ES2312167T3

ES2312167T3 - Acidos polinucleicos y proteinas a partir de un virtus del sindrome reproductivo y respiratorio porcino y sus usos.

Info

Publication number: ES2312167T3
Application number: ES95932336T
Authority: ES
Inventors: Prem S. Paul; Xiang-Jin Meng; Patrick Halbur; Igor Mozorov; Melissa A. Lum
Original assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC; Iowa State University Research Foundation Inc ISURF
Current assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC; Iowa State University Research Foundation Inc ISURF
Priority date: 1994-09-01
Filing date: 1995-09-01
Publication date: 2009-02-16
Anticipated expiration: 2015-09-01
Also published as: EP0776209B1; CA2198461C; EP0776209A4; ATE402952T1; EP2042512A3; US6592873B1; US20060029928A1; EP2042512A2; CA2198461A1; US20050175633A1; EP0776209A1; DE69535795D1; WO1996006619A1; US7264957B2; US7223854B2; PT776209E; DK0776209T3

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UNA PREPARACION PURIFICADA QUE CONTIENE UN ACIDO POLINUCLEICO QUE CODIFICA AL MENOS UN POLIPEPTIDO SELECCIONADO A PARTIR DEL GRUPO INTEGRADO POR PROTEINAS CODIFICADAS POR UNA O MAS ESTRUCTURAS DE LECTURA ABIERTA (ELAS) DE UNA CADENA IOWA DEL VIRUS DEL SINDROME RESPIRATORIO Y REPRODUCTIVO PORCINO (VSRRP), PROTEINAS HOMOLOGAS CON AQUELLAS CODIFICADAS POR UNA O MAS DE LAS ELAS, ZONAS ANTIGENICAS DE DICHAS PROTEINAS QUE SON AL MENOS DE UNA LONGITUD DE CINCO AMINOACIDOS Y QUE ESTIMULAN DE FORMA EFECTIVA LA PROTECCION INMUNOLOGICA EN UN RECEPTOR PORCINO CONTRA EL RIESGO CONSECUENTE A LA EXPOSICION CON UN AISLADO DEL VSRRP, Y COMBINACIONES DE ESTA, EN LAS QUE AMINOACIDOS NO ESENCIALES PARA LA ANTIGENICIDAD PUEDEN SER SUSTITUIDOS DE FORMA CONSERVADORA. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A UN POLPEPTIDO CODIFICADO POR DICHO ACIDO POLINUCLEICO, UNA VACUNA QUE INCLUYE UNA CANTIDAD EFECTIVA DEL MENCIONADO ACIDO POLINUCLEICO O PROTEINA, ANTICUERPOS QUE SE UNEN ESPECIFICAMENTE A DICHO ACIDO POLINUCLEICO O PROTEINA; METODOS PARA PRODUCIRLA; Y METODOS PARA ALCANZAR UNA RESPUESTA INMUNOLOGICAMENTE EFECTIVA CONTRA EL VSRRP, DE TRATAR UN CERDO INFECTADO POR VSRRP, Y DE DETECTAR EL VSRRP.

Description

Ácidos polinucleicos y proteínas a partir de un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino y sus usos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a ADN aislado a partir de un virus reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), a una proteína y/o un polipéptido de la ORF-2 codificado por el ADN, a una vacuna que protege a los cerdos de PRRSV basada en la proteína o el ADN, a un método para proteger a un cerdo frente al PRRSV usando la vacuna, a un método para producir la vacuna, a un método para tratar a un cerdo infectado o expuesto a PRRSV, y a un método para detectar PRRSV.

Análisis de los antecedentes

En los últimos años, las piaras de cerdos norteamericanas y europeas han sido susceptibles a la infección por nuevas cepas de virus reproductivos y respiratorios (véase, A.A.S.P., septiembre/octubre de 1991, pp. 7-11; The Veterinary Record, 1 de febrero de 1992, pp. 87-89; Ibid., 30 de noviembre de 1991, pp. 495-496; Ibid., 26 de octubre de 1991, p. 370; Ibid., 19 de octubre de 1991, pp. 367-368; Ibid., 3 de agosto de 1991, pp. 102-103; Ibid., 6 de julio de 1991; Ibid., 22 de junio de 1991, p. 578; Ibid., 15 de junio de 1991, p. 574; Ibid., 8 de junio de 1991, p. 530; Ibid.,1 de junio de 1991, p. 511: Ibid., 2 de marzo de 1991, p. 212). Entre las primeras de las nuevas cepas a identificar se encontraba un virus asociado con la denominada enfermedad misteriosa del cerdo (MSD) o "síndrome de las orejas azules", ahora conocido como síndrome de esterilidad y respiratorio porcino (SIRS) o síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS).

En el medio oeste de los Estados Unidos en 1987 apareció una MSD consistente en una incapacidad reproductora en hembras y una enfermedad respiratoria en cerdos lactantes y destetados (Hill et al., Am. Assoc. Swine Practitioner Newsletter 4:47 (1992); Hill et al., Proceedings Mystery Swine Disease Committee Meeting, Denver, Colorado 29-31 (1990); Keffaber, Am. Assoc. Swine Practitioner Newsletter 1: 1-9 (1989): Loula, Agri-Practice 12:23-34 (1991)). La incapacidad reproductora se caracterizó por abortos, cerdos nacidos muertos y cerdos nacidos débiles. La enfermedad respiratoria en cerdos lactantes y destetados se caracterizaba por fiebre, dificultad respiratoria y neumonía. En Europa apareció una enfermedad similar en 1990 (Paton et al., Vet. Rec. 128: 617 (1991); Wensvoort et al., Veterinary Quarterly 13: 121-130 (1991); Blaha, Proc. Am. Assoc. Swine Practitioners, pp. 313-315 (1993)), y ahora se he reconocido en todo el mundo.

Esta enfermedad también se ha denominado aborto epidémico porcino y síndrome respiratorio (PEARS), enfermedad del aborto azul, enfermedad de las orejas azules (Reino Unido), abortus blau (Países Bajos), seuchenhafter spatabort der schweine (Alemania), enfermedad Heko-Heko y, en los Estados Unidos, síndrome de Wabash, enfermedad misteriosa del cerdo (MPD) y plaga porcina (véanse las referencias citadas anteriormente y Meredith, Review of Porcine Reproductive and Respiratory Disease Syndrome, Pig Disease Information Centre, Department of Veterinary Medicine, Madingley Road, Cambridge CB3 OES, U.K. (1992); Wensvoort et al., Vet. Res. 24: 117-124 (1993); Paul et al., J. Clin. Vet. Med. 11:19-28 (1993)). En Europa, el virus correspondiente se ha denominado "virus Lelystad".

En una conferencia internacional en mayo de 1992, investigadores de todo el mundo coincidieron en denominar a esta enfermedad Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS). Originalmente, la enfermedad parecía ser principalmente una enfermedad reproductiva durante sus primeras fases, pero ahora ha evolucionado principalmente hasta convertirse en una enfermedad respiratoria.

El virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) es un patógeno porcino reconocido hace relativamente poco asociado con el síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS). El PRRSV es un patógeno importante en la industria porcina. Las infecciones por PRRSV son comunes en las piaras de los Estados Unidos. Los brotes de PRRS en Inglaterra han ocasionado la cancelación de ferias de cerdos.

Los síntomas de PRRS incluyen una reticencia a comer (anorexia), fiebre leve (pirexia), cianosis de las extremidades (particularmente orejas azuladas), mortinatos, abortos, alta mortalidad en las camadas afectadas, lechones nacidos débiles y parto prematuro. La mayoría de los lechones nacen vivos y las cerdas afectadas mueren antes de que hayan transcurrido 48 horas. Los signos clínicos de PRRS incluyen signos leves de tipo gripal, respiración rápida ("latidos fuertes") y una neumonitis intersticial difusa. El virus de la PRRS tiene un periodo de incubación de aproximadamente 1-2 semanas desde el contacto con un animal infectado por PRRSV. El virus parece ser un arterivirus de ARN con envuelta (The Veterinary Record, 1 de febrero de 1992). El virus se ha desarrollado satisfactoriamente en macrófagos alveolares de cerdo y en células CL2621 (Benfield et al, J. Vet. Diagn. Invest., 4: 127-133, 1992; Collins et al, Swine Infertility and Respiratory Syndrome/Mystery Swine Disease. Proc., Minnesota Swine Conference for Veterinarians, pp. 200-205, 1991), y en células MARC-145 (Joo, PRRS: Diagnosis, Proc., Allen D. Leman Swine Conference, Veterinary Continuing Education and Extension, University of Minnesota (1993), 20: 53-55; Kim et al, Arch. Virol., 133: 477-483 (1993)). También se ha notificado un cultivo satisfactorio del virus que produce SIRS por Wensvoort et al (Mystery Swine Disease in the Netherlands: The Isolation of Lelystad Virus. Vet. Quart. 13: 121-130, 1991).

Inicialmente, varios agentes se incriminaron en la etiología de esta enfermedad (Wensvoort et al., Vet. Res. 24: 117-124 (1993); Woolen et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 197: 600-601 (1990)). Ahora hay un consenso en que el agente causante de PRRS es un virus de ARN con envuelta denominado Virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRSV) que, según se ha notificado, tiene aproximadamente 62 nm de diámetro (Benfield et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4:127-133, 1992).

Los aislados del virus varían en su capacidad para replicarse en líneas celulares continuas. Algunos crecen fácilmente mientras que otros requieren varios pases y algunos crecen únicamente en cultivos alveolares porcinos (SAM) (Bautista et al., J. Vet. Diagn. Invest. 5: 163-165, 1993; véanse también los ejemplos presentados mas adelante [particularmente la Tabla 1].

El PRRSV es un miembro de un grupo denominado Arterivirus que incluye el virus de la arteritis equina (EAV), el virus de elevación de la lactato deshidrogenasa (LDV) y el virus de la fiebre hemorrágica de simios (SHFV) (Benfield et al., 1992, supra; Plagemann, Proc. Am. Assoc. Swine Practitioners, 4:8-15,1992; Plagemann y Moennig, Adv. Virus Res. 41: 99-192, 1992; Conzelmann et al., Virology, 193: 329-339, 1993; Godney et al., Virology, 194: 585-596; Meulenberg et al., Virology, 192: 62-72, 1993). Los virus de ARN de cadena positiva de este grupo de Arterivirus se parecen morfológicamente a los togavirus, pero están relacionados de manera distante con los coronavirus y torovirus basándose en la organización del genoma y en la expresión génica (Plagemann et al.,supra; Spaan et al., J. Gen. Virol. 69, 2939-2952 (1988); Strauss et al., Annu. Rev. Biochem. 42, 657-683 (1988); Lai, Annu. Rev. Microbiol. 44, 303-333 (1990); Snijder et al., Nucleic Acid Res. 18, 4535-4542 (1990)). Los miembros de este grupo infectan a los macrófagos y contienen una serie anidada de 5 a 7 ARNm subgenómicos en células infectadas (Plagemann et al., supra;
Meulenberg et al., Virology, 192, 62-72 (1993); Conzelmann et al., Virology, 193, 329-339 (1993); 15, 16, 17, 18, 19).

Se ha demostrado que el genoma viral de los aislados europeos es un ARN de cadena más de aproximadamente 15,1 kb (Conzelmann et al., supra; Meulenberg et al., supra), y parece ser similar en organización genómica a LDV y a EAV (Meulenberg et al., supra). Sin embargo, no se ha encontrado ninguna reacción serológica cruzada entre PRRSV, LDV y EAV (Goyal et al., J. Vet. Diagn. Invest., 5, 656-664 (1993)).

El PRRSV se cultivó inicialmente en cultivos celulares de macrófagos alveolares porcinos (SAM) (Pol et al., Veterinary Quarterly, 13:137-143, 1991; Wensvoort et al., Veterinary Quarterly, 13: 121-130, 1991) y después en líneas celulares continuas CL2621 (Benfield et al., supra), MA-104 y MARC-145 (Joo, Proc. Allen D. Leman Swine Conference, pp. 53-55, 1993). La enfermedad reproductiva y respiratoria se ha reproducido con filtrados pulmonares sin células (Christianson et al., Am. J. Vet. Res., 53: 485-488, 1992; Collins et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4: 117-126, 1992; Halbur et al., Proc. Central Veterinary Conference, pp. 50-59, 1993), y con PRRSV propagado en cultivos celulares (Collins et al., supra, y Proc. Allen D. Leman Swine Conference, pp. 47-48, 1993).

En un aislado de PRRSV europeo se han identificado ocho fases de lectura abierta (también denominadas en la presente memoria "ORF" o "genes"). Los genes de este aislado europeo se organizan de forma similar a los de los coronavirus (Meulenberg et al., supra). En células infectadas con PRRSV se ha encontrado una serie anidada en el extremo 3' del ARN mensajero similar a la de los coronavirus (Conzelmann et al., supra; Meulenberg et al., supra).

Se ha predicho que ORF 1a y 1b en la mitad 5' del genoma de PRRSV europeo codifica la ARN polimerasa viral. Las ORF 2-6 en la mitad 3' del genoma probablemente codifican proteínas asociadas a la membrana viral (envuelta) (Meulenberg et al., supra). Se presupone que la ORF 6 codifica la proteína de membrana (M) basándose en sus características similares a la ORF 6 de EAV, la ORF 2 de LDV y la proteína M del virus de la hepatitis de ratón y el virus de la bronquitis infecciosa (Meulenberg et al., Virology 192, 62-72 (1993); Conzelmann et al., Virology 193, 329-339 (1993); Murtaugh, Proc. Allen D. Leman Swine Conference, Minneapolis, MN, pp. 43-45 (1993); Mardassi et al., Abstracts of Conference of Research Workers in Animal Diseases, Chicago, IL, pp. 43 (1993)). El producto de la ORF 7 es extremadamente básico e hidrófilo, y se ha predicho que es la proteína de la nucleocápsida viral (N) (Meulenberg et al., supra; Conzelmann et al., supra; Murtaugh, supra; Mardassi et al., supra y J. Gen. Virol., 75: 681-885 (1994)).

Aunque se han identificado epítopos conservados entre aislados de PRRSV de Estados Unidos y europeos usando anticuerpos monoclonales (Nelson et al., J. Clin. Microbiol., 31:3184-3189, 1993), existe una amplia variación antigénica y genética entre los aislados de Estados Unidos y europeos de PRRSV (Wensvoort et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4: 134-138, 1992). Los aislados europeos están muy relacionados genéticamente, ya que la secuencia de nucleótidos en la mitad 3' del genoma de dos aislados de PRRSV europeos es casi idéntica (Conzelmann et al., supra; Meulenberg et al., supra).

Aunque el síndrome producido por PRRSV parece ser similar en los Estados Unidos y en Europa, varios estudios recientes han descrito variaciones fenotípicas, antigénicas, genéticas y patogénicas entre aislados de PRRSV en los Estados Unidos y en Europa (Murtaugh, supra; Bautista et al., J. Vet. Diagn. Invest., 5, 163-165 (1993); Bautista et al., J. Vet. Diagn. Invest., 5, 612-614 (1993); Wensvoort et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4, 134-138 (1992); Stevenson et al., J. Vet. Diagn. Invest., 5, 432-434 (1993)). Por ejemplo, los aislados europeos crecen preferentemente en cultivos SAM y se replican a un título muy bajo en otros sistemas de cultivo (Wensvoort, Vet. Res., 24, 117-124 (1993); Wensvoort et al., J. Vet. Quart., 13,121-130 (1991); Wensvoort et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4, 134-138 (1992)). Por otra parte, se ha demostrado que algunos de los aislados de Estados Unidos se replican bien en SAM así como en la línea celular continua CL2621 (Benfield et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4, 127-133 (1992); Collins et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4, 117-126 (1992)). De esta manera, se observan diferencias fenotípicas entre los aislados de Estados Unidos, ya que no todos los aislados de PRRSV aislados en SAM pueden replicarse en la línea celular CL2621 (Bautista et al., J. Vet. Diagn. Invest., 5, 163-165 (1993)).

Puede existir un alto grado de variación antigénica regional entre los aislados de PRRSV. Se encontraron cuatro aislados europeos muy relacionados antigénicamente, pero estos aislados europeos diferían antigénicamente de los aislados de Estados Unidos. Además, se demostró que tres aislados de Estados Unidos diferían antigénicamente entre sí (Wensvoort et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4, 134-138 (1992)). Se descubrió que animales seropositivos para los aislados europeos eran negativos para el aislado de Estados Unidos VR 2332 (Bautista et al., J. Vet. Diagn. Invest., 5, 612-614 (1993)).

Se describieron secuencias de aislados europeos de PRRSV, por ejemplo, en las Solicitudes de Patente Internacional WO 92/21375 (cepa Lelystad) y WO 95/31550 (aislado español PRRS-Olot). Se describieron secuencias de aislados estadounidenses de PRRSV en la Solicitud de Patente europea EP 0595436 (ORF 5-7 de ISU-12) y en la solicitud de Patente Internacional WO 96/04010 (VR 2332).

Los aislados de PRRSV de Estados Unidos difieren genéticamente al menos en parte de los aislados europeos (Conzelmann et al., supra; Meulenberg et al., supra; Murtaugh et al., Proc Allen D. Leman Conference, pp 43-45, 1993). Las diferencias genéticas entre los aislados de Estados Unidos y los aislados europeos son sorprendentes, especialmente porque se consideran el mismo virus (Murtaugh, supra). También se notificaron observaciones similares cuando se comparaba el aislado canadiense IAF-exp91 y otro aislado de Estados Unidos VR 2332 con LV (Murtaugh, supra; Mardassi, supra). Sin embargo, las secuencias de nucleótidos de 5 kb 3' terminal de dos aislados europeos son casi idénticas (Conzelmann et al., supra; Meulenberg et al., supra).

También se ha sugerido la existencia de cepas apatógenas o poco patógenas entre los aislados (Stevenson, supra). De esta manera, estos estudios sugieren que los aislados de PRRSV en Norteamérica y en Europa son antigénica y genéticamente heterogéneos, y que existen diferentes genotipos o serotipos de PRRSV. Sin embargo, antes de la presente invención no estaba completamente claro el papel de la variación antigénica y genética en la patogénesis de PRRSV.

La existencia de PRRSV en los Estados Unidos ha afectado de manera adversa a la industria de las granjas porcinas. Casi la mitad de las piaras de cerdos en los estados productores de cerdos de los Estados Unidos son seropositivas para PRRSV (Animal Pharm., 264:11 (11/11/92)). En Canadá, el PRRS se ha caracterizado por anorexia y pirexia en cerdas con una duración de hasta dos semanas, abortos en el último término, aumento en el índice de cerdos nacidos muertos, cerdos nacidos débiles y muertes en recién nacidos precedidas por una respiración abdominal rápida y diarrea. Se ha publicado el trabajo sobre el aislamiento del virus que produce PRRS, sobre un método de diagnóstico de la infección por PRRS y sobre el desarrollo de una vacuna contra el virus de la PRRS (véase la Publicación de la Patente canadiense Nº 2.076.744; la Publicación de la Patente Internacional PCT Nº WO 93/03760; la Publicación de la Patente Internacional PCT Nº WO 93/06211 y la Publicación de la Patente Internacional PCT Nº WO 93/07898).

También existe variabilidad en la virulencia de PRRSV en piaras. Recientemente, se ha producido una forma más virulenta de PRRSV con una mayor incidencia en cerdos de 3-8 semanas de edad en la mitad occidental de Estados Unidos. Típicamente, cerdos sanos de 3-5 semanas se destetan y enferman de 5 a 7 días después. Los métodos de identificación de virus rutinarios en tejidos de cerdos afectados han demostrado que el virus de la gripe porcina (SIV), el virus de la pseudorrabia (PRV) y Mycoplasma hyopneumoniae no están asociados con esta nueva forma de PRRS. Originalmente denominada neumonía intersticial proliferativa (PIP; véase la solicitud de patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 07/969.071), esta enfermedad se ha asociado muy recientemente con PRRS, y el virus se ha denominado informalmente la "cepa Iowa" de PRRSV (véase la solicitud de patente de Estados Unidos con el Nº de serie 08/131.625).

En la técnica se ha expresado pesimismo y escepticismo en relación con el desarrollo de vacunas eficaces contra estos virus porcinos (The Veterinary Record, 26 de octubre de 1991). Existe la creencia de que la vacuna de la gripe huma-
na puede producir alguna protección contra los efectos de PRRS y PNP (The Veterinary Record, 6 de julio de 1991).

Se sabe que las proteínas de la envuelta viral son muy variables en muchos coronavirus tales como el virus de la peritonitis infecciosa felina y el virus de la hepatitis del ratón (Dalziel et al: Site-specific alteration of murine hepatitis virus type 4 peplomer glycoprotein E2 results in reduced neurovirulence. J. Virol., 59:464-471 (1986); Fleming et al: Pathogenicity of antigenic variants of murine coronavirus JHM selected with monoclonal antibodies. J. Virol., 58: 869-875 (1986); Fiscus et al: Antigenic comparison of the feline coronavirus isolates; Evidence for markedly different peplomer glycoproteins. J. Virol., 61: 2607-2613 (1987); Parker et al: Sequence analysis reveals extensive polymorphism and evidence of deletions within the E2 glycoprotein gene of several strains of murine hepatitis virus. Virology, 173: 664-673 (1989)).

Por ejemplo, una deleción o una mutación en la proteína de la envuelta principal en coronavirus puede alterar el tropismo tisular y la patogenicidad in vivo. Una mutación en un mutante resistente a anticuerpos monoclonales de MHV ha producido una pérdida de su neurovirulencia para ratones (Fleming et al, 1986 supra). Se cree que el coronavirus respiratorio porcino (PRCV) es un mutante de deleción del virus de la gastroenteritis transmisible (TGEV) en el ganado porcino. La deleción en el genoma de PRCV puede estar en el extremo 5' del gen spike (S) de TGEV (Halbur et al, An overview of porcine viral respiratory disease. Proc. Central Veterinary Conference, pp. 50-59 (1993); Laude et al, Porcine respiratory coronavirus: Molecular features and virus-host interactions. Vet. Res., 24:125-150 (1993); Vaughn et al, Isolation and characterization of three porcine respiratory coronavirus isolates with varying sizes of deletions. J. Clin. Micro., 32:1809-1812 (1994).

El PRCV tiene un tropismo selectivo para el tracto respiratorio y no se replica en el tracto gastrointestinal (Rasschaert et al, Porcine respiratory coronavirus differs from transmissible gastroenteritis virus by a few genomic deletions. J. Gen Virol., 71: 2599-2607 (1990); Inude et al, 1993 supra). Por el contrario, TGEV tiene un tropismo tanto para el tracto respiratorio como para el tracto gastrointestinal (Laude et al, 1993, supra).

También se conocen las variaciones en las relaciones antigénicas y genéticas entre aislados de LDV de patogenicidad variable (Kuo et al, Lactate-dehydrogenase-elevating virus (LDV): subgenomic mRNAs, mRNA leader and comparison of 3' -terminal sequences of two LDV isolates. Virus Res., 23:55-72 (1992); Plagemann, LDV, EAV, and SHFV: A new group of positive stranded RNA virusses. Proc. Am. Assoc. Swine Practitioners, 4: 8-15 (1992); Chen et al, Sequences of 3' end of genome and of 5' end of open reading frame 1a of lactate dehydrogenase-elevating virus and common junction motifs between 5' leader and bodies of seven subgenomic mRNAs. J. Gen. Virol., 74: 643-660 (1993)).

Sin embargo, la presente descripción proporciona la primera percepción en las relaciones entre las fases de lectura abierta del genoma de PRRSV y sus efectos correspondientes sobre la virulencia y replicación.

Además, un diagnóstico del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) se basa en la recopilación de información de la historia clínica de la piara, serología, patología y finalmente el aislamiento del virus de PRRS (PRRSV). En el último año se han publicado tres referencias excelentes que revisan el diagnóstico de PRRSV (Van Alstine et al, "Diagnosis of porcine reproductive and respiratory syndrome", Swine Healt and Production, Vol.1, Nº 4, (1993), p. 24-28; Christianson et al, "Porcine reproductive and respiratory syndrome: A review", Swine Health and Production, Vol. 1, Nº 2 (1994), pp. 10-28 y Goyal, "Porcine reproductive and respiratory syndrome", J. Vet. Diagn. Invest. 5: 656-664 (1993). También se ha demostrado recientemente que PRRSV se replica en macrófagos alveolares pulmonares por inmunohistoquímica con oro coloidal (Magar et al, (1993): Immunohistochemical detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus using colloidal gold. Can. J. Vet. Res., 57: 300-304).

Los signos clínicos varían ampliamente entre granjas, y por lo tanto, no son las pruebas más fiables de un diagnóstico definitivo, excepto en el caso de un brote agudo severo en piaras no expuestas previamente que experimentan una gran cantidad de abortos, un aumento del número de cerdos nacidos muertos y neumonía severa en cerdos recién nacidos y lactantes. En el momento actual, la presentación clínica más común es neumonía y problemas bacterianos diversos en cerdos de 3-10 semanas de edad. Sin embargo, muchas piaras positivas para PRRSV no tienen problemas reproductivos o respiratorios aparentes.

Algunas piaras muestran una incapacidad reproductiva devastadora, caracterizada por abortos en el tercer trimestre, cerdos nacidos muertos y cerdos nacidos débiles. Muchas de estas piaras también experimentan una enfermedad respiratoria severa en recién nacidos. También es común la enfermedad respiratoria inducida por PRRSV en cerdos de 4-10 semanas de edad y puede ser bastante severa (Halbur et al, Viral contributions to the porcine respiratory disease complex. Proc. Am. Assoc. Swine Pract. (1993), pp 343-350). Los brotes clínicos de PRRSV a menudo van seguidos de neumonía bacteriana, septicemia o enteritis. De esta manera, ha sido difícil obtener un diagnóstico aceptablemente rápido y fiable de la infección por PRRSV antes de la presente invención.

La industria de las granjas porcinas se ha visto y se seguirá viendo afectada de manera adversa por estas enfermedades reproductivas y respiratorias porcinas y por nuevas variantes de las mismas, cuando aparezcan. PRRSV es un patógeno de los cerdos que produce pérdidas económicas por enfermedades reproductivas y respiratorias. Las pérdidas económicas por PRRS se producen por la pérdida de cerdos a causa de abortos, cerdos nacidos muertos, repetición de la cría, mortalidad previa al destete y posterior al destete, reducción de la eficacia de conversión del alimento y aumento de los costes de fármacos y de mano de obra, y se ha estimado un coste de aproximadamente 236 dólares por cerda además de la pérdida de beneficios (Polson et al., Financial implications of mystery swine disease (MSD), Proc. Mystery Swine Disease Committee Meeting, Denver, Co., 1990, pp. 8-28). Esto representa una pérdida de 23.600 dólares para una piara de 100 cerdas o 236.000 dólares para una piara de 1.000 cerdas.

PRRSV produce pérdidas adicionales por neumonía en cerdos lactantes. Sin embargo, no se conocen las pérdidas económicas exactas debidas a la neumonía asociada con PRRSV. PRRSV es una causa importante de neumonía en cerdos lactantes y destetados. La enfermedad reproductiva ha sido el resultado clínico predominante de las infecciones por PRRSV durante los últimos años. Actualmente la enfermedad respiratoria se ha convertido en el problema principal asociado con el PRRSV.

Sorprendentemente, el mercado de las vacunas animales en los Estados Unidos y en todo el mundo es mayor que el mercado de las vacunas humanas. De esta manera, existe un incentivo económico para desarrollar nuevas vacunas veterinarias, además de los beneficios sustanciales para la salud pública derivados de la protección de los animales de granja frente a la enfermedad.

Descripción de la invención

Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar un ácido polinucleico aislado a partir de un virus reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), que contiene la ORF-2 de uno cualquiera de VR 2385 (ISU-12), VR 2429 (ISU-22), VR 2431 (ISU-3927), VR 2474 (ISU-79) y VR 2475 (ISU-1894) y combinaciones de los mismos.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un ácido polinucleico aislado que codifica a una proteína de PRRSV, codificada por la ORF-2.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar una proteína de PRRSV, aislada a partir de un PRRSV o codificada por un ácido polinucleico de PRRSV, codificada por la ORF-2.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar una vacuna basada en una proteína o ácido polinucleico, que protege a un cerdo frente al PRRS.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para inducir una respuesta inmunológica eficaz contra un PRRSV usando la vacuna.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para producir una vacuna basada en una proteína o ácido polinucleico, que protege a un cerdo frente a una infección por PRRSV.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar el uso de los ácidos polinucleicos o proteínas de la invención en la fabricación de una vacuna para tratar a un cerdo infectado o expuesto a PRRSV.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para detectar PRRSV.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un ensayo de diagnostico de inmunoperoxidasa para la detección del antígeno de PRRSV en tejidos porcinos.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un anticuerpo que se una inmunológicamente a una proteína de PRRSV o a una región antigénica de dicha proteína.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un anticuerpo que se una inmunológicamente a una vacuna basada en una proteína o ácido polinucleico que protege a un cerdo frente al PRRSV.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método de detección y un kit de diagnóstico para ensayar un PRRSV.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar los objetos anteriores, donde el virus de PRRS es la cepa Iowa de PRRSV.

Estos y otros objetos se harán evidentes durante la siguiente descripción de las realizaciones preferidas, se han proporcionado por al menos un polipéptido purificado seleccionado entre el grupo consistente en proteínas codificadas por una o mas fases de lectura abierta de ORF 2, ORF 3, ORF 4 y ORF 5 de una cepa Iowa de PRRSV, regiones antigénicas de dichas proteínas que tienen una longitud de al menos 5 aminoácidos y que estimulan eficazmente la protección inmunológica en un hospedador porcino contra una exposición posterior con un aislado de PRRSV, y combinaciones de los mismos; un ácido polinucleico aislado que codifica dicho polipéptido o polipéptidos; una vacuna que comprende una cantidad eficaz de dicho polinucleótido, polipéptido o polipéptidos; anticuerpos que se unen específicamente a dicho polinucleótido o polipéptido; métodos para producirlos; y el uso de los polipéptidos anteriores para inducir una respuesta inmunológica eficaz contra un PRRSV; la fabricación de una vacuna para tratar a un cerdo expuesto o infectado por PRRSV y la detección de PRRSV.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un organigrama que indica un procedimiento para producir una vacuna de subunidad;

la Figura 2 es un organigrama que indica un procedimiento para producir una vacuna modificada por ingeniería genética;

la Figura 3 muestra un procedimiento esquemático general para la construcción de una biblioteca de ADNc de \lambda como se describe por el fabricante (Stratagene);

la Figura 4 muestra un procedimiento esquemático general para identificar clones auténticos del aislado del virus de PRRS ISU-12 (VR 2385) por hibridación diferencial (modificado a partir de "Recombinant DNA", 2nd ed., Watson, J.D., et al., eds. (1992), p. 110);

la Figura 5 es una transferencia de Northern que muestra las especies de ARNm subgenómico de VR 2385, desnaturalizado con glioxal 6 M y DMSO, y separado en un gel de agarosa al 1,5%;

la Figura 6 muestra los clones de ADNc de \lambda usados para obtener la secuencia de nucleótidos 3'-terminal de VR 2385;

la Figura 7 muestra la secuencia 3'-terminal de 2062 pb (SEC ID Nº: 13) y las secuencias de aminoácidos codificadas por las ORF 5, 6 y 7 (SEC ID Nº: 15, 17 y 19, respectivamente) de VR 2385;

la Figura 8 compara las regiones ORF-5 de los genomas de VR 2385 y el virus Lelystad;

la Figura 9 compara las regiones ORF-6 de los genomas de VR 2385 y el virus Lelystad;

la Figura 10 compara las regiones ORF-7 de los genomas de VR 2385 y el virus Lelystad;

la Figura 11 compara las regiones no traduccionales 3' de los genomas de VR 2385 y el virus Lelystad;

la Figura 12 muestra un efecto citopático en células HI-FIVE infectadas con un baculovirus recombinante que contiene el gen ORF-7 de VR 2385 (Baculo.PRRSV. 7);

la Figura 13 muestra células HI-FIVE infectadas con un baculovirus recombinante que contiene el gen de la ORF-6 de VR 2385, teñidas con antisuero porcino contra VR 2385, seguido de IgG anti-porcina conjugada con fluoresceína;

la Figura 14 muestra células HI-FIVE infectadas con un baculovirus recombinante que contiene el gen de la ORF-7 de VR 2385, respectivamente, teñidas con antisuero porcino contra VR 2385, seguido de IgG anti-porcina conjugada con fluoresceína;

la Figura 15 muestra una banda del tamaño esperado para el producto de la ORF-6 de VR 2385, detectada por una técnica de radioinmunoprecipitación (véase el Experimento II(B) más adelante);

la Figura 16 muestra una banda del tamaño esperado para el producto de la ORF-7 de VR 2385, detectada por una técnica de radioinmunoprecipitación (véase el Experimento II(B) más adelante);

la Figura 17 compara las secuencias de nucleótidos de la ORF 6 y la ORF 7 de seis aislados estadounidenses de PRRSV y de LV, donde primero se muestra la secuencia de nucleótidos de VR 2385 y, en secuencias posteriores, sólo se indican los nucleótidos que son diferentes;

las Figuras 18(A)-(B) muestran el alineamiento de secuencias de aminoácidos de los supuestos genes de M (Fig. 18(A)) y N (Fig. 18(B)) del grupo de arterivirus propuesto, realizado con un programa GENEWORKS (IntelliGenetics, Inc.);

las Figuras 19(A)-(B) muestran árboles filogenéticos basados en las secuencias de aminoácidos de los supuestos genes de M (Fig. 19(A)) y N (Fig. 19(B)) para el grupo de arterivirus propuesto;

la Figura 20 muestra la secuencia de nucleótidos de una región del genoma del aislado de PRRSV VR 3285 que contiene las ORF 2, 3 y 4;

las Figuras 21(A)-(C) comparan las secuencias de nucleótidos de la ORF 2, ORF 3 y ORF 4 del aislado de PRRSV VR 2385 con las ORF correspondientes del virus Lelystad (LV);

las Figuras 22 (A)-(C) muestran alineamientos de las secuencias de aminoácidos previstas codificadas por las ORF 2, 3 y 4 del aislado de PRRSV VR 2385 y LV;

la Figura 23 muestra una tinción inmunohistoquímica de una muestra de tejido pulmonar extraída de un cerdo infectado 9 días antes con PRRSV, en la que se observa tinción ABC positiva con hematoxilina como tinte de contraste dentro del citoplasma de macrófagos y células desprendidas en los espacios alveolares;

la Figura 24 muestra una tinción inmunohistoquímica de una muestra de tejido pulmonar extraída de un cerdo infectado 4 días antes con PRRSV, en la que se muestra tinción ABC positiva con hematoxilina como tinte de contraste dentro del desecho celular en las luces terminales de las vías respiratorias;

la Figura 25 muestra un corazón de un cerdo infectado 9 días antes con PRRSV, en el que se muestra tinción positiva dentro de las células endoteliales (flechas) y macrófagos aislados por el método del complejo de estreptavidina-biotina de la presente invención (con hematoxilina como colorante de contraste); la barra indica una longitud de 21 micrómetros;

la Figura 26 muestra una amígdala de un cerdo infectado 9 días antes con PRRSV, en la que se muestran células con tinción positiva (cabezas de flecha) dentro de los folículos y en el epitelio de la cripta por el método del complejo de estreptavidina-biotina de la presente invención (con hematoxilina como colorante de contraste); la barra indica una longitud de 86 micrómetros;

la Figura 27 muestra un ganglio linfático de un cerdo infectado 9 días antes con PRRSV, en el que se muestra tinción positiva dentro de los folículos por el método del complejo de estreptavidina-biotina de la presente invención (con hematoxilina como colorante de contraste), y células positivas (flechas) que se parecen a macrófagos o a células dendríticas; la barra indica una longitud de 21 micrómetros;

\newpage

las Figuras 28(A)-(C) son fotomicrografías de pulmones de cerdos inoculados con (A) fluido de cultivo de una línea celular no infectada, (B) fluido de cultivo de una línea celular infectada con un aislado de PRRSV de baja virulencia (los pulmones muestran lesiones de tipo A de PRRS) y (C) fluido de cultivo de una línea celular infectada con un aislado de PRRSV de alta virulencia (los pulmones muestran lesiones de tipo B de PRRS);

las Figuras 29(A)-(B) ilustran la tinción inmunohistoquímica con un anticuerpo monoclonal anti-PRRSV de un pulmón de un cerdo infectado 9 días antes con PRRSV; y

las Figuras 30(A)-(B) muestran transferencias de Northern de los aislados de PRRSV VR 2385pp (denominado "12"), VR 2429 (ISU-22, denominado "22"), VR 2430, (denominado "55"), ISU-79 (denominado "79"), ISU-1894 (denominado "1894") y VR 2431 (denominado "3927").

Mejor modo para realizar la invención

En la presente invención, un "virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino" o "PRRSV" se refiere a un virus que produce la enfermedad PRRS, PEARS, SIRS, MSD y/o PIP (el término "PIP" ahora parece estar en desuso), incluyendo la cepa Iowa de PRRSV, otras cepas de PRRSV encontradas en los Estados Unidos (por ejemplo, VR 2332), cepas de PRRSV encontradas en Canadá (por ejemplo, IAF-exp91), cepas de PRRSV encontradas en Europa (por ejemplo, virus Lelystad, PRRSV 10) y variantes muy relacionadas de estos virus que pueden haber aparecido y que aparecerán en el futuro.

La presente vacuna es eficaz si protege a un cerdo frente a la infección por un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV). Una vacuna protege a un cerdo frente a la infección por PRRSV si después de la administración de la vacuna a uno o mas cerdos no afectados, una exposición posterior a un aislado de virus biológicamente puro (por ejemplo, VR 2385, VR 2386 u otro aislado de virus descrito mas adelante) tiene como resultado una reducción de la gravedad de cualquier cambio general o histopatológico (por ejemplo, lesiones en el pulmón) y/o síntomas de la enfermedad, en comparación con los cambios o síntomas producidos típicamente por el aislado en cerdos similares que no están protegidos (es decir, con respecto a un control apropiado). Mas particularmente, puede demostrarse que la vacuna de la presente invención es eficaz administrando la vacuna a uno o mas cerdos adecuados que la necesitan y, después de un periodo de tiempo aproximado (por ejemplo, 1-4 semanas), exponiendo a los cerdos a una muestra grande (10^{3-7} TCID_{50}) de un aislado de PRRSV biológicamente puro. Después de extrae una muestra de sangre del cerdo expuesto una vez que ha transcurrido aproximadamente una semana, y se realiza un intento de aislar el virus a partir de la muestra de sangre (por ejemplo, véase el procedimiento de aislamiento de virus ejemplificado en el Experimento VIII mostrado mas adelante). El aislamiento del virus es una indicación de que la vacuna no puede ser eficaz y la incapacidad de aislar el virus es una indicación de que la vacuna puede ser eficaz.

De esta manera, la eficacia de la vacuna de la presente invención puede evaluarse cuantitativamente (es decir, una reducción en el porcentaje de tejido pulmonar consolidado en comparación con un grupo de control apropiado) o cualitativamente (por ejemplo, aislamiento de PRRSV a partir de la sangre, detección de antígeno de PRRSV en una muestra de tejido de pulmón, amígdala o ganglio linfático por un método de ensayo de inmunoperoxidasa [descrito mas adelante], etc.). Los síntomas de la enfermedad reproductiva y respiratoria porcina pueden evaluarse cuantitativamente (por ejemplo, temperatura/fiebre), semi-cuantitativamente (por ejemplo, gravedad de la insuficiencia respiratoria [explicada con detalle mas adelante] o cualitativamente (por ejemplo, la presencia o ausencia de uno o mas síntomas o una reducción de la gravedad de uno o mas síntomas, tales como cianosis, neumonía, lesiones cardiacas y/o cerebrales, etc.).

Un cerdo no afectado es un cerdo que no se ha expuesto a un agente infeccioso de la enfermedad reproductiva y respiratoria porcina o que se ha expuesto a un agente infeccioso de la enfermedad reproductiva y respiratoria porcina pero que no muestra los síntomas de la enfermedad. Un cerdo afectado es uno que muestra los síntomas de PRRS o uno a partir del cual puede aislarse PRRSV.

Los signos o síntomas clínicos de PRRS pueden incluir letargo, insuficiencia respiratoria, "latidos rápidos" (expiración forzada), fiebre, pelaje áspero, estornudos, tos, edema ocular y ocasionalmente conjuntivitis. Las lesiones pueden incluir lesiones pulmonares generales y/o microscópicas, miocarditis, linfadenitis, encefalitis y rinitis. El agente infeccioso puede ser un solo virus, o puede estar combinado con uno o mas agentes infecciosos adicionales (por ejemplo, otros virus o bacterias). Además, se han encontrado formas menos virulentas y no virulentas del PRRSV y de la cepa Iowa, que pueden producir una subserie de los síntomas anteriores o no producen ningún síntoma. Sin embargo, de acuerdo con la presente invención pueden usarse formas menos virulentas y no virulentas de PRRSV para proporcionar protección contra las enfermedades reproductivas y respiratorias porcinas.

Las lesiones histológicas en las diversas enfermedades porcinas son diferentes. La Tabla 1 proporcionada a continuación compara las observaciones fisiológicas y la patología de las lesiones asociadas con varias enfermedades producidas por virus porcinos:

TABLA I Patología Comparativa de Neumonía Viral Porcina

1

donde "PRRS(p)" representa la patología publicada del virus PRRS, "PRRS(o)" representa la patología del virus de PRRS observada por los presentes inventores, "SIV" representa el virus de la gripe porcina de tipo A, "PCRV" representa el coronavirus respiratorio porcino, "PPMV" representa el paramixovirus porcino, "Iowa" se refiere a la cepa de PRRSV descubierta por los presentes inventores, "Tipo II" se refiere a neumocitos de tipo II (que proliferan en cerdos infectados), "Inter." se refiere a la infiltración septal intersticial por células mononucleares, "necrosis de las vías respiratorias" se refiere a la necrosis en las partes terminales de las vías respiratorias y los símbolos (-) y (+) a (++++) se refieren a la siguiente escala de gravedad comparativa:

(-): negativo (no observado)

(+): leve (justo por encima del umbral de observación)

(++): moderado

(+++): severo

(++++): mas severo.

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Un "virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino" o "PRRSV" produce una enfermedad reproductiva y respiratoria porcina definida por uno o mas de los signos clínicos, síntomas, lesiones e histopatología descritos anteriormente, y se caracteriza como un arterivirus de ARN con envuelta que tiene un tamaño de 50 a 80 nm de diámetro y de 250 a 400 nm de longitud. Las "cepas norteamericanas de PRRSV" se refieren a las cepas de PRRSV que son nativas de Norteamérica. Las "cepas de Estados Unidos de PRRSV" se refieren a las cepas de PRRSV nativas de Estados Unidos, y las "cepas europeas de PRRSV" se refieren a las cepas de PRRSV de Europa, tales como el virus Lelystad (depositado en el CDI [Lelystad, Países Bajos] en el depósito del Instituto Pasteur, París, Francia, con el número de depósito I-1102; véase la Publicación de Patente Internacional Nº WO 92/21375, publicada el 10 de diciembre de 1992).

La "cepa Iowa" de PRRSV se refiere a (a) las cepas de PRRSV aisladas por los presentes inventores, (b) las cepas que tienen una identidad (u homología) de secuencia de al menos 97% en la séptima fase de lectura abierta (ORF 7) con al menos uno de VR 2385, VR 2430 y VR 2431; (c) las cepas que, después de no más de 5 pases, crecen hasta un título de al menos 10^{4} TCID_{50} en células CRL 11171, células MA-104 o células PSP-36, (d) las cepas que tienen una homología de al menos 80% y preferiblemente de al menos 90% con una o mas de las OFR 2-5 de VR 2385, y (e) las cepas que producen un mayor porcentaje de consolidación de tejido pulmonar que el virus Lelystad (por ejemplo, 10 después de la infección, los cerdos infectados presentan una consolidación pulmonar de al menos 20%, preferiblemente de al menos 40%). Preferiblemente, la cepa Iowa de PRRSV se caracteriza por al menos dos de las características anteriores (a) - (e).

La presente invención se refiere principalmente a ácidos polinucleicos (segmentos de ARN y/o ADN genómico, ARNm, ADNc, etc.) aislados a partir de o correspondientes a un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), a proteínas codificadas por el ADN, a métodos para producir los ácidos polinucleicos y proteínas, a vacunas que protegen a los cerdos frente al PRRSV, a un método para proteger a un cerdo frente al PRRSV usando la vacuna, a un método para producir la vacuna, al uso de la vacuna en la fabricación de un medicamento para tratar a un cerdo infectado o expuesto al PRRSV, y a un método para detectar un PRRSV. Más particularmente, la presente invención se refiere a una vacuna que protege a los cerdos de las cepas norteamericanas de PRRSV, a un método para producir y administrar la vacuna y a ácidos polinucleicos y proteínas obtenidas a partir de una cepa Iowa de PRRSV. Sin embargo, se cree que la información obtenida en el transcurso del desarrollo de la presente invención será útil para desarrollar vacunas y métodos para proteger a los cerdos frente a todas y cada una de las cepas del síndrome reproductivo y respiratorio porcino. Por lo tanto, la presente invención no se limita necesariamente a ácidos polinucleicos, proteínas, vacunas y métodos relacionados con la cepa Iowa del virus del PRRS (PRRSV).

La frase "ácido polinucleico" se refiere a ARN o ADN, así como a ARNm y ADNc correspondientes o complementarios al ARN o ADN aislado a partir del virus o agente infeccioso. Una "ORF" se refiere a una fase de lectura abierta, o segmento que codifica un polipéptido, aislada a partir de un genoma viral, incluyendo el genoma de PRRSV. En el ácido polinucleico de la presente invención, una ORF puede incluirse en parte (como un fragmento) o en su totalidad y puede solapar con las secuencias 5' ó 3' de una ORF adyacente (véanse las Figs. 7 y 21 y los Experimentos I y IV presentados más adelante). Un "polinucleótido" es equivalente a un ácido polinucleico, pero puede definir una molécula o grupo de moléculas distintas (por ejemplo, como una subserie de un grupo de ácidos polinucleicos).

Haciendo referencia ahora a las Figuras 1-2, se proporcionan organigramas de procedimientos para preparar tipos de vacunas incluidas en la presente invención. Los organigramas de las Figuras 1-2 se proporcionan como métodos ilustrativos para producir las vacunas de la presente invención y no pretenden limitar la presente invención de ninguna manera.

La primera etapa en todos los procedimientos detallados en la Figuras 1-2 es identificar una línea celular susceptible de infección con un virus o agente infeccioso reproductivo y respiratorio porcino. (Para simplificar el análisis en relación con la preparación de la vacuna, el término "virus" se refiere a un virus y/u otro agente infeccioso asociado con una enfermedad reproductiva y respiratoria porcina). Después se prepara una solución maestra de células (MCS) de la célula hospedadora susceptible. Las células hospedadoras susceptibles continúan sometiéndose a pases más allá de la MCS. Se prepara una solución de células de trabajo (WCS) a partir de los pases de células entre MCS y MCS+n.

Se propaga un virus de siembra maestro en la línea de células hospedadoras susceptibles, entre MCS y MCS+n, preferiblemente en WCS. El virus de partida se aísla por métodos conocidos en la técnica a partir de muestras de tejido apropiadas, preferiblemente homogeneizadas, tomadas a partir de cerdos infectados que presentan síntomas de la enfermedad correspondientes a los producidos por el virus de interés. Una célula hospedadora adecuada, preferiblemente una muestra de WCS, se infecta con el virus de partida, y después se cultiva. Posteriormente se aísla el virus de la vacuna y se purifica en placas a partir de la célula hospedadora infectada cultivada por métodos conocidos en la técnica. Preferiblemente, el virus a usar para preparar la vacuna se purifica en placa tres veces.

Después de prepara un virus de siembra maestro (MSV) a partir del virus purificado en placa por métodos conocidos en la técnica. El MVS(X) después se somete a pases en WCS al menos cuatro veces hasta los pases de virus MSV(X+1), MSV(X+2), MSV(X+3) y MSV(X+4). El MSV(X+4) se considera el virus de siembra de trabajo. Preferiblemente, el pase de virus a usar en los estudios de cerdos y el producto de vacuna de la presente invención es MSV(X+5), el producto del quinto pase.

Junto con la solución de células de trabajo, el virus de siembra de trabajo se cultiva por métodos conocidos en cantidades suficientes para preparar una vacuna prototipo, preferiblemente MSV(X+5). Las vacunas prototipo de la presente invención pueden ser de cualquier tipo adecuado para uso en el campo de la medicina veterinaria. Los tipos principales de vacunas sobre los que se centra la presente invención incluyen una vacuna de subunidad (Figura 1) y una vacuna modificada por ingeniería genética (Figura 2). Sin embargo, también son aceptables otros tipos de vacunas reconocidas en el campo de las vacunas veterinarias, incluyendo vacunas de virus vivas, vivas modificadas, atenuadas e inactivadas. Una vacuna inactivada puede inactivarse por medio de un tratamiento químico o calor, etc., de una manera conocida para el especialista habitual en la técnica.

Un virus atenuado puede obtenerse repitiendo el pase seriado del virus en una célula hospedadora adecuada un número suficiente de veces para obtener un virus esencialmente no virulento. Por ejemplo, un PRRSV puede someterse a pases seriados de 1 a 20 veces (o mas, si se desea) para que esté suficientemente atenuado para usarse como una vacuna atenuada. MSV(X+5) puede ser dicha vacuna atenuada.

En los procedimientos indicados en cada una de las Figuras 1-2, después de la preparación de una vacuna prototipo se realizan modelos de exposición de cerdos y ensayos clínicos por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, antes de realizar los estudios reales de vacunación/exposición, la enfermedad a prevenir y/o a tratar debe definirse en términos de sus síntomas, resultados de ensayos clínicos, condiciones, etc. Como se describe en la presente memoria, la cepa Iowa de PRRSV se ha definido en términos de su histopatología y los síntomas clínicos que produce. En los experimentos presentados mas adelante se describen con detalle análisis clínicos de la cepa Iowa de PRRSV.

Una vez que se ha administrado una vacuna prototipo a un cerdo, posteriormente se expone el cerdo al virus que produce la enfermedad. Esto se conoce como "exposición" del cerdo y su sistema inmunológico. Después de observar la respuesta del cerdo expuesto al virus o agente infeccioso y de analizar la capacidad de la vacuna prototipo de proteger al cerdo, se realizan estudios de eficacia por métodos conocidos convencionales. Después se crea un ensayo de potencia en un procedimiento separado por método conocidos en la técnica, y después se producen series de preautorización.

Antes de preparar la vacuna de subunidad del prototipo (Figura 1), deben identificarse los componentes protectores o antigénicos del virus de la vacuna. Estos componentes protectores o antigénicos incluyen ciertos segmentos o fragmentos de aminoácidos de las proteínas virales (preferiblemente proteínas de la cubierta) que inducen una respuesta protectora o inmunológica particularmente fuerte en credos; estos fragmentos de proteínas antigénicas fusionados a proteínas que no son de PRRSV que actúan como vehículos y/o adyuvantes; las propias proteínas de la cubierta viral individuales o múltiples, oligómeros de las mismas, y asociaciones de mayor orden de las proteínas de la cubierta viral que forman subestructuras de virus o partes identificables o unidades de dichas subestructuras de virus; oligoglicósidos, glicolípidos o glicoproteínas presentes en o cerca de la superficie del virus o en subestructuras virales tales como la nucleocápsida; lipoproteínas o grupos de lípidos asociados con el virus, etc.

Los segmentos o fragmentos de aminoácidos antigénicos tienen preferiblemente una longitud de al menos 5 aminoácidos, de una forma particularmente preferida de al menos 10 aminoácidos y pueden tener hasta, pero sin incluir, la longitud entera de la proteína nativa. En la presente invención, la afinidad de unión (o constante de unión o constante de asociación) de un fragmento antigénico es preferiblemente al menos 1% y más preferiblemente al menos 10% de la afinidad de unión de la proteína de longitud entera correspondiente (es decir, que se codifica por la misma ORF) por un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la proteína de longitud entera. El anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la proteína de longitud entera codificada por una ORF de un PRRSV se deposita preferiblemente según el Tratado de Budapest en un depósito aceptable, o se secuencia o caracteriza de otra manera en términos de sus propiedades fisicoquímicas (por ejemplo, tipo de anticuerpo [IgG, IgM, etc.], peso molecular, número de cadenas pesadas y ligeras, afinidades de unión por una o mas proteínas conocidas o secuenciadas [por ejemplo, seleccionadas entre las SEC ID Nº: 15, 17, 19, 21, 24, 26, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 67, 69, 71, 73, 75 y 77], etc.).

Los fragmentos antigénicos de las proteínas virales (por ejemplo, los codificados por una o más de las ORF 2-6 de un virus PRRSV) se identifican por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar ácidos polinucleicos que tienen una ORF truncada que codifica un polipéptido con un número predeterminado de restos aminoacídicos delecionados del extremo N, del extremo C o de ambos extremos. La ORF truncada puede expresarse in vitro o in vivo de acuerdo con métodos conocidos, y el polipéptido truncado correspondiente después puede aislarse de acuerdo con métodos conocidos. Las propiedades inmunoprotectoras de los polipéptidos pueden medirse directamente (por ejemplo, in vivo). Como alternativa, la región o regiones antigénicas del polipéptido de longitud completa pueden determinarse indirectamente por medio de la exploración de una serie de polipéptidos truncados frente a, por ejemplo, anticuerpos monoclonales depositados o caracterizados de manera adecuada. (Si se realiza el método indirecto alternativo, la incapacidad de un polipéptido truncado de unirse a un anticuerpo monoclonal de neutralización es una fuerte indicación de que la parte del polipéptido de longitud entera delecionada en el polipéptido truncado contiene un fragmento antigénico.) Una vez identificadas, la parte o partes antigénicas o inmunoprotectoras (la "subunidad o subunidades") de las proteínas virales o del propio virus posteriormente pueden clonarse y/o purificarse de acuerdo con métodos conocidos. (Los protocolos de inactivación viral/bacteriana y de purificación de subunidades mencionados en la Figura 1 son opcionales).

Las vacunas modificadas por ingeniería genética (Figura 2) empiezan con una modificación del procedimiento general usado para la preparación de las otras vacunas. Después de la purificación en placa, el virus de PRRS puede aislarse a partir de un homogeneizado de tejidos adecuado por métodos conocidos en la técnica, preferiblemente por métodos de cultivo de células convencionales usando PSP-36, ATCC CRL 11171 o macrófagos como hospedadores.

El ARN se extrae del virus biológicamente puro por un método conocido, preferiblemente por el método de isotiocianato de guanidina usando un kit de aislamiento de ARN disponible en el mercado (por ejemplo, el kit disponible en Stratagene, La Jolla, California), y purificarse por uno o más métodos conocidos, preferiblemente por ultracentrifugación en un gradiente de CsCl. El ARN mensajero puede purificarse adicionalmente o enriquecerse por cromatografía en columna de oligo (dT)-celulosa.

El genoma viral después se clona en un hospedador adecuado por métodos conocidos en la técnica (véase Maniatis et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1989), Cold Spring Harbor, Massachusetts). Después se analiza el genoma del virus para determinar regiones esenciales del genoma para producir partes antigénicas del virus. Posteriormente, el procedimiento para producir una vacuna modificada por ingeniería genética es esencialmente igual que el procedimiento para una vacuna viva modificada, una vacuna inactivada o una vacuna de subunidad (véase la Figura 1 de la presente solicitud y las Figuras 1-3 de la solicitud de Estados Unidos con el Nº de serie 08/131.625). Durante las series de preautorización, la expresión de la subunidad clonada recombinante de una vacuna de subunidad puede optimizarse por métodos conocidos por los especialistas en la técnica (véanse, por ejemplo, las secciones relevantes de Maniatis et al, citado anteriormente).

La vacuna de la presente invención protege a los cerdos frente a un virus o agente infeccioso que produce una enfermedad reproductiva y respiratoria porcina. Preferiblemente, la vacuna de la presente invención protege a los cerdos frente a la infección por PRRSV. Sin embargo, también es de esperar que la vacuna de la presente invención proteja también a un cerdo frente a la infección por variantes muy relacionadas de diversas cepas de PRRSV.

También pueden prepararse vacunas de virus de subunidad a partir de subunidades de virus semipurificadas por los métodos descritos anteriormente en la discusión de la Figura 1. Por ejemplo, se han preparado aislados de hemaglutinina del virus de la gripe y antígenos de superficie de neuraminidasa aislados a partir del virus de la gripe, y se ha demostrado que son menos tóxicos que el virus entero. También pueden prepararse vacunas de subunidad a partir de subunidades muy purificadas del virus. Un ejemplo en los seres humanos es el antígeno de superficie 22-nm del virus de la hepatitis B humana. Se conocen subunidades del virus del herpes simple humano y otros muchos ejemplos de vacunas de subunidad para uso en seres humanos. De esta manera, a la vacuna de subunidad de la presente invención se le pueden aplicar métodos para preparar vacunas de subunidad purificadas a partir de PRRSV cultivado en una célula hospedadora adecuada.

En la naturaleza pueden encontrarse vacunas de virus atenuadas y pueden tener deleciones de genes naturales (véanse los Experimentos VIII y IX presentados más adelante). Como alternativa, pueden prepararse vacunas atenuadas por una diversidad de métodos conocidos tales como el pase en serie (por ejemplo, 5-25 veces) en cultivos celulares o en cultivos de tejidos. Sin embargo, las vacunas de virus atenuadas preferidas en la presente invención son las atenuadas por deleciones de genes recombinantes o mutaciones génicas (como se ha descrito anteriormente).

Las vacunas modificadas por ingeniería genética se producen por técnicas conocidas por los especialistas en la técnica. Estas técnicas incluyen las que usan ADN recombinante y las que usan virus vivos. Por ejemplo, pueden identificarse ciertos genes de virus que codifican proteínas responsables para inducir una respuesta inmune o protectora más fuerte en cerdos. Estos genes identificados pueden clonarse en vectores de expresión de proteínas tales como (pero sin limitación) el vector de baculovirus (véase, por ejemplo, O'Reilly et al, "Baculovirus Expression Vectors: A Lab Manual", Freeman & Co. (1992)). El vector de expresión que contiene el gen que codifica la proteína inmunogénica del virus puede usarse para infectar células hospedadoras apropiadas. Las células hospedadoras se cultivan, expresando de esta manera las proteínas de vacuna deseadas, que pueden purificarse en una medida deseada, y después usarse para proteger a los cerdos de la enfermedad reproductiva y respiratoria.

Las proteínas modificadas por ingeniería genética pueden expresarse, por ejemplo, en células de insectos, células de levadura o células de mamífero. Las proteínas modificadas por ingeniería genética que pueden purificarse y/o aislarse por métodos convencionales, pueden inocularse directamente en animales para conferir protección contra enfermedades reproductivas y respiratorias porcinas. En una vacuna se pueden usar una o mas proteínas de la envuelta de un PRRSV (es decir, las codificadas por las ORF 2-6) o partes antigénicas de las mismas para inducir anticuerpos neutralizadores. En una vacuna pueden usarse nucleoproteínas procedentes de un PRRSV para inducir inmunidad celular.

Preferiblemente, la presente invención transforma una línea celular de insecto (HI-FIVE) con un vector de transferencia que contiene ácidos polinucleicos obtenidos a partir de la cepa Iowa de PRRSV. Preferiblemente, el presente vector de transferencia comprende ADN de baculovirus linealizado y un plásmido que contiene uno o más ácidos polinucleicos obtenidos a partir de la cepa Iowa de PRRSV. La línea de células hospedadoras puede co-transfectarse con el ADN de baculovirus linealizado y un plásmido, de forma que se obtenga un baculovirus recombinante. De una forma particularmente preferida, el ácido polinucleico de la presente invención codifica una o más proteínas de la cepa Iowa de PRRSV.

Como alternativa, puede insertarse ADN o ARN de un PRRSV que codifica una o mas proteínas virales (por ejemplo, de la envuelta y/o nucleoproteínas) en vectores vivos, tales como poxvirus o un adenovirus, y usarse como una vacuna.

De esta manera, la presente invención se refiere además a una preparación purificada de un ácido polinucleico aislado a partir del genoma de un virus de PRRS, preferiblemente un ácido polinucleico aislado a partir del genoma de la cepa Iowa de PRRSV. El ácido polinucleico de la presente invención tiene utilidad (o aplicación) en la producción de la vacuna de la presente invención, en la selección o identificación de animales infectados o expuestos, en la identificación de virus y/o agentes infecciosos relacionados y como un vector para transformar células y/o inmunizar a animales (por ejemplo, cerdos) con genes heterólogos.

En los experimentos descritos mas adelante se describen con detalle el aislamiento, clonación y secuenciación de las ORF 2-7 del aislado ISU-12 de PRRSV purificado en placa (depositado el 30 de octubre de 1992 en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parlawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A., con los números de acceso VR 2385 [purificado en placas 3 x] y VR 2386 [no purificado en placas]) y las ORF 6-7 de los aislados de PRRSV ISU -22, ISU-55 e ISU-3927 (depositados el 29 de septiembre de 1993, en la Colección Americana de Cultivos Tipo, con los números de acceso VR 2429, VR 2430 y VR 2431, respectivamente), ISU-79 e ISU-1894 (depositados el 31 de agosto de 1994, en la Colección Americana de Cultivos Tipo, con los números de acceso VR 2474 y VR 2475, respectivamente). Sin embargo, las técnicas usadas para aislar, clonar y secuenciar estos genes también pueden aplicarse al aislamiento, clonación y secuenciación de los ácidos polinucleicos genómicos de cualquier PRRSV. De esta manera, la presente invención no se limita a las secuencias específicas descritas en los Experimentos presentados mas adelante.

Por ejemplo, pueden diseñarse cebadores para obtener cantidades relativamente grandes de ADN por reacción en cadena de la polimerasa (y si se desea, para obtener ARN por transcripción y/o proteína por traducción de acuerdo con métodos conocidos in vivo o in vitro) basándose en la información de secuencia cuando se ha determinado mas de una secuencia obtenida a partir del genoma de PRRSV (por ejemplo, las ORF 2-5 de VR 2385 y el virus Lelystad, o las ORF 6-7 de VR 2385, VR 2429, VR 2430, ISU-79, ISU-1894, VR 2431 y el virus Lelystad). A partir de las secuencias determinadas se selecciona una región de aproximadamente 15 a 50 nucleótidos de longitud que tiene una identidad de al menos 80% y preferiblemente de al menos 90%. Una región en la que se produce una deleción en una de las secuencias (por ejemplo, de al menos 5 nucleótidos) puede usarse como base para preparar un cebador selectivo para la amplificación selectiva del ácido polinucleico de una cepa o tipo de PRRSV con respecto a otro (por ejemplo, para el diagnóstico diferencial de las cepas de PRRSV norteamericanas y europeas).

Una vez que el ácido polinucleico genómico se ha amplificado y clonado en un hospedador adecuado por métodos conocidos, los clones pueden explorarse con una sonda diseñada basándose en la información de secuencia descrita en la presente memoria. Por ejemplo, se selecciona una región de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 nucleótidos de longitud basándose en un alto grado de identidad (por ejemplo, al menos 90%) entre dos o mas secuencias (por ejemplo, en las ORF 6-7 de las cepas Iowa de PRRSV descritas en el Experimento III mostrado mas adelante), y puede prepararse un polinucleótido con una longitud e identidad de secuencia adecuadas por métodos conocidos (tales como síntesis automática, o restricción de un fragmento adecuado a partir de un ácido polinucleico que contiene la región seleccionada, amplificación por PCR usando cebadores que hibridan específicamente con el polinucleótido y aislamiento por electroforesis). El polinucleótido puede marcarse, por ejemplo, con ^{32}P (para la identificación radiométrica) o biotina (para la detección por fluorometría). La sonda después se hibrida con los ácidos polinucleicos de los clones y se detecta de acuerdo con métodos conocidos.

Los presentes inventores han descubierto que la ORF 4 parece estar relacionada con la virulencia de PRRSV. Por ejemplo, al menos un aislado de PRRSV que muestra una virulencia relativamente baja también parece tener una deleción en la ORF 4 (véanse, por ejemplo, los Experimentos VIII-XI presentados más adelante). Por consiguiente, en una realización preferida, la presente invención se refiere a un ácido polinucleico obtenido a partir de un aislado de PRRSV que confiere protección inmunogénica directa o indirectamente frente a una exposición posterior con un PRRSV, pero en el que se ha delecionado o mutado la ORF 4 en tal medida que produciría un PRRSV que contiene el ácido polinucleico poco virulento (es decir, un fenotipo de "poca virulencia " (lv); véase la explicación mostrada más adelante) o no virulento (un denominado "mutante de deleción"). Preferiblemente, la ORF 4 se deleciona o muta en tal medida que haga que un virus de PRRS sea no virulento. Sin embargo, puede ser deseable conservar regiones de la ORF 4 de PRRSV en el ácido polinucleico de la presente invención que (i) codifiquen un fragmento peptídico antigénico inmunoprotector y (ii) no confieran virulencia a un virus de PRRS que contenga el ácido polinucleico.

También se describe un PRRSV per se en el que la ORF 4 se ha delecionado o mutado en tal medida que hace que el virus sea poco virulento o no virulento (por ejemplo, VR 2431). Este virus es útil como vacuna o como vector para transformar un hospedador adecuado (por ejemplo, MA-104, PSP 36, CRL 11171, MARC-145 o macrófagos alveolares porcinos) con un gen heterólogo. Los genes heterólogos preferidos que pueden expresarse usando el presente mutante de deleción pueden incluir los que codifican una proteína o un antígeno distinto de un antígeno del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (por ejemplo, proteínas y/o antígenos que contienen polipéptidos del virus de la pseudorrabia y/o gripe porcina, una hormona del crecimiento porcina, etc.) o un adyuvante basado en un polipéptido (tal como los descritos mas adelante para la composición de vacuna de la presente invención).

En ciertas realizaciones del ácido polinucleico de la presente invención también puede ser deseable que éste contenga, por ejemplo, la región 3'-terminal de la ORF 3 (por ejemplo, de 200 a 700 nucleótidos de longitud), de la que al menos parte puede solapar con la región 5' de la ORF 4. De forma similar, cuando la región 3' terminal de la ORF 4 solapa con la región 5' terminal de la ORF 5, puede ser deseable conservar la región 5' de la ORF 4 que solapa con la ORF 5.

Los presentes inventores también han descubierto que la ORF 5 del genoma de PRRSV parece estar relacionada con la replicación del virus en células hospedadoras de mamífero capaces de mantener un cultivo mientras están infectadas con PRRSV. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a ácidos polinucleicos obtenidos a partir de un genoma de PRRSV en el que la ORF 5 puede estar presente en múltiples copias (un denominado "mutante de superproducción"). Por ejemplo, el ácido polinucleico de la presente invención puede contener al menos dos y, más preferiblemente, de 2 a 10 copias de la ORF 5 de un aislado de PRRSV de fenotipo de alta replicación (hr).

De forma interesante, el aislado de PRRSV ISU-12 tiene un número sorprendentemente grande de posibles codones de iniciación (secuencias ATG/AUG) cerca del extremo 5' de la ORF 5, que posiblemente indican sitios de inicio alternos de este gen (véase la SEC ID Nº: 13). De esta manera, pueden existir formas alternas de la proteína codificada por la ORF 5 de un aislado de PRRSV, particularmente donde las ORF alternas codifican una proteína que tiene un peso molecular similar al determinado experimentalmente (por ejemplo, de aproximadamente 150 a aproximadamente 250 aminoácidos de longitud). En la Figura 7 se indica la región codificante más probable para la ORF 5 de ISU-12 (SEC ID Nº: 14).

Se pueden preparar mutantes de deleción y superproducción de acuerdo con métodos conocidos. Por ejemplo, se puede preparar un ácido polinucleico mutante que contiene un cambio "silencioso" o degenerado en la secuencia de una región que codifica un polipéptido. Por medio de la selección y la obtención de una mutación degenerada apropiada, se puede sustituir una secuencia de ácido polinucleico reconocida por una enzima de restricción conocida. Por ejemplo, si se realiza dicha mutación degenerada silenciosa en uno o dos de los extremos 3' de la ORF 3 y en los extremos 3' y 5' de la ORF 4 y la ORF 5, se puede insertar un ácido polinucleico sintético (un denominado "casete") que puede contener múltiples copias de la ORF 5, múltiples copias de una proteína de la envuelta viral o un fragmento antigénico de la misma. El "casete" puede ir precedido de un codón de iniciación adecuado (ATG), y puede terminar convenientemente con un codón de terminación en el extremo 3' (TAA, TAG o TGA).

Por supuesto, puede insertarse una secuencia oligonucleotídica que no codifica un polipéptido o, como alternativa, puede no insertarse un casete. Haciendo esto, se puede proporcionar un denominado mutante de deleción.

De esta manera, en una realización de la presente invención, el ácido polinucleico codifica una o más proteínas, o regiones antigénicas de las mismas, de un PRRSV. Preferiblemente, el ácido nucleico de la presente invención codifica al menos una región antigénica de una proteína de membrana (de la envuelta) de PRRSV. Mas preferiblemente, el ácido polinucleico de la presente invención contiene al menos una copia del gen de la ORF-5 procedente de un aislado de fenotipo de alta virulencia (hv) del PRRSV (véase la descripción del "fenotipo hv" mostrada mas adelante) y un fragmento, región o secuencia suficientemente larga de al menos una de las ORF-2, ORF-3, ORF-4, ORF-5 y/o ORF-6 del genoma de un aislado de PRRSV para codificar una región antigénica de la proteína o proteínas correspondientes y estimular eficazmente protección inmunológica frente a una exposición posterior con un aislado de PRRSV de fenotipo hv. Incluso mas preferiblemente, en el ácido polinucleico de la presente invención está contenida al menos una proteína de la envuelta entera codificada por la ORF-2, ORF-3, ORF-5 y/u ORF-6 de un PRRSV, y el ácido polinucleico de la presente invención excluye una parte suficientemente larga de la ORF 4 de un PRRSV hv de manera que el PRRSV que la contiene es de poca virulencia o carece de virulencia. De una manera particularmente preferida, el ácido polinucleico de la presente invención excluye la región entera de una ORF 4 de PRRSV hv que no solapa con el extremo 3' de la ORF 3 y el extremo 5' de la ORF 5.

Mas preferiblemente, el ácido polinucleico se aísla a partir del genoma de un aislado de la cepa Iowa de PRRSV (por ejemplo, VR 2385 (ISU-12 purificado en placa 3X), VR 2386 (ISU-12 no purificado en placa), VR 2428 (ISU-51), VR 2429 (ISU-22), VR 2430 (ISU-55), VR 2431 (ISU-3927), ISU 79 y/o ISU-1894.

Una realización preferida de la presente invención se refiere a una preparación purificada que puede comprender, consiste esencialmente o consiste en un ácido polinucleico que tiene una secuencia de la fórmula (I):

(I)5' -\alpha-\beta-\gamma-3'

donde \alpha codifica al menos un polipéptido o fragmento antigénico del mismo codificado por la ORF 2 de una cepa Iowa de PRRSV y regiones del mismo que codifican los fragmentos antigénicos; y \beta es un enlace covalente o un ácido polinucleico de asociación que excluye una parte suficientemente larga de la ORF 4 de un PRRSV hv para que el PRRSV sea poco virulento o no virulento; y \gamma es al menos una copia de una ORF 5 de una cepa Iowa de PRRSV, preferiblemente de un fenotipo de alta replicación (hr).

Como alternativa, la presente invención puede referirse a una preparación purificada que puede comprender, consistir esencialmente o consistir en un ácido polinucleico que tiene una secuencia de la formula (II):

(II)5'-\alpha-\beta-\gamma-\delta-\varepsilon-3'

donde \alpha, \beta y \gamma son como se ha definido anteriormente; \delta es un enlace covalente; y \varepsilon codifica al menos un polipéptido o fragmento antigénico del mismo codificado por un polinucleótido seleccionado entre el grupo consistente en la ORF 6 y ORF 7 de una cepa Iowa de PRRSV y regiones del mismo que codifican los fragmentos antigénicos; y cuando \delta es un enlace covalente, \gamma puede tener un extremo 3' que excluye la región solapante con el extremo 5' de una ORF 6 correspondiente. Preferiblemente, \varepsilon es un polinucleótido que codifica el menos una región antigénica de una proteína codificada por una ORF 6 de una cepa Iowa de PRRSV, y más preferiblemente codifica al menos una proteína codificada por una ORF 6 de una cepa Iowa de PRRSV.

De esta manera, el ácido polinucleico de la presente invención puede seleccionarse entre el grupo consistente en, de 5' a 3':

(III)\zeta-(ORF 5)_{n}

(IV)\zeta-(ORF 5)_{n}-\eta

donde:

\zeta se selecciona entre el grupo consistente en ORF 2-, ORF 2-ORF 3-, ORF 2-ORF 4'-, y ORF 2-ORF 3-ORF 4'-; y

\eta se selecciona entre el grupo consistente en -ORF 5', -ORF 6, -ORF 7, -ORF 5'-ORF 6, -ORF 5' -ORF 7, -ORF 6-ORF 7 y -ORF 5' - ORF 6-ORF 7;

donde cada una de las ORF 2, ORF 3, ORF 6 y ORF 7 codifica una proteína codificada por la segunda, tercera, sexta y séptima fases de lectura abierta de una cepa Iowa de PRRSV, respectivamente; ORF 4' es una región de una cuarta fase de lectura abierta de una cepa Iowa de PRRSV que (i) codifica un fragmento peptídico antigénico inmunoprotector y que (ii) no confiere virulencia a un PRRSV que contiene el ácido polinucleico; la ORF 5 es una quinta fase de lectura abierta de un aislado de PRRSV hv; la ORF 5' es una región de una quinta fase de lectura abierta de una cepa Iowa de PRRSV que (i) codifica un fragmento peptídico inmunoprotector antigénico y (ii) no confiere virulencia a un PRRSV que contiene el ácido polinucleico, y que puede tener un extremo 3' que excluye la parte solapante con el extremo 5' de una ORF 6 correspondiente; y n\geq1.

El ácido polinucleico de la presente invención también puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en combinaciones de las secuencias anteriores, como una mezcla de polinucleótidos o unidos covalentemente en forma de cabeza-cola (sentido-antisentido) o cabeza-cabeza. También se incluyen en la presente invención ácidos polinucleicos complementarios a las secuencias anteriores y combinaciones de los mismos (ácido polinucleico antisentido). De esta manera, además de poseer copias múltiples o variantes de la ORF 5, el ácido polinucleico de la presente invención también puede contener copias múltiples o variantes de una o más de las ORF 1-3 y 6-7 y regiones de las ORF 4-5 de la cepa Iowa de PRRSV.

También se describen ácidos polinucleicos que comprenden, consisten esencialmente o consisten en la fase de lectura abierta 1a y 1b de un aislado de PRRSV. Basándose en la información sobre virus relacionados evolutivamente con el PRRSV, se cree que las ORF 1a y 1b de PRRSV codifican una ARN polimerasa. Las ORF 1a y 1b se traducen dando lugar a una sola proteína por desplazamiento de fase. Preferiblemente, el ácido polinucleico de las ORF 1a y 1b de un aislado de PRRSV se obtiene a partir de una cepa Iowa de PRRSV.

De forma similar a los métodos descritos anteriormente y en los siguientes experimentos para las ORF 2-7, se puede preparar una biblioteca de clones recombinantes (por ejemplo, usando E. coli como hospedador) que contenga fragmentos de restricción preparados convenientemente de un genoma de PRRSV (por ejemplo, insertados en un plásmido apropiado que pueda expresarse en el hospedador). Los clones después se exploran con una sonda adecuada (por ejemplo, basándose en una secuencia conservada de las ORF 2-3; véase, por ejemplo, la Figura 22). Posteriormente, los clones positivos pueden seleccionarse y desarrollarse hasta un nivel apropiado. Después los ácidos polinucleicos pueden aislarse a partir de los clones positivos de acuerdo con métodos conocidos. Después puede diseñarse un cebador adecuado para PCR y prepararse como se ha descrito anteriormente para amplificar la región deseada del ácido polinucleico. El ácido polinucleico amplificado después puede aislarse y secuenciarse por métodos conocidos.

La preparación purificada de la presente invención también puede contener un ácido polinucleico seleccionado entre el grupo consistente en secuencias que tienen una identidad (u homología) de secuencia de al menos 97% con al menos una ORF 7 de VR 2385, VR 2430 y/o VR 2431; y secuencias que tienen una identidad (u homología) de secuencia de al menos 80% y preferiblemente de al menos 90% con al menos una de las ORF 1-6 de VR 2385, VR 2428, VR 2429, VR 2430 y/o VR 2431. Preferiblemente, el ácido polinucleico excluye una región o parte suficientemente larga de la ORF 4 de los aislados de PRRSV hv de VR 2385, VR 2429, ISU-28, ISU-79 y/o ISU 984 para que el aislado sea poco virulento o no virulento.

En el contexto de la presente solicitud, "homología" se refiere al porcentaje de restos nucleotídicos o aminoacídicos idénticos en las secuencias de dos o más virus, alineadas de acuerdo con un método convencional para determinar la homología (por ejemplo, los programas informáticos MACVECTOR o GENEWORKS, alineados de acuerdo con el procedimiento descrito en el Experimento III indicado más adelante).

Por consiguiente, un aspecto adicional de la presente invención incluye un ácido polinucleico aislado que tiene una homología de al menos 90% con un polinucleótido que codifica una proteína, polipéptido o fragmento de la misma codificado por las ORF 1-7 de una cepa Iowa de PRRSV (por ejemplo, SEC ID Nº: 15, 17, 19, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65 y 67). Preferiblemente, el ácido polinucleico aislado de la presente invención codifica una proteína, polipéptido o fragmento antigénico de la misma que tiene una longitud de al menos 10 aminoácidos y donde pueden haberse sustituido de forma conservativa aminoácidos no esenciales para la antigenicidad. Un resto aminoacídico en una proteína, polipéptido o fragmento antigénico de la misma se sustituye de forma conservativa si se reemplaza por un miembro de su grupo de polaridad como se define a continuación:

Aminoácidos básicos:

lisina (Lys), arginina (Arg), histidina (His)

Aminoácidos ácidos:

ácido aspártico (Asp), ácido glutámico (Glu), asparagina (Asn), glutamina (Gln).

Aminoácidos hidrófilos no iónicos:

serina (Ser), treonina (Thr), cisteína (Cys) asparagina (Asn), glutamina (Gln)

Aminoácidos que contienen azufre:

cisteína (Cys), metionina (Met)

Aminoácidos hidrófobos aromáticos:

fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr), triptófano (Trp)

Aminoácidos hidrófobos no aromáticos:

glicina (Gly), alanina (Ala), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (Ile), prolina (Pro)

Mas particularmente, el ácido polinucleico de la presente invención codifica una o más de las proteínas codificadas por las segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta y/o séptima fases de lectura abiertas (ORF 2-7) de los aislados de PRRSV VR 2385, VR 2386, VR 2428, VR 2429, VR 2430, VR 2431, VR 2432, ISU-79 y/o ISU-1894 (por ejemplo, SEC ID Nº: 15, 17, 19, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 y 65).

Para explorar o identificar tejidos y/o muestras de fluidos biológicos de animales infectados y/o para identificar virus relacionados por métodos descritos en la presente memoria y conocidos por los especialistas habituales en los campos de diagnóstico veterinario y viral y de medicina veterinaria, se pueden usar segmentos relativamente cortos de ácidos polinucleicos (de aproximadamente 20 pb o mayores) en el genoma de un virus. Por consiguiente, también se describe un ácido polinucleico aislado (y si se desea purificado) consistente esencialmente en un fragmento con una longitud de 15 a 2000 pb, preferiblemente de 18 a 1000 pb, y mas preferiblemente de 21 a 100 pb, derivado de las ORF 2-7 de un genoma de PRRSV preferiblemente la cepa Iowa de PRRSV). De una forma particularmente preferida, los presentes fragmentos de ácido polinucleico aislados se obtienen a partir de un extremo de una o más de las ORF 2-7 del genoma de la cepa Iowa de PRRSV y, mas preferiblemente, se seleccionan entre el grupo consistente en la SEC ID Nº: 1-12, 22 y 28-34.

También se describe un kit de diagnóstico para ensayar el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, que comprende (a) un primer cebador que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de 10 a 50 nucleótidos de longitud que hibrida con un ácido polinucleico genómico de una cepa Iowa del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino a una temperatura de 25 a 75ºC, (b) un segundo cebador que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de 10 a 50 nucleótidos de longitud, encontrándose dicha secuencia de dicho segundo cebador en dicho ácido polinucleico genómico de dicha cepa Iowa del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino y que está cadena abajo de la secuencia con la que hibrida el primer cebador y, (c) un reactivo que permite la detección de un ácido polinucleico amplificado. Preferiblemente, el reactivo es un colorante intercalante, cuyas propiedades fluorescentes cambian cuando se intercala en ADN bicatenario.

Las ORF' 6 y 7 no son candidatos probables para controlar los fenotipos de virulencia y replicación de PRRSV, ya que las secuencias de nucleótidos de estos genes están muy conservadas entre aislados de alta virulencia (hv) y de baja virulencia (lv) (véase el Experimento III presentado más adelante). Sin embargo, la ORF 5 de los aislados de PRRSV parece estar menos conservada entre aislados de alta replicación (hr) y baja replicación (lr). Por lo tanto, se cree que la presencia de una ORF 5 procedente de un aislado de PRRSV hr en el ácido polinucleico de la presente invención mejorará la producción y expresión de una vacuna recombinante producida a partir del ácido poli-
nucleico.

Por consiguiente, se prefiere que el ácido polinucleico de la presente invención, cuando se usa con fines inmunoprotectores (por ejemplo, en la preparación de una vacuna), contenga al menos una copia de la ORF 5 de un aislado de alta replicación (es decir, un aislado que crece a un título de 10^{6}-10^{7} TCID_{50}, por ejemplo, en células CRL 11171; véanse también las discusiones de los Experimentos VIII-XI presentados más adelante).

Por otra parte, el aislado lv VR 2431 parece ser un mutante de deleción, con respecto a los aislados hv (véanse los Experimentos III y VIII-XI presentados más adelante). La deleción parece estar en la ORF 4, según el análisis de transferencia de Northern. Por consiguiente, cuando se usa con fines inmunoprotectores, el ácido polinucleico de la presente invención preferiblemente no contiene una región de la ORF 4 de un aislado hv responsable de su alta virulencia y, más preferiblemente, excluye la región de la ORF 4 que no solapa con las ORF 3 y 5 adyacentes (donde la ORF 4 solapa con las ORF 3 y 5 adyacentes).

También se sabe (al menos en el caso de PRRSV) que ni la proteína de la nucleocápsida ni los anticuerpos contra ella confieren protección inmunológica frente al virus (por ejemplo, PRRSV) a cerdos. Por consiguiente, el ácido polinucleico de la presente invención, cuando se usa con fines inmunoprotectores, contiene una o más copias de una o más regiones de las ORF 2, 3, 4, 5 y 6 de un aislado de PRRSV que codifica una región antigénica de la proteína de la envuelta viral, pero que no produce los síntomas o cambios histopatológicos asociados con el PRRS. Preferiblemente, esta región presenta una reacción inmunológica cruzada con anticuerpos contra proteínas de la envuelta de otros aislados de PRRSV. De forma similar, la proteína codificada por el ácido polinucleico inmunoprotector de la presente invención confiere protección inmunológica a un cerdo al que se le ha administrado una composición que comprende la proteína, y los anticuerpos contra esta proteína presentan una reacción inmunológica cruzada con las proteínas de la envuelta de otros aislados de PRRSV. Más preferiblemente, el ácido polinucleico inmunoprotector de la presente invención codifica la proteína de la envuelta entera de un aislado de PRRSV.

Los presentes fragmentos del ácido polinucleico aislado pueden obtenerse por digestión del ADNc correspondiente (complementario) a los ácidos polinucleicos virales con una o más enzimas de restricción apropiadas, pueden amplificarse por PCR y clonarse, o pueden sintetizarse usando un sintetizador de polinucleótidos automático disponible en el mercado.

La descripción también incluye una o más proteínas o fragmentos antigénicos de las mismas procedentes de un virus de PRRS, preferiblemente de la cepa Iowa de PRRS. Como se ha descrito anteriormente, un fragmento antigénico de una proteína de un virus de PRRS (preferiblemente de la cepa Iowa de PRRSV) tiene una longitud de al menos 5 aminoácidos, de una forma particularmente preferida de al menos 10 aminoácidos, y proporciona o estimula una respuesta inmunológicamente protectora en un cerdo al que se le ha administrado una composición que contiene el fragmento antigénico.

Los especialistas habituales en la técnica conocen métodos para determinar la parte antigénica de una proteína (véase la descripción anterior). Además, también se puede determinar un fragmento antigénico esencial de una proteína demostrando primero que la proteína de longitud completa es antigénica en un animal hospedador (por ejemplo, un cerdo). Si la proteína sigue siendo antigénica en presencia de un anticuerpo que se une específicamente a una región o secuencia particular de la proteína, entonces esa región o secuencia puede ser no esencial para la inmunoprotección. Por otra parte, si la proteína ya no es antigénica en presencia de un anticuerpo que se une específicamente a una región o secuencia particular de la proteína, entonces esa región o secuencia se considera esencial para la antigenicidad.

La presente invención también se refiere a una proteína o fragmento antigénico de la misma codificada por uno o más de los ácidos polinucleicos definidos anteriormente, y preferiblemente por una o más de las ORF de un PRRSV, más preferiblemente de la cepa Iowa de PRRSV. Las proteínas y fragmentos antigénicos de la presente invención son útiles para inmunizar a cerdos frente al PRRSV, en ensayos serológicos para seleccionar cerdos para la exposición o infección por PRRSV (particularmente la cepa Iowa de PRRSV), etc.

Por ejemplo, la proteína de la presente invención puede seleccionarse entre el grupo consistente en las proteínas codificadas por la ORF 2 de VR 2385, ISU-22 (VR 2429), ISU-1894, ISU-79 e ISU-3927 (VR 2431) (por ejemplo la SEC ID Nº: 67; puede comprender además al menos una de las proteínas de las SEC ID Nº: 15, 17, 19, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 67, 69 y 71; polipéptidos con una homología de al menos 80% con una proteína codificada por una de las ORF 2-5 de VR 2385 (SEC ID Nº: 15, 67, 69 y 71); y polipéptidos con una homología de al menos 97% con una proteína codificada por una de las ORF 6-7 de VR 2385, VR 2429, VR 2430, ISU-1894, ISU-79 y VR 2431 (por ejemplo, las SEC ID Nº: 17, 19, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 y 61). Preferiblemente, la proteína de la presente invención tiene una secuencia de la SEC ID Nº: 67.

También se describe un virus biológicamente puro, caracterizado por contener el ácido polinucleico de la presente invención y/o por producir una enfermedad reproductiva y respiratoria porcina que puede incluir una o más de las siguientes lesiones histológicas: lesiones pulmonares generales y/o microscópicas (por ejemplo, consolidación pulmonar), neumocitos de tipo II, miocarditis, encefalitis, formación de exudados alveolares y formación de sincitios. La frase "biológicamente puro" se refiere a una muestra de un virus o un agente infeccioso en el que toda la descendencia procede de un solo progenitor. Normalmente, se consigue una muestra de virus "biológicamente puro" por purificación en placa 3 veces en cultivo celular.

En particular, el virus o agente infeccioso biológicamente puro de la presente invención es un aislado de la cepa Iowa del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, de la que se han depositado muestras según los términos del Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A., con los números de acceso VR 2385, VR 2386, VR 2428, VR 2429, VR 2430, VR 2431, VR 2474 y VR 2475.

Además de las características (a)-(e) descritas anteriormente, la cepa Iowa de PRRSV también puede caracterizarse por transferencias de Northern de su ARNm. Por ejemplo, la cepa Iowa de PRRSV puede contener 7 ó 9 ARNm, y también puede tener deleciones o variaciones en su tamaño. En particular, como se describirá en los experimentos presentados más adelante, los ARNm de la cepa Iowa de PRRSV pueden contener hasta cuatro deleciones, con respecto al VR 2385/VR 2386.

La presente invención además se refiere a una composición para proteger a un cerdo de una infección viral, que comprende una cantidad de la vacuna de la presente invención eficaz para inducir una respuesta inmunológica a un virus que produce una enfermedad reproductiva y respiratoria porcina, en un vehículo fisiológicamente aceptable.

Una cantidad eficaz de la vacuna de la presente invención es una con la que se induce una respuesta inmunológica suficiente a la vacuna para proteger a un cerdo expuesto a un virus que produce una enfermedad reproductiva y respiratoria porcina o una enfermedad relacionada. Preferiblemente, el cerdo se protege en una medida en la que se ha descubierto que se reducen significativamente de uno a todos los síntomas o efectos fisiológicos adversos (por ejemplo, lesiones pulmonares) de la enfermedad a prevenir.

La composición puede administrarse en una sola dosis o en dosis repetidas. Las dosificaciones pueden contener, por ejemplo, de 1 a 1.000 microgramos de antígeno basado en virus (vacuna), pero no debe contener una cantidad de antígeno basado en virus suficiente para ocasionar una reacción adversa o síntomas fisiológicos de infección. En la técnica se conocen métodos para determinar dosificaciones adecuadas de agente antigénico activo.

La composición que contiene la vacuna de la presente invención puede administrarse junto con un adyuvante o con un vehículo aceptable que puede prolongar o mantener la respuesta inmunológica en el animal hospedador. Un adyuvante es una sustancia que aumenta la respuesta inmunológica a la vacuna de la presente invención cuando se combina con ella. El adyuvante puede administrarse al mismo tiempo y en el mismo sitio que la vacuna o en un momento diferente, por ejemplo, como un refuerzo. Ventajosamente también pueden administrarse adyuvantes al animal en una manera o un sitio o localización diferente de la manera, sitio o localización en la que se administra la vacuna. Los adyuvantes incluyen hidróxido de aluminio, sulfato de potasio y aluminio, enterotoxina lábil o estable frente al calor aislada a partir de Escherichia coli, toxina colérica o su subunidad B, toxina diftérica, toxina tetánica, toxina pertussis, adyuvante incompleto de Freund, adyuvante completo de Freund y similares. Los adyuvantes basados en toxinas, tales como la toxina diftérica, toxina tetánica y toxina pertussis, pueden inactivarse antes del uso, por ejemplo, por tratamiento con formaldehído.

La presente invención también se refiere al uso de los ácidos nucleicos, proteínas, composiciones y vacunas descritas anteriormente en la fabricación de un medicamento para proteger a un cerdo de la infección por un virus que produce una enfermedad reproductiva y respiratoria porcina. La protección puede conseguirse por medio de la administración de una cantidad eficaz de una vacuna que induce una respuesta inmunológica contra dicho virus en un cerdo que necesita protección frente a la infección por dicho virus. Por "protección de un cerdo frente a una infección" por un virus o agente infeccioso del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, se entiende que después de la administración de la vacuna de la presente invención a un cerdo, el cerdo muestra síntomas clínicos reducidos (menos severos) o no presenta síntomas clínicos (tales como fiebre) asociados con la enfermedad correspondiente, con respecto a cerdos de control (infectados). Los síntomas clínicos pueden cuantificarse (por ejemplo, fiebre, recuento de anticuerpos y/o lesiones pulmonares), semicuantificarse (por ejemplo, gravedad de la insuficiencia respiratoria) o cualificarse.

También se describe un sistema para medir la insuficiencia respiratoria en cerdos afectados. El presente sistema de puntuación respiratoria clínica evalúa la insuficiencia respiratoria de los cerdos afectados por medio de la siguiente escala.

0 = sin enfermedad; respiración normal

1 = disnea y polipnea leve cuando los cerdos se someten a condiciones de estrés (se les fuerza a respirar en volúmenes mayores y/o a una velocidad acelerada).

2 = disnea y polipnea leve cuando los cerdos están en reposo

3 = disnea y polipnea moderada cuando los cerdos se someten a condiciones de estrés

4 = disnea y polipnea moderada cuando los cerdos están en reposo

5 = disnea y polipnea severa cuando los cerdos se someten a condiciones de estrés

6 = disnea y polipnea severa cuando los cerdos están en reposo.

En el sistema de puntuación respiratoria clínica de la presente invención, una puntuación de "0" es normal, e indica que el cerdo no está afectado por una enfermedad reproductiva y respiratoria porcina. Una puntuación de "3" indica una enfermedad respiratoria moderada, y una puntuación de "6" indica una enfermedad respiratoria muy severa. Una cantidad de la vacuna o composición de la presente invención puede considerarse eficaz si un grupo de cerdos expuestos a los que se ha administrado la vacuna o composición muestra una menor puntuación respiratoria clínica media que un grupo de cerdos expuestos de forma idéntica que no han recibido la vacuna o composición. (Un cerdo se considera "expuesto" cuando se expone a una concentración de un agente infeccioso suficiente para producir la enfermedad en un animal no vacunado).

Preferiblemente, la presente composición de vacuna se administra directamente a un cerdo que aún no se ha expuesto a un virus que produce una enfermedad reproductiva o respiratoria. La vacuna de la presente invención puede administrarse por vía oral o parenteral. Los ejemplos de vías de administración parenteral incluyen las vías de administración intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea e intranasal.

Cuando se administra como una solución, la vacuna de la presente invención puede prepararse en forma de una solución acuosa, un jarabe, un elixir o una tintura. Estas formulaciones se conocen en la técnica y se preparan por disolución del antígeno u otros aditivos apropiados en los sistemas disolventes apropiados. Estos disolventes incluyen agua, solución salina, etanol, etilenglicol, glicerol, fluido A1, etc. Los aditivos adecuados conocidos en la técnica incluyen colorantes certificados, aromatizantes, edulcorantes y conservantes antimicrobianos tales como timerosal (etilmercuritiosalicilato sódico). Estas soluciones pueden estabilizarse, por ejemplo, por adición de gelatina parcialmente hidrolizada, sorbitol o un medio de cultivo de células, y pueden tamponarse por métodos conocidos en la técnica, usando reactivos conocidos en la técnica tales como hidrógeno fosfato sódico, dihidrógeno fosfato sódico, hidrógeno fosfato potásico y/o dihidrógeno fosfato potásico.

Las formulaciones líquidas también pueden incluir suspensiones y emulsiones. En la técnica se conoce la preparación de suspensiones, por ejemplo, usando un molino coloidal, y emulsiones, por ejemplo usando un homogeneizador.

Las formas de dosificación parenterales, diseñadas para la inyección en sistemas de fluidos corporales, requieren una isotonicidad y tamponamiento del pH apropiados a los niveles correspondientes de fluidos corporales porcinos. Las formulaciones parenterales también pueden esterilizarse antes del uso.

La isotonicidad puede ajustarse con cloruro sódico y otras sales cuando sea necesario. Pueden usarse otros disolventes tales como etanol o propilenglicol para aumentar la solubilidad de los ingredientes de la composición y la estabilidad de la solución. Otros aditivos que pueden usarse en la presente formulación incluyen dextrosa, antioxidantes convencionales y agentes quelantes convencionales tales como ácido etilendiamina tetraacético (EDTA).

La presente invención también se refiere a un método ex vivo para producir la vacuna de la presente invención que comprende las etapas de sintetizar o aislar un ácido polinucleico de un virus de PRSS (preferiblemente la cepa Iowa) que codifica una proteína antigénica o parte de la misma (preferiblemente la proteína de la cubierta viral), infectar a una célula hospedadora adecuada con el ácido polinucleico, cultivar la célula hospedadora y aislar la proteína antigénica o parte de la misma a partir del cultivo. Como alternativa, el propio ácido polinucleico puede conferir actividad inmunoprotectora a un animal hospedador al que se le administra.

Preferiblemente, la vacuna se recoge a partir de un medio de cultivo por las etapas de (i) precipitar células hospedadoras cultivadas transfectadas, (ii) lisar las células precipitadas, y (iii) aislar la vacuna. De una forma particularmente preferida, las células hospedadoras infectadas con el virus o agente infeccioso se cultivan en un medio adecuado antes de la recolección.

Preferiblemente, después de cultivar las células hospedadoras infectadas, las células hospedadoras infectadas se precipitan añadiendo una solución de un poli(etilenglicol) (PEG) convencional al medio de cultivo, en una cantidad suficiente para precipitar las células infectadas. Las células infectadas precipitadas pueden purificarse adicionalmente por centrifugación. Las células precipitadas después se lisan por métodos conocidos por los especialistas habituales en la técnica. Preferiblemente, las células se lisan por medio de ciclos repetidos de congelación y descongelación (se prefieren particularmente tres ciclos de congelación y descongelación). La lisis de las células precipitadas libera el virus, que después puede recogerse, preferiblemente por centrifugación. El virus puede aislarse y purificarse por centrifugación en un gradiente de CsCl, y después recuperarse a partir de la banda que contiene el virus apropiada del gradiente de CsCl.

Como alternativa, el cultivo de células infectadas puede congelarse y descongelarse para lisar las células. El material de cultivo celular congelado y descongelado puede usarse directamente como una vacuna viva. Preferiblemente, sin embargo, el material de cultivo celular congelado y descongelado se liofiliza (para el almacenamiento) y después se rehidrata para usarse como una vacuna.

El medio de cultivo puede contener solución salina tamponada, nutrientes esenciales y fuentes adecuadas de carbono y nitrógeno reconocidas en la técnica, en concentraciones suficientes para permitir el crecimiento de células infectadas por virus. Los medios de cultivo adecuados incluyen medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo de Eagle (MEM), medio de Ham, medio 199, suero bovino fetal, suero de ternero fetal y otros medios equivalentes que mantienen el crecimiento de células infectadas por virus. El medio de cultivo puede suplementarse con suero bovino fetal (hasta 10%) y/o L-glutamina (hasta 2 mM), u otros aditivos apropiados, tales como suplementos de crecimiento y/o antibióticos convencionales. Un medio preferido es DMEM.

Preferiblemente, la vacuna de la presente invención se prepara a partir de un virus o agente infeccioso cultivado en una línea celular apropiada. La línea celular preferiblemente es PSP-36 o una línea celular equivalente que puede infectarse con el virus y cultivarse. Un ejemplo de una línea celular equivalente a PSP-36 es la línea celular PSP-36-SAH, que se depositó según los términos del Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A., el 28 de octubre de 1992, con el número de depósito CRL 11171. Otra línea celular equivalente es MA-104, disponible en el mercado en Whittaker Bioproducts Inc. (Walkersville, Maryland). Los resultados preliminares indican que la cepa Iowa de PRRSV también puede cultivarse en células de cornetes nasales porcinos.

También parece haber una relación entre la gravedad de la histopatología producida por una exposición con una cantidad convencional de un aislado particular y el título al que el aislado puede desarrollarse en una célula hospedadora de mamífero (por ejemplo, células CRL 11171, MA-104 [de riñón de mono verde africano], etc.).

Por consiguiente, también se describe un método para cultivar un virus de PRRS que comprende infectar a la línea celular PSP-36, CRL 11171 o una línea celular equivalente y cultivar la línea celular infectada en un medio adecuado. Una "línea celular equivalente" contra PSP-36 o CRL 11171 es una que puede infectarse con el virus y cultivarse, produciendo de esta forma células infectadas cultivables. Las líneas celulares equivalentes incluyen MA-104, PSP-36-SAH y células MARC-145 (disponibles en el National Veterinary Services Laboratory, Ames, Iowa), por
ejemplo.

Preferiblemente, el virus cultivado es al menos un aislado de la cepa Iowa de PRRSV. De una forma particularmente preferida, la vacuna de la presente invención se prepara a partir de dicho cultivo de la cepa Iowa de PRRSV, se cultiva en células PSP-36 y se purifica en placas al menos tres veces.

La línea celular MA-104 se obtiene a partir de células de riñón de mono, y es de tipo epitelial. Las células MA-104 forman una monocapa confluente en matraces de cultivo que contienen medio esencial mínimo de Dulbecco y FBS (suero bovino fetal) al 10%. Cuando se forma la monocapa, las células se inoculan con una muestra de tejido homogeneizado al 10%, tomado a partir de un tejido apropiado (tal como pulmón y/o corazón) en un cerdo infectado. Preferiblemente, están presentes antibióticos apropiados para permitir el crecimiento del virus y las células hospedadoras y para reprimir el crecimiento y/o la viabilidad de células distintas de las células hospedadoras (por ejemplo, bacterias o levaduras).

Tanto las células PSP-36 como MA-104 desarrollan algunos aislados del virus de PRRS a altos títulos (mayores de 10^{7} TCID_{50}/ml). Las células PSP-36 y MA-104 también desarrollarán el agente infeccioso asociado con la cepa Iowa de PRRSV. Las células MA-104 también pueden desarrollar rotavirus, poliovirus y otros virus.

Se cree que las células CL2621 son de origen no porcino y de tipo epitelial, y están patentadas (Boehringer-Ingelheim). A diferencia de PSP-36 y MA-104, algunas muestras del virus que produce PRRS se han cultivado de forma insatisfactoria en células CL2621 (Bautista et al, American Association of Swine Practitioners Newsletter, 4:32, 1992).

Las características principales de CL2621 son que es de origen no porcino y es de tipo epitelial, desarrollándose en medio MEM. Sin embargo, Benfield et al (J. Vet. Diagn. Invest., 1992; 4:127-133) han notificado que se usaron células CL2621 para propagar virus de PRRS, pero se usaron células MA-104 para controlar la propagación de poliovirus, deduciéndose de esta manera que CL2621 no es igual que MA-104, y que la misma célula no puede propagar los dos virus.

La cepa Iowa de PRRSV generalmente no puede desarrollarse en líneas celulares distintas de PSP-36, PSP-36-SAH y MA-104. Sin embargo, como se ha descrito anteriormente, se ha notificado que algunos virus que producen PRRS crecen tanto en CL2621 como en macrófagos alveolares porcinos primarios, aunque algunas cepas del virus de PRRS no crecen en células PSP-36, MA-104 o CL2521.

La vacuna de la presente invención, aislados de virus, proteínas y ácidos polinucleicos pueden usarse para preparar anticuerpos que pueden proporcionar resistencia inmunológica a un paciente (en este caso un cerdo) expuesto a un virus o agente infeccioso. Los anticuerpos incluidos en la presente invención se unen inmunológicamente a (1) una vacuna que protege a un cerdo frente a un virus de PRRS o (2) al propio virus de PRRS. Los anticuerpos de la presente invención también tienen las siguientes utilidades:

(1) como agente diagnóstico para determinar si un cerdo se ha expuesto a un virus o agente infeccioso de PRRS, y (2) en la preparación de la vacuna de la presente invención. El presente anticuerpo puede usarse para preparar una columna de inmunoafinidad por métodos conocidos, y la columna de inmunoafinidad puede usarse para aislar el virus o agente infeccioso, o una proteína de los mismos.

Para inducir anticuerpos contra dichas vacunas o virus, se inmuniza a un animal hospedador apropiado, tal como un ratón, conejo u otros animales usados para dicha inoculación, con la proteína usada para preparar la vacuna. El animal hospedador después se inmuniza con (se le inyecta) uno de los tipos de vacunas descritas anteriormente, opcionalmente administrando un agente potenciador inmune (adyuvante) tal como los descritos anteriormente. El animal hospedador preferiblemente se inmuniza posteriormente de 1 a 5 veces a ciertos intervalos de tiempo, preferiblemente cada 1 a 4 semanas y más preferiblemente cada 2 semanas. Los animales hospedadores después se sacrifican y se recoge su sangre. Después se separa el suero de la sangre entera recogida por técnicas conocidas. El suero contiene anticuerpos contra las vacunas. También pueden purificarse anticuerpos por métodos conocidos para proporcionar anticuerpos de inmunoglobulina G (IgG).

La presente invención también incluye anticuerpos monoclonales contra las presentes vacunas y/o virus. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse por el método de Kohler et al (Nature, vol. 256 (1975), páginas 495-497). Básicamente, las células inmunes de una preparación de células enteras del bazo del animal hospedador inmunizado (descrito anteriormente) se fusionan con células de mieloma por un procedimiento convencional para producir hibridomas. Los hibridromas se cultivan y el fluido de cultivo resultante se explora frente al fluido o inóculo que lleva el agente infeccioso (virus o vacuna). La introducción del hibridoma en el peritoneo del animal hospedador produce un crecimiento peritoneal del hibridoma. La recogida del líquido ascítico del animal hospedador proporciona una muestra del anticuerpo monoclonal contra el agente infeccioso producido por el hibridoma. El sobrenadante del cultivo de células de hibridoma también puede usarse como fuente de anticuerpo monoclonal, que se aísla por métodos conocidos por los especialistas en la técnica. Preferiblemente, el anticuerpo de la presente invención es de tipo de inmunoglobulina IgG o IgM.

La presente invención también se refiere al uso de un anticuerpo como se ha descrito anteriormente en la fabricación de un medicamento para tratar a un cerdo que padece una enfermedad reproductiva y respiratoria. El tratamiento comprende administrar a un cerdo que necesita dicho tratamiento una cantidad eficaz de un anticuerpo que se une inmunológicamente a un virus que produce una enfermedad reproductiva y respiratoria porcina o a una vacuna que protege a un cerdo frente a la infección por un virus reproductivo y respiratorio porcino en un vehículo fisiológicamente aceptable.

La presente invención también se refiere a un método para diagnosticar una infección de un cerdo o la exposición de una piara a un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino y a un kit de diagnóstico para ensayar dicho síndrome, que comprende el anticuerpo de la presente invención (preferiblemente un anticuerpo monoclonal) y un agente de diagnóstico que indica una reacción inmunológica positiva con dicho anticuerpo (preferiblemente que comprende estreptavidina conjugada con peroxidasa, un anticuerpo biotinilado contra una proteína o antígeno de PRRSV y una peroxidasa). El presente kit puede comprender además peróxido de hidrógeno acuoso, una proteasa que digiere la muestra de tejido porcino, un colorante fluorescente (por ejemplo, tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina), y una cepa tisular (por ejemplo, hematoxilina).

El diagnóstico de PRRS se basa en recopilar información a partir de la historia clínica de la piara que se esté diagnosticando, a partir de la serología y patología de cerdos infectados y, finalmente, sobre el aislamiento del virus de PRRS (PRRSV) de la piara infectada. De esta manera, el método de la presente invención para detectar PRRSV es útil para diagnosticar una infección por y/o la exposición al virus en una piara.

Los signos clínicos varían ampliamente entre granjas y, de esta manera, no son las pruebas más fiables de un diagnóstico definitivo, excepto en el caso de un brote agudo severo en piaras no expuestas previamente que experimentan una gran cantidad de abortos, mayores números de cerdos nacidos muertos y neumonía severa en cerdos recién nacidos y lactantes. En el momento actual, la presentación clínica más común es neumonía y problemas bacterianos diversos en cerdos de 3-10 semanas de edad. Sin embargo, muchas piaras positivas para PRRSV no tienen problemas reproductivos o respiratorios aparentes.

Hay algunas lesiones generales que son muy sugerentes de infección por PRRSV en cerdos en crecimiento. La lesión general reproducible experimentalmente más consistente en los cerdos de 3-10 semanas de edad en los que se han inoculado diferentes cepas de PRRSV es la linfadenopatía. En particular, los ganglios linfáticos ilíacos y mediastinales a menudo tienen de 3 a 10 veces el tamaño normal, son de color castaño y algunas veces son quísticos. Los ganglios lin-
fáticos normalmente no son hiperémicos, tales como las lesiones/afecciones observadas en la septicemia bacteriana.

Tres lesiones histológicas son coherentes con la infección por PRRVS. Comúnmente se observa neumonía intersticial y se caracteriza por una infiltración septal con células mononucleares, proliferación de neumocitos de tipo 2 y la presencia de células necróticas en los espacios alveolares. Comúnmente se observan miocarditis perivascular no supurativa y ganglios linfáticos hiperplásicos en las fases subagudas de la enfermedad.

El grado de neumonía visible a simple vista es dependiente de la cepa. En general, los pulmones no pueden colapsar y tienen una distribución poco homogénea de la consolidación de color castaño de 10-80% con bordes irregulares. Con menos frecuencia se observa encefalitis. En raras ocasiones se observan lesiones en el feto y la en placenta por microscopia óptica.

Sin embargo, el porcentaje de consolidación en los pulmones proporciona un ensayo particularmente fiable de la infección por PRRSV (es decir, \geq10% de consolidación en cualquier momento de 3 a 10 días después de la infección (DPI) es una indicación positiva de la infección), particularmente por un virus con un fenotipo de alta virulencia (hv) (\geq40% de consolidación en cualquier momento de 3 a 10 días DPI es una indicación positiva de infección por un aislado de PPRSV hv).

En lugar de la histopatología sobre el tejido pulmonar, la mayoría de los laboratorios están usando rutinariamente un ensayo de anticuerpo fluorescente indirecto (IFA) o un ensayo de monocapa de inmunoperoxidasa (IPMA) para la detección de anticuerpos séricos. Tanto con el IFA como con el IPMA, se deben determinar subjetivamente criterios de valoración y de esta forma los ensayos no se pueden automatizar. También se han creado ensayos de neutralización de virus séricos (SVN) y actualmente se usan ensayos ELISA en algunos laboratorios de investigación. Los anticuerpos detectados por el ensayo IFA normalmente aparecen a los 10 días de exposición, pero tienen una duración relativamente corta, desapareciendo en algunas ocasiones antes de que hayan transcurrido 3 meses.

Los anticuerpos detectados por ELISA normalmente aparecen antes de que hayan transcurrido 3 semanas, pero se desconoce su duración. Los anticuerpos detectados por SVN normalmente no se detectan hasta 4-5 semanas después de la exposición. El ensayo SVN se considera menos sensible en la enfermedad aguda, pero se han realizado mejoras en el ensayo SVN usando suplementación con suero porcino seronegativo. Según se ha notificado, los títulos de SVN se pueden medir durante más tiempo que los títulos en IFA e IPMA, y por lo tanto pueden ser más adecuados para la detección de animales positivos en piaras infectadas de forma crónica.

En caso de IFA, se fijan células infectadas con soluciones de acetona y metanol y se incuban anticuerpos para los sueros convalecientes de cerdos infectados con las células infectadas, preferiblemente durante aproximadamente 30 min. a 37ºC. Una reacción inmunológica positiva es una en la que el anticuerpo se une a las células infectadas con virus, pero no se retira por lavado por las etapas de lavado posteriores (normalmente 3 x con tampón PBS). Después añade y se incuba un segundo anticuerpo (anti-anticuerpo) marcado con un reactivo fluorescente (FITC), preferiblemente durante otros 30 min. Una reacción inmunológica positiva hace que el segundo anticuerpo se una al primero, quedando retenido después del lavado y dando como resultado una señal fluorescente que puede detectarse y semicuantificarse. Una reacción inmunológica negativa produce una unión pequeña o nula del anticuerpo a la célula infectada. Por lo tanto, el segundo anticuerpo marcado de forma fluorescente no puede unirse, el marcador fluorescente se retira por lavado y se detecta poca o ninguna fluorescencia en comparación con un control positivo apropiado.

Los kits IPA y ELISA son similares al kit IFA, con la excepción de que el segundo anticuerpo se marca con una enzima específica en lugar de con un reactivo fluorescente. De esta manera, se añade un sustrato apropiado para la enzima unida al segundo anticuerpo que tiene como resultado la producción de un producto coloreado, que después se detecta y se cuantifica, por ejemplo, por colorimetría.

Los médicos usan títulos de anticuerpo para determinar el momento apropiado para la vacunación y/o puesta en práctica de estrategias de tratamiento o control. Antes de la presente invención, los ensayos de serología no proporcionaban niveles de título de anticuerpo suficientemente adecuados o fiables para tomar decisiones sanitarias en relación con los animales. Puede ser apropiado buscar un cambio del estado seronegativo a seropositivo, o un aumento de al menos 4 veces en el título, como indicación positiva de infección/exposición a PRRSV. La búsqueda de un aumento del porcentaje de cerdos seropositivos en un grupo de edad particular a lo largo del tiempo en una piara puede ser útil para determinar cuándo el virus se mantiene y se propaga de forma activa. Sin embargo, las cerdas infectadas en la primera parte del tercer trimestre y que abortan cerca del momento del parto tendrán poca probabilidad de mostrar altos títulos.

El aislamiento del virus (VI) proporciona un diagnóstico definitivo, pero tiene algunas limitaciones. Rara vez el virus se aísla a partir de fetos nacidos muertos o de abortos autolisados. Las cerdas infectadas en la última parte del último trimestre pueden tener una viremia transitoria y no abortar hasta el final. Los cerdos muertos de cualquier edad no son las mejores muestras para VI, porque el virus no sobrevive bien a temperatura ambiente. Deben separarse los tejidos del esqueleto, empaquetarse por separado y refrigerarse en cuanto sea posible para obtener una muestra de virus viable.

Los mejores tejidos para el aislamiento del virus son amígdalas, pulmón, ganglios linfáticos y bazo. El suero también es una muestra excelente para el aislamiento del virus, ya que (a) la viremia es a menudo prolongada en los cerdos en crecimiento, (b) la muestra es fácil de manipular, y (c) la muestra puede congelarse rápidamente y procesarse.

La variación entre los laboratorios en la capacidad de aislar PRRSV es elevada porque no se han estandarizado los ensayos, reactivos, líneas celulares y medios usados para detectar/seleccionar PRRSV. La eficacia del aislamiento varía porque no todas las cepas norteamericanas crecerán en todas las líneas celulares. Se han usado ensayos IFA de secciones de tejidos congelados con un éxito limitado.

También se han creado ensayos de neutralización de virus en suero (SVN) y actualmente se están usando ensayos ELISA en algunos laboratorios de investigación. Los anticuerpos detectados por ELISA normalmente aparecen en 3 semanas, pero su duración es desconocida. Los anticuerpos de SVN normalmente no se detectan hasta 4-5 semanas después de la exposición. El ensayo de SVN se considera menos sensible en la enfermedad aguda, pero se han realizado mejoras en el ensayo de SVN usando suplemento con suero porcino seronegativo. Según se ha notificado, los títulos de SVN se miden durante un período de tiempo mayor que los títulos en IFA e IPMA. De esta manera, los títulos de SVN pueden ser más adecuados para la detección de animales positivos en piaras infectadas de forma crónica.

Antes de la presente invención, sin embargo, los ensayos serológicos no proporcionaron niveles de título de anticuerpo suficientemente adecuados o fiables para tomar decisiones sanitarias para los animales. La búsqueda de un mayor porcentaje de cerdos seropositivos en un grupo de edad particular a lo largo del tiempo en una piara también puede ser útil para determinar cuándo se mantiene y se propaga de forma activa el virus. Sin embargo, las cerdas infectadas en la primera parte del primer trimestre de gestación y que abortan cerca del parto, probablemente no mostrarán títulos crecientes. De esta manera, puede ser apropiado buscar un cambio del estado seronegativo al estado seropositivo o al menos un aumento de 4 veces en el título como una indicación positiva de infección y/o exposición a PRRSV, se siente la necesidad de un ensayo basado en el título más fiable.

De esta manera, la presente invención también se refiere a un método para detectar antígeno de PRRSV en tejidos. El método de diagnóstico de la presente invención, que emplea un ensayo de inmunoperoxidasa (IPT) preferiblemente en un tejido fijado con formalina, parece ser bastante útil para confirmar la presencia de la infección activa y puede proporcionar un aumento significativo e importante en la fiabilidad de los ensayos basados en el título. Se examinó una sección de pulmones, amígdalas, ganglios linfáticos mediastinales y ganglios linfáticos traqueobronquiales de 26 cerdos inoculados experimentalmente con PRRSV ATCC VR 2385 (véase el Experimento V presentado más adelante). El virus se detectó en 18/26 pulmones, 26/26 amígdalas, 15/26 ganglios linfáticos mediastinales y 14/26 ganglios linfáticos traqueobronquiales. Los cerdos de este estudio se sacrificaron durante un periodo de 28 días (después de la inoculación). El virus se detectó en al menos un tejido de cada cerdo sometido a necropsia hasta 10 días después de la inoculación.

En el Ejemplo V presentado más adelante se describe una técnica completa para la presente técnica de inmunoperoxidasa para la detección de antígenos de PRRSV en tejidos porcinos, basándose en el ensayo de estreptavidina-biotina. En resumen, el presente método para detectar PRRSV comprende retirar peroxidasa endógena de una muestra de tejido porcino aislada con peróxido de hidrógeno acuoso (preferiblemente, una solución al 0,1-5%, y más preferiblemente, de 0,1-1,0%), digerir después el tejido con una cantidad suficiente de una proteasa apropiada para exponer antígenos virales (por ejemplo, Proteasa XIV, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, y más preferiblemente una solución acuosa al 0,001-0,25% de la misma). Posteriormente, el método comprende además incubar líquido ascítico con anticuerpos monoclonales primarios (preferiblemente diluido en TRIS/PBS en una cantidad de 1:10 a 1:100.000, y más preferiblemente de 1:100 a 1:10.000) con las secciones tisulares tratadas con proteasa en una cámara humidificada durante un periodo de tiempo suficiente y a una temperatura apropiada para proporcionar una unión inmunológica esencialmente completa, si efectivamente puede ocurrir (por ejemplo,16 horas a 4ºC).

Un anticuerpo monoclonal adecuado para el uso en el presente ensayo de diagnóstico es SDOW-17 (disponible en Dr. David Benfield, South Dakota State Univ.), que reconoce un epítopo conservado de la proteína de la nucleocápsida de PRRSV (Nelson et al, "Differentiation of U.S. and European isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by monoclonal antibodies, "J. Clin. Micro., 31:3184.3189 (1993)).

El método de la presente invención para detectar PRRSV comprende además incubar un anticuerpo de unión de cabra anti-ratón biotinilado (disponible en Dako Corporation, Carpintera, CA) con el tejido, seguido de incubación de estreptavidina conjugada con peroxidasa con el tejido tratado con anticuerpo biotinilado (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA). El método después comprende además incubar el tejido tratado con estreptavidina conjugada con peroxidasa con un cromógeno, tal como tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (disponible en Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA), y finalmente, marcar el tejido tratado con hematoxilina.

Particularmente cuando se combinan con las técnicas de diagnóstico adicionales de histopatología, los procedimientos de aislamiento de virus y la serología, la técnica de detección de antígenos con inmunoperoxidasa de la presente invención en tejidos ofrece un diagnóstico rápido y fiable de la infección de PRRSV.

Otras características de la invención se harán evidentes en el transcurso de las siguientes descripciones de realizaciones ilustrativas, que se proporcionan para ilustrar la invención, y no pretenden ser limitantes de la misma.

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Experimento I

Clonación molecular y secuenciación de nucleótidos de la región 3'-terminal de VR 2385 (ISU-12 purificado en placa) (I) Materiales y Métodos (A) Propagación y Purificación del Virus

Se usó una línea celular continúa, PSP-36 para aislar y propagar ISU-12. El virus ISU-12 se purificó en placa 3 veces en células PSP-36 (el virus ISU-12 purificado en placas se depositó bajo los términos y las condiciones del Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A., con el número de Acceso VR 2385). Después, las células PSP-36 se infectaron con el virus purificado en placa. Cuando más de 70% de las células infectadas mostraron cambios citopáticos, el cultivo se congeló y se descongeló tres veces. El medio de cultivo después se aclaró por centrifugación de baja velocidad a 5.000 x g durante 15 min. a 4ºC. El virus después se precipitó con PEG-8000 al 7% y NaCl al 2,3% a 4ºC durante una noche con agitación, y el precipitado se sedimentó por centrifugación. Los sedimentos de virus después se resuspendieron en 2 ml de tampón TRIS-EDTA, y se depositaron en la parte superior de un gradiente de CsCl (1,1245-1,2858 g/ml). Después de la ultracentrifugación a 28.000 rpm durante aproximadamente 8 horas a 20ºC, se observó y se recogió una banda transparente con una densidad de 1,15-1,18 g/ml.

El título de infectividad de esta banda se determinó por IFA, y se descubrió que el título era 10^{6} TCID_{50}/ml. También se observaron partículas típicas de virus por microscopia electrónica de tinción negativa (EM).

(B) Aislamiento de ARN Viral

Se aisló ARN total a partir de la banda que contenía virus en el gradiente de CsCl con un kit de aislamiento de ARN disponible en el mercado (obtenido en Stratagene). Después se enriqueció ARN poli(A) por cromatografía en columna de oligo (dT)-celulosa de acuerdo con el procedimiento descrito por el fabricante de la columna (Invitrogen).

(C) Construcción de Biblioteca de ADNc \lambda de VR 2385

En la Figura 3 se muestra un procedimiento esquemático general para la construcción de una biblioteca de ADNc \lambda. Se realizó la síntesis de ADNc de la primera cadena partir de ARNm por transcripción inversa usando un cebador de oligo(dT) que tenía un sitio de restricción Xho I. La mezcla de nucleótidos contenía dATP, dGTP, dTTP normales y el análogo 5 metilado de dCTP, que protege al ADNc de las enzimas de restricción usadas en las etapas de clonación posteriores.

Después se realizó la síntesis de ADNc de la segunda cadena con RNasa H y ADN polimerasa I. Los extremos de ADNc se hicieron romos (extremos romos) con la ADN polimerasa de T4, se ligaron a adaptadores EcoR I con ADN ligasa de T4 y posteriormente se fosforilaron con polinucleótido quinasa de T4. El ADNc se digirió con Xho I, y el ADNc digerido se seleccionó por tamaños en un gel de agarosa. El ADNc digerido mayor de 1 kb de tamaño se seleccionó y se purificó por un kit de purificación de ADN disponible en el mercado (GENECLEAN, disponible de BIO 101, Inc., La Jolla, California).

El ADNc purificado después se ligó a brazos del vector de fago lambda, modificado por ingeniería genética con extremos cohesivos Xho I y EcoR I. El vector ligado se empaquetó en fagos lambda infecciosos con extractos de lambda. Para la transfección se usó la cepa SURE (disponible en Stratagene) de células E. coli, y después se amplificó la biblioteca de lambda y se tituló en la cepa de células XL-1 blue.

(D) Selecciones de la Biblioteca de \lambda por la Hibridación Diferencial

En la Figura 4 se muestra un procedimiento esquemático general para identificar clones auténticos de la cepa VR 2385 del virus de PRRS por hibridación diferencial, y se describe más adelante. La biblioteca \lambda se cultivó en placa sobre células XL-1 blue, se indujeron placas en membranas de nylon por duplicado y se desnaturalizaron con NaOH 0,5 N por una metodología convencional. Se aislaron ARN mensajeros de células PSP-36 infectadas con virus y células PSP-36 no infectadas por cromatografía en columna de oligo (dT)-celulosa como se describe por el fabricante de la columna (Invitrogen).

Se sintetizaron sondas de ADN complementario a partir de ARNm aislados de células PSP-36 infectadas con virus y células PSP-36 normales usando cebadores aleatorios en presencia de ^{32}P-dCTP de acuerdo con el procedimiento descrito por el fabricante (Amersham). Después se purificaron individualmente dos sondas (la primera sintetizada a partir de células PSP-36 infectadas con virus, y la otra a partir de células PSP-36 normales no infectadas) por cromatografía en columna de Sephadex G-50. Las sondas se hibridaron con las membranas de nylon duplicadas, respectivamente, a 42ºC en formamida al 50%. Se aislaron las placas que hibridaron con la sonda preparada a partir de las células infectadas con el virus, pero no con la sonda preparada a partir de células normales. Se rescataron los fagémidos que contenían insertos de ADNc virales por escisión in vitro con la ayuda del fago coadyuvante G408. Los fagémidos rescatados después se amplificaron en células XL-1 blue. Los plásmidos que contenían los insertos de ADNc virales se aislaron por cromatografía en columna Qiagen, y posteriormente se secuenciaron.

(E) Secuenciación de Nucleótidos y Análisis de la Secuencia

Se purificaron plásmidos que contenían Insertos de ADNc virales por cromatografía en columna Qiagen, y se secuenciaron por el método didesoxi de Sanger con cebadores universales inversos, así como una diversidad de cebadores oligonucleotídicos internos. Se obtuvieron secuencias de al menos tres clones distintos. Se secuenciaron clones o regiones adicionales cuando se obtuvieron datos con secuencia ambiguos. Los datos de secuencia de nucleótidos se ensamblaron y se analizaron independientemente usando dos programas informáticos, GENEWORKS (IntelliGenetics, Inc., Mountain View, California) y MACVECTOR (International Biotechnologies, Inc., New Haven, Connecticut).

(F) Cebadores oligonucleotídicos

Se sintetizaron oligonucleótidos como ADN monocatenario usando un sintetizador de ADN automático (Applied Biosystems) y se purificaron por HPLC. Se sintetizaron los oligonucleótidos PP284 (5'-CGGCCGTGTGGTTCTCGC
CA AT-3'; SEC ID NO: 1) y PP285 (5'-CCCCATTTCCCTCTAGCGAC TG-3'; SEC ID NO: 2) para la amplificación por PCR. Se generó una sonda de ADN con estos dos cebadores a partir del extremo 3' del genoma viral para el análisis de transferencia de Northern (véase en análisis presentado más adelante). Se sintetizaron los oligonucleótidos PP286 (5'-GCCGCGGAAC CATCAAGCAC-3'; SEC ID NO: 3) y PP287 (5'-CAACTTGACG CTATGTGAGC-3'; SEC ID NO: 4) para la amplificación por PCR. Se usó una sonda de ADN generada por estos dos cebadores para seleccionar adicionalmente la biblioteca de \lambda. Los oligonucleótidos PP288 (5'-GCGGTCTGGATTGACGACAG-3'; SEC ID Nº: 5), PP289 (5'-GACTGCTAGGGCTTCTGCAC-3'; SEC ID Nº: 6), PP386 (5'-GCCATTCAGCTCACATAGCG-3'; SEC ID Nº: 7), PP286 y PP287 se usaron como cebadores de secuenciación para obtener secuencias internas.

(G) Análisis de Transferencia de Northern

Un fragmento de ADN específico del extremo 3' del clon de ADNc de VR2385 se amplificó por PCR con cebadores PP284 y PP285. El fragmento de ADN se escindió de un gel de agarosa con un kit de purificación de ADN disponible en el mercado (GENECLEAN, obtenido en Bio 101) y se marcó con ^{32}P-dCTP por extensión de cebador aleatorio (usando un kit disponible en Amersham). Se aisló el ARN total a partir de células PSP-36 infectadas con VR 2385 a las 36 horas después de la infección usando un kit disponible en el mercado para el aislamiento de ARN total de acuerdo con el procedimiento descrito por el fabricante (Stratagene). Se desnaturalizaron especies de ARNm subgenómico de VR 2385 con glioxal 6 M y DMSO, y se separaron en un gel de agarosa al 1%. (En el Experimento II presentado más adelante se describen resultados de un procedimiento similar en el que se utilizó un gel de agarosa al 1,5% y se muestran en la figura 5). Los ARNm subgenómicos separados después se transfirieron a membranas de nylon usando un secante de presión POSIBLOT^{TM} (Stratagene). La hibridación se realizó en un horno de hibridación con frascos cilíndricos a 42ºC y formamida al 50%.

Resultados (A) Clonación, Identificación y Secuenciación del Genoma 3' Terminal de VR 2385

Se construyó una biblioteca de \lambda de ADNc cebada con oligo(dT) a partir de un virus parcialmente purificado, obtenido a partir de células PSP-36 infectadas con VR 2385. Se encontraron problemas en la exploración de la biblioteca de \lambda de ADNc con sondas basadas en la secuencia del virus Lelystad. Se prepararon tres series de cebadores. La primera serie (PP105 y PP106; SEC ID Nº: 8-9) corresponde a las posiciones 14577 a 14596 y 14977 a 14995 de la secuencia genómica de Lelystad, localizada en la región del gen de la nucleocápsida. La segunda serie (PP106 y PP107, SEC ID Nº: 9-10) corresponde a las posiciones 14977 a 14995 y 14054 a 14072 de la secuencia genómica de Lelystad, las ORF 6 y 7 flanqueantes. La tercera serie (PM541 y PM542; SEC ID Nº: 11-12) corresponde a las posiciones 11718 a 11737 y 11394 a 11413 de la secuencia genómica de Lelystad, localizada en la región OFR-1b.

PP105:	5'-CTCGTCAAGT ATGGCCGGT-3'	(SEC ID Nº: 8)

PP106:	5'-GCCATTCGCC TGACTGTCA-3'	(SEC ID Nº: 9)

PP107:	5'-TTGACGAGGA CTTCGGCTG-3'	(SEC ID Nº: 10)

PP541:	5'-GCTCTACCTG CAATTCTGTG-3'	(SEC ID Nº: 11)

PM542:	5'-GTGTATAGGA CCGGCAACCG-3'	(SEC ID Nº: 12)

No tuvo éxito ninguno de los intentos de generar sondas por PCR a partir del agente infeccioso VR 2385 usando estas tres series de cebadores. Sin embargo, después de varios intentos usando la técnica de hibridación diferencial, se aislaron las placas auténticas que representaban ADNc específicos de VR 2385 usando sondas preparadas a partir de células PSP-36 infectadas con VR 2385 y células PSP-36 normales. Los procedimientos implicados en la hibridación diferencial se describen y se presentan en la figura 4.

Inicialmente se identificaron tres placas positivas (\lambda-4, \lambda-75 y \lambda-91). Se rescataron fagémidos que contenían insertos de ADNc viral dentro del fago \lambda por escisión in vitro con la ayuda de fagos coadyuvantes G408. Los insertos de los clones positivos se analizaron por digestión con enzimas de restricción y secuenciación terminal. La especificidad de los clones de ADNc se confirmó adicionalmente por hibridación con ARN de células PSP-36 infectadas con la cepa Iowa de PRRSV, pero no con el ARN de células PSP-36 normales. Después se generó una sonda de ADN a partir del extremo 5' del clon \lambda-75 por PCR con cebadores PP286 y PP287. Además se identificaron placas positivas (\lambda-229, \lambda-268, \lambda-275, \lambda-281, \lambda-323 y \lambda-345) usando esta sonda. Todos los clones de ADNc de \lambda usados para obtener la secuencia de nucleótidos 3' terminales se presentan en la Fig 6. Se secuenciaron al menos tres clones separados para eliminar cualquier error. En caso de cualquier dato de secuencia ambiguo se usaron clones y cebadores internos adicionales (PP288, PP289, PP286, PP287 y PP386) para determinar la secuencia. La secuencia 3' terminal de 2062 pb (SEC ID Nº: 13) y las secuencias de aminoácidos codificadas por las ORF 5, 6 y 7 (SEC ID Nº: 15, 17 y 19, respectivamente) se presentan en la Figura 7.

(B) Una Serie Anidada de ARNm Subgenómico

Se separó ARN total de células PSP-36 infectadas con virus en un gel de agarosa con glioxal al 1%/DMSO, y se transfirió a membranas de nylon. Se generó una sonda de ADNc por PCR con una serie de cebadores (PP284 y PP285) que flanqueaban la región 3' terminal del genoma viral. La sonda contiene una secuencia 3' no traduccional y la mayor parte de la secuencia de la ORF-7. Los resultados de hibridación de transferencia de Northern demuestran que el patrón de la especie de ARNm de células PSP-36 infectadas con la cepa Iowa de PRRSV es muy similar al del virus Lelystad (LV), el virus de la arteritis equina (EAV), el virus de elevación de lactato deshidrogenasa (LDV) y coronavirus, ya que la replicación del virus requería la formación de ARNm subgenómicos.

Los resultados también indican que los ARNm subgenómicos específicos de VR2385 representan una serie anidada 3' de ARNm, porque la sonda de transferencia de Northern representa sólo la secuencia 3' terminal. Los tamaños del ARN genómico viral de VR 2385 (14 kb) y 6 ARNm subgenómicos (ARN 2 (3,0 kb), ARN 3 (2,5 kb), ARN 4 (2,2 kb), ARN 5 (1,8 kb), ARN 6 (1,3 kb) y ARN 7 (0,98 kb)) se parecen a los de LV, aunque hay diferencias tanto en el genoma como en las especies de ARN subgenómicas. También se observaron diferencias en las cantidades relativas de los ARN subgenómicos, siendo el ARN 7 el ARNm subgenómico más predominante.

(C) Análisis de Fases de Lectura Abiertas Codificadas por ARN Subgenómico

Se han encontrado tres ORF grandes en la SEC ID Nº: 13: ORF-5 (nucleótidos [nt] 426-1025; SEC ID Nº: 14), ORF 6 (nt 1013-1534; SEC ID Nº: 16) y ORF 7 (nt 1527-1895; SEC ID Nº: 18). La ORF 4, localizada en el extremo 5' de la secuencia resultante, está incompleta en la secuencia 3' terminal de 2062 pb de la SEC ID Nº:13. Cada una de las ORF 5, 6 y 7 tiene una capacidad codificante de más de 100 aminoácidos. Las ORF 5 y ORF 6 solapan entre sí por 13 pb y la ORF 6 y ORF 7 solapan entre si por 8 pb. También se han encontrado dos ORF más pequeñas localizadas totalmente dentro de la ORF 7, que codifican sólo 37 aa y 43 aa respectivamente. Otras dos ORF cortas solapan completamente con la ORF 5. La capacidad codificante de estas dos ORF es sólo de 29 aa y 44 aa respectivamente. Ningún ARNm subgenómico específico se correlacionaba con estas ORF más pequeñas por análisis de transferencia de Northern. Se cree que la ORF 6 y la ORF 7 codifican la proteína de la membrana viral y la proteína de la cápsida respectivamente.

(D) El Análisis de las Secuencias Consenso para la secuencia de unión líder demuestra que un motivo de secuencia corto, AACC, puede servir como sitio en el ARNm subgenómico donde se añade el líder durante la trascripción (el sitio de unión). El sitio de unión de la ORF 6 se encuentra 21 pb cadena arriba del codón de inicio ATG, y el sitio de unión de la ORF se encuentra 13 pb cadena arriba del codón de inicio ATG, respectivamente. No se ha identificado ninguna secuencia consenso AACC en la ORF 5, aunque se ha encontrado en la ORF 5 de LV. Se han encontrado secuencias de unión similares en LDV y en EAV.

(E) Secuencia 3' No Traduccional y Cola de Poli (A)

Se ha identificado una secuencia no traduccional de 151 nucleótidos de longitud (151 nt) después del codón de parada de la ORF 7 en el genoma de VR 2385, en comparación con 114 nt en LV, 80 nt en LDV y 59 nt en EAV. La longitud de la cola de poli (A) es de al menos 13 nucleótidos. Hay una secuencia consenso, CCGG/AAATT-poli (A) entre los virus de PRRS VR 2385, LV y LDV en la región adyacente a la cola de poli (A).

(F) Comparación de Secuencias de VR 2385 y Genomas de LV entre las ORF 5, 6 y 7 y entre las Secuencias no Traduccionales

En la figura 8 se muestra una comparación de las regiones ORF-5 de los genomas de VR 2385 y del virus Lelystad (SEC ID Nº: 20). Las comparaciones correspondientes de la región de la ORF-6, la región de la ORF-7 y las secuencias no traduccionales de VR 2385 (SEC ID Nº: 16, 18 y 22, respectivamente) con las regiones correspondientes de LV (SEC ID Nº: 23, 25 y 27 respectivamente) se muestran en las Figuras 9, 10 y 11 respectivamente.

Los resultados de las comparaciones se presentan en la Tabla 1 mostrada a continuación. Las homologías de secuencia de nucleótidos entre LV y VR 2385 de las ORF 5, ORF 6, ORF 7 y las secuencias no traduccionales son 53%, 78%, 58% y 58% respectivamente.

El tamaño de la ORF 7 en LV es 15 nt mayor que en VR 2385. Además, la secuencia no traduccional 3' terminal es diferente en longitud (150 nt en VR 2385, pero sólo 114 nt en LV). Al igual que en LV, en el genoma de la cepa Iowa del aislado del virus de PRRS VR 2385 también se ha identificado la secuencia de unión, AACC, con la excepción de ORF 5. La secuencia de unión de ORF 6 en VR 2385 está a 21 nt cadena arriba del codón de inicio ATG, mientras que la secuencia de unión de la ORF 6 está a 28 nt cadena arriba de ATG en LV.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Experimento II

La expresión de genes de VR 2385 en células de insecto (A) Producción de Baculovirus Recombinante

Las secuencias de ORF-5, ORF-6 y ORF-7 se amplificaron individualmente por PCR usando cebadores basados en la secuencia de nucleótidos genómica de VR 2385 (ISU-12). La ORF-5 se amplificó usando los siguientes cebadores:

5'-GGGGATCCGG TATTTGGCAA TGTGTC-3': (SEC ID Nº: 28)

3'-GGGAATTCGC CAAGAGCACC TTTTGTGG-5': (SEC ID Nº: 29)

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La ORF-6 se amplificó usando los siguientes cebadores:

5'-GGGGATCCAG AGTTTCAGCG G-3': (SEC ID Nº: 30)

3'-GGGAATTCTG GCACAGCTGA TTGAC-5': (SEC ID Nº: 31)

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La ORF-7 se amplificó usando los siguientes cebadores:

5'-GGGGATCCTT GTTAAATATG CC-3': (SEC ID Nº: 32)

3'-GGGAATTCAC CACGCATTC-5': (SEC ID Nº: 33)

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Los fragmentos de ADN amplificados se clonaron en el vector de transferencia de baculovirus pVL1393 (disponible en Invitrogen). Se mezclaron un \mug de ADN de baculovirus AcMNPV linealizado (disponible en el mercado en Pharmingen, San Diego, California) y 2 \mug de construcciones de vector que contenían ADNc clonado amplificado por PCR con 50 \mul de lipofectina (Gibco) y se incubaron a 22ºC durante 15 min para preparar una mezcla de
transfección.

Una hora después de sembrar las células HI-FIVE, el medio se reemplazó por medio de cultivo de células de insecto Excell 400 reciente (disponible en JR Scientific Co.) y la mezcla de transfección se añadió gota a gota. La mezcla resultante se incubó a 28ºC durante seis horas. Posteriormente se retiró el medio de transfección y se añadió medio de cultivo de células de insecto Excell 400 limpio. La mezcla resultante se incubó después a 28ºC.

Cinco días después de la transfección, el medio de cultivo se recogió y se aclaró. Se inocularon diluciones de diez veces de los sobrenadantes en células HI-FIVE y se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente. Después de desechar el inóculo se aplicó un recubrimiento de 1,25% de agarosa sobre las células. La incubación a 28ºC se realizó durante cuatro días. Posteriormente se seleccionaron las placas claras y se recogieron usando una pipeta Pasteur estéril. Cada placa se mezcló con 1 ml de medio de insecto de Grace en un tubo con tapón de cierre con resorte de 5 ml y se puso en una nevera durante una noche para liberar el virus de la agarosa. Los tubos se centrifugaron durante 30 min a 2000 x g para retirar la agarosa y los sobrenadantes se transfirieron a nuevos tubos estériles. Las etapas de purificación de placas se repitieron tres veces para evitar la posible contaminación con virus de tipo silvestre. Los clones recombinantes puros se almacenaron a -80ºC para una investigación adicional.

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(B) Expresión de Proteínas de Agente Infeccioso de la Cepa Iowa Recombinante

Para evaluar la expresión se usaron ensayo de inmunofluorescencia indirecta y ensayos de radioinmunoprecipitación.

Ensayo de inmunofluorescencia indirecta: se infectaron células de insecto Hi-five en una placa de cúmulos de cultivo celular de 24 pocillos con baculovirus de tipo silvestre o baculovirus recombinante o se infectaron de forma simulada. Después de 72 horas, las células se fijaron y se tiñeron con diluciones apropiadas de anticuerpos policlonales anti-VR 2385 de cerdo, seguido de IgG anti-cerdo marcada con isotiocianato de fluoresceína (marcada con FITC). Se detectó inmunofluorescencia en células infectadas con los virus recombinantes, pero no en las células infectadas de forma simulada ni en las células inoculadas con el baculovirus de tipo silvestre. Por ejemplo, la Figura 12 muestra células HI-FIVE infectadas con el baculovirus recombinante que contenía el gen ORF-7 de VR-2385 (Baculo.PRRSV.7), que presenta un efecto citopático. Se obtuvieron resultados similares con baculovirus recombinantes que contenían ORF-5 (Baculo-PRRSV.5) y ORF-6 (Baculo-PRRSV.6; datos no mostrados). Las Figuras 13 y 14 muestran células HI-FIVE infectadas con un baculovirus recombinante que contiene el gen de la ORF-6 de VR 2385 y el gen de la ORF-7 de VR 2385, teñidas con antisuero porcino de VR 2385 seguido de IgG antiporcina conjugada con fluoresceína, donde las células de insecto están produciendo proteína viral de la cepa Iowa recombinante. Se obtuvieron resultados similares con baculovirus recombinante que contenía la ORF-5.

Radioinmunoprecipitación: Se realizó radioinmunoprecipitación con cada virus recombinante (Baculo.PRRSV.5, Baculo.PRRSV.6 y Baculo.PRRSV.7) para determinar adicionalmente la antigenicidad y autenticidad de las proteínas recombinantes. Se infectaron de forma simulada células de insecto HI-FIVE o, como alternativa, se infectaron con cada uno de los baculovirus recombinantes. Dos días después de la infección se añadió medio sin metionina. Cada mezcla se incubó durante dos horas y después se añadieron proteínas marcadas con ^{35}S-metionina (Amersham) y la mezcla se incubó durante cuatro horas adicionales a 28ºC. Se prepararon lisados de células radiomarcadas por tres ciclos de congelación y descongelación y los lisados celulares se incubaron con antisuero anti-VR 2385 preinmune o inmune. Los inmunocomplejos se precipitaron con proteína A-agarosa y se analizaron en SDS-PAGE después de la ebullición. Una película de rayos X se expuso a los geles a -80ºC y se reveló. Se detectaron bandas del tamaño esperado con los productos de la ORF-6 (Figura 15) y la ORF-7 (Figura 16).

Experimento III

Resumen

La variación genética y posible evolución del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) se determinó por clonación y secuenciación de los supuestos genes de la proteína de membrana (M, ORF 6) y la nucleocápsida (N, ORF 7) de seis aislados de PRRSV estadounidenses con diferente virulencia. Las secuencias de aminoácidos deducidas de las supuestas proteínas M y N de cada uno de estos aislados se alinearon con las secuencias correspondientes (en la medida conocida) de otro aislado estadounidense, dos aislados europeos y otros miembros del grupo arterivirus propuesto, incluyendo el virus elevador de lactato deshidrogenasa (LDV) y el virus de la arteritis equina (EAV).

Los supuestos genes M y N presentaron una identidad en la secuencia de aminoácidos de 94-100% entre los aislados de PRRSV estadounidenses con diferente virulencia. Sin embargo, sus secuencias de aminoácidos variaban ampliamente de las de los aislados de PRRSV europeos y presentaban sólo una identidad de 57-59% y 78-81%, respectivamente. Los aislados de PRRSV estadounidenses estaban más relacionados con LDV que los aislados de PRRSV europeos. La proteína N de los aislados estadounidenses y los aislados europeos compartían una identidad de secuencia de aminoácidos de aproximadamente 50% y 40% con la de LDV, respectivamente.

Los dendrogramas filogenéticos construidos basándose en los supuestos genes M y N del grupo arterivirus propuesto fueron similares e indicaban que tanto los aislados de PRRSV estadounidenses como los europeos estaban relacionados con LDV y estaban relacionados de forma distante con EAV. Los aislados de PRRSV estadounidenses y europeos estaban dentro de dos grupos distintos con una distancia genética ligeramente diferente con respecto a LDV. Los resultados sugieren que los aislados de PRRSV estadounidenses y europeos representan dos genotipos diferentes y que pueden haber evolucionado a partir de LDV en diferentes periodos de tiempo y haber existido por separado en Estados Unidos y Europa antes de que se hubiera reconocido su asociación con PRRS en el ganado porcino.

La ORF 6 codifica la proteína de membrana (M) de PRRSV, basándose en las características similares de la ORF 6 de EAV, ORF 2 de LDV y la proteína M del virus de la hepatitis del ratón y el virus de la bronquitis infecciosa (Meulenberg et al, Virology, 192, 62-72 (1993); Conzelmann et al, Virology, 193, 329-339 (1993); Mardassi et al, Abstr. Conf. Res. Workers in Animal Diseases, Chicago, IL, pág. 43 (1993)). El producto de la ORF 7, la proteína de la nucleocápsida viral (N), es extremadamente básico e hidrófilo (Meulenberg et al, Virology, 192, 62-72 (1993); Conzelmann et al, Virology, 193, 329-339 (1993); Murtaugh et al, Proc. Allen D. Leman Swine Conference, Minneapolis, MN, págs. 43-45 (1993); Mardassi et al, Abstr. Conf. Res. Workers in Animal Diseases, Chicago, IL, pág. 43 (1993)).

Las secuencias de aminoácidos codificadas por las ORF 5, 6 y 7 del aislado estadounidense VR 2385 y del aislado europeo virus Lelystad (LV) se han comparado y la identidad (es decir, el porcentaje de aminoácidos en la secuencia que son iguales) entre los dos virus es únicamente de 54%, 78% y 58%, respectivamente. De esta manera, existen diferencias genéticas sorprendentes entre el aislado estadounidense VR 2385 y el aislado europeo LV (véase la solicitud de patente de Estados Unidos Nº de Serie 08/131,625, presentada el 5 de octubre de 1993).

Sin embargo, el aislado estadounidense VR 2385 es muy patógeno en comparación con el LV europeo. Por tanto, los aislados de PRRSV en Norte América y en Europa parecen ser antigénicamente y genéticamente heterogéneos y pueden existir diferentes genotipos o serotipos de PRRSV.

Para determinar adicionalmente la variación genética entre los aislados de PRRSV se clonaron y secuenciaron los supuestos genes M y N de cinco aislados de PRRSV estadounidenses adicionales con diferente virulencia. Se han construido árboles filogenéticos basados en los supuestos genes M y N de siete aislados de PRRSV estadounidenses, dos aislados de PRRSV europeos y otros miembros del grupo arterivirus propuesto, incluyendo LDV y EAV.

Se aislaron aislados de PRRSV (ISU-12 (VR 2385/VR 2386), ISU-22 (VR 2429), ISU-55 (VR 2430), ISU-79, ISU-1894 e ISU-3927 (VR 2431), analizándose y describiéndose cada uno de ellos en la solicitud de patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 08/131.625, presentada el 5 de octubre de 1993) a partir de pulmones de cerdo obtenidos de diferentes granjas en Iowa durante brotes de PRRS, de acuerdo con el procedimiento descrito en la solicitud de patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 08/131.625. Para aislar y propagar estos virus se usó una línea celular continua, ATCC CRL 11171. Todos los virus se clonaron biológicamente por tres ciclos de purificación en placa antes de la secuenciación del ácido polinucleico.

Los estudios de patogenicidad en cerdos privados de calostro obtenidos por cesárea (CDCD), descritos en la solicitud de patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 08/131.625, demostraron que VR 2385, VR 2429 e ISU-79 eran muy patógenos, mientras que VR 2430, ISU 1894 y VR 2431 no eran tan patógenos. Por ejemplo, VR 2385, VR 2429 e ISU-79 produjeron una consolidación de 50 a 80% de los tejidos pulmonares en cerdos CDCD de cinco semanas de edad infectados experimentalmente a los que se había realizado la necropsia 10 días después de la inoculación, mientras que VR 2430, ISU-1894 y VR 2431 produjeron sólo una consolidación de 10 a 25% de los tejidos pulmonares en el mismo experimento.

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Sección Experimental

Se infectaron monocapas de células ATCC CRL 11171 con cada uno de los aislados de PRRSV al séptimo pase a una m.o.i. de 0,1. Se aisló el ARN celular total a partir de células infectadas por el método de isotiocianato de guanidina (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)). La calidad del ARN de cada aislado se determinó por hibridación de transferencia de Northern (datos no mostrados) con una sonda de ADNc generada a partir del extremo 3' del genoma de VR 2385 por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores PP284 y PP285 (SEC ID Nº: 1 Y 2) como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 08/131.625. Se sintetizó ADNc a partir del ARN celular total con cebadores aleatorios usando transcriptasa inversa. El ADNc sintetizado se amplificó por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como se ha descrito previamente (Meng et al, J. Vet. Diagn. Invest., 5, 254-258 1993)). Se diseñaron cebadores para RT-PCR basándose en una secuencia en el genoma de VR 2385 que produjo la amplificación de todas las regiones codificantes de la proteína de los supuestos genes M y N ((cebador 5'-GGGGATCCAGAGTTTCAGCGC-3' (SEC ID Nº: 30); cebador 3': 5'-GGGAATTCACCACGCATTC-3' (SEC ID Nº: 33). Se introdujeron sitios de restricción únicos (EcoR I y BamH I) en los extremos de los productos de PCR por métodos convencionales. Se obtuvo un producto de PCR con el tamaño esperado de aproximadamente 900 pb a partir de cada uno de los aislados de los virus. Después se usó hibridación de transferencia de Southern para confirmar la especificidad de los productos amplificados.

La sonda de ADNc marcada con ^{32}P de VR 2385 hibridó con los productos de RT-PCR de cada uno de los anteriores aislados de virus. Los productos de PCR de los supuestos genes M y N de cada uno de los aislados de PRRSV se purificaron y clonaron en el vector pSK+ (Meng et al, J. Vet. Diagn. Invest. 5, 254-258 (1993)). Se secuenciaron plásmidos que contenían los supuestos genes M y N de longitud completa con un Secuenciador de ADN automático (obtenido en Applied Biosystems, Inc., Foster City California). Se secuenciaron de tres a cuatro clones de ADNc de cada aislado de virus con cebadores universal e inverso así como otros cebadores de secuenciación específicos para virus (PP288: 5'-GCGGTCTGGATTGACGAC-3' (SEC ID Nº: 5) y PP289: 5'-GACTGCTAGGGCTTCTGC-3' (SEC ID Nº: 6), describiéndose en cada uno de ellos en la solicitud de patente con el Nº de Serie 08/131.625 y DP966: 5'-AATGGGGCTTCTCCGG-3' (SEC ID Nº: 34)). Las secuencias se combinaron y analizaron por los programas informáticos MACVECTOR (International Biotechnologies, Inc.) y GENEWORKS (IntelliGenetics, Inc.).

El análisis de las secuencias de nucleótidos que codificaban las supuestas proteínas M y N de los cinco aislados de PRRSV estadounidenses indicaron que, al igual que LV (Meulenberg et al, Virology, 192, 62-72 (1993)) y VR 2385, los supuestos genes M y N de cada uno de los cinco aislados estadounidenses adicionales se solapaban en 8 pares de bases (pb). La Figura 17 muestra la secuencia de nucleótidos de las ORF 6 Y 7 de seis aislados de PRRSV estadounidenses y de LV, en la que primero se muestra la secuencia de nucleótidos de ISU-12 (VR 2385 y VR 2386) (SEC ID Nº: 35) y en secuencias posteriores (SEC ID Nº: 36-41) sólo se indican los nucleótidos que son diferentes. Los codones de inicio están subrayados e indicados por (+1>), los codones de parada están indicados por asteriscos (*) y se indican por (-), y las dos deleciones más grandes en el supuesto gen N están indicadas adicionalmente
por (^).

Las Figuras 18 (A) - (B) muestran el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de los supuestos genes M (Fig. 18(A)) y N (Fig. 18(B)) del grupo arterivirus propuesto, realizado con un programa GENEWORKS (IntelliGenetics, Inc.) usando los siguientes parámetros (valores por defecto): el valor para abrir un hueco es 5, el valor para alargar un hueco es 25, la longitud diagonal mínima es 4 y el desplazamiento diagonal máximo es 10. Se omitió la secuencia del gen M de EAV debido a que la identidad de secuencia relativamente baja con PRRSV y LDV requiere huecos en los alineamientos. Las secuencias de VR 2385/VR 2386 (SEC ID Nº: 17 y 19) se muestran en primer lugar y en secuencias posteriores (SEC ID Nº: 43, 45, 47, 49, 51, 24, 53, 55, 57, 59, 61 y 26, respectivamente), sólo se indican las diferencias. Las deleciones se indican por (-) y las dos deleciones mayores en el supuesto gen N se indican adicionalmente
por (^).

En cada uno de los cinco aislados se distribuyeron aleatoriamente numerosas sustituciones en la secuencia de nucleótidos a lo largo de los genes M y N, en comparación con VR 2385. La mayoría de las sustituciones son mutaciones silenciosas en la tercera base cuando se convierten en secuencias de aminoácidos (véase la Fig. 18). Se encuentran inserciones y deleciones en las secuencias de nucleótidos de los supuestos genes M y N en comparación con los aislados estadounidenses de LV, pero no se encuentran entre los aislados estadounidenses (Fig. 17). Por ejemplo, hay dos deleciones de mayor tamaño, de 15 y 10 nucleótidos cada una, en el supuesto gen N de los aislados estadounidenses en comparación con el genoma N de LV (Fig. 17).

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Las secuencias de aminoácidos deducidas de los supuestos genes M y N de los seis aislados de PRRSV de la cepa Iowa se alinean con la correspondiente secuencia N de otro aislado estadounidense, VR 2332 (Murtaugh et al, Proc. Allen D. Leman Swine Conference, Minneapolis, MN, págs. 43-45 (1993)); dos aislados de PRRSV europeos, LV (Meulenberg et al, Virology, 192, 62-72 (1993)) y el aislado de PRRSV 10 (PRRSV-10) (Conzelmann et al, Virology, 193, 329-339 (1993)); dos cepas de LDV, LDV-C (Godney et al, Virology, 177, 768-771 (1990)) y LDV-P (Kuo et al, Virus Res., 23, 55-72 (1992)); y EAV (Den Boon et al, J. Virol., 65, 2910-2920 (1991)) (Fig. 18).

Las secuencias de aminoácidos del supuesto gen N están muy conservadas entre los siete aislados de PRRSV estadounidenses (Fig. 18(B)) y presentaron una identidad de secuencia de aminoácidos de 96-100% (Tabla 1). Sin embargo, las supuestas proteínas N de los aislados de PRRSV estadounidenses compartían sólo una identidad de secuencia de aminoácidos de 57-59% con las de los dos aislados europeos (Tabla 1), lo que sugiere que los aislados estadounidenses y europeos pueden representar dos genotipos diferentes.

La supuesta proteína M de cada uno de los aislados estadounidenses también estaba muy conservada y presentaba una mayor similitud de secuencia con las proteínas M de los dos aislados europeos (Fig. 18(A)) que variaba de una identidad de aminoácidos de 78 a 81% (véase la Tabla 2 representada más adelante). El supuesto gen N de cada uno de los aislados de PRRSV estadounidenses compartía una identidad de secuencia de aminoácidos de 49-50% con la de las cepas de LDV, mientras que los dos aislados de PRRSV europeos compartían una identidad de aminoácidos de sólo 40-41% con la de las cepas de LDV (Tabla 2).

Se encontraron dos regiones de deleciones de secuencias de aminoácidos, "KKSTAPM" (SEC ID Nº: 62) y "ASQG" (SEC ID Nº: 63) en las supuestas proteínas N de cada uno de los siete aislados de PRRSV estadounidenses, así como las dos cepas de LDV y EAV, cuando se compararon con los dos aislados de PRRSV europeos (Fig. 18(B)). Estos resultados indicaron que los aislados de PRRSV estadounidenses están más relacionados con LDV que los aislados de PRRSV europeos y que PRRSV puede haber experimentado una evolución divergente en los Estados Unidos y en Europa antes de reconocer su asociación con PRRS en el ganado porcino (Murtaugh, Proc. Allen D. Leman Swine Conference, Minneapolis, MN, págs. 43-45 (1993)).

Los aislados europeos pueden haber divergido de LDV durante un periodo mayor que los aislados estadounidenses y, por lo tanto, pueden haber evolucionado en primer lugar. Sin embargo, la identidad de secuencia de aminoácidos del supuesto gen M entre los aislados de PRRSV estadounidenses y las cepas de LDV era similar a la observada entre los aislados de PRRSV europeos y las cepas de LDV (Tabla 2). Los supuestos genes M y N de los aislados estadounidenses y europeos de PRRSV compartían únicamente una identidad de secuencia de aminoácidos de 15-17% y 22-24% con los de EAV, respectivamente.

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(Tabla pasa a página siguiente)

3

La homología de secuencia de PRRSV con LDV y EAV sugiere que estos virus están muy relacionados y pueden haber evolucionado a partir de un antepasado común (Plagemann et al, supra; Murtaugh, supra). La alta conservación de secuencia entre LDV y PRRSV confirmó la hipótesis de que PRRSV puede haber evolucionado a partir de LDV y se adaptó rápidamente a una nueva especie de hospedador (Murtaugh, supra). Se encontró una infección de LDV asintomática en todas las cepas de ratones (Murtaugh, supra; Kuo et al, supra). Sin embargo, muchas formas de cerdo están infectadas con roedores de tipo silvestre (Hooper et al, J. Vet. Diagn. Invest., 6, 13-15 (1994)), de forma que es posible que PRRSV evolucionara a partir de ratones infectados con LDV y se adaptara rápidamente a un nuevo hospedador, el cerdo.

Las relaciones evolutivas de PRRSV con otros miembros del grupo arterivirus propuesto se determinaron basándose en la secuencia de aminoácidos de los supuestos genes M y N. La Figura 19 muestra un árbol filogenético del grupo arterivirus propuesto basándose en las secuencias de aminoácidos de los supuestos genes M y N de este grupo. El árbol filogenético para el gen N es esencialmente igual que el del gen M. La longitud de las líneas horizontales que conectan una secuencia con otra es proporcional a la distancia genética estimada entre secuencias, como se indica por los números proporcionados encima de cada línea. Se construyeron árboles UPGMA (Método de grupo por parejas no ponderado por media aritmética) con un programa GENEWOKS (IntelliGenetics, Inc.), que primero agrupa las dos secuencias más similares, después se agrupa la similitud promedio de estas dos secuencias con las siguientes secuencias más similares o subalineamientos y el agrupamiento se continua de esta manera hasta que todas las secuencias/aislados se localizan en el árbol; ambos árboles carecen de raíz.

Los aislados de PRRSV se clasifican en dos grupos distintos. Todos los aislados de PRRSV estadounidenses secuenciados hasta ahora están muy relacionados y forman un grupo. Los dos aislados de PRRSV europeos están muy relacionados y forman otro grupo. Tanto los aislados de PRRSV estadounidenses como los europeos están relacionados con cepas de LDV y están relacionados de forma distante con EAV (Fig. 19).

Los patrones evolutivos para los supuestos genes M y N también sugieren que PRRSV puede ser una variante de LDV. Por ejemplo, la distancia genética de los aislados de PRRSV estadounidenses está ligeramente más próxima a LDV que los aislados de PRRSV europeos (Fig. 19), lo que sugiere de nuevo que el PRRSV estadounidense y europeo puede haber evolucionado a partir de LDV en periodos de tiempo diferentes y existir por separado antes de reconocer su asociación con PRRS en el ganado porcino. El PRRSV europeo puede haber evolucionado antes que el PRRSV estadounidense. También es posible que el PRRSV estadounidense y europeo puedan haber evolucionado por separado a partir de diferentes variantes de LDV que existían por separado en los Estados Unidos y en Europa.

Una característica sorprendente de los virus de ARN es su rápida evolución, dando como resultado una variación de secuencia extensa (Koonin et al, Critical Rev. Biochem. Mol. Biol., 28, 375-430 (1993)). Se han obtenido pruebas directas de recombinación entre diferentes virus de ARN de cadena positiva (Lai, Microbiol. Rev., 56, 61-79 (1992)). El virus de la encefalitis equina occidental parece ser un híbrido reciente evolutivamente entre el virus de la encefalitis equina oriental y otros alfavirus muy relacionados con el virus Sindbis (Hahn et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5997-6001 (1988)). Por consiguiente, la aparición de PRRSV y su íntima relación con LDV y EAV no es sorprendente. Aunque se ha usado la proteína de la cápsida o nucleocápsida para la construcción de árboles evolutivos de muchos virus de ARN de cadena positiva, las proteínas con motivos de secuencia conservados tales como ARN polimerasa dependiente de ARN, ARN replicasa, etc., típicamente son más adecuadas para estudios filogenéticos (Koonin et al, supra).

Experimento IV

Clonación y secuenciación de ADNc correspondiente a las ORF 2, 3 y 4 de PRRSV VR 2385

Se clonó y analizó la región que incluía las ORF 2, 3 y 4 del genoma del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), aislado VR 2385. Para clonar el ADNc de PRRSV VR 2385 se infectaron células ATCC CRL 11171 con el virus a una m.o.i. de 0,1 y el ARN celular total se aisló usando un Kit de Aislamiento de ARN (Stratagene). La fracción de ARNm se purificó a través de una columna Poly (A) Quick (Stratagene) y el ARNm purificado se usó para generar una biblioteca de ADNc. Se construyó una biblioteca de ADNc oligo dT en el vector Uni-ZAP XR \lambda usando un kit de síntesis ZAP-cDNA (Stratagene), de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se aislaron clones recombinantes después de la exploración de la biblioteca con una sonda de hibridación específica para la ORF 4 (un producto de PCR de 240 p.b. específico para el extremo 3' de la ORF 4; SEC ID Nº: 64). Se extrajo ADNc específico para PRRSV que contenía pSK+ recombinante in vivo a partir de placas \lambda positivas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se secuenciaron varios plásmidos recombinantes con una serie anidada de insertos de ADNc con tamaños que variaban de 2,3 a 3,9 kb a partir de los extremos 5' de los fragmentos clonados. La secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 65 se determinó al menos en dos clones de ADNc independientes y tenía 1800 nucleótidos de longitud (Fig. 21). El análisis informático de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducidas se realizó usando los programas GENEWORKS (IntelliGenetics. Inc) y MACVECTOR (International Biotechnologies, Inc.)

Se identificaron tres ORF parcialmente solapantes (ORF 2, ORF 3 y ORF 4) en esta región. Las ORF 2, 3 y 4 comprendían los oligonucleótidos 12-779 (SEC ID Nº: 66), 635-1396 (SEC ID Nº: 68) y 1180-1713 (SEC ID Nº: 70), respectivamente, en el fragmento de ADNc secuenciado.

Una comparación de la secuencias de ADN de las ORF 2, 3 y 4 de PRRSV VR 2385 con las ORF correspondientes del virus LV (SEC ID Nº: 72, 74 y 76, respectivamente) se presenta en la Fig. 22. El nivel de identidad de secuencia de nucleótidos (homología) fue de 65% para la ORF 2, de 64% para la ORF 3 y 66% para la ORF 4.

Las secuencias de aminoácidos predichas codificadas por las OFR 2-4 de PRRSV VR 2385 (SEC ID Nº: 67, 69, 71, respectivamente) y LV (SEC ID Nº: 73, 75 y 77, respectivamente) se muestran en la Fig. 23. Una comparación de PRRSV VR 2385 y LV muestra un nivel de homología de 58% para la proteína codificada por la ORF 2, 55% para la proteína codificada por la ORF 3 y 66% para la proteína codificada por la ORF 4 (véase la Fig. 23).

Experimento V

Un método de inmunoperoxidasa para detectar PRRSV

En cuatro animales negativos para PRRSV privados de calostro de 3 semanas de edad se inocularon por vía intranasal 10^{5,8} TCID_{50} de aislado estadounidense de PRRVS ATCC VR 2386 propagado en células ATCC CRL 11171. Estos cerdos se pusieron sobre jaulas elevadas y se alimentaron con un sustituto de leche comercial. Se realizaron necropsias de dos cerdos 4 días después de la inoculación (DPI) y de dos cerdos 8 DPI.

En el momento de la necropsia, se separaron los pulmones derecho e izquierdo de cada cerdo y se inflaron a través del bronquio primario con 45 ml de uno de cuatro agentes de fijación y después se fijaron por inmersión durante 24 horas. Los agentes de fijación usados en este experimento incluían formalina tamponada neutra al 10%, solución de Bouin, HISTOCHOICE (disponible en Ambresco, Solon, OH) y una mezcla que contenía formaldehído al 4% y glutaraldehído al 1% (4F:1G). Los tejidos fijados en Bouin se aclararon con cinco cambios de 30 minutos de alcohol etílico al 70% después de 4 horas de fijación en solución de Bouin. Todos los tejidos se procesaron rutinariamente en un procesador automático de tejidos empezando en alcohol etílico al 70%. Los tejidos se procesaron en bloques de parafina antes de que hubieran transcurrido 48 horas desde la necropsia.

Se montaron secciones de 3 micrómetros de espesor en portaobjetos de vidrio recubiertos con poli-l-lisina, se desparafinaron con dos cambios de xileno y se rehidrataron por medio de baños de alcohol graduado en agua destilada. Se retiró la peroxidasa endógena por tres cambios de 10 minutos de peróxido de hidrógeno al 3%. Esto se continuó por un aclarado con frasco de lavado con tampón TRIS 0,05 M (pH 7,6) seguido de un baño con TRIS de 5 minutos. Se realizó una digestión con proteasa en todas las secciones de tejidos excepto las fijadas en HISTOCHOICE. La digestión se realizó en proteasa al 0,05% (Proteasa XIV disponible en Sigma Chem., St. Louis, Mo.) en tampón TRIS durante 2 minutos a 37ºC. La digestión se continuó por un aclarado con frasco de lavado con tampón TRIS y después por un baño con tampón TRIS frío de 5 minutos. Se realizó un bloqueo durante 20 minutos con una solución al 5% de suero de cabra normal (disponible en Sigma Chem., St. Louis, Mo.).

El anticuerpo primario usado fue el anticuerpo monoclonal SDOW-17 (obtenido en Dr. David Benfield, South Dakota, State Univ.), diluido 1:1000 en TRIS/PBS (una parte de TRIS:9 partes de PBS (0,01 M, pH 7,2)). El anticuerpo monoclonal SDOW-17 reconoce un epítopo conservado en la proteína de la nucleocápsida de PPRSV (Nelson et al, J. Clin. Microbiol, 31:3184-3189). Las secciones de tejido se inundaron con anticuerpo primario y se incubaron a 4ºC durante 16 horas en una cámara humidificada. La incubación con el anticuerpo primario se continuó posteriormente por un aclarado con frasco de lavado con tampón TRIS, un baño con tampón TRIS de 5 minutos y después un baño con tampón TRIS de 5 minutos que contenía suero de cabra normal al 1%. Las secciones se inundaron con antisuero de cabra anti-ratón biotinilado (obtenido en Dako Corporation, Carpintera, CA) durante 30 minutos. La incubación con anticuerpo de unión se continuó por tres aclarados en tampón TRIS, como los que se hicieron después de la incubación con el anticuerpo primario. Después, las secciones se trataron con estreptavidina conjugada con peroxidasa, diluida 1:200 en TRIS/PBS, durante 40 minutos, seguido de un aclarado con frasco de lavado con tampón TRIS y un baño con tampón TRIS de 5 minutos. Las secciones después se incubaron con tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina reciente (DAB, obtenido en Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) durante 8-10 minutos a temperatura ambiente y después se aclararon en un baño de agua destilada durante 5 minutos. Se realizó una tinción de contraste con hematoxilina (disponible en Shandon, Inc., Pittsburgh, PA), y las secciones se aclararon con agua corriente de Scott (10 g de MgSO_{4} y 2 g de NaHCO_{3} en 1 litro de agua ultrapura), y después con agua destilada. Después de la deshidratación, las secciones se cubrieron con medios de montaje y posteriormente se aplicó un cubreobjetos.

Se incluyeron dos controles negativos. Para un control se realizó la sustitución del anticuerpo primario por tampón TRIS/PBS. El otro control se realizó utilizando pulmones de cerdos gnotobióticos no infectados, de edad similar, en lugar de pulmones de cerdos infectados con PRRSV.

Los cambios histológicos en los tejidos infectados se caracterizaron por una neumonía intersticial proliferativa multifocal moderada con una hipertrofia e hiperplasia pronunciada de neumocitos de tipo 2, infiltración moderada de tabiques alveolares con células mononucleares, y abundante acumulación de desechos de células necróticas y células inflamatorias mixtas en los espacios alveolares. No se observaron lesiones en el epitelio bronquial o bronquiolar. Sin embargo, hubo un desecho de células necróticas en las luces más pequeñas de las vías respiratorias.

Se observó una tinción intensa y especifica en el citoplasma de las células infectadas en los tejidos fijados con formalina y solución de Bouin. La tinción fue menos intensa y específica en los tejidos fijados con 4F:1G. Hubo una tinción deficiente, pocos detalles celulares y una tinción de fondo moderada en los tejidos fijados con HISTOCHOICE. La tinción de fondo fue insignificante con los otros agentes de fijación. Los detalles celulares fueron superiores en las secciones de tejido fijadas con formalina y adecuados en los tejidos fijados con solución de Bouin y 4F:1G.

El antígeno marcado principalmente estaba dentro del citoplasma de células desprendidas y macrófagos en los espacios alveolares (Fig. 24) y dentro del desecho celular en las luces terminales de las vías respiratorias (Fig. 25). En comparación con secciones del mismo bloque teñidas con hematoxilina y eosina, se determinó que la mayoría de las células marcadas eran macrófagos, y algunas probablemente eran neumocitos desprendidos. Se observaron menores intensidades de tinción en células mononucleares dentro de los tabiques alveolares y en raras ocasiones en neumocitos de tipo 2 con hipertrofia.

Usando una técnica de inmunoperoxidasa en secciones congeladas, otros investigadores pudieron detectar antígenos en células epiteliales de bronquiolos y conductos alveolares, así como dentro de células en los tabiques alveolares y espacios alveolares (Pol et al, "Pathological, ultrastructural, and immunohistochemical changes caused by Lelystad virus in experimentally induced infections of mystery swine disease (synonym: porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS)", Vet. Q., 13:137-143). Los presentes solicitantes no pudieron detectar antígenos en el epitelio bronquiolar usando el presente método de inmunoperoxidasa.

La presente técnica de complejo de estreptavidina-biotina (ABC) usando un anticuerpo monoclonal de PRRSV puede modificarse cuando sea necesario para identificar pulmones porcinos infectados con PRRSV. Tanto la formalina tamponada neutra al 10% como la solución de Bouin son agentes de fijación estables. La digestión con proteasa aumenta la detección de antígenos sin destruir los detalles celulares. Por lo tanto, esta técnica es bastante útil para el diagnóstico de neumonía de cerdos inducida por PRRSV, y para la detección de PRRSV en muestras de tejido pulmonar.

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Experimento VI

Una identificación inmunohistoquímica de sitios de replicación de PRRSV

Resumen: En cuatro cerdos privados de calostro obtenidos por cesárea (CDCD) de tres semanas de edad se inoculó por vía intranasal un aislado de virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino. Todos los cerdos inoculados presentaron enfermedad respiratoria moderada. Se realizaron necropsias de dos cerdos 4 días después de la inoculación (PI) y de dos cerdos 9 días PI. En la necropsia se observó una consolidación moderada de los pulmones y un aumento severo de los ganglios linfáticos. Se observó una miocarditis linfomacrofágica perivascular moderada. En las amígdalas, bazo y ganglios linfáticos se observaron necrosis e hiperplasia folicular linfoide notable.

Se detectó antígeno del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino por el presente método de inmunoperoxidasa con estreptavidina-biotina principalmente dentro de los macrófagos alveolares en el pulmón y en las células endoteliales y macrófagos en el corazón. Los macrófagos y las células de tipo dendrítico en los ganglios linfáticos, bazo, amígdalas y timo también tienen una tinción intensamente positiva para el antígeno de la proteína de la nucleocápsida del PRRSV.

Sección experimental: Se cogieron cuatro cerdos desde el canal del parto de una cerda que era positiva para el anticuerpo contra PRRSV por examen del suero con anticuerpo inmunofluorescente indirecto (IFA). Los cerdos se llevaron a un sitio diferente, se encerraron en jaulas elevadas y se alimentaron con un sustituto de leche comercial. Se extrajo sangre de estos cerdos a los 0, 7, 14 y 21 días de edad y se descubrió que eran negativos para el anticuerpo contra PRRSV por el ensayo IFA. No se aisló PRRSV del suero de los cerdos o las cerdas usando células MARC-145 (disponibles en National Veterinary Services Laboratory, Ames, Iowa).

En los cuatro cerdos a las 3 semanas de edad se inocularon por vía intranasal 10^{5,8} TCID_{50} del aislado estadounidense de PRRSV ATCC VR 2385 propagado en células ATCC CRL 11171. Se observó una enfermedad respiratoria de leve a moderada de 3 a 9 días después de la inoculación (DPI). Se realizaron necropsias de dos cerdos a 4 DPI y de los otros dos a 9 DPI. A 4 DPI, un cerdo mostró 31% y el otro 36% de consolidación de los pulmones de color castaño. A 9 DPI, los dos cerdos restantes mostraron una consolidación de los pulmones de 37% y 46% respectivamente. Los ganglios linfáticos estaban moderadamente aumentados y eran edematosos.

Los tejidos linfoides recogidos en la necropsia incluían las amígdalas, timo, bazo y ganglios linfáticos traqueobronquiales, mediastinales e ilíacos mediales. Los tejidos linfoides se fijaron por inmersión durante 24 horas en formalina tamponada neutra al 10%, se procesaron rutinariamente en un procesador automático de tejidos, se incluyeron en parafina, se seccionaron a 6 micrómetros y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Se cortaron secciones adicionales (incluyendo las secciones de tejido pulmonar anteriores) a 3 micrómetros y se montaron en portaobjetos recubiertos con poli-l-lisina para inmunohistoquímica.

Se repitió el ensayo de inmunoperoxidasa descrito en el Experimento VI anterior. En resumen, después de retirar la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno al 3%, se añadió líquido ascítico con anticuerpo monoclonal primario diluido 1:1000 en TRIS/PBS durante 16 horas a 4ºC en una cámara humidificada. Se usó el anticuerpo monoclonal SDOW-17 (obtenido en Dr. David Benfield, South Dakota State Univ.), que reconoce que un epítopo conservado de la proteína de la nucleocápsida de PRRSV. Se añadió anticuerpo de unión de cabra anti-ratón biotinilado (obtenido de Dako Corporation, Carpintera, CA), seguido del tratamiento con estreptavidina conjugada con peroxidasa (obtenida en Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) e incubación con tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (obtenido en Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). La muestra incubada finalmente se tiñó con colorante de contraste en hematoxilina.

Las lesiones microscópicas incluían neumonía intersticial, miocarditis, amigdalitis y linfadenopatía. Se examinó una sección de pulmón de cada lóbulo. Las lesiones neumónicas intersticiales se caracterizaron por infiltración septal con células mononucleares, hiperplasia e hipertrofia de neumocitos de tipo 2, y acumulación de macrófagos y desecho de células necróticas en espacios alveolares. Estas lesiones eran moderadas y multifocales a 4 DPI y severas y difusas a 9 DPI. El epitelio de los bronquios y bronquiolos no estaba afectado. El antígeno de PRRSV se detectó fácilmente por inmunohistoquímica en macrófagos alveolares. A menudo se encontraron macrófagos positivos para el antígeno de PRRSV de color pardo oscuro y de gran tamaño en grupos de 5-10 células. Se observaron unas pocas células mononucleares positivas para el antígeno de PRRSV dentro de los tabiques alveolares. No se detectó antígeno de PRRSV en ningún tejido de los cerdos de control negativos.

Se examinó una sección del ventrículo izquierdo y una sección del ventrículo derecho. A 4 DPI, había focos perivasculares pequeños distribuidos aleatoriamente de linfocitos y macrófagos. Había una inflamación linfoplasmacítica e histiocítica perivascular multifocal moderada a 9 DPI. Números moderados de células endoteliales que revestían pequeños capilares de ganglios linfáticos a lo largo del miocardio se tiñeron de manera fuertemente positiva para el antígeno de PRRSV (Fig. 26) tanto a 4 como a 9 DPI. Las células endoteliales positivas para el antígeno de PRRSV a menudo no estaban rodeadas por células inflamatorias a 4 DPI, pero estaban en áreas de inflamación a 9 DPI. Unos pocos macrófagos entre miocitos y en el tejido alveolar perivascular también tuvieron una tinción fuertemente positiva para el antígeno de PRRSV.

Se observó una amigdalitis leve con necrosis. Comúnmente se observaron focos necróticos de 1-10 células con picnosis y cariorrexis en el centro de folículos prominentes y con menos frecuencia en el tejido linforreticular circundante. Se observaron grandes números de linfocitos y macrófagos dentro del epitelio de la cripta y cantidades moderadas de desechos de células necróticas en criptas. El antígeno de PRRSV se detectó rápidamente dentro de las células en el centro de los folículos hiperplásicos, en el tejido linforreticular circundante y dentro de células en el epitelio de la cripta (Fig. 27). También estaba presente la tinción entre desechos necrótico en las criptas. En todos estos sitios, las células positivas para el antígeno de PPRSV se parecían a macrófagos o a células de tipo dendrítico.

Las lesiones tímicas eran mínimas. Había unos pocos focos necróticos con picnosis y cariorrexis en la médula. Estos focos solían implicar o estar cerca de corpúsculos tímicos. El antígeno de PRRSV se identificó frecuentemente dentro de los macrófagos cerca de estas áreas necróticas y con menos frecuencia dentro de macrófagos aislados grandes en la corteza.

Eran evidentes focos necróticos y células necróticas individuales con centros germinales de nódulos linfoides y en vainas linfoides periarteriolares (PALS) del bazo. Se concentraron células de tinción positiva de antígeno de PRRSV en el centro de folículos linfoides y se dispersaron a lo largo de las PALS. Las células positivas generalmente tenían grandes núcleos ovales y abundante citoplasma con proyecciones citoplásmicas prominentes, compatibles con macrófagos o células dendríticas. Se observaron menores números de células con forma fusiforme de tinción positiva en la zona marginal. El tamaño y localización de estas células sugiere que son células reticulares.

Los cambios predominantes en los ganglios linfáticos fueron edema subcapsular, focos de necrosis en folículos linfoides, y la presencia de células sincitiales en el borde del tejido linfoide central con el tejido conectivo periférico suelto. Las vénulas endoteliales grandes eran inusualmente prominentes y a menudo estaban hinchadas. Las células sincitiales tenían 2-10 núcleos con múltiples nucleolos prominentes y un citoplasma eosinófilo moderado. Estas células no parecían contener antígeno de PRRSV. Se observó una tinción citoplásmica celular intensa y específica en los folículos. Las células positivas tenían grandes núcleos con abundante citoplasma y procesos citoplásmicos prominentes (Fig. 27). Estas células se parecían a macrófagos o a células dendríticas. Se observaron menores números de células positivas en el tejido linfoide perifolicular.

La gravedad de la lesión y la cantidad de antígeno detectada dentro de los diversos tejidos generalmente era similar a 4 y a 9 DPI. El tamaño general de los ganglios linfáticos y el número de células sincitiales en los ganglios linfáticos eran más prominentes a 9 DPI que a 4 DPI. La cantidad de antígeno detectado en el corazón también era mayor a 9 DPI.

Se usaron tejidos de cerdos CDCD no infectados de edad similar para controles histológicos e inmunohistoquímicos. Otros controles negativos para inmunohistoquímica incluían el uso del mismo protocolo menos el anticuerpo primario de PRRSV en los tejidos de cerdos infectados. No se detectó antígeno de PRRSV en ninguno de los controles negativos.

Conclusiones: el procedimiento inmunohistoquímico descrito en la presente memoria es útil para detectar el antígeno de PRRSV en el pulmón, corazón y tejidos linfoides de cerdos infectados con PRRSV. Se observó una neumonía intersticial severa y miocarditis linfohistiocítica perivascular multifocal moderada. También se observó una hiperplasia folicular linfoide notable y necrosis de grupos individuales o pequeños de células en las amígdalas, bazo y ganglios linfáticos. El antígeno de PRRSV se detectó fácilmente en macrófagos alveolares del pulmón y en células endoteliales y macrófagos del corazón. Los macrófagos y células de tipo dendrítico en las amígdalas, ganglios linfáticos, timo y bazo también tuvieron una tinción intensamente positiva para el antígeno viral.

PRRSV puede replicarse en las amígdalas con posterior viremia y una replicación adicional, principalmente dentro de los macrófagos de los sistemas respiratorio y linfoide del cerdo.

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Experimento VII

Diagnóstico de PRRS

El presente ensayo de inmunoperoxidasa con estreptavidina-biotina para la detección del antígeno de PRRSV en tejidos es bastante útil para confirmar la presencia de una infección activa. En 26 cerdos se inocularon experimentalmente PRRSV ATCC VR 2385 de acuerdo con el procedimiento de los Experimentos V/VI anterior. Se examinó una sección de cada uno de los pulmones, amígdalas, ganglios linfáticos mediastinales y ganglios linfáticos traqueobronquiales de cada cerdo. El virus se detectó por el ensayo de inmunoperoxidasa del Experimento V en 23/26 pulmones, 26/26 amígdalas, 15/26 ganglios linfáticos mediastinales y 14/26 ganglios linfáticos traqueobronquiales.

Los cerdos de este experimento se sacrificaron después de 28 días desde la inoculación. El virus se detectó en al menos un tejido en cada cerdo sometido a la necropsia hasta 10 días después de la inoculación.

En el Experimento V presentado más adelante se describe una técnica completa para la técnica de inmunoperoxidasa basada en estreptavidina-biotina para la detección de antígeno de PRRSV. En resumen, después de la retirada de la peroxidasa endógena por peróxido de hidrógeno al 3% y digestión con proteasa al 0,05% (Proteasa XIV, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), se añade líquido ascítico con anticuerpo monoclonal primario diluido 1:1000 en TRIS/PBS durante 16 horas a 4ºC en una cámara humidificada. El anticuerpo monoclonal usado fue SDOW-17 (Dr. David Benfield, South Dakota State Univ.), que reconoce un epítopo conservado de la proteína de la nucleocápsida de PRRSV (Nelson et al, "Differentiation of U.S. and European isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by monoclonal antibodies", J. Clin. Micro., 31:3184-3189 (1993)). Después se pone en contacto anticuerpo de unión de cabra anti-ratón biotinilado (Dako Corporation, Carpintera, CA) con el tejido, seguido del tratamiento con estreptavidina conjugada con peroxidasa (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA), incubación con tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA), y finalmente tinción con hematoxilina.

Particularmente cuando se combina con una o más técnicas analíticas adicionales tales como histopatología, aislamiento de virus y/o serología, el ensayo de detección de antígenos de inmunoperoxidasa tisular de la presente invención ofrece un diagnóstico rápido y fiable de la infección por PRRSV.

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Experimento VIII

Se determinó la patogenia de aislados de PRRSV en cerdos de 4-8 semanas. Los aislados se dividieron en dos grupos: (1) fenotipos con alta virulencia (hv) y (2) fenotipos con baja virulencia (lv) (véase la Tabla 3 presentada más adelante). Por ejemplo, en la Tabla 4 presentada más adelante se muestra el porcentaje medio de consolidación pulmonar de grupos de cerdos inoculados con un aislado de PRRSV. En la Tabla 5 presentada más adelante se muestra la patogenia de varios aislados de PRRSV a 10 DPI. Los resultados de la Tabla 5 se analizaron estadísticamente para verificar la diferencia entre los fenotipos hv y lv, como se determina por el porcentaje de consolidación pulmonar.

Los aislados caracterizados como aislados con alta virulencia producen una enfermedad clínica severa con fiebre alta y disnea. En general, los aislados hv producen neumonía severa caracterizada por neumonía intersticial proliferativa con proliferación de neumocitos de tipo II marcada, formación de células sincitiales, acumulación de exudados alveolares, infiltración septal leve con células mononucleares, encefalitis y miocarditis (denominada más adelante PRRS-B). Los aislados caracterizados como aislados con baja virulencia no producen una enfermedad clínica significativa y producen neumonía leve caracterizada predominantemente por neumonía intersticial con infiltración septal por células mononucleares, típica de un PRRS clásico (denominado PRRS-A más adelante).

TABLA 3 Características y Patogenia de aislados de PRRSV

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TABLA 4

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TABLA 5

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6

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Los mecanismos precisos importantes en la patogénesis de la infección por PRRSV aún no ha se han delineado completamente. Sin embargo, se ha demostrado por inmunohistoquímica en secciones congeladas que los macrófagos alveolares y las células epiteliales que revisten los conductos alveolares y los bronquiolos contienen antígenos virales (Pol et al: Pathological, ultrastructural, and immunohistochemical changes caused by Lelystad virus in experimentally induced infections of mystery swine disease (synonym: porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS). Veterinary Quarterly, 13:137-143 (1991)).

El presente ensayo de inmunohistoquímica para la detección de PRRSV en tejidos fijados con formalina (véase el Experimento VI indicado anteriormente) demuestra que PRRSV también se replica en células epiteliales alveolares y en macrófagos. También parece variar el grado de replicación del virus y los tipos celulares infectados por aislados de PRRSV (véase el Experimento X mostrado más adelante).

El papel de diferentes genes en la virulencia y replicación no se conoce de forma precisa. Sin embargo, las ORF 4 y 5 parecen ser determinantes importantes de la virulencia in vivo y la replicación in vitro PRRSV.

Los resultados de clonación y secuenciación de las ORF 5, 6 y 7 del aislado de PRRSV VR 2385 (véase el Experimento I indicado anteriormente) demuestran que la ORF 5 codifica una proteína de membrana (véase también la Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de serie 08/131.625). Una comparación de las ORF 5-7 de VR 2385 con las ORF 5-7 del virus Lelystad demuestra que la ORF 5 es la menos conservada de las tres proteínas analizadas (véase la Tabla 2 presentada anteriormente), indicando de esta manera que la ORF puede ser importante para determinar la virulencia.

Basándose los resultados de la transferencia de Northern, la ORF 4 del aislado lv VR 2431 parece tener una deleción en el ARNm 4 (véase también el Experimento V de la solicitud de patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 08/131.625).

Experimentos IX-XI

PRRSV (ATCC VR 2386) se propagó in vitro en células ATCC CRL 11171 por el método descrito en el Experimento III de la solicitud de patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 08/131.625. El aislado de PRRSV se clonó biológicamente por tres vueltas de purificación en placa en células CRL 11171 y se caracterizó. El aislado purificado en placas (en lo sucesivo "VR 2386pp", que es equivalente a VR 2386, depositado en la ATCC, Rockville Maryland, el 29 de octubre de 1992) se replicó hasta aproximadamente 10^{6}-10^{7} TCID_{50}/ml en el 11º pase de cultivo celular en células CRL 11171. También se detectaron antígenos virales en el citoplasma de células infectadas usando suero convaleciente de PRRSV. Se demostró que VR 2386pp estaba relacionado antigénicamente con VR 2332 por IFA usando anticuerpos policlonales y monoclonales contra la proteína de la nucleocápsida de VR 2332 (SDOW-17, obtenido en David Benfield, South Dakota State University).

Se aislaron otros diversos aislados de virus (VR 2429 (ISU-22), ISU-28, VR 2482 (ISU-51), VR 2430 (ISU-55), ISU-79, ISU-984. ISU-1894 y VR 2431 (ISU-3927)) y se purificaron en placas en la línea celular CRL 11171. La replicación del virus en la línea celular CRL 11171 variaba entre los aislados de PRRSV (véase la Tabla 3 presentada a continuación). El aislado VR 2385 y los aislados purificados en placa VR 2386pp, VR 2430 e ISU-79 se replicaron hasta 10^{6-7} TCID_{50}/ml, y de esta manera, tienen un fenotipo de alta replicación (hr). Otros aislados tales como ISU-984 e ISU-1894 se replicaron a un título de 10^{4-5} TCID_{50}/ml, correspondiente a un fenotipo de replicación moderada (mr). Los aislados ISU-3927 e ISU-984 se replicaron muy poco en la línea celular CRL 11171 y normalmente produjeron un título de 10^{3} TCID_{50}/ml, por lo tanto tienen un fenotipo de baja replicación (lr).

Experimento IX

Se compararon las patogenias de varios aislados de PRRSV en cerdos privados de calostro obtenidos por cesárea (CDCD) para determinar si había una correlación entre la replicación in vitro y la patogenia (véase también el Experimento V de la solicitud de patente con Nº de Serie 08/131.265). Para inocular a los cerdos se usaron cuatro aislados de PRRSV purificados en placa (VR 2386pp, VR 2429, ISU-984 y VR 2431) y un aislado no purificado en placa (VR 2385). Como controles sirvieron un grupo no inoculado y un grupo inoculado con cultivo de células no infectadas. Dos cerdos de cada grupo se sacrificaron a 3, 7, 10 y 21 DPI. Tres cerdos se sacrificaron a 28 y 36 DPI. Los aislados de PRRSV clonados biológicamente VR 2386pp, VR 2429 e ISU-984 indujeron la enfermedad respiratoria severa en cerdos CDCD de 5 semanas, mientras que VR 2431 no producía ninguna enfermedad significativa. Las puntuaciones de lesiones pulmonares generales tuvieron máximos a 10 DPI (véase la Tabla 4) y variaban de una consolidación de 10,5% (VR 2431) a una consolidación de 77% (VR 2385). Las lesiones se resolvieron a 36 DPI.

Las lesiones microscópicas incluían neumonía intersticial, encefalitis y miocarditis (Tabla 3). Los aislados lv también producían miocarditis y encefalitis menos severa que los aislados hv.

En las Figs. 28(A)-(C) se muestran fotografías de pulmones de cerdos en los que se habían inoculado (A) fluido de cultivo de la línea celular no infectada CRL 11171, (B) fluidos de cultivo de la línea celular infectada con el aislado lv VR 2431, (C) o fluidos de cultivo de la línea celular infectada con el aislado hv VR 2386pp. El pulmón de la Fig. 28 (B) tiene neumonía muy leve, mientras que el pulmón de la Fig. 28(C) tiene consolidación severa.

Experimento X

Se realizó un experimento adicional usando un mayor número de cerdos para examinar adicionalmente la patogenia de aislados de PRRSV y obtener más datos estadísticamente significativos. Los resultados se muestran en la Tabla 5. Colectivamente, los resultados demuestran que los aislados de PRRSV pueden dividirse en dos grupos basándose en la neumopatogenia. Los aislados VR 2385, VR 2429, ISU-28 e ISU-79 tienen un fenotipo de alta virulencia (hv) y producen neumonía severa. Los aislados ISU-51, VR 2430, ISU-1984 y VR 2431 tienen un fenotipo de baja virulencia (lv) (Tabla 4) y producen neumonía de bajo grado.

Los aislados de PRRSV también producen dos tipos de lesiones microscópicas en los pulmones. El primer tipo encontrado generalmente en los aislados lv se denomina PRRS-A y se caracteriza por neumonía intersticial con infiltración septal con células mononucleares típica de PRRS (como se describe por Collins et al, Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332) in North American and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs. J. Vet. Diagn. Invest., 4:117-126 (1992)). El segundo tipo de lesión, PRRS-B, se encuentra en aislados hv y se caracteriza como neumonía intersticial proliferativa con una notable proliferación de neumocitos de tipo II, exudación alveolar y formación de células sincitiales, como se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 08/131.625 y por Halbur et al, An overview of porcine viral respiratory disease. Proc. Central Veterinary Conference, pp. 50-59 (1993). En las Figs. 28(A)-(C) se muestran ejemplos de lesiones de tipo PRRS-A y PRRS-B, donde la Fig. 28(A) muestra un pulmón normal, la Fig. 28(B) son lesiones producidas por PRRSV de tipo A, y la Fig. 28(C) muestra las lesiones producidas por PRRSV de tipo B.

Se usó el ensayo de inmunoperoxidasa del Experimento V usando anticuerpos monoclonales contra PRRSV para detectar antígenos virales en células del epitelio alveolar y macrófagos (véase la Fig. 29(A)). Este ensayo ahora se usa rutinariamente en el University Veterinary Diagnostic Laboratory del Estado de Iowa para detectar el antígeno de PRRSV en tejidos.

En las Figuras 29(A)-(B) se muestra la tinción inmunohistoquímica con anticuerpo monoclonal anti-PRRSV de pulmón procedente de un cerdo infectado 9 días previamente con VR 2385. Se usó una técnica de inmunoperoxidasa con complejo de estreptavidina-biotina (ABC) acoplada con tinción de contraste con hematoxilina. En la Fig. 29 (A) se muestra claramente la tinción positiva dentro del citoplasma de macrófagos y células desprendidas en los espacios alveolares, y dentro de los desechos celulares en las luces terminales de las vías respiratorias en la Fig. 29(B).

Experimento XI

Para determinar si había una correlación entre fenotipos biológicos y cambios genéticos en aislados de PRRSV, se realizaron análisis de transferencia de Northern en 6 aislados de PRRSV.

Se aislaron ARN intracelulares totales de células CRL 11171 infectadas con virus VR 2386pp por el método de isotiocianato de guanidina, se separaron en gel de agarosa con glioxal al 1%/DMSO y se transfirieron a membranas de nylon. Se generó una sonda de ADNc por PCR con una serie de cebadores que flanqueaban la región 3' terminal del genoma viral. La sonda contenía una secuencia 3' no codificante y la mayor parte de la secuencia de la ORF-7 (véase la solicitud de patente de Estados Unidos con el Nº de serie 08/131.625).

La hibridación de la transferencia de Northern reveló una serie anidada de 6 especies de ARNm subgenómicas (Fig. 30). El tamaño del ARN genómico viral de VR 2386pp (14,7 kb) y los seis ARNm subgenómicos, ARNm 2 (3,3 kb), ARNm 3 (2,8 kb), ARNm 4 (2,3 kb), ARNm 5 (1,9 kb), ARNm 6 (1,4 kb) y ARNm 7 (0,9 kb), se parecían a los de LV, aunque había ligeras diferencias en los tamaños estimados del genoma y los ARNm subgenómicos (Conzelmann et al, Virology, 193, 329-339 (1993), Meulenberg et al. Virology, 192, 62-72 (1993)). El ARNm 7 del VR 2386pp era el ARNm subgenómico más abundante (véase la Fig. 30 y el Experimento I anterior). También se compararon los números totales de ARNm subgenómicos y sus tamaños relativos. Los ARNm subgenómicos de 3 aislados tenían 6 ARNm subgenómicos similares a los descritos para el virus Lelystad. Por el contrario, tres aislados tenían 8 ARNm subgenómicos (Fig. 30). No se sabe el origen exacto de las dos especies adicionales de ARNm, pero se localizan entre los ARNm subgenómicos 3 y 6 y se observaron repetidamente en cultivos infectados a un bajo MOI. De forma interesante, se ha detectado un ARNm subgenómico adicional en aislados de LDV propagados en cultivos de macrófagos (Kuo et al, 1992). Se especula que los ARNm adicionales en células infectadas con algunos aislados de PRRSV proceden del gen 4 y 5 posiblemente transcrito a partir de un sitio de inicio de la transcripción alterno. Se necesitan otros estudios para determinar el origen de estos ARN y su significado en la patogénesis de las infecciones por PRRSV.

La Fig. 30 muestra transferencias de Northern de aislados de PRRSV VR 2386pp (denominado "12"), VR 2429 (ISU-22, denominado "22"), VR 2430 (denominado "55"), ISU-79 (denominado "79"), ISU-1894 (denominado
"1984") y VR 2431 (denominado "3297"). Estos datos representan resultados de cuatro experimentos de hibridación de transferencia de Northern distintos. El aislado VR 2386pp (12) se procesó en un gel, ISU-1894 y VR 2431 se procesaron en un segundo gel, VR 2430 e ISU-79 se procesaron en un tercer gel, e ISU-22 se procesó en un cuarto gel. En los aislados VR 2429, VR 2430 e ISU-79 son evidentes dos ARNm adicionales.

El ARNm subgenómico 4 de VR 2431 (ISU-3927) migra más rápido que el de otros aislados en la transferencia de Northern, lo que sugiere una deleción. De manera interesante, el aislado VR 2431 tiene fenotipos lv y lr y es el aislado de PRRSV menos virulento de las cepas Iowa descritas en este documento. Esto sugiere que el gen 4 puede ser importante en virulencia y replicación. Como se ha descrito anteriormente, los genes 6 y 7 tienen menos probabilidad de participar en la expresión de los fenotipos de virulencia y replicación.

En resumen, los aislados de PRRSV varían en patogenia y en el grado de replicación de los cultivos celulares. El número de ARNm subgenómicos y la cantidad de ARNm también varía entre los aislados de PRRSV de Estados Unidos. Más significativamente, uno de los aislados, VR 2431, que se replica a bajo título (fenotipo lr) y que es el aislado menos virulento (fenotipo lv) entre los aislados de PRRSV de la cepa Iowa descritos en la presente memoria, parece tener un ARNm subgenómico de migración más rápida 4, lo cual sugiere que existe una deleción en su ORF 4.

Experimento XII

Comparación de la patogenia y distribución antigénica de dos aislados estadounidenses del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino con el virus Lelystad

En cerdos de 2-10 semanas de edad se observan frecuentemente la enfermedad respiratoria inducida por PRRSV con neumonía bacteriana secundaria, septicemia y enteritis (Halbur et al., "Viral contributions to the porcine respiratory disease complex", Proc. Am. Assoc. Swine Pract., pp. 343-350 (1993); Zeman et al., J. Vet. Diagn. Invest. (1993)). Los brotes pueden durar de 1-4 meses o convertirse en un problema continuado en algunas granjas donde el paso de cerdos a través de la unidad es apropiado para la propagación del virus desde animales de mayor edad a animales susceptibles más jóvenes que han perdido la protección pasiva del anticuerpo.

La gravedad y la duración de los brotes es bastante variable. De hecho, algunas piaras se devastan por las altas pérdidas de producción (Polson et al., "Financial Impact of Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome (PEARS), "Proc. 12th Inter. Pig Vet. Soc., p. 132 (1992); Polson et al, "An evaluation of the financial impact of porcine reproductive and respiratory syndrome (PPRS) in nursery pigs", Proc. 13^{th} Inter. Pig Vet. Soc., p. 436 (1994)), mientras que otras piaras no tienen pérdidas aparentes debido a la infección con PRRSV. Esto puede deberse a varias posibilidades, incluyendo diferencias en las cepas del virus, diferencias en la susceptibilidad genética de los cerdos, diferencias ambientales o de alojamiento o el estilo de producción (paso de cerdos) de la unidad.

Este experimento compara la patogenia y distribución de antígenos de dos cepas estadounidenses (ISU-12 [VR 2385], ISU 3927 [VR 2431]) y una cepa europea (virus Lelystad, obtenido en el National Veterinary Services Laboratory, P.O. Box 844, Ames, Iowa, 50010) en un modelo común de cerdos para documentar similitudes y diferencias que pueden explicar las diferencias en gravedad de brotes de campo de PRRSV y ayudar a entender mejor la patogénesis de la enfermedad inducida por PRRSV. (En las siguientes descripciones experimentales, "x/y" se refiere al número de cerdos "x" entre un grupo particular de cerdos que tiene "y" miembros).

Materiales y Métodos Diseño Experimental

Cien cerdos privados de calostro obtenidos por cesárea (CDCD) de 4 semanas de edad se dividieron aleatoriamente en 4 grupos grandes de 25 cerdos cada uno y se asignaron a uno de cuatro edificios aislados. Dentro de cada edificio, los cerdos se dividieron adicionalmente en 3 salas separadas (11 cerdos,11 cerdos, y 3 cerdos por sala). Cada sala dentro del edificio tenía sistemas de ventilación automática separados. Los cerdos se encerraron en jaulas elevadas y se alimentaron con una ración completa basada en harina de soja y maíz con proteína al 18%. Después de la exposición a un inóculo de virus, los cerdos se sometieron a necropsias como se detalla en la Tabla 6 presentada más adelante 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 21 y 28 días después de la inoculación (DPI).

Preparación de Inóculo del Virus

Cada virus se purificó en placa tres veces. Las dosis de exposición fueron 10^{5,8} para VR 2385 y 10^{5,8} para VR 2431. La dosis de exposición del virus Lelystad fue de 10^{5,8}.

Los cerdos se expusieron por vía intranasal sentándolos sobres sus nalgas de forma perpendicular al suelo y extendiendo su cuello completamente hacia atrás. Los inóculos se dejaron caer gota a gota lentamente en los dos orificios nasales de los cerdos, tardando aproximadamente 2-3 minutos por cerdo. A los cerdos de control se les administraron 5 ml de medio de cultivo de células no infectadas de la misma manera.

Evaluación clínica

Se tomaron las temperaturas rectales y se registraron diariamente desde -2 DPI a 10 DPI. Se proporcionó una puntuación de la enfermedad respiratoria clínica a cada cerdo diariamente desde el día 0 a 10 DPI, de acuerdo con el siguiente intervalo de puntuación 0-6, de forma similar al análisis de insuficiencia respiratoria descrito anteriormente:

0 = normal

1 = disnea y/o taquipnea leve en condiciones de estrés

2 = disnea y/o taquipnea leve sin condiciones de estrés

3 = disnea y/o taquipnea moderada en condiciones de estrés

4 = disnea y/o taquipnea moderada sin condiciones de estrés

5 = disnea y/o taquipnea severa en condiciones de estrés

6 = disnea y/o taquipnea severa sin condiciones de estrés

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TABLA 6 Programa de Necropsia

7

Se consideraba que un cerdo se "estresaba" por el manipulador del cerdo después de sujetar al cerdo bajo su brazo y tomar la temperatura rectal del cerdo durante aproximadamente 30-60 segundos. Por separado se anotaron otras observaciones clínicas relevantes, tales como tos, diarrea, falta de apetito o letargo, y no se reflejan en la puntuación de la enfermedad respiratoria.

Examen Patológico

Se realizaron necropsias completas en todos los cerdos. Las lesiones pulmonares macroscópicas recibieron una puntuación para estimar el porcentaje de consolidación del pulmón. A cada lóbulo pulmonar se le asignó un número para reflejar el volumen aproximado del pulmón entero representado por ese lóbulo. Se asignaron diez (10) puntos posibles a cada uno de los lóbulos siguientes: lóbulo anterior derecho, lóbulo medio derecho, parte anterior del lóbulo anterior izquierdo y parte caudal del lóbulo anterior izquierdo del pulmón. Al lóbulo accesorio se le asignaron cinco (5) puntos. A cada uno de los lóbulos caudales derecho e izquierdo se les asignaron veintisiete puntos y medio (27,5) para alcanzar un total de 100 puntos. Se estimaron las puntuaciones de lesión pulmonar generales y se proporcionó una puntuación para reflejar la cantidad de consolidación en cada lóbulo. El total de todos los lóbulos fue una estimación del porcentaje de consolidación del pulmón entero para cada cerdo.

Se tomaron secciones de todos los lóbulos pulmonares, cornetes nasales, cerebro, tálamo, hipotálamo, glándula pituitaria, tronco cerebral, plexo coroides, cerebelo, corazón, páncreas, íleon, amígdala, ganglio linfático mediastinal, ganglio linfático ilíaco medio, ganglio linfático mesentérico, timo, hígado, riñón y glándula suprarrenal para el examen histopatológico. Los tejidos se fijaron en formalina tamponada neutra al 10% durante 1-7 días y se procesaron rutinariamente en bloques de parafina en un procesador automático de tejidos. Se cortaron secciones a 6 \mum y se tiñeron con hematoxilina y eosina.

Inmunohistoquímica

Se realizó una tinción inmunohistoquímica como se ha descrito en el Experimento VI anterior. Se cortaron secciones a 3 \mum y se montaron en portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina. Se retiró la peroxidasa endógena por tres cambios de 10 minutos de peróxido de hidrógeno al 3%. Esto se continuó por un baño de TRIS y después por digestión con proteasa al 0,05% (Proteasa XIV, Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.) en tampón TRIS durante 2 minutos a 37ºC. Después de otro baño con tampón TRIS, se realizó el bloqueo durante 20 minutos con una solución al 5% de suero normal de cabra. Se añadió líquido ascítico con anticuerpo monoclonal primario (SDOW-17, obtenido de Dr. David Benfield, South Dakota State Univ.) diluido 1:1000 en TRIS/PBS durante 16 horas a 4ºC en una cámara humidificada. Después de la incubación con el anticuerpo primario y un baño posterior con TRIS de 5 minutos que contenía suero de cabra normal al 1%, los portaobjetos se inundaron con anticuerpo de unión de cabra anti-ratón biotinilado (Dako Corporation, Carpintera, CA) durante 30 minutos. Las secciones se lavaron con TRIS y se trataron con estreptavidina conjugada con peroxidasa (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) durante 40 minutos, y después se incubaron con tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (Vector Laboratories Inc. Burlingame, CA), durante 8-10 minutos. Después las secciones se tiñeron con hematoxilina.

En los controles inmunohistoquímicos el anticuerpo primario se sustituyó por TBS en todas las secciones de tejido pulmonar y linfoide. Se hizo lo mismo en otras secciones de otros tejidos considerados posiblemente positivos. Los cerdos de control no infectados también sirvieron como controles negativos. No se detectó tinción en ninguno de los tejidos de los cerdos de control. La cantidad de antígeno se estimó de acuerdo con la siguiente escala: (0) = negativo (sin células positivas), (1) = células de tinción positiva aisladas o raras (aproximadamente 1-5 células positivas por sección histológica), (2) = un número relativamente bajo de células positivas, aunque más abundantes que las células aisladas (por ejemplo, aproximadamente 10-20 células positivas por sección histológica), (3) = un número moderado de células positivas (por ejemplo, aproximadamente 40-80 células positivas por sección histológica), y (4) = un número relativamente grande de células positivas (más de aproximadamente 100 células positivas por sección histológica).

Aislado de Virus

Se reunieron los mismos tejidos de cada uno de dos cerdos sometidos a necropsias de cada grupo de exposición a 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21 y 28 DPI. A 10 DPI, se sometieron a necropsias nueve cerdos de cada grupo, de forma que se hicieron tres grupos de los mismos tejidos de tres cerdos de cada grupo de exposición. También se reunieron de forma similar los sueros.

Resultados Enfermedad Clínica

En la tabla 7 se resume la puntuación media de la enfermedad clínica respiratoria para cada grupo. Los cerdos de control permanecieron normales. La enfermedad respiratoria era mínima, y los síntomas y la histopatología eran similares en los grupos de cerdos infectados con virus Lelystad y VR 2431. A 2 DPI, unos cuantos cerdos de cada uno de estos grupos mostraron disnea y taquipnea leve después de someterse a estrés por manipulación. De 5-10 DPI, un número mayor de los cerdos de estos grupos demostró una enfermedad respiratoria leve y un par de cerdos mostraron una respiración abdominal dificultosa, moderada pero transitoria. A 14 DPI, todos los cerdos de los grupos de virus Lelystad (LV) y VR 2431 se habían recuperado. En unos cuantos cerdos de estos grupos se detectó otra enfermedad clínica transitoria que incluía quemosis, enrojecimiento de la conjuntiva, orejas caídas y cianosis en zonas restringidas de la piel cuando se sometían a estrés por manipulación. No se observó tos.

TABLA 7 Puntuación Media de la Enfermedad Clínica Respiratoria

8

A 2 DPI, el grupo expuesto a VR 2385 mostró enfermedad respiratoria leve sin haberse sometido a estrés. A 5 DPI todos los cerdos de este grupo mostraron una enfermedad respiratoria moderada caracterizada por respiración abdominal dificultosa y disnea en condiciones de estrés. Algunos de los cerdos de este grupo recibieron puntuaciones de insuficiencia respiratoria de 5 ó 6 durante un período de 2 a 5 días, y la puntuación media de la enfermedad clínica respiratoria tuvo un máximo de 3,5/6 a 7 DPI. La enfermedad respiratoria se caracterizó por taquipnea severa y respiración abdominal dificultosa, pero no se observó tos. Los cerdos con VR 2385 generalmente eran moderadamente letárgicos y anoréxicos de 4-10 DPI. Otros signos clínicos transitorios incluían quemosis, pelaje áspero, letargo y anorexia. Se necesitaron 21 DPI para que la mayoría de los cerdos de este grupo se recuperaran totalmente.

Lesiones Generales

La Tabla 8 resume el porcentaje estimado de consolidación de los pulmones para cerdos de cada grupo. Las lesiones pulmonares en el grupo Lelystad y en el grupo VR 2431 fueron similares en tipo y grado. Las lesiones primero se observaron a 5 DPI para los dos grupos, y alcanzaron un máximo a 15 DPI para el grupo expuesto a Lelystad y a 7 DPI para el grupo expuesto a VR 2431. Las puntuaciones individuales variaban de 0-31 por ciento de consolidación para el grupo de Lelystad y de 0-27 por ciento para el grupo de VR 2431. El porcentaje medio de consolidación estimada del pulmón para los nueve cerdos sometidos a necropsia a 10 DPI fue de 6,8 por ciento para los cerdos expuestos al virus Lelystad y de 9,7 por ciento para los cerdos expuestos a VR 2431. Las lesiones fueron predominantemente en los lóbulos craneal, medio y auxiliar y en la parte ventromedial de los lóbulos diafragmáticos. La consolidación se caracterizó por áreas multifocales con motas de color castaño, con bordes irregulares y poco definidos.

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TABLA 8 Porcentaje Estimado de Consolidación de Pulmones (0-100%)

9

Las lesiones linfoides generales fueron más comunes que las lesiones pulmonares tanto con VR 2431 como con LV. Se observó consistentemente linfadenopatía en los ganglios linfáticos mediastinal e ilíaco medio. Estos ganglios linfáticos tenían color castaño, y de 5 a 28 DPI, habían aumentado de tamaño a 2-10 veces su tamaño normal. A menudo se observó al menos un quiste relleno de líquido de 1-5 mm en cada uno de estos ganglios linfáticos. No se observó ninguna otra lesión general en los grupos LV o VR 2431.

El grupo de VR 2385 tenía una consolidación pulmonar considerablemente más severa. La distribución de la consolidación pulmonar era similar a la de cerdos infectados con VR 2431 y LV, pero los lóbulos craneoventrales enteros o las partes coalescentes grandes de los lóbulos craneal, medio, auxiliar y diafragmático ventromedial estaban consolidadas. No hubo pleuritis ni hubo pus visible en las vías respiratorias. El porcentaje de consolidación estimado del pulmón de 7-10 DPI variaba de 28% a 71%. La puntuación media estimada de los nueve cerdos sometidos a la necropsia a 10 DPI fue una consolidación de 54,2%.

Las lesiones linfoides en el grupo de VR 2385 generalmente fueron similares a las observadas en los otros grupos. Además, los ganglios linfáticos a lo largo de la aorta torácica y en la región cervical a menudo eran 2-5 veces el tamaño normal. Los bazos también habían aumentado ligeramente de tamaño y tenían una textura sustanciosa.

Varios cerdos del grupo del VR 2835 tenían corazones moderadamente agrandados y redondeados con 10-30 ml de fluido transparente en el espacio pericárdico. Algunos de estos cerdos también tenían 50-200 ml de fluido similar en la cavidad abdominal. No hubo ningún exudado visible o fibrina en el líquido.

Lesiones microscópicas

Corazón: los cerdos de control sometidos a necropsia hasta 10 DPI no tuvieron ninguna muestra de inflamación miocárdica. Varios cerdos de todo el estudio tuvieron focos discretos distribuidos aleatoriamente de células hematopoyéticas en el endocardio y miocardio. Estas células hematopoyéticas (i) se observaron en cúmulos de 10-30 células, (ii) variaban en tamaño de 8-20 micrómetros, y (iii) tenían núcleos de tinción oscura ovales redondeados grandes con cromatina densa, formando cúmulos, múltiples nucleolos pequeños y citoplasma o anfífilo y escaso. A 10 DPI, 2/9 cerdos de control tenían miocarditis linfohistiocítica perivascular multifocal leve. Esto también se observó en 1/2 cerdos sometidos a necropsia a 15 y 21 DPI respectivamente.

Los cerdos en los que se había inoculado VR 2431 también tuvieron pruebas de hematopoyesis extramedular miocárdica, similar a los controles. La miocarditis se observó en primer lugar a 7 DPI y se vio en 16/18 cerdos sometidos a necropsia de 7-28 DPI. La miocarditis era leve, multifocal, normalmente perivascular y peripurkinje, y linfohistiocítica. Se encontró inflamación consistentemente en el endocardio, a menudo alrededor de o que implicaba fibras de purkinje. La inflamación en el epicardio y miocardio era la más consistente alrededor de los vasos o se distribuía aleatoriamente entre las fibras musculares. No fue evidente degeneración miocárdica, necrosis o fibrosis. Se observaron bajos números de eosinófilos en los infiltrados perivasculares en 4/9 cerdos a 9 DPI.

En los cerdos inoculados con LV, fue evidente una hematopoyesis extramedular multifocal en la mayoría de los cerdos hasta 7 DPI. Primero se observó una miocarditis leve a 2 DPI y fue incoherente y leve en cerdos después de 3-10 DPI.

Los cerdos sometidos a necropsias a 15 y 21 DPI tuvieron miocarditis multifocal moderada. La miocarditis era mucho menos severa a 28 DPI. En total, 13/17 cerdos inoculados con LV sometidos a necropsias de 7-28 DPI tenían miocarditis linfohistiocítica, que era leve-moderada, perivascular, peripurkinje o de distribución aleatoria. Se observaron menos números de células plasmáticas y eosinófilos en áreas de inflamación de 10-28 DPI.

Se observó una miocarditis linfohistiocítica multifocal moderada empezando a 10 DPI en todos los cerdos inoculados con VR 2385. Se observó miocarditis severa en 2/9 cerdos sacrificados a 10 DPI y en 1/2 cerdos sacrificados en cada uno de 15, 21 y 28 DPI, respectivamente. Los casos más severos se caracterizaron por infiltrados linfoplasmacíticos e histiocíticos de multifocales a difusos que fueron más intensos en regiones perivasculares, peripurkinje y endocardiales. También se observaron menores números de eosinófilos y células picnóticas no identificables en asociación con la inflamación. No fue evidente degeneración miocárdica, necrosis y fibrosis.

Pulmón: se observaron lesiones pulmonares muy leves en 2/25 de los cerdos de control. Un cerdo se sometió a una necropsia a 5 DPI y tuvo un espesamiento septal multifocal leve con linfocitos, macrófagos y neutrófilos. A 10 DPI, un cerdo tuvo un engrosamiento linfohistiocítico perivascular y peribronquiolar leve y un número ligeramente mayor de macrófagos y neutrófilos en los espacios alveolares.

En los cerdos inoculados con VR 2431, primero se detectaron lesiones pulmonares microscópicas a 2 DPI, y estuvieron presentes en 20/25 de los cerdos. Todo los cerdos sometidos a necropsias en o después de 7 DPI tuvieron lesiones pulmonares microscópicas. Las lesiones, cuando estaban presentes, eran multifocales, de leves (12/25) a moderadas (8/25), generalmente más severas a 10 DPI y se resolvieron casi totalmente a 28 DPI. La neumonía intersticial multifocal se caracterizó por tres cambios principales: espesamiento septal con células mononucleares, hipertrofia e hiperplasia de neumocitos de tipo 2, y acumulación de macrófagos normales y necróticos en los espacios alveolares. Estos cambios estaban presentes a lo largo del periodo de 28 días. Se observó un engrosamiento linfohistiocítico perivascular y peribronquiolar de leve a moderado en la mayoría de los cerdos examinados a 10-15 DPI, pero se resolvió aparentemente a 28 DPI. En raras ocasiones se observaron lesiones pulmonares en secciones tomadas del lóbulo pulmonar caudal.

Los cerdos en los que se había inoculado LV tenían lesiones pulmonares microscópicas muy similares a las de VR 2431 en distribución, tipo y gravedad. Se observaron lesiones pulmonares microscópicas en 21/25 de los cerdos LV. Las lesiones primero se observaron a 2 DPI y persistieron a largo del periodo de 28 días. Las lesiones más severas se observaron en algunos de los cerdos sometidos a necropsias a 10 DPI y en la mayoría de los cerdos sometidos a necropsias a 15 y 21 DPI. La neumonía intersticial se caracterizó principalmente por espesamiento septal con células mononucleares, engrosamiento linfohistiocítico, peribronquiolar y perivascular y acumulación de macrófagos y desechos necróticos en los espacios alveolares. La hiperplasia e hipertrofia de neumocitos de tipo 2 fue menos coherente y menos severa que la observada en los cerdos inoculados con VR 2431. En raras ocasiones se observaron lesiones pulmonares en secciones tomadas del lóbulo pulmonar caudal.

Todos los cerdos que se inocularon con VR 2385 y se sometieron a necropsias en o después de 5 DPI tenían neumonía intersticial de moderada a severa. Se observaron lesiones multifocales leves a 2 DPI. Las lesiones se convirtieron en moderadas y multifocales a 5 DPI, severas y difusas de 7-10 DPI, y aún moderadas pero dispersas a 21 y 28 DPI. La neumonía intersticial en todas las fases también se caracterizó por tres cambios principales (espesamiento septal con células mononucleares, hipertrofia e hiperplasia de neumocitos de tipo 2 y acumulación de macrófagos normales y necróticos en los espacios alveolares). De estos tres cambios, la hipertrofia de neumocitos fue la más prominente y característica de la inoculación con VR 2385. El engrosamiento linfomacrofágico peribronquiolar y perivascular fue leve a 5 DPI, moderado a 10 DPI y se resolvió casi totalmente a 28 DPI.

Inmunohistoquímica

Se examinaron las dos glándulas suprarrenales de todo los cerdos. No se observaron lesiones en las glándulas suprarrenales en ninguno de los cerdos de control, inoculados con VR 2431 o inoculados con LV. En los cerdos inoculados con VR 3285, 9/25 cerdos tenían adrenalitis linfoplasmacítica e histiocítica multifocal leve. Normalmente se observó inflamación en la médula. También se observaron células picnóticas y desechos cariorréxicos entre las células inflamatorias. También se observó vasculitis linfoplasmacítica y neuritis en la arteria y nervios suprarrenales, respectivamente, en 3/28 de los cerdos inoculados con VR 2385.

Las lesiones de los cornetes nasales fueron similares en tipo pero diferían en gravedad y frecuencia en los 4 grupos de cerdos. Un pequeño número (5/25) de los cerdos de control e inoculados con LV (5/25) tenían rinitis leve, observada a 10-21 DPI. La rinitis se caracterizó por displasia localizada en regiones del epitelio, con pérdida de cilios e infamación supurativa linfohistiocítica subepitelial multifocal leve, con ligero edema y congestión.

Más de los cerdos inoculados con VR 2431 (17/25) tenían rinitis. Las lesiones eran leves a 5 DPI, pero moderadas a 10 DPI. Se observaron displasia epitelial con edema intercelular, un aspecto "blebbed" o "tombstone" de células epiteliales superficiales hinchadas que pasaron a ser picnóticas y aparentemente se desprendían en la cavidad nasal, y una pérdida completa o parcial de cilios en grandes zonas discretas del epitelio. Hubo un edema subepitelial difuso moderado, venas dilatadas y congestionadas, e infiltrados multifocales de linfocitos, células plasmáticas, macrófagos y neutrófilos. La inflamación era máxima cerca de las localizaciones donde los conductos de las glándulas mucosas submucosas se extendían a la superficie. A menudo se observó exocitosis leucocítica, especialmente de neutrófilos, en el epitelio displásico de la superficie y a lo largo de los conductos mucosos. A21 DPI las lesiones se habían convertido en leves y se habían resuelto a 28 DPI.

Primero se observó rinitis a 5 DPI en los cerdos inoculados con VR 2385. Un total de 20/25 cerdos, y los 17 cerdos sometidos a necropsias en o después de 7 DPI, tenían rinitis similar a la observada en el grupo de ISU-3927, con la excepción de que la lesión persistía a lo largo de un periodo de 28 días.

Las Tablas 9, 10 y 11 resumen y comparan el número de tejidos diferentes en los que se detectó el antígeno de PRRSV para cada uno de los grupos de exposición. No se detectó antígeno en los cerdos de control. La Tabla 12 resume la cantidad estimada de antígeno en algunos de los tejidos que se ensayaron.

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Aislamiento de virus

En la Tabla 13 se resume el aislamiento de virus de diversos tejidos, donde "Lg" se refiere a pulmones, "LN" se refiere a ganglios linfáticos, "Ht" se refiere al corazón, "Ser" se refiere al suero, "Tons" se refiere a las amígdalas, "Spln" se refiere al bazo, "SI" se refiere al intestino delgado, y "Brn" se refiere al cerebro.

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TABLA 9 Inmunohistoquímica para VR 2385

10

TABLA 10 Inmunohistoquímica para VR 2431

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11

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TABLA 11 Inmunohistoquímica para el virus Lelystad

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12

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Serología

Todos los cerdos expuestos al virus LV fueron negativos antes de la exposición y permanecieron <1:20 hasta 7 DPI. A 10 DPI, 6/9 de los cerdos sometidos a necropsias fueron seropositivos con títulos que variaban de 1:20 a 1:1280. Sólo 2/10 cerdos tuvieron títulos >1:20 (los dos fueron 1:1280). A 15 DPI, todos los cerdos fueron positivos y 5/6 fueron >1:320. A 21 DPI, los títulos más comunes fueron 1:1280 ó 1:5120. Los títulos de anticuerpo contra VR 2431 fueron similares a los niveles observados con el virus LV. Sin embargo, con VR 2385, 9/9 fueron positivos a 10 DPI y 7/9 fueron \geq1:320. No se detectó anticuerpo en suero contra PRRSV en los cerdos de control.

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Discusión

Este Experimento demuestra claramente diferencias en patogenia entre aislados de PRRSV, diferencias en la distribución de antígenos de PRRSV, y diferencias en la cantidad de antígeno de PRRSV en tejidos seleccionados. En estos criterios fue similar el aislado de la cepa Iowa de baja virulencia VR 2431 y el virus Lelystad de baja virulencia. El aislado de VR 2385 de la cepa Iowa fue considerablemente más virulento, y el antígeno de PRRSV se detectó en más tejidos y en mayores cantidades en comparación con LV y VR 2431.

El patrón de distribución de antígenos a lo largo del tiempo (Tabla 12) sugiere que cuando los cerdos se infectan por la vía oronasal, la replicación inicial y continua del virus puede estar en la amígdala y en los tejidos linfoides del tracto respiratorio superior, con una posterior viremia a 24 horas PI. Se detecta una pequeña cantidad de antígeno en el pulmón 24 horas PI y picos a 5-7 DPI, pero persiste hasta durante 28 días. El antígeno está presente en los tejidos linfoides generalmente de 2-21 DPI.

El antígeno se detecta principalmente dentro de los macrófagos y células de tipo dendrítico en los pulmones, ganglios linfáticos, amígdalas, timo y bazo.

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(Tabla pasa a página siguiente)

13

14

TABLA 12

Experimento XIII

Patogenia comparativa de nueve aislados de PRRSV estadounidenses en un modelo de cerdo CDCD de 5 semanas

La parte (A) de este experimento muestra un modelo coherente para estudiar la enfermedad respiratoria y sistémica inducida por PRRSV en lechones (por ejemplo, de aproximadamente 5 semanas) y para caracterizar lesiones generales y microscópicas asociadas con el curso de la enfermedad inducida por PRRSV. La Parte (B) de este experimento usa el modelo para comparar estadísticamente la virulencia de aislados de PRRSV de piaras con diferente gravedad en la enfermedad, y para determinar específicamente si estas diferencias pueden deberse a características de virulencia del virus.

Materiales y Métodos Fuente de aislados de PRRSV

Se recibieron cerdos vivos o tejidos recientes de 61 piaras durante un período de 3 años entre 1991 y 1993. Todos los casos se presentaron para un diagnóstico etiológico de enfermedad respiratoria en cerdos de 1-16 semanas de edad. Algunas de las piaras tenían una incapacidad reproductiva concurrente y otras no. Las nueve piaras seleccionadas diferían en tamaño, estilo de producción, edad de cerdos enfermos, tiempo desde que se observó la enfermedad inicial y gravedad de los brotes de la enfermedad en ese momento. La información clínica de las granjas seleccionadas se resume en la Tabla 14.

TABLA 14 Perfiles de Piaras de PRRSV

15

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Preparación de inóculos

Se purificaron en placa aislados de PRRSV tres veces de acuerdo con el procedimiento descrito en el Experimento I sección (I) (A) anterior.

Cerdos experimentales

Inicialmente se alimentaron cerdos privados de calostro obtenidos por cesárea (CDCD) de cuatro semanas de edad con una dieta preiniciadora comercial con 22% de proteína que contenía proteína plasmática secada por pulverización durante 7 días, y después se cambiaron a una ración basada en harina de soja-maíz con 18% de proteína en segunda fase durante el resto del experimento. Los cerdos se encerraron en salas ventiladas individualmente con suelo de hormigón de 12 (3,66 m) pies x 12 (3,66 m) pies.

Parte (A): Modelo de cerdo CDCD

Noventa y ocho cerdos CDCD de 4 semanas de edad se dividieron aleatoriamente en siete salas de 14 cerdos cada una. Las salas se asignaron aleatoriamente a uno de siete tratamientos como se muestra en la Tabla 15. El tratamiento consistía en la inoculación intranasal de 10^{5,7} TCID_{50} de un aislado de PRRSV (seleccionado entre los aislados de PRRSV purificados en placa VR 2385, VR 2429 [ISU-22], VR 2431 o ISU-984, aislado no purificado en placa ISU-12 [VR 2386]), inoculación intranasal de cultivo de células no infectadas y medio, o sin tratamiento. Dos cerdos de cada grupo se sometieron a necropsias a DPI 3, 7, 20 y 21 y 3 cerdos se sometieron a necropsias de cada grupo a DPI 28 y 36. Las temperaturas rectales se registraron diariamente desde DPI -2 a DPI +14. Se aplicó una puntuación de enfermedad respiratoria clínica desde DPI -2 a DPI 14. Las puntuaciones varían de 0-6, de acuerdo con la escala de insuficiencia respiratoria mencionada en el Experimento XII. Un lechón se consideraba "estresado" por el manipulador de cerdos cuando éste sujetaba al cerdo debajo de su brazo y tomaba la temperatura rectal durante aproximadamente 30-60 segundos. Otras observaciones clínicas relevantes (por ejemplo, tos, diarrea, inapetencia o letargo) se anotaron por separado cuando se observaron. Otras observaciones clínicas no tuvieron ningún impacto sobre la puntuación respiratoria clínica. Los pesos se registraron a DPI 0, 7, 14, 21 y 28.

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TABLA 15 Parte (A) Diseño Experimental

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Parte (B): Patogenia Comparativa

Los resultados de la Parte (A) establecieron que las lesiones pulmonares generales eran más severas a 10 DPI para 4 de 5 aislados de PRRSV. La parte (B) se diseñó para recoger y comparar datos de un mayor número de cerdos sometidos a necropsias a 10 DPI. En este experimento, 105 cerdos CDCD cruzados de 4 semanas de edad se dividieron aleatoriamente en siete salas, cada una con 15 cerdos. A cada sala se le asignó aleatoriamente un tratamiento. Los tratamientos consistían en una exposición intranasal con 10^{5,8} TCID_{50} de uno de seis aislados de PRRSV purificados en placa (VR 2428, [ISU-51], ISU-79 VR 2430 [ISU-55], ISU-1894, ISU-28 o VR 2385) o cultivo de células PSP-36 no infectadas y medio. Diez cerdos de cada grupo se sometieron a necropsias a 10 DPI, y 5 cerdos de cada grupo se sometieron a necropsias a 28 DPI. Las temperaturas rectales se registraron de -2 DPI a +10 DPI, y los pesos se registraron a 0, 10 y 28 DPI. Las puntuaciones de la enfermedad clínica respiratoria y los otros signos clínicos se registraron como en la Parte (A) anterior.

Serología

Parte (A): se extrajo sangre de los cerdos a 0, 10 y 28 DPI. La presencia de anticuerpo sérico contra PRRSV se detectó por la técnica de anticuerpo inmunofluorescente (IFA) descrita por Benfield et al (J. Vet. Diagn. Invest., 4:127-133 (1992)).

Parte (B): se extrajo sangre de los cerdos a 0, 3, 10, 16 y 28 DPI y se ensayó por el procedimiento IFA de la Parte (A) con respecto a la presencia de anticuerpos séricos contra PRRSV.

Aislamiento de Virus

Se intentó el aislamiento de virus a partir de homogeneizados pulmonares de todos los cerdos sacrificados a 3, 7, 10, 21 y 28 DPI (Parte (A)). También se intentó el aislamiento de los virus a partir de pulmón y del suero de todos los cerdos por separado en grupos de dos cerdos usando células CRL 11171 (PSP 36) (Parte (B)).

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Patología General

Se realizaron necropsias completas en todos los cerdos. Se examinaron todos los sistemas de órganos. Se calculó un porcentaje estimado de consolidación del pulmón de cada cerdo basándose en el sistema de puntuación descrito en el Experimento XII anterior, en el que a cada lóbulo pulmonar se le asignó un número para reflejar el volumen aproximado de pulmón entero representado por ese lóbulo. También se anotaron otras lesiones de acuerdo con esto.

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Patología Microscópica

Se tomaron secciones de todos los lóbulos pulmonares descritos anteriormente, así como de cornetes nasales, cerebro, tálamo, hipotálamo, glándula pituitaria, tronco cerebral, plexo coroides, cerebelo, corazón, páncreas, íleon, amígdala, ganglio linfático mediastinal, ganglio linfático ilíaco medio, ganglio linfático mesentérico, timo, hígado, riñón y glándula suprarrenal para el examen histopatológico. Los tejidos se fijaron en formalina tamponada neutra al 10% durante 1-7 días y se procesaron rutinariamente en bloques de parafina en un procesador de tejidos automático. Se cortaron secciones a 6 \mum y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las lesiones en varios tejidos se graduaron de acuerdo con la siguiente escala: (-) = normal, (+) = leve, (++) moderada, (+++) = severa y (++++) = muy severa (véase la Tabla 19).

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Resultados Enfermedad clínica - Parte (A) modelo de cerdo CDCD

Cerdos expuestos a VR 2385 mostraron la enfermedad respiratoria clínica más severa, con puntuaciones por encima de 2,5/6,0 a 7-9 DTI (Tabla 16). El inicio de la enfermedad respiratoria se detectó a 3 DPI, y los síntomas y lesiones continuaron hasta 14 DPI. La enfermedad respiratoria se caracterizó por respiraciones y taquipnea abdominal dificultosa y acentuada. No hubo tos. Los cerdos se volvieron letárgicos a 3 DPI, eran anoréxicos a 5 DPI, y no volvieron a alimentarse de manera completa y a realizar una actividad normal hasta después de 14 DPI. Se notó un edema en el párpado en dos cerdos a 6 y 7 DPI.

Los cerdos expuestos a VR 2429 tuvieron un inicio posterior de la enfermedad respiratoria (5 DPI), pero la enfermedad respiratoria severa apareció más rápidamente y tuvo una mayor duración que en los cerdos en los que se había inoculado ISU-12. VR 2429 produjo puntuaciones respiratorias mayores de 3,0/6,0 en 7-13 DPI. Los cerdos dejaron de alimentarse y eran letárgicos a 6-14 DPI. No se detectó ningún otro signo clínico.

En los cerdos expuestos a ISU-984 se produjo la enfermedad respiratoria de moderada a severa con un inicio gradual que empezaba a 4 DPI. Los cerdos tuvieron una puntuación de 2-2,5/6,0 para la enfermedad respiratoria a 7-10 DPI y mayor de 3,0/6,0 con unas pocas puntuaciones de 4-5/6,0 a 11-14 DPI. Otros signos clínicos incluían letargo, edema en el párpado y decoloración transitoria de la piel con manchas moradas.

En los cerdos expuestos a VR 2431 se produjo una enfermedad respiratoria leve. El inicio de la enfermedad se produjo a 5 DPI con las puntuaciones de la enfermedad clínica respiratoria más severas entre 2 y 2,5/6,0 en algunos cerdos a 7-8 DPI. Los cerdos parecían considerablemente mejores a 10 DPI y eran completamente normales a 14 DPI. Se observaron letargo y anorexia a 7-8 DPI.

Las temperaturas rectales medias eran mayores de 104ºF para todos los grupos expuestos a 7 DPI, y permanecieron por encima de 104ºF hasta después de 10 DPI. Esto coincidió con el periodo de enfermedad respiratoria clínica más severa. Los cerdos de control permanecieron clínicamente normales a lo largo de todo el experimento.

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Enfermedad clínica - Parte (B), Patogenia comparativa:

En la Tabla 17 se resumen las puntuaciones de enfermedad clínica respiratoria y las temperaturas rectales. VR 2428 produjo enfermedad respiratoria muy leve y los cerdos parecían casi normales a 10 DPI. VR 2430 indujo una disnea y taquipnea leves de 4-10 DPI, así como letargo y anorexia de 4-6 DPI. A 5-8 DPI, ISU-1894 produjo una enfermedad respiratoria moderada de corta duración y los cerdos generalmente se recuperaron a 10 DPI. Los cerdos en los que se inoculó ISU-1894 también fueron transitoriamente letárgicos y anoréxicos de 4-7 DPI. ISU-79 indujo una enfermedad respiratoria severa con respiraciones dificultosas de mayor frecuencia, acompañadas de letargo y anorexia de 4 DPI a 15 DPI. ISU-12 indujo taquipnea y disnea moderadas de larga duración (4-28 DPI). Estos cerdos también eran moderadamente letárgicos y levemente anoréxicos durante ese periodo de tiempo.

Los cerdos de los tres grupos (ISU-12, ISU-79, ISU-28) presentaron frecuentemente una decoloración transitoria de color morado azulado de la piel cuando se sometían a estrés por medio de manipulación. ISU-28 produjo una enfermedad respiratoria severa similar a ISU-79, pero tenía un inicio posterior (a 7 DPI), y sólo de 5 días de duración. Los controles permanecieron normales hasta 10 DPI.

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Lesiones Generales - Parte (A), Modelo de cerdo CDCD

Se puntuaron las lesiones pulmonares generales y se estimaron como el porcentaje de consolidación pulmonar. Los resultados se resumen en la Tabla 16. El grado de consolidación variaba de 7,3% (IS-984) a 29% (VR 2386) a 3 DPI, de 20% (VR 2431) a 56,3% (VR 2386) a 7 DPI, de 10,5% (VR 2431) a 77,5% (VR 2385) a 10 DPI, de 0% (VR 2431) a 37,3% a 21 DPI, y de 0% (VR 2431, VR 2385) a 11% (VR 2429) a 28 DPI. En ningún grupo permanecía ninguna lesión detectable de forma general a 36 DPI. No se observó ninguna lesión pulmonar general en ningún momento en el grupo de control.

Los lóbulos pulmonares afectados estaban principalmente en la parte anterior, media, auxiliar y ventromedial de los lóbulos caudales. Las áreas consolidadas no estaban bien demarcadas. Estas áreas eran multifocales dentro de cada lóbulo y tenían bordes irregulares e indistintos, dando a los lóbulos afectados un aspecto con motas de color
castaño.

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(Tabla pasa a página siguiente)

17

Lesiones Generales - Parte (B), Patogenia comparativa

Las lesiones pulmonares generales estimaron por el porcentaje de consolidación pulmonar, y se muestran en la Tabla 18.

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Lesiones Microscópicas - Parte (A), Modelo de cerdo CDCD

Los resultados se muestran en la Tabla 19. VR 2385, VR 2386, VR 2428 e ISU-984 indujeron lesiones pulmonares microscópicas similares. Produjeron neumonía intersticial moderada-severa, caracterizada por: (i) proliferación de neumocitos de tipo II, (ii) espesamiento septal con células mononucleares, y (iii) acumulación de exudado alveolar mixto. VR 2431 indujo sólo neumonía intersticial leve con espesamiento septal por células mononucleares. Se observó miocarditis únicamente en los cerdos inoculados con VR 2386.

\vskip1.000000\baselineskip

Aislamiento de Virus - Parte (A), modelo de cerdo CDCD

Se recuperó PRRSV a partir de los pulmones de los 11 cerdos inoculados con VR 2386, de 9 de 11 cerdos inoculados con VR 2385, de 6 de 11 cerdos inoculados con ISU-984, de 9 de 11 cerdos inoculados con VR 2431, o de 0 de 11 cerdos inoculados con controles de cultivo de células, y de 0 de 11 cerdos de control no inoculados hasta 28 DPI.

\vskip1.000000\baselineskip

Serología - Parte (A), Modelo de cerdo CDCD

Todos los cerdos inoculados con PRRSV tuvieron un título de anticuerpo contra PRRSV detectable de \geq 640 a 10 DPI. Ninguno de los cerdos de control tuvo un nivel detectable de anticuerpo contra PRRSV. La mayoría de los cerdos inoculados con PRRSV tuvieron títulos de \geq 2560 a 28 DPI.

\vskip1.000000\baselineskip

Serología - Parte (B), Patogenia comparativa

Todos los cerdos inoculados con PRRSV tuvieron títulos de anticuerpo contra PRRSV de \geq64 a 10 DPI. Los cerdos de control no tuvieron niveles detectables de anticuerpos contra PRRSV.

\vskip1.000000\baselineskip

Discusión

Los cerdos CDCD de 5 semanas de edad inoculados por vía intranasal con 10^{5,8} TCID_{50} de PRRSV proporcionan un modelo excelente para estudiar y comparar la enfermedad respiratoria y sistémica inducida por PRRSV. Se observaron diferencias significativas (p < 0,05) en los datos de neumopatogenia indicados en la Tabla 18. Basándose en los resultados obtenidos aquí y en el Experimento XI anterior, los aislados pudieron agruparse en grupos de alta y baja virulencia como se indica continuación:

alta virulencia: VR 2385, VR 2386, VR 2429 (ISU-22), ISU-28, ISU-984, ISU-79

baja virulencia: VR 2431, VR 2428 (ISU-51), VR 2430, ISU -1984, LV.

Un aislado de PRRSV puede considerarse un fenotipo de "alta virulencia" si produce uno o más de los siguientes:

(a) una consolidación pulmonar general media a 10 DPI de al menos 30%, y preferiblemente, al menos 40%;

(b) hipertrofia e hiperplasia de neumocitos de tipo II de moderada a muy severa, espesamiento intersticial de moderado a muy severo, exudado alveolar de moderado a muy severo, y la presencia de sincitios; o

(c) una puntuación de insuficiencia respiratoria media de al menos 2,0 en algún punto en algún momento de 10-21 DPI.

Cuando un aislado no satisface ninguno de los criterios anteriores, puede considerarse un fenotipo de "baja virulencia".

Evidentemente, son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores. Por lo tanto, debe entenderse que dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas la invención puede ponerse en práctica de otra forma distinta a la que se describe específicamente en la presente memoria.

18

TABLA 18 Parte (B), Consolidación Pulmonar General Media y Desviación Típica

19

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\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 19 Experimento XIII, Parte (A), Modelo de cerdo CDCD: Resumen de Lesión Microscópica a 10 DPI

20

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: PAUL, PREM S.

\hskip3,9cm MENG, XIANG-JIN

\hskip3,9cm HALBUR, PATRICK G.

\hskip3,9cm MOROZOV, IGOR

\hskip3,9cm LUM, MELISSA A.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: UN ÁCIDO POLINUCLEICO AISLADO A PARTIR DE UN VIRUS DEL SÍNDROME REPRODUCTIVO Y RESPIRATORIO PORCINO (PRRSV), UNA PROTEÍNA CODIFICADA POR EL ÁCIDO POLINUCLEICO, UNA VACUNA PREPARADA A PARTIR DE O QUE CONTIENE EL ÁCIDO POLINUCLEICO O PROTEÍNA,

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 77

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: OBLON, SPIVAK, McCLELLAND, MAIER & NEUSTADT, P.C.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 1755 S. Jefferson Davis Highway, Suite 400

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Arlington

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: Virginia

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: U.S.A.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 22202

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: Compatible con PC IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/131.625

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-OCT-1993

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL PROCURADOR/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Lavalleye, Jean-Paul M.P.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 31.451

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 4625-021-55X CIP

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (703) 413-3000

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (703) 413-2220

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TELEX: 248855 OPAT UR

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGCCGTGTG GTTCTCGCCA AT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCCATTTCC CTCTAGCGAC TG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCGCGGAAC CATCAAGCAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAACTTGACG CTATGTGAGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGTCTGGA TTGACGACAG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACTGCTAGG GCTTCTGCAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCATTCAGC TCACATAGCG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCGTCAAGT ATGGCCGGT

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCATTCGCC TGACTGTCA

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGACGAGGA CTTCGGCTG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCTACCTG CAATTCTGTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGTATAGGA CCGGCAACCG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2062 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (VR 2385/VR 2386)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:13:

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 603 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (VR 2385/VR 2386)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..600

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 200 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 525 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (VR 2385/VR 2386)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..522

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 174 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 372 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (VR 2385/VR 2386)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..369

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 123 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:19:

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 606 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: Lelystad

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..603

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:20:

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 201 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:21:

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 164 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (VR 2385/VR 2386)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 522 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: Lelystad

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..519

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:23:

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 173 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:24:

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 387 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: Lelystad

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..384

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 128 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:26:

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 127 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: Lelystad

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:27:

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGATCCGG TATTTGGCAA TGTGTC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGTTTTCC ACGAGAACCG CTTAAGGG

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGATCCAG AGTTTCAGCG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGTTAGTCG ACACGGTCTT AAGGG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGATCCTT GTTAAATATG CC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTACGCACC ACTTAAGGG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATGGGGCTT CTCCGG

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 886 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (VR 2385/VR 2386)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:35:

\vskip1.000000\baselineskip

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 886 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-1894

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:36:

\vskip1.000000\baselineskip

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 886 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-22 (VR 2429)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:37:

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 886 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-79

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:38:

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 886 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-55 (VR 2430)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:39:

61

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 886 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-3927 (VR 2431)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:40:

\vskip1.000000\baselineskip

62

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 898 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: Lelystad

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:41:

\vskip1.000000\baselineskip

64

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 525 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-1894

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..522

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:42:

65

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 174 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:43:

\vskip1.000000\baselineskip

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 525 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-22 (VR 2429)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..522

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:44:

\vskip1.000000\baselineskip

67

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 174 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:45:

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 525 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-79

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..522

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:46:

69

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 174 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:47:

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 525 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-55 (VR 2430)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..522

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:48:

71

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 174 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:49:

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 525 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-3927 (VR 2431)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..522

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:50:

73

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 174 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:51:

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 372 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-1894

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..369

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:52:

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 123 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:53:

\vskip1.000000\baselineskip

76

77

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 372 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-22 (VR 2429)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..369

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:54:

\vskip1.000000\baselineskip

78

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 123 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:55:

\vskip1.000000\baselineskip

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 372 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-79

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..369

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:56:

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 123 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:57:

\vskip1.000000\baselineskip

82

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 372 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-55 (VR 2430)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..369

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:58:

\vskip1.000000\baselineskip

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 123 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:59:

\vskip1.000000\baselineskip

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 372 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-3927 (VR 2431)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..369

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:60:

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 123 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:61:

\vskip1.000000\baselineskip

86

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:62:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Lys Ser Thr Ala Pro Met}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:63:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ser Gln Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 240 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico;

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: ADN (sintético)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (VR 2385/VR 2386)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:64:

\vskip1.000000\baselineskip

87

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1799 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (VR 2385/VR 2386)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:65:

\vskip1.000000\baselineskip

88

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 771 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (VR 2385/VR 2386)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..768

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:66:

\vskip1.000000\baselineskip

89

90

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 256 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:67:

\vskip1.000000\baselineskip

91

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 765 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (VR 2385/VR 2386)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..762

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:68:

93

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 254 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:69:

\vskip1.000000\baselineskip

94

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 537 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Iowa

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (VR 2385/VR 2386)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..534

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:70:

\vskip1.000000\baselineskip

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 178 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:71:

\vskip1.000000\baselineskip

96

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 750 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: Lelystad

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..747

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:72:

97

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 249 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:73:

98

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 798 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: Lelystad

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..795

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:74:

99

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 265 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:75:

100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 552 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: Lelystad

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..549

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:76:

101

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 183 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:77:

102

Claims

1. Una preparación purificada que contiene un ácido polinucleico seleccionado entre la ORF 2 de un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) de uno cualquiera de VR 2385 (ISU-12), VR 2429 (ISU-22), VR 2431 (ISU-3927), VR 2474 (ISU-79) y VR 2475 (ISU-1894) y combinaciones de los mismos.

2. La preparación purificada de la reivindicación 1, donde dicho ácido polinucleico tiene una secuencia seleccionada entre las fórmulas (I) y (II):

(I)5' -\alpha-\beta-\gamma- 3'

(II)5' -\alpha-\beta-\gamma-\delta-\varepsilon- 3'

donde:

\alpha: codifica al menos un polipéptido codificado por la ORF 2 de una cepa Iowa de PRRSV;

\beta: es un enlace covalente o un ácido polinucleico de unión;

\gamma: es al menos una copia de una ORF 5 de una cepa Iowa de PRRSV;

\delta: es un enlace covalente; y

\varepsilon: codifica al menos un polipéptido codificado por un polinucleótido seleccionado entre la ORF 6 y ORF 7 y una cepa Iowa de PRRSV; y

\gamma: puede tener un extremo 3' que excluye la región solapante con el extremo 5' de una ORF 6 correspondiente.

\vskip1.000000\baselineskip

3. La preparación purificada de la reivindicación 2, donde dicha ORF 5 procede de un fenotipo de alta replicación (hr).

4. La preparación purificada de la reivindicación 2, donde \varepsilon es un polinucleótido que codifica una región antigénica de la ORF 6.

5. La preparación purificada de la reivindicación 1, donde dicho ácido polinucleico comprende los nucleótidos 12 a 782 de la SEC ID Nº: 65.

6. Un polipéptido purificado codificado por el ácido polinucleico de la reivindicación 1, 2 ó 5.

7. Una vacuna que comprende una cantidad eficaz del polipéptido de la reivindicación 6 para inducir una respuesta inmunológica en un cerdo contra un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino y un vehículo fisiológicamente aceptable.

8. Una vacuna que comprende una cantidad eficaz del ácido polinucleico de la reivindicación 1 ó 2 para inducir una respuesta inmunológica en un cerdo contra un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino y un vehículo fisiológicamente aceptable.

9. La vacuna de la reivindicación 7 u 8, donde dicho virus produce una enfermedad caracterizada por uno o más de los siguientes síntomas y signos clínicos: insuficiencia respiratoria, fiebre y una afección reproductiva en una cerda seleccionada entre el grupo consistente en abortos, mortinatos, lechones débiles, formación de neumocitos de tipo II, miocarditis, encefalitis, formación de exudados alveolares y formación de sincitios.

10. Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente al polipéptido codificado por el ácido polinucleico de la reivindicación 1.

11. Un kit de diagnóstico para ensayar un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino que comprende el anticuerpo de la reivindicación 10 y un agente de diagnóstico que indica una reacción inmunológica positiva con dicho anticuerpo.

12. El kit de diagnóstico de la reivindicación 11, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal biotinilado y dicho agente de diagnóstico comprende estreptavidina conjugada con peroxidasa y una peroxidasa.

13. El kit de diagnóstico de la reivindicación 12, que comprende además peróxido de hidrógeno acuoso, una proteasa que digiere la muestra de tejido porcino, un colorante fluorescente y un tinte de tejidos.

14. Un método para diagnosticar la infección de un cerdo por o la exposición de una piara de cerdos a un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, renunciando a los métodos de diagnóstico puestos en práctica en el cuerpo del animal, comprendiendo dicho método las etapas de:

incubar el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 10 con una muestra de tejido durante un período de tiempo suficiente y a una temperatura apropiada para proporcionar una unión inmunológica esencialmente completa entre dicho anticuerpo monoclonal y uno o más antígenos virales en dicha muestra de tejido;

incubar un anticuerpo de unión biotinilado con la muestra de tejido tratado con anticuerpo monoclonal;

incubar una estreptavidina conjugada con peroxidasa con el tejido tratado con anticuerpo biotinilado; y

detectar dichos antígenos virales.

15. El método de la reivindicación 14, que comprende además, antes de dichas etapas de incubación, las etapas secuenciales de retirar la peroxidasa endógena de una muestra de tejido porcino aislado con peróxido de hidrógeno acuoso, y digerir dicha muestra de tejido con una cantidad suficiente de una proteasa apropiada para exponer dichos antígenos virales; y después de dicha segunda etapa de incubación, las etapas secuenciales de incubar el tejido tratado con estreptavidina conjugada con peroxidasa con un cromógeno y un tinte, y detectar dichos antígenos virales, con lo que la observación del tejido tratado con cromógeno teñido es indicativa de la presencia de dichos antígenos virales.

16. Un método ex vivo para producir una vacuna que confiere protección inmunológica contra una exposición posterior a un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, comprendiendo dicho método las etapas de infectar una célula hospedadora adecuada con el ácido polinucleico de la reivindicación 1 y cultivar dicha célula hospedadora.

17. El método de la reivindicación 16, que comprende además la etapa de aislar al menos una de dichas células hospedadoras cultivadas y un polipéptido codificado por dicho ácido polinucleico.

18. Un método ex vivo para producir la vacuna de la reivindicación 8, comprendiendo dicho método las etapas de infectar una célula hospedadora adecuada con al menos uno de dichos ácido polinucleico y un virus que contiene dicho ácido polinucleico, cultivar dicha célula hospedadora y aislar dicho ácido polinucleico a partir de dicha célula hospedadora cultivada.

19. El método la reivindicación 18, donde dicha etapa de infección emplea dicho virus, y dicha etapa de aislamiento comprende:

(A): recoger una muestra suficientemente grande de dicho virus para aislar dicho ácido polinucleico,

(B): aislar dicho ácido polinucleico a partir de dicho virus recogido y

(C): combinar dicho ácido polinucleico con dicho vehículo fisiológicamente aceptable.

20. El método la reivindicación 19, donde dicho virus o agente infeccioso se recoge de una fuente seleccionada entre un medio de cultivo, células infectadas con dicho virus y tanto un medio de cultivo como células infectadas con dicho virus.

21. Uso de una preparación de ácido polinucleico de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2 o de un polipéptido de la reivindicación 6 para la fabricación de una vacuna para la protección de un cerdo frente a una infección por un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino.

22. El uso de la reivindicación 21, donde la vacuna es adecuada para la administración oral o parenteral

23. El uso de la reivindicación 21, donde la vacuna se administra por vía intramuscular, intradérmica, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intranasal.