CN113005099A - 一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII‑NJ‑Wko株及其制备方法和应用，属于微生物领域，该重组新城疫病毒rVII‑NJ‑Wko株于2020年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V202082。本发明通过新城疫病毒反向遗传操作技术和定点突变技术使该重组病毒无法表达W蛋白，拯救的重组新城疫病毒rVII‑NJ‑Wko株的MDT值为64.8h，ICPI值为1.72，EID50/ml值为8.00log10，HA效价为8log2。该重组新城疫病毒rVII‑NJ‑Wko株可用于深入研究新城疫病毒W蛋白的功能和新城疫病毒W蛋白的作用机制，还可作为潜在的分子标记疫苗侯选株。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体公开了一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株及其制备方法和应用。
背景技术
新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)强毒株感染引起的一种急性、高度接触性禽类烈性传染病，是《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中优先防制的一类动物疫病之一。近年来，我国ND呈现出新的流行病学特点：非典型性ND和免疫带毒现象普遍存在，免疫失败时有发生，直接及间接造成的经济损失巨大，ND的防控面临着新挑战，寻求防控ND的新途径已成为亟待解决的重大科学与生产实际问题(Dimitrov KM，等.Updated unifiedphylogenetic classification system and revised nomenclature for Newcastledisease virus[J].Infection Genetics and Evolution,2019,74:103917.)。
NDV为副黏病毒科副黏病毒属的禽副黏病毒I型，基因组为不分节段的单股负链RNA，基因组结构模式为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，依次编码六种结构蛋白：核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein，NP)、磷蛋白(Phosphorprotein，P)、基质蛋白(Matrix protein，M)、融合蛋白(Fusionprotein，F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(Heamagglutinin-Neuraminidase protein，HN)和大分子蛋白(Large protein，L)；以及两种非结构蛋白(V和W)。NP、P和L作为内部蛋白参与病毒RNA的转录与复制，形成有活性的mRNA(Kho CL，等.Regions on nucleocapsid protein ofNewcastle disease virus that interact withits phosphoprotein[J].Archives ofVirology,2004,149(5):997-1005.)；M蛋白构成囊膜内表面的支撑物，驱动病毒出芽(Pantua HD，等.Requirements for theAssembly andRelease ofNewcastle Disease Virus-Like Particles[J].Journal ofVirology,2006,80(22):11062-11073.)；F和HN是形成病毒表面纤突的糖基化蛋白，是决定NDV毒力和致病性的主要因素(Ren S，等.Hemagglutinin-neuraminidase and fusionproteinsofvirulentNewcastle disease virus cooperatively disturb fusion-fissionhomeostasis to enhance mitochondrial function by activating the unfoldedprotein response of endoplasmic reticulum andmitochondrial stress[J].Veterinary Research,2019,50(1):37.)。另外，V蛋白能通过多种策略拮抗宿主天然免疫应答(Huang Z，等.Newcastle Disease Virus V Protein Is Associated with ViralPathogenesis and Functions as an Alpha InterferonAntagonist[J].JournalofVirology,2003,77(16):8676-8685.)。然而，目前有关W蛋白的功能及其作用机制并不清楚。
NDV仍只一个血清型，但根据F基因高变区的遗传进化分析可将所有毒株分为ClassⅠ和ClassⅡ大类，其中ClassⅠ又可分为3个基因型，ClassⅡ分为至少20个基因型。分子流行病学研究结果表明，我国目前流行的NDV以ClassⅡ中的基因VII型(鸡、鸭、鹅群)为主(潘群兴，等。新城疫不同宿主源分离株的生物学特性[J].江苏农业学报,2011,27(6):1325-1329.)。不同地区、不同时间分离的NDV在抗原性、致病性和毒力存在着差异。
发明内容
本发明的目的是一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株及其制备方法和应用。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株，该重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株于2020年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V202082。
作为优选的实施方式，该重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株是通过新城疫病毒反向遗传操作技术和定点突变技术获得的。
作为优选的实施方式，所述新城疫病毒反向遗传操作技术是以新城疫病毒VII-NJ株为骨架实现的，所述新城疫病毒VII-NJ株于2019年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201945。
作为优选的实施方式，所述定点突变技术是通过采用定点突变试剂盒将新城疫病毒VII-NJ株P基因开放阅读框的404CAT406突变为404TAG406，使W基因沉默表达，同时保证P基因和V基因正常表达。
本发明的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、新城疫病毒VII-NJ株全基因组主质粒pCI-VII-NJ的构建；
步骤二、新城疫病毒VII-NJ株NP、P、L辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P、pcDNA-L的构建；
步骤三、重组新城疫病毒VII-NJ株的拯救与鉴定；
步骤四、主质粒pCI-VII-NJ的定点突变；
步骤五、重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的拯救。
作为优选的实施方式，步骤一至步骤三具体包括以下步骤：
(1)新城疫病毒VII-NJ株全基因组主质粒pCI-VII-NJ的构建
根据新城疫病毒VII-NJ株全基因组信息合成全基因组，在5’端引入单一限制性内切酶Sal I和锤头状核酶结构，在3’端引入单一限制性内切酶Not I和丁肝病毒核酶结构，将合成的全基因组序列插入至pCI-neo载体，鉴定正确后将其命名为新城疫病毒VII-NJ株全基因组主质粒pCI-VII-NJ；
(2)新城疫病毒VII-NJ株NP、P、L辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P、pcDNA-L的构建
根据新城疫病毒VII-NJ株全基因组信息，分别合成其NP、P、L基因，在各基因ORF前引入Kozak序列，在NP和P基因序列两端分别引入限制性内切酶Hind III和EcoR I，在L基因序列两端分别引入限制性内切酶Nhe I和Not I，将合成的NP、P、L基因序列分别插入至pcDNA3.1载体，鉴定正确后将其分别命名为辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L；
(3)重组新城疫病毒VII-NJ株的拯救与鉴定
取BHK-21细胞接种后待细胞生长至70～80％单层时，以磷酸钙转染试剂将主质粒pCI-VII-NJ与三个辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L共转染BHK-21细胞，pCI-VII-NJ、pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L的质量比为4:2:1:1，每孔转染量分别为5μg、2.5μg、1.25μg和1.25μg，转染细胞于5％CO2、37℃培养箱中培养12h后，弃去转染混合物，以含有10％DMSO的PBS休克细胞2.5min，加入完全DMEM培养液继续于5％CO2、37℃培养箱中培养；4天后收获细胞上清，接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔，5天后收取鸡胚尿囊液，收获血凝和血凝抑制检测均为阳性的鸡胚尿囊液；将收集的鸡胚尿囊液感染生长过夜的DF1细胞，24h后，弃去培养液，以PBS洗涤细胞两次，室温下以预冷的80％丙酮固定30min，弃去丙酮，以PBS洗涤3遍后，配制含1％BSA的PBS缓冲液，按1:100倍体积比稀释鸡抗NDV高免血清作为一抗室温下与细胞共孵育30min，弃掉抗体稀释液，以PBST洗涤3遍，加入以1％BSA按1:300体积比倍稀释山羊抗鸡FITC标记荧光抗体，同时加入以1:500体积比倍稀释的伊文思蓝染色液对细胞背景进行染色，室温避光条件下孵育30min，最后以PBST洗涤细胞三次后于荧光显微镜下观察，鸡抗NDV高免血清检测鸡胚尿囊液感染细胞显示阳性绿色荧光信号，未感染病毒细胞只显示红色背景颜色；电子显微镜观察呈现典型新城疫病毒颗粒形态特征，表明利用NDVVII-NJ株基因组成功救获具有感染性的重组病毒，将其命名为rVII-NJ。
作为优选的实施方式，步骤四至步骤五具体包括以下步骤：
(1)主质粒pCI-VII-NJ的定点突变
根据W和V基因的mRNA编辑特性，以新城疫病毒VII-NJ株为骨架，将主质粒pCI-VII-NJ中P基因ORF的404CAT406突变为404TAG406，使W基因沉默表达，同时保证P基因和V基因正常表达，突变引物分别为Wko-F：caatgctaaaaagggccTAGggtcgggtcc，Wko-R：CTAggccctttttagcattggacgatttattgc，采用定点突变试剂盒将主质粒pCI-VII-NJ进行定点突变，将突变后的主质粒命名为pCI-VII-NJ-Wko；
(2)重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的拯救
采用磷酸钙转染法将突变后的主质粒pCI-VII-NJ-Wko分别与三个辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L共转染BHK-21细胞，经弃液、DMSO休克、再培养后收集细胞上清，接种于9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔，盲传3代后进行血凝和血凝抑制检测，阳性样品进行RT-PCR法与间接免疫荧光法检测，同时进行免疫电镜观察，鉴定正确的重组病毒命名为rVII-NJ-Wko；将重组病毒rVII-NJ-Wko以MOI＝0.1接种DF-1细胞，48h后收集细胞进行SDS-PAGE电泳和Westernblot分析，分别采用NP蛋白单克隆抗体和W蛋白特异性抗体检测重组病毒中W蛋白的表达情况，若rVII-NJ-Wko感染细胞样品中不能检测到W蛋白，说明W蛋白被沉默，表明重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的拯救成功。
本发明的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株作为基础生物材料在研究新城疫病毒W蛋白的功能和作用机制中的应用。
本发明的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株在制备分子标记疫苗侯选株中的应用。
本发明的有益效果是：
如图1所示，本发明提供了一株具有分子标记的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株，该分子标记为新城疫病毒W蛋白沉默，通过新城疫病毒反向遗传操作技术和定点突变技术使该重组病毒无法表达W蛋白，拯救的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的MDT值为64.8h，ICPI值为1.72，EID50/ml值为8.00log10，HA效价为8log2。该重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株作为一种重要的生物材料，可用于深入研究新城疫病毒W蛋白的功能和新城疫病毒W蛋白的作用机制，为深入研究新城疫病毒W蛋白的功能和解析其作用机制奠定重要基础。同时，本发明的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株还可以作为潜在的分子标记疫苗侯选株，应用于疫苗领域。
附图说明
图1为本发明的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的制备方法的原理示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1新城疫病毒VII-NJ株反向遗传操作平台的建立
1、新城疫病毒VII-NJ株全基因组主质粒(pCI-VII-NJ)的构建
根据新城疫病毒VII-NJ株(该病毒株遗传序列信息已公开，于2019年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学保藏中心)，保藏号为：CCTCC NO：V201945)的全基因组信息，通过人工合成方式合成其全基因组，在其5’端引入单一限制性内切酶Sal I和锤头状核酶结构(HamRz，核苷酸序列为TCTGTTTGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCC TATAGTC，见序列表中的序列1)，在其3’端引入单一限制性内切酶Not I和丁肝病毒核酶结构(HdvRz，核苷酸序列为GGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCG，见序列表中的序列2)，序列由通用生物系统(安徽)有限公司合成，并将合成的全基因组序列插入至pCI-neo载体(购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)，鉴定正确后将其命名为新城疫病毒VII-NJ株全基因组主质粒pCI-VII-NJ。
2、新城疫病毒VII-NJ株NP、P、L辅助质粒(pcDNA-NP、pcDNA-P、pcDNA-L)的构建
根据新城疫病毒VII-NJ株(该病毒株遗传序列信息已公开，于2019年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学保藏中心)，保藏号为：CCTCC NO：V201945)序列信息，通过人工合成方式分别合成其NP、P、L基因，在各基因ORF前引入Kozak序列(核苷酸序列为GCCACC)，在NP和P基因序列两端分别引入限制性内切酶Hind III和EcoR I，在L基因序列两端分别引入限制性内切酶Nhe I和NotI，序列由通用生物系统(安徽)有限公司合成，并将合成的NP、P、L基因序列分别插入至pcDNA3.1载体(购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)，鉴定正确后将其分别命名为辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L。
3、重组新城疫病毒VII-NJ株的拯救与鉴定
取生长良好的BHK-21细胞(购自美国ATCC公司)接种于6孔板中，第二天待细胞生长至70％～80％单层时，以磷酸钙转染试剂(购自赛默飞世尔科技公司)按说明书方法将构建好的全长转录质粒pCI-VII-NJ与三个辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L共转染BHK-21细胞，pCI-VII-NJ、pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L的质量比为4:2:1:1，每孔转染量分别为5μg、2.5μg、1.25μg和1.25μg，转染细胞于5％CO2、37℃培养箱中培养12h后，弃去转染混合物，以含有10％DMSO的PBS(购自赛默飞世尔科技公司)休克细胞2.5min，加入完全DMEM培养液继续于5％CO2、37℃培养箱中培养。4天后收获细胞上清，接种于9日龄SPF鸡胚(购自南京天邦生物科技有限公司)尿囊腔，5天后收取鸡胚尿囊液，进行血凝(HA)和血凝抑制(HI)检测(具体步骤参照中华人民共和国国家标准《GB/T16550-2008新城疫诊断技术》，发布日：2008-12-31，实施日：2009-05-01，发布机构：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会)，收获血凝(HA)和血凝抑制(HI)检测均为阳性的鸡胚尿囊液，进行后续鉴定。
为了进一步鉴定救获病毒，将收集的鸡胚尿囊液感染生长过夜的DF1细胞(购自美国ATCC公司)，24h后，弃去培养液，以PBS(购自赛默飞世尔科技公司)洗涤细胞两次，室温下以预冷的80％丙酮(国产分析纯)固定30min，弃去丙酮，以PBS洗涤3遍后，配制含1％BSA的PBS缓冲液，按1:100倍体积比稀释鸡抗NDV高免血清(购自哈尔滨维科生物技术有限公司)，作为一抗室温下与细胞共孵育30min，然后弃掉抗体稀释液，以PBST(含0.5％吐温-20)洗涤3遍，加入以1％BSA按1:300体积比倍稀释山羊抗鸡FITC标记荧光抗体(购自碧云天生物科技有限公司)，同时加入以1:500体积比倍稀释的伊文思蓝染色液对细胞背景进行染色，同样室温孵育30min，抗体的孵育全程置于摇床上轻轻晃动以使抗体与细胞充分接触，孵育荧光抗体要在避光条件下进行，最后以PBST洗涤细胞三次后于荧光显微镜下观察。结果可见，鸡抗NDV高免血清检测鸡胚尿囊液感染细胞可显示阳性绿色荧光信号，而未感染病毒细胞(Mock)只显示红色背景颜色。另外，为观察重组病毒的形态特征，分别取接种鸡胚尿囊液，经磷钨酸负染后，电子显微镜观察。结果显示典型新城疫病毒颗粒形态特征。这表明通过反向遗传操作技术，利用NDVVII-NJ株基因组成功救获具有感染性的重组病毒，将其命名为rVII-NJ；同时，这也表明新城疫病毒VII-NJ株反向遗传操作平台成功建立。
实施例2重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的拯救与鉴定
1、主质粒(pCI-VII-NJ)的定点突变
根据W和V基因的“mRNA编辑”特性，以基因VII型NDV强毒VII-NJ株(该病毒株遗传序列信息已公开，于2019年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学保藏中心)，保藏号为：CCTCC NO：V201945)为骨架，具体为其主质粒(pCI-VII-NJ)中P基因ORF的404CAT406突变为404TAG406，使W基因沉默表达，同时保证P基因和V基因的正常表达，突变引物分别为，Wko-F：caatgctaaaaagggccTAGggtcgggtcc(见序列表中的序列3)，Wko-R：CTAggccctttttagcattggacgatttattgc(见序列表中的序列4)(下划线标记为突变位点)，引物由通用生物系统(安徽)有限公司合成，采用定点突变试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将主质粒pCI-VII-NJ进行定点突变，将突变后的主质粒命名为pCI-VII-NJ-Wko。
2、重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的拯救
将突变后的主质粒命名为pCI-VII-NJ-Wko，基于新城疫病毒VII-NJ株反向遗传操作平台(实施例1中已建立)，采用磷酸钙转染法将上述全长cDNA克隆质粒(pCI-VII-NJ-Wko)分别与三个辅助质粒(pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L)共转染BHK-21细胞，经弃液、DMSO休克、再培养后收集细胞上清，接种于9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔，盲传3代后进行血凝(HA)和血凝抑制(HI)检测，阳性样品进行RT-PCR法与间接免疫荧光法检测，同时进行免疫电镜观察，鉴定正确的重组病毒命名为rVII-NJ-Wko。将上述重组病毒rVII-NJ-Wko以MOI＝0.1接种DF-1细胞，48h后收集细胞，进行SDS-PAGE电泳和Westernblot分析，分别采用NP蛋白单克隆抗体(公开号为CN110452885A，发明名称为：一种分泌抗新城疫病毒NP蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞4F6株，该杂交瘤细胞4F6株于2019年5月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学保藏中心)，保藏号为：CCTCC NO：C2019102)和W蛋白特异性抗体(由吉林大学丁壮教授提供)检测重组病毒中W蛋白的表达情况，结果可见rVII-NJ-Wko感染细胞样品中不能检测到W蛋白，说明W蛋白被沉默，进而表明重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的拯救成功。
本发明的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株，于2020年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学保藏中心)，保藏号为：CCTCC NO：V202082。
3、重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的生物性活性分析
对鉴定正确的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株进行主要生物学活性分析，分别测定其HA(血凝效价)、EID50(鸡胚半数感染量)、MDT(鸡胚平均致死时间)以及ICPI(1日龄雏鸡脑内接种致病指数)(具体步骤参照中华人民共和国国家标准《GB/T16550-2008新城疫诊断技术》，发布日：2008-12-31，实施日：2009-05-01，发布机构：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会)。结果显示，本发明的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的MDT值为64.8h，ICPI值为1.72，EID50/ml值为8.00log10，HA效价为8log2。
本发明的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株作为一种重要的生物材料，可用于深入研究新城疫病毒W蛋白的功能和新城疫病毒W蛋白的作用机制，为深入研究新城疫病毒W蛋白的功能和解析其作用机制奠定重要基础。同时，本发明的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株还可以作为潜在的分子标记疫苗侯选株，应用于疫苗领域。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctgtttggt ctgatgagtc cgtgaggacg aaactatagg aaaggaattc ctatagtc 58
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggtcggcat ggcatctcca cctcctcg 28
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caatgctaaa aagggcctag ggtcgggtcc 30
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctaggccctt tttagcattg gacgatttat tgc 33
Claims (9)
1.一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株，其特征在于，该重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株于2020年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V202082。
2.根据权利要求1所述的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株，其特征在于，该重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株是通过新城疫病毒反向遗传操作技术和定点突变技术获得的。
3.根据权利要求2所述的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株，其特征在于，所述新城疫病毒反向遗传操作技术是以新城疫病毒VII-NJ株为骨架实现的，所述新城疫病毒VII-NJ株于2019年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201945。
4.根据权利要求3所述的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株，其特征在于，所述定点突变技术是通过采用定点突变试剂盒将新城疫病毒VII-NJ株P基因开放阅读框的404CAT406突变为404TAG406，使W基因沉默表达，同时保证P基因和V基因正常表达。
5.如权利要求1至4中任意一项所述的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、新城疫病毒VII-NJ株全基因组主质粒pCI-VII-NJ的构建；
步骤二、新城疫病毒VII-NJ株NP、P、L辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P、pcDNA-L的构建；
步骤三、重组新城疫病毒VII-NJ株的拯救与鉴定；
步骤四、主质粒pCI-VII-NJ的定点突变；
步骤五、重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的拯救。
6.根据权利要求5所述的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的制备方法，其特征在于，步骤一至步骤三具体包括以下步骤：
(1)新城疫病毒VII-NJ株全基因组主质粒pCI-VII-NJ的构建
根据新城疫病毒VII-NJ株全基因组信息合成全基因组，在5’端引入单一限制性内切酶Sal I和锤头状核酶结构，在3’端引入单一限制性内切酶Not I和丁肝病毒核酶结构，将合成的全基因组序列插入至pCI-neo载体，鉴定正确后将其命名为新城疫病毒VII-NJ株全基因组主质粒pCI-VII-NJ；
(2)新城疫病毒VII-NJ株NP、P、L辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P、pcDNA-L的构建
根据新城疫病毒VII-NJ株全基因组信息，分别合成其NP、P、L基因，在各基因ORF前引入Kozak序列，在NP和P基因序列两端分别引入限制性内切酶Hind III和EcoR I，在L基因序列两端分别引入限制性内切酶Nhe I和Not I，将合成的NP、P、L基因序列分别插入至pcDNA3.1载体，鉴定正确后将其分别命名为辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L；
(3)重组新城疫病毒VII-NJ株的拯救与鉴定
取BHK-21细胞接种后待细胞生长至70～80％单层时，以磷酸钙转染试剂将主质粒pCI-VII-NJ与三个辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L共转染BHK-21细胞，pCI-VII-NJ、pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L的质量比为4:2:1:1，每孔转染量分别为5μg、2.5μg、1.25μg和1.25μg，转染细胞于5％CO2、37℃培养箱中培养12h后，弃去转染混合物，以含有10％DMSO的PBS休克细胞2.5min，加入完全DMEM培养液继续于5％CO2、37℃培养箱中培养；4天后收获细胞上清，接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔，5天后收取鸡胚尿囊液，收获血凝和血凝抑制检测均为阳性的鸡胚尿囊液；将收集的鸡胚尿囊液感染生长过夜的DF1细胞，24h后，弃去培养液，以PBS洗涤细胞两次，室温下以预冷的80％丙酮固定30min，弃去丙酮，以PBS洗涤3遍后，配制含1％BSA的PBS缓冲液，按1:100倍体积比稀释鸡抗NDV高免血清作为一抗室温下与细胞共孵育30min，弃掉抗体稀释液，以PBST洗涤3遍，加入以1％BSA按1:300体积比倍稀释山羊抗鸡FITC标记荧光抗体，同时加入以1:500体积比倍稀释的伊文思蓝染色液对细胞背景进行染色，室温避光条件下孵育30min，最后以PBST洗涤细胞三次后于荧光显微镜下观察，鸡抗NDV高免血清检测鸡胚尿囊液感染细胞显示阳性绿色荧光信号，未感染病毒细胞只显示红色背景颜色；电子显微镜观察呈现典型新城疫病毒颗粒形态特征，表明利用NDVVII-NJ株基因组成功救获具有感染性的重组病毒，将其命名为rVII-NJ。
7.根据权利要求5所述的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的制备方法，其特征在于，步骤四至步骤五具体包括以下步骤：
(1)主质粒pCI-VII-NJ的定点突变
根据W和V基因的mRNA编辑特性，以新城疫病毒VII-NJ株为骨架，将主质粒pCI-VII-NJ中P基因ORF的404CAT406突变为404TAG406，使W基因沉默表达，同时保证P基因和V基因正常表达，突变引物分别为Wko-F：caatgctaaaaagggccTAGggtcgggtcc，Wko-R：CTAggccctttttagcattggacgatttattgc，采用定点突变试剂盒将主质粒pCI-VII-NJ进行定点突变，将突变后的主质粒命名为pCI-VII-NJ-Wko；
(2)重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的拯救
采用磷酸钙转染法将突变后的主质粒pCI-VII-NJ-Wko分别与三个辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L共转染BHK-21细胞，经弃液、DMSO休克、再培养后收集细胞上清，接种于9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔，盲传3代后进行血凝和血凝抑制检测，阳性样品进行RT-PCR法与间接免疫荧光法检测，同时进行免疫电镜观察，鉴定正确的重组病毒命名为rVII-NJ-Wko；将重组病毒rVII-NJ-Wko以MOI＝0.1接种DF-1细胞，48h后收集细胞进行SDS-PAGE电泳和Westernblot分析，分别采用NP蛋白单克隆抗体和W蛋白特异性抗体检测重组病毒中W蛋白的表达情况，若rVII-NJ-Wko感染细胞样品中不能检测到W蛋白，说明W蛋白被沉默，表明重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的拯救成功。
8.如权利要求1至4中任意一项所述的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株作为基础生物材料在研究新城疫病毒W蛋白的功能和作用机制中的应用。
9.如权利要求1至4中任意一项所述的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株在制备分子标记疫苗侯选株中的应用。
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- 2021-03-25 CN CN202110317145.4A patent/CN113005099A/zh active Pending
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