CN111549047A

CN111549047A - 驱动外源基因在蓝藻中高效表达的启动子的筛选方法

Info

Publication number: CN111549047A
Application number: CN202010313418.3A
Authority: CN
Inventors: 石拓; 成杰; 郑灵刚
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2020-04-20
Filing date: 2020-04-20
Publication date: 2020-08-18

Abstract

本发明公开了一种驱动外源基因在蓝藻中高效表达的启动子的筛选方法。属于生物工程技术领域。筛选步骤包括设计并合成初始母载体pMCS、质粒pMCS‑GFP的构建、构建启动子表征载体、构建启动子表征藻株、采用流式细胞仪检测GFP荧光信号进行筛选。与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：采用流式细胞仪对GFP荧光信号的原位检测，省时省力，且可以确保结果的准确性。通过自主构建启动子元件表征载体，可以对不同启动子进行强弱对比，并据此筛选出比6803PcpcBA表现更佳的启动子7002PcpcBA。

Description

驱动外源基因在蓝藻中高效表达的启动子的筛选方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，更具体的说是涉及一种驱动外源基因在蓝藻中高效表达的启动子的筛选方法。

背景技术

蓝藻是开阔大洋最重要的初级生产者之一，能够利用太阳光与二氧化碳分别作为能源与碳源将无机碳转化为有机碳，因而在全球的碳循环中扮演着十分重要的角色。与陆生植物及真核微藻相比，蓝藻具备营养需求简单、生长速率快、能量转化效率高、固碳能力强以及遗传操作方便等优势，因而常常被用作细胞生物反应器生产有价值的化工产品。然而，蓝藻中外源基因的表达仅仅占到其胞内可溶性蛋白的3％，显著限制了利用蓝藻生产化工产品的潜力，也进一步限制了蓝藻表达系统的应用潜力。为了进一步提高蓝藻生产化工产品的能力，开发出一系列能够精准调控基因表达的合成生物学工具迫在眉睫。

目前，已经在模式生物大肠杆菌与酿酒酵母中开发出基于点突变的组成型启动子文库以及诱导型启动子系统，但应用于蓝藻细胞后效果不佳，甚至会出现相反的结果。尽管一些诱导型启动子已经在传统模式蓝藻集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803(以下简称PCC6803)与聚球藻Synechococcus sp.PCC 7942(以下简称PCC7942)中取得一些进展，但是同一启动子在不同蓝藻细胞中的表现差异很大。

Synechococcus sp.PCC 7002(以下简称聚球藻7002)是一种广盐性的海洋微藻，具有一定的耐热耐高温的特性，是目前发现的蓝藻属中生长速率最快的藻株之一，其基因组信息完整，遗传操作方便，因而具备工业化生产的潜力。但是聚球藻7002缺乏精准调控基因表达的遗传调控元件，限制了产物在细胞内的积累。外源基因在细胞内的表达受胞内转录与翻译水平的调控，且转录水平调控在原核生物中发挥着极为重要的作用。一般而言，转录水平的调控主要集中于启动子的适配性以及活性强弱。目前源自于PCC6803的PcpcBA组成型启动子(6803PcpcBA)以及源自于PCC7942的Zn²⁺诱导的PsmtA启动子被认为在聚球藻7002中表现最佳。考虑到藻细胞对外源Zn²⁺的敏感性较强且耐受性较弱，组成型启动在调控基因表达过程中发挥着举足轻重的作用。为了进一步优化聚球藻7002表达系统，尤其是进一步提升聚球藻7002表达系统在生产高附加值香精香料、精细化学品以及天然产物方面的应用价值，提高聚球藻7002表达外源基因的能力迫在眉睫。尽管提高外源基因表达量的方法很多，如：基于靶向物种的密码子优化、设计合适的核糖体结合位点序列、移除产物避免产物反馈抑制等。但是，通过筛选高效启动子提高外源基因的表达量仍然是最有效的调控方法。

综上，如何提供一种用于筛选高效启动子驱动外源基因在聚球藻7002中表达的方法是本领域亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种驱动外源基因在聚球藻7002中高效表达的启动子的筛选方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

驱动外源基因在蓝藻中高效表达的启动子的筛选方法，所述蓝藻为聚球藻7002，包括如下步骤：

(1)设计并合成初始母载体pMCS：

克隆载体pBluescript SK(+)购自Stratagene(La Jolla，CA，USA)，在克隆载体pBluescriptSK(+)的多克隆位点处修改相关酶切位点，使得酶切位点依次为：KpnI，XhoI，AatII，MluI，SalI，EcoRV，PstI，SphI，BamHI，SpeI，NotI和SacI，得到初始母载体pMCS；

(2)质粒pMCS-GFP的构建：

(21)将位于聚球藻7002内源质粒pAQ1上的同源上游臂Flank-A与同源下游臂Flank-B、绿色荧光蛋白Green fluorescent protein报告基因GFP、源自聚球藻7002rbcL基因的终止子7002TrbcL、抗性基因Kanamycin进行PCR扩增，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化；

所述同源上游臂Flank-A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述同源下游臂Flank-B的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述绿色荧光蛋白Green fluorescent protein报告基因GFP的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；

所述终止子7002TrbcL的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述抗性基因Kanamycin的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(22)将步骤(21)扩增的基因片段经相应的限制性内切酶酶切和DNA连接酶依次连接至初始母载体pMCS，之后转化感受态细胞E.coli Top10；

(23)在含有卡那霉素的LB固体平板上进行单克隆筛选，得到阳性克隆子后，摇菌提取质粒，经测序验证，得到质粒pMCS-GFP；

(3)将备选启动子与经过SalI-EcoRV双酶切后的质粒pMCS-GFP利用T4 DNA连接酶连接，得到酶连产物，经卡那霉素筛选以及测序验证，得到启动子表征载体；

(4)将启动子表征载体进行藻细胞的转化以及阳性克隆藻株的鉴定，得到启动子表征藻株；

(5)启动子的筛选：以野生型聚球藻7002为对照组，八个启动子表征藻株为实验组，利用共聚焦激光扫描显微镜对部分表征藻株GFP荧光信号进行定性检测，利用多功能酶标仪对八个启动子表征藻株的GFP荧光强度进行定量检测。

在上述技术方案的基础上，本发明又做了如下改进：

本发明得到的启动子表征藻株，一方面利用多功能酶标仪对GFP荧光强度进行定量检测，另一方面探索利用流式细胞仪原位检测GFP荧光信号的可能性。

传统的GFP荧光信号的检测常常需要提取胞内的总蛋白，该方法费时费力。本发明采用流式细胞仪对GFP荧光信号进行原位检测，省时省力，且可以确保结果的准确性。

优选的，所述步骤(22)中限制性内切酶的应温度为37℃，反应时间为3h。

优选的，所述步骤(22)中DNA连接酶为T4 DNA连接酶，反应条件为16℃下反应3～5h，或者4℃过夜。

优选的，步骤(5)流式细胞仪参数设置为：流速为低速，计数10000个；前向散射光FSC的阈值为10；侧向散射光SSC的阈值为210；SYBR Green的阈值为89；Chlorophyll的阈值为30。

优选的，步骤(5)中根据前向散射光FSC和侧向散射光SSC两个通道，找出藻细胞的类群，根据Chlorophyll通道找出有活性的细胞，排除死去的或者活力低的细胞，根据SYBRGreen通道圈出可产生GFP绿色荧光信号的细胞，根据SYBR Green的数值大小作为表征启动子强弱的标准。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：(1)本发明通过自主构建启动子表征载体，不仅开发出聚球藻7002中精准调控基因表达的不同强度的启动子元件，而且筛选到的7002PcpcBA启动子比6803PcpcBA表现更佳，可以高效调控外源基因的表达；(2)本发明采用流式细胞仪对GFP荧光信号的原位检测，省时省力，且可以确保结果的准确性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为实施例1步骤(1)中初始母载体pMCS的图谱；

图2附图为实施例1步骤(3)中启动子表征载体的构建流程示意图；

图3附图为实施例2中共聚焦激光扫描显微镜定性检测图；

图4附图为实施例2中以野生型聚球藻7002为例进行圈门操作的结果图；

图5附图为实施例2中野生型聚球藻7002与突变株6803PpsaAB混合藻株进行圈门操作的比较结果图；

图6附图为实施例2中GFP荧光强度进行定量检测结果图；

图7附图为实施例2中两种检测平台测定GFP荧光强度的吻合度，其中，横坐标为多功能酶标仪检测结果，纵坐标为流式细胞仪检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

聚球藻7002由中国科学院水生生物研究所赵进东老师友情赠送；

E.coli Top 10购自TaKaRa有限责任公司；

克隆载体pBluescript SK(+)购自Stratagene(La Jolla，CA，USA)。

实施例未提及的试剂为市售渠道购买，未提及的方法为常规技术手段，在此不再赘述。

实施例1

(1)设计并合成初始母载体pMCS：

克隆载体pBluescript SK(+)购自Stratagene(La Jolla，CA，USA)，在克隆载体pBluescriptSK(+)的多克隆位点处修改相关酶切位点，使得酶切位点依次为：KpnI，XhoI，AatII，MluI，SalI，EcoRV，PstI，SphI，BamHI，SpeI，NotI和SacI，得到初始母载体pMCS；初始母载体pMCS的图谱如图1所示。设计好的初始母载体pMCS送往上海生工有限责任公司进行质粒的合成。

本发明选取初始母载体pMCS，将目的基因(包括启动子与报告基因GFP)亚克隆至初始母载体pMCS，并通过同源重组技术，将目的基因利用同源臂整合进聚球藻7002的内源质粒pAQ1中，一方面使得目的基因可以跟随内源质粒pAQ1自主复制，始终将拷贝数维持在50左右，另一方面，可以避免因游离质粒拷贝数对GFP荧光信号的影响。

(2)质粒pMCS-GFP的构建：

(21)根据初始母载体pMCS上的多克隆酶切位点设计如表1所示引物，将位于聚球藻7002内源质粒pAQ1上的同源上游臂Flank-A与同源下游臂Flank-B、绿色荧光蛋白Greenfluorescentprotein报告基因GFP、源自聚球藻7002rbcL基因的终止子7002TrbcL、抗性基因Kanamycin使用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化；

所述同源上游臂Flank-A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述同源下游臂Flank-B的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述终止子7002TrbcL的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述抗性基因Kanamycin的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

PCR扩增体系及扩增条件如表2、表3所示。

表1引物序列信息

表2 PCR反应体系

表3 PCR反应条件

(22)将步骤(21)扩增的基因片段经相应的限制性内切酶酶切(应温度为37℃，反应时间为3h)和T4 DNA连接酶(反应条件为16℃下反应3～5h，或者4℃过夜)依次连接至初始母载体pMCS，之后转化感受态细胞E.coli Top10；在含有卡那霉素的LB固体平板上进行单克隆筛选，得到阳性克隆子后，摇菌提取质粒，经测序验证，得到质粒pMCS-GFP。

(3)将备选启动子：6803PpsaAB、6803PpsbDC、6803PcpcBA、6803PrbcL、7002PpsaAB、7002PpsbDC、7002PcpcBA和7002PrbcL；与经过SalI-EcoRV双酶切后的质粒pMCS-GFP利用T4 DNA连接酶连接，得到酶连产物，经卡那霉素筛选以及测序验证，得到八个启动子表征载体；启动子表征载体的构建流程示意图如图2所示。

所述6803PpsaAB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述6803PpsbDC的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述6803PcpcBA的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述6803PrbcL的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述7002PpsaAB的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述7002PpsbDC的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述7002PcpcBA的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

所述7002PrbcL的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

所使用的备选启动子的功能信息如表4所示。

表4备选启动子功能信息

光合作用在光自养生物体内扮演着举足轻重的作用，参与光合作用基因的启动子元件可以有效地调控聚球藻7002中外源基因的高效表达；与此同时，聚球藻7002胞内的藻蓝蛋白含量可以占到其胞内可溶性蛋白的40％，因此，我们推测，藻蓝蛋白基因的启动子同样可以有效地调控外源基因在聚球藻7002中的高效表达。本发明选取源自聚球藻7002及集胞藻6803的八个启动子元件，其中六个启动子元件与光合作用相关，两个启动子元件与藻蓝蛋白相关。

(4)将上述得到的八个启动子表征载体分别使用内切酶KpnI和SacI进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶切完全后，切胶回收，得到线性DNA片段。使用NanoDrop 2100检测线性DNA片段的浓度与纯度。

取3ug的线性DNA片段与750uL处于对数生长期的聚球藻7002浓缩藻液(OD₇₃₀约8.0)混匀，以野生型聚球藻7002为对照，置于35℃、100rpm的摇床中暗处理过夜。次日，将混合液置于35℃、50rpm、80μmol photons m^-2s^-1的光照培养箱中处理12h。随后将混合液常温离心(4000rpm，5min)，弃上清，用200μL新鲜A⁺培养基重悬细胞，均匀的涂布在含有卡那霉素的A⁺固体平板上，至于35℃的光照摇床中筛选获得单克隆突变株。得到的单克隆突变株利用测序引物Sequencing FOR与Sequencing REV进行琼脂糖凝胶电泳检测，并送往上海生工测序鉴定，得到八个启动子表征藻株。A⁺培养基配方如表5所示。

表5 A⁺培养基配方

表5中微量元素配方如表6所示。

表6微量元素配方(1000×)

实施例2

将实施例1获得的八个启动子表征藻株置于光照培养箱中培养。其中培养温度为35±1℃，光照强度为80μmol photons m^-2s^-1，光暗周期为14h:10h，转速为50rpm。

(一)为了定性的检测GFP是否进行了有效的表达，利用共聚焦激光扫描显微镜对野生株(Control)与部分表征藻株的GFP荧光信号进行定性检测，取处于对数生长期的藻细胞20μL，置于共聚焦激光扫描显微镜下观察，分别采用488nm与665nm的激发光检测GFP的绿色荧光信号与叶绿素自发红色荧光信号，结果如图3所示。由图3结果可知，GFP均进行了有效的表达。

(二)利用流式细胞仪定量检测GFP荧光信号，检测步骤如下：

(1)上机样本的准备：取处于对数生长期的藻细胞10μL于1.5mL的离心管中，利用新鲜的A⁺培养基稀释100倍，作为流式细胞仪的上机检测的样本；

(2)流式细胞仪开机后，先进行排气泡以及机器预热。检测参数设置为：流速为低速，计数10000个；前向散射光FSC阈值为10，反应细胞的大小；侧向散射光SSC的阈值为210，反应细胞的复杂程度；SYBR Green(488nm的GFP通道)阈值为89，Chlorophyll的阈值为30。

(3)藻细胞群体的圈门：根据前向散射光FSC和侧向散射光SSC两个通道，找出藻细胞的类群，根据Chlorophyll通道找出有活性的细胞，排除死去的或者活力低的细胞，根据SYBR Green通道圈出可产生GFP绿色荧光信号的细胞。根据SYBR Green的数值大小作为表征藻株启动子强弱的标准。

图4为以野生型聚球藻7002为例进行圈门操作的结果图。

图5附图为实施例2中野生型聚球藻7002与突变株6803PpsaAB混合藻液进行圈门操作的结果图。

(三)利用多功能酶标仪对GFP荧光强度进行定量检测，具体操作包括如下步骤：

(1)通过浊度法测定藻细胞的生长：取处于对数生长期的藻细胞1mL，利用分光光度计测定OD₇₃₀；

(2)胞内粗蛋白的提取：取处于对数生长期的藻细胞1mL于1.5ml的离心管中，5000rpm离心10min，弃上清液；加入300μL的蛋白提取液重悬，置于转速为300rpm的室温金属浴中抽提30min；取出离心管，至于转速为12000rpm的低温高速离心机中，4℃离心30min；

(3)取200μL上清液于96孔板中，利用多功能酶标仪检测激发波长480nm，散射波长570nm下的荧光强度。

本发明借助多功能酶标仪与流式细胞仪两个检测平台对GFP荧光强度进行定量检测，检测结果如图6所示。图6中纵坐标为GFP荧光相对强度，指处理组(实验组)检测的GFP荧光强度与对照组(野生株)检测的GFP荧光强度的比值，其中对照组的荧光强度设置为1。

由图6结果可知，两种检测平台均可以准确地检测GFP的荧光信号，且7002PcpcBA启动子表现最佳，显著高于先前报道的6803PcpcBA启动子。

对两种检测平台的结果的一致性进行评价，结果如图7所示。图7中线性关系为Y＝0.9205X-0.0010，相关系数R²为0.9523，说明流式细胞仪原位检测GFP荧光信号是一种省时省力的快速检测平台，检测准确度高。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 山东大学

<120> 驱动外源基因在蓝藻中高效表达的启动子的筛选方法

<160> 37

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 406

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtacccgct ctcaccaaag attcacctgt tagagctact caacatccat cagttcttaa 60

aaccaggggt gacattcacc ggggcgagcc ttgaagggtt caaggaaaat tgtttgcggt 120

atgccaagcc gatcaagtgg attcttggca gaacgatcac cgacaaaatg agcccgctcg 180

aaattgctca ggcgctccta ggcaagcttg accggaaatt ggaatacaag gggcgctttg 240

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gtataaatag atttattcag gaggcttaga cccgtgatcg ctcgag 406

<210> 2

<211> 526

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcggccgcct ttctcttatg cacagatggg gactggaaac cacacgcaca attcccttaa 60

aaagcaaccg caaaaaataa ccatcaaaat aaaactggac aaattctcat gtgttcttct 120

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<210> 3

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

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gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtga 720

<210> 4

<211> 183

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gttacagttt tggcaattac taaaaaactg acttcaattc aatgttagcc cgctcccgcg 60

ggttttttgt tgctttttca cagtgactat aggtaatcag caacacaata cggccctgtt 120

ctttggacag tttttgtata atgttgaccg catcctgacc ggatttttta tctaagtggg 180

gaa 183

<210> 5

<211> 894

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taatacgact cactataggg acgtcatgag ccatattcaa cgggaaacgt cttgctctag 60

gccgcgatta aattccaaca tggatgctga tttatatggg tataaatggg ctcgcgataa 120

tgtcgggcaa tcaggtgcga caatctatcg attgtatggg aagcccgatg cgccagagtt 180

gtttctgaaa catggcaaag gtagcgttgc caatgatgtt acagatgaga tggtcagact 240

aaactggctg acggaattta tgcctcttcc gaccatcaag cattttatcc gtactcctga 300

tgatgcatgg ttactcacca ctgcgatccc cgggaaaaca gcattccagg tattagaaga 360

atatcctgat tcaggtgaaa atattgttga tgcgctggca gtgttcctgc gccggttgca 420

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gcaatcacga atgaataacg gtttggttga tgcgagtgat tttgatgacg agcgtaatgg 540

ctggcctgtt gaacaagtct ggaaagaaat gcataaactt ttgccattct caccggattc 600

agtcgtcact catggtgatt tctcacttga taaccttatt tttgacgagg ggaaattaat 660

aggttgtatt gatgttggac gagtcggaat cgcagaccga taccaggatc ttgccatcct 720

atggaactgc ctcggtgagt tttctccttc attacagaaa cggctttttc aaaaatatgg 780

tattgataat cctgatatga ataaattgca gtttcatttg atgctcgatg agtttttcta 840

aacgcgttag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttg 894

<210> 6

<211> 334

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtgcccatt gctatcagtt gtaagttgat gaaaatgctg taaatttttg taacaaagtt 60

caactttgtc ttgacttttg taagtctttg caaaatctag gagctagaac tggtcagggc 120

tggggcaatt tttaattatt gttacgcagg tcttgcctag ggggggggag gccgtattat 180

cttctagtga tgtttgctga aaacgcctat ctgtgcaagg tttaacatcg ttattatgaa 240

gcgaaaacta attccctttt ttacgcttcc tctattacac tattctgcat aggaaaccct 300

taatagttca ttgtcgagcg aggagaaccc tgca 334

<210> 7

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctggcgatc ggcgattatg agagtgaata tgtcagaatg taaaatattt gctaataata 60

tgtagatgcg tttcggcaag gaacgccaac ataagtgcag gtttggcccc tgtggcctgg 120

cttgctaccc ataagaaaat ggcatcagga gaacaaatat tgttccaccg acaggccgca 180

tttgggtttt ggccaaccgc tataccccgg cggtgtagtt tccaatcgtc tcgtcttatt 240

agagaatgga gtctaaatgg cataacccaa attacaaaag cctcctttag aaattcttgc 300

ctttgatgct agctacgcaa gaggatttgc atttat 336

<210> 8

<211> 562

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acccacctgt agagaagagt ccctgaatat caaaatggtg ggataaaaag ctcaaaaagg 60

aaagtaggct gtggttccct aggcaacagt cttccctacc ccactggaaa ctaaaaaaac 120

gagaaaagtt cgcaccgaac atcaattgca taattttagc cctaaaacat aagctgaacg 180

aaactggttg tcttcccttc ccaatccagg acaatctgag aatcccctgc aacattactt 240

aacaaaaaag caggaataaa attaacaaga tgtaacagac ataagtccca tcaccgttgt 300

ataaagttaa ctgtgggatt gcaaaagcat tcaagcctag gcgctgagct gtttgagcat 360

cccggtggcc cttgtcgctg cctccgtgtt tctccctgga tttatttagg taatatctct 420

cataaatccc cgggtagtta acgaaagtta atggagatca gtaacaataa ctctagggtc 480

attactttgg actccctcag tttatccggg ggaattgtgt ttaagaaaat cccaactcat 540

aaagtcaagt aggagattaa tt 562

<210> 9

<211> 277

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcaccatttg gacaaaacat caggaattct aattagaaag tccaaaaatt gtaatttaaa 60

aaacagtcaa tggagagcat tgccataagt aaaggcatcc cctgcgtgat aagattacct 120

tcagaaaaca gatagttgct gggttatcgc agatttttct cgcaaccaaa taactgtaaa 180

taataactgt ctctggggcg acggtaggct ttatattgcc aaatttcgcc cgtgggagaa 240

agctaggcta ttcaatgttt atggaggact gacctag 277

<210> 10

<211> 227

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgtgccgtaa tgatttcagg gagttttaaa tattgttaat gtcccccaac atccttggaa 60

agtaggccct atcatttaca tcaatgcttt ttgcccaatg ggttttagag cagtcctaaa 120

tcactggaaa ccttgcaagc tggtgattcg ctcacagctt atctatttga atacatctat 180

ttagatagaa cctttattac gtcgattgtc tagagaggag aatcctc 227

<210> 11

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcccctcagc tgaagtcaat tgtatctttt tgtaacaaaa actctgctag atattaagaa 60

aagtgtttac actcaggtta tgaaatcctt cagaaggcta tatgcctatg gagtatgtgt 120

tattttaaga aacgttaacc atctgaaata gcctatattt cataaggttg acccgcttac 180

atgattctcg gaaactcccc tgaccatagg atttatacct attggctttt gctcatttga 240

cagggagaat ccataacaag gaaactagcg taagccattt aatatccaac ccttgttcat 300

tcatatagac aagaggaatt aaaaact 327

<210> 12

<211> 686

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

caagggaggt tttttatgtg agttcacatt ttgttacgtt acccaatcaa tacttgagcc 60

gctcaaaaag tctgacctag agcagaaagt ccctgagtat atcgactcat taatccggtc 120

tttccgcttg gtttcttgag ttgattttct gcgaaatttt ggaaattcag agatctaacc 180

ttagggggag tccacttaaa aacggctctg ctcaaccttg caaatgccct actcttcttc 240

tgtctagccc aagcactccc tgagaaaatt agcggcgatc gcctataaac atgaagtttt 300

atgacagatc tttttacaag atgtaatgtt taaatgccgg cagacgttgt ataacattta 360

cctaagatta agagtcactc gcagtactcc ttagaaaccc cataggttcc aaggaactag 420

catgaacttt atctggcaac tttaagaatc tgagaaattc aatgaatgta aagtttctta 480

aatgccaagg tgaaaaacaa gcaaaaatag ctgacactct taattggctt tggggattaa 540

gtttccaact cgaaaacaaa accttttatc gactctagga ttttgttttc agcaagagag 600

cccctcagca cttgcttcac tcttgttagt aagcaaaccg cacaaaataa atcccactca 660

tcaaaatata agtaggagat aaaaac 686

<210> 13

<211> 478

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ccttagcccc acaaaacttt catgattgct tgagtgaaaa ttaaatgttt aaagttctta 60

aaggagattg ttgagaaaca taaatactta attcatctca tttgaacgct ttccctctct 120

aaagatcccg acagaaaacg gttttagccc aatgtctcat taggtagcat ggctgaattc 180

gagcgggatt ttatggcttt tttaggtatt tttgtaaggg taaaataggc ccatcaaaca 240

gcattagaaa tgctaatcag cccaaaaaac aaaagcaatc tttttttgtt gctaaaagat 300

aaaaataagt cgaggctgtg gtaacatatc ccacagatta aagaaagtca taagacttga 360

atcttcagaa ttttaaaaag cagttttgcc aacgtaagat ttttgaagtt ttcgaccaac 420

aataccgtta ctggtatttg tctgttaaag ataagcattt ttgctggagg aaaaccgc 478

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccccccgata tcatggtgag caagggcga 29

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccccccacta gttcacttgt acagctcgtc cat 33

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccccccgtcg acggtgccca ttgctatcag ttgtaagtt 39

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccccccgata tctgcagggt tctcctcgct cga 33

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ccccccgtcg accctggcga tcggcgatta tga 33

<210> 19

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ccccccgata tccataaatg caaatcctct tgcgtagct 39

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ccccccgtcg acacccacct gtagagaaga gtccctgaat a 41

<210> 21

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ccccccgata tcaattaatc tcctacttga ctttatgagt tgggat 46

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tttgtcgact caccatttgg acaaaacat 29

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tttgatatcc taggtcagtc ctccataaa 29

<210> 24

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ccccccgtcg actgtgccgt aatgatttca gggagtttt 39

<210> 25

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ccccccgata tcgaggattc tcctctctag acaatcgacg t 41

<210> 26

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ccccccgtcg acgcccctca gctgaagtca attgtatct 39

<210> 27

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ccccccgata tcagttttta attcctcttg tctatatgaa tgaaca 46

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tttgtcgact ggttccgaaa ccgaaggata 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tttgatatcg catcagcctg agaaacaacc 30

<210> 30

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ccccccgtcg acccttagcc ccacaaaact ttcatgatt 39

<210> 31

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ccccccgata tcaatgcggt tttcctccag caa 33

<210> 32

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ccccccggta cccgctctca ccaaagattc acctgttag 39

<210> 33

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ccccccctcg agcgatcacg ggtctaagcc tcctgaat 38

<210> 34

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

ccccccgcgg ccgcctttct cttatgcaca gatggggact 40

<210> 35

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ccccccgagc tcggggtttt ctcgtgttta ggcagcat 38

<210> 36

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ccccccttct aaacgcgtta gcataacccc tt 32

<210> 37

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ccccccctcg ccggacacgc tgaactt 27

Claims

1.驱动外源基因在蓝藻中高效表达的启动子的筛选方法，其特征在于，所述蓝藻为聚球藻7002，包括如下步骤：

(1)设计并合成初始母载体pMCS：

在克隆载体pBluescript SK(+)的多克隆位点处修改相关酶切位点，使得酶切位点依次为：KpnI，XhoI，AatII，MluI，SalI，EcoRV，PstI，SphI，BamHI，SpeI，NotI和SacI，得到初始母载体pMCS；

(2)质粒pMCS-GFP的构建：

所述同源上游臂Flank-A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述同源下游臂Flank-B的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述绿色荧光蛋白Green fluorescent protein报告基因GFP的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；

所述终止子7002TrbcL的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述抗性基因Kanamycin的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(5)启动子的筛选：采用流式细胞仪检测GFP荧光信号对备选启动子进行筛选。

2.如权利要求1所述的驱动外源基因在蓝藻中高效表达的启动子的筛选方法，其特征在于，所述步骤(22)中限制性内切酶的反应温度为37℃，反应时间为3h。

3.如权利要求1所述的驱动外源基因在蓝藻中高效表达的启动子的筛选方法，其特征在于，所述步骤(22)中DNA连接酶为T4 DNA连接酶，反应条件为16℃下反应3～5h，或者4℃过夜。

4.如权利要求1所述的驱动外源基因在蓝藻中高效表达的启动子的筛选方法，其特征在于，步骤(5)流式细胞仪参数设置为：流速为低速，计数10000个；前向散射光FSC的阈值为10；侧向散射光SSC的阈值为210；SYBR Green的阈值为89；Chlorophyll的阈值为30。

5.如权利要求4所述的驱动外源基因在蓝藻中高效表达的启动子的筛选方法，其特征在于，步骤(5)中根据前向散射光FSC和侧向散射光SSC两个通道，找出藻细胞的类群，根据Chlorophyll通道找出有活性的细胞，排除死去的或者活力低的细胞，根据SYBR Green通道圈出可产生GFP绿色荧光信号的细胞，根据SYBR Green的数值大小作为表征启动子强弱的标准。