体是来自口蹄疫病毒A2区域的功能部分。在其它实施方式中，所述剪切部分能够被由所述生物天然产生的蛋白酶剪切。本文也描述了包含调控元件的载体，所述调控元件包括HSP70启动子、HSP70启动子的功能部分、rbcS2的5’端上游翻译区域(UTR)、rbcS2的5’UTR的功能部分、或它们的组合。在一些实施方式中，所述调控元件由待被转化的生物产生。而其它载体包含第四核酸，其编码符合第一、第二和/或第三核酸读码框的分泌信号。该载体中有用的分泌信号为莱茵衣藻碳酸酐酶分泌信号。本发明的载体可用于多种NVPO中，其包括光合细菌、蓝细菌、蓝藻门、原绿藻门、红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、tribophyta、灰色藻门、丝足虫门、裸藻门、眼虫藻、定鞭藻门、金藻门、隐藻门、隐滴虫、甲藻门、腰鞭毛虫、定鞭金藻、硅藻门、黄藻门、黄绿藻、针胞藻类、褐藻门和浮游植物。在一些实施方式中，所述载体能够被稳定转化在莱茵衣藻(C.reinhardtii)、盐生杜氏藻(D.salina)、雨生红球藻(H.pluvalis)、二形栅藻(S.dimorphus)、绿色杜氏藻(D.viridis)、杜氏盐藻(D.tertiolecta)、集胞藻属(Synechocystis)的细菌、聚球藻属(Synechococcus)的细菌或节旋藻属(Athrospira)的细菌中。本文所述的载体可包含本文所述的任意核苷酸序列(如表5-8中)，或与这些序列中任一序列具有至少70％同一性的核酸序列。而其它载体包含符合所述第一、第二、第三和/或第四核酸读码框的第五核酸，其中所述第五核酸编码一个标记。所述编码的标记可以是附加表位或金属亲和标记。

本公开也提供了含有载体的宿主细胞，其中所述载体包含编码蛋白的第一核酸，编码选择性标记的第二核酸，其中所述第一和第二核酸包含一个开放读码框，配置为第一和第二核酸在无维管光合生物中表达的启动子，和任选地一个或多个额外的核酸，其编码剪切部分、分泌信号、标记或其组合，其中所述一个或多个额外的核酸符合所述第一和第二核酸的读码框。所述宿主细胞可以是光合细菌、蓝细菌、蓝藻门、原绿藻门、红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、tribophyta、灰色藻门、丝足虫门、裸藻门、眼虫藻、定鞭藻门、金藻门、隐藻门、隐滴虫、甲藻门、腰鞭毛虫、定鞭金藻、硅藻门、黄藻门、黄绿藻、针胞藻类、褐藻门或浮游植物。在一些实施方式中，所述宿主细胞为莱茵衣藻(C.reinhardtii)、盐生杜氏藻(D.salina)、雨生红球藻(H.pluvalis)、二形栅藻(S.dimorphus)、绿色杜氏藻(D.viridis)、杜氏盐藻(D.tertiolecta)、集胞藻属(Synechocystis)的细菌、聚球藻属(Synechococcus)的细菌或节旋藻属(Athrospira)的细菌。在其它实施方式中，所述载体被稳定地整合入所述宿主细胞的核基因组。

本文进一步提供了在无维管光合生物中生产蛋白的方法，其包括：生长所述生物，其中所述生物包含具有单一开放读码框的外源核酸，其中所述开放读码框包含编码蛋白的第一核酸和编码选择性标记的第二核酸，并且其中所述生物进一步包含启动子，其被配置为所述开放读码框在所述生物中表达，因此产生所述蛋白。在一些实施方式中，所述蛋白是类异戊二烯产生酶或生物物质降解酶。在其它实施方式中，所述开放读码框包含至少一个密码子，其被优化为在无维管光合生物的核中表达。开放读码框可进一步包含第三核酸，其编码符合第一和第二核酸读码框的剪切部分。所述剪切部分可以是自剪切的蛋白酶，并且在特定的实施方式中可以特别地是来自口蹄疫病毒A2区域的功能部分。在其它实施方式中，剪切部分能够被所述生物天然产生的蛋白酶剪切。开放读码框可进一步包含第四核酸，其编码符合所有组成该开放读码框的其它核酸的读码框的分泌信号。在一种实施方式中，所述分泌信号是莱茵衣藻碳酸酐酶分泌信号。如本文所公开，用于这样方法的生物可以是莱茵衣藻(C.reinhardtii)、盐生杜氏藻(D.salina)、雨生红球藻(H.pluvalis)、二形栅藻(S.dimorphus)、绿色杜氏藻(D.viridis)、杜氏盐藻(D.tertiolecta)，集胞藻属(Synechocystis)、聚球藻属(Synechococcus)或节旋藻属(Athrospira)的细菌。用在该方法中的开放读码框可进一步包含第五核酸，其编码符合所有组成该开放读码框的其它核酸的读码框的标记。所述标记可以是附加表位或金属亲和标记。

本文进一步公开的是包含融合蛋白的宿主细胞，其中所述融合蛋白包含编码蛋白的第一核酸和编码选择性标记的第二核酸，并且所述宿主细胞是无维管光合生物。所述宿主细胞可以是莱茵衣藻(C.reinhardtii)、盐生杜氏藻(D.salina)、雨生红球藻(H.pluvalis)，集胞藻属(Synechocystis)、聚球藻属(Synechococcus)或节旋藻属(Athrospira)的细菌。在一些实施方式中，所述载体被稳定地整合入所述宿主细胞的核基因组。融合蛋白可进一步包含剪切部分、分泌信号、标记或其组合。剪切部分可以是自剪切的蛋白酶，如来自口蹄疫病毒A2区域的功能部分。可选地，剪切部分可以能够被所述生物天然产生的蛋白酶剪切。可使用的一种分泌信号为莱茵衣藻碳酸酐酶分泌信号。在含有标记的融合蛋白中，所述标记可以是附加表位或金属亲和标记。

本文提供了一种生产转基因无维管光合生物的方法，所述生物在选择性条件下表达目标蛋白，其中所述方法包括以下步骤：用含有单一开放读码框的核酸转化所述生物，其中所述开放读码框编码含有所述目标蛋白和选择性标记的融合蛋白；其中所述生物能够在要求选择性标记表达以维持该生物存活的环境条件下表达选择性标记，由此导致所述目标蛋白的表达。在一些实施方式中，所述蛋白是类异戊二烯产生酶或生物物质降解酶。融合蛋白可进一步包含剪切部分、分泌信号、标记或其组合。剪切部分可以是自剪切的蛋白酶，如来自口蹄疫病毒A2区域的功能部分。可选地，剪切部分能够被所述生物天然产生的蛋白酶剪切。可被使用的一种分泌信号为莱茵衣藻碳酸酐酶分泌信号。在含有标记的融合蛋白中，所述标记可以是附加表位或金属亲和标记。

本公开进一步提供的是在无维管光合生物中提高叶绿醇生产的方法，其包括用这样的核酸转化所述生物的步骤，所述核酸引起由该生物产生的叶绿醇提高到高于由不含所述核酸的生物产生的水平。在一些实施方式中，所述核酸编码GPP合成酶、FPP合成酶、忙牛儿基忙牛儿基还原酶、叶绿素酯水解酶或焦磷酸酶。在一些实施方式中，转化步骤可包括叶绿体转化。而在另一些实施方式中，所述酶是与所述生物内源的或与所述生物的内源性酶同源，或是所述生物外源的。在一些实施方式中，所述酶被过量表达。所述酶的表达可通过诱导型启动子调控。所公开的方法可进一步包含用这样的核酸转化所述生物，所述核酸引起二甲基烯丙醇、异戊醇、牻牛儿醇、法尼醇或牻牛儿基牻牛儿醇(geranylgeraniol)的产生。在一些实施方式中，实施该方法使用的生物为光合细菌、蓝细菌、蓝藻门、原绿藻门、红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、tribophyta、灰色藻门、丝足虫门、裸藻门、眼虫藻、定鞭藻门、金藻门、隐藻门、隐滴虫、甲藻门、腰鞭毛虫、定鞭金藻、硅藻门、黄藻门、黄绿藻、针胞藻类、褐藻门和浮游植物。所述生物可以是莱茵衣藻(C.reinhardtii)、盐生杜氏藻(D.salina)、雨生红球藻(H.pluvalis)、二形栅藻(S.dimorphus)、绿色杜氏藻(D.viridis)或杜氏盐藻(D.tertiolecta)。

本文也提供了含有被引入核酸的宿主细胞，其中所述核酸引起由宿主细胞产生的叶绿醇提高到高于由不含所述核酸的宿主细胞产生的水平，其中所述宿主细胞是无维管光合生物。在一些实施方式中，所述宿主细胞可以在高盐环境中生长，例如，所述宿主细胞可以是绿色杜氏藻(D.viridis)或杜氏盐藻(D.tertiolecta)。在一些实施方式中，所述高盐环境包含0.5-4.0摩尔氯化钠。在一些宿主细胞中，所述核酸存在于叶绿体中。而在其它宿主细胞中，所述核酸编码选自由GPP合成酶、FPP合成酶、忙牛儿基忙牛儿基还原酶、叶绿素酯水解酶和焦磷酸酶组成的组的酶。所述宿主细胞可进一步包含这样的核酸，其引起二甲基烯丙醇、异戊醇、牻牛儿醇、法尼醇或牻牛儿基牻牛儿醇的产生。所述宿主细胞可以是光合细菌、蓝细菌、蓝藻门、原绿藻门、红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、tribophyta、灰色藻门、丝足虫门、裸藻门、眼虫藻、定鞭藻门、金藻门、隐藻门、隐滴虫、甲藻门、腰鞭毛虫、定鞭金藻、硅藻门、黄藻门、黄绿藻、针胞藻类、褐藻门和浮游植物。在一些实施方式中，所述宿主细胞是莱茵衣藻(C.reinhardtii)、盐生杜氏藻(D.salina)、雨生红球藻(H.pluvalis)、二形栅藻(S.dimorphus)、绿色杜氏藻(D.viridis)或杜氏盐藻(D.tertiolecta)。

本文公开的另一种方法提供了在无维管光合生物中生成叶绿醇的方法，包括步骤：用这样的核酸转化所述生物，其中所述核酸引起由该生物产生的叶绿醇提高到高于在给定环境条件下产生的水平；和从所述生物中收集叶绿醇。在该方法的一些实施方式中，所述核酸编码GPP合成酶、FPP合成酶、忙牛儿基忙牛儿基还原酶、叶绿素酯水解酶或焦磷酸酶。而在其它实施方式中，所述转化为叶绿体转化。而在另一些实施方式中，所述酶是所述生物内源的或与所述生物的内源性酶同源，或是所述生物外源的。在一些实施方式中，所述酶被过量表达。所述酶的表达可通过诱导型启动子调控。所公开的方法可进一步包含用这样的核酸转化所述生物，所述核酸引起二甲基烯丙醇、异戊醇、牻牛儿醇、法尼醇或牻牛儿基牻牛儿醇的产生。在一些实施方式中，实施该方法使用的生物为光合细菌、蓝细菌、蓝藻门、原绿藻门、红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、tribophyta、灰色藻门、丝足虫门、裸藻门、眼虫藻、定鞭藻门、金藻门、隐藻门、隐滴虫、甲藻门、腰鞭毛虫、定鞭金藻、硅藻门、黄藻门、黄绿藻、针胞藻类、褐藻门和浮游植物。所述生物可以是莱茵衣藻(C.reinhardtii)、盐生杜氏藻(D.salina)、雨生红球藻(H.pluvalis)、二形栅藻(S.dimorphus)、绿色杜氏藻(D.viridis)或杜氏盐藻(D.tertiolecta)。

本文进一步提供的是一种组合物，其包含至少3％的叶绿醇和至少痕量的基因修饰的无维管光合生物的细胞部分。在一些实施方式中，所述基因修饰的生物是通过内源、异源或外源的GPP合成酶、FPP合成酶、忙牛儿基忙牛儿基还原酶、叶绿素酯水解酶或焦磷酸酶修饰的。在其它实施方式中，所述生物的叶绿体是被基因修饰的。所公开的组合物可进一步含有二甲基烯丙醇、异戊醇、牻牛儿醇、法尼醇或牻牛儿基牻牛儿醇。在一些实施方式中，存在于该组合物中的细胞部分来自光合细菌、蓝细菌、蓝藻门、原绿藻门、红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、tribophyta、灰色藻门、丝足虫门、裸藻门、眼虫藻、定鞭藻门、金藻门、隐藻门、隐滴虫、甲藻门、腰鞭毛虫、定鞭金藻、硅藻门、黄藻门、黄绿藻、针胞藻类、褐藻门和浮游植物。在其它实施方式中，所述生物可以是莱茵衣藻(C.reinhardtii)、盐生杜氏藻(D.salina)、雨生红球藻(H.pluvalis)、二形栅藻(S.dimorphus)、绿色杜氏藻(D.viridis)或杜氏盐藻(D.tertiolecta)。

在一些实施方式中，这样的核苷酸序列编码在类异戊二烯合成途径中发挥作用的一种或多种多肽。在类异戊二烯生物合成途径中的多肽的实例包括合成酶，如C5、C10、C15、C20、C30和C40合成酶。在类异戊二烯途径中多肽的更具体实例为苧烯合成酶、1，8-桉树脑合成酶、α-蒎烯合成酶、莰烯合成酶、(+)-桧萜合成酶、月桂烯合成酶、松香二烯合成酶、紫杉二烯合成酶、法尼焦磷酸合成酶、紫穗槐二烯(amorphadiene)合成酶、(E)-α-红没药烯合成酶、diapophytoene合成酶或diapophytoene去饱和酶。在其它实施方式中，所述合成酶是β-石竹烯合成酶、大根香叶烯A合成酶、8-表雪松醇合成酶、朱栾倍半萜合成酶、(+)-δ-杜松烯合成酶、大根香叶烯C合成酶、(E)-β-法尼烯合成酶、蓖麻烯合成酶、vetispiradiene合成酶、5-表-马兜铃烯合成酶、马兜铃烯合成酶、α-葎草烯、(E，E)-α-法尼烯合成酶、(-)-β-蒎烯合成酶、γ-松油烯合成酶、苧烯环化酶、沉香醇合成酶、(+)-冰片二磷酸合成酶、左旋海松二烯合成酶、异海松二烯合成酶、(E)-γ-红没药烯合成酶、柯巴基焦磷酸合成酶、贝壳衫烯合成酶、长叶烯合成酶、γ-葎草烯合成酶、δ-蛇床烯(selinene)合成酶、β-水芹烯合成酶、异松油烯合成酶、(+)-3-蒈烯合成酶、顺-柯巴基焦磷酸合成酶、α-松油醇合成酶、顺-海松-7，15-二烯合成酶、反-山达海松二烯合成酶、sterner-13-ene合成酶、E-β-罗勒烯、S-沉香醇合成酶、牻牛儿醇合成酶、γ-松油烯合成酶、沉香醇合成酶、E-β-罗勒烯合成酶、表-雪松醇合成酶、α-姜烯合成酶、愈创木二烯合成酶、卡藜二烯合成酶、顺-穆罗拉二烯合成酶、阿菲迪柯林-16b-醇合成酶、伊丽莎白三烯合成酶、檀香醇合成酶、广藿香醇合成酶、zinzanol合成酶、雪松醇合成酶、香紫苏醇合成酶、柯巴醇合成酶或泪柏醇合成酶。

本文考虑的任意核苷酸序列可以包括一个或多个异源序列和/或一个或多个同源序列。

在一些实施方式中，产生的产物可以由转化的生物自然产生。在其它实施方式中，产生的产物不是由转化的生物自然产生的。

在一些实施方式中，产物(如，燃料、燃料原料、香料、杀虫剂)是富烃分子，如类异戊二烯。类异戊二烯(通过异戊二烯单元的数目分类)可以是半萜、单萜、倍半萜、二萜、三萜或四萜。在特定的实施方式中，所述类异戊二烯可以是天然生成的类异戊二烯，如类固醇或类胡萝卜素。类胡罗卜素的亚类别包括胡罗卜素和叶黄素。一些类异戊二烯是纯烃(如苧烯)，而其它的是烃衍生物(如桉树脑)。

本文的任何核苷酸序列可以进一步包含在被转化的生物中对于表达该核苷酸序列是偏倚的密码子。在一些实施方式中，核苷酸序列中的密码子在该密码子的第三核苷酸位置上是富A/T的。例如，密码子中至少50％的第三核苷酸位置可以是A或T。在其它实施方式中，密码子是富G/C的，例如，密码子的至少50％的第三核苷酸位置可以为G或C。

可以使本文的核苷酸序列适合于叶绿体表达。例如，本文的核苷酸序列可以包含叶绿体特异启动子或叶绿体特异调控控制区域。所述核苷酸序列可以被适合于核表达。例如，核苷酸序列可以包含核特异性启动子或核特异性调控控制区域。所述核酸序列可以编码带有靶向序列的蛋白，所述靶向序列编码叶绿体靶向蛋白(如，叶绿体转运肽(chloroplast transit peptide))，或引导蛋白到内膜系统以在内质网或质膜上沉积的信号肽。

燃料产品是通过改变细胞内酶的成分，以改善特定燃料分子的生物合成而产生的。例如，编码生物合成酶的核苷酸序列可以被引入光合生物的叶绿体。编码燃料生物合成酶的核苷酸序列也可以被引入光合生物的核基因组。引入核基因组的核苷酸序列可以指导生物合成酶在细胞的细胞质中积累，或可指导生物合成酶在光合生物的叶绿体中积累。

本文的任意核苷酸序列可进一步包含调控序列。调控序列可包含以下的一个或多个：启动子、内含子、处理元件(processing element)、3’未翻译区、5’未翻译区、RNA稳定元件或翻译增强子。启动子可以是以下的一个或多个：适合在生物中表达的启动子，藻类启动子，叶绿体启动子和核启动子，它们中的任何一个可以是原生或合成的启动子。调控序列可以是可诱导的或可自调控的。调控序列可以包含自体同源序列和/或异源序列。在一些情况下，控制序列可以在第一同源序列和第二同源序列的一侧。第一和第二同源序列每一个长度可以都是至少500个核苷酸。同源序列可以允许同源重组，或可以用于隔离异源序列以促进基因表达。

在一些实施方式中，核苷酸序列可允许产物(如蛋白)从细胞中分泌。在这些例子中，本文的核苷酸序列可编码增强、起始或提高产物从生物分泌到外部环境的速率的蛋白。

本发明也考虑了用本文的一个或多个核苷酸序列或表达载体转化的生物。这样的生物优选的是进行光合作用的，并且可以是，例如，单细胞或多细胞的。例如，这样的生物可以是多细胞或单细胞的藻类或蓝细菌。本文考虑的藻类的一些实例包括红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、tribophyta、灰色藻门、丝足虫门、眼虫藻、定鞭藻门、隐藻门、隐滴虫、腰鞭毛虫和浮游植物。

本文考虑的任何生物可以用本文所述的一种或多种表达载体暂时或稳定地转化。优选地，生物生成的产物不会使该生物不能存活。

本发明也考虑了生产燃料产品的方法。所述方法可以包括用表达载体转化无维管光合生物，培养该生物；和收集由该生物产生的燃料产品。所述表达载体可以编码这样的蛋白，其改变光合生物的生物合成途径，以提高燃料分子的生产或积累。所述表达载体可能也编码这样的调控元件，其改变生物合成途径中的原生酶，以允许改善燃料生产或累积。所述载体也可编码允许分泌或提高燃料分子分泌的蛋白或调控元件。

本发明也提供了一种商业方法，包括向培养适合生产燃料产品的基因修饰的无维管光合生物的一方提供碳信用额(carbon credit)。所述生物可以是本文描述的任何一种。在一些实施方式中，碳信用额可与以下一项或多项交换：相当容易变现的金融票据，至少一个现在和将来的生意机会的承诺，有关知识产权的法律许可，政府税务补贴，给定市场购买者准入；或不含培养所述生物的碳排放过程的使用。碳信用额基本上可从制定规章的机构直接取得。可选地，碳信用额基本上可从管理实体直接获得。碳信用额可通过至少一个实体调控，所述实体选自包括市、县、州、省、国家、地区、多国和国际主权实体。

附图简述

本发明的新特征在所附权利要求中具体描述。通过参考以下描述示例性实施方式的详细描述——其中本发明的原理被使用，和附图，可获得对本发明特征和优点的更好理解，所述附图中：

图1是莱茵衣藻中天然生成酶途径的表示。

图2是莱茵衣藻中酶途径的改进的一个实例的表示。

图3，图A-D提供了本发明所述核酸结构的图示。

图4，图A-D显示了用FPP合成酶和红没药烯合成酶转化的莱茵衣藻的PCR和蛋白质印迹分析结果。

图5显示了用FPP合成酶和红没药烯合成酶转化的莱茵衣藻的气相色谱-质谱分析结果。

图6，图A-E显示了用FPP合成酶和角鲨烯合成酶转化的莱茵衣藻的PCR和蛋白质印迹分析结果。

图7显示了用FPP合成酶和角鲨烯合成酶转化的莱茵衣藻的气相色谱-质谱分析结果。

图8显示了用苧烯合成酶转化的莱茵衣藻的蛋白质印迹分析结果。

图9显示了用苧烯合成酶转化的莱茵衣藻的气相色谱-质谱分析结果。

图10，图A-C显示了用GPP合成酶转化的莱茵衣藻的PCR和蛋白质印迹分析结果。

图11显示了用FPP合成酶和姜烯合成酶转化的莱茵衣藻的PCR和蛋白质印迹分析结果。

图12显示了用FPP合成酶和倍半萜合成酶转化的莱茵衣藻的蛋白质印迹分析结果。

图13显示了用FPP合成酶和倍半萜合成酶转化的莱茵衣藻的气相色谱-质谱分析结果。

图14显示了用FPP合成酶和倍半萜合成酶转化的大肠杆菌(E.coli)的蛋白质印迹分析结果。

图15显示了用FPP合成酶和倍半萜合成酶转化的大肠杆菌中FPP和倍半萜生成的气相色谱-质谱分析结果。

图16是本发明的核酸结构的图示。

图17显示了由细胞核表达木聚糖酶2的莱茵衣藻的蛋白质印迹分析结果。

图18显示了莱茵衣藻的核及叶绿体中表达的外源酶的木聚糖酶活性比较。

图19显示了由细胞核表达内切葡聚糖酶的莱茵衣藻的蛋白质印迹分析结果。

图20显示了由细胞核表达CBH1的莱茵衣藻的蛋白质印迹分析结果。

发明详述

本发明涉及使用一种或多种光合生物生产产品的组合物及方法。在一些实施方式中，光合生物是无维管生物(如蓝细菌、藻类)。如本文详述，无维管光合生物(NVPO)可被外源、异源或自体同源的核酸转化，所述核酸编码实现本发明产物生产的一种或多种酶。例如，NVPO(如莱茵衣藻)可用编码酶(如红没药烯合成酶、倍半萜合成酶)的一种或多种核酸转化，所述酶实现期望产物(如红没药烯、角鲨烯)的生产。产生的产物可以是由光合生物天然或非天然产生的。当其是天然生成时，生产可通过引入本发明所述的核酸提高。例如，用编码实现期望产物(如姜烯、红没药烯)生产的酶的一种或多种核酸转化NVPO，可引起另一产物(如叶绿醇)生产的提高。而在其它实施方式中，多种产物可通过转化的NVPO产生，并且所述多种产物可以是天然生成的、非天然生成的或其组合。本发明所述的组合物可包含天然和非天然生成的产物的1∶0.1、1∶0.2、1∶0.3、1∶0.4、1∶0.5、1∶0.6、1∶0.7、1∶0.8、1∶0.9、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100或更高比例的混合物。

通过本发明所述方法生成的产物包括烃和烃的衍生物。在某些方面，所述烃和/或烃的衍生物是类异戊二烯(或类萜)。本发明考虑的类异戊二烯可包括任何数量的碳原子，含有5个到15个碳原子的类异戊二烯是示例。本发明的类异戊二烯可以是由转化前的NVPO天然生成的一种(如叶绿醇)，或可以是仅在外源核酸插入后生成的(如姜烯)。本发明的产物也可包括除一种或多种天然生成的类异戊二烯之外的一种或多种非天然生成的类异戊二烯。此外，所述产物是在细胞内生成的，并且可被保留在该生物内。因此，产物的收集可涉及本发明所述生物的一个或多个细胞的破碎和/或从该生物的周围环境中收集该产物。本发明所述产品的收集可涉及收集细胞在其中生长的全部或部分液态环境，从液态环境中分离细胞，和在从生长环境中分离之前或之后破碎细胞，或这些的组合。

收集到的产物可在收集后被纯化(如精制)。产物可以其被收集的形式使用，或可在收集前或收集后被改变。例如，在产物为倍半萜(C15)的情况下，倍半萜可被氢化、裂化或被其他方式改性，产生具有不同碳原子数的化合物。在一些实施方式中，产物的改变可产生燃料产品(如辛烷、丁烷)。

生物

可使用本文所述组合物和方法转化的生物的实例包括维管和无维管生物。所述生物可以是原核生物或真核生物。所述生物可以是单细胞生物或多细胞生物。

无维管光合生物的实例包括苔藓植物(bryophtyes)，如叶苔门(marchantiophytes)或角苔门(anthocerotophytes)。在一些实施方式中，所述生物是蓝细菌。在一些实施方式中，所述生物是藻类(如大型藻(macroalgae)或微藻)。所述藻类可以是单细胞或多细胞藻类。在一些实施方式中，所述生物是红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、tribophyta、灰色藻门、丝足虫门、眼虫藻、定鞭藻门、隐藻门、隐滴虫、甲藻门、腰鞭毛虫或浮游植物。例如，所述微藻莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)可用编码苧烯合成酶的载体或其被线性化的部分转化，以生产苧烯。

本发明所述的方法使用微藻，莱茵衣藻示例。依据本发明的方法使用微藻表达多肽或蛋白复合体提供了这样的优势——可以培养大量的微藻，包括商业地培养(Cyanotech Corp.；Kailua-Kona HI)，因此允许期望产品的大量生产，以及分离——如果希望的话。然而，在任何植物的叶绿体中表达例如功能哺乳动物多肽包括蛋白复合体的能力允许这些植物的作物生产，并因此能够方便地生产大量多肽。因此，本发明所述的方法可以使用任何具有叶绿体的植物实施，包括，例如，微藻和大型藻，如海洋藻类和海草，以及在土壤中生长的植物。

术语“植物”在本文被宽泛地使用，以指代含有质体(plastids)，特别是叶绿体的真核生物，并且其包括在任何发育阶段的任何这样的生物；或指代植物的部分，包括植物剪枝(plant cutting)、植物细胞、植物细胞培养物、植物器官、植物种子或胚芽(plantlet)。植物细胞是植物的结构和生理单位，其包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单个细胞或培养的细胞的形式，或可以是更高组成单元，如植物组织、植物器官或植物。因此，植物细胞可以是原生质体，生成配子的细胞，或一个细胞，或可以再生为整个植物的细胞集合。同样地，种子，其包含多个植物细胞并能够再生为整个植物，出于本公开的目的，被认为是植物细胞。植物组织或植物器官可以是种子、原生质体、胼胝体，或被归类进结构或功能单元的任何其它类别的植物细胞。植物特别有用的部分包括可收获部分和用于繁殖后代植物的部分。植物的可收获部分可以是植物任何有用的部分，例如花朵、花粉、幼苗(seedling)、块茎、叶、茎、果实、种子、根等。用于繁殖的植物部分包括，例如，种子、果实、剪枝(cutting)、幼苗、块茎、根茎(rootstock)等。

本发明的方法可以产生含有原生质体的植物，所述原生质体被基因修饰以包含稳定整合的多核苷酸(Hager和Bock，Appl.Microbiol.Biotechnol.54：302-310，2000)。因此，本发明进一步提供了转基因(叶绿体转基因(transplastomic))植物，如莱茵衣藻，其包括一个或多个含有多核苷酸的原生质体，所述多核苷酸编码一个或多个异源多肽，包括与形成功能蛋白复合体特异相关的多肽。本发明的光合生物包含至少一个被修饰以生成产物的宿主细胞。

载体、转化及方法

这里的生物/宿主细胞可以用表达载体或其线性化部分转化，以改变产物的生产和/或分泌，例如，提高产物的生产和/或分泌。产物可以是由生物天然地或非天然地产生的。

表达载体或其线性化部分可以编码一个或多个同源或异源核苷酸序列(由宿主细胞或由不同的生物产生)和/或一个或多个自体同源的核苷酸序列(由相同的生物产生)和/或编码同源或异源多肽的那些。可被转化进藻类宿主细胞的异源核苷酸序列的实例包括来自细菌、真菌、植物、光合细菌或其它藻类的基因。可被转化进藻类宿主细胞的自体同源核苷酸序列的实例包括生成类异戊二烯的基因，其包括编码产生带有两个磷酸根的类异戊二烯的蛋白质(如GPP合成酶、FPP合成酶)的基因，内源启动子和来自psbA、atpA或rbcL基因的5’UTRs。在一些实施方式中，异源序列在两个自体同源序列或同源序列的一侧。同源序列包括那些具有与宿主细胞中的序列至少50％、60％、70％、80％或90％同源性的序列。在一些实施方式中，同源序列在两个自体同源序列的一侧。第一和第二同源序列使异源序列能够重组进入宿主生物的基因组。第一和第二同源序列每一个的长度都可以至少是100、200、300、400或500个核苷酸。

表达载体可含有为在被转化生物中表达而改变了密码子的核苷酸序列。普通技术人员在使用核苷酸密码子来具体指明给定氨基酸中已经熟知由特定宿主细胞显示的“密码子偏倚性”。并非被理论限制，但通过使用宿主细胞优选的密码子，翻译的比率可以更高。因此，当合成用于提高在宿主细胞中表达的基因时，可期望设计这样的基因，以便其密码子使用的频率接近宿主细胞优选的密码子使用的频率。在一些生物中，密码子偏倚性在核基因组和细胞器基因组之间不同，因此，密码子优化或偏倚可针对靶基因进行(如核密码子偏倚、叶绿体密码子偏倚)。本发明的密码子一般地富A/T，如，在密码子第三核苷酸的位置上富A/T。典型地，富A/T的密码子偏倚被用于藻类。在一些实施方式中，密码子的至少50％的第三核苷酸位置是A或T。在其它实施方式中，密码子的至少60％、70％、80％、90％或99％的第三核苷酸位置是A或T。

构建藻类的基因改造株(genetically manipulated strain)的一个方法涉及用编码目的基因的核酸转化，所述核酸典型地是能够将前体转化为燃料产物或燃料产物前体的酶。在一些实施方式中，转化可将核酸引入宿主藻类细胞的任何质体(如叶绿体)。转化的细胞通常在引入外源核酸后被铺于选择性培养基中。该方法也可以包括若干筛选的步骤。开始，通常进行主转化体(primary transformant)的筛选，以确定哪些克隆带有合适的外源核酸插入体。显示恰当插入的克隆可被增殖并重新筛选，以确保遗传稳定性。这样的方法保证转化体含有目的基因。在多种实施方式中，这样的筛选通过聚合酶链反应(PCR)进行，但是，本领域已知的任何其它合适的技术也可被使用。多种不同的PCR方法在本领域内公知(如嵌套PCR、实时PCR)。对于任何给定的筛选，本领域普通技术人员可认识到PCR组分可改变以达到最优的筛选效果。例如，当对向其中加入EDTA(其螯合镁)以螯合有毒金属的破碎藻类细胞进行PCR时，镁浓度可能需要上调。在这样的实施方式中，镁浓度可能需要上调或下调(与可购买的PCR试剂盒中标准浓度比较)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0mM。因此，调整后，PCR反应中最终的镁浓度可以是，如0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5mM或更高。虽然在本文所述的实例中使用了具体的例子；但是，本领域普通技术人员能认识到其它PCR技术可替代所述的具体方法。筛选带有合适的外源核酸插入体的克隆之后，通常克隆被筛选存在的编码蛋白。蛋白表达筛选通常通过蛋白质印迹分析和/或酶活性测试进行。

用在本发明方法中的重组核酸分子可以包含在载体中。而且，在使用第二(或更多)重组核酸分子进行该方法的情况下，第二重组核酸分子也可以包含在载体内，其可以，但不必与含有第一重组核酸分子的载体相同。所述载体可以是用于将多核苷酸引入叶绿体的任何载体，并且优选地，包含足以与叶绿体基因组DNA进行同源重组的叶绿体基因组DNA的核苷酸序列，例如，含有约400到1500或更多基本上连续的叶绿体基因组DNA核苷酸的核苷酸序列。叶绿体载体和选择叶绿体基因组区域用作载体的方法已经公知(参见，例如，Bock，J.Mol.Biol.312：425-438，2001；也参见Staub和Maliga，Plant Cell 4：39-45，1992；Kavanagh等，Genetics 152：1111-1122，1999，它们中的每一个都在此通过引用并入)。

在一些实施方式中，这样的载体包括启动子。用于本发明的启动子可来自任何来源(如病毒、细菌、真菌、原生生物、动物)。本文考虑的启动子可以对光合生物、无维管光合生物和维管光合生物(如藻类、开花植物)是特异性的。在这里所用，术语“无维管光合生物”是指任何宏观或微观生物，包括但不限于，藻类、蓝细菌和光合细菌，其不具有如在高等植物中发现的维管系统。在一些实施方式中，上述核酸被插入含有光合生物如藻类的启动子的载体中。所述启动子可以是在叶绿体和/或其它质体中表达的启动子。在一些实施方式中，所述核酸是基于叶绿体的。考虑用于插入本文所述任何核酸到叶绿体中的启动子的实例包括美国申请2004/0014174中公开的那些。所述启动子可以是组成型启动子(constitutive promoter)或诱导型启动子。启动子通常包括接近转录起始点的必需核酸序列(如TATA元件)。

“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下活跃的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调控下活跃的启动子。诱导型启动子/调控元件的实例包括，例如，硝酸盐诱导的启动子(Bock等，Plant Mol. Biol.17：9(1991))，或光诱导的启动子(Feinbaum等，MoI Gen.Genet.226：449(1991)；Lam和Chua，Science 248：471(1990))，或热响应启动子(Muller等，Gene 111：165-73(1992))。

莱茵衣藻的整个叶绿体基因组在互联网上通过URL″biology.duke.edu/chlamy_genome/-chloro.html″对公众可用(参见“view complete genome as text file”链接和“maps of the chloroplast genome”链接)，它们每一个都在此通过引用被并入(J.Maul，J.W.Lilly和D.B.Stern，未公开的结果；2002年1月28日修改；将以GenBank帐号AF396929公开)。通常，叶绿体基因组DNA的核苷酸序列被这样选择，以致其不是基因的一部分，包括调控序列或编码序列，特别是如果由于同源重组事件被打断，将产生对叶绿体有害作用的基因，例如，用于叶绿体基因组复制，或对含有叶绿体的植物细胞产生有害作用的基因。在这一方面，包含莱茵衣藻叶绿体基因组序列的网站也提供了显示叶绿体基因组编码区和非编码区的图谱，由此帮助用于构建本发明载体的序列的选择。例如，叶绿体载体，p322，是从约143.1kb位置的Eco(Eco RI)位点延伸到约148.5kb位置的Xho(Xho I)位点的克隆(参见，互联网，在URL″biology.duke.edu/chlamy_genome/chloro.html″，并点击″maps of the chloroplast genome″链接和″140-150kb″链接；也可直接通过互联网上URL″biology.duke.edu/chlam-y/chloro/chlorol40.html″获取)。

在本发明实施中使用的载体也可以含有一个或多个给予该载体期望性质的额外的核苷酸序列，包括，例如，这样的序列，诸如辅助载体操控的克隆位点，指导该载体复制或其包含的核苷酸序列转录的调控元件，编码选择性标记的序列等。因此，所述载体可以包含，例如，一个或多个克隆位点，如多克隆位点，其可以但不必放置为使异源多核苷酸可以被插入该载体并且可操控地链接到期望的元件。所述载体也可以包含原核生物的复制起点(ori)，例如，大肠杆菌ori或粘粒ori，由此如期望，允许该载体在原核宿主细胞，以及在植物的叶绿体中传递。

调控元件，作为本文所用的术语，广义地指调控多核苷酸转录或翻译，或其被可操控地链接到的多肽的定位的核苷酸序列。实例包括，但不限于RBS、启动子、增强子、转录终止子、起始(启动)密码子、用于内含子剪切和正确读码框保持的剪接信号、终止密码子、琥珀密码子或赭石密码子和IRES。此外，细胞区室化信号(即，将多肽靶向到细胞液、核、叶绿体膜或细胞膜的序列)。在本发明的一些方面，细胞区室化信号(如叶绿体靶向序列)可被连接到基因和/或转录体，以便该基因的翻译在叶绿体内发生。在其它方面，细胞区室化信号可被链接到基因，以便该基因翻译后，蛋白被运送到叶绿体。这样的信号在本领域内公知并已经被广泛地报告。参见，如，美国专利号5,776,689；Quinn等，J.Biol.Chem，1999；274(20)：14444-54；von Heijne等，Eur.J.Biochem.1989；180(3)：535-45。

载体，或其线性化部分，可包括编码报告多肽或其它选择性标记的核苷酸序列。术语“报告基因(reporter)”或“选择性标记”指的是给予可检测表型的多核苷酸(或编码的多肽)。报告基因通常编码可检测的多肽，例如，绿色荧光蛋白，或一种酶，如荧光素酶，当与合适的试剂(分别是特定波长的光或荧光素)接触时，其产生可被肉眼或使用适当的仪器检测到的信号(Giacomin，Plant Sci.116：59-72，1996；Scikantha，J.Bacteriol.178：121，1996；Gerdes，FEBS Lett.389：44-47，1996；也参见Jefferson，EMBO J.6：3901-3907，1997，fl-glucuronidase)。选择性标记通常是这样的分子，当在细胞中存在或表达时，其为含有该标记的细胞提供了选择性优势(或劣势)，例如，在否则会杀死细胞的试剂存在的情况下生长的能力。

选择性标记可以提供一种获得表达该标记的原核细胞或植物细胞或两者的方法，并因此可以被用作本发明所述载体的一个部分(参见，例如，Bock，上文，2001)。选择性标记的一个类别是原生或修饰的基因，其恢复宿主细胞的生物或生理功能(如，恢复光合能力，恢复代谢途径)。选择性标记的其它实例包括，但不限于，给予抗代谢物抗性的那些，如，二氢叶酸还原酶，其给予对甲氨喋呤的抗性(Reiss，Plant Physiol.(Life Sci.Adv.)13：143-149，1994)；新霉素磷酸转移酶，其给予对氨基糖苷新霉素、卡那霉素和嘌呤霉素的抗性(Herrera-Estrella，EMBO J.2：987-995，1983)；hygro，其给予对潮霉素的抗性(Marsh，Gene 32：481-485，1984)；trpB，其允许细胞使用吲哚替代色氨酸；hisD，其允许细胞使用组氨醇(histinol)替代组氨酸(Hartman，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 85：8047，1988)；甘露糖-6-磷酸异构酶，其允许细胞使用甘露糖(WO 94/20627)；鸟氨酸脱羧酶，其给予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂——2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸的抗性(DFMO；McConlogue，1987，In：Current Communications in Molecular Biology，Cold SpringHarbor Laboratory ed.)；和来自土曲霉(Aspergillus terreus)的脱氨酶，其给予对杀稻瘟素S的抗性(Tamura，Biosci.Biotechnol.Biochem.59：2336-2338，1995)。其它选择性标记包括给予除草剂抗性的那些，例如，草胺膦乙酰转移酶基因，其给予对草胺膦的抗性(White等，Nucl.Acids Res.18：1062，1990；Spencer等，Theor.Appl.Genet.79：625-631，1990)；变异EPSPV合成酶，其给予草甘膦抗性(Hinchee等，BioTechnology 91：915-922，1998)；变异的乙酰乳酸合成酶，其给予咪唑啉酮或磺酰脲抗性(Lee等，EMBO J.7：1241-1248，1988)；变异的psbA，其给予对阿特拉津(atrazine)的抗性(Smeda等，Plant Physiol.103：911-917，1993)；或变异的前卟啉原(protoporphyrinogen)氧化酶(参见美国专利号5,767,373)；或给予对除草剂如草丁膦(glufosinate)的抗性的其它标记。选择性标记包括给予真核细胞二氢叶酸(DHFR)或新霉素抗性，或给予原核生物，如大肠杆菌四环素、氨苄青霉素抗性；和植物中争光霉素、庆大霉素、草甘膦、潮霉素、卡那霉素、甲氨喋呤、腐草霉素、草胺膦(phosphinotricin)、壮观霉素、链霉素、磺酰胺和磺酰脲抗性的多核苷酸(参见，例如，Maliga等，Methods in Plant Molecular Biology，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1995，第39页)。

报告基因已经被成功地用在高等植物的叶绿体中，并且已经报道了高水平重组蛋白的表达。此外，报告基因已经被用在莱茵衣藻的叶绿体中，但是，在大多数情况下，产生非常少量的蛋白。报告基因极大地增强了监控多种生物中基因表达的能力。在高等植物的叶绿体中，β-葡萄糖醛酸酶(uidA，Staub和Maliga，EMBOJ.12：601-606，1993)、新霉素磷酸转移酶(nptII，Carrer等，Mol Gen.Genet.241：49-56，1993)、腺苷基-3-腺嘌呤转移酶(adenosyl-3-adenyltransf-erase)(aadA，Svab和Maliga，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 90：913-917，1993)和维多利亚发光水母(Aequorea victoria)GFP(Sidorov等，Plant J.19：209-216，1999)已经被用作报告基因(Heifetz，Biochemie 82：655-666，2000)。这些基因中的每一个都具有使它们成为有用的叶绿体基因表达的报告基因的性质，如易于分析、灵敏性或原位检查表达的能力。基于这些研究，其它异源蛋白已经在高等植物的叶绿体中表达，如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Cry毒素，其将抗性给予草食昆虫(Kota等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 96：1840-1845，1999)或人生长激素(Staub等，Nat.Biotechnol.18：333-338，2000)，一种可能的生物药物。若干报告基因已经在真核绿藻莱茵衣藻的叶绿体中表达，包括aadA(Goldschmidt-Clermont，Nucl.Acids Res.19：4083-4089 1991；Zerges和Rochaix，Mol.Cell Biol.14：5268-5277，1994)、uidA(Sakamoto等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 90：477-501，19933，Ishikura等，J.Biosci.Bioeng.87：307-314 1999)、海肾(Renilla)荧光素酶(Minko等，Mol.Gen.Genet.262：421-425，1999)和来自鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)的氨基糖苷磷酸转移酶(amino glycoside phosphotransferase)aphA6(Bateman和Purton，Mol.Gen.Genet 263：404-410，2000)。

本文所述的载体可包含修饰的基因和/或开放读码框，其含有一个或多个重组产生的特征。例如，编码目标蛋白的基因可被有用的分子标记物标记。在一些实施方式中，所述标记可以是附加表位或标记多肽。通常地，附加表位包含足够数量的氨基酸残基以提供抗体可根据其制备的抗原表位，而抗原表位也足够短，以便其不影响所融合到的多肽的活性。优选地，标记也是相当独特的，以便根据该标记制备的抗体基本不与其它抗原表位(如FLAG标记)交叉反应。其它合适的标记可被使用，如，亲和标记。亲和标记被附加到蛋白上，以便使用亲和技术将蛋白从其天然粗生物来源中提纯。这样的标记的实例包括，但不限于，几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和金属亲和标记(如pol(His))。将标记置于C-和/或N-末端可基于例如蛋白功能而确定。本领域普通技术人员能认识到，适当标记的选择将基于多个因素，包括预期的用途、目标蛋白、费用等。

可对编码本发明所述蛋白的基因进行的修饰的另一实例是加入可剪切部分。典型地，所述剪切部分是被蛋白酶靶向的、合适长度的多肽。所述蛋白酶可以是生物中天然生成的，所述生物被预期是本发明所述载体的宿主。例如，在目标宿主是莱茵衣藻的情况下，蛋白可被工程化以包含可被膜结合的蛋白酶(参见，例如，Hoober等，Plant Physiol.1992 July；99(3)：932-937)或ClpP蛋白酶(NCBI#3053)识别的氨基酸区域。在其它实施方式中，自剪切蛋白酶，如口蹄疫病毒的A2区域(或其功能化部分)可被使用。Halpin等，Plant J.，1999；17(4)，453-459。典型地，可剪切部分将被用于含有融合蛋白的本发明所述载体。例如，在一些实施方式中，载体可含有编码融合蛋白的单一开放读码框，可剪切部分可被插入编码融合蛋白各部分的序列之间(例如，参见图14A)。

而可对编码本发明所述蛋白的基因进行的另一种修饰是加入分泌信号。蛋白分泌典型地是通过通常位于多肽N-末端的疏水性分泌信号，其靶向该蛋白到内质网，并最终到细胞膜。分泌信号允许多种宿主包括NVPOs中重组蛋白的产生和分泌。可被用于本发明的分泌信号的一个实例是来自莱茵衣藻碳酸酐酶蛋白的信号。Toguri等，Eur.J.Biochem.1986；158，443-450。多种这样的信号在本领域内被公知，并且合适的信号的选择取决于，例如，宿主细胞和蛋白折叠。

在一些实施方式中，本发明所述的载体含有诸如大肠杆菌或酿酒酵母(S.cerevisiae)复制起点的元件。这些特征，与适当的选择性标记结合，允许所述载体在目标宿主细胞和细菌和/或酵母细胞之间“穿梭(shuttled)”。在第二宿主(secondary host)中传递本发明的穿梭载体的能力可允许对该载体特征更方便地操控。例如，含有载体和推定插入的目标多肽的反应混合物可以被转化进原核宿主细胞如大肠杆菌，被扩增并用常规方法收集，并且被检验，以分辨含有目标插入体或构建体的载体。如果期望，该载体可以进一步被操作，例如，通过进行定点突变插入的多核苷酸，随后再次扩增并选择具有变异的目标多核苷酸的载体。穿梭载体随后可以被引入植物细胞叶绿体，其中目标多肽可以被表达，并且如果期望，根据本发明所述的方法进行分离。

本发明的多核苷酸或重组核酸分子可以使用本领域已知的任何方法被引入植物叶绿体或核。多核苷酸可以通过多种本领域熟知的方法被引入细胞，并且部分地基于特定的宿主细胞进行选择。例如，多核苷酸可以使用直接基因转移的方法被引入植物细胞，所述方法例如电穿孔或使用粒子枪的微粒介导(基因枪)转化或“玻璃珠法(glass bead method)”，或通过花粉介导的转化、脂质体介导的转化、使用损伤或酶降解的未成熟胚胎或损伤或酶降解的胚胎胼胝体转化(Potrykus，Ann.Rev.Plant.Physiol.Plant Mol.Biol.42：205-225，1991)。

术语“外源的”以比较的意义用在这里，表示提到的核苷酸序列(或多肽)来自不同于参照来源的来源，或被连接到通常与其不相关的第二核苷酸序列(或多肽)，或被修饰以至于其是通常与参照材料不相关的形式。例如，编码酶的多肽相对于植物叶绿体的核苷酸序列是异源的；包含，例如，被可操作地链接到第二核苷酸序列的第一核苷酸序列的重组核酸分子的组成也是这样；被引入叶绿体的变异多核苷酸也是这样，所述变异多核苷酸通常无法在叶绿体中发现。

质体转化是用于将多核苷酸引入植物细胞叶绿体的一种方法(参见美国专利号5,451,513、5,545,817和5,545,818；WO 95/16783；McBride等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 91：7301-7305，1994)。在一些实施方式中，叶绿体转化涉及引入一侧带有期望核苷酸序列的叶绿体DNA的区域，允许外源DNA同源重组进入目标叶绿体基因组。本文的描述假定宿主细胞可以用载体转化。本领域普通技术人员能认识到这样的转化包括用环状或线性化的载体，或载体的线性化部分转化。因此，包含载体的宿主细胞可含有该细胞中的整个载体(环状或线性的形式)，或可包含本发明载体的线性化部分(如，图3和16中图示出的构建体)。在一些实施方式中，叶绿体基因组DNA一侧的1到1.5kb的核苷酸序列可以被使用。使用这种方法，在叶绿体16S rRNA和给予对奇霉素和链霉素的抗性的rps12基因中的点突变可以被用作转化的选择性标记(Svab等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 87：8526-8530，1990)，并且可以约每100次目标叶片轰击一个的频率，产生稳定的同型(homoplasmic)转化体。

微粒介导的转化也可以被用于将多核苷酸引入植物细胞叶绿体(Klein等，Nature 327：70-73，1987)。该方法是用了诸如金或钨的微粒，其被期望的多核苷酸通过与氯化钙、亚精胺或聚乙二醇沉淀而包衣。微粒粒子使用诸如BIOLISTICPD-1000粒子枪(BioRad；Hercules Calif.)的设备被高速加速进入植物组织。使用基因枪方法进行转化的方法在本领域内被公知(参见，例如，Christou，Trends inPlant Science 1：423-431，1996)。微粒介导的转化已经被使用，例如，用以产生多种转基因植物种类，包括棉花、烟草、玉米、杂交白杨和木瓜。重要的谷类作物，诸如小麦、燕麦、大麦、高粱和水稻也已经使用微粒介导输送被转化(Duan等，Nature Biotech.14：494-498，1996；Shimamoto，Curr.Opin.Biotech.5：158-162，1994)。大多数双子叶植物的转化用上述方法是可能的。单子叶植物的转化也可以使用，例如，上述基因枪方法、原生质体转化、部分渗透细胞的点穿孔、使用玻璃纤维引入DNA、玻璃珠振荡(agitation)法等进行转化。

转化频率可通过隐性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因被显性选择性标记替代而提高，所述显性选择性标记包括但不限于细菌aadA基因(Svab和Maliga，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 90：913-917，1993)。转化后通常需要约15到20个细胞分裂周期以达到同质(homoplastidic)状态。叶绿体可包含其基因组的多个拷贝对本领域普通技术人员是显而易见的，并且因此，术语“同质的(homoplasmic)”或“同型异源性(homoplasmy)”指的是这样的状态——特定目标基因座的所有拷贝都基本相同。质体表达，其中基因通过同源重组插入每个植物细胞中存在的环状质体基因组的所有几千个拷贝中，利用了相对于核表达基因的大量拷贝数优势，以允许表达水平轻易地超过总可溶植物蛋白的10％。

本发明的方法可以通过向叶绿体中引入重组核酸分子实施，其中所述重组核酸分子包括第一多核苷酸，其编码至少一个多肽(即，1个、2个、3个、4个或更多)。在一些实施方式中，多肽被可操作地链接到第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和/或后续多肽。例如，在烃生产途径中的若干酶可以被直接或间接地链接，以便由途径中的一种酶产生的产物一旦产生，即与该途径中下一种酶非常靠近。

对于叶绿体的转化，本发明的一个主要优势是包含选择性标记和一个或多个目的基因的重组核酸构建体的使用。典型地，叶绿体的转化通过用以下两种构建体共转化叶绿体实施：一种包含选择性标记且第二种包含目的基因。这些转化体的筛选由于多种原因是费力且费时的。首先，培养一些转化的生物需要的时间是漫长的。其次，转化体必须被筛选出选择性标记和目的基因两者都存在。典型地，对目的基因的第二次筛选通过DNA印记法进行(参见，例如PCT/US2007/072465)。

在叶绿体中，基因表达的调控一般地在转录后并且通常在翻译起始时发生。这种调控取决于叶绿体翻译装置，以及核编码的调控因子(参见Barkan和Goldschmidt-Clermont，Biochemie 82：559-572，2000；Zerges，Biochemie 82：583-601，2000)。叶绿体翻译装置通常与细菌中的类似；叶绿体包含70S核糖体；具有缺少5’加盖的mRNA并通常不含有3’多腺苷尾部(Harris等，Microbiol.Rev.58：700-754，1994)；而且翻译在叶绿体和在细菌中被诸如氯霉素的选择性试剂抑制。

本发明的一些方法利用了核糖体结合序列(RBS)相对于编码序列的恰当置放。以前就已经注意到：RBS这样的置放引起植物叶绿体中稳健的翻译(参见美国申请2004/0014174，在此被引入作为参考)，以及利用叶绿体中表达多肽的多肽是该多肽不穿过通常被由核基因表达的多肽穿过的细胞区室，并因此，不经过某些翻译后修饰，如糖基化。同样地，通过本发明的一些方法产生的多肽和蛋白复合体可以被预期在没有这样的翻译后修饰的情况下产生。

术语“多核苷酸”或“核苷酸序列”或“核酸分子”在本文中被宽泛地使用，表示由磷酸二酯键连接在一起的两个或多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的序列。因此，该术语包括RNA和DNA，其可以是基因或其一部分、cDNA、合成的多脱氧核糖核苷酸序列等，并且可以是单链或多链的，以及DNA/RNA杂交体。而且，该术语，如本文中所用，包括天然生成的核酸分子，其可以从细胞分离，以及合成的多核苷酸，其可以通过例如化学合成的方法或通过酶的方法如通过聚合酶链反应(PCR)制备。应该认识到，不同术语的使用只是出于讨论的方便，以便区分，例如，组合物的不同成分，除了术语“合成的多核苷酸”用在这里指的是已经被修饰以反映叶绿体密码子使用的多核苷酸。

通常，包含一个多核苷酸的核苷酸是天然生成的脱氧核糖核苷酸，如连接到2’-脱氧核糖的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶，或诸如链接到核糖的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶。然而，取决于使用，多核苷酸也可以含有核苷酸类似物，包括非天然生成的合成的核苷酸或修饰的天然生成的核苷酸。核苷酸类似物在本领域内被公知并可购买到，含有这些核苷酸类似物的多核苷酸也一样(Lin等，Nucl.Acids Res.22：5220-5234，1994；Jellinek等，Biochemistry 34：11363-11372，1995；Pagratis等，Nature Biotechnol.15：68-73，1997)。通常，磷酸二酯键连接本发明多核苷酸的核苷酸，但是其它键，包括硫二酯键(thiodiester bond)、硫代磷酸酯键(phosphorothioate bond)、肽状键和任何其它本领域内已知的键可被用于产生合成的多核苷酸(Tam等，Nucl.Acids Res.22：977-986，1994；Ecker和Crooke，BioTechnology 13：351360，1995)。

本文所述的任意产物可以通过转化生物，以引起由所述产物的生物的生产和/或分泌来制备。生物被认为是光合生物，即使转化事件破坏或消除了该转化的生物的光合能力(如，外源核酸被插入编码光合作用所需的蛋白的基因)。

融合蛋白载体

在本发明的一些实施方式中，宿主NVPO核或质体基因组将是用含有融合蛋白的构建体转化的目标。本文所述的任何载体或其线性化的部分可以通过插入合适的信号(如，宿主细胞的核复制起点或质体的复制起点)或合适的一侧同源区域(用于与目标基因组进行同源重组)被修饰用于核或质体转化。本发明的一些构建体在图14中被示出。图14A中所示的构建体包含至少一个调控元件(“启动子/5’UTR”和/或“3’UTR”)和一个含有至少两个元件(“选择性标记”和“转基因”)的开放读码框(即，融合蛋白)。在一些实施方式中，一个或多个调控元件可以是待转化生物内源的(如，5’和3’调控元件是引导构建体插入目标基因组的一侧同源部分)。在该图中，启动子被可操作地连接到开放读码框，因此驱动融合蛋白的表达。使用这种方法的一个潜在优点是防止重组事件，降低可能导致删除的表达或其它作用，或降低转基因(即，类异戊二烯产生酶)的表达。此外，通过创建包含选择性标记和转基因的融合蛋白，插入位点可能被保留以产生多转化株(multiply-tranformed strains)。然而，在一些实施方式中，融合蛋白可含有两个或多个转基因(如，FPP合成酶或姜烯合成酶)。

图14A中也显示了包含一个可选的剪切部分(“CM”)，其符合选择性标记和转基因的读码框。如上文所述，该剪切部分，当存在时，可允许目标基因从选择性标记上剪切。典型地，对可剪切部分的剪切将产生两个功能蛋白(如，选择性标记和转基因)。剪切可导致该可剪切部分的一部分留在侧翼多肽的一个、两个上，或都没有。剪切可在翻译后或翻译中发生。因此，在一些实施方式中，含有选择性标记、转基因和介于中间的可剪切部分的融合蛋白可存在于宿主细胞中。在其它实施方式中，该融合蛋白在全长融合蛋白转录体被翻译之前被剪切。

可对编码融合蛋白(或本文所述的任何其它蛋白或蛋白的种类)的序列进行其它修饰。一个例子是接头(linker)多肽。这样的多肽可为目标蛋白提供空间分隔，允许融合蛋白的部分恰当地折叠，和/或起因于融合蛋白的重组构建。在另一实例中，分泌信号可符合该融合蛋白的一个或多个部分(如，转基因、选择性标记或两者)的读码框而被融合。典型地，分泌信号被用于靶向在核基因组中表达的融合蛋白。在其它实施方式中，一个或多个标记可按照该融合蛋白的一个或多个部分的读码框被融合。例如，编码多聚组氨酸(poly(His))标记的核苷酸序列可按照编码转基因的序列的读码框被连接，并且编码FLAG标记的核苷酸序列可按照编码选择性标记的序列的读码框被连接。而在其它实施方式中，编码分泌信号的核酸可按照该融合蛋白的一部分的读码框被连接。在一些实施方式中，分泌信号可被连接到转基因。明显地，选择性标记、转基因、可剪切部分、信号序列和/或标记的多种组合可基于实施者的需要，被结合成单一的开放读码框。因此，图14中所示的构建体的简化版本并非意欲限制本发明构建体的范围。本领域普通技术人员也能认识到，各部分的这些组合也可被用在构建体中，其可用于转化叶绿体。

图14B显示了核转化的另一方法，其中转化的构建体包含选择性标记和在不同调控元件控制下的转基因。尽管没有明示，这样的构建体按上文所述，可包含可剪切部分、分泌信号和/或标记。

核酸、蛋白质和酶

本文公开的载体和其它核酸可以编码促进本文所述中间体、产物、前体和产物衍生物生产的多肽。例如，载体可编码在类异戊二烯途径中促进中间体、产物、前体和衍生物生产的多肽。

实施本发明中用到的酶可通过由任意生物包括细菌、植物、真菌和动物衍生的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，所述酶是类异戊二烯产生酶。用在这里，“类异戊二烯产生酶”是天然或非天然生成的酶，其产生类异戊二烯或提高类异戊二烯的产量。在一些实施方式中，类异戊二烯产生酶产生带有两个磷酸根的类异戊二烯(如，GPP合成酶、FPP合成酶、DMAPP合成酶)。在其它实施方式中，类异戊二烯产生酶产生带有零、一、三或更多磷酸根的类异戊二烯，或可产生带有其它功能基团的类异戊二烯。这些酶的非限定性实例和它们的来源显示于表1。编码本发明中有用的酶和其它蛋白的多核苷酸可通过本领域已知的任何手段分离和/或合成，包括，但不限于克隆、亚克隆和PCR。

表1.本发明中使用的合成酶的实例

所述合成酶可以是葡萄烃合成酶、β-石竹烯合成酶、大根香叶烯A合成酶、8-表雪松醇合成酶、朱栾倍半萜合成酶、(+)-δ-杜松烯合成酶、大根香叶烯C合成酶、(E)-β-法尼烯合成酶、蓖麻烯合成酶、vetispiradiene合成酶、5-表-马兜铃烯合成酶、马兜铃烯合成酶、α-葎草烯、(E，E)-α-法尼烯合成酶、(-)-β-蒎烯合成酶、γ-松油烯合成酶、苧烯环化酶、沉香醇合成酶、(+)-冰片二磷酸合成酶、左旋海松二烯合成酶、异海松二烯合成酶、(E)-γ-红没药烯合成酶、柯巴基焦磷酸合成酶、贝壳衫烯合成酶、长叶烯合成酶、γ-葎草烯合成酶、δ-蛇床烯合成酶、β-水芹烯合成酶、异松油烯合成酶、(+)-3-蒈烯合成酶、顺-柯巴基焦磷酸合成酶、α-松油醇合成酶、顺-海松-7，15-二烯合成酶、反-山达海松二烯合成酶、sterner-13-ene合成酶、E-β-罗勒烯、S-沉香醇合成酶、牻牛儿醇合成酶、γ-松油烯合成酶、沉香醇合成酶、E-β-罗勒烯合成酶、表-雪松醇合成酶、α-姜烯合成酶、愈创木二烯合成酶、卡藜二烯合成酶、顺-穆罗拉二烯合成酶、阿菲迪柯林-16b-醇合成酶、伊丽莎白三烯合成酶、檀香醇合成酶、广藿香醇合成酶、zinzanol合成酶、雪松醇合成酶、香紫苏醇合成酶、柯巴醇合成酶或泪柏醇合成酶。

本发明的载体能够稳定地转化多种光合生物，包括，但不限于光合细菌(包括蓝细菌)、蓝藻门、原绿藻门、红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、tribophyta、灰色藻门、丝足虫门、裸藻门、眼虫藻、定鞭藻门、金藻门、隐藻门、隐滴虫、甲藻门、腰鞭毛虫、定鞭金藻、硅藻门、黄藻门、黄绿藻、针胞藻类、褐藻门和浮游植物。本发明所述的其它载体能够稳定地转化莱茵衣藻(C.reinhardtii)、盐生杜氏藻(D.salina)、雨生红球藻(H.pluvalis)、二形栅藻(s.dimorphus)、绿色杜氏藻(D.viridis)或杜氏盐藻(D.tertiolecta)。

本文的载体可编码在甲羟戊酸途径中发挥作用的多肽，例如，如，硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧酶。在其它实施方式中，所述多肽是非甲羟戊酸途径中的酶，例如DOXP合成酶、DOXP还原酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶、2-C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸合成酶、HMB-PP合成酶、HMB-PP还原酶或DOXP还原异构酶。

在其它实施方式中，载体可含有编码类异戊二烯途径中的多肽的核苷酸序列，如，例如，编码合成酶的序列。所述合成酶可以是C10、C15、C20、C30或C40合成酶。在一些实施方式中，所述合成酶为苧烯合成酶、1，8-桉树脑合成酶、α-蒎烯合成酶、莰烯合成酶、(+)-桧萜合成酶、月桂烯合成酶、松香二烯合成酶、紫杉二烯合成酶、法尼焦磷酸合成酶、紫穗槐二烯合成酶、(E)-α-红没药烯合成酶、diapophytoene合成酶或diapophytoene去饱和酶。合成酶的非限定性实例和它们的氨基酸序列显示于表2。

表2.合成酶的蛋白序列

编码多核苷酸的一个或多个密码子可以被偏倚，以反映叶绿体和/或核密码子的使用。大多数氨基酸由两个或多个不同的(简并的)密码子编码，并且各种生物使用某些密码子优先于其它密码子是公知的。这样优选的密码子使用，其也在叶绿体中使用，在这里指的是“叶绿体密码子使用”。莱茵衣藻的密码子偏倚性已经被报道。参见美国申请2004/0014174。编码类异戊二烯生物合成酶——其被偏倚用于在莱茵衣藻中表达——的核酸的实例在表5-8中提供。与原生序列同一性百分比(在该序列被分离的生物中)可以是约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更高。本发明的一些载体包含表5提供的一种或多种核酸和/或具有与其约70％同一性的核酸。

适合确定核酸或多肽序列之间序列同一性或序列相似性百分比的算法的一个实例是BLAST算法，其在Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中描述。进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开获得。BLAST算法参数W、T和X确定比对(alignment)的灵敏性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望值(E)10、截断值100、M＝5、N＝-4和双链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)3、期望值(W)10和BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915)。除了计算序列同一性百分比，BLAST算法也可以进行两个序列间相似性的统计分析(参见，例如Karlin&Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小总和概率(smallest sum probability)(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间发生偶然匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸和参考核酸比较中最小总和概率小于约0.1，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，该核酸则被认为与参考序列相似。

术语“偏倚的”当用于指密码子时，表示多核苷酸中密码子的序列已经被改变，以至于该密码子在该偏倚(bias)用于的目标中，如藻细胞、叶绿体，是被优选地使用的一个。为叶绿体密码子使用而偏倚的多核苷酸可以重新合成，或可以使用常规的重组DNA技术，例如，通过位点定向诱变法，进行基因修饰，以改变一个或多个密码子，以便它们针对叶绿体密码子使用是偏倚的。叶绿体密码子偏倚可以在不同植物中多种地变化，包括，例如，在藻类叶绿体中与在烟草中比较。通常，选择的叶绿体密码子偏倚性反映了用本发明所述核酸转化的植物的叶绿体密码子使用。例如，在莱茵衣藻为宿主的情况下，叶绿体密码子使用被偏倚，以反映藻类叶绿体密码子使用(约74.6％的AT偏倚在第三个密码子位置)。

本发明的一种方法可以使用编码第一多肽和至少第二多肽的多核苷酸实施。因此，该多核苷酸可以编码，例如，第一多肽和第二多肽；第一多肽、第二多肽和第三多肽等。而且，任何或所有编码的多肽可以是相同的或不同的。在微藻莱茵衣藻的叶绿体中表达的多肽可被组装，形成功能多肽或蛋白复合体。因此，本发明的方法提供了产生功能蛋白复合体，包括，例如，二聚体、三聚体和四聚体的方法，其中所述复合体的亚基可以是相同的或不同的(如，分别是同源二聚体或异源二聚体)。

术语“重组核酸分子”用在这里是指由人工介入操控的多核苷酸。重组核酸分子可以含有两个或多个核苷酸序列，它们以这样的方式连接——以至于产物无法在自然界的细胞中找到。特别地，两个或多个核苷酸序列可以被可操作地连接，而且，例如，可以编码融合多肽，或可以含有编码的核苷酸序列和调控元件。重组核酸分子也可以基于天然生成的多核苷酸，但被操控以至于与天然生成的多核苷酸不同(如，为叶绿体密码子使用而偏倚、限制性酶切位点的插入、启动子的插入、复制起点的插入)。重组核酸分子可进一步包含肽标记(如His-6标记)，其能够辅助细胞内多肽表达的识别。其它标记包括，例如：FLAG抗原表位、c-myc抗原表位；生物素和谷胱甘肽S-转移酶。这些标记可以通过本领域内已知的任何方法检测(如，抗标记的抗体、链霉亲和素)。这些标记也可被用于分离可操作连接的多肽，例如，通过亲和层析。

包含天然生成的核苷酸和磷酸二酯键的多核苷酸可以被化学合成或可以使用同组DNA的方法、使用合适的多核苷酸作为模板而生产。相比之下，含有核苷酸类似物或磷酸二酯键以外的共价键的多核苷酸通常是化学合成的，尽管诸如T7聚合酶的酶可以将某些类型的核苷酸类似物插入多核苷酸，且因此能够被用于从合适的模板生产重组的多核苷酸(Jellinek等，见上文，1995)。用于实施本发明方法的多核苷酸可从任何生物中分离。

本发明可以利用NVPO中天然生成产物的生产途径。这样途径的一个实例(用于叶绿醇和β-胡萝卜素的生产)显示于图1。本领域普通技术人员将认识到，该类异戊二烯生成途径只不过是通过实例的方式提供，以进一步阐释一种实施方式。

本发明的一个方面是修改叶绿醇/β-胡萝卜素途径，以生产非天然生成的产物和/或提高天然生成产物的产量。图2显示了用于图1所示途径的修改的一个潜在可能。通过插入外源牻牛儿基二磷酸合成酶(GPPS)和/或法尼二磷酸合成酶(FPPS)，GPP和FPP的产量可以被提高。例如，宿主生物(如，莱茵衣藻、杜氏盐藻)可以用表5或7中所列的任何编码GPP或FPP合成酶的序列转化(如，SEQ ID NOs.82、87-94、118和/或180-191)。而且，如下文实施例中所示例，GPPS或FPPS的引入可由编码酶(如，苧烯合成酶、姜烯合成酶、叶绿素酯水解酶)的外源基因的插入伴随，所述酶引起不是由NVPO天然产生的目的类异戊二烯(如，单萜、倍半萜和三萜)的生产。可单独或组合用于转化NVPOs的酶的非限定性列表在表5-8中提供。

编码本发明所述酶的基因的插入可导致天然生成的类异戊二烯(如，GPP、FPP、叶绿醇、八氢番茄红素、β-胡萝卜素)产量的提高。例如，天然生成的类异戊二烯(如，GPP、FPP、八氢番茄红素)的产量可通过以下途径提高：1)引入编码生产类异戊二烯的合成酶的内源或外源基因的额外拷贝；2)引入调控元件(如，组成型启动子、诱导型启动子)以控制天然生成的合成酶的表达；和/或3)引入外源核酸，其通过间接途径提高天然生成的类异戊二烯产量(如，外源GPPS可提高细胞内GPP的浓度，为叶绿醇/叶绿素的合成途径提供更多底物)。

因此，某些天然生成的类异戊二烯的产量可被提高。仅出于阐释的目的，所述类异戊二烯，叶绿醇，是通过多种NVPOs，包括莱茵衣藻，天然产生的。一般地，野生型莱茵衣藻株中叶绿醇的量小于以质量计1％。本公开提供了若干可提高叶绿醇产量的机制。在一个实施例中，驱动内源基因(如GPP合成酶)组成型或诱导型表达的调控元件可被引入生物的基因组，以在比天然生成的调控元件达到的更高水平上表达该基因。可选地，一种或多种外源类异戊二烯合成酶可被引入生物的基因组。这些合成酶可与目标NVPO同源或非同源(如，来自相关生物的GPP合成酶、FPP合成酶)。可选地，外源的酶(如，磷酸酶、焦磷酸酶)可被引入目标NVPO。这些酶可对天然生成的底物(如，GGPP、叶绿基二磷酸)起作用，或可对由引入宿主NVPO的其它外源酶生成的底物作用。在一些实施方式中，外源酶可产生目标类异戊二烯(如，叶绿醇)，或可产生用于酶的前体，其随后发挥生产目标类异戊二烯的作用。而在另一种方法中，酶可被引入或上调，其引起由宿主NVPO产生的产物的降解——天然地或作为引入基因的结果——由此产生目的类异戊二醇。例如，叶绿素酯水解酶可被引入宿主细胞，促进叶绿素降解为叶绿醇。

使用这些方法，修饰的NVPO可包含约1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5.0％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6.0％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％或更多。如果期望，叶绿醇可以从修饰的NVPOs中被收集并被浓缩到约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、76％、80％、85％、90％、95％或更高。在一些实施方式中，包含从本发明的NVPO中收集的叶绿醇的组合物也可包含NVPO细胞的部分(如，细胞壁物质、细胞膜物质、蛋白质、碳水化合物、核酸等)。

本发明中使用的途径可以包含细胞液中、质体中(如，叶绿体)或两者中存在的酶。编码本发明实施方式中酶的外源核酸可被引入宿主细胞，以便编码的酶在细胞液中或在质体中或在两者中都有活性。在一些实施方式中，在宿主细胞转化后，在一个细胞内区室(如，在细胞液中)中存在的天然生成的酶可在不同的细胞内区域内(如在叶绿体中)，或在天然生成和非天然生成的区域内表达。

为了阐释这一概念，并且只是通过实例的方式，无维管光合微藻可以被基因工程化，以产生类异戊二烯，如苧烯(一种在特用化学和石化工业中有很高价值的分子)。苧烯是纯烃单萜，仅含有氢和碳原子。苧烯不是莱茵衣藻中天然产生的。苧烯在这些微藻中的产生可以通过工程化该微藻以在叶绿体中表达异源酶苧烯合成酶而完成。苧烯合成酶可以将萜烯前体牻牛儿基焦磷酸(geranylpyrophosphate)转化成苧烯。不像苧烯，牻牛儿基焦磷酸天然存在于微藻的叶绿体中。苧烯合成酶的表达可以通过插入编码苧烯合成酶的异源基因到微藻的叶绿体基因组中完成。随后使微藻的修饰株成为同质的，以确保苧烯基因在所有后代的叶绿体基因组中稳定保持。当被插入的基因存在于叶绿体基因组的所有拷贝中时，微藻对于基因是同质的。叶绿体可能包含其基因组的多个拷贝对本领域普通技术人员是显而易见的，并且因此，术语“同质的(homoplasmic)”或“同型异源性(homoplasmy)”指的是这样的状态——特定目标基因座的所有拷贝都基本相同。质体表达，其中基因通过同源重组插入每个植物细胞中存在的环状质体基因组的所有几千个拷贝中，利用了相对于核表达基因的大量拷贝数优势，以允许表达水平轻易地超过总可溶植物蛋白的10％。

简单地说，确定本发明所述生物的原生质状态的过程包括在给定的目标基因座上，筛选有外源核酸存在且没有野生型核酸的转化体。这样的方法被用在下文的实施例1和2中(图4A-C和6A-C)。

本文的任何载体(如，包括上文所述的任何表达载体)可以包含编码蛋白或多肽的核苷酸序列，所述蛋白或多肽允许或提高由转化的生物产生产物的分泌。蛋白或多肽分子影响、提高、上调或调节产物从宿主细胞或生物的分泌。

表达载体可包含编码允许或提高产物分子分泌的蛋白或多肽，和编码来自类异戊二烯途径的合成酶的核苷酸序列。

选择性标记

在一些实施方式中，表达载体中的异源序列编码显性选择性标记，用于转化的生物的选择。因此，已经接受转化的生物可以在一种化合物(如，显性选择性标记向其赋予抗性的化合物)存在的情况下被培养，所述化合物允许对转化的宿主细胞进行显性选择。当在宿主生物中表达时，选择性标记向其赋予抗性的化合物的实例包括代谢抑制剂(即，抑制藻类新陈代谢的化合物)，如抗生素、杀真菌剂、灭藻剂、杀菌剂和除草剂。功能上，这些化合物可对细胞有毒性，或通过作为蛋白或核酸的结合试剂抑制代谢。例如，这些化合物可以抑制翻译、转录、酶功能、细胞生长、细胞分裂和/或微管形成。适合用于本发明的显性选择性标记可以选自任何已知的或后续识别的选择性标记，包括从真菌和细菌来源衍生的标记(参见，例如美国专利号5,661,017)。在其它实施方式中，与营养缺陷型变异菌株互补的野生型同源基因也可被用作选择性标记系统，例如，在一些绿藻中(参见，例如Kindle等，J.Cell Biol.，109：2589-2601(1989)，其讨论了带有编码硝酸还原酶基因的莱茵衣藻的硝酸还原酶缺陷型变体的转化)。

调控序列

本文所述的任何表达载体可进一步包含调控序列。调控序列可包括例如，启动子、操纵子、抑制子、增强子、转录终止序列、调控翻译的序列，或与宿主细胞相容的和控制本发明的核酸分子表达的其它调控序列。在一些情况下，调控序列包括能够控制、调节或影响转录起始、延伸和/或终止的转录控制序列。例如，调控序列可以提高生物中基因或基因产物的转录和翻译速率和/或效率，其中所述基因或基因产物的表达被上调，(直接或间接地)引起本文所述的产物的生产、分泌或两者的提高。调控序列也可通过提高基因或基因产物的稳定性，导致生产、分泌或两者的提高。

调控序列可以是自体同源或异源的，并且如果是异源的，可以是同源的。调控序列可编码促进产物表达和生产的酶的一个或多个多肽。例如，异源的调控序列可由所述生物相同属的另一种(如，另一藻类种)产生，并在藻类中编码合成酶。在另一实施方式中，自体同源的调控序列可以由表达载体将在其中表达的生物中产生。

取决于应用，调控序列可以被用以影响诱导型或组成型表达。藻类调控序列可以被使用，并且可以是核、病毒、染色体外、线粒体或叶绿体源的。

合适的调控序列包括与待表达核苷酸序列天然相关的那些(例如，藻类启动子天然地与藻类衍生的核苷酸序列可操作地连接)。合适的调控序列包括与待表达的核酸分子非天然相关的调控序列(例如，一个种的藻类启动子与另一生物或藻类种的核苷酸序列可操作连接)。后一种调控序列可以是在相同种内控制另一基因表达的序列(即，自体同源)，或可以从不同生物或种中衍生(即，异源的)。

为了确定推定的调控序列是否合适，该推定的调控序列被连接到核酸分子，其通常编码产生容易检测的信号的蛋白。该构建体可随后通过标准技术插入藻类或其它生物，并且其表达被监控。例如，如果核酸分子编码显性的选择性标记，待使用的藻类或生物被测试在所述标记为其提供抗性的化合物存在的环境中生长的能力。

在一些情况下，调控序列是启动子，如适合核苷酸序列在无维管光合生物中表达的启动子。例如，所述启动子可以是藻类启动子，例如美国公开申请号2006/0234368和2004/0014174，以及Hallmann的Transgenic Plant J.1：81-98(2007)中所述。该启动子可以是叶绿体特异性启动子或核启动子。启动子可以是EF1-α基因启动子或D启动子。在一些实施方式中，所述合成酶被可操作地连接到EF1-α基因启动子。在一些实施方式中，所述合成酶被可操作地连接到D启动子。

本文的调控序列可以在多种位置发现，包括例如，编码区域和非编码区域、5′-未翻译区域(如，编码区域上游的区域)和3′-未翻译区域(如，编码区域下游的区域)。因此，在一些实施方式中，自体同源或异源的核苷酸序列可以包含一个或多个3′或5′-未翻译区域、一个或多个内含子或一个或多个外显子。

例如，在一些实施方式中，调控序列可以包含隐秘小环藻(Cyclotella cryptica)乙酰辅酶A羧化酶5′-未翻译调控序列或隐秘小环藻乙酰辅酶A羧化酶3′-未翻译调控序列(美国专利号5,661,017)。

调控序列也可编码嵌合或融合多肽，如蛋白AB或SAA，其促进异源核苷酸序列和蛋白的表达。其它调控序列包括自体同源的内含子序列，其可促进异源序列的翻译。

在本文的任何表达载体中使用的调控序列可被诱导。可诱导的调控序列，如启动子，可以通过例如光被诱导。调控序列也可以是可自体调控的。可自体调控的调控序列的实例包括通过，例如，内源ATP水平或通过由生物产生的产物自体调控的那些。在一些实施方式中，所述调控序列可通过外源试剂被诱导。其它可诱导的元件在本领域内被公知，并且可适合用在本发明中。

本文所述的各种调控序列的各种组合可通过本发明实施，并与本发明的其它特征组合。在一些情况下，表达载体含有一个或多个调控控制，其被可操作地连接到编码多肽的核苷酸序列。这样的序列，可以，例如，上调本文所述的产物的分泌、生产或两者。在一些情况下，表达载体包含一个或多个调控序列，其被可操作地连接到编码多肽的核苷酸序列上，所述多肽影响，例如，上调产物的分泌、生产或两者。

表达

叶绿体是光合生物中生产性的细胞器和大量蛋白合成的位置。本文所述的任何表达载体可选择性地适合叶绿体表达。许多来自高等植物的叶绿体启动子已经在Kung和Lin，Nucleic Acids Res.13：7543-7549(1985)中描述。基因产物可在叶绿体中由表达载体表达。由表达载体编码的基因产物也可由叶绿体靶向基因被靶向到叶绿体。例如，靶向表达载体或由表达载体编码的基因产物到叶绿体可进一步增强由调控序列和编码允许或提高燃料分子分泌的蛋白或多肽的序列提供的效果。

本文所述的靶向叶绿体的各种组合可通过本发明具体体现并与本发明的其它特征组合。例如，编码萜烯合成酶的核苷酸序列可被可操作地连接到编码叶绿体靶向基因的核苷酸序列。宿主细胞可用编码靶向叶绿体的苧烯合成酶的表达载体转化，并且因此，可产生比用编码苧烯合成酶但没有叶绿体靶向基因的表达载体转化的宿主细胞更多的苧烯合成酶。提高的苧烯合成酶的表达可产生比产生较少的宿主细胞更多的苧烯。表5和7提供了编码本发明中有用的类异戊二烯产生酶的核酸实例。表6和8提供了添加限制性酶切位点的这些核酸的序列。表5-8中的序列也针对莱茵衣藻的表达进行了密码子偏倚。这些位点，显而易见地，能够被用于将核酸插入载体。

而在另一实施例中，包含编码产生产物(如，燃料产物、香料产物、杀虫剂产物)的酶的核苷酸序列的表达载体被靶向到叶绿体，所述产物不是由生物通过使用由该生物天然产生的前体作为底物天然产生的。通过靶向该酶到叶绿体，产物的生产与酶在其中被表达但未被靶向到叶绿体的宿主细胞相比被提高。不被理论限制，这可能是由于更多的前体在叶绿体中被产出，并且因此，更多的产物可能通过由被引入的核苷酸序列编码的酶被产出。

产物

本文考虑的产物的实例包括烃产物和烃衍生物产物。烃产物是仅含有氢分子和碳分子的产物。烃衍生物产物是带有一个或多个杂原子的烃产物，其中所述杂原子是非氢或碳的任何原子。杂原子的实例包括，但不限于，氮、氧、硫和磷。一些产物是富含烃的，其中以重量量计至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的产物是由碳和氢构成。

可使用本文所述的组合物及方法生产的烃和烃衍生物的实例包括萜烯，及其衍生物，类萜。萜烯是异戊二烯(C5)单元构成的分子，并且不必是纯的烃。萜烯典型地是由异戊二烯单元衍生。异戊二烯单元是五碳单元(C5)。萜烯是可以被改性(如氧化、去甲基等)或其碳骨架被重组以形成萜烯衍生物如类异戊二烯的烃。

类异戊二烯(也被称为类萜)是由异戊二烯亚单元衍生，但是是被改性的，如通过诸如氧的杂原子的加入、通过碳骨架的重组和通过烷基化。类异戊二烯通常具有若干个碳原子，其可被5整除，但这不是要求，因为“不规则(irregular)”类萜是已知的。类胡萝卜素，诸如胡萝卜素和叶黄素，是类异戊二烯作为有用产物的实例。类固醇是类萜的另一实例。类异戊二烯的实例包括，但不限于，半萜(C5)、单萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)、三萜(C30)、四萜(C40)和多萜(C_n，其中n等于或大于45)。类异戊二烯的其它实例包括，但不限于，苧烯、1，8-桉树脑、α-蒎烯、莰烯、(+)-桧萜、月桂烯、松香二烯、紫杉二烯、法尼焦磷酸、紫穗槐二烯(amorphadiene)、(E)-α-红没药烯、姜烯或diapophytoene，及其衍生物。

类异戊二烯前体被认为通过两种途径产生。甲羟戊酸途径，或HMG-CoA还原酶途径，产生二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)和异戊基焦磷酸(IPP)，类异戊二烯常见的C5前体。非甲羟戊酸途径是形成DMAPP和IPP的可选途径。DMAPP和IPP可被缩合以形成牻牛儿基二磷酸(GPP)或其它前体，如法尼二磷酸(FPP)、忙牛儿基忙牛儿基二磷酸(GGPP)，由它们形成更高级的类异戊二烯。

可以包含本发明的类异戊二烯的产物的实例包括，但不限于，燃料产物、香料产物和杀虫剂产物。在一些实施方式中，产物可被直接使用。在其它实施方式中，产物可被用作“原料(feedstock)”以生产另一种产物。例如，在产物为类异戊二烯的情况下，所述类异戊二烯可被氢化并被“裂化(cracked)”以产生较短链的烃(如，法尼烯被氢化以产生法尼烷，其随后被裂化以产生丙烷、丁烷、辛烷或其它燃料产物)。

由本发明产生的产物可由被转化的宿主细胞和/或生物天然或非天然(如作为转化的结果)地产生。产物也可以是自然界中不存在的新分子。例如，藻类中天然产生的产物可以是萜烯，如类胡萝卜素(如β-胡萝卜素)。不是由藻类天然产生的产物的实例包括非天然的萜烯，如苧烯。宿主细胞可被基因修饰，例如，通过用序列转化以促进苧烯的分泌。

燃料产品

燃料产品的实例包括石化产品及其前体，和所有其它可能在石油化学工业中有用的物质。燃料产品包括，例如，石油产品、石油的前体，以及它们的石化产品和前体。燃料或燃料产品可被用在燃烧器中，例如锅炉、窑炉、烘干机或熔炉。燃烧器的其它实例是诸如汽车引擎或发电机的内燃机，包括汽油发动机、柴油发动机、喷射发动机和其它。燃料产品也可被用于生产塑料、树脂、纤维、弹性体、润滑剂和凝胶。

燃料产品可以包括短链烷烃(small alkane)(例如1到约4个碳)，如甲烷、乙烷、丙烷或丁烷，其可被用于加热(如在烹饪中)或制作塑料。燃料产品也可包括带有约5个到约9个碳原子的碳骨架的分子，如石脑油(naptha)或石油醚，或其前体。其它燃料产品可以是约5到约12个碳原子或用作汽油或发动机燃料的环烷烃。约10到约18个碳的分子和芳香族，如煤油或其前体，也可以是燃料产品。燃料产品也可包括具有多于12个碳的分子或其前体，如润滑油中所用的。其它燃料产品包括重瓦斯(heavy gas)或燃料油(fuel oil)，或它们的前体，通常包括约20到约70个碳的链烷烃、环烷烃和芳香烃。燃料产品也包括可以从原油衍生或从原油中发现的其它残留物和它们的前体，例如焦炭、沥青、焦油和蜡，它们通常包含具有约70或更多碳的多个环。

多种燃料产品可通过若干过程被进一步精炼为终端用户的最终产品。精炼可以通过分级分馏(fractional distillation)进行。例如，燃料产品的混合物，如具有多种不同链长的不同烃类的混合物可通过分级分馏被分离成各种成分。

精炼也可包括任意的一个或多个以下步骤：裂化、整合(unify)或改变所述燃料产品。长链(Large)燃料产品，如长链烃(如≥C10)，可通过裂化被打断成较短的片段。裂化可通过加热或高压，例如通过蒸气处理、减粘裂化或焦化进行。燃料产品也可通过减粘裂化被精炼，例如降低重油的粘度。精炼也可包括焦化，其中重的、几乎是纯的碳残余物被产出。裂化也可通过催化的方法进行，通过使用催化剂，例如，但不限于，沸石、水合硅酸铝、矾土或二氧化硅-氧化铝，提高裂化反应的速率。催化可通过流化催化裂化，由此热的催化剂，如沸石，被用于催化裂化反应。催化也可通过加氢裂化进行，与流化催化裂化相比，通常使用更低的温度。加氢裂化通常在升高的氢气分压存在的条件下发生。燃料产品可通过催化裂化被精炼，以产生柴油、汽油和/或煤油。

燃料产品也可通过在整合步骤中将它们结合而精炼，例如，通过使用诸如铂或铂-铼混合物的催化剂。所述整合过程通常产生氢气，一种可被用在裂化中的副产物。

燃料产品也可通过将烃改变或重组(rearranging)或重构(restructuring)为较小的分子进行精制。在催化重组过程中有许多化学反应发生，它们被本领域普通技术人员公知。一般地，催化重组在催化剂存在和高氢分压下进行。一个常见的过程是烷基化。例如，丙烯和丁烯与诸如氢氟酸或硫酸的催化剂混合。

燃料产物也可被混合或结合为混合物，以获得终产物。例如，燃料产物可被混合以形成各种等级的汽油，带有或没有添加剂的汽油，各种重量和等级的润滑油，各种等级的煤油，喷气式发动机燃料，加热用油(heating oil)和用于制备塑料和其它聚合物的化学品。本文描述的燃料产品的组合物可与通过其它方式产生的燃料产品结合或混合。

由本发明所述宿主细胞产生的一些燃料产品，特别是精炼后的，与已经存在的石化产品相同，即相同的结构。一些燃料产品可与已存在的石化产品不同。然而，尽管一种分子可能不存在于传统的石化产品中或精炼品中，其仍可能在这些工业中有用。例如，烃可以被生产为其在汽油的沸点范围内，并且其可以被用作汽油或添加剂，即使它不是通常在汽油中存在的。

方法

因此，产物(如，类异戊二烯、燃料产品、香料产品、杀虫剂产品)可通过以下方法产生，其包括：用表达载体转化宿主生物(如，无维管光合生物)，培养该生物；和收集由该生物产生的产物。在相关但独特的方面，本发明提供了生产产物的方法，其包括：用表达载体转化光合生物，培养该生物；和收集由该生物产生的产物。所述表达载体通常是本文所述的表达载体的类型，并且特别地被用于向生物增加额外的生物合成能力或改变该生物中已经存在的生物合成途径，意图在于提高或允许由该光合生物产生分子。

本文的方法包括选择用于生产产物的基因，产物例如类异戊二烯、燃料、香料和杀虫剂，用该基因转化光合生物的细胞，和在允许生产产物的合适条件下培养该生物。本发明的生物可以在传统的发酵生物反应器中培养，其包括，但不限于，分批式(batch)、补料分批式(fed-batch)、细胞再循环和连续式发酵器。而且，它们可在光生物反应器中生长(参见，例如，美国专利公开号20050260553；美国专利号5,958,761；美国专利号6,083,740)。培养也可以在摇瓶、试管、微量滴定盘(microtiter dish)和培养皿中进行。培养在适合重组细胞的温度、pH和氧含量的条件下进行。这些培养条件在本领域普通技术人员中被公知。

宿主生物是包含宿主细胞的生物。在优选的实施方式中，宿主生物是进行光合作用的。光合生物是天然进行光合作用(具有质体)的或被基因修饰或被其它修饰能进行光合作用的生物。在一些实施方式中，光合生物可用本发明的构建体转化，其使得全部或部分光合器官无法使用。在一些实施方式中，宿主生物是无维管和光合的。宿主细胞可以是原核的。本发明所述的一些原核生物的实例包括，但不限于，蓝细菌(如，聚球藻(Synechococcus)、集胞藻(Synechocystis)、节旋藻(Athrospira))。宿主生物可以是单细胞生物或多细胞生物。在大多数实施方式中，所述宿主生物是真核生物(如，绿藻、红藻、褐藻)。在优选的实施方式中，所述宿主细胞是微藻(如，莱茵衣藻、杜氏盐藻(Dunaliella salina)、雨生红球藻(Haematococcus pluvalis)、二形栅藻(Scenedesmus dimorphus)、绿色杜氏藻(D.viridis)或盐生杜氏藻(D.tertiolecta))。本文考虑的生物的实例包括，但不限于，红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、tribophyta、灰色藻门、丝足虫门、眼虫藻、定鞭藻门、隐藻门、隐滴虫、腰鞭毛虫和浮游植物。

可被用于实施本发明的一些宿主生物是嗜盐的(如，盐生杜氏藻、杜氏绿藻或杜氏盐藻)。例如，盐生杜氏藻可以在海水和咸水湖(盐分为千分之30-300)和高盐培养基(如，人工海水培养基、海水营养琼脂、半盐水培养基、海水培养基等)中生长。在本发明的一些实施方式中，包含本发明载体的宿主细胞可以在液态环境中生长，所述液态环境为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2，1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、31.、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3摩尔或更高浓度的氯化钠。本领域普通技术人员会认识到，其它盐(钠盐、钙盐、钾盐等)也可存在于所述液态环境中。

在嗜盐生物被用于本发明的情况下，其可用本文所述的任何载体转化。例如，盐生杜氏藻可用载体转化，所述载体能够插入叶绿体基因组并包含编码类异戊二烯产生酶(如，FPP合成酶、姜烯合成酶、角鲨烯合成酶)的核酸。转化的嗜盐生物可随后在高盐环境(如，咸水湖、咸水池塘、高盐培养基等)被培养，以生成目的产物(如类异戊二烯)。产物的分离可包括从该生物提取所述产物前，从高盐环境中转移转化的生物。在产物被分泌到周围环境的实例中，在对产物的任何进一步处理前，对所述液态环境脱盐可能是必要的。

宿主生物可在允许光合作用的条件下被培养，但是，这不是要求(如，宿主生物可在没有光的条件下被培养)。在一些实例中，所述宿主生物可以这样的方式被基因修饰——光合能力被减弱和/或破坏(见下文实施例)。在宿主生物不能进行光合作用的生长条件下(如，由于没有光和/或基因修饰)，通常，向该生物提供必要的营养物质，以支持在没有光合作用下的生长。例如，生物在其中(或其上)生长的培养基，可用任何必要的营养物质补充，包括有机碳源、氮源、硫源、维生素、金属、脂质、核酸、微量营养素或生物特异性需求。有机碳源包括宿主生物能够代谢的任何碳来源，其包括，但不限于，醋酸盐、简单的碳水化合物(如，葡萄糖、蔗糖、乳糖)、复杂的碳水化合物(如，淀粉、糖原)、蛋白质和脂质。本领域普通技术人员将认识到，并非所有的生物都能够充分地代谢特定的营养物质，并且营养物混合物可能需要根据不同生物进行修改，以便提供合适的营养物混合物。

宿主生物也可在陆地上生长，例如，垃圾填埋场。在一些实例中，宿主生物在乙醇生产工厂或在产生CO₂的其它设施或区域(如，城市、高速公路等)附近生长。因此，本文所述的方法考虑了向乙醇工厂或产生CO₂的其它设施或区域出售碳信用额，并同时通过在乙醇生产工厂附近培养一种或多种本文所述的修饰的生物来生产燃料的商业方法。

而且，所述生物可在户外开放水域生长，如池塘、大洋、海、河流、水床(waterbed)、沼泽水(marsh water)、浅池、湖泊、水库等。当在水中生长时，所述生物可以被包含在由乐高积木状(lego-like)颗粒组成的光环状(halo like)物体中。所述光环状物体围绕藻类，并允许其从下方水中保持营养同时保持其在无遮挡的阳光中。

在一些实例中，生物可以在容器中生长，其中每个容器包含1个或2个或多个生物。所述容器可以被构建为漂浮在水上。例如，容器可以由空气和水的组合填充，使得容器和在其中的宿主生物漂浮。因此，适应在淡水中生长的宿主生物可以在咸水(即，海水)中生长，并且反之亦然。如果容器有任何损坏，这种机制允许生物自动死亡。

在一些实例中，若干容器可以包含在上述光环状结构中。例如，多达100、1,000、10,000、100,000或1,000,000个容器可以被安排在光环状结构的一平米中。

在一些实施方式中，所述产物(如，燃料产品、香料产品、杀虫剂产品)通过收集所述生物被收集。所述产物随后可从生物中被提取。在一些实例中，所述产物可在不杀死所述生物的情况下被生产。生产和/或表达所述产品可不使所述生物不能存活。

在一些实施方式中，所述产物(如，燃料产品、香料产品、杀虫剂产品)的生产是可诱导的。所述产物可被诱导以表达和/或生产，例如，通过暴露于光照。而在其它实施方式中，所述产物的生产是自体调控的。所述产物可形成反馈回路，其中当产物(如，燃料产品、香料产品、杀虫剂产品)达到某个水平时，产物的表达或分泌被抑制。在其它实施方式中，所述生物的代谢产物的水平抑制产物的表达或分泌。例如，作为能量产生提高以表达或生产产物的结果，所述生物产生的内源ATP可形成反馈回路，以抑制该产物的表达。而在另一实施方式中，产物的生产可被例如通过光或外源试剂诱导。例如，用于引起宿主生物中产物生产的表达载体可包含可诱导的调控序列，其被外源试剂激活或钝化。

本发明也涉及筛选新基因/表达载体，以产生本文所述的任何燃料产品的方法。这些方法包括以下步骤：(1)向光合生物中插入候选的核酸表达载体；(2)收集由此产生的推定的燃料产品；(3)将推定的燃料产品应用到质谱中，以确定该推定的燃料产品的特征，以及其是否可被用作燃料产品。在一些实施方式中，步骤(2)可包括收集已知的燃料产品，以及确定候选表达载体是否相对于没有该候选表达载体的光合生物提高了燃料产品的生产或分泌。

其它方法

本发明也提供了一种商业方法，包括向培养基因修饰的、适合生产燃料产品的无维管光合生物一方提供碳信用额。本发明提出的生产燃料产品的方法提供了相对于目前方法可能更环境友好的生产燃料产品的方式。因此，本文所述的方法和组合物可被用在交换碳信用额的商业方法中。

碳信用额可以是补贴(allowance)、许可、信用或类似物，其已经被一些相关主权实体(例如但不限于市(包括所有规模和类型的城市，包括立市(incorporated)和未立市的(unincorporated)城市)、县、州或省、或国家，以及相关政府实体，如区域的、多国的或其它国际实体，如联合国或欧盟)允许、授权或承认。

碳信用额基本上可从规章制定机构或管理实体直接取得。在其它实例中，它们可间接地获得，例如，使用本文所述方法或组合物的实体可以从规章制定机构直接获得碳信用额，并可随后将该碳信用额转移到另一实体。碳信用额的转移可与给定的使用基因修饰的无维管光合生物的过程、产品相联系，所述生物适合产生燃料产品。

例如，第一个实体可被认定为是提供可消耗产品，该产品被分配到最终用户的机动货车(mobile platform)用于消耗，其中所述消耗和/或可消耗产品的生产包括相应的所产生的尾气。例如，柴油燃料的燃烧通常导致相应氮氧化物的环境释放，而汽油的燃烧通常导致相应的硫氧化物的释放。

第一方可采用使用上述基因修饰的生物生产其产物的方法，或在它们的组合物中使用由上文所述的基因修饰的生物产生的产物，产生与生产例如柴油燃料的传统方法相比对环境危害较小的影响。因此，抵消了终产物对环境的影响。第一方可随后收到碳信用额或尾气信用额，作为减少总排放的结果。所述碳信用额可从调控或管理机构取得，或可从第二方被转移到第一方，其中所述第二方可已经向第一方卖出了基因修饰的生物或基因修饰生物的产物。

碳信用额可被交换为很容易变现的金融票据。例如，碳信用额可被交换为现金等价物，如现金、支票等。碳信用额也可被交换为关于知识产权的法律授权，例如，但不限于，转让(assignment)或许可(license)。碳信用额也可被交换为政府税务补贴，或许可给定市场的购买者。碳信用额也可被交换为使用另一碳释放过程，如不包含培养所述生物的过程。例如，一方可拥有在一个时间段内如一个月或一年可释放的有限量的排放，而且如果超过该限度可能产生罚款或处罚。然而，用碳信用额，超过限度的一方可交换碳信用额以抵消罚款或处罚，或在确定由该方产生的排放量时碳信用额可被考虑进去。

本发明所述的商业方法也可以包括除燃料产品以外的产物的生产，如香料和杀虫剂。与燃料产品相关的商业方法，包括涉及碳信用额使用的那些，也与其它类型的有用产物和材料的生产相关。

尽管本发明优选的实施方式已经在本文被示出和描述，但对本领域普通技术人员明显的是，这些实施方式仅通过举例的方式被提供。多种变型、变化和替代在不背离本发明的前提下现在对本领域普通技术人员是想得到的。应该理解，本文所述发明的实施方式的各种替代可在实施本发明时被采用。意图在于，所附权利要求界定本发明的范围，并且在这些权利要求范围内的方法和结构以及它们的等价物由此被覆盖。以下实施例仅阐释本文公开的发明，但并非限制它。

实施例

实施例1.FPP合成酶和倍半萜合成酶在莱茵衣藻中的产生

在本实施例中，编码来自原鸡(G.gallus)的FPP合成酶(FPPS)的核酸和来自欧洲云杉(P.abies)的红没药烯合成酶(BisabS)的核酸被引入莱茵衣藻。转化DNA被图示在图3中。对于这些实施例，转化DNA被包含在带有大肠杆菌元件(如，复制起点、抗生素抗性标记)的载体中。在这一实例中，编码FPP合成酶的基因(SEQ ID NO.82，表5；SEQ ID NO.135，表6)是图3中标记为“转基因”的片段，并被来自莱茵衣藻psbA基因的5’UTR和启动子序列以及来自莱茵衣藻psbA基因的3’UTR调控；并且标记“选择标记”的片段是来自细菌的编码卡那霉素抗性的基因，其被来自莱茵衣藻atpA基因的5’UTR和启动子序列以及来自莱茵衣藻rbcL基因的3’UTR调控。红没药烯合成酶基因(SEQ ID NO.115，表5；SEQ IDNO.168，表6)是图3中标记“转基因”的片段，并被来自莱茵衣藻psbA基因的5’UTR和启动子序列以及来自莱茵衣藻psbA基因的3’UTR调控；并且标记“选择标记”的片段是来自细菌的编码链霉素抗性的基因，其被来自莱茵衣藻atpA基因的5’UTR和启动子序列以及来自莱茵衣藻rbcL基因的3’UTR调控。FPP合成酶转基因盒(transgene cassette)通过标记为“同源物A”和“同源物B”的片段被靶向到莱茵衣藻的psbA基因座，所述两个片段分别与在psbA基因座的5’和3’两侧的DNA的序列相同。红没药烯合成酶转基因盒通过标记为“同源物C”和“同源物D”的片段被靶向到莱茵衣藻的3HB基因座，所述两个片段分别与在3HB基因座的5’和3’两侧的DNA的序列相同。在构建这一转化DNA中进行的所有DNA操作基本上如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press 1989)和Cohen等，Meth.Enzymol.297，192-208，1998中所述。

对于这些实验，所有的转化都在莱茵衣藻株137c(mt+)上进行。细胞在0.5mM的5-氟脱氧尿苷存在的TAP培养基中(Gorman和Levine，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA54：1665-1669，1965，其在此被引入作为参考)在23℃，450Lux恒定照明且在设置为100rpm的旋转摇床(rotary shaker)上被培养到后对数期(约7天)。50ml的细胞通过在4,000g 23℃离心5分钟被收集。上清液被倒出并且细胞被重悬浮在4ml的TAP培养基中，用于随后的通过粒子轰击的叶绿体转化(Cohen等，上文，1998)。所有的转化都在卡那霉素(100μg/ml)选择下进行，其中抗性通过由图3中标识为“选择标记”的片段编码的基因给予。(衣藻库存中心(Chlamydomonas StockCenter)，杜克大学(Duke University))

PCR被用于识别转化的菌株。对于PCR分析，10⁶个藻类细胞(来自琼脂平板或液态培养物)被悬浮在10mM的EDTA中并被加热到95℃10分钟，随后冷却到约23℃。包含反应缓冲液、MgCl₂、dNTPs、PCR引物对(表4)、DNA聚合酶和水的PCR混合物(cocktail)被制备。在EDTA中的藻类裂解物被加入为反应提供模板。镁浓度被改变，以补偿加入的EDTA中的藻类裂解物的量和浓度。退火温度梯度被采用，以确定针对特定引物对的最优的退火温度。

为了识别包含FPP合成酶基因的菌株，引物对被使用，其中一个引物退火到psbA 5’UTR(SEQ ID NO.55)的一个位点，而另一引物(SEQ ID NO.66)退火到FPP合成酶的编码片段。期望的克隆是产生预期大小的PCR产物的那些。为了识别包含红没药烯合成酶基因的菌株，引物对被使用，其中一个引物退火到psbA的5’UTR(SEQ ID NO.55)而另一引物(SEQ ID NO.73)退火到红没药烯合成酶的编码片段。期望的克隆是在两个反应中都产生预期大小的PCR产物的那些。

为了确定内源psbA基因座被置换到何种程度(异质性(heteroplasmic)对同质性(homoplasmic))，含有两组引物对的PCR反应被采用(在同一反应中)。第一对引物扩增由表达载体靶向的内源基因座，并包含退火到psbA的5’UTR内(SEQ ID NO.57)的一个引物和退火到psbA编码区域的另一引物(SEQ ID NO58)。第二对引物(SEQ ID NOs.59和60)扩增不被表达载体靶向的恒定或对照区域，所以应该在所有情况下产生期望大小的产物。该反应确认了内源基因座中PCR产物的缺失不是源自抑制PCR反应的细胞和/或其它污染物。引物对的浓度被改变，以便两个反应能在相同的试管中进行；但是，用于内源基因座的那一对是恒定对浓度的5倍。使用的循环次数＞30以提高灵敏性。最期望的克隆是产生恒定区域产物，但没有内源基因座产物的那些。期望的产物也是产生相对于对照反应弱强度的内源基因座产物的那些。该PCR的结果显示于图4，图A、B和C。

对96个克隆进行PCR的结果被确定，并且该结果显示于图4。图4A和4B分别显示了使用对FPP合成酶和角鲨烯合成酶基因特异的引物对的PCR结果。可以看出，多个转化的克隆对FPP合成酶和角鲨烯合成酶基因的插入都是阳性的(如，编号1-3)。图4C显示了使用将同质克隆与异质克隆区分开的引物对的PCR结果。可以看出，多个转化的克隆是同质的或异质的，到有利于转基因插入的程度(如，编号1-3)。未编号的克隆显示了野生型基因座的存在，并且因此未被选择用于进一步分析。

为了确定FPP合成酶基因是否引起FPP合成酶在转化的藻类中的表达和红没药烯合成酶基因是否引起红没药烯合成酶在转化的藻类中的表达，两种可溶蛋白被免疫沉淀并通过蛋白质印迹法观察。简单地说，500ml的藻类细胞培养物通过在4,000g，4℃离心15分钟被收集。上清液被倒出并且细胞被重悬浮在10ml的裂解缓冲液中(100mM Tris-HCl，pH＝8.0，300mM NaCl，2％Tween-20)。细胞通过超声降解法(35％的功率，30秒10次)裂解。裂解物通过在14,000g，4℃离心1小时被净化。上清液被去除并与抗-FLAG抗体偶联的琼脂糖树脂在4℃温育10小时。树脂通过重力过滤与裂解物分离，并用清洗缓冲液(100mM Tris-HCl，pH＝8.0，300mM NaCl，2％Tween-20)清洗3次。树脂与加样缓冲液(XT样品缓冲液；Bio-Rad)4∶1混合，样品被加热到95℃1分钟，冷却到23℃，且不溶蛋白通过离心被除去。可溶蛋白通过SDS-PAGE分离，接着被转移到PVDF膜上。膜用TBST+0.5％干燥的脱脂奶粉在23℃封闭(block)30分钟，与抗-FLAG碱性磷酸酶偶合的抗体(1∶2,500稀释于TBST+0.5％干燥的脱脂奶粉)在4℃温育10小时，用TBST润洗3次。蛋白通过化学荧光检测观察。来自多个克隆的结果(图4D)显示了FPP合成酶基因的表达引起FPP合成酶的表达，以及红没药烯合成酶基因的表达引起红没药烯合成酶的表达。

用于表达FPP合成酶和红没药烯合成酶的莱茵衣藻转化体的培养在液态TAP培养基中，在23℃，5,000Lux恒定照明的条件下，在设置为100rpm的旋转摇床上进行，除非另有说明。在收集前，培养物被维持在每毫升1×10⁷个细胞的密度至少48小时。

为了确定藻类叶绿体中产生的红没药烯合成酶是否是功能性酶，从FPP生产倍半萜被检测。简单地说，50ml的藻类细胞培养物通过在4,000g，4℃离心15分钟被收集。上清液被倒出并且细胞被重悬浮在0.5mL反应缓冲液中(25mM HEPES，pH＝7.2，100mM KCl，10mM MnCl₂，10％甘油和5mM DTT)。细胞通过超声降解法(35％的功率，30秒10次)裂解。0.33mg/mL的FPP被加入裂解物中，并且该混合物被转移到玻璃小瓶中。反应用庚烷覆盖并在23℃温育12小时。反应被停止并通过涡旋混合物提取。0.1mL庚烷被去除，并且样品通过气相色谱-质谱(GC-MS)分析。结果显示在图5中。结果显示相对野生型菌株(WT)，倍半萜显著增长(由峰表示)。

实施例2.三萜分子在莱茵衣藻中的生产

在本实施例中，编码来自原鸡(G.gallus)的FPP合成酶的核酸和来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的角鲨烯合成酶(SqS)的核酸被引入莱茵衣藻。转化DNA在图3中图示。在本实例中，标识为“转基因1”的片段是编码FPP合成酶的基因(SEQID NO.82，表5；SEQ ID NO.135，表6)；标识为“转基因2”的片段是编码角鲨烯合成酶的基因(SEQ ID NO.85，表5；SEQ ID NO.138，表6)；标记为“5’UTR”的片段是来自莱茵衣藻的rbcL基因的5’UTR和启动子序列；标记为“3’UTR”的片段包含来自莱茵衣藻的psbA基因的3’UTR，并且标记为“选择标记”的片段是来自细菌的卡那霉素抗性编码基因，其被来自莱茵衣藻atpA基因的5’UTR和启动子序列以及来自莱茵衣藻rbcL基因的3’UTR序列调控。转基因盒通过标记为“5’同源物”和“3’同源物”的片段被靶向到莱茵衣藻的3HB基因座，所述两个片段分别与3HB基因座5’和3’侧的DNA序列一致。在构建这一转化DNA中进行的所有DNA操作基本上如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)和Cohen等，Meth.Enzymol.297，192-208，1998中所述。

对于这些实验，所有的转化都在莱茵衣藻株137c(mt+)上进行。细胞在0.5mM的5-氟脱氧尿苷存在的TAP培养基中(Gorman和Levine，Proc.Natl.Acad.Sci，USA54：1665-1669，1965，其在此被引入作为参考)在23℃，450Lux恒定照明且在设置为100rpm的旋转摇床上被培养到后对数期(约7天)。50ml的细胞通过在4,000g23℃离心5分钟被收集。上清液被倒出并且细胞被重悬浮在4ml的TAP培养基中，用于随后的通过粒子轰击的叶绿体转化(Cohen等，上文，1998)。所有的转化都在卡那霉素(150μg/ml)选择下进行，其中抗性通过由图3中标识为选择标记的片段编码的基因给予。(衣藻库存中心，杜克大学)

PCR被用于识别转化的菌株。对于PCR分析，10⁶个藻类细胞(来自琼脂平板或液态培养物)被悬浮在10mM的EDTA中并被加热到95℃10分钟，随后冷却到约23℃。包含反应缓冲液、MgCl₂、dNTPs、PCR引物对(表4)、DNA聚合酶和水的PCR混合物被制备。在EDTA中的藻类裂解物被加入为反应提供模板。镁浓度被改变，以补偿加入的EDTA中的藻类裂解物的量和浓度。退火温度梯度被采用，以确定针对特定引物对的最优的退火温度。

为了识别包含FPP合成酶基因的菌株，这样的引物对被使用，其中一个引物退火到psbC 5’UTR(SEQ ID NO.64)的一个位点，而另一引物(SEQ ID NO.66)退火到FPP合成酶的编码片段(SEQ ID NO.66)。为了识别包含角鲨烯合成酶基因的菌株，这样的引物对被使用，其中一个引物退火到psbC 5’UTR(SEQ ID NO.64)的一个位点，而另一引物(SEQ ID NO.72)退火到角鲨烯合成酶的编码片段(SEQ ID NO.72)内。期望的克隆是在两个反应中都产生预期大小的PCR产物的那些。为了确定内源基因座被置换到何种程度(异质性对同质性)，含有两组引物对的PCR反应被采用(在同一反应中)。第一对引物扩增由表达载体靶向的内源基因座(SEQ ID NOs.68和69)。第二对引物(SEQ ID NOs.59和60)扩增不被表达载体靶向的恒定或对照区域，所以应该在所有情况下产生期望大小的产物。该反应确认了内源基因座中PCR产物的缺失不是源自抑制PCR反应的细胞和/或其它污染物。引物对的浓度被改变，以便两个反应能在相同的试管中进行；但是，用于内源基因座的那一对是恒定对浓度的5倍。使用的循环次数＞30以提高灵敏性。最期望的克隆是产生恒定区域产物，但没有内源基因座产物的那些。期望的产物也是产生相对于对照反应弱强度的内源基因座产物的那些。

对96个克隆进行PCR的结果被确定，并且该结果显示于图6。图6A和6B分别显示了使用对FPP合成酶和角鲨烯合成酶基因特异的引物对的PCR结果。可以看出，多个转化的克隆对FPP合成酶和角鲨烯合成酶基因的插入都是阳性的(如，编号1-10)。图6C显示了使用将同质克隆与异质克隆区分开的引物对的PCR结果。可以看出，多个转化的克隆是同质的或异质的，到有利于转基因插入的程度(如编号1-10)。未编号的克隆显示了野生型基因座的存在，并且因此未被选择用于进一步分析。

为了确保FPP合成酶和角鲨烯合成酶基因的存在引起FPP合成酶和角鲨烯合成酶的表达，进行了蛋白质印迹法。大约1×10⁸个藻类细胞被从TAP琼脂培养基中收集，并被悬浮在0.5ml裂解缓冲液中(750mM Tris，pH＝8.0，15％蔗糖，100mMβ-巯基乙醇)。细胞通过超声降解法(15％的功率，30秒5次)裂解。裂解物与加样缓冲液(5％SDS，5％β-巯基乙醇，30％蔗糖，溴酚蓝)1∶1混合，并且蛋白通过SDS-PAGE分离，随后被转移到PVDF膜上。膜用TBST+0.5％干燥的脱脂奶粉在23℃封闭30分钟，与抗-FLAG抗体(1∶1,000稀释于TBST+0.5％干燥的脱脂奶粉)在4℃温育10小时，用TBST润洗3次，与辣根连接的抗小鼠抗体(1∶10,000稀释于TBST+0.5％干燥的脱脂奶粉)在23℃温育1小时，用TBST润洗3次。蛋白通过化学荧光检测观察。来自多个克隆的结果(图6D)显示了莱茵衣藻细胞中FPP合成酶基因的表达引起蛋白的产生。角鲨烯合成酶基因的产物的观察被所有样品中存在的未识别蛋白的信号阻碍。

用于内切-β-葡聚糖酶表达的莱茵衣藻转化体的培养在液态TAP培养基中，在23℃，5,000Lux恒定照明的条件下，在设置为100rpm的旋转摇床上进行，除非另有说明。在收集前，培养物被维持在每毫升1×10⁷个细胞的密度至少48小时。

为了确定FPP合成酶和角鲨烯合成酶这两种酶是否在转化的藻类中产生，两种酶被免疫沉淀并通过蛋白质印迹法观察。简单地说，500ml的藻类细胞培养物通过在4,000g，4℃离心15分钟被收集。上清液被倒出并且细胞被重悬浮在10ml的裂解缓冲液中(100mM Tris-HCl，pH＝8.0，300mM NaCl，2％Tween-20)。细胞通过超声降解法(35％的功率，30秒10次)裂解。裂解物通过在14,000g，4℃离心1小时被净化。上清液被去除并与抗-FLAG抗体偶联的琼脂糖树脂在4℃温浴10小时。树脂通过重力过滤与裂解物分离，并用清洗缓冲液(100mM Tris-HCl，pH＝8.0，300mM NaCl，2％Tween-20)清洗3次。多个样品的蛋白质印迹法分析的结果(图6D和6E)显示两种酶确实都被生产。

为了确定FPP合成酶和角鲨烯合成酶是否包含有功能的体内角鲨烯生物合成途径，确定了角鲨烯的积累。简单地说，藻类细胞培养物通过4000g、4℃离心5分钟收集。上清液被倒出，并且剩余的细胞团被重悬浮在10ml的TAP培养基中，并被转移到50ml的离心管中。细胞通过在3,000RPM离心5分钟而再次结团。所有的上清液都被去除并且细胞质量被确定。样品保持在冰上，并且细胞团以0.75mg生物质量：5mL MeOH的比例被重悬浮在冰冷甲醇(MeOH)中。含有30mL MeOH的溶剂空白被保存在冰上的50mL锥形瓶中，以控制滤取(leaching)。细胞团通过用移液器反复吸取被溶解，并且裂解物被保存在冰上以沉淀蛋白。裂解物随后通过在1,000RPM离心5分钟净化。4mL可溶部分被转移到褐色玻璃小瓶中并用8mL庚烷覆盖。裂解物在旋转轮(rotating wheel)上，在23℃被提取过夜。来自每个样品的1.5mL庚烷被冻干到完全干燥，并随后被重悬浮在100μL庚烷中。分析在GC-MS上进行。结果显示于图7。这些分析以每个菌株5个重复样进行。

实施例3.单萜合成酶在莱茵衣藻中的生产

在本实施例中，编码来自绿薄荷(M.spicata)的苧烯合成酶的核酸被引入莱茵衣藻。转化DNA在图3中被图示。在这一实例中，标记为“转基因”的片段是编码苧烯合成酶(SEQ ID NO.74，表5；SEQ ID NO.127，表6)的基因，其被来自莱茵衣藻的psbA基因的5’UTR和启动子序列以及来自莱茵衣藻的psbA基因的3’UTR调控；并且标识为“选择标记”的片段是来自细菌的卡那霉素抗性编码基因，其被来自莱茵衣藻的atpA基因的5’UTR和启动子序列以及来自莱茵衣藻的rbcL基因的3’UTR调控。转基因盒通过标记为“同源物A”和“同源物B”的片段被靶向到莱茵衣藻的psbA基因座，所述两个片段分别与psbA基因座5’和3’侧的DNA序列一致。在构建这一转化DNA中进行的所有DNA操作基本上如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press 1989)和Cohen等，Meth.Enzymol.297，192-208，1998中所述。

对于这些实验，所有的转化都在莱茵衣藻株137c(mt+)上进行。细胞在0.5mM的5-氟脱氧尿苷存在的TAP培养基中(Gorman和Levine，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA54：1665-1669，1965，其在此被引入作为参考)在23℃，450Lux恒定照明且在设置为100rpm的旋转摇床上被培养到后对数期(约7天)。50ml的细胞通过在4,000g23℃离心5分钟被收集。上清液被倒出并且细胞被重悬浮在4ml的TAP培养基中，用于随后的通过粒子轰击的叶绿体转化(Cohen等，上文，1998)。所有的转化都在卡那霉素(100μg/ml)的选择下进行，其中抗性通过由图3中标识为选择标记摄的片段编码的基因给予。(衣藻库存中心，杜克大学)

PCR被用于识别转化的菌株。对于PCR分析，10⁶个藻类细胞(来自琼脂平板或液态培养物)被悬浮在10mM的EDTA中并被加热到95℃10分钟，随后冷却到约23℃。包含反应缓冲液、MgCl₂、dNTPs、PCR引物对(表4)、DNA聚合酶和水的PCR混合物被制备。在EDTA中的藻类裂解物被加入为反应提供模板。镁浓度被改变，以补偿加入的EDTA中的藻类裂解物的量和浓度。退火温度梯度被采用，以确定针对特定引物对的最优的退火温度。

为了识别包含苧烯合成酶基因的菌株，这样的引物对被使用，其中一个引物退火到psbA的5’UTR(SEQ ID NO.55)而另一引物(SEQ ID NO.56)退火到苧烯合成酶的编码片段。期望的克隆是产生预期大小的PCR产物的那些。为了确定内源基因座被置换到何种程度(异质性对同质性)，含有两组引物对的PCR反应被采用(在同一反应中)。第一对引物扩增由表达载体靶向的内源基因座，并包含退火到psbA的5’UTR(SEQ ID NO.57)内的一个引物和退火到psbA编码区域的另一引物(SEQ ID NO.58)。第二对引物(SEQ ID NOs.59和60)扩增不被表达载体靶向的恒定或对照区域，所以应该在所有情况下产生期望大小的产物。该反应确认了内源基因座中PCR产物的缺失不是源自抑制PCR反应的细胞和/或其它污染物。引物对的浓度被改变，以便两个反应能在相同的试管中进行；但是，用于内源基因座的那一对是恒定对浓度的5倍。使用的循环次数＞30以提高灵敏性。最期望的克隆是产生恒定区域产物，但没有内源基因座产物的那些。期望的产物也是产生相对于对照反应弱强度的内源基因座产物的那些。

用于苧烯合成酶表达的莱茵衣藻转化体的培养在液态TAP培养基中，在23℃黑暗中，在设置为100rpm的旋转摇床上进行，除非另有说明。在收集前，培养物被维持在每毫升1×10⁷个细胞的密度至少48小时。

为了确定苧烯合成酶基因是否引起苧烯合成酶在转化的藻类中表达，两种可溶蛋白被免疫沉淀并通过蛋白质印迹法观察。简单地说，500ml的藻类细胞培养物通过在4,000g，4℃离心15分钟被收集。上清液被倒出并且细胞被重悬浮在10ml的裂解缓冲液中(100mM Tris-HCl，pH＝8.0，300mM NaCl，2％Tween-20)。细胞通过超声降解法(35％的功率，30秒10次)裂解。裂解物通过在14,000g，4℃离心1小时被净化。上清液被去除并与抗-FLAG抗体偶联的琼脂糖树脂在4℃温浴10小时。树脂通过重力过滤与裂解物分离，并用清洗缓冲液(100mM Tris-HCl，pH＝8.0，300mM NaCl，2％Tween-20)清洗3次。来自多个样品的蛋白质印迹法分析的记过(图8)显示了苧烯合成酶(LimS)的确被产出。

为了确定藻类叶绿体中产生的苧烯合成酶是否是功能性酶，从GPP生产苧烯被检测。简单地说，50μL苧烯合成酶结合的琼脂糖(上文制备的相同样品)被重悬浮在含有0.33mg/mL GPP的300μL反应缓冲液中(25mM HEPES，pH＝7.2，100mM KCl，10mM MnCl₂，10％甘油和5mM DTT)，并被转移到玻璃小瓶中。反应用庚烷覆盖并在23℃温育12小时。反应被停止并通过振荡混合物提取。0.1mL庚烷被去除并且样品通过GC-MS分析。结果显示于图9。结果显示分离的酶能够在体外将GPP转化为苧烯。

来自细胞粗裂解物的苧烯合成酶也被检测。简单地说，50ml的藻类细胞培养物通过在4,000g，4℃离心15分钟被收集。上清液被倒出并且细胞被重悬浮在0.5mL反应缓冲液中(25mM HEPES，pH＝7.2，100mM KCl，10mM MnCl₂，10％甘油和5mM DTT)。细胞通过超声降解法(35％的功率，30秒10次)裂解。0.33mg/mL的GPP被加入裂解物中，并且该混合物被转移到玻璃小瓶中。反应用庚烷覆盖并在23℃温育12小时。反应被停止并通过振荡混合物提取。0.1mL庚烷被去除并且样品通过GC-MS分析。结果显示于图9。结果显示产生苧烯合成酶的菌株能够在体内产生苧烯。

实施例4.GPP合成酶在莱茵衣藻中的生产

在本实施例中，编码来自拟南芥(A.thaliana)的GPP合成酶(GPPS)的核酸被引入莱茵衣藻。转化DNA在图3中被图示。在这一实例中，标记为“转基因”的片段是编码GPP合成酶(SEQ ID NO.89，表5；SEQ ID NO.142，表6)的基因，其被来自莱茵衣藻的psbA基因的5’UTR和启动子序列以及来自莱茵衣藻的psbA基因的3’UTR调控；并且标识为“选择标记”的片段是来自细菌的卡那霉素抗性编码基因，其被来自莱茵衣藻的atpA基因的5’UTR和启动子序列以及来自莱茵衣藻的rbcL基因的3’UTR调控。转基因盒通过标记为“同源物A”和“同源物B”的片段被靶向到莱茵衣藻的psbA基因座，所述两个片段分别与psbA基因座5’和3’侧的DNA序列一致。在构建这一转化DNA中进行的所有DNA操作基本上如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press 1989)和Cohen等，Meth.Enzymol.297，192-208，1998中所述。

对于这些实验，所有的转化都在莱茵衣藻株137c(mt+)上进行。细胞在0.5mM的5-氟脱氧尿苷存在的TAP培养基中(Gorman和Levine，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA54：1665-1669，1965，其在此被引入作为参考)在23℃，450Lux恒定照明且在设置为100rpm的旋转摇床上被培养到后对数期(约7天)。50ml的细胞通过在4,000g23℃离心5分钟被收集。上清液被倒出并且细胞被重悬浮在4ml的TAP培养基中，用于随后的通过粒子轰击的叶绿体转化(Cohen等，上文，1998)。所有的转化都在卡那霉素(100μg/ml)的选择下进行，其中抗性通过由图3中标识为选择标记摄的片段编码的基因给予。(衣藻库存中心，杜克大学)

PCR被用于识别转化的菌株。对于PCR分析，10⁶个藻类细胞(来自琼脂平板或液态培养物)被悬浮在10mM的EDTA中并被加热到95℃10分钟，随后冷却到约23℃。包含反应缓冲液、MgCl₂、dNTPs、PCR引物对(表4)、DNA聚合酶和水的PCR混合物被制备。在EDTA中的藻类裂解物被加入为反应提供模板。镁浓度被改变，以补偿加入的EDTA中的藻类裂解物的量和浓度。退火温度梯度被采用，以确定针对特定引物对的最优的退火温度。

为了识别包含GPP合成酶基因的菌株，这样的引物对被使用，其中一个引物退火到psbA的5’UTR(SEQ ID NO.55)而另一引物(SEQ ID NO.61)退火到GPP合成酶的编码片段。期望的克隆是产生预期大小的PCR产物的那些。为了确定内源基因座被置换到何种程度(异质性对同质性)，含有两组引物对的PCR反应被采用(在同一反应中)。第一对引物扩增由表达载体靶向的内源基因座，并包含退火到psbA的5’UTR(SEQ ID NO.57)的一个引物和退火到psbA编码区域的另一引物(SEQ ID NO.58)。第二对引物(SEQ ID NOs.59和60)扩增不被表达载体靶向的恒定或对照区域，所以应该在所有情况下产生期望大小的产物。该反应确认了内源基因座中PCR产物的缺失不是源自抑制PCR反应的细胞和/或其它污染物。引物对的浓度被改变，以便两个反应能在相同的试管中进行；但是，用于内源基因座的那一对是恒定对浓度的5倍。使用的循环次数＞30以提高灵敏性。最期望的克隆是产生恒定区域产物，但没有内源基因座产物的那些。期望的产物也是产生相对于对照反应弱强度的内源基因座产物的那些。该PCR的结果显示于图10(A和B)。

为了确保GPP合成酶基因的存在引起GPP合成酶的表达，进行了蛋白质印迹法。约1×10⁸个藻类细胞从TAP琼脂培养基中收集并被悬浮在0.05ml的裂解缓冲液中(Bugbuster；Novagen)。溶液被加热到95℃5分钟并随后被冷却到23℃。裂解物与加样缓冲液(XT样品缓冲液；Bio-Rad)3∶1混合，样品被加热到95℃1分钟，冷却到23℃，且不溶蛋白通过离心被除去。可溶蛋白通过SDS-PAGE分离，接着被转移到PVDF膜上。膜用TBST+0.5％干燥的脱脂奶粉在23℃封闭30分钟，与抗-FLAG抗体(1∶2,500稀释于TBST+0.5％干燥的脱脂奶粉)在4℃温育10小时，用TBST润洗3次，与辣根相连的抗小鼠抗体(1∶5,000稀释于TBST+0.5％干燥的脱脂奶粉)在23℃温育1小时，用TBST润洗3次。蛋白通过化学荧光检测观察。来自多个克隆的结果(图10C)显示了莱茵衣藻细胞中GPP合成酶基因的表达引起蛋白的产生。图10C。

用于GPP合成酶表达的莱茵衣藻转化体的培养在液态TAP培养基中，在23℃，5,000Lux恒定照明的条件下，在设置为100rpm的旋转摇床上进行，除非另有说明。在收集前，培养物被维持在每毫升1×10⁷个细胞的密度至少48小时。

为了确定藻类叶绿体中产生的GPP合成酶是否是功能性酶，从IPP和DMAPP生产苧烯被检测。简单地说，50ml的藻类细胞培养物通过在4,000g，4℃离心15分钟被收集。上清液被倒出并且细胞被重悬浮在0.5mL反应缓冲液中(25mMHEPES，pH＝7.2，100mM KCl，10mM MnCl₂，10％甘油和5mM DTT)。细胞通过超声降解法(35％的功率，30秒10次)裂解。1μg苧烯合成酶(从大肠杆菌制备)与0.33mg/mL IPP及0.33mg/mL DMAPP一起被加入裂解物，并且该混合物被转移到玻璃小瓶中。反应用庚烷覆盖并在23℃温育12小时。反应被停止并通过振荡混合物提取。0.1mL庚烷被除去并且样品由GC-MS分析。

实施例5.FPP合成酶和倍半萜合成酶在莱茵衣藻中的产生

在本实施例中，编码来自原鸡(G.gallus)的FPP合成酶(FPPS)的核酸和来自罗勒(O.basilicum)的姜烯合成酶(ZinS)的核酸被引入莱茵衣藻。转化DNA在图3中被图示。在这一实例中，标记为“转基因1”的片段是编码FPP合成酶(SEQID NO.82，表5；SEQ ID NO.135，表6)的基因，其被来自莱茵衣藻的psbD基因的5’UTR和启动子序列以及来自莱茵衣藻的psbA基因的3’UTR调控，标记为“转基因2”的片段是编码姜烯合成酶(SEQ ID NO.101，表5；SEQ ID NO.154，表6)的基因，其被来自莱茵衣藻的psbD基因的5’UTR和启动子序列以及来自莱茵衣藻的psbA基因的3’UTR调控；并且标识为“选择标记”的片段是来自细菌的卡那霉素抗性编码基因，其被来自莱茵衣藻的atpA基因的5’UTR和启动子序列以及来自莱茵衣藻的rbcL基因的3’UTR调控。转基因盒通过标记为“同源物C”和“同源物D”的片段被靶向到莱茵衣藻的3HB基因座，所述两个片段分别与3HB基因座5’和3’侧的DNA序列一致。在构建这一转化DNA中进行的所有DNA操作基本上如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press 1989)和Cohen等，Meth.Enzymol.297，192-208，1998中所述。

对于这些实验，所有的转化都在莱茵衣藻株137c(mt+)上进行。细胞在0.5mM的5-氟脱氧尿苷存在的TAP培养基中(Gorman和Levine，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA54：1665-1669，1965，其在此被引入作为参考)在23℃，450Lux恒定照明且在设置为100rpm的旋转摇床上被培养到后对数期(约7天)。50ml的细胞通过在4,000g23℃离心5分钟被收集。上清液被倒出并且细胞被重悬浮在4ml的TAP培养基中，用于随后的通过粒子轰击的叶绿体转化(Cohen等，上文，1998)。所有的转化都在卡那霉素(100μg/ml)的选择下进行，其中抗性通过由图3中标识为选择标记摄的片段编码的基因给予。(衣藻库存中心，杜克大学)

PCR被用于识别转化的菌株。对于PCR分析，10⁶个藻类细胞(来自琼脂平板或液态培养物)被悬浮在10mM的EDTA中并被加热到95℃10分钟，随后冷却到约23℃。包含反应缓冲液、MgCl₂、dNTPs、PCR引物对(表4)、DNA聚合酶和水的PCR混合物被制备。在EDTA中的藻类裂解物被加入为反应提供模板。镁浓度被改变，以补偿加入的EDTA中的藻类裂解物的量和浓度。退火温度梯度被采用，以确定针对特定引物对的最优的退火温度。为了识别包含FPP合成酶基因的菌株，这样的引物对被使用，其中一个引物退火到psbD 5’UTR(SEQ ID NO.62)的一个位点，而另一引物(SEQ ID NO.66)退火到FPP合成酶的编码片段(SEQID NO.66)。为了识别包含姜烯合成酶基因的菌株，这样的引物对被使用，其中一个引物退火到psbD 5’UTR(SEQ ID NO.62)的一个位点，而另一引物退火到姜烯合成酶的编码片段(SEQ ID NO.67)。期望的克隆是在两个反应中部产生预期大小的PCR产物的那些。为了确定内源基因座被置换到何种程度(异质性对同质性)，含有两组引物对的PCR反应被采用(在同一反应中)。第一对引物扩增由表达载体靶向的内源基因座(SEQ ID NOs.68和69)。第二对引物(SEQ ID NOs.59和60)扩增不被表达载体靶向的恒定或对照区域，所以应该在所有情况下产生期望大小的产物。该反应确认了内源基因座中PCR产物的缺失不是源自抑制PCR反应的细胞和/或其它污染物。引物对的浓度被改变，以便两个反应能在相同的试管中进行；但是，用于内源基因座的那一对是恒定对浓度的5倍。使用的循环次数＞30以提高灵敏性。最期望的克隆是产生恒定区域产物但没有内源基因座产物的那些。期望的产物也是产生相对于对照反应弱强度的内源基因座产物的那些。

为了确保FPP合成酶和姜烯合成酶基因的存在引起FPP合成酶和姜烯合成酶的表达，进行了蛋白质印迹法。约1×10⁸个藻类细胞从TAP琼脂培养基中收集并被悬浮在0.05ml的裂解缓冲液中(Bugbuster；Novagen)。溶液被加热到95℃5分钟并随后被冷却到23℃。裂解物与加样缓冲液(XT样品缓冲液；Bio-Rad)3∶1混合，样品被加热到95℃1分钟，冷却到23℃，且不溶蛋白通过离心被除去。可溶蛋白通过SDS-PAGE分离，接着被转移到PVDF膜上。膜用TBST+0.5％干燥的脱脂奶粉在23℃封闭30分钟，与抗-FLAG抗体(1∶2,500稀释于TBST+0.5％干燥的脱脂奶粉)在4℃温育10小时，用TBST润洗3次，与辣根偶联的抗小鼠抗体(1∶5,000稀释于TBST+0.5％干燥的脱脂奶粉)在23℃温育1小时，用TBST润洗3次。蛋白通过化学荧光检测观察。来自多个克隆的结果(图11)显示了莱茵衣藻细胞中GPP合成酶基因的表达引起蛋白的产生。

用于表达FPP合成酶和姜烯合成酶的莱茵衣藻转化体的培养在液态TAP培养基中，在23℃，5,000Lux恒定照明的条件下，在设置为100rpm的旋转摇床上进行，除非另有说明。在收集前，培养物被维持在每毫升1×10⁷个细胞的密度至少48小时。

为了确定藻类叶绿体中产生的FPP合成酶和姜烯合成酶是否是功能性酶，从DMAPP和IPP生产倍半萜被检测。简单地说，50ml的藻类细胞培养物通过在4,000g，4℃离心15分钟被收集。上清液被倒出并且细胞被重悬浮在0.5mL反应缓冲液中(25mM HEPES，pH＝7.2，100mM KCl，10mM MnCl₂，10％甘油和5mMDTT)。细胞通过超声降解法(35％的功率，30秒10次)裂解。0.33mg/mL的FPP被加入裂解物中，并且该混合物被转移到玻璃小瓶中。反应用庚烷覆盖并在23℃温育12小时。反应被停止并通过振荡混合物提取。0.1mL庚烷被去除，并且样品通过气相色谱-质谱(GC-MS)分析。

实施例6.FPP合成酶和倍半萜合成酶在莱茵衣藻中的产生

在本实施例中，编码来自原鸡(G.gallus)的FPP合成酶的核酸和来自玉米(Z.mays)的倍半萜合成酶(SesqS)的核酸被引入莱茵衣藻。转化DNA在图3中被图示。在这一实例中，标记为“转基因1”的片段是编码FPP合成酶(SEQ ID NO.82，表5；SEQ ID NO.135，表6)的基因，其被来自莱茵衣藻的psbD基因的5’UTR和启动子序列以及来自莱茵衣藻的psbA基因的3’UTR调控，标记为“转基因2”的片段是编码姜烯合成酶(SEQ ID NO.106，表5；SEQ ID NO.159，表6)的基因，其被来自莱茵衣藻的psbD基因的5’UTR和启动子序列以及来自莱茵衣藻的psbA基因的3’UTR调控；并且标识为“选择标记”的片段是来自细菌的卡那霉素抗性编码基因，其被来自莱茵衣藻的atpA基因的5’UTR和启动子序列以及来自莱茵衣藻的rbcL基因的3’UTR调控。转基因盒通过标记为“同源物C”和“同源物D”的片段被靶向到莱茵衣藻的3HB基因座，所述两个片段分别与3HB基因座5’和3’侧的DNA序列一致。在构建这一转化DNA中进行的所有DNA操作基本上如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press 1989)和Cohen等，Meth.Enzymol.297，192-208，1998中所述。

对于这些实验，所有的转化都在莱茵衣藻株137c(mt+)上进行。细胞在0.5mM的5-氟脱氧尿苷存在的TAP培养基中(Gorman和Levine，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA54：1665-1669，1965，其在此被引入作为参考)在23℃，450Lux恒定照明且在设置为100rpm的旋转摇床上被培养到后对数期(约7天)。50ml的细胞通过在4,000g23℃离心5分钟被收集。上清液被倒出并且细胞被重悬浮在4ml的TAP培养基中，用于随后的通过粒子轰击的叶绿体转化(Cohen等，上文，1998)。所有的转化都在卡那霉素(100μg/ml)的选择下进行，其中抗性通过由图3中标识为选择标记摄的片段编码的基因给予。(衣藻库存中心，杜克大学)

PCR被用于识别转化的菌株。对于PCR分析，10⁶个藻类细胞(来自琼脂平板或液态培养物)被悬浮在10mM的EDTA中并被加热到95℃10分钟，随后冷却到约23℃。包含反应缓冲液、MgCl₂、dNTPs、PCR引物对(表4)、DNA聚合酶和水的PCR混合物被制备。在EDTA中的藻类裂解物被加入为反应提供模板。镁浓度被改变，以补偿加入的EDTA中的藻类裂解物的量和浓度。退火温度梯度被采用，以确定针对特定引物对的最优的退火温度。

为了识别包含FPP合成酶基因的菌株，这样的引物对被使用，其中一个引物退火到psbD 5’UTR(SEQ ID NO.62)的一个位点，而另一引物(SEQ ID NO.66)退火到FPP合成酶的编码片段(SEQ ID NO.66)。为了识别包含倍半萜合成酶基因的菌株，这样的引物对被使用，其中一个引物退火到psbD 5’UTR(SEQ ID NO.62)的一个位点，而另一引物退火到倍半萜合成酶的编码片段(SEQ ID NO.70)。期望的克隆是在两个反应中都产生预期大小的PCR产物的那些。为了确定内源基因座被置换到何种程度(异质性对同质性)，含有两组引物对的PCR反应被采用(在同一反应中)。第一对引物扩增由表达载体靶向的内源基因座(SEQ ID NOs.68和69)。第二对引物(SEQ ID NOs.59和60)扩增不被表达载体靶向的恒定或对照区域，所以应该在所有情况下产生期望大小的产物。该反应确认了内源基因座中PCR产物的缺失不是源自抑制PCR反应的细胞和/或其它污染物。引物对的浓度被改变，以便两个反应能在相同的试管中进行；但是，用于内源基因座的那一对是恒定对浓度的5倍。使用的循环次数＞30以提高灵敏性。最期望的克隆是产生恒定区域产物但没有内源基因座产物的那些。期望的产物也是产生相对于对照反应弱强度的内源基因座产物的那些。

为了确保FPP合成酶和倍半萜合成酶基因的存在引起FPP合成酶和倍半萜合成酶的表达，进行了蛋白质印迹法。约1×10⁸个藻类细胞从TAP琼脂培养基中收集并被悬浮在0.05ml的裂解缓冲液中(Bugbuster；Novagen)。溶液被加热到95℃5分钟并随后被冷却到23℃。裂解物与加样缓冲液(XT样品缓冲液；Bio-Rad)3∶1混合，样品被加热到95℃1分钟，冷却到23℃，且不溶蛋白通过离心被除去。可溶蛋白通过SDS-PAGE分离，接着被转移到PVDF膜上。膜用TBST+0.5％干燥的脱脂奶粉在23℃封闭30分钟，与抗-FLAG抗体(1∶2,500稀释于TBST+0.5％干燥的脱脂奶粉)在4℃温育10小时，用TBST润洗3次，与辣根偶联的抗小鼠抗体(1∶5,000稀释于TBST+0.5％干燥的脱脂奶粉)在23℃温育1小时，用TBST润洗3次。蛋白通过化学荧光检测观察。来自多个克隆的结果(图12)显示了莱茵衣藻细胞中FPP合成酶基因的表达引起蛋白的产生。

用于表达FPP合成酶和倍半萜合成酶的莱茵衣藻转化体的培养在液态TAP培养基中，在23℃，5,000Lux恒定照明的条件下，在设置为100rpm的旋转摇床上进行，除非另有说明。在收集前，培养物被维持在每毫升1×10⁷个细胞的密度至少48小时。

为了确定藻类叶绿体中产生的FPP合成酶和倍半萜合成酶是否是功能性酶，从DMAPP和IPP生产倍半萜被检测。简单地说，50ml的藻类细胞培养物通过在4,000g，4℃离心15分钟被收集。上清液被倒出并且细胞被重悬浮在0.5mL反应缓冲液中(25mM HEPES，pH＝7.2，100mM KCl，10mM MnCl₂，10％甘油和5mMDTT)。细胞通过超声降解法(35％的功率，30秒10次)裂解。0.33mg/mL的FPP被加入裂解物中，并且该混合物被转移到玻璃小瓶中。反应用庚烷覆盖并在23℃温育12小时。反应被停止并通过振荡混合物提取。0.1mL庚烷被去除，并且样品通过气相色谱-质谱(GC-MS)分析。

实施例7.二萜分子在莱茵衣藻中的生产

在本实施例中，莱茵衣藻的菌株被工程化，以表达来自原鸡(G.gallus)的FPP合成酶和来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的角鲨烯合成酶(参见上文所述)。用于表达FPP合成酶和角鲨烯合成酶的莱茵衣藻转化体的培养在液态HSM培养基中，在23℃，5,000Lux恒定照明的条件下，在设置为100rpm的旋转摇床上进行，除非另有说明。

为了确定任何一种酶的表达是否影响产生二萜的代谢途径，叶绿醇的生产被检测。简单地说，800mL藻类细胞培养物通过4000g、4℃离心5分钟收集。上清液被倒出，并且剩余的细胞团被重悬浮在10ml的HSM培养基中，并被转移到50ml的离心管中。细胞通过在3,000RPM离心5分钟而再次结团。所有的上清液都被去除并且细胞质量被确定。样品被保持在23℃，并且细胞团以0.75mg生物物质∶5mLMeOH的比例被重悬浮在MeOH∶KOH(1∶10)中。含有30mL MeOH∶KOH(1∶10)的溶剂空白被保存在冰上的50mL锥形瓶中，以控制滤取(leaching)。细胞团通过反复吸取被溶解。裂解物被加热到55℃30分钟(每间隔10分钟摇动以保证完全混合)。裂解物被冷却到约23℃，并且4mL每种样品被转移到褐色玻璃瓶中并用8mL庚烷覆盖，并在旋转轮上在23℃混合10-12小时。100μL庚烷被收集。分析在GC-MS上进行。结果显示于图13。结果显示了这些酶的表达提高了叶绿醇在莱茵衣藻中的生产。

实施例8.包含大肠杆菌中单萜生物合成途径的酶的生产

在本实施例中，编码来自拟南芥(A.thaliana)的GPP合成酶和来自绿薄荷(M.spicata)的苧烯合成酶的核酸被引入大肠杆菌BL-21细胞。在本实例中，编码GPP合成酶的基因(SEQ ID NO.89，表5；SEQ IDNO.142，表6)和编码苧烯合成酶的基因(SEQ ID NO.74，表5；SEQ ID NO.127，表6)使用NdeI和XhoI位点被分别连接到质粒pET-21a。产生的质粒被转化进入大肠杆菌BL-21细胞。在构建这一转化DNA中进行的所有DNA操作基本上如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)和Cohen等，Meth.Enzymol.297，192-208，1998中所述。

当细胞密度达到OD＝0.6时，合成酶的表达被诱导。细胞在30℃培养5小时并随后被收集。为了确保GPP合成酶和苧烯合成酶基因的存在引起酶的表达，基本上按上文所述进行了蛋白质印迹法。结果(图14；道1：分子量梯度；道2：GPP合成酶；和道3：苧烯合成酶)显示了GPP合成酶和苧烯合成酶蛋白在大肠杆菌细胞中的表达。

为了确定酶是否有功能，检测了由IPP和DMAPP生产苧烯。简单地说，500ml的大肠杆菌细胞培养物通过在4,000g，4℃离心15分钟被收集。上清液被倒出并且细胞被重悬浮在10ml的裂解缓冲液中(100mM Tris-HCl，pH＝8.0，300mM NaCl，2％Tween-20)。细胞通过超声降解法(35％的功率，30秒3次)裂解。裂解物通过在14,000g，4℃离心1小时被净化。上清液被去除并与抗-FLAG抗体偶联的琼脂糖树脂在4℃温浴10小时。树脂通过重力过滤与裂解物分离，并用清洗缓冲液(100mM Tris-HCl，pH＝8.0，300mM NaCl，2％Tween-20)清洗3次。酶用洗脱缓冲液(100mM Tris-HCl，pH＝8.0，300mM NaCl，250μg/mL FLAG肽)被从树脂上洗脱。

反应在反应缓冲液(25mM HEPES，pH＝7.2，100mM KCl，10mM MnCl₂，10％甘油和5mM DTT)中进行，加入或未加入苧烯合成酶和IPP及DMAPP。反应用庚烷覆盖并在23℃温育12小时。反应被停止并通过振荡混合物提取。0.1mL庚烷被去除，并且样品通过气相色谱-质谱(GC-MS)分析。结果显示于图15。在包含从转化的大肠杆菌菌株中分离的苧烯合成酶的反应中产生了一个巨大的峰。

实施例9.用编码融合的抗性标记和目标基因的核酸对莱茵衣藻进行核转化

在本实施例中，编码来自里氏木霉(T.reesei)的木聚糖酶2的核酸被引入莱茵衣藻。转化DNA被图示在图16A中。标记为“转基因”的片段是木聚糖酶2的编码基因；标记为“启动子/5’UTR”的片段是带有内含子的莱茵衣藻C.reinhardtii HSP70/rbcS25’UTR；标记为“选择性标记”的片段是争光霉素抗性基因；标记为CM(可剪切部分)的片段是口蹄疫病毒(FMDV)的A2病毒蛋白酶；并且标记为3’UTR的片段是来自莱茵衣藻rbcS2的3’UTR。争光霉素抗性基因、A2和木聚糖酶2编码区域被物理连接符合读码框，产生嵌合的单一ORF。金属亲和标记(MAT)和FLAG附加表位使用标准技术被加入ORF的3’末端。在构建这一转化DNA中进行的所有DNA操作基本上如Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)和Cohen等，Meth.Enzymol.297，192-208，1998中所述。

对于这些实验，所有转化都在细胞壁缺陷型莱茵衣藻菌株CC3395(精氨酸营养缺陷型变异mt-)上进行。细胞被培养并通过电穿孔被转化。细胞被培养到中对数期(约2-6×10⁶个细胞/ml)。在收集前，Tween-20以0.05％的浓度被加入细胞培养物，以防止细胞粘附于离心管。温和地离心(2000到5000g之间)细胞5分钟。上清液被去除并且细胞被重悬浮在TAP+40mM蔗糖的培养基中。1到2μg转化DNA与～1×10⁸个细胞在冰上混合并被转移到电穿孔小皿中。电穿孔在电容设置为25μF、电压设置为800V以传递2000V/cm的条件下进行以及时间常数为10-14ms。电穿孔后，小皿被放回室温5-20分钟。细胞被转移到10ml的TAP+40mM蔗糖+50μg/ml精氨酸中并在持续摇动的条件下允许其在室温下恢复12-16小时。细胞随后通过在2000g到5000g之间离心被收集，并被重悬浮在0.5ml TAP+40mM蔗糖的培养基中。0.25ml细胞在TAP+100μg/ml争光霉素+50μg/ml精氨酸上被铺板。所有的转化都在争光霉素(100μg/ml)的选择下进行，其中抗性通过由图16A中标识为选择标记的片段编码的基因给予。转化的菌株被保持在争光霉素存在的环境中以防止外源DNA的损失。

在争光霉素存在下生长的克隆通过点印迹法被筛选。简单地说，克隆通过BugBuster蛋白提取试剂(Novagen)被裂解，并且MAT标记的蛋白使用Co²⁺磁性珠(Invitrogen)，依据生产商的说明被分离。暴露于蛋白后，所述珠子用150μl含有0.05％Tween-20的1X Tris缓冲盐溶液(Buffered Saline)(TBST)在室温下润洗三次。蛋白通过150μl的10μM EDTA、25mM Tris-HCl pH 7.0、400mMNaCl从珠子上被洗脱，并且150μl洗脱物被点印迹到硝酸纤维素膜上。膜由起始封闭(TBS)封闭缓冲液(Starting Block(TBS)blocking buffer)(Thermo Scientific)封闭，并用1∶3000稀释于起始封闭缓冲液(Starting Block buffer)中的辣根过氧化物酶偶联的小鼠抗-FLAG抗体(Sigma)探查1小时。探查后，膜用TBST润洗四次，随后用Supersignal West Dura化学发光底物(Thermo Scientific)显影并用CCD相机(Alpha Innotech)拍照。在点印迹法分析中显示阳性结果的克隆随后通过蛋白质印迹法被筛选。

在TAP琼脂平板上生长的藻类细胞的斑点通过将细胞重悬浮在含有还原试剂的50μl 1X SDS加样缓冲液(BioRad)中被裂解。样品随后被煮沸并在10％Bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上电泳，并使用Trans-blot半干燥印迹装置(semi-dryblotter)(BioRad)，根据生产商的说明被转移到PVDF膜上。膜由起始封闭(TBS)封闭缓冲液(Thermo Scientific)封闭，并用1∶3000稀释于起始封闭缓冲液中的辣根过氧化物酶偶联的小鼠抗-FLAG抗体(Sigma)探查1小时。探查后，膜用TBST润洗四次，随后用Supersignal West Dura化学发光底物(Thermo Scientific)显影并用CCD相机(Alpha Innotech)拍照。来自5个克隆(和野生型对照)的结果被显示于图17。阳性克隆显示了一条比野生型背景(Wt bkg)分子量小的条带。少量的完整融合体(争光霉素抗性标记融合到木聚糖酶)被细胞翻译；由于抗性标记形成二聚体，这些产物移动到较高的分子量。该结果表明木聚糖酶2从该菌株中被产生。

为了确定产生的木聚糖酶是否是有功能的，酶活性被检测。细胞斑被50μl的BugBuster蛋白提取试剂(Novagen)匀化，并且EnzCheck Ultra木聚糖酶测试试剂盒(Molecular Probe)被依据生产商的说明，用于检测木聚糖酶活性。

结果显示于图18，并与从莱茵衣藻菌株分离的木聚糖酶比较，所述莱茵衣藻菌株从转化的叶绿体中产生外源的木聚糖酶。

用于质粒构建、转化、克隆选择、蛋白质印迹法和酶分析的相似步骤对表3中所列的每一种酶进行。对于这些酶中的每一种，实验在融合蛋白制备为具有莱茵衣藻碳酸酐酶分泌信号的情况下被重复。

表3.在莱茵衣藻的细胞核中表达的某些酶

酶	来源
		CBH1	绿色木霉
CBHII	里氏木霉
		CBH1	刺银斧鱼
葡聚糖内切酶I	里氏木霉
		葡聚糖内切酶III	里氏木霉
葡聚糖内切酶V	里氏木霉
		葡聚糖内切酶A	黑曲霉
β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶	里氏木霉
		β-葡萄糖苷酶	里氏木霉
β-葡萄糖苷酶	黑曲霉

木聚糖酶2	里氏木霉
		木聚糖酶1	里氏木霉
FPP合成酶	鸡
		角鲨烯去饱和酶	金黄色葡萄球菌

实施例10.用编码抗性标记和目标基因的核酸对莱茵衣藻进行核转化

在本实施例中，编码来自里氏木霉(T.reesei)的葡聚糖内切酶的核酸被引入莱茵衣藻。转化DNA被图示在图16B中。标识为“转基因”的片段是葡聚糖内切酶编码基因；标识为“启动子/5’UTR”的片段是莱茵衣藻HSP70/rbcS25’UTR；标识为“选择性标记”的的片段是潮霉素抗性基因(我们应该包括关于非功能性巴龙霉素(paromomycin)抗性基因么？我想可能不用)，并且标识为3’UTR的片段是来自莱茵衣藻rbcS2的3’UTR。潮霉素抗性基因和葡聚糖内切酶编码区域被分别表达，潮霉素标记被β2-微管蛋白启动子驱动。葡聚糖内切酶编码序列被融合到编码莱茵衣藻碳酸酐酶分泌信号的DNA片段上。金属亲和标记(MAT)和FLAG附加表位使用标准技术被加入ORF的3’末端。在构建这一转化DNA中进行的所有DNA操作基本上如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press 1989)和Cohen等，Meth.Enzymol.297，192-208，1998中所述。

对于这些实验，所有的转化都基本上按上文所述，在细胞壁菌株莱茵衣藻株CC1960(mt+)中进行。所有的转化都在潮霉素(20μg/ml)的选择下进行，其中抗性通过由图16B中标识为选择标记的片段编码的基因给予。转化的菌株被保持在潮霉素存在的环境中。

在潮霉素存在下生长的克隆通过点印迹法被筛选。简单地说，克隆被裂解并且MAT标记的蛋白按上文所述被纯化用于点印迹法。暴露于蛋白后，所述珠子用150μl的1X TBST润洗两次，并用150μl的100mM Tris-HCl pH 7.5、400mMNaCl和20mM咪唑在室温下润洗一次。蛋白通过150μl的10μM EDTA、25mMTris-HCl pH 7.0、400mM NaCl从珠子上被洗脱，并且150μl洗脱物被点印迹到硝酸纤维素膜上。膜按前文所述被封闭并用抗-FLAG抗体探测。

在点印迹法分析中显示阳性结果的克隆随后通过蛋白质印迹法被筛选。来自对数期液态培养基的1×10⁸个细胞在3000g离心5分钟被收集。上清液被倒出并且细胞被重悬浮在1ml的蛋白结合缓冲液(100mM Tris-HCl pH 7.5、400mM NaCl和20mM咪唑)中。细胞在500μl锆珠(1mm，BioSpec Products，Inc.)存在下通过最高速震荡被裂解。裂解物通过在2400g、4℃离心1分钟净化。上清液被去除并用琼脂糖树脂(Invitrogen)在4℃温育1小时。树脂通过在2400g离心与裂解物分离，并用蛋白结合缓冲液(100mM Tris-HCl pH 7.5、400mM NaCl、20mM咪唑)清洗3次。蛋白通过将树脂与100μl洗脱缓冲液(25mM Tris-HCl，pH＝7.5，400mM NaCl，20mM EDTA)温育被洗脱。来自3个克隆中(和野生型对照)结合到树脂上的样品(道1-4)和洗脱后的样品(道5-8)的结果显示于图19。阳性克隆显示了一条在野生型对照中缺少的条带(由箭头表示)。该结果表明葡聚糖内切酶从该菌株中被产生。

实施例11.用编码抗性标记和目标基因的核酸对莱茵衣藻进行核转化

在本实施例中，编码来自棘孢曲霉(A.aculeatus)的编码CBH1的核酸被引入莱茵衣藻。转化DNA被图示在图16B中。标识为“转基因”的片段是葡聚糖外切酶编码基因；标识为“启动子/5’UTR”的片段是莱茵衣藻HSP70/rbcS25’UTR；标识为“选择性标记”的片段是潮霉素抗性基因，并且标识为3’UTR的片段是来自莱茵衣藻rbcS2的3’UTR。潮霉素抗性基因和CBH1编码区域被分别表达，潮霉素标记被β2-微管蛋白启动子驱动。CBH1编码序列被融合到编码莱茵衣藻碳酸酐酶分泌信号的DNA片段上。金属亲和标记(MAT)和FLAG附加表位使用标准技术被加入ORF的3’末端。在构建这一转化DNA中进行的所有DNA操作基本上如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press 1989)和Cohen等，Meth.Enzymol.297，192-208，1998中所述。

对于这些实验，所有的转化都基本上按上文所述，在细胞壁菌株莱茵衣藻株CC1960(mt+)中进行。所有的转化都在潮霉素(20μg/ml)的选择下进行，其中抗性通过由图16B中标识为选择标记的片段编码的基因给予。转化的菌株被保持在潮霉素存在的环境中。

在潮霉素存在下生长的克隆通过下拉测试(pull-down assay)，接着通过蛋白质印迹法分析被筛选。4ml液态培养物在3000g离心5分钟被收集。上清液被倒出并且细胞被重悬浮在1ml的蛋白结合缓冲液(100mM Tris-HCl pH 7.5、400mMNaCl、20mM咪唑、0.005％NP40)中。蛋白纯化和蛋白质印迹法分析按上文所述进行。来自5个克隆中(和野生型对照)结合到树脂上的样品(泳道1-5)和洗脱后的样品(泳道7-11)的结果显示于图20。阳性克隆(7、8、9)显示了一条在野生型对照中缺少的条带(由箭头表示)。该结果表明CBH1从该菌株中被产生。

实施例12.用编码抗性标记和目标基因的核酸对莱茵衣藻进行核转化

在本实施例中，编码来自里氏木霉(T.reesei)的木聚糖酶2的核酸被引入莱茵衣藻。转化DNA被图示在图16A中。标记为“转基因”的片段是木聚糖酶2的编码基因；标记为“启动子/5’UTR”的片段是带有内含子的莱茵衣藻C.reinhardtii HSP70/rbcS25’UTR；标记为“选择性标记”的片段是争光霉素抗性基因；标记为CM(可剪切部分)的片段是口蹄疫病毒(FMDV)的A2病毒蛋白酶；并且标记为3’UTR的片段是来自莱茵衣藻rbcS2的3’UTR。争光霉素抗性基因、A2和木聚糖酶2编码区域被物理连接符合读码框，产生嵌合的单一ORF。编码衣藻碳酸酐酶基因的分泌信号序列的核酸被置于A2序列和木聚糖酶2编码序列5’末端之间。金属亲和标记(MAT)和FLAG附加表位使用标准技术被加入ORF的3’末端。在构建这一转化DNA中进行的所有DNA操作基本上如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)和Cohen等，Meth.Enzymol.297，192-208，1998中所述。

对于这些实验，所有转化都在细胞壁缺陷型莱茵衣藻菌株CC3395(精氨酸营养缺陷型变异mt-)上进行。细胞被培养并通过电穿孔被转化。细胞被培养到中对数期(约2-6×10⁶个细胞/ml)。在收集前，Tween-20以0.05％的浓度被加入细胞培养物，以防止细胞粘附于离心管。温和地离心(2000到5000g之间)细胞5分钟。上清液被去除并且细胞被重悬浮在TAP+40mM蔗糖的培养基中。1到2μg转化DNA与～1×10⁸细胞在冰上混合并被转移到电穿孔小皿中。电穿孔在电容设置为25μF，电压设置为800V以传递2000V/cm的条件下进行，和时间常数为10-14ms。电穿孔后，小皿被放回室温5-20分钟。细胞被转移到10ml的TAP+40mM蔗糖+50μg/ml精氨酸中并在持续摇动的条件下允许其在室温下恢复12-16小时。细胞随后通过在2000g到5000g之间离心被收集，并被重悬浮在0.5ml TAP+40mM蔗糖的培养基中。0.25ml细胞在TAP+100μg/ml争光霉素+50μg/ml精氨酸上被铺板。所有的转化都在争光霉素(100μg/ml)的选择下进行，其中抗性通过由图16A中标识为“选择标记”的片段编码的基因给予。转化的菌株被保持在争光霉素存在的环境中以防止外源DNA的损失。

在争光霉素存在下生长的克隆通过点印迹法被筛选。简单地说，克隆通过BugBuster蛋白提取试剂(Novagen)被裂解，并且MAT标记的蛋白使用Co²⁺磁性珠(Invitrogen)，依据生产商的说明被分离。暴露于蛋白后，所述珠子用150μl含有0.05％Tween-20的1X Tris缓冲盐溶液(TBST)在室温下润洗三次。蛋白通过150μl的10mM EDTA、25mM Tris-HCl pH 7.0、400mM NaCl从珠子上被洗脱，并且150μl洗脱物被点印迹到硝酸纤维素膜上。膜由起始封闭(TBS)的封闭缓冲液(Thermo Scientific)封闭，并用1∶3000稀释于起始封闭缓冲液中的辣根过氧化物酶偶联的小鼠抗-FLAG抗体(Sigma)探查1小时。探查后，膜用TBST润洗四次，随后用Supersignal West Dura化学发光底物(Thermo Scientific)显影并用CCD相机(Alpha Innotech)拍照。在点印迹法分析中显示阳性结果的克隆随后通过蛋白质印迹法被筛选。藻类细胞以50ml的体积被培养，并被小心地离心以避免细胞裂解。钴来源的磁珠(Invitrogen)被加入到条件培养基(conditioned media)中，并根据生产商的说明温育和润洗。蛋白由150μl的10mM EDTA、25mMTris-HCl pH 7.0、400mM NaCl从珠子上被洗脱，并且50μl含有还原试剂的4X SDS加样缓冲液(BioRad)被加入到洗脱物中。样品随后被煮沸并在10％Bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上电泳，并使用Trans-blot半干燥印迹装置(BioRad)，根据生产商的说明被转移到PVDF膜上。膜由起始封闭(TBS)的封闭缓冲液(ThermoScientific)封闭，并用1∶3000稀释于起始封闭缓冲液中的辣根过氧化物酶偶联的小鼠抗-FLAG抗体(Sigma)探查1小时。探查后，膜用TBST润洗四次，随后用Supersignal West Dura化学发光底物(Thermo Scientific)显影并用CCD相机(AlphaInnotech)拍照。

表4.PCR引物

表5.编码示例性类异戊二烯产生酶的核酸

表6.编码示例性类异戊二烯产生酶的核酸(带有限制性酶切位点)

表7.编码用于提高叶绿醇产量的示例性产类异戊二烯酶的核酸

表8.编码用于提高叶绿醇产量的示例性产类异戊二烯酶的核酸(带有限制性酶切位点)

除非另有定义，本文所用的技术和科学术语具有本发明所涉及领域普通技术人员通常理解的意义。本文对本领域普通技术人员公知的各种材料和方法进行了引用。阐述重组DNA技术通用原理的标准参考工作包括Sambrook等，″MolecularCloning：A Laboratory Manual″，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，N.Y.，1989；Kaufman等编，″Handbook of Molecular and Cellular Methodsin Biology and Medicine″，CRC Press，Boca Raton，1995；和McPherson，ed.，″DirectedMutagenesis：A Practical Approach″，IRL Press，Oxford，1991。教导用于本发明所选择方面的酵母遗传的一般技术和原理的标准参考文献包括：Sherman等″Laboratory Course Manual Methods in Yeast Genetics″，old Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986和Guthrie等，″Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology″，Academic，New York，1991。

在数值范围被提供之处，应该理解在该范围上限和下限之间的每个中间数值也是被具体公开。在所述范围中任何所述值或中间值之间的每个较小范围和在所述范围中的任何其它所述值或中间值都被包括。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括或被排除于该范围，并且任一界限、没有一个界限或两个界限都被包含在该更小范围中的每个范围也被包括，其服从于该所述范围中任何具体排除的界限。在所述范围包括界限的一个或两个之处，排除那些被包含界限中任一或两个的范围也被包括。

Claims (163)

1.分离的载体，其包括：(a)核酸，其编码生产带有两个磷酸根的类异戊二烯的酶；和(b)启动子，其被配置用于在无维管光合生物的叶绿体中表达所述核酸，其中所述载体不包含叶绿体的整个基因组。

2.权利要求1所述的载体，其中所述带有两个磷酸根的类异戊二烯是GPP、IPP、FPP、GGPP或DMAPP。

3.权利要求1所述的载体，其中所述载体插入叶绿体基因组不破坏所述叶绿体的光合能力。

4.权利要求1所述的载体，其进一步包含促进与叶绿体基因组同源重组的核酸序列。

5.权利要求1所述的载体，其进一步包含编码第二种酶的核酸，所述第二种酶修饰所述带有两个磷酸根的类异戊二烯。

6.权利要求5所述的载体，其中所述第二种酶是葡萄烃合成酶、苧烯合成酶、桉叶油素合成酶、蒎烯合成酶、莰烯合成酶、桧萜合成酶、月桂烯合成酶、松香二烯合成酶、紫杉二烯合成酶、红没药烯合成酶、diapophytoene去饱和酶、diapophytoene合成酶、单萜合成酶、异松油烯合成酶、姜烯合成酶、罗勒烯合成酶、倍半萜合成酶、姜黄烯合成酶、法尼烯合成酶、忙牛儿基忙牛儿基还原酶、叶绿素酯水解酶、β-石竹烯合成酶、大根香叶烯A合成酶、8-表雪松醇合成酶、朱栾倍半萜合成酶、(+)-δ-杜松烯合成酶、大根香叶烯C合成酶、(E)-β-法尼烯合成酶、蓖麻烯合成酶、vetispiradiene合成酶、5-表-马兜铃烯合成酶、马兜铃烯合成酶、α-葎草烯、(E，E)-α-法尼烯合成酶、(-)-β-蒎烯合成酶、γ-松油烯合成酶、苧烯环化酶、沉香醇合成酶、(+)-冰片二磷酸合成酶、左旋海松二烯合成酶、异海松二烯合成酶、(E)-γ-红没药烯合成酶、柯巴基焦磷酸合成酶、贝壳衫烯合成酶、长叶烯合成酶、γ-葎草烯合成酶、δ-蛇床烯合成酶、β-水芹烯合成酶、异松油烯合成酶、(+)-3-蒈烯合成酶、顺-柯巴基焦磷酸合成酶、α-松油醇合成酶、顺-海松-7，15-二烯合成酶、反-山达海松二烯合成酶、sterner-13-ene合成酶、E-β-罗勒烯、S-沉香醇合成酶、牻牛儿醇合成酶、γ-松油烯合成酶、沉香醇合成酶、E-β-罗勒烯合成酶、表-雪松醇合成酶、α-姜烯合成酶、愈创木二烯合成酶、卡藜二烯合成酶、顺-穆罗拉二烯合成酶、阿菲迪柯林-16b-醇合成酶、伊丽莎白三烯合成酶、檀香醇合成酶、广藿香醇合成酶、zinzanol合成酶、雪松醇合成酶、香紫苏醇合成酶、柯巴醇合成酶或泪柏醇合成酶。

7.权利要求1所述的载体，其中所述载体进一步包含选择性标记。

8.权利要求1所述的载体，其中编码所述酶的核酸对所述叶绿体是密码子偏倚的。

9.权利要求8所述的载体，其中所述叶绿体来自微藻。

10.权利要求9所述的载体，其中所述微藻是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、绿色杜氏藻或杜氏盐藻。

11.权利要求1所述的载体，其包含表5中的任何序列或与其具有至少70％同一性的序列。

12.分离的载体，其包括：(a)编码产生带有两个磷酸根的类异戊二烯的酶的核酸；和(b)编码叶绿体靶向分子的核酸，其用于将所述酶靶向到叶绿体。

13.权利要求12所述的载体，其进一步包含选择性标记、促进与叶绿体基因组同源重组的核酸序列、或它们的组合。

14.权利要求12所述的载体，其中所述带有两个磷酸根的类异戊二烯是GPP、IPP、FPP、GGPP或DMAPP。

15.权利要求12所述的载体，其进一步包含促进与细胞核基因组同源重组的核酸序列。

16.权利要求12所述的载体，其进一步包含编码第二种酶的核酸，所述第二种酶修饰所述带有两个磷酸根的类异戊二烯；和编码叶绿体靶向分子的核酸，其用于将所述第二种酶靶向到叶绿体。

17.权利要求16所述的载体，其中所述第二种酶是葡萄烃合成酶、苧烯合成酶、桉叶油素合成酶、蒎烯合成酶、莰烯合成酶、桧萜合成酶、月桂烯合成酶、松香二烯合成酶、紫杉二烯合成酶、红没药烯合成酶、diapophytoene去饱和酶、diapophytoene合成酶、单萜合成酶、异松油烯合成酶、姜烯合成酶、罗勒烯合成酶、倍半萜合成酶、姜黄烯合成酶、法尼烯合成酶、忙牛儿基忙牛儿基还原酶、叶绿素酯水解酶、β-石竹烯合成酶、大根香叶烯A合成酶、8-表雪松醇合成酶、朱栾倍半萜合成酶、(+)-δ-杜松烯合成酶、大根香叶烯C合成酶、(E)-β-法尼烯合成酶、蓖麻烯合成酶、vetispiradiene合成酶、5-表-马兜铃烯合成酶、马兜铃烯合成酶、α-葎草烯、(E，E)-α-法尼烯合成酶、(-)-β-蒎烯合成酶、γ-松油烯合成酶、苧烯环化酶、沉香醇合成酶、(+)-冰片二磷酸合成酶、左旋海松二烯合成酶、异海松二烯合成酶、(E)-γ-红没药烯合成酶、柯巴基焦磷酸合成酶、贝壳衫烯合成酶、长叶烯合成酶、γ-葎草烯合成酶、δ-蛇床烯合成酶、β-水芹烯合成酶、异松油烯合成酶、(+)-3-蒈烯合成酶、顺-柯巴基焦磷酸合成酶、α-松油醇合成酶、顺-海松-7，15-二烯合成酶、反-山达海松二烯合成酶、sterner-13-ene合成酶、E-β-罗勒烯、S-沉香醇合成酶、牻牛儿醇合成酶、γ-松油烯合成酶、沉香醇合成酶、E-β-罗勒烯合成酶、表-雪松醇合成酶、α-姜烯合成酶、愈创木二烯合成酶、卡藜二烯合成酶、顺-穆罗拉二烯合成酶、阿菲迪柯林-16b-醇合成酶、伊丽莎白三烯合成酶、檀香醇合成酶、广藿香醇合成酶、zinzanol合成酶、雪松醇合成酶、香紫苏醇合成酶、柯巴醇合成酶或泪柏醇合成酶。

18.权利要求12所述的载体，其中编码所述酶的核酸对所述生物是密码子偏倚的。

19.权利要求12所述的载体，其中所述生物是微藻。

20.权利要求19所述的载体，其中所述微藻是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、绿色杜氏藻或杜氏盐藻。

21.权利要求12所述的载体，其包含表5中的任何序列或与其具有至少70％同一性的序列。

22.宿主细胞，其包含：

(a)载体，其含有：(a)核酸，其编码生产带有两个磷酸根的类异戊二烯的酶；和(b)启动子，被配置用于在无维管光合生物的叶绿体中表达所述核酸，其中所述载体不包含叶绿体的整个基因组；或

(b)载体，其含有：(a)编码产生带有两个磷酸根的类异戊二烯的酶的核酸；和(b)编码叶绿体靶向分子的核酸，其用于将所述酶靶向到叶绿体。

23.权利要求22所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞对所述核酸是同质的。

24.权利要求22所述的宿主细胞，其中所述细胞选自由蓝藻门、原绿藻门、红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、tribophyta、灰色藻门、丝足虫门、裸藻门、眼虫藻、定鞭藻门、金藻门、隐藻门、隐滴虫、甲藻门、腰鞭毛虫、定鞭金藻、硅藻门、黄藻门、黄绿藻、针胞藻类、褐藻门和浮游植物组成的组。

25.权利要求22所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、绿色杜氏藻或杜氏盐藻。

26.权利要求22所述的宿主细胞，其中叶绿素水平对所述宿主细胞转化后能光自养是足够的。

27.权利要求22所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞以比相同生物的野生型株更高的水平产生至少一种天然生成的类异戊二烯。

28.宿主细胞，其包含表5中核苷酸序列，或与其具有至少70％同一性的核苷酸序列的至少两个拷贝。

29.权利要求28所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是无维管光合生物。

30.权利要求28所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞对所述核苷酸序列是同质的。

31.权利要求28所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、绿色杜氏藻或杜氏盐藻。

32.基因修饰的叶绿体，其包含权利要求1所述的载体。

33.无维管光合生物，其包含权利要求32所述的叶绿体。

34.产生类异戊二烯的方法，其包含：(a)用核酸转化无维管光合生物的叶绿体，所述核酸编码产生带有两个磷酸根的类异戊二烯的酶；和(b)收集至少一种由所述转化的生物产生的类异戊二烯。

35.权利要求34所述的方法，其进一步包括在水性环境中培养所述生物，其中CO₂被提供给所述生物。

36.权利要求35所述的方法，其中所述CO₂至少部分从燃烧的化石燃料中产生。

37.权利要求35所述的方法，其中所述CO₂至少部分从烟道气中产生。

38.权利要求34所述的方法，其中所述带有两个磷酸根的类异戊二烯是GPP、IPP、FPP、GGPP或DMAPP。

39.权利要求34所述的方法，其中所述收集步骤包括以下步骤的一个或多个：(a)收集所述转化的生物；(b)从细胞培养基中收集所述类异戊二烯；(c)机械破碎所述生物；或(d)化学破碎所述生物。

40.权利要求34所述的方法，其中所述生物是微藻。

41.权利要求37所述的方法，其中所述微藻是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、绿色杜氏藻或杜氏盐藻。

42.用于产生类异戊二烯的方法，其包含：(a)转化无维管光合生物的叶绿体以产生所述类异戊二烯，其中所述生物不是用异戊二烯合成酶或甲基-丁烯醇合成酶转化；和(b)收集所述类异戊二烯。

43.权利要求42所述的方法，其进一步包括在水性环境中培养所述生物，其中CO₂被提供给所述生物。

44.权利要求43所述的方法，其中所述CO₂至少部分从燃烧的化石燃料中产生。

45.权利要求43所述的方法，其中所述CO₂至少部分从烟道气中产生。

46.权利要求42所述的方法，其中所述类异戊二烯是GPP、IPP、FPP、GGPP或DMAPP。

47.权利要求42所述的方法，其中所述叶绿体用核酸转化，所述核酸编码葡萄烃合成酶、苧烯合成酶、桉叶油素合成酶、蒎烯合成酶、莰烯合成酶、桧萜合成酶、月桂烯合成酶、松香二烯合成酶、紫杉二烯合成酶、红没药烯合成酶、diapophytoene去饱和酶、diapophytoene合成酶、单萜合成酶、异松油烯合成酶、姜烯合成酶、罗勒烯合成酶、倍半萜合成酶、姜黄烯合成酶、法尼烯合成酶、忙牛儿基忙牛儿基还原酶、叶绿素酯水解酶、β-石竹烯合成酶、大根香叶烯A合成酶、8-表雪松醇合成酶、朱栾倍半萜合成酶、(+)-δ-杜松烯合成酶、大根香叶烯C合成酶、(E)-β-法尼烯合成酶、蓖麻烯合成酶、vetispiradiene合成酶、5-表-马兜铃烯合成酶、马兜铃烯合成酶、α-葎草烯、(E，E)-α-法尼烯合成酶、(-)-β-蒎烯合成酶、γ-松油烯合成酶、苧烯环化酶、沉香醇合成酶、(+)-冰片二磷酸合成酶、左旋海松二烯合成酶、异海松二烯合成酶、(E)-γ-红没药烯合成酶、柯巴基焦磷酸合成酶、贝壳衫烯合成酶、长叶烯合成酶、γ-葎草烯合成酶、δ-蛇床烯合成酶、β-水芹烯合成酶、异松油烯合成酶、(+)-3-蒈烯合成酶、顺-柯巴基焦磷酸合成酶、α-松油醇合成酶、顺-海松-7，15-二烯合成酶、反-山达海松二烯合成酶、sterner-13-ene合成酶、E-β-罗勒烯、S-沉香醇合成酶、牻牛儿醇合成酶、γ-松油烯合成酶、沉香醇合成酶、E-β-罗勒烯合成酶、表-雪松醇合成酶、α-姜烯合成酶、愈创木二烯合成酶、卡藜二烯合成酶、顺-穆罗拉二烯合成酶、阿菲迪柯林-16b-醇合成酶、伊丽莎白三烯合成酶、檀香醇合成酶、广藿香醇合成酶、zinzanol合成酶、雪松醇合成酶、香紫苏醇合成酶、柯巴醇合成酶或泪柏醇合成酶。

48.权利要求42所述的方法，其中所述收集步骤包括以下步骤的一个或多个：(a)收集所述转化的生物；(b)从细胞培养基中收集所述类异戊二烯；(d)机械破碎所述生物；或(e)化学破碎所述生物。

49.权利要求42所述的方法，其中所述生物是微藻。

50.权利要求49所述的方法，其中所述微藻是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、绿色杜氏藻或杜氏盐藻。

51.包含基因修饰的叶绿体的生物，其中所述叶绿体包含编码类异戊二烯产生酶的核酸，并且其中所述生物能够在高盐环境中生长。

52.权利要求51所述的生物，其中所述生物是无维管光合生物。

53.权利要求51所述的生物，其中所述生物是盐生杜氏藻。

54.权利要求51所述的生物，其中所述高盐环境包含0.5-4.0摩尔的氯化钠。

55.用于制备类异戊二烯的方法，其包含：(a)用核酸转化生物以提高或起始所述类异戊二烯的产生，其中所述生物在高盐环境中生长；和(b)收集所述类异戊二烯。

56.权利要求55所述的方法，其中所述生物是无维管光合生物。

57.权利要求55所述的方法，其中所述生物是盐生杜氏藻、绿色杜氏藻或杜氏盐藻。

58.权利要求55所述的方法，其中所述转化步骤是叶绿体转化。

59.权利要求55所述的方法，其中所述收集步骤包括以下步骤的一个或多个：(a)收集所述转化的生物；(b)从细胞培养基中收集所述类异戊二烯；(c)机械破碎所述生物；或(d)化学破碎所述生物。

60.权利要求55所述的方法，其中所述高盐环境包含0.5-4.0摩尔的氯化钠。

61.载体，其包含：异源核酸，其编码产生一种或多种类异戊二烯的酶；和启动子，其被配置来在光合细菌中表达所述核酸。

62.权利要求61所述的载体，其中所述光合细菌是蓝细菌种。

63.权利要求61所述的载体，其中所述蓝细菌种是选自集胞藻属、聚球藻属或节旋藻属的属的成员。

64.宿主细胞，其包含权利要求61所述的载体。

65.权利要求64所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是蓝细菌种。

66.权利要求66所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自集胞藻属、聚球藻属或节旋藻属的属的成员。

67.宿主细胞，其包含：编码葡萄烃合成酶的第一核酸，和编码FPP合成酶的第二核酸，其中所述宿主细胞是无维管光合生物。

68.权利要求67所述的宿主细胞，其中所述第一核酸和第二核酸被整合入叶绿体基因组。

69.权利要求67所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是微藻。

70.权利要求69所述的宿主细胞，其中所述微藻是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、绿色杜氏藻或杜氏盐藻。

71.载体，其包含：(a)编码蛋白质的第一核酸；(b)编码选择性标记的第二核酸，其中所述第一核酸和第二核酸包含一个开放读码框；和(c)启动子，其被配置来在无维管光合生物中表达所述第一核酸和第二核酸。

72.权利要求71所述的载体，其中所述蛋白质是类异戊二烯产生酶或生物物质降解酶。

73.权利要求72所述的载体，其中所述类异戊二烯产生酶是葡萄烃合成酶、苧烯合成酶、桉叶油素合成酶、蒎烯合成酶、莰烯合成酶、桧萜合成酶、月桂烯合成酶、松香二烯合成酶、紫杉二烯合成酶、FPP合成酶、红没药烯合成酶、diapophytoene去饱和酶、diapophytoene合成酶、GPP合成酶、IPP异构酶、单萜合成酶、异松油烯合成酶、姜烯合成酶、罗勒烯合成酶、倍半萜合成酶、姜黄烯合成酶、法尼烯合成酶、忙牛儿基忙牛儿基还原酶、叶绿素酯水解酶、β-石竹烯合成酶、大根香叶烯A合成酶、8-表雪松醇合成酶、朱栾倍半萜合成酶、(+)-δ-杜松烯合成酶、大根香叶烯C合成酶、(E)-β-法尼烯合成酶、蓖麻烯合成酶、vetispiradiene合成酶、5-表-马兜铃烯合成酶、马兜铃烯合成酶、α-葎草烯、(E，E)-α-法尼烯合成酶、(-)-β-蒎烯合成酶、γ-松油烯合成酶、苧烯环化酶、沉香醇合成酶、(+)-冰片二磷酸合成酶、左旋海松二烯合成酶、异海松二烯合成酶、(E)-γ-红没药烯合成酶、柯巴基焦磷酸合成酶、贝壳衫烯合成酶、长叶烯合成酶、γ-葎草烯合成酶、δ-蛇床烯合成酶、β-水芹烯合成酶、异松油烯合成酶、(+)-3-蒈烯合成酶、顺-柯巴基焦磷酸合成酶、α-松油醇合成酶、顺-海松-7，15-二烯合成酶、反-山达海松二烯合成酶、sterner-13-ene合成酶、E-β-罗勒烯、S-沉香醇合成酶、牻牛儿醇合成酶、γ-松油烯合成酶、沉香醇合成酶、E-β-罗勒烯合成酶、表-雪松醇合成酶、α-姜烯合成酶、愈创木二烯合成酶、卡藜二烯合成酶、顺-穆罗拉二烯合成酶、阿菲迪柯林-16b-醇合成酶、伊丽莎白三烯合成酶、檀香醇合成酶、广藿香醇合成酶、zinzanol合成酶、雪松醇合成酶、香紫苏醇合成酶、柯巴醇合成酶或泪柏醇合成酶。

74.权利要求72所述的载体，其中所述生物物质降解酶是外切-β-葡聚糖酶、内切-β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、内切木聚糖酶或木质酶。

75.权利要求71所述的载体，其中所述第一核酸或第二核酸包含至少一个为在无维管光合生物的细胞核中表达而优化的密码子。

76.权利要求71所述的载体，其进一步包含第三核酸，其编码符合所述第一核酸和第二核酸读码框的剪切部分。

77.权利要求76所述的载体，其中所述剪切部分是自剪切蛋白酶。

78.权利要求77所述的载体，其中所述蛋白酶是来自口蹄疫病毒A2区域的功能部分。

79.权利要求76所述的载体，其中所述剪切部分能够被由所述生物天然产生的蛋白酶剪切。

80.权利要求71所述的载体，其中所述启动子包括HSP70、HSP70的功能部分、rbcS2的5’端上游翻译区域(UTR)、rbcS2的5’UTR的功能部分、或它们的组合。

81.权利要求80所述的载体，其中所述启动子从所述生物衍生。

82.权利要求71或76所述的载体，其进一步包含编码分泌信号的第四核酸。

83.权利要求82所述的载体，其中所述第一核酸、第二核酸和第四核酸都符合读码框。

84.权利要求82所述的载体，其中所述第一核酸、第二核酸、第三核酸和第四核酸都符合读码框。

85.权利要求82所述的载体，其中所述分泌信号是莱茵衣藻碳酸酐酶分泌信号。

86.权利要求71所述的载体，其中所述细胞选自由光合细菌、蓝细菌、蓝藻门、原绿藻门、红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、tribophyta、灰色藻门、丝足虫门、裸藻门、眼虫藻、定鞭藻门、金藻门、隐藻门、隐滴虫、甲藻门、腰鞭毛虫、定鞭金藻、硅藻门、黄藻门、黄绿藻、针胞藻类、褐藻门和浮游植物组成的组。

87.权利要求71所述的载体，其中所述载体能够在莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、绿色杜氏藻或杜氏盐藻中稳定转化。

88.权利要求71所述的载体，其中所述载体能够在集胞藻属、聚球藻属或节旋藻属的细菌中稳定转化。

89.权利要求71所述的载体，其包含表7中的任何序列或与其具有至少70％同一性的序列。

90.权利要求71、76或82中所述的载体，其进一步包含第五核酸，其符合所述第一核酸、第二核酸、第三核酸读码框，和/或编码标记。

91.权利要求90所述的载体，其中所述标记是附加表位或金属亲和标记。

92.宿主细胞，其包含载体，其中所述载体包含：

编码蛋白的第一核酸；

编码选择性标记的第二核酸，其中所述第一核酸和第二核酸包含一个开放读码框；

启动子，其被配置用于在无维管光合生物中表达所述第一核酸和第二核酸；和

任选地一个或多个额外的核酸，其编码剪切部分、分泌信号、标记或其组合，其中所述一个或多个额外的核酸符合所述第一核酸和第二核酸的读码框。

93.权利要求92所述的宿主细胞，其中所述细胞选自由光合细菌、蓝细菌、蓝藻门、原绿藻门、红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、tribophyta、灰色藻门、丝足虫门、裸藻门、眼虫藻、定鞭藻门、金藻门、隐藻门、隐滴虫、甲藻门、腰鞭毛虫、定鞭金藻、硅藻门、黄藻门、黄绿藻、针胞藻类、褐藻门和浮游植物组成的组。

94.权利要求92所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、绿色杜氏藻或杜氏盐藻。

95.权利要求92所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是集胞藻属、聚球藻属和节旋藻属的细菌。

96.权利要求92所述的宿主细胞，其中所述载体被稳定地整合入所述宿主细胞的细胞核基因组。

97.在无维管光合生物中生产蛋白质的方法，其包括：

培养无维管光合生物，其中所述生物包含具有单一开放读码框的外源核酸，其中所述开放读码框包含编码蛋白质的第一核酸和编码选择性标记的第二核酸，并且其中所述生物进一步包含启动子，其被配置来在所述生物中表达所述开放读码框，由此产生所述蛋白质。

98.权利要求97所述的方法，其中所述蛋白质是类异戊二烯产生酶或生物物质降解酶。

99.权利要求97所述的方法，其中所述开放读码框包含至少一个为在无维管光合生物的细胞核中表达而优化的密码子。

100.权利要求97所述的方法，其中所述开放读码框进一步包含第三核酸，其编码符合所述第一核酸和第二核酸的读码框的剪切部分。

101.权利要求100所述的方法，其中所述剪切部分是自剪切蛋白酶。

102.权利要求101所述的方法，其中所述蛋白酶是来自口蹄疫病毒A2区域的功能部分。

103.权利要求100所述的方法，其中所述剪切部分能够被由所述生物天然产生的蛋白酶剪切。

104.权利要求97或100所述的方法，其进一步包含编码分泌信号的第四核酸。

105.权利要求104所述的方法，其中所述第四核酸符合组成所述开放读码框的所有其它核酸的读码框。

106.权利要求104所述的方法，其中所述分泌信号是莱茵衣藻碳酸酐酶分泌信号。

107.权利要求97所述的方法，其中所述生物是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、绿色杜氏藻、杜氏盐藻，集胞藻属、聚球藻属或节旋藻属的细菌。

108.权利要求97、100或104所述的方法，其中所述开放读码框进一步包括编码标记的第五核酸，其中所述第五核酸符合组成所述开放读码框的所有其它核酸的读码框。

109.权利要求108所述的方法，其中所述标记是附加表位或金属亲和标记。

110.包含融合蛋白的宿主细胞，其中所述融合蛋白包含编码蛋白质的第一核酸和编码选择性标记的第二核酸，并且其中所述宿主细胞是无维管光合生物。

111.权利要求110所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、绿色杜氏藻或杜氏盐藻。

112.权利要求110所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是集胞藻属、聚球藻属或节旋藻属的细菌。

113.权利要求110所述的宿主细胞，其中所述载体被稳定地整合入所述宿主细胞的细胞核基因组。

114.权利要求110所述的宿主细胞，其中所述融合蛋白进一步包含可剪切部分、分泌信号、标记或其组合。

115.权利要求110所述的宿主细胞，其中所述可剪切部分是自剪切蛋白酶。

116.权利要求115所述的宿主细胞，其中所述蛋白酶是来自口蹄疫病毒A2区域的功能部分。

117.权利要求110所述的宿主细胞，其中所述可剪切部分能够被由所述生物天然产生的蛋白酶剪切。

118.权利要求110所述的宿主细胞，其中所述分泌信号是莱茵衣藻碳酸酐酶分泌信号。

119.权利要求110所述的宿主细胞，其中所述标记是附加表位或金属亲和标记。

120.生成在选择性条件下表达目标蛋白的转基因无维管光合生物的方法，其包括：

用包含单一开放读码框的核酸转化无维管光合生物，其中所述开放读码框编码包含所述目标蛋白和选择性标记的融合蛋白；

其中所述生物能够在环境条件下表达所述选择性标记，所述环境条件要求选择性标记的表达以维持所述生物的存活，由此导致所述目标蛋白的表达。

121.权利要求120所述的方法，其中所述蛋白是类异戊二烯产生酶或生物物质降解酶。

122.权利要求120所述的方法，其中所述开放读码框进一步包含一个或多个核酸，其编码可剪切部分、分泌信号、标记或其组合。

123.权利要求122所述的方法，其中所述可剪切部分是自剪切蛋白酶。

124.权利要求123所述的方法，其中所述蛋白酶是来自口蹄疫病毒A2区域的功能部分。

125.权利要求122所述的方法，其中所述可剪切部分能够被由所述生物天然产生的蛋白酶剪切。

126.权利要求122所述的方法，其中所述分泌信号是莱茵衣藻碳酸酐酶分泌信号。

127.权利要求122所述的方法，其中所述标记是附加表位或金属亲和标记。

128.提高无维管光合生物中叶绿醇生产的方法，其包括：用核酸转化所述生物，其引起由所述生物产生的叶绿醇产量提高到高于由不含所述核酸的宿主细胞产生的水平。

129.权利要求128所述的方法，其中所述核酸编码选自由GPP合成酶、FPP合成酶、忙牛儿基忙牛儿基还原酶、叶绿素酯水解酶和焦磷酸酶组成的组的酶。

130.权利要求128所述的方法，其中所述转化是叶绿体转化。

131.权利要求129所述的方法，其中所述酶相对于所述生物是内源的，或与所述生物的内源酶是同源的。

132.权利要求131所述的方法，其中所述酶被过量表达。

133.权利要求129所述的方法，其中所述酶对所述生物是外源的。

134.权利要求129所述的方法，其中所述酶的表达通过诱导型启动子调控。

135.权利要求128所述的方法，进一步包含用这样的核酸转化所述生物，该核酸引起二甲基烯丙醇、异戊醇、牻牛儿醇、法尼醇或牻牛儿基牻牛儿醇的产生。

136.权利要求128所述的方法，其中所述生物选自由光合细菌、蓝细菌、蓝藻门、原绿藻门、红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、tribophyta、灰色藻门、丝足虫门、裸藻门、眼虫藻、定鞭藻门、金藻门、隐藻门、隐滴虫、甲藻门、腰鞭毛虫、定鞭金藻、硅藻门、黄藻门、黄绿藻、针胞藻类、褐藻门和浮游植物组成的组。

137.权利要求128所述的方法，其中所述生物是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、绿色杜氏藻或杜氏盐藻。

138.权利要求128所述的方法，其中所述核酸包含表7中的序列或与其具有70％同源性的序列。

139.含有被引入核酸的宿主细胞，其中所述核酸引起由所述宿主细胞产生的叶绿醇产量提高到高于由不含所述核酸的宿主细胞产生的水平，其中所述宿主细胞是无维管光合生物。

140.权利要求139所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够在高盐环境中生长。

141.权利要求140所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是盐生杜氏藻、绿色杜氏藻或杜氏盐藻。

142.权利要求140所述的宿主细胞，其中所述高盐环境包含0.5-4.0摩尔的氯化钠。

143.权利要求139所述的宿主细胞，其中所述核酸存在于叶绿体中。

144.权利要求139所述的宿主细胞，其中所述核酸编码选自由GPP合成酶、FPP合成酶、忙牛儿基忙牛儿基还原酶、叶绿素酯水解酶和焦磷酸酶组成的组的酶。

145.权利要求139所述的宿主细胞，其进一步包含这样的核酸，该核酸引起二甲基烯丙醇、异戊醇、牻牛儿醇、法尼醇或牻牛儿基牻牛儿醇的产生。

146.权利要求139所述的宿主细胞，其中所述细胞选自由光合细菌、蓝细菌、蓝藻门、原绿藻门、红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、tribophyta、灰色藻门、丝足虫门、裸藻门、眼虫藻、定鞭藻门、金藻门、隐藻门、隐滴虫、甲藻门、腰鞭毛虫、定鞭金藻、硅藻门、黄藻门、黄绿藻、针胞藻类、褐藻门和浮游植物组成的组。

147.权利要求139所述的宿主细胞，其中所述细胞是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、绿色杜氏藻或杜氏盐藻。

148.在无维管光合生物中生产叶绿醇的方法，其包括：

用核酸转化所述生物，其引起由所述生物产生的叶绿醇产量提高到高于由不含所述核酸的所述生物产生的水平；和

从所述生物收集所述叶绿醇。

149.权利要求148所述的方法，其中所述核酸编码选自由GPP合成酶、FPP合成酶、忙牛儿基忙牛儿基还原酶、叶绿素酯水解酶和焦磷酸酶组成的组的酶。

150.权利要求148所述的方法，其中所述转化是叶绿体转化。

151.权利要求148所述的方法，其中所述核酸编码相对于所述生物是内源的酶或与所述生物的内源酶是同源的酶。

152.权利要求151所述的方法，其中所述酶被过量表达。

153.权利要求148所述的方法，其中所述核酸编码相对于所述生物是外源的酶。

154.权利要求148所述的方法，其中所述核酸的表达通过诱导型启动子调控。

155.权利要求148所述的方法，进一步包含用这样的核酸转化所述生物，该核酸引起二甲基烯丙醇、异戊醇、牻牛儿醇、法尼醇或牻牛儿基牻牛儿醇的产生。

156.权利要求148所述的方法，其中所述生物选自由光合细菌、蓝细菌、蓝藻门、原绿藻门、红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、tribophyta、灰色藻门、丝足虫门、裸藻门、眼虫藻、定鞭藻门、金藻门、隐藻门、隐滴虫、甲藻门、腰鞭毛虫、定鞭金藻、硅藻门、黄藻门、黄绿藻、针胞藻类、褐藻门和浮游植物组成的组。

157.权利要求148所述的方法，其中所述生物是莱茵衣藻、盐生杜氏藻或雨生红球藻。

158.一种组合物，其包含至少3％的叶绿醇和至少痕量的基因修饰无维管光合生物的细胞部分。

159.权利要求158所述的组合物，其中所述基因修饰生物是通过内源、异源或外源的GPP合成酶、FPP合成酶、忙牛儿基忙牛儿基还原酶、叶绿素酯水解酶或焦磷酸酶修饰的。

160.权利要求158所述的组合物，其中所述生物的叶绿体是被基因修饰的。

161.权利要求158所述的组合物，其进一步包含二甲基烯丙醇、异戊醇、牻牛儿醇、法尼醇或牻牛儿基牻牛儿醇。

162.权利要求158所述的组合物，其中所述生物选自由光合细菌、蓝细菌、蓝藻门、原绿藻门、红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、tribophyta、灰色藻门、丝足虫门、裸藻门、眼虫藻、定鞭藻门、金藻门、隐藻门、隐滴虫、甲藻门、腰鞭毛虫、定鞭金藻、硅藻门、黄藻门、黄绿藻、针胞藻类、褐藻门和浮游植物组成的组。

163.权利要求158所述的组合物，其中所述生物是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、绿色杜氏藻或杜氏盐藻。

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