ES2343201T3 - Vacunas contra el srrp. - Google Patents
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Abstract
Vacuna contra el Síndrome Reproductor y Respiratorio Porcino (SRRP), que comprende el virus de SRRP vivo, caracterizada porque contiene una o varias de las cepas del virus de SRRP que se han depositado el 27 de octubre de 2004 en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Gran Bretaña, con los números de entrada ECACC 04102703, ECACC 04102702 y ECACC 04102704, opcionalmente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, pero no la cepa depositada con el número de entrada ECACC 04102701.
Description
Vacunas contra el SRRP.
La presente invención pertenece al campo de las
vacunas contra enfermedades infecciosas. Más particularmente, se
refiere a vacunas contra el Síndrome Reproductor y Respiratorio
Porcino (SRRP), una enfermedad vírica que afecta a los cerdos.
El Virus del Síndrome Reproductor y Respiratorio
Porcino (VSRRP) es un virus de ARNss de cadena (+) que pertenece a
la familia Arteriviridae. El virus existe en forma de dos genotipos
denominados tipo "US" y tipo "EU" que comparten
aproximadamente el 50% de homología de secuencia (Dea S y col.
(2000). Arch Virol 145:659-88), y que se pueden
distinguir por sus propiedades inmunológicas. La mayor parte de la
información de la secuenciación de diversos materiales aislados se
basa en las proteínas estructurales, es decir, la proteína de la
envoltura GP5 que justifica sólo \sim 4% del genoma vírico,
mientras que se conoce sólo poco de las proteínas no estructurales
(nsp, del inglés "non-structural
proteins").
La proteína nsp2 tiene 1078 aminoácidos en el
Virus Lelystad (VL), prototipo del tipo EU y sólo comparte 32% de
homología con VSRRP-US (Allende R y col. (1999). J
Gen Virol 80:307-15). Induce anticuerpos séricos
durante la infección natural (Oleksiewicz MB y col. (2001a). J
Virol 75:3277-90, Oleksiewicz MB y col. (2001b). Vet
Microbiol 81:109-25), parece tener un papel crucial
en la replicación vírica (Snijder EJ y col. (2001). J Gen Virol
82:985-94, van der Meer Y y col. (1998). J Virol
72:6689-98) y se cree que tiene funciones
específicas de la especie (de Vries AAF y col. (1997). Seminars in
Virology 8:33-47). La secuencia de nucleótidos que
codifica la secuencia de aminoácidos de nsp2 está representada en
SEQ ID NO: 2. Variaciones en la longitud de la región codificadora
de nsp2 sólo se han descrito hasta la fecha para un material aislado
de tipo US (Shen S y col. (2000). Arch Virol
145:871-83) y para las cepas de tipo EU encontradas
en US (Fang Y y col. Virus Res. 2004 Mar
15;100(2):229-35, Ropp SL y col. J Virol.
Abril 2004;78(7):3684-703).
El aislamiento de VSRRP y la preparación de
vacunas se han descrito en diversas publicaciones (documentos WO
92/21375, WO 93/06211, WO 93/03760, WO 93/07898, WO 96/36356, EP 0
676 467, EP 0 732 340, EP 0 835 930). El documento WO 96/36356
describe una vacuna viva y atenuada contra PRRS. Allende R y col.
(2000), Arch Virol 145:1149-1161 compararon la
secuencia genómica de una vacuna atenuada contra PRRSV con la de su
parental VR-2332 y con la cepa patógena 16244B, e
identificaron nueve cambios de aminoácidos. Shen y col. (2000),
Arch Virol 145:871-883 determinaron la secuencia de
nucleótidos de una cepa de vacuna contra SRRP e identificaron un
gen Nsp2 con una única inserción. Fang y col. (2004), Virus Res.
100:229-235 informaron sobre una heterogeneidad de
la secuencia en Nsp2 de VSRRP similar al europeo, aislado en los
Estados Unidos de América.
Todavía existe la necesidad de proporcionar
vacunas con características mejoradas, en particular en relación
con la eficacia y la seguridad.
La presente invención se refiere a vacunas
mejoradas, del tipo vivas modificadas de SRRP, de genotipo Europeo
y a nuevas cepas de VSRRP que se pueden utilizar para la preparación
de tales vacunas. En particular, la invención proporciona cepas
mejoradas del virus de SRRP que se han depositado en la Colección
Europea de Cultivos Celulares (ECACC, del inglés "European
Collection of Cell Cultures") con los números de orden ECACC
04102703, ECACC 04102702 y ECACC 04102704.
Figura 1: Gel de agarosa (2% de agarosa, teñido
con bromuro de etidio) de productos de RT-PCR
obtenidos a partir de la región nsp2 (pos. 2068 - 2713) de un
material aislado similar a Lelystad (pista 1), Porcilis® PRRS
(pista 2) y testigo negativo (pista 3). Pista 4: escalera de 100 pb.
Los productos de Porcilis® PRRS (banda doble en 434 y 416 pb y una
banda en 347 pb) son menores que el producto similar a LV (569
pb).
Figura 2: Productos de la PCR de nsp2 obtenidos
a partir de una selección de placas después de un pase sobre el un
cultivo de células Ma104.
Figura 3: Secuencia de nucleótidos de una placa
representativa de cada variante de longitud, comparada con la
secuencia de nucleótidos del Virus Lelystad (LV) prototipo de la
cepa.
Figura 4: Productos de la PCR de nsp2 obtenidos
a partir de diferentes muestras de las dos cerdas que muestran un
fracaso reproductor después de la vacunación con Porcilis® PRRS y
sus descendientes.
Figura 5: Los productos de la PCR de nsp2
obtenidos a partir de muestras clínicas de lechones de 6 semanas de
edad, vacunados con Porcilis® PRRS. El círculo muestra las muestras
de cerdos con la enfermedad PMWS.
Figura 6A: Secuencia de nucleótidos de los
productos de la PCR de nsp2 obtenidos a partir de diferentes
muestras de campo que muestran la misma deleción de 222 nucleótidos
que un grupo de placas obtenidas a partir del frasco de la vacuna
Porcilis PRRS (p. ej. la placa P45), comparada con la secuencia de
longitud completa (similar a Lelystad) de la placa 36 obtenida a
partir de Porcilis.
Figura 6B: Secuencia de nucleótidos de los
productos de la PCR de nsp2 obtenidos a partir de diferentes
muestras de campo que muestran la misma deleción de 135 nucleótidos
que un grupo de placas obtenidas a partir del frasco de la vacuna
Porcilis PRRS (p. ej. la placa P27), comparada con la secuencia de
longitud completa (similar a Lelystad) de la placa 36 obtenida a
partir de Porcilis.
Figura 6C: Secuencia de nucleótidos de los
productos de la PCR de nsp2 obtenidos a partir de diferentes
muestras de campo que muestran la misma deleción de 153 nucleótidos
que un grupo de placas obtenidas a partir del frasco de la vacuna
Porcilis PRRS (p. ej. la placa 31), comparada con la secuencia de
longitud completa (similar a Lelystad) de la placa 36 obtenida a
partir de Porcilis.
La presente invención se refiere a vacunas
mejoradas contra el SRRP. En particular, la invención se refiere a
vacunas vivas modificadas (VVM). Una vacuna viva modificada se
caracteriza porque contiene virus vivos que se pueden replicar en
cerdos, pero que no ejercen síntomas clínicos de SRRP o sólo pocos
síntomas moderados de la enfermedad. Además, después de la
administración se induce una respuesta inmune en los cerdos que
conduce generalmente a un grado significativo de protección contra
una infección posterior con virus patógenos de SRRP. Los virus que
muestran tales características se denominan generalmente virus
atenuados. En general, el virus atenuado se puede generar a partir
de material aislado de virus patógenos, haciendo pases repetidos en
células hospedadoras adecuadas, hasta que muestra las propiedades
deseadas (documentos WO 92/21375, WO 93/06211, WO 93/03760, WO
93/07898, WO 96/36356, EP 0 676 467, EP 0 732 340, EP 0 835 930).
Alternativamente, se puede generar por ingeniería genética, mediante
el uso de un clon infeccioso, normalmente un transcrito de ADN
complementario de longitud completa del genoma vírico (documentos
WO 98/18933, EP 1 018 557, WO 03/062407, Nielsen y col., J Virol
2003, 77:3702-3711). En una realización preferida,
la presente invención se refiere a un VVM que contiene virus del
SRRP con genotipo Europeo.
La presente invención se basa en el hallazgo
inesperado de que la seguridad y la eficacia de un MMV de SRRP se
pueden mejorar, si se tiene cuidado de que el virus utilizado para
la vacuna no muestre ciertas deleciones en la secuencia de nsp2.
Más específicamente, un virus de acuerdo con la invención debe
contener una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o una
secuencia de nucleótidos que difiera de SEQ ID NO: 1 en 1, 2, 3, 4
o 5 nucleótidos (tanto sustituciones y deleciones como inserciones),
como parte de una secuencia codificadora de nsp2 parcial o
completa. En otras palabras, los nucleótidos que se corresponden con
los nucleótidos nºs. 145 a 163 de la SEQ ID NO: 1 no deben estar
suprimidos en dicho virus.
Las cepas de virus atenuados que se pueden
utilizar para las vacunas de acuerdo con la presente invención, han
sido depositadas por Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, bajo el
Tratado de Budapest, el 27 de octubre de 2004, en la Colección
Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Porton Down, Salisbury,
Wiltshire, SP4 0JG, Gran Bretaña, con los números de entrada
04102703 (VSRRP bs104-P27), 04102702 (VSRRP
bs104-P31) y 04102704 (VSRRP
bs104-P36). Una vacuna de acuerdo con la presente
invención no debe contener, sin embargo, una cepa del virus
depositado en la ECACC el mismo día, bajo las mismas condiciones,
con el número de entrada 04102701 (VSRRP
bs104-P45). Las cepas depositadas se han obtenido
por purificación de placas a partir de un producto de vacuna a
disposición comercial (Porcilis PRRS, Intervet Deutschland GmbH,
Unterschleißheim), tal y como se describe en los ejemplos. Se
encontró de forma inesperada que dicho producto comprendía cuatro
subclones, teniendo tres de estos clones (ECACC04102703,
ECACC04102702 o ECACC 04102704) las características deseadas de
acuerdo con la presente invención, volviéndoles adecuados como
ingredientes de preparaciones de vacunas mejoradas, mientras que el
cuarto clon (ECACC04102701) tiene una deleción no deseada en
nsp2.
En un aspecto, la presente invención es una cepa
del virus de SRRP que es una cualquiera de las cepas del virus de
SRRP que se han depositado el 27 de octubre de 2004, en la Colección
Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Porton Down, Salisbury,
Wiltshire, SP4 0JG, Gran Bretaña, con los números de entrada ECACC
04102703, ECACC 04102702 y ECACC 04102704. La invención puede
tomarse para que se extienda a cepas de virus del SRRP que se han
obtenido a partir de las cepas depositadas, mediante propagación o
multiplicación en una forma idéntica, en particular los
descendientes que poseen las características de las cepas
depositadas. Después de una propagación continuada, las cepas
pueden adquirir mutaciones, la mayoría de las cuales no alterará
significativamente las propiedades de estas cepas.
Para un experto está claro que las cepas de la
invención se pueden modificar para impartir otras propiedades
deseables a las mismas. Esto se puede conseguir mediante técnicas
convencionales de propagación y selección, tales como la
propagación continuada en células hospedadoras adecuadas para
extender el fenotipo atenuado. Esto se puede conseguir
adicionalmente por mutación dirigida a la secuencia de ácido
nucleico del genoma de estas cepas mediante técnicas adecuadas de
ingeniería genética. Tal y como se ha detallado anteriormente, en
tales técnicas se emplea generalmente la construcción de copias de
ADN complementario de longitud completa (clones infecciosos) del
genoma vírico que se puede modificar entonces mediante métodos de
recombinación y de manipulación del ADN (tales como mutagénesis
dirigida al sitio, etc.). De este modo, se pueden modificar, por
ejemplo, sitios antigénicos o propiedades enzimáticas de las
proteínas víricas. Clones infecciosos de las cepas del virus de
SRRP de genotipo Europeo y Norteamericano, han sido descritos en la
bibliografía, véanse las referencias citadas anteriormente.
Las cepas de virus de SRRP adecuadas para las
vacunas de la invención se pueden hacer crecer y recoger por
métodos conocidos en la técnica, p. ej., mediante propagación en
células hospedadoras adecuadas, tales como la línea de células de
simio MA-104, células Vero o macrófagos alveolares
porcinos, tal y como se describe en los ejemplos.
Las vacunas que comprenden una cualquiera de las
cepas de VSRRP ECACC04102703, ECACC04102702 o ECACC04102704, así
como cualquier combinación de estas cepas, pero no la cepa
ECACC04102701 de VSRRP, constituyen las realizaciones preferidas de
la presente invención. Preferentemente, las vacunas de acuerdo con
la presente invención son vacunas vivas modificadas que comprenden
una o varias de estas cepas vivas en un vehículo adecuado, pero
también se puede utilizar un virus inactivado para preparar vacunas
con virus muerto (VM). Las VVM se formulan típicamente para permitir
la administración de 10^{1} a 10^{7} partículas víricas por
dosis, preferentemente 10^{3} a 10^{5} partículas por dosis,
más preferentemente 10^{4} a 10^{5} partículas por dosis
(4,0-5,0 log_{10} TCID_{50}). Los VM se pueden
formular basándose en un título de preinactivación de 10^{3} a
10^{10} partículas víricas por dosis. La vacuna puede comprender
un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, una solución
salina fisiológica. La vacuna puede comprender o no un coadyuvante.
Un ejemplo de coadyuvante adecuado es acetato de
\alpha-tocoferol que se puede obtener bajo la
marca Diluvac Forte®. Alternativa mente, se pueden utilizar, por
ejemplo, coadyuvantes a base de alumbre.
Una vacuna de acuerdo con la presente invención
se puede presentar en forma de una preparación liofilizada del
virus vivo, que se va a reconstituir en un disolvente, para dar como
resultado una solución para inyección. El disolvente puede ser, p.
ej., agua, solución salina fisiológica o tampón, o un disolvente
coadyuvante. El disolvente puede contener coadyuvantes, por
ejemplo, acetato de \alpha-tocoferol. La vacuna
reconstituida se puede inyectar a continuación en un cerdo, por
ejemplo, en forma de inyección intramuscular o intradérmica en el
cuello. Para la inyección intramuscular, se puede aplicar un volumen
de 2 ml, para una inyección intradérmica es típicamente de 0,2 ml.
En un aspecto adicional, la presente invención es, por tanto, un
producto de vacuna que comprende en recipientes separados, una
composición liofilizada del virus y un disolvente para la
reconstitución y, opcionalmente, contiene, además, un folleto o una
etiqueta con las instrucciones de uso.
Una vacuna de acuerdo con la presente invención
puede no sólo comprender una o varias de las cepas mencionadas
anteriormente, sino también puede incluir otros componentes activos
contra el SRRP u otras enfermedades porcinas víricas o bacterianas,
tales como el circovirus porcino o el virus de la fiebre porcina
clásica. Por consiguiente, la invención se refiere adicionalmente a
una vacuna tal y como se ha descrito, caracterizada porque contiene
al menos un antígeno adicional activo contra una porque contiene al
menos un antígeno adicional activo contra una enfermedad porcina que
no es el SRRP.
Catorce cerdas sanas preñadas de una piara que
se había confirmado negativa para VSRRP (sometida a ensayo
virológico y serológico) se emplearon en este estudio. Las cerdas
habían hecho frente a uno o a dos partos y se había confirmado que
estaban preñadas en el momento de la vacunación/infección de
estimulación el día 94 (+/-3) de la gestación. Se dividieron en
tres grupos de tratamiento (tabla 1). El primer grupo se trató con
una dosis comercial de Porcilis® PRRS de 2 ml que contenía al menos
10^{4,0} de TCID_{50} i.m., el día 94 (+/- 3) de la gestación.
El grupo testigo de la estimulación (grupo 2) recibió una dosis de
10^{4,72} de TCID_{50} en 2 ml de medio de cultivo del material
aislado de campo 92045 de la cepa Europea patógena, por vía
intranasal. El grupo 3 se vacunó con la dosis comercial de 2 ml que
contenía 10^{4,0} de TCID_{50} i.m. de Ingelvac PRRS MLV, siete
días antes de la inseminación y se estimuló con el material aislado
de campo 92045, de la cepa Europea (10^{4,72} de TCID_{50} en 2
ml de medio de cultivo celular, i.n.) el día 94 (+/- 3) de la
gestación.
Los animales del grupo 1 se vigilaron hasta el
día 5 posterior al parto. Los animales de los grupos 2 y 3 se
vigilaron hasta el día 28 posterior al parto.
Todas las cerdas se acostumbraron a las
instalaciones animales, 1 semana antes de la vacunación. En las
cerdas y en los lechones, el investigador observó su estado de
salud general, una vez al día. Cada animal que moría o que sufría
eutanasia, se sometió a un examen post-mortem
y a posteriores análisis de laboratorio.
La preñez se confirmó con examen con
ultrasonidos. El suero de las cerdas se obtuvo los días de estudio
0, 7, 14 y en el parto, para los análisis con PCR y ELISA.
Cualquier material que se asociaba con un aborto, se sometió a
pruebas de laboratorio.
En todos los lechones que nacieron muertos se
realizó una patología completa de rutina. Se recogieron muestras de
tejido pulmonar de todos los lóbulos pulmonares de los lechones que
nacieron muertos y de los momificados. Las muestras para el ensayo
de la PCR se almacenaron a -70ºC. Se recogieron 2 ml de sangre
previa al calostro de cada lechón el día del parto. Se preparó el
suero y se almacenaron partes alícuotas a -70ºC. El suero se empleó
para someter a ensayo la viremia, para evaluar la infección
transplacental. Todos los lechones del grupo 1 que sobrevivieron
hasta el día 5, se sometieron a eutanasia con una edad de 5
días.
Se investigaron los siguientes criterios
principales (por orden de prioridad): número de lechones nacidos
vivos por camada, número de lechones nacidos muertos por camada,
número de fetos momificados por camada y número de lechones
supervivientes hasta una edad de 5 o 28 días, respectivamente. El
número de lechones que nacieron virémicos se determinó empleando un
suero previo al calostro. La frecuencia de las muestras de sangre y
de tejido que eran positivas para la PCR, procedentes de cerdas y/o
lechones, se investigó para evaluar la epidemiología y el curso de
la infección.
Las muestras de campo investigadas en este
estudio se tomaron a partir de sangre, suero y diversos materiales
orgánicos, la mayoría pulmones y nódulos linfáticos, con diagnóstico
rutinario de VSRRP, procedentes de diferentes países europeos. Las
muestras se almacenaron a -20ºC durante un máximo de 3 días antes de
la preparación del ARN y el material residual se transfirió
posteriormente a -70ºC para un almacenamiento a largo plazo. El ARN
y los productos de la RT-PCR se almacenaron a
-20ºC.
Las células Ma104 (clon CL2621) se dejaron
crecer en MEM (Dulbecco, Alemania) suplementado con 10% de FCS y
antibióticos.
Los macrófagos alveolares porcinos se recogieron
empleando un método descrito por Wensvoort y col. (Wensvoort, G. y
col. Vet. Quat. 1991, 13:121-130) y modificado del
modo siguiente: en cada lóbulo pulmonar se infundieron
50-100 ml de PBS y a continuación se masajearon
durante 3 a 5 min. A continuación, se recogió el fluido del lóbulo
y se hizo pasar a través de un filtro de gasa. Este procedimiento se
repitió hasta que el fluido de lavado era claro. El fluido de
lavado reunido se centrifugó a 500 g durante 15 min. a temperatura
ambiente. El sedimento se lavó en PBS y se congelaron partes
alícuotas de 1 x 10^{7} células en 50% de RPMI 1640 (Biochrom),
40% de FCS y 10% de DMSO, a - 196ºC. Para un uso posterior, las PAMs
se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS y
antibióticos.
Se transfirieron aproximadamente 0,5 cm^{3} de
material de tejido a un tubo que contenía un homogeneizador de
acero de tipo Ballet en 1,8 ml de PBS estéril. Los tubos se agitaron
durante 10 minutos hasta que se homogeneizó el material orgánico.
Los desechos celulares se sedimentaron centrifugando durante 2 min.
a 450 g y a temperatura ambiente. El material sobrenadante se hizo
pasar a través de un filtro estéril de tamaño de poro 0,45 \mum y
se almacenó a -70ºC. Se emplearon partes alícuotas para inocular un
cultivo celular en monocapa y semiconfluente, empleando placas de
microtitulación de 24 pocillos.
El ARN procedente del material orgánico, se
extrajo con el equipo de reactivos RNeasy Mini Kit y el procedente
de suero, plasma, material sobrenadante de cultivos celulares y de
solución de vacunas con el equipo de reactivos QIAamp Viral RNA
Mini Kit (ambos de Qiagen), según las instrucciones del fabricante,
empleando aproximadamente 100 mg de material orgánico y 140 \mul
de material fluido, respectivamente, para cada preparación. El ARN
se eluyó finalmente en 65 \mul de tampón, tal y como recomendaba
el fabricante.
Monocapas confluentes de células Ma104 en placas
de cultivo celular de 10 cm de diámetro, se sembraron 48 horas
antes de ser infectadas, con el virus respectivo en diluciones
décuplas desde 10^{-1} hasta 10^{-4}. Las células se incubaron
durante 1 hora con las diluciones de virus que a continuación se
retiraron y las células se extendieron con 30 ml de medio de Ma104
que contenía 5% de metilcelulosa (Sigma). Las placas se
seleccionaron después de cinco a siete días y se transfirieron a
monocapas de Ma104 en placas de 24 pocillos. El virus se recogió de
estas placas con aproximadamente 50% de CPE y se sometió a un
análisis posterior.
Las células se fijaron a -20ºC durante 15 min.
empleando acetona enfriada con hielo: metanol (1:1) y a continuación
secado al aire. Después de rehidratar en PBS, las células se
incubaron con el anticuerpo monoclonal, específico de VSRRP, SDOW17
(Rural Technologies Inc., EE.UU.) diluido 1:1000 en PBS durante 1
hora. Después de 3 lavados con PBS, las células se incubaron con
anticuerpo secundario de cabra anti-ratón, conjugado
con FITC (Dianova, Hamburg, Alemania) (1:150 en PBS) durante otra
hora. Después de 3 lavados finales con PBS, las células se
recubrieron con glicerina: solución de PBS (1:1) y se sometieron a
microscopía de inmunofluorescencia.
Se realizó una RT-nPCR de
diagnóstico para comprobar en las muestras la presencia del virus
VSRRP-EU; a continuación, las muestras positivas se
sometieron a amplificación del fragmento nsp2. Las secuencias de
cebadores se enumeran en la tabla 2.
La RT-nPCR para diagnóstico se
realizó con el equipo de reactivos Titan One Tube Kit (Roche
Molecular Biochemicals) del modo siguiente: [5 \mul de la
preparación de ARN total, tampón de 1*RT-PCR, dNTPs
0,4 mM, 20 pmol de cebadores PLS y PLR, ditiotreitol 5 mM,
MgCl_{2} 1 mM, 2,5 - 5 U de RNasin (Promega Ltd), 1 - 2,5 U de
mezcla de enzimas, ajustado a un volumen final de 25 \mul con agua
destilada tratada con DEPC]. Las condiciones de los ciclos eran las
siguientes: 45ºC durante 1 hora, 94ºC durante 2 min. y 30 ciclos a
94ºC durante 30 s, 58ºC durante 45 s y 68ºC durante 45 s, etapa de
elongación final a 68ºC durante 5 min. La reacción de la PCR anidada
se realizó con Qiagen Taq (Qiagen AG) del modo siguiente: [1 \mul
del producto de la RT-PCR, tampón de 1*PCR, 10
\mul de solución Q, MgCl_{2} 3,5 mM, dNTPs 0,3 mM, 20 pmol de
cada cebador
EU-7-n-s y
EU-7-n-as, 2,5 U de
polimerasaTaq, ajustado a un volumen final de 50 \mul con agua
destilada]. Las condiciones de los ciclos eran las siguientes: 7
ciclos a 94ºC durante 1 min., 58ºC durante 1 min. y 72ºC durante 1
min., seguido de 30 ciclos a 94ºC durante 1 min. y 70ºC durante 1,5
min. (sin etapa de reasociación), etapa de elongación final a 70ºC
durante 5 min.
Las muestras positivas se sometieron a
continuación a la amplificación del fragmento nsp2, empleando PCR
con transcripción inversa en una etapa con los cebadores
EU-1a-2058-s y
EU-1a-2683-as, con
el equipo de reactivos de Qiagen, One Step RT-PCR
Kit (Qiagen) del modo siguiente: [2 \mul de la preparación de ARN,
5 \mul de tampón de RT-PCR, 5 \mul de solución
Q, dNTPs 0,4 mM, 20 pmol de cada cebador, 2,5 - 5 U de RNasin
(Promega), 1 \mul de la mezcla de enzimas One Step, ajustado a un
volumen final de 25 \mul con agua destilada tratada con DEPC].
Las condiciones de los ciclos eran las siguientes: 50ºC durante 1
hora, 95ºC durante 15 min. y 40 ciclos a 94ºC durante 60 s, 60ºC
durante 5 s, 50ºC durante 5 s y 72ºC durante 2 min., etapa de
elongación final a 72ºC durante 10 min.
La reacción de la PCR anidada se realizó con la
polimerasa Taq (Qiagen) y la pareja de cebadores
EU-1a-2061-s +
EU-1a-2574-as, del
modo siguiente: [1 \mul del producto de RT-PCR,
tampón de 1*PCR buffer, 10 \mul de solución Q, MgCl_{2} 3,5 mM,
dNTPs 0,6 mM, 20 pmol de cada cebador, 2,5 U de polimerasa Taq,
ajustado a un volumen final de 50 \mul con agua destilada]. Las
condiciones de los ciclos eran las siguientes: 8 ciclos a 94ºC
durante 1 min., 60ºC durante 5 s, 50ºC durante 5 s y 68ºC durante 45
s, seguido de 50 ciclos a 94ºC durante 1 min. y 70ºC durante 1 min.
(sin etapa de reasociación), etapa de elongación final a 70ºC
durante 5 min. Los cebadores de la PCR anidada se alargaron con
etiquetas M13 para facilitar la secuenciación directa de los
nucleótidos de los productos de la PCR.
La secuenciación de nucleótidos se realizó sobre
los productos de la PCR anidada que se habían generado con
cebadores que contenían una marca M13, directamente desde la
reacción de la PCR o a partir de los productos de la PCR que se
habían escindido de los geles de agarosa y se habían purificado con
el equipo de reactivos de extracción en gel JETsorb kit (Genomed).
La secuenciación se realizó empleando el secuenciador automático
LI-COR DNA Analyzer GENE READIR 4200®
(LI-COR Inc., Lincoln, Nebraska, EE.UU.). Las
secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducidos se analizaron
con AlignIR®, vs1.1 (LI-COR Inc., Lincoln, Nebraska,
EE.UU.) y el paquete de programas de DNASIS® 2.6 (Hitachi Software
Genetic Systems Inc., San Francisco, EE.UU.).
Un frasco que contenía 10 dosis de la vacuna
viva modificada Porcilis® PRRS liofilizada se reconstituyó con 20
ml de PBS estéril. El ARN se preparó a partir de esta solución y el
fragmento nsp2 se sometió a amplificación mediante
RT-nPCR, tal y como se ha descrito. El ARN
procedente de otra cepa Europea de VSRRP similar a Lelystad con
secuencia de nucleótidos conocida, se amplificó como testigo
positivo en el mismo experimento. Un producto de la amplificación
de 569 pb se esperaba para este fragmento, y se obtuvo para la cepa
testigo. Sin embargo, la muestra de Porcilis® PRRS no produjo un
producto similar. Por el contrario, mostraba una banda doble en un
gel de agarosa regular al 2%, con una banda de aproximadamente 430
pb y la otra de aproximadamente 350 pb (véase, la figura 1).
Ambas bandas se purificaron separadamente a
partir del gel y a continuación se sometieron a secuenciación de
los nucleótidos. Era obvio que ambos productos de la PCR tenían una
deleción, comparados con la secuencia de nucleótidos del virus
Lelystad; sin embargo, las secuencias obtenidas eran algo ambiguas y
el alcance preciso de la deleción no se pudo determinar. Por ello
se decidió purificar en placa la vacuna para excluir que las
ambigüedades eran debidas a una cepa de la vacuna no homogénea.
\vskip1.000000\baselineskip
De nuevo se reconstituyó un frasco que contenía
10 dosis de la vacuna Porcilis® PRRS liofilizada, con 20 ml de PBS
estéril. La solución de la vacuna reconstituida se incubó con
monocapas de Ma104 confluentes, con diferentes diluciones, tal y
como se ha descrito en Materiales y Métodos y a continuación se
recubrieron con medio que contenía metilcelulosa. Se seleccionaron
las placas al cabo de 5 a 7 días de incubación y se dejaron crecer
en placas de 24 pocillos sobre Ma104 hasta que mostraron una CPE de
aproximadamente 50%. El material sobrenadante de los cultivos
celulares se recogió a continuación y se almacenó a -70ºC.
Un total de 47 placas se sometió a una prueba
adicional. Para ello, se preparó el ARN a partir del material
sobrenadante del primer pase sobre placas de 24 pocillos y se
utilizó para la amplificación con RT-nPCR del
fragmento nsp2. Los productos resultantes de la PCR se analizaron
sobre un gel de agarosa al 2%. El resultado se resume en la tabla
3. Además de las poblaciones mezcladas que se debían probablemente a
la superposición de las placas, se encontraron cuatro poblaciones
específicas (en el intervalo de tamaño desde aproximadamente 569
pb, 434 pb, 416 pb y 347 pb, respectivamente). Los productos de la
PCR de algunas placas representativas se muestran en la figura
2.
La secuencia de nucleótidos de una placa
representativa de cada grupo se determinó a continuación mediante
secuenciación directa de los productos de la RT-nPCR
de nsp2 y se obtuvieron los siguientes resultados: placa nº 36: sin
deleción en nsp2; placa nº 27: deleción de 135 nt; placa nº 31:
deleción de 153 nt; y placa nº 45: deleción de 222 nt. Las
secuencias de nucleótidos de estas placas se muestran en la figura
3.
\vskip1.000000\baselineskip
Después del parto, las cerdas 7062 y 6677 que se
habían vacunado con la vacuna Porcilis® PRRS el día 90 de la
gestación, mostraban un fracaso reproductor de moderado a grave
(véase la tabla 4). La proporción de animales nacidos muertos y
débiles era 62,5% en la camada 7062 y 44,4% en la camada 6677.
Además, hasta el día 5 posterior al parto, murieron los cuatro
lechones que nacieron vivos de la cerda 7062 y todos los lechones
nacidos débiles de la cerda 6677. Las observaciones clínicas se
enumeran en la tabla 5. En conclusión, 5 días después del parto
sólo sobrevivían 29,4% (5 lechones) de los lechones de ambas
camadas.
Seis cerdas del grupo 2 parieron después de la
infección con el material aislado 92045 del virus de campo de SRRP.
25,3% y 26,4% de los lechones nacieron muertos o momificados,
respectivamente. De los 42 lechones que nacieron vivos, 24 (27,6%)
lechones nacieron normales y sólo 18 lechones (20,7%) nacieron
normales. De forma similar a las camadas de las cerdas vacunadas con
Porcilis® PRRS el día 94 (+/-3) de la gestación, sólo 29,9% de los
lechones nacidos sobrevivieron.
Las cerdas vacunadas con VVM de Ingelvac PRRS® e
infectadas con la exposición similar al grupo 2, parían 72,9% de
lechones sanos normales. 16,7% y 6,2% de los lechones nacieron
muertos o momificados, respectivamente. Aunque la cerda 6930 perdió
todos los lechones hasta los 28 días de edad, sólo 2 lechones de
otras camadas murieron durante este periodo. Por tanto, 60,4% de
los cerdos vacunados con Ingelvac PRRS® VVM e infectados por
exposición al material aislado 92045 altamente patógeno del virus de
campo de SRRP, sobrevivieron hasta una edad de 28 días.
Los sueros de las cerdas y de los lechones, así
como el tejido pulmonar y el fluido corporal de los lechones del
grupo 1, se examinaron para estudiar la presencia de VSRRP. Las
muestras positivas para la PCR se sometieron a secuenciación de los
nucleótidos de los marcos de lectura abierta 5 y 7 y también del
fragmento nsp2. Los resultados obtenidos mediante la PCR y el
aislamiento del virus se enumeran en la tabla 6.
En las dos cerdas 6677 y 7062 que padecían fallo
reproductor, cada muestra positiva de la PCR mostraba una secuencia
del ORF 5 y 7 idéntica a Porcilis® PRRS, indicando que en estos
animales no era detectable otra cepa de VSRRP. Aunque se encontró
el VSRRP en todos los lechones nacidos muertos de la cerda 7062,
sólo un lechón nacido muerto de la cerda 6677 (50%) reaccionaba de
forma positiva. Todos los lechones que nacieron débiles de la cerda
7062 y 67% de los lechones nacidos débiles, así como 50% de los
lechones nacidos sanos y normales de la cerda 6677 proporcionaban
resultados positivos en la PCR, que se verificaron como Porcilis®
PRRS por análisis de la secuencia, incluso a partir de muestras
tomadas antes de la ingesta del calostro. Por tanto, sólo 4 de los
17 lechones (23,5%) eran negativos para Porcilis® PRRS. Para el
fragmento nsp2, todas las muestras mostraban una banda fuerte de
aproximadamente 347 pb que se corresponde con la variante más corta
de los posibles fragmentos de nsp2 que se pueden amplificar a partir
de la vacuna Porcilis® PRRS (figura 4). La mayoría de las muestras
tenían una banda muy débil de aproximadamente 434 pb; sólo el lechón
7062/4310 tenía una banda doble fuerte.
Para el diagnóstico diferencial, se investigó
material orgánico así como suero para el genotipo US de VSRRP y
para PPV, BVD, CSFV, BDV, PrV, PCV2, SIV, PEV/PTV, swParamyxoV,
EMCV, swHEV así como para Leptospira spp., Chlamydophila spp. y
Chlamydia spp. Todas estas pruebas dieron resultados negativos.
El material del pulmón procedente de cinco
lechones de cada cerda, se sometió a intentos de aislamiento del
virus en células Ma104 y en macrófagos alveolares porcinos,
escogiendo dos lechones que habían nacido muertos y tres lechones
que habían nacido vivos de cada cerda (véase la tabla 6). Una parte
alícuota de 30 \mul de suspensión orgánica homogeneizada y
filtrada estérilmente, se empleó para inocular un pocillo de células
Ma104 y de células de células PAM, respectivamente. Las células se
incubaron a 37ºC y 5% de CO_{2} durante 5 días y a continuación
se tiñeron en un ensayo inmunofluorescente con el anticuerpo
monoclonal específico de VSRRP, SDOW17. De las diez suspensiones
orgánicas, cuatro dieron como resultado un efecto citopático y
resultados positivos de la tinción en las células Ma104 y PAM. Las
seis muestras restantes dieron resultados negativos en ambos tipos
de células.
De cada muestra positiva, se preparó un ARN a
partir del material sobrenadante del cultivo celular respectivo,
procedente de las células PAM y Ma104. El ARN se sometió a
RT-nPCR para el ORF 5 y 7, así como para el
fragmento nsp2. La secuenciación de los nucleótidos de los
productos de la PCR de los ORF 5 y 7 confirmaba el virus como
Porcilis® PRRS. El producto de la PCR de nsp2 daba como resultado
sin ambigüedad la secuencia de Porcilis® PRRS con la mayor deleción
de 222 nucleótidos.
Tomando el resultado de estos experimentos, se
puede concluir que la variante representada por la placa 45 y
depositada bajo ECACC04102701, es preferentemente responsable de la
infección transplacental y la reducción observada del
comportamiento reproductor.
\vskip1.000000\baselineskip
Una piara negativa para el virus de campo VSRRP
en la que se vacunaba regularmente los lechones con Porcilis® PRRS
con 6 semanas de edad, fue investigada en relación con
VSRRP-EU. Se tomaron diez muestras de cada lechón
con cada edad de 4, 7, 9,5 y 13,5 semanas, respectivamente. En el
grupo de 9,5 semanas, tres lechones padecieron el Síndrome de
desmedro multisistémico post-destete (PMWS, del
inglés "Post-weaning Multisystemic Wasting
Síndrome") que se correlaciona frecuentemente con el circovirus 2
porcino y la coinfección con SRRP (Ellis y col., Vet Microbiol
2004, 98:159-163). Un producto específico de la
RT-nPCR de VSRRP-EU se obtuvo para
1/10, 7/10, 9/10 y 7/10 animales antes de la vacunación, 1 semana
después de la vacunación, 3,5 semanas y 7,5 semanas después de la
vacunación. Después de amplificar con RT-PCR la
región codificadora de nsp2, procedente de muestras positivas para
VSRRP, sólo se obtuvieron productos típicos de la PCR de Porcilis®
PRRS: 8 muestras proporcionaban sólo el producto de \sim347 pb, 4
muestras sólo el producto de \sim434 pb y 4 muestras la banda
doble de 434 y 347 pb. Ninguna muestra proporcionaba el producto
similar a Lelystad (véase la figura 5). La región nsp2 se podía
amplificar en tres de los cuatro lechones con la enfermedad PMWS,
dos de los cuales mostraban el producto de 434 pb y uno el producto
de 347 pb.
Se sometieron a amplificación del fragmento nsp2
un total de 514 muestras de sangre y tejido que se habían enviado
para diagnosticar piaras sospechosas de padecer SRRP y que habían
dado positivo en RT-nPCR de rutina para el VSRRP.
Los productos de la amplificación se obtuvieron en 41,4% de las 514
muestras. Se encontraron deleciones de longitudes variadas en 30,7%
de las muestras analizadas, lo que indica una frecuencia total de
12,7% de las variantes de la deleción de nsp2 en el campo. En la
mayoría de los casos, las bandas encontradas mostraban el mismo
patrón que el encontrado en la vacuna Porcilis® PRRS, consistente en
una banda (doble) de 434 y 416 pb que no se podía diferenciar
fácilmente sobre un gel regular de agarosa al 2% o una banda de 347
pb. Por ello, una selección de las muestras se sometió a
secuenciación de nucleótidos para comprobar si estos productos de
la PCR se obtenían de hecho a partir del virus de la vacuna
Porcilis® PRRS. Los resultados se muestran en la figura 6
A-C.
- n - número de cerdas; i.m. por vía intramuscular, i.n. por vía intranasal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- Para los cebadores anidados de la PCR, las marcas M13 se marcan con itálica, mientras que la secuencia específica de VSRRP de los cebadores está subrayada.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
D = débil, Dep = deprimido, A = anorexia
^{1}El lechón 4305 muere el día 1 debido a un
accidente en la toma de sangre.
^{2}Los lechones 4307 y 4308 mueren debido a
agalactia.
^{3}El lechón 4310 mostraba señales graves de
neumonía.
- nr: no realizado
- *:El fragmento de PCR de la PCR para diagnóstico realizada rutinariamente se secuenció
- **Todos los materiales reaislados procedentes de MA 104 y PAMs, se secuenciaron en
- ORF 5 y ORF 7 y eran idénticos a Porcilis® PRRS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
<110> Boehringer Ingelheim Vetmedica
GMBH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vacuna contra SRRP mejorada
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P01-1833
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del Síndrome Reproductor y
Respiratorio Porcino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaaagttcc ggcgctgc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 533
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del Síndrome Reproductor y
Respiratorio Porcino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 533
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del Síndrome Reproductor y
Respiratorio Porcino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggccagcc agtcaatc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgccctaat tgaataggtg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtaaaacga cggccagtat gataaagtcc cagcgccag
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggaaacag ctatgaccct gtatgagcaa ccggcagcat
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgttgaagga ttgtccgagc tcc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagatccaaag gcgaactgct g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtaaaacga cggccagttg aaggattgtc cgagctcc
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtaaaacga cggccagttg aaggattgtc cgagctcc
\hfill38
Claims (11)
1. Vacuna contra el Síndrome Reproductor y
Respiratorio Porcino (SRRP), que comprende el virus de SRRP vivo,
caracterizada porque contiene una o varias de las cepas del
virus de SRRP que se han depositado el 27 de octubre de 2004 en la
Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Porton Down,
Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Gran Bretaña, con los números de
entrada ECACC 04102703, ECACC 04102702 y ECACC 04102704,
opcionalmente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable,
pero no la cepa depositada con el número de entrada ECACC
04102701.
2. Vacuna de la reivindicación 1, que contiene
las cepas del virus de SRRP que se han depositado con los números de
entrada ECACC 04102703, ECACC 04102702 y ECACC 04102704.
3. Vacuna de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, que contiene adicionalmente un coadyuvante.
4. Vacuna de la reivindicación 3, en la que el
coadyuvante es acetato de \alpha-tocoferol.
5. Vacuna de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que comprende una composición liofilizada
del virus.
6. Una cepa del virus de SRRP que es una
cualquiera de las cepas del virus de SRRP que se han depositado el
27 de octubre de 2004 en la Colección Europea de Cultivos Celulares
(ECACC), Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Gran Bretaña,
con los números de entrada ECACC 04102703, ECACC 04102702 y ECACC
04102704.
7. Método para preparar una vacuna, que
comprende incorporar por mezcla una o varias cepas del virus de SRRP
según la reivindicación 6, con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
8. Uso de un virus de SRRP según la
reivindicación 6, para la preparación de una vacuna.
9. Producto de vacuna, que comprende en
recipientes separados una composición liofilizada según la
reivindicación 5, y un disolvente para la reconstitución y
opcionalmente contiene, además, un folleto o una etiqueta que
comprende las instrucciones de uso.
10. Producto de vacuna de la reivindicación 9,
en donde el disolvente contiene un coadyuvante.
11. Vacuna según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque contiene al
menos un antígeno adicional activo contra una enfermedad porcina
que no es el SRRP.
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