CN103215315B - 利用蓝藻生产异戊二烯 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用蓝藻生产异戊二烯的方法,包括:(1)在蓝藻中表达来源于蓝桉的异戊二烯合成酶编码基因以及密码子优化的异戊二烯合成酶编码基因;(2)cpc操纵子的启动子在蓝藻中介导萜类化合物合成酶编码基因的表达的应用;(3)增强表达异戊二烯基焦磷酸异构酶编码基因;(4)包含异戊二烯基焦磷酸异构酶和异戊二烯合成酶的融合蛋白;(5)SMUO tag在蓝藻中表达外源蛋白的应用。本发明对蓝藻进行遗传改造,在蓝藻中表达植物来源的异戊二烯合成酶(IspS),通过多种方法显著地提高了基因工程蓝藻生产异戊二烯的产量,并且这些研究结果可以还应用于基因工程蓝藻表达其他外源蛋白,极大地拓展了基因工程蓝藻的应用范围,具有广泛的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域,具体地说,涉及利用蓝藻生产异戊二烯的方法。
背景技术
异戊二烯是重要的大宗基础原料,主要用于合成异戊橡胶,以用于制造轮胎。同时用于生产甲基庚烯酮、薰衣草醇等多种精细化工产品。还用于生产集成电路用的光刻橡胶以及合成润滑油添加剂等。此外,最近的研究表明异戊二烯还可以转化成生物燃料,如航空燃料。
目前,工业上异戊二烯主要用石油基原料生产,即利用溶剂萃取蒸馏法分离炼油副产物中的C5馏分。该制备方法费用高且异戊二烯的纯度低,随着化石资源的日益短缺、石油价格的不断上涨,预计异戊二烯的生产供应将受到限制、成本将进一步提高。还有通过化学合成异戊二烯,如丙酮和乙烯反应,丙烯聚合等,但同样面临着效率低,纯度低,成本高的问题。另一方面,随着世界经济的发展,轮胎的需求量不断的增加,而天然橡胶的的生产由于种植土地有限、病虫害等原因受到限制,导致异戊二烯的需求量呈现快速增长。因此,迫切需要开发出一种高纯度、低成本的异戊二烯制造技术。
异戊二烯是种类繁多的萜类化合物的组成单体。目前发现的异戊二烯的生物合成途径有两条(图1):(1)甲羟戊酸(MVA)途径,以三个乙酰辅酶A分子为原料,形成甲羟戊酸,继而经过焦磷酸化,脱羧化合成异戊二烯基焦磷酸(IPP),再经过异构,形成二甲丙烯基焦磷酸(DMAPP),DMAPP在异戊二烯合成酶(isoprene synthease)的作用下生成异戊二烯。(2)磷酸甲基赤藓糖(MEP)途径,以丙酮酸和三磷酸甘油醛为原料,形成脱氧木酮糖-5-磷酸,还原异构生成甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP),继而经过一系列的反应生成羟甲基丁烯-4-磷酸(HMDPP),再在HMDPP还原酶的作用下同时生成IPP和DMAPP,DMAPP在异戊二烯合成酶的作用下生成异戊二烯。
目前仅有植物来源的异戊二烯合成酶基因(ispS)克隆和鉴定出来,分别来自杨树(Populus alba;Populus tremloides)(Mliter et.al.Planta2001213:483-487;Sasaki et.al.FEBS Letters579(2005)2514-2518)和葛藤(Kudzu)(Sharkey et.al.Plant Physiology137(2005)700-712)。植物在特定环境条件下(如热胁迫等)会释放异戊二烯,但收集植物释放的异戊二烯非常困难,效率低,而且植物生长缓慢,所以远远不能满足需求。
近年来随着代谢工程和合成生物学技术的迅速发展,利用微生物发酵法生产萜类化合物取得重大进展。美国Genencor公司通过遗传改造大肠杆菌BL21(E.coli BL21),获得高产异戊二烯工程菌。具体来说,向大肠杆菌中导入改造后的杨树来源的异戊二烯合成酶(IspS),进而导入外源的MVA途径、并且过表达磷酸葡萄糖酸内酯酶,最后通过发酵条件的优化,使异戊二烯的产量达到60g/L。然而,大肠杆菌发酵法合成异戊二烯,需要消耗大量的葡萄糖和淀粉。
蓝藻等光合微生物能够通过光合作用固定空气中的CO2,在光生物反应器中较快生长。因此通过对蓝藻进行基因工程改造,将CO2直接生物转化为异戊二烯,不仅能够降低底物成本,还可以减少CO2的排放,因而具有重要的现实意义。Melis et.al.首次在聚胞藻(Synechocystis)中成功表达了葛藤来源的异戊二烯合成酶,并检测到异戊二烯的合成,但产量(50μg/L)很低,远远不能满足工业化生产的要求。
发明内容
为了解决现有的异戊二烯的生产方法中存在的产量低、成本高的缺陷,本申请的发明人通过比较蓝桉、杨树、葛藤等不同来源的异戊二烯合成酶,并且对其进行密码子优化后在聚胞藻中表达,进一步通过对异戊二烯合成途径的代谢流量的优化,结果显著地提高了聚胞藻基因工程菌合成异戊二烯的产量。
因此,本发明的目的在于提供多种利用蓝藻生产异戊二烯的方法。
为解决上述的技术问题,本发明采用以下技术方案:
根据本发明的第一个方面,一种利用蓝藻生产异戊二烯的方法,在蓝藻中表达来源于蓝桉的异戊二烯合成酶编码基因。
根据本发明的优选实施例,所述来源于蓝桉的异戊二烯合成酶编码基因具有如SEQ ID NO:50所示的核苷酸序列。
根据本发明的第二个方面,一种密码子优化的异戊二烯合成酶编码基因,所述基因是根据蓝藻的密码子偏好性,在不改变编码的氨基酸序列的基础上,将来源于蓝桉的异戊二烯合成酶编码基因的核苷酸序列经密码子优化获得。
根据本发明的优选实施例,所述基因具有如SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列。
根据本发明的第三个方面,一种利用蓝藻生产异戊二烯的方法,其特征在于,在蓝藻中表达如上所述的密码子优化的异戊二烯合成酶编码基因。
根据本发明的第四个方面,编码藻蓝蛋白的cpc操纵子的启动子的应用,所述启动子在蓝藻中介导萜类化合物合成酶编码基因的表达。
根据本发明的优选实施例,所述萜类化合物合成酶为异戊二烯合成酶。
根据本发明的优选实施例,所述启动子具有如SEQ ID NO:63所示的核苷酸序列。
根据本发明的第五个方面,一种利用蓝藻生产异戊二烯的方法,增强表达异戊二烯基焦磷酸异构酶编码基因。
根据本发明,所述增强表达异戊二烯基焦磷酸异构酶编码基因是通过插入至少一个所述异戊二烯基焦磷酸异构酶编码基因的拷贝至蓝藻中。
根据本发明,所述异戊二烯基焦磷酸异构酶编码基因来源自蓝藻、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌或Haematococcus pluialis。
根据本发明的第六个方面,一种融合蛋白,所述融合蛋白包含异戊二烯基焦磷酸异构酶和异戊二烯合成酶。
根据本发明的优选实施例,所述异戊二烯基焦磷酸异构酶来源自酿酒酵母。
根据本发明,所述异戊二烯合成酶来源自杨树、蓝桉或葛藤。
根据本发明的优选实施例,所述异戊二烯基焦磷酸异构酶位于所述异戊二烯合成酶的N端。
根据本发明的第七个方面,一种利用蓝藻生产异戊二烯的方法,在蓝藻中表达如上所述的融合蛋白。
根据本发明的第八个方面,SMUO tag在蓝藻中表达外源蛋白的应用。
根据本发明的优选实施例,所述SMUO tag位于所述外源蛋白的N端。
根据本发明的优选实施例,所述外源蛋白为异戊二烯合成酶。
本发明的有益效果:
1、通过比较杨树、蓝桉、葛藤等不同来源的异戊二烯合成酶的编码基因ispS,并对其序列进行密码子优化,显著地提高了基因工程蓝藻的异戊二烯产量;
2、筛选到可以高效表达ispS基因的启动子Pcpc,并可应用于在蓝藻中高效表达关键基因;
3、发现异戊二烯基焦磷酸异构酶(IDI)是蓝藻异戊二烯合成途径上的一个限速步骤,通过比较不同来源的异戊二烯基焦磷酸异构酶编码基因、并对其进行过量表达,可以提高基因工程蓝藻的异戊二烯产量;
4、通过构建表达Idi-IspS融合蛋白,发现可以显著提高基因工程蓝藻的异戊二烯合成,可应用于蓝藻合成各种萜类化合物的研究;
5、发现在异戊二烯合成酶的N端添加一些标签,能够增大该酶在蓝藻中的可溶性表达,可应用于在蓝藻中表达难溶蛋白。
本发明对蓝藻进行遗传改造,在蓝藻中表达植物来源的异戊二烯合成酶(IspS),并检测到异戊二烯的生成,继而通过密码子优化、启动子筛选、限速酶筛选、融合蛋白表达和蛋白标签筛选等多种系统的方法研究,显著地提高了基因工程蓝藻生产异戊二烯的产量,并且这些研究结果还可以应用于基因工程蓝藻表达其他外源蛋白,极大地拓展了基因工程蓝藻的应用范围,具有广泛的工业应用前景。
附图说明
图1为异戊二烯的生物合成途径示意图。
图2为pKS2的质粒示意图。
图3为pKS3的质粒示意图。
图4为pKS4的质粒示意图。
图5A为重组菌株ss103、ss005、ss007、ss014和ss026合成异戊二烯的累积产量图。
图5B为重组菌株ss014和ss026的异戊二烯生产产率结果图。
图5C为重组菌株ss014和ss026的生长曲线图。
图6为不同启动子表达k1*ispS重组菌株合成异戊二烯的累积产量图。
图7为蓝藻合成异戊二烯的MEP途径示意图。
图8为重组菌株ss005、ss230和ss234合成异戊二烯的累积产量图。
图9为重组菌株ss217、ss219、ss221和ss223合成异戊二烯的累积产量图。
图10为重组菌株ss005、ss231和ss236合成异戊二烯的累积产量图。
图11A为重组菌株ss005、ss016和ss017合成异戊二烯的累积产量图。
图11B为重组菌株ss016的异戊二烯生产产率结果图。
图11C为重组菌株ss005、ss016和ss017的生长曲线图。
图12A为重组菌株ss016、ss019、ss020、ss021合成异戊二烯的累积产量图。
图12B为重组菌株ss016、ss019、ss020、ss021的生长曲线图。
图13为重组菌株ss016、ss022和ss023合成异戊二烯的累积产量图。
图14为重组菌株ss006、ss024、ss025、ss029合成异戊二烯的累积产量图。
具体实施方式
以下通过具体实施例,对本发明做进一步详细说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本发明涉及异戊二烯合成途径在蓝藻中的构建、优化及其应用。具体而言,通过对蓝藻进行遗传改造,在蓝藻中表达植物来源的异戊二烯合成酶(IspS),并检测到异戊二烯的生成;通过比较杨树、蓝桉、葛藤等不同来源的异戊二烯合成酶的编码基因ispS,并对其序列进行密码子优化,显著地提高了基因工程蓝藻的异戊二烯产量;利用不同的启动子表达异戊二烯合成酶的编码基因ispS,筛选到可以高效表达ispS基因的启动子Pcpc,并可应用于在蓝藻中高效表达关键基因;发现异戊二烯基焦磷酸异构酶(IDI)是蓝藻异戊二烯合成途径上的一个限速步骤,通过比较不同来源的异戊二烯基焦磷酸异构酶编码基因、并对其进行过量表达,可以提高基因工程蓝藻的异戊二烯产量;通过构建表达Idi-IspS融合蛋白,发现可以显著提高基因工程蓝藻的异戊二烯合成,研究了具有不同Linker(连接肽)的融合蛋白对异戊二烯合成的影响,可应用于蓝藻合成各种萜类化合物的研究;发现在异戊二烯合成酶的N端添加一些标签,能够增大该酶在蓝藻中的可溶性表达,可应用于在蓝藻中表达难溶蛋白。
本发明中所用的菌株和生长条件如下:
克隆宿主大肠杆菌DH5α和蛋白表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)购自Novagen公司。所有的大肠杆菌在含有相应的抗性LB培养基中,37℃培养。
聚胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803由日本国立环境研究所微生物菌种保藏中心(NIES Microbial Culture Collection)提供。聚胞藻PCC6803在BG11液体培养基中培养。固体培养基在BG11液体培养基中添加1.5%的琼脂和0.15%的硫代硫酸钠。发酵培养基在BG11液体培养基中添加0.1mol/L的碳酸氢钠,调节pH至7.5,过滤除菌。培养条件:30℃,光强2000~3500lux。对于转化后的重组菌添加20μg/ml的相应的抗生素;
其中,所述BG11液体培养基的组成如下:NaNO31.5g/L、MgSO4·7H2O0.075g/L、CaCl2·2H2O0.036g/L、HEPES(20mM)4.76g/L、Stcok11mL、Stock2(Trace metal mixA5)1mL、Stock31mL;
Stock1:柠檬酸·H2O6.567g/L、柠檬酸铁铵6g/L、EDTANa·2H2O1.107g/L;
Stock2:H3BO32.86g/L、MnSO4·H2O1.545g/L、ZnSO4·7H2O0.222g/L、CuSO4·5H2O0.079g/L、Na2MoO4·2H2O0.391g/L、CoCl2·6H2O0.0404g/L;
Stock3:K2HPO4·3H2O52g/L、Na2CO320g/L。
本发明中所用的质粒信息如下:
所有质粒均为pBluescript KS+(购自Stratagene公司)衍生质粒,用于通过同源重组整合到聚胞藻PCC6803基因组中表达目的基因。
本发明中所用的引物信息如表1所示。
表1、引物信息
本发明中聚胞藻PCC6803转化和传代的方法如下:
野生型(WT)的聚胞藻PCC6803在液体BG11培养基中生长2~3天,细胞浓度约为6×107细胞/mL(OD730=0.6),离心收集细胞,再用BG11培养基重悬,使细胞密度到达109细胞/mL。每100μl的细胞加入1μg的质粒,混匀,暗培养12h,再光照1h,最后涂布到含有相应抗生素的BG11固体平板上,培养5~6天,即可看到单克隆长出。挑单克隆进行液体培养,鉴定重组子。将正确插入的重组菌在含有相应抗生素的液体培养基中传代,3~4代后即可得到完全插入基因组上相应位点的重组菌。
本发明中检测异戊二烯的合成的方法如下:
将纯的重组菌接种到含有100mL发酵培养基的300mL的盐水瓶中封闭培养。每天从盐水瓶内培养基的上方气体中取100μL的气体,进行GC检测。GC7900购自上海天美公司,使用毛细管柱(TM-PLOT Q:30m*0.53mm*40μm)和光离子化检测器(PID)。GC条件:进样口150℃,柱温150℃,检测器150℃。检测不同浓度梯度的异戊二烯标准品(购自Sigma公司),绘制标准曲线。根据标准曲线,计算出重组菌合成异戊二烯的产量和产率。绘制Time-course曲线。
实施例1、整合聚胞藻基因组的表达载体的构建
1.1、质粒pKS2的构建
质粒pKS2为插入在聚胞藻PCC6803基因组中的glgX(slr0237)位点的同源重组载体。以聚胞藻PCC6803基因组为模板,引物对P5与P6扩增上游同源臂glgX-up序列(glgXup),引物对P7与P8扩增下游同源臂psbA2-down序列(glgXdn),依次装载入pBluescript KS+质粒上,再引入壮观霉素标记(Spe),同时引入聚胞藻PCC6803内源的编码psbA2的启动子(PpsbA2)和大肠杆菌的trrnB终止子序列(trrnB),得到表达目的基因的同源重组载体pKS2(SEQ ID NO:47),其质粒示意图如图2所示。
1.2、质粒pKS3的构建
将pKS2中编码psbA2的启动子替换为编码cpc操纵子的的启动子序列(Pcpc),则得到表达目的基因的同源重组载体pKS3(SEQ ID NO:48),其质粒示意图如图3所示。
1.3、质粒pKS4的构建
质粒pKS4为插入在聚胞藻PCC6803基因组中的phb(slr1993-slr1994位点之间)位点的同源重组载体。以聚胞藻PCC6803基因组基因组为模板,引物对P9与P10扩增上游同源臂phb-up序列(phbup),引物对P11与P12扩增下游同源臂phb-down序列(phbdn),依次装载入pBluescript KS+质粒上,再引入氯霉素标记(Cm),同时引入聚胞藻PCC6803内源的编码psbA2的启动子(PpsbA2)和大肠杆菌的trrnB终止子序列(trrnB),得到表达目的基因的同源重组载体pKS4(SEQ ID NO:49),其质粒示意图如图4所示。
实施例2、密码子优化
来源于蓝桉(Eucalyptus globulus)的异戊二烯合成酶编码基因e1ispS,原始DNA序列来自GenBank数据库(GenBank:AB266390.1),序列如SEQ ID NO:50所示。来源于杨树(Populus alba)的异戊二烯合成酶编码基因p1ispS,原始DNA序列来自GenBank数据库(GeneBank:AB198180),序列如SEQ ID NO:51所示。来源于Populusalba x Populus tremula的异戊二烯合成酶p2ispS,原始序列来自GenBanK数据库(GenBank:AJ294819.1),序列如SEQ ID NO:52所示。其中,e1ispS、p1ispS和p2ispS序列均不含有信号肽,而p2fulllength(SEQ ID NO:53)是含有信号肽的全长序列。由南京金斯瑞公司合成上述DNA序列。
通过使用DNA2.0公司的GeneDesigner软件,根据聚胞藻PCC6803的密码子偏好性(其密码子使用表来自Kazusa Codon Usage Database),对e1ispS、p1ispS分别进行密码子优化,优化后的序列分别命名为e1*ispS(SEQ ID NO:54)、p1*ispS(SEQID NO:55)。由DNA2.0公司合成上述序列。
将来源于葛藤(Pueraria montana)的异戊二烯合成酶编码基因(GenBank:AY316691.1)经密码子优化,优化后的序列命名为k1*ispS(SEQ ID NO:56)。由南京金斯瑞公司合成上述DNA序列。在pKS3质粒的Pcpc启动子的下游的NdeI和PstI酶切位点之间分别插入e1ispS、p1ispS、p2ispS、p2fulllength ispS、e1*ispS、p1*ispS、k1*ispS,形成质粒pPcpce1ispS、pPcpcp1ispS、pPcpcp2ispS、pPcpc p2fulllength ispS、pPcpce1*ispS、pPcpcp1*ispS、pPcpck1*ispS。将上述质粒分别转化入聚胞藻PCC6803中,筛选阳性重组菌株,如表2所示。
表2、表达不同来源的ispS的重组菌株
重组菌株 | 特征 |
ss103 | ΔglgX::Pcpck1*ispS |
ss005 | ΔglgX::Pcpcp1ispS |
ss007 | ΔglgX::Pcpcp2ispS |
ss014 | ΔglgX::Pcpce1ispS |
ss026 | ΔglgX::Pcpce1*ispS |
将筛选获得的阳性重组菌株发酵并检测异戊二烯产量,结果如图5A、5B和5C所示,发酵第9天时,表达e1IspS的重组菌累积产量为398μg/L,而表达e1*IspS的重组菌累积产量达到1124μg/L,最大产率为227μg/L/d。经过对来源于蓝桉的ispS基因的密码子优化,使异戊二烯的产量提高了3倍。
本实施例通过对聚胞藻PCC6803进行遗传操作,成功地在蓝藻中表达了IspS,检测到异戊二烯的生成,并发现通过对ispS基因进行密码子优化,可以显著提高蓝藻合成异戊二烯的产量。
实施例3、启动子筛选
以聚胞藻PCC6803基因组为模板,克隆以下启动子:引物对P37和P38克隆psbA的启动子PpsbA2(SEQ ID NO:57)、引物对P41和P42克隆rbc operon启动子Prbc(SEQ ID NO:58)、引物对P43和P44克隆groESL operon 启动子PgroESL(SEQID NO:59)、引物对P45和P46克隆Ni2+诱导的启动子PnrsB(SEQ ID NO:60)、引物对P47和P48克隆ftsQ operon启动子PftsQ(SEQ ID NO:61)。以质粒pTrcHis(购自Invitrogen公司)为模板,引物对P49和P50克隆启动子Ptrc(SEQ ID NO:62)。
将上述启动子分别用于替换实施例2中的pPcpck1*ispS质粒中的由引物对P39和P40扩增的Pcpc启动子(SEQ ID NO:63),得到使用不同启动子表达k1*ispS的质粒。将上述质粒分别转化入聚胞藻PCC6803中,筛选阳性重组菌株,如表3所示。
表3、在不同的启动子条件下表达k1*ispS的重组菌株
将筛选获得的阳性重组菌株发酵并检测异戊二烯产量,结果如图6所示,发酵第11天时,SS103使用Pcpc启动表达k1*IspS时,异戊二烯的累积产量高达324μg/L,是SS101和SS104累积产量的12倍,而其他启动子表达强度与PpsbA2相同,或更弱。说明在所有的启动子中,Pcpc可以高效地介导ispS的表达。
本实施例通过启动子的挖掘,筛选获得聚胞藻PCC6803中高效表达目的基因的启动子Pcpc,可应用于在蓝藻中表达关键基因,为蓝藻合成生物提供重要的启动子元件。
实施例4、限速酶筛选
蓝藻合成异戊二烯的MEP途径如图7所示,其中包含编码脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶的dxs基因以及编码异戊二烯基焦磷酸异构酶的idi基因。
4.1、构建过表达dxs、idi和idi的重组菌株
以聚胞藻PCC6803基因组为模板,引物对P13与P14扩增聚胞藻PCC6803内源的dxsSS(SEQ ID NO:64),引物对P15与P16扩增聚胞藻PCC6803内源的idiSS(SEQID NO:65)。将dxsSS和idiSS依次连接到载体pKS4上,得到质粒ppsbA2dxsSSidiSS。仅将idiSS连接到载体pKS4上,得到质粒ppsbA2idiSS。
将质粒ppsbA2dxsSSidiSS和ppsbA2idiSS分别转化SS005(ΔglgX::Pcpcp1ispS),筛选阳性重组菌株,如表4所示。
表4、过表达dxs、idi和idi的重组菌株
重组菌株 | 特征 |
ss005 | ΔglgX::Pcpcp1ispS |
ss230 | ΔglgX::Pcpcp1ispSΔphb::PpsbA2idiSS |
ss234 | ΔglgX::Pcpcp1ispSΔphb::PpsbA2dxsSSidiSS |
将筛选获得的阳性重组菌株发酵并检测异戊二烯产量,结果如图8所示,发酵第10天,同时过表达dxsSS和idiSS两个基因的重组菌SS234累积产量达到2666μg/L,是未表达上游MEP途径的重组菌SS005的2.6倍,而SS234的产量与单独过表达idiSS的重组菌SS230几乎相同。以上结果说明idi编码的异戊二烯基焦磷酸异构酶是蓝藻合成异戊二烯的一个重要的限速酶。
4.2、构建过表达不同来源的idi的重组菌株
以实施例3中所述启动子Ptrc替换质粒pKS4中的启动子PpsbA2,得到质粒pKSTrc。引物对P13与P14扩增聚胞藻PCC6803内源的dxsSS(SEQ ID NO:64),装入载体pKSTrc,得到载体PtrcdxsSS。
以聚胞藻PCC6803基因组为模板,引物对P15与P16扩增聚胞藻PCC6803内源的idi(idiSS)(SEQ ID NO:65)。以酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)S288C(来源自ATCC)的基因组为模板,引物对P17与P18扩增酵母来源的idi(idiSC)(SEQID NO:66)。以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168(来源自ATCC)的基因组为模板,引物对P19与P20扩增芽孢杆菌来源的idi(idiBS)(SEQ ID NO:67)。由南京金斯瑞公司合成Haematococcus pluialis Flotow NIES-144(来源自日本国立环境研究所(National Institute for Environmental Studies,NIES))来源的的idi(idiHP)(SEQID NO:68)。将上述4种不同来源的idi分别装入PtrcdxsSS,得到质粒PtrcdxsSSidiSS、PtrcdxsSSidiSC、PtrcdxsSSidiBS、PtrcdxsSSidiHP。
将上述质粒分别转化SS103(ΔglgX::Pcpck1*ispS),筛选阳性重组菌株,如表5所示。
表5、过表达不同来源的idi的重组菌
重组菌株 | 特征 |
ss217 | ΔglgX::Pcpck1*ispSΔphb::PtrcdxsSS idiSS |
ss219 | ΔglgX::Pcpck1*ispSΔphb::PtrcdxsSS idiSC |
ss221 | ΔglgX::Pcpck1*ispSΔphb::PtrcdxsSS idiBS |
ss223 | ΔglgX::Pcpck1*ispSΔphb::PtrcdxsSS idiHP |
将筛选获得的阳性重组菌株发酵并检测异戊二烯产量,结果如图9所示,发酵第8天时,与过表达蓝藻内源的idiSS相比,过表达酿酒酵母来源的idiSC的重组菌SS219的异戊二烯的累积产量最高,而过表达其他来源的idi的重组菌,合成异戊二烯的累积产量没有明显差别。以上结果说明酿酒酵母来源的idi在蓝藻中的表达活性最高。
4.3、构建过表达酿酒酵母来源的idiSC重组菌株
以酿酒酵母的基因组为模板,引物对P17与P18扩增酵母来源的idi(idiSC)(SEQID NO:66),装入载体pKS4,得到载体PpsbA2idiSC,转化SS005(ΔglgX::Pcpcp1ispS),得到重组菌SS231。
以聚胞藻PCC6803基因组为模板,引物对P13与P14扩增聚胞藻PCC6803内源的dxsSS(SEQ ID NO:64),以酿酒酵母的基因组为模板,引物对P17与P18扩增酵母来源的idi(idiSC)(SEQ ID NO:66),依次装入pKS4,得到载体PpsbA2dxsSSidiSC,转化SS005(ΔglgX::Pcpcp1ispS),得到重组菌SS236。
以上重组菌株信息如表6所示。
表6、过表达酿酒酵母来源的idiSC的重组菌株
重组菌株 | 特征 |
ss005 | ΔglgX::Pcpcp1ispS |
ss231 | ΔglgX::Pcpcp1ispSΔphb::PpsbA2idiSC |
ss236 | ΔglgX::Pcpcp1ispSΔphb::PpsbA2dxsSS idiSC |
将筛选获得的阳性重组菌株发酵并检测异戊二烯产量,结果如图10所示,发酵第10天时,和对照组SS005相比,SS231和SS236的产量相似,都达到3263μg/L,是SS005的3.3倍。以上结果进一步说明了idi编码的异戊二烯基焦磷酸异构酶是蓝藻合成异戊二烯的一个重要的限速酶。
综上所述,本实施例研究了蓝藻MEP途径,发现idi编码的异戊二烯基焦磷酸异构酶是蓝藻合成异戊二烯的一个重要的限速酶,并通过过表达不同来源的idi,发掘出在蓝藻中表达活性最好的idi是来自酿酒酵母,为提高蓝藻MEP途径的代谢流量提供实验依据,可应用于提高蓝藻中合成其他重要萜类化合物的产量。
实施例5、在聚胞藻PCC6803中表达Idi与IspS的融合蛋白
5.1、构建表达IdiSC与p1IspS的融合蛋白
以酿酒酵母的基因组为模板,引物对P21与P22扩增idiSC基因。以质粒pPcpcp1ispS为模板,引物对P23与P24扩增p1ispS基因。以上述两个纯化的PCR产物的混合物为模板,引物对P21与P24扩增得到idi-GGGS-p1ispS融合PCR片段(GGGS为Idi蛋白和IspS蛋白之间的连接肽序列,是短的柔性linker),装入pKS2,得到质粒pPcpcidi-GGGS-p1ispS,转化聚胞藻PCC6803,得到重组菌SS016。
改变Idi和IspS的连接顺序,可得到p1ispS-GGGS-idi的融合PCR片段,装入pKS2,得到质粒pPcpcp1ispS-GGGS-idi,转化聚胞藻PCC6803,得到重组菌SS017。
以酿酒酵母的基因组为模板,引物对P25与P26扩增idiSC基因。以质粒pPcpcp1ispS为模板,引物对P27与P28扩增p1ispS基因,将idiSC、p1ispS依次装入pKS2,得到质粒pPcpcidiSCp1ispS(非融合蛋白,idi、p1ispS有各自的rbs序列),转化聚胞藻PCC6803,得到重组菌SS018。
以上重组菌株信息如表7所示。
表7、在聚胞藻PCC6803表达Idi-IspS融合蛋白的重组菌株
重组菌株 | 特征 |
ss016 | ΔglgX::Pcpcidi-GGGS-p1ispS |
ss017 | ΔglgX::Pcpcp1ispS-GGGS-idi |
ss018 | ΔglgX::Pcpcidi p1ispS |
将筛选获得的阳性重组菌株发酵并检测异戊二烯产量,结果如图11A、11B和11C所示,发酵第9天时,表达Idi-p1IspS融合蛋白的重组菌SS016累计产量高达6.01mg/L,并且从第3天到第6天,SS016合成异戊二烯的产率达到1.2mg/L~1.4mg/L。但是表达p1IspS-Idi融合蛋白的重组菌SS017的产量只达到2.0mg/L,说明Idi在融合蛋白的N端效果更好。证实在蓝藻中表达Idi-p1IspS的融合蛋白的重组菌可以有效的提高异戊二烯的产量,而且融合蛋白的顺序很关键。
5.2、构建不同的Linker(连接肽的氨基酸序列)表达IdiSC与p1IspS的融合蛋白
改变IdiSC-p1IspS的连接序列,选用以下连接肽连接融合蛋白:Linker1:GSGGGGS(长的柔性linker);Linker2:GSGEAAAK(短的刚性linker);Linker3:GSG(EAAAK)2(长的刚性Linker)。将上述不同连接肽连接的IdiSC-p1IspS融合蛋白连接到pKS2,得到的载体分别转化聚胞藻PCC6803,得到重组菌S019、SS020、SS021,如表8所示。
表8、在聚胞藻PCC6803中表达不同连接肽连接的Idi-IspS融合蛋白的重组菌株
重组菌株 | 特征 |
ss016 | ΔglgX::Pcpcidi-GGGS-p1ispS |
ss019 | ΔglgX::Pcpcidi-GSGGGGS-p1ispS |
ss020 | ΔglgX::Pcpcidi-GSGEAAAK-p1ispS |
ss021 | ΔglgX::Pcpcidi-GSG(EAAAK)2-p1ispS |
将筛选获得的阳性重组菌株发酵并检测异戊二烯产量,结果如图12A和12B所示,发酵第12天时,SS016、SS019、SS020、SS021产量几乎相同,说明Linker的长度和柔性对IdiSC-p1IspS融合蛋白的表达和合成异戊二烯的产量几乎没有影响。
5.3、构建表达IdiSC与p2IspS或e1IspS的融合蛋白
以同样的方式构建IdiSC与p2IspS的融合PCR片段,和IdiSC与e1IspS的融合PCR片段,Linker序列为:GGGS。连接到pKS2,得到的载体分别转化聚胞藻PCC6803,得到重组菌SS02、SS023,如表9所示。
表9、在聚胞藻PCC6803中表达Idi-p2IspS以及Idi-e1IspS融合蛋白的重组菌株
重组菌株 | 特征 |
ss022 | ΔglgX::Pcpcidi-GGGS-p2ispS |
ss023 | ΔglgX::Pcpcidi-GGGS-e1ispS |
将筛选获得的阳性重组菌株发酵并检测异戊二烯产量,结果如图13所示,表达不同来源的IspS的融合蛋白同样可以有效的提高异戊二烯的产量,说明Idi-IspS构建的融合蛋白适用于不同物种来源的IspS,具有普遍意义。
综上所述,本实施例发现在蓝藻中表达Idi-p1IspS的融合蛋白的重组菌可以有效的提高异戊二烯的产量,而且融合蛋白的顺序很关键,但融合蛋白的连接肽序列和IspS的来源对于蓝藻生产异戊二烯的产量无显著影响。
实施例6、蛋白标签优化
以质粒ChampionTMpET SUMO vector(购自life technologies公司)为模板,引物对P29与P30扩增SUMO tag(SEQ ID NO:69)。以质粒pPcpcp2fulllength ispS为模板,引物对P33与P34扩增p2fulllength ispS。以纯化的SUMO tag和p2fulllength ispS的PCR片段为模板,引物对P29与P34扩增Sumo-p2fulllength ispS全长PCR片段,装入pKS2载体,得到质粒pPcpcSumo-p2fulllength ispS。
以聚胞藻PCC6803基因组为模板,引物对P31与P32扩增分子伴侣蛋白groEStag(SEQ ID NO:70)。以质粒pPcpcp2fulllength ispS为模板,引物对P33与P34扩增p2fulllength ispS。以纯化的groES tag和p2fulllength ispS的PCR片段为模板,引物对P31与P34扩增groES-p2fulllength ispS全长PCR片段,装入pKS2载体,得到质粒pPcpcgroES-p2fulllength ispS。
以质粒pPcpcp2fulllength ispS为模板,引物对P35与P36扩增his-p2fulllength ispSPCR片段,即在p2fulllength ispS的N端加入6×His tag序列,装入pKS2载体,得到质粒pPcpchis-p2fulllength ispS。
将上述3个质粒分别转化聚胞藻PCC6803,得到重组菌SS024、SS025、SS029,如表10所示。
表10、在IspS的N端表达不同tag的重组菌株
重组菌株 | 特征 |
ss006 | ΔglgX::Pcpcp2-fulllength ispS |
ss024 | ΔglgX::PcpcSumo-p2fulllength ispS |
ss025 | ΔglgX::PcpcgroES-p2fulllength ispS |
ss029 | ΔglgX::Pcpchis-p2fulllength ispS |
将筛选获得的阳性重组菌株发酵并检测异戊二烯产量,结果如图14所示,发酵第10天时,与对照组不含N段蛋白标签的重组菌ss006相比,ss024即表达SMUOtag的重组菌产量提高了3倍,即通过在p2fulllength ispS的N端表达SUMO tag,可以显著提高异戊二烯的产量。而表达His tag和groES tag的重组菌,异戊二烯的产量反而降低。
本实施例证实可以通过表达可溶性标签SUMO tag,来提高异戊二烯的产量,SUMO tag可能提高了IspS的可溶性,该结果可应用于在蓝藻中表达可溶性差的蛋白。
Claims (2)
1.一种密码子优化的异戊二烯合成酶编码基因,其特征在于,所述基因是根据蓝藻的密码子偏好性,在不改变编码的氨基酸序列的基础上,将来源于蓝桉的异戊二烯合成酶编码基因的核苷酸序列经密码子优化获得,所述基因的核苷酸序列如SEQID NO:54所示。
2.一种利用蓝藻生产异戊二烯的方法,其特征在于,在蓝藻中表达如权利要求1所述的密码子优化的异戊二烯合成酶编码基因。
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