CN110295197A

CN110295197A - 一种重组表达载体、制备得到的iii型鸭甲型肝炎病毒样颗粒、制备方法及应用

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Publication number: CN110295197A
Application number: CN201910603170.1A
Authority: CN
Inventors: 宋翠萍; 丁铲; 孙英杰; 廖瑛; 仇旭升; 谭磊; 梦春春; 刘炜玮
Original assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Current assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Priority date: 2019-07-05
Filing date: 2019-07-05
Publication date: 2019-10-01
Anticipated expiration: 2039-07-05
Also published as: CN110295197B

Abstract

本发明提供了一种重组表达载体、制备得到的III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒、制备方法及应用，包含III型鸭甲型肝炎病毒结构蛋白前体基因P1和蛋白水解酶基因3C；所述结构蛋白前体基因P1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述蛋白水解酶基因3C的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。经过密码子优化的基因在昆虫细胞中表达水平明显提高，可获得具有较好空间构型的蛋白，在胞内自发组装成病毒样颗粒(VLPs)，够获得高纯度、形态均一、性状稳定的病毒颗粒。

Description

一种重组表达载体、制备得到的III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒、制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种密码子优化鸭肝炎病毒样颗粒及其制备方法和应用，尤其涉及一种重组表达载体、制备得到的III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒、制备方法及应用。

背景技术

鸭甲型病毒性肝炎是由鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus，DHAV)引起的一种以肝脏肿胀、出血为主的急性、烈性传染病，主要侵害3周龄内雏鸭，给养鸭业带来了巨大的经济损失。鸭肝炎病毒有3个血清型(I型，II型，和III型)，II型和其他两种血清型间无交叉反应性。以前我国主要流行的是I型鸭甲型肝炎病毒，临床上主要是弱毒疫苗和高免卵黄抗体进行预防和治疗，但目前临床上不断有弱毒疫苗免疫或高免卵黄抗体治疗无效的报道，研究结果已显示我国目前同时流行DHAV-1和DHAV-3，但使用I型鸭肝炎弱毒疫苗免疫，虽然可以很好的保护1型鸭肝炎强毒的攻击，但对III型鸭肝炎强毒没有抵抗力。

鸭甲型肝炎病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属。DHAV病毒核衣壳为对称的二十面体，无囊膜，核心为单股RNA，直径大小为20-40nm，对氯仿有耐受性。完整的基因组包含5’非编码区(5’UTR)，一个大的开放阅读框(ORF)，表达一个多聚蛋白，3’非编码区(3’UTR)和Poly(A)尾。此ORF可分为三区域：P1，P2，及P3。P1带有病毒壳蛋白：VP0，VP1，VP3。P2和P3则带有非结构蛋白如蛋白酶2A，3C，3C，及病毒聚合酶3D^pol。

DHAV VP1蛋白通常大部分暴露在病毒的表面，可以诱导机体产生中和抗体，是病毒吸附至细胞特异性受体的结合蛋白，也是决定病毒抗原性的主要成分，为病毒抗原性的高变区。DHAV-3VP1与DHAV-1之间存在较大差异，不仅出现点突变或连续变异，而且存在明显的插入或缺失现象，DHAV-3的抗原性发生变化有可能是VP1中氨基酸位点的变异导致的，因此DHAV-3便显出与DHAV-1的交叉反应性很低或无交叉中和反应。

CN106047824A公开了一种Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒样颗粒的制备方法。该发明将Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒结构蛋白前体基因P1和蛋白水解酶基因3CD在杆状病毒表达系统中共表达，制备并鉴定了鸭肝炎病毒样颗粒，为鸭肝炎病毒新型疫苗的研制奠定了基础。IFA结果显示重组蛋白在昆虫细胞中成功表达；以P3代病毒(MOI＝5)感染悬浮生长的昆虫细胞，收集细胞裂解液上清，可见直径约20～25nm的球形病毒样颗粒，与DHV天然病毒高度相似；但该方法生产III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒时蛋白表达效率低，收率不高，且活性差。

因此，提供一种血清III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒的制备方法，探究病毒样颗粒对疫苗的影响，为进一步研制诊断抗原及鸭肝炎病毒基因工程疫苗奠定了基础。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种重组表达载体、制备得到的III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒、制备方法及应用，以血清III型鸭肝炎病毒HBGT株(GenBank：KX290465.1)为模板，将血清III型鸭肝炎病毒前体蛋白P1和3C蛋白酶基因按杆状病毒喜用密码子进行优化设计和人工合成，利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统获得表达P1和3C基因的重组杆状病毒，经过密码子优化的基因在昆虫细胞中表达水平明显提高，可获得具有较好空间构型的蛋白，在胞内自发组装成病毒样颗粒(VLPs)，够获得高纯度、形态均一、性状稳定的病毒颗粒，为进一步研制诊断抗原及血清3型鸭肝炎病毒基因工程疫苗奠定了基础。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒的重组表达载体，包含III型鸭甲型肝炎病毒结构蛋白前体基因P1和蛋白水解酶基因3C；

所述结构蛋白前体基因P1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述蛋白水解酶基因3C的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明中，所述P1和3C基因均经过密码子优化，更适合重组表达载体的构建，通过对密码子的优化提高最终得到的病毒样颗粒的表达量，利于后续应用。此外，发明人意外发现，将III型鸭肝炎强毒经鸭胚连续传代65代致弱后免疫雏鸭，不仅可以保护III型鸭肝炎强毒的攻击，对I型强毒有80％的保护力。遗憾的是，III型鸭肝炎致弱株，经鸭胚继续传代后发生返强，不具备制苗条件，而利用本发明的III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒可用于制备疫苗，安全性高，蛋白表达稳定，具有广阔应用前景。

结构蛋白前体基因P1的氨基酸序列具体如下(SEQ ID NO.1)：

MDTLTKNIEDETVKIIGSCAEKAQEAISGLGAVESVASTNSVVATANATTTQTIPDPTNGSTDDFYSCSYEVGARGDNISRLVHLHTGQWSTQHGVTTCLRWLATPGCFYTVNTQPAYGQTRYFRFIRCGYHFRLLVNAPSGAAGGLMMVWMPYPYCRVLTGSYNVDASVDRRSLLNLPYAILDLRTDTEIDLVIPYVNFRNYVEITATDSVGGAICVFVLGAFTHGSGTSNTVDYTLFGEMLETDLQCPRPFNDQGKKKPRRRPIHKPKSPPQESRIIIQPGPGAANLSNSSVVTMAESVALANEGTAVDYSTAGCASSVDDVVMVLRRWQIVGDFQWANTVTPGNRINRFQVVFNRMPTFALFFDKFQYWRGSLEVKLLTFGSQFNTGRYQMSWYPVSDGEQTLAQCQNSVFVTCDVCATPATLILPFTNTTWRKSTRENYGYITWHVVNRLTVNSTSPSTISCVILMRVGKDFQFTAPLYGALQMAANNQGDSNQLGDDEPVCFLNFETANVPIQGESHTLVKHLFGRQWLVRTVQHTNEVQELDLPVPDQGHASLLRFFAYFSGEVILTIVNNGTTPCMVAHSYTMDNLTSEYAVTAMGGILIPANSAKNINIPFYSVTPLRPTRPMPAFQGGGLTFGRLYIWTQSGSVSVFMGLHKPALFFPLPAPTYTTHTQLNNIETMNLHNQSDQPDCHLCKICKKMKKWSRNHRPFRFCLRLKTLAFELHLEIE.

蛋白水解酶基因3C的氨基酸序列具体如下(SEQ ID NO.2)：

MNRLVNVSSENEVATGLAVGGKYVLTFGHSKFTQLDSIRDMVFNSPAKGTPITYDGLPTDLQLLDCDIPHQFKDVSKLIATDDYRGNGWLVWKDDDQYMIQEVTKIRPFGQTTTASGTTSCQTYIYNCKTGPGSCGGVLVALIGGNLKILGIHTSGNGTMGASNRIFPVFNQGAIVEKKYSG.

优选地，所述结构蛋白前体基因P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述蛋白水解酶基因3C的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

结构蛋白前体基因P1的核苷酸序列具体如下(SEQ ID NO.3)：

ATGGACACTCTGACCAAAAATATCGAGGACGAGACCGTGAAGATCATCGGTAGCTGTGCTGAGAAGGCCCAAGAAGCCATCTCCGGTCTGGGTGCTGTCGAGTCCGTCGCTTCCACCAACAGCGTGGTGGCTACTGCTAACGCCACTACCACCCAGACCATTCCCGACCCTACTAATGGCTCCACCGACGACTTCTACAGCTGCTCCTACGAGGTGGGTGCCCGCGGCGATAATATTAGCCGCCTCGTGCACCTCCACACCGGTCAATGGAGCACTCAGCACGGCGTGACCACTTGTCTGCGTTGGCTGGCTACCCCCGGTTGCTTCTATACTGTGAACACCCAGCCCGCCTACGGCCAGACTCGTTACTTTCGCTTCATCCGTTGCGGTTACCACTTCCGTCTGCTCGTCAACGCTCCTTCCGGCGCTGCTGGCGGTCTCATGATGGTGTGGATGCCCTACCCCTATTGCCGCGTGCTGACCGGTTCCTACAACGTGGATGCTAGCGTGGACCGCCGTTCTCTGCTGAATCTGCCCTACGCCATTCTGGATCTCCGCACCGATACCGAGATCGACCTCGTCATCCCTTACGTCAACTTCCGCAACTATGTGGAAATCACCGCTACCGACAGCGTGGGCGGCGCTATTTGTGTCTTCGTGCTGGGCGCCTTTACCCATGGTAGCGGTACCTCCAATACCGTGGATTACACTCTGTTCGGCGAGATGCTGGAAACTGATCTGCAGTGCCCCCGCCCCTTCAACGATCAAGGTAAAAAGAAGCCCCGCCGCCGTCCTATCCATAAGCCTAAAAGCCCCCCCCAAGAGTCCCGCATTATCATTCAACCCGGTCCCGGCGCTGCCAACCTCTCCAATTCCTCCGTCGTGACCATGGCTGAATCCGTGGCCCTCGCTAATGAGGGTACTGCTGTGGACTACAGCACTGCTGGCTGTGCTTCCAGCGTGGACGATGTGGTGATGGTGCTGCGCCGTTGGCAAATCGTCGGCGATTTTCAGTGGGCTAACACTGTCACCCCCGGCAACCGTATTAATCGCTTCCAAGTCGTGTTCAACCGCATGCCTACTTTTGCTCTGTTCTTCGACAAGTTCCAATACTGGCGTGGCTCTCTGGAAGTGAAGCTGCTGACCTTCGGCTCCCAATTTAACACCGGCCGCTACCAGATGAGCTGGTACCCCGTGAGCGACGGTGAGCAGACTCTGGCTCAGTGTCAGAATAGCGTCTTCGTGACTTGCGATGTGTGTGCTACCCCCGCTACTCTCATCCTCCCTTTCACCAACACTACTTGGCGCAAAAGCACCCGTGAGAACTACGGCTACATCACTTGGCACGTGGTCAACCGTCTGACCGTCAATTCCACCTCCCCTAGCACCATTAGCTGCGTGATCCTCATGCGTGTGGGCAAAGACTTCCAGTTTACCGCCCCTCTCTACGGTGCTCTGCAAATGGCCGCTAACAACCAAGGTGACAGCAATCAACTCGGCGACGACGAGCCCGTCTGTTTTCTGAACTTTGAGACCGCTAACGTCCCTATCCAAGGCGAGTCCCACACTCTGGTGAAGCACCTCTTCGGTCGCCAGTGGCTGGTGCGTACCGTGCAGCACACTAACGAGGTGCAAGAACTGGATCTGCCCGTCCCCGACCAAGGTCATGCTTCTCTGCTGCGCTTCTTCGCTTACTTTAGCGGCGAGGTGATTCTGACCATCGTGAACAACGGTACCACCCCTTGCATGGTCGCCCACAGCTACACTATGGATAATCTGACCTCCGAGTACGCCGTCACTGCTATGGGCGGTATCCTCATTCCCGCCAACAGCGCCAAGAACATTAATATCCCCTTCTACAGCGTGACCCCTCTCCGTCCCACTCGCCCTATGCCCGCTTTTCAAGGTGGCGGTCTGACTTTCGGCCGTCTGTACATCTGGACCCAGTCCGGTTCCGTGAGCGTCTTCATGGGTCTCCACAAGCCCGCCCTCTTCTTCCCTCTCCCCGCTCCTACTTACACTACCCACACCCAGCTCAACAACATTGAGACTATGAACCTCCACAATCAGAGCGACCAGCCCGACTGTCATCTCTGTAAAATTTGCAAAAAGATGAAGAAATGGTCCCGTAACCACCGTCCCTTCCGCTTTTGTCTGCGTCTGAAGACTCTGGCCTTCGAGCTGCATCTGGAAATCGAGTAA.

蛋白水解酶基因3C的核苷酸序列具体如下(SEQ ID NO.4)：

ATGAACCGCCTCGTGAATGTCTCCTCCGAAAACGAGGTGGCTACTGGTCTCGCCGTGGGTGGTAAGTACGTGCTGACTTTCGGCCACTCCAAGTTCACCCAACTCGACAGCATTCGCGACATGGTGTTCAACAGCCCCGCCAAGGGCACCCCTATCACTTACGACGGCCTCCCTACCGATCTCCAACTGCTGGACTGCGATATCCCCCACCAGTTTAAGGACGTGTCCAAGCTGATCGCCACTGATGATTACCGTGGCAACGGTTGGCTCGTGTGGAAGGACGATGACCAGTACATGATCCAAGAGGTGACTAAAATCCGCCCTTTCGGTCAGACCACCACTGCCTCCGGCACCACCAGCTGCCAAACCTACATCTACAACTGCAAGACCGGCCCCGGCAGCTGCGGTGGTGTCCTCGTGGCTCTCATCGGTGGCAACCTCAAGATTCTCGGTATCCACACCAGCGGCAACGGCACTATGGGTGCCTCCAACCGCATCTTCCCCGTGTTCAACCAAGGTGCTATCGTGGAGAAGAAGTACTCCGGCTAA.

优选地，所述结构蛋白前体基因P1的启动子为P_H，所述蛋白水解酶基因3C的启动子为P₁₀；所述启动子P_H的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述启动子P₁₀的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明中，将结构蛋白前体基因P1和蛋白水解酶基因3C分别插入P_H和P₁₀启动子的下游，通过对启动子和其启动翻译的基因进行调整，可以更好地表达2种蛋白，从而获得病毒样颗粒。

启动子P_H的核苷酸序列如下所示(SEQ ID NO.5)：

5’-ATCATGGAGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATTCCGGATTATTCATACCGTCCCACCATCGGGCGCG-3’.

启动子P₁₀的核苷酸序列如下所示(SEQ ID NO.6)：

5’-GTCGAGTGATTGTAAATAAAATGTAATTTACAGTATAGTATTTTAATTAATATACAAATGATTTGATAATAATTCTTATTTAACTATAATATATTGTGTTGGGTTGAATTAAAGGTCCGTAT-3’.

第二方面，本发明提供一种III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒，采用如第一方面所述的重组表达载体制备得到。

第三方面，本发明提供一种III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：构建如第一方面所述的重组表达载体，将所述表达载体转染昆虫细胞获得重组杆状病毒，将所述重组杆状病毒感染昆虫细胞，培养后收获上清，即得III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒。

优选地，所述昆虫细胞为sf9细胞。

优选地，所述昆虫细胞的培养基为SF900-II。

优选地，所述制备方法还包括III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒纯化的步骤：将收获的上清离心，再取上清过滤，滤液经过蔗糖梯度密度离心，收集白色条带即为纯化的III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒。

优选地，所述离心的转速为500-800×g，例如可以是500×g、600×g、700×g或800×g。

优选地，所述离心的时间为25-30min，例如可以是25min、26min、27min、28min、29min或30min。

优选地，所述过滤为0.22μm滤膜过滤。

优选地，所述蔗糖梯度密度为20％、40％和60％。

作为本发明的优选方法，所述制备方法具体包括如下步骤：

(1)将III型鸭甲型肝炎病毒结构蛋白前体基因P1和蛋白水解酶基因3C克隆到昆虫细胞高效表达载体pFastBacDual中，转录大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，提取阳性质粒即为重组表达载体；

(2)将步骤(1)所得重组表达载体转转染昆虫细胞sf9细胞获得重组杆状病毒；

(3)将步骤(2)所得重组杆状病毒接种昆虫细胞sf9细胞，培养后收获上清，将收获的上清离心500-800×g，离心25-30min，再取上清通过0.22μm滤膜过滤，滤液经过蔗糖梯度密度离心，所述蔗糖梯度密度为20％、40％和60％，在20％-40％的蔗糖层出现白色条带，收集白色条带即为纯化的III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒。

第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的重组表达载体或如第二方面所述的III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒在制备III型鸭甲型肝炎疫苗中的应用。

第五方面，本发明提供一种III型鸭甲型肝炎疫苗，含有如第二方面所述的III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒。

优选地，所述III型鸭甲型肝炎疫苗还包括佐剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的重组表达载体包含有经过密码子优化的III型鸭甲型肝炎病毒结构蛋白前体基因P1和蛋白水解酶基因3C，其在昆虫细胞中表达水平显著提高；

(2)通过本发明的重组表达载体获得的病毒样颗粒具有较好的空间结构，在胞内自发组装成病毒样颗粒；

(3)本发明提供针对III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒的制备方法，能够得到高纯度、形态均一、性状稳定的病毒样颗粒，为进一步研制诊断抗原及血清III型鸭肝炎病毒基因工程疫苗奠定基础。

附图说明

图1a-b分别为实施例1中血清3型鸭肝炎病毒株HBGT结构蛋白前体基因P1和蛋白水解酶基因3C的PCR产物凝胶电泳图；

图2a为实施例1中P1代重组毒感染sf9细胞的结果，图2b为正常sf9细胞；

图3a-b分别为实施例1中对重组病毒的P1基因和3C基因琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图4为实施例2中病毒样颗粒的电镜检测结果；

图5a-c分别为实施例3中分别对VP0、VP1和VP3蛋白表达进行Western blot检测结果；

图6a-c分别为实施例3中VP0、VP1、VP3小鼠多抗血清Western blot检测病毒样颗粒蛋白表达；

图7a-e为实施例4中重组杆状病毒rBac-DHAV-3感染sf9细胞后固定细胞的IFA鉴定结果，图7a为VP0小鼠多抗，图7b为VP1小鼠多抗，图7c为VP3小鼠多抗，图7d为空载体Bacmid感染sf9细胞，图7e为正常sf9细胞；

图8为对比例1中密码子优化前后蛋白表达结果。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

以下实施例中采用的材料不限于上述列举，可用其他同类材料替代，仪器未注明具体条件的，按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，本领域技术人员应当掌握使用常规材料及仪器的相关知识。

实施例1

(1)DHAV-3P1和3C基因根据杆状病毒密码子进行优化和基因合成。

(2)DHAV-3RNA提取：HBGT鸭胚尿囊液通过TRIzol法提取RNA，6nt反转录，制备cDNA模板。

(3)P1和3C基因克隆：将P1和3C基因产物分别克隆至pEASY-Blunt3Cloning载体中，转化后挑菌测序鉴定，获得构建正确的质粒Blunt3-P1，Blunt3-3C。

(4)穿梭质粒构建：将获得的Blunt3-3C进行酶切(NheI和KpnI双酶切)，同时将pFastBacDual质粒进行双酶切，酶切产物进行电泳，回收酶切产物。30μL酶切体系如表1，37℃，酶切2h。

表1

将上述酶切产物进行SDS-PAGE电泳，切胶回收，T4DNA连接酶16℃连接过夜，10μL连接体系如表2所示。

表2

组分	体积/μL
		3C基因片段	6.5
pFastBacDual	1.5
		T4ligase	1
Buffer	1

将连接产物转化DH5α感受态细胞中，挑菌提取质粒NheI，KpnI双酶切及PCR鉴定将3C正确重组至pFastBacDual载体Pp10启动子下，命名为pFast-3C。阳性菌扩增提取质粒，SalI，HindIII双酶切，同时将Blunt3-P1进行SalI，HindIII双酶切，酶切产物进行电泳，回收酶切产物，将酶切产物电泳，切胶回收，T4DNA连接酶16℃连接过夜。酶切体系和连接体系如上所述。将连接产物转化DH5α感受态细胞中，挑菌提取质粒SalI，HindIII双酶切及PCR鉴定将3C正确重组至pFastBacDual载体P_H启动子下，经鉴定正确的质粒，即为穿梭质粒pFast-P1-3C。

(5)重组杆粒构建：鉴定正确的穿梭质粒pFast-P1-3C转座DH10感受态细胞，SOC液37℃摇床慢摇培养45min，然后按照10^-1，10^-2，10^-3均匀涂布于三抗板(卡那酶素终浓度50μg/mL，庆大霉素终浓度7μg/mL，四环素终浓度10μg/mL)经蓝白斑筛选(IPTG终浓度24mg/mL,X-gal终浓度20mg/mL)，白色菌落代表发生重组，蓝色菌落则未重组，37℃放置48h，挑取白色菌落三区划线继续涂布于三抗筛选板，连续传代2次，直至板子上的菌落均为白色，则挑取白斑，提基因组，以特异性引物PCR鉴定正确，则为重组杆粒rBac-P1-3C，其中检测P1基因的引物对如SEQ ID NO.7-8所示，检测3C基因的引物对如SEQ ID NO.9-10所示。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒、50℃退火30秒、72℃延伸2分钟30秒，共30个循环；最后72℃再延伸10分钟。对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果见图1a-1b，P1大小约2200bp，3C大小约560bp，结果与预期相符，即P1和3C基因均正确重组入杆粒。

检测P1基因的特异性引物对的核苷酸序列如下：

DHAV-3-P1F(SEQ ID NO.7)：ggGTCGACacc atggacactctaactaaaaaca；

DHAV-3-P1R(SEQ ID NO.8)：ccAAGCTT ttattcaatttctagatggagc.

检测3C基因的特异性引物对的核苷酸序列如下：

DHAV-3-3C F(SEQ ID NO.9)：

ccGCTAGCaccatgAATAGATTGGTCAATGTCTC；

DHAV-3-3C R(SEQ ID NO.10)：ccGGTACCTTATATAATCATGCAGGCAG.

(6)重组杆状病毒构建：利用脂质体介导转染法(碧云天lipoInsectTM转染试剂)，将(5)构建正确的重组杆粒rBac-P1-3C转染sf9昆虫细胞，具体过程如下：8*10⁵个sf9铺于6孔板，密度达到70-90％，27℃-28℃培养；准备2支1.5mL无菌离心管，1支离心管里将8μL转染试剂lipoInsectTM加入100μL无血清无抗生素Grace培养基，一支里将16μg重组杆粒rBac-P1-3C加入100μL无血清无抗生素Grace培养基，室温分别静置5min，然后轻轻混合2管，混匀，室温静置15-30min；将混合物均匀滴加到整个孔中，混匀，培养4h后，换成新鲜培养基；27℃-28℃培养约96h，收集培养液，500g离心5min，获得上清即为P1代重组杆状病毒rBac-DHAV-3，4℃避光保存(-80℃保存的重组毒添加胎牛血清至终浓度为2％以保护病毒被蛋白酶降解，避免反复冻融，病毒滴度为10⁷-10⁸pfu/mL)；P1代重组毒再次sf9(细胞密度2*10⁶cells/ml，病毒感染滴度为0.1MOI)，27-28℃培养48h-72h，感染的sf9细胞，细胞变大变圆，停止分裂，70-80％细胞死亡，如图2a所示，而正常sf9没有病变，如图2b所示。收集细胞和上清，500g离心5min，取上清，即为P2代重组毒。以此类推收集至第4代毒。

每代毒于-80℃保存备用。培养中，收集第3代感染细胞，设计P_H启动子通用引物，用通用引物和3C特异性引物进行PCR，检测rBac-DHAV-3重组病毒是否完整和正确。通用引物序列如下：

P_PHF:TATTCCGGATTATTCATACC，P_PHR:ACAAATGTGGTATGGCTGA

PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒、50℃退火30秒、72℃延伸3分钟，共30个循环；最后72℃再延伸10分钟。

对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图3a-3b所示，图3a中泳道1为重组杆状病毒为模板，泳道2为空杆粒为模板，泳道3为sf9细胞为模板，对P1基因进行PCR验证，图3b中三个泳道的模板与图3a相同，并对3C基因进行PCR验证，P1大小约2200bp，3C大小约560bp，结果与预期相符，即重组病毒结构完整、有效，可进一步应用。

(7)III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒纯化收集细胞培养上清，500g离心30min，除去大的杂蛋白和细胞碎片，收集上清经0.22μm滤膜过滤，滤液经不连续的20％-40％-60％蔗糖梯度密度离心，在20％-40％蔗糖层出现白色条带，收集白色条带层即为纯化的病毒样颗粒。

实施例2电镜观察病毒样颗粒

蔗糖梯度密度纯化后的病毒样颗粒进行电子透射电镜观察，病毒样颗粒用1％磷钨酸pH6.8负染，电镜参数为XR51，放大倍数为49000x，标尺为200nm，病毒样颗粒形态如图4所示。

由图4可知，镜下的病毒样颗粒直径约25nm，与天然病毒大小相似。

实施例3Western Blot检测

1、DHAV-3VP0、VP1、VP3蛋白多抗制备

(1)DHAV-3VP0、VP1、VP3引物设计：根据SEQ ID NO.3所示的目的碱基序列，设计引物:

DHAV-3-VP0F(NheI)(SEQ ID NO.11):

5’-cc GCTAGC ATGGATACTCTAACTAAAAA-3’；

DHAV-3-VP0R(HindIII)(SEQ ID NO.12):

5’-ccAAGCTT ttaCTGGTCATTAAAAGGCCGAG-3’；

DHAV-3-VP1F(BamHI)(SEQ ID NO.13):

5’-cc GGATCC atgGGTGATTCCAATCAGCT-3’；

DHAV-3-VP1R(HindIII)(SEQ ID NO.14):

5’-ccAAGCTT ttaTTCAATTTCTAGATGGA-3’；

DHAV-3-VP3F(BamHI)(SEQ ID NO.15):

5’-cc GGATCC atg GGTAAGAAGAAACCACGGCG-3’；

DHAV-3-VP3R(HindIII)(SEQ ID NO.16):

5’-ccAAGCTT tta CTGGTTATTGGCAGCCATCT-3’.

(2)DHAV-3VP0,VP1,VP3基因扩增

参考现有技术，以实施例1步骤(4)中的穿梭质粒pFast-P1-3C为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)人工扩增获得VP0、VP1、VP3基因。PCR扩增时，反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒、50℃退火30秒、72℃延伸1分钟10秒，共30个循环；最后72℃再延伸10分钟。对PCR扩增产物进行1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳分析，并回收扩增产物备用。

(3)DHAV-3VP0、VP1、VP3基因克隆：将VP0、VP1、VP3PCR产物分别克隆至T载体(pMD19T Simple vector)中，转化后挑菌测序鉴定，获得构建正确的质粒19T-VP0，19T-VP1，19T-VP3。

(4)VP0、VP1、VP3表达载体构建：将构建正确的质粒19T-VP0，19T-VP1,19T-VP3分别进行酶切(NheI和HindIII，BamHI和HindIII双酶切)，同时对表达载体PET28a质粒进行酶切，对酶切产物进行电泳，切目的条带回收。将酶切产物经T4连接酶，16℃连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞，经含氨苄青霉素终浓度100μg/mL，IPTG终浓度24mg/mL，X-gal终浓度20mg/mL的选择培养基筛选阳性菌落。对筛选的阳性菌落提取质粒，酶切及PCR法鉴定正确，命名为Pcold-VP0、PET28a-VP1、PET28a-VP3。

(5)VP0、VP1、VP3蛋白表达：经鉴定正确的重组表达载体Pcold-VP0、PET28a-VP1、PET28a-VP3质粒转化BL21感受态细胞，经含氨苄青霉素终浓度100μg/mL的选择培养基筛选阳性菌落。对筛选的阳性菌落提取质粒，酶切及PCR法鉴定正确。鉴定正确的阳性菌扩大培养，37℃培养至OD值为1，经IPTG诱导(终浓度0.2μM，0.5μM，1μM)，37℃继续培养12h，离心，收集菌体，

(6)Pcold-VP0、PET28a-VP1、PET28a-VP3蛋白表达鉴定：经诱导表达的Pcold-VP0、PET28a-VP1、PET28a-VP3用His蛋白进行Western blot检测，如图5a-5c所示，图5a的泳道1-3为Pcold-VP0的检测平行样本，泳道4为Pcold-TF，图5b的泳道1-2为Pet-VP1的检测平行样本，泳道3为Pet-28a；图5c的泳道1-4为Pet-VP3的检测平行样本，泳道5为Pet-28，图5a-5c中的M泳道均为Maker，由图5a-5c可知，待测样本的分子量分别为90KD(Pcold-VP0)和35kd(PET28a-VP1、PET28a-VP3)左右看到阳性条带，表明Pcold-VP0、PET28a-VP1、PET28a-VP3蛋白表达。

(7)VP0、VP1、VP3蛋白纯化：通过His柱子纯化融合让蛋白，步骤如下：诱导好的细菌离心，加入50mL Lysis Buffer,混匀；超声破碎30min；将HisPurNi IDA Column固定在铁架上，去掉下端塞和上端塞，流干预装柱的保护液；柱中加入5mL Lysis Buffer,平衡柱子，流干Lysis Buffer后，重复2次；将处理好的样品加入柱中，收集流出液；柱中加入5mLLysis Buffer冲洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，分段收集洗杂液，重复5次；使用5mLLysis Buffer和5mL去离子水交替平衡填料，重复2次，再用5mL 20％乙醇平衡填料，重复1次，添加10mL 20％乙醇到柱子中，置4℃保存。

(8)VP0、VP1、VP3蛋白多抗制备：Pcold-VP0、PET28a-VP1、PET28a-VP3纯化蛋白免疫小鼠，50μg/只，一免用弗氏完全佐剂混合纯化蛋白，10天后二免用弗氏不完全佐剂混合纯化蛋白，10天后直接免疫纯化蛋白，4天后小鼠尾静脉采血。

2、VP0、VP1、VP3小鼠多抗血清Western blot检测病毒样颗粒蛋白表达

VP0、VP1、VP3小鼠多抗经Western blot检测血清3型鸭肝炎病毒样颗粒蛋白表达情况，结果如图6a-c所示，重组病毒感染sf9细胞48h，收集细胞Westernblot检测到血清3型鸭肝炎病毒壳蛋白VP0，VP1，VP3蛋白表达。

实施例4VP0、VP1、VP3小鼠多抗血清IFA检测病毒样颗粒蛋白表达

VP0,VP1,VP3多抗通过IFA检测血清III型鸭肝炎病毒样颗粒壳蛋白表达，IFA步骤如下：重组病毒感染sf9细胞48h，室温4％多聚甲醛固定细胞10min，TBS洗3遍，triton100透化10min，TBS洗3遍，5％脱脂奶37℃封闭1h，TBS洗3遍，一抗37℃孵育1h，TBS洗3遍，二抗37℃孵育1h，TBS洗3遍，DAPI37℃孵育5min，TBS洗3遍，封片。结果如图7a-7e所示，其中图7a为VP0小鼠多抗，图7b为VP1小鼠多抗，图7c为VP3小鼠多抗，图7d为空载体Bacmid感染sf9细胞，图7e为正常sf9细胞。

由图7a-e可知，血清III型鸭肝炎病毒样颗粒结构蛋白得到表达。

实施例5经密码子优化后P3代病毒样颗粒滴度检测

病毒滴度是病毒功能特性的关键性因素，滴度检测目的在于确定P3代重组病毒滴度，为以后的使用提供依据。

将盲传于第3代的重组杆状病毒利用BacPAK杆状病毒滴度快速测定试剂盒进行测定，以未经密码子优化的病毒样颗粒作为对照，步骤如下：

1)将长满Sf9细胞的培养皿去除原有的细胞培养基，用新鲜的细胞培养基重悬，调整细胞密度为3-4*10⁵cells/ml，传代至96孔板，每孔200μl，27℃恒温箱静置1h。

2)将收获的第4代rBac-DHAV3进行10倍连续倍比稀释，小心将96孔板中细胞上清全部弃去，加入rBac-DHAV3的病毒稀释液(稀释度为10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12)，每个稀释度做3个重复，并设立不加病毒液的细胞培养液做对照，27℃恒温箱感染1h。

3)将96孔板中的细胞培养液轻轻弃去，每孔分别加入50μl MethylCelluloseOverlay，密封，加入27℃恒温箱，孵育43-47h。

4)将Methyl Cellulose Overlay弃去，每孔分别轻轻加入150μl预冷的80％丙酮溶液，室温固定10min。

5)弃去80％丙酮，每孔分别加入50μl 30倍稀释的标准山羊血清稀释液，37℃作用5min。

6)每孔加入200μlPBST洗板5min，重复洗涤3次。

7)用标准山羊血清按1：200进行稀释鼠的gp64抗体，每孔加入25μl的gp64抗体稀释液，37℃作用25min。

8)重复第6步。

9)加入50μl羊抗鼠HRP，37℃作用25min。

10)PBST洗板3次。

11)每孔加入50μl蓝色过氧化物酶底物，室温作用3h。

放置于显微镜下观察感染灶，并计算每个稀释度3个重复空内感染灶的平均数。计算得到经密码子优化后P3代重组毒的滴度为1*10¹¹PFU/ml，而未优化的重组毒滴度为1*10⁹PFU/ml。由此说明，密码子优化不仅影响蛋白的表达量，同时会影响病毒的滴度。

对比例1

与实施例1相比，不对P1和3C基因进行密码子优化，其他表达操作与实施例1相同，对比密码子优化前后蛋白表达情况，蛋白电泳结果见图8，其中泳道1为实施例1中密码子优化后的蛋白表达结果，泳道2为未进行密码子优化的蛋白表达结果。

由图8可知，经密码子优化后，血清3型鸭肝炎病毒样颗粒蛋白在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中大量表达，显著提高病毒样颗粒蛋白的表达量。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心)

<120> 一种重组表达载体、制备得到的III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒、制备方法及

应用

<130> 2019

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 733

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 1

Met Asp Thr Leu Thr Lys Asn Ile Glu Asp Glu Thr Val Lys Ile Ile

1 5 10 15

Gly Ser Cys Ala Glu Lys Ala Gln Glu Ala Ile Ser Gly Leu Gly Ala

20 25 30

Val Glu Ser Val Ala Ser Thr Asn Ser Val Val Ala Thr Ala Asn Ala

35 40 45

Thr Thr Thr Gln Thr Ile Pro Asp Pro Thr Asn Gly Ser Thr Asp Asp

50 55 60

Phe Tyr Ser Cys Ser Tyr Glu Val Gly Ala Arg Gly Asp Asn Ile Ser

65 70 75 80

Arg Leu Val His Leu His Thr Gly Gln Trp Ser Thr Gln His Gly Val

85 90 95

Thr Thr Cys Leu Arg Trp Leu Ala Thr Pro Gly Cys Phe Tyr Thr Val

100 105 110

Asn Thr Gln Pro Ala Tyr Gly Gln Thr Arg Tyr Phe Arg Phe Ile Arg

115 120 125

Cys Gly Tyr His Phe Arg Leu Leu Val Asn Ala Pro Ser Gly Ala Ala

130 135 140

Gly Gly Leu Met Met Val Trp Met Pro Tyr Pro Tyr Cys Arg Val Leu

145 150 155 160

Thr Gly Ser Tyr Asn Val Asp Ala Ser Val Asp Arg Arg Ser Leu Leu

165 170 175

Asn Leu Pro Tyr Ala Ile Leu Asp Leu Arg Thr Asp Thr Glu Ile Asp

180 185 190

Leu Val Ile Pro Tyr Val Asn Phe Arg Asn Tyr Val Glu Ile Thr Ala

195 200 205

Thr Asp Ser Val Gly Gly Ala Ile Cys Val Phe Val Leu Gly Ala Phe

210 215 220

Thr His Gly Ser Gly Thr Ser Asn Thr Val Asp Tyr Thr Leu Phe Gly

225 230 235 240

Glu Met Leu Glu Thr Asp Leu Gln Cys Pro Arg Pro Phe Asn Asp Gln

245 250 255

Gly Lys Lys Lys Pro Arg Arg Arg Pro Ile His Lys Pro Lys Ser Pro

260 265 270

Pro Gln Glu Ser Arg Ile Ile Ile Gln Pro Gly Pro Gly Ala Ala Asn

275 280 285

Leu Ser Asn Ser Ser Val Val Thr Met Ala Glu Ser Val Ala Leu Ala

290 295 300

Asn Glu Gly Thr Ala Val Asp Tyr Ser Thr Ala Gly Cys Ala Ser Ser

305 310 315 320

Val Asp Asp Val Val Met Val Leu Arg Arg Trp Gln Ile Val Gly Asp

325 330 335

Phe Gln Trp Ala Asn Thr Val Thr Pro Gly Asn Arg Ile Asn Arg Phe

340 345 350

Gln Val Val Phe Asn Arg Met Pro Thr Phe Ala Leu Phe Phe Asp Lys

355 360 365

Phe Gln Tyr Trp Arg Gly Ser Leu Glu Val Lys Leu Leu Thr Phe Gly

370 375 380

Ser Gln Phe Asn Thr Gly Arg Tyr Gln Met Ser Trp Tyr Pro Val Ser

385 390 395 400

Asp Gly Glu Gln Thr Leu Ala Gln Cys Gln Asn Ser Val Phe Val Thr

405 410 415

Cys Asp Val Cys Ala Thr Pro Ala Thr Leu Ile Leu Pro Phe Thr Asn

420 425 430

Thr Thr Trp Arg Lys Ser Thr Arg Glu Asn Tyr Gly Tyr Ile Thr Trp

435 440 445

His Val Val Asn Arg Leu Thr Val Asn Ser Thr Ser Pro Ser Thr Ile

450 455 460

Ser Cys Val Ile Leu Met Arg Val Gly Lys Asp Phe Gln Phe Thr Ala

465 470 475 480

Pro Leu Tyr Gly Ala Leu Gln Met Ala Ala Asn Asn Gln Gly Asp Ser

485 490 495

Asn Gln Leu Gly Asp Asp Glu Pro Val Cys Phe Leu Asn Phe Glu Thr

500 505 510

Ala Asn Val Pro Ile Gln Gly Glu Ser His Thr Leu Val Lys His Leu

515 520 525

Phe Gly Arg Gln Trp Leu Val Arg Thr Val Gln His Thr Asn Glu Val

530 535 540

Gln Glu Leu Asp Leu Pro Val Pro Asp Gln Gly His Ala Ser Leu Leu

545 550 555 560

Arg Phe Phe Ala Tyr Phe Ser Gly Glu Val Ile Leu Thr Ile Val Asn

565 570 575

Asn Gly Thr Thr Pro Cys Met Val Ala His Ser Tyr Thr Met Asp Asn

580 585 590

Leu Thr Ser Glu Tyr Ala Val Thr Ala Met Gly Gly Ile Leu Ile Pro

595 600 605

Ala Asn Ser Ala Lys Asn Ile Asn Ile Pro Phe Tyr Ser Val Thr Pro

610 615 620

Leu Arg Pro Thr Arg Pro Met Pro Ala Phe Gln Gly Gly Gly Leu Thr

625 630 635 640

Phe Gly Arg Leu Tyr Ile Trp Thr Gln Ser Gly Ser Val Ser Val Phe

645 650 655

Met Gly Leu His Lys Pro Ala Leu Phe Phe Pro Leu Pro Ala Pro Thr

660 665 670

Tyr Thr Thr His Thr Gln Leu Asn Asn Ile Glu Thr Met Asn Leu His

675 680 685

Asn Gln Ser Asp Gln Pro Asp Cys His Leu Cys Lys Ile Cys Lys Lys

690 695 700

Met Lys Lys Trp Ser Arg Asn His Arg Pro Phe Arg Phe Cys Leu Arg

705 710 715 720

Leu Lys Thr Leu Ala Phe Glu Leu His Leu Glu Ile Glu

725 730

<210> 2

<211> 182

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 2

Met Asn Arg Leu Val Asn Val Ser Ser Glu Asn Glu Val Ala Thr Gly

1 5 10 15

Leu Ala Val Gly Gly Lys Tyr Val Leu Thr Phe Gly His Ser Lys Phe

20 25 30

Thr Gln Leu Asp Ser Ile Arg Asp Met Val Phe Asn Ser Pro Ala Lys

35 40 45

Gly Thr Pro Ile Thr Tyr Asp Gly Leu Pro Thr Asp Leu Gln Leu Leu

50 55 60

Asp Cys Asp Ile Pro His Gln Phe Lys Asp Val Ser Lys Leu Ile Ala

65 70 75 80

Thr Asp Asp Tyr Arg Gly Asn Gly Trp Leu Val Trp Lys Asp Asp Asp

85 90 95

Gln Tyr Met Ile Gln Glu Val Thr Lys Ile Arg Pro Phe Gly Gln Thr

100 105 110

Thr Thr Ala Ser Gly Thr Thr Ser Cys Gln Thr Tyr Ile Tyr Asn Cys

115 120 125

Lys Thr Gly Pro Gly Ser Cys Gly Gly Val Leu Val Ala Leu Ile Gly

130 135 140

Gly Asn Leu Lys Ile Leu Gly Ile His Thr Ser Gly Asn Gly Thr Met

145 150 155 160

Gly Ala Ser Asn Arg Ile Phe Pro Val Phe Asn Gln Gly Ala Ile Val

165 170 175

Glu Lys Lys Tyr Ser Gly

180

<210> 3

<211> 2202

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

atggacactc tgaccaaaaa tatcgaggac gagaccgtga agatcatcgg tagctgtgct 60

gagaaggccc aagaagccat ctccggtctg ggtgctgtcg agtccgtcgc ttccaccaac 120

agcgtggtgg ctactgctaa cgccactacc acccagacca ttcccgaccc tactaatggc 180

tccaccgacg acttctacag ctgctcctac gaggtgggtg cccgcggcga taatattagc 240

cgcctcgtgc acctccacac cggtcaatgg agcactcagc acggcgtgac cacttgtctg 300

cgttggctgg ctacccccgg ttgcttctat actgtgaaca cccagcccgc ctacggccag 360

actcgttact ttcgcttcat ccgttgcggt taccacttcc gtctgctcgt caacgctcct 420

tccggcgctg ctggcggtct catgatggtg tggatgccct acccctattg ccgcgtgctg 480

accggttcct acaacgtgga tgctagcgtg gaccgccgtt ctctgctgaa tctgccctac 540

gccattctgg atctccgcac cgataccgag atcgacctcg tcatccctta cgtcaacttc 600

cgcaactatg tggaaatcac cgctaccgac agcgtgggcg gcgctatttg tgtcttcgtg 660

ctgggcgcct ttacccatgg tagcggtacc tccaataccg tggattacac tctgttcggc 720

gagatgctgg aaactgatct gcagtgcccc cgccccttca acgatcaagg taaaaagaag 780

ccccgccgcc gtcctatcca taagcctaaa agcccccccc aagagtcccg cattatcatt 840

caacccggtc ccggcgctgc caacctctcc aattcctccg tcgtgaccat ggctgaatcc 900

gtggccctcg ctaatgaggg tactgctgtg gactacagca ctgctggctg tgcttccagc 960

gtggacgatg tggtgatggt gctgcgccgt tggcaaatcg tcggcgattt tcagtgggct 1020

aacactgtca cccccggcaa ccgtattaat cgcttccaag tcgtgttcaa ccgcatgcct 1080

acttttgctc tgttcttcga caagttccaa tactggcgtg gctctctgga agtgaagctg 1140

ctgaccttcg gctcccaatt taacaccggc cgctaccaga tgagctggta ccccgtgagc 1200

gacggtgagc agactctggc tcagtgtcag aatagcgtct tcgtgacttg cgatgtgtgt 1260

gctacccccg ctactctcat cctccctttc accaacacta cttggcgcaa aagcacccgt 1320

gagaactacg gctacatcac ttggcacgtg gtcaaccgtc tgaccgtcaa ttccacctcc 1380

cctagcacca ttagctgcgt gatcctcatg cgtgtgggca aagacttcca gtttaccgcc 1440

cctctctacg gtgctctgca aatggccgct aacaaccaag gtgacagcaa tcaactcggc 1500

gacgacgagc ccgtctgttt tctgaacttt gagaccgcta acgtccctat ccaaggcgag 1560

tcccacactc tggtgaagca cctcttcggt cgccagtggc tggtgcgtac cgtgcagcac 1620

actaacgagg tgcaagaact ggatctgccc gtccccgacc aaggtcatgc ttctctgctg 1680

cgcttcttcg cttactttag cggcgaggtg attctgacca tcgtgaacaa cggtaccacc 1740

ccttgcatgg tcgcccacag ctacactatg gataatctga cctccgagta cgccgtcact 1800

gctatgggcg gtatcctcat tcccgccaac agcgccaaga acattaatat ccccttctac 1860

agcgtgaccc ctctccgtcc cactcgccct atgcccgctt ttcaaggtgg cggtctgact 1920

ttcggccgtc tgtacatctg gacccagtcc ggttccgtga gcgtcttcat gggtctccac 1980

aagcccgccc tcttcttccc tctccccgct cctacttaca ctacccacac ccagctcaac 2040

aacattgaga ctatgaacct ccacaatcag agcgaccagc ccgactgtca tctctgtaaa 2100

atttgcaaaa agatgaagaa atggtcccgt aaccaccgtc ccttccgctt ttgtctgcgt 2160

ctgaagactc tggccttcga gctgcatctg gaaatcgagt aa 2202

<210> 4

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 4

atgaaccgcc tcgtgaatgt ctcctccgaa aacgaggtgg ctactggtct cgccgtgggt 60

ggtaagtacg tgctgacttt cggccactcc aagttcaccc aactcgacag cattcgcgac 120

atggtgttca acagccccgc caagggcacc cctatcactt acgacggcct ccctaccgat 180

ctccaactgc tggactgcga tatcccccac cagtttaagg acgtgtccaa gctgatcgcc 240

actgatgatt accgtggcaa cggttggctc gtgtggaagg acgatgacca gtacatgatc 300

caagaggtga ctaaaatccg ccctttcggt cagaccacca ctgcctccgg caccaccagc 360

tgccaaacct acatctacaa ctgcaagacc ggccccggca gctgcggtgg tgtcctcgtg 420

gctctcatcg gtggcaacct caagattctc ggtatccaca ccagcggcaa cggcactatg 480

ggtgcctcca accgcatctt ccccgtgttc aaccaaggtg ctatcgtgga gaagaagtac 540

tccggctaa 549

<210> 5

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 5

atcatggaga taattaaaat gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc 60

gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca 120

tcgggcgcg 129

<210> 6

<211> 122

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 6

gtcgagtgat tgtaaataaa atgtaattta cagtatagta ttttaattaa tatacaaatg 60

atttgataat aattcttatt taactataat atattgtgtt gggttgaatt aaaggtccgt 120

at 122

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 7

gggtcgacac catggacact ctaactaaaa aca 33

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 8

ccaagctttt attcaatttc tagatggagc 30

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 9

ccgctagcac catgaataga ttggtcaatg tctc 34

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 10

ccggtacctt atataatcat gcaggcag 28

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 11

ccgctagcat ggatactcta actaaaaa 28

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 12

ccaagctttt actggtcatt aaaaggccga g 31

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 13

ccggatccat gggtgattcc aatcagct 28

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 14

ccaagctttt attcaatttc tagatgga 28

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 15

ccggatccat gggtaagaag aaaccacggc g 31

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 16

ccaagctttt actggttatt ggcagccatc t 31

Claims

1.一种III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒的重组表达载体，其特征在于，包含III型鸭甲型肝炎病毒结构蛋白前体基因P1和蛋白水解酶基因3C；

2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述结构蛋白前体基因P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述蛋白水解酶基因3C的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1或2所述的重组表达载体，其特征在于，所述结构蛋白前体基因P1的启动子为P_H，所述蛋白水解酶基因3C的启动子为P₁₀；

所述P_H的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述P₁₀的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

4.一种III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒，其特征在于，采用如权利要求1-3任一项所述的重组表达载体制备得到。

5.一种III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：构建如权利要求1-3所述的重组表达载体，将所述表达载体转染昆虫细胞获得重组杆状病毒，将所述重组杆状病毒感染昆虫细胞，培养后收获上清，即得III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述昆虫细胞为sf9细胞；

优选地，所述昆虫细胞的培养基为SF900-II。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒纯化的步骤：将收获的上清离心，再取上清过滤，滤液经过蔗糖梯度密度离心，收集白色条带即为纯化的III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒；

优选地，所述离心的转速为500-800×g；

优选地，所述离心的时间为25-30min；

优选地，所述过滤为0.22μm滤膜过滤；

优选地，所述蔗糖梯度密度为20％、40％和60％。

8.根据权利要求5-7任一项所述的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

9.一种如权利要求1-3任一项所述的重组表达载体或如权利要求4所述的III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒在制备III型鸭甲型肝炎疫苗中的应用。

10.一种III型鸭甲型肝炎疫苗，其特征在于，含有如权利要求4所述的III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒；

优选地，所述III型鸭甲型肝炎疫苗还包括佐剂。