CN105866408B - 一种四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫层析检测技术领域，具体公开了一种四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括第一试纸条和第二试纸条，第一试纸条和第二试纸条均包括塑料板、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜，硝酸纤维纤维素膜上设置有检测线1、检测线2和控制线，第一试纸条玻璃纤维素膜上包被量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体；第一试纸条的检测线1上包被腺病毒抗原，检测线2上包被轮状病毒抗原；第二试纸条玻璃纤维素膜上包被量子点标记的星状病毒抗体和量子点标记的诺如病毒抗体；第一试纸条的检测线1上包被星状病毒抗原，检测线2上包被诺如病毒抗原。该试剂盒实现了对肠道病毒进行快速、灵敏的联合检测。

Description

一种四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫层析检测技术领域，具体涉及一种四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒及其制备方法。

背景技术

轮状病毒(rotavims，RV)是全世界范围内人和动物急性腹泻的主要病原之一，轮状病毒的生物学性状为大小不等的球形，直径60～80nm，双层衣壳，无包膜，负染后在电镜下观察，病毒外形呈车轮状，故名。在粪便中存活数天到数周。耐乙醚、酸、碱和反复冻融，pH适应范围广(pH3.5～10)。在室温下相对稳定，55℃30分钟可被灭活。基因组及其编码的蛋白质为双链RNA病毒，约18550bp，由11个基因片段组成。每个片段含一个开放读码框架，分别编码6个结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)和5个非结构蛋白(NSP1～NSP5)，非结构蛋白为病毒酶或调节蛋白，在病毒复制中起主要作用。VP6位于内衣壳，为组和亚组特异性抗原；VP4和VP7位于外衣壳，VP7为糖蛋白，是中和抗原，决定病毒血清型，VP4为病毒的血凝素，亦为重要的中和抗原，VP1～VP3位于核心。根据VP6的抗原性，目前将其分为A～G 7个组，A组轮状病毒根据VP6又分为4个亚组(I、II、I+II、非I非II)。另外A组根据表面中和抗原VP7和VP4分14个G血清型(VP7为糖蛋白)和19个P血清型(VP4为蛋白)。其中，A～C组轮状病毒能引起人类和动物腹泻，D～G组只引起动物腹泻。

A组RV最为常见，是秋冬季婴幼儿腹泻的最重要病原，在发展中国家，每年约有87万儿童死于轮状病毒感染。主要流行的血清型为G1P8、G2P4、G3P8和G4P8，是引起6个月～2岁婴幼儿严重胃肠炎的主要病原体占病毒性胃肠炎的80％以上，是导致婴幼儿死亡的主要原因之一。年长儿童和成人常呈无症状感染。传染源是病人和无症状带毒者，病人每克粪便中排出的病毒体可达1010个，粪-口是主要的传播途径。病毒还可能通过呼吸道传播，从有呼吸道症状儿童的呼吸道分泌物中曾检出轮状病毒的存在，在动物中已证明气溶胶可传播病毒。温带地区晚秋和冬季是疾病发生的主要季节。

病毒侵入人体后在小肠粘膜绒毛细胞内增殖，病毒基因产物VP4为主要致病因子，造成细胞溶解死亡，微绒毛萎缩、变短、脱落；腺窝细胞增生、分泌增多，导致严重腹泻，水和电解质的丧失。潜伏期为24～48小时，突然发病，发热、水样腹泻、呕吐和脱水，一般为自限性，可完全恢复。但当婴儿营养不良或已有脱水，若不及时治疗，是导致婴儿死亡的主要原因。

B组RV由我国洪涛等发现，主要感染青壮年，B组病毒可在年长儿童和成人中产生暴发流行，但至今仅在我国有过报道。1982～1983年，该组病毒在我国东北，西北矿区青壮年工人中引发了大规模霍乱样腹泻流行，患者达数十万人；C组RV主要感染青少年，主要引起散发流行，对人的致病性类似A组，但发病率很低。

轮状病毒感染后机体可产生型特异性抗体IgM和IgG，对同型病毒有保护作用，特别是肠道sIgA。对异型只有部分保护作用，细胞免疫亦有交叉保护作用。A组RV血清型众多，VP6蛋白是其主要的组特异性抗原,有较强的抗原性和免疫原性,可诱导保护性免疫.有研究表明,VP6蛋白的IgA mAb对RV感染具有免疫保护作用,肌注免疫VP6DNA疫苗可产生较好的异源保护作用。轮状病毒(rotavirus,RV)是引起全世界婴幼儿严重腹泻的重要病原,RV危害严重且无有效的治疗手段,根除RV感染的惟一途径是发展安全、有效的疫苗,这已成为一个全球性的公共医疗目标,是一项十分迫切而必要的工作

目前国内虽然已经研发了RV疫苗，但其效果还需要观察，因此RV的预防控制还将是公共卫生工作的长期任务，这一工作的开展离不开快速、准确的RV实验室诊断技术。

腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。衣壳里是线状双链DNA分子，腺病毒分两个属，共约100余血清型。一般会造成呼吸系统的不适，对啮齿类动物有致癌能力，或能转化体外培养的啮齿类动物细胞，但对人体不出现致癌性。人体腺病毒已知有52种，分别命名为adl～ad52，研究得最详细是ad2。腺病毒基因组转录产生mRNA，已知的转录单位至少有5个：EⅠ区位于病毒基因组左侧，可再分成EⅠA和EⅠB，与细胞转化有关；EⅡ区编码DNA结合蛋白，参与病毒的复制；EⅢ区编码出现在宿主细胞表面的一种糖蛋白；EⅣ区位于ad2基因组右端，受EⅡ区编码的DNA结合蛋白质调控；第5个转录单位在病毒感染中期合成ad2蛋白质Ⅳ。

腺病毒对啮齿类动物有致癌能力，或能转化体外培养的啮齿类动物细胞。使细胞转化只需要腺病毒基因组的一部分，这些基因位于基因组的左端，约占整个基因组的7％～10％。尽管腺病毒分布很广，但对人体不出现致癌性。人体细胞是一类允许细胞(permissive cell)，即这类细胞允许感染入侵的病毒在细胞内复制增殖，最后细胞裂解死亡而释放出大量子代病毒。在体外培养的多种人体肿瘤细胞中均未查出腺病毒颗粒，但在人的1号染色体上有adl2的整合位点，这意味着人体细胞对于腺病毒也可能是非允许细胞，即这类细胞在病毒感染后，病毒不能在细胞内复制增殖，但可整合在受感染细胞的基因组内。这些细胞被病毒转化，表型发生改变，且可在体外无限期地培养传代。

腺病毒是一种无包膜的双链DNA病毒，基因组长约25-45kb，理论上可编码22-40个基因。衣壳(capsid)呈规则的20面体结构，直径约80-110nm。衣壳含有240个六联体(hexon)、12个五联体(penton)及12根纤毛(fiber)，除此之外还有其他一些小蛋白，如VI、VIII、IX、IIIa和IVa2等。六联体是形成病毒衣壳20个三角形面的主要蛋白，12个顶端是5个五联体亚单位和3个纤毛蛋白构成的复合物，12根纤毛以五联体蛋白为基底由衣壳表面伸出，纤毛顶端形成头节区(knob)。五联体和纤毛的头节区可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。

腺病毒含13％DNA和87％的蛋白质，病毒体分子量约为175×106。病毒基因组为线状双链DNA，大约含35kb～36kb，腺病毒12、18和31型的DNA组成中，G+C mol％最低(48％～49％)，属于对动物具有高致癌性基因型。腺病毒1、2、4、5、8等型的G+C mol％较高(61％)，致癌性反而低或无。这是一种用于人腺病毒分离株的分组的标准，根据其基因同源性将人腺病毒分为A～F等6组。

腺病毒的基因组以线性的双链DNA形式存在，由蛋白VII和一种称为mu的小蛋白紧密地环绕在其周围，起到类组蛋白样的作用。另一种蛋白V将这种DNA-蛋白复合物连接起来，并通过蛋白VI与病毒衣壳连接在一起。在两条链的5′端各以共价键结合着一个被称为DNA末端蛋白(pTP)复合物(DNA-TPC)的特化的结构，与腺病毒复制密切相关。腺病毒基因组的两端各有一段100bp的反向末端重复序列(ITR)，是复制的起始位点。在左端ITR的3′侧有一段长约300bp的包装信号(ψ)介导腺病毒基因组包装入病毒衣壳。对腺病毒而言，只有包括两端的ITR和包装信号(ψ)的约0.5kb的序列是顺式作用元件，也就是说必须由腺病毒载体自身携带，而其他的30余种蛋白都可以通过辅助病毒(或细胞)反式补足。病毒蛋白约11种(TP和PⅠ～PⅩ)，其中有4种蛋白(病毒多肽PⅤ、PⅦ，末端蛋白TP、酶蛋白PⅩ)与病毒基因构成病毒核心，多肽PⅦ是主要的核心蛋白，如同组蛋白一样包裹病毒基因DNA。构成病毒衣壳的蛋白质约7种。多肽PⅡ是病毒衣壳中最丰富和最主要成分，六邻体是由3个PⅡ分子紧密相连组成。多肽PⅥ、PⅧ在六邻体与病毒核心之间形成连接桥，并与多肽PⅨ一起稳定着六邻体分子的晶格排列。5个分子多肽PⅢ相连构成五邻体的基座蛋白，PⅢa为五邻体的周围蛋白，也参与衣壳的组成，五邻体通过PⅤ与病毒核心相连。多肽PⅣ主要构成病毒三聚体纤突，纤突与病毒血凝活性相关，因血凝素(纤突)具有型特异性，常用血凝抑制试验(HI)对临床分离株进行分型。

腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染，人腺病毒约1/3的已知血清型通常与人类疾病相关，但一种血清型可引起不同的临床疾患；相反，不同血清型也可引起同一种疾患。许多腺病毒在肠道细胞中复制，随粪便排出，但大多血清型与胃肠道疾病无关。而40型和41型腺病毒可引起婴幼儿与年少(4岁以下)儿童的胃肠炎，致腹痛、腹泻。C组腺病毒能引起某些婴幼儿肠套叠。

腺病毒11、12型能引起儿童急性出血性膀胱炎，尿中出现病毒。37型可引起女性宫颈炎和男性尿道炎，常由性传播感染。在免疫功能低下者可引起偶发或严重的病毒感染，尤其在器官移植病人中发生严重呼吸道感染和病毒性肝炎，多由1、5和7型腺病毒引起。艾滋病患者可感染多种血清型腺病毒，并能出现抗原性介于中间的杂合型毒株，而且常为致死性腺病毒感染。主要原因是腺病毒的E1A蛋白可反式激活HIV的转录，加速HIV的复制。临床发现37％的艾滋病患者病毒性腹泻是由腺病毒所致。

与绝大多数呼吸道感染的病原相比，机体对腺病毒的再感染能产生有效的免疫。起保护作用的是体内产生的循环中和抗体。正常的健康成人一般也具有多型的抗体。约40％～60％的6～15岁的人具有1、2和5型中和抗体，但3、4和7型抗体很少。母亲的抗体能保护婴儿免除严重的腺病毒呼吸道感染。腺病毒的生活周期可以分为两个截然不同却又不能割裂开来的两个阶段。第一阶段包括腺病毒颗粒粘附和进入宿主细胞，将基因组释放到宿主细胞核中，以及有选择性地转录和翻译早期基因。在这个阶段，细胞为病毒基因组复制和腺病毒晚期基因表达并最终释放成熟的感染颗粒，即第二阶段，作好了准备。第一阶段将在6～8个小时内完成，第二阶段则更快，只需4～6个小时。

星状病毒，是一种感染哺乳动物及鸟类的病毒。人星状病毒于1975年从腹泻婴儿粪便中分离得到，球形，直径28-35nm，无包膜，电镜下表面结构呈星形，有5～6个角。核酸为单正链RNA，7.0kb，两端为非编码区，中间有三个重叠的开放读码框架。该病毒呈世界性分布，粪-口传播，是引起婴幼儿、老年人及免疫功能低下者急性病毒性肠炎的重要病原之一，其致病性已日益受到重视，人类感染腺病毒主要症状是严重腹泻，伴随发热、恶心、呕吐。本病为自愈性疾病，大部分患者在出现症状2-3天时，症状会逐渐减轻，但也有极少数症状加重，造成脱水。

诺如病毒(Norovirus，NV)，又称为诺罗病毒、诺沃克病毒或脓融病毒，是一种引起非细菌性急性胃肠炎的病毒。直径约为26～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称；从急性胃肠炎病人的粪便中分离，不能在细胞或组织中培养，也没有合适的动物模型；基因组为单股正链RNA；在氯化铯密度梯度中的浮力密度为1.36～1.41g/cm3；电镜下缺乏显著的形态学特征，负染色电镜照片显示，NV是具有典型的羽状外缘，表面有凹痕的小圆状结构病毒。诺如病毒基因组全长约7.7kb，包含3个开放阅读框(Open readding frames，ORFs)。ORF1编码非结构蛋白，包括RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)；ORF2和ORF3分别编码主要(VP1)和次要(VP2)衣壳蛋白。VP1蛋白结构上可分为S和P区两个相邻的区域，其中S区形成内壳，构成VP1的底座；P区形成拱样结构突出于内壳外。P区可进一步分为P1和P2两个亚区，后者位于VP1的最外层，高度变异，目前认为是免疫识别和受体结合的关键部位。ORF1/ORF2的重组及P2区的变异大大丰富了NV的遗传多样性。根据VP1序列的同源性，诺如病毒可分为GI～GV五个基因群(Genogroup)，其中引起人类感染的主要是GI和GII群，基因群可进一步分为不同的基因型(Genotype)。自1995～1996年诺如病毒首次导致世界性大流行以来，GII群中的第4基因型GII.4，一直在世界范围内的流行中占据主导地位，且几乎每隔两、三年，GII.4便会引发一次大范围流行，同时出现一种新的变异株。

诺如病毒的特征是感染人口密度较高和卫生环境差的地方，如邮轮。诺如病毒是由粪便、口水传染，人若吃了被感染的蚌类也会感染。诺如病毒感染性腹泻是由诺如病毒属病毒引起的腹泻，具有发病急、传播速度快、涉及范围广等特点，是引起非细菌性腹泻暴发的主要病因。诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。诺如病毒遗传高度变异，在同一时期和同一社区内可能存在遗传特性不同的毒株流行。诺如病毒抗体没有显著的保护作用，尤其是没有长期免疫保护作用，极易造成反复感染。诺如病毒遗传高度变异，在同一时期和同一社区内可能存在遗传特性不同的毒株流行。诺如病毒抗体没有显著的保护作用，尤其是没有长期免疫保护作用，极易造成反复感染。

因此，实现对腺病毒、轮状病毒、星状病毒、诺如病毒的同时联合检测，对于临床肠道腹泻疾病的诊断和治疗具有重要的意义。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种灵敏度高、准确度高、操作简便、成本低的四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒，实现对腺病毒、轮状病毒、星状病毒、诺如病毒的同时联合检测。

本发明的目的还在于提供一种四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒的制备方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒，包括具有两个检视窗口的壳体，所述壳体内放置有第一试纸条和第二试纸条，所述第一试纸条和第二试纸条均包括塑料板、设置在塑料板上的玻璃纤维素膜、设置在玻璃纤维素膜上的硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上一端设有样本垫，对应的另一端设有吸水垫，所述硝酸纤维纤维素膜上设置有检测线1、检测线2和控制线，所述第一试纸条的玻璃纤维素膜上包被有量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体的混合物；所述第一试纸条的检测线1上包被有腺病毒抗原，检测线2上包被有轮状病毒抗原；所述第二试纸条的玻璃纤维素膜上包被有量子点标记的星状病毒抗体和量子点标记的诺如病毒抗体混合物；所述第一试纸条的检测线1上包被有星状病毒抗原，检测线2上包被有诺如病毒抗原；所述第一试纸条和第二试纸条控制线上均包被有羊抗鼠lgG。

所述第一试纸条玻璃纤维素膜上包被的量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体混合物中量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体质量比为1：1；所述第二试纸条玻璃纤维膜上包被的量子点标记的星状病毒抗体和量子点标记的诺如病毒抗体混合物中量子点标记的星状病毒抗体、量子点标记的诺如病毒抗体的质量比为1：1。

所述量子点为硒化镉或硫化镉量子点。

所述硝酸纤维素膜上设置的检测线1与检测线2之间、检测线2与检测线3之间、检测线1与控制线之间的间隔均不小于5mm。

上述四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒的制备方法，包括以下操作步骤：

第一、制备第一试纸条：

1)原材料的制备：

A：制备玻璃纤维素膜：将量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体混合包被在玻璃纤维素膜上，干燥，备用；

B：制备硝酸纤维素膜：取硝酸纤维素膜，间隔划分出检测线1、检测线2、检测线3和控制线，然后将腺病毒抗原、轮状病毒抗原、羊抗鼠lgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线1、检测线2和控制线上，之后将包被后的硝酸纤维素膜放入封闭液中封闭，干燥，备用；

2)组装：在塑料板上放置步骤1)制备的玻璃纤维素模，然后在步骤1)制备的玻璃纤维素膜上放置步骤1)制备的硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素的一端放置样品垫，对应的另一端放置吸水垫，干燥，即的第一试纸条；

第二、按照上述第一试纸条同样的制备方法制备第二试纸条；

第三、将制备的第一试纸条和第二试纸条对应放置在具有两个检视窗口的壳体内，即完成。

步骤A中还包括首先制备量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体的混合物，具体方法包括以下操作步骤：

a：在胶乳颗粒悬浊液中加入改性环糊精，混匀24小时，纯化，得改性环糊精-胶乳复合物悬浊液；

b：在步骤a制备的改性环糊精-胶乳复合物悬浊液中加入量子点，混匀24小时，纯化，得量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊液；

c：在步骤b制备的量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊液中加入活化剂，活化15分钟，纯化，之后加入腺病毒抗体，混匀2～4小时后，离心得沉淀物颗粒，将沉淀物颗粒用封闭液重悬，室温混匀1小时，之后再进行纯化，即得量子点标记的腺病毒抗体；

d：按照上述步骤a～c同样的方法制备量子点标记的轮状病毒抗体，然后将量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体混合，备用；

所述改性环糊精为羧甲基化改性环糊精或氨基化改性环糊精。

所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。

步骤B中所用的封闭液为牛血清白蛋白溶液。

步骤c中所述量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊液与活化剂的质量比为1：10。

步骤c中所用的封闭液为牛血清白蛋白溶液。

步骤a中所述改性环糊精与胶乳颗粒的质量比为20：1；步骤b中所述量子点与环糊精-乳胶复合物的质量比为10：1；步骤c中所述腺病毒抗体与量子点-改性环糊精-胶乳复合物的质量比为1：20。

步骤a中胶乳颗粒使用前进行纯化处理，所述纯化处理的具体方法为：取胶乳颗粒加入第一缓冲液中，离心分离，弃去上清，再用第一缓冲液重悬沉淀物颗粒，然后再离心分离，弃去上清，再用第一缓冲液重悬沉淀物颗粒，4℃保存备用。

上述纯化后的胶乳颗粒在使用时取胶乳颗粒，采用第二缓冲液将胶乳颗粒稀释成浓度为10mg/ml。

上述步骤b中还包括首先将步骤a中制备的改性环糊精-胶乳复合物悬浊液，采用第二缓冲液稀释成浓度为10mg/ml的悬浊液，然后再加入量子点。

上述步骤c中还包括首先将步骤b中制备的量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊液，采用第二缓冲液稀释成浓度为10mg/ml的悬浊液，然后再加入活化剂活化。

步骤c中所述封闭后进行纯化的具体方法为：8000rpm条件下离心15min，弃去上清，沉淀复溶于分散液中。

步骤A中将量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体混合包被在玻璃纤维素膜上的具体方法为：将将量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体混合物均匀喷涂于玻璃纤维素膜上。

步骤a和步骤b中所述纯化的具体方法为：8000rpm条件下离心，弃去上清，沉淀用第一缓冲液进行重悬，之后在8000rpm条件下离心，弃去上清，沉淀复溶于第一缓冲液中。

步骤c中活化后纯化的具体方法为：8000rpm条件下离心弃去上清，沉淀用第一缓冲液进行重悬。

步骤B中将腺病毒抗原、轮状病毒抗原、羊抗鼠lgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上的具体方法为：分别取浓度均为1mg/ml的腺病毒抗原、轮状病毒抗原和羊抗鼠IgG，以1ul/cm，10cm/秒的速度分别喷涂到硝酸纤维的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上。

步骤1)和步骤2)中所述的干燥为37℃干燥3～5小时。

上述第一缓冲液为0.02M，pH7.4的PB缓冲液。上述第二缓冲液为0.02M，pH6.1的MES缓冲液。

上述四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒在使用时，将待测样品加入试纸条的样品垫上，玻璃纤维素膜上的量子化标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体、量子点标记的星状病毒、量子点标记的诺如病毒抗体首先特异性的捕捉到待测样品中的腺病毒、轮状病毒、星状病毒和诺如病毒，然后在达到第一试纸条检测线2时，量子点标记的轮状病毒抗体-轮状病毒结合物与检测线2上的轮状病毒抗原特异性结合；在第一试纸条检测线1时，量子点标记的腺病毒抗体-腺病毒结合物与检测线1上的腺病毒抗原特异性结合；在第一试纸条检测线2时，量子点标记的诺如病毒抗体-诺如病毒结合物与检测线2上的诺如病毒抗原特异性结合，在第一试纸条检测线1时，量子点标记的星状病毒抗体-星状病毒结合物与检测线1上的星状病毒抗原特异性结合。之后通过检测第一试纸条和第二试纸条检测线1、检测线2上结合的量子点的荧光效应，定性的测得腺病毒、轮状病毒、星状病毒和诺如病毒的阳性率，为肠道疾病的诊断提供依据。

本发明四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒，以量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体、量子点标记的星状病毒抗体、量子点标记的诺如病毒抗体包被在玻璃纤维素膜上，作为检测探针，利用间接法原理结合量子点的荧光特性实现了采用荧光免疫层析的方法对腺病毒、轮状病毒、星状病毒、诺如病毒进行快速、特异、简便、灵敏的联合检测。本发明四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒检测线低，检测灵敏度高。

本发明四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒的制备方法，操作简便，易于控制，适于工业化推广应用。

进一步优选的，本发明制备方法中，创新量子点标记技术，采用羧甲基化或氨基化改性的环糊精修饰量子点，然后将腺病毒抗体、轮状病毒抗体、星状病毒抗体、诺如病毒抗体分别结合在改性环糊精的羧基基团或氨基基团上，实现制备获得量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体、量子点标记的星状病毒、量子点标记的诺如病毒。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

一种四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒，包括具有两个检视窗口的壳体，所述壳体内放置有第一试纸条和第二试纸条，所述第一试纸条和第二试纸条均包括塑料板、设置在塑料板上的玻璃纤维素膜、设置在玻璃纤维素膜上的硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上一端设有样本垫，对应的另一端设有吸水垫，所述硝酸纤维纤维素膜上设置有检测线1、检测线2和控制线，所述第一试纸条的玻璃纤维素膜上包被有质量比为1：1的量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体的混合物；所述第一试纸条的检测线1上包被有腺病毒抗原，检测线2上包被有轮状病毒抗原；所述第二试纸条的玻璃纤维素膜上包被有质量比为1：1的量子点标记的星状病毒抗体和量子点标记的诺如病毒抗体混合物；所述第一试纸条的检测线1上包被有星状病毒抗原，检测线2上包被有诺如病毒抗原；所述第一试纸条和第二试纸条控制线上均包被有羊抗鼠lgG。所述量子点为硒化镉量子点。

本实施例四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒的制备方法，具体操作步骤为：

第一、制备第一试纸条：

1)制备玻璃纤维素膜：

a：取1ml未标记胶乳颗粒加入10ml，0.02M，pH7.4PB缓冲液中；离心机10000rpm离心20min；去掉上清液，再用10ml，0.02M，pH7.4PB缓冲液重悬沉淀颗粒物；之后再离心机10000rpm离心20min，去掉上清并用5ml0.02M，pH7.4，PB缓冲液重悬沉淀颗粒物，4℃保存待用；

b：取步骤a制备的胶乳颗粒用0.02M，pH6.1的MES缓冲液将胶乳颗粒稀释至10mg/ml，取0.05ml稀释后的胶乳颗粒悬浊液加入10mg羧基化改性环糊精，混匀24小时后，离心机8000rpm离心，弃去上清，并用0.02M，pH7.4的PB缓冲液重悬沉淀颗粒物，之后再次离心机8000rpm离心，弃去上清，沉淀颗粒物复溶于0.02M，pH7.4的PB缓冲液中，得羧基化改性环糊精-胶乳复合物悬浊液；

c：取步骤b制备的羧基化改性环糊精-胶乳复合物悬浊液，用0.02M，pH6.1的MES缓冲液将其稀释至10mg/ml，取20ml稀释后的羧基化改性环糊精-胶乳复合悬浊液，加入20mg硒化镉量子点，混匀24小时，离心机8000rpm离心，弃去上清，并用0.02M，pH7.4的PB缓冲液重悬沉淀颗粒物，之后再次离心机8000rpm离心，弃去上清，沉淀颗粒物复溶于0.02M，pH7.4的PB缓冲液中，得量子点-羧基化改性环糊精-胶乳复合物悬浊液；

d：取步骤c制备的量子点-羧基化改性环糊精-胶乳复合物悬浊液，用0.02M，pH6.1的MES缓冲液将其稀释至10mg/ml，然后按照量子点-改性环糊精-胶乳复合物与活化剂的质量比为1：10，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化15分钟后，8000rpm离心，弃去上清，并用0.02M，pH7.4的PB缓冲液重悬沉淀物颗粒，之后按照腺病毒抗体：量子点-羧基化改性环糊精-胶乳复合物＝1：20的比例加入腺病毒抗体，混匀3小时后，8000rpm离心15分钟，将沉淀物颗粒用封闭液重悬，室温混匀1小时，之后8000rpm离心15min，沉淀颗粒物复溶于分散液，即得量子点标记的腺病毒抗体；

e：按照上述步骤a～c同样的方法制备量子点标记的轮状病毒抗体，然后将量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体混合，喷涂于玻璃纤维素模上，37℃干燥4小时，即得量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体混合物标记的玻璃纤维素膜；

2)制备硝酸纤维素膜：取硝酸纤维素膜，间隔6mm依次划分检测线3、检测线2、检测线1和控制线，之后取浓度均为1mg/ml的腺病毒抗原、轮状病毒抗原、羊抗鼠IgG，以1ul/cm，10cm/秒的速度分别喷涂到硝酸纤维膜的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上，之后将硝酸纤维素膜放入牛血清白蛋白溶液中封闭，37℃干燥3小时，即得所述的硝酸纤维素膜；

3)组装：在塑料板上放置步骤1)制备的玻璃纤维素模，在步骤1)制备的玻璃纤维素膜上放置步骤2)制备的硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素的一端放置样品垫，对应的另一端放置吸水垫，37℃干燥5小时，即得第一试纸条；

第二、按照上述第一试纸条同样的制备方法制备第二试纸条；

第三、将第一试纸条和第二试纸条对应的放入具有两个检视窗的壳体内，使得试纸条的检测线和控制线均从检视窗可见。

实施例2

本实施例四种肠道病毒联合检测用试剂盒，与实施例不同的地方在于，采用的量子点为硫化镉量子点，采用的改性环糊精为氨基化干性环糊精，制备腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体、量子点标记的星状病毒抗体、量子点标记的诺如病毒抗体的过程中，在活化的量子点-改性环糊精-胶乳悬浊液中加入抗体或抗原的混匀时间为2小时，其他同实施例1。

实施例3

本实施例四种肠道病毒联合检测用试剂盒，与实施例不同的地方在于，制备腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体、量子点标记的星状病毒抗体、量子点标记的诺如病毒抗体的过程中，在活化的量子点-改性环糊精-胶乳悬浊液中加入抗体或抗原的混匀时间为4小时，其他同实施例1。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒包括具有两个检视窗口的壳体，所述壳体内放置有第一试纸条和第二试纸条，所述第一试纸条和第二试纸条均包括塑料板、设置在塑料板上的玻璃纤维素膜、设置在玻璃纤维素膜上的硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上一端设有样本垫，对应的另一端设有吸水垫，所述硝酸纤维纤维素膜上设置有检测线1、检测线2和控制线，其特征在于，所述第一试纸条的玻璃纤维素膜上包被有量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体的混合物；所述第一试纸条的检测线1上包被有腺病毒抗原，检测线2上包被有轮状病毒抗原；所述第二试纸条的玻璃纤维素膜上包被有量子点标记的星状病毒抗体和量子点标记的诺如病毒抗体混合物；所述第二试纸条的检测线1上包被有星状病毒抗原，检测线2上包被有诺如病毒抗原；所述第一试纸条和第二试纸条控制线上均包被有羊抗鼠lgG；

包括以下操作步骤：

第一、制备第一试纸条：

1)原材料的制备：

A：制备玻璃纤维素膜：将量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体混合包被在玻璃纤维素膜上，干燥，备用；

B：制备硝酸纤维素膜：取硝酸纤维素膜，间隔划分出检测线1、检测线2、检测线3和控制线，然后将腺病毒抗原、轮状病毒抗原、羊抗鼠lgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线1、检测线2和控制线上，之后将包被后的硝酸纤维素膜放入封闭液中封闭，干燥，备用；

2)组装：在塑料板上放置步骤1)制备的玻璃纤维素模，然后在步骤1)制备的玻璃纤维素膜上放置步骤1)制备的硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素的一端放置样品垫，对应的另一端放置吸水垫，干燥，即的第一试纸条；

第二、按照上述第一试纸条同样的制备方法制备第二试纸条；

第三、将制备的第一试纸条和第二试纸条对应放置在具有两个检视窗口的壳体内，即完成；

步骤A中还包括首先制备量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体的混合物，具体方法包括以下操作步骤：

a：在胶乳颗粒悬浊液中加入改性环糊精，混匀24小时，纯化，得改性环糊精-胶乳复合物悬浊液；

b：在步骤a制备的改性环糊精-胶乳复合物悬浊液中加入量子点，混匀24小时，纯化，得量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊液；

c：在步骤b制备的量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊液中加入活化剂，活化15分钟，纯化，之后加入腺病毒抗体，混匀2～4小时后，离心得沉淀物颗粒，将沉淀物颗粒用封闭液重悬，室温混匀1小时，之后再进行纯化，即得量子点标记的腺病毒抗体；

d：按照上述步骤a～c同样的方法制备量子点标记的轮状病毒抗体，然后将量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体混合，备用。

2.如权利要求1所述的四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒的制备方法，其特征在于，所述改性环糊精为羧甲基化改性环糊精 或氨基化改性环糊精。

3.如权利要求1所述的四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤a中所述改性环糊精与胶乳颗粒的质量比为20：1；步骤b中所述量子点与环糊精-乳胶复合物的质量比为10：1；步骤c中所述腺病毒抗体与量子点-改性环糊精-胶乳复合物的质量比为1：20。

4.如权利要求1所述的四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤A中将量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体混合物包被在玻璃纤维素膜上的具体方法为：将量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体混合物均匀喷涂于玻璃纤维素膜上。

5.如权利要求1所述的四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤B中将腺病毒抗原、轮状病毒抗原羊抗鼠lgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线1、检测线2和控制线上的具体方法为：分别取浓度均为1mg/ml的腺病毒抗原、轮状病毒抗原和羊抗鼠IgG，以1ul/cm，10cm/秒的速度分别喷涂到硝酸纤维的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上。

6.一种四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒，其特征在于，由如权利要求1～5任一项所述的制备方法制备而成。

7.如权利要求6所述的四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒，其特征在于，所述第一试纸条玻璃纤维素膜上包被的量子点标记的腺病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体混合物中量子点标记的腺 病毒抗体、量子点标记的轮状病毒抗体质量比为1：1；所述第二试纸条玻璃纤维膜上包被的量子点标记的星状病毒抗体和量子点标记的诺如病毒抗体混合物中量子点标记的星状病毒抗体、量子点标记的诺如病毒抗体的质量比为1：1。

8.如权利要求6所述的四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒，其特征在于，所述量子点为硒化镉或硫化镉量子点。

9.如权利要求6所述的四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上设置的检测线1与检测线2之间、检测线2与检测线3之间、检测线1与控制线之间的间隔均不小于5mm。