CN101928728B - 肠病毒类病毒颗粒的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及应用杆状病毒重组蛋白表达系统来制备肠病毒71型类病毒颗粒及其应用。通过修改杆状病毒载体设计，降低水解蛋白酶3CD表达及加强结构蛋白前驱物蛋白P1以增加类病毒颗粒(VLP)表达。该肠病毒类病毒颗粒能引发小鼠高抗体效价反应及中和效价反应，显示VLP可作为肠病毒71型的疫苗。

Description

肠病毒类病毒颗粒的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及应用杆状病毒重组蛋白表达系统来制备肠病毒71型类病毒颗粒、制造方法及其应用。

背景技术

肠病毒(Enterovirus)在分类上属于微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)，为单正股(positive，single strand)RNA病毒，感染途径主要通过粪便或呼吸道飞沫传染，能够感染人体多种系统器官，甚至造成器官功能衰竭的现象。传统上使用中和血清试验可将肠病毒分为脊髓灰白质炎病毒型(Polioviruses，PV)，克沙奇病毒A型(Coxsackieviruses A，CAV)，克沙奇病毒B型(Coxsackieviruses 2B，CBV)，人类肠道细胞致病性孤儿病毒(Enteric cytopathogenic human orphan viruses，即伊科病毒Echoviruses)，及68-71型肠病毒等。在肠病毒各血清型中，肠病毒71型的致病力特别高，常伴随着神经系统的并发症且有致死的可能。

肠病毒71型病毒颗粒是直径约为25-27nm的二十面体聚合大分子，但其详细组成等信息尚未清楚研究。目前对肠病毒的了解主要来自脊髓灰白质炎病毒(即小儿麻痹病毒)。根据小儿麻痹病毒的研究，肠病毒基因组全长约7500nt，包括单一开放读码框架(open reading frame，ORF，约6600nt)，两侧则分别为5’与3’未翻译区(untranslated regions，UTR)。此ORF可分为三区域：P1，P2及P3，并会被翻译为单一的多蛋白(polyprotein)。P1带有病毒壳蛋白：VP4，VP2，VP3及VP1。P2及P3则带有非结构性蛋白质如水解蛋白(protease)2A、3C、与3CD，以及病毒聚合脢3D^pol，主要负责病毒的复制并产生病毒毒性。以小儿麻痹病毒为例，肠病毒颗粒理论上是由60个VP1及VP3、58-59个VP2及VP4，与1-2个VP0分子(VP2及VP4未分开前的前趋物)所形成。VP1、VP2与VP3均位于病毒壳外层，而VP4则完全位于内层。对目前已研究较多的肠病毒，如小儿麻痹病毒、CAV与CBV，已有许多中和抗原决定部位(neutralization determinants)被发现主要位于VP1另有少数位于VP2与VP3。此外，这些结构蛋白质亦与病毒毒性减弱、病毒热稳定性、宿主范围、细胞驱向性等有关。

昆虫杆状病毒(baculovirus)一般简称为杆状病毒，属于杆状病毒科(Baculoviride)，其宿主局限于无脊椎动物，其中又以鳞翅目昆虫为其主要宿主。杆状病毒科可分成两个属，分别是颗粒体病毒属(Granulovirus，GV)以及核多角体病毒属(Nucleopolyhedrovirus，NPV)组成，差别在于包埋体蛋白质的不同。前者的包埋体较小，约为0.25-0.5μm，只包埋一颗病毒粒子；后者较大，约为1-15μm，主要由大小约为29kD的多角体蛋白(polyhedron)所组成，可以包覆较多的病毒粒子。NPV以其独特的感染周期及基因表达方式，可在稳定的细胞株中培养，使其具有发展为基因表达载体的潜力。目前最常作为杆状病毒表达载体的病毒是苜蓿尺蠖蛾核多角体病毒(Autograph californica nuclear polyhedrosis virus；AcMNPV)和家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus；BmNPV)，其主要宿主分别为蛾类和家蚕。

NPV的遗传物质为双股环状结构的DNA，大小约80-200kb，由长杆状蛋白鞘(nucleocapsid)包覆在内，外层再由脂蛋白被膜(lipoproteinenvelope)所包覆，形成长约40-50nm，宽约200-400nm的病毒结构。病毒在感染细胞后可产生出两种形态的病毒粒子：出芽型病毒粒子(buddedvirion；BV)与封埋型病毒粒子(occlusion body-derived virus；OV)。出芽型病毒粒子产生于感染周期的早期，感染后新生的nucleocapsid会由细胞核膜释出到细胞质里，并进一步穿出细胞膜；封埋型病毒粒子则产生于感染周期的后期，且其会被包埋在大小约30kDa的多角体蛋白质或晶形结构的蛋白质中，形成大小约1-15μm的多角体(polyhedron)或称之为封埋体。而实验室常用的杆状病毒均为出芽型病毒粒子。

杆状病毒表达载体目前已广泛应用在异源基因的表达系统上，为一种能快速、方便生产外源重组蛋白质的系统。至今已逾数百种源自病毒、细胞、真菌、原生物、以及动植物基因利用此系统生产出重组蛋白质。甚至一些较为复杂的蛋白质结构，例如类病毒粒子，也可在宿主体内表达。

杆状病毒表达载体系统是一种真核细胞病毒表达系统，将外来基因接于启动子的下游放入杆状病毒中，再利用此重组杆状病毒感染昆虫细胞，病毒基因启动子就可能会驱动此外来基因生产出重组蛋白质。而由于重组杆状病毒所感染的昆虫细胞是一种真核细胞，因此其蛋白质可进行各种翻译后修饰(post-translational modifications)，所以利用杆状病毒表达载体系统所生产的真核基因重组蛋白质，在抗原性、免疫性和生物活性上通常与其天然蛋白质相似。加上一般所使用的启动子为杆状病毒基因本身所具有的强势启动子(如：polyhedrin或是p10启动子)，所以本系统所产出的重组蛋白质产量相当大(1-600mg/L)。

除了可进行较佳的翻译后修饰外，使用杆状病毒表达系统尚有以下优点：(1)杆状病毒具有相当大的基因组(88-200kbp)，可容纳相当大的外来基因，使得同一株杆状病毒可同时携带两组以上的外源基因组。(2)因为重组杆状病毒的宿主仅局限于无脊椎动物，因此在安全性方面比起其它基因载体，例如腺相关病毒(AAV)等，更为安全。(3)重组杆状病毒本身具有足够的遗传信息来感染细胞并繁殖，所以不需要卫星细胞或卫星病毒(helper cell lines or helper viruses)的存在，相比较之下在后续的应用上较为广泛，例如腺相关病毒的生产往往需要腺病毒的存在，使得在纯化AAV时造成一些瓶颈。(4)重组杆状病毒/昆虫细胞系统因具有可悬浮培养的特性，可大规模地利用反应器生产，对于之后生产程序上的放大更为方便且快速。

现今肠病毒71型疫苗的发展方式主要有下列几种：

(1)将病毒以福尔马林去活化后制成去活化病毒疫苗。

(2)利用多次的病毒继代培养及筛选，以选殖出繁殖力强、毒性弱的新病毒株(YN3-4a)，进而利用这株新的病毒株作为减毒病毒疫苗(attenuated vaccine)。这种减毒病毒疫苗在初步的小鼠动物免疫测试实验中已有不错的成果。

(3)利用基因突变制造毒性减弱的EV71病毒株作为免疫抗原。在猴子免疫实验中已发现所产生的免疫血清具有中和不同血清型病毒的能力，并且由此突变的EV71减毒病毒引发的神经毒性相当轻微。

(4)以大肠杆菌大量表达基因重组VP1，再利用纯化后的VP1蛋白质作为亚单元疫苗(subunit vaccine)进行免疫测试。

(5)将VP1基因克隆入质粒中，制成DNA疫苗(DNA vaccine)，再将DNA疫苗注射入动物体内以表达VP1蛋白质，希望所表达的VP1可以顺利诱发免疫反应。

(6)利用减毒的鼠伤寒杆菌携带表达VP1蛋白质的质粒，在小鼠肠道表达VP1抗原以诱发强烈免疫反应作为口服活菌疫苗。

(7)利用基因转殖鼠，将VP1蛋白质表达在母鼠的乳汁中，做为小鼠的口服抗原。

(8)利用基因克隆的蕃茄，在蕃茄表达VP1蛋白质作为口服疫苗。

(9)直接使用化学合成的VP1肽链(VP1 peptide)作为免疫抗原以产生中和血清。

然而，类似(1)-(3)这些利用减毒病毒或是去活化病毒做为疫苗的方法，疫苗的本身都含有完整的病毒基因，因此仍然有病毒感染的安全性考虑，并且去活化病毒疫苗在处理过程也会失去部分诱发免疫能力。而像(4)-(9)这些直接使用纯化后的VP1蛋白质(或多肽)或是用载体表达VP1蛋白质的亚单元疫苗，其诱发的免疫效果也不理想，整体的效果仍比去活化病毒疫苗差。这可能是由于VP2与VP3亦有中和抗原决定部位，同时部分中和抗原决定部位与形状有关，甚至有些位于不同蛋白质间氨基酸上，单独用VP1作为亚单元疫苗可能会因此丧失了部分重要的抗原决定部位。因此，若能同时利用VP1，VP2，VP3与VP4作为抗原，并保留它们在野生病毒内的原有结构与形状，则理论上可诱发更多与更强的抗体。

类病毒颗粒(virus-like particle，VLP)是病毒外壳蛋白质所组成的壳状结构，不含病毒基因体，因此不会有传染复制的疑虑，使用上较为安全。由于类病毒颗粒与真实病毒相似，因此进入人体后，可诱发体内的免疫系统产生特定抗体以抵抗真实病毒的侵犯，达到保护的效果。目前常用的传统疫苗包括去活化疫苗及减毒疫苗，因其作法是将真实病毒是以外力方式使抗原决定位不活化或是降低其毒性，病毒的遗传物质仍然存在于疫苗当中，因此无法完全免除施打疫苗后被感染的机会；与前者相比较，类病毒颗粒和真实病毒相近的外壳则能保有和真实病毒较相近的抗原决定部位，引发良好的免疫反应以抵抗真实病毒的感染。因此，类病毒颗粒疫苗为极具潜力的一种疫苗形式。类病毒颗粒疫苗在国外已有相当的研究，且目前多数的类病毒颗粒都以杆状病毒/昆虫细胞表达系统制造，如小儿麻痹病毒，艾滋病毒，人类微小病毒，华式囊病毒等等。而一些临床上重要病毒的类病毒颗粒也都被表达出来，例如SARS冠状病毒、D型肝炎病毒、人类乳突病毒、禽流感病毒H5N1与流行性感冒病毒等，以进行更多的病毒疫苗研究。肠病毒71型近年来陆续在国内及各国爆发重大疫情，因此其病毒学，病理学与生物学方面的基本研究大量增加，对基因组成与变异性、致病性质、免疫性质等病毒信息有了更进一步的了解，因此对发展新一代的疫苗与检验试剂有相当大的帮助。但截至目前为止，肠病毒71型疫情的控制，主要还是依靠政府的公共卫生监控机制，包含疾病通报及防疫倡导，因此若要进行有效的预防或治疗，疫苗或抗病毒药物的开发具有极重要的地位。

发明内容

本发明改良杆状病毒的基因设计，希望新构建的杆状病毒(Bac-P1-C3CD)能通过降低3CD水解酶的表达量，而使得昆虫细胞能有更多资源以表达强势启动子polyhedrin下游的P1蛋白质。然而在不同细胞株之间有不同的胞外类病毒颗粒表达量分布。以Sf-9细胞作为宿主细胞，利用弱势启动子驱动3CD以增加VLP产量的策略，确有其功效；然而在以Hi-5进行生产时，却无法提升产量。这是由于Hi-5细胞对于强势启动子的感受性很强，而使得由弱势启动子驱动的3CD表达量过低，虽能有效大量表达P1蛋白，但却因为没有足够量的3CD能将P1完整切割成VP1、VP0、VP3，以致无法提升类病毒颗粒产量。另外，通过小量试产来讨论感染时的细胞浓度及MOI对于VLP产量的可能的影响，发现提高细胞浓度确实能够大幅增加VLP产量。综合所有实验结果，目前已可利用Bac-P1-C3CD在高细胞浓度(4×10⁶cells/ml)时感染Sf-9细胞并且在培养液中得到高产量的VLP。在胞外可收成的最大产量超过50mg/l，不仅是过去总产量(约10mg/l)的5倍以上，更可避免打破细胞，减少后续纯化时的困难度。

本发明提供一种表达病毒蛋白质的基因重组载体，其包括：(a)

强势杆状病毒启动子及一段连接于该启动子下游且与其作用的核苷酸序列，其中该核苷酸序列可翻译成病毒的病毒壳蛋白；以及(b)弱势启动子及一段连接于该启动子下游且与其作用的核苷酸序列，其中该核苷酸序列可翻译成水解病毒的病毒壳蛋白的水解蛋白，而其中强势杆状病毒启动子驱动连接于该启动子下游的核苷酸序列所翻译的蛋白质产量高于弱势启动子驱动连接于该启动子下游的核苷酸序列所翻译的蛋白质产量。

在本发明中所述的病毒指肠病毒，而最佳实施例为肠病毒71型。

在本发明中所述的强势杆状病毒启动子选自于杆状病毒多角体蛋白启动子或P10启动子，而弱势启动子选自于杆状病毒立即早期启动子、巨细胞病毒启动子或其它在杆状病毒内可作用的弱势启动子。

本发明亦提供一种重组杆状病毒，其包括可表达病毒蛋白质的杆状病毒基因重组载体，该重组杆状病毒用于感染宿主细胞以制备重组蛋白质，而重组蛋白质指肠病毒的病毒壳蛋白及水解蛋白。

本发明进一步提供一种表达病毒蛋白质的杆状病毒宿主细胞，该杆状病毒宿主细胞受到重组杆状病毒的感染。

在本发明中所述的杆状病毒宿主细胞为昆虫细胞，其选自于Sf-9或Hi-5细胞株，而最佳实施例为Sf-9细胞株，此外该宿主细胞用以制备类病毒颗粒并释放至细胞外。

本发明更进一步提供一种制备类病毒颗粒的方法，其步骤为(a)构筑可表达病毒蛋白质的基因重组载体；(b)将该载体导入杆状病毒以形成重组杆状病毒；及(c)以该重组杆状病毒感染宿主细胞以形成可表达病毒蛋白质的宿主细胞。进一步经培养后，离心上清液以取得类病毒颗粒，该类病毒颗粒为肠病毒的类病毒颗粒。

本发明进一步提供一种在制备预防病毒感染的疫苗中的用途，其中该物质选自于包括免疫有效量的重组杆状病毒，宿主细胞及该宿主细胞所释出的类病毒颗粒所组成的群组。而病毒指肠病毒。

附图说明

图1(a)-(c)表示重组杆状病毒载体的构建。EV71基因P1及3CD分别克隆进入pFastBac^TM DUAL质粒中，经过Bac-to-Bac System所建议的实验流程后即可制成病毒，图1(a)Bac-P1-3CD(以p10启动子驱动3CD表达)，图1(b)Bac-P1-C3CD(以CMV启动子驱动3CD表达)，图1(c)Bac-P1-I3CD(以IE-1启动子驱动3CD表达)。

图2(a)-(c)比较以三种病毒株(Bac-P1-3CD，Bac-P1-C3CD，Bac-P1-I3CD)在不同细胞内生产肠病毒71型类病毒颗粒的产量。当细胞浓度约达1×10⁶cell/ml时，以MOI 10感染细胞，感染后2，3或4天(dayspost-infection，dpi)，收取细胞液，以低速离心将细胞离心下来，收取上清液作为胞外类病毒颗粒样品。图2(a)以西方墨点法分析Sf-9细胞的表达量。图2(b)以西方墨点法分析Hi-5细胞的表达量。图2(c)以ELISA定量不同基因重组杆状病毒在感染Sf-9细胞(□)，及以Bac-P1-3CD感染Hi-5细胞(■)后72小时类病毒颗粒的总产量。上述的实验皆于100ml spinner flask操作，实验中所使用的培养基皆为SF-900II。实验结果为三次独立细胞培养实验的平均值。

图3表示不同细胞浓度对于肠病毒71型类病毒颗粒产量的影响。当Sf-9细胞(□)浓度约达1-，2-，4-或6×10⁶cells/ml时，以Bac-P1-C3CD感染细胞(MOI 10)。或者当Hi-5细胞(■)浓度达1-或2×10⁶cells/ml时，以Bac-P1-3CD感染细胞(MOI 10)。感染后72小时后取样，将细胞离心下来，再收取上清液以ELISA定量类病毒颗粒的浓度。上述的实验皆于100mlspinner flask操作，实验中所使用的培养基皆为SF-900II。实验结果为三次独立细胞培养实验的平均值。

图4表示

反应器内不同溶氧量对于类病毒颗粒产率的影响。当Sf-9细胞达1×10⁶cells/m时接种入反应器内，并以SF-900II培养。培养时溶氧量控制在50％，当三天后细胞浓度达4×10⁶cells/ml时，以Bac-P1-C3CD(MOI 10)感染细胞，感染后溶氧量分别控制为15、30或60％，以比较不同溶氧量对于VLP产量的影响。实验正对照组是以相同感染条件(4×10⁶cells/ml，MOI 10)，但生产于旋转角瓶(未控制溶氧量)的类病毒颗粒产量。实验结果为一次独立细胞培养实验的平均值。

图5(a)-(d)表示类病毒颗粒的外型、大小及表面蛋白。图5(a)与图5(b)为穿透式电子显微镜照片。图5(c)与图5(d)为免疫金染色配合穿透式电子显微镜确认类病毒颗粒上含有VP1蛋白。实验样本为以Bac-P1-C3CD感染Sf-9细胞后，纯化所得到的类病毒颗粒(图5a与图5c)，或是以Bac-P1-3CD感染High-5细胞，经纯化得到的类病毒颗粒(图5b与图5d)。Bar，100nm。

图6表示纯化后类病毒颗粒注射于小鼠所引发的anti-EV71IgG抗体效价分析。负对照组PBS：以灭菌过的PBS与佐剂混合(1∶1)作为注射样品。负对照组r-BV：以不带有任何外源蛋白基因的r-BV感染Sf-9。正对照组EV71：以蔗糖不连续梯度离心法所纯化得到的肠病毒71型病毒。正对照组Bac-P1-3CD：以Bac-P1-3CD感染Hi-5细胞所生产的类病毒颗粒。实验组Bac-P1-C3CD：以Bac-P1-C3CD感染Sf-9细胞所生产的类病毒颗粒。这五组样品分别与佐剂混合，注射入小鼠腹腔，并在第四周进行加强注射。血清在第7周收集，进行序列稀释(最低稀释倍率为2³)，再进行分析。

图7(a)-(b)表示类病毒颗粒所诱发的抗体对于不同肠病毒株的中和效价测试。图7(a)表示血清对于肠病毒株TW/2272/98(genogroup C2)的中和效价。图7(b)表示血清对肠病毒71型genogroup B5病毒的中和效价。负对照组PBS：以灭菌过的PBS与佐剂混合(1∶1)作为注射样品。负对照组r-BV：以不带有任何外源蛋白基因的r-BV感染Sf-9。正对照组EV71：以蔗糖不连续梯度离心法所纯化得到的肠病毒71型病毒。正对照组Bac-P1-3CD：以Bac-P1-3CD感染Hi-5细胞所生产的类病毒颗粒。实验组Bac-P1-C3CD：以Bac-P1-C3CD感染Sf-9细胞所生产的类病毒颗粒。这五组样品分别与佐剂混合，注射入小鼠腹腔，并在第四周进行加强注射。血清在第7周收集，进行序列稀释(最低稀释倍率为2³)，再进行分析。进行分析时，血清的最低稀释倍率为2³。

具体实施方式

材料

细胞培养

昆虫细胞培养

本发明中所使用的两种昆虫细胞分别是Sf-9及Hi-5。Sf-9细胞株分别以Sf-900II及带有10％胎牛血清和0.1％(w/v)Pluronic F-68的TNM-FH两种培养基进行培养，并于spinner flask中以转速90rpm悬浮培养于5％CO₂的27℃恒温培养箱中。Hi-5细胞株则以Sf-900II无血清培养基进行培养，放置于5％CO₂的27℃恒温培养箱以转速90rpm在spinner悬浮培养。本发明使用TNM-FH培养基培养的Sf-9进行重组杆状病毒的生产及病毒放大，使用Sf-900II培养的Sf-9进行肠病毒71型类病毒颗粒的生产。

哺乳动物细胞培养

本发明中所使用的哺乳动物细胞主要为人类胚胎横纹肌肉瘤细胞(Human Embryonal rhabdomyosarcoma，RD)，RD细胞以含10％胎牛血清及PSN抗生素的Alpha minimal Essential medium(α-MEM)培养液进行培养，放置于5％CO2的37℃恒温培养箱于培养盘中贴附培养。本发明使用RD细胞主要作为肠病毒的宿主细胞，以进行肠病毒的培养增殖。

重组杆状病毒

重组杆状病毒载体

本发明使用

杆状病毒表达系统来进行病毒制备，并以系统中的pFastBac DUAL质粒作为基因骨架，构建重组杆状病毒。此质粒具有两个杆状病毒的后期强势启动子，分别为杆状病毒多角体蛋白启动子(polyhedrin promoter)及p10启动子，而在两个启动子下游各有一个多重克隆位点(Multiple cloning site，MCS I及MCS II)，可将外来基因克隆入表达外来基因。因此根据已发表的肠病毒株TW/2272/98的序列，本发明将带有病毒外壳蛋白的P1基因连接至polyhedrin启动子下游，将3CD基因接至p10启动子下游，并命名此一病毒为Bac-P1-3CD。此外，本发明也将3CD基因连接至弱势启动子下游，分别为IE-1启动子(baculovirusimmediate early promoter)及CMV启动子(cytomegalovirus)下游，命名为Bac-P1-I3CD及Bac-P1-C3CD(如图1(a)-(c))。

重组杆状病毒放大

本发明中重组杆状病毒的放大是使用Sf-9细胞株及有10％胎牛血清的TNM-FH培养基。放大病毒时，需先将Sf-9细胞株培养于旋转角瓶(Spinner Flask)中，待细胞浓度达到约1×10⁶cell/ml时，将细胞以500×g的转速离心10分钟，抽去9/10的培养基，使细胞回溶在1/10原始体积的培养基中。此时加入病毒感染剂量(multiplicity ofinfection，MOI)为0.05pfu/cell(溶菌斑形成单位/细胞，plaque forming units per cell)的病毒液，于室温下均匀摇晃一小时后，以新鲜培养基补回至原始体积，并置入spinner在27℃恒温培养箱悬浮培养。感染4～6天后，观察细胞存活率，当细胞存活率降至60～70％时，以3000×g的转速离心10分钟以去除细胞及其碎片，收集上清液(即病毒液)避光保存于4℃冰箱中，若需长期保存则置于-80℃冰箱中。

终点稀释法定量病毒效价

终点稀释法首先需先将病毒液以TNM-FH培养基作10倍的连续稀释，之后再将病毒液与浓度为1×10⁵cell/ml的Sf-9细胞，以150μl病毒液对1350μl细胞液的比例混合，加入96孔盘中，每个病毒稀释倍率作12孔。之后将96孔盘置入27℃恒温培养箱中培养13天，在光学显微镜下，观察细胞被感染的情形，最后以统计学方法计算病毒效价(titer)，此病毒浓度称之为感染效价(infectious titer)，单位为pfu/ml(溶菌斑形成单位/毫升，plaque forming units per milliliter)。

纯化肠病毒71型类病毒颗粒

肠病毒71型类病毒颗粒的生产

本发明中使用Sf-9及Hi-5两种细胞株来生产EV71VLP。当悬浮培养中的细胞浓度达到约1-6×10⁶cell/ml时，加入MOI为0.001-10pfu/cell的病毒液，再将spinner放入27℃恒温培养箱。为了决定EV 71VLP最佳的收成时间，于感染后每24小时取样一次细胞液，并西方墨点法分析VLP的产量。

生物反应器生产肠病毒71型类病毒颗粒

本发明目的在于增加类病毒颗粒的单位体积产率，当确认最佳生产条件后将尝试以实验室及生物反应器生产类病毒颗粒。本发明采用Sartorius

发酵槽进行生产。

属于搅拌式生物反应器，利用无气泡通气系统进行通气。本发明以电子气体混和装置调控氮气、氧气及空气的混和比例，并于槽体上空气部分以打气泵通气来增加溶氧量，将旋转叶片转速调控在100rpm，将温度控制在27度。

胞内肠病毒71型类病毒颗粒的萃取

将感染后72小时的Sf-9细胞离心10分钟收取细胞，去除培养基后，将细胞回溶至TNE缓冲液(40mM Tris，100mM NaCl，2mM MgCl₂，1mMEDTA，pH 7.4)中，置入-80℃冰箱，利用重复冰冻/解冻三次以将细胞打破。之后加入1/10体积的组织分解溶液(lysis buffer，10％NP-40，40mMTris，100mM NaCl，2mM MgCl₂，1mM EDTA，pH 7.4)，静置于冰上反应30分钟。将反应后的细胞液离心30分钟，收取上清液，此时所得的上清液即含有类病毒颗粒蛋白质。

胞外肠病毒71型类病毒颗粒的收集

将感染后不同时间点(如72或96小时)的Sf-9细胞离心30分钟后收取上清液。

以蛋白质定量法定量类病毒颗粒的总蛋白浓度

配置不同浓度的牛血清蛋白(BSA，bovine serum albumin)标准品溶液(12.5-1.5625μg/ml)后，本发明将每个浓度的标准品取400μl与100μl蛋白质染剂(BioRad protein assay)混合均匀，置于室温下10分钟，量测在波长595nm下的吸光值(OD)，制作出标准品BSA的检量线(25μg/ml-1.5625μg/ml)。在同时本发明将通过超高速离心后纯化而得的类病毒颗粒样品以1∶20倍稀释后，取400μl与100μl蛋白质染剂混合均匀，置于室温下10分钟，测量其在OD₅₉₅的吸收值，可由BSA标准品的吸光值所绘出的检量线推算出类病毒颗粒总蛋白浓度。

肠病毒71型的纯化

本发明使用肠病毒71型为TW/2272/98(属于genotype C2)及genotypeB5。TW/2272/98为1998年台湾首次爆发肠病毒大流行时所分离出的病毒株，而genotype B5则为2007年至2008年肠病毒流行时的主要病毒株，经基因测序后证实为genotype B5。实验中利用RD细胞来进行所有病毒株的培养增殖，病毒的培养流程如下：RD细胞于15cm培养盘内培养至约8成满时，抽掉原来的培养液并加入15ml Phosphate-buffered saline(PBS)缓冲液以清洗残余培养液，清洗完细胞后将PBS去除。另外本发明以10ml不含胎牛血清的α-MEM培养液稀释肠病毒71型病毒液，将稀释的病毒液加入培养盘中，之后将培养盘放置于摇晃板上作用1小时进行病毒感染。经1小时病毒吸附后，去除含有病毒的α-MEM培养液，接着加入含2％胎牛血清及PSN抗生素的α-MEM培养液，在37℃培养箱中培养。当70％细胞产生细胞变大、脱落等典型的细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)后，收集感染后的培养液离心10分钟(5000rpm)，离心后收取上清液。此外收集感染的细胞与培养液，在溶液中添加NP-40(最后浓度1％)以帮助病毒由细胞破片中释出，并利用两次冷冻/解冻的方式将细胞打破。细胞破片经过6000rpm、10分钟离心去除后，将含有病毒的溶液储存于-80℃或直接进行纯化。进行纯化时，将样品置于4℃的环境下并持续搅拌，在持续搅拌的环境下先缓慢加入氯化钠至浓度2％(w/v)，氯化钠完全融化后，再缓慢加入聚乙烯丁二醇8000(PEG 8000)至浓度14％(w/v)(替代方法：以TNE缓冲液为溶剂配置60％(w/v)PEG 8000溶液，缓慢加入病毒液中至PEG 8000的浓度为14％(w/v))。PEG 8000都溶解后，将样品留置于4℃的环境下并持续搅拌overnight，利用PEG 8000将使病毒沉淀。沉淀过程完成后，以6000rpm高速离心30分钟将上清液和沉淀物分离，沉淀物以1/10原始病毒体积的TNE缓冲液回溶。将蔗糖溶于TNE缓冲液中，分别配置成重量百分浓度为25％、40％(w/v)的蔗糖溶液，再以针筒及18号长针头依蔗糖(浓度25％、40％的顺序)，将溶液由底部注入容量为11ml的超高速离心管中，体积分别为5、3ml；高浓度的溶液由底部注入时，能够将低浓度的蔗糖溶液抬升，可以减少不同浓度间溶液的混和。完成25-40％的蔗糖梯度后，再将5ml的样品小心加在管中溶液的最上层。将所要离心的离心管都依上述步骤完成后，再挂上悬篮式离心陀(Swinging bucket)，以100000×g、4℃离心4小时(P40ST rotor，30000rpm，113000×g，CP100MX，Hitachi)。之后以针筒及长针头由底部慢慢吸取溶液，以每0.5ml为单位收集成一管，并以西方点墨分析VLP于各管中的含量病毒会位于25％及40％中间的界面，以针头收集界面的带状物质(band).。分析完后将含有VLP的部分集中，稀释于约10倍样品体积的TE缓冲液中，再以超高速离心30000rpm、2小时将肠病毒离心沉淀；除去上清液后加入适当的PBS缓冲液回溶底部的沉淀物，不溶的部分以4500×g、10分钟的离心方式将之去除，此上清液即含有纯化后的肠病毒。纯化后的病毒均根据终点稀释法分析其病毒效价。病毒效价是根据已感染细胞的典型细胞病理变化(CPE)的原理，以终点稀释法(end-point dilution)测定。所得病毒效价单位为TCID50。实验方式是将RD细胞培养于96孔细胞培养盘，当细胞繁殖至约80％满时，待测的病毒以含2％胎牛血清及PSN抗生素的α-MEM培养液进行连续10倍率稀释(10^-2-10^-10)，将原本的培养液抽取出，取100μl的稀释病毒到个别孔中，每个稀释倍率至少感染12个孔。感染完后于37℃、5％CO2培养箱中培养3天，感染结束后观察纪录每孔中细胞的CPE，利用终点稀释法公式进行分析。

实施例一

VLP特性分析方法

西方墨点法(Western blotting)

利用垂直式转印槽将分离完的SDS-PAGE的蛋白质样本转印至硝化纤维膜(0.45μm，NC membrane)。转印前先剪一张与凝胶大小相同的NCmembrane，与胶体一起浸润于转印缓冲液(transfer buffer，2.5mM Tris，192mM glycine，20％v/v methanol，pH 8.3)五分钟然后将NC membrane置于胶体之上，并在其上下各放一张以transfer buffer浸润过的滤纸，转印电流为100V，时间60分钟。将转印好的membrane置于固定缓冲液(blockingbuffer，25mM Tris，150mM NaCl，5％nonfat powdered milk，pH 7.4)中，室温一小时或4℃隔夜。接着以稀释1500倍的mouse anti-VP1单株抗体为第1级抗体，辨识膜上的VP1蛋白质，在室温作用2小时或4℃作用隔夜，然后以washing buffer(TBST，0.05％Tween-20in TBS)清洗三次，每次约10分钟，以稀释2500倍的Alkaline Phosphatase-conjugated goatanti-mouse IgG单株抗体作为第2级抗体，辨识抓取第1级抗体，室温作用一小时，接着使用呈色剂5-bromo-4-chloroindoxyl phosphate(BCIP)/nitroblue tetrazolium(NBT)呈色。

酶联免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

ELISA又可分为direct与sandwich两种方法，本发明采用sandwichELISA的方式以提高精准性。吸附用抗体(rabbit anti-VLP多株抗体)以1∶10000稀释后，分别各取100μl到ELISA的96孔微量滴定盘的各个孔中，置于室温下2个小时或是放于4℃隔夜使抗体吸附到孔中的底部。吸附完成后将溶液吸出，以100μl清洗液PBS-T(0.05％Tween 20 in PBS buffer)注入各个孔，在室温下静置10分钟后将清洗液取出，重复清洗的步骤共4次。最后一次取出清洗液后，每孔加入100μl blocking buffer(含1％BSA的PBST溶液)在室温反应1小时，将孔中底部的所有空隙都填补上蛋白质，接着以清洗液重复清洗4次。取出清洗液后，加入100μl的稀释后(样品稀释倍率为1∶100)待测样品(如含类病毒颗粒的细胞液)或肠病毒71型类病毒颗粒标准品(标准品由0.5μg/ml以两倍序列稀释直到0.015625μg/ml)，标准品为胞内生产的类病毒颗粒通过超高速离心法纯化而得，在室温下反应2小时后，接着以清洗液重复清洗4次。取出清洗液后，加入100μl、稀释500倍的EV71单株抗体(mouse IgG_2b monoclonal antibody)，在室温下反应2小时，接着以清洗液重复清洗4次。取出清洗液后，加入100μl、稀释2000倍的goat anti-mouse IgG conjugated with HRP二级抗体，在室温下反应1.5小时，再以清洗液重复清洗4次。在最后一次清洗时，配制TMB(3，3’，5，5’-tetramethyl benzidine)呈色剂，将1mg TMB溶于1mldimethyl sulfoxide(DMSO)中，再加入9ml的Phosphate-Citrate Buffer(0.1M NaH₂PO₄和0.1M citric acid，以磷酸调整到pH 5)，取出清洗液后，每个孔中加入100μl TMB进行呈色反应，在37℃下反应约15分钟，直到反应试剂呈现明显蓝色。接着在每个孔中加入50μl、2M H₂SO₄以中止呈色反应，再将微量滴定盘置于ELISA reader中，以波长450nm读取其ELISA数值。根据类病毒颗粒标准品的浓度及所得的吸光值，本发明做出检量线后，再对待测样品中的类病毒颗粒作相对定量。

穿透式电子显微镜(Transmission Electron Microscopy，TEM)

本发明将纯化后的VLP样品以超高速离心沉淀在离心管下方后，以100μl ddH₂O回溶。于室温下，将10μl(浓度调整为约50μg/ml)纯化后的VLP样品液滴在TEM铜网上方，静置吸附5分钟后，以滤纸吸干多余液滴。取10μl的2％phosphotungstic acid(PTA，以NaOH调整到pH 7.2)滴于铜网上负染3～5分钟。最后再以滤纸吸除多余染剂，将铜网样品面朝上，置于除湿下的冷气房中，待隔夜风干后即可直接利用穿透式电子显微镜观察。

免疫金染色及穿透式电子显微镜观察

在进行免疫金粒子的标定实验时，本发明先将TEM铜网置于石蜡封口膜(parafilm)上，取约10μl(浓度为50μg/ml)的类病毒颗粒样品滴在镀碳铜网上，静置约5分钟后以棉纸吸掉多余的样品，接着将10μl的磷酸盐缓冲溶液滴在镀碳铜网上清洗掉多余的蛋白质并以棉纸吸掉多余的PBS，重复清洗的步骤三次。清洗完后，将anti-VP1抗体以PBS稀释(1∶200稀释)后，取10μl稀释液滴在铜网上，静置1小时使抗体辨识吸附到样品上。当抗体反应时间结束后，重复上述清洗方法，以PBST清洗铜网表面三次，接着把二级抗体以1∶1000的比例稀释于PBS中，取稀释后抗体10μl滴在铜网上，二级抗体上连接大小为5nm的金粒子，能够在电子显微镜下明显呈现。二级抗体反应1小时后，以PBST清洗铜网表面三次，清洗完后以棉纸吸干铜网表面溶液，取10μl的2％磷酸钨溶液滴在铜网上，静置染色三分钟后，利用棉纸将多余的染剂吸干，置于烘箱中干燥约12小时，再以穿透式电子显微镜观察。

结果

病毒株与细胞株组合筛选

从先前实验室研究得知，利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统共同表达肠病毒71型的蛋白质P1(以polyhedrin强启动子驱动)及3CD(以p10强启动子驱动)，P1在表达后可被3CD切割成VP0，VP1与VP3，进一步在细胞内自发性地组装形成类病毒颗粒。所制备出的杆状病毒命名为Bac-P1-3CD(见图1(a)-(c))。为提升类病毒颗粒的产量，本发明猜测少量的3CD水解酶即能使得P1蛋白被切割并形成类病毒颗粒。因此，本发明将P10启动子换成在昆虫细胞内较弱势的启动子(IE-1及CMV启动子)，希望能够通过降低3CD水解酶的量，使得P1蛋白表达量增加，进一步提高类病毒颗粒的产量。因此本发明也将3CD基因接至弱势启动子，如IE-1启动子及CMV启动子下游，制备出另外二株病毒，Bac-P1-I3CD及Bac-P1-C3CD(见图1(a)-(c))。重组杆状病毒Bac-P1-3CD、Bac-P1-C3CD、Bac-P1-I3CD皆可表达P1及3CD重组蛋白。

建构杆状病毒株完成后，以悬浮培养法在Spinner Flask培养Sf-9及Hi-5细胞，在细胞浓度达到约1×10⁶cell/ml时，分别以Bac-P1-3CD、Bac-P1-C3CD及Bac-P1-I3CD以MOI 10进行感染。于感染后48，72，96小时收取细胞液以10000×g离心10分钟，再以西方墨点法初步侦测VP1蛋白表达。就Sf-9细胞而言，由图2(a)中，比较三株杆状病毒的VP1产量，发现不论在感染后那一天所收取的细胞上清液，Bac-P1-3CD所表达的VP1蛋白产量都比重组杆状病毒Bac-P1-C3CD及Bac-P1-I3CD的产量来得低。Bac-P1-C3CD及Bac-P1-I3CD则在感染后第四天可以达到最高的VP1产量，且Bac-P1-C3CD所产生的胞外VP1产量最高。接着，以理论上表达量较高的昆虫细胞株Hi-5进行类病毒颗粒的生产，以和Sf-9相同的实验条件进行病毒感染及细胞上清液的收成分析。实验结果经Westernblot分析后如图2(b)。相反地，Bac-P1-C3CD及Bac-P1-I3CD在感染Hi-5细胞后，VP1蛋白的产量远比Bac-P1-3CD少，且VP1蛋白的表达随时间逐渐下降。但反观以Bac-P1-3CD感染Hi-5的VP1蛋白表达则随着时间而逐渐增加。

为了得知用哪种杆状病毒及昆虫细胞株，可得到最高的类病毒颗粒产量。本发明以Western blot结果中表达量较好的几组实验组再进一步地进行ELISA分析。将三株病毒株感染Sf-9细胞，或是以Bac-P1-3CD感染Hi-5细胞，共四组实验条件，在感染第四天以ELISA分析上清液内类病毒颗粒的表达量。结果如图2(c)，以Bac-P1-3CD及Bac-P1-I3CD感染Sf-9细胞的胞外类病毒颗粒的产量分别为1.5mg/L及7.8mg/L，而Bac-P1-C3CD组别的产量最高，可达到12.5mg/L。若以Hi-5为宿主细胞时，Bac-P1-3CD组别可达12.1mg/L。此两组感染细胞及病毒组合产生的VLP产量较佳且结果相近。因此本发明选定两个细胞与病毒组合(以Bac-P1-C3CD感染Sf-9细胞及以Bac-P1-3CD感染Hi-5细胞)来进行最佳感染细胞浓度(CCI，Cell Concentration at Infection)条件探讨。

最佳感染浓度探讨

除了改良杆状病毒的基因设计，亦探讨感染时的细胞浓度对于VLP产量的影响。首先，本发明在Sf-9细胞浓度达到1×10⁶、2×10⁶、4×10⁶及6×10⁶cells/ml时，以MOI 10的Bac-P1-C3CD感染Sf-9细胞，取感染后第4天的细胞上清液，以ELISA分析胞外类病毒颗粒产量。如图3所示，当细胞浓度增加时，类病毒颗粒的产量亦有所提升，以4×10⁶cell/ml进行生产时可有最高产量43.3mg/L。但过高的细胞浓度(6×10⁶cell/ml)则可能因为养分短缺使得细胞存活率快速下降，反而造成类病毒颗粒产量下降。

在Hi-5部分，由于以SF-900II培养Hi-5细胞在旋转瓶内之最大细胞浓度为3×10⁶cells/ml，因此在细胞浓度达到1×10⁶及2×10⁶cell/ml时进行感染，并且在感染后第4天收取细胞上清液，以ELISA定量分析胞外类病毒颗粒产量。如图3所示，在固定剂量(MOI 10)条件下，提高感染时的细胞浓度的确能提升VLP产量，与Sf-9细胞的结果相似。当细胞浓度达2×10⁶cell/ml可以有最高的类病毒颗粒量22.2mg/L。

综合以上结果，Sf-9细胞在细胞浓度达到4×10⁶cell/ml时以MOI 10的Bac-P1-C3CD病毒剂量进行感染，在第四天可得最大产量。因此决定以此条件进行感染，并于第四天收取上清液，做为后续反应器生产类病毒颗粒之生产参数。也将此感染条件所收取的细胞液以高速离心机离心30分钟(18000rpm)后，收取上清液，再进行初步纯化作为后续小鼠实验的抗原。

反应器生产类病毒颗粒

在旋转角瓶中确定类病毒颗粒最佳生产条件后，尝试以实验室等级搅拌式生物反应器来生产类病毒颗粒。实验中调整不同的溶氧量值(DO15％、30％、60％)，以比较不同的溶氧量对于胞外类病毒颗粒产量的影响。相同生产条件但于旋转角瓶所生产的类病毒颗粒产量则做为正对照组(positive)。ELISA分析结果(图4)显示，在反应器内所生产的类病毒颗粒产量比旋转角瓶所生产的类病毒颗粒产量来的高。此外，溶氧量控制在30％的类病毒颗粒表达量最高，在第四天后的最大产量可达64.3mg/L。因此在反应器溶氧量的部分，选定溶氧量为30％为反应器生产参数。

类病毒颗粒定性分析

以Bac-P1-C3CD生产的类病毒颗粒产量较先前以Bac-P1-3CD生产类病毒颗粒的产量有大幅增加。为确认以Bac-P1-C3CD生产出来的类病毒颗粒与Bac-P1-3CD生产出来的类病毒颗粒有相同基本性质，本发明以Bac-P1-C3CD感染Sf-9细胞所生产出来的类病毒颗粒为实验组，而以Bac-P1-3CD感染Hi-5细胞所生产的类病毒颗粒为正对照组，进行后续各项定性分析。

离心纯化后的类病毒颗粒(包含实验组及正对照组)以磷钨酸做负染色后，利用生物型穿透式电子显微镜观察。由图5(a)可以发现，本发明所纯化出来的VLP有类似圆形的形状，颗粒大小约为25-30nm，和实际病毒颗粒(27nm)大小相似，并与先前利用Bac-P1-3CD感染Hi-5细胞后，收取胞外上清液经由PEG沉淀结合胶体过滤层析法纯化所得到的VLP(图5(b))，在外观及大小上并无太大差异。颗粒中间呈现黑色，可能是颗粒内部被染剂渗入所造成的，因此推测这些应该为中空的颗粒球。

为了进一步证明这些颗粒就是肠病毒71型VLP，本发明以anti-VP1单株抗体辨识并抓取肠病毒VLP上的VP1蛋白质，接着以连接金粒子(5nm)的二级抗体辨认抓取VP1单株抗体，如此完成的免疫金标志以穿透式电子显微镜观察，结果如图5(c)所示。图中可以隐约看出VLP的分布，但可能是因为使用较多抗体蛋白质，和单纯的负染色结果相比较，颗粒的外观变的较为模糊。图中可以明显看出5nm金粒子的小黑点，这些小黑点绝大部分都包围在类病毒颗粒附近，因此确认这些颗粒含有肠病毒VLP蛋白质VP1。同时也将实验结果与先前实验室以Bac-P1-3CD感染Sf-9细胞后，打破细胞并利用超高速离心法所纯化类病毒颗粒后，以上述同样的抗体进行免疫金标志及电子显微镜观察的结果做比对，如图5(d)也发现金粒子都包围类病毒颗粒附近。

综合以上结果，以穿透式电子显微镜观察到两组类病毒颗粒的粒径大小与形状相同，也从免疫金染色当中证明VP1位于类病毒颗粒的表面。在此可以初步结论以Bac-P1-C3CD感染Sf-9细胞后所生产的类病毒颗粒与实验室原先以Bac-P1-3CD感染Hi-5细胞或是Sf-9细胞所生产的类病毒颗粒的基本性质是非常近似的。

实施例二

小鼠免疫实验分析

小鼠免疫及血清样本收集

为了了解纯化后的类病毒颗粒在免疫性质上的表达，本发明以腹腔注射的方式进行动物实验。在样品纯化完成后，先将总蛋白质浓度调整成40μg/ml，存放于-80℃冰箱中。Female BALB/c mice是由国家动物中心订购，并送往清大动物房进行检疫后，在小鼠周龄为6～8周时进行腹腔注射。进行腹腔注射前，将样品与相同体积的佐剂(complete Freund’s adjuvant forpriming injection，Sigma，cat#F5881；incomplete Freund’s adjuvant forbooster injection，Sigma，cat#F5506)以三向阀进行混合约3分钟，待样品混合均匀呈白色乳胶状。每只小鼠以500μl(10μg total protein/mouse)混合后的乳胶状样品进行腹腔注射，此时标示为第0周。于第四周时，以相同样品准备方式及注射方式(但佐剂为incomplete Freund’s adjuvant)进行加强注射(booster injection)。在第7周时，利用脸部采血法收集小鼠血液，采集得来的小鼠血液，置于4℃冰箱4小时后，以2000×g离心10分钟。所得澄清的小鼠血清以56℃去活化30分钟后，再进行后续分析。实验组别包括以下五组：(1)PBS组：为了消除佐剂对于实验数值的影响，本发明将PBS混合佐剂后进行相同注射，并以此组所收集的血清作为数值评估的依据。(2)负对照组(rBV)：为了了解抗体反应是否确实来自类病毒颗粒，而非其它杂蛋白质所造成的误差，本发明以一株未带有任何外源蛋白基因的重组杆状病毒感染Sf-9细胞后，利用与实验组相同的纯化程序进行纯化，收集相同位置的蛋白质，以此作为负对照组。(3)正对照组(EV71)：以蔗糖不连续梯度离心法所纯化而得到的肠病毒，纯化后的肠病毒尚具有感染力，因此以56℃加热30分钟去活化。(4)正对照组(Bac-P1-3CD)：以Bac-P1-3CD感染Hi-5细胞所生产出类病毒颗粒。(5)实验组(Bac-P1-C3CD)：以Bac-P1-C3CD感染Sf-9细胞所生产出类病毒颗粒。每一组实验动物只数为四只。

抗体效价

首先配置Coating buffer；以ddH₂O先配制0.1M Na₂HPO₄(pH约9.0)及0.1M NaH₂PO₄(pH约4.5)。再取固定量0.1M Na₂HPO₄溶液以0.1MNaH₂PO₄将pH调至6.8即为Coating buffer(pH 6.8)。接着将纯化而得的肠病毒经由蛋白质分析定量出总蛋白量，并以Coating buffer稀释到总蛋白浓度为5μg/μl后，在96孔盘加入100μl，在37℃静置一小时使抗原吸附到孔中的底部。吸附完成后将溶液吸出，以200μl清洗液PBS-T(0.05％Tween 20in PBS buffer)注入各个孔，于室温下静置3分钟后，将清洗液取出，重复清洗的步骤共3次。最后一次取出清洗液后，加入100μl的blockingbuffer(0.1％BSA in PBST)后在37℃下静置反应1小时，将孔中底部的所有空隙都填补上蛋白质，接着以清洗液重复清洗3次。

取出清洗液后，加入100μl稀释后的小鼠血清(以blocking buffer在eppendorf中做连续两倍稀释，稀释倍率为2⁵到2²⁰)，在37℃下静置反应1小时。以清洗液重复清洗3次后，加入100μl稀释5000倍的goatanti-mouse IgG conjugated with HRP二级抗体，在37℃下静置反应1小时，再以清洗液重复清洗3次。接着加入100μl/well TMB进行呈色，在室温下反应。待呈现明显蓝色后，在每个孔中加入50μl的2M H₂SO₄以中止呈色反应，将微量滴定盘置于ELISA reader中，以波长450nm读取其ELISA数值。

读取吸光值(OD)后，首先必须先检查阴性组别(注射PBS组)的OD值是否小于0.2，若大于0.2则应判定为测试无效，需重新检测。而阳性组别的判定为比阴性组别大0.2的OD值。例如，若阴性组别的吸光值为0.2，则若实验组稀释至216后，吸光值低于0.4(0.2+0.2)，则此实验组效价判定为15。

中和效价

首先将贴附培养的RD细胞以Trypsin脱附下来后，稀释成2×10⁵cells/ml，并将悬浮细胞量种入96孔盘(100μl/well)，置于5％CO₂的37℃恒温培养箱中过夜。接着以含有2％FBS及1％PSN antibiotic的α-MEM对去活化后的小鼠血清样品进行2倍的连续稀释(2³～2¹⁵)，并与相同体积的2000 TCID₅₀ live EV71(混合后为1000 TCID₅₀ EV71)均匀混合后，置入37℃恒温培养箱中进行中和反应1小时。接着，自37℃恒温培养箱中取出培养隔夜的RD细胞，将培养液抽去后，加入100μl/well已反应1小时的血清病毒混合液，之后置入37℃恒温培养箱培养。3天后，观察96孔盘中CPE的情形。

根据CPE的情形，能保护50％well不产生CPE的血清稀释倍率，该稀释倍率即为该血清样品的中和抗体效价。例如，2¹²以后的稀释倍率组别中和反应皆停止(出现CPE的well数大于50％)，则2¹¹即为该血清样品的中和抗体效价。

交叉保护效果(cross reaction)分析

本发明利用抗体中和试验，分析以YN3 strain VLP所诱发的小鼠血清，对于中和不同strain肠病毒71型感染力的效果。实验方式与中和试验类似，首先将贴附培养的RD细胞以Trypsin脱附下来后，稀释成2×10⁵cells/ml的浓度，并将悬浮细胞种入96孔盘(100μl/well)。接着以含有2％FBS及1％PSN antibiotic的α-MEM对去活化后的小鼠血清进行2倍的连续稀释(2³～2¹⁵)，稀释后的血清混合加入不同血清型的肠病毒71型(如TW/2272/98 strain及B5 strain)，所有使用的病毒剂量均为100TCID₅₀，混合后的样品于室温下反应约1小时，反应完成后移除96well培养盘中的培养液，再将100μl小鼠血清与待测病毒的混合液加入培养孔中(最后病毒浓度100TCID₅₀/well)，并于37℃培养箱中培养3天后观察96孔盘中细胞病变现象的情形，并依据所述的中和效价判定方法来确定血清的中和效价。

统计分析

数值差异性的分析法，是用至少三次重复实验的数据，以t检验(Student’s t-test)进行统计分析。计算出的p值小于0.05表示数值间有明显差异，反之若大于0.05，则表示数值间没有明显差异。

结果

类病毒颗粒做为疫苗的免疫性质

抗体效价分析

为了确定经过VLP免疫后的小鼠是否能产生anti-EV71专一性抗体，首先将实验所采集的小鼠血清以56℃加热30分钟去活化来去除补体的干扰，接着进行抗体效价分析。如图6所示。PBS负对照组不会引发抗体免疫反应，而rBV则会引发些许的免疫反应，抗体效价值约为2⁷。但实验组(Bac-P1-C3CD)及两组正对照组(EV71及Bac-P1-3CD)的抗体效价值皆可达到2¹²-2¹³，且在统计上并无显著的差异(p＞0.05)。

血清中和效价(neutralization titer)分析

抗体效价只能分析抗体辨认肠病毒抗原的能力，并无法代表实际感染时抗体中和真实肠病毒的能力，因此以血清中和效价分析来评估抗体中和真实病毒的能力。本发明将小鼠血清做连续2倍稀释(最低稀释倍率为2³)，并与100TCID₅₀的真实EV71(TW/2272/98strain)混合反应两小时后，加入96孔盘对RD细胞进行感染，于三天后观察CPE现象，并计算中和效价。图7(a)的结果显示，负对照组PBS及rBV组及在最低稀释倍率时即无法对EV71进行中和反应，正对照组EV71在注射后第七周的中和效价达2⁷，而正对照组Bac-P1-3CD及实验组Bac-P1-C3CD则有着良好的中和真实EV71的能力，其中和效价值分别可达到2^10.75及2^10.5，且两者之间并无显著的统计学差异(p＞0.05)。推测去活化肠病毒引发中和效价低于实验组Bac-P1-C3CD或是正对照组Bac-P1-3CD的原因可能是因为纯化肠病毒的纯度不高的关系，导致无法引发很好的免疫反应。

抗体对于不同肠病毒株的交叉保护

前述中和效价实验中所用的活病毒(TW/2272/98)与本发明生产类病毒颗粒所用的病毒株YN3为同一来源，均为1998年流行的病毒株。而在2008年流行的肠病毒71型则是属于genotype B5。为了确定VLP所诱发的抗体是否能中和不同基因型的肠病毒71型，本发明将收集的小鼠血清针对genotype B5的病毒株进行中和测试。首先以RD细胞来感染增殖病毒，再测定各个病毒的浓度，利用病毒的中和测试的方法来测定类病毒颗粒所诱发的抗体对病毒的中和强度。由图7(b)的结果发现与图7(a)类似的结果，负对照组PBS及rBV组无法有效中和肠病毒71型，而正对照组EV71所引发的中和效价为2^7.25，依旧低于正对照组Bac-P1-3CD(效价达2^11.75)，而由Bac-P1-C3CD生产的类病毒颗粒所诱发出的抗体，在中和B5病毒株的最高稀释倍率能够达到2^12.5，这代表了由YN3strain肠病毒71型类病毒颗粒所诱发的抗体亦可以有效的降低其它不同肠病毒71型病毒株的感染力。

以现有的数据显示，以新建立的方式所得到的类病毒颗粒与本实验室先前的生产方式所得的类病毒颗粒应皆具有作为肠病毒71型疫苗候选者的良好潜力。

Claims (7)

1.一种表达肠病毒蛋白质的基因重组载体，其包括：

a.强势杆状病毒启动子及一段连接于该启动子下游的核苷酸序列，其中该核苷酸序列可翻译成肠病毒的病毒壳蛋白；以及

b.弱势启动子及一段连接于该启动子下游的核苷酸序列，其中该核苷酸序列可翻译成水解肠病毒的病毒壳蛋白的水解蛋白，

其中强势杆状病毒启动子驱动连接于该启动子下游的核苷酸序列所翻译的蛋白质产量高于弱势启动子驱动连接于该启动子下游的核苷酸序列所翻译的蛋白质产量，其特征在于该强势杆状病毒启动子选自于杆状病毒多角体蛋白启动子或P10启动子，该弱势启动子选自于杆状病毒立即早期启动子或巨细胞病毒启动子。

2.一种重组杆状病毒，其包括如权利要求1所述的基因重组载体。

3.一种杆状病毒宿主细胞，其受到如权利要求2所述的重组杆状病毒的感染，其中该宿主细胞为昆虫细胞。

4.根据权利要求3所述的杆状病毒宿主细胞，其特征在于昆虫细胞选自于Sf-9或Hi-5细胞株。

5.根据权利要求4所述的杆状病毒宿主细胞，其特征在于其用以制备类病毒颗粒并释放至细胞外。

6.一种制备类病毒颗粒的方法，其包括(a)构建如权利要求1所述的基因重组载体；(b)将该载体导入杆状病毒以形成如权利要求2所述的重组杆状病毒；及(c)以该重组杆状病毒进行转染以形成如权利要求5所述的宿主细胞。

7.一种物质在制备预防肠病毒感染的疫苗中的用途，其中该物质为免疫有效量的如权利要求2所述的重组杆状病毒，或如权利要求3所述的宿主细胞，或该宿主细胞所释出的类病毒颗粒。

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