CN110438053A - 一种适用于聚球藻的生物封存系统、构建方法及应用 - Google Patents

一种适用于聚球藻的生物封存系统、构建方法及应用 Download PDF

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    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora

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Abstract

本发明公开了一种适用于聚球藻的生物封存系统、构建方法及应用，构建为：从聚球藻7942中获得毒性基因sepT2、抗毒基因sepA2及缺铁诱导启动子PisiAB，从集胞藻6803中获得启动子PpsbA2；从整合型质粒pBA3031中扩增得到终止子Trbcl；以pBR322为载体，用缺铁诱导启动子PisiAB表达毒性基因sepT2，用终止子Trbcl终止转录；用启动子PpsbA2表达抗毒基因sepA2，构建质粒并转入聚球藻。本发明的系统，在非诱导情况下正常生长，诱导后迅速死亡。这对聚球藻的生物封存系统发展与优化具有重要的理论及实际意义，也为解决其它蓝细菌的生物安全问题提供了借鉴。

Description

一种适用于聚球藻的生物封存系统、构建方法及应用
技术领域
本发明属于生物安全领域，具体涉及一种适用于聚球藻7942和聚球藻2973的生物封存系统、其构建方法及应用，可用于防止基因工程菌的逃逸。
背景技术
随着传统能源日益枯竭、温室效应逐渐严重、环境不断恶化等问题，生物能源因其绿色环保可持续等特点越来越受到人们的广泛关注，开发利用可替代的新能源迫在眉睫。聚球藻作为一种光合蓝细菌，可直接利用光能和二氧化碳生产生物燃料和精细化学品，近年来已作为新一代“细胞工厂”得到了广泛应用。聚球藻7942是常用的模式菌株，遗传背景清晰，而聚球藻2973由于其耐高光、耐高温、快速生长的特点，成为了极具生产潜力的工程菌。但由于蓝细菌在自然环境中具有很强的适应性和繁殖力，且很多蓝细菌是天然感受态，外源基因可通过基因水平转移扩散到天然蓝藻中，因此潜在的生物安全问题也引起了大众关心：如外源基因逃逸极其可能带来的基因库污染，基因编辑菌株对生物多样性的影响等。
为了解决这一问题，主动型和被动型的生物封存系统在蓝细菌中都已经得到了开发。现存的主动型致死系统通常是组合诱导型启动子和致死基因，但由于启动子的严谨性等限制，会造成未经诱导的菌株生长受到影响。而被动型系统是基于通过敲除特定基因来生产营养缺陷型菌株，但因“饥饿”造成菌株死亡往往需要很长的时间。因此，开发一种适用于聚球藻7942和聚球藻2973的严谨、高效、可快速致死的生物封存系统至关重要。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种适用于聚球藻的生物封存系统。
本发明的第二个目的是提供一种适用于聚球藻的生物封存系统的构建方法。
本发明的第三个目的是提供一种适用于聚球藻的生物封存系统的应用。
本发明的技术方案概述如下：
适用于聚球藻的生物封存系统的构建方法，包括如下步骤：
(1)从聚球藻7942中获得毒性基因sepT2、抗毒基因sepA2以及缺铁诱导启动子PisiAB，从集胞藻6803中获得启动子PpsbA2；从整合型质粒pBA3031中扩增得到终止子Trbcl；所述毒性基因sepT2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述抗毒基因sepA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述缺铁诱导启动子PisiAB的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述启动子PpsbA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述终止子Trbcl的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
(2)以pBR322为载体，用缺铁诱导启动子PisiAB表达毒性基因sepT2，用终止子Trbcl终止转录；用启动子PpsbA2表达抗毒基因sepA2，构建质粒pBR322-A2/T2；
(3)将所述质粒pBR322-A2/T2转入聚球藻。
步骤(3)所述聚球藻优选为聚球藻7942或聚球藻2973。
上述方法构建的适用于聚球藻的生物封存系统。
上述系统的应用。
本发明的适用于聚球藻的生物封存系统，在非诱导情况下正常生长，诱导后迅速死亡。这对聚球藻的生物封存系统发展与优化具有重要的理论及实际意义，也为解决其它蓝细菌的生物安全问题提供了借鉴。
附图说明
图1为在载体中用缺铁诱导启动子PisiAB表达毒性基因sepT2，用启动子PpsbA2表达抗毒基因sepA2的构建图示。
图2为聚球藻7942sepA2/T2、7942野生型在正常培养条件和缺铁条件下的生长曲线。
图3为聚球藻2973sepA2/T2、2973野生型在正常培养条件和缺铁条件下的生长曲线。
具体实施方式
pBR322(市售)
下面的实施例是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明但并不用于限制本发明。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
(1)目的基因的体外扩增
采用细菌基因组提取试剂盒提取聚球藻7942基因组作为模板，
以SEQ ID No.6所示序列为sepA2基因上游引物，
以SEQ ID No.7所示序列为sepA2基因下游引物，
以SEQ ID No.8所示序列为sepT2基因上游引物，
以SEQ ID No.9所示序列为sepT2基因下游引物，
以SEQ ID No.10所示序列为PisiAB启动子上游引物，
以SEQ ID No.11所示序列为PisiAB启动子下游引物，进行PCR扩增；
采用细菌基因组提取试剂盒提取集胞藻6803基因组作为模板，以SEQ ID No.12、SEQ ID No.13所示序列分别为PpsbA2启动子上、下游引物，进行PCR扩增；
采用整合型质粒pBA3031(Sun T,Li S,Song X,et al.Re-direction of carbonflux to key precursor malonyl-CoA via artificial small RNAs in photosyntheticSynechocystis sp.PCC 6803[J].Biotechnology for biofuels,2018,11(1):26.)作为模板，以SEQ ID No.14、SEQ ID No.15分别作为终止子Trbcl上、下游引物，进行PCR扩增。
取基因组溶液10ng，5×Phusion HF buffer 4μl，10μM的dNTP 0.4μl，10μM的上下游片段引物各1μl，Phusion酶0.2μl，无菌水12.4μl，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃30s；98℃10s，72℃30s，72℃90s，共30个循环，4℃5min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得目的基因片段：毒性基因sepT2、抗毒基因sepA2、缺铁诱导启动子PisiAB、启动子PpsbA2和终止子Trbcl；
毒性基因sepT2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
抗毒基因sepA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
缺铁诱导启动子PisiAB的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
启动子PpsbA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
终止子Trbcl的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
(2)质粒载体的构建
以SEQ ID No.12所示序列为上游引物，SEQ ID No.15所示序列为下游引物，以PpsbA2片段、sepA2基因片段和Trbcl片段为模板，进行融合PCR获得融合片段1；以SEQ IDNo.10所示序列为上游引物，SEQ ID No.9所示序列为下游引物，以PisiAB片段和sepT2基因片段为模板，进行融合PCR获得融合片段2。
步骤为：取模板各10ng，5×Phusion HF buffer 4μl，10μM的dNTP 0.4μl，10μM的上下游片段引物各1μl，Phusion酶0.2μl，用无菌水补足体系至20μl，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃30s；98℃10s，72℃30s，72℃90s，共30个循环，4℃5min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得上述目的基因片段。将获得的两个融合片段分别进行磷酸化，步骤为取融合片段各16μl,加入PNKBuffer 2μl，10μM ATP 2μl，PNK酶1μl，在PCR管中混匀，37℃放置30min，再次用DNA纯化试剂盒纯化。
以质粒pBR322-NSⅢ(核苷酸序列如SEQ ID NO:18)作为模板，以SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示序列分别为上下游引物，进行反向PCR。步骤为98℃30s；98℃10s，72℃120s，72℃90s，共30个循环，4℃5min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得质粒片段1。将质粒片段1和已经磷酸化的融合片段1按照摩尔比1:3混合，加入连接缓冲液2μl，T4DNA连接酶1μl，无菌水补加至总体系20μl，22℃连接1.5h后转化如大肠杆菌Trans5α进行质粒复制扩增并筛选阳性克隆。选择阳性转化子扩大培养并提取质粒，以质粒为模板，SEQ ID No.15和SEQ ID No.17为引物，进行反向PCR，方法同上。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得质粒片段2。将质粒片段2和已磷酸化的融合片段2进行连接并转化，方法同上。
(3)目的基因的转化
将聚球藻7942和聚球藻2973分别接种到BG11液体培养基中，菌液于37℃，160rpm,200μmol photons m-2s-1培养至对数期。带有pRL443和pRL623的大肠杆菌HB101以及步骤(2)最终获得质粒的大肠杆菌于37℃，200rpm摇床中培养至OD600在0.4左右。大肠杆菌用LB培养基洗涤两次以除去原有培养基中的抗生素，并分别用100μL无抗LB培养基重悬。将HB101和携带目的质粒的大肠杆菌混合，在37℃下孵育30min，分别与1mL聚球藻7942和聚球藻2973混合。将混合菌液在37℃下孵育1h，涂在覆盖醋酸纤维素膜的BG11(+5％LB)固体培养基上。37℃，150μmol photons m-2s-1光照培养24h后，转膜到相应抗性的BG11固体培养基上，聚球藻7942约一周后可见单菌落，聚球藻2973约3天后可见单菌落。筛选阳性转化子，获得带有生物封存功能的突变株7942-sepA2/T2和2973-sepA2/T2，即为适用于聚球藻的生物封存系统。
所述液体培养基BG 11：NaNO31.5g，K2HPO4.3H2O 0.04g，MgSO4·7H2O 0.075g，EDTA0.001g，Na2CO30.02g，H3BO32.86g，MnCl2·4H2O 1.81g，ZnSO4·7H2O 0.222g，NaMoO4·5H2O0.390g，CuSO4·5H2O 0.079g，Co(NO3)2·6H2O 0.0494g，CaCl2·2H2O 0.036g，柠檬酸铁铵0.006g，加水至1L。
所述固体培养基BG 11：NaNO31.5g，K2HPO4.3H2O 0.04g，MgSO4·7H2O 0.075g，EDTA0.001g，Na2CO30.02g，H3BO32.86g，MnCl2·4H2O 1.81g，ZnSO4·7H2O 0.222g，NaMoO4·5H2O0.390g，CuSO4·5H2O 0.079g，Co(NO3)2·6H2O 0.0494g，CaCl2·2H2O 0.036g，柠檬酸铁铵0.006g，琼脂15g，加水至1L。
实施例2
测定聚球藻7942野生型和突变株在正常液体培养基BG 11和缺铁液体培养基BG11的生长曲线。
将聚球藻7942(野生株WT)与实施例1所得的突变株7942-sepA2/T2在正常液体培养基BG 11和含有去铁胺100μM的液体培养基BG 11培养，摇床设置参数为光照强度200μmolphotons m-2s-1，转速160rpm，温度37℃。
步骤为：接种时取OD750nm为0.2的新鲜细胞5mL加入20mL培养基中，每组做3个平行样，用96孔板酶标仪测定波长为750nm下的吸光值，每24h测量一次，绘制生长曲线(图2)。
从图2中可以观察到在正常液体培养基BG 11中，野生株和突变株生长状况几乎一致，而在缺铁诱导的培养基中，突变株的生长状况明显差于野生株，这一结果表明诱导情况下实现了聚球藻7942的生物封存。
实施例3
测定聚球藻7942野生型和突变株在正常液体培养基BG 11和缺铁液体培养基BG11的生长曲线。
将聚球藻2973(野生株WT)与实施例1所得的突变株2973-sepA2/T2在正常液体培养基BG 11和含有去铁胺100μM的液体培养基BG 11培养，摇床设置参数为光照强度200μmolphotons m-2s-1，转速160rpm，温度37℃。
步骤为：接种时取OD750nm为0.2的新鲜细胞5mL加入20mL培养基中，每组做3个平行样，用96孔板酶标仪测定波长为750nm下的吸光值，每24h测量一次，绘制生长曲线(图2)。
从图2中可以观察到在正常液体培养基BG 11中，野生株和突变株生长状况几乎一致，而在缺铁诱导的培养基中，突变株的生长状况明显差于野生株，这一结果表明诱导情况下实现了聚球藻2973的生物封存。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种适用于聚球藻的生物封存系统、构建方法及应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 270
<212> DNA
<213> 聚球藻PCC 7942(Synechococcus elongatus PCC 7942)
<400> 1
cccctgattc tgccgaatac aggacttcta gtcgatcgca ctttgccccg aaacacaatt 60
cagatccaga aagttactgg gagccttctc tttattgaga gtaatttctg ataagtagag 120
catagcaatg aagagtaagg ggctcaattt tcgtcagaag aagcttatat gaacactatg 180
tcggctagaa tacctagagt tcgtcgtaaa acttaatatc aacttattga gaattattgt 240
aaattactgg cattgaactc actctccttc 270
<210> 2
<211> 415
<212> DNA
<213> 集胞藻PCC 6803(Synechocystis sp. PCC 6803)
<400> 2
tatcaataag tattaggtat atggatcata attgtatgcc cgactattgc ttaaactgac 60
tgaccactga ccttaagagt aatggcgtgc aaggcccagt gatcaatttc attatttttc 120
attatttcat ctccattgtc cctgaaaatc agttgtgtcg cccctctaca cagcccagaa 180
ctatggtaaa ggcgcacgaa aaaccgccag gtaaactctt ctcaaccccc aaaacgccct 240
ctgtttaccc atggaaaaaa cgacaattac aagaaagtaa aacttatgtc atctataagc 300
ttcgtgtata ttaacttcct gttacaaagc tttacaaaac tctcattaat cctttagact 360
aagtttagtc agttccaatc tgaacatcga caaatacata aggaattata accaa 415
<210> 3
<211> 267
<212> DNA
<213> 聚球藻PCC 7942(Synechococcus elongatus PCC 7942)
<400> 3
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ccagctctgc gcgatcgccg cttggaagtg attgtcttgc ttgctgtcga tgaagcacca 120
tctgctgaag gtgagcccgt cgttgatgaa caagcgatcg ctcgcatctt tgcagaaacc 180
caaggagctt ggggacgttc cgactcgacg gagactgttg ctaattggat cgaagcccag 240
cgccgtcaag actggcctga agactag 267
<210> 4
<211> 384
<212> DNA
<213> 聚球藻PCC 7942(Synechococcus elongatus PCC 7942)
<400> 4
atgcaagcgg tctttgatac caacatcctc atctaccacc tcaaaggctg tcttcctgaa 60
gcggggagtc aaattctgcg cagcagtctg gggcgcggtg ccgtctgttc agtcattacc 120
cgcctagagg ttttgggtta cgaccaacct tggccagaaa gactgaaagc acaagctttg 180
ctccagctat ttcgagaacg ggcattggat gaatcgattg ctgattgcac gattcagctg 240
cgtcaacaac aacggatcaa actgcccgat gccatcgttg ccgcaactgc gctgacagag 300
aacttgccac tcgtgacgcg caacaccaaa gactttaaag ccatcgctgg cttacaactg 360
attaacccct ttcaaccgaa ctag 384
<210> 5
<211> 179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
accggtgttt ggattgtcgg agttgtactc gtccgttaag gatgaacagt tcttcggggt 60
tgagtctgct aactaattag ccattaacag cggcttaact aacagttagt cattggcaat 120
tgtcaaaaaa ttgttaatca gccaaaaccc actgcttact gatgttcaac ttcgacagc 179
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acaatccaaa caccggtcta gtcttcaggc cagtctt 37
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cattgaactc actctccttc atgcaagcgg tctttgatac 40
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccgacaatcc aaacaccggt ctagttcggt tgaaaggggt 40
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctgactgacc actgacctta a 21
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atttgacgat gtgcttccat ataattcctt atgtatttgt cgatg 45
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aagactggcc tgaagactag accggtgttt ggattgtcgg 40
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gctgtcgaag ttgaacatca 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caaataaaac gaaaggctca 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctcgagctga tccttcaact c 21
<210> 18
<211> 5926
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gatcccggcg ttactagtaa ctgcagccag gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa 60
agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctctact agagtcacac 120
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ctgcagaggt caccgatccg agcagtcggc ctctggttgg taaagaccgt gcgactgccg 420
gtgatgatcg tgttcaagcc atgcaggggg caggcgtgaa ggtcatcctt tcgggccacg 480
gggcggctgt tgacgaaggt gtcgtcgctc ccggtgatga tgatcccgcc gtgatcggtc 540
acgtcgttta gtcgagcgat gcctggcgtc gtagtcacgg gtttaggtca atacgacttg 600
cggtcactgt aacgttgccc tcggcggtca cgttaacgtc gccttgggct tcgacttgcg 660
cctcctgcac aaggatcaca atccgtcctt gggctgcggt gaggtcgatc ttgtactcat 720
gcgcttcgcg gtcgtactgg atgattgagt catcctcgaa ctgcgtcttt tggatcgttt 780
ctttgtcctc gatctggggg tagtcagtcg agaacgcgcc gggcatcgcg aagccctgac 840
tgatctcgcc ggagggggcc atcacgacga cggcctcacc gacctcgggc gcccaccaga 900
accgatcctt gcccgctcgc tgcgtgagcc acggaatcca gtcagtgagg agcagcgcct 960
cgccgctctc ctcgtcttcc tcgatcgcga cacggatcag ccccttggga tagtcagcct 1020
cggctaccct gcctacgcgg agcaagttgc cgtgacgccg actgtgatcg cggaacccct 1080
atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 1140
taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc 1200
cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 1260
aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 1320
aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact 1380
tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtgttg acgccgggca agagcaactc 1440
ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag 1500
catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat 1560
aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt 1620
ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa 1680
gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgcag caatggcaac aacgttgcgc 1740
aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg 1800
gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt 1860
gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca 1920
gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat 1980
gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca 2040
gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg 2100
atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 2160
ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 2220
ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 2280
ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 2340
ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 2400
ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 2460
tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 2520
tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 2580
tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 2640
tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 2700
gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 2760
tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 2820
ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct 2880
gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 2940
gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc tgatgcggta ttttctcctt 3000
acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat 3060
gccgcatagt taagccagta tacactccgc tatcgctacg tgactgggtc atggctgcgc 3120
cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg 3180
cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 3240
caccgaaacg cgcgaggcag ctgcggtaaa gctcatcagc gtggtcgtga agcgattcac 3300
agatgtctgc ctgttcatcc gcgtccagct cgttgagttt ctccagaagc gttaatgtct 3360
ggcttctgat aaagcgggcc atgttaaggg cggttttttc ctgtttggtc actgatgcct 3420
ccgtgtaagg gggatttctg ttcatggggg taatgatacc gatgaaacga gagaggatgc 3480
tcacgatacg ggttactgat gatgaacatg cccggttact ggaacgttgt gagggtaaac 3540
aactggcggt atggatgcgg cgggaccaga gaaaaatcac tcagggtcaa tgccagcgct 3600
tcgttaatac agatgtaggt gttccacagg gtagccagca gcatcctgcg atgcagatcc 3660
ggaacataat ggtgcagggc gctgacttcc gcgtttccag actttacgaa acacggaaac 3720
cgaagaccat tcatgttgtt gctcaggtcg cagacgtttt gcagcagcag tcgcttcacg 3780
ttcgctcgcg tatcggtgat tcattctgct aaccagtaag gcaaccccgc cagcctagcc 3840
gggtcctcaa cgacaggagc acgatcatgc gcacccgtgg ccaggaccca acgctgcccg 3900
agatgcgccg cgtgcggctg ctggagatgg cggacgcgat ggatatgttc tgccaagggt 3960
tggtttgcgc attcacagtt ctccgcaaga attgattggc tccaattctt ggagtggtga 4020
atccgttagc gaggtgccgc cggcttccat tcagccagct cgtcgtgatg tcgaaaccca 4080
agccaccctc agaggtgaag gccgcttcga gcacatcggg aagcgtgtcg acgacggtgc 4140
tcggtgcctc gggtaagagc cagatagatg cggtgacgtt caccgtcgcg atcgtggcgg 4200
gaaccacggt cactgcgtcc gttacaactc gcacgtcgtc ggccagcacg actgactcga 4260
cggcttcgat tagcccggga gaggcaaggc catcaggctc ggtagacaga atgctgatta 4320
acacctcgcc gggagcaggg ctgctcacag ccgcgtcctt cacccgtggg tcagccgtca 4380
gcgcttgata gcggtaccag gccgcaccgc ctgcggtcga gctgcccttg atccgctcga 4440
tggtgcgatc gcgaagctcg ccatccggct cattcggctg ccgcaccacg ccgtagaacg 4500
cggcaaggtt gtcgaggtcg gggccgtttg agtagcgaag cagtgtcgca agaagtgcgt 4560
cgttgatccg ctgacgcagg atcagctcgc gggctgcgca gacctccagc agcttgatga 4620
ccgggtcgga ttcgaggatg gcggtgtagc tggcgtcacg cgatcgcagg tcgtcgatca 4680
agtcctgcag gatcagttca aagtccagcg cttcgatgat ggtgggcgcg ggaatcgtag 4740
caaagtcaag aacggtcatg agacgactaa gccctccagc gtgatacgcc tgccctcggg 4800
gatgtagtag ccgatcaggt tcagctcgac ttgaccagct gcgctggctg agacgatgcg 4860
aaccttctcc agcttcagcc gtggctccca gcgatcgagc gcttcagctg tggccgccac 4920
caggtcaacg atgagggact ggttgatcgg tcgctctaga gcttagaaaa actcatcgag 4980
catcaaatga aactgcaatt tattcatatc aggattatca ataccatatt tttgaaaaag 5040
ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc cataggatgg caagatcctg 5100
gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac atcaatacaa cctattaatt tcccctcgtc 5160
aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc atgagtgacg actgaatccg gtgagaatgg 5220
caaaagctta tgcatttctt tccagacttg ttcaacaggc cagccattac gctcgtcatc 5280
aaaatcactc gcatcaacca aaccgttatt cattcgtgat tgcgcctgag cgagacgaaa 5340
tacgcgatcg ctgttaaaag gacaattaca aacaggaatc gaatgcaacc ggcgcaggaa 5400
cactgccagc gcatcaacaa tattttcacc tgaatcagga tattcttcta atacctggaa 5460
tgctgttttc ccggggatcg cagtggtgag taaccatgca tcatcaggag tacggataaa 5520
atgcttgatg gtcggaagag gcataaattc cgtcagccag tttagtctga ccatctcatc 5580
tgtaacatca ttggcaacgc tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg gcgcatcggg 5640
cttcccatac aatcgataga ttgtcgcacc tgattgcccg acattatcgc gagcccattt 5700
atacccatat aaatcagcat ccatgttgga atttaatcgc ggcctggagc aagacgtttc 5760
ccgttgaata tggctcataa caccccttgt attactgttt atgtaagcag acagttttat 5820
tgttcatgat gatatatttt tatcttgtgc aatgtaacat cagagatttt gagacacaac 5880
gtggctttgt tgaataaatc gaacttttgc tgagttgaag gatcag 5926

Claims (4)

1.适用于聚球藻的生物封存系统的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)从聚球藻7942中获得毒性基因sepT2、抗毒基因sepA2以及缺铁诱导启动子PisiAB，从集胞藻6803中获得启动子PpsbA2；从整合型质粒pBA3031中扩增得到终止子Trbcl；所述毒性基因sepT2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述抗毒基因sepA2的核苷酸序列如SEQID NO:3所示；所述缺铁诱导启动子PisiAB的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述启动子PpsbA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述终止子Trbcl的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
(2)以pBR322为载体，用缺铁诱导启动子PisiAB表达毒性基因sepT2，用终止子Trbcl终止转录；用启动子PpsbA2表达抗毒基因sepA2，构建质粒pBR322-A2/T2；
(3)将所述质粒pBR322-A2/T2转入聚球藻。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(3)所述聚球藻为聚球藻7942或聚球藻2973。
3.权利要求1或2所述的方法构建的适用于聚球藻的生物封存系统。
4.权利要求3所述系统的应用。
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