CN105755015B - 表达鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的重组酵母菌株及其所表达的蛋白和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的重组酵母菌株及其所表达的蛋白和用途。本发明所述的重组酵母菌株，含有经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列，其能够高效表达VP2蛋白，且表达的重组VP2蛋白可以自我组装成病毒样颗粒。将本发明重组酵母菌株所表达的鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒蛋白制成疫苗免疫鸡，实验结果表明：本发明蛋白亚单位疫苗能有效诱导机体产生特异性的体液免疫应答，使免疫鸡获得100％的抵抗高致病力vvIBDV致死性攻击的保护，并可清除体内残留的病毒，达到清除性免疫的目的。因此，本发明的提出为鸡传染性法氏囊病的防治提供了一种新的技术手段。

Description

表达鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的重组酵母菌株及其所 表达的蛋白和用途

技术领域

本发明涉及一种重组酵母菌株及其所表达的蛋白和用途，特别涉及一种表达鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的重组酵母菌株，还涉及由该酵母菌株所表达得到的鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒及其在预防鸡传染性法氏囊病中的用途。本发明属于医学或兽医学技术领域。

背景技术

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的能够引起鸡体免疫抑制的重要的病毒病，严重危害着世界的养鸡业。传统疫苗在防治该病的历史中起到非常重要的作用，随着该病近年来呈现的新的变化-血清型变异株，超强毒株的出现，使得对该病的防治越来越棘手，传统疫苗的研制速度已经有些难于跟上该病的变化。快速的开发新型有效的能防治变异和超强毒株的新型疫苗的要求尤为迫切。蛋白亚单位基因工程疫苗是去除遗传物质但又保留病毒抗原性的安全疫苗，不存在散毒的危险。该疫苗的开发和应用将为防治当前流行的鸡传染性法氏囊病提供有效的工具和手段，并可为防治禽类免疫抑制病提供有效的参考和经验。

甲醇酵母(Pichia pastoris)表达系统是近几年发展起来的一个真核表达系统，它不仅像原核生物一样操作简便、容易培养、生长快速、成本低廉、适于大规模工业化发酵生产，而且能对重组蛋白进行正确的折叠和翻译后加工修饰，如糖基化、甲基化以及β-折叠等。酵母表达系统是所有表达系统中表达量最高的，可以达到克/升以上，有的表达量高达12克/升。酵母表达载体有分泌型和非分泌型，分泌型可以将所表达的蛋白分泌到液体培养基中去，且酵母本身分泌的蛋白非常少，杂蛋白非常少，易于纯化。Pichia pastoris具有可利用甲醇作为碳源和能源等独特的优势，被认为是分泌表达或非分泌表达外源基因的一种优秀工程菌。

Jagadish等用不同载体在酵母中表达了IBDV的大片段，结果表明，以非融合蛋白形式表达的多聚蛋白经翻译后或翻译过程中的加工，可产生正确的VP3，但检测不到VP2。但以融合蛋白形式表达的蛋白前体可产生稳定的VP2和VP3，说明在表达的多聚蛋白的N末端需要有部分酵母蛋白序列的保护，否则可能会被蛋白酶水解。Macreadie等用酵母表达了IBDV大片段。用转化的酵母裂解液100-200μL(相当于50μgVP2)与弗氏不完全佐剂乳化后注射SPF鸡，可刺激产生很高的ELISA抗体和中和抗体。用1mL免疫鸡的血清腹腔注射1日龄雏鸡，第二天用100CID₅₀的IBDV攻毒，三天后检测法氏囊含毒量。结果表明，免疫鸡血清可对雏鸡提供很好的保护。Fahey等用酵母表达了IBDV VP2，制成油佐剂苗后免疫10周龄SPF鸡。免疫2周后可检测到抗体，然后持续上升，免疫后6周ELISA抗体滴度达高峰，中和抗体效价8周后达到高峰。但以上这些疫苗只能提供临床保护，并不能提供很好的组织病理学保护，也不能清除体内的病毒，无法达到消除免疫的目的。

本发明通过重组酵母菌株表达改造后的鸡传染性法氏囊病毒VP2基因，其表达的重组VP2蛋白可自我组装成病毒样颗粒(VLP)，动物免疫攻毒实验结果表明，本发明的鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒可以实现消除性免疫。在生产工艺上，本发明的重组酵母菌株可以通过发酵培养高表达鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒，比起用SPF鸡法氏囊或细胞培养物制备的传统IBD疫苗，酵母菌的培养简单、方便，所需培养基价格也较低，表达产物经过粗提即可使用，适合大规模生产。因此，用酵母表达生产的IBD亚单位苗将具有更好的应用前景。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列；

本发明的目的之二是提供一种含有经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列的重组酵母菌株，其表达的重组VP2蛋白可以自我组装成病毒样颗粒(VLP)。

本发明的目的之三是提供由所述的重组酵母菌株表达的鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒(VLP)。

本发明的目的之四是提供由所述的鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒在制备抗鸡传染性法氏囊病蛋白亚单位基因工程疫苗中应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列，其是按照毕赤酵母密码子偏嗜表进行优化后，并通过融合PCR的方法将序列GAATTCGCCACCATGTCTTACTACCACCACCACCACCACCACGACTACGACATTCCAACTACTGAGAACTTGTACTTCCAAGGTGCTATGGGTTCT融合到VP2序列的5’端所得到的，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

将该经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列整合入酵母基因组中，研究发现该重组酵母菌表达的重组VP2蛋白可以自我组装成病毒样颗粒(VLP)，因此，进一步的，本发明还提出了所述的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列在制备鸡传染性法氏囊病病毒病毒样颗粒中的用途。

更进一步的，本发明提出了一种表达鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的重组酵母菌株，其含有1-7个拷贝的本发明所述的经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列(SEQ ID NO.1所示)。

在本发明中，优选的，所述的表达鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的重组酵母菌株含有7个拷贝的本发明所述的经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列。

在本发明中，优选的，所述的表达鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的重组酵母菌株，是通过以下方法构建得到的：

(1)获得经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，命名为optiVP2基因；

(2)将optiVP2基因和酵母载体连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过碱裂解法提取重组质粒，限制性内切酶切下完整的optiVP2基因表达盒，同时酶切已经得到的含有optiVP2基因的重组质粒，进行连接反应，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，重复6次构建得到含有7个表达盒的表达质粒，命名为pAO815optiVP2*7；

(3)将重组酵母载体pAO815optiVP2*7线性化，转化酵母感受态细胞，获得基因组中整合了7个optiVP2表达盒的重组酵母。

在本发明中，优选的，所述的酵母载体为pAO815，所述的酵母感受态细胞为SMD1168酵母感受态细胞。

在本发明中，优选的，pAO815optiVP2*7是通过以下方法构建得到的：

(1)将optiVP2基因和酵母载体pAO815分别用EcoRⅠ酶切，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，载体用CIAP去磷酸化，optiVP2基因片段及载体用T₄DNA连接酶进行连接反应；将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过碱裂解法提取重组质粒；

(2)用BglⅡ和BamHⅠ切下完整的optiVP2基因表达盒，用BamHⅠ单酶切已经得到的含有optiVP2基因的重组质粒，用CIAP去磷酸化，optiVP2基因表达盒及载体通过T₄DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞；

(3)重复步骤(2)6次构建得到含有7个表达盒的表达质粒，命名为pAO815optiVP2*7。

在本发明中，更优选的，所述的表达鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的重组酵母菌株命名为SMD1168/IBDVNP7-44，分类命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏号是：CGMCC NO.12175，保藏时间是：2016年3月3日。

再进一步的，本发明提出了由以上任一项所述的重组酵母菌株表达得到一种鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒蛋白及其在制备抗鸡传染性法氏囊病蛋白亚单位基因工程疫苗中应用。

在本发明中，优选的，所述的鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒由以上任一项所述的重组酵母菌株通过以下方法得到：将所述的重组酵母菌株接种于BMGY培养基中，30℃，300rpm摇瓶培养，培养菌密度至OD₆₀₀为4时离心，用BMMY培养基重新悬浮酵母细胞至OD₆₀₀＝1，继续摇瓶培养，每12小时补加无水甲醇至0.5％(v/v)浓度，BMMY培养基诱导120小时后，离心收集菌体，提取蛋白，即得。

综上，本发明公开了一种新的可以表达鸡传染性法氏囊病病毒VLP的酵母菌株，其表达的重组VP2蛋白可以自我组装成VLP。本发明鸡传染性法氏囊病病毒VLP能够在酵母细胞中高效表达，所表达的重组蛋白具有鸡传染性法氏囊病病毒天然蛋白的生物学活性和免疫原性。将本发明所表达的重组蛋白制成疫苗，免疫鸡实验结果表明：本发明蛋白亚单位疫苗能有效诱导机体产生特异性的体液免疫应答，使免疫鸡获得100％的抵抗高致病力vvIBDV致死性攻击的保护，对法氏囊组织有完全保护，并可清除体内残留的病毒，达到清除性免疫的目的。

附图说明

图1为pAO815optiVP2*7质粒构建图谱；

图2A为酵母表达的IBDV-VP2重组蛋白的SDS-PAGE检测结果；

泳道M:protein marker；泳道1:阴性对照P.pastoris酵母SMD1168细胞裂解液；泳道2:重组酵母SMD1168-IBDVP2细胞裂解液；

图2B为酵母表达的IBDV-VP2重组蛋白的Western blot检测结果；

泳道M:protein marker；泳道1:阴性对照P.pastoris酵母SMD1168细胞裂解液；泳道2:重组酵母SMD1168-IBDVP2细胞裂解液；

图2C为酵母表达的IBDV-VP2重组蛋白的电子显微镜负染结果(标尺为40nm)；

C1:IBD-sVP；C2：IBDV阳性对照；C3：酵母裂解液阴性对照；

图3为各组动物在免疫后的不同时间点的ELISA抗体和IBDV中和抗体水平。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1鸡传染性法氏囊病病毒optiVP2的合成与克隆

1、病毒RNA的提取

将感染鸡传染性法氏囊病病毒超强毒Gx(vvIBDV-Gx)株的SPF鸡法氏囊用研磨器研磨。取200μl病料补加TE(PH8.0)至500μl，加入5μl蛋白酶K和10％SDS50μl，56℃水浴3小时。加入等体积酚/氯仿抽提3次，等体积氯仿抽提一次。移出上清至另一1.5ml离心管，加入1/10体积NaAc(3M,PH5.2)、等体积异丙醇，-20℃沉淀2小时。4℃、12000转/分、离心15分钟，用75％乙醇洗一次。真空干燥，将RNA用无RNA酶去离子水重新溶解。

2、基因组A片段RF243基因的获得

对提取的病毒RNA进行RT-PCR，应用随机引物进行RT反应，反应体系为20μl，按照superscriptTMⅡ反转录试剂说明进行操作。设计特异性扩增RF243PCR引物，引物序列为：

Paf:5`-gcggaattcgatgacgaacctgcaagatcaaac-3`,

Par:5`-ccgaattccaaggtcctcatcagagacagcc-3`

以RT产物为模板，加入10μl至PCR反应体系中，PCR反应体系为100μl,其他溶液按照Expand High Fidelity PCR System说明书添加，反应条件如下：预变性94℃3min，循环参数为94℃10sec、55℃20sec、72℃3min，循环30次，72℃延伸7min。

经过RT-PCR扩增IBDV-Gx株病毒RNA得到长度为3.1Kb的片段，该片段包含IBDV A片段基因完整的大开放阅读框。

应用华舜琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，按照说明书操作。PCR产物与pMD18-T连接，转化大肠杆菌感受态细胞。碱裂解法提取质粒，用PCR进行鉴定，PCR鉴定引物及条件同上，鉴定正确重组质粒送交大连TaKaRa生物公司测序。

3、VP2基因的优化改造及合成

将毕赤酵母密码子偏嗜表输入DNAstar软件Editseq中，以步骤2中测得序列为原型，以软件进行分子改造和修饰，获得的新基因序列送交上海博亚生物公司合成。

4、optiVP2基因的扩增

以优化基因序列为模板设计特异性扩增VP2基因引物，在引物两端引入EcoRⅠ酶切位点。引物序列为:optiVP2-F:5`-TTTGAATTCGCCACCATGTCTAACTTGCAAGACCAAAC-3`,optiVP2(466)-R:5`-TTTGAATTCTTAGGCGGGTGGGAACAATGTAGATAC-3`。以人工合成的基因为模板进行PCR扩增，反应体系100μl，模板2μl，其它溶液按照Expand High Fidelity PCRSystem说明书添加，反应条件如下：预变性94℃，3min，循环参数为94℃10sec、55℃20sec、72℃1min，循环30次，72℃延伸7min。通过融合PCR的方法将序列GAATTCGCCACCATGTCTTACTACCACCACCACCACCACCACGACTACGACATTCCAACTACTGAGAACTTGTACTTCCAAGGTGCTATGGGTTCT融合到VP2序列的5’端，得到优化后的VP2基因序列，命名为optiVP2，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

实施例2重组酵母的构建及鉴定

1、重组酵母载体的构建

将optiVP2基因(SEQ ID NO：1所示)和酵母载体pAO815(Invitrogen,CA,USA)分别用EcoRⅠ酶切，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收。载体用CIAP去磷酸化。外源片段及载体用T₄DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，构建得到含有一个拷贝optiVP2基因的重组质粒pAO815optiVP2*1。通过碱裂解法提取重组质粒，用Bgl Ⅱ和BamHⅠ切下完整的表达盒；用BamH Ⅰ单酶切重组质粒pAO815optiVP2*1，用CIAP去磷酸化。通过T₄DNA连接酶进行连接反应。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，构建得到含有两个拷贝optiVP2基因的重组质粒pAO815optiVP2*2。重复6次构建得到含有7个optiVP2基因表达盒的重组质粒，命名为pAO815optiVP2*7。质粒构建图谱见图1。

2、重组质粒的提取及鉴定

将氨苄青霉素加入LB中终浓度50mg/ml，挑取含有pAO815optiVP2*7的单菌落接种LB。碱裂解法提取质粒。用PCR方法进行鉴定，PCR鉴定引物及条件同实施例1，PCR扩增出1.5Kb条带，将鉴定正确质粒送交大连TaKaRa生物公司测序，测序结果表明扩增的基因符合合成基因测序的结果，基因插入正确，与载体读码框相符。双酶切鉴定，在2.2Kb，4.3Kb和18.9Kb处分别出现一条条带，符合7个optiVP2基因表达盒首尾相连的预期，证明质粒构建正确。

3、转化酵母感受态细胞

将重组酵母载体pAO815optiVP2*7用Sal Ⅰ酶切线性化，转化SMD1168酵母感受态细胞(Invitrogen,CA,USA)，按照Invitrogen公司毕赤酵母电转化指导方法进行。将转化后酵母菌涂布MD平板。

4、酵母重组子的筛选和鉴定

挑取10个酵母单菌落，接种5ml含有抗生素的YPD，过夜培养，离心，弃去培养液，用5ml灭菌去离子水洗一次。应用蛋白酶K、SDS过夜消化酵母菌，离心，将上清液转至另一1.5ml离心管，酚、氯仿抽提3次，无水乙醇沉淀。应用AOX1 5`及3`引物进行PCR，PCR条件为：预变性94℃3min，循环参数为94℃1min、55℃1min、72℃1min，循环30次，72℃延伸7min。

应用蛋白酶K-SDS消化酵母菌，提取酵母DNA，用AOX1 5`和optiVP2(466)-R:5`-TTTGAATTCTTAGGCGGGTGGGAACAATGTAGATAC-3`引物进行PCR，当外源基因片段整合进入酵母基因组，则PCR产物中应当有一条18257bp左右的DNA片段，通过筛选，共获得了68株基因组中整合了7个optiVP2表达盒的重组酵母菌株。

5、酵母重组子的小规模诱导表达

将PCR鉴定正确的重组酵母菌株接种于25ml BMGY中，30℃摇瓶培养(300rpm)，培养菌密度至OD₆₀₀为4时离心(3000g，5min)，用50ml BMMY重新悬浮酵母细胞，OD₆₀₀＝1，继续30℃摇瓶培养(300rpm)。每12小时补加0.5％(v/v)无水甲醇。BMMY诱导120小时后，离心收集菌体，冻存于-70℃冰箱。

6、表达蛋白的提取及鉴定

将小规模诱导收获的菌体用yeast buster提取蛋白，取40μl，加入5倍SDS上样缓冲液10μl，煮沸10分钟，进行SDS-PAGE电泳、Western blot(参照《分子克隆》第二版)、BCA法测定表达量和电子显微镜负染观察，阳性重组酵母菌株表达的VP2重组蛋白可以和抗IBDV单克隆抗体反应，见图2A以及图2C。不同株酵母相同时间表达蛋白的表达量虽有所不同，但诱导120小时后蛋白表达水平均能够达到1g/L以上，凭借SDS-PAGE筛选到表达量高的菌株优化为工程菌株，通过BCA法测定总蛋白量和薄层扫描确定目标蛋白的表达量达到1.32g/L，将该株表达鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的重组酵母菌株命名为SMD1168/IBDVNP7-44，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号是：CGMCCNO.12175。Western-blot结果证明表达的VP2重组蛋白能够和特异性抗体发生免疫反应。电子显微镜负染结果显示表达的VP2重组蛋白能够形成直径为20nm左右的病毒样颗粒(IBD-sVP)，见图2C。

实施例3本发明重组蛋白免疫原性的测定

将实施例2所制备的病毒样颗粒(IBD-sVP)分成两组：1组用灭菌水稀释到20μg/ml，2组与油佐剂1:1乳化，乳化后蛋白浓度为20μg/ml。

取4周龄SPF鸡，分组，每组10只。A，B，C，D组为本发明病毒样颗粒组：A组免疫IBD-sVP 20μg/1ml/只，无佐剂，免疫两次；B组免疫IBD-sVP 20μg/1ml/只，有佐剂，免疫两次；C组免疫IBD-sVP 20μg/1ml/只，无佐剂，免疫一次；D组免疫IBD-sVP20μg/1ml/只，有佐剂，免疫一次。E组为常规灭活疫苗(鸡传染性法氏囊病灭活疫苗，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所维科生物技术开发公司)免疫组，免疫剂量为1ml/只。免疫途径均为肌肉注射法。F组为无免疫攻毒对照组。G组为无免疫无攻毒对照组。实验动物分组情况如下表1所示。

表1实验动物分组

^a死亡率：每组中死亡鸡数/总数。

^b囊重比：每组中法氏囊的重量/体重×1000。用平均数±标准差表示。

^c组织病理学评价：1：正常-10％囊泡萎缩。2：10-30％囊泡萎缩。3:30-70％囊泡萎缩。4：超过70％囊泡萎缩。

^d保护率：组织病理学评价为1，囊重比不低于阴性对照2个标准差。表示为受保护的鸡数/总数。

^eIBDV残留：PCR检测IBDV呈阳性的鸡数/攻毒后7天存活的鸡数。

各组免疫后每7天采血，检测ELISA抗体和中和抗体，并于首免后第28天攻毒。攻毒后连续观察7天，记录死亡数。试验在负压隔离器(澳大利亚进口)中进行。结果如下表2及图3所示。

表2攻毒保护评价

上述结果表明，免疫28天后攻毒，攻毒后7天，常规灭活苗免疫组存活率为90％，组织保护率为44％，本发明亚单位疫苗免疫组存活率为100％，组织保护率为100％，未免疫攻毒对照组存活率为20％。攻毒结果表明，用本发明IBDV重组VP2蛋白免疫SPF鸡，不仅可以产生抵抗超强毒IBDV致死攻击的免疫保护力，还能对法氏囊组织提供完全保护。

Claims (5)

1.一种制备鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒蛋白的方法，其特征在于通过以下方法得到：

将表达鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的重组酵母菌株接种于BMGY培养基中，30℃，300 rpm摇瓶培养，培养菌密度至OD₆₀₀为4时离心，用BMMY培养基重新悬浮酵母细胞，继续摇瓶培养，每12小时补加无水甲醇至0.5%（v/v）浓度，BMMY培养基诱导120小时后，离心收集菌体，提取蛋白，即得；

其中，所述的表达鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的重组酵母菌株，含有7个拷贝的经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列，所述的经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的重组酵母菌株是通过以下方法构建得到的：

（1）获得经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，命名为optiVP2基因；

（2）将optiVP2基因和酵母载体连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过碱裂解法提取重组质粒，限制性内切酶切下完整的optiVP2基因表达盒，同时酶切已经得到的含有optiVP2基因的重组质粒，进行连接反应，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，重复6次构建得到含有7个表达盒的表达质粒，命名为pAO815optiVP2*7；

（3）将重组酵母载体pAO815optiVP2*7线性化，转化酵母感受态细胞，获得基因组中整合了7个optiVP2表达盒的重组酵母。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的酵母载体为pAO815，所述的酵母感受态细胞为SMD1168酵母感受态细胞。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的pAO815optiVP2*7是通过以下方法构建得到的：

（1）将optiVP2基因和酵母载体pAO815分别用EcoRⅠ酶切，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，载体用CIAP去磷酸化，optiVP2基因片段及载体用T₄ DNA连接酶进行连接反应；将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过碱裂解法提取重组质粒；

（2）用BglⅡ和BamHⅠ切下完整的optiVP2基因表达盒，用BamHⅠ单酶切已经得到的含有optiVP2基因的重组质粒，用CIAP去磷酸化，optiVP2基因表达盒及载体通过T₄ DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞；

（3）重复步骤（2）6次构建得到含有7个表达盒的表达质粒，命名为pAO815optiVP2*7。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的表达鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的重组酵母菌株命名为SMD1168/IBDVNP7-44，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号是：CGMCC NO.12175。

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