ES2388909T3 - Vacuna contra el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino basada en aislado JA-142 aislada - Google Patents
Vacuna contra el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino basada en aislado JA-142 aislada Download PDFInfo
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Abstract
Un virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (SRRP) que comprende una secuencia representada porSEC ID Nº:1 o por una secuencia que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con SEC ID Nº:1.
Description
Vacuna contra el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino basada en aislado JA-142 aislada
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere, en general, al virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (SRRP) atípico avirulento atenuado (VSRRP) y a las vacunas de virus vivo correspondientes para su administración a ganado porcino para conferir una inmunidad eficaz en el ganado porcino frente a VSRRP.
Descripción de la técnica anterior
El SRRP surgió a finales de los años 80 como una enfermedad vírica importante del ganado porcino. El VSRRP causa insuficiencia reproductiva grave en cerdas gestantes, manifestada en forma de partos prematuros, aumento del número de mortinatos, cerdos momificados y nacidos débiles, tasa de partos disminuida y retraso en la vuelta al estro. Además, el sistema respiratorio del ganado porcino infectado con VSRRP se ve afectado desfavorablemente, lo que se demuestra por lesiones que aparecen en los pulmones del ganado porcino infectado. Para combatir los problemas asociados con la infección por VSRRP, se han desarrollado vacunas que conferían inmunidad a las cepas de VSRRP existentes entonces.
Las epidemias de una forma excepcionalmente grave de SRRP, denominado en lo sucesivo en el presente documento “SRRP atípico”, se reconoció por primera vez en Norteamérica en la última parte de 1996. Se diferenciaban de las epidemias de “SRRP típico” en que: 1) los signos clínicos eran más prolongados así como más graves; 2) la incidencia de abortos era superior, especialmente durante la primera parte y la mitad de la gestación; 3) existía una mayor incidencia de mortalidad de cerdas nulíparas y mutíparas; 4) el VSRRP se aislaba menos frecuentemente de fetos abortados, cerdos mortinatos y cerdos nacidos vivos —quizá porque los abortos eran más frecuentemente el resultado de una enfermedad maternal aguda más que de una infección transplacentaria; 5) las lesiones pulmonares de los cerdos jóvenes afectados eran más amplias; y 6) las vacunas disponibles en el mercado proporcionaban escasa o ninguna protección. En su conjunto, estas observaciones indicaban la emergencia de cepas más virulentas y antigénicamente diferentes de VSRRP y la necesidad de una nueva generación de vacunas contra SRRP.
El procedimiento usado más frecuentemente para producir vacunas de virus vivo atenuado es realizar pases en serie del virus en un sustrato (habitualmente un cultivo celular) distinto del huésped natural (S) hasta que se atenúe lo suficiente (es decir, se reduzca su virulencia o capacidad para producir enfermedades) para usarlo como vacuna. Para el primer pase, se infecta un cultivo celular con el inóculo seleccionado. Después de obtener pruebas claras de replicación de virus (por ejemplo, efectos citopáticos inducidos por virus [ECP] en las células infectadas), se usa una alícuota del medio de cultivo celular, o células infectadas, o ambas, del primer pase para infectar un segundo cultivo celular. El procedimiento se repite hasta que una o más mutaciones críticas en el genoma viral causan una atenuación suficiente de modo que el virus pueda usarse con seguridad como vacuna. El grado de atenuación se determina habitualmente empíricamente exponiendo al huésped natural (S) a niveles de pase progresivamente mayores del virus.
El procedimiento anterior es básicamente válido y se ha usado con éxito para el desarrollo de numerosas vacunas para uso humano y veterinario. Sin embargo, es relativamente ineficaz porque la fase logarítmica de la replicación de virus, durante la que es más probable que se produzcan mutaciones, se completa con frecuencia mucho antes de que se hagan visiblemente evidentes pruebas de la replicación viral.
Murtaugh y col. (1995) Archives Virol. 40, 1451-1460 compara las secuencias que codifican proteínas estructurales de las cepas víricas VR-2332 y Lelystad del virus de SRRP. El análisis comparativo de secuencias indica que había grados de identidad de aminoácidos con los marcos de lectura abiertos del virus Lelystad que variaban del 55 % en ORF5 al 79 % en ORF6.
Mengelin y col. (1999) A. J. V. 60(3), 334-340 describe la identificación y evaluación clínica de cepas silvestres relacionadas con vacuna sospechosas de virus del syndrome respiratorio y reproductivo porcino. Se concluyó que en piaras de ganado porcino, la cepa de la vacuna puede haber persistido y mutado a una forma menos atenuada.
El documento EP 0835929 A1 describe una nueva cepa atenuada (CNCM Institut Pasteur 1-1642) de virus del SRRP, junto con un procedimiento de replicación de atenuación de la misma usando un clon obtenido a partir de células de hígado de mono MA-104 (CNCM Institut Pasteur 1-1643).
El documento US 5.476.778 desvela un procedimiento de atenuación de virus del síndrome respiratorio y de infertilidad porcino que comprende pasar el virus por una línea celular de simio en condiciones bien definidas.
El documento US 5.587.164 divulga un procedimiento para cultivar virus del SRRP en un cultivo hístico que es susceptible a la infección para replicar el virus en una cantidad suficiente para proteger animales contra el SRRP o puede usarse para diagnosticar SRRP o identificar la estructura molecular de virus del SRRP para desarrollar productos recombinantes, comprendiendo dicho procedimiento inocular los virus en el tejido hístico y recolectar el virus replicado
Por lo tanto, existe la necesidad indudable en la técnica de una vacuna que confiera una inmunidad eficaz contra cepas de VSRRP, incluyendo cepas de VSRRP atípicas recientemente descubiertas. También existe la necesidad en la técnica de un procedimiento de preparación de dicha vacuna. Por último, lo que se necesita es un procedimiento de pase de un virus que atenúe el virus más eficazmente de lo que hasta ahora se creía posible, con el virus atenuado resultante generando anticuerpos específicos de VSRRP en ganado porcino, confiriendo de este modo una inmunidad eficaz frente a una infección posterior por VSRRP.
La presente invención se refiere a las realizaciones (1) a (21) siguientes:
- (1)
- Un virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (SRRP) que comprende una secuencia representada por SEC ID Nº:1 o por una secuencia que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con SEC ID Nº:1.
- (2)
- El virus de la realización (1), comprendiendo el virus la secuencia representada por SEC ID Nº:1.
- (3)
- Un virus del SRRP que tiene el número de acceso ATCC VR-2638.
- (4)
- El virus de la realización (1), comprendiendo el virus la secuencia representada por SEC ID Nº:2.
- (5)
- El virus de una cualquiera de las realizaciones (1) a (3), atenuado por un procedimiento para atenuar un virus que incluye las etapas de replicar sucesivamente dicho virus mediante inoculación y replicación del virus en cultivos celulares individuales respectivos hasta lograr la atenuación, retirar las muestras que contienen virus de al menos determinados de dichos cultivos celulares mientras el virus se está replicando a una velocidad logarítmica y antes de la inducción de efectos citopáticos en dichos determinados cultivos celulares e inocular el siguiente pase de cultivo celular respectivo con dichas muestras.
- (6)
- El virus de la realización (5), produciéndose dicha etapa de retirada aproximadamente 24 horas después de la inoculación de dichos cultivos celulares.
- (7)
- El virus de la realización (5), comprendiendo dicho cultivo celular una monocapa de células que tiene una confluencia superior a aproximadamente el 70 %.
- (8)
- El virus de la realización (5), que además comprende la etapa de analizar periódicamente dicho virus progenie para evaluar la atenuación.
- (9)
- El virus de la realización (5), que además comprende las etapas de conservar dichos determinados cultivos celulares después de dicha etapa de retirada y observar si la inducción de efectos citopáticos tiene lugar en dichos cultivos celulares conservados.
- (10)
- El virus de la realización (5), comprendiendo dicha inoculación el número más pequeño de virus que da como resultado en última instancia ECP.
- (11)
- El virus de una cualquiera de las realizaciones precedentes, habiéndose pasado dicho virus un mínimo de 200 veces en cultivo celular.
- (12)
- El virus de una cualquiera de las realizaciones precedentes, estando dicho virus atenuado.
- (13)
- El virus de una cualquiera de las realizaciones precedentes, siendo dicho virus avirulento.
- (14)
- El virus de una cualquiera de las realizaciones precedentes, siendo dicho virus capaz de generar respuestas de anticuerpos en ganado porcino.
- (15)
- El virus de la realización (14), siendo dicha respuesta de anticuerpos específica para cepas de virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino.
- (16)
- El virus del SRRP atenuado de una cualquiera de las realizaciones (5) a (10), obtenido mediante atenuación de un virus que tiene una secuencia de ácido nucleido representada por SEC ID Nº:2.
- (17)
- Una vacuna que comprende el virus según una cualquiera de las realizaciones precedentes.
- (18)
- La vacuna de la realización (17), que además comprende un agente vehículo farmacológicamente compatible.
- (19)
- Una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende al menos el 95 % de identidad de secuencia con SEC ID Nº:1.
- (20)
- Una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia tal como se muestra en SEC ID Nº:1.
- (21)
- La vacuna tal como se define en la realización (17) o (18) para su uso en la inmunización de ganado porcino contra el síndrome respiratorio y reproductivo porcino, en la que dicha inmunización comprende administrar dicha vacuna a dicho ganado porcino.
La presente invención supera los problemas resumidos anteriormente y proporciona cepas de VSRRP atípico atenuado y las vacunas vivas modificas mejoradas correspondientes que confieren una inmunidad eficaz contra cepas de VSRRP atípicas recientemente descubiertas. La expresión “inmunidad eficaz” se refiere a la capacidad de una vacuna para prevenir infecciones por VSRRP en ganado porcino, incluyendo infecciones por VSRRP atípico que dan como resultado signos clínicos importantes de la enfermedad. Es decir, el ganado porcino inmunizado puede o no ser serológicamente positivo para VSRRP, pero no presenta ningún síntoma clínico importante. La expresión “VSRRP atípico” se refiere a estas nuevas cepas de SRRP que son sustancialmente más virulentas que las cepas de VSRRP típicas.
En formas preferentes, la vacuna descrita en el presente documento incluye virus vivo cuya virulencia se ha atenuado. Se ha demostrado que el virus atenuado resultante es avirulento y confiere una inmunidad eficaz. Se seleccionó una cepa particularmente virulenta de SRRP atípico (denominada JA-142) que causaba síntomas especialmente graves de SRRP y representa la cepa dominante de VSRRP atípico para su atenuación posterior por pase. El virus atenuado resultante se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, MD el 2 de febrero de 1999 y concordaba con el Nº de Acceso de la ATCC VR-2638. Este virus atenuado es un Virus de Semilla Maestra (VSM) preferido que se ha pasado y desarrollado posteriormente como una vacuna de VSRRP eficaz.
El nombre dado al virus no atenuado, JA-142, surge del patrón enzimático de restricción. El 1 representa la incapacidad de la enzima MLU I para escindir el virus en el marco de lectura abierta 5 (ORF 5). El 4 representa la escisión por Hinc II en las posiciones de pares de bases 118 y 249 de la ORF 5 y secuencias contiguas cortas. El 2 representa la escisión por Sac II en la posición del par de bases 54 de la ORF 5 y secuencias contiguas cortas.
El pase del virus hasta su atenuación se efectuó usando un nuevo procedimiento que daba como resultado una eficacia aumentada. En concreto, el virus se mantuvo en la fase de replicación logarítmica durante todos los múltiples pases de cultivo celular para acortar sustancialmente el tiempo hasta la atenuación. Esto se consigue asegurándose de que en cada cultivo celular exista un exceso sustancial de células inicialmente no infectadas respecto al número de virus presente. Así, transfiriendo sólo pequeñas cantidades de virus de un pase a otro, se asegura una replicación logarítmica.
En la práctica, el procedimiento se inicia normalmente por inoculación de varios cultivos celulares distintos con alícuotas virales progresivamente más pequeñas (es decir, menor cantidad de virus en cada cultivo). Por ejemplo, los cultivos de partida podrían contener alícuotas virales de 200 !l, 20 !l y 2 !l. Después de un periodo de incubación corto inicial (por ejemplo, �24 horas), las mismas alícuotas virales (en el ejemplo, de 200 !l, 20 !l y2 !l) de cada cultivo celular se transfieren a cultivos individuales recién preparados (previamente no infectados), mientras que los cultivos de partida se controlan hasta que se observa o no un efecto citopático (ECP). Este procedimiento se continúa en un orden en serie durante múltiples pases, usando las mismas alícuotas virales en cada caso y conservando los cultivos para la observación del ECP. Si todos los pases de cultivo en serie presentan ECP después de que se completen un número seleccionado de pases, puede terminarse la serie de mayor alícuota viral (en el ejemplo, de 200 !l y 20 !l), después de lo cual se emplea otra serie de alícuotas virales progresivamente más pequeñas (por ejemplo, de 2 !l, 0,2 !l y 0,02 !l) y el procedimiento se repite de nuevo, manteniendo de nuevo los cultivos celulares después de la transferencia para la observación del ECP.
En algún punto en este procedimiento de inoculación de alícuotas virales sucesivamente más pequeñas no se observará ECP en un cultivo celular dado. Cuando esto ocurre, el siguiente mayor nivel de alícuota viral que muestra ECP sustituye al pase en el que no se observó ECP, después de lo cual se inocularán pases posteriores usando las alícuotas virales previamente empleadas.
En vista de que un virus tenderá a volverse más eficaz en la infección de células y también a replicarse hasta un mayor título de infectividad para cultivos celulares con el tiempo (lo que es especialmente cierto con virus de ARN tales como el VSRRP), se observará que son necesarias alícuotas virales cada vez más pequeñas para mantener la infección durante la transferencia en serie. El uso de la alícuota más pequeña que mantiene la infección contribuye a asegurar que la replicación viral permanece en una fase logarítmica durante todo el procedimiento.
La secuencia de ADN del virus pasado atenuado del pase 201 se determinó después usando procedimientos convencionales. La secuencia de este virus atenuado se designó como VSM JA-142 Pase Nº 201, y cuya secuencia se proporciona como SEC ID Nº: 1. La secuencia del virus virulento, JA-142, se proporciona como SEC ID Nº: 2.
Tal como se usan en el presente documento, serán aplicables las definiciones siguientes: La “identidad de secuencia”, como se conoce en la técnica, se refiere a una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos
o más secuencias polinucleotídicas, en concreto una secuencia de referencia y una secuencia dada que se comparará con la secuencia de referencia. La identidad de secuencia se determina por comparación de la secuencia dada con la secuencia de referencia después de que las secuencias se hayan alineado óptimamente para producir el mayor grado de similitud de secuencia, según se determina por el emparejamiento entre hebras de dichas secuencias. Tras dicho alineamiento, se determina la identidad de secuencia en base a posición por posición, por ejemplo, las secuencias son “idénticas” en una posición particular si, en esa posición, los nucleótidos o restos aminoacídicos son idénticos. El número total de dichas identidades de posición se divide después entre el número total de nucleótidos o restos en la secuencia de referencia para dar el % de identidad de secuencia. La identidad de secuencia puede calcularse fácilmente por procedimientos conocidos, incluyendo, pero sin limitación, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, Nueva York (1988), Biocomputing: Informatics y Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York (1991); y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los procedimientos preferidos para determinar la identidad de secuencia están diseñados para dar el mayor emparejamiento entre las secuencias ensayadas. Los procedimientos para determinar la identidad de secuencia están codificados en programas informáticos disponibles públicamente que determinan la identidad de secuencia entre secuencias dadas. Los ejemplos de dichos programas incluyen, pero sin limitación, el paquete de programas GCG (Devereux, J. y col., Nucleic Acids Research, 12 (1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. y col., J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990). El programa BLASTX está disponible públicamente en el NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. y col., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. y col., J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990)).
Estos programas alinean óptimamente secuencias usando pesos de huecos por defecto para producir el mayor nivel de identidad de secuencia entre las secuencias dada y de referencia. Como ilustración, por un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene una “identidad de secuencia” de al menos, por ejemplo, el 95 % con una secuencia de nucleótidos de referencia se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido dado es idéntica a la secuencia de referencia excepto por que la secuencia polinucleotídica dada puede incluir hasta 5 mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, en un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 95 % respecto a la secuencia de nucleótidos de referencia, hasta el 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden delecionarse o sustituirse con otro nucleótido, o un número de nucleótidos de hasta el 5 % de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden aparecer en las posiciones terminales 5’ o 3’ de la secuencia de nucleótidos de referencia, o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleótidos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. De forma análoga, por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos dada que tiene, por ejemplo, una identidad de secuencia de al menos el 95 % con una secuencia de aminoácidos de referencia, se entiende que la secuencia de aminoácidos dada del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia excepto por que la secuencia polipeptídica dada puede incluir hasta 5 modificaciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia polipeptídica dada que tenga una identidad de secuencia de al menos el 95 % con una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta el 5 % de los restos aminoacídicos en la secuencia de referencia pueden delecionarse o sustituirse con otro aminoácido, o un número de aminoácidos de hasta el 5 % del número total de restos aminoacídicos en la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de referencia. Estas modificaciones de la secuencia de referencia pueden aparecer en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia, o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los restos de la secuencia de referencia o en el uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Preferentemente, las posiciones de restos que no son idénticos difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. Sin embargo, las sustituciones conservativas no se incluyen como un emparejamiento cuando se determina la identidad de secuencia.
De forma similar, la “homología de secuencia”, tal como se usa en el presente documento, también se refiere a un procedimiento para determinar el grado de relación de dos secuencias. Para determinar la homología de secuencia, dos o más secuencias se alinean óptimamente como se ha descrito anteriormente y se introducen huecos si es necesario. Sin embargo, al contrario que la “identidad de secuencia”, se cuentan las sustituciones de aminoácidos conservativas como emparejamiento cuando se determina la homología de secuencia. En otras palabras, para obtener un polipéptido o polinucleótido que tenga una homología de secuencia del 95 % con una secuencia de
referencia, el 95 % de los restos aminoacídicos o nucleótidos en la secuencia de referencia deben coincidir, o comprender una sustitución conservativa, con otro aminoácido o nucleótido, o un número de aminoácidos o nucleótidos de hasta el 5 % de los restos aminoacídicos o nucleótidos totales, sin incluir sustituciones conservativas, en la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de referencia.
Una “sustitución conservativa” se refiere a la sustitución de un resto aminoacídico o nucleótido con otro resto aminoacídico o nucleótido que tiene características similares o propiedades que incluyen tamaño, hidrofobicidad, etc., de modo que la funcionalidad global no cambia significativamente.
El término “aislado” significa alterado “por la mano del hombre” de su estado natural, es decir, si aparece en la naturaleza, se ha modificado o retirado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido presente de forma natural en un organismo vivo no está “aislado”, pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está “aislado”, según se emplea el término en el presente documento.
Preferentemente, las secuencias que comparten una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la SEC ID Nº: 1 son eficaces para conferir inmunidad a animales vacunados con virus atenuados que contienen dichas secuencias homólogas.
Descripción detallada de la realización preferente
Los ejemplos siguientes exponen realizaciones preferentes de la presente invención. Sin embargo, debe entenderse que estos ejemplos se proporcionan a modo de ilustración.
Ejemplo 1
Materiales y Procedimientos
Este ejemplo describe un procedimiento de pase para atenuar virus que maximiza la eficacia de atenuación asegurando que el virus esté preferentemente en una fase de replicación logarítmica. El virus se pasó (es decir, una alícuota de medio nutritivo que incluía el virus, células no unidas y residuos celulares de un cultivo celular infectado por virus se añadió al medio nutritivo de un cultivo no infectado) a intervalos diarios. Se añadieron diferentes cantidades de virus a cada intervalo usando múltiples cultivos. Por ejemplo, al principio, se transfirieron 200 !l a un cultivo no infectado, se añadieron 20 !l a un segundo cultivo no infectado y 2 !l a un tercer cultivo no infectado. El objetivo era tener una cantidad suficiente de células susceptibles de modo que los ciclos de replicación pudieran continuar hasta la transferencia siguiente. El procedimiento se consideraba exitoso si las células mostraban finalmente ECP. Sin embargo, debido a que el ECP inducido por VSRRP no aparece hasta cierto tiempo después de la fase de crecimiento logarítmica, los pases se realizaron antes de que se supiera si serían o no finalmente exitosos (“pases a ciegas”). Se decía que los pases que daban como resultado ECP inducido por virus habían dado como resultado una “toma”. Si un pase no daba como resultado una toma, el pase se reiniciaba la mayor dilución del último pase que daba como resultado una toma. A medida que se realizaban más y más pases, el virus se adaptaba más a replicarse en la línea celular y era menos capaz de producir síntomas de enfermedad en su huésped original. Estos cambios se producen por mutaciones aleatorias que se producen durante la replicación.
Usando este procedimiento, se usaron los procedimientos siguientes para pasar un virus ejemplar de acuerdo con la presente invención, VSM, JA-142. Esta cepa se pasó en cultivos celulares MARC-145 a intervalos diarios. Se usaron placas de veinticuatro pocillos para el procedimiento para minimizar la cantidad de células y de medio nutritivo necesaria y para simplificar la técnica de pase de múltiples alícuotas. Se añadieron células y medio nutritivo a cada pocillo y se dejó que las células formaran o casi formaran (más de aproximadamente el 70 %) una monocapa confluente. El medio nutritivo comprendía medio esencial mínimo (MEM) de solución salina equilibrada de Earle a aproximadamente el 90 %, suero fetal de ternera al 10 % y 0,05 mg/ml de sulfato de gentamicina. El volumen de medio nutritivo usado era de aproximadamente 1 ml. Habitualmente se usaron tres pocillos de una columna para cada cantidad de virus que se transfirió. Una alícuota de medio nutritivo del pase anterior se transfirió al primer pocillo de la columna a las 48 ó 72 horas, después de que se hubieran preparado los cultivos celulares, medio nutritivo del primer pocillo se transfirió al segundo pocillo de la misma columna a las 72 ó 96 horas y al tercer pocillo de la misma columna a las 96 ó 120 horas. Las placas se preparaban habitualmente dos veces por semana, de modo que a veces se usaba el cuarto pocillo de la columna y a veces no se usaba. Las condiciones de pase se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera húmeda que contenía CO2 al 5 %.
Se analizaron alícuotas de diferentes tamaños (que tenían diferentes cantidades de virus) para cada pase para determinar si la cantidad de virus era suficiente para inducir el ECP. Por ejemplo, se usó una serie distinta de transferencias de alícuotas (pases) de 200 !l, 20 !l y 2 !l, respectivamente, hasta que las alícuotas más pequeñas presentaban sistemáticamente ECP, siendo el objetivo transferir la alícuota más pequeña que producía ECP. Cuando la alícuota más pequeña (por ejemplo, de 2 !l) del grupo de alícuotas que se estaba ensayando daba como resultado sistemáticamente ECP, se ensayaban cantidades menores (por ejemplo, de 0,2 !l y 0,02 !l). Cuando una
dilución determinada no presentaba ECP, esa serie de cultivos se reiniciaba con la siguiente menor cantidad que
daba como resultado ECP a ese pase (es decir, si la transferencia de 2 !l no tenía éxito produciendo ECP en el pase
25 pero la transferencia de 20 !l en el pase 25 tenía éxito, la transferencia de 2 !l se repetía usando 20 !l,
5 reanudando las transferencias de 2 !l para el pase 26).
Usando este procedimiento, se determinaba la menor cantidad de virus que era necesario transferir para obtener
ECP. El virus se pasaba con éxito a intervalos diarios usando las cantidades siguientes de medio nutritivo infectado
por virus (que reflejan la mayor dilución [es decir, la alícuota más pequeña] que daba como resultado ECP, teniendo
presente que también funcionarían otras diluciones): 10
Número de Pase Cantidad Transferida
3-21 200 !l
22, 23 20 !l
24-41 200 !l
42-83 20/200 !l (con alternancia)
84-90 20 !l
91-112 2 !g
113 0,2 !l
114-116 2 !l
117 0,2 !l
118-120 2 !l
121 0,2 !l
122-124 2 !l
125-167 0,2 !l
168 0,02 !l
169-171 0,2 !l
172 0,02 !l
173-175 0,2 !l
176 0,02 !l
177-179 0,2 !l
180 0,02 !l
181-183 0,2 !l
184 0,02 !l
185-187 0,2 !l
188 0,02 !l
(continuación)
Número de Pase Cantidad Transferida
189-191 0,2 !l
192 0,02 !l
193-195 0,2 !l
196 0,02 !l
197 0,2 !l
Resultados y Discusión
El pase de los virus usando el procedimiento anterior daba como resultado un VSRRP atenuado, JA-142. Como es evidente, el virus se adaptaba más a replicarse en el cultivo celular y por lo tanto requería que se transfiriera una menor cantidad de medio nutritivo infectado por virus a medida que continuaban los pases. Para transferencias usando una cantidad muy pequeña de medio nutritivo infectado por virus (por ejemplo, de 0,2 !l o 0,02 !l) era necesaria una dilución distinta. Esta dilución se efectuaba añadiendo una pequeña cantidad de medio nutritivo infectado por virus a una mayor cantidad de medio nutritivo. Por ejemplo, para obtener una transferencia de 0,2 !l, se añadían 2 !l de medio nutritivo infectado por virus a 20 !l a medio nutritivo y se añadían 2 !l de esta dilución al siguiente cultivo en la serie. Usando esta estrategia, se usaba la mayor dilución que daba como resultado un ECP y se minimizaba el tiempo necesario para pasar el virus. El pase a intervalos diarios aseguraba que el virus estaba siempre en una fase de replicación logarítmica. La transferencia diaria también aseguraba que hubiera un número adecuado de células para la replicación del virus.
Debido a que las mutaciones (que probablemente son acumulativas) que probablemente dan como resultado la atenuación sólo se producen durante la replicación, no supone una ventaja tener sustancialmente todas las células infectadas ni que la replicación se desarrolle a una velocidad más lenta o se detenga antes de la siguiente transferencia. Basándose en estudios previos del VSRRP, se sabía que el ciclo de replicación es de aproximadamente 8 horas, por lo tanto, transferir una cantidad mínima de virus de medio nutritivo infectado por virus a medio nutritivo no infectado a intervalos diarios da como resultado que el virus tenga siempre muchas células en las que replicarse.
Como puede apreciarse fácilmente, el pase usando este procedimiento da como resultado ahorros de tiempo que hasta ahora se creían imposibles (es decir, cada pase requería menos tiempo). Esto es especialmente importante cuando son necesarios un alto número de pases para una atenuación viral adecuada. Si cada pase, usando los procedimientos antiguos, se realizaba a un intervalo de 3 días, un procedimiento que requiera 200 pases llevaría 400 días menos usando el procedimiento de la presente invención.
Ejemplo 2
Materiales y Procedimientos
Este ejemplo determinó si el pase 200 del virus del SRRP, JA-142, revertiría a virulento cuando se pasase en el animal huésped seis veces. Este estudio estaba constituido por seis grupos. Cinco cerdos del grupo 1 (grupo principal) se inocularon por vía intranasal con VSM de SRRP, JA-142 pase 200, mientras que tres cerdos del grupos 1A (grupo de control) se inocularon por vía intranasal con diluyente estéril. A los animales se les suministró pienso comercial y agua ad libitum durante todo el estudio. Los cerdos de ambos grupos de tratamiento se controlaron diariamente para determinar los signos clínicos (aspecto, signos respiratorios, heces, etc.). Después de seis días, los animales se pesaron, se les extrajo sangre y se sacrificaron. Después de puntuar los pulmones para las lesiones, se recogieron lavados pulmonares de cada animal. Los lavados pulmonares se congelaron y se descongelaron una vez, y se preparó una combinación usando 2,0 ml de suero y 2,0 ml de lavado pulmonar de cada animal dentro de un grupo para preparar los Retropases 1 y 1A, respectivamente. Esta combinación se usó para exponer (por vía intranasal) a los animales del grupo 2 y del grupo 2A, respectivamente. Este procedimiento se repitió para los grupos 3 y 3A a 6 y 6A. Los animales de cada grupo se alojaron por separado pero en condiciones idénticas.
Después de la inoculación, se recogieron muestras de sangre y se controlaron las temperaturas corporales. Se midieron las temperaturas rectales para cada animal periódicamente desde -1 DPE (días post-exposición) a 6 DPE y se calculó el promedio junto con las temperaturas de otros animales del mismo grupo. El estado de salud de cada animal se controló diariamente durante la duración del estudio. Los resultados se recopilaron y se puntuaron en
forma de observación diaria. Los parámetros de puntuación son los siguientes:
- 1.
- Aspecto normal = 0; deprimido = 1; excitado = 2; comatoso/muerto = 30.
- 2.
- Respiración normal = 0; estornudos = 1; tos = 1; rápida/lenta = 2; con dificultad = 3.
- 3.
- Heces normales = 0; secas = 1; sueltas = 2; fluidas = 3.
- 4.
- Ojos normales = 0; llorosos = 1; apagados = 2; hundidos = 3.
- 5.
- Orificios nasales normales = 0; exudado seroso = 1; enrojecidos/inflamados = 2; úlceras con costras = 3.
- 6.
- Boca normal = 0; babas = 2; úlceras = 3.
- 7.
- Actividad NA
- 8.
- Apetito normal = 0; disminuido = 1; anoréxicos (ninguno) = 3.
- 9.
- Otros
Los animales también se pesaron antes de la inoculación y en la necropsia. Se calculó el promedio del aumento de peso para cada grupo para su comparación. Se realizaron ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) y ensayos de neutralización de suero (NS) de SRRP después de las exposiciones de los animales a artículos de 5 ensayo y de control. Se realizaron intentos para aislar VSRRP de muestras de suero en células MA-104. Antes y después de la vacunación, se determinaron los recuentos de leucocitos totales usando un COULTER COUNTER MODEL Z1, Coulter Corp., Miami, FL. En la necropsia, se puntuaron los pulmones de cada animal. La puntuación del pulmón se realizó separando el pulmón en 7 secciones y determinando el porcentaje de implicación pulmonar (el porcentaje del área pulmonar afectada como se muestra por lesiones o enrojecimiento para cada sección y
10 multiplicando por el área aproximada de pulmón total) del porcentaje de área pulmonar total que abarca la sección. Los parámetros para la puntuación pulmonar son los siguientes:
% de Implicación del Lóbulo Apical Izquierdo X 0,10 = _ % de Implicación del Lóbulo Cardiaco Izquierdo X 0,10 = _ % de Implicación del Lóbulo Diafragmático Izquierdo X 0,25 = _ % de Implicación del Lóbulo Apical Derecho X 0,10 = _ % de Implicación del Lóbulo Cardiaco Derecho X 0,10 = _ % de Implicación del Lóbulo Diafragmático Derecho X 0,25 = _ % de Implicación del Lóbulo Intermedio del Pulmón Derecho X 0,10 = _ Total (Suma de los valores en la columna más a la derecha) = _
Resultados y Discusión
Cada grupo de cerdos se controló durante seis días después de la vacunación. Las puntuaciones clínicas eran bajas en todos los grupos. Los resultados de las puntuaciones clínicas se proporcionan en la Tabla 1.
TABLA 1
- Puntuaciones Clínicas Diarias
- Tratamiento
- Grupo 1 Nº de Cerdo Día -1 Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Promedio
- JA-142 pase 200
- 545 0 0 2 0 0 0 0 0 0,25
- 551
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 561
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 565
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 806
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Promedio
- 0 0 0,4 0 0 0 0 0 0,05
- Solución salina
- 550 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 568
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 801
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Promedio
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Tratamiento
- Grupo 2 Nº de Cerdo Día -1 Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Promedio
- Retropase 1
- 546 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 553
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 562
- 0 0 0 0 0 1 0 0 0,125
- 572
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 573
- 0 0 0 0 2 0 0 0 0,25
- Promedio
- 0 0 0 0 0,4 0,2 0 0 0,075
- Retropase 1
- 556 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 566
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 802
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Promedio
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
(continuación)
- Tratamiento
- Grupo 3 Nº de Cerdo Día -1 Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Promedio
- Retropase 2
- 548 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 567
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 569
- 0 0 0 0 1 1 0 0 0,25
- 574
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 804
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Promedio
- 0 0 0 0 0,2 0,2 0 0 0,05
- Retropase 2A
- 547 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 5564
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 805
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Promedio
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Tratamiento
- Grupo 4 Nº de Cerdo Día -1 Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Promedio
- Retropase 3
- 549 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 554
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 563
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 570
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 803
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Promedio
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Retropase 3A
- 560 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 571
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 575
- 0 0 0 0 0 0 0 0
- Promedio
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Tratamiento
- Grupo 5 Nº de Cerdo Día -1 Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Promedio
- Retropase 4
- 1 0 2 0 0 2 0 2 2 1
- 2
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 3
- 2 0 2 2 2 2 2 2,0 1,75
(continuación)
- Tratamiento
- Grupo 5 Nº de Cerdo Día -1 Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Promedio
- 4
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 5
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Promedio
- 0,4 0,4 0,4 0,4 0,8 0,4 0,8 0,8 0,55
- Retropase 4A
- 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 7
- 0 0 2 2 2 2 2 2 1,5
- 8
- 0 0 0 0 0 0 0 00 0
- Promedio
- 0 0,08 0,48 0,48 0,56 0,48 0,56 0,56 0,4
- Tratamiento
- Grupo 6 Nº de Cerdo Día -1 Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Promedio
- Retropase 5
- 10 0 0 0 0 2 0 0 2 0,5
- 12
- 0 0 0 2 2 0 0 2 0,75
- 14
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 15
- 2 2 2 0 0 0 0 0 1
- 16
- 2 2 2 0 0 1 1 2 1,25
- Promedio
- 0,8 0,8 0,8 0,4 0,8 0,2 0,2 1,6 0,7
- Retropase 5A
- 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 11
- 2 2 0 0 0 0 0 0 0,5
- 13
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Promedio
- 0,666667 0,56 0,16 0,08 0,16 0,04 0,04 0,32 0,253333
No había diferencias significativas entre grupos para las temperaturas rectales o los aumentos de peso diarios. 5 Todas las puntuaciones pulmonares eran negativas.
Serológicamente, las proporciones de S/P de ELISA y títulos de NS eran negativos durante todo el periodo de ensayo de cada grupo. Se intentó el aislamiento de virus en todas las muestras de suero y lavados pulmonares. El día 6, el 60-100 % de las muestras de suero de los grupos a los que se les administró JA-142, pase 200, y retropases posteriores eran positivos. Los grupos a los que se les administró solución salina eran negativos. En los
10 tres primeros pases se recuperó virus en los lavados pulmonares de sólo el 20-40 % de los cerdos, pero en los últimos tres pases, el virus se recuperó del 50-80 % de los cerdos.
Basándose en estos datos, el JA-142 pase 200 no revertía a virulento cuando se pasaba por cerdos seis veces.
Ejemplo 3
Materiales y Procedimientos
Este ejemplo demostró que el nivel de atenuación de seguridad de VSM, JA-142, pase 200 no cambiaba significativamente durante seis retropases en el animal huésped. La evaluación del nivel de atenuación o seguridad se realizó usando el modelo de cerda gestante y controlando el efecto sobre el rendimiento reproductivo. Este modelo es el sistema de ensayo más sensible y no depende de factores subjetivos para el ensayo de la virulencia. Este ejemplo estaba constituido por cuatro grupos (A, B, C y D) que tenían siete cerdas por grupo. El grupo A se inoculó por vía intranasal con VSM de SRRP, JA-142 pase 200. El grupo B se inoculó por vía intranasal con JA-142 pase 200, retropase 6. El grupo C se inoculó por vía intranasal con diluyente estéril, para que actuaran como controles normales. El grupo D se inoculó por vía intranasal con VSRRP JA-142 pase 4. Los artículos de ensayo (exposición a JA-142, pase 4) se administraron a aproximadamente 93 días de gestación. Se controlaron las temperaturas corporales de las cerdas durante los siete primeros días después de la vacunación. Se recogieron muestras de sangre de las cerdas una vez por semana y en el momento del parto. Se recogieron muestras de sangre y se registraron los pesos de los lechones al nacimiento, a los 7 y 14 días de edad. El estado de salud de cada animal se controló diariamente durante la duración del estudio hasta y después del parto durante 14 días. El rendimiento del parto se evaluó observando el estado de salud de los lechones nacidos.
Se realizaron ensayos de ELISA de SRRP después de las exposiciones de las cerdas al artículo de ensayo. También se realizaron ensayos de ELISA de SRRP en los sueros de lechones semanalmente después del parto. Después de la exposición al artículo de ensayo, se realizaron intentos para aislar VSRRP de muestras de suero en células MA
104. Se midieron las temperaturas rectales periódicamente desde 0 días post-vacunación (DPV) a 7 DPV, y se determinó la temperatura promedia de cada grupo. Antes y después de la inoculación, se determinaron los recuentos de leucocitos totales como en el Ejemplo 1. Se realizaron observaciones clínicas de las cerdas como en el Ejemplo 2, desde -1 DPV hasta el parto. Se realizaron observaciones clínicas de los lechones desde el parto hasta los 14 días de edad. Por último, en la necropsia se puntuaron los pulmones de cada lechón para determinar el porcentaje de implicación pulmonar.
Resultados
Los resultados de ELISA indican que los animales usados en el presente estudio no habían recibido una exposición previa a VSRRP. Los animales que recibieron inóculos de virus, los grupos A, B y D, presentaban seroconversión a los 14 días post-tratamiento. Tres cerdas del grupo B permanecían negativas a los 14 días post-tratamiento. En el momento del parto, las cerdas negativas del grupo B daban positivo en el ensayo para anticuerpos contra VSRRP.
Los resultados de ELISA de los cerdos indicaban que la mayoría de las muestras de lechones nacidos de las cerdas del grupo A y del grupo B se tomaron después de que hubieran mamado. Esos cerdos que eran negativos a cero días post-parto (0 DPP) daban positivo en el ensayo a 7 DPP. Todos los cerdos nacidos de cerdas del grupo C eran seronegativos en el ensayo durante todo el estudio. Sólo se ensayaron unos pocos cerdos del grupo D, puesto que la mayoría eran mortinatos o estaban momificados. La mitad de esos cerdos que se ensayaron eran seropositivos. Esto indicaba que se tomaron muestras de los cerdos seronegativos antes de que mamaran, o que no fueron capaces de mamar. Todos los lechones nacidos de cerdas del grupo D murieron antes de 7 DPP. Los aislamientos de VSRRP de las cerdas de los grupos A y B eran esporádicos. Aunque los resultados del ensayo de ELISA indicaban que estas cerdas se inocularon con éxito con los artículos de ensayo virales, muchas permanecían negativas para aislamiento de virus a partir de suero.
La mayoría de los cerdos nacidos de cerdas de los grupos A y B daban positivo en el ensayo para aislamiento de virus durante la realización del estudio. La camada nacida de una cerda del grupo A nunca dio positivo en el ensayo y en la camada nacida de una cerda del grupo B sólo dos de ocho lechones dieron positivo en el ensayo para aislamiento de virus. No se recuperó virus de los lechones nacidos de cerdas del grupo C. Se recuperó virus de la mayoría (71 %) de los lechones nacidos de cerdas del grupo D.
Las temperaturas rectales post-tratamiento eran corrientes. Los grupos que se trataron con VSM, retropase 6 o diluyente estéril no tuvieron mediciones que superasen los 38,72ºC (101,7ºF). El grupo D, tratado con JA-142, pase 4, tenía cuatro (de siete) cerdas que sufrieron temperaturas que superaban los 38,89ºC (102ºF), alcanzando una cerda 39,67ºC (103,4ºF) durante uno de los días. El comportamiento de aumento de peso de los lechones nacidos de cerdas de los grupos A (tratado con VSM) y B (tratados con VSM, retropase 6) era superior que el de los cerdos nacidos de cerdas de control del grupo C. El promedio de aumento de peso para el periodo de observación de 14 días era de 3,58 kg (7,9 lb). Para el grupo A era de 3,49 kg (7,7 lb); para el grupo B y el grupo C era de 3,13 kg (6,9 lb). La diferencia en el aumento de peso no estaba relacionada con el tamaño de la camada restante a los 14 días. Los tamaños de camada promedios a los 14 días post-parto (DPP) eran de 9 para el grupo A, 7 para el grupo B y 10 para el grupo C. Ningún cerdo nacido de las cerdas del grupo D sobrevivió más allá de 3 DPP.
Los recuentos de leucocitos (WBC) para las cerdas de los grupos A, B y C permanecían relativamente constantes. Los porcentajes promedios de los valores pre-exposición eran equivalentes a o superiores al 92 % durante la duración del periodo de observación. Tres cerdas del grupo D tenían recuentos de WBC que eran inferiores al intervalo normal esperado (7-20 x 106/ml).
5 Las puntuaciones clínicas post-inoculación eran corrientes para las cerdas de los grupos A y B. Se observó que varias cerdas del grupo C experimentaban signos clínicos durante un periodo de varios días. La mayoría de los síntomas clínicos observados estaban en la categoría de apetito disminuido, síntomas respiratorios y depresión. Una cerda del grupo C murió el día 31 del ensayo de neumonía bacteriana crónica. Se observó que seis de las siete cerdas del grupo D tenían signos clínicos, principalmente de grados variables de gravedad, de pérdida de apetito,
10 que variaban desde disminuido hasta anoréxico. Los resultados de la puntuación clínica se proporcionan en la Tabla
2.
TABLA 2
- Puntuaciones Clínicas de Cerdas
- Tratamiento
- Nº Cerda -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
- Grupo A
- 98 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- JA-142 VSM
- 133 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Pase 200
- 147 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 178
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 215
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 233
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 243
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Prom.
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 13
- 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
- Grupo A
- 98 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- JA-142 VSM
- 133 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Pase 200
- 147 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 178
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 215
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 233
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 243
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Prom.
- 0 0,6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 29
- 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
- Grupo A
- 98 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
(continuación)
- 29
- 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
- JA-142 VSM
- 133 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
- Pase 200
- 147 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 178
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 215
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 233
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 243
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Prom.
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Tratamiento
- Nº Cerda -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
- Grupo B
- 49 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Retropase 6
- 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 135
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 149
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
- 209
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 212
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 226
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Prom.
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
- 13
- 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
- Grupo B
- 49 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Retropase 6
- 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 135
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
(continuación)
- 13
- 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
- 149
- 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
- 209
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 212
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 226
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Prom.
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 29
- 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
- Grupo B
- 49 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Retropase 6
- 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 135
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 149
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2
- 209
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 212
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 226
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Prom.
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
- Tratamiento
- Nº Cerda -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
- Grupo C
- 58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Diluyente Estéril
- 113 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 3 3 5 3 3
- 117
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1
- 144
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 156
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
(continuación) (continuación)
- -3
- -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
- 166
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Prom.
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,2 0,5 0,5 0,8 0,7 0,7
- 13
- 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
- Grupo C
- 58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Diluyente Estéril
- 113 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 6 6 2 4 2 2
- 117
- 0 0 0 0 0 0 1 5 5 5 5 5 2 4 1 1
- 144
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 156
- 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 166
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Prom.
- 0,8 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,8 1,5 1,5 1,5 1,8 1,8 0,7 1,3 0,5 0,5
- 29
- 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
- Grupo C
- 58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Diluyente Estéril
- 113 2 2 30
- 117
- 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 144
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1
- 156
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 166
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Prom.
- 0,7 0,7 6 0 0 0 0 0 0 0 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
- Tratamiento
- Nº Cerda -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
- Grupo D
- 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1
- -3
- -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
- JA-142
- 106 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1
- Pase 4
- 159 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 1 1 1 1 1 1
- 190
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
- 206
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0
- 232
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 234
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1
- Prom.
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,6 0,6 0,6 0,6 0,7 0,7 0,7
- 13
- 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
- Grupo D
- 2 1 1 3 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- JA-142
- 106 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Pase 4
- 159 1 1 1 1 3 4 2 3 3 3 2 0 0 2 0 0
- 190
- 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 206
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 232
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 234
- 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Prom.
- 0,4 0,3 0,6 0,6 0,6 0,6 0,3 0,4 0,4 0,4 0,3 0 0 0,3 0 0
- 29
- 30 31 32 33 34 35 36 37 38
- Grupo D
- 2 0 0 0 1 1 1 3 3 1 1
- JA-142
- 106 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Pase 4
- 159 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
(continuación)
- 29
- 30 31 32 33 34 35 36 37 38
- 190
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 206
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 232
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 234
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Prom.
- 0 0 0 0,1 0,1 0,1 0,4 0,4 0,1 0,1
Las observaciones clínicas de los lechones se incluían en dos categorías principales, muerte y apetito reducido. No había diferencias significativas entre los grupos A, B y C en el área del promedio de muertes por camada (MPC). El grupo A tenía un promedio de 1,3 MPC, el grupo B tenía un promedio de 2,4 MPC, el grupo C tenía un promedio de 2,0 MPC y ningún cerdo del grupo D sobrevivió más allá de tres días post-parto. Las puntuaciones clínicas para los lechones se proporcionan en la Tabla 3.
TABLA 3
- Tratamiento
- Nº Cerda Nº Cerdo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
- Grupo A
- 98 813 0 0 1 30
- JA-142
- 814 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Pase 200
- 815 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 816
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 817
- 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 818
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 819
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 820
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 821
- 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 822
- 1 30
- Prom.
- 0,3 3 0,2 3,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 133
- 720 30
- 721
- 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 722
- 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 723
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 724
- 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0
(continuación)
- Tratamiento
- Nº Cerda Nº Cerdo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
- 725
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 798
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 799
- 30
- 800
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 807
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0
- 809
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 810
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 812
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Prom.
- 4,6 0,2 0 0,1 0 0,1 0 0 0 0 0 0,1 0 0
- 147
- 823 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 824
- 0 0 0 0 0 0 0 3 1 1 1 1 1 1
- 825
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 845
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 846
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 847
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 848
- 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
- 849
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2
- 850
- 30
(continuación)
- Tratamiento
- Nº Cerda Nº Cerdo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
- 976
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 977
- 0 0 0 0 1 1 3 30
- 978
- 30
- Prom.
- 5 0 0 0 0,1 0,1 0,4 3,3 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,3
- 178
- 486 30
- 487
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0
- 488
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 489
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 490
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 491
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 492
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 493
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 494
- 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Prom.
- 3,3 0,1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,1 0 0
- Grupo A
- 215 495 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- JA-142
- 496 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Pase 200
- 497 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 498
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
(continuación)
- Tratamiento
- Nº Cerda Nº Cerdo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
- 499
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 500
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 808
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Prom.
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 233
- 476 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 477
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 478
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 479
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 480
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 481
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 482
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 483
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 484
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 485
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Prom.
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 243
- 707 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 708
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 709
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
(continuación)
- Tratamiento
- Nº Cerda Nº Cerdo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
- 710
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 711
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 712
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 713
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 30
- 714
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 715
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 716
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 717
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0
- 718
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0
- 719
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Prom.
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,1 2,3 0,2 0 0
- Grupo B
- Retropase 6
- 49 430 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 431
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 432
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 433
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 434
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 435
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
(continuación)
- Tratamiento
- Nº Cerda Nº Cerdo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
- 436
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 437
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 438
- 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Prom.
- 3,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 100
- 459 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 460
- 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0
- 461
- 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0
- 462
- 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
- 463
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 464
- 0 0 1 1 1 1 30
- 465
- 0 30
- Prom.
- 0 4,3 0,2 0,2 0,3 0,3 5,3 0,4 0,4 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
- 135
- 439 0 0 0 0 0 0 0 30
- 440
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 441
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 442
- 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 3 3 3 30
- 443
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 444
- 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0
(continuación)
- Tratamiento
- Nº Cerda Nº Cerdo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
- 445
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 446
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 447
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Prom.
- 0 0 0 0,1 0,1 0,1 0,2 3,6 0,1 0,1 0,4 0,4 0,4 3,8
- 149
- 231 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 232
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 233
- 0 0 0 0 0 0 30
- 234
- 0 0 0 0 0 0 3 1 1 3 1 1 1 1
- 235
- 0 0 0 0 0 0 3 2 3 3 0 0 0 0
- 236
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 237
- 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
- 238
- 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0
- 239
- 0 0 30
- 240
- 30
- 241
- 3 30
- 242
- 0 0 0 0 0 2 3 3 30
- Prom.
- 2,8 2,7 3 0 0 0,4 4,4 0,9 4,4 1 0,3 0,3 0,3 0,3
(continuación)
- Tratamiento
- Nº Cerda Nº Cerdo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
- Grupo B
- 209 448 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Retropase 6
- 449 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 450
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 451
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
- 452
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 453
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 454
- 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1
- 455
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1
- 456
- 30
- 457
- 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1 1 1 1 1
- 458
- 30
- Prom.
- 5,5 0 0 0 0 0 0 0 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4
- 212
- 243 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 244
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 245
- 0 0 0 0 3 1 30
- 246
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 247
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 248
- 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0
(continuación)
- Tratamiento
- Nº Cerda Nº Cerdo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
- 249
- 0 0 0 0 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0
- 250
- 0 0 0 3 30
- 426
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 427
- 0 0 0 1 3 1 1 30
- 428
- 0 0 0 1 3 3 30
- 429
- 0 0 0 0 2 3 3 3 3 3 3 1 30
- Prom.
- 0 0 0 0,4 3,6 0,9 6,2 3,9 0,4 0,4 0,6 0,1 3,8 0
- 226
- No gest.
- Tratamiento
- Nº Cerda Nº Cerdo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
- Grupo C
- Diluyente Estéril
- 58 24 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 25
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 46
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 47
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 48
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 49
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 50
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 51
- 0 0 0 2 2 1 1 1 30
(continuación)
- Tratamiento
- Nº Cerda Nº Cerdo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
- Prom.
- 0 0 0 0,3 0,3 0,1 0,1 0,1 3,8 0 0 0 0 0
- 113
- 17 30
- 18
- 30
- 19
- 30
- 20
- 30
- 21
- 0 30
- 22
- 30
- 23
- 30
- Prom.
- 25,7 30
- 117
- 52 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 53
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 54
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 55
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 56
- 1 0 0 0 30
- 57
- 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 58
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
(continuación)
- Tratamiento
- Nº Cerda Nº Cerdo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
- 59
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 60
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0
- 61
- 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0
- 62
- 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Prom.
- 0,5 0 0 0 2,7 0 0 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0 0
- 144
- 146 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 147
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0
- 148
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0
- 149
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0
- 150
- 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0
- 221
- 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 0 0
- 222
- 0 0 0 0 0 2 2 1 1 1 1 1 0 1
- 223
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 224
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 225
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 970
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 971
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
(continuación)
- Tratamiento
- Nº Cerda Nº Cerdo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
- Prom.
- 0 0 0 0 0 0,3 0,3 0,1 0,2 0,1 0,2 0,2 0,1 0,1
- Grupo C
- 156 63 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Diluyente Estéril
- 64 0 0 1 0 30
- 65
- 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0
- 66
- 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 67
- 0 0 0 0 1 0 1 1 30
- 68
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 69
- 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0
- 70
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 71
- 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 1 0
- 72
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 73
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 74
- 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 75
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Prom.
- 0 0 0,1 0 2,5 0,2 0,3 0,3 2,6 0,1 0,1 0,1 0,1 0
- 166
- 76 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
(continuación)
- Tratamiento
- Nº Cerda Nº Cerdo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
- 77
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 78
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 79
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 80
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 81
- 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 141
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 142
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 143
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 144
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 145
- 1 30
- Prom.
- 0,2 2,7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Tratamiento
- Nº Cerda Nº Cerdo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
- Grupo D
- JA-142
- 2 891 1 3 30
- Pase 4
- 892 1 30
- Prom.
- 1 16,5 30
- 106
- Abortado NA
(continuación)
- Tratamiento
- Nº Cerda Nº Cerdo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
- 159
- 883 30
- 884
- 30
- Prom.
- 30
- 190
- Abortado NA
- 206
- 890 30
- Prom.
- 30
- 232
- 888 30
- 889
- 30
- Prom.
- 30
- 234
- Abortado NA
Los resultados de rendimiento de parto proporcionaban las diferencias y similitudes más espectaculares entre los diversos grupos de tratamiento. Puesto que los tratamientos no tendrían un efecto sobre el tamaño de las camadas, la forma más apropiada de comparar los resultados de partos sería usando valores de porcentaje. El grupo A tenía un porcentaje promedio de vivos/nacidos del 85 % (DT +/- 9,6). El grupo B tenía un porcentaje promedio de vivos/nacidos del 89 % (DT +/- 11,6). El grupo de control (grupo C) tenía un porcentaje promedio de vivos/nacidos del 83,4 % (DT +/- 7,9). Los porcentajes promedios para mortinatos para los grupos A, B y C eran del 8,8 (DT +/- 9,66), 6,6 (DT +/- 9,7) y 14 (DT +/- 11,39), respectivamente. Los porcentajes promedios de momificados nacidos de cerdas de los grupos A, B y C eran del 6,1 (DT +/- 6,01), 3,9 (DT +/- 4,45) y 2,6 (DT +/- 4,01), respectivamente. Los porcentajes promedios de vivos/nacidos, mortinatos y momificados nacidos de las cerdas del grupo D eran del 8,7 (DT +/- 8,92), 10,7 (DT +/- 11,39) y 81,9 (DT +/- 17,18), respectivamente.
Los resultados de este ejemplo demostraban la estabilidad del VSM, JA-142, pase 200, después de pasarse en el animal huésped seis veces. No había diferencias significativas entre el grupo de cerdas tratadas con el VSM (grupo A) y las cerdas que se expusieron al virus del retropase 6 (grupo B) en las categorías de rendimiento de parto, leucopenia, temperaturas rectales y observaciones clínicas de las cerdas o de los lechones. Además, los resultados en estas mismas categorías para los grupos A y B eran comparables a los conseguidos por el grupo C, que se había tratado con diluyente estéril. Por último, el rendimiento de las cerdas que se habían expuesto al virus parental virulento de VSM, JA-142, pase 4, ilustraba claramente el nivel de atenuación del VSM y la ausencia de reversión a virulencia por el virus JA-142 retropase 6.
Ejemplo 4
Materiales y Procedimientos
Este ejemplo evaluó la seguridad y el nivel de atenuación de administrar una concentración 10X de VSM, JA-142, pase 201. El estudio se realizó en el modelo de cerda gestante y se controló el efecto de esta dosificación sobre el rendimiento reproductivo. El estudio estaba constituido por tres grupos, A, C y D. El grupo A se inoculó por vía intranasal con VSM de SRRP, JA-142, pase 200. El grupo C se inoculó por vía intranasal con diluyente estéril para que actuara como grupo de control normal. El grupo D se inoculó por vía intranasal con JA-142 pase 201 10X. Todas las inoculaciones se administraron a aproximadamente 93 días de gestación. Se controlaron las temperaturas corporales de las cerdas durante los primeros siete días después de la inoculación (vacunación). Se recogieron muestras de sangre de las cerdas una vez por semana y en el momento del parto. Antes y después de la inoculación, se determinaron los recuentos de leucocitos totales como en el Ejemplo 2. El estado de salud de cada animal se controló diariamente durante la duración del estudio hasta y después del parto durante 14 días. Se realizaron observaciones clínicas de las cerdas desde -1 DPV hasta el parto. El rendimiento del parto se evaluó por observación del estado de salud de los lechones nacidos. Se realizaron ensayos de ELISA de VSRRP después de las exposiciones de las cerdas al artículo de ensayo. Se realizaron intentos para aislar VSRRP de muestras de suero en células MA-104 después de la exposición al artículo de ensayo. Se realizaron observaciones clínicas de los lechones desde el parto hasta los 14 días de edad. Se recogieron muestras de sangre de los lechones al nacimiento, a los 7 y 14 días de edad. Se realizaron ensayos de ELISA de VSRRP en los sueros de lechones semanalmente después del parto. Los lechones también se pesaron al nacimiento, el día 7 post-parto y en la necropsia. En la necropsia, los pulmones de cada lechón se puntuaron para determinar el porcentaje de implicación pulmonar.
Resultados y Discusión
No había diferencias significativas entre los grupos a los que se les administró una dosis 10X de VSM, JA-142, pase 201, los grupos a los que se les administró una dosis normal de VSM, JA-142, pase 200, y los grupos a los que se les administró diluyente estéril. Por lo tanto, basándose en la seguridad y la atenuación de VSM, JA-142, pase 200 y en la ausencia de cualquier diferencia significativa en los resultados que comparan estos grupos, se demostró que una dosis 10X de VSM , JA-142, pase 201 era segura, estaba atenuada y era eficaz para inducir anticuerpos contra VSRRP.
Ejemplo 5
Materiales y Procedimientos
Este ejemplo demostró que una dosis de vacuna mínima de VSRRP, JA-142, pase 205 que representa VSM+5 es eficaz en un modelo de exposición respiratoria experimental en cerdos de engorde. Se dividieron los cerdos en tres grupos. El grupo 1 se inoculó por vía intramuscular con VSM de SRRP, JA-142 pase 205 a un título de 2,0 log/dosis. El grupo 2 se inoculó por vía intramuscular con diluyente estéril. El grupo 3 actuó como control normal. Los cerdos de
los grupos 1 y 2 se expusieron a un aislado de VSRRP con un patrón de RFLP de 144 a día 28 post-vacunación. Se controlaron las temperaturas corporales de los cerdos durante los siete primeros días después de la vacunación y diariamente después de la exposición. Cada animal se pesó en la vacunación, en la exposición, semanalmente durante todo el estudio y en la necropsia. Se recogieron muestras de sangre semanalmente después de la vacunación y cada dos días después de la exposición. Se controló el estado de salud de cada animal diariamente durante la duración del estudio. En la necropsia, se sacrificó cada animal y los pulmones se puntuaron para determinar el porcentaje de implicación pulmonar como en el Ejemplo 2. Se realizaron ensayos de ELISA de VSRRP después de las exposiciones de los cerdos a los artículos de ensayo y exposición. Después de la exposición a los artículos de ensayo, se realizaron intentos para aislar VSRRP de muestras de suero en células MA-104. Se analizaron los resultados de aislamiento de virus y ELISA usando un análisis de l2 que ensaya si el porcentaje de animales positivos es el mismo en cada grupo. Se realizaron recuentos de leucocitos como en el Ejemplo 2.
Resultados y Discusión
A los cerdos del grupo 1 (cerdos vacunados) les fue mejor en todos los aspectos de este ejemplo de lo que les fue a los cerdos del grupo 2 (cerdos a los que se administró diluyente estéril). Las puntuaciones clínicas, temperaturas rectales y porcentaje de implicación pulmonar eran todos superiores para los cerdos a los que se administró diluyente estéril. Los recuentos de leucocitos y el aumento de peso eran inferiores para los cerdos que recibieron el diluyente estéril. También había una reducción significativa de la viremia, que comenzaba el día 4 post-exposición en el grupo al que se administró vacuna. Los días 10 y 11 post-exposición, el número de animales positivos para viremia disminuyó adicionalmente en el grupo vacunado, pero continuaba siendo el mismo en el grupo que recibió diluyente estéril.
Se usó un ELISA para controlar el estado serológico anti-VSRRP antes de y después de la vacunación y de la exposición. Todos los cerdos eran negativos (proporción S/P <0,4) en el momento de la vacunación. Todos los cerdos, incluyendo los vacunados, eran negativos a 7 DPV (días post-vacunación). Siete días después, 21 de 22 cerdos vacunados dieron positivo en el ensayo para anticuerpo contra VSRRP. Dos cerdos del grupo 1 continuaron siendo negativos durante el periodo pre-exposición y presentaron seroconversión a los 8 días post-exposición (8 DPE). Todos los cerdos del grupo 2 eran negativos a día de ensayo 0 y continuaron siendo negativos durante todo el periodo de pre-exposición. El día de ensayo 39 (8 DPE), 17 de los 22 cerdos expuestos no vacunados (Grupo 2) fueron seropositivos en el ensayo. Todos los cerdos del grupo 3 (controles normales) continuaron siendo seronegativos durante todo el estudio.
Se realizaron aislamientos de virus a partir de sueros antes y después de la vacunación. De los 22 cerdos vacunados, 17 eran positivos a 2 DPV, 18 eran positivos a 4 DPV y 19 eran positivos a 7 DPV. Después de la vacunación, no se recuperó en absoluto virus de la vacuna de un cerdo, y no hasta 0 DPE de otro. Estos resultados se corresponden con el estado seronegativo de estos cerdos durante el periodo de observación post-vacunación. En el momento de la exposición, el 55 % de los cerdos vacunados eran positivos para viremia. Después de la exposición, este porcentaje aumentó hasta el 82 % (a 2 DPE) y disminuyó gradualmente hasta el 9 % a 11 DPE. Todos los cerdos del grupo 2 eran negativos a 0 DPE y aumentaban hasta un 82 % de positivos a 2 DPE y 91 % a 4 DPE. A 6 y 10 DPE, el grupo 2 era aproximadamente el 82 % positivo a virus y el 73 % de este grupo era positivo a 11 DPE. Los controles normales, el grupo 3, continuaron siendo negativos durante la duración del estudio.
El control de la temperatura rectal mostraba un aumento de grupo global experimentado por el grupo 2. La mitad de los cerdos de este grupo experimentaban un aumento de 0,55ºC (1ºF) sobre el promedio pre-exposición durante 2 o más días durante el periodo de observación de 11 días. En comparación, sólo cuatro de los 22 cerdos en el grupo vacunado experimentaron temperaturas de 0,55ºC (1ºF) sobre su promedio pre-exposición. La duración promedia del periodo durante el que esos animales experimentaban temperaturas elevadas durante dos o más días era de 2,2 días para el grupo 1 y de 4 días para el grupo 2. Ninguno de los cerdos del grupo 3 experimentó aumentos de
0,55ºC (1ºF) sobre su promedio pre-exposición durante dos días o más tiempo.
Se controló el aumento de peso durante el periodo de observación de 11 días. Los cerdos del grupo 3 aumentaron un promedio de 0,48 kg/día (1,06 libras/día), los cerdos del grupo 2 aumentaron un promedio de 0,43 kg/día (0,94 libras/día) y los cerdos del grupo 1 aumentaron un promedio de 0,24 kg/día (0,53 libras/día). Por lo tanto, los cerdos expuestos no vacunados aumentaron sólo aproximadamente el 57 % tanto peso como lo hicieron los cerdos expuestos vacunados y sólo el 50 % tanto peso como el grupo de control.
Se controló la leucopenia (recuentos de leucocitos) durante el periodo de observación post-exposición. El grupo 3 experimentó una reducción del 5 % en el promedio de grupo el día de ensayo 33 (2 DPE) en comparación con el promedio pre-exposición. Para el grupo 2, los recuentos de leucocitos disminuyeron un promedio del 41 % y no
volvieron a los niveles pre-exposición hasta DPE. El grupo vacunado experimentó una disminución promedia de grupo del 12 % el día de ensayo 34 (3 DPE). Los recuentos volvieron al nivel pre-exposición al día siguiente y continuaron igual al nivel pre-exposición durante la duración del periodo de observación.
Se realizaron observaciones clínicas diarias desde el día de ensayo 28 (-4 DPE) al día de ensayo 42 (11 DPE). Todos los cerdos carecían de cualquier signo clínico observable durante el periodo pre-exposición. El grupo 3 permanecía sin ningún signo clínico durante la duración del periodo post-exposición. Se observó que cinco de los cerdos del grupo 2 tenían signos clínicos post-exposición. Estos signos se hicieron evidentes 6 DPE y no se consideró que fueran graves. Los cerdos vacunados tenían 1 sólo signo clínico observado durante el periodo de observación post-exposición de 11 días.
A la finalización del estudio, los pulmones se evaluaron para las lesiones pulmonares observables. El grupo 3 tenía pulmones normales y una puntuación promedia de grupo de 0,02. Las puntuaciones de cerdos individuales para el grupo 2 variaban desde un mínimo de 33 hasta un máximo de 98 para un promedio de grupo de 78,33. Las puntuaciones del grupo vacunado variaban desde 30 hasta un máximo de 90 con un promedio de grupo de 53,20.
Los datos de este ejemplo demostraron la eficacia de una vacuna viral de SRRP atípico vivo modificado. La vacuna se administró a una dosis mínima de 2,0 log por dosis que contenía el quinto pase más allá del VSM (JA-142, pase 205). La eficacia de la vacuna se demostró reduciendo significativamente el alcance de las lesiones pulmonares, la gravedad de la leucopenia post-exposición y la fiebre post-exposición. Además, se mantuvo una tasa de crecimiento normal en cerdos vacunados/expuestos en comparación con la conseguida por los cerdos de control normales, y significativamente mejor que la conseguida por cerdos expuestos/no vacunados.
Ejemplo 6
Materiales y Procedimientos
Este ejemplo comparó cuatro grupos, los grupos 1, 2 y 3, que tenían veinte cerdos cada uno, y el grupo 4, que tenía 10 cerdos. El grupo 1 se inoculó por vía intramuscular (IM) con VSM de SRRP, JA-142, pase 205, a un título de aproximadamente 2,5 log/dosis. El grupo 2 se inoculó por vía intranasal con VSM de SRRP, JA-142, pase 205, a un título de aproximadamente 5,0 log/dosis. El grupo 3 se inoculó IM con diluyente estéril. El grupo 4 actuaban como controles estrictos. Los cerdos se expusieron a un aislado de VSRRP de la South Dakota State University (SDSU) con un patrón de RFLP de 144 el día 28 post-vacunación. Se controlaron las temperaturas corporales de los cerdos diariamente después de la exposición. Cada animal se pesó en la vacunación, en la exposición, semanalmente durante la duración del estudio y en la necropsia. Se recogieron muestras de sangre semanalmente después de la vacunación y cada dos días después de la exposición. El estado de salud de cada animal se controló diariamente durante la duración del estudio. A la finalización del estudio, los animales se sacrificaron y sus pulmones se puntuaron para determinar el porcentaje de implicación pulmonar.
Se realizaron ensayos de ELISA de VSRRP después de las exposiciones de los cerdos a los artículos de ensayo y exposición. También se realizaron intentos para aislar VSRRP a partir de muestras de suero en células MA-104 después de la exposición a los artículos de ensayo. Se determinaron los recuentos de WBC y las observaciones clínicas post-inoculación como en el Ejemplo 2.
Resultados y Discusión
A cero días post-vacunación (DPV), todos los cerdos de este ejemplo eran serológicamente negativos para VSRRP, como se indica por que tenían una proporción de S/P <0,4. A 14 DPV, el 70 % de los cerdos del grupo 1 y el 95 % de los cerdos del grupo 2 dieron positivo en el ensayo para la presencia de anticuerpo anti-VSRRP. Sólo un cerdo vacunado del grupo 1 continuaba siendo seronegativo durante todo el periodo de pre-exposición. Este cerdo se volvió seropositivo a los siete días post-exposición (DPE). Todos los cerdos de los grupos 3 y 4 continuaron siendo negativos durante todo el periodo pre-exposición. A nueve DPE, todos los cerdos del grupo 3, el grupo tratado con diluyente estéril, dieron positivo en el ensayo por ELISA para anticuerpo contra VSRRP. Los controles normales, el grupo 4, continuaron siendo negativos durante la duración del estudio.
Los resultados de aislamiento de virus se correlacionaban bien con los resultados serológicos. Sólo un cerdo continuaba siendo negativo para el aislamiento de virus a partir de suero y esto correspondía al estado seronegativo durante el periodo post-vacunación. Estos resultados indican una relación entre la viremia post-vacunación y la conversión serológica con la dosificación de vacuna. El grupo 2 era el 100 % seropositivo a 14 DPV en comparación con el 70 % para el grupo 1. El grupo de alta dosis (grupo 2) era el 85 % y el 90 % positivo a viremia a 14 y 21 DPV,
respectivamente. En comparación, el grupo de baja dosis (grupo 1) era el 55 % y el 85 % positivo para los mismos días de ensayo.
Después de la exposición, el 89 % de los animales del grupo 3 experimentaron temperaturas que eran 0,55ºC (1ºF)
o más superiores a los valores pre-exposición durante dos o más días. En el grupo 1, el 75 % de los animales experimentaron temperaturas de un grado o más superiores durante dos o más días. Mientras que sólo el 45 % de los animales del grupo 2 experimentó temperaturas elevadas. En comparación, el 30 % de los animales del grupo de control normal (grupo 4) experimentó temperaturas elevadas durante dos o más días durante el periodo de observación de 11 días.
El tratamiento con la alta dosis de vacuna o la baja dosis de vacuna parecía no tener un efecto perjudicial sobre el rendimiento del crecimiento durante el periodo post-vacunación (-3 DPV a 28 DPV). El aumento de peso diario promedio para los grupos 1 y 2 era de 0,35 kg/día (0,77 lb/día) y de 0,34 kg/día (0,76 lb/día), respectivamente. Para una comparación, los grupos 3 y 4 tenían aumentos de peso diarios promedio de 0,35 kg (0,77 lb) y 0,354 kg (0,78 lb), respectivamente. Después de la exposición, los grupos vacunados tenían un aumento de peso diario promedio de 0,02 kg/día (0,05 lb/día) (grupo 1) y 0,07 kg/día (0,15 lb/día) (grupo 2) más que el grupo tratado con diluyente estéril. Los controles normales tenían un promedio de 0,18 a 0,23 kg/día (0,4 a 0,5 lb/día) más de aumento de peso diario que los vacunados durante el mismo periodo de tiempo.
El ochenta y cuatro por ciento (16 de 19) del grupo 3, el grupo de tratamiento con diluyente estéril, experimentó una disminución del 25 % o superior en su recuento de WBC durante uno o más días después de la exposición. En los controles normales, 3 de 10 (el 30 %) habían experimentado disminuciones similares. Después de la exposición, en los grupos vacunados, el de baja dosis (grupo 1) y el de alta dosis (grupo 2), 11 de 20 (55 %) y 3 de 20 (15 %) habían experimentado una leucopenia del 25 % durante uno o más días.
Las observaciones clínicas realizadas antes de la exposición indicaban que los cerdos estaban en buen estado de salud. Después de la exposición, el nivel de estado de salud no cambiaba significativamente para aquellos cerdos que se expusieron (grupos 1, 2 y 3). La letargia, los signos respiratorios y la pérdida de apetito eran los signos clínicos observados y estos se describieron como de gravedad leve. Los signos clínicos descritos para un cerdo del grupo 2 podían atribuirse a la neumonía bacteriana (véase la discusión a continuación sobre lesiones pulmonares) que estaba experimentando. El grupo de control normal (grupo 4), no tenía ningún signo clínico observable durante el periodo de observación de 11 días.
A la finalización del estudio, los cerdos se sacrificaron y los pulmones se observaron para lesiones tipo SRRP para puntuar el grado de implicación pulmonar. El porcentaje de implicación se puntuó para cada lóbulo, y después se multiplicó por el porcentaje de pulmón representado por la capacidad pulmonar total. Por ejemplo, un 50 % de implicación pulmonar para un lóbulo diafragmático se multiplicaba después por 25 % para que equivalga al 12,5 % de la capacidad pulmonar total. La puntuación máxima que podía obtenerse era de 100. La puntuación pulmonar promedia de grupo para los controles normales (grupo 4) era de cero. La puntuación promedia de grupo para el grupo de tratamiento con diluyente estéril (grupo 3) era de 70,08. Las puntuaciones promedias de grupos de tratamiento vacunados eran de 48,83 para el grupo de baja dosis (grupo 1) y de 17,76 para el grupo de alta dosis (grupo 2). Se observó que un cerdo tenía una puntuación pulmonar de 62,5, la mayor puntuación dentro del grupo 2. Se describió que las lesiones observadas en los pulmones de este cerdo estaban asociadas con neumonía bacteriana.
A partir de los resultados de este estudio, ambos niveles de dosificación de la vacuna de VSM de SRRP atípico reducían la gravedad de los signos clínicos asociados con la enfermedad respiratoria causada por el VSRRP. Una dosis de campo completa se comportaba mejor que la dosis mínima según se indicó por la reducción significativa de las puntuaciones de lesiones pulmonares.
Ejemplo 7
Materiales y Procedimientos
Este ejemplo determinó la secuencia del VSM, JA-142, del pase 201 atenuado, así como la secuencia del pase 3 del virus del aislado de campo, JA-142. El aislado de virus atenuado se obtuvo de la reserva de semilla maestra que representa el pase 201 en células de simio MA-104 de un aislado de VSRRP de cerdos afectados con SRRP.
El virus se cultivó en células 2621, una línea celular de riñón de mono, también denominada MA-104 y USU-104 (Gravell y col., 181 Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 112-1-19 (1986), Collins y col., Isolation of Swine Infertility and
Respiratory Syndrome Virus (Isolate ATCC VR-2332) in North America and Experimental Reproduction of the Disease in Gnotobiotic Pigs, 4 J. Vet. Diagn. Invest. 117-126 (1992)) (cuyos contenidos se incorporan por la presente por referencia). Las células se cultivaron en 50 ml de medio MEM de Eagle modificado por Dulbecco (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), complementado con suero fetal de ternera al 10 % y gentamicina 50 !g/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en una atmósfera de CO2 al 5 % humidificada a 37ºC en matraces de cultivo de tejidos de plástico de 75 cm2. Las células se mantuvieron por pase a intervalos de 5-7 días. Las células se desprendieron de la superficie con tripsina-verseno y se dividieron 1:4. Para infectar las células, se decantaron los medios y se añadió 1 ml de sobrenadante de células que contenía virus a un título de aproximadamente 105-106 dosis infecciosas en cultivo de tejidos (DICT50) durante 30 min. Se añadieron treinta ml de medio recién preparado que contenía suero fetal de ternera al 4 %. Las células se incubaron como se ha descrito anteriormente durante 5 días, momento en el que era evidente un efecto citopático en el cultivo. Se centrifugó el medio de cultivo que contenía virus a 2000 rpm en una centrífuga Beckman TJ6 para sedimentar el residuo celular.
Se purificó ARN genómico viral añadiendo 1120 !l de tampón AVL preparado (kit de aislamiento de ARN Viral QIAamp) (QIAGEN, Inc. Valencia, CA)/ARN transportador a una muestra de 280 !l de medio de cultivo que contenía virus. La mezcla se agitó vorticialmente y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min. Se añadieron 1120 !l de etanol y la mezcla se invirtió varias veces. Se absorbió ARN a la matriz de una columna de centrifugación QIAamp por centrifugación repetida de alícuotas de 630 !l a 6.000 x g durante 1 min. La columna se lavó con 500 !l de tampón AW y se centrifugó para eliminar todo rastro de solución de lavado. El ARN se eluyó de la columna con 60 !l de agua tratada con dietilpirocarbonato a temperatura ambiente. El ARN purificado se almacenó a -70ºC o se usó inmediatamente para la síntesis de ADNc.
Para la síntesis de ADNc, se calentó ARN viral a 67ºC durante 7 min, se cebó con hexámeros aleatorios o cebadores específicos de VSRRP y se realizó una transcripción inversa con la transcriptasa inversa Superscript II RNasa H- (RT) (Life Technologies, Inc.). Las reacciones contenían MgCl2 5 mM, tampón convencional II 1X (Perkin Elmer Corp. Wellesley, MA), 1 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 1 unidad/!l de inhibidor de ARNasa, 2 unidades de RT y 1 !l de ARN en una reacción de 40 !l. Las mezclas de reacción se incubaron durante 15 min a 42ºC, durante 5 min a 99ºC y durante 5 min a 5ºC.
Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a los fragmentos de ADN obtenidos para secuenciación de la forma siguiente: porciones de 10 !l de una mezcla de reacción de ADNc se combinaron con los reactivos siguientes, dando como resultado una reacción de 25 !l que contenía MgCl2 2 mM, tampón convencional II 1X (Perkin Elmer), 0,2 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 0,3 !M de cebador específico de VSRRP 5’ y 3’ y 0,375 unidades de Taq polimerasa AmpliTaq (Perkin Elmer). Se prepararon las reacciones por calentamiento durante 4 min a 93ºC en un termociclador, después 35 ciclos constituidos por 50-59ºC durante 30 s, 72ºC durante 30-60 s y 94ºC durante 30 s. Los tiempos y temperaturas específicos variaban dependiendo de las temperaturas de hibridación de los cebadores en cada reacción, y de la longitud esperada del producto amplificado. Se realizó una incubación final durante 10 min a 72ºC y las reacciones se pusieron a 4ºC. Se purificaron los productos de PCR con un kit Microcon 100 (Amicon, Bedford, MA).
Se realizó una PCR de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) para obtener la secuencia terminal del extremo 5’ del ARN genómico, basándose en el procedimiento de Frohman, MA., On Beyond Classic RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), 4 PCR Methods and Applications S40-S58 (1994) (cuyo contenido se incorpora por la presente por referencia). Se aisló el ARN viral y se convirtió en ADNc como se ha descrito anteriormente, con hexámeros aleatorios como cebadores. Se purificaron los productos de reacción en una columna Microcon 100 (Amicon). Se añadió una cola poli(dA) al extremo 3’ por incubación de 10 !l de ADNc en un volumen de 20 !l que contenía tampón 4 1X (New England Biolabs, Beverly, MA), CoCl2 2,5 mM, dATP 0,5 mM y 2 unidades de transferasa terminal (New England Biolabs), durante 15 min a 37ºC. La reacción se interrumpió por calentamiento durante 5 min a 65ºC y después se diluyó hasta 200 !l con agua.
Se realizó una PCR usando el Sistema de PCR de Moldes de Gran Tamaño Expanda (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) en un volumen de reacción de 50 !l que contenía 10 !l de ADNc con cola poli(dA) diluido, tampón 3 1X, 0,35 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, MgCl2 0,625 mM, cebador Qt 0,04 !M (Frohman, 1994), cebador Qo 0,3 !M (Frohman, 1994), 5’-CGCCCTAATTGAATAGGTGAC-3’ 0,3 !M y 0,75 !l de mezcla enzimática. Las reacciones se calentaron a 93ºC durante 2 min en un termociclador y se sometieron a 25 ciclos, estando cada ciclo constituido por 93ºC durante 10 s, 63ºC durante 30 s y 68ºC durante 12 min. Después de 25 ciclos, la reacción se incubó a 68ºC durante 7 min y se mantuvo a 4ºC. Se diluyó una alícuota de la reacción 100 veces y se añadieron 5 !l de producto diluido a una segunda reacción de PCR que contenía, en 50 !l, tampón 1 1X, 0,35 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, cebador Qi 0,3 !M (Frohman, 1994), 5’
CCTTCGGCAGGCGGGGAGTAGTGTTTGAGGTGCTCAGC-3’ 0,63 !M y 0,75 !l de mezcla enzimática. Las reacciones se calentaron a 93ºC durante 2 min en un termociclador y se sometieron a 25 ciclos, estando cada ciclo constituido por 93ºC durante 10 s, 63ºC durante 30 s y 68ºC durante 4 min. Después de 25 ciclos, la reacción se incubó a 68ºC durante 7 min y se mantuvo a 4ºC. Los productos de reacción se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1 % y la banda de aproximadamente 1500 pb se purificó usando el kit de purificación en gel QIAgen QXII. El ADN eluido se clonó en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI) usando procedimientos convencionales. Se aislaron clones individuales y se cultivaron para el aislamiento del ADN plasmídico usando kits de aislamiento de plásmidos de QIAgen.
Se combinaron productos de PCR y ADN plasmídico con cebadores apropiados basados en secuencias de VSRRP relacionadas en Genbank o derivados de secuencias conocidas, y se sometieron a reacciones de secuenciación automáticas con kits de secuenciación cíclica con terminadores Taq DyeDeoxy (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un Termociclador PR 2400 (Perkin Elmer) en el University of Minnesota Advanced Genetic Analysis Center. Las reacciones se sometieron a electroforesis en un secuenciador de ADN Applied Biosystems 3700. La lectura automática de nucleótidos y la corrección de errores de secuencias se realizaron principalmente con el programa Phred (University of Washington Genome Center) y el ensamblaje de fragmentos se realizó principalmente con el programa Phrap (University of Washington Genome Center). Se usó un programa informático adicional que incluía el paquete Lasergene (DNASTAR Inc., Madison, WI), el paquete Wisconsin versión 9.1 (Genetics Computer Group, Madison, WI) y EuGene (Molecular Biology Information Resource, Houston, TX) para analizar la secuencia. La secuencia genómica viral final se ensambló a partir de aproximadamente 100 reacciones de PCR y 428 reacciones de secuenciación de ADN.
Resultados
Los resultados del Ejemplo 7 se proporcionan como SEC ID Nº: 1 y 2 en las que la SEC ID Nº: 1 representa la secuencia del pase 201 del Virus de Semilla Maestra, JA 142, y la SEC ID Nº: 2 representa la secuencia del virus virulento aislado de campo, JA 142, después de tres pases.
También se divulga
Punto 1: En un procedimiento de pase multiple para atenuar un virus que incluye las etapas de replicar sucesivamente dicho virus mediante inoculación y replicación del virus en cultivos celulares individuales respectivos hasta lograr la atenuación, la mejora que comprende retirar las muestras que contienen virus de al menos determinados de dichos cultivos celulares mientras el virus se está replicando a una velocidad logarítmica y antes de la inducción de efectos citopáticos en dichos determinados cultivos celulares e inocular los pases de cultivos celulares respectivos siguientes con dichas muestras.
Punto 2: El procedimiento del punto 1, produciéndose dicha etapa de retirada aproximadamente 24 horas después de la inoculación de dichos cultivos celulares.
Punto 3: El procedimiento del punto 1, comprendiendo dicho cultivo celular una monocapa de células que tiene una confluencia superior a aproximadamente el 70 %.
Punto 4: El procedimiento del punto 1, que además comprende la etapa de analizar periódicamente dicho virus progenie para evaluar la atenuación.
Punto 5: El procedimiento del punto 1, que además comprende las etapas de conservar dichos determinados cultivos celulares después de dicha etapa de retirada y observar si tiene lugar la inducción de efectos citopáticos en dichos cultivos celulares conservados.
Punto 6: El procedimiento del punto 1, comprendiendo dicha inoculación el número más pequeño de virus que da como resultado en última instancia ECP.
Punto 7: Un virus del SRRP que tiene el número de acceso ATCC VR-2638.
Punto 8: Un virus atenuado mediante el procedimiento del punto 1.
Punto 9: El virus del punto 8, habiéndose pasado dicho virus un mínimo de 200 veces en cultivo celular.
Punto 10: El virus del punto 9, siendo dicho virus sustancialmente avirulento.
Punto 11: El virus del punto 10, siendo dicho virus capaz de generar respuestas de anticuerpos en ganado porcino.
Punto 12: El virus del punto 11, siendo dicha respuesta de anticuerpos específica para cepas de virus del síndrome
respiratorio y reproductivo porcino.
Punto 13: Una vacuna que comprende el virus del punto 7.
Punto 14: La vacuna del punto 13, que además comprende un agente vehículo farmacológicamente compatible.
Punto 15: La vacuna del punto 13, siendo dicho vacuna capaz de generar respuestas de anticuerpos en un animal
huésped.
Punto 16: La vacuna del punto 15, incluyendo dicho animal huésped ganado porcino.
Punto 17: La vacuna del punto 15, siendo dicha respuesta de anticuerpos específica para cepas de virus del
síndrome respiratorio y reproductivo porcino.
Punto 18: La vacuna del punto 17, incluyendo dichas cepas cepas del síndrome respiratorio y reproductivo porcino
atípicas.
Punto 19: Un virus que tiene un patrón de escisión de enzima de restricción de 1-4-2 por las enzimas MLU 1, Hinc II
y Sac II, respectivamente, en el marco de lectura abierto cinco.
Punto 20: El virus del punto 19 que no es escindido por MLU 1 en el marco de lectura abierto cinco.
Punto 21: Una vacuna que comprende el virus del punto 19.
Punto 22: La vacuna del punto 21, que además comprende un agente vehículo farmacológicamente compatible.
Punto 23: La vacuna del punto 21, siendo dicho vacuna capaz de generar respuestas de anticuerpos en un animal
huésped.
Punto 24: La vacuna del punto 23, incluyendo dicho animal huésped ganado porcino.
Punto 25: La vacuna del punto 23, siendo dicha respuesta de anticuerpos específica para cepas de virus del
síndrome respiratorio y reproductivo porcino.
Punto 26: La vacuna del punto 25, incluyendo dichas cepas el síndrome respiratorio y reproductivo porcino atípico.
Punto 27: Un procedimiento para inmunizar ganado porcino contra cepas del virus del síndrome respiratorio y
reproductivo porcino, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de administrar a ganado porcino la vacuna del
punto 21.
Punto 28: Una secuencia de ADN aislada que tiene al menos aproximadamente el 65 % de identidad de secuencia
con SEC ID Nº:1.
Punto 29: Una secuencia de ADN aislada que tiene al menos aproximadamente el 75% de homología de secuencia
con SEC ID Nº:1.
Punto 30: Una secuencia de ADN aislada que tiene al menos aproximadamente el 65% de identidad de secuencia
con SEC ID Nº:2.
Punto 31: Una secuencia de ADN aislada que tiene al menos aproximadamente el 75% de homología de secuencia
con SEC ID Nº:1.
Punto 32: Un virus del SRRP que incluye la secuencia del punto 28.
Punto 33: Un virus del SRRP que incluye la secuencia del punto 29.
Punto 34: El virus del punto 33, estando dicho virus atenuado por el procedimiento del punto 1.
Punto 35: El virus del punto 33, habiéndose pasado dicho virus un mínimo de 200 veces en cultivo celular.
Punto 36: El virus del punto 33, estando dicho virus sustancialmente atenuado.
Punto 37: El virus del punto 33, siendo dicho virus sustancialmente avirulento.
Punto 38: El virus del punto 33, siendo dicho virus capaz de generar respuestas de anticuerpos en ganado porcino.
Punto 39: El virus del punto 38, siendo dicha respuesta de anticuerpos específica para cepas de virus del síndrome
respiratorio y reproductivo porcino.
Punto 40: Una vacuna que comprende la secuencia de ADN del punto 29.
Punto 41: La vacuna del punto 40, que además comprende un agente vehículo farmacológicamente compatible.
Punto 42: La vacuna del punto 40, siendo dicho vacuna capaz de generar respuestas de anticuerpos en un animal
huésped.
Punto 43: La vacuna del punto 42, incluyendo dicho animal huésped ganado porcino.
Punto 44: La vacuna del punto 43, siendo dicha respuesta de anticuerpos específica para cepas de virus del
síndrome respiratorio y reproductivo porcino.
Punto 45: La vacuna del punto 44, incluyendo dichas cepas cepas del síndrome respiratorio y reproductivo porcino
atípicas.
Punto 46: La secuencia de ADN del punto 29, confiriendo la administración de dicha secuencia a un animal huésped
inmunidad eficaz.
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<150> 09/298.110
<151>
<160> 2
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<210> 1
5 <211> 15424
<212> ADN
<213> Virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino
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<210> 2
<211> 15424
<212> ADN
<213> Virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino
<400> 2
Claims (21)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Un virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (SRRP) que comprende una secuencia representada por SEC ID Nº:1 o por una secuencia que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con SEC ID Nº:1.
-
- 2.
- El virus de la reivindicación 1, comprendiendo el virus la secuencia representada por SEC ID Nº:1.
-
- 3.
- Un virus del SRRP que tiene el número de acceso ATCC VR-2638.
-
- 4.
- El virus de la reivindicación 1, comprendiendo el virus la secuencia representada por SEC ID Nº:2.
-
- 5.
- El virus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, atenuado por un procedimiento para atenuar un virus que incluye las etapas de replicar sucesivamente dicho virus mediante inoculación y replicación del virus en cultivos celulares individuales respectivos hasta lograr la atenuación, retirar las muestras que contienen virus de al menos determinados de dichos cultivos celulares mientras el virus se está replicando a una velocidad logarítmica y antes de la inducción de efectos citopáticos en dichos determinados cultivos celulares e inocular el siguiente pase de cultivo celular respectivo con dichas muestras.
-
- 6.
- El virus de la reivindicación 5, produciéndose dicha etapa de retirada aproximadamente 24 horas después de la inoculación de dichos cultivos celulares.
-
- 7.
- El virus de la reivindicación 5, comprendiendo dicho cultivo celular una monocapa de células que tiene una confluencia superior a aproximadamente el 70 %.
-
- 8.
- El virus de la reivindicación 5, que además comprende la etapa de analizar periódicamente dicho virus progenie para evaluar la atenuación.
-
- 9.
- El virus de la reivindicación 5, que además comprende las etapas de conservar dichos determinados cultivos celulares después de dicha etapa de retirada y observar si la inducción de efectos citopáticos tiene lugar en dichos cultivos celulares conservados.
-
- 10.
- El virus de la reivindicación 5, comprendiendo dicha inoculación el número más pequeño de virus que da como resultado en última instancia ECP.
-
- 11.
- El virus de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, habiéndose pasado dicho virus un mínimo de 200 veces en cultivo celular.
-
- 12.
- El virus de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, estando dicho virus atenuado.
-
- 13.
- El virus de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, siendo dicho virus avirulento.
-
- 14.
- El virus de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, siendo dicho virus capaz de generar respuestas de anticuerpos en ganado porcino.
-
- 15.
- El virus de la reivindicación 14, siendo dicha respuesta de anticuerpos específica para cepas de virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino.
-
- 16.
- El virus del SRRP atenuado de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, obtenido mediante atenuación de un virus que tiene una secuencia de ácido nucleido representada por SEC ID Nº:2.
-
- 17.
- Una vacuna que comprende el virus según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
-
- 18.
- La vacuna de la reivindicación 17, que además comprende un agente vehículo farmacológicamente compatible.
-
- 19.
- Una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende al menos el 95 % de identidad de secuencia con SEC ID Nº:1.
-
- 20.
- Una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia tal como se muestra en SEC ID Nº:1.
-
- 21.
- La vacuna tal como se define en la reivindicación 17 ó 18 para su uso en la inmunización de ganado porcino contra el síndrome respiratorio y reproductivo porcino, en la que dicha inmunización comprende administrar dicha vacuna a dicho ganado porcino.
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