CN1285407A - 热休克诱导外源基因高效表达的蓝藻转基因表达系统及其用于表达胸腺素α1的方法 - Google Patents
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Abstract
涉及一种基因工程,构建了包含蓝藻热休克基因groESL强启动区、目的基因UBTα1、rbcS终止区和Km标记基因的完整的可高效表达的蓝藻基因表达系统,并运用基因整合平台系统和穿梭质粒系统进行转基因表达胸腺素α1,由于利用热休克基因groESL的强启动子,易调控,经热诱导后能几十上百倍地加快转录,同时利用泛素融合技术,使目的基因Tα1得到高效表达,本发明工艺简单,可举一反三,具有很大的开发前景,为产业化开发转基因蓝藻开辟一条新途径。
Description
本发明涉及一种基因工程。
蓝藻(Cyanophyte)又称蓝细菌(Cyanobacterium)，是一种特殊的微生物。蓝藻的基因组简单，除了裸露的染色体DNA外不含叶绿体和线粒体DNA，便于进行基因分析。近年来，已克隆了大量蓝藻基因，建立了一些蓝藻的基因转移系统以及外源基因表达系统。蓝藻作为表达外源基因的受体菌已取得了不少研究成果。Tandeau de Marsac(Mol.Gen.Genet1987，209：296～298)以pUC303为载体在单胞藻Synechococcus sp.PCC7942(简称Synechococcus7942，其余藻名依此类推)中表达了原核生物芽孢杆菌杀幼蚊毒素基因；Fukuda等(Biotech.Lett1994，16：1～6)在Synechococcus 7942中表达了植物的乙烯合成酶基因；Takeshima(Proc.Natl.Acad.Sci USA 1994，91：9685～9689)把合成的人过氧化物歧化酶基因(h-SOD)置于1，5-核酮糖二磷酸羧化酶基因(rbc)的启动子下在Synechococcus 7942中表达，产物占总蛋白量的3％，并且有良好的胞内生物活性；Murphy(Appl.Environ.Microbiol1992，58：1650～1655)把枯草杆菌的cryIVD基因融合在Synechococcus sp.PCC7942的cpcB基因上表达，融合蛋白质的表达量高而且没有明显降解，并具有杀蚊效力；孙军等(生物工程进展，1994，14(6)：39～42)在Anabaena 7120中表达了小鼠的金属硫蛋白基因(mt-1)。这些研究工作表明包括真核基因在内的外源基因能在蓝藻中表达。
在目前的基因工程研究中，目的基因产物表达量一般可达细胞总蛋白量的20-30％。但存在一个问题，表达产物主要以无生物活性的包涵体形式存在，要得到活性产物必须进行体外折叠，成本高、得率低。而体内蛋白质折叠和装配须有其它蛋白质和酶参与，其中分子伴侣(Molecular Chaperones)就是非常重要的一种。它们是一类进化上很保守的蛋白质，广泛存在于原核与真核生物中，可催化、介导蛋白质特定构象的形成与稳定，参与体内蛋白质的折叠、装配与转运。迄今为止，发现大多数分子伴侣属于热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)。热休克蛋白具有在热诱导后，细胞内大部分蛋白质的合成受抑制，而其则可过量表达的特性。Webb等(J.Bateriol1990，172：5079～5088)对Synechococcus sp.PCC7942的热休克蛋白GroEL与GroES的基因克隆并测序，其序列如下：
-240 -200
GCTTCGCGAGCGCGACAACTGTCAGGAGGGCGATTTTGCC
ACAGTCCAGCGTATCACCGAAGGCTGCACCTTCCCGCAGC
-150
AAGATTCCCATTCCTGCGATCGCCGAGTTCGGGAACCCGT
“-35” “-100” “-10”
ACTGAGGTCGCGTTGCCCTCCGAGAAGGCGGCCCGTACAT
↓ -50
TAGCACTCAGGTACTGGGAGTGCTAATCCATGCGGATCAT
-1
CCCGGTTGCCCTCTCCCCGTGACGACGTTTACTCAAAACT研究表明groEL与groES组成一个操纵子，经Southern分析表明该操纵子在染色体中为单拷贝，并经引物延伸实验鉴定出groESL的启动子区域。Ellis(Science，1990，250：954～959)认为，由于热休克基因groESL的启动子属于强启动子，易调控，经热诱导后能几十上百倍地加快转录。同时根据热休克蛋白具分子伴侣的特性，如果外源基因产物与热休克蛋白同时表达，可以提高活性的外源蛋白产量。
胸腺(Thymus)是免疫系统中重要的中枢器官，负责T细胞的分化和成熟，在抗感染、抗肿瘤和抗自身免疫性疾病中起着重要作用。从胸腺素混合物中分离出的胸腺素α1，是一个二十八肽，它可以预防免疫抑制病人感染条件致病菌，提高机体的细胞免疫能力，可用于治疗多种疾病如红斑狼疮、乙肝、艾滋病等，还可作为治疗某些癌症的辅助药物。现在胸腺素制剂已广泛应用于临床，但均是从猪、牛的胸腺中提取的多组分胸腺肽，提取时易混入猪、牛的某些蛋白，注射后可能导致人产生过敏反应。采用人胚胎提取的人胸腺素虽疗效不错，但人胚胎来源困难，难以形成规模生产。用多肽合成仪可合成胸腺素α1，但价格太贵。王震熙等(浙江医科大学学报，1989，18(3)：106～109)把Tα1基因导入PWR590菌株，用SPA-ELISA改良法在转化的菌株中检测到Tα1的表达；Wetzel等(Biochemistry1980，19：6096～6104)根据Low和Goldstein(1979)确定的氨基酸序列人工合成了Tα1基因，与质粒pBR322连接后导入E.coli中表达，虽得到与天然Tα1活性相同的表达产物，但表达量低。
本发明的目的旨在提供一种包含热休克基因groESL强启动区、目的基因，终止子及筛选标记基因的完整的可高效表达的蓝藻基因表达系统及以基因整合平台系统和穿梭质粒系统进行表达胸腺素α1的方法。
下面为本发明的详细内容。
一、蓝藻基因表达系统的构建
根据Synechococcus sp.PCC7942 groESL操纵子中翻译起点ATG上游240bp片段两端的序列设计一对引物P1、P2：
P1 5′端引物：5′-TCGCGAGCTCGACAACTGTC-3′
SacⅠ
P2 3′端引物：5′-CCGCATGCTTTTGAGTAAACGTCGTCACGG-3′
SphⅠ以蓝藻Synechococcus sp.PCC7942基因组DNA为模板，以P1和P2引物进行特异性PCR扩增得含groESL启动区的PCR扩增片段。用HindⅢ酶切含卡那霉素抗性基因Kmr)，MCS和rbcS polyA终止区的质粒pKYLX-71-35S，电泳回收4.9kb片段，与经同样酶切的pUC19连接重组，连接物转化E.coli JM101以氨卞青霉素和卡那霉素筛选得重组质粒pUCMT1’。根据胸腺素α1基因片段两端的序列设计一对PCR引物T1和T2：
T1(5′端引物)：5’-GGGCATGCAAGGATCCGACGCAGCT
SphⅠ BamHⅠ
GTTGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAAGACTTAAAGG-3’
T2(3′端引物)：5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTCA
SalⅠ SpeⅠ
ACAACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3’以常规PCR扩增法进行扩增后得110bp的Tα1 DNA片段；运用pUC18多克隆位点两端的通用引物U1和U2：
U1(5′端引物)：5’-CGCCAGGGTTTTTCCCAGTCACGAC-3’
U2(3′端引物)：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’以含有人工合成的泛素基因(UB)克隆至pUC18质粒的SphⅠ/BamHⅠ位点之间所构建的质粒pUCUB为模板，按常规PCR方法扩增出含UB基因的328bp的DNA片段；纯化328bp的UB DNA片段和110bp的Tα1 DNA片段，用BamHⅠ同时酶切，然后用T4DNA连接酶连接，以连接产物为模板，以U1和T2’为引物进行特异性扩增，得380bp的UBTα1 DNA片段。
U1(5′端引物)：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’
T2’(3′端引物)：5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTC-3’
SalⅠ SpeⅠ
按图1所示的设计，用SphⅠ同时单酶切groESL启动区的PCR扩增片段和UBTα1 DNA片段后连接，以连接物为模板，P1、T2’为引物按常规PCR法扩增后得ESL-UBTa1片段。再将此片段插入到质粒pUCMT1’的SacⅠ-XbaⅠ位点之间，连接物转化受体菌E.coli JM101，在具有Ap与Km的培养基上筛选出双抗的克隆子，获得包含有热休克基因groESL的强启动区、目的基因UBTα1，终止区以及Km标记基因的完整表达载体质粒pEUTMT1。
二、蓝藻转基因表达胸腺素α1的方法
1．蓝藻基因整合平台表达系统
根据蓝藻Synechococcus sp.PCC7942的isiAB操纵子中1.5kb DNA片段两端的序列设计一对PCR引物I1、I2：
Ⅰ1 5′端引物：5′-GGAAGCTTCCCAGAAGTCACTTACGACTGG-3′
HindⅢ
Ⅰ2 3′端引物：5′-CTTCTAGAATGCCCATAGC-3′
XbaⅠ以Synechococcus sp.PCC7942的染色体DNA为模板，按常规的PCR技术进行扩增得1．5kb的isiAB部分片段；回收isiAB操纵子1.5kb的PCR扩增片段，按图2设计，用HindⅢ和XbaⅠ双酶切质粒pUC19和扩增片段，用T4 DNA连接酶连接，连接物转化受体菌E.coli JM101，用X-gal筛选出白色克隆子，得含有整合靶位的同源片段isiAB基因片段质粒pISIAB。用HindⅢ酶切回收表达载体pEUTMT1’的包含了groESL启动区、目的基因UBTα1、rbcS终止区和Km标记基因在内的完整表达元件的4.21kb的DNA片段，将其插入到质粒pISIAB的HindⅢ酶切位点当中，连接物转化受体菌E.coli JM101，在具有Ap与Km的培养基上筛选出双抗的克隆子，得供体质粒pEUTISI，该质粒大小为8.37kb。
2．蓝藻穿梭质粒表达系统
从织线藻Plectonema boryanum中提取出的内源小质粒pPBS1，其序列被测定并已收入于DNA数据库，编号为Genbank Accession No.AF176225，将质粒pPBS1克隆进质粒pBR322的ClaⅠ位点上，构建成穿梭质粒载体pPRS-1；按图3设计，用HindⅢ酶切下含有热休克基因groESL的强启动区、目的基因UBTa1、终止区以及Km标记基因的表达载体pEUTMT1的4.21kb的完整表达元件的DNA片段，再通过电泳分离回收，并插入到穿梭质粒载体pPRS-1的HindⅢ位点上，连接物转化受体菌E.coli JM101，在具有Km的培养基上筛选出克隆子，得到10.08kb大小的蓝藻穿梭表达质粒pPREUT。
3．重组质粒分别转化Synechococcus sp.PCC7942
将构建好的供体质粒pEUTISI和蓝藻穿梭表达质粒pPREUT分别转化蓝藻Synechococcussp.PCC7942，转化后，将蓝藻细胞与DNA混合液涂布于Millipore滤膜上，先在不含Km的BG-11固体培养基上恢复培养20hr，然后转移滤膜至含Km 15μg/ml的BG-11固体培养基上进行筛选培养。一周后，转化组的滤膜上出现抗Km的绿色单藻落，即为转化藻株。
为了证明外源基因已转化入蓝藻细胞中，提取转化藻株总DNA进行Southern杂交鉴定。以外源基因片段为探针，结果发现穿梭质粒组的转化子的杂交信号存在于蓝藻质粒中，表明外源基因是以质粒的形式存在于蓝藻细胞中的；而对整合平台系统的转化组而言，以isiAB基因区的1.5kb PCR片段为探针模板制备探针，杂交结果出现了比原对照杂交带更大的条带，证明供体质粒已通过同源序列交换定位整合到转化藻株的染色体整合靶位isiAB的DNA片段上。另外，通过蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳和Wesstem印迹法对转化藻株进行表达产物的检测鉴定。由于groESL启动子是热休克启动子，对转化藻株进行40℃ 30min热诱导，然后提取其水溶性蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果在11KD的位置上转化藻株出现了一条特异带，而野生藻株不见此带。为了验证这条带就是目的蛋白，进行了Western Blotting检测。结果转化藻株均出现了特异性杂交带，而野生藻株不出现此杂交带，说明目的蛋白UBTα1在蓝藻中得到了表达。为了初步确定表达量，我们应用凝胶扫描成像系统对蛋白电泳图谱进行分析，可知转化藻的藻株中UBTα1的表达量分别占其水溶性蛋白总量的17.6％和10％。因此可以认为胸腺素α1在蓝藻中已得到高效表达。
通过构建了包含热休克基因groESL的强启动区、目的基因UBTα1、终止区以及Km筛选标记基因的的完整的可高效表达的蓝藻基因表达系统，并运用基因整合平台系统和穿梭质粒系统进行蓝藻的转基因表达胸腺素α1。本发明利用热休克基因groESL的启动子属于强启动子，易调控，经热诱导后能几十上百倍地加快转录，同时利用泛素融合表达技术，使目的基因UBTα1得到高效表达，表达量分别达到17.6％和10％，且工艺简单、成本低，具有很大的开发前景，为产业化开发转胸腺素α1基因蓝藻开辟一条新的途径。
图1为热休克表达载体pEUTMT1’的构建图
图2为整合平台表达系统供体质粒pEUTISI的构建图
图3为蓝藻穿梭表达质粒pPREUT的构建图
下面通过实施例对本发明做进一步说明。实施例1、蓝藻基因表达系统的构建
蓝藻Synechococcus sp.PCC7942 groESL操纵子的启动子在热诱导下属强启动子，并且其核苷酸序列已被测定。蓝藻启动区序列一般位于转录起始点上游50bp以内。因此，为了克隆groESL启动区，就根据ATG上游240bp片段两端的序列设计一对引物P1、P2。P2的5端设计了一个SphⅠ酶切位点，其切点为GCATG↓C，可以保证不破坏ATG起始的阅读框以及ATG上游几个碱基的序列。GroESL启动区引物如下：
P1 5′端引物：5′-TCGCGAGCTCGACAACTGTC-3′
SacⅠ
P2 3′端引物：5′-CCGCATGCTTTTGAGTAAACGTCGTCACGG-3′
SphⅠ
将10ml培养至对数后期的Synechococcus sp.PCC7942蓝藻细胞离心沉淀并重悬浮于0.5m裂解液中。在1.5ml微离心管中经多次冻融步骤后，加5mg溶菌酶，充分漩涡振荡，37℃培养约30min。加SDS至1％，并加入蛋白酶K至100ug/ml，50℃培养至少2小时。进行2-3次酚仿和2次氯仿抽提。加1/3体积10.5mol/L乙酸铵和2体积2-丙醇到抽提后的水相中，置于-20℃至少15min，然后4℃离心20min。用70％乙醇洗沉淀2次，每次洗后离心5min。减压干燥沉淀，重悬于0.3ml TE缓冲液中。待作为PCR模板。
在0.5ml无菌离心管中依次加入：ddH2O 36ul；10×Taq酶缓冲液5ul；4×dNTP(2.5mmol/L)5ul；P1引物1ul；P2引物1ul；模板(蓝藻G-DNA)1ul；Taq酶(3U/ul)1ul
PCR反应参数：首先94℃预变性5min；接着94℃变性30S；50℃复性45S；72℃延伸50S；35个循环；最后72℃再延伸5min。
反应结束后，取5ml进行2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，在电泳图谱上出现一条略0．2kb片段，表明被扩增的片段是预期要克隆的片段，包含了groESL启动区。
除了启动区以外，还应含有相应的终止区以及报告基因、多克隆位点(Multiple CloningSites，MCS)等元件。质粒pKYLX-71-35S含有上述元件，因此将其进行亚克隆，把卡那霉素抗性基因(Kmr)，MCS和rbcS polyA终止区的4.9kb HindⅢ酶切片段亚克隆至pUC19中。
用HindⅢ酶切pKYLX-71-35S，电泳回收4.9kb片段，与经同样酶切的pUC19连接重组。连接物转化E.coli JM101以氨卞青霉素和卡那霉素筛选，挑出一系列克隆子，进一步提取克隆子质粒用一系列内切酶酶切鉴定，筛选得到重组质粒pUCMT1’，它分别可被SacⅠ和XbaⅠ酶切成一个片段，被HindⅢ酶切成两个片段。并且通过分子大小估算，正好是4.9kb和2.7kb之和7.6kb，证明此质粒为预期设计的重组质粒pUCMT1’，含有pKYLX-71-35S的Kmr、MCS和rbcS polyA诸元件。
根据胸腺素α1基因片段两端的序列设计一对PCR引物T1和T2：
T1(5′端引物)：5’-GGGCATGCAAGGATCCGACGCAGCT
SphⅠ BamHⅠ
GTTGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAAGACTTAAAGG-3’
T2(3′端引物)：5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTCA
SalⅠ SpeⅠ
ACAACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3’以常规PCR扩增法进行扩增后得110bp的Tα1 DNA片段；运用pUC18多克隆位点两端的通用引物U1和U2：
U1(5′端引物)：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’
U2(3′端引物)：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3，以含有人工合成的泛素基因(UB)克隆至pUC18质粒的SphⅠ/BamHⅠ位点之间所构建的质粒pUCUB为模板，按常规PCR方法扩增出含UB基因的328bp的DNA片段；纯化328bp的UBDNA片段和110bp的Tα1 DNA片段，用BamHⅠ同时酶切，然后用T4DNA连接酶连接，以连接产物为模板，以U1和T2’为引物进行特异性扩增，得380bp的UBTα1 DNA片段。
U1(5′端引物)：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’
T2’(3′端引物)：5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTC-3’
SalⅠ SpeⅠ
如图1设计，将groESL启动区的PCR扩增片段与UBTa1 PCR片段连接，再通过PCR法扩增它们的连接片段。
将UBTa1与groESL启动区的经回收后的PCR产物同时用SphⅠ做单酶切两小时，于2％琼脂糖凝胶上电泳，回收相应片段后14℃连接过夜。然后以P1、T2’为引物按常规PCR技术进行扩增ESL-UBTα1(570bp)：
在0.5ml无菌离心管中依次加入ddH2O 34μl；10×Taq酶缓冲液5μl；MgCl2(25mmol/L)3μl；4×dNTP(2.5mmol/L)4μ1；P1引物1μl；T2’引物1μl；模板(ESL-UB-Tα1连接物)1μl；Taq酶1μl；总体积50μl；最后覆盖石蜡油30μl，防止蒸发。
PCR反应参数：首先94℃预变性8min；接着94℃变性45sec；55℃复性45sec；72℃延伸45sec；35个循环；最后72℃再延伸5min。
反应结束后取5μl进行2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，在电泳图谱上出现570bp大小的DNA亮带，表明启动区已经与目的基因连接成功，获得ESL-UBTa1片段。再将此片段插入到质粒pUCMT1’的SacⅠ-XbaⅠ位点之间，连接物转化受体菌E.coli JM101，在具有Ap与Km的培养基上筛选出双抗的克隆子。由于SpeⅠ和XbaⅠ为同尾酶，用这两种酶酶切后连接的片段上其识别序列均会消失，因此若用XbaⅠ酶切转化子质粒，可将克隆了外源基因的重组质粒与自身环化的载体区分开，重组质粒不能被XbaⅠ酶切，而自身环化的载体可被XbaⅠ切成线型。此外，还可用HindⅢ单酶切和以E1、T2’为引物进行PCR分析进行鉴定。可以看出克隆子经HindⅢ酶切后与载体用HindⅢ酶切后不同，而且两个片段大小符合预期设计，且克隆子用XbaⅠ酶切不能切动，为确证其是重组子pEUTMT1，在以E1、T2’为引物做PCR试图扩增出ESL-UBTα1(570bp)片段。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，在电泳图谱该大小位置上出现一条特异性亮带，与预期相符，而以载体为模板扩增ESL-UBTα1未见有该特异性亮带。因此就获得了包含有热休克基因groESL的强启动区、目的基因UBTa1，终止区以及Km标记基因的完整表达载体质粒pEUTMT1。实施例2、蓝藻转基因表达胸腺素α1
1、蓝藻基因整合平台表达系统的构建
蓝藻Synechococcus sp.PCC7942的isiAB操纵子已定序，被确定为基因整合平台系统的整合靶位。选用其中1.5kb作为整合靶位同源DNA片段。
根据isiAB操纵子中1.5kb DNA片段两端的序列设计一对PCR引物I1，I2：
I1 5′端引物：5′-GGAAGCTTCCCAGAAGTCACTTACGACTGG-3′
HindⅢ
I2 3′端引物：5′-CTTCTAGAATGCCCATAGC-3′
XbaⅠ
PCR扩增isiAB 1.5kb的区段：
(1)除了引物改为I1，I2外，其余的PCR反应组分同实施例1
(2)PCR反应参数：94℃预变性5min；接着94℃变性1min；55℃复性1min；72℃延伸3min；35个循环；最后72℃再延伸5min。
(3)反应结束后，取5ul进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，在电泳图谱上出现唯一的1．5kb片段。表明此DNA片段是预期扩增的isiAB部分片段。
回收isiAB操纵子1.5kb的PCR扩增片段。根据预先引物设计，扩增片段两端分别具HindⅢ和XbaⅠ酶切位点，而pUC19的MCS区也具这两种内切酶的单一切点。按图2设计，用HindⅢ和XbaⅠ双酶切pUC19和扩增片段，用T4 DNA连接酶连接。连接物转化受体菌E.coliJM101，用X-gal筛选，获得几十个白色克隆子。其中任选若干克隆子检测质粒，并根据isiAB操纵子1.5kb片段中具特有的StuⅠ识别序列，用StuⅠ进行酶切分析，获得能被StuⅠ酶单切的质粒，结果显示，被检测的克隆子中，所含质粒能被StuⅠ酶切，并且其分子大小为4.2kb，正好是pUC19和isiAB1.5kb片段之和，表明该质粒是预期设计的质粒pISIAB，该质粒含有整合靶位的同源片段isiAB基因片段。
利用基因整合平台系统表达外源基因，需将完整的表达系统插入到含整合靶位同源DNA片段的质粒中。按图2设计，用HindⅢ酶切回收表达载体pEUTMT1’的4.21kb的片段，其中包含了ESL启动区、目的基因UBTα1、rbcS终止区和Km标记基因在内的整套表达系统，再插入到质粒pISIAB的HindⅢ酶切位点当中，连接物转化受体菌E.coli JM101，在具有Ap与Km的培养基上筛选出双抗的克隆子。提取质粒进一步用内切酶酶切鉴定，最终得到能有效表达目的基因的供体质粒pEUTISI，该质粒大小为8.37kb。
2、蓝藻穿梭质粒表达系统的构建
蓝藻穿梭表达载体除了含有蓝藻质粒和大肠杆菌源质粒的复制起始位点外，还包括抗性选择标记、启动区、供目的基因插入的多克隆位点(Multiple Cloning Sites，MCS)以及相应的终止区等表达元件。
从织线藻Plectonema boryanum中提取出的内源小质粒pPBS1，其序列被测定并已收入于DNA数据库，编号为Genbank Accession No.AF176225，将质粒pPBS1克隆进质粒pBR322的ClaⅠ位点上，构建成穿梭质粒载体pPRS-1。
按图3设计，首先，用HindⅢ酶切下表达载体pEUTMT1的4.21kb的完整表达元件的DNA片段，再通过电泳分离回收，并插入到穿梭质粒载体pPRS-1的HindⅢ位点上，经转化筛选及酶切分析鉴定，最后得到10.08kb大小的蓝藻穿梭表达质粒pPREUT。
3、重组质粒分别转化Synechococcus sp.PCC7942
在最适条件下培养蓝藻Synechococcus sp.PCC 7942至OD730=0.25～0.35。离心收集藻细胞，用10ml 10mmol/L NaCl洗一次。离心并浓缩藻细胞于原1/10体积的新鲜BG-11培养基中。将构建好的重组质粒分别转化蓝藻Synechococcus sp.PCC7942，混匀。避光孵育过夜，供随后筛选转化子。
将孵育后的蓝藻与DNA混合液涂布于覆盖在BG-11固体培养基上的Millipore滤膜(Φ9cm，孔径0.45μm)上，正常生长条件下培养20hr。转移滤膜至含卡那霉素15μg/ml的BG-11固体培养基上，培养7-10天后转化单藻落出现，挑取生长好的藻落移入2ml BG-11液体培养基中(含10～15μg/ml卡那霉素)，经常摇动，培养7天。挑生长最好的藻株进行逐级扩大培养(加Km至15μg/ml)。实施例3、转化藻株的Southern杂交鉴定
为了进一步证明外源基因已转化入蓝藻细胞中，提取转化藻株总DNA进行Southern杂交鉴定。以外源基因片段为探针，结果发现穿梭质粒组的转化子的杂交信号存在于蓝藻质粒中，表明外源基因是以质粒的形式存在于蓝藻细胞中的；而对另一组转化子，即整合平台系统的转化组而言，以isiAB基因区的1.5kb PCR片段为探针模板制备探针，杂交结果出现了比原对照杂交带更大的条带，证明供体质粒已通过同源序列交换定位整合到转化藻株的染色体整合靶位isiAB的DNA片段上。实施例4、转化藻株的SDS-PAGE检测和Western blot杂交鉴定
重组质粒虽已转化入受体蓝藻细胞中，但目的基因能否表达或能否高效表达，尚不能确定，必须通过其蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳和Wesstern印迹法对转化藻株进行表达产物的检测鉴定。
由于groESL启动子是热休克启动子，我们对转化藻株进行40℃ 30min热诱导，然后提取其水溶性蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果在11KD的位置上转化藻株出现了一条特异带，而野生藻株不见此带。为了验证这条带就是目的蛋白，我们进行了Western Blotting检测。结果转化藻株均出现了特异性杂交带，而野生藻株不出现此杂交带，说明目的蛋白UBTα1在蓝藻中得到了表达。为了初步确定表达量，我们应用凝胶扫描成像系统对蛋白电泳图谱进行分析，可知转化藻的藻株中UT的表达量分别占其水溶性蛋白总量的17.6％和10％。因此可以认为胸腺素α1在蓝藻中已得到高效表达。
Claims (3)
1．热休克诱导外源基因高效表达的蓝藻转基因表达系统，其特征在于根据蓝藻Synechococcus sp.PCC7942的groESL操纵子中ATG上游240bp片段两端的序列设计一对引物P1、P2：
P1 5′端引物：5′-TCGCGAGCTCGACAACTGTC-3′SacⅠ
P2 3′端引物：5′-CCGCATGCTTTTGAGTAAACGTCGTCACGG-3′SphⅠP2的5′端设计了一个SphⅠ酶切位点，其切点为GCATG↓C；以蓝藻Synechococcus sp.PCC7942基因组DNA为模板，以p1和p2引物进行特异性PCR扩增得含groESL启动区的PCR扩增片段；用HindⅢ酶切质粒pKYLX-71-35S，电泳回收4.9kb片段，与经同样酶切的pUC19连接重组，连接物转化E.coli JM101，以氨卞青霉素和卡那霉素筛选得重组质粒pUCMT1’；根据胸腺素α1基因片段两端的序列设计PCR引物T1、T2和T2’：
T1(5′端引物)：5’-GGGCATGCAAGGATCCGACGCAGCTSphⅠ BamHⅠGTTGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAAGACTTAAAGG-3’T2(3′端引物)：5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTCASalⅠ SpeⅠACAACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3’T2’(3′端引物)：5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTC-3’SalⅠ SpeⅠ以常规PCR扩增法进行扩增后得110bp的Tα1 DNA片段；运用pUC18多克隆位点两端的通用引物U1和U2：
U1(5′端引物)：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’
U2(3′端引物)：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’以质粒pUCUB为模板，按常规PCR方法扩增出含UB基因的328bp的DNA片段；纯化UBDNA片段和Tα1 DNA片段，用BamHⅠ同时酶切，然后用T4DNA连接酶连接，以连接产物为模板，以U1和T2’为引物进行特异性扩增，得380bp的UBTα1 DNA片段；用SphI同时单酶切groESL启动区的PCR扩增片段和UBTα1 DNA片段，连接后以连接物为模板，P1、T2，为引物按常规PCR法扩增后得ESL-UBTα1片段，将ESL-UBTα1片段插入到质粒pUCMT1’的SacⅠ-XbaⅠ位点之间，连接物转化受体菌E．coli JM101，在具有Ap与Km的培养基上筛选出双抗的克隆子，获得包含热休克基因groESL的强启动区、目的基因UBTα1，终止区以及Km标记基因的蓝藻的完整表达载体质粒pEUTMT1。
2．如权利要求1所述的热休克诱导外源基因高效表达的蓝藻转基因表达系统，其特征在于所说的质粒pUCUB为以人工合成的泛素基因UB克隆至pUC18质粒的SphⅠ/BamHⅠ位点之间所构建的质粒。
3．如权利要求1所述的热休克诱导外源基因高效表达的蓝藻基因表达系统用于表达胸腺素α1的方法，其特征在于以蓝藻基因整合平台表达系统或蓝藻穿梭质粒表达系统进行表达胸腺素α1，其方法如下：
(1)蓝藻基因整合平台表达系统
根据蓝藻Synechococcus sp.PCC7942的isiAB操纵子中1.5kb DNA片段两端的序列设计一对PCR引物I1、I2：
I1 5′端引物：5′-GGAAGCTTCCCAGAAGTCACTTACGACTGG-3′HindⅢ
I2 3′端引物：5′-CTTCTAGAATGCCCATAGC-3′XbaⅠ以Synechococcus sp.PCC7942的染色体DNA为模板，以Ⅰ1和Ⅰ2为引物按常规的PCR技术进行扩增得1.5kb的isiAB部分片段；回收isiAB操纵子1.5kb的PCR扩增片段，用HindⅢ和XbaⅠ双酶切质粒pUC19和扩增片段，用T4 DNA连接酶连接，连接物转化受体菌E.coliJM101，用X-gal筛选出白色克隆子，得含有整合靶位的同源片段isiAB基因片段质粒pISIAB；用HindⅢ酶切回收表达载体pEUTMT1的包含了groESL启动区、目的基因UBTα1、rbcS终止区和Km标记基因在内的完整表达元件的4.21kb的DNA片段，将其插入到质粒pISIAB的HindⅢ酶切位点当中，连接物转化受体菌E.coli JM101，在具有Ap与Km的培养基上筛选出双抗的克隆子，得供体质粒pEUTISI，该质粒为8.37kb；
(2)蓝藻穿梭质粒表达系统
从织线藻Plectonema boryanum中提取出的内源小质粒pPBS1，其序列被测定并已收入于DNA数据库，编号为Genbank Accession No.AF176225，将质粒pPBS1克隆进质粒pBR322的ClaⅠ位点上，构建成穿梭质粒载体pPRS-1；用HindⅢ酶切下含有热休克基因groESL的强启动区、目的基因UBTa1、终止区以及Km标记基因的表达载体pEUTMT1的4．21kb的完整表达元件的DNA片段，再通过电泳分离回收，并插入到穿梭质粒载体pPRS-1的HindⅢ位点上，连接物转化受体菌E.coli JM101，在具有Km的培养基上筛选出克隆子，得到10.08kb的蓝藻穿梭表达质粒pPREUT；
(3)重组质粒分别转化Synechococcus sp.PCC7942
将构建好的供体质粒pEUTISI和蓝藻穿梭表达质粒pPREUT分别转化蓝藻Synechococcussp.PCC7942，转化后，将蓝藻细胞与DNA混合液涂布于Millipore滤膜上，先在不含Km的BG-11固体培养基上恢复培养20hr，然后转移滤膜至含Km 15μg/ml的BG-11固体培养基上进行筛选培养，一周后，转化组的滤膜上出现抗Km的绿色单藻落，即为转化藻株。
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