JPH05503840A - Ｂ型ロタウイルスの培養ならびにその利用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｂ型ロタウィルスの培養ならびにその利用法発明の背景 発明の分野 本発明の分野はＢ型ロタウィルスの細胞培養による増殖、および診断キットで使 う抗原ならびに抗血清の製造法、そしてＢ型ロタウィルス感染予防の（修飾生菌 および死菌）ワクチンの製造法に関する。

関連情報の開示 ロタウィルスは乳幼児ならびに子ブタの急性胃陽炎の主因である（２．３．４． ６．１０．１３．２５）。非常に様々な種類の動物にみられるロタウィルスは、 電子顕微鏡で見たときのその特徴ある車輪状の外観から命名されたものであるが 、他のｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ同様、そのゲノムは二本鎖ＲＮＡ　（ｄｓＲＮＡ） の形をとっている。ゲノムは１１個のｄｓＲＮＡセグメントに分割することによ って、しオウイルスと、オルビウイルスとに分けることができる。

１９８３年にＰｅｄｌｅｙ（３１）は、蛍光抗体法で決定した血清差［ｓｅｒｏ ｌｏｇｉｃａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓコ、および１次元末端フィンガープリ ント分析で判定した核酸差に基つき、ロタウィルスを数個の型ないしグループに 分けた。）ＲＮＡの電気フニロタイブ［ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｔｙｐｅ’、 ちこの分類の基礎として使用された（１７）。グループＡのロタウィルスは「典 型的」、その他のもの（Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ）は「非典型的」と考えた。グループＢ のロタウィルスは、動物に対する広範な感染能力かあり、ヒトに病気を起こす能 力かあるので特に注目を集めた。グループＢロタウィルスのグループ反応エピト ープに対する単クローン性抗体か開発されたか、これはウィルス特性のイムノア ッセイに使用できるとされている（２６）。

Ｂ型（グループＢとも呼ばれる）ロタウィルスが、乳幼児ならびに乳離れ直後の ブタの下痢に認められている（１０．２０）。数年に亘る診断検査は、ブタのＢ 型ロタウィルス感染かロタウィルスのポジティブなケースの２５％につき原因と なっていることを示している。血清検査は、オフ１イオ州の研究においてテスト されたブタ血清の２３％にＢ型ロタウィルス抗体があること、また、英国の５種 類の集団［ｂｅｒｄ］からの血清の８６％に同抗体かあることを示した（１．１ ９）。現在、Ｂ型ロタウィルスは、ヒト、ウシ、ラット、ブタ、ヒツジ、および ニワトリから単離されているが、細胞培養では満足のゆく増殖が行われていない （１，７，１３，１６，１７，２０，２１，２２）。別の源から採取したＢ型ロ タウィルスは共通のグループ抗原をもっていると考えられている。

Ｂ型ロタウィルス抗血清は、ヒト（ＡＤＲＶ）、ラット、ウシ、ブタおよび子ヒ ツジのＢ型ロタウィルスと交差反応することが示されている（６．１７．２６） 。ある証明は実際に、Ｂ型ロタウィルスの単離体がその単離された動物種に対し てよりも他の種に対して有毒であることを示唆している（８．２６）。

Ａ型ロタウィルスは数種の細胞系で十分に増殖されているか、タンパク分解酵素 、Ｄ　Ｅ　Ａ、　Ｅデキストラン、またはこれら双方の混合物を組合せることが 必要である。米国医師会が認可する２つのＡ型ロタウィルス修飾生菌ワクチン（ ｍｏｄｉｆｉｅｄ　１ｉｖｅ　ｖａｃｃｉｎｅｓ］　（肛■）がある。第１のワ クチンはノーデン［Ｎｏｒｄｅｎ’、研究所の開発に係るもので、ウシ用のＭＬ Ｖロタウィルスワクチンである。ウシロタウィルスワクチンはウシＡ型ロタウィ ルスの１本鎖でできている（ＮＣＤＶ）　（２７〜２９）。第２のものはアンピ コ社［Ａｍｂｉｃｏ　Ｉｎｃ、　］がブタ用に開発したもので、ブタＡ型ロタウ ィルスの２つの主要な血清型ててきている。アンピコ社のブタロタウィルスもＭ ＬＶワクチンで、その安全性および効用については既に報告されている通りであ る（１１．１２．２３．２４）。これらのワクチンは動物のロタウィルス性下痢 を抑制する手段として使用される。動物におけるロタウィルス感染を十分に抑制 するには受動、能動の両免疫かなければならない。ワクチンはダム［ｄａｍ］動 物（受動免疫）と乳母動物（能動免疫）の両者に使用されるであろう。Ａ型ロタ ウィルスを含むヒトのワクチンも開発されているか、まだ商業化までには至って いない（′ｉ４．２０）。Ａ型ロタウィルス抗原の診断用の診断試薬も販売され ている。

Ｂ型ロタウィルスを十分に増殖することについてはまだ報告されていない。ナカ タ（１５）は、グループＡのグループＢロタウィルスへの継代法を行ってみたか 失敗したことについて報告している。Ｃ型ロタウィルスは、細胞培養によって僅 かな倍数だけしか維持てきなかったことも報告されている（１６）。ロタウィル スの全ての型は形態上類似して見えるが、それぞれの型は異なる型に交差反応し ない独自の抗原成分をもっている。したかって動物およびヒトにＢ型ロタウィル スのワクチンを開発し、診断の助けとする必要性か明らかに存在するのである。

Ｂ型ロクウイルスを細胞培養て増殖するプロセスは、これら好ましい生成物の開 発につながるであろう。

発明の概７ 本発明はウィルスを活性化するＢ型ロタウィルス抗原液の処理法に基づくもので 、細胞培養でウィルスを生育させ維持することを実現するものである。ウィルス を細胞培養に適合するために、ウィルスはエチレンシアミン四酢酸（以下ｒＥＤ ＴＡＪ　３のようなキレ・−ト化剤で処理されなければならない。Ａ型およびＣ 型のごタクィルスの生育は、細胞培養におけるウィルスの複製を促進、否、むし ろ可能にするタンパク分解酵素の濃度に依存的であることが特徴である。ＥＤＴ Ａと組合せて、あるいは組合せずにタンパク分解酵素をＢ型ロタウィルス抗原の ために使用する実験は、ウィルス力価の−ｊ的な低減を示す。Ａ呈およびＣ型［ コタウｒルスの生育にＥＤＴＡを使用することは、外層膜［ｏｕｔｅｒ　５ｈｅ ｌｌ］を除去することによってウィルスを不感染なものとし、したがってこのプ ロセスはＢ型ロタウィルスの単離体に特別なもので、ウィルスのゲノムを変更す ることなく細胞培養で確実な生育と連続的な増殖を可能にする現時点における唯 一の方法である。

Ｂ型ロタウィルスの生育は、細胞培養に適合させたｌ＼型ロタウィルスの鎖につ き説明したものとは異なり、感染細胞培養におけ乙特殊な細胞変性効果（ＣＰＥ ）の生成に特徴かある。感染した細胞培養は感染の多核質様［５ｙｎｃｙｔｉａ ｌ−１ｉｋｅ］すなわちンノンチアのような病巣域ｒｆｏｃａｌ　３ｒｅａ］を 示すか、収穫液を評価すると、培養組織を特殊な間接免疫蛍光（ｒＦＡ）染色す ることにより、あるいはＲＮＡ抽出やポ１．゛アクリルアミ）・ゲ’Ｉ’Ｎ気詠 ＠ｔ；　（ＰＡＧＥ＞により、Ｂ型ロタ・ウィルスと確認される。；たがって、 ウィルスの特殊な細胞変性効果を観察できるように細胞培養でＢ型ロクウイルス を連続的に増殖することか本発明の目的である。このロタウィルスをその病原性 を薄めるのに十分なほどまで同一細胞または種々の異なる細胞中に継代させ、こ うして希薄化させたウィルスは適当な本土リヤで修飾生菌・ウィルスワクチンと 巳で役立たせることかできる。増殖したウィルスは治療（予防を含む）および診 断を目的とする利用上のウィルス抗原の源ともなり得る。

細胞培養継代させたＢ型ロタウィルス抗原のブタは免疫学的に応答し、ＩＦＡ、 血清中和［ｓｅｒｕｍ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ］およびＥＬＴＳＡ分析て測 定すると、抗Ｂ型ロタウィルス抗体を産生じている。ゲノムか異なる４つのブタ Ｂ型ロタウィルス単離体とか、中国起源のヒトＢ型ロタウィルス（ＡＤＲＶ株） 単離体とかの、Ｂ型ロタウィルスの幾つかの細胞株［５ｔｒａｉｎ］がこの方法 で増殖されている。ヒトＢ型ロタウィルス（ＡＤＲＶ）およびブタＢ型ロタウィ ルスに対する血清は、相互に交差反応（ＩＦＡ）することが知られているか、こ れはＢ型ロタウィルスの２細胞株間の関係を暗示するものである。さらにヒトＢ 型ロタウィルスに対する高度免疫血清はウシＢ型ロタウィルス、子ヒツジＢ型ロ タウィルスおよびラットＢ型ロタウィルスに交差反応することが報告されている （６．１５．２６）。したかりて本明細書中に記載の列中て、細胞培養調整した ブタＢ型ロタウィルスをヒトＢ型ロタウィルスの代替品として種々の目的に使用 できることが明らかである。したがって抗血清調整のための指示つ・イルス［１ ｎｄｉｃａｔｏｒ　ｖｉ、ｒｕｓ］として、あるいは診断キ・シト中の抗原源と して役立てることかできる。さらにこの細胞培養調整したブタＢ型ロタウィルス は、ブタ、ヒトその他の種のＢ型ロタウィルス抗原に対する生きたワクチンの候 補でもある。

ちらゆろ種類の動物（ならびにヒト）に適した診断テストに使用可能なり型ロタ ウィルス抗原を提供することも本発明の目的である。さらに、ブタ以外の動物お よびヒトをＢ型ロタウィルスの病気から予防するための免疫原として機能するワ クチンであるブタＢ型ロタウィルスに対するワクチンを提供することも本発明の 目的である。

図面の簡単な説明 図１は、ＲＮＡ抽出法およびＰＡＧＥ分析法（１８）によるブタＢ型ロタウィル ス単離体のウィルスのゲノム（「フィンガープリント」）である。ビルレント（ 腸由来の親）単離体および細胞培養適合（２５継代と５０継代）単離体の双方と も同一のフィンガープリントを示した。細胞培養継代はＭ　ａ　−１０４細胞を 使用した。

図２は細胞培養適合された４種のブタＢ型ロタウィルスのウィルスゲノムを示す 。

図３はＭａ−１０４細胞中のブタＢ型ロタウィルスの５０継代の免疫電子顕微鏡 写真（ＩＥＭ）で、細胞培養継代を通してウィルスはその抗原性Ｕａｒ＋ｔｉｇ ｅｎｉｃｉｔ）ｌを維持するこ吉を示している。

好ましい実施例の詳細な説明 本発明の上記目的ならびに利点を、以下に記載の例により具体的に述へる。

これまでロタウィルスのＢ型は、細胞培養ではうまく生育、継代できなかった。

細胞培養で作られるブタＢ型ロタウィルスは、病原性の少ないのでヒト細胞株［ ５ｔｒａｉｎ］に比し際だった利点をもつ。感染（−だ細胞培Ｉの間接免疫室光 染色の結果は、それら２株間の抗原間係を明確に示している。

本発明の実施には、ここに記載のものと同等な物質および方法を行うこともでき るが、より好まし°７Ａ選択につき以下に記載する。

ここにアンヒコＢ型株−１（以下ｒＡｍＢ−ＩＪ）と記す囃離体は、アイオワの 感染集団から単離したしのである。このＢ型ウィルスは、感染した５週齢の最近 離乳したばかりの下痢庁ブタの小腸抽出物から単離した。この単離体を遠心およ び濾過殺菌によって精製し、ブタＡ型ロタウィルスの２つの血清型に経口暴露し ておいた３０日齢のノドハイオートブタ中に経口接種した。これらのブタは、Ａ ｍＢ−１０タウイルスの経口接種前にＡ型ロタウィルス暴露から立ち直っていた 。それら動物を最初の下痢（接種後２日）で殺し、腸の全内容物を使って新しく 腸抽出物を調製した。ウィルス性の腸内容物をノドパイオートブタにさらに２回 継代させた（接種前に抗Ａ型の、および抗Ｃ型のロタウィルス血清でインキュベ ートして）。第４継代まてにＢ型ロタウィルスだけがノドパイオートブタ中に同 定された。その純度および同定は、（ａ）チャレンジして殺した動物（チャレン ジ後１８時間）の小腸セクションを特異的間接ＩＦＡ染色法、（ｂ）腸内容物の ＲＮＡ抽出法ＰＡＧＥで評価したウィルスのゲノムのプロフィル、（ｃ）腸内容 物の免疫電子顕微鏡法、で顕示させた。初乳を奪った帝王切開児（ＣＤＣＤ）ブ タに高度免疫血清を生成するため腸内容物を使ったとき純度はさらに高められ、 Ｂ型ロタウィルスに対する活性だけが高度免疫化後の血清中に検出された。

Ｂ型バルクウィルスの閉力［ｖｉｒｕｌｃｎｃｅ］が帝王切開し初乳を遮断した （ＣＤ　ＣＤ）ブタに顕示された。チャレンジされたブタは接種後２４時間以内 に水硬［ｗａｔｅｒｙ　ｄｉａｒｒｈｅａ］を示し、チャレンン後５〜７日間続 いた。チャレンジ後１８時間で殺したブタから採取した小腸セグメントは、小腸 細胞［ｓｌ！Ｉａｌｌ　１ｎｔｅｓｔｉｎａ１　ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅｓ］の融 解し萎縮した症状（絨毛萎縮）を示した。■ＦＡで染色した凍結セクションは、 腸内の十二指腸と空欄中に発生した優勢感染［ｐｒｅｄｏｍｉｎａｔｅｉｎｆｅ ｃｔｉｏｎコを伴う感染の病巣域（ンンンチウム様の）を示した。小腸内腔には 水様内容物が充満しておリチャレンシされた動物はチャレンジされなかった対照 動物に比し日平均重量増加の減少を示した。ブタの感染可能服用量（Ｐ　Ｉ　Ｄ ）　ｉｉ５〜７　［３間で１０３Ｐ　Ｉ　Ｄ　ｓｏ／　Ｉｌｌと判定された。

前述の・ペルクな腸液を細胞培養の生育開始物質として使用した。以下に記載の 方法および培地によって、次のウシ、ブタ、およびサルの細胞系かＢ型ロタウィ ルスの生育を支持することが発見された。すなわちウシ鼻介’ｉｊ４　（Ｂ　Ｔ 　［Ｅｏｖｉ：′１ｅ　ｔｕｒｂｉｎａｔｅ］）と胚ウシ腎臓（Ｅ　Ｂ　Ｋ　Ｅ Ｅｍｂｒｙｃｎｉｃ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｋｉｄｎｅｙｌ）　；ブタ精巣（Ｓ　Ｔ　 ［５ｗ１ｎｅ　Ｔｅ５ｔｉｃｕｌａｒコンおよびプライマＩノブタ腎１ｉ（ＰＫ ［Ｐｒ１ｎａｒｙ　Ｐｉ、；　Ｋｉｄｎｅｙｌ）とべｏ　［Ｖｅｒｏｌ　（アフ リカソゲリーン）、ＢＳＣ（アフリカングリーン）、ＣＶ−１（アフリカングリ ーンサル腎臓）、胚つシ肺（Ｅ　Ｂ　Ｌ　ＪＥＯｂｒ＞ｏｎｉｃ　Ｂｏｖｉｎｃ Ｌｕｎｇ］）、およびＭａ−１０＜（胚アカゲサル腎＠ＥＥａ山ｙｏｎｉｃ　Ｒ ｈｅｓｕ；　Ｋｉｄｎｅｙｌ）である。つ・ｒルスは浮遊培養および単層培養の いずれても増殖できる。これら以外の細胞系も使用し得る。選択した細胞系はＭ ａ−１０，４で、下記のウィルス増殖に関するデータは全てＭ　ａ　−１０４で 得たちのである５Ｍａ−４Ｑ・Ｓａ胞はオハイオ州農業研究開発所のＥｄ、　！ ３ｏｈｌ博士から入手した。Ｍ　ａ　−Ｉ　Ｃ４細胞はアイオワリ−・［立大学 のＰｒ汀Ｐａｕｌ博士、またはスタッフォード大学の［（ａｒｒｙ　Ｇｒｅｅｎ ｂｅｒｇ博士からも入手可能である。この細胞は多くの研究所で広く使われてい る。Ｍａ−１０４細胞系の次に最適な宿主はＥＢＫ細胞とＳＴ細胞てあった。

Ｂ型ロタウィルスを細胞培養に適合するに当たって、このつ・イルスはキレート 化剤、好ましくはＣａ″“イオンとＭｇ”イオンをキレート化するもの、より好 ましくはアミノカルボキシル酸（例えばＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡあるいは ペンシルＥＤ　Ｔ　Ａ、　）で処理しておかなければならないことか分かった。

通常、このキレート化剤の温間は、０．１ｍＭ〜１１００ＮＩ、好ましくは１〜 １０ｍＭである。このウィルスはこのキレート化剤で前処理するか、ウィルス吸 収後にその細胞を処理するが、前処理の方がより効果的である。キレート化剤の ウィルスに対する効果はその時点ては不明確であるが、ウィルス増で培地はカル シウムイオンまたはマグオンラムイオンで補助してみると、細胞培養に対するウ ィルスの感染成立能力［１ｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ］を低下させることが分かつｔ ＝。これはカルシウムまたはマグネシウムの低濃度な培地はキレート化剤の処理 と同様な効果をもたらすことを暗示している。またキレート化剤がウィルスのポ リメラーゼを活性化するのだということも考えられる。この場合は本発明はその ような効果を有するならその他のキレート化剤；をも包含するっさらに別の方法 として、ウィルスを活性化するためＳＤＳとかＴｗｅｅｎ　２ｆ：ｌのような界 面活性剤を使用することもできる。

カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンはＥＤＴＡおよびＥ　Ｇ　Ｔ　７〜 てキレート化されることに注意してほしい。ＥＧＴＡおよびＥ　Ｄ　Ｔ　Ａは等 しく効果的なようである。

Ｂ型ロタウィルスがこうしたキレート化剤の補助で細胞培養に一腐適合されてし まえば、そのキレート化剤から引き離してもよい。このような引き離りは突然に 行−】でもよいし、あるいはキし・−ト什剤の濃度を徐々に低下させてい−〕で 行ってもよい。

引き離しを突然行うときは、１０継代より前てないことが好ましく、２０継代後 にするのが好ましい。引き離し後もそれは特徴的な細胞変性効果およびグループ アクティヒテノを出し続ける。

張合血清型ロタウィルス感染が実際には一般的である（：ρ）。

Ｂ型ロタウィルスを生育させ、同ウィルスを継代させるため、キレート・化剤で ビルレントサ〉プルを処理することによって、キレート化剤がＡ型ロタウィルス およびＣ型ロタウィルスを不感染なものにするので、Ｂ型ウィルスをＡ型ウィル スおよびＣ型ウィルスから精製することが間接的にできる。

Ｂ型ロタウィルスの幾つがの株が、本発明の方法で首尾よく細胞培養されている ７ 本発明に従って調製したＢ型フタウィルスの効果的な量を使い、薬学的に許容さ れたキャリヤと結合することでワクチンを調製できる、そのワクチンの提案され た投与のタイプに従い、キャリヤは経コ、筋肉注射、その他のワクチン投与従来 技術に適合するものであれば３よい。修飾生菌ウィルスワクチンの場合には、ウ ィルスは凍結乾燥し、スクロース、セラチー・、およびペプトンで安定化させる のがよい。死菌ウィルス（または抗原フラクション）ワクチンの場合、好ましい 上ヤリャはフロイントの完全または不完全アシドくント、スクアラン、水酸化ア ルミニウム水である。さらに本発明に従いＩ生される８型ロクウイルス；ま、Ａ 型ロタウィルス、伝染性胃腸炎、Ｃ局ｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐ＝ｒｆｒｉｒ＋ｇｅ ｎｓｃ型、およびＥｓ口ｔｏ＝ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉなとのこれまである多価 ワクチン製剤を単独、もし、くけそれらを複数適当に組合せて共に用いることが できる。

本発明に従い謝製されたＢ型ロタウィルス抗原はＢ型ロタウ・ｒルス感染を診断 するだめの診断テストに使用することもてきる。こうした免疫学的反応の型は当 業苦に周知で、ｔＡ、ＥＬｒＳＡ、免疫蛍光、イム７１アグルテイネーンヨン［ ｉｎＩ！ｉｕｎｏａｇｇ１ｕｔｉｎａｔｉｏｎ３なとがある。

元のままの、あるいは精製したＢ型ロタウィルス抗原は、抗体含有液の産生ある いはＢ型ロタウィルス感受性生物に対する予防接種における免疫原則として、ま たはＢ型ロタウィルス特異性抗体の精製におけるイムノソルベント［ｉｎＩ［１ ｕｎｏｓｏｒｂｅｏｔ］として使用することもできる。これら多クローン性抗体 または単クローン性抗体を、こんとは予防接種による免疫応答誘発の代替体とし て、あるいはその誘発の追加体として治療法的に使用することかできる。同抗体 は免疫血清または乳の形、あるいはもっと精製した形で投与する。抗体はまた、 診断薬としての使用に備えて標識したり不溶化したりする。

Ｂ型ロタウィルス粒子は宿主細胞の生育を支持する培養基から得ることかできる か、その宿主細胞を、例えば凍結・解凍反復とか音波処理することによって溶解 すれば、収率を向上させることかでる。次にそのウィルス液を、例えば２．００ ０〜６．０００　Ｘｇて遠心して、細胞破片から精製する。さらにウィルスは、 例えば１００．０００　Ｘ　ｇて２０％スクロースクッション中で高速遠心機に かけ生理的食塩水中で再！１ｉ！！濁してさらに精製してもよい。得られた抗原 調整品を診断的に使用するため標識するとか不溶化する。

あるいはこの調整品を、例えばケル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、レクチ ン親和性クロマトグラフィ、逆相ＨＰＬＣなとて要素たる抗原断片や抗原分子に クロマトグラフィで分解（７てもよい。

例Ｉ Ｍ　ａ、　−１０４細胞系におけるウィルス増殖と連続継代ウィルスの増殖に使 う培地は、非必須アミノ酸とＥａｒｌｅｓ　ＢＢＳ中の０．１Ｍソディアムビル ベートｌ：ｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅｌ、ＮａＨＣＯ２て７．２にｐＨ調 整したしグルタミンのイーグル最小必須培地である。基礎培地を使用する直前に 、０．２ＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤、　１０　ｍＭ　１−グルタミン、０．０５　μ ｇ／ｌ＋ｌ　Ｄ　Ｅ　Ａ、　Ｅデキストラン、５０　ｕｇ／’ｍｌケンタマイシ ンを補給し、ＩＯＮ　ＮａＯＨてｐＩ（を７゜０〜７．２に謝整する。ウィルス 吸収中のＤＥＡＥデキスト・ランは病巣域の数を増加させ、それによってウィル スの感染成立能力［１ｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ］を向上させることが発見された。

血清（２％）も同様に膏益であることか分かった。もっともその存在はＡ型ロタ ウィルスの増殖を阻害することになる。Ｌグルタミンとピルベートも同様に病巣 数を増加させた。細胞培養を１〜３回洗浄し、接種する前に３０〜６０分間、３ ７°Ｃでインキュベートする。ウィルス増殖に使用した細胞培養容器は、４８ウ エルのマイクロ力価プレート、組織培養管、レイトン培養管、３２オンス瓶、お よび６４０　ｃｍ２の回転瓶である。回転培養［ｒｏｌｌｉｎｇ］がウィルス産 生に最も効果的な方法であることが分かったが、回転培養でなくてはならないも のでもなく静置培養でもつ・ｒルスを生育させることができた。

接種用のウィルス液は１〜１０　ｘｌｌ’Ｌｔのキレート化剤（例えばＥＤＴＡ またはＥ　Ｇ　Ｔ　Ａ　）て３７°Ｃて５〜１５分間、前処理する。その溶液を 細胞接種前に希釈してもよい。洗浄培地［ｒｉｎｓｅ　ｍｅｄｉｕｍ］を除去し 培養組織［ｃｕＨｕｒｅｓ］を前処理したＢ型ロタウィルスで接種し、３７〜３ ９°Ｃて１〜２時間インキュベートする。接種物を洗浄し新たなウィルス増殖培 地を加える。その培養組織を３７〜３９°Ｃて１〜７日間（回転または静置）イ ンキュベートする。独特な細胞変性効果が接種後わずか１８時間で観察された（ 図２）。感染細胞はシンシチウムのような感染の病巣域を現出した。シンシチウ かを分化し［ｐｒｏｇｒｅｓｓ］単一層中に穴を残して離れた［ｄｅｔａｃｈｌ 。感染病巣域は感染した単一層の特異的ＩＦＡ染色法てＢ型ロタウィルスと判定 された。

収穫時には残りの付着している細胞を、激しく振ったり、機械的に掻き出したり 、連続的に凍結・解凍したりして除去する。

此の際、細胞破片を濃縮することもできるしく遠心または濾過で）そのまま使用 することもてぎる。収穫物は破片を粉砕するため音波処理し、それからウィルス をＥＤＴＡで前処理して新たな細胞培養に上記したように次継代させる。音波処 理か感染細胞を粉砕するのに好ましい方法であるか、ホモジネートするとかＫＣ Ｉの使用などもある。新たに接種した細胞培養は再び３７〜３９°Ｃで１〜７日 間インキュベートされ前と同様に収穫される。この細胞培養の接種、インキュベ ート、および収穫は５０回継続する。ウィルスＲＮＡゲノムが、親（ビルレント ）株として細胞培養の継代を通してその元のまま残った。

ＡｍＢ−１／Ｍａ−１約１０５−６１を子／ｍｌ　＋　＋ＡｍＢ−１／Ｍａ−１ ２　約１０３−４粒子／１１ＡｍＢ−１／Ｍａ−２５　約１．Ｑ３−４粒子／ｚ ｌ　＋　＋ＡｍＢ−１／Ｍａ−４０　約１０’−５粒子／ｍｌＡｍ２−１／Ｍａ −５０　約１０ドア粒子／ｍｌ　＋　＋＠１．ＴＦＡ　間接免疫蛍光染色法 ２、ＧＥ：ＲＮＡ抽出法ＰＡＧＥ評価、ｒ７タウイルスフインガプリント分析 ＥＤＴＡの重要性ニツイては、ＥＤＴＡと共にＭａ−１０４中で４９回継代した Ｂ型ロタウィルス（即ち、細胞培養に使われたウィルス）かＥＤＴＡなして継代 されたという別の実験で示されている。’ｌＥＢＭ代まで、殆ともしくは全くＮ 胞変性効果はなかった。無ＥＤＴＡ培養では細胞変性効果のロス前に腸の（不適 合）Ｂ型ロタウィルスを３継代しか作ることができなかった。

例２ Ｍ　ａ　−１０４細胞系での異なる４つのブタＢ型ロタウィルス単離体の増殖 ブタＢ型ロタウィルスの４つの単離体がＲＮＡゲノムプロフィルによって異なる ものであると判定された。これら単離体の３つはアイオワからのもので、そのう ち２つは下痢症の４〜５週齢の乳離れ直後のブタから単離し、１つは下痢症の２ 日齢乳幼ブタから単離した。４つめの単離体はインディアナから受けたもので、 下痢症の４〜５週齢乳離れ直後ブタからのものである。

これら単離体を例１て記載した技術を使ってＭａ−１０４細胞培養中で増殖した 。

４つの単離体の２つは、ロタウィルスＡ型およびＢ型の株［５ｔｒａｉｎ］の混 合体であった。Ｍ　ａ　−１０４中で２継代させた後、その継代ウィルスは純粋 なり型であること、即ちＡ型ロタウィルスは除去されていること、か判定された 。

第１０継代の細胞培養をＲＮＡ抽出法ＰＡＧＥで評価すると、単離体全部かＢ型 コタウィルスに対し独特なウィルスケツムフィンガプリントを維持するものであ ることか示された。これら第１０継代の単離体は全部、感染細胞培養の特異性Ｉ ＦＡ染色法で純粋Ｂ型ロタウィルスであることが判定された。

例３ Ｍ　ａ　−１０４細胞系中でのヒトＢ型ロタウィルス株（ＡＤＲＶ）の増殖 ヒトＢ型ロタウィルスのＡＤＲＶ株で感染している別々の志願者（被験体＃１、 ＃３）から得た２つの排泄物サンプルを、例１て述へた技術を使ってＭａ−１０ ４中で評価した。回転層の３つのグループを１クループにつき４瓶づつ接種し、 ２つの接種していない対照瓶を入れた。最初の２グループを第１セントは濾過殺 菌していない接種物を使って、第２セントは０．２ミクロンの濾過殺菌接種物を 使って、被験体＃１排泄物で接種した。最終グループは被験体＃３の濾過殺菌し ていない排泄物で接種した。吸収後、接種物を３回洗浄し、新しいウィルス増殖 培地を加え、瓶は３７℃で０．２５　ｒｐｍの回転棚に置いた。

接種後１８時間で、Ｂ型ロタウィルスの典型的な細胞変性効果か見られ、接種後 ２４時間までにシンシチウムか分化し離れた。濾過殺菌されたグループですら典 型的なシンシチウム様の細胞変性効果形成を現出したことに留意されたい。これ は細胞培養を感染するのはウィルス集塊［ｖｉｒｕｓ　ａｇｇｒｅｇａｔｅ］で はないことを示している。ヒトＢ型ロタウィルスを、最初から細胞培養によって 生育させようとする従来の試みは全て失敗してしている。

例４ 診断キット 本発明の診断アッセイは特定のアッセイフォーマットに限定されるものではない 。蛍光イムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、粒子（例 、ラテックス）凝集アッセイなどが使用可能である。それらアッセイは競合フォ ーマットまたはサンドイッチフォーマットで、また標識抗抗体の代わりに標識抗 原を使用してもよい。ＥｒＡにとって好ましい標識は、アルカリホスファターゼ 、西洋ワサビのベルオキシダーゼである。ＲＩＡの場合、好ましい標識は■１２ ５である。免疫試Ｘ　’、ｉｒｎ＋＋＋ｕｎｏｒｅａｇｅｎｔＪに標識種（また は支持体）を結合するためにアビジン・ヒオチン複合体を使用してもよい。Ｂ型 抗原に対して生起した多クローン性または単クローン性の抗体を、標識後または 不溶化後に、診断試薬として使用することもてきる。

診断キットは本発明により調製した抗原または抗体から、それら抗原や抗体を適 当な希釈剤を入れた適当な容器中でパッケージすることにより作る。

特異性ＩＦＡおよびＥＬＩＳＡアッセイで評価すれば、ヒトＢ型ロタウィルスに 対する抗血清はブタＢ型ロタウィルスに交差反応し、ブタＢ型抗血清はヒトＢ型 ロタウィルスと交差反応するであろう。さらに公表結果は、ヒトＢ型ロタウィル スがラン、ラット、および子ヒツジのＢ型ロタウィルスと交差反応するだろうこ とを示している（６．８．１５．２６）。ヒトＢ型抗血清の源を評価した。高度 免疫血清はスタッフォード大学、退役軍人病院のＨａｒｒｙ　Ｇｒｅｅｎｂｕｒ ｇ博士から入手することができた。ギニャブタおよびウサギで血清を調製した。

集密Ｍ　ａ　−１０４細胞のレイトン管をＡｍＢ−１／Ｍａ−１０４の継代２５ で例１に記載の通り接種した。

スライドを接種後２４時間目に検査した所、典型的な細胞変性効果が認められた 。スライドはアセトンに固定し、希釈度を異にしたヒトＢ型抗血清を使って間接 免疫蛍光法で染色した。

抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣおよび抗ギニャブタ１ｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｅｓ研 究所）を抱合体として使用した。特異性Ｂ型宙光か１／１０希釈度のもの、およ び１／１．００希釈度のものに観察されたか、１／１０００のものには観察され なかった。

抗原キャプチャＥＬｒＳＡを、ヤギおよびギニャブタで調製したＢ型ロタウィル スに対する抗血清を使って評価した。例１て記載したと同様にＭａ−１０４細胞 中に増殖させたＢ型ロタウィルスのバルク液を抗血清産生用の免疫剤として使用 した。

このウィルス液を３回凍結・解凍させ、細胞破片を１０．０００　Ｘ　ｇで３０ 分間遠心して取り除いた。このウィルスをさらにスクロース勾配を通して超遠心 （１００，０００ｘ　ｇで２時間）して精製した。

ウィルスを収集し殺菌水中で再懸濁した。余分なスクロースを取り除くため、ウ ィルスを上記と同様に再度超遠心機にかけ、今度はウィルスのペレットを殺菌水 中で再懸濁した。

動物を６週間に亙って第１週、第３週、第５週にフロイントの完全アジュバント 中にアジュバントしたウィルスを注射して高度免疫させた。

Ｂ型ロタウィルスに対する抗血清力価を、抗ギニャブタＩｇＧベルオキシダーセ 抱合体または抗ヤギＩｇＧペルオキシダーゼ抱合体およびＡＢＴＳ基質を使って 上記精！！！！Ｂ型ロタウィルス抗原に対するＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａブロック滴定 によって決定した。

Ｂ型ロタウィルス検出に使ったアッセイは、マイクロ力価プレートにヤギ抗日型 ロタウィルスの所望希釈液を塗布し４℃で一晩インキユベートするサンドイッチ ＥＬｒＳＡである。そのプレートを生理的食塩水で洗浄し非結合部位を２％ウシ 胎児血清でふさいだ。プレートを生理的食塩水で洗浄した後、例１て記載したよ うに作ったＢ型ロタウィルスのバルク液の４倍希釈液（生理的食塩水中で）で接 種した。各プレートの最後の列は対照としてＡ型ロタウィルスの４倍希釈液で接 種した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを生理的食塩水で洗浄し Ｂ型ギニャブタの抗血清を加えた。室温で１時間インキュベートした後、プレー トを生理的食塩水で洗浄し、ウサギ抗ギニャブタ西洋ワサビペルオキシダーセを ウェル全部に加えた。室温で１時間インキュベートした後、プレートを生理的食 塩水で洗浄し、ＡＢＴＳ基質を各ウェルに加えた。暗室中に室温で１時間インキ ュベートした後、プレートを４１ＯｎＩｌ＋フィルターのＥＬｔＳＡ読取器で読 んだ。特異的色彩反応≧０．１光学密度ユニットの試料でポジティブな読みを決 定した。

細胞培養経由のブタＢ型ロタウィルスは、ヒトＢ型血清に対するＥＬＩＳＡ中の 抗原源として使われるとき、ピルレフトヒトＢ型ロタウィルスに同等であること が見いだされた。このことは細胞培養で得たＢ型ロタウィルスがピルレフトヒト Ｂ型ロタウィルスと交差反応することを示している。こうしてここに記載の獲得 ブタＢ型はヒトおよびヒト以外の種々の哺乳類動物の診断キットとして使用する ため抗原および抗血清の調製に使用することができる。

例５ 組織培養で得たＢ型ロタウィルスの 修飾生菌ワクチンとしての評価 得られたブタＢ型ロタウィルスか、上記技術による細胞培養！ｆｌ織中に５０継 代を経てもその免疫原性を維持するがとうがを判定するために動物ワクチン研究 を行った。５日齢のブタ６頭を得られたブタＢ型ロタウィルスの細胞培養継代レ ベルの差異の評価に使った。２頭を対照としワクチン接種を行わず、２頭はＢ型 ロタウィルスＭａ−１０４の継代２５で接種し、２頭はＢ型ロタウィルスＭａ− １０４の継代５０て接種した。ＡｍＢ−１／Ｍａ−２５ワクチンの力価は約１０ ５−’ＴＣＩ　Ｄ　５０／ブタであった。ＡｒｎＢ−１／Ｍａ−５０ワクチンの 力価は約１０６−”ＴＣＩＤ５０／ブタであった。筋肉内注射がフロイントの不 完全アジュバントされて１回の経口投与および１回の筋肉内注射しか与えられな かった。ワクチン接種後３週間目、全動物にビルレントＢ型ロタウィルスをチャ レンジした。ワクチン接種時、チャレンジ時（つまり接種後３週間目）、チャレ ンジ後３週開目に、各々血液サンプルを集めた。Ｂ型ロタウィルスに対する血清 抗体レベルを、感染させた細胞培養組織のスライド上の血清を滴定することによ って決定する。簡単に言えば、血清希釈液を作り、それを感染させたスライド上 に接種し、これらスライドを洗浄してからウサギ抗ブタＩｇＧ　ＦＩＴＣ抱合体 で染色する。スライドを特異性蛍光につき観察し、血清力価をプラス反応を読ま せる最高度の希釈度のりシプロカル［ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ］として記録した。

データを表１に示す。

表１　細胞培養で得たブタＢ型ロタウィルスに対する血清の抗体応答 動物　処　理　Ｂ型ロタウィルス血清抗体力価■１番号　チャレンツ日■２　チ ャレンジ後３週開目１−Ｉ　Ｂ型ロタウィルス／Ｍａ−２５＜５　＜５　４００ １−２　Ｂ型ロタウィルス／Ｍａ−２５＜５　＜５　１００２−Ｉ　Ｂ型ロタウ ィルス／Ｍａ−５０＜　５　１００　４．００２−２　Ｂ型ロタウィルス／Ｍａ −５０＜　５　１００　４００３−１　ワクチン非接種　＜５＜５８０３−２　 ワクチン非接種　＜５　＜５　４０■１　力価　力価はプラスのＩＦＡ力価を引 き出した最高希釈間のリシプロカルとして表しである。

■２　ワクチン接種後３週間目 Ｂ型ロタウィルスの低継代を接種された動物たちはワクチン接種後の血清変化を 示さなかったが、チャレンジ後のＢ型抗体しベルはＢ型ロタウィルス継代の第５ ０代第２５代のレベルに同じなので、少なくとも最初は準備されたことか明らか である。

両ワクチン接種群の抗体レベルは、非接種のチャレンジ対照抗体レベルより少な くとも５倍大きかった。動物番号］−２と１−１の相対的に低い力価は、Ａｍ、 Ｂ　−１／Ｍ　ａ　−２５ワクチンかＡｍＢ　−１／　Ｍ　ａ　−５０ワクチン より約１０倍少ないウィルスを接種されているという事実によるものと考えられ る。

動物たちは日に２回、ロタウィルス感染の臨床徴候にっき観察された。動物たち はいずれもワクチン接種後は何らの臨床徴候を示さす、したかってＢ型組織培養 の継代物質が安全なことを示している。データはウィルスか病気に関連する国力 を規定する因子ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｆａｃｔｏｒ］なしに免疫応答を示すよう に修飾されていることを示唆している。さらにチャレンジ後の臨床徴候は、接種 動物か非接種対照動物より相対的に低い罹患率であることである（表２）。罹患 率と耐久時間［Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ　Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｄｕｒａｔ ｉｏｎ；　（Ｍ　ｒ　Ｄ）は、全ブタ延日数に対する下痢症状ブタの延日数とし て規定している。

表２　チャレンジ後の臨床徴候 クループ　ＭＩＤ　非接種動物と比較しての低下率非接種ブタ　１２／１４．（ ８６％〕 Ｂ型／１１ａ−２５　９／　１４　（６４％）　２６％Ｂ型／Ｍａ−５０　０／ 　１４．　（０％）　１００％上記のデータは本発明方法による細胞培養組織へ のＢ型ロタウィルスの適用かそのウィルスの抗原性に阻害的でなく、本発明法に より細胞培養で増殖したウィルスは有毒なり型ロタウィルス感染に対する有効な ワクチン（修飾生菌または死菌）たり得る。上記技術による細胞培養での継代は 、その免疫原性を変えることなくＢ型ロタウィルスの閉力を減殺ないし除去する 。

例６ ＥＤＴＡからのウィルスの引き離し ウィルス液か前処理され、またはＥＤＴＡを補給される反復継代後、Ｂ型ロタウ ィルスは成長に永続的な阻害を及ぼすことなくＥＤＴＡから引き離すことかでき ることを発見した。以下の実験で、ウィルスのＥＤＴＡからの引離効果は第２２ 代の継代て起こると考えた。

継代　ＥＤＴＡ維持　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ引き離し２２　１０’ＴＣＩ　Ｄｉ。、／ ｍｌ　１０　’ＴＣＩ　Ｄｓｎ／ｍ１３５　１０’　１０’ 継代は約２日をおいて行われた。

このデータから、第５０代の継代まてにウィルスはＥＤＴＡ引き離しのショック から完全に立ち直ることか明らかである。

実施例について上Ｓ己したことは本発明の一般的内容について十分に開示してい るので、現時点の技術を適用することによって本発明概念から離れることなく上 記実施例の応用を容易に行ったり採用したりすることができるであろう。したか ってかかる採用や応用は本発明で開示した実施例の均等物の範囲内のものと考え られるへきものである。

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Ｃ，、Ｙｏｌｋｅｎ、　Ｒ，Ｈ，１９８４ロタウィルス様試薬によって引き起こ される乳幼児ラットの感染性下痢、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５２：　９４−９８２ ３、　Ｗｅｌｔｅｒ、　Ｍ、Ｗ、、　Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、　Ｇ、Ｒ，、及び Ｗｅｌｔｅｒ、　Ｃ，Ｊ。

１９８６　２つの主要なＡ型血請型に対する組合せブタロタウィルスワクチン。

Ａｇｒｉ、　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　５ｗ１ｎｅ　ＩＩＩＩｍｕｎｏｌｏｇｙ　７： ５９−６２２４、　Ｗｅｌｔｅｒ、　ｉＷ、、　Ｗｅｌｔｅｒ、　Ｃ，Ｊ、１９ ９０　帝王切開で取り出した初乳遮断ブタにおける死菌・修飾生菌ブタロタウィ ルスワクチンの評価。Ｖｅｔ　Ｍｉｃｒｏ、　２２：　１７９−１８６２５、Ｗ ｏｏｄｅ、Ｇ、Ｎ、、Ｂｒｉｄｇｅｒ、Ｊ、Ｃ，、Ｅ！ａｌｌ、Ｇ、Ａ、、Ｊｏ ｎｅｓ、Ｊ、Ｍ。

とＪａｃｋｓｏｎ、　Ｇ、　１９７６　レオウィルス様試薬（ロタウィルス）の 子ブタの急性胃腸炎からの単離。Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　９： ２０２６、　Ｙｏｌｋｅｎ、　Ｒ，、ｆｅｅ、　Ｓ、、　Ｅｉｄｅｎ、　Ｊ、　 Ｋｉｎｎｅｙ、　Ｊ、、　Ｖｏｎｄｅｒｆｅｃｈｔ、　Ｓ、　１，９８８．単ク ローン性抗体に認識されたグループＢロタウィルスのグループ応答エピトープの 同定ならびにウィルス特性記述のための精確イムノアッセイ開発のための応用。

Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒ、　２６（９）：　１８５３−１８５８２７　米国 特許３．８３８．００４、Ｍｅｂｕｓ　ａｎｄ　Ｔｗｉｅｂａｕｓ、　９−２４ −７４゜子ウシの下痢ウィルスワクチンと処方。

２８、米国特許３，３３９，５５５．Ｍｅｂｕｓ　ａｎｄ　Ｔｗｉｅｈａｕｓ、 　１０−１−７４．子ウシの下痢ウィルスワクチンと処方。

２９、米国特許３．８６９．５４７、Ｍｅｂｕｓら、３−４−７５、子ウシ下痢 ウィルスワクチンと処方。

３０、米国特許４．７５１．．０８０．　Ｗｙａｔｔら、６−１４−８８、ロタ ウィルス症に対するワクチン。

３１、　Ｐｅｄｌｅｙ、　Ｓ、　Ｂｒｉｄｇｅｒ、　Ｊ、Ｃ，、Ｂｒｏｗｒ＋、 　Ｊ＞Ｆ＞、　ＭｃＣｒａｅ、　ＬＡ。

１９８３、明白なりループ抗原をもったロタウィルスの分子特性。

Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ。、　６４：　２０９３−２１０１−−ロ　− −ｄ　彎　ｅｍ　ト曽　−− 抗体と反応した第５０継代細胞培養 ＡｍＢ−１（Ｂ型ロタウィルス） の電子顕微鏡写真 第３図 国際調査報告 ＧｒｏｕｐＶ、ｃｌｓｆｍｓ２３．２４．ａｎｄ２５．ｄｒａｗｎヒ０ａｖｉｒ ｕｓ、Ｑｊソニーニジ至、ｃｌａｇａｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｃｌａｓｓ　４３５． ５ｕｂｃｌａｓｓ　２３５．ｆｏｒ　ｅｘａｍｐｌｅＧｒｔ）ｕｐＶｌ、＋：１ ｄｉｎ＋２Ｆ１．ｄｒａｗｎｔ二ｏｓｖａｃｃｉｎｅＣｕｎ１ｐｒｉｓｉｎｇｊ ｈｅｗｈｏｌｅｚ４ｒｕ！１．ｃｌａｓｓｉｒｉｅｄ　ｉｎ　ｃｌａｓｓ　４２ ４．５ｕｂｃｌａｓｓ　９３．ｆｏｒ　ｅ＼ａｍｐｌｅ。

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞の成育を支持するものであってＢ型ロタウイルスが感受性なタンパク分 解酵素を本質的にもたない培地を供給されている細胞であって、Ｂ型ロタウイル スの生育を支持することができるものの中においてＢ型ロタウイルスを継代させ ることを特徴とする細胞培養組織におけるＢ型ロタウイルスの継続的生育適合方 法。
2. ２．培地中のＣａ＋＋濃度が０．６ｍｇ／ｍｌ以下、培地中のＭｇ＋＋濃度が０ ．４ｍｇ／ｍｌ以下である請求項１の方法。
3. ３．少なくとも１継代につき、ウイルス液を細胞培養組織への接種に先立ちキレ ート化剤で処理している請求項１の方法。
4. ４．少なくとも１継代につき、ウイルス感染細胞をキレート化剤で処理している 請求項１の方法。
5. ５．キレート化剤がＥＤＴＡまたはＥＧＴＡである請求項３または請求項４の方 法。
6. ６．培地が界面活性剤も含有している請求項１の方法。
7. ７．界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである請求項６の方法。
8. ８．細胞がウシ、ブタ、およびサルの細胞群から選択されたものである請求項３ または請求項４の方法。
9. ９．細胞が、ウシ鼻介骨、胚ウシ腎臓、ブタ精巣、初代ブタ腎臓、Ｖｅｒｏ，Ｂ ＳＣ，ＣＶ−１，Ｅ８Ｌおよび胚アカゲザルの細胞群から選択されたものである 請求項３または請求項４の方法。
10. １０．細胞がＭａ−１０４細胞である請求項３または請求項４の方法。
11. １１．ロタウイルスが少なくとも９継代に亙って増殖されたものである請求項３ または請求項４の方法。
12. １２．請求項１の方法による細胞培養で増殖させたＢ型ロタウイルスから作った ワクチンをヒトまたは動物に投与することを特徴とするＢ型ロタウイルス由来の 感染ヒトまたは動物の免疫感作方法または処理方法。
13. １３．請求項１の方法に従い細胞培養に適合させたＢ型ロタウイルスのウイルス 粒子で試料をインキュベートすることを特徴とし、該試料中の抗体が上記ウイル ス粒子の少なくともいくつかと結合し、それでそのウイルス粒子に結合した抗体 の存在を検出する、試料中のＢ型ロタウイルスに対する抗体の検出方法。
14. １４．抗体はヒト抗体であって、増殖させられたＢ型ロタウイルスはブタ源から 得たものである請求項１３の方法。
15. １５．結合した抗体は、その結合抗体を抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣでインキュベー トすることにより検出する請求項１４の方法。
16. １６．抗体は自らが結合するウイルス粒子を中和し、中和されたウイルス粒子な らびにそれらと結合した抗体は、それらウイルス粒子をＭａ−１０４細胞に暴露 することで検出し、また該細胞の感染状態を非結合のウイルス粒子で検出する請 求項１３の方法。
17. １７．請求項１の方法に従った細胞培養にＢ型ロタウイルスを適合し、宿主細胞 を溶解し、そしてその溶解液からウイルス抗原を少なくとも部分的に精製するこ とによって得たＢ型ロタウイルス抗原の１または２以上のものからなる抗原試薬 であって、そのＢ型ロタウイルス抗原を標識するか安定化した状態で存在させて いることを特徴とするもの。
18. １８．請求項１の方法に従った細胞培養にＢ型ロタウイルスを適合し、その宿主 細胞と薬学的に受容できるキャリヤとを溶解することを特徴とする工程を経て得 たＢ型ロタウイルス抗原の１または２以上のものからなる免疫原性組成物であっ て、該組成物は免疫適格物質中に抗体を産生することができ、これら産生された 抗体は免疫学的にＢ型ロタウイルスと交差反応するもの。
19. １９．請求項１８の免疫原性組成物を投与することを特徴とするヒトまたは動物 の免疫感作方法。
20. ２０．Ｂ型ロタウイルスに対して生成した抗体、またはＢ型ロタウイルスから作 った抗原調製品に対して生成した抗体からなる組成物であって、ロタウイルスが 請求項１の方法に従った細胞培養に適合されたもの。
21. ２１．請求項３または請求項４の方法による細胞培養にＢ型ロタウイルスを適合 させた後、該ウイルスをキレート化剤から引き離すことを特徴とする細胞培養中 にＢ型ロタウイルスを調製する方法。
22. ２２．Ｂ型ロタウイルスをキレート化剤に暴露させた状態で少なくとも約２０継 代後、そのキレート化剤からＢ型ロタウイルスを引き離すことを特徴とする請求 項２１の方法。
23. ２３．細胞培養適合のＢ型ロタウイルス。
24. ２４．請求項１〜１１の方法により細胞培養に適合されたＢ型ロタウイルス。
25. ２５．請求項３または請求項４の方法で細胞培養に適合され、キレート化剤から 引き離された細胞培養適合のＢ型ロタウイルス。
26. ２６．請求項２３〜２５に従い細胞培養適合したＢ型ロタウイルスと両立可能な 免疫学的キャリヤとからなるワクチン。
27. ２７．Ｂ型ロタウイルスの実質的に抗原全部を有する請求項１８の免疫原性組成 物。
28. ２８．請求項１８の免疫原性組成物に対して産生される多クローン性抗体または 単クローン性抗体。