HU217105B - SIRS-vakcina, és eljárás a betegség diagnosztizálására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát képezi eljárás sertésnek sertésterméketlenségi éslégúti tünetegyüttessel (SIRS) szembeni imműnizálására alkalmasvakcina előállítására, tővábbá SIRS diagnősztizálására. A találmánytárgyát képezik tővábbá vakcinák SIRS megelőzésében való alkalmazásra,tővábbá SIRS-vírűst tartalmazó készítmények. A találmány szerintimegőldás alkalmas SIRS diagnősztizálására, illetve megelőzéséresertésben. ŕ

Description

A találmány tárgyát képezi eljárás sertésnek sertésterméketlenségi és légúti tünetegyüttessel (SIRS) szembeni immunizálására alkalmas vakcina előállítására, továbbá SIRS diagnosztizálására. A találmány tárgyát képezik továbbá vakcinák SIRS megelőzésében való alkalmazásra, továbbá SIRS-vírust tartalmazó készítmények.

A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható SIRS diagnosztizálására, illetve megelőzésére sertésben.

1987 óta a sertéstermelő ágazat egy ismeretlen betegség által okozott, pusztító járvány áldozata, amelyet gyakran neveznek „misztikus sertésvésznek (MSD)”, újabban viszont „sertésterméketlenségi és légúti tünetegyüttes (SIRS)” néven említik, mivel a kutatók eddig nem voltak képesek azonosítani a kórokozó ágenst. Észak-Amerikában és Európában sertések százezreit érinti ez a betegség. Ha egyszer egy sertést a SIRS megfertőzött, akkor az az egyetlen sertés egy egész kondát képes megfertőzni három-hét nap alatt. 1987 és 1991 között a sertéstermesztő ágazat sokmillió dollárt veszített a SIRS miatt. Egy legfrissebb vizsgálat szerint a SIRS a feljegyzésekben szereplő, kocánként 250-500 USD veszteséget okozott.

A SIRS a sertésekben sok tünetet okoz. A SIRS első jele a tenyészállományban általában az anorexia és a gyenge lázas állapot. Emellett a tenyészállatok bőre kékes elszíneződést mutathat, főleg a fülük, a mellbimbójuk, az orrmányuk, valamint a nyakuk és a válluk frontrésze. Az érintett bőr gyógyíthatatlanul elroncsolódhat. A SIRS-nek azonban a legpusztítóbb tünete a szaporodási probléma, amely a sertés-tenyészállományban előfordul. A SIRS hatására a kocák koraszülött malacokat hoznak világra; nagyon kis tömegű, gyenge malacokat, légzési problémákkal; illetve olyan malacokat, amelyek elpusztulnak, mielőtt elválasztják őket. A SIRS által okozott egyéb szaporodási tünetek közé tartozik a malacok korai ellése, a megtermékenyítési ráta csökkenése, néhány kocának nem indul be a szaporodási ciklusa, valamint az egy alomban található malacok össz-számának csökkenése. A becslések szerint a szaporodási problémák miatt elvesztett malacok száma az éves malacszám 10-15 százalékára tehető.

A kutatás a SIRS kórokozójának megtalálására irányult. Számos lehetséges baktérium kórokozót izoláltak. A potenciális baktérium kórokozók típusa azonban eltérő volt a különböző a sertésfarmokon. A vírusvizsgálatok során alkalmazták a fluoreszcens antitestvizsgálatot, az elektronmikroszkópos vizsgálatot és a szerológiai módszereket. Ezekkel a módszerekkel nem sikerült a SIRS kórokozóját azonosítani. Ennek az az eredménye, hogy mindeddig nem sikerült egy olyan vakcinát kifejleszteni, amely a sertéspopulációban előforduló SIRS kezelésére használható.

Az egyik patogén, amelyet a sertésterméketlenségi és légúti tünetegyüttes kutatásakor izoláltak, nem más, mint a Lelystad-kórokozóként ismert vírus. A Lelystadkórokozót, amelyet az izolálást követően vírusként jellemeztek, sertésterméketlenségi és légúti tünetegyüttesben szenvedő sertésekből izolálták, majd kimutatták róla, hogy sertéstüdő-makrofágok tenyészeteiben szaporodik [Wensvoort és munkatársai, Tijdsch Diergeneeskd, 116, 675-76, (1991); Wensvoort és munkatársai, Vet. Q., 13,121-130 (1991)]. Ezenkívül azáltal, hogy terhes kocákat tenyészetben szaporított Lelystadvírus hatásának tettek ki, a sertésterméketlenségi és légúti tünetegyüttesre jellemző klinikai tüneteket is előállították [Teprstra és munkatársa, Vet. Q., 13, 131-36 (1991)]. Megfelelő vakcina azonban 1991-ben nem áll rendelkezésre, és az akkori feltételezések szerint kifejlesztése is messze volt még [Animál Phar., 230, 21 (1991)]. Wensvoort és munkatársai szerint azt, hogy nem sikerült mindeddig vakcinát kifejleszteni, legalább két tény indokolja, egyrészt az, hogy szükség van a Lelystad-vírus további jellemzésére, másrészt találni kell egy, a sertés eredetű alveoláris makrofágoktól különböző sejtes rendszert [Wensvoort és munkatársai, Vet. Q., 73,121—30 (1991)].

Az FR 2,602,791 számú szabadalmi irat és a neki megfelelő 4,810,493 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat majomvesesejtek alkalmazását úja le TRT/SHS-vírus tenyésztésére. Az eljárás részét képezi majomvesesejtek [például afrikai zöldmajom vesesejtjei (például VERO-sejtek, rhesusmajom vesesejtjei, illetve Buffalo Green majomvesesejtek) folyamatos vonalából készült tenyészet beoltása a majomvesesejtek vírusával. A TRT/SHS vírus fertőző orrlégcsőgyulladás kiváltásáért felelős pulykában, továbbá olyan betegségek okozója madarak egyéb fajaiban, mint például a fertőző nagyfejtünetegyüttes („duzzadtfej-tünetegyüttes”) csirkékben és gyöngytyúkokban. Az FR 2,602,791 legyengített vagy inaktivált TRT/SHS-vírust tartalmazó vakcinák előállítását is ismerteti.

A jelen találmány tárgya tehát olyan vakcina és szérum, amelyet ha sertés-tenyészállománynak adunk be, akkor csökkenti a SIRS előfordulását a populációban. A találmány tárgya továbbá eljárás egy sertéspopuláció kezelésére a vakcinával, melynek segítségével a SIRS-t kiirtjuk a sertéspopulációból. A találmány tárgya továbbá eljárás a SIRS diagnosztizálására.

Az említett és egyéb célkitűzéseket a jelen találmány segítségével el lehet érni, amely a misztikus sertésvész megelőzésére és kezelésére alkalmas vakcinára és szérumra, valamint a betegség sertésben való diagnosztizálására irányul.

A vakcina egy fertőző kórokozóból származik, amely a sertéseket a misztikus sertésvésszel (SIRS) fertőzi meg. A fertőző kórokozót a betegséggel fertőzött sertés feldolgozott szövetéből, előnyösen tüdőszövetből előállított oltóanyaggal állítjuk elő. A fertőző kórokozó előnyösen egy in vitro emlőssejttenyészet terméke, azaz például egy, a fertőzött sertésszövetből származó oltóanyaggal fertőzött majomsejtvonal terméke. Az oltóanyag nem tartalmaz előnyösen 1,0 mikronnál, előnyösebben 0,5 mikronnál, még előnyösebben 0,2 mikronnál nagyobb biológiai részecskéket. Az is előnyös, ha az oltóanyagot semlegesítjük a szokványos sertésbetegségek elleni antitestekkel.

A jelen találmány szerint SIRS-szel fertőzött kondákból származó malacokból nyert szövethomogenizátum2

HU 217 105 Β mai következetesen reprodukálni lehet a SIRS légzési és szaporodási formáit, ha gnotobiotikus malacokat és vemhes kocákat intranazálisan beoltottunk vele. Az így szüretien vagy szűrt (0,45, 0,22 vagy 0,1 pm) oltóanyaggal beoltott gnotobiotikus malacok anorexiásak lettek és mikroszkopikusos tüdőléziók fejlődtek ki bennük, hasonlóak azokhoz, amelyek a SIRS-szel fertőzött kondákban láthatók. Ugyanez az oltóanyag ugyanolyan reprodukciós hatásokat okoz, mint amelyek a SIRS-szel fertőzött kondákban láthatók. Egy virális kórokozót sikerült kinyerni a szövethomogenizátumokból. A virális kórokozó olyan betegséget okoz, amely utánozza a SIRS-t malacokban és vemhes kocákban. A virális kórokozót még nem lehetett azonosítani. Azonban annyit lehet tudni, hogy a virális kórokozó egy kényes, nem hemagglutináló burokkal rendelkező RNS-vírus. Egy, a SIRS-t okozó virális kórokozót 1991. július 18-án helyeztünk letétbe az American Type Culture Collectionnél (Rockville, Maryland), ATCC VR-2332 letéti számon.

A fertőzött sertések kezelésére használt szérum SIRS elleni emlősantitesteket tartalmaz. Ezt emlősök (nem sertés és sertés) vérplazmájából kapjuk, amely emlősöket az előzőkben leírt fertőző kórokozóval előkezeltünk.

Egy másik módszer szerint a szérumot hibridómamódszerrel készített monoklonális antitestekből állítjuk elő.

A SIRS diagnosztizálására használt módszer a SIRS-re immunspecifikus antitestek felhasználásán alapul. A módszerhez szükség van egy tüdőbiopszia-mintára vagy egy biopsziamintára, vagy más szövetekből származó, hasonló mintákra (homogenizátum vagy biopszia), ezeket homogenizáljuk, szűrjük és kombináljuk, valamint szükség van az immunspecifikus antitestekre, egy ismert kimutatási technika alkalmazási módja szerint, a kombináció során keletkező konjugátum kimutatására. A konjugátum immobilizálása vagy kicsapása és az olyan kimutatási technikák alkalmazása mint az ELISA; RIA; Southern biot; Northern biot; Western biot és hasonlók lehetővé teszik a SIRS diagnosztizálását.

A jelen találmány szerint a SIRS elleni antitesteket alkalmazó terápiás és diagnosztikai módszerekben az előzőkben leírt kényes, nem hemagglutináló burokkal rendelkező RNS-vírus elleni monoklonális antitesteket (azaz például IgG-t vagy IgM-et) használunk. Az antitestekre példaként megemlíthetjük az SDOW 12 és SDOW 17 antitesteket, amelyeket az American Type Culture Collectionnél helyeztünk letétbe 1992. március 27-én, HB 10996 és HB 10997 letéti számon.

Az alábbiakban a mellékelt ábrák rövid leírását adjuk meg.

Az 1. ábrán a VR-2332 SIRS-vírusnál megfigyelt citopatikus hatásokat láthatjuk. 1A. ábra: Nem fertőzött, nem festett egysejt-réteg. IB. ábra: Fertőzött egysejt-réteg, kis granuláris kerek és degenerálódó sejtek figyelhetők meg három nappal a SIRS-vírus 6. átoltásával végzett inokulálás után.

A 2. ábrán a SIRS-vírussal fertőzött MA-104 sejtek direkt immunfluoreszcenciás festése látható. 2A. ábra:

nem fertőzött egysejt-réteg. 2B. ábra: Fertőzött sejtek intenzív, gyakran citoplazmatikus fluoreszcenciával, a beoltás után három nappal megfigyelve.

A 3. ábrán a CsCl sűrűséggradiensen tisztított SIRSvírus sűrűséggradiens-profilja látható. A legnagyobb vírusfertőzési aktivitás 1,18-1,19 g/ml-nél jelentkezik.

A 4. ábrán az 1,18-1,19 g/ml sűrűségű CsCl-gradiens frakciókban megfigyelt vírusrészecskék elektronmikroszkópos képe látható. 4A. ábra: Ez a négy részecske gömbölyű, átmérőjük 60-65 nm. Két részecske „üres”, elektronsűrű magot mutat (nyíl), a másik két részecske komplett. A vonal jelentése 100 nm. 4B. ábra: A SIRSvírus immungoid elektronmikroszkópiája hiperimmun nyúlszérummal, valamint aranyrészecskékkel jelzett antinyúl IgG-részecskékkel. Figyeljük meg a körülbelül 25-30 nm átmérőjű magrészecske jelenlétét a virionban. A vonal jelentése 50 nm.

Az 5. ábrán a SIRS-vírus hőmérséklet-stabilitása látható 4 °C-on (üres háromszögek), 37 °C-on (üres körök) és 56 °C-on (tele körök).

A misztikus sertésvész kórokozójának meghatározása nehéz feladat volt. A jelen találmány szerint sikerült megvalósítani a SIRS kórokozójának izolálását és szaporítását. A továbbiakban a „fertőző kórokozó” szakkifejezés jelentése egy olyan vírus, amely képes a sertésekben terméketlenséget és légzési tüneteket okozni. Pontosabban, a fertőző kórokozó egy kényes, nem hemagglutináló burokkal rendelkező RNS-vírus és annak zoopatogén mutánsai, amelyek képesek a sertésekben terméketlenséget és légúti megbetegedéseket okozni. A fertőző kórokozó izolálása nagy áttörés és felfedezés. Ez lehetővé teszi vakcinák és antitestszérumok készítését a fertőzött sertések kezelése céljából, valamint a diagnosztikai módszerekben való alkalmazás céljából.

A vakcina egy inaktivált vagy attenuált SIRS fertőző kórokozót tartalmaz, amely egy fertőzött sertéstüdőszövet, vagy egyéb, a SIRS-re jellemző léziókat mutató sertésszövet feldolgozásából származó oltóanyagból származik. A fertőző kórokozó funkcionális származékai, beleértve az alegység, a vektor, a rekombináns és szintetikus peptidvakcinákat és egyebeket, szintén elképzelhetők. A SIRS-vakcina kifejlesztésében egy többlépéses eljárást alkalmazunk. A SIRS fertőző kórokozóját először egy oltóanyag formájában állítjuk elő, oly módon, hogy fertőzött sertésszövetekből, előnyösen tüdőszövetből választjuk el és izoláljuk. A SIRS fertőző kórokozóját azután ismert vakcinakészítési technológiákkal kezeljük, és így állítunk elő SIRS elleni vakcinákat.

A SIRS fertőző kórokozóját előnyösen oltóanyag formájában izoláljuk olyan malacok tüdőszövetéből, amelyek a SIRS következtében gyorsan lélegeznek (más szövet is alkalmazható a vírus kinyerésére, például a magzati szövet). Az ilyen malacokat elroncsoljuk, és tüdőszövetüket eltávolítjuk. A tüdőszövetet azután mikroszkóposán megvizsgáljuk, hogy vannak-e benne megvastagodott alveoláris szeptumok, amik a makrofágok, degenerálódó sejtek és az alveoláris terekben levő törmelék következményei. Ezek a jellemzők a SIRS fertőző kórokozó jelenlétére utalnak. Más sertés3

HU 217 105 Β szövetek, amelyek ilyenfajta léziókat tartalmaznak, is használhatók a SIRS fertőző kórokozó izolálására.

A tüdőt vagy más sertésszövetet azután homogenizáljuk egy gyógyászatilag elfogadható vizes oldatban (ilyen például a fizológiai sóoldat, Ringer-féle oldat, Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldat, minimális szükséges táptalaj és hasonlók), oly módon, hogy a szövet a homogenizátum 10 tömeg/térfogatszázalékát tartalmazza. A homogenizátumot ezután olyan szűrőkön bocsátjuk át, amelyek pórusátmérője 0,05-10 mikron között változik, a pórusátmérő előnyösen 0,45, 0,2 és 0,1 mikron az egyes szűrőkön, így állítjuk elő a SIRS fertőző kórokozót tartalmazó, szűrt homogenizátumot. Ennek eredményeképpen a szűrt homogenizátum olyan biológiai részecskéket tartalmaz, amelyeknek a részecskemérete nem nagyobb 1 mikronnál, előnyösen nem nagyobb mint 0,2-0,1 mikron. A szűrt homogenizátumot azután Freund-féle inkomplett adjuvánssal keverhetjük össze, ezáltal az antitestek termelődése serkenthető emlősökbe való injekciózással. Ezt a keveréket használhatjuk oltóanyagként SIRS előidézésére sertésekben, illetve a SIRS fertőző kórokozó további tanulmányozására.

Azután, hogy előállítottuk a fertőző kórokozót tartalmazó, szűrt homogenizátumot, a fertőző kórokozót inaktiválhatjuk, illetve elpusztíthatjuk, ha a szűrt homogenizátumot standard kémiai inaktiváló ágenssel kezeljük, például egy aldehidreagenssel, ilyen például a formaiin, az acetaldehid és a hasonlók; reaktív savas alkoholokkal, ilyen például a krezol, a fenol és a hasonlók; savakkal, ilyen például a benzoesav, benzolszulfonsav és hasonlók; laktonokkal, ilyen például a béta-propiolakton és a kaprolakton; valamint aktivált laktámokkal, karbodiimidekkel és karbonil-diheteroaromás vegyületekkel, például karbonil-diimidazollal. Besugárzás, azaz például ultraibolya és gamma besugárzás is használható a fertőző kórokozók elpusztítására vagy inaktiválására. Egy másik módszer szerint a fertőző kórokozót oly módon attenuálhatjuk, hogy ismételten szaporítjuk nem sertés, emlős vagy majom eredetű sejttenyészetekben, ezáltal a fertőző kórokozó elveszti a virulens szaporodás képességét. A sejttenyészetben való attenuáció részleteit az alábbiakban adjuk meg.

Az elpusztított vagy attenuált fertőző kórokozót azután megfelelő titerre hígítjuk, egy hígító adjuvánsoldat hozzáadásával, az immunválasz serkentése érdekében. A titrálást úgy végezzük, hogy SIRS-antitesttel szemben méijük immunológiai tesztben, azaz például ELISA-, RIA-, IFA- vagy enzimszubsztrát-kimutatási tesztben, az alábbiakban ismertetett módon.

A fertőző kórokozó tisztított formájának előállításához az előzőkben ismertetett, szűrt homogenizátummal olthatunk be egy sorozat in vitro sejtkészítményt. Az emlősszervek sejtjeit tartalmazó sejtkészítményeket, azaz például a vese, a máj, a szív és az agy, a tüdő, a lép, a herék, az orrkagylócsont, fehér- és vörösvérsejtek és a nyirokmirigyek, valamint a rovarok és madarak embriósejtjeit használhatjuk. Az ezeknek a sejtkészítményeknek megfelelő szaporító táptalajok közé tartoznak például azok, amelyek az emlőssejtek növekedését elősegítik, ilyen például a boíjúmagzatszérum és agar, a vérinfuziós agar, az agy-szív infúziós glükóztáptalaj és agar, valamint a hasonlók. Az emlőssejtek előnyösen majom vesesejtek, legelőnyösebben afrikai zöldmajom embrionális vesesejtek - majomvese-sejtvonal (MA-104).

Miután a sejtkészítményt beoltottuk a szűrt homogenizátummal és a tenyészetet szaporítottuk, a tenyésztett sejtek csomóit kinyeijük, majd újra bejuttatjuk steril szaporító táptalajba. A sorozat végső tenyészetéből származó tenyészfolyadékból kapjuk a virulens fertőző kórokozó tisztított formáját. Emellett, miután az ismételt begyűjtések sorozatát végrehajtottuk, a tenyészetet szaporíthatjuk, a tenyészfolyadékot kinyerhetjük, és a folyadékot használhatjuk oltóanyagként egy másik sejttípushoz. Ily módon a fertőző kórokozó úgy attenuálható, hogy az egyik sejttípus tenyészfolyadéka szolgáltatja az attenuált fertőző kórokozó tisztított formáját.

Poliklonális antitestszérumokat állíthatunk elő, ha a fertőző kórokozót antigénanyagként alkalmazzuk, hogy emlősökben immunválaszt váltsunk ki. A fentiekben leírt módon előállított tenyészfolyadék vagy oltóanyag egy serkentőadjuvánssal együtt adható be egy nem sertés emlősnek, például lónak, kecskének, egérnek vagy nyúlnak. Az ismételt fertőzés után a vérszérumból bizonyos mennyiséget eltávolítunk, és antigénszempontból tisztítjuk, immobilizált antitesteket alkalmazva azokra a betegségekre specifikus antitestekből, amelyek rendszerint megtalálhatók egy véreztetett állat szérumában. A félig tisztított szérum további tisztításával, például szacharidgél oszlopon fiziológiai sóoldattal, és a 10 000 daltonnál nagyobb molekulatömegű, fehéijeszerű komponenseket összegyűjtve, kapjuk a tisztított poliklonális szérumot, amelyet a kezelésben felhasználhatunk.

Monoklonálisantitest-szérumokat a hibridómatechnikával állíthatunk elő. Egy egér, sertés, patkány, nyúl vagy más megfelelő faj SIRS-tartalmú sejttenyészetlizátummal vagy az előzőkben leírt gradiensen tisztított SIRS-vel immunizálva, az állat lépe eltávolítható és egy teljes sejtkészítménnyé alakítható. Kohler és Milstein módszerét követve [Natúré, 256, 495-497 (1975)] a lépsejtkészítményből származó immunsejtek füzionáltathatók mielómasejtekkel hibridómák előállítása céljából. A hibridómákat tenyésztve és a tenyészfolyadékot a fertőző kórokozót tartalmazó folyadékkal vagy oltóanyaggal szemben vizsgálva lehetővé válik annak a hibridómatenyészetnek az izolálása, amely a SIRS fertőző kórokozó elleni monoklonális antitesteket termel. A hibridómát bejuttatva a gazdaszervezet hasüregébe, a hibridóma peritoneális szaporodását kapjuk. Az aszcitesz folyadék összegyűjtésével kapjuk azt a testfolyadékot, amely a fertőző kórokozó elleni monoklonális antitestet tartalmazza. Emellett a hibridóma-sejttenyészet felülúszója is használható. A monoklonális antitestet előnyösen egy rágcsáló eredetű hibrid sejtvonallal állítjuk elő, amelyben az antitest egy IgG vagy IgM típusú immunglobulin. A SIRS fertőző kórokozó elleni monoklonális antitestre példa lehet a SDOW 12 és SDOW 17 monoklonális antitest. Az ebben a leírásban más helyen tárgyalt egyéb felhasználás mellett a jelen találmány szerinti monoklonális antitesteket különböző diagnosztikai

HU 217 105 Β és terápiás készítményekben és eljárásokban használhatjuk, beleértve a passzív immunizálást és az antiidiotípuskészítményt.

A jelen találmány szerinti vakcina képes a sertéspopulációkban megtalált SIRS fertőzések megelőzésére és gyógyítására. A hatékony in vivő profilaktikus és antiinfektív felhasználás céljából a SIRS-vakcina tartalmaz elpusztított vagy attenuált SIRS-fertőző kórokozót, és beadhatjuk önmagában vagy egy gyógyászatilag elfogadható hordozóval, amely a sertés számára elfogadható. A vakcinát beadhatjuk orálisan, parenterálisan, intranazálisan vagy intravénásán. A vakcinadózist befolyásoló faktorok közé tartozik például a fertőzött sertés kora, testsúlya, és a kiindulási antitest szintje. Egy adott dózis mérete lehet 103-107 Tissue Culture Infective Dose (szövettenyészet-fertőző dózis) 50 per ml, előnyösen 1-5 ml-es dózisban beadva. A vakcinadózisokat 14-18 napon belül kell alkalmazni, hogy biztosítsuk azt, hogy a sertésben kifejlődik az immunitás a SIRS-fertőzéssel szemben.

A SIRS-vakcinát számos különböző dózisformában beadhatjuk. Egy elpusztított vagy attenuált SIRS-fertőző kórokozót tartalmazó vizes közeget beszárithatunk, és kombinálhatjuk gyógyászatilag elfogadható inért töltőanyaggal és pufferolóanyaggal, azaz például laktózzal, keményítővel, kalcium-karbonáttal, nátrium-citráttal, tablettákká kapszulákká és hasonló kiszerelési formákká alakítva. Ezek a kombinációk por formában is kialakíthatók, vagy szuszpendálhatók egy vizes oldatban, oly módon, hogy ezek a porok és/vagy oldatok hozzáadhatok állati tápokhoz vagy az állatok ivóvizéhez. Ezek a SIRS-vakcinaporok vagy -oldatok megfelelően édesíthetők vagy ízesíthetők, különböző ismert ágensek felhasználásával, hogy ezzel elősegítsük azt, hogy a sertés orálisan felvegye a vakcinát.

A parenterális beadás céljára az elpusztított vagy attenuált SIRS fertőző kórokozót kombinálhatjuk gyógyászatilag elfogadható hordozóval/hordozókkal, amelyek a szakterületen jártas szakember számára jól ismertek, ilyen lehet például a sóoldat, a víz, a propilénglikol stb. Ebben a formában a vakcinát beadhatjuk parenterálisan, intranazálisan vagy orálisan, az állatgyógyászati szakterületen jártas szakember számára jól ismert módszerek alkalmazásával. A SIRS-vakcinát intravénásán is beadhatjuk egy tűvel. Ebben a formában a SIRS-vakcinát gyógyászatilag elfogadható hordozóval (hordozókkal) kombináljuk, például sóoldattal. A SIRS-vakcina parenterális és intravénás készítményei tartalmazhatnak emulgeáló- és/vagy szuszpendálóágenseket is, gyógyászatilag elfogadható hígítószerrel együtt, hogy szabályozzuk a SIRS bejuttatását és a dózis mennyiségét.

A SIRS diagnosztizálását az előzőkben leírt poliklonális vagy monoklonális antitestszérumokkal végezzük. Vagy az antitestszérumot, vagy a biopsziából származó szövethomogenizátumot immobilizálhatjuk egy polisztirolfelülettel, vagy egy másik, fehéije immobilizálására alkalmas polimerfelülettel érintkezésbe hozva. Az antitestszérum és a homogenizátum közül a másikat azután hozzáadjuk, inkubáljuk, és a nem immobilizált anyagot eltávolítjuk, például mosással. Ezután egy jelzett, az antitestszérumra specifikus, fajspecifikus antitestet adunk hozzá, és a jelölést, valamint a mennyiségét meghatározzuk. A jelzés meghatározása mutatja a SIRS jelenlétét a vizsgált szövetben. Ennek a módszernek tipikus megvalósítási módja lehet az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat (ELISA); a radioimmunesszé (RIA); az immunfluoreszcencia-vizsgálat (IFA), a Northern biot, a Southern biot, és a Western biot.

Az alábbi példákkal a találmány specifikus megvalósítási módjait illusztráljuk. A példák azonban nem korlátozzák a találmány érvényességi körét, amit a leírásban teljesen leírtunk.

1. példa

A SIRS fertőző kórokozót úgy jellemezhetjük, hogy meghatározzuk a fiziko-kémiai tulajdonságait (méret, érzékenység lipid oldószerekre, érzékenység proteázokra) az oltóanyag kezelésével, majd gnotobiotikus sertéseket oltunk be vele, hogy meghatározzuk, hogy a SIRS fertőző kórokozó patogén maradt-e.

A. Anyagok

Gnotobiotikus sertések. A gnotobiotikus sertések előállítását és fenntartását leírták a szakirodalomban [Benfield et al., Am. J. Vet. Rés., 49, 330-336 (1988); Collins et al., Am. J. Vet. Rés., 50, 824-835 (1989)]. A kocákat reprodukciós problémáktól, többek között SIRS-től mentes kondából kell választani. Koraszüléses vagy mumifikálódott magzatokat tartalmazó almot nem szabad használni.

SIRS oltóanyag (MN90-SD76-GP2, a továbbiakban a jelölése MNSD90 χ 7 6—L vagy MNSD90 χ 76—P)

Hörgő, tüdő, orrkagylócsont, mandula, máj, agy és lép gyűjthető be szopós malacokból egy SIRS-vel spontán módon fertőzött Minnesota sertéstelepről [Collins et al., Minnesota Swine Conference fór Veterinarians, Abstract, 254-55 (1990)]. Ezekből a szövetekből homogenizátumot (jele MN 89-35477) készítünk Hankféle kiegyensúlyozott sóoldatban, antibiotikumok nélkül, majd 0,5 ml intranazálisan beoltunk háromnapos gnotobiotikus malacokba, üvegporlasztó alkalmazásával (Ted Pella Co., Redding, CA). A beoltott malacokban klinikai tünetek fejlődhetnek ki, valamint olyan mikroszkópos léziók, amelyeket a spontán megfertőzött malacokban figyelhetünk meg. Ezekből a gnotobiotikus sertésekből tüdő, máj, vese, lép, szív és agy gyűjthető be nyolc nappal az eredeti beoltás után, ezeket egyesítjük egy másik homogenizátum készítésének céljából. Ezt a második homogenizátumot adhatjuk be még egyszer a gnotobiotikus sertéseknek. Ugyanúgy ugyanazokat a szöveteket gyűjthetjük be és homogenizálhatjuk, azzal a különbséggel, hogy a tüdőszövetet külön homogenizátumban készíthetjük el, mivel a SIRS szaporodásához a tüdőhomogenizátum az ideális. Ez a tüdőhomogenizátum az eredeti inokulum (MN 89-35477) második sorozatpasszálása („serial passage”) gnotobiotikus sertésekben [Collins et al., 71^st Meeting of the Conference of Research Workers in Animál Disease, Abstract No. 2. (1990)]. Két szűrlet készíthető 0,20 pm-es szűrő alkalmazásával (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI), illetve 0,10 pm-es szűrő alkalmazásával (Millipore Corp.,

HU 217 105 Β

Bedford, MA). Ezekből a szűrletekből alikvot részeket készíthetünk és -70 °C-on tárolhatjuk őket. Minden szűrlet mentes a baktériumoktól, és vírusokat sem szabad megfigyelni közvetlen elektronmikroszkópos vizsgálattal, negatívan festett készítményeket alkalmazva.

Kontroll oltóanyag

Két látszatfertőzött gnotobiotikus sertés tüdőszövetéből készített homogenizátumokat használjuk oltóanyagként kontrolisertésekben. Ez a kontroll oltóanyag előállítható 0,20 és 0,10 pm-es szűrletek formájában, amint az a SIRS oltóanyagnál leírtuk.

Nekropsziás eljárások és hisztopatológia

A sertéseket hét nappal az eredeti oltás után leöljük, amint azt Collins és munkatársai korábban közölték [Collins et al., 71^st Meeting of the Conference of Research Workers in Animál Disease, Abstract No. 2. (1990)]. A szöveteket összegyűjtjük, fixáljuk semleges puffereit formaiinban, majd előkészítjük fénymikroszkópos vizsgálatokhoz [Collins et al., Am. J. Vet. Rés., 50, 824-835 (1989)]. A mintákat az orrkagylócsontból, a mandulákból, hörgőkből, agyból, timuszból, tüdőből (apikális, kardiális, diafragmás lebenyek), szívből, veséből, lépből, májból, gyomorból, patkóbélből, éhbélből, végbélből, leszálló- és felszállógyomorból, vérből és bélfodor-nyirokmirigyekből nyerhető. Ezeket a szöveteket feldolgozhatjuk, majd fénymikroszkóppal megvizsgálhatjuk, hogy meghatározzuk, vajon a limfomononukleáris agyhártyagyulladás, a szövetközi tüdőgyulladás, limfoplazmatikus nátha, limfomononukleáris miokarditisz vagy májkapuhepatitis jelen van-e. A léziókat következetesen megfigyelhetjük spontán fertőzött sertésekben, amelyek SIRS oltóanyagot kapott kondából származnak [Collins et al., Minnesota Swine Conference fór Veterinarians, Abstract, 254-55 (1990)]. Széklettartalom is gyűjthető és vizsgálható, hogy van-e benne vírus, amint azt korábban Ritchie és munkatársai leírták [Ritchie et al., Arch. Gesante. Virus-forsche, 23, 292-98 (1968)]. Vért vehetünk immunológiai vizsgálatokhoz, valamint szöveteket hogy baktériumot tenyésszünk belőlük, amint azt a 3. példában újuk le.

B. Fertőző kórokozó izolálása

Egy SIRS-szel fertőzött kondából származó fertőzött malac tüdőszövetét és kombinált agy-lép-máj-vese szövetét külön homogenizáljuk. A szövet tízszázalékos homogenizátumát használjuk. Az egyes homogenizátumokat minimális szükséges táptalajjal (MÉM) keverjük össze, amely 1000 pg/ml gentamicint tartalmaz. Mindkét mintát centrifugáljuk, körülbelül 4000 g-vel körülbelül 25 percig. Ezután eltávolítjuk a felülúszót, és egy 0,45 pm-es szűrőn szüljük át. A szövet- és tüdőhomogenizátumokat azután kombináljuk, és az egyesített anyagot használjuk különböző szövettenyészet-sejtvonalak fertőzésére.

1. In vitro-vizsgálat

Két vizsgálatot végzünk 75 cm²-es műanyag lombikokban. Az 1. vizsgálatban a kombinált anyagot két palack teljes sejtlemezre oltjuk be az alábbi listán megadott összes sejtvonalra. Emellett az egyes sejtvonalak egyik lombikjához körülbelül 2,5 mg tripszint adunk. Minden egyéb körülmény azonos a sejtvonalak lombikjaiban. Szénun nincs a tenyésztőtáptalajban. Az oltóanyag mennyisége 1 ml. Mindegyik lombikot hét napig tartjuk körülbelül 34 °C-on. Az eredményeket feljegyezzük a hetedik napon. Fagyasztás és felolvasztás után mintát veszünk, amellyel egy második átoltást végzünk ugyanarra a sejtvonalra. A megmaradt anyagot lefagyasztjuk és -60 °C-on tároljuk.

A 2. vizsgálatban az egyesített anyagot ugyanazoknak a sejteknek az egyik lombikjára oltjuk, amelyeket az 1. vizsgálatban használtunk. A sejtek azonban csak 20-40%-ban nőtték be a lombikot a beoltás pillanatában. A közeg körülbelül 10 százalék boíjúmagzatszérumot tartalmazott. Az oltóanyag mennyisége ismét 1 ml, majd a tenyészeteket körülbelül 34 °C-on inkubáljuk körülbelül hét napig. Mindkét vizsgálat eredményeit az alábbiakban foglaljuk össze:

Használt sejtvonalak 1. vizsgálat 2. vizsgálat Szarvasmarhaorrkagylócsont (BT) - Macskavese (CRFK) - Majom- (Verő) vese - Majom- (Verő) tüdő - Kutyavese (MDCK) - Sertés (PK2a) vese - Vidramenyéttüdő - Vadászgörénytüdő - Szarvasmarhatüdő - Bölénytüdő Szarvasmarhavese (MDBK) - Sertésherék (ST) - Majomvese (MA-104) - Emberi bélrák (HRT-18) - NV

Emberi tüdő NV + =CPE hatás -= nincs CPE hatás NV=nem vizsgált

Az 1. tesztben egyik vizsgált sejtvonal esetében sem volt megfigyelhető citopatikus hatás. A 2. tesztben azonban az MA-104 sejtek kis csomói elkezdtek duzzadni, és „gyenge lukakat” képeztek az egysejt-rétegben a palack sarkai körül. A folyadékot kinyetjük a palackból, egy új, MA-104 sejteket [Boehringer Ingelheim Animál Health, BIAH; illetve Microbiological Associates (Rockville, Maryland, USA)] tartalmazó palackba juttatjuk be (a sejtréteg ismét 20-40%-os), majd ezt követően harmadszor is átoltjuk. A citopatikus hatás (CPE) minden egyes átoltás után erősebb. A fentiekben ismertetett eljárásokat az MA-104 sejtvonalra megismételjük, teljesen egybefüggő egysejt-réteget alkalmazva. CPE is megfigyelhető. A további vizsgálatokkal ki lehet mutatni, hogy a virális kórokozó 37 °C-on is nő. A szérum jelenléte segítheti a virális kórokozó kezdeti izolálását. A virális kórokozó további átoltásai az MA-104 sejtvonalban előidézik a CPE-t, a szérum jelenléte nélkül. Azonban sokkal kifejezettebb CPE figyelhető meg a szérum alkalmazásárával az MA-104 sejtvonal szaporító táptalajában.

A virális kórokozót nyolcszor oltottuk át az MA-104 sejtvonalban, és jó CPE fejlődött ki három nappal az ötödik vagy nagyobb számú átoltás után. A kapott titer

HU217 105 Β körülbelül 105,5. A virális kórokozó szintén szaporodik a további majomsejtvonalakban.

2. In vivo-vizsgálatok

Egy harmadik átoltásból származó kórokozókat használunk két háromnapos gnotobiotikus malac beoltására. Mind a két malacot intranazálisan oltjuk be, az egyiket 1 ml-rel, a másikat 2 ml-rel. A malacokat hét napig figyeljük meg, majd elpusztítjuk.

Szövetmintákat gyűjtünk a hisztopatológiai vizsgálatokhoz, valamint a virális kórokozók kinyeréséhez. A hisztopatológiai jelentés megerősíti, hogy a fertőzött malacokban a tüdőléziók azonosak azokkal a tüdőléziókkal, amelyeket azokban a malacokban lehet megfigyelni, amelyek SIRS-ben szenvednek. A szövetmintákat az előzőkben leírt módon dolgozzuk fel, majd 20-40 százalékos, majd 100 százalékos MA-104 egysejtrétegen szaporítjuk, boíjúmagzatszérum jelenlétében. A virális kórokozót ismét kinyerjük.

Egy harmadik átoltásból származó kórokozót is felhasználunk kocák beoltására, hogy igazoljuk azt, hogy a betegség szaporodásra gyakorolt hatása megismételhető és megerősíthető. A többet ellő kocákat intranazálisan oltjuk be a vemhesség 93. napján. A kocák által ellett malacok 50%-a koraszülött volt (8/13 és 6/16 halva született/élő) a vemhesség 112. és 114. napján. A halva született malacok közül hét részleges múmia volt, az élve született malacok pedig gyengék voltak és nem voltak képesek energikusan szopni. A virális kórokozó kinyerhető volt a halva született malacok szöveteiből.

A virális kórokozót három olyan kondából lehetett kinyerni, amelyekről ismert volt, hogy SIRS-ük van. Az ATCC VR-2332 kórokozó elleni antitesttitereket azonosítottak ugyanezekben a kondákban.

Jóllehet van valamennyi különbség a klinikai tünetekben, azaz a fülek, a farok és a tőgy bőrcianózisában az európai sertéseknél, az elfogadott vélemény az, hogy az észak-amerikai és az európai betegségeket ugyanaz a vírus okozza, egy kényes, nem hemagglutináló burokkal rendelkező RNS-vírus, amint arra példa az ATCC VR-2332 letétbe helyezett kórokozó.

JA. példa

A fertőző kórokozó további jellemzése

A. Anyagok és módszerek

I. Sejtek

Crandell macskavese (CRFK), majomvese (MA-104) sejtjeit szaporítjuk 37 °C-on a megfelelő sejttenyésztő lombikban. A CRFK és MA-104 sejteket Eagle-féle minimumesszenciálís táptalajban (MÉM) szaporítjuk (kapható a Gibco Laboratoriestól, Grand Island, NY), amely ki van egészítve 10 százalék gamma-sugárzással besugárzott boíjúmagzatszérummal (FBS) (kapható a JRH Biosciences-nél, Lenexa, KS), 1 százalék penícillin-sztreptomicinnel és 2,5 pg/ml amfotericin B-vel. Az MA-104 sejteket ugyanebben a táptalajban szaporítjuk, amely 10% FBS-sel és 50 pg/ml gentamicinnel van kiegészítve. Az FBS-ről és a sejtekről megerősítjük, hogy nem tartalmaznak szarvasmarhahasmenés-vírust (BVDV), az előzőkben leírt módszereket alkalmazva [Mayer et al., Vet. Microbiol., 16, 303-314 (1988); Smithies et al., Proc. Annu. Meet. U. S. Animál Health Assoc., 73, 539-550 (1969); és Vickers et al., J. Vet. Diagn. Invest., 2,300-302 (1990)].

2. A VR-322 izolátum forrása (SIRS-vírus)

A SIRS-vírusnak ezen példa céljából való izolálását és forrását mutatjuk be az alábbiakban. Az ebben a vizsgálatban használt vírusok az MA-104 sejtekben végzett 5-7. átoltás után vannak, a titer 105-106 TCID50/ml.

Gnotobiotikus sertések

A zárt méhmegnyitással kapott gnotobiotikus malacokat rozsdamentes acélkádakban tartjuk, amelyeket flexibilis filmizolátorok borítanak, Miniatas és munkatársai leírása szerint [Miniatas O.P. et al., Can. J. Comp. Med., 42, 428-437 (1978)]. Az izolátorokat szobahőmérsékleten tartjuk 30 °C körül, és a malacokat javasolt mennyiségű, kereskedelmi forgalomban levő tejpótlóval tápláljuk, naponta háromszor. Ürülékkeneteket gyűjtünk a kísérleti beoltás előtt és a nekropsziánál, majd ezeket birkavéres agarba, tergitol-hét agarba és brillantzöld agarba oltjuk, aerob és anaerob atmoszférában. A nekropsziánál gyűjtött székletben is megvizsgáljuk a vírus jelenlétét negatív elektronmikroszkópiával, Richie és munkatársai leírása szerint [Richie et al., Arch. Gesanta. Virus-forsche, i. m.].

Az oltóanyag forrása

Egy 160 kocából álló, a fialást éppen befejezett kondánál West Central Minnesotában a SIRS kitörését lehetett megfigyelni, tipikus SIRS tünetekkel. Egy élő kocát, élő újszülött malacokat és halva született magzatokat vetettünk alá a Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory eljárásainak, hogy elvégezzék például a nagy nekropsziát, a hisztopatológiát, és elvégezzék a rutin mikrobiológiai vizsgálatokat. Egy oltóanyagot úgy állítunk elő kísérleti célokra, hogy klinikai, illetve újszülött sertések szöveteit használjuk. Még pontosabban, két élő és két halott, 7-10 napos malacot, amelyeket az érintett konda epizootikus formája során kapunk, felboncoljuk, és a mintákat a diagnosztikai vizsgálatok céljára összegyűjtjük. Az élő malacokat eutanáziaoldat intravénás injekcióban való beadásával elpusztítjuk a boncolás előtt. Az egyes sertésekből izolált agy, tüdő és mandula 10%-os homogenizátumát (MN89-35477) egyesítjük kiegyensúlyozott Hank-féle oldattal (HBSS), amely 100 NE penicillint, 100 pg/ml sztreptomicint és 5 pg/ml amfotericin B-t tartalmaz.

Kísérleti átvitel gnotobiotikus sertésből álló sorozatot fertőzünk háromnapos korban egyesített szövethomogenizátummal. Mindegyik malacot intranazálisan fertőzzük meg, egy gumiballon felhasználásával, amelyet egy üvegporlasztóhoz kapcsoltunk, a sertés orrlyukai előtt. Először két gnotobiotikus malacot oltunk be 0,5 ml szüretien oltóanyaggal (MN89-35477), figyeljük a betegség klinikai tüneteit, majd a fertőzés utáni (PE) hetedik napon elektrosokkal elpusztítjuk őket.

Az előzőkben említett gnotobiotikus malacokból származó egyesített tüdőszöveteknek egy 10 százalékos homogenizátumát (MNSD-1) ellenőrzés nélkül átoltjuk három gnotobiotikus malacba, oly módon, hogy az

HU 217 105 Β egyik malac 0,5 ml szüretien homogenizátumot kap, a másik malac 0,5 ml, 0,45 pm-es szűrővel megszűrt homogenizátumot, a harmadik pedig 0,5 ml, 0,22 μιη-es szűrővel megszűrt homogenizátumot. A malacokat nyolc nappal a beoltás után elpusztítjuk, majd a hisztológiai vizsgálatokhoz szövetmintákat veszünk, továbboltjuk gnotobiotikus malacokba, és a vírust izoláljuk belőlük.

Az MNSD-10,45 μιη-es szűrletével oltott malac tüdejéből (MSND90 χ 76-L) és az agyának, májának valamint veséjének keverékéből (MNSD90 x 76-P) 25 százalékos szuszpenziót készítünk foszfáttal puffereit sóoldatban, amely 0,5 mg/ml kanamicint, sztreptomicint és vankomicint tartalmaz. Hat gnotobiotikus malacot oltunk be az MNSD90x76-L tüdőhomogenizátummal; négy malac kap 0,45 pm-es szűrletet, kettő pedig 0,1 pm-es szűrletet. Három fertőzetlen, kontroll gnotobiotikus malacot is beoltunk, az egyiket egy fertőzetlen malacból származó HBSS-szövethomogenizátum 0,45 pm-es szűrletével, a másik kettőt pedig csak HBSS-sel.

A vírus izolálása

A szövethomogenizátumokat (MNSD90x76-L és MNSD90x76-P) 1500 g-vel centrifugáljuk 20 percig 4 °C-on. A felülúszót 1:1 arányban hígítjuk minimális esszenciális táptalajjal (MÉM), amely 10 pg/ml gentamicint tartalmaz, majd Vortexszel alaposan összekeverjük, és újra centrifugáljuk 4500 g-vel 4 °C-on 30 percig. A felülúszót összegyűjtjük, majd egy 0,45 pm-es szűrőn szüljük át. A tüdőből és a kevert szövetekből származó homogenizátumokat egyesítjük, majd egybefüggő MA-104 sejtvonalra oltjuk rá. A vírus izolálását 75 cm²-es lombikokban végezzük, amelyekben az MA-104 sejtek 20-40 százalékban összefüggő egysejt-rétege található, a lombikok 50 ml, 10 százalék botjúszérummal (FBS) kiegészített MEMet (pH=7,5) tartalmaznak. A sejttenyészeteket hét napig 34 °C-on tartjuk. Ha citopatikus hatás (CPE) nem figyelhető meg hét napon belül, akkor a tenyészeteket lefagyasztjuk, megolvasztjuk, és MA—104 sejtekre oltjuk, majd az előzőkben leírt módon inkubáljuk.

A vírus titrálása

A vírus titrálását 96 lyukas, lapos fenekű mikrotiterlemezeken végezzük. A vírusból 10-szeres sorozathígításokat készítünk, 2% FBS-sel kiegészített MEM-ben. Három nap elteltével a sejtszaporító táptalajt leszívjuk a mikrotiterlemezekről, a vírushígításból 200-200 pl-t öt lyukba teszünk, majd a lemezeket 37 °C-on inkubáljuk 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában. Három nap múlva azokban a lyukakban, amelyekben nincs CPE, a táptalajt lecseréljük 2% FBS-sel kiegészített MEM-mel (pH=7,5), majd a végső leolvasást az inkubálás ötödik napján végezzük. A titereket Reed és munkatársai számításai alapján határozzuk meg [Reed et al., Am. J. Hyg., 27,493-497(1938)].

3. Más vírusok

Attenuált poliovírust, amelyet Dr. Roger Komenttől kaptunk (Department of Microbiology, University of South Dakota School of Medicine, Vermillion, SD), MA-104 sejteken szaporítunk 108 TCID50/ml titerig, majd a pszeudorabieszvírus Shope törzsét, amelyet a National Veterinary Services Laboratorytól kaptunk (Ames, IA), CRFK-sejteken szaporítjuk 105-7 TCID50/ml koncentrációig. Ezeket a vírusokat használjuk RNS- és DNS-vírus kontrollként, hogy meghatározzuk a SIRS-vírus VR-2322 izolátumának nukleinsavtípusát.

4. Antiszérumkészítés a VR-2322 izolátum ellen

A SIRS-vírus VR-2322 izolátumának ötödik átoltását (titer 106 TCID50/ml) 0,25 százalékos formaiinnal inaktiváljuk, majd 1:1 arányban Freund-féle inkomplett adjuvánssal keveijük össze, és egy nyulat szubkután injekciózunk 2 ml ilyen szuszpenzióval, kéthetes intervallumokban, összesen hat hétig. Az utolsó injekció után két héttel készített antiszérum neutralizálótitere 1:512.

5. Vírusneutralizációs teszt (VNT)

MA-104 sejteket oltunk lapos fenekű, 96 lyukas mikrotiterlemezekbe a VNT meghatározására. Az egyes szérumokból (100 pl) kétszeres sorozathígításokat készítünk MÉM hígítószerben, majd azonos térfogatú (100 pl) VR-2322 izolátumot adunk hozzá, amely 100-300 TCID50-et tartalmaz 100 pl-ben. Mindegyik keveréket egy óra hosszat inkubáljuk 37 °C-on, majd az egyes szérum-vírus keveréket három lyukba osztjuk szét. A mikrotiterlemezeket további három napig inkubáljuk 37 °C-on, fénymikroszkóppal vizsgáljuk a citopatikus hatásokat (CPE), majd a végponttitert a legmagasabb, CPE-t neutralizáló hatású szérumhígítás reciprokával fejezzük ki.

Az alábbi poliklonális antiszérumokat, hacsak külön nem jelezzük, akkor a VR-2322 izolátumra leírt módon készítjük (azzal a különbséggel, hogy a vírusok nincsenek inaktiválva), és használjuk a VNT-ben: az átvihető gasztroenteritisz Miller törzse; a sertésrotavírus 4-es szerotípusa (Gottfríed); sertésrotavírus 5-ös szerotípus (OSU); sertésreovírus 1-es szerotípus; sertés-enterovírusok 1-8 szerotípusai, amelyek a National Veterinary Services Laboratorytól szerezhetők be (Ames, IA); a sertésparvovírus elleni monoklonális antitest, amelyet az American Type Culture Collectiontől lehet beszerezni, Rockville, MD; enkefalomielokarditisz-vírus, amelyet Dr. W. Christiansontól lehet beszerezni, Department of Clinical and Population Sciences, University of Minnesota, St. Paul, MN; pszeudorabieszvírus, amelyet a National Veterinary Services Laboratory-tól lehet beszerezni, Ames, IA; keleti, nyugati és venezuelai lóagyvelőgyulladás-vírusok; a BVDV elleni D89 monoklonális antitest [Mayeret al., Vet. Microbiol., 16,303-314 (1988), lóarteritisz-vírus, amelyet a National Veterinary Services Laboratorytól lehet beszerezni, Ames, IA; rubellá; és tejsav-dehidrogenáz-vírus, amelyet Dr. W. Cefrunytól lehet beszerezni, Department of Microbiology, University of South Dakota, School of Medicine, Vermillion, SD.

6. Közvetlen elektronmikroszkópia (DEM)

A cézium-kloridos gradiens frakcióit vizsgáljuk DEM-mel, hogy van-e bennük vírusrészecske, amint azt Benfield és munkatársai már leírták [J. Clin Microbiol., 16, 186—190 (1982); Horzinek, „Non-Athropod-bome Togaviruses”, (Acad. Press, London, 1981); valamint Richie és munkatársai Arch. Gesante. Virus-forsce,

HU 217 105 Β

i. m.] és elektronmikroszkóppal (Hitachi HU12A, Hitachi, Tokió, Japán) 75 kV mellett végezzük a vizsgálatot.

7. Immun-elektronmikroszkópia (IEM)

Az immungoid jelzést kecske anti-nyúl-IgG kolloidális aranyrészecskékkel (5 nm) végezzük. Röviden, a vírust töményítjük oly módon, hogy 30 percig 4 °C-on 40000 g-vel centrifugáljuk, az üledéket 50 μΐ desztillált vízben szuszpendáljuk, majd ebből 25 μΐ-t egy darab parafilmre teszünk. Egy kollódiumszénnel borított rácsot úsztatunk a víruscseppre 15 percre, száraz szűrőpapírral blottoljuk, majd egy 25 μΐ-es nyúl anti-SIRS szérumcseppre helyezzük két percre. A rácsokat mossuk, kétszer cserélve a 0,1 százalékos szarvasmarhaszérumalbumin (BSA)-TRIS puffért, mindegyikben ötöt percig hagyjuk állni, majd 15 percig egy csepp arannyal jelzett anti-nyúl-IgG-n hagyjuk úszni. Hatszor mossuk BSA-TRIS pufferben (mindegyik két percig tart), majd kétszer mossuk desztillált vízben, majd a rácsokat negatívan festjük, és vizsgáljuk a DEM-re leírt módon.

8. Hemagglutinációs teszt (HA T)

Meghatározzuk, hogy a VR-2322 izolátum képes-e hemagglutinálni birka-, kecske-, sertés-, szarvasmarha-, egér-, patkány-, nyúl-, tengerimalac-, humán 0-ás, kacsa- és csirkeeritrocitákat, standard módszerek alkalmazásával. A SIRS-vírus VR-2322-es izolátumának 5-7. átoltása kétszeres hígításait foszfáttal puffereit sóoldatban készítjük el (pH=7,2-7,4) U fenekű mikrotiterlemezeken. Azonos térfogatú, 1 százalékos mosott eritrocitát adunk mindegyik, előzőkben említett fajból az egyes vírushígításhoz, és 4 °C-on, 22 °C-on vagy 37 °C-on inkubáljuk; egy vagy két óra múlva leolvassuk, amikor az eritrocitakontrollok (amelyek nem tartalmaznak vírust) leülepedtek a lyuk fenekére.

9. Immunfluoreszcencia (ImF)

A VR-2322 izolátummal fertőzött, illetve fertőzetlen MA-104 sejtek indirekt vagy direkt ImF-festését poliklonális vagy monoklonális antitestekkel végezzük, amelyeket a VNT-ben megvizsgáltunk. A sertésinfluenza, amelyet a National Veterinaiy Services Laboratory-tól lehet beszerezni (Ames, IA) (A típus, HINI), és a sertéskolera-vírus poliklonális antiszérumokat, amelyeket a National Veterinary Services Laboratorytól lehet beszerezni (Ames, IA), szintén felhasználjuk. Az egysejt-rétegből készített vakarékokat 72 órával Pl eltávolítjuk egy steril oltókaccsal, az ImF-festést az előzőkben leírt módon végezzük [Benfield et al., J. Clin Microbiol., 16, 186-190(1982)].A pozitív kontroli-lemezeket vagy egy lábadozó kocából származó antiszérummal (VNT titer 1:256), vagy egy, a SIRS-vírus VR-2322 izolátuma elleni monoklonális antitesttel (SDOW 12 vagy SDOW 17, az előzőkben leírva) festjük.

10. Szűrési vizsgálatok a VR-2322 izolátum méretének meghatározására

A tisztított-fertőzött sejttenyészet-felülúszókat egy 0,45 μιη-es szűrőn szüljük át (Schleicher and Schuell, Keene, NH), illetve egy 0,2 μιη-es szűrőn (Schleicher and Schuell, Keene, NH), egy 0,10 pm-es szűrőn (Millipore Products Div., Bedford, MA) és egy 0,05 μιη-es szűrőn (Millipore Products Div., Bedford, MA). A szűrés előtti és utáni fertőzési titert mikrotitervizsgáló módszerrel határozzuk meg, Cottral korábban leírt eljárásával [Manual of Standardized Methods fór Veterinary Microbiology, 81-82 (Comell Univ. Press, Ithaca, NY, 1978)]. A fertőzési titer századrészére való csökkenését tekintjük szignifikánsnak.

11. A VR-2332 izolátum gradiens tisztítása

A SIRS-vírus tisztított tenyészetéből származó VR-2332-es izolátumát centrifügálással töményítjük (Beckman SW 41 Ti rotor) 200000 g-vel 4 °C-on 16 óra hosszat, egy szakaszos szacharózgradiensen, amely 2-2 ml 20, 30, 40, 50 és 65 százalékos szacharózból áll (tömeg/térfogat) TNC pufferben (10 mmol/1 TRIS, 100 mmol/1 NaCl és 2 mmol/1 CaCl₂, pH=7,8). A tenyészet-felülúszókat is extraháljuk 1,1,2-triklór-trifluoretánnal (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), majd ultracentrifügálással tisztítjuk (lOOOOOxg, 4 °C, egy óra), majd cézium-klorid-gradiensen tisztítjuk (1,2 g/ml), amint azt a szacharózgradiens esetében leírtuk. Bármelyik gradiensből származó frakciókat a gradiens tetejéről szedünk, a refrakciós indexet refraktométerrel határozzuk meg, majd a kiválasztott frakciókat Hang-féle kiegyensúlyozott sóoldatban hígítjuk, az előzőkben leírt vírustitráláshoz.

12. Kloroform- és fluorokarbon-inaktiválás

Azonos térfogatú SIRS-vírust (VR-2332) és kloroformot keverünk össze alkalmanként 30 percig szobahőmérsékleten, majd 500 g-vel centrifugáljuk 4 °C-on 15 percig. Hasonlóképpen azonos térfogatú 1,1,2-triklórtrifluor-etánt és SIRS-vírust keverünk össze Vortex berendezésben öt percig, majd a kloroformmal kezelt vírusra leírt módon centrifügáljuk. A centrifügálás után az egyes mintákból származó vizes fázist kinyeijük, hígítjuk, majd mikrotitervizsgálattal meghatározzuk a megmaradt vírus-fertőzőképességet. Azt tekintjük szignifikáns csökkenésnek, ha a kezelt oldat fertőzőképessége századrésze a kezeletlen oldat fertőzőképességének.

73. A DNS-vírusok inhibitorainak hatása a VR-2332 izolátumra

Az 5-bróm-2-dezoxi-uridin (BUDR) és a mitomicin C ismert inhibitorai a DNS-vírusok replikációjának, de nem gátolják az RNS-vírusokat, a Retroviridae kivételével [Eastembrook, Virology, 19, 509-520 (1962); Reich et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 47, 1212-1217 (1961)]. Ebben a kísérletben pszeudorabiesz és poliovírusokat használtunk ismert DNS- és RNS-vírus kontrollként. A sejteket (CRFK vagy MA-104) 96 lyukú mikrotiterlemezekre oltjuk le, majd párhuzamos lyukakat 100 μΐ, tízszeresre hígított pszeudorabieszvírussal, poliovírussal vagy SIRS-szel oltjuk be. Egy egyórás abszorpciós periódus után (37 °C), az abszorbeálatlan vírust tartalmazó táptalajt eltávolítjuk, és vagy MEM-mel (kezeletlen víruskontroli); vagy 40, illetve 150 μg/ml BUDR-rel kiegészített MEM-mel; illetve 2, 10 vagy 20 μg/ml mitomicin C-vel kiegészített MEM-mel helyettesítjük. A mikrotiterlemezeket 37 °C-on inkubáljuk további négy napig, a CPE-t fénymikroszkóppal vizsgáljuk, majd a vírustitert az előzőkben leírt módon számítjuk [Cottral,

HU 217 105 Β

Manual of Standardized Methods fór Veterinary Microbiology, 81-82 (Comell Univ. Press, Ithaca, NY, 1978)]. A vírus fertőzőképességében megfigyelt 1000szeres csökkenést fogadjuk el szignifikánsnak.

14. A SIRS-vírus hőstabilitása

A vírus MEM-ben készült 2 ml-es alikvot részét inkubáljuk 4 °C-on vagy vízfürdőben 37 °C-on, illetve 56 °C-on legalább öt napig. Az egyes, különböző hőmérsékleten tárolt csövekből származó alikvot részeket 15, 30, 60 és 120 perc elteltével gyűjtjük össze, majd 12 és 120 óra között 12 órás intervallumonként. A vírusmintákat MEM-ben tízszeresre hígítjuk, és a vírustitert az előzőkben leírt módon számítjuk.

B. Eredmények

1. A VR-2332 izolátum citopátiás hatása a MA-104 sejtekre

A CPE kis, kerek sejtcsomóként indult, amelyről úgy tűnt, hogy a fertőzetlen sejtek egysejt-rétegének megmaradó része felé emelkedik (1B. ábra). A kerek sejtek száma megnövekszik, és számos sejt piknotikussá válik, és elválik az egysejt-rétegtől két-négy nappal PL Öt-hat nap elteltével a CPE nyilvánvaló az egysejt-réteg 100 százalékában. A fertőzőképességi titerek 105 és 107 TCID50/ml között változnak a vírus ötödikhetedik átoltása után. A beoltatlan MA-104 sejtekben nem figyelhető meg CPE (1A. ábra).

Fluoreszcencia nem volt megfigyelhető a beoltatlan MA-104 sejteknél (2A. ábra). A 2B. ábra azt mutatja, hogy intenzív, diffúz fluoreszcencia volt megfigyelhető a beoltott MA-104 sejteknél, amelyeket akár lábadozó kocák szérumával, akár nyúlantiszérummal, akár monoklonális antitesttel festettünk (a monoklonális antitesteket a SIRS VR-2332 izolátuma ellen készítettük).

2. A lipid oldószerek hatása a SIRS-vírus fertőzőképességére (VR-2332 izolátum)

A vírust kloroformmal előkezelve a vírus elveszíti a fertőzőképességét (a titer 105-ről <101 TCID50/ml-re csökken, míg a fluorokarbonnal való kezelésnek nincs jelentős hatása.

3. Hemagglutináció

A vírus nem hemagglutinálja a 11 különböző fajból származó eritrocitákat, az inkubálás hőmérsékletétől teljesen függetlenül.

4. A SIRS-vírus méretének becslése szűréssel

A vírustiterek nem változtak a 0,45, 0,20 és 0,10 pm-es szűrőkön való szűrés után. A fertőzőképességi titerek azonban ezredrészükre csökkentek (105-ről 102 TCID50/ml-re), miután a 0,05 pm-es (50 nm) szűrőn szűrtük át.

5. A DNS-inhibitorok hatása a SIRS-vírus replikációjára

Csak a DNS-vírus fertőzőképessége csökkent azután, hogy BUDR-rel vagy mitomicin C-vel kezeltük. A poliovírus (RNS-kontroll) és a VR-2332 izolátum replikációja nem változott, jelezve, hogy a SIRS-vírus genomja feltehetőleg RNS (1. és 2. táblázat).

6. Vírustisztítás

Víruscsíkok nem mutathatók ki szacharózgradiensen, és a csúcsvírustitereket (104 TCID/ml) 1,18 -1,23 g/ml-es sűrűségű frakciókból lehet kinyerni. Ez a legmagasabb vírustiter 1000-szer alacsonyabb, mint a vírusszuszpenzió-tisztítás előtti fertőzési titer (107 TCID50/ml). A cézium-klorid-gradienseken egyetlen halvány, opalizáló sáv figyelhető meg 1,28-1,19 egyensúlyi sűrűség mellett. A vírusfertőzési érték csúcsa 1,3x106 TCID50/ml, ami 130-szor magasabb, mint a szacharózgradiensből származó csúcs-fertőzőképesség, és ez megfelelt a látható csíknak.

7. A tisztított SIRS-vírusrészecske DEM-vizsgálata

Pleiomorf, de túlnyomó részben szférikus virionokat lehetett megfigyelni DEM-mel a CsCl-frakciókban (1,18-1,19 g/ml). A virionok mérete 48-80 nm (25 részecske átlaga=62 nm), és komplett, az elektronok számára áteresztő, vagy üres (elektronsűrű középpont) részecskék figyelhetők meg, amelyeket egy vékony membrán vagy burok vesz körül (4A. ábra). (Egy 40-45 nm átmérőjű ikozahedrális nukleokapszid volt megfigyelhető, rövid felszíni nyúlványokkal, amelyeknek mérete körülbelül 5 nm). Ezek a részecskék középponti részeket tartalmaztak, amelyeknek az átmérője 25-35 nm volt (4B. ábra). A virionokat immungoiddal jelezzük, ha a nyúl hiperimmun antiszérumot és arannyal jelzett anti-nyúl-IgG-t használjuk primer és szekunder antitestként (4B. ábra). A varionokat nem lehetett arannyal jelezni, ha a VR-2332 nyúl hiperimmun antiszérum nem volt jelen.

8. A SIRS-vírusantigén kapcsolatai más vírusok antiszérumaival

Az ismert sertésvírusok és különböző togavírusok elleni antiszérumok nem semlegesítették vagy reagáltak a SIRS-vírus antigénjével a fertőzött MA-104 sejtekben. A lábadozó koca és a hiperimmun nyúlantiszérumneutralizáló antitest titerei 1:256, illetve 1:512 volt.

9. A hőmérséklet hatása a SIRS-vírus fertőzöképességére

Az MA-104 sejtek vírusfertőződését 50 százalékkal lehetett csökkenteni, miután 12 óra hosszat 37 °C-on inkubáltuk, és teljesen inaktiválódott, miután 37 °C-on inkubáltuk 48 óra hosszat, illetve 45 percig 56 °C-on (5. ábra). A fertőzőképesség nem változott, ha egy hónapig 4 °C-on tároltuk, és akkor sem, ha négy hónapig -70 °C-on tároltuk (nem közölt adatok). A SIRS-vírussal fertőzött gnotobiotikus sertésekből származó és Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldatban homogenizált tüdőszövet legalább 18 hónapig megtartja a fertőzőképességét a sertésekre vonatkoztatva.

Az eredmények azt mutatják, hogy a VR-2332 izolátum egy kényes, nem hemagglutináló burokkal rendelkező RNS vírus, amelyet előzetesen nem ízeltlábúak által hordozott togavírusként lehet osztályozni, amely egy ismeretlen nemzetséghez tartozik.

A SIRS-vírusban egy RNS-genom jelenlétét azon az alapon erősítettük meg, hogy ez a vírus képes folytatni a replikációt 5-bróm-2-dezoxi-uridin és mitomicin C jelenlétében, amelyekről ismert, hogy gátolják a DNS replikációját, valamint az RNS-vírusok egyik családjának a replikációját (Retroviridae) [Eastembrook, Virology, 19, 509-520 (1962); Reich et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 47, 1212-1217 (1961)], de más RNS-vírusok replikációját nem gátol10

HU 217 105 Β jak. Az, hogy mi a SIRS-vírust előzetesen az RNS-vírusok közé soroltuk, megegyezik azzal a megfigyeléssel, hogy ez a vírus replíkálódik a sejt citoplazmájában, amit jelez a vírusantigének jelenléte ImF alapján.

A SIRS-vírus VR-2332 izolátuma hőmérséklet-érzékeny, de viszonylag hosszú ideig viszonylag stabil 4 °C-on és -70 °Con. Ennek a vírusnak a 37 °C-on megfigyelt termolabilitása gyakorlati jelentőséggel bír a vírus szaporítása szempontjából, azt sugallva, hogy a 37 °C-nál alacsonyabb hőmérsékleten végzett szaporítás magasabb víruskitermelést eredményez. A hűtés elegendő a diagnosztikai minták vírusizolálás céljából való tárolásához egy rövid időre, különben pedig a mintát több hónapra, vagy még hosszabb időre le lehet fagyasztani.

2. példa

Az 1. példa kísérletei alapján a SIRS fertőző kórokozó oltóanyagának legtisztább formáját használhatjuk a SIRS kórokozó átvitelére vemhes kocákba, hogy reprodukáljuk a betegségtünetek reproduktív formáját.

Újabban átmeneti anorexiát és idő előtti fialást (mindkettő jellegzetes klinikai tünete a SIRS-nek) lehetett indukálni 2/2 kocában, amelyeket ugyanazzal a SIRS-oltóanyaggal oltottunk be, amely légzőszervi léziókat okoz a gnotobiotikus malacokban. Emellett a sertések közül 15/29 (52 százalék) halva született, és a megmaradt 14 malac gyenge volt, nem táplálkozott rendesen. Nagyméretű vagy mikroszkopikus léziók nem voltak megfigyelhetők a halva született malacokban vagy a placentában, és a mikrobiális kórokozó kimutatására irányuló izolálást eljárások még folyamatban vannak. Ennélfogva, az alábbiakban leírt kísérlet azt vizsgálja, hogy a SIRS reproduktív formája átvihető-e a kocákra intranazális beoltással, és vajon a magzati életképesség megzavarása az anyai szövetekben való replikáció eredménye, vagy pedig a magzatokban való replikáció eredménye.

Az 1. példában végzett kísérletek információt adnak arról, hogy az oltóanyagot hogyan kell kezelni (szűrőméret, szerves oldószeres extrakció és/vagy proteázemésztés) ahhoz, hogy a SIRS-kórokozó legtisztább formáját kapjuk egy oltóanyag számára. Mivel a SIRSkórokozónak mind légzési formája létezik fiatal malacokban, mind reproduktív formája létezik felnőtt sertésekben, ezért szükségszerű, hogy a tünet utóbbi formáját reprodukáljuk, annak igazolására, hogy a fertőző kórokozó a SIRS feltételezett okozója.

Egy 93 napos vemhességgel rendelkező kocát használunk kísérleti állatként, mivel lehetséges, hogy kísérletileg indukáljunk abortuszt ezekben az állatokban, amelyeket a SIRS fertőző kórokozójával oltottunk be. A kocákat vásárolhatjuk egy olyan kereskedelmi kondából, amely mentes a SIRS problémájától. Ennek a kondának a teljes járványtani feljegyzéseit számítógépesíteni lehet, és a vemhességi időkre, alomméretekre, valamint a halvaszületésekre vonatkozó információt hozzáférhetővé lehet tenni összehasonlító vizsgálatok céljából. Három kocából álló csoportokat lehet intranazálisan beoltani a vemhesség 93. napján, akár a 0,20 μιη-es szűrlettel (pozitív kontrollok), akár egy patogén, de módosított oltóanyaggal, amit az 1. példa eredményei diktálnak, a kontroll oltóanyag 0,20 μιη-es szűrletével (negatív kontroll), valamint egy olyan kontroll oltóanyaggal, amelyet az 1. példa kísérleteinek eredményei alapján módosítottunk. Mindegyik kocacsoport külön, izolált szobákban tartható, és naponta vizsgálható, ameddig a vemhesség véget nem ér. A hőmérsékletetet és a klinikai tüneteket (anorexia, légzési problémák, azaz köhögés, prüszkölés és fokozott légzés) naponta feljegyezhetjük. A kocákból való mintavételt korlátozhatjuk a fialás előtti és utáni vérminta vételére szerológiai célokból. A fialás aktuális dátumát fel lehet jegyezni, és a halva született, mumifikálódott magzatok, az élő „gyenge” sertések és az élő „normális” sertések számát feljegyezzük. A magzatokat megvizsgálhatjuk, hogy van-e rajtuk nagy vagy mikroszkópos lézió, az 1. példában leírtak alapján, majd a magzati szöveteket a mikrobiológiai vizsgálatok céljára a 3. példában leírtak alapján dolgozhatjuk fel. A magzati szérumokat is meg lehet vizsgálni, hogy vannak-e jelen gamma-globulinok és PPV, valamint EMCV elleni antitestek [Joo et al., in Proceedings of the Mystery Swine Disease Committe Meeting, 62-66 (1990); Kim et al„ J. Vet. Diagn. Invest., 1, 101-104 (1990)]. Az élve született malacokat egy hétig lehet megfigyelni, a morbiditást és a mortalitást fel lehet jegyezni, azután a malacokat elpusztítjuk, és a szöveteket összegyűjtjük a fénymikroszkópos vizsgálatok céljára, amint azt a magzatoknál leírtuk.

A SIRS-oltóanyag 0,2 μιη-es és módosított szűrleteinek patogén hatása van a kocákra, és anorexiát, valószínűleg enyhe lázat és idő előtti fialást okoznak, nagyszámú halva született és gyenge malaccal az egyes almokban. Ez illusztrálja azt a bizonyítékot, hogy az oltóanyag a SIRS fertőző kórokozót tartalmazza. A kontroll oltóanyaggal beoltott kocák hozzávetőlegesen időben fialnak, az alomméret a kondára jellemző normál határok között van, amint azt a kondáról vezetett, hozzáférhető járványtani adatbázisból meg lehet állapítani. A halva született malacokban nem találunk léziókat, és a túlélő gyenge malacok között nagyarányú mortalitás figyelhető meg a születés után egy héten belül.

3. példa

SIRS-oltóanyaggal beoltott, majd elpusztított gnotobiotikus malacokból származó, a fertőzés után különböző időpontokban vett szövetmintákat használhatunk arra a célra, hogy izoláljuk és azonosítsuk a SIRS fertőző kórokozót, hogy meghatározzuk a léziók fejlődésmenetét, és hogy megbizonyosodjunk arról, hogy a SIRS kórokozó immunszuppresszív hatású.

A fagyasztott szövetek és beoltott sejttenyészetek immunfluoreszcencia-vizsgálata

A fagyasztott szöveteken és sejtkaparékokon végzett immunfluoreszcencia-vizsgálatokat úgy hajthatjuk végre, ahogy azt korábban leírták [Benfield et al., J. Clin. Microbiol., 16, 186-190 (1982), Benfield et al., Am. J. Vet. Rés., 49, 330-336 (1988)]. A lefagyasztott szöveteket és sejtkaparékokat megvizsgálhatjuk PPVre, EMCV-re (lásd a 4. példát az rövidítések meghatározására) és a SIRS-kórokozó(k)ra.

HU 217 105 Β

A PPV- és EMCV-konjugátumok megkaphatok a South Dakota Animal Disease Research and Diagnostic Laboratorytól. Egy hiperimmun szérumot állíthatunk elő gnotobiotikus malacokban a SIRS-oltóanyag legtisztább formájából. Két malacot intranazálisan lehet beoltani, majd a Freund-féle adjuvánsban készített SIRS-oltóanyaggal bőr alá egy erősítőinjekciót adunk az első beoltás után kettő vagy négy héttel. A szérumokat ezekből a malacokból az utolsó erősítőinjekció után két héttel vesszük le. A kontrollszérumot is előállítjuk két gnotobiotikus malacból, a kontroll oltóanyag, és ugyanazon immunizációs protokoll felhasználásával, amelyet a SIRS-oltóanyagra leírtunk. Ezeket a szérumokat primer antitestekként használhatjuk, és fluoreszcein-izotiocianáttal konjugált kecske- vagy nyúl-antisertés-immunglobulint használhatunk szekunder antitestként a SIRS-antigének kimutatására a lefagyasztott szövetmintákban és sejttenyészetekben.

Szerológiai vizsgálatok

A kontroll- és beoltott sertésekből származó szérumokat megvizsgálhatjuk, hogy van-e bennük PPV vagy SIV elleni antitest (hemagglutinációs gátlás), Leptospira (mikroagglutináció) és EMCV (vírusneutralizáció) (lásd a 4. példát a rövidítések magyarázatára). A korábbi eredmények azt mutatják, hogy az egyéb általában előforduló mikrobiológiai kórokozókra való szerológiai vizsgálat negatív [Collins et al., 71st Meeting of the Conference of Research Workers in Animal Disease, Abstract No. 2. (1990)].

Immunológiai vizsgálatok

Szöveteket és vért vehetünk a SIRS-vel beoltott és kontrollmalacokból, abból a célból, hogy az immunológiai helyzetüket megállapítsuk. A sertésleukocitákat a perifériás vérből izolálhatjuk egyetlen lépésben, szakaszos gradiensflotációval Histopaque 1077-en Pescovitz és munkatársai leírása szerint [Pescovitz et al., J. Immunoi., 134, 37-44 (1985)]. A nyirokmirigyekből, a lépből és a csecsemőmirigyből származó sejteket egysejt-formára hozhatjuk a szövetek közepes darálásával és a keletkező sejtszuszpenziók kinyerésével [Hurley et al., Cancer Rés., 47, 3729-3735 (1987)].

A sertésleukociták fenotípusát monoklonális antitestek paneljével lehet megállapítani, amelyek az American Type Culture Collectiontől szerezhetők be, valamint Joan Lunneytől (USA, Beltsville, MD). Ezek közé tartoznak antitestek az összes T-sejt, a pCD2 mérésére [MSA4; Hammerberg et al., Vet. Immunoi. Immunopathol., 11, 107-121 (1986)], segítő/II-es osztályú MHC-dependens T-sejtek, pCD4 [74-12-4; Lunney et al., Vet. Immunoi. Immunopathol., 17, 135-144 (1987)], a citotoxikus szuppresszor/I-es osztályú MHCdependens T-sejtek, pCD8 [74-2-11; Lunney et al., Vet. Immunoi. Immunopathol., 17, 135-144 (1987)], makrofágok és granulociták [74-22-15A; Lunney et al., Vet. Immunoi. Immunopathol., 17, 135-144 (1987)], timociták és perifériális B-sejtek, pCDl [76-7-4, Lunney et al., Vet. Immunoi. Immunopathol., 17, 135-144 (1987)], valamint sertés MHC ΙΙ-es osztályú antigének, amelyek ekvivalensek a humán DRw-vel [MSA3; Hammerberg et al., Vet. Immunoi. Immunopathol., 11, 107-121 (1986)] és a DQw (TH21A és mások) [VRMD, Pullman, WA; Davis et al., Hybridoma Technology in Agriculture and Veterinary Research, Rowman and Allanheld, 121-150 (1984)]. A sertés-immunglobulinok elleni izotípusspecifikus monoklonális antitestek is hozzáférhetők [Paul et al., Am. J. Vet. Rés., 50, 471-479 (1989)], és a minimális telítőkoncentráció kétszeresénél használhatók a perifériális vérből, nyirokmirigyből és a Peyer-plakkokból származó leukociták indirekt fluoreszcencia-festésére [Hurley et al., Vet. Immunoi. Immunopathol., 25, 177-193 (1990)]. A kétszínes elemzés eléréséhez a sejteket rPE-vel jelzett avidinnel is megfesthetjük, miután biotinhez kötött (Pierce #21333) antitesteket kötöttünk hozzá. A sejteket áramlási citometriával elemezhetjük, illetve egy kétszínű analitikai fluoreszcens mikroszkóppal (PTI-FSCAN rendszer). Az együttkimutatást a 488 nm-es lézerfénnyel az áramlási citométerben, illetve a kettős analitikai fluoreszcens mikroszkóp felhasználásával elvégezhetjük. A celluláris fluoreszcencia intenzitása és a pozitív sejtek százaléka is meghatározható.

Az in vitro fúnkcionális vizsgálatok lektin mitogenezis konkanavalin A-val, alkörmös mitogénnel (PWM) és fitohemagglutininnel (PHA) végezhetők Hammerberg és munkatársai leírása szerint [Hammerberg et al., Am. J. Vet. Rés., 50, 868-874 (1989)]. Az antigénspecifikus in vitro lizozimre adott T-sejt válaszok is modellezhetők az ő technikájuk szerint. A B-sejt szaporodási vizsgálatokat is elvégezhetjük Escherichia coli és Salmonella typhimurium LPS-sel, illetve antiimmunglobulinnal [Symons et al., Inf. Archs., Allergy Appl. Immun., 54, 67-77 (1977)]. A PWM által indukált antitesttermelést Hammerberg és munkatársai módszerével végezhetjük el és értékelhetjük ki mennyiségileg [Hammerberg et al., Am. J. Vet. Rés., 50, 868-874 (1989)]. Az IL-1 makrofág termelését 48 órás Escherichia coli LPS expozíció után az egértimocita-vizsgálattal mérhetjük [Mizel, Immunological Rév., 63, 51-72 (1982)]. A PHA-val serkentett limfociták IL-2 termelését Stott és munkatársai által leírt módszerrel mérhetjük [Stott et al., Vet. Immunoi. Immunopathol., 13, 31-38 (1986)]. Egy izotípusspecifikus antilizozim ELISA végezhető el a sertésimmunoglobulin-izotípusok elleni monoklonális antitestekkel [Paul et al., Am. J. Vet. Rés., 50,471-479 (1989)].

Az in vivő antitesttermelés becsléséhez három SIRS-vel oltott malacot és három kontroll oltóanyaggal oltott malacot injekciózunk kétszázalékos birkaeritrocitával és egy 10 pg/ml szarvasmarhaszérumalbumin-oldattal különböző pontokon 5, 7, 10, 14 és 24 nappal az eredeti beoltás után, majd szövetmintákat gyűjtünk a hisztopatológiához, amint azt az 1. példában leírtuk, valamint az antitesthez vért veszünk. Az összantitestszint és az egyes antigénekre adott specifikus IgG-, valamint IgM-válaszok mérhetők antigénspecifikus radiális immundiffúziós ELISA-val. Az antigénspecifikus tarfoltvizsgálatot lépsejteken végezhetjük el, hogy megbecsüljük a B-sejt kiónok gyakoriságát a fertőzött és kontrollállatokban [Kappler, J. Immunoi., 112, 1271-1285 (1974)].

HU 217 105 Β

4. példa

Ennek a kísérletnek az a célja, hogy hiperimmun antiszérumokat készítsünk gnotobiotikus malacokban egy SIRS-izolátummal szemben, amelyet diagnosztikai reagensként lehet használni, és a SIRS-antigén tulajdonságainak további jellemzésére.

A South Dakota State Universityn gnotobiotikus malacokon, az University of Minnesotával kooperációban végzett korábbi vizsgálatok azt mutatják, hogy az MN 89-35477 jelű, a termelésből izolált, egyesített szövethomogenizátumok léziókat okoztak gnotobiotikus malacokban. Az ezekből a malacokból származó szövethomogenizátumokat azután klinikai betegségek és légzési léziók előidézésére használjuk, amely a SIRS-re jellemző a háromnapos gnotobiotikus sertésekben [Collins et al., 71st Meeting of the Conference of Research Workers in Animál Disease, Abstract No. 2. (1990); Collins et al., Minnesota Swine Conference fór Veterinarians, Abstract, 254-55 (1990)]. Az eredeti oltóanyag ezen második, gnotobiotikus sertésekben (90 χ 75) való átoltása során kapott tüdő- és szövethomogenizátumokat használjuk második oltóanyag előállítására. A második oltóanyagot használhatjuk oltóanyagként és antigénként, hogy ebben a kísérletben előállítsuk a hiperimmun szérumot.

Gnotobiotikus sertések

A gnotobiotikus sertéseket az előzőkben leírt módon lehet készíteni és fenntartani [Benfield et al., Am. J. Vet. Rés., 49, 330-336 (1988); Collins et al., Am. J. Vet. Rés., 50, 824-835 (1989)].

A hiperimmun szérumok oltása

A hiperimmun szérumot úgy lehet előállítani, hogy először egy gnotobiotikus sertést oltunk be az előzőkben leírt módon. A sertésnek azután egy fokozóinjekciót lehet adni, amely 1 ml második oltóanyagot és 1 ml Freund-féle inkomplett adjuvánst tartalmaz, az eredeti fertőzés után 14 és 21 nappal [Harlow and Lane, 1988]. A sertést azután az utolsó beoltás után 14 nappal vagy később le kell ölni és ki kell véreztetni. A szérumokat össze kell gyűjteni, és megfelelő alikvot részekre kell osztani, majd -20 °C-on kell tárolni.

Szerológia

A hiperimmun szérumokat le lehet vizsgálni, hogy tartalmaz-e a sertések általános kórokozóival szemben antitesteket, amint azt általánosan csinálják a legtöbb diagnosztikai laboratóriumban. Ezeket a szérumokat meg lehet vizsgálni a Haemophilus, Brucellosis, Leptospira (6 szerovariáns), pszeudorabiesz (PRV), parvovírus (PPV), enkefalomiokarditisz-virus (EMC) és sertésinfluenza- vírus (Sí) elleni antitestek jelenlétére.

Eredmények

Az antiszérumok készítésére használt sertés a 4B számú (kísérleti száma 90x238). Ezt a sertést 1990. november 1-jén oltottuk be, és naponta figyeltük a klinikai jelek megjelenését, egészen addig, amíg 1990. november 29-én le nem öltük. A klinikai tüneteket az 1. táblázatban foglaljuk össze. Sajnos, a sertés degenerált állapota miatt várható volt, hogy el kell pusztítani csupán egyetlen fokozóinjekció után, amit 1990. november 13-án adtunk be. A sertést az első fokozóinjekció beadása után 16 nappal öltük le, 1990. november 29-én.

A szerológiai eredmények negatívak minden fent említett kórokozóra, kivéve a PPV-t, amely 16, 384-es titert adott (lásd 2. táblázat). Ezen a sertésen előtitrált szérumokat nem hajtottunk végre.

A sertés boncolása során tüdő-, szív-, agy-, vese-, végbél-, vékonybél-, orrkagylócsont-, lép-, gyomor- és tracheamintákat veszünk. Ezeket a mintákat kiértékeljük, és azt állapíthatjuk meg, hogy az ebből a sertésből származó tüdőben a súlyos tüdőgyulladás léziói találhatók meg, amelyek tipikusan jellemzők a tenyésztésben felbukkanó SIRS-esetekre.

Ennek a kísérletnek az eredményei megerősítik azokat a kezdeti vizsgálatokat, hogy egy fertőző kórokozó van jelen a második oltóanyagban, mivel képes klinikai betegségeket indukálni, és olyan léziókat indukálni, amelyek jellemzőek azokra, amelyeket a természetes SIRS-esetekben lehet megfigyelni.

1. táblázat

Dátum Megfigyelések a beoltott malacon (90 x 238)

10. 29. Műtét

11. 1. A sertést intranazálisan beoltjuk 0,5 ml, előzőkben említett oltóanyaggal, porlasztó alkalmazásával délután 5:00 órakor.

11.2. Nincs megfigyelés

11.3. Ennek a sertésnek kétszer annyi tej maradt az edényében, mint a kontrolisertéseknek. Nem vagyok biztos abban, milyen jól esznek a sertések, illetve hogy a kórokozó okozza az anorexiát. A széklet normális.

11.4. Talán egy kicsit lassú, de éber és erős. A fele tejet meghagyta, a széklet lágy és barna.

11.5., délelőtt 9:00: erős, éber, a legtöbb tejet megitta, a széklet nyálkás és barna (2).

Délután 4:00: erős, éber, a legtöbb tejet megitta, a széklet nyálkás és barna.

11.6., délelőtt 9:00: erős, éber, a tej felét megitta, a széklet barna, nyálkás (2).

Délután 6:00: erős, éber, a tej felét meghagyta, a széklet laza sárgásbarna (2).

11. 7., délelőtt 9:00: erős, éber, a tej legnagyobb részét megitta, a széklet világosbarna, nyálkás (2). 11. 8., délután 2:00: éber, nem iszik annyi tejet, mint a kontrollok, lassúbb, mint a kontrollok, nyálkás, sárga széklet.

11. 9., délelőtt 8:00: éber, nem iszik olyan agresszíven, mint a kontrollok, pasztaszerű széklet. Délután 5:00: ugyanaz a megfigyelés, mint de. 8:00-kor.

11. 10., délután 6:00: éber, élénk, az ormányát agresszíven hozzádörzsöli az edénye fedőjéhez, a széklet laza barna, nem eszik úgy, mint a kontrollok.

11. 11., délután 6:00: éber, élénk, az ormányát agresszíven hozzádörzsöli az edénye fedőjéhez, a széklet pasztaszerű, nem eszik olyan jól, mint a kontrollok, délután 6:30-kor még van tej az edényében, a kontrollok befejezték az evést.

11. 12., délelőtt 9:00: éber, de nem olyan agresszív, mint a kontrollok, a kontrollok 5 perc alatt kiürítették az edényüket, de ez a sertés a tejnek legalább a

HU 217 105 Β

1. táblázat (folytatás) kétharmadát meghagyta. Valamennyire dörzsöli az ormányát.

11. 13. 90x75 tüdő és egyesített szövetekkel oltva, porlasztó alkalmazásával (0,5 ml) és sp. IFA-val (1 ml), délután 4:00-kor. Éber, de nem olyan agresszív, mint a kontrollok, még megvan a tej fele, miközben a kontrollok az összes tejüket megették. Nem dörzsöli az ormányát, a széklete pasztás.

11.15-től 11.24-ig: nincs túl nagy változás, éber, de folyamatosan csökken az aktivitása.

11.24. délután 1:00: a légzés gyorsabbnak tűnik, a szőrzete durva, nem növekszik úgy a súlya, mint a kontrolioknak.

11. 29. Leölés - vérminta a Η. I. szérumhoz. A szokásos mennyiség gyűjtve a hisztopatológiához, beleértve a mandulákat. Vérminta a limfocitamitogenikus vizsgálathoz. Nagy léziók nem figyelhetők meg. Orrkagylócsont-tenyészeteket indítunk.

2. táblázat

A beoltott malac antitesttesztjei

1. Sertésinfluenza - negatív

2. Sertés-enkefalomiokarditisz - negatív

3. Sertés-APP - negatív

4. Sertés-PRV - negatív

5. Sertés-PPV - negatív

6. Sertés-Brucella - negatív

7. Sertés-Leptospirosa - negatív

8. Sertés-EPI - negatív

4A. példa - Monoklonálisantitest-készítés

Egérimmunizálás

Nyolc héttel a hibridómafüzió előtt BALB/c AnN egereket IP beoltunk az antigén és Freund-féle komplett adjuváns (CFA) 1:1 keverékével. A használt antigén mennyisége függ az antigén immunogenitásától és toxicitásától. Maximum 0,3 ml CFA-t használunk egerenként. Öt héttel az indulóimmunizálás után az egereket beoltjuk az antigénnel CFA-ban. Egy héttel a fúzió előtt az egereket IP immunizáljuk sóoldatban levő antigénnel. Két nappal a fúzió előtt az egereket IV beoltjuk sóoldatban levő antigénnel.

Mielómasejtek

Az egér-mielómasejteket [P3/NS-l/l-Ag4-l (ATCC TIB 18) beszerezhető az ATCC-től, lásd továbbá például Kohler és Milstein, Eur. J. Immunoi. 6, (7) 511-519 (1971)] Dulbecco-féle, módosított Eagle táptalajon (DMEM) tartjuk fenn, amely 10% boqúmagzatszérumot tartalmaz. A fúzióhoz körülbelül 107-108 sejtre van szükség egy tipikus egérlépből kapott B-sejtekkel. Közvetlenül a hibridómafüzió előtt a mielómasejteket egy logfázisú tenyészetből kinyerjük egy 50 ml-es centrifúgacsőbe, majd a sejteket centrifugálással ülepítjük (200 g, öt perc). Eltávolítjuk a felülúszót, és a sejteket kétszer mossuk szérummentes DMEM-mel, majd az előzőek szerint centrifugáljuk. Az üledéket újra szuszpendáljuk (107-108 sejtet tartalmaz) 1 ml szérummentes DMEM-ben.

Léplimfociták izolálása

Az egeret cervikális diszlokációval elpusztítjuk, majd néhány percre 70%-os etanolba merítjük. A lépet egy aszeptikus eljárással eltávolítjuk, majd egy steril Petri-csészébe visszük át, amely 5 ml hideg, szérummentes DMEM-et tartalmaz. Szikével felhasítjuk a lépet a hosszanti tengelye mentén, és óvatosan kapargatjuk a lép hosszában, hogy a szplenocitákat bejuttassuk a közegbe. Egy pipetta használatával a szabad sejteket és a közeget egy 15 ml-es centrifugacsőbe visszük, a lép burkát visszahagyva. A szövettörmeléket öt percig hagyjuk ülepedni a csőben, majd az egysejt-szuszpenziót egy másik csőbe visszük át. A sejteket öt percig 200 g-vel centrifugáljuk, a felülúszót elöntjük, majd az üledéket ismét mossuk hideg, szérummentes DMEMmel. A sejteket 1 ml szérummentes DMEM-ben szuszpendáljuk, majd jégen tároljuk a fúzióig.

Fúzió

A lépsejteket a mielómasejteket tartalmazó centrifugacsövekhez adjuk, majd öt percig centrifúgáljuk 500 gvel. A összes felülúszót eltávolítjuk, majd az üledéket meglazítjuk, oly módon, hogy a cső oldalát megütögetjük. Minden reagenst és sejtet 37 °C-on tartunk, 1 ml 50 százalékos polietilénglikol-oldatot (PEG 4000, Gibco, Grand Island, NY) adunk cseppenként a csőhöz egyperces időtartam alatt, óvatos kevertetés közben. A keveréket egy percig állni hagyjuk 37 °C-on. 1 ml meleg, szérummentes DMEM-et adunk hozzá cseppenként, egy perc alatt, óvatos kevertetés közben. Végezetül 20 ml szérummentes DMEM-et adunk hozzá cseppenként négy perc alatt, majd azonnal centrifugáljuk a sejteket 200 gvel, öt percig. A felülúszót elöntjük, majd a sejteket újra szuszpendáljuk 47 ml DMEM-ben, amely 20% botjúmagzatszérumot, 0,2 egység/ml inzulint, 0,5 mmol/1 nátrium-piruvátot, 1 mmol/1 oxálecetsavat, 2 mmol/1 L-glutamint, nem esszenciális aminosavakat és 10 százalék NCTC-109 limfocita táptalajt tartalmaz. A sejtszuszpenzióból 1 ml-t két 24 lyukas, lapos fenekű szövettenyésztő lemez lyukaiba viszünk. Ez tartalmazza a mielóma-kontroll-lyukakat is, majd a lemezeket 37 °Con inkubáljuk 10%-os CO₂-atmoszférában (SDMEM).

Egy éjszakán át tartó inkubálás után a táptalajból 0,5 ml-t eltávolítunk minden egyes lyukból, anélkül, hogy a sejtréteget megzavarnánk. Minden egyes lyukhoz hozzáadunk 1 ml SDMEM-et, amely 1 χ 10^-4 mol/1 hipoxantint, 4xl0~⁷ aminopterint és l,6xl0~⁵ timidint (HAT) tartalmaz, és az inkubálást tovább folytatjuk 37 °C-on 10% CO₂ jelenlétében. Folytatjuk a használt táptalaj helyettesítését 1 ml friss DMEM+HAT táptalajjal hetente háromszor, két-három hétig. Ha jelentős klónnövekedést észlelünk, akkor ELISA-val, indirekt FA-val, vagy más megfelelő vizsgálórendszerrel vizsgáljuk a sejteket a specifikus antitestek jelenléte szempontjából.

Klónozás

A specifikus antitestre pozitívnak bizonyuló primer lyukakat azonnal szubklónozni kell, hogy stabil sejtvonalat kapjunk, és elkerüljük a más kiónok által való túlnövést. A kiválasztott primer lyukakból származó sejteket újraszuszpendáljuk, és sejtszámlálást végzünk tripánkék festékkel, valamint hemocitométerrel. A sejtekből hígí14

HU 217 105 Β tást készítünk, hogy végül körülbelül 2 sejt/ml végkoncentrációt kapjunk SMDM+HT táptalajban. Táprétegként nem beoltott egerekből származó normális lépsejteket használunk, 50 μΐ pakolt sejtet adva 100 ml táptalajhoz.

A 96 lyukas lemezek minden egyes lyukához 250 μΐ sejtszuszpenziót adunk, majd 37 °C-on 10%-os szén-dioxidban inkubáljuk. A kiónok két-három héten belül láthatók kell hogy legyenek, és az egyedi kiónokat vizsgáljuk, amikor a jelentős növekedés már nyilvánvaló. Megismételjük a klónozást eljárást azokkal a lyukakkal, amelyek a specifikus antitestre pozitívnak bizonyultak. A szelektált kiónokat lassan felnövesztjük szövettenyésztő lombikokban a további jellemzés és hűtve tárolás céljából.

Aszcitesztermelés

BALB/c AnM egereknek 0,5 ml pristane-t adunk két héttel a hibridómasejtekkel való beoltás előtt. A hibridómasejteket összegyűjtjük, majd Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldattal (HBSS) egyszer mossuk. A sejteket HBSS-ben szuszpendáljuk, és a pristane-t kapott egereket 104-106 élő sejttel oltjuk be. Amikor az aszcitesztermelés nyilvánvaló (általában egy vagy két héttel a beoltás után), akkor egy 16G 1-1/2” tűvel a hasi részen a lágyék táján leszívjuk. A tű középpontját egy centrifugacső fölé tartjuk, majd az aszciteszt a csőbe csöppentjük. Az aszciteszfolyadékot 200 g-vel centrifugáljuk, egy 0,2 nm-es szűrőn átszűrjük, majd fagyasztva tároljuk.

4B. példa

SIRS monoklonális antitestek (SDOW12 és

SD0W17)

A SIRS-vírus elleni SDOW 12 (ATCC No. HB 10996) és SDOW 17 (ATCC No. HB 10997) monoklonális antitesteket a fenti standard kísérleti leírás szerint állítjuk elő, amely a monoklonális antitestek előállítására vonatkozik. Az egér immunizálására használt antigén a SIRS-vírus hatodik átoltása (VR-2332), amelyet MA-104 sejteken szaporítunk [a sejteket a Boehringer Ingelheim Animál Health-től (BIAH) szereztük be]. Minden egyes immunizálásnál az egereket 0,3 ml gradiensen tisztított vírussal oltunk be, amelynek titere 106 TCID50/100 μΐ.

Egy indirekt fluoreszcensantitest- (IFA) vizsgálatot alkalmazunk, hogy kimutassuk a specifikus antitestet a hibridóma primer lyukakban és klónlyukakban. Az acetonnal fixált vírust és a 96 lyukas szövettenyésztő lemezekben levő fertőzött, illetve nem fertőzött egysejt-rétegeket használjuk az IFA-ban. A sejttenyészet-felülúszók és az ezekből a hibridómákból származó aszciteszfolyadékok éles, granuláris citoplazmatikus fluoreszcenciát mutattak a SIRS-szel fertőzött sejtekben.

Ezeknek a monoklonális antitesteknek az előzetes jellemzése magában foglalja a SIRS virális fehéijék immunglobulin-izotípusának meghatározását és a radioimmunprecipitációját. A SDOW 12 és SDOW 17 monoklonális antitestek mind IgGl izotípusúak. Ezek emellett kötődnek egy 15 kódolt méretű virális fehérjéhez a radioimmunprecipitáció során.

5. példa

Három pilotvizsgálatot írunk le. Egy gnotobiotikussertés-vizsgálatot végeztünk, annak igazolására, hogy a termelésből származó anyag használható fertőzésre, és a mikroorganizmusmentes sertésekben a tünetegyüttes légzési komponensét elő lehet idézni vele. Egy második vizsgálatot is végeztünk, amelyben szokványos módon elválasztott sertéseket használtunk, annak meghatározására, hogy a gnotobiotikus sertésekben megfigyelt légzési betegség reprodukálható-e szokványos sertésekben is. És végezetül, egy vemheskoca-vizsgálatot is végeztünk, annak meghatározására, hogy a tünetegyüttesnek az a komponense, amely a szaporodási problémákat mutatja, szintén reprodukálható-e kísérletileg.

Anyagok és módszerek

Az inokulum forrása ugyanaz, mint amit az 1A. példában leírtunk.

Gnotobiotikus vizsgálat

Hat méhirtásból származó gnotobiotikus malacot oltunk be intranazálisan háromnapos korban a termelésből származó oltóanyaggal (10 százalékos homogenizátumok, különböző szövetek). Szűrt (0,22 μηι) és szüretien oltóanyagot is használunk. Két kontrollmalacot csak a közeggel oltunk be. A klinikai jeleket naponta ellenőrizzük, és a malacokat a beoltás után leöljük, egy állat kivételével, amelyet megtartunk a hiperimmun szérum termeléséhez. A vírus izolálásához és a hisztológiai vizsgálatokhoz szöveteket gyűjtünk a boncolás során, olyan szérumokkal együtt, amelyekben megvizsgáljuk, hogy van-e bennük antitestleptospira, chlamydia, eperythrozonon, Aujeszky-betegség-vírus, sertésparvovírus, enkefalomiokarditiszvírus, hemagglutináló agyhártyagyulladás-vírus, sertésinfluenza-vírus, szarvasmarha-légzésiszíncíciumvírus, kutyaszopomyicavírus, szarvasmarha-virálishasmenés- és sertéskoleravírus elleni antitest. Az eredeti oltóanyagot és a gnotobiotikus malacokból származó szöveteket folyamatos és primer sejtvonalakba oltjuk be, háromszori átoltással. Emellett direkt és immun-elektronmikroszkópiát is végzünk.

Szokványos sertés vizsgálata

Három szokványos, 28 napos választási malacot, amelyek olyan farmról származnak, ahol nem fordult elő SIRS, intranazálisan beoltunk fertőzött gnotobiotikus malacokból származó tüdőhomogenizátumokkal. A kontroliban egy negatív gnotobiotikus sertésből származó tüdőhomogenizátumot használunk oltóanyagként. A malacokon naponta figyeljük a klinikai jeleket, és a fertőzés után nyolc nappal felboncoljuk őket. A szérumokat, illetve a szöveteket az előzőkben leírt módon dolgozzuk fel.

Vemhessertés-vizsgálat

Nyolc, egyszerre többet kölykező kocát, amelyeknek ismert az előéletük, és egy olyan farmról származnak, ahol nem fordult elő SIRS, használunk ebben a vizsgálatban. A várt fialási időpont előtt nyolc héttel hat kocát intranazálisan beoltunk a fertőzött gnotobiotikus malacokból származó tüdőhomogenizátummal, két kocát pedig negatív tüdőhomogenizátummal. A klinikai tüneteket naponta vizsgáljuk. A kocákat hagyjuk természetes

HU 217 105 Β úton fialni, és ha lehet, akkor a fialáson ott kell lenni, hogy az élve született malacoktól szopás előtti szérumot vegyünk. A kocákat és az élő malacokat röviddel a fialás után elpusztítjuk, majd szöveteket gyűjtünk a hisztopatológiához és a vírus izolálásához. Szérumot és mellüregi folyadékot is gyűjtünk.

Eredmények

A boncolásnál nincs megfigyelhető nagy lézió. A szopós malacok mikroszkópos vizsgálata nekrotizáló intersticiális tüdőgyulladást és limfomononukleáris agyhártyagyulladást mutat ki. A magzatokban nincs lézió, de a kocának enyhe agyhártyagyulladása van. A mikrobiológiai vizsgálat nem adott konkluzív eredményeket.

Gnotobiotikus vizsgálat

A malacok anorexiásak lettek, és a beoltás után durva szőrük lett. A kontrollok normálisak maradtak. Mikroszkopikus léziók voltak találhatók azokban a principálisokban, amelyeket szűrt vagy nem szűrt anyaggal oltottunk be. A léziók hasonlítanak a termelési esetben megfigyeltekhez, és a következő típusok fordulnak elő: nekrotizáló intersticiális tüdőgyulladás (6/6 [a hat malacból hatban]), limfoplazmatikus rhinitis (4/6), limfomononukleáris agyhártyagyulladás (2/6) és szívizomgyulladás. Etiológiai áganst nem azonosítottunk, sem az oltás előtt, sem az oltás után, illetve az oltóanyag, illetve a szövet vizsgálatakor.

Szokványosán elválasztott malacok vizsgálata

Klinikailag a principálisok lassúvá és anorexiássá váltak a beoltás után két nappal. Az állatok láthatóan fáztak, annak ellenére, hogy megfelelő hőmérsékletet biztosítottunk. Egy malacnak magas volt a hőmérséklete (41,5 °C) hat nappal a beoltás után. Intersticiális tüdőgyulladás, agyhártyagyulladás és szívizomgyulladás volt található a principálisokban, de a kontroliban nem.

Vemhes kocák vizsgálata

Klinikailag csak két principálisban volt jelentős testhőmérséklet-emelkedés (1,5 °C) a beoltás utáni harmadik napon. Azonban az oltás utáni negyedik vagy ötödik napon anorexia volt megfigyelhető 4/6 kocánál. Három koca hét nappal korábban fialt, három időben fialt. A fertőzött kocák magzatainak több mint 50%-a halott volt, míg a kontrolloknál normális almok voltak. Mind halva születettek, mind múmiák találhatók voltak a fertőzött almokban. A laboratóriumi eredmények nem voltak konkluzívak - nem lehetett specifikus kórokozót azonosítani, és a mai napig nem voltak találhatók léziók a magzatokban.

Jóllehet kórokozó mikroorganizmust nem lehetett azonosítani, a megfigyelések azt sugallják, hogy a SIRS-t kísérletileg át lehet vinni gnotobiotikus és szokványos sertésekre (egy farmról származó minta használatával). A SIRS-nek mind a légzési, mind a szaporodási formáit reprodukálni lehetett. A folyamatban szereplő kórokozó fertőző, 0,22 pm-nél szűrhető, és láthatóan érzékeny.

A SIRS egy fontos, teijedő betegség, nemcsak az Amerikai Egyesült Államokban, hanem az egész világon. Abból a célból, hogy a betegséget szabályozott körülmények között vizsgáljuk, gnotobiotikus sertéseket oltunk be intranazálisan háromnapos korukban, olyan szövethomogenizátummal, amely SIRS jeleit mutató farmról származik. A termelésben megfigyeltekhez hasonlító mikroszkopikus léziók, beleértve a nekrotizáló intersticiális tüdőgyulladást, és kisebb mértékben a limfoplazmatikus rhinitist, a limfomononukleáris agyhártyagyulladást vagy szívizomgyulladást, megfigyelhetők voltak a principálisokban, de a kontrollokban nem. A többet fialó vemhes kocákat is beoltottuk gnotobiotikus tüdőhomogenizátumokkal, a fialási időpontjuk előtt három héttel. Klinikailag ezek a kocák anorexián estek át, és volt olyan, amelyik egészen hét nappal korábban fialt. A magzatoknak több mint 50%-a vagy halva született volt, vagy a mumifikálódás kezdeti stádiumában. A megfigyelések azt sugallják, hogy a betegséghez kapcsolódó fertőző kórokozó izolálható és kísérletileg átvihető termelésből származó szövetekkel gnotobiotikus sertésekre, illetve a gnotobiotikus sertésekről szokványos módon elválasztott malacokra vagy vemhes kocákra. Ez a vizsgálat modellje lehet a betegségnek, mind a légzési, mind a szaporodási formájának, ami a SIRS patogenezisének és diagnosztizálásának további vizsgálatához vezet.

Claims (28)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás sertésnek SIRS-szel szembeni immunizálására alkalmas vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy egy SIRS eredetű, inaktivált vagy legyengített, a VR-2332-es ATCC nyilvántartási számon letétbe helyezett vírus immunológiai jellemzőivel bíró virális fertőző kórokozót és egy gyógyászatilag elfogadható hordozót összekeverünk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy SIRS eredetű, legyengített fertőző kórokozót gyógyászati hordozóval összekeverünk.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legyengített fertőző kórokozóként sertésben nem zoopatogén, a SIRS-vírusnak majomsejteken keresztüli passzálását tartalmazó eljárással előállított, módosított SIRS-vírust alkalmazunk.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy majomsejtekként MA-104 majomsejtekbe vagy azok származékába bejuttatott és azokból kinyert fertőző kórokozót alkalmazunk.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fertőző kórokozóként ATCC VR-2332 nyilvántartási számon letétbe helyezett vírust alkalmazunk.

6. Eljárás ATCC VR-2332-es nyilvántartási számon letétbe helyezett vírus immunológiai jellemzőivel bíró vírus azonosítására, azzal jellemezve, hogy egy vírus és egy monoklonális antitest komplexét állítjuk elő a vírust tartalmazó mintának az ATCC VR-2332 nyilvántartási számú SIRS-vírus 15 kD méretű proteinjéhez specifikusan kötődő monoklonális antitesttel való reagáltatása útján, és kimutatjuk a komplexet.

7. Eljárás SIRS diagnosztizálására sertésben, azzal jellemezve, hogy sertés eredetű szövetmintából származó izolátumot állítunk elő, az ízolátumhoz egy monoklonális antitestet

HU 217 105 Β adunk, és így víruskórokozó és monoklonális antitest által alkotott komplexet állítunk elő, amely monoklonális antitest specifikusan kötődik az ATCC VR-2332 nyilvántartási számú SIRS-vírus 15 kD méretű proteinjéhez, és kimutatjuk a komplexet, amelynek jelenléte SIRSbetegségre utal.

8. Eljárás SIRS-betegség diagnosztizálására sertésben, azzal jellemezve, hogy sertésből tüdőszövetmintát állítunk elő, a tüdőszövetmintát hordozóval érintkeztetjük, és ezáltal immobilizált szövetmintát állítunk elő, az immobilizált szövetmintához monoklonális antitestet adunk, és így virális kórokozó és monoklonális antitest komplexét állítjuk elő, amely monoklonális kórokozó specifikusan kötődik az ATCC VR-2332 nyilvántartási számú SIRS-vírus 15 kD méretű proteinjéhez és kimutatjuk a komplexet.

9. A 6., 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestként ATCC HB 10996 nyilvántartási számú vagy ATCC HB 10997 nyilvántartási számú hibridóma-sejtvonalból származtatható antitestet alkalmazunk.

10. Vakcina SIRS megelőzésében való alkalmazásra, azzal jellemezve, hogy egy, SIRS-szel fertőzött sertésszövetből származó, inaktivált vagy legyengített fertőző kórokozót tartalmaz gyógyászati hordozóval kombinálva, ahol a fertőző kórokozó egy, ATCC VR-2332 nyilvántartási számon letétbe helyezett vírus immunológiai jellemzőivel bíró vírus. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 01.)

11. A 10. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy fertőző kórokozóként SIRS-betegséggel fertőzött sertésből származó szövet szűrt homogenizátumából nyert oltóanyag alkalmazásával előállított fertőző kórokozót tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 01.)

12. A 11. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy fertőző kórokozóként 0,1 mikronnál nem nagyobb méretű biológiai részecskéket tartalmazó szűrt homogenizátumból előállított fertőző kórokozót tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 01.)

13. A 11. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy fertőző kórokozóként az alább felsorolt sertésbetegségek elleni antitestszérummal végzett közömbösítéssel tisztított homogenizátumból előállított fertőző kórokozót tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 01.)

14. A 12. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy módosított, sertésben nem zoopatogénné tett, életképes, az ATCC VR-2332 nyilvántartási számon letétbe helyezett SIRS-vírust tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 01.)

15. A 10. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy elpusztított vagy inaktivált, az ATCC VR-2332 nyilvántartási számon letétbe helyezett SIRS-vírust tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 01.)

16. A 10. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy SIRS-vírusnak majomsejteken keresztül történő passzálását tartalmazó eljárással előállított, legyengített, sertésben nem zoopatogén, módosított SIRS-vírus hatásos mennyiségét tartalmazza. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 01.)

Yl.

A 16. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy majomsejtekként MA-104 majomvesesejtekbe bejuttatott és azokból kinyert, legyengített SIRS-vírust tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 01.)

18. A 10. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy vírusként gradiens- vagy sorozat-sejttenyésztéssel tisztított vírust tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 01.)

19. Vírus biológiailag tiszta tenyészete, azzal jellemezve, hogy a vírus ATCC VR-2332 nyilvántartási számon letétbe helyezett vírus immunológiai jellemzőivel bíró, sertésben sertésterméketlenségi és légúti betegséget kiváltani képes vírus. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 01.)

20. A 19. igénypont szerinti tenyészet, azzal jellemezve, hogy a vírus ATCC VR-2332 nyilvántartási számon letétbe helyezett SIRS-vírus. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 01.)

21. Készítmény, azzal jellemezve, hogy SIRS-vírust tartalmaz majomsejttenyészetben. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 01.)

22. A 21. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a máj omsejttenyészet majomvesesejteket tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 01.)

23. A 22. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a majomvesesejtek MA-104 majomvesesejteket tartalmaznak. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 01.)

24. Monoklonális antitest, azzal jellemezve, hogy specifikusan képes kötődni az ATCC VR-2332 nyilvántartási számú virális kórokozó egy 15 kD méretű antigénjének egy epitópjához. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 01.)

25. A 24. igénypont szerinti monoklonális antitest, azzal jellemezve, hogy az ATCC HB 10996 vagy az ATCC HB 10997 nyilvántartási számon letétbe helyezett hibridóma-sejtvonalak bármelyikéből származtatható. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 01.)

26. A 24. igénypont szerinti monoklonális antitest, azzal jellemezve, hogy IgG vagy IgM típusú immunoglobulin-molekula. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 01.)

27. Hibridóma-sejtvonal, azzal jellemezve, hogy ATCC letétbe helyezési nyilvántartási száma HB 10996 vagy HB 10997. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 01.)

28. Izolált vérszérum, azzal jellemezve, hogy az ATCC VR-2332 nyilvántartási számon letétbe helyezett SIRS-vírus legalább egy antigén-determinánsához specifikusan kötődni képes poliklonális antitesteket tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 01.)