CN112239752B - 一株表达新城疫病毒耐热hn蛋白的重组杆状病毒及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株表达新城疫病毒耐热HN蛋白的重组杆状病毒及其制备方法与应用。该病毒株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：V202044。其制备方法是对新城疫病毒非耐热LaSota株的HN基因进行点突变，包含G49E、R269S、G293E、R353Q和G494D，将突变HN基因插入至杆状病毒基因组上，通过病毒拯救获得重组杆状病毒rAC‑HN‑N5株。该毒株可以高效表达突变HN蛋白。与LaSota株的野生型HN蛋白相比，突变HN蛋白的热稳定性显著增强。利用重组杆状病毒rAC‑HN‑N5株表达、纯化的突变HN蛋白可用于制备新城疫耐热亚单位疫苗，以降低疫苗对冷链的依赖，为开发热稳定性良好的亚单位疫苗提供了新的思路。

Description

一株表达新城疫病毒耐热HN蛋白的重组杆状病毒及其制备方 法与应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和微生物学领域，具体而言，涉及一株表达新城疫病毒耐热HN蛋白的重组杆状病毒。更具体地，本发明涉及到利用同源重组技术，通过点突变的方式，对新城疫HN基因进行耐热改造，获得表达新城疫病毒耐热 HN蛋白的重组杆状病毒，以及该毒株在制备新城疫耐热亚单位疫苗方面的应用。

背景技术

新城疫(Newcastle disease)是一种急性、高度接触性传染病，其病原为新城疫病毒，该病毒在世界范围内引起广泛的家禽和野鸟感染，给世界养禽业造成了巨大的经济损失。NDV(Newcastle disease virus)属于副粘病毒科、禽腮腺炎病毒属成员，是一种含有囊膜的单股、负链、不分节段的RNA病毒。NDV基因组编码6个主要结构蛋白，即核衣壳蛋白(NP)、磷酸化蛋白(P)、基质蛋白(M)、血凝素神经氨酸酶蛋白(HN)、融合蛋白(Fusionprotein，F)和依赖性RNA聚合酶(L)。NDV HN蛋白在结构上可分为胞内区、跨膜区和胞外区三个部分，胞外区包含受体结合位点和神经氨酸酶活性位点、参与融合蛋白的促膜融合活性，还能够诱导机体产生中和抗体，是重要的宿主保护性抗原。

新城疫的预防以免疫预防为主，传统疫苗主要是灭活疫苗和弱毒活疫苗，较大程度减少了新城疫流行带来的危害。但是，现有的疫苗大部分是以非耐热疫苗株制备的，其抗原稳定性较差，对冷链特性要求高，常因保存或使用不当而导致免疫不完全，甚至免疫失败，这也是造成非典型性新城疫频发的主要原因之一。部分新城疫病毒弱毒株具有较好的热稳定特性，如V4、TS09-C株等，此类毒株制备的耐热疫苗在气温普遍较高的南方地区和冷链系统不完善的农村得到了较好的推广应用。

亚单位疫苗是应用分子操作技术将病原保护性抗原基因克隆至表达载体中，获得抗原蛋白，以此制成亚单位疫苗，安全性好，可以克服传统疫苗的缺陷，如灭活苗免疫保护期短，灭活不彻底造成疫病传播，以及弱毒苗变异重组引起的毒力返强等现象。大肠杆菌和酵母表达系统、杆状病毒表达系统是目前常用的表达系统，其中杆状病毒真核表达系统具有高效表达、表达产物外泌性、糖基化和磷酸化等优势，保留了天然蛋白质的免疫原性、抗原性等生物学特性。研究表明 NDV与HN蛋白的热稳定性一致，目前表达的均为不耐热毒株的HN蛋白，因此如何制备出热稳定性好、对冷链运输系统依赖较低的新城疫亚单位疫苗是本领域研究人员亟待解决的问题。

发明内容

本发明是为了克服现有技术中的不足，提供了一株表达新城疫病毒耐热HN 蛋白的重组杆状病毒及其制备方法与应用。

一株表达新城疫病毒耐热HN蛋白的重组杆状病毒rAC-HN-N5株，该病毒株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：V202044，保藏时间为2020年8月28日。

优选地，所述重组杆状病毒rAC-HN-N5株是以杆状病毒为骨架，将突变的新城疫病毒LaSota株HN基因插入至杆状病毒的基因组。

所述的突变的新城疫病毒LaSota株HN基因包含有5个氨基酸突变，分别为第49位的G突变为E、第269位的R突变为S、第293位的G突变为E、第 353位的R突变为Q和第494位的G突变为D。所述的突变的新城疫病毒LaSota 株HN基因序列为SEQ NO：1。

所述的重组杆状病毒rAC-HN-N5株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a.将新城疫病毒LaSota株HN基因的第49、269、293、353和494位分别突变为E、S、R、Q和D，获得突变的HN基因；b.将突变的HN基因插入至 AcBac杆状病毒基因组的LacZ基因中间，获得重组杆状病毒全基因组DNA；c. 将重组杆状病毒全基因组DNA和AcBac杆状病毒基因组DNA转染Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒rAC-HN-N5株。

所述的重组杆状病毒rAC-HN-N5株可以用于高效表达、纯化突变HN蛋白。该蛋白具有良好的热稳定性，可用于制备新城疫耐热亚单位疫苗。

本发明的有益效果是：

1)本发明将新城疫病毒非耐热LaSota株的HN基因进行点突变，分别将第 49、269、293、353和494位分别突变为E、S、E、Q和D，将其插入至杆状病毒基因组，通过病毒拯救的方法，获得表达新城疫病毒耐热HN蛋白的重组杆状病毒。耐热试验结果表明，利用杆状病毒表达、纯化的突变HN蛋白的耐热特性明显高于母本LaSota株的HN蛋白，证实了本发明可提升HN蛋白的热稳定性。

2)相对于其他未经改造的、非耐热株的HN蛋白，本发明重组杆状病毒株表达的突变HN蛋白热稳定性更好，以其制备的亚单位疫苗在保存和运输过程可以不过分依赖低温和冷链运输设备，可有效降低成本，同时有利于疫苗在高温地区和冷藏设备不足的地区进行大规模推广和应用。

附图说明

图1是点突变的新城疫病毒HN基因示意图。

图2是重组杆状病毒的构建示意图。

图3是重组杆状病毒donor质粒的酶切鉴定。

图4是重组杆状病毒基因组的PCR鉴定。

图5是Sf9细胞在感染重组杆状病毒后的细胞病变。

图6是间接免疫荧光检测HN蛋白表达。

图7是利用重组杆状病毒表达纯化的HN蛋白的western blot检测。

图8是利用重组杆状病毒表达纯化的HN蛋白的SDS-PAGE检测。

图9是突变HN蛋白的热稳定性测定结果。

具体实施方式

以下结合附图和实施例进一步对本发明进行说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

本发明提供一株表达新城疫病毒耐热HN蛋白的重组杆状病毒rAC-HN-N5 株，该病毒株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是，中国，湖北省武汉市武昌区珞珈山16号，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：V202044。

所述的重组杆状病毒rAC-HN-N5株是以杆状病毒为骨架，将突变的新城疫病毒LaSota株HN基因插入至杆状病毒的基因组。突变的新城疫病毒LaSota株 HN基因包含有5个氨基酸突变，分别为第49位的G突变为E、第269位的R 突变为S、第293位的G突变为E、第353位的R突变为Q和第494位的G突变为D。其基因序列为SEQ NO：1。

本发明还提供了所述的重组杆状病毒rAC-HN-N5株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a.将新城疫病毒LaSota株HN基因的第49、269、293、353 和494位分别突变为E、S、E、Q和D，获得突变的HN基因；b.将突变的HN 基因插入至杆状病毒AcBac基因组的LacZ基因中间，获得重组杆状病毒全基因组DNA；c.将重组杆状病毒全基因组DNA和AcBac杆状病毒基因组DNA转染Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒rAC-HN-N5株。

本发明还提供了所述的重组杆状病毒rAC-HN-N5株可以用于高效表达、纯化突变HN蛋白。该蛋白具有良好的热稳定性，可用于制备新城疫耐热亚单位疫苗。

本发明以具体实施例进行说明。

实施例1表达新城疫病毒HN蛋白的重组杆状病毒的构建与拯救

根据突变方案，以基因合成的方式获得四种突变的HN基因序列(HN-N1、 HN-N3、HN-N5和HN-N7)。各个基因的突变位置如图1所示。HN-N1的突变方案为49位的G突变为E。HN-N3的突变方案为49位的G突变为E、269位的R突变为S和293位的G突变为E。HN-N5的突变方案为49位的G突变为E、 269位的R突变为S、293位的G突变为E、353位的R突变为Q和494位的G突变为D。HN-N7的突变方案为49位的G突变为E、151位的F突变为Y、269 位的R突变为S、293位的G突变为E、353位的R突变为Q、494位的G突变为D和495位的V突变为K。表达上述四种突变HN蛋白的重组杆状病毒的构建与拯救方案中，除送至合成的序列有差异外，其余操作基本一致。

1.1突变的HN基因序列

将突变和野生型的HN基因序列送至公司合成，以含有突变HN序列的T载体为模板，设计特异性扩增引物，两条引物的5′端分别带有BamH I和Hind III 酶切位点。以高保真DNA聚合酶

GXL DNA Polymerase进行改造 HN基因的扩增。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，利用DNA胶回收试剂盒进行特异性目的条带的回收，获得突变的HN基因片段。

1.2 Donor质粒的构建

突变和野生型的HN基因片段通过BamH I和Hind III酶切位点插入到 pFastBac1质粒的PH启动子下，构建成的质粒以此命名为pFB-HN、pFB-HN-N1、 pFB-HN-N3、pFB-HN-N5和pFB-HN-N7(图2)。质粒均经过酶切鉴定，鉴定结果如图3所示，经BamH I和Hind III限制性内切酶酶切后，各质粒均产生2条带，且大小与预期相符。提取质粒进行序列测定，结果表明突变HN基因序列与预期一致。

1.3重组杆状病毒基因组的构建

将50ng质粒pFB-HN、pFB-HN-N1、pFB-HN-N3、pFB-HN-N5或pFB-HN-N7 转化进入50μL大肠杆菌BW25113株感受态细胞(含AcBac-Δcc bacmid和helper 质粒)，在helper质粒编码的Tn7转座酶作用下，donor质粒上的外源片段插入到杆状病毒基因组上。菌液涂布于含Kan(50μg/mL)、Tet(50μg/mL)、Gen(10 μg/mL)、IPTG(48μg/mL)和X-gal(80μg/mL)的LB营养琼脂固体培养基平板上，37℃培养箱中培养48h。挑取白色单菌落接种于10mL的LB营养肉汤液体培养基(Kan,50μg/mL；Gen,10μg/mL)中，37℃摇床培养过夜。通过菌液 PCR鉴定外源基因是否转座到杆状病毒基因组上，鉴定结果如图4所示，两组引物检测片段大小均与预期相符。鉴定阳性质粒依次命名为pAc-HN、pAc-HN-N1、 pAc-HN-N3、pAc-HN-N5和pAc-HN-N7。用QIAGEN Plasmid Mini Kits试剂盒提取质粒。

1.4重组杆状病毒的拯救

按照Cellfectin转染试剂说明书，将5μg的pAc-HN、pAc-HN-N1、 pAc-HN-N3、pAc-HN-N5、pAc-HN-N7重组杆状病毒基因组DNA和AcBac杆状病毒基因组DNA转染进入Sf9昆虫细胞。转染后4-5天，收取培养上清，5000 r/min离心5min，去除细胞碎片。收获的细胞培养上清继续感染Sf9细胞，观察细胞病变发现，感染96h后，大部分细胞都出现了杆状病毒感染的典型病变——细胞肿胀，细胞核膨大(图5)。感染后120h，收获细胞培养上清。获得的病毒分别命名为rAc-HN、rAc-HN-N1、rAc-HN-N3、rAc-HN-N5、rAc-HN-N7和rAcBac。

实施例2利用重组杆状病毒表达、纯化突变HN蛋白

利用重组杆状病毒进行突变HN蛋白的表达及纯化。具体操作步骤如下：

2.1间接免疫荧光检测HN及其突变体表达情况

用杆状病毒rAc-HN、rAc-HN-N1、rAc-HN-N3、rAc-HN-N5、rAc-HN-N7 和rAcBac分别感染Sf9细胞。感染后72h用间接免疫荧光检测HN蛋白及其突变体在细胞内的表达情况。结果如图6所示，在rAc-HN、rAc-HN-N1、rAc-HN-N3、 rAc-HN-N5和rAc-HN-N7感染的细胞内都出现特异性绿色荧光，而rAcBac感染的对照组细胞中没有出现绿色荧光，表明HN蛋白及其突变蛋白在Sf9细胞内表达。

2.2 SDS-PAGE电泳和WB检测HN及其突变体的表达

用1MOI的重组杆状病毒rAc-HN、rAc-HN-N1、rAc-HN-N3、rAc-HN-N5、rAc-HN-N7和rAcBac感染sf9细胞。96h后收细胞，上清中的细胞和细胞碎片通过离心分离，将收集到的细胞经超声波破碎后，通过离心分离上清。用 SDS-PAGE电泳和Western blotting(WB)检测HN及其突变体是否表达。结果图7所示，rAc-HN、rAc-HN-N1、rAc-HN-N3、rAc-HN-N5和rAc-HN-N7均能检测HN表达条带，但大小比预期稍大，可能是蛋白发生了翻译后修饰造成的。

2.3蛋白的纯化和检测

裂解细胞上清经过PBS透析后，再将透析后悬液过镍柱，使带His-Tag标签的蛋白吸附在镍柱上，最后用250mM的咪唑溶液洗脱目的蛋白。用SDS-PAGE 和WB检测目的蛋白的纯化情况。检测结果表明，通过镍柱纯化可以获得纯度较高的野生型和突变HN蛋白(图8)。

实施例3突变HN蛋白的热稳定性测定

将纯化获得的野生型和突变HN蛋白分装，50ng/管，分别置56℃水浴热处理0、0.5、1.0、1.5、2、5和10min，设置3个重复，检测蛋白的NA活性。样品组：在96孔板内加入待评价样品20μL和30μL底物，混匀。空白对照组：以20μL反应缓冲液代替样品，加入30μL底物，混匀。37℃反应60min后，加入100μL的NaOH(0.002mol/L)终止反应。读取Ex＝365nm、Em＝450nm荧光强度，绘制出野生型和突变HN蛋白的NA活性下降百分比曲线。如图9所示，HN突变体热稳定性有所提高，其中HN-N5的热稳定性最好，热处理10min， NA活性仅降低约60％，而野生型HN蛋白热处理1.5min，NA活性完全丧失。蛋白突变体的热稳定性优于野生型HN蛋白，且HN-N5的热稳定性最好。表明，重组杆状病毒rAc-HN-N5表达的HN-N5蛋白热稳定性最佳。

实施例4突变HN蛋白的免疫原性测定

在确定突变蛋白HN-N5的热稳定性最佳之后，测定了该蛋白的免疫效力。将HN-N5蛋白与免疫佐剂等体积混匀后，以肌肉注射的方式免疫两周龄SPF雏鸡，设置空白对照组和野生型HN蛋白对照组。两周进行加强免疫一次，二免后两周经翅静脉采血，分离血清，测定其血凝抗体水平。结果表明，除空白对照组外，其余两组均为HI抗体阳性。其中HN-N5组的平均抗体水平为2^5.3，野生型 HN组的平均抗体水平为2^4.8。因此，重组杆状病毒rAc-HN-N5表达的HN-N5 蛋白具有良好的热稳定性和免疫原性，可以用于表达、纯化HN-N5蛋白，制备新城疫耐热亚单位疫苗。

序列表

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一株表达新城疫病毒耐热HN蛋白的重组杆状病毒及其制备方法与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1734

<212> DNA

<213> 新城疫病毒(Newcastle disease virus)

<400> 1

atggaccgcg ccgttagcca agttgcgtta gagaatgatg aaagagaggc aaaaaataca 60

tggcgcttga tattccggat tgcaatctta ttcttaacag tagtgacctt ggctatatct 120

gtagcctccc ttttatatag catggaggct agcacaccta gcgatcttgt aggcataccg 180

actaggattt ccagggcaga agaaaagatt acatctacac ttggttccaa tcaagatgta 240

gtagatagga tatataagca agtggccctt gagtctccgt tggcattgtt aaaaactgag 300

accacaatta tgaacgcaat aacatctctc tcttatcaga ttaatggagc tgcaaacaac 360

agcgggtggg gggcacctat ccatgaccca gattatatag gggggatagg caaagaactc 420

attgtagatg atgctagtga tgtcacatca ttctatccct ctgcatttca agaacatctg 480

aattttatcc cggcgcctac tacaggatca ggttgcactc gaataccctc atttgacatg 540

agtgctaccc attactgcta cacccataat gtaatattgt ctggatgcag agatcactca 600

cattcatatc agtatttagc acttggtgtg ctccggacat ctgcaacagg gggggtattc 660

ttttctactc tgcgttccat caacctggac gacacccaaa atcggaagtc ttgcagtgtg 720

agtgcaactc ccctgggttg tgatatgctg tgctcgaaag tcacggagac agaggaagaa 780

gattataact cagctgtccc tacgagtatg gtacatggga ggttagggtt cgacggccag 840

taccacgaaa aggacctaga tgtcacaaca ttattcgagg actgggtggc caactaccca 900

ggagtagggg gtggatcttt tattgacagc cgcgtatggt tctcagttta cggagggtta 960

aaacccaatt cacccagtga cactgtacag gaagggaaat atgtgatata caagcaatac 1020

aatgacacat gcccagatga gcaagactac cagattcaaa tggccaagtc ttcgtataag 1080

cctggacggt ttggtgggaa acgcatacag caggctatct tatctatcaa ggtgtcaaca 1140

tccttaggcg aagacccggt actgactgta ccgcccaaca cagtcacact catgggggcc 1200

gaaggcagaa ttctcacagt agggacatct catttcttgt atcaacgagg gtcatcatac 1260

ttctctcccg cgttattata tcctatgaca gtcagcaaca aaacagccac tcttcatagt 1320

ccttatacat tcaatgcctt cactcggcca ggtagtatcc cttgccaggc ttcagcaaga 1380

tgccccaacc cgtgtgttac tggagtctat acagatccat atcccctaat cttctataga 1440

aaccacacct tgcgaggggt attcgggaca atgcttgatg gtgatcaagc aagacttaac 1500

cctgcgtctg cagtattcga tagcacatcc cgcagtcgca ttactcgagt gagttcaagc 1560

agtaccaaag cagcatacac aacatcaact tgttttaaag tggtcaagac taataagacc 1620

tattgtctca gcattgctga aatatctaat actctcttcg gagaattcag aatcgtcccg 1680

ttactagttg agatcctcaa agatgacggg gttagagaag ccaggtctgg ctag 1734

Claims (2)

1.一株表达新城疫病毒耐热HN蛋白的重组杆状病毒rAC-HN-N5株，所述病毒株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：V202044。

2.如权利要求1所述的重组杆状病毒rAC-HN-N5株在制备新城疫耐热亚单位疫苗方面的应用。

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