PT776209E

PT776209E - Ácidos polinucleicos e proteínas obtidos a partir do vírus do sindroma reprodutivo e respiratório porcino e utilizações destes ácidos e destas proteínas

Info

Publication number: PT776209E
Application number: PT95932336T
Authority: PT
Inventors: Prem S Paul; Meng Xiang-Jin; Patrick Halbur; Igor Mozorov; Melissa A Lum
Original assignee: Univ Iowa State Res Found Inc; Wyeth Corp
Priority date: 1994-09-01
Filing date: 1995-09-01
Publication date: 2008-11-06
Also published as: US20060029928A1; US20050175633A1; CA2198461A1; EP2042512A2; DK0776209T3; EP2042512A3; WO1996006619A1; US7264957B2; EP0776209A4; ATE402952T1; US6592873B1; CA2198461C; EP0776209B1; US7223854B2; DE69535795D1; EP0776209A1; ES2312167T3

Description

DESCRIÇÃO

ÁCIDOS POLINUCLEICOS E PROTEÍNAS OBTIDOS A PARTIR DO VÍRUS DO SÍNDROMA REPRODUTIVO E RESPIRATÓRIO PORCINO E UTILIZAÇÕES DESTES ÁCIDOS E DESTAS

PROTEÍNAS

Dominio da Invenção A presente invenção tem por objecto o ADN isolado de um virus do sindroma reprodutivo e respiratório porcino (VSDRP) , uma proteína e/ou um polipéptido de um QLA-2 (quadro de leitura aberta, ORF na terminologia inglesa) codificado pela DRA, uma vacina que protege os porcos de um VSDRP, à base da proteína ou do ADN, um processo para a protecção de um porco de um VSDRP utilizando uma vacina, um processo de produção da vacina, um processo para o tratamento de um porco infectado por exposição a um VSDRP e um processo para a detecção de um VSDRP.

Discussão dos antecedentes:

Nos últimos anos, varas de porcos da América do Norte e da Europa têm estado sujeitas a infecções causadas por novas estirpes de vírus reprodutivos e respiratórios (ver A.A.S.P., Setembro/Outubro 1991, pp. 7-11; The Veterinary Record, 1 de Fevereiro de 1992, pp. 87-89; Ibid., Novembro 30, 1991, pp. 495-496; Ibid., Outubro .26, 1991, p. 370;

Ibid., Outubro 19, 1991, pp. 367-368; Ibid., Agosto 3, 1991, pp. 102-103; Ibid., Julho 6, 1991; Ibid., 22 de Junho de 1991, p. 578; Ibid., Junho 15, 1991, p. 574; Ibid.,

Junho 8, 1991, p. 530; Ibid., Junho 1, 1991, p. 511; Ibid., Março 2, 1991, p. 213). Entre as primeiras das novas 1 estirpes a serem identificadas estava um vírus associado com a chamada Doença Misteriosa dos Porcos (DMP) ou "síndroma das orelhas azuis", conhecido agora como Síndroma Respiratório e da Infertilidade dos Porcos (SRIP) ou Síndroma Respiratório e Reprodutivo Porcino (SRRP).

Uma DMP consiste numa insuficiência reprodutiva nas fê-meas e numa doença respiratória em porcos em fase de amamen-tação ou desmamados que apareceu na região' centro-oeste dos Estados Unidos em 1987 (Hill et al., Am. Assoe. Swine Practitioner Newsletter 4 : 47 (1992); Hill et al., Proceedings Mystery Swine Disease Committee Meeting, Denver, Colorado 29-31 (1990); Keffaber, Am. Assoe. Swine Practitioner Newsletter 1: 1-9 (1989); Loula, Agri-Practice 12:23-34 (1991)). A insuficiência reprodutiva foi caracte-rizada por abortos, mortinascimentos e porcos que nasceram debilitados. A doença respiratória em porcos em fase de amamentação ou desmamados foi caracterizada por febre, dificuldade de respiração e pneumonia. Uma doença semelhante apareceu na Europa em 1990 (Paton et al., Vet. Rec. 128: 617 (1991); Wensvoort et al., Veterinary Quarterly 13: 121-130 (1991); Blaha, Proc. Am. Assoe. Swine Practitioners, pp. 313-315 (1993)) e hoje já foi reconhecida em todo o mundo.

Esta doença também tem sido chamada síndroma respiratório e do aborto porcino epidémico (SRAPE), doença do aborto azul, blue ear disease (U.K.), abortus blau (Netherlands), seuchenhafter spatabort der schweine (Alemanha), Heko-Heko disease, nos E.U.A., síndroma de Wabash, doença misteriosa dos porcos (DMP), e praga dos por-cos (ver as referências citadas antes e Meredith, Review of Porcine Reproductive and Respiratory Disease Syndrome, Pig Disease Information Centre, Department of 2

Veterinary Medicine, Madingley Road, Cambridge CB3 OES, U.K. (1992); Wensvoort et al., Vet. Res. 24: 117-124 (1993); Paul et al., J. Clin. Vet. Med. 11: 19-28 (1993)). Na Europa, o vírus correspondente tem sido designado por "vírus de Lelystad."

Numa conferência internacional, em Maio de 1992, investigadores de todo o Mundo concordaram em chamar a esta doença Síndroma Reprodutivo e Respiratório Porcino (SRRP). A doença originalmente parecia ser principalmente uma doença reprodutiva nas suas fases precoces, mas agora evoluiu para uma doença principalmente respiratória. 0 vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (VSRRP) é um agente patogénico reconhecido há relativamente pouco tempo associado ao sindroma reprodutivo e respiratório porcino (SRRP). 0 VSRRP é um agente patogénico significativo na indústria dos suínos. As infecções por VSRRP são comuns nas varas de porcos nos E.U.A. Epidemias de SRRP na Inglaterra têm levado ao cancelamento de feiras de suínos.

Os sintomas de SRRP incluem uma relutância em comer (anorexia) , uma febre não muito alta (pirexia) , cianose da-s extremidades (nomeadamente as orelhas azuladas), mortinas-cimento, aborto, elevada mortalidade nas crias afectadas, debilidades nos ’leitões recém-nascidos e nascimento pré-maturo dos leitões. A maioria dos leitões que nasce vivo de porcas afectadas morre num prazo de 48 horas. Os sinais clínicos do SRRP incluem sinais ligeiros semelhantes à gripe, respiração rápida ("com roncos"), e uma pneumonite intersticial aguda. 0 vírus do SRRP tem um período de incubação de cerca de 1-2 semanas desde o contacto com um animal infectado com o VSRRP. 0 vírus parece ser um 3 arterivirus com um ARN envelopado (The Veterinary Record, Fevereiro 1, 1992). O vírus cresceu com sucesso nos macro-fagos alveolares do porco e em células CL2621 (Benfield et al, J. Vet. Diagn. Invest., 4: 127-133, 1992; Collins et al, Swine Infertility and Respiratory Syndrome/ Mystery Swine Disease. Proc., Minnesota Swine Conference for Veterinarians, pp. 200-205, 1991), e em células MARC-145 (Joo, PRRS: Diagnosis, Proc., Allen D. Leman Swine

Conference, Veterinary Continuing Education and Extension, University of Minnesota (1993), 20: 53-55; Kim et al, Arch. Virol., 133: 477-483 (1993)). Uma cultura de um vírus que causa o SRIP que teve sucesso já foi relatada por Wensvoort et al (Mystery Swine Disease in the Netherlands: The Isolation of Lelystad Vírus. Vet. Quart. 13: 121-130, 1991) .

Inicialmente, implicou-se um certo número de agentes na etiologia desta doença (Wensvoort et al., Vet. Res. 24: 117-124 (1993); Woolen et al., J. Am. Vet. Med. Assoe. 197: 600-601 (1990)). Há hoje em dia um consenso de que o agente causador do SRRP é um vírus com o ARN envelopado referido como o vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (VSRRP), relatado como tendo aproximadamente 62 nm de diâmetro (Benfield et al., J. Vet-. Diagn. Invest., 4: 127-133, 1992) .

Os produtos isolados do vírus variam na sua capacidade para replicar em linhas de células contínuas. Alguns crescem rapidamente, enquanto outros requerem várias passagens e alguns crescem apenas em culturas alveolares de suínos (SAM) (Bautista et al., J. Vet. Diagn. Invest. 5: 163-165, 1993; ver também os exemplos aí citados [particularmente o quadro 1] ) . 4 0 VSRRP é um elemento de um grupo de arterivirus que inclui o virus da arterite equina (VAE), o virus da promoção de lactato-desidrogenase (VLD) e o virus da febre hemorrágica dos srmios (VFHS) (Benfield et al., 1992, supra; Plagemann, Proc. Am. Assoe. Swine Practitioners, 4: 8-15 1992; Plagemann e Moennig, Adv. Virus Res. 41: 99-192, 1992; Conzelmann et al., Virology, 193: 329-339, 1993; Godney et al., Virology, 194: 585-596, 1993; Meulenberg et al., Virology, 192: 62-72, 1993). Os virus do ARN de hélice positive deste grupo de Arterivirus parecem-se morfologicamente com os toga virus, mas têm uma relação muito distante com os corona virus e com os toro virus com base- na organização do genoma e na expressão dos genes (Plagemann et al., supra; Spaan et al., J. Gen. Virol. 69, 2939-2952 (1988); Strauss et al., Annu. Rev. Biochem. 42, 657-683 (1988); Lai, Annu. Rev. Microbiol. 44, 303-333 (1990); Snijder et al., Nucleic Acid Res. 18, 4535-4542 (1990)). Os membros deste grupo infectam macrófagos e contêm um conjunto aninhado de 5 a 7 ARNms (ARN mensageiros) sub-genómicos nas células infectadas (Plagemann et al., supra; Meulenberg et al., Virology, 192, 62-72 (1993); Conzelmann et al., Virology, 193, 329-339 (1993),-15, 16, 17, 18, 19). O genoma virai de produtos isolados europeus mostrou ser um ARN mais enrolado de cerca de 15,1 kb (Conzelmann et al., supra; Meulenberg et al., supra), e parece ser semelhante na sua organização genómica ao VLD e ao VAE (Meulenberg et al. , supra) . Contudo, não se encontraram reacções serológicas cruzadas entre VSRRP, VLD e VAE (Goyal et al., J. Vet. Diagn. Invest., 5, 656-664 (1993)). 0 VSRRP foi inicialmente cultivado em culturas de células em macrófagos alveolares de suinos (MAS) (Pol et al., 5

Veterinary Quarterly, 13: 137-143, 1991; Wensvoort et al., Veterinary Quarterly, 13: 121-130, 1991) e depois nas linhas contínuas de células CL2621 (Benfield et al., supra), MA-104, e MARC-145 (Joo, Proc, Allen D. Leman Swine Conference, pp. 53-55, 1993). A doença reprodutiva e respiratória tem sido reproduzida com filtrados dos pulmões isentos de células (Christianson et al., Am. J. Vet. Res., 53: 485-488, 1992; Collins et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4: 117-126, 1992; Halbur et al., Proc. Central Veterinary Conference, pp. 50-59, 1993), e com VSRRP propagados em culturas de células (Collins et al., supra, e Proc. Allen D. Leman Swine Conference, pp. 47-48, 1993).

Identificaram-se oito quadros de leitura aberta (também referidos aqui como "QLAs" ou "genes") num produto isolado de um VSRRP europeu. Os genes deste produto isolado europeu estão organizados do mesmo modo que no coronavírus (Meulenberg et al., supra). Encontrou-se um conjunto aninhado na extremidade 3' do ARN mensageiro nas células infectadas com VSRRP similar aos dos coronavírus (Conzelmann et al., supra; Meulenberg et al., supra).

Prevê-se que os QLA la e lb na metade 5' do genoma do VSRRP europeu codificam a polimerase do ARN virai. Os QLAs 2-6 na metade 3' do genoma provavelmente codificam para as proteínas associadas (envelopadas) à membrana virai (Meulenberg et al., supra). É previsível que o . QLA6 codifique a proteína da membrana (M) com base nas suas características similares ao QLA 6 de VAE, QLA 2 de VLD, e a proteína M do vírus da hepatite de rato e o. vírus da bronquite infecciosa (Meulenberg et al., Virology 192, 62-72 (1993); Conzelmann et al., Virology 193, 329-339 (1993); Murtaugh, Proc. Allen D. Leman Swine Conference, Minneapolis, MN, pp. 43-45 (1993); Mardassi et al.·, 6

Abstracts of Conference of Research Workers in Animal Diseases, Chicago, IL, pp. 43 (1993)). O produto do QLA 7 é extremamente básico e hidrofilico, e é previsível que seja uma proteína virai da cápside do núcleo (N) (Meulenberg et al., supra; Conzelmann et al., supra; Murtaugh, supra; Mardassi et al., supra e J. Gen. Virol., 75: 681-685 (1994) ) .

Embora se tenham observado epítopos conservados entre os produtos isolados de VSRRP nos EUA e na Europa utilizando anticorpos monoclonais (Nelson et al., J. Clin. Microbiol., 31: 3184-3189, 1993), há uma enorme variação antigénica e genética entre ambos os produtos isolados de VSRRP nos EUA (Wensvoort et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4: 134-138, 1992). Os produtos isolados europeus estão geneticamente fortemente relacionados, dado que a sequência de nucleótidos na metade 3' do genoma dos dois produtos isolados dos VSRRP europeus é quase idêntica (Conzelmann et al., supra; Meulenberg et al., supra).

Embora o síndroma causado pelo VSRRP pareça ser similar nos E.U.A e na Europa, vários estudos recentes têm descrito variações fenotípicas, antigénicas, genéticas e patogénicas entre os produtos isolados de VSRRP nos E.U.A e na Europa (Murtaugh, supra; Bautista et al., J. Vet. Diagn. Invest., 5, 163-165 (1993); Bautista et al., J. Vet. Diagn. Invest., 5, 612-614 (1993); Wensvoort et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4, 134-138 (1992); Stevenson et al., J. Vet. Diagn. Invest., 5, 432-434 (1993)). Por exemplo, os produtos isolados europeus crescem preferencialmente em culturas de MAS e replicam com um título muito baixo noutros sistemas de culturas (Wensvoort, Vet. Res., 24, 117-124 (1993); Wensvoort et al., J. Vet. Quart., 13, 121-130 (1991); Wensvoor et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4, 7 134-138 (1992)). Por outro lado, alguns produtos isolados dos E.U.A. têm mostrado que se replicam bem tal como nas linhas continuas de células CL2621 (Bonfield et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4, 127-133 (1992); Collins et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4, 117-126 (1992)). Assim, observam-se diferenças fenotipicas entre os produtos isolados dos E.U.A., dado que nem todos os produtos isolados de VSRRP isolados nos MAS podem replicar nas linhas de células CL2621 (Bautista et al., J. Vet. Diagn. Invest., 5, 163-165 (1993)).

Pode existir um elevado grau de variações antigénicas regionais entre os produtos isolados de VSRRP. Verificou-se que quatro produtos isolados europeus estavam muito relacionados antigenicamente, mas estes produtos isolados europeus diferem antigenicamente dos produtos isolados dos E.U.A.. Além disso, três produtos isolados dos E.U.A. mostraram diferir antigenicamente uns dos outros (Wensvoort et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4, 134-138 (1992)). Verificou-se que animais seropositivos para os produtos isolados europeus eram negativos para os produtos isolados dos E.U.A. VR 2332 (Bautista et al. J. Vet. Diagn. Invest., 5, 612-614 (1993)).

As sequências dos produtos isolados europeus de VSRRP foram descritas, por exemplo, nos pedidos de patentes inter-nacionais W092/21375 (estirpe Lelystad) e WO95/31550 (isolado espanhol SRRP-Olot). As sequências dos produtos isolados de VSRRP dos E.U.A. foram descritas no pedido de patente europeia EP 0 595 436 (QLAs 5-7 de ISU-12) e no pedido de patente internacional W096/04010 (VR 2332) .

Os produtos isolados de VSRRP dos E.U.A. diferem geneticamente pelo menos em parte dos produtos isolados 8 europeus (Conzelmann et al., supra; Meulenberg et al. , supra; Murtaugh et al., Proc. Allen D. Leman Conference, pp. 43-45, 1993). As diferenças genéticas entre os produtos isolados dos E.U.A. e da Europa U.S. são impressionantes, especialmente desde que se consideraram que são o mesmo virus (Murtaugh, supra). Observações similares foram também relatadas quando se compara o produto isolado canadiano IAF-exp91 e outro isolado dos E.U.A. VR 2332 com LV (Murtaugh; supra; Mardassi, supra). Contudo, as sequências de nucelótidos de 5 kb de terminal 3' dos dois produtos isolados europeus são quase idênticas (Conzelmann et al., supra; Meulenberg et al., supra).

Também tem sido sugerida a existência de estirpes apa-togénicas ou com baixa patogenicidade entre os produtos isolados (Stevenson, supra). Assim, estes estudos sugerem que os produtos isolados de VSRRP na América do Norte e na Europa são antigenicamente e geneticamente heterogéneas, e que existem diferentes genotipos ou serotipos de VSRRP. Contudo, antes da presente invenção, o papel da variação antigénica e genética na patogénese de VSRRP não estava inteiramente claro. A ocorrência do SRRP nos E.U.A. afectou adversamente a indústria pecuária dos suinos. Quase metade das varas de suínos nos estados com produção de suínos nos E.U.A. é seropositiva para o VSRRP (Animal Pharm., 264: 11 (11/11/92)). No Canadá, o SRRP tem sido caracterizado por anorexia e pirexia em porcas que duram até 2 semanas, abortos de fim de termo, aumento das taxas de morti-nascimento, porcos que nascem debilitados e mortes neona-tais precedidas de uma respiração abdominal rápida e de diarreia. Os trabalhos sobre o isolamento do vírus que causa o SRRP, sobre o processo de diagnóstico de uma 9 infecção do SRRP e sobre o desenvolvimento de uma vacina contra o virus do SRRP têm sido publicados (ver publicação da patente canadiana No. 2.076.744; publicação da patente internacional PCT No. WO 93/03760; publicação da patente internacional PCT No. WO 93/06211; e publicação da patente internacional PCT No. WO 93/07898). Há também uma variabilidade na virulência de VSRRP nas varas. Recentemente, tem ocorrido uma forma mais virulenta de SRRP com incidência crescente em porcos com 3-8 semanas de idade na região centro-oeste dos Estados Unidos. Normalmente, porcos saudáveis com 3-5 semanas de idade são desmamados e ficam doentes 5-7 dias mais tarde. Os processos de rotina para a identificação de virus nos tecidos dos porcos afectados têm mostrado que o virus da gripe em suinos (VGS), virus da pseudoraiva (VPR), e Mycoplasma hyopneumoniae não estão associados a esta nova forma de SRRP. Originalmente designada por pneumonia intersticial proliferativa (PIP; ver o pedido de patente norte-americana U.S. da série No. 07/969.071), esta doença tem sido ligada, muito recentemente, ao SRRP, e o virus tem sido designado informalmente por "estirpe de Iowa" de VSRRP (ver o pedido de patente U.S. da série No. 08/131.625).

Tem sido expresso pessimismo e cepticismo na técnica no que respeita ao desenvolvimento de vacinas eficazes contra estes virus porcinos (The Veterinary Record, Outubro 26, 1991). Crê-se que a vacina para a gripe humana pode dar alguma protecção contra os efeitos do SRRP e PNP (The Veterinary Record, 6 de Julho de 1991).

As proteínas de envelope virai são conhecidas por serem altamente variáveis em muitos coronavirus, tal como um vírus da peritonite infecciosa de felinos e o vírus da 10 hepatite de ratos (Dalziel et al: Site-specific alteration of murine hepatitis virus type 4 peplomer glycoprotein E2 results in reduced neurovirulencea. J. Virol., 59: 464-471 (1986); Fleming et al: Pathogenicity of antigenic variants of murine coronavirus JHM selected with monoclonal antibodies. J. Virol·., 58: 869-875 (1986); Fiscus et al: Antigenic comparison of the feline coronavirus isolates; Evidence for markedly different peplomer glycoproteins. J. Virol., 61: 2607-2613 (1987); Parker et al: Sequence analysis reveals extensive polymorphism and evidence of deletions within the E2 glycoprotein gene of several strains of murine hepatitis virus. Virology, 173: 664-673 (1989)).

Por exemplo, a eliminação ou uma mutação na principal proteina de envelope no coronavirus pode alterar o tropismo do tecido e a patogenicidade in vivo. Uma mutação num mutante resistente a anticorpo monoclonal de MHV resultou na perda da sua neurovirulência para o rato (Fleming et al, 1986 supra). Crê-se que o coronavirus respiratório porcino (CVRP) seja um mutante de eliminação do virus transmissível da gastroenterite (VTGE) em porcos. A eliminação no genoma do CVRP pode ser na extremidade 5' do gene em espicula (S) do VTGE (Halbur et al, An overview of porcine virai respiratory disease. Proc. Central Veterinary Conference, pp. 50-59 (1993); Laude et al, Porcine respiratory coronavirus: Molecular features and virus-host interactions. Vet. Res., 24: 125-150 (1993); Vaughn et al, Isolation and characterization of three porcine respiratory coronavirus isolates with varying sizes of deletions. J. Clin. Micro., 32: 1809-1812 (1994). O CVRP tem um tropismo selectivo para o tracto respiratório e não se replica no tracto gastrointestinal 11 (Rasschaert et al, Porcine respiratory coronavirus differs from transmissible gastroenteritis virus by a few genomic deletions. J. Gen. Virol., 71: 2599-2607 (1990); Laude et al, 1993 supra) . Pelo contrário, o VTGE tem um tropismo tanto pata o tracto respiratório como para o tracto gastroin-testinal (Laude et al, 1993 supra). A variação na afinidade antigénica e genética entre os produtos isolados do VLD, de patogenicidade variável, é também conhecida (Kuo et al, Lactate-dehydrogenase-elevating virus (VLD): subgenomic mRNAs, mRNA leader and comparison of 3'-terminal sequences of two LDV isolates. Virus Res., 23: 55-12 (1992); Plagemann, LDV, EAV, and SHFV: A new grupo of positive stranded RNA virus. Proc. Am. Assoe. Skine Practitioners, 4: 8-15 (1992); Chen et al, Sequences of 3' end of genome and of 5' end of open reading frame a of lactate dehydrogenase-elevating virus and common junction motifs between 5' leader and bodies of seven subgenomic mARNs. J. Gen. Virol., 74: 643-660 (1993)).

Contudo, a presente memória descritiva dá uma primeira visão sobre as relações entre os quadros de leitura aberta do genoma do VSRRP e os seus correspondentes efeitos na virulência e na replicação.

Além disso, um diagnóstico do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (SRRP) baseia-se na compilação da informação a partir da história clínica da vara, da sero-logia, da patologia, e, em última análise, no isolamento do vírus do SRRP (VSRRP) . No ano passado publicaram-se três excelentes referências de revisão do diagnóstico do (Van Alstine et al, "Diagnosis of porcine reprodutive and respiratory syndrome," Swine Health and Production, Vol. 1, No. 4 (1993), p. 24-28; Christianson et al, "Porcine 12

Swine reprodutive and respiratory syndrome: A review.

Health and Production, Vol. 1, No. 2 (1994), pp. 10-28 e Goyal, "Porcine reprodutive and respiratory syndrome," J. Vet. Diagn. Invest. 5: 656-664 (1993)). Verificou-se também recentemente que o VSRRP replica nos macrófagos alveolares pulmonares por imuno-histoquimica de colóides de ouro (Magar et al (1993): Immunohistochemical detection of porcine reprodutive and respiratory syndrome virus using colloidal gold. Can. J. Vet. Res., 57: 300-304).

Os sinais clínicos variam amplamente entre as diferentes propriedades agrícolas e por isso não são a evidência mais fiável para um diagnóstico definitivo, excepto no caso de uma epidemia severa aguda em varas de animais jovens que experimentam distúrbios de abortos, um aumento do número de porcos com mortinascimento, e severas pneumonias neonatais e de porcos muito jovens. Presentemente, a apresentação clínica mais comum é a pneumonia e vários problemas bacterianos em porcos com 3-10 semanas de idade. Contudo, muitas varas positivas em relação ao VSRRP aparentemente não têm problemas reprodutivos nem respiratórios.

Algumas varas evidenciam uma insuficiência reprodutiva devastadora, caracterizada por abortos no terceiro trimestre, porcos com mortinascimento e porcos que nascem debilitados. Muitas destas varas também experimentaram várias doenças respiratórias neonatais. A doença respiratória induzida pelo VSRRP em porcos com 4-10 semanas de idade é também comum e pode ser bastante severa (Halbur et al, Virai contributions to the porcine respiratory disease complex. Proc. Am. Assoe. Swine Pract. (1993), pp. 343-350) . As epidemias clínicas provocadas por VSRRP são fre-quentemente seguidas de pneumonia bacteriana, septicémia, 13 ou enterite. Assim, tem sido difícil obter um diagnóstico fiável e rápido de uma forma aceitável da infecção por VSRRP, antes da presente invenção. A indústria da exploração pecuária de suínos tem sido t e continuará a ser afectada adversamente por estas doenças reprodutivas e respiratórias de suínos e as suas novas variantes, à medida que elas aparecem. 0 VSRRP é um agente patogénico dos suínos que causa perdas económicas por via das doenças reprodutivas e respiratórias. As perdas económicas por SRRP ocorrem da perda de porcos por causa dos abortos, porcos com mortinascimento, repetição da criação, mortalidade pré-desmame e post-desmame, reduzida eficiência na conversão da alimentação, aumento do custo dos fármacos e da mão-de-obra o que tem sido estimado num custo aproximado de $236 por porca para além da perda de lucros (Poison et al., Financial implications of mystery swine disease (MSD), Proc. Mystery Swine Doença Committee Meeting, Denver, Co., 1990, pp. 8-28). Isto representa uma perda de $23.600 para uma vara de 100 porcas ou $236,000 para uma vara de 1000 porcas. O VSRRP causa perdas adicionais resultantes da pneumonia em porcos recém-nascidos. Contudo, as perdas económicas causadas pelas pneumonias associadas ao VSRRP não são conhecidas. O VSRRP é uma causa importante de pneumonia em porcos recém-nascidos ou desmamados. A doença reprodutiva foi o resultado clínico predominante das infecções por VSRRP durante os últimos anos. A doença respiratória tornou-se agora o principal problema associado ao VSRRP.

Surpreendentemente, o mercado para as vacinas de animais nos E.U.A e em todo o mundo é maior do que o 14 mercado das vacinas humanas. Assim, existe um incentivo económico para desenvolver novas vacinas veterinárias, para além dum beneficio substancial para a saúde pública que deriva da protecção de animais de explorações pecuárias em relação à doença.

Descrição da invenção

De acordo com isto, um dos objectos da presente invenção consiste em providenciar um ácido polinucleico isolado a partir do virus reprodutivo e respiratória porcino (VSRRP), contendo QLA-2 de um qualquer dos virus VR2385 (ISU-12) , VR 2429 (ISU-22), VR 2431 (ISU-3927), VR2474 (ISU-79) e VR2475 (ISU-1894) e das suas combinações.

Constitui um outro objecto da presente invenção providenciar um ácido polinucleico isolado que codifica uma proteína do VSRRP, codificado por QLA-2.

Constitui um outro objecto da presente invenção providenciar uma proteína de VSRRP, quer isolada a partir de um VSRRP ou codificada por um ácido polinucleico, codificado por QLA-2.

Constitui ainda um outro objecto da presente invenção providenciar uma vacina à base de uma proteína ou de um ácido polinucleico que protege um porco contra SRRP.

Constitui ainda um outro objecto da presente invenção providenciar um processo para provocar uma resposta imunológica efectiva contra o VSRRP utilizando a vacina.

Constitui ainda um outro objecto da presente invenção providenciar um processo para a de produção de uma vacina à 15 base de uma proteína ou de um ácido polinucleico que protege um porco contra uma infecção por VSRRP.

Constitui ainda um outro objecto da presente invenção providenciar a utilização de ácidos polinucleicos ou proteínas da presente invenção no fabrico de uma vacina para o tratamento de um porco infectado por VSRRP ou por exposição ao vírus.

Constitui ainda um outro objecto da presente invenção providenciar um processo para detectar o VSRRP.

Constitui ainda um outro objecto da presente invenção providenciar um ensaio de diagnóstico com imunoperoxidase para a detecção de um antigénio de VSRRP em tecidos porcinos.

Constitui ainda um outro objecto da presente invenção providenciar um anticorpo que se liga imunologicamente a uma proteína de VSRRP proteína ou a uma região antigénica dessa proteína.

Constitui ainda um outro objecto da presente invenção providenciar um anticorpo que se liga imunologicamente a uma vacina à base de proteína ou de ácido polinucleico que protege um porco contra um VSRRP.

Constitui ainda um outro objecto da presente invenção providenciar um processo de diagnóstico e um kit para analisar um VSRRP.

Constitui ainda um outro objecto da presente invenção providenciar os objectos anteriores, em que o vírus do SRRP é a estirpe de Iowa do VSRRP. 16

Estes e outros objectos, que se tornarão evidentes na descrição que se segue dos enquadramentos preferidos, são providenciados por pelo menos um polipéptido purificado seleccionado no grupo que consiste em proteínas codificadas por um ou mais quadros de leitura aberta (QLA) 2, QLA 3, QLA 4 e QLA 5 de uma estirpe de Iowa do VSRRP, regiões antigénicas das referidas proteínas que têm pelo menos 5 aminoácidos de comprimento e que estimula efectivamente a protecção imunológica num hospedeiro porcino contra um reforço subsequente com um produto isolado de VSRRP, e as suas combinações; um ácido polinucleico isolado que codifica esse polipéptido ou esses polipéptidos; uma vacina que compreende uma quantidade efectiva desse polinucleótido ou desses polipéptido(s); anticorpos que se ligam especifi-camente a um desses polinucleótidos ou polipéptidos; processos para a respectiva produção; e utilização dos polipéptidos anteriores para provocar uma resposta imunológica efectiva contra um VSRRP, fabrico de uma vacina para o tratamento de porco exposto ou infectado por um VSRRP, e a detecção de um VSRRP.

Breve descrição dos desenhos A figura 1 representa um diagrama de fluxo que sublinha um processo para a produção de uma sub-unidade de vacinas; A figura 2 representa um diagrama de fluxo que sublinha um processo para a produção de uma vacina tratada por engenharia genética; A figura 3 mostra um processo esquemático geral para a construção de uma biblioteca de ADNc λ tal como descrito pelo fabricante (Stratagene); A figura 4 mostra um processo esquemático geral para a identificação de clones autênticos dos produtos 17 isolados do virus do SRRP ISU-12 (VR 2385) por hibridação diferencial (modificado a partir de "Recombinant ADN," 2a ed., Watson, J.D., et al., eds. (1992), p. 110); A figura 5 é uma análise de mancha (Northern blot) que mostra as espécies de ARNm sub-genómico VR 2385, desnaturadas com glioxal 6 M e DMSO e separou-se num gel de agarose a 1,5 % 1; A figura 6 mostra os clones λ de ADNc utilizados para obter a sequência de nucleótidos de terminal 3' de VR 2385; A figura 7 mostra a sequência de terminal 3' de 2062 pb (SEQ ID NO:13) e as sequências de aminoácidos codificadas pelos QLA's 5, 6 e 7 (SEQ ID NOS: 15, 17 e 19, respectivamente) de VR 2385; A figura 8 compara as regiões do QLA-5 dos genomas de VR 2385 e do virus de Lelystad; A figura 9 compara as regiões do QLA-6 dos genomas de VR 2385 e do virus de Lelystad; A figura 10 compara as regiões do QLA-7 dos genomas de VR 2385 e do virus de Lelystad; A figura 11 compara as regiões não translacionais de 3' dos genomas de VR 2385 e do virus de Lelystad; A figura 12 mostra os efeitos citopáticos em células HI-FIVE infectadas com um baculovirus recombinante contendo o gene do QLA-7 de VR 2385 (Báculo.VSRRP.7); A figura 13 mostra as células de HI-FIVE infectadas com um baculovirus recombinante contendo o gene do QLA-6 de VR 2385, corado com anti-soros de suínos para VR 2385, seguido de IgG anti-suínos conjugado com fluoresceína; A figura 14 mostra células de HI-FIVE infectadas com um baculovirus recombinante contendo o gene do QLA-7 de VR 2385, respectivamente, corado com anti-soros de suínos 18 para VR 2385, seguido de IgG anti-suinos conjugado com fluoresceina; A figura 15 mostra uma banda com a dimensão esperada para um produto de QLA-β de VR 2385, detectado por uma técnica de radioimunoprecipitação (ver a Experiência II(B) a seguir); A figura 16 mostra uma banda com a dimensão esperada para um produto de QLA-7 de VR 2385, detectado por uma técnica de radioimunoprecipitação (ver a Experiência II(B) a seguir); A figura 17 compara as sequências de nucleótidos de QLA 6 e de QLA 7 de seis produtos isolados do VSRRP dos E.U.A. e de LV, em que se mostra primeiro a sequência de nculeótidos VR 2385, e nas sequências subsequentes, apenas se indicam os nucleótidos que são diferentes;

As figuras 18 (A)-(B) mostram o alinhamento das sequências de aminoácidos da putativos genes M (Fig. 18 (A) ) e N (Fig. 18 (B)) do grupo de arterivirus propostos, realizado com um programa GENEWORKS (IntelliGenetics, Inc.);

As figuras 19 (A)-(B) mostram árvores filogenéticas à base das sequências de aminoácidos dos putativos genes M (Fig. 19(A)) e N (Fig. 19(B)) para o grupo de arterivirus proposto.; A figura 20 mostra a sequência de nucleótidos de uma região do genoma de produtos isolados de VSRRP VR 2385 contendo QLA’s 2, 3 e 4;

As figuras 21(A)- (C) comparam as sequências de nucleótidos de.QLA 2, QLA 3 e QLA 4 de VR 2385 de VSRRP com os correspondentes QLA's do virus de Lelystad (VL); As figuras 22(A)-(C) mostram alinhamentos das previstas sequências de aminoácidos codificadas pelos QLA's 2, 3 e 4 de VR 2385 and VL de VSRRP; 19 A figura 23 mostra a coloração imuno-histoquimica de uma amostra de um tecido do pulmão colhido de um porco infectado 9 dias antes com VSRRP, em que se observa a coloração ABC positiva com um contra-corante de hematoxilina resultante do citoplasma de macrófagos e células dispersas em espaços alveolares; A figura 24 mostra uma coloração imuno-histoquimica de uma amostra de um tecido do pulmão recolhida de um porco infectado 4 dias antes com VSRRP, em que se demonstra a coloração ABC positiva com um contra-corante de hematoxilina resultante de fragmentos celulares no espaço interior das vias respiratórias terminais; A figura 25 mostra um coração de um porco infectado 9 dias antes com VSRRP, em que a coloração positiva é demonstrada dentro das células endoteliais (seta) e dos macrófagos isolados por meio do presente processo do complexo de estreptavidina-biotina (com o contra-corante de hematoxilina); a barra indica um comprimento de 21 microns; A figura 26 mostra uma amígdala de um porco infectado 9 dias antes com VSRRP, em que se demonstram as células coradas positivamente (cabeças das setas) dentro dos folículos e no epitélio da cripta pelo presente processo do complexo de estreptavidina-biotina (com o contra-corante de hematoxilina); a barra indica um comprimento de 86 microns; A figura 27 mostra um nódulo linfático de um porco infectado 9 dias antes com VSRRP, em que se demonstra a coloração positiva dentro de folículos por. meio do presente processo do complexo de estreptavidina-biotina (com o contra-corante de hematoxilina); e as células positivas (setas) parecem macrófagos ou células dendrí-ticas; a barra indica um comprimento de 21 microns; 20

As figuras 28(A)-(C) são fotomicrografias de pulmões de porcos inoculados com um fluido da cultura (A) cultura de uma linha de células não infectadas, com um fluido da cultura (B) de uma linha de células infectadas com um produto isolado de VSRRP de baixa virulência (os pulmões mostram lesões de SRRP do tipo A) , e com um fluido da cultura (C) de uma linha de células infectadas com um produto isolado de VSRRP de alta virulência (os pulmões mostram lesões de SRRP do tipo B);

As figuras 29(A)—(B) ilustram a coloração imuno-histoquímica de um anticorpo monoclonal anti-VSRRP de um pulmão de um porco infectado 9 dias antes com VSRRP; e

As figuras 30(A)-(B) mostram análises de manchas (Northern blots) de produtos .isolados de VSRRP VR 2385pp (designado como "12"), VR 2429 (ISU-22, designado como "22"), VR 2430, designado como "55"), ISU-79 (designado como "79"), ISU-1894 (designado como "1894"), e VR 2431, designado como "3927") .

Melhor prática para a realização da presente invenção-

Na presente invenção, um "vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino" ou "VSRRP" refere-se a um vírus que causa as doenças SRRP, SRAPE, SRIP, MSD e/ou .PIP (o termo "PIP" agora parece estar desfavorecido), incluindo a estirpe de Iowa de VSRRP, outras estirpes de VSRRP encontrados nos Estados Unidos (por exemplo, VR 2332), estirpes de VSRRP encontradas no Canadá (por exemplo, IAF-exp91), estirpes de VSRRP encontrados na Europa (por exemplo, vírus de Lelystad, VSRRP-10), e variantes 21 fortemente relacionadas destes virus que possam ter aparecido e que aparecerão no futuro. A presente vacina é efectiva se protege um porco contra uma infecção provocada por um virus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (VSRRP). Uma vacina protege um porco contra a infecção por um VSRRP se, depois da administração da vacina a um ou mais porcos não afectados, um reforço subsequente com um produto isolado de um vírus puro sob o ponto de vista biológico (por exemplo, VR 2385, VR 2386, ou outros produtos isolados de vírus descritos a seguir) resulta numa diminuição da severidade de quaisquer alterações significativas ou histopatológicas (por exemplo, lesões no pulmão) e/ou de sintomas da doença, quando comparadas com as alterações ou sintomas normalmente causados pelo produto isolado em porcos similares que não estejam protegidos (isto é, relativa a um controlo apropriado). Mais particularmente, a presente vacina pode mostrar-se efectiva por meio da administração da vacina a um ou mais porcos apropriados que dela precisam, depois após um período de tempo apropriado (por exemplo, 1-4 semanas), reforçando com uma amostra grande (103-7 TCID50) de um produto isolado de VSRRP puro sob o ponto de vista biológico. Retira-se então uma amostra de sangue do porco que recebeu o reforço passada cerca 'de uma semana, e realiza-se então uma tentativa para isolar o vírus da amostra de sangue (por exemplo, ver o processo de isolamento do vírus exemplificado na Experiência VIII a seguir). O isolamento do vírus é uma indicação que a vacina pode não ser efectiva, e a falha no isolamento do vírus é uma indicação que a vacina pode ser eficaz.

Assim, a eficácia da presente vacina pode ser avaliada quantitativamente (isto é, uma diminuição da percentagem do 22 tecido de pulmão consolidado quando comparada com um grupo de controlo apropriado) ou qualitativamente (por exemplo, o isolamento de VSRRP do sangue, detecção do antigénio do VSRRP num pulmão, amostra de tecido de amígdala ou nódulo linfático por um processo de ensaio com imunoperoxidase [descrito a seguir], etc.). Os sintomas da doença reprodutiva e respiratória porcina podem ser avaliados quantitativamente, (por exemplo, temperatura/febre), semi-quantitativamente (por exemplo, severidade de dificuldades respiratórias [explicadas em detalhe a seguir], ou qualitativamente (por exemplo, a presença ou a ausência de um ou mais sintomas ou uma redução na severidade de um ou mais sintomas, tal como cianose, pneumonia, lesões do coração e/ou do cérebro, etc.).

Um porco não afectado é um porco que ou esteve exposto ou que não esteve exposto a um agente infeccioso da doença reprodutiva e respiratória porcina ou que foi exposto a um agente infeccioso da doença reprodutiva e respiratória porcina mas não exibe sintomas da doença. Um porco afectado é um animal que exibe sintomas de SRRP ou dos quais se pode isolar VSRRP.

Os sinais clínicos ou sintomas de SRRP podem incluir letargia, insuficiência respiratória, "roncos" (expiração forçada), febres, pêlos eriçados, espirros, tosse, edema dos olhos e, ocasionalmente conjuntivites. As lesões podem incluir lesões pulmonares grandes e/ou microscópicas lesões, miocardite, linfadenite, encefalite e rinite. 0 agente infeccioso pode ser um simples vírus, ou pode ser combinado com. um ou mais agentes infecciosos adicionais (por exemplo, outros vírus ou bactérias). Além disso, encontraram-se formas menos virulentas e não virulentas do VSRRP e da estirpe de Iowa, que podem causar quer um 23 subconjunto dos sintomas anteriores ou não causar sintomas nenhuns. Apesar de tudo, as formas menos virulentas e não virulentas do VSRRP podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção para dar protecção contra doenças reprodutivas e respiratórias porcinas.

As lesões histológicas nas várias doenças dos suinos são diferentes. 0 quadro I a seguir compara observações fisiológicas e a patologia das lesões associadas com um certo número de doenças causadas pelos virus porcinos:

QUADRO I

Patologia comparativa da pneumonia virai de suinos Lesão SRRP(P) SRRP(o) VGS PNP CVRP PPMV Iowa Tipo II + + + + + + + + ++ ++ ++++ Espessamento inter. ++++ + + + + + ++ + Exsudado alveolar + + + + + + + + + + + + +++ Necrose das vias aéreas - — + + + + + + + + + + + + Sincitia - ++ +1- + + + +++ Encefalite + +++ - - - ++ + Miocardite +1- ++ “ “ - +++ em que "SRRP (p)." representa a patologia publicada do virus SRRP, "SRRP(o)" representa a patologia do virus SRRP observada pelos requerentes, "GVS" representa o virus A da gripe de suinos, "CVRP" representa coronavírus respiratório porcino, "PPMV" representa a paramixovírus porcino, "Iowa" refere-se à. estirpe de VSRRP descoberta pelos requerentes, "Tipo II" refere-se a pmneumócitos do tipo II (que prolifera em porcos infectados), "Inter." Refere-se a infiltração do septo intersticial por células mono-nucleares, "necrose das vias aéreas" refere-se à necrose nas vias aéreas terminais, e os símbolos (-) e ( + ) até 24 (++++) referem-se a uma escala de severidade comparativa como se segue: (-): negativo (não observado) (+): ligeiro (logo acima do limiar de observação) (++): moderado (+++): severo (++++): o mais severo

Um "vírus reprodutivo e respiratório porcino" ou "VSRRP" causa uma doença reprodutiva e respiratória porcina definida por um ou mais sinais clínicos, sintomas, lesões e histopatologia conforme se descreveu antes, e é caracterizado como sendo um arterivírus de ARN envelopado, com uma dimensão desde 50 a 80 nm de diâmetro e de 250 a 400 nm de comprimento. "As estirpes norte-americanas de VSRRP" referem-se às estirpes de VSRRP que são originárias da América do Norte, "as estirpes de VSRRP dos E.U.A." referem-se às estirpes de VSRRP originárias da América do Norte, e "as estirpes de VSRRP europeias" referem-se a estirpes originárias da Europa, tal como o vírus de Lelystad (depositado pelo CDI [Lelystad, Holanda] no depositário no Institut Pasteur, Paris, França, com o número de depósito 1-1102; ver a publicação do pedido de patente internacional No. WO 92/21375, publicada em 10 de Dezembro de 1992). A "estirpe de Iowa" de VSRRP refere-se (a) às estirpes de VSRRP isoladas pelos requerentes, (b) às estirpes com pelo menos 97 % de identidade da sequência (ou homologia) no sétimo quadro de leitura aberta (QLA 7) com pelo menos um de VR 2385, VR 2430 e VR 2431; (c) às estirpes que, após 25 não mais do que 5 passagens, crescem até a um título de pelo menos 104 TCID50 em células CRL 11171, células MA-104 ou células PSP-36 células, (d) às estirpes com pelo menos 80 % e preferencialmente pelo menos 90 % de homologia com um ou mais QLA's 2-5 de VR 2385, e (e) às estirpes que causam uma maior percentagem de consolidação do tecido do pulmão do que o virus de Lelystad (por exemplo, 10 dias após a infecção, exibindo os porcos infectados pelo menos 20 % e preferencialmente pelo menos 40 % da consolidação do pulmão). Preferencialmente, a estirpe de Iowa de VSRRP é caracterizada por pelo menos duas das características (a)-(e) a anteriores. A presente invenção diz respeito, principalmente, aos ácidos polinucleicos (segmentos de ARN genómico e/ou ADN, ARNm, ADNc, etc.) isolados dos correspondentes vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (VSRRP), proteínas codificadas pelo ADN, processos de produção dos ácidos polinucleicos e proteínas, vacinas que protegem porcos de um VSRRP, um processo de protecção de um porco do VSRRP utilizando a vacina, um processo de produção da vacina, uma utilização da vacina no fabrico de um medicamento para o tratamento de um porco infectado por exposição a· um VSRRP, e um processo de detecção de um VSRRP. Mais particularmente, a presente invenção tem por objecto uma vacina que protege os porcos from das estirpes norte-americanas de VSRRP, um processo de produção e de administração da vacina, e de ácidos polinucleicos e proteínas obtidas de uma estirpe de Iowa de VSRRP. Contudo, crê-se que a informação recolhida no decurso do desenvolvimento da presente invenção será útil no desenvolvimento de vacinas e processos de protecção de porcos contra qualquer uma das estirpes de sindroma reprodutivo e respiratório porcino. Por isso, a presente invenção não 26 está necessariamente limitada a ácidos polinucleicos, proteínas, vacinas e processos relacionados com a estirpe de Iowa do vírus de SRRP vírus (VSRRP). A frase "ácido polinucleico" refere-se ao ARN ou ao ADN, assim como aos ARNm e ADNc correspondentes ou complementares do ARN ou do ADN isolados do vírus ou do agente infeccioso. Um "QLA" refere-se a um quadro de leitura aberta, ou um segmento que codifica um polipéptido, isolado de um genoma virai, incluindo' o genoma de VSRRP genoma. No presente ácido polinucleico polinucleico, pode-se incluir um QLA em parte (como um fragmento) ou na totalidade e pode sobrepor-se com a sequência de 5' ou de 3' de um QLA adjacente (ver figs. 7 e 21, e as experiências I e IV a seguir. Um "polinucleótido" é equivalente a um ácido polinucleico, mas pode definir uma molécula distinta ou um grupo de moléculas (por exemplo, como um subgrupo de ácidos polinucleicos).

Em referência agora às figuras 1-2, dão-se os diagramas de fluxo dos processos para a preparação de vários tipos de vacinas englobadas pela presente invenção. Os diagramas de fluxo das figuras 1-2 são dadas como exemplos dos processos de produção das vacinas da presente invenção, e não pretendem, de nenhum modo, limitar a presente invenção. A primeira etapa em cada processo detalhado nas figuras 1-2 consiste em identificar uma linha de células susceptível a infecção com um vírus reprodutivo e respiratório porcino ou um agente infeccioso. (Para simplificar a discussão no que respeita à preparação da vacina, o termo "vírus" refere-se a um vírus e/ou a outro agente infeccioso associado à doença reprodutiva e 27 respiratória porcina.) Prepara-se então um stock de células-mães (SCM) (em inglês master cell stock - MCS) da célula do hospedeiro sensível. As células do hospedeiro sensível continuam a ser passadas pelas SCM. 0 stock de células de trabalho (SCT) prepara-se a partir das passagens de células entre SCM e SCM+n.

Faz-se a propagação de um vírus semente principal na linha de célula do hospedeiro sensível, entre SCM e SCM+n, preferencialmente no SCT. Isola-se o vírus que constitui a matéria-prima por processos conhecidos na técnica a partir de amostras de tecido apropriadas, preferencialmente homogeneizadas, colhidas de porcos infectados que exibem sintomas da doença que correspondem aos causados pelo vírus que interessa. Infecta-se uma célula de hospedeiro apropriada, preferencialmente uma amostra do SCT, com o vírus que constitui a matéria-prima,, e depois faz-se uma cultura. Em seguida isola-se o vírus da vacina e purifica-se numa placa a partir de células de hospedeiro apropriadas em cultura, infectadas por processos conhecidos na técnica. Preferencialmente, o vírus que se utilize para preparar a vacina é purificado em placa três vezes.

Prepara-se então o vírus-matriz que serve de semente (VMS) a partir do vírus purificado em placa por processos conhecidos na técnica. Faz-se então a passagem de VMS(X) pelo SCT pelo menos quarto vezes através das passagens dos vírus VMS(X+l), VMS(X+2), VMS(X+3) e VMS(X+4). Considera-se o VMS(X+4) como sendo o virus de trabalho que serve de semente. Preferencialmente, a passagem do virus · que se utilize nos estudos sobre o porco e no produto da vacina da presente invenção é o VMS(X+5), o produto da quinta passagem. 28

Em conjunto com este stock de células de trabalho, faz-se uma cultura do vírus de trabalho que serve de semente, por processos conhecidos em quantidades suficientes para preparar um protótipo de vacina, preferencialmente VMS(X+5). Os presentes protótipos de vacinas podem ser de qualquer tipo apropriado para ser utilizado no domínio da medicina veterinária. Os principais tipos de vacinas nos quais se foca a presente invenção incluem uma vacina de sub-unidade (figura 1) e uma vacina tratada por engenharia genética (figura 2) . Contudo, também são aceitáveis outros tipos de vacinas reconhecidas no domínio das vacinas de veterinária, incluindo vacinas de vírus vivos, de vírus vivos modificadas, de vírus atenuados e de vírus mortos. Uma vacina morta pode tornar-se inactive por meio de um tratamento químico ou por calor, etc., de uma forma conhecida pelos técnicos com competências normais.

Um vírus atenuado pode obter-se por repetição em série de passagens do vírus numa célula hospedeira apropriada num número de vezes suficiente para se obter um virus pra-ticamente não virulento. Por exemplo, pode-se passar em série um de 1 a 20 vezes (ou mais, de desejado), de modo a torná-lo suficientemente atenuado para ser utilizado como uma vacina atenuada. O VMS(X+5) pode ser essa vacina atenuada.

Nos processos ilustrados por cada uma das figuras 1-2, no seguimento da preparação de um protótipo de vacina, realizam-se modelos de imunização do porco e ensaios clínicos por processos conhecidos na técnica. Por exemplo, antes da realização dos estudos de vacinação actuais/imu-nização, tem de se definir a doença a se prevenida e/ou tratada em termos dos seus sintomas, resultados dos ensaios clínicos, condições, etc. Tal como se descreve aqui, a 29 estirpe de Iowa do VSRRP tem sido definida em termos da sua histopatologia e dos sintomas clínicos que a causam. As análises clínicas da estirpe de Iowa do VSRRP estão descritas em detalhe nas experiências que se seguem.

Quem administra um protótipo de vacina a um porco, expõe então o porco ao vírus que causa a doença. Isto é conhecido como um "estímulo" ao porco e ao seu sistema imunológico. Depois de se observar a resposta do porco estimulado à exposição ao vírus ou ao agente infeccioso e. de se analisar a capacidade do protótipo de vacina para proteger o. porco, realizam-se então estudos de eficácia por meio de processos convencionais. Desenvolve-se então um ensaio de potência num processo separado conhecido na técnica, e produzem-se então séries pré-licenciadas.

Antes da preparação do protótipo de vacina em subunidades (figura 1) , devem identificar-se os componentes protectores ou antigénicos do vírus da vacina. Esses componentes protectores ou antigénicos incluem alguns segmentos de aminoácidos ou fragmentos das proteínas virais (preferencialmente proteínas envoltórias) que provocam uma resposta protectora ou imunológica particularmente forte em porcos; os fragmentos de proteínas antigénicas fundidos com as proteínas que não fazem parte do VSRRP que actuam como um veículo e/ou um adjuvante; as próprias proteínas envoltórias de vírus múltiplos ou simples, os seus oligómeros e associações de ordem superior das proteínas envoltórias víricas que foram as subestruturas ou partes identificáveis dos vírus ou unidades dessas subestruturas; oligoglicósidos, glicolípidos ou glicoproteínas presentes ou próximas da superfície do vírus ou em subestruturas virais tal como a cápside do núcleo; lipoproteínas ou grupos de lípidos associados ao vírus, etc. 30

Os segmentos ou os fragmentos antigénicos de aminoácidos têm preferencialmente pelo menos 5 aminoácidos de comprimento, particularmente preferíveis pelo menos 10 aminoácidos de comprimento, e podem ter um comprimento superior mas que não inclua o comprimento completo da proteína natural. Na presente invenção, a afinidade de ligação (ou a constante de ligação ou a constante de associação) de um fragmento antigénico é preferencialmente de pelo menos 1% e mais preferencialmente pelo menos 10 % da afinidade de ligação da proteína correspondente de comprimento completa (isto é, que é codificada pelo mesmo QLA) com um anticorpo monoclonal que se liga especi-ficamente à proteina de comprimento completo. O anticorpo monoclonal que se liga especificamente à proteína de comprimento completo codificada por um QLA de um VSRRP está preferencialmente depositado, de acordo com o Tratado de Budapeste num depositante aceite ou é sequenciado ou de alguma forma caracterizado em termos das suas propriedades físico-químicas (por exemplo, tipo de anticorpo [IgG, IgM, etc.],, peso molecular, número de cadeias pesadas e leves, afinidades de ligação com uma ou mais proteínas conhecidas ou sequenciadas [por exemplo, seleccionada nas SEQ ID NOS: 15, 17, 19, 21, 24, 26, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 67, 69, 71, 73, 75 e 77], etc.).

Os fragmentos antigénicos das proteínas virais (por exemplo, os codificados por um ou mais QLA's, 2-6 de um vírus VSRRP vírus) são identificados por processos conhecidos na técnica. Por exemplo, podem preparar-se ácidos polinucleicos com um QLA truncado codificando um polipéptido com um número pré-determinado de resíduos de aminoácidos eliminados do terminal N, do terminal C ou ambos. O QLA truncado pode ser expresso in vitro ou in vivo de acordo com processos conhecidos, e pode-se então isolar 31 o correspondente polipéptido truncado de acordo com processos conhecidos. As propriedades imunoprotectoras dos polipéptidos podem ser medidas directamente (por exemplo, in vivo) . Alternativamente, as regiões antigénicas do polipéptido de comprimento completo podem ser determinadas indirectamente por rastreio de uma série de polipéptidos truncados contra, por exemplo, anticorpos monoclonais depositados ou caracterizados apropriadamente. (Se se realiza o processo alternativo, indirecto, a insuficiência de um polipéptido truncado para se ligar a um anticorpo monoclonal de neutralização é uma forte indicação que a porção de polipéptido de comprimento completo eliminada no polipéptido truncado contém um fragmento antigénico.) Uma vez identificadas, as porções antigénicas ou imunoprotectoras (as "sub-unidade(s)") das proteínas virais ou do próprio virus podem ser em seguidas clonadas e/ou purificadas de acordo com processos conhecidos. (Os protocolos de inactivação viral/bacteriana e de purificação citados na fig. 1 são opcionais.)

As vacinas tratadas por engenharia genética (figura 2) começam com uma modificação do processo geral utilizado para a preparação de outras vacinas. Depois da purificação em placa, o vírus do SRRP vírus pode ser isolado a partir de um de tecido apropriado homogeneizado por processos conhecidos na técnica,, preferencialmente por meio de processos convencionais de cultura de células utilizando PSP-36, ATCC CRL 11171 ou células de macrófagos como hospedeiros.

Extrai-se o ARN a partir de virus puros sob o ponto de vista biológico por meio de um processo conhecido, preferencialmente pelo processo de isotiocianato de guani-dina utilizando um kit de isolamento de ARN comercialmente 32 disponível (por exemplo, o kit disponível na Stratagene, La Jolla, Califórnia), e purificado por um ou mais processos conhecidos, preferencialmente por ultra centrifugação num gradiente de CsCl. 0 ARN mensageiro pode ainda ser purificado ou enriquecido por meio de uma cromatograf ia em coluna de oligo (dT)-celulose.

Faz-se então a clonagem do genoma virai num hospedeiro apropriado por processos conhecidos na técnica (ver Maniatis et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory (1989), Cold Spring Harbor, Massachusetts). 0 genoma do vírus genoma é então analisado para se determinar as regiões essenciais do genoma para a produção de porções ·antigénicas do virus. Depois, o processo para a produção de uma vacina tratada por engenharia genética é praticamente o mesmo que o utilizado para uma vacina viva modificada, uma vacina inactivada ou uma de sub-unidade (ver figura 1 do presente pedido de patente e as figuras 1-3 da série de pedidos de patente U.S. No. 08/131.625). Durante as series de pré-licenciamento, pode-se optimizar a expressão de uma sub-unidade recombinante, clonada de um a vacina de sub-unidade por processos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, secções relevantes de Maniatis et al, citadas antes). A presente vacina protege porcos contra um vírus ou um agente infeccioso agente que causa uma doença reprodutiva e respiratória porcina. Preferencialmente, a presente vacina protege porcos contra a infecção por VSRRP. Contudo, também se espera que a presente vacina proteja um porco contra infecções por variantes relacionadas de muito próximo de várias estirpes de VSRRP. 33

As vacinas de virus em subunidades podem também ser preparadas a partir de subunidades virus semi-purifiçadas pelos processos descritos antes na discussão da figura 1. Por exemplo, preparou-se a hemaglutinina isolada do virus da gripe e os antigénios de superfície de neuraminidase isolados do vírus da gripe, e mostraram ser menos tóxicos do que o vírus completo. As vacinas de subunidades podem também ser preparadas a partir de subunidades do vírus altamente purificadas. Um exemplo em seres humanos é o antigénio de superfície de 22-nm do vírus humano da hepatite B. As subunidades do vírus humano de herpes simplex e muitos outros exemplos de vacinas de subunidades para serem utilizadas em .seres humanos são conhecidas. Assim, os processos de preparação de vacinas de subunidades purificadas do VSRRP em cultura numa célula de hospedeiro apropriada podem ser aplicáveis à presente vacina de subunidades.

As vacinas de vírus atenuados podem ser encontradas na natureza e podem ter eliminações de genes de ocorrência natural (ver as experiências VIII e IX a seguir) . Alternativamente, as vacinas atenuadas podem se preparadas por uma variedade de processos conhecidos, tal como uma passagem em série (por exemplo, 5-25 vezes) em culturas de células ou culturas de tecidos. Contudo, as vacinas de vírus atenuados preferidas na presente invenção são as atenuadas por eliminações de genes recombinantes ou mutações de genes (tal como se descreveu antes).

As vacinas tratadas por engenharia genética são produzidas por técnicas conhecidas pelos especialistas na matéria. Essas técnicas incluem as que utilizam ADN recom-binante e ' as que utilizam vírus vivos. Por exemplo, podem identificar-se alguns genes de vírus que codificam para 34 proteínas responsáveis pela indução de uma resposta imunitária e protectora mais forte em porcos. Esses genes identificados podem ser clonados em vectores de expressão de proteínas, tal como (mas não se limitando) vectores de baculovírus (ver, por exemplo, 0'Reilly et al, "Baculovírus Expression Vectors: A Lab Manual," Freeman & Co. (1992)). 0 vector de expressão contendo o gene que codifica a proteína do vírus imunogénico pode ser utilizado para infectar as células de hospedeiro apropriadas. As células de hospedeiro em cultura expressam assim as proteínas da vacina desejadas, que podem ser purificadas no grau desejado, sendo depois utilizadas para proteger os porcos de uma doença reprodutiva e respiratória porcina.

As vacinas tratadas por engenharia genética podem ser expressas, por exemplo, em células de insectos, células de leveduras ou células de mamíferos. As proteínas tratadas por engenharia genética, que podem ser purificadas e/ou isoladas por processos convencionais, podem ser inoculadas directamente em animais para conferir protecção contra doenças reprodutivas e respiratórias porcinas. Uma ou mais proteínas de envelope de um VSRRP (isto é, as codificadas pelos QLA's 2-6) ou as suas porções antigénicas podem ser utilizadas numa vacina para induzir anticorpos de neutralização. As nucleoproteínas de um VSRRP podem ser utilizadas numa vacina para induzir imunidade celular.

Preferencialmente, a presente invenção transforma uma linha de células de insecto (HI-FIVE) num vector de transferência contendo ácidos polinucleicos obtidos da estirpe de Iowa de VSRRP. Preferencialmente, o presente vector de transferência compreende ADN de baculovírus linearizado e um plasmido contendo um ou mais ácidos polinucleicos obtidos da estirpe de Iowa de VSRRP. A linha de 35 células do hospedeiro pode ser co-transfectada com o ADN de baculovírus linearizado e um plasmido, de tal modo que se produz um baculovírus recombinante. Particularmente preferencial, o presente ácido polinucleico codifica uma ou mais proteínas da estirpe de Iowa de VSRRP.

Alternativamente, o ARN ou o ADN de um VSRRP que codifica uma ou mais proteínas virais (por exemplo, proteínas de envelope e/o nucleares) pode ser inserido em vectores vivos, tal como um poxvírus ou um adenovírus, e utilizado como uma vacina.

Assim, a presente invenção ainda tem por objecto uma preparação purificada de um ácido polinucleico isolado do genoma de um vírus de SRRP, preferencialmente um ácido polinucleico isolado do genoma da estirpe de Iowa de VSRRP. 0 presente ácido polinucleico tem utilidade (ou é útil) na produção da presente vacina, no rastreio e na identificação de animais infectados ou expostos, na identificação de vírus relacionados e/ou de agentes infecciosos, e como um vector para a transformação de células e/ou a imunização de animais (por exemplo, porcos) com genes heterólogos.

Nas experiências descritas aqui a seguir, o isolamento, clonagem. e sequenciação dos QLA's 2-7 dos produtos isolados de VSRRP purificados em placas ISU-12 (depositados em 30 de Outubro de 1992, na the American Tipo Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, E.U.A., com os números de acesso VR 2385 [3 x placas purificadas] e VR 2386 [placas não purificadas]) e os QLA's 6-7 dos produtos isolados de VSRRP ISU-22, ISU-55 e ISU-3927 (depositados em 29 de Setembro de 1993, na American Tipo Culture Collection com os números de acesso VR 2429, VR 2430 e VR 2431, respectivamente), ISU-79 e ISU- 36 1894 (depositados em 31 de Agosto de 1994, na American Tipo Culture Collection com os números de acesso VR 2474 e VR 2475, respectivamente) estão descritos em detalhe. Contudo, as técnicas utilizadas para isolar, clonar e sequenciar estes genes também podem ser aplicadas para o isolamento, clonagem e sequenciação dos ácidos polinucleicos genómicos de qualquer VSRRP. Assim, a presente invenção não se limita a sequências especificas descritas nas experiências que se seguem.

Por exemplo, podem produzir-se iniciadores para fazer quantidades relativamente grandes de ADN por meio da reacção em cadeia de polimerase (e se desejado, para fazer ARN por transcrição e/ou proteínas por tradução de acordo com processos conhecidos in vivo ou in vitro) com base na informação da sequência em que se determinou mais do que uma sequência obtida de um genoma de VSRRP (por exemplo, QLA's 2-5 de VR 2385 e vírus de Lelystad, ou QLA's 6-7 de VR 2385, VR 2429, VR 2430, ISU-79, ISU-1894, VR 2431 e vírus de Lelystad). Selecciona-se uma região de cerca de 15 a 50 nucleótidos de comprimento com pelo menos 80 % e preferencialmente com pelo menos 90 % de identidade com determinadas sequências. Uma região em que ocorre uma eliminação numa das sequências (por exemplo, com pelo menos 5 nucleótidos) pode ser utilizada como a base para a preparação de um iniciador selectivo para a amplificação selectiva do ácido polinucleico de uma estirpe ou de um tipo de VSRRP em relação a outro (por exemplo, para o diagnóstico diferencial de estirpes de VSRRP norte-americanas ou europeias).

Uma vez amplificado e clonado o ácido polinucleico num hospedeiro apropriado por processos conhecidos, os clones podem ser rastreados com uma sonda produzida com base na 37 informação da sequência aqui descrita. Por exemplo, selecciona-se a região com cerca de 50 a cerca de 500 nucleótidos de comprimento com base quer num elevado grau de identidade (por exemplo, pelo menos 90 %) entre duas ou mais sequências (por exemplo, nos QLA's 6-7 da estirpe de Iowa de VSRRP descritas na experiência III a seguir), e um polinucleótido de comprimento e identidade de sequência apropriados, podem ser preparados de acordo com processos conhecidos (tal como síntese automática ou restrição de um fragmento apropriado de um ácido polinucleico contendo a região seleccionada, amplificação por RCP utilizando iniciadores que hibridam especificamente com o polinucleótido, e isolamento por electroforese) . O polinucleótido pode ser marcado com, por exemplo, 32P (para identificação radiométrica) ou biotina (para detecção por fluo-rometria). A sonda hibrida então com os ácidos polinu-cleicos dos clones e é detectada de acordo com processos conhecidos.

Os requerentes descobriram que QLA 4 parece estar relacionado com a virulência de VSRRP. Por exemplo, pelo menos um produto isolado de VSRRP que exibe uma virulência relativamente baixa parece ter uma eliminação no QLA 4 (ver, por exemplo, as experiências VI II-XI a seguir). De acordo com isto, num enquadramento preferido, a presente invenção tem por objecto um ácido polinucleico a partir de um produto isolado de VSRRP que confere uma protecção imunogénica directamente ou indirectamente contra um reforço subsequente com um VSRRP, mas no qual o QLA 4 foi eliminado ou mutado num grau que tornará o VSRRP, que contém o ácido polinucleico, quer pouco virulento (isto é, um fenotipo de "virulência baixa" (vb); ver a explicação a seguir) ou não virulento (chamado um "mutante de eliminação "). Preferencialmente, QLA tem uma eliminação ou uma 38 mutação num grau que torne um virus de não virulento. Contudo, pode ser desejável reter regiões de um QLA 4 de VSRRP no presente ácido polinucleico que (i) codifica um fragmento de péptido antigénico, imunoprotector e (ii) não vai conferir virulência a ura vírus do SRRP contendo o ácido polinucleico.

Também tem por objecto um VSRRP per se em que o QLA 4 tem uma eliminação ou está mutado de tal modo que o torne pouco virulento ou não virulento (por exemplo, VR 2431). Um tal vírus é útil como uma vacina ou como um vector para transformar um hospedeiro apropriado (por exemplo, MA-104, PSR 36, CRL 11171, HARC-145 ou células de macrófago alveolar porcino) com um gene heterólogo. Os genes heterólogos preferidos que podem ser expressos utilizando o presente mutante de eliminação pode incluir os que codificam uma proteína ou um antigénio diferente de um antigénio de vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (por exemplo, pseudoraiva e/ou prtoteínas do vírus da gripe e/ou antigénios contendo polipéptidos, uma hormona de crescimento porcino, etc.) ou um adjuvante à base de polipéptidos (tal como os discutidos a seguir para a presente composição de vacina).

Também pode ser desejável, em certos enquadramentos do presente ácido polinucleico que contém, por exemplo, a região do terminal 3' do QLA 3 (por exemplo, de 200 a 700 nucleótidos de comprimento), pelo menos parte do qual pode sobrepor-se à região 5' do QLA 4. Do mesmo, quando a região de terminal 3' do QLA 4 se pode sobrepor à região de terminal 5' do QLA 5, pode ser desejável reter a região 5' do QLA 4 que se sobrepõe a QLA 5. 39

Os requerentes também descobriram que QLA 5 no genoma de VSRRP parece estar relacionado com a replicação do virus nas células hospedeiras de mamíferos capazes de sustentar uma cultura infectada com VSRRP. De acordo com isto, a presente invenção tem também por objecto ácidos polinucleicos obtidos de um genoma de VSRRP no qual QLA 5 pode estar presente em múltiplas cópias (um chamado "mutante de sobreprodução"). Por exemplo, o presente ácido polinucleico pode conter pelo menos dois, e mais preferencialmente, de 2 a 10 cópias de QLA 5 a partir de um produto isolado de VSRRP de um fenotipo de alta replicação (ar) . É interessante, que o produto isolado de VSRRP ISU-12 tem um número surpreendentemente elevado de potenciais codões de iniciação (sequências ATG/AUG) próximo da terminação 5' de QLA 5, indicando possivelmente os sitios de inicio alternativos deste gene (ver SEQ ID NO: 13). Assim, podem existir formas alternativas da proteina codificadas pelo QLA 5 de um produto isolado de VSRRP, particularmente onde os QLA's alternativos codificam uma proteina com um peso molecular similar ao determinado experimentalmente (por exemplo, de cerca de 150 a cerca de 250 aminoácidos de comprimento). A região de codificação mais provável para o QLA 5 de ISU-12 (SEQ ID NO: 14) está indicada na figura 7.

Podem preparar-se mutantes de eliminação e de sobreprodução de acordo com processos conhecidos. Por exemplo, pode-se preparar um ácido polinucleico mutante que pode conter uma alteração "silenciosa" ou degenerada na sequência de uma região que codifica um polipéptido, seleccionando e produzindo uma mutação degenerada apropriada, pode-se substituir uma sequência de ácidos poli- 40 nucleicos reconhecida por uma enzima de restrição conhecida. Por exemplo, se essa mutação silenciosa, degenerada for feita em uma ou duas das extremidades 3' do QLA 3 e das extremidades 5' e 3' de QLA 4 e de QLA 5, pode-se inserir um ácido polinucleico sintético (uma chamada "cassete") que pode conter múltiplas cópias de QLA 5, múltiplas cópias de uma proteína de envelope virai ou um seu fragmento antigénico. A "cassete" pode ser precedida por um codão de iniciação apropriado (ATG), e pode terminar de uma forma apropriada com um codão de terminação na extremidade 3' (TAA, TAG ou TGA).

Obviamente, uma sequência de oligonucleótidos que não codifica um polipéptido pode ser inserida, ou alternativamente, não se pode inserir nenhuma cassete. Fazendo isto, pode-se providenciar um chamado mutante de eliminação.

Assim, num enquadramento da presente invenção, o ácido polinucleico codifica uma ou mais proteínas, ou as respectivas regiões antigénicas de um VSRRP. Preferencialmente, o presente ácido nucleico codifica pelo menos uma região antigénica de uma proteína (de envelope) da membrana do VSRRP. Mais preferencialmente, o presente ácido polinucleico contém pelo menos uma cópia do gene do QLA-5 de um produto isolado do fenótipo de alta virulência (av) de VSRRP (ver a seguir a descrição do "fenotipo de av") e um fragmento, região ou sequência suficientemente longos, de pelo menos um dos QLA-2, QLA-3, QLA-4, QLA-5 e/ou QLA-6 do genoma de um produto isolado de VSRRP para codificar uma região antigénica das proteína(s) correspondentes e estimular efectivamente a protecção imunológica contra um estímulo subsequente com um produto isolado de VSRRP de um fenotipo av. Ainda mais preferencialmente, pelo menos uma proteína de envelope inteira codificada pelos QLA-2, QLA-3, 41 QLA-5 e/ou QLA-6 de um VSRRP está contida no presente ácido polinucleico, e o presente ácido polinucleico exclui uma porção suficientemente longa do QLA 4 de um VSRRP de av para modificar um VSRRP que o contenha para o tornar pouco virulento ou não virulento. Particularmente e preferencialmente, o presente ácido polinucleico exclui toda a região de um QLA 4 de VSRRP de av que não se sobrepões com a extremidade 3' de QLA 3 e da extremidade 5' do QLA 5. 0 que é mais preferencial é que o ácido polinucleico seja isolado do genoma de um produto isolado da estirpe de Iowa de VSRRP (por exemplo, VR 2385 (3X ISU-12 de placas purificadas), VR 2386 (ISU-12 de placas não purificadas), VR 2428 (ISU-51) , VR 2429 (ISU-22), VR 2430 (ISU-55) , VR 2431 (ISU-3927), ISU-79 e/ou ISU-1894.

Um enquadramento preferido da presente invenção diz respeito a uma preparação purificada que pode compreender, pode consistir essencialmente ou pode consistir num ácido polinucleico com uma sequência de fórmula (I): 5 ’ —<x—β—γ—3 1 (I) na qual a codifica pelo menos um polipéptido ou um seu fragmento antigénico codificado pelo QLA 2 de uma estirpe de Iowa de VSRRP e as suas regiões que codificam os fragmentos antigénicos; e β representa quer uma ligação covalente ou um ácido polinucleico de ligação que exclui uma porção suficientemente longa de CRT 4 de um VSRRP para tornar o VSRRP de av quer pouco virulento quer não virulento; é γ representa pelo menos uma cópia de um QLA 5 de uma estirpe de Iowa de VSRRP preferencialmente de um fenótipo de alta replicação (ar). 42

Alternativamente, a presente invenção pode ter por objecto uma preparação purificada que pode compreender, pode consistir essencialmente ou pode consistir num ácido polinucleico com uma sequência de fórmula (II): 5'-α-β-γ- δ-ε-3’ (II) na qual α, β e γ têm os significados definidos antes; δ representa uma ligação covalente; e ε codifica pelo menos um polipéptido ou um seu fragmento antigénico codificado por um polinucleótido seleccionado no grupo que consiste em QLA 6 e QLA 7 de uma estirpe de Iowa de VSRRP e as suas regiões que codificam os fragmentos antigénicos; e quando δ representa uma ligação covalente, γ pode ter uma extremidade 3' que exclui a região de sobreposição com a extremidade 5' de um QLA 6 correspondente. Preferencialmente, ε representa um polinucleótido que codifica pelo menos uma região antigénica de uma proteína codificada por um QLA 6 de uma estirpe de Iowa de VSRRP, e mais preferencialmente, codifica pelo menos uma proteína codificada por um QLA 6 de uma estirpe de Iowa de VSRRP.

Assim, o presente ácido polinucleico pode ser seleccionado no grupo que consiste em, de 5' a 3': ζ-iQLA 5)n (III) ζ-ÍQLA 5)η-η (IV) em que: ζ se selecciona no grupo que consiste em QLA 2-, QLA 2-QLA 3-, QLA 2-QLA 4*-, e QLA 2-QLA 3-QLA 4*-; e η se selecciona no grupo que consiste em -QLA 5*, -QLA 6, - 43 QLA 7, -QLA 5*-QLA 6, -QLA 5*-QLA 7, -QLA 6-QLA 7 e -QLA 5*-QLA 6-QLA 7; em que cada um de. QLA 2, QLA 3, QLA 6 and QLA 7 codifica uma proteína codificada pelo Segundo, terceiro, sexta e sétimos quadros de leitura aberta de uma estirpe de Iowa de VSRRP, respectivamente; QLA 4* representa uma região de um quadro de leitura aberta de uma estirpe de Iowa de VSRRP que (i) codifica um fragmento de um péptido antigénico, imunoprotector e que (ii) não confere virulência a um VSRRP contendo um ácido polinucleico; 0 QLA 5 representa um quinto quadro de leitura aberta de um produto isolado de um VSRRP de av; QLA 5* representa uma região de um quinto quadro de leitura aberta de uma estirpe de Iowa do VSRRP que (i) codifica um fragmento de um péptido antigénico, imunoprotector e que (ii) não confere virulência a -um VSRRP contendo um ácido polinucleico e que pode ter uma extremidade 3' que exclui a porção de sobreposição com the 511- e um QLA 6 correspondente; e n > 1. 0 presente ácido polinucleico pode também compreender, consistir essencialmente ou consistir em combinações das sequências anteriores, quer como uma mistura de polinu-cleótidos ou ligados covalentemente quer da cabeça para a cauda (paralelo-anti-paralelo) ou de um modo cabeça-a-cabeça. Os ácidos polinucleicos complementares das sequências anteriores e as suas combinações (ácido polinucleico anti-paralelo) estão também englobados na presente invenção. Assim, para além de possuir cópias múltiplas ou variantes de QLA 5, os presentes ácidos polinucleicos pode também conter cópias múltiplas ou variantes de um ou mais dos QLA's 1-3 e 6-7 e das regiões de QLA's 4-5 de uma estirpe de Iowa de VSRRP's. 44

Também tem por objecto ácidos polinucleicos que compreendem, podem consistir essencialmente ou podem consistir no quadro de leitura aberta la e lb de um produto isolado de VSRRP. Com base na informação respeitante ao virus evolucionalmente relacionado com o VSRRP, crê-se que os QLA la e lb do VSRRP codificam uma polimerase do ARN. QLA la e lb traduzem-se numa única proteína por deslocação dos quadros de leitura. Preferencialmente, o ácido polinucleico dos QLA la e lb de um produto isolado de VSRRP obtém-se de uma estirpe de Iowa de VSRRP.

Do mesmo modo que os processos descritos antes e na sequência das experiências para os QLA's 2-7, pode-se preparar uma biblioteca de clones recombinantes (por exemplo, utilizando E. coli como hospedeiro) contendo fragmentos de restrição de forma apropriada de um genoma de VSRRP (por exemplo, inserido num plasmido apropriado que se expressa no hospedeiro). Os clones são então rastreados com uma sonda apropriada (por exemplo, com base numa sequência de QLA's 2-3 conservada; ver, for exemplo, figura 22). Os clones positivos podem então ser seleccionados e crescem até a um nível apropriado. Os ácidos polinucleicoe podem então ser isolados a partir de clones positivos de acordo com processos conhecidos. -Um iniciador apropriado de RCP podem então ser projectados e preparados conforme descrito antes para amplificar a região desejada do ácido polinucleico. 0 ácido polinucleico amplificado pode então ser isolado e sequenciado de acordo com processos conhecidos. A presente preparação purificada pode também conter um ácido polinucleico seleccionado a partir do grupo que consiste em sequências que têm pelo menos 97 % de identidade de sequências (ou homologia) com pelo menos um QLA 7 de VR 2385, VR 2430 e/o VR 2431; e as sequências têm 45 pelo menos 80 % e preferencialmente pelo menos 90 % de identidade de sequência (ou homologia) com pelo menos um dos QLA's 1-6 de VR 2385, VR 2428, VR 2429, VR 2430 e/ou VR 2431. Preferencialmente, o ácido polinucleico exclui uma região suficientemente longa ou uma porção de QLA 4 dos produtos isolados de VSRRP, VR 2385, VR 2429, ISU-28, ISU-79 e/ou ISU-984 para tornar o produto isolado pouco virulento ou não virulento.

No contexto do presente pedido de patente de invenção, a "homologia" refere-se à percentagem de nucleótido ou de residuos de aminoácidos idênticos nas sequências de dois ou mais virus, alinhados de acordo com um processo convencional para a determinação da homologia (por exemplo, os programas de computador MACVECTOR ou GENEWORKS, alinhados de acordo com o processo descrito na Experiência III que se segue).

De acordo com isto, um outro aspecto da presente invenção engloba um ácido polinucleico isolado pelo menos 90 % homólogo de um polinucleótido que codifica uma proteína, um polipéptido ou um seu fragmento codificados pelos QLA's 1-7 de uma estirpe de Iowa do VSRRP (por exemplo, SEQ ID NOS: 15, 17, 19, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65 e 67). Preferencialmente, o presente ácido polinucleico isolado codifica uma proteína, polipéptido, ou um seu fragmento antigénico que tem pelo menos 10 aminoácidos de comprimento e em que os aminoácidos não essenciais quanto à antigeneicidade podem ser substituídos de forma conservadora. Um resíduo de aminoácido numa proteína, polipéptido, ou um seu fragmento antigénico é substituído conservadoramente se for substituído por um membro do seu grupo de polaridade tal como se define a seguir: 46

Aminoácidos básicos: lisina (Lis), arginina (Arg), histidina (His) Aminoácidos ácidos: ácido aspártico (Asp), ácido glutâmico (Glu), aspa-ragina (Asn), glutamina (Gin)

Aminoácidos hidrofilicos não iónicos: serina (Ser), treonina (Tre), cisteina (Cis), asparagina (Asn), glutamina (Gin)

Aminoácidos contendo enxofre: cisteina (Cis), metionina (Met)

Aminoácidos hidrofóbicos, aromáticos: fenilalanina (Fen) , tirosina (Tir), triptofano (Trp)

Aminoácidos hidrofóbicos, não aromáticos: glicina (Gli), alanina (Ala), valina (Vai), leucina (Leu), isoleucina (Ile), prolina (Pro)

Mais particularmente, o presente ácido polinucleico codifica uma ou mais das proteína (s) codificadas pelo segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto e/ou sétimos quadros de leitura aberta (QLA's 2-7) dos produtos isolados de VSRRP VR 2385, VR 2386, VR 2428, VR 2429, VR 2430, VR 2431, VR 2432, ISU-79 e/ou ISU-1894 (por exemplo, as SEQ ID NOS: 47 15, 17, 19, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 e 65) .

Podem utilizar-se segmentos de ácidos polinucleicos relativamente pequenos (cerca de 20 pb ou mais longos) no genoma de um virus para rastrear ou identificar amostras de tecido e/ou de fluidos biológicos de animais infectados, e/ou para identificar vírus relacionados, pelos processos aqui descritos e conhecidos dos especialistas nas matérias de veterinária e diagnósticos virais e na medicina veterinária. De acordo com isto, a presente invenção também tem por objecto ácidos polinucleicos isolados (e, se desejado, purificadas) que consistem essencialmente num fragmento de 15 a 2000 pb, preferencialmente de 18 a 1000 pb, e mais preferencialmente de 21 a 100 pb de comprimento, derivados dos QLA's 2-7 de um genoma do VSRRP (pre-ferencialmente de uma estirpe de Iowa de VSRRP). Particularmente e preferencialmente, os presentes fragmentos de ácidos polinucleicos isolados obtêm-se a partir da terminação de um ou mais dos QLA's 2-7 do genoma da estirpe de Iowa de VSRRP, e o que é mais preferencial, seleccionam-se do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 1-12, 22 e 28-34.

Também tem por objecto um kit de diagnóstico kit para analisar um vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino, compreendendo (a) um primeiro iniciador que compreende um polinucleótido comportando uma sequência de 10 a 50 nucleótidos de comprimento que híbrida com um ácido polinucleico genómico de uma estirpe de Iowa do vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino a uma temperatura de 25 a 75 °C, . (b) um segundo iniciador que compreende um polinucleótido comportando uma sequência de 10 a 50 nucleótidos de comprimento, sendo a referida sequência do referido segundo iniciador encontrada no 48 referido ácido polinucleico genómico da referida estirpe de Iowa do virus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino e estando a jusante da sequência com a qual o primeiro iniciador híbrida, e (c) um reagente que permite a detecção de um ácido polinucleico amplificado. Preferencialmente, o reagente é um corante de intercalação, cujas propriedades fluorescentes mudam após a intercalação num ADN de hélice dupla.

Os QLA's 6 e 7 provavelmente não são candidatos para o controle da virulência e da replicação dos demóticos de VSRRP, dado que as sequências de nucleótidos destes genes estão altamente conservadas entre os produtos isolados de alta virulência (av) e de virulência baixa (vb) (ver experiência III a seguir). Contudo, o QLA 5 nos produtos isolados de VSRRP parece estar menos conservado entre os produtos isolados de alta replicação (ar) e de baixa replicação (br). Por isso, crê-se que a presença de um QLA 5 de um produto isolado de VSRRP de ar no presente ácido polinucleico vai aumentar a produção e a expressão de uma vacina recombinante produzida a partir do ácido polinucleico.

De acordo· com isto, prefere-se que o presente ácido polinucleico, quando utilizado para fins de imunoprotecção (por exemplo, na preparação de uma vacina) , contenha pelo menos uma cópia de QLA 5 de um produto isolado de alta replicação (isto é, um produto isolado que cresce a um título de 106-107 de TCID50 em, por exemplo, células CRL 11171; ver também as discussões nas experiências VIII-XI a seguir).

Por outro lado, o VR 2431 de vb isolado parece der um mutante de eliminação, relativamente aos produtos isolados 49 de av (ver experiências III e VIII-XI a seguir). A eliminação parece estar no QLA 4, com base na análise de manchas (Northern blot). De acordo com isto, quando utilizados para fins de imunoprotecção, os presentes ácidos polinucleicos preferencialmente não contêm uma região do QLA 4 de produtos isolados av responsáveis pela sua alta virulência, e mais preferencialmente, excluem a região do QLA 4 que não se sobrepõe aos QLA's 3 e 5 adjacentes (quando QLA 4 se sobrepões aos QLA's 3 e 5 adjacentes).

Também é sabido (pelo menos para VSRRP) que nem a proteína da cápside do núcleo nem os seus anticorpos conferem protecção imunológica contra o vírus (por exemplo, VSRRP) em porcos. De acordo com isto, o presente ácido polinucleico, quando utilizado para fins de imunoprotecção, contém uma ou mais cópias de uma ou mais regiões dos QLA's 2, 3, 4, 5 e de um produto isolado de um VSRRP que codifica uma região antigénica da proteína de envelope virai, mas que não resulta nos sintomas ou nas alterações histo-patológicas associadas à SRRP. Preferencialmente, esta região é imunologicamente reactiva de forma cruzada com anticorpos com as proteínas de envelope de outros produtos isolados de VSRRP. Do mesmo modo, a proteína codificada pelo presente ácido polinucleico imunoprotector confere protecção imunológica a um porco a que foi administrada uma composição compreendendo a proteína, e anticorpos desta proteína que reagem de forma cruzada sob o ponto de vista imunológico com as proteínas de envelope de outros produtos isolados de PRRBV. Mais preferencialmente, o presente ácido polinucleico imunoprotector codifica toda a proteína de envelope de um produto isolado de VSRRP.

Os presentes fragmentos isoladas de ácido polinucleico podem obter-se por digestão do ADNc correspondente (comple- 50 mentar) aos ácidos polinucleicos virais com uma ou mais enzimas de restrição apropriadas, podem ser amplificados por RCP e clonado, ou pode ser sintetizado utilizando um sintetizador automático de polinucleótidos, disponível comercialmente. A descrição também inclui uma ou mais proteínas ou os seus fragmentos antigénicos a partir de um vírus do SRRP, preferencialmente a partir da estirpe Iowa do VSRRP. Tal como se descreveu antes, um fragmento antigénico de uma proteína de um vírus de SRRP (preferencialmente a partir da estirpe Iowa do VSRRP) tem pelo menos 5 aminoácidos de comprimento, particularmente e preferencialmente pelo menos 10 aminoácidos de comprimento, e providencia ou estimula uma resposta protectora sob o ponto de vista imunológico num porco a que se administrou uma composição contendo o fragmento anti-génico.

Os processos para a determinação de uma porção antigénica de uma proteína são conhecidos pelos especialistas na matéria (ver a descrição anterior). Além disso, pode-se também determinar um fragmento antigénico essencial-de uma proteína mostrando primeiro que a proteína· de comprimento completo é antigénica num hospedeiro animal (por exemplo, um porco). Se a proteína ainda for antigénica na presença de um anticorpo que se liga especificamente a uma região particular ou a uma sequência da proteína, então essa região ou sequência pode não ser essencial para a imunoprotecção. Por outro lado, se a proteína já não for antigénica na presença de um anticorpo que se liga. especificamente a uma região particular· ou a uma sequência da proteína, então essa região ou sequência pode ser essencial para a antigenicidade. 51 A presente invenção também tem por objecto uma proteína ou um seu fragmento antigénico codificado por um ou mais dos ácidos polinucleicos definidos antes, e preferencialmente por um ou mais dos QLA's de um VSRRP, mais preferencialmente da estirpe Iowa de VSRRP. As presentes proteínas e os fragmentos antigénicos são úteis para a imunização de porcos contra VSRRP, em ensaios serológicos para o rastreio de porcos quanto à sua exposição ou ao estado de infecção pelo VSRRP (particularmente a estirpe Iowa de VSRRP), etc.

Por exemplo, a presente proteína pode ser seleccionada do grupo que consiste nas proteínas codificadas pelos QLA'2 de VR 2385, ISU-22 (VR 2429), ISU-1894, ISU-79 e ISU-3927 (VR 2431) (por exemplo, a SEQ ID NO: 67); pode adicionalmente compreender pelo menos uma das proteínas das SEQ ID SEQ ID NOS: 15, 17, 19, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 67, 69 e 71; polipéptidos pelo menos 80 % homólogos de uma proteína codificada por um dos QLA's 2-5 de VR 2385 (SEQ ID NOS: 15, 67, 69 e 71); e polipéptidos pelo menos 197 % homólogos da proteína codificada por um dos QLA's 6-7 de VR 2385, VR 2429, VR 2430, ISU-1694, ISU-79 e VR 2431 (por exemplo, SEQ ID NOS: 17, 19, 43, 45, 47, 49, .51, 53, 55, 57, 59 e 61). Preferencialmente, a presente proteína tem uma sequência da SEQ ID NO: 67.

Também tem por objecto um vírus puro, sob o ponto de vista biológico, caracterizado pelo facto de conter o presente ácido polinucleico e/ou porque causa uma doença do vírus do síndroma reprodutivo e respiratório, porcino que pode incluir uma ou mais das seguintes lesões, histológicas: lesões pulmonares grandes e/o microscópicas (por exemplo, consolidação do pulmão), pneumocite do tipo II, miocardite, encefalite, formação de exsudado alveolar e formação de 52 sincicio. A frase "puro sob o ponto de vista biológico" refere-se a uma amostra de um vírus ou de um agente infeccioso em que todos os descendentes derivam de um único pai. Normalmente, uma amostra de um virus "puro sob o ponto de vista biológico" consegue-se por purificação 3 x em placa numa cultura de células.

Em particular, o presente vírus puro sob o ponto de vista biológico ou agente infeccioso é um produto isolado da estirpe Iowa do vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino, cujas amostras tinham sido depositadas nos termos do Tratado de Budapeste da-American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, E.U.A., com os números de acesso VR 2385, VR 2386, VR 2428, VR 2429, VR 2430, VR 2431, VR 2474 e VR 2475.

Para além das características (a)-(e) descritas antes, a estirpe Iowa de VSRRP pode também ser caracterizada por análises de manchas (Northern blots) do seu ARNm. Por exemplo, a estirpe Iowa de VSRRP pode conter quer 7 ou 9 ARNm's, e pode também ter eliminações ou variações na sua dimensão. Em particular, tal como estará descrito nas experiências que se seguem, os ARNm''S da estirpe Iowa de VSRRP podem conter até quatro eliminações, relativamente ao VR 2385/VR 2386. A presente invenção ainda tem por objecto uma composição para a protecção de um porco em relação a uma infecção virai, que compreende uma quantidade da presente vacina efectiva para provocar uma resposta imunológica a um vírus que causa uma doença reprodutiva e respiratória porcina num veículo aceitável sob o ponto de vista fisiológico. 53

Uma quantidade efectiva da presente vacina é aquela em que se provoca uma resposta imunológica suficiente à vacina para proteger um porco exposto a um virus que causa uma doença reprodutiva e respiratória porcina ou uma enfermidade relacionada. Preferencialmente, o porco é protegido na medida em que fica prevenido contra um ou todos os sintomas ou efeitos fisiológicos adversos (por exemplo, lesões do pulmão) da doença a ser prevenida que ficam significativamente reduzidos. A composição pode ser administrada numa dose única, ou em doses repetidas. As dosagens podem conter, por exemplo, de 1 a 1.000 microgramas de antigénio à base de virus (vacina) , mas não devem conter uma quantidade de antigénio à base de virus suficientes para resultar numa reacção adversa ou sintomas fisiológicos de infecção. Os processos são conhecidos na técnica para a determinação de doses apropriadas do agente antigénico activo. A composição contendo a presente vacina pode ser administrada em conjunto com um adjuvante ou com um veiculo aceitável que pode prolongar ou sustentar a resposta imunológica no animal hospedeiro. Um adjuvante é uma substância que aumenta a resposta imunológica à presente vacina quando, se combinam. 0 adjuvante pode ser administrado ao mesmo tempo e no mesmo sitio que a vacina ou num momento diferente, por exemplo como um reforço. Os adjuvantes também podem ser administrados com vantagem ao animal de uma forma ou num sitio ou numa localização diferente da maneira, sitio ou localização em que foi administrada a vacina. Os adjuvantes incluem hidróxido de alumínio, sulfato de alumínio e potássio, enterotoxinas lábeis ao calor ou estáveis ao calor isoladas a partir de Escherichia coli, toxina da cólera ou a sua sub-unidade B, 54 toxina da difteria, toxina do tétano, toxina da tosse convulsa, adjuvante incompleto de Freund, adjuvante completo de Freund, e similares. Os adjuvantes à base de toxinas, tal como a toxina da difteria, a toxina do tétano e a toxina da tosse convulsa, podem ser inactivados antes da sua utilização, por exemplo, por tratamento com formaldeido. A presente invenção também tem por objecto a utilização de ácidos nucleicos, proteínas, composições e vacinas descri-tas antes no fabrico de um medicamento para a protecção de porco de uma infecção contra um vírus que causa uma doença reprodutiva e respiratória porcina. A protecção pode ser conseguida por meio da administração de uma quantidade efectiva de uma vacina que provoca uma resposta imunológica contra esse vírus num porco que necessita de protecção contra a infecção por esse virus. Por "protecção de um porco de uma infecção" contra um virus do sindroma reprodutivo e respiratório porcino ou contra um agente infeccioso, significa que depois da administração da presente vacina a um porco, o porco mostra uma redução de sintomas (menos severos) ou a não existência de sintomas clínicos (tal como febre) associados à doença correspondente, relativamente aos porcos de controlo (infectados) . Os sintomas clínicos podem ser quantificados (por exemplo, febre, contagem de anticorpos, e/ou lesões do pulmão), semi-quantifiçados (por exemplo, severidade da insuficiência respiratória), ou qualificados.

Também tem por objecto um sistema para a medição da insuficiência respiratória nos porcos afectados. 0 presente sistema de pontuação clínica respiratória avalia a insuficiência respiratória dos porcos 'afectados pela escala que se segue: 55 Ο - sem doença; respiração normal 1 - dispneia e polipneia ligeiras quando os porcos são pressionados (forçados a respirar em volumes maiores e/ou a taxas aceleradas) 2 - dispneia e polipneia ligeiras quando os porcos repousam 3 - dispneia e polipneia moderadas quando os porcos são pressionados 4 - dispneia e polipneia moderadas quando os porcos repousam 5 - dispneia e polipneia severas quando os porcos são pressionados 6 - dispneia e polipneia severas quando os porcos repousam

No presente sistema de pontuação clinica respiratória, uma pontuação de "0" é normal, e indica que o porco não está afectado por · uma doença reprodutiva e respiratória porcina. Uma pontuação de "3" indica uma doença respiratória moderada, e uma pontuação de "6" indica uma doença respiratória muito severa. Uma quantidade da presente vacina ou composição pode ser considerada efectiva se um grupo de porcos estimulados pela vacina ou composição mostra uma pontuação média da respiração clinica mais baixa do que um grupo de porcos estimulados do mesmo modo a que não se deu a vacina ou uma composição. (Um porco considera-se "estimulado" quando é exposto a uma concentração de um 56 agente infeccioso suficiente para causar a doença num animal não vacinado.)

Preferencialmente, a presente composição de vacina é administrada directamente a um porco ainda não exposto a um virus que causa uma doença reprodutiva e respiratória. A presente vacina pode ser administrada oralmente ou parentericamente. Exemplos de vias parentéricas de administração incluem as vias de administração intra-dérmica, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea e intranasal.

Quando administrada como uma solução, a presente vacina pode ser preparada na forma de uma solução aquosa, um xarope, um elixir, ou uma tintura. Essas formulações são conhecidas na técnica, e são preparadas por dissolução do antigénio e de outros aditivos apropriados nos sistemas de dissolventes apropriados. Esses dissolventes incluem água, solução salina, etanol, etileno-glicol, glicerol, fluido Al, etc. Os aditivos conhecidos na técnica apropriados incluem corantes certificados, aromatizantes, adoçantes, e conservantes anti-microbianos, tal como timerosal (etil-mercuritiossalicilato de sódio). Essas soluções podem ser estabilizadas, por exemplo, por adição de uma gelatina parcialmente hidrolisada, sorbitol, ou um meio de cultura de células, e podem ser tamponadas por processos conhecidos na técnica, utilizando reagentes conhecidos na técnica, tal como fosfato de hidrogénio e sódio, fosfato de di-hidrogénio e sódio, fosfato de hidrogénio e potássio e/ou fosfato de di-hidrogénio e potássio.

As formulações liquidas podem também incluir suspensões e emulsões. A preparação de suspensões, por exemplo 57 utilizando um moinho de colóides, e emulsões, por exemplo utilizando um homogeneizador, é conhecida na técnica.

As formas de dosagem parentérica, projectadas para in-jecção nos sistemas dos fluidos do corpo, requerem uma iso-tonicidade apropriada e um tamponamento do pH para os niveis correspondentes de fluidos do corpo porcinos. As formulações parentéricas devem também ser esterilizadas antes da sua utilização. A isotonicidade pode ser ajustada com cloreto de sódio e outros sais conforme necessário. Outros dissolventes, tais como o etanol ou propileno-glicol, podem ser utilizados para aumentar a solubilidade dos ingredientes da composição e a estabilidade da solução. Outros aditivos que podem ser utilizados na presente formulação incluem dextrose, anti-oxidantes convencionais e agentes de que-lação convencionais, tal como ácido etilenodiamina-tetra-acético (EDTA). A presente invenção também tem por objecto um processo de produção ex vivo da presente vacina, compreendendo as etapas de sintetização ou de isolamento de um ácido polinucleico de um virus do SRRP (preferencialmente a estirpe Iowa) que codifica uma proteína antigénica ou uma porção dela (preferencialmente a proteína envoltória virai), infectando uma célula de hospedeiro apropriada com o ácido polinucleico, fazendo uma cultura da célula de hospedeiro, e o isolamento da proteína antigénica ou uma sua porção a partir de uma cultura. Alternativamente, o próprio ácido polinucleico pode conferir actividade imunoprotectora a um animal hospedeiro ao qual é administrado. 58

Preferencialmente, recolhe-se a vacina de um meio de cultura por meio de três etapas de (i) precipitação transfectada, de células do hospedeiro em cultura, (ii) lise das células precipitadas, e (iii) isolamento da vacina. Particularmente e preferencialmente, as células hospedeiras infectadas com o virus ou um agente infeccioso são postas em cultura num meio apropriado antes da colheita.

Preferencialmente, depois da cultura de células do hospedeiro infectadas, as células do hospedeiro infectadas precipitam por meio da adição de uma solução de um poli(etileno-glicol) (PEG) convencional a um meio de cultura, numa quantidade suficiente para precipitar as células infectadas. As células infectadas precipitadas podem ainda ser purificadas por centrifugação. Faz-se então a lise das células precipitadas por processos conhecidos pelos técnicos desta matéria. Preferencialmente, faz-se a lise das células por meio de repetidas congelamentos e descongelamentos (três ciclos de congelamentos e descongelamentos são particularmente preferidos). A lise das células precipitadas liberta o virus, que pode então ser· colhido, preferencialmente por centrifugação. 0 virus pode ser isolado e purificado por centrifugação num gradiente de CsCl, recuperando depois a banda apropriada contendo o virus a partir do gradiente de CsCl.

Alternativamente, a cultura de células infectadas pode ser congelada e descongelada para fazer a lise das células. 0 material da cultura de células congelada e descongelada pode ser utilizado directamente como uma vacina viva. Preferencialmente, contudo, o material da cultura de células congelada e descongelada é liofilizado (para 59 armazenagem), e depois é re-hidratado para ser utilizado como uma vacina. 0 meio de cultura pode conter uma solução salina támponada, nutrientes essenciais e fontes apropriadas de carbono e azoto reconhecidas na técnica, em concentrações suficientes para permitir o crescimento de células infectadas pelo virus. Os meios de cultura apropriados incluem o meio essencial minimo de Dulbecco (DMEM), meio essencial minimo de Eagle (MEM) , meio de Ham, meio 199, soro bovino fetal, soro de vitelo fetal e outros meios equivalentes que suportam o crescimento de células infectadas com vírus. 0 meio de cultura pode ser complementado com soro bovino fetal (até 10 %) e/ou L-glutamina (até 2 mM) , ou outros aditivos apropriados, tal como suplementos convencionais de crescimento e/ou anti-bióticos. Um meio preferido é o DMEM.

Preferencialmente, a presente vacina prepara-se a partir de um vírus ou de um agente infeccioso em cultura numa linha de células apropriada. A linha de células é preferencialmente uma linha de células de PSP-36 ou uma linha equivalente capaz de ser infectada com o vírus e posta em cultura. Um exemplo de uma linha de células equivalente a PSP-36 é a linha de células PSP-36-SAH, que foi depositada nos termos do Tratado de Budapeste na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, E.U.A., em 28 de Outubro de 1992, com o número de depósito CRL 11171. Uma outra linha de células equivalente é a MA-104, disponível comercialmente na Whittaker Bioprodutos Inc. (Walkersville, Maryland). Os resultados preliminares indicam que a estirpe Iowa do VSRRP pode também ser posta em cultura em células da concha nasal de suínos. 60

Parece haver também uma relação entre a severidade da histopatologia causada por um estimulo com uma quantidade padrão de um produto isolado particular e o titulo ao qual o produto isolado pode crescer numa célula hospedeira de um mamífero (por exemplo, as células CRL 11171, MA-104 [de rim de macaco verde africano], etc.).

De acordo com isto, também tem por objecto um processo de cultura de um vírus do SRRP, compreendendo a infecção das linhas de células PSP-36, CRL 11171 ou uma linha de células equivalente e a cultura · da linha de células infectada num meio apropriado. Uma "linha de células equivalente" a PSP-36 ou a CRL 11171 é uma linha que é capaz de ser infectada com o vírus e posta em cultura, originando assim a produção de células infectadas na cultura. As linhas de células equivalentes incluem as células MA-104, PSP-36-SAH e MARC-145 (disponíveis no National Veterinary Services Laboratory, Ames, Iowa), por exemplo.

Preferencialmente, o vírus de cultura é pelo menos um produto isolado da estirpe Iowa do VSRRP. Particularmente e preferencialmente, a presente vacina prepara-se a partir dessa cultura da estirpe Iowa do VSRRP, resultante da cultura de células PSP-36, e purificadas em placas pelo menos três vezes. A linha de células MA-104 obtém-se a partir de células de rim de macaco, e é semelhante às células epiteliais. As células MA-104 formam uma monocamada confluente em frascos de cultura contendo meio essencial mínimo de. Dulbecco e SBF (soro bovino fetal) a 10 %. Quando se forma a monocamada, as células são inoculadas com a amostra of tecido homogeneizada a 10%, colhida de um tecido apropriado (tal 61 num porco como pulmão e/ou coração) num porco infectado. Preferencialmente, estão presentes antibióticos apropriados, para permitir o crescimento do virus e de células hospedeiras e para suprimir o crescimento e/ou a viabilidade de células diferentes das células hospedeiras (por exemplo, bactérias ou leveduras).

Tanto as células PSP-36 como as MA-104 células fazem crescer produtos isolados do virus do SRRP com títulos elevados (acima de 107 TCIDso/ml) . As células PSP-36 e MA-104 farão também crescer o agente infeccioso associado com a estirpe Iowa de VSRRP. As células MA-104 células são também capazes de fazer crescer rotavírus, poliovírus, e outros virus.

Crê-se que as células CL2621 não têm uma origem porcina e são semelhantes às epiteliais de origem não porcina e estão patenteadas (Boehringer-Ingelheim). Ao contrário de PSP-36 e de MA-104, algumas amostras do vírus que causa o SRRP têm sido cultivadas sem sucesso em células CL2621 (Bautista et al, American Associativo of Swine Practitioners Newsletter, 4: 32, 1992).

As principais características de CL2621 residem no facto de não terem origem em suínos e de serem semelhantes às epiteliais, crescendo em meio MEM. Contudo, Benfield et al (J. Vet. Diagn. Invest., 1992; 4: 127-133) relataram que as células CL2621 foram utilizadas para propagar o vírus do SRRP, mas as células MA-104 foram utilizadas para controlar a propagação do vírus poliomielite, inferindo-se assim que CL2621 não é o mesmo que MA-104, e que a mesma célula pode não propagar ambos os vírus. 62 A estirpe Iowa do VSRRP geralmente não pode crescer em linhas de células diferentes de PSP-36, PSP-36-SAH e MA-104. Tal como se descreveu antes, contudo, alguns virus que causam SRRP têm sido referidos como crescendo tanto em CL2621 como em macrófagos alveolares primários de suinos, embora algumas estirpes do virus do SRRP não crescem em células PSP-36, MA-104 ou CL2621.

As vacinas, produtos isolados de virus, proteínas e áci-dos polinucleicos da presente invenção podem ser utilizados para preparar anticorpos que podem providenciar resistência imunológica a um paciente (neste caso, um porco) exposto a um vírus ou a um agente infeccioso. Os anticorpos, englobados pela presente invenção ligam-se imunologicamente quer a (1) uma vacina que protege um porco contra um vírus de SRRP ou (2) ao próprio vírus do SRRP. Os anticorpos da presente invenção também têm as seguintes utilidades: (1) como um agente de diagnóstico para determinar se um porco esteve exposto a um vírus do SRRP vírus ou a um agente infeccioso e (2) na preparação da presente vacina. 0 presente anticorpo pode ser utilizado para preparar uma coluna de imunoaf inidade por meio de processos conhecidos, e a coluna de imunoafinidade pode ser utilizada para isolar· o vírus ou o agente infeccioso, ou uma sua proteína.

Para produzir anticorpos para essas vacinas ou vírus, imuniza-se um animal hospedeiro apropriado, tal como um rato, coelho, ou outros animais utilizados para essa inoculação, com a proteína utilizada para preparar a vacina. O animal hospedeiro é assim imunizado (injectado) com um dos tipos de vacinas descritas antes, eventualmente administrando um agente de imuno-estimulação (adjuvante), tal como os descritos antes. O animal hospedeiro é em 63 seguida preferencialmente imunizado de 1 a 5 vezes a intervalos de tempo determinados, preferencialmente de 1 em 1 ou de 4 em 4 semanas, mais preferencialmente de 2 em 2 semanas. Os animais hospedeiros são então sacrificados, e faz-se uma colheita do seu sangue. Separa-se então o soro por técnicas conhecidas a partir do sangue completo colhido. 0 soro contém anticorpos das vacinas. Os anticorpos podem também ser purificados por processos conhecidos para providenciar anticorpos de imunoglobulina G (IgG). A presente invenção também engloba anticorpos monoclo-nais das vacinas e/ou dos virus da presente invenção. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos pelo processo de Kohler et al (Nature, vol. 256 (1975), páginas 495-497). Basicamente, as células imunitárias de uma preparação de células completas do baço do animal hospedeiro imunizado (descrito antes) são utilizadas com células de mieloma por meio de um processo convencional para produzir hibridomas. Faz-se a cultura dos hibridomas e o fluido resultante da cultura é rastreado contra o fluido ou o inoculo que comporta o agente infeccioso (virus ou vacina). A introdução do hibridoma no peritoneu do animal hospedeiro produz um crescimento peritoneal do hibridoma. A colheita do fluido da ascite do animal hospedeiro providencia a amostra do anticorpo monoclonal com o agente infeccioso produzido pelo hibridoma. Também o sobrenadante da cultura de células de hibridoma pode ser utilizado como uma fonte do anticorpo monoclonal, que é isolada por processos conhecidos dos especialistas nesta técnica. Preferencialmente, o anticorpo da IgG ou da IgM da presente invenção, do tipo de imunoglobulina. 64 A presente invenção também tem por objecto a utilização de um anticorpo tal como descrito antes no fabrico de um medicamento para o tratamento de um porco que sofre de uma doença reprodutiva e respiratória. 0 tratamento compreende a administração de uma quantidade efectiva de um anticorpo que se liga imunologicamente a um virus que uma doença reprodutiva e respiratória porcina ou a uma vacina que protege um porco contra a infecção causada por um vírus de uma doença reprodutiva e respiratória porcina num veículo aceitável sob o ponto de vista fisiológico a um porco que necessita dela. A presente invenção também tem por objecto um processo of diagnóstico de uma infecção em porco por exposição de uma vara a um vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino e um kit de diagnóstico para realizar o ensaio, compreendendo o presente anticorpo (preferencialmente um anticorpo monoclonal e um agente de diagnóstico agente que indica uma reacção imunológica positiva com o referido anticorpo (preferencialmente compreendendo estreptavidina conjugada com peroxidase, um anticorpo biotinilado contra uma proteína ou um antigénio do VSRRP e uma peroxidase). 0 presente kit pode ainda compreender peróxido de hidrogénio aquoso, uma protease que digere a amostra do tecido porcino, um corante fluorescente (por exemplo, tetra-cloridrato de 3,3'-diaminobenzidina), e um corante de tecido (por exemplo, hematoxilina).

Um diagnóstico de SRRP baseia-se na compilação de a partir da história clínica da vara que vai ser diagnosticada, a partir da serologia e da patologia dos porcos infectados, e por último, no isolamento do vírus do SRRP (VSRRP) a partir da vara infectada. Assim, o presente 65 processo de detecção do VSRRP é útil no diagnóstico da infecção e/ou exposição ao vírus por parte da vara.

Os sinais clínicos variam amplamente entre as diferentes explorações agrícolas, e por isso não são as evidências mais fiáveis de um diagnóstico definitivo, excepto no caso de uma 'severa epidemia aguda em varas de animais jovens que experimentaram distúrbios como aborto, aumento do número de porcos que nascem mortos, e pneumonias severas em porcos recém-nascidos e muito jovens. Presentemente, os sinais clínicos mais comuns são a pneumonia e vários problemas bacterianos em porcos com 3-10 semanas de idade. Contudo, muitas varas positivas para o VSRRP não têm aparentemente problemas reprodutivos ou respiratórios. Há algumas lesões significativas que são muito sugestivas de infecção por VSRRP em porcos em crescimento. A lesão reprodutiva mais consistente que pode ser experimentada é uma lesão significativa em porcos com 3-10 semanas como a linfadenopatia. Em particular, o ilíaco e os nódulos linfáticos mediastínicos têm muitas vezes uma dimensão 3-10 vezes a dimensão normal, têm uma cor acastanhada e algumas vezes são quísticos. Os nódulos linfáticos não são normalmente heperémicos, tal como as condições/lesões encontradas na septicémia bacteriana.

Três lesões histológicas são consistentes com a infecção pelo VSRRP infecção. Observa-se normalmente uma pneumonia intersticial e caracteriza-se por uma infiltração do septo com células mononucleares, proliferação pneumocítica do tipo 2 e a presença de células necróticas nos espaços alveolares. Observa-se vulgarmente miocardite perivascular não supurativa e nódulos linfáticos hiperplásicos em estádios sub-agudas da 66 doença. 0 grau de visibilidade macroscópica da pneumonia depende da estirpe. Em geral, os pulmões falham até ao colapso e têm uma distribuição desigual de consolidação corada de castanho a 10-80 % com rebordos irregulares. A encefalite é observada muito menos vezes. As lesões no feto e na placenta raramente se observam à luz do microscópio.

Contudo, a percentagem de consolidação nos pulmões providencia um ensaio particularmente fiável para a infecção por VSRRP (isto é, a consolidação a 10 % em qualquer momento desde os 3 a 10 dias post-infecção (DPI) é uma indicação positiva da infecção), particularmente pelo virus com um fenotipo de alta virulência (av) (> 40 % de consolidação em qualquer momento desde os 3 a 10 dias DPI é umá indicação positiva da infecção por um produto isolado de VSRRP av).

Contrariamente à histopatologia nos tecidos do pulmão, a maior parte dos laboratórios utilizam por rotina quer um ensaio do anticorpo fluorescente indirecto (AFI) ou o ensaio de monocamada de imunoperoxidase (EMIP) para a detecção do anticorpo do soro. Tanto com o AFI como com o EMIP, deve-se determinar subjectivamente os pontos finais e assim os ensaios não são automatizáveis. Também se desenvolveram ensaios de neutralização do virus no soro (SVN), e ensaios de ELISA que são correntemente utilizados nalguns laboratórios de investigação. Os anticorpos detectados pelo ensaio de AFI normalmente aparecem 10 dias após a exposição mas podem ter um período de vida relativamente curto, desaparecendo algumas vezes no prazo de 3 meses. 67

Os anticorpos detectados por ELISA normalmente aparecem dentro de 3 semanas, mas a sua duração é desconhecida. Os anticorpos não são normalmente detectados por NVS até às 4-5 semanas após a exposição. 0 ensaio de NVS é considerado menos sensível na doença aguda, mas introduziram-se melhorias no ensaio de NVS utilizando um suplemento de soro porcino seronegativo. Os títulos de NVS, de acordo com os relatos, são mensuráveis durante mais tempo do que os títulos com IFA e EMIP, e assim, podem ser mais apropriados para a detecção de animais positivos em varas infectadas cronicamente.

Com AFI, fixam-se as células infectadas com soluções de acetona e metanol e faz-se a incubação dos anticorpos dos soros de convalescentes de porcos infectados com as células infectadas, preferencialmente durante cerca de 30 min. a 37 °C. Uma reacção imunológica positiva é aquela em que o anticorpo se liga às células infectadas com o vírus, mas 'não é lavada nas subsequentes etapas de lavagem (normalmente 3 X com tampão de SBF). Adiciona-se então um segundo anticorpo (um anti-anticorpo) marcado com um reagente fluorescente (FITC), faz-se a sua incubação, preferencialmente durante mais 30 min. Uma reacção imunológica positiva resulta na ligação do segundo anticorpo ao primeiro, ficando retido depois da lavagem, e resultando num sinal fluorescente, que pode ser detectado e semi-quantifiçado. Uma reacção imunológica negativa resulta em pouco ou nenhuma ligação do anticorpo da célula infectada. Por isso, o Segundo anticorpo marcado por fluorescência falha na ligação, o marcador fluorescente sai na lavagem, e detecta-se pouco ou nenhuma fluorescência, comparada com um controlo positivo apropriado. 68

Os kits de IPA e de ELISA são semelhantes ao kit de AFI, excepto no facto de o segundo anticorpo ser marcado com uma enzima especifica, em vez de um reagente fluorescente. Assim, adiciona-se um substrato apropriado para a enzima ligada ao segundo anticorpo o que resulta na produção de um produto colorido, que é então detectado e quantificada por colorimetria, por exemplo.

Os clínicos utilizam títulos de anticorpo para determinar o tempo apropriado para a vacinação e/ou a implementação de estratégias de gestão ou de controlo. Antes da presente invenção, os ensaios de serologia não deram níveis de títulos de anticorpos adequados ou suficientemente fiáveis para tomar decisões sobre os cuidados de saúde para o animal. Pode ter sido apropriado procurar uma mudança do estado de seronegativo para seropositivo ou para um aumento de pelo menos 4 vezes no título, como uma indicação positiva de infecção/exposição do VSRRP. Procurar um aumento da percentagem dos porcos seropositivos num grupo etário particular ao longo do tempo, numa vara, pode ser útil para determinar se o vírus se mantém e se se propaga activamente. Contudo, as porcas infectadas no princípio do 3o trimestre e que abortaram próximo do termo provavelmente não exibem aumentos dos títulos. 0 isolamento do vírus (IV) providencia um diagnóstico definitivo, mas tem algumas limitações. O vírus raramente é isolado de nados mortos ou de fetos autolisados resultantes de abortos. As porcas infectadas no princípio do último trimestre pode ter uma virémia transiente e não aborta até ao fim do termo. Os porcos mortos de qualquer idade não são as melhores amostras para ο IV, porque o vírus não sobrevive bem à temperatura ambiente. Os tecidos têm de ser retirados da carcaça, embalados separadamente, e refrige- 69 rados tão cedo quanto possível para se obter uma amostra de vírus viável.

Os melhores tecidos para o isolamento do vírus são as amígdalas, o pulmão, os nódulos linfáticos, e o baço. 0 soro é também uma excelente amostra para o isolamento do vírus, dado que (a) a virémia prolonga-se muitas vezes nos porcos em crescimento, (b) a amostra é fácil de manusear, e (c) a amostra pode ser rapidamente arrefecida e tratada. A variação entre laboratórios na capacidade para isolar o VSRRP é elevada porque os ensaios, os reagentes, as linhas de células e os meios utilizados para de-tectar/rastrear o VSRRP ainda não foi normalizada. A eficácia do isolamento varia porque nem todas as estirpes norte-americanas crescem em cada uma das linhas de células. As secções de tecido congelado dos ensaios AFI têm sido utilizadas com um sucesso limitado.

Os ensaios de neutralização do vírus no soro (NVS) tam-bém têm sido desenvolvidos, e os ensaios de ELISA são utilizados correntemente nalguns laboratórios de investigação. Os anticorpos detectados por ELISA normalmente aparecem dentro de 3 semanas, mas a sua duração é desconhecida. Os anticorpos de NVS normalmente não são detectados até às 4-5 semanas após a exposição. 0 ensaio de NVS é considerado menos sensível na doença aguda, mas têm sido introduzidas melhorias no ensaio NVS utilizando um suplemento de soro porcino seronegativo. Os títulos de NVS têm sido relatados como podendo ser medidos durante um período de tempo mais longo do que os títulos em AFI e EMIP. Assim, os títulos de NVS podem ser mais apropriados para a detecção de animais positivos em varas cronicamente infectadas. 70

Antes da presente invenção, contudo, os ensaios de serologia não davam níveis de títulos de anticorpos adequados ou suficientemente fiáveis para tomar decisões sobre cuidados de saúde nos animais. A procura de um aumento da percentagem dos porcos seropositivos num grupo etário particular ao longo do tempo numa vara, pode também ser útil para determinar se o vírus se mantém e se propaga activamente. Contudo, as porcas infectadas no princípio do 3o trimestre e que abortaram próximo do termo provavelmente não exibem aumentos dos títulos. Assim, embora possa ter sido apropriado procurar uma alteração de estados seronegativos para seropositivos ou pelo menos um aumento de 4 vezes no título como uma indicação positiva da infecção e/ou exposição ao VSRRP, sente-se uma necessidade de um ensaio mais fiável com base no título.

Assim, a presente invenção também tem por objecto um processo para a detecção de antigénios de VSRRP antigénio em tecidos. 0 presente processo de diagnóstico, que utiliza um ensaio de imunoperoxidase (EIP) preferencialmente em tecido fixado com formalina, parece ser bastante útil para confirmar a presença de uma infecção activa, e pode dar um aumento significativo na fiabilidade dos ensaios à base do título. Examinou-se uma secção dos pulmões, amígdalas, nódulos linfáticos mediastínicos e nódulos linfáticos tra-queobrônquicos de 26 porcos inoculados experimentalmente inoculados com o VSRRP VR 2385 da ATCC (ver experiência V a seguir). Detectou-se o vírus em 18/26 pulmões, 26/26 amígdalas, 15/26 nódulos linfáticos mediastínicos, e 14/26 nódulos linfáticos traqueobrônquicos. Os porcos neste estudo foram mortos durante um período de 28 dias (post-inoculação). Detectou-se o vírus em pelo menos um tecido em todos os porcos necropsiados até 10 dias após a inoculação. 71

Uma técnica completa relacionada com a presente técnica de imunoperoxidase para a detecção do antigénio do VSRRP em tecidos porcinos, com base num ensaio com estreptavidina-biotina, está descrita no Exemplo V aqui a seguir. Em resumo, o presente processo para a detecção de VSRRP compreende a eliminação da peroxidase endógena de uma amostra de tecido porcino isolado com peróxido de hidrogénio aquoso (preferencialmente, uma solução a 0,1-5 %, e mais preferencialmente, 0,1-1,0%), e a digestão do tecido com uma quantidade suficiente de uma protease apropriada para expor antigénios virais (por exemplo, protease XIV, Sigma Quimica Company, St. Louis, MO, e mais preferencialmente, a sua solução aquosa a 0,001-0,2 %) . Depois, o processo ainda compreende a incubação de um fluido de ascite do anticorpo monoclonal primário (preferencialmente diluído em TRIS/SBF numa quantidade de 1:10 a 1: 100.000, e mais preferencialmente, de 1:100 a 1:10.000) com as secções de tecido tratadas com protease numa câmara húmida durante um período de tempo suficiente e a uma temperatura apropriada para providenciar a ocorrência de uma ligação imunológica praticamente completa, se de facto ocorrer (por exemplo, 16 horas a 4 °C).

Um anticorpo monoclonal apropriado para ser utilizado no presente ensaio de diagnóstico em SDOW-17 (disponível no Dr. David Benfield, South Dakota State Univ.), que reconhece um epítopo conservado da proteína da cápside do núcleo do VSRRP (Nelson et al, "Differentiation of U.S. and European isolates of porcine reprodutiva and respiratory sindrome vírus by monoclonal antibodíes," J. Clin. Micro., 31: 3184-3189 (1993)). O presente processo para a detecção de VSRRP compreende ainda a incubação de anticorpo de ligação anti-rato de 72 cabra biotinilado (disponível na Dako Corporation, Carpintera, CA) com o tecido, seguido de incubação de estreptavidina conjugada com peroxidase com o tecido tratado com o anticorpo biotinilado (Zymed Laboratórios, South San Francisco, CA) . 0 processo compreende ainda a incubação do tecido tratado com estreptavidina conjugada com peroxidase com um cromagénio, tal como tetracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina (disponível nos Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA), e finalmente, corando o tecido tratado com hematoxilina.

Particularmente quando combinado com outras técnicas de diagnóstico de histopatologia, processos de isolamento de vírus e serologia, a presente técnica de detecção da imuno-peroxidase do tecido oferece um diagnóstico rápido e fiável da infecção por VSRRP.

Outras caracteristicas da presente invenção tornar-se-á evidente no decurso das descrições que se seguem dos enquadramentos dos exemplos, que são dadas a titulo de ilustração da presente invenção, e não pretendem limitá-la.

EXPERIÊNCIA I CLONAGEM MOLECULAR E SEQUENCIAÇÃO DE NUCLEÓTIDOS DA REGIÃO DO TERMINAL 3' DE VR 2385 (ISU-12 DE PLACAS PURIFICADAS) (I) Materiais e métodos (A) Propagação e Purificação de vírus

Utilizou-se uma linha de células contínua, PSP-36, para isolar e propagar ISU-12. 0 vírus de ISU-12 vírus foi purificado em placas 3 vezes em células PSP-36 (o vírus 73 ISU-12 purificado em placa foi depositado, nos termos e condições do Tratado de Budapeste, na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, E.U.A., com o n° de acesso VR 2385). As células PSP-36 foram então infectadas com o virus purificado em placa. Quando mais do que 70 % das células infectadas mostraram alterações citopática, congelou-se e descongelou-se a cultura três vezes. Clarificou-se então o meio de cultura por meio de centrifugação a baixa velocidade a 5,000 X g durante 15 min. a 4 °C. O virus precipitou então com PEG-8000 a 7 % e NaCl a 2,3 % a 4 °C durante a noite com agitação, e transformou-se o precipitado em peletes por centrifugação. Os peletes do virus foram então novamente suspensos em 2 ml de tampão de Tris-EDTA, e dispôs-se em camadas no topo de um gradiente de CsCl (1,1245-1,2858 g/ml). Depois da ultra-centrifugação a 28.000 rpm durante cerca de 8 horas a 20 °C, observou-se e colheu-se uma banda clara com uma densidade de 1,15-1,18 g/ml. Determinou-se o titulo de infectividade desta banda por AFI, e verificou-se que o titulo era de 106 TCID50/ml. Observaram-se também partículas típicas do vírus por meio da coloração negativa num microscópio électrónico (ME). (B) Isolamento do ARN virai

Isolou-se o ARN total a partir da banda contendo o vírus no gradiente de CsCl comercialmente disponível com um kit de isolamento de ARN (obtido na Stratagene). Enriqueceu-se então o ARN de Poli (A) por meio de croma-tografia em coluna de oligo (dT)-celulose de acordo com o processo descrito pelo fabricante da coluna (Invitrogen). (C) Construção de uma biblioteca de ADNc λ de VR 2385 74

Na figura 3 mostra-se um processo esquemático geral para a construção de uma biblioteca de ADNc λ. A sintese da primeira hélice de ADNc a partir do ARNm realizou-se por transcrição inversa utilizando um iniciador de oligo (dT) com um sítio de restrição de Xho I. A mistura de nucleótidos continha dATP, dGTP, dTTP normais e o análogo de 5-metil dCTP, que protege o ADNc das enzimas de restrição utilizadas em etapas subsequentes de clonagem. A síntese da segunda hélice de ADNc foi então realizada com RNAse H e polimerase I de ADN. Tornaram-se cegos os terminais de ADNc (blunt-ended) com polimerase de ADN de T4, ligada aos adaptadores de EcoR I com ligase de ADN de T4, e em seguida fosforilou-se com polinucleótido-cinase de T4. 0 ADNc foi digerido com Xho I, e o ADNc digerido foi seleccionado por dimensão em gel de agarose. Seleccionaram-se os ADNc diferidos com uma dimensão maior do que 1 kb e purificaram-se por meio de um kit de purificação de ADN comercialmente disponível (GENECLEAN, disponível na BIO 101, Inc., La Jolla, Califórnia).

Os ADNc purificados foram então ligados aos braços do vector do fago lambda, foram tratados por engenharia genética com as extremidades de coesão de Xho I e EcoR I. O vector ligado foi acondicionado em fagos lambda infecciosos com extractos lambda. Utilizaram-se as estirpes SURE (disponíveis na Stratagene) de células de E. coli para a transfecção, e amplificou-se então a biblioteca lambda e titulou-se na estirpe da célula azul XL-1. (D) Rastreio da biblioteca X por hibridação diferencial

Na figura 4 mostra-se um processo esquemático geral para a identificação de clones autênticos do vírus do SRRP da estirpe VR 2385 estirpe por hibridação diferencial, que 75 se descreve aqui a seguir. A biblioteca de λ foi colocada em placas, em células azuis XL-1, penduraram-se as placas em membranas de nylon em duplicado e desnaturaram-se com NaOH 0,5 N por uma metodologia convencional. Isolaram-se os ARN's mensageiros a partir tanto das células PSP-36 infectadas com virus como células PSP-36 não infectadas por meio de cromatografia em coluna de oligo (dT)-celulose conforme descrito pelo fabricante da coluna (Invitrogen).

Sintetizaram-se as sondas complementares de ADN a partir de ARNm's isolados a partir tanto das células PSP-36 infectadas com virus e células PSP-36 normais utilizando iniciadores aleatórios na presença de 32P-dCTP de acordo com o processo descrito pelo fabricante (Amersham). Purificaram-se então duas sondas (a primeira sintetizada a partir de células PSP-36 infectadas com virus, a outra a partir de células PSP-36 normais não infectadas) individualmente por meio de cromatografia em coluna Sephadex G-50. Hibridaram-se as sondas com as membranas de nylon em duplicado, respectivamente, a 42 °C em formamida a 50 %. Isolaram-se as placas que hibridaram com a sonda preparada a partir de células infectadas com virus, mas não com a sonda preparada a partir de células normais. Recuperaram-se os fagemidos contendo as inserções de ADNc por uma excisão in vitro com a ajuda de fagos auxiliares de G408. Amplificaram-se então os fagemidos recuperados em células azuis XL-1. Os plasmidos contendo inserções de ADNc virai foram isolados por cromatografia em coluna Qiagen e em seguida sequenciou-se. (E) Sequenciação de nucleótidos e análise das sequências

Os plasmidos contendo inserções de ADNc virai foram isolados por cromatografia em coluna Qiagen e sequenciados 76 por um processo de didesoxi de Sanger com iniciadores universais e inversos, assim como uma variedade de iniciadores internos de oligonucleótidos. Obtiveram-se as sequências a partir de, pelo menos, três clones separados. Os clones ou regiões adicionais foram sequenciados quando se obtiveram dados ambiguos das sequências. Os dados da sequência de nucleótidos foram reunidos e analisados independentemente utilizando dois programas de software de computador, GENEWORKS (IntelliGenetics, Inc., Mountain View, Califórnia) e MACVECTOR (International Biotechnologies, Inc., New Haven, Connecticut). (F) Iniciadores de oligonucleótidos

Sintetizaram-se os oligonucleótidos como ADN de hélice simples utilizando um sintetizador automático de ADN (Applied Biosystems) e purificaram-se por CLAR:. Sintetizaram-se os oligonucleótidos PP284 (5'-CGGCCGTGTG GTTCTCGCCAAT-3'; SEQ ID NO: 1) e PP285 (5'-CCCCATTTGC CTCTAGCGAC TG-3'; SEQ ID NO: 2) por amplificação por RCP. Gerou-se uma sonda de ADN sonda com estes dois iniciadores a partir da extremidade 3' do genoma virai para a análise de mancha (Northern blot) (ver a discussão a seguir). Os oligonucleótidos PP286 (5'-GCCGCGGAAC CATCAAGCAC-3'; SEQ ID NO: 3) e PP287 (5 ' -CAACTTGACG CTATGTGAGC-3' ; SEQ ID NO: 4) foram sintetizados por amplificação por RCP. Utiliza-se uma sonda de ADN gerada por estes dois iniciadores para melhor rastrear a biblioteca X. Os oligonucleótidos PP288 (5'-GCGGTCTGGATTGACGACAG-3' ; SEQ ID NO: 5), PP28 9 (5'-GACTGCTAGG GCTTCTGCAC-3'; SEQ ID NO: 6), PP386 (5'-GCCATTCAGC TCACATAGCG-3' ; SEQ ID NO: 7), PP286 e PP287 foram utilizados como iniciadores de sequenciação para se obter sequências internas. 77 (G) Análise de mancha (Northern blot)

Amplificou-se um fragmento de ADN específico da extremidade 3' do clone de ADNc de VR 2385 por RCP com os

iniciadores PP28 4 e PP285. Excitou-se o fragmento de ADN fragmento a partir de gel de agarose com um kit de purificação de ADN comercialmente disponível (GENECLEAN, obtido da Bio 101), e marcou-se com 32P-dCTP por extensão aleatória de um iniciador (utilizando um kit disponível na Amersham). Isolou-se o ARN total a partir de células PSP-36 infectadas com VR 2385, 36 horas post-infecção, utilizando um kit comercialmente disponível para o isolamento do ARN total de acordo com o processo descrito pelo fabricante (Stratagene). Desnaturaram-se as espécies de ARNm sub-genómico de VR 2385 com glioxal 6 M e DMSO, e separaram-se num gel de agarose a 1 %. (Resultados a partir de um processo similar substituindo um gel de agarose a 1,5 % descrito na experiência II a seguir e ilustrados na figura 5.) Os ARNm's sub-genómicos separados foram então transferidos para membranas de nylon utilizando uma peça absorvente à pressão POSIBLOTTM (Stratagene). Realizou-se a Hibridação num forno de hibridação com frascos rolantes a 42 °C e em formamida a 50 %.

RESULTADOS (A) Clonagem, identificação e sequenciação do genoma do terminal 3' de VR 2385

Construiu-se uma biblioteca λ de ADNc iniciado por oligo (dT) a partir células PSP-36 infectadas com VR 2385. Encontraram-se problemas no rastreio da biblioteca λ de ADNc com sondas à base da sequência do vírus Lelystad. Prepararam-se três conjuntos de iniciadores. 0 primeiro 78 conjunto (PP105 e PP106; SEQ ID NOS: 8-9) corresponde às posições 14577 a 14595 e 14977 a 14995 da sequência genómica dé Lelystad, localizada na região do gene da cápside do núcleo. 0 segundo conjunto (PP106 e PP107, SEQ ID NOS: 9-10) corresponde às posições 14977 a 14995 e 14054 a 14072 da sequência genómica de Lelystad, que flanqueia os QLA's 6 e 7. O terceiro conjunto (PM541 e PM542; SEQ ID NOS: 11-12) corresponde às posições 11718 a 11737 e 11394 a 11413 da sequência genómica de Lelystad, localizada na região do QLA-lb. PP105: 5'-CTCGTCAAGT ATGGCCGGT-3' (SEQ ID NO: 8) PP106: 5'-GCCATTCGCC TGACTGTCA-3' (SEQ ID NO: 9) PP107: 5'-TTGACGAGGA CTTCGGCTG-3' (SEQ ID NO: 10) PM541: 5'-GCTCTACCTG CAATTCTGTG-3' (SEQ ID NO: 11) PM542: 5'-GTGTATAGGA CCGGCAACCG-3' (SEQ ID NO: 12)

Todas as tentativas para gerar sondas por RCP a partir do agente infeccioso VR 2385 utilizando estes três conjuntos de iniciadores foram infrutíferas. Depois de várias tentativas para utilizar a técnica de hibridação, contudo, isolaram-se as placas autênticas que representavam o ADNc específico de VR 2385 utilizando sondas preparadas a partir de células PSP-36 infectadas com VR 2385 e células PSP-36 normais. Os processos envolvidos na hibridação diferencial estão descritos no conjunto da figura 4.

Identificaram-se inicialmente três placas positivas (λ-4, λ-75 e λ-91). Recuperaram-se os fagemidos contendo inserções de ADNc virai dentro dos fagos X por meio de uma excisão in vitro com a ajuda dos fagos auxiliares de G408. As inserções dos clones positivos foram analisadas por digestão da enzima de restrição e sequenciação do terminal. A especificidade dos clones de ADNc foi ainda confirmada 79 por hibridação com ARN a partir de células PSP-36 infectada com a estirpe Iowa de VSRRP, mas não com o ARN de células PSP-36 normais. Uma sonda de ADN foi então gerada a partir da extremidade 5' do clone λ -75 por RCP com os iniciadores. PP286 e PP287. Identificaram-se outras placas positivas (λ -229, λ-268, λ-275, λ-281, λ-323 e λ-345) utilizando esta sonda. Outros clones de ADNc utilizados para obter as sequências do nucleótido do terminal 3' estão apresentados na fig. 6. Sequenciaram-se pelo menos três clones separados para eliminar qualquer erro. No caso de qualquer dado ambíguo da sequência, utilizaram-se os clones e os iniciadores internos adicionais (PP288, PP289, PP286, PP287 e PP386) para determinar a sequência. A sequência (SEQ ID NO: 13) de terminal 3' de 2062 pb e as sequências de aminoácidos codificadas pelos QLA's 5, 6 e 7 (SEQ ID NOS: 15, 17 e 19, respectivamente) estão apresentadas na figura 7 . (B) Um Conjunto aninhado do ARNm subgenómico

Separou-se o ARN total das células PSP-36 infectadas com o vírus em gel de agarose de glioxal a 1 %/DMSO, e fez-se a análise de manchas em membranas de nylon. Gerou-se uma sonda de ADNc por RCP com um conjunto de iniciadores (PP284 e PP285) flanqueando a região extrema do terminal -3' do genoma virai. A sonda contém uma sequência não transla-cional de 3' e a maior parte da sequência do QLA-7. Os resultados da hibridação por Northern blot mostram que os modelos das espécies de ARNm das células PSP-36 infectada com a estirpe Iowa de VSRRP são muito semelhantes aos do virus Lelystad (VL), virus da arterite de equino (VAE), vírus de lactato-desidrogenase (VLD) e coronavírus, pelo facto de a replicação do virus requerer a formação de ARNm.'s sub-genómicos. 80

Os resultados também indicam que os ARNm's sub-genómicos específicos de VR 2385 representam um conjunto aninhado em 3' dos ARNm's, porque a sonda de Northern blot representa apenas a sequência do extremo do terminal 3Γ. A dimensão do ARN genómico virai de VR 2385 (14 kb) e dos 6 ARNm's sub-genómicos (ARN 2 (3,0 kb), ARN 3 (2,5 kb), ARN 4 (2,2 kb), ARN 5 (1,8 kb), ARN 6 (1,3 kb) e ARN 7 (0,98 kb)) parecem-se com os do VL, embora haja diferenças tanto no genoma como nas espécies de ARN sub-genómico. Também se observaram diferenças nas quantidades relativas dos ARNm's sub-genómicos, . sendo o ARN 7 o ARNm sub-genómico mais predominante. (C) Análise dos quadros de leitura aberta codificados pelo ARN sub-genómico

Encontraram-se três grandes QLA's nas SEQ. ID NO: 13: QLA-5 (nucleótidos [nt] 426-1025; SEQ ID NO: 14), QLA 6 (nt 1013-1534; SEQ ID NO: 16) e QLA 7 (nt 1527-1895; SEQ ID NO: 18). O QLA 4, localizado na extremidade 5' da sequência resultante, está incompleto na sequência de 2062-pb do terminal 3' da SEQ ID NO: 13. Os QLA'S 5, 6 e 7 têm cada um uma capacidade de codificação de mais do que 10 0 amino-ácidos. Os QLA 5 e QLA 6 sobrepõem-se um ao outro por 13 pb, e QLA 6 e QLA 7 sobrepõem-se um ao outro por 8 pb. Também se encontraram dois QLA's mais pequenos localizados inteiramente dentro de QLA 7, codificando para apenas 37 aa e 43 aa, respectivamente. Outros dois QLA's curtos sobrepõem-se completamente a QLA 5. A capacidade de codificação destes dois QLA's é de apenas 29 aa e 44 aa, respectivamente. Nenhum ARNm sub-genómico específico estava correlacionado com estes QLA's mais pequenos como se comprova por análise de mancha (Northern blot). Crê-se que QLA 6 e 81 QLA 7 codificam a proteína da membrana virai e a proteína da cápside, respectivamente. (D) Sequência de consenso para a junção lider A análise das sequências mostra que um elemento curto da sequência, AACC, pode servir como o sítio no ARNm sub-genómico aonde se adiciona líder durante a transcrição (o sítio de junção). 0 sítio de junção do QLA 6 encontra-se 21 pb a montante do codão de iniciação de ATG e o sítio de junção de QLA 7 encontra-se 13 pb a montante do codão de iniciação de ATG, respectivamente. Não se identificou nenhuma sequência de consenso AACC no QLA 5, embora se tenha encontrado no QLA 5 de VL. Encontraram-se sequências de junção semelhantes no VLD e no VAE. (E) Sequência não translacional de 3' e cauda de poli(A)

Identificou-se uma sequência não translacional com 151 nucleótidos de comprimento (151 nt) no seguimento do codão de paragem de QLA 7 no genoma de VR 2385, comparada com os 114 nt em VL, 80 nt em VLD e 59 nt em VAE. 0 comprimento da cauda de poli (A) é de pelo menos 13 nucleótidos. Há uma sequência de consenso, CCGG/AAATT-poli (A) entre VR 2385, VL e VLD do vírus de SRRP na região adjacente à cauda de poli(A).

(F) Comparação das sequências dos genomas de VR 2385 e de VL

Entre os QLA's 5, 6 e 7, e entre as sequências não translacionais

Na figura 8 mostra-se' uma comparação das regiões de QLA-5 dos genomas dos vírus VR 2385 e Lelystad (SEQ ID NO: 82 20). As comparações correspondentes da região de QLA-β, da região de QLA-7, e das sequências não translacionais de VR 2385 (SEQ ID NOS: 16, 18 e 22, respectivamente) com as regiões correspondentes de VL (SEQ ID NOS: 23, 25 e 27, respectivamente) estão ilustradas nas figuras 9, 10 e 11, respectivamente.

Os resultados das comparações estão apresentados no quadro a seguir. As homologias das sequências de nucleótidos entre VL e VR 2385 dos QLA 5, QLA 6, QLA 7 e das sequências não translacionais são de 53 %, 78 %, 58 % e 58%, respectivamente.

Esta dimensão do QLA 7 em VL tem mais 15 nt do que a de VR 2385. Também, a sequência nao translacional do terminal 3' tem um comprimento diferente (150 nt em VR 2385, mas apenas 114 nt em VL). Tal como VL, a sequência de junção, AACC, também foi identificado no genoma da estirpe Iowa do produto isolado do virus do SRRP VR 2385, excepto para o QLA 5. A sequência de junção de QLA 6 no VR 2385 está 21 nt a montante do codão de iniciação ATG, enquanto a sequência de junção de QLA 6 está 28 nt a montante de ATG em VL. 83

Quadro 1: Comparação dos genes dos produtos isolados do VSRRP dos E.U.A.,, VR 238 5 da ATCC com o produto isolado do virus Lelystad europeu*

Gene ARN Dimensão estimada do ARN (em Kb) QLAs VR 2385 Lelystad Homologia entre Dimen. Aminoá- cidos N- glico- silação sites Diemsão da proteína prevista <kd) Dimen. Aminoá -eidos N- glico- silação sites Diemsão da proteína prevista (kd) VR2385& Lelystad 5 5 1,9 5 200 2 22,2 201 2 22,4 53 6 6 1,4 6 174 1 19,1 173 2 18,9 78 7 7 0,9 7 123 2 13,6 128 1 13,8 58 NTR ' ‘ ' 151 (nt) NA 114 (nt) 0 NA 58 (nt) *: Com base nos dados apresentados por Conzelmann et al, Virology, 193, 329-339 (1993), Meulenberg et al, Virology, 192, 62-72 (1993), e os resultados aqui apresentados.

EXPERIÊNCIA II EXPRESSÃO DOS GENES DE VR 2385 EM CÉLULAS DE INSECTOS (A) Produção of baculovirus recombinante

Amplificaram-se individualmente as sequências dos QLA-5, QLA-6 e QLA-7 por RCP utilizando iniciadores à base da sequência de nucleótidos de VR ^2385 (ISU-12) genómico.

Amplificou-se o QLA-5 utilizando os iniciadores que se seguem: 5'-GGGGATCCGG TATTTGGCAA TGTGTC-31 (SEQ ID NO: 28) 3'-GGGAATTCGC CAAGAGCACC TTTTGTGG-5' (SEQ ID NO: 29)

Amplificou-se o QLA-6 utilizando os iniciadores que se seguem: 5'-GGGGATCCAG AGTTTCAGCG G-3’ (SEQ ID NO: 30) 3'-GGGAATTCTG GCACAGCTGA TTGAC-5' (SEQ ID NO: 31) 84

Amplificou-se o QLA-7 utilizando os iniciadores que se seguem: 5'-GGGGATCCTT GTTAAATATG CC-3' (SEQ ID NO: 32) 3'-GGGAATTCAC CACGCATTC-5' (SEQ ID NO: 33)

Clonaram-se os fragmentos de ADN amplificados no vector de transferência do baculovirus pVL1393 (disponível na Invitrogen) . Misturou-se um pg do AND AcMNPV do baculovirus linearizado (comercialmente disponível na Pharmingen, San Diego, Califórnia) e 2 pg das estruturas do vector contendo ADNc clonado e amplificado por RCP, com 50 pl de lipofectina (Gibco), e incubou-se a 22 °C durante 15 min. para preparar uma mistura de transfecção.

Uma hora após a sementeira das células HI-FIVE, substituiu-se o meio com um meio fresco de cultura de células de insectos Exceli 400 (disponível na JR Scientific Co.), e adicionou-se gota a gota a mistura de transfecção. Fez-se a incubação da mistura resultante a 28 °C durante seis horas. Depois, eliminou-se o meio de transfecção, e adicionou-se meio fresco de cultura de células de insectos Exceli 400. Fez-se então a incubação da mistura a 28°C.

Cinco dias após a transfecção, recolheu-se e purificou-se o meio de cultura. Inocularam-se nas células HI-FIVE com os sobrenadantes diluídos dez vezes, e fez-se a incubação durante 60 min. à temperatura ambiente. Depois de se ter descartado o inoculo, aplicou-se sobre as células mais uma camada de agarose a 1,25 %. A incubação a 28 °C foi realizada durante quatro dias. Depois, seleccionaram-se as placas purificadas e fez-se uma repescagem utilizando uma pipeta de Pasteur esterilizada. Misturou-se uma com 1 ml meio de insecto de Grace num tubo de 5 ml com tampa de 85 mola, e colocou-se num frigorifico durante a noite para libertar o virus da agarose. Centrifugaram-se os tubos durante 30 minutos a 2000 x g para eliminar a agarose, e transferiram-se os sobrenadantes para novos tubos esterilizados. Repetiram-se três vezes as etapas de purificação das placas para evitar possiveis contaminações com virus do tipo selvagem. Armazenaram-se os clones recombinantes puros a -80 °C durante uma investigação posterior. (B) Expressão de proteínas recombinantes de um agente infeccioso da estirpe Iowa

Para avaliar a expressão, utilizou-se um ensaio por imunofluorescência indirecta e ensaios de radioimuno-preci-pitação.

Ensaio por imunof luorescência indirecta: Infectaram-se células de insectos Hi-five numa placa de junção de. culturas de células com 24 cavidades, com baculovirus de tipo selvagem ou baculovirus recombinante, ou simulou-se a infecção. Passadas 72 horas, fixaram-se as células e coraram-se com diluições apropriadas de anticorpos poli-clonais de VR 2385 anti-suinos, seguido de IgG anti-suino marcado com isotiocianato de fluoresceína (marcada com ITCF). Detectou-se imuno-fluorescência em células infectadas com o vírus, mas não nas células com infecção simulada ou nas células inoculadas com baculovirus de tipo selvagem. Por exemplo, a figura 12 mostra células HI-FIVE infectadas com o baculovirus recombinante contendo o gene do QLA-7 VR 2385 (Báculo.VSRRP.7), que exibiu um efeito citopático. Obtiveram-se resultados similares com baculovirus recombinante contendo QLA-5 (Báculo.VSRRP.5) e QLA-6 (Báculo.VSRRP.6; dados não mostrados). As figuras 13 e 14 mostram células HI-FIVE infectadas com um baculovirus 86 recombinante contendo o gene de QLA-6 de VR 238 5 e o gene do QLA-7 VR 2385, respectivamente, seguido de IgG anti-suíno conjugada com fluoresceína, em que as células de insectos produzem a proteína virai recombinante da estirpe Iowa. Obtém-se resultados semelhantes com o QLA-5 contendo o baculovírus recombinante.

Radioimunoprecipitação: Realizou-se a radioimunopreci-pitação com cada um dos vírus recombinantes (Báculo.VSRRP.5, Báculo.VSRRP.6 e Báculo.VSRRP.7) para determinar ainda a antigenicidade e a autenticidade das proteínas recombinantes. As células de insectos HI-FIVE foram infectadas de modo simulado, ou alternativamente, infectadas com cada um dos baculovírus recombinantes. Dois dias depois da infecção, adicionou-se meio isento de metionina. Incubou-se cada uma das misturas durante duas horas, e depois marcaram-se as proteínas com 35S-metionina (Amersham), e fez-se a incubação da mistura durante mais quatro horas a 28 °C. Prepararam-se os lisados das células marcadas com rádio por meio de três ciclos de congelação e descongelação, e icubaram-se os lisados de células com anti-soro pré-imune ou imune anti-VR 2385. Os complexos imunitários precipitaram com Proteína A-agarose e foram analisados por EGPA-SDS (electroforese em gel de poliacrilamida e sulfato de dodecilo e sódio) depois de serem levados à ebulição. Expôs-se o filme de raios X a géis a -80 °C, e revelou-se. Detectaram-se as bandas com a dimensão esperada com os produtos QLA-β (figura 15) e QLA-7 (figura 16). 87

EXPERIÊNCIA III

Resumo:

Determinou-se a variação genética e a possível evolução do vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (VSRRP) por clonagem e sequenciação da putativa proteína da membrana (M, QLA 6) e dos genes da cápside do núcleo (N, QLA 7) de seis produtos isolados de VSRRP dos E.U.A. com virulência diferente. As sequências de aminoácidos deduzidas das putativas proteínas M e N de cada um destes produtos isolados foram alinhadas com as sequências correspondentes (até a um grau conhecido) de um outro produto isolado dos E.U.A., dois produtos isolados europeus, e outros membros do grupo de arterivírus proposto, incluindo o vírus de promoção de lactato-desidrogenase (VLD) e vírus da arterite equina (VAE).

Os putativos genes M e N exibiram uma identidade se sequência de aminoácidos de- 96-100 % entre produtos isolados de VSRRP dos E.U.A. com virulência diferente. Contudo, as suas sequências de aminoácidos variaram muitíssimo das dos produtos isolados de VSRRP europeus, e exibiram uma identidade de 57-59 % e de 78-81 %, respecti-vamente. Os produtos isolados de VSRRP dos E.U.A. estavam muito mais proximamente relacionados com VLD do que com os produtos isolados de VSRRP europeus. A proteína N dos produtos isolados dos E.U.A. e dos produtos isolados europeus partilharam uma identidade de sequências de aminoácidos de cerca de 50 % e de 40 % com as de VLD, respectivamente.

Os dendrogramas filogenéticos construídos com base nos putativos genes M e N do proposto grupo de arterivírus eram 88 similares e indicavam que, tanto os produtos isolados de VSRRP dos E.U.A., como os produtos isolados de VSRRP europeus estavam relacionados com o VLD e só estavam vagamente relacionados com o VAE. Os produtos isolados de VSRRP dos E.U.A. e europeus caem em dois grupos distintos com uma ligeira diferença genética relativamente a VLD. Os resultados sugerem que os produtos isolados de VSRRP dos E.U.A. e europeus representam dois genotipos diferentes, e que podem ter evoluído a partir de VLD em diferentes períodos de tempo e podem ter existido separadamente nos E.U.A. e na Europa antes da sua associação com o SRRP ser reconhecida em suínos. 0 QLA 6 codifica a proteína da membrana proteína (M) de VSRRP, com base em características semelhantes do QLA 6 de VAE, QLA 2 deVLD, e a proteína M proteína do vírus da hepatite de rato e o vírus da bronquite infecciosa (Meulenberg et al, Virology, 192, 62-72 (1993); Conzelmann et al, Virology, 193, 329-339 (1993); Mardassi et al, Abstr. Conf. Res. Workers in Animal Diseases, Chicago, IL, p. 43 (1993)) . 0 produto de QLA 7, a proteína virai da cápside do núcleo (N), é extremamente básico e hidrofílico (Meulenberg et al, Virology, 192, 62-72 (1993); Conzelmann et al, Virology, 193, 329-339 (1993); Murtaugh et al, Proc. Allen D. Leman Swine Conference, Minneapolis, MN, pp. 43-45 (1993); Mardassi et al, Abstr. Conf. Res. Workers in Animal Diseases, Chicago, IL, p. 43 (1993) ) .

Compararam-se as sequências de aminoácidos codificadas pelos QLA's 5, 6 e 7 do produto isolado dos E.U.A. VR 2385 e do produto isolado europeu do vírus Lelystad (VL) e a identidade (isto é, a percentagem de aminoácidos na sequência que forem iguais) entre os dois vírus é de apenas 54 %, 78 % e 58 %, respectivamente. Assim, existem diferen- 89 ças impressionantes entre os produtos isolados dos E.U.A. VR 2385 e o VL isolado europeu (ver o pedido de patente U.S. da série com o No. 08/131.625, registada em 5 de Outubro de 1993).

Contudo, o produto isolado dos E.U.A. VR 2385 é altamente patogénico comparado com o VL Europeu. Assim, os produtos isolados de VSRRP dos E.U.A. e na Europa parecem ser antigénicamente e genéticamente heterogéneos, e podem existir diferentes genotipos ou serotipos de VSRRP.

Para determinar melhor a variação genética entre os produtos isolados de VSRRP, clonaram-se e sequenciaram-se os putativos genes M e N de mais cinco produtos isolados de VSRRP dos E.U.A. com virulências diferentes. Construiram-se árvores filogenéticas com base nos putativos genes M e N de sete produtos isolados de VSRRP dos E.U.A., dois produtos isolados de VSRRP Europeus e outros elementos do grupo de arterivirus proposto, incluindo VLD e VAE.

Os produtos isolados de VSRRP (ISU-12 (VR 2385NR 2386), ISU-22 (VR 2429), ISU-55 (VR 2430), ISU-79, ISU-1894 e ISU-3927 (VR 2431), que estão indicados e descritos no pedido de patente de invenção U.S. da série No. 08/131.625, registado em 5 de Outubro de 1993) foram isolados a partir de pulmões de suinos obtidos de diferentes explorações agrícolas no Iowa durante epidemias de SRRP, de acordo com o processo descrito no pedido de patente de invenção U.S. da série No. 08/131.625. Uma linha de células contínua, ATCC CRL 11171, foi utilizada para isolar e propagar estes vírus. Todos os vírus foram biologicamente clonados por meio de três ciclos de purificação de placas antes da sequenciação dos ácidos polinucleicos. 90

Os estudos de patogenecidade em porcos desprovidos de colostro derivados de uma cesariana (PCNC), descritos no pedido de patente de invenção U.S. da série No. 08/131.625, mostraram que VR 2385, VR 2429 e ISU-79 eram altamente patogénicos, enquanto VR 2430, ISU-1894 e VR 2431 não eram tão patogénicos. Por exemplo, VR 2385, VR 2429 e ISU-79 produziram dé 50 a 80 % de consolidação dos tecidos do pulmão em porcos PCNC com cinco semanas de idades infectados experimentalmente foram submetidos a necropsia 10 dias após a inoculação, enquanto VR 2430, ISU-1894 e VR 2431 produziram apenas 10 a 25 % de consolidação dos tecidos do pulmão na mesma experiência.

Secção experimental:

Infectaram-se monocamadas de células CRL 11171 células da ATCC com cada um dos produtos isolados de VSRRP na sétima passagem de uma m.o.i. de 0,1. 0 ARN celular total foi isolado a partir de células infectadas células por meio do processo do isotiocianato de guanidina (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)). A qualidade do ARN de cada um dos produtos isolados foi determinada por hibridação de "Northern blot" (dados não mostrados) com uma sonda de ADNc gerada a partir da extremidade 3' do genoma de VR 2385 por meio de uma reacção em cadeia de polimerase (RCP) com os iniciadores PP284 ePP285 (SEQ ID NOS: 1 e 2) , tal como descrito no pedido de patente de invenção U.S. da série No. 08/131.625. Sintetizou-se o ADNc a partir do ARN celular total com iniciadores aleatórios utilizando transcriptase inversa. O ADNc sintetizado foi amplificado por meio de uma reacção em cadeia de polimerase (RCP) como se descreveu previamente (Meng et al, J. Vet. Diagn. Invest., 5, 254-258 (1993)). 91

Projectaram-se iniciadores para RCP-TI com base numa sequência no genoma de VR 2385 que resultou numa amplificação de toda a proteína que codifica regiões dos putativos genes M e .N genes (iniciador de 5': 5'-GGGGATCCAGAGTTTCAGCGG-3' (SEQ ID NO: 30); iniciador de 3': 5'-GGGAATTCACCACGCATTC-3' (SEQ ID NO: 33)). Introduziram-se sítios de restrição únicos (EcoR I e BamH I) nas terminações dos produtos de RCP por processos convencionais. Obteve-se um produto de RCP produto com a dimensão esperada com cerca de 900 bp a partir de cada um dos vírus isolados. A hibridação de "Southern blot" foi então utilizada para confirmar a especificidade dos produtos amplificados.

Isola-se a sonda de ADNc marcada com 32P de VR 2385 hibridado com os produtos de' RCP-TI produtos de cada um dos vírus anteriores. Os produtos da RCP dos putativos genes M e N de cada Um dos produtos isolados de VSRRP foram purificados e clonados num vector pSK+. (Meng et al, J. Vet. Diagn. Invest. 5, 254-258 (1993)). Os plasmidos contendo os putativos genes M e N de comprimento completo foram sequenciados com um sequenciador automatizado de ADN (obtido na Applied Biosystems, Inc., Foster City, Califórnia). Sequenciaram-se três a quarto dos clones de ADNc de cada virus isolado com iniciadores universais e inversos, assim como outros iniciadores específicos dos vírus (PP288: 5' -GCGGTCTGGATTGACGAC-3' (SEQ ID NO: 5) e PP289: 5'-GACTGCTAGGGCTTCTGC-3' (SEQ ID NO: 6), cada um dos quais está descrito no pedido de patente de invenção U.S. da série No. 08/131.625, e DP966: 5'-AATGGGGCTTCTCCGG-3' (SEQ ID NO: 34)). Combinaram-se as sequências e analisaram-se por meio dos programas de computador MACVECTOR (Intetnational Biotechnologies, Inc.) e GENEWORKS (IntelliGenetics, Inc.). 92 A análise das sequências de nucleótidos codificando as putativas proteínas M e N dos cinco produtos isolados de VSRRP dos E.U.A. indicou que, tal como o VL (Meulenberg et al, Virology, 192, 62-72 (1993)) e VR 2385, os putativos genes M e N de cada um dos cinco produtos isolados dos E.U.A. adicionais está sobreposto por meio de 8 pares de bases (pb). A figura 17 mostra a sequência de nucleótidos dos QLA's 6 e 7 de seis produtos isolados de VSRRP dos E.U.A. e de VL, em que a sequência de nucleótido de ISU-12 (VR 2385 e VR 2386) (SEQ ID NO: 35) se mostra primeiro, e nas sequências subsequentes (SEQ ID NOS: 36-41), apenas se indicam os nucleótidos que são diferentes. Os codões de início estão sublinhados e indicados por (+1>), os codões de paragem estão indicados por asteriscos (*), estão indicados por (-) , e as duas eliminações maiores no putativo gene N estão ainda indicados por (A).

As figuras 18 (A)-(B) mostram o alinhamento de sequências de aminoácidos dos putativos . genes de M (fig. 18(A)) e N (fig. 18 (B)) do grupo proposto de arterivírus, realizado com o programa GENEWORKS (IntelliGenetics, Inc.), utilizando os seguintes parâmetros (valores por defeito): custo para abrir um intervalo é 5, o custo para a.umentar um intervalo é 25, o comprimento mínimo em diagonal é de 4, e o deslocamento máximo em diagonal é de 10. A sequência do gene M de VAE foi omitida porque a identidade relativamente baixa da sequência com VSRRP e VLD requer intervalos nos alinhamentos. As sequências de VR 2385/VR 2386 (SEQ ID NOS: 17 e 19) estão ilustradas primeiro e nas sequências subsequentes (SEQ ID NOS: 43, 45, 47, 49, 51, 24, 53, 55, 57, 59, 61 e 26, respectivamente) , estão indicadas apenas as diferenças. As eliminações estão indicadas por (-) , e as duas eliminações maiores nos putativos genes N estão ainda indicadas por (Λ). 93

Numerosas substituições na sequência de nucleótidos foram distribuídas aleatoriamente pelos genes M e N em cada um dos cinco produtos isolados, quando comparados com VR 2385. A maior parte das substituições são mutações silenciosas da terceira base quando convertidas em sequências de aminoácidos (ver fig. 18). Encontram-se inserções e eliminações nas sequências de nucleótidos dos putativos genes M e N quando se comparam os produtos isolados dos E.U.A. com VL, mas não se encontram entre os produtos isolados dos E.U.A. (fig. 17). Por exemplo, há duas eliminações maiores, de 15 e 10 nucleótidos cada, no putativo gene N dos produtos isolados dos E.U.A. quando comparados como o genoma N de VL (fig. 17).

As sequências de aminoácidos deduzidas dos putativos genes M e N de seis dos cinco produtos isolados de VSRRP da estirpe lowa estão alinhadas com a correspondente sequência N doutro produto isolado dos E.U.A., VR 2332 (Murtaugh et al, Proc. Allen D. Leman Swine Conference, Minneapolis, MN, pp. 43-45 (1993)); dois produtos europeus isolados de VSRRP, VL (Meulenberg et al, Virology 192, 62-72 (1993)) e o produto 10 isolado de VSRRP isolate (VSRRP-10) (Conzelmann et al, Virology, 193, 329-339 (1993)); duas estirpes de VLD , VLD-C (Godney et al, Virology, 177, 768- 771 (1990)) e VLD-P (Kuo et al, Vírus Res., 23, 55-72 (1992)); e. VAE (Den Boon et al, J. Virol., 65, 2910 -2920 (1991)) (fig. 18).

As sequências de aminoácidos dos putativos genes estão altamente conservadas entre os sete os produtos isolados dos E.U.A. (fig. 18 (B)), e exibem 96-100% de identidade com a sequência de aminoácidos (quadro 1) . Contudo, as putativas proteínas de N dos produtos isolados de VSRRP dos E.U.A. partilham uma identidade de sequência de aminoácidos 94 de apenas 57-59% com as dos dois produtos isolados europeus (quadro 1), sugerindo que os produtos isolados dos E.U.A. e europeus podem representar dois genotipos diferentes. A putativa proteína M de cada um dos produtos isolados dos E.U.A. estava também altamente conservada, e exibia uma similaridade de sequência mais elevada com as proteínas M proteínas dos dois produtos isolados europeus (fig. 18(A)), variando entre 78 e 81 % de identidade de aminoácidos (ver quadro 2 a seguir) . 0 putativo gene de N de cada um dos pro-dutos isolados de VSRRP dos E.U.A. partilha 49-50 % de identidade com a sequência de aminoácidos das estirpes do VLD, enquanto os dois produtos isolados de VSRRP europeus partilham apenas 40-41 % de identidade de aminoácidos com a das estirpes de VLD (quadro 2).

Duas regiões das eliminações das sequências de aminoácidos, "KKSTAPM" (SEQ ID NO: 62) e "ASQG" (SEQ ID NO: 63), foram encontradas nas putativas proteínas N proteínas de cada um dos sete produtos isolados VSRRP dos E.U.A., assim como as duas estirpes de VLD e VAE, quando comparadas com os dois produtos isolados de VSRRP europeus (fig. 18(B)). Estes resultados indicaram que os produtos isolados de VSRRP dos E.U.A. estão relacionados de forma mais próxima com VLD do que com os produtos isolados de VSRRP europeus, e esse VSRRP pode ter sofrido uma evolução divergente nos E.U.A. e na Europa antes da sua associação com o SRRP em suínos ter sido reconhecida (Murtaugh, Proc. Allen D. Leman Swine Conferência, Minneapolis, MN, pp. 43-45 (1993)).

Os produtos isolados europeus podem ter divergido de VLD for por um tempo mais longo do que os produtos isolados dos E.U.A., e por isso podem ter evoluído primeiro. Contudo, a identidade da sequência de aminoácidos do 95 putativo gene M entre os produtos isolados de VSRRP e as estirpes de VLD é semelhante à existente entre os produtos isolados de VSRRP Europeus e âs estirpes de VLD (quadro 2). Os putativos genes M e N produtos isolados de VSRRP dos E.U.A. e da Europa partilham apenas 15-17 % e 22-24 % de identidade de sequência de aminoácidos com as do VAE respectivamente.

Comparação 2. Comparação aos pares das sequências de aminoácidos entre as putativas proteínas da cápside do núcleo e da membrana do grupo de arterivirus proposto

VÍRUS

Virus VR2385 ISU- 22 ISU- 55 ISU- 79 ISU- 1894 ISU- 3927 VR2332 VL VSRRP- 10 VLD- P VLE- C VAE VR2385 *** 98 96 98 98 96 96 57 57 49 49 22 ISU-22 99 k k k 98 100 100 98 98 57 57 49 49 23 ISU-55 99 100 k k k 98 98 97 96 59 59 49 49 23 ISU-79 98 99 99 *** 100 98 98 57 57 49 49 23 ISU- 1894 99 100 100 99 •k-k-k 98 98 57 57 49 49 23 ISU- 3927 96 97 97 97 97 *** 96 59 59 49 49 23 VR2332 N/D N/D N/D N/D N/D N/D k k k 57 57 50 49 22 VL 78 79 79 79 79 81 N/D *** 99 41 40 23 VSRRP- 10 78 79 79 79 79 81 N/D 100 41 40 23 VLD-P 50 51 51 51 51 51 N/D 53 53 * * * 98 23 VLD-C 49 50 50 50 50 50 N/D 52 52 96 24 VAE 16 16 16 16 16 15 N/D 17 17 16 17

Nota.s Os valores no quadro são a percentagem de identidade das sequências de aminoácidos. N/D, não disponível. b As comparações da proteína da cápside do núcleo são apresentadas na metade superior direita e as comparações da proteína da membrana são apresentadas na metade inferior esquerda. A homologia da sequência de VSRRP com a de VLD e de VAE sugere que estes vírus estão fortemente relacionados e podem ter evoluído de um ancestral comum (Plaqemann et al, 96 supra; Murtauqh, supra). A elevada conservação da sequência entre VLD e VSRRP suportou a hipótese de que o VSRRP pode ter evoluído de VLD e ter-se adaptado rapidamente a novas espécies hospedeiras (Murtaugh, supra). Verificou-se uma infecção assintomática de VLD em todas as estirpes de ratos (Murtauqh, supra; Kuo et al, supra). Contudo, muitos tipos de porcos estão infestados com roedores selvagens (Hooper et al, J.. Vet. Diagn. Invest., 6, 13-15 (1994)), por isso é possível que o VSRRP tenha evoluído a partir de ratos infectados com VLD, e se tenha adaptado rapidamente a novos hospedeiros, os suínos.

As relações evolucionárias de VSRRP com outros membros do grupo proposto de arterivírus foram determinadas com base na sequência de aminoácidos dos putativos genes M e N. A figura 19 mostra uma árvore filogenética do grupo proposto de arterivírus com base na sequência de aminoácidos dos putativos genes M e N. A árvore filogenética para o gene N é praticamente a mesma que a do gene M. 0 comprimento das linhas horizontais que ligam uma sequência à outra é proporcional à distância genética estimada entre sequências, conforme se indica pelos números dados antes de cada linha. As árvores PGPMA (processo dos grupos de pares ponderados com a media aritmética) foram construídas com o programa GENEWORKS (IntelliGenetics, Inc.), que agrupa primeiro as duas sequências mais semelhantes, depois agrupa-se por semelhança média destas duas sequências com as próximas sequências mais semelhantes ou sub-alinhamentos e o agrupamento continua desta forma até todas as sequências/produtos isolados estarem localizadas na árvore; nenhuma das duas árvores tem raiz.

Os produtos isolados de VSRRP isolates caem dentro de dois grupos distintos. Todos os produtos isolados de VSRRP 97 dos E.U.A. ainda longe de estarem sequenciados estão bastante relacionados entre si e formam um grupo. Os dois produtos isolados de VSRRP europeus estão bastante relacionados entre si e formam um outro grupo. Tanto os produtos isolados de VSRRP dos E.U.A. como os europeus estão relacionados com as estirpes de VLD e só de muito longe estão relacionados com o VAE (fig. 19).

Os modelos de evolução para os putativos genes N e M também sugerem que o VSRRP pode ser uma variante de VLD. Por exemplo, a distância genética dos produtos isolados de VSRRP dos E.U.A. é ligeiramente mais próxima do VLD do que os produtos isolados de VSRRP europeus (fig. 19), sugerindo novamente que os VSRRP norte-americanos e europeus pode ter evoluido a partir de VLD em períodos de tempo diferentes e podem ter existido separadamente antes da sua associação com o SRRP ter sido reconhecida em suínos. 0 VSRRP europeu pode ser evoluído mais cedo do que o VSRRP dos E.U.A. Também é possível que os VSRRP norte-americanos e europeus possam ter evoluído separadamente a partir de variantes diferentes de VLD que existiam separadamente nos E.U.A. e na Europa.

Uma característica impressionante do ARN dos vírus de é a sua rápida evolução, resultando numa extensa variação das sequências (Koonin et al, Criticai Rev. Biochem. Mol. Biol., 28, 375-430 (1993)). Obteve-se uma evidência directa da recombinação entre diferentes vírus com ARN de hélice positiva (Lai, Microbiol. Rev., 56, 61-79 (1992)). O vírus da encefalite equina ocidental parece ser um híbrido de evolução recente entre o vírus da encefalite equina oriental e outros alfavírus relacionados de muito próximo com o vírus Sindbis (Hahn et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85, 5997-6001 (1988)). De acordo com isto, a 98 emergência de VSRRP e da sua relação próxima com VLD e VAE não é surpreendente. Embora a cápside ou a proteína da cápside do núcleo tenham sido utilizadas para a construção de árvores evolutivas de muitos vírus com ARN de hélice positiva, proteínas com elementos da sequência conservados tal como polimerase de ARN dependente de ARN, replicase de ARN, etc., são normalmente mais apropriados para estudos filogenéticos (Koonin et al, supra). EXPERIÊNCIA IV: CLONAGEM E SEQUENCIAÇÃO DE ADNc CORRESPONDENDO AOS QLA'S 2, 3 E 4 DO VSRRP VR 2385. A região que inclui os QLA's 2, 3, e 4 do genoma do produto isolado do vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (VSRRP) VR 2385 foi clonada e analisada. Para clonar o ADNc do VSRRP VR 2385, infectaram-se células CRL 11171 da ATCC com o vírus a uma m.o.i. de 0,1, e isolou-se o ARN celular total utilizando um kit de isolamento de ARN (Stratagene) . A fracção de ARNm foi purificadas através de uma coluna Poli(A) Quick (Stratagene), e os ARNm purificados foram utilizados para gerar uma biblioteca de ADNc. Construiu-se uma biblioteca de oligo dT de ADNc num vector λ de Uni-ZAP XR utilizando um kit de síntese de ZAP-ADNc (Stratagene), de acordo com as instruções do fabricante. Isolaram-se os clones recombinantes depois do rastreio da biblioteca com uma sonda de hibridação específica de QLA 4 (um produto de RCP de 240 p.b. específico para a extremidade 3' de QLA 4; SEQ ID NO: 64). Excisou-se in vivo pSK . recombinante + ADNc específico de VSRRP a partir de placas X positivas, de acordo com as instruções do fabricante. 99

Sequenciaram-se vários plasmidos recombinantes com um conjunto aninhado de inserções de ADNc com dimensões variando de 2,3 a 3,9 kb a partir das extremidades 5' dos fragmentos clonados. A sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 65 foi determinada em pelo menos dois clones independentes de ADNc e tinha 1800 nucleótidos de comprimento (fig. 21) . A análise em computador do nucleótido e das sequências de aminoácidos deduzidas foi realizada utilizando os programas GENEWORKS (IntelliGenetics, Inc.j e MACVECTOR (International Biotechnologies, Inc.).

Observaram-se três sobreposições parciais de QLA's (QLA 2, QLA 3 e QLA 4) nesta região. Os QLA's 2, 3 e 4 continham os nucleótidos 12-779 (SEQ ID NO: 66), 635-1396 (SEQ ID NO: 68) e 1180-1713 (SEQ ID NO: 70), respecti-vamente, no fragmento de ADNc sequenciado. A comparação das sequências de ADN dos QLA's 2, 3 e 4 do VSRRP VR 2385 com os correspondentes QLA's do vírus VL (SEQ ID NOS: 72, 74 e 76, respectivamente) apresenta-se na fig. 22. O nivel de identidade das sequências de nucleótidos (homologia) foi de 65 % para o QLA 2, 64 % para o QLA 3 e 66 % para o QLA 4.

As sequências de aminoácidos previstas, codificadas pelos QLA's 2-4 do VSRRP VR 2385 (SEQ ID NOS: 67, 69 e 71, respectivamente) e do VL (SEQ ID NOS: 73, 75 e 77, respectivamente) estão ilustradas na fig 23. A comparação dos VSRRP VR 2385 e VL mostra um nível de homologia de 58 % para a proteina codificada por QLA 2, 55 % para a proteína codificada por QLA 3 e 66 % para a proteína codificada pelo QLA 4 (ver fig. 23). 100

EXPERIÊNCIA V

Um processo de imunoperoxidase para a detecção do VSRRP

Inocularam-se intranasalmente, quatro animais com 3 semanas de idade, privados de colostro, negativos para o VSRRP, com 105'8 de TCID50 de produtos isolados de VSRRP dos E.U.A. VR 2386 da ATCC propagados em células CRL 11171 da ATCC. Estes porcos foram alojados em deques aramados e foram alimentados com um substituto de leite comercial. Dois porcos foram submetidos a necropsia 4 dias post inoculação (DPI) e dois 8 DPI.

No momento da necropsia, separaram-se os pulmões direito e esquerdo de cada porco e insuflaram-se por via do brônquio principal com 45 ml de um de quatro fixadores e depois imergiu-se no fixador durante 24 horas. Os fixadores utilizados nesta experiência incluíram formalina neutra tamponada a 10 %, solução de Bouin, HISTOCHOICE (disponível na Ambresco, Solon, OH), e uma mistura contendo formaldeído a 4 % e glutaraldeído a 1 % (4F:1G). Lavaram-se os tecidos fixados em solução de Bouin em cinco mudas de 30 minutos de álcool etílico a 70 % após 4 horas de fixação em solução de Bouin. Todos os tecidos foram tratados por um processo de rotina num processador automatizado de tecidos começando em álcool etílico a 70 %. Trataram-se os tecidos com blocos de parafina no prazo de 48 horas após a necropsia.

Montaram-se secções com uma espessura de 3 micron em lâminas de vidro revistas com poli-l-lisina, desparafinou-se com duas mudas de xileno e re-hidratou-se por meio de banhos de álcool graduados até água destilada. Eliminou-se a peroxidase exógena por meio de três mudas de 10 minutos de peróxido de hidrogénio a 3 %. Seguiu-se uma lavagem com uma garrafa de água com tampão TRIS 0,05 M (pH 7,6) seguido 101 de um banho de TRIS de 5 minutos. Realizou-se a digestão da protease em todas as secções de tecidos excepto para os fixados em HISTOCHOICE. A digestão realizou-se em protease a 0,05. % (Protease XIV, disponível na Sigma Chem., St. Louis, Mo.) em tampão de TRIS durante 2 minutos a 37 °C. A digestão foi seguida de uma lavagem com uma garrafa de tampão de TRIS e depois um banho frio com tampão de TRIS durante 5 minutos. Fez-se um bloqueio de 20 minutos com uma solução a 5 % de soro normal de cabra (disponível na Sigma Chem., St. Louis, Mo.).

Os anticorpos primários utilizados foram o anticorpo monoclonal SDOW-17 (obtido do Dr. David Benfield, South Dakota State Univ.), diluído a 1:1000 em TRIS/SBF (1 parte de TRIS : 9 partes de SBF (0,01 M, pH 7,2)) . O anticorpo monoclonal SDOW-17 reconhece um epítopo conservado na proteína da cápside do núcleo do VSRRP (Nelson et al, J. Clin. Microbiol·., 31: 3184-3189). As secções de tecido foram embebidas em anticorpo primário e incubdas a 4 °C durante 16 horas numa câmara húmida. A incubação do anticorpo primário foi então seguida de uma lavagem com uma garrafa de solução de lavagem com tampão de TRIS, um banho em tampão de TRIS durante 5 minutos, e depois um banho em tampão de TRIS durante 5 minutos contendo soro normal de cabra a 1 %. As secções foram embebidas em anti-soro anti-rato de cabra biotinilado (obtido na Dako Corporation, Carpintera, CA) durante 30 minutos. A incubação do anticorpo de ligação foi seguida de três lavagens em tampão de TRIS, tal como foi feito na incubação do anticorpo primário. Trataram-se então as secções com estreptavidina conjugada com peroxidase, diluiu-se em TRIS/SBF a 1:200, durante 40 minutos, seguida de uma lavagem com uma garrafa de solução de lavagem com tampão de TRIS e um banho com tampão de TRIS de 5 minutos. Fez-se então a incubação das 102 secções com tetracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina preparado recentemente (DAB, obtido dos Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) durante 8-10 minutos à temperatura ambiente, e depois lavaram-se num banho de água destilada durante 5 minutos. Fez-se uma contra-coloração em hematoxilina (disponível na Shandon, Inc., Pittsburgh, PA), e lavaram-se as secções com água da torneira de Scott (10 g de MgSC>4 e 2 g de NaHCC>3 em 1 litro de água ultrapura) , depois com água destilada. Depois da desidratação, cobriram-se as secções com o meio de montagem, e depois aplicou-se uma cobertura de vidro.

Incluíram-se dois controlos negativos. A substituição do tampão de TRIS/SB.F no lugar do anticorpo primário foi feita em um dos controlos. O outro controlo foi feito por substituição dos pulmões de porco gnotiobióticos, com idade comparável, não infectados, por pulmões infectados com VSRRP.

As alterações histológicas em tecidos infectados foram caracterizadas por uma pneumonia intersticial prolife-rativa, multifocal, moderada com uma hipertrofia e uma hiperplasia pronunciadas de pneumócito do tipo 2, uma infiltração moderada do septo alveolar com células mononu-cleares, e uma acumulação abundante de fragmentos de células necróticas e misturou-se com células inflamatórias nos espaços alveolares. Não se observaram quaisquer danos epiteliais brônquicos ou bronquiolares. Contudo, havia fragmentos de células necróticas no lúmen das vias respiratórias mais pequenas.

Observou-se uma coloração intensa e específica no citoplasma de células infectadas nos tecidos fixados em formalina e em solução de Bouin. A coloração foi menos 103 intensa e especifica nos tecidos fixados em 4F:1G. Houve uma coloração pobre, poucos detalhes celulares, e uma coloração moderada da base nos tecidos fixados em HISTOCHOICE. A coloração de fundo foi negligenciável com os outros fixadores. Os detalhes celulares foram superiores nas secções de tecido fixadas em formalina e adequadas na solução de Bouin e tecidos fixados em 4F : 1G. 0 antigénio marcado estava principalmente dentro do citoplasma das células espalhadas e nos macrófagos nos espaços alveolares (fig. 24) e dentro dos fragmentos celulares no lúmen dos terminais aéreos (fig. 25) . Quando se compararam com as secções do mesmo bloco coradas com hematoxilina e eosina, determinou-se que a maior parte das células marcadas eram macrófagos, e algumas eram muito provavelmente pneumócitos descartados. Observaram-se intensidades menores da coloração em células mononucleares dentro do septo alveolar e raramente nos pneumócitos hipertrofiados do tipo 2.

Utilizando uma técnica de imunoperoxidase nas secções congeladas, outros foram capazes de detectar o antigénio nas células epiteliais de bronquíolos e duetos alveolares assim como dentro de células no septo alveolar e nos espaços alveolares (Pol et al, "Pathological, ultrastructural, and immunohistochemical changes caused by Lelystad virus in experimentally induced infections of mystery swine disease (synonym: porcine epidemic abortion and respiratory sindrome (SRAPE))," Vet. Q., 13: 137-143). Os requerentes não conseguiram detectar o antigénio no epitélio bronquiolar utilizando o presente processo de imunoperoxidase. 104 A presente técnica do complexo de estreptavidina-biotina (ABC) utilizando um anticorpo monoclonal de VSRRP pode ser modificada conforme necessário para identificar pulmões de suínos infectados com VSRRP. Tanto a formalina tamponada neutral a 10 % como a solução de Bouin são fixadores aceitáveis. A digestão da protease melhora a detecção do antigénio sem destruir os detalhes celulares. Esta técnica é por isso bastante útil para o diagnóstico de pneumonia de porcos induzida por VSRRP, e para a detecção de VSRRP em amostras de tecido do pulmão.

EXPERIÊNCIA VI

Uma identificação imunohistoquímica de sítios de replicação de VSRRP

Resumo: Inocularam-se intranasalmente quatro porcos com três semanas de idade, desprovidos de colostro, resultantes de cesarianas (PCNC), com um produto isolado de vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino. Todos os porcos inoculados exibiram uma doença respiratória moderada. Dois porcos foram submetidos a necropsia 4 dias post inoculação (PI) e dois deles, 9 dias PI. A consolidação moderada dos pulmões e um alargamento severo dos nódulos linfáticos foram notados na necropsia. Observou-se uma miocardite linfomacrofágica perivascular moderada. Observou-se uma marcada hiperplasia folicular linfóide e observou-se necroses nas amígdalas, baço, e nódulos linfáticos. O antigénio do virus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino foi detectado pelo presente processo de imunoperoxidase e estreptavidina-biotina primeiramente nos macrófagos alveolares no pulmão e nas células endoteliais e 105 macrófagos no coração. Os macrófagos e as células semelhantes às dendríticas nos nódulos linfáticos, baço, amígdalas, e timo coraram também de uma forma intensamente positiva para o antigénio da proteína da cápside do núcleo de VSRRP.

Secção experimental: Agarraram-se quatro porcos do canal vaginal de uma porca que era positiva para o anticorpo de VSRRP como se confirmou pelo exame do soro feito por exame indirecto do anticorpo imunofluorescente (AFI) . Levar.am-se os porcos para um sítio diferente, alojaram-se em deques aramados e alimentaram-se com um substituo de leite comercial. Fizeram-se colheitas de sangue nestes porcos, ãos 0, 7, 14, e 21 dias de idade e verificou-se que eram negativos para os anticorpos de VSRRP por meio de um teste AFI. Não se isolaram VSRRP dos soros dos porcos ou da porca utilizando células MARC-145 (disponíveis no National Veterinary Services Laboratory, Ames, Iowa).

Inocularam-se os quatro porcos intranasálmente às 3 semanas de idade com 105'8 TCID50 de produtos isolados de VSRRP norte-americano VR 2385 propagado em células CRL 11171 da ATCC. Observou-se uma doença respiratória suave a moderada aos 3-9 dias post inoculação (DPI) . Dois porcos foram necropsiados 4 DPI e dois 9 DPI. 4 DPI, um dos porcos evidenciou 31 % e o outro 36 % de consolidação dos pulmões com uma coloração acastanhada. Aos 9 DPI, os outros dois porcos evidenciaram 37 % e 46 % de consolidação dos pulmões, respectivamente. Os nódulos linfáticos estavam moderadamente aumentados e edemaciados.

Os tecidos linfóides colhidos na necropsia incluíram as amígdalas, o timo, o baço, a região traqueobrônquica, o 106 mediastino, e os nódulos linfáticos do ilíaco médio. Os tecidos linfóides foram fixados por imersão durante 24 horas em formalina tamponada neutral a 10 %, tratada por processos de rotina num processador automatizado de tecidos, embebidos em parafina, seccionados em pedaços de 6 microns e corados com hematoxilina e eosina. Cortaram-se secções adicionais (incluindo as anteriores secções de tecido do pulmão) em pedaços de 3 microns e montaram-se em lâminas revestidas com poli-L-lisina para o exame de imunohistoquímica. 0 ensaio de imunoperoxidase descrito na Experiência VI anterior foi repetido. Em resumo, depois de se ter eliminado a peroxidase endógena com peróxido de hidrogénio a 3 %, adicionou-se fluído de ascites de anticorpo monoclonal primário diluído a 1:1000 em TRIS/SBF durante 16 horas a 4 °C numa câmara húmida. Utilizou-se o anticorpo monoclonal SDOW-17 (obtido do Dr. David Benfield, South Dakota State Univ.), que reconhece um epítopo conservado da proteína da cápside do núcleo de VSRRP. Adicionou-se o anticorpo de ligação anti-rato de cabra, biotinilado (obtido da Dako Corporation, Carpintera, CA) , seguido do tratamento com estreptavidina conjugada com peroxidase (obtida dos Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) e da incubação com tetracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina (obtido dos Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). A amostra incubada foi finalmente contra-corada em hematoxilina .

As lesões microscópicas incluíram pneumonia intersticial, miocardite, amigdalite, e linfadenopatia. Examinou-se uma secção de pulmão de cada lobo. As lesões pneumónicas intersticiais foram caracterizadas por infiltração do septo com células mononucleares, hiperplasia e hipertrofia de 107 pneumócitos do tipo, e pela acumulação de macrófagos e fragmento de células necróticas nos espaços alveolares. Estas lesões foram moderadas e multifocais aos 4 DPI e severas e difusas aos 9 DPI. 0 epitélio dos brônquios e dos bronquiolos não estava afectado. O antigénio de VSRRP foi facilmente detectado por imuno-histoquimica em macrófagos alveolares. Encontraram-se muitas vezes grandes macrófagos positivos para o antigénio do VSRRP, castanhos-escuros em grupos de 5-10 células. Observaram-se algumas células mononucleares positivas para o antigénio do VSRRP no septo alveolar. Não se detectou o antigénio do VSRRP antigénio em nenhum dos tecidos dos porcos do controlo negativo.

Examinou-se uma secção do ventrículo esquerdo e uma secção do ventriculo direito. Aos 4 DPI, havia focos peri-vasculares muito pequenos, distribuídos aleatoriamente, de linfócitos e macrófagos. Havia uma inflamação moderada multi-focal, perivascular linfoplasmocitica e histiocítica aos 9 DPI. Um número moderado de células endoteliais ao longo das pequenas capilaridades linfáticas ao longo do miocárdio, estavam coradas de forma fortemente positiva para o antigénio de VSRRP (fig. 26) tanto aos 4 como aos 9 DPI. As células endoteliais, positivas para o antigénio do VSRRP, frequentemente não estavam rodeadas por células inflamatórias aos 4 dias DPI, mas havia áreas de inflamação aos 9 dias DPI. Alguns macrófagos entre os miócitos e no tecido alveolar perivascular também estavam corados de uma forma fortemente positiva para o antigénio do VSRRP.

Observou-se uma amigdalite ligeira com necrose. Observaram-se vulgarmente focos necróticos de of 1-10 células com picnose e cariorrexia no centro de folículos proeminentes e muito menos vezes no tecido circundante linfo-reticular. Observou-se um grande número de linfócitos e 108 macrófagos dentro do epitélio da cripta, e observaram-se quantidades moderadas de fragmentos de células necróticas nas criptas. 0 antigénio de VSRRP foi facilmente detectado nas células no centro dos foliculos hiperplásicos, no tecido circundante linforeticular, e nas células dentro do epitélio da cripta (fig. 27) . A coloração também estava presente entre os fragmentos necróticos nas criptas. Em todos estes sitios, as células positivas para o antigénio de VSRRP pareciam macrófagos ou células semelhantes às células dendríticas.

As lesões do timo eram mínimas. Houve alguns focos necróticos com picnose e cariorrexia na medula. Estes focos tendiam a envolver ou a estar próximos dos corpúsculos tí-micos. 0 antigénio do VSRRP foi frequentemente identificado entre macrófagos próximo destas áreas necróticas e muito menos vezes nos grandes macrófagos isolados no córtex.

Os focos necróticos e as células necróticas simples eram evidentes como os centros germinais dos nódulos linfóides e nas folhas linfóides periarteriolares (FLPA) do baço. As células coradas positivamente para o antigénio de VSRRP estavam concentradas · no centro dos- foliculos linfóides e espalhavam-se ao longo das FLPA. As células positivas geralmente têm grandes núcleos ovais e citoplasma abundante com projecções citoplásmicas proeminentes, compatíveis com macrófagos ou células dendríticas. Observaram-se números menores de células com coloração positive em forma de fusos na zona marginal. A dimensão e a localização destas células sugere que são células reticulares.

As alterações predominantes dos nódulos linfáticos foram edemas subcapsulares, focos de necrose em foliculos 109 linfóides, e a presença de células sinciciais na fronteira do tecido linfóide central com a perda do tecido conjuntivo periférico. As vénulas endoteliais altas estavam anormalmente proeminentes e muitas vezes estavam aumentadas de volume. As células sinciciais tinham 2-10 núcleos com múltiplos núcleos proeminentes e citoplasma eosinofilico moderado. Estas células não pareciam conter antigénio de VSRRP. Observou-se uma coloração citoplasmática celular intensa e especifica nos foliculos. As células positivas tinham grandes núcleos com citoplasma abundante e proeminentes processos citoplásmicos (fig. 27). Estas células pareciam macrófagos ou células dendriticas. Observou-se um número inferior de células positivas no tecido linfóide perifolicular. A severidade da lesão e a quantidade de antigénio de-tectada nos vários tecidos foi geralmente similar aos 4 e aos 9 DPI. A grande dimensão dos nódulos linfáticos e o número de células sinciciais nos nódulos linfáticos foram mais proeminentes aos 9 DPI do que aos 4 DPI. A quantidade de antigénio detectado no coração também foi maior aos 9 DPI.

Utilizaram-se tecidos de porcos PCNC não infectados, com idades semelhantes, para os controlos histológicos e para a imuno-histoquimica. Outros controlos negativos para a imuno-histoquimica incluíram a utilização do mesmo protocolo menos o anticorpo primário de VSRRP em tecidos de porcos infectados. 0 antigénio de VSRRP não foi detectado em nenhum dos controlos negativos.

Conclusões: 0 processo imuno-histoquímico aqui descrito é útil para a detecção do antigénio de VSRRP no pulmão, coração e tecidos linfóides de porcos infectados 110 com VSRRP. Observaram-se severas pneumonias intersticiais e moderadas miocardites linfo-histiociticas multifocais perivásculares. Também se observou uma marcada hiperplasia folicular linfóide e necrose de células individuais ou de pequenos aglomerados de células nas amígdalas, baço, e nos nódulos linfáticos. 0 antigénio de VSRRP foi facilmente detectado nos macrófagos alveolares no pulmão e em células endoteliais e macrófagos no coração. Os macrófagos e as células semelhantes às dendríticas como células em amígdalas, nódulos linfáticos, timo, e baço também coraram positivamente de forma muito intensa para o antigénio virai. O VSRRP pode replicar nas amígdalas com uma subsequente virémia e mais replicação, principalmente nos macrófagos nos sistemas respiratórios e linfóides do porco.

EXPERIÊNCIA VII

Diagnóstico do SRRP: 0 presente ensaio de imunoperoxidase e estreptavidina-biotina para a detecção do antigénio de VSRRP em tecidos é bastante útil para confirmar a presença de uma infecção activa. 26 porcos foram inoculados experimentalmente com VR 2385 do VSRRP da ATCC de acordo com o processo das Experiências V/VI anteriores. Examinou-se uma secção de cada um dos pulmões, amígdalas, nódulos linfáticos mediastínicos e nódulos linfáticos traqueobrônquicos de cada porco. Detectou-se o vírus pelo ensaio de imunoperoxidase da Experiência V em 23/26 pulmões, 26/26 amígdalas, 15/26 nódulos linfáticos mediastínicos, e 14/26 nódulos linfáticos traqueobrônquicos. 111

Os porcos nesta experiência foram mortos ao longo de um período de 28 dias post-inoculação. Detectou-se o vírus em pelo menos um tecido de cada porco submetido a necropsia até 10 dias post inoculação.

Uma técnica completa para a técnica da imunoperoxidase à base de estreptavidina-biotina para a detecção do antigénio de VSRRP em tecidos de suínos está descrita na Experiência. V infra. Em resumo, depois da eliminação da peroxidase endógena por meio do peróxido de hidrogénio a 3 % e da digestão com protease a 0,05 % (Protease XIV, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), adiciona-se fluído de ascites de anticorpo monoclonal primário diluído a 1:1000 em TRIS/SBF durante 16 horas a o O numa câmara húmida. 0 anticorpo monoclonal utilizado foi o SDOW-17 (Dr. David Benfield, South Dakota State Univ . ) , que reconhece um epítopo conservado da proteína da cápside do núcleo de VSRRP (Nelson et al, "Differentiation of U.S. and Europeans isolates of porcine reprodutive and respiratory sindrome virus by monoclonal antibodies," J. Clin. Micro., 31: 3184-3189 (1993)). Faz-se então contactar o anticorpo de ligação anti-rato de cabra biotinilado (Dako Corporation, Carpintera, CA) com o tecido, seguido do tratamento com estreptavidina· conjugada com peroxidase (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) , incubação com te-tracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA), e finalmente coloração com hema-toxilina.

Particularmente quando se combina com um ou mais técnicas analíticas adicionais tal como histopatologia, o isolamento do vírus e/ou a serologia, o presente ensaio de detecção do antigénio no tecido com imunoperoxidase oferece um diagnóstico rápido e fiável da infecção pelo VSRRP. 112

Uma técnica completa para a técnica da imunoperoxidase à base de estreptavidina-biotina para a detecção do antigénio de VSRRP em tecidos de suínos está descrita na Experiência V infra. Em resumo, depois da eliminação da peroxidase endógena por meio do peróxido de hidrogénio a 3 % e da digestão com protease a 0,05 % (Protease XIV, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), adiciona-se fluído de ascites de anticorpo monoclonal primário diluído a 1:1000 em TRIS/SBF durante 16 horas a 4°C numa câmara húmida. O anticorpo monoclonal utilizado foi o SDOW-17 (Dr. David Benfield, South Dakota State Univ.), que reconhece um epítopo conservado da proteína da cápside do núcleo de VSRRP (Nelson et al, "Differentiation of U.S. and Europeans isolates of porcine reprodutive and respiratory sindrome virus by monoclonal antibodies," J. Clin. Micro., 31: 3184-3189 (1993)). Faz-se então contactar o anticorpo de ligação anti-rato de cabra biotinilado (Dako Corporation, Carpintera, CA) com o tecido, seguido do tratamento com estreptavidina conjugada com peroxidase (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) , incubação com te-tracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina (Vector Laboratories Inc. , Burlingame, CA), e finalmente coloração com hema-toxilina.

EXPERIÊNCIA VIII

Determinou-se a patogenicidade dos produtos isolados de VSRRP em porcos com 4-8 semana de idade. Os produtos isolados foram divididos em dois grupos: (1) fenótipos com alta virulência (av) e (2) fenótipos com baixa virulência (bv) (ver quadro 3 a seguir) . Por exemplo, a percentagem média de consolidação do pulmão dos grupos de porcos inoculados com um produto isolado de VSRRP está ilustrada no quadro 4 a seguir. A patogenicidade de um certo número de produtos isolados de VSRRP ao 10 DPI está ilustrada no quadro 5 a seguir. Os resultados no quadro 5 foram analisados sob o ponto de vista estatístico para verificar a diferença entre os fenótipod de av e de bv, conforme se pode determinar pela percentagem de consolidação do pulmão.

Produtos isolados caracterizados como de alta virulência produzem uma doença clínica severa com febre alta e dispneia. Em geral, os produtos isolados av produzem uma pneumonia severa caracterizada pela pneumonia intersticial proliferativa com marcada proliferação de pneumócito do tipo II, a formação de células sinciciais, acumulação do exsudado alveolar, infiltração ligeira do septo com células mononucleares, encefalite e miocardite (designada por SRRP-B daqui para a frente). Os produtos isolados caracterizados como de baixa virulência não produzem uma doença clínica significativa e produzem uma pneumonia ligeira caracterizada predominantemente por pneumonia intersticial com infiltração do septo por células mononucleares, típica do SRRP clássico (designada daqui para a frente por SRRP-A). 113

Quadro 3: Características e Patogenicidade dos produtosisolados de VSRRP

Isolado do vírus No. de ARNms subgenómicos mRNAs ARNm 4 Severidade de lesões da pneumonia* Lesões microscópicas** Lesão Tipo no pulmão Coração Cérebro Alta Virulência (av) VR 2385 6 Normal + + + + B + + + + ++++ VR 2429 8 Normal + + + + B ++ + + +++ ISU-28 ND ND + + + B ++ + + ++++ ISU-79 8 Normal + + + + B +++ +++ ISU-984 ND ND + + + B ++ + +++ Baixa virulência (bv) ISU-51 ND ND + A + + VR 2430 8 Normal + A/B + + ISU-95 ND ND + A + + ISU-1894 6 Normal + A/B + + VR 2431 6 Eliminação + A/B - - Lelystad** 6 Normal + A +/- +/- *: (-) normal, (+) ligeiro, (++) moderado, (+++) severa, (++++) pneumonia muito severa. **: Os isolados de VSRRP produz dois tipos de lesões microscópicas do pulmão: lesões do tipo A incluem a pneumonia intersticial com uma infiltração média do septo com células mononucleares típicas de SRRP tal como descrito por Collins et al (1992) ; as lesões do tipo B incluem a proliferação de pneumócitos do tipo II e são típicas das descritas como PIP (Halbur et al 1993). ***: Pol et al, (Vet. Quart., 13: 137-143 (1991); Wensvoort et al, Antigenic comparison of Lelystad virus and swine infertility and respiratory syndrome virus. J. Vet. Diagn. Invest., 4: 134-138 (1992); Meulenberg et al, Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS), is related to LDV and EAV. Virology, 192: 62-72 (1993).__._( QUADRO 4 ISOLADO DE VÍRUS Pontuação da % média de consolidação do pulmão a x DPI* 3 10 21 28 VR-2385 29 77,3 37,3 6,0 VR-238Spp 20,5 77,5 25,0 0,0 ISU-22 25,5 64,8 36,5 11,0 ISU-984 7,25 76,0 21,0 0,5 ISU-3927 13,5 10,5 0 0,0 PSP-36 0 0 0 0,0 UNINOC 0 0 0 0,0 *: o intervalo de pontuação é de 0-100 % de consolidação do tecido do pulmão. 114 QUADRO 5 INOCULO no. Porcos % média de consolidação do pulmão alO DPI ± D.P. (desvio padrão) Não infectados 10 0 ± 0 Linha de células CRL 11171 10 0 + 0 ISU-51 10 16,7 ± 9,0 ISU-55 10 20,8 + 15,1 ISU-1894 10 27,4 ± 11,7 ISU-79 10 51,9 ± 13,5 VR-2386pp 10 54,3 ± 9,8 ISU-28 10 62,4 ± 20,9 * Patogenicidade de isolados de VSRRP ISU-28, vr 2386pp e ISU-79 não foi significativamente diferente (p > 0,05) entre cada um deles, mas foram diferentes da de ISU-51, ISU-55, e ISU-1894 (p < 0,001). Todos os isolados de VSRRP eram significativamente diferentes (p < 0,001) dos controlos.

Os mecanismos importantes e precisos na patogénese da infecção por VSRRP não foram ainda completamente delineados. Contudo, os macrófagos alveolares e as células epiteliais células que revestem as vias bronquiólicas e alveolares demonstraram conter antigénios virais, por imúnocitoquímica nas secções congeladas (Pol et al: Pathological, ultrastructural, and immunohistochemistry changes caused by Lelystad vírus in experimentally induced infections of mystery swine disease (sinónimo: aborto epidémico porcino e síndroma respiratória (AEPSR). Veterinária Quarterly, 13: 137-143 (1991)). O presente ensaio de imúnocitoquímica para a detecção de VSRRP em tecidos fixados em formalina (ver Experiência VI supra) mostra que o VSRRP também se replica em células epiteliais alveolares e em macrófagos. A extensão da replicação do vírus replicação e os tipos de células infectadas pelos produtos isolados de VSRRP também parecem variar (ver Experiência X a seguir). 115 O papel dos diferentes genes na virulência e na repli-cação não é conhecido de uma forma precisa. Contudo, os QLA's 4 e 5 parecem ser determinantes da virulência in vivo e da replicação in vitro do VSRRP.

Os resultados da clonagem e da sequenciação dos QLA's · 5, 6 e 7 do produto isolado de VSRRP VR 2385 (ver

Experiência I supra) mostram que o QLA 5 codifica uma proteína da membrana (ver também o pedido de patente dos E.U.A. da série No. 08/131.625). Uma comparação dos QLA's 5-7 de VR 2385 com os QLA's 5-7 do vírus de Lelystad mostra que o QLA 5 é a menos conservada das proteínas analisadas (ver quadro 2 supra) , indicando assim que o QLA 5 pode ser importante na determinação da virulência.

Com base nos resultados da análise de mancha (Northern blot) , o QLA 4 do produto isolado de bv de VR 2431 parece ter uma eliminação no ARNm 4 (ver também a Experiência V do ' pedido de patente dos E.U.A. da série No. 08/131.625).

EXPERIÊNCIAS IX-XI O VSRRP (VR 2386 da ATCC) propagou-se in vitro nas células CRL 11171 da ATCC células por meio do processo descrito na Experiência III do pedido de patente dos E.U.A. da série No. 08/131.625. 0 produto isolado de VSRRP foi clonado biologicamente por meio de três ciclos de purificação de placa em células CRL 11171 e caracterizado. O produto isolado purificado em placas (daqui para a frente "VR 2386pp", que é equivalente ao VR 2386, depositado na ATCC, Rockville Maryland, em 29 de Outubro de 1992) replicou-se até cerca de 106-107 TCID50/ml na 11a passagem da cultura de células em células CRL 11171. Também se detectaram antigénios virais no citoplasma das células 116 infectadas utilizando soro de VSRRP convalescente. O VR 2386pp mostrou estar relacionado, sob o ponto de vista antigénico, com o VR 2332 por meio de AFI utilizando anticorpos policlonais e monoclonais com a proteína da cápside do núcleo de VR 2332 (SDOW-17, obtido do Dr. David

Benfield, South Dakota State University). Vários outros vírus de produtos isolados (VR 2429 (ISU-22), ISU-28, VR 2428 (ISU-51) , VR 2430 (ISU-55) , ISU-

79, ISU-984, ISU-1894, e VR 2431 (ISU-3927)) foram isolados e purificados em placas em linhas de células CRL 11171. A replicação do virus nas linhas de células CRL 11171 variou entre os produtos isolados de VSRRP (ver quadro 3 a seguir). O produto isolado VR 2385 e os produtos isolados purificado em placas VR 2386pp, VR 2430 e ISU-79 replicaram até 106-107 TCID5o/ml, e assim, têm um fenotipo de alta replicação (ar). Outros produtos isolados, tais como ISU-984, ISU-1894 replicaram até a um título de 104-105 TCID50/ml, correspondendo a um fenotipo de replicação moderada (rm) . Os produtos isolados ISU-3927 e ISU-984 replicaram muito pouco na linha de células CRL 11171 e normalmente originaram um título de 103 TCID50/ml, e assim têm um fenotipo de baixa replicação (br).

EXPERIÊNCIA IX

A patogenicidade dos vários produtos isolados de VSRRP foi comparada em porcos desprovidos de colostro derivados de cesariana (PCNC) para determinar se há uma correlação entre a replicação in vitro e a patogenicidade (ver também a experiência V do pedido de patente da série No. 08/131.625. Utilizou-se quatro produtos isolados de VSRRP purificados em placas (VR 2386pp, VR 2429, ISU-984, e VR 2431), e um produto isolado não purificado em placa (VR 117 2385) para inocular os porcos. Um grupo não inoculado e um grupo inoculado com cultura de células não infectadas serviram como controlos. Mataram-se dois porcos de cada grupo no 3, 7, 10, e 21 DPI. Mataram-se três porcos no 28 e 36 DPI. Os produtos isolados de VSRRP clonados biologicamente VR 2386pp, VR 2429, e ISU-984 induziram uma severa doença respiratória em porcos PCNC com 5 semanas de idade, enquanto VR 2431 não produziu qualquer doença significativa. As pontuações de grandes lesões do pulmão tiveram o seu pico no 10 DPI (ver quadro 4) e variaram de 10,5 % de consolidação (VR 2431) até 77 % de consolidação (VR 2385). As lesões foram resolvidas no 36° DPI.

As lesões microscópicas incluíram pneumonia intersticial, encefalite, e miocardite (quadro 3) . Os produtos isolados de bv também causaram miocardite e encefalite menos severas do que os produtos isolados de av. Nas figs. 28(A)-(C), mostram-se fotografias de pulmões de porcos inoculados com (A) fluido de cultura da linha de células CRL 11171 não infectada, (B) fluidos de cultura da linha de células infectada com o produto isolado VR 2431 de bv, (C) fluidos de cultura da linha de células infectada com o produto isolado VR 2386pp de av. O pulmão na Fig. 28(B) tem uma pneumonia muito ligeira, enquanto o pulmão na fig. 28(C) tem uma consolidação severa.

EXPERIÊNCIA X

Realizou-se uma experiência adicional utilizando um número maior de porcos para examinar melhor a patogenicidade de produtos isolados de VSRRP e para se obter dados significativos sob o ponto de vista estatístico. Os resultados estão ilustrados no quadro 5. Colectivamente, os resultados mostram que os produtos 118 isolados de VSRRP podem ser divididos em dois grupos com base na pneumopatogenicidade. Os produtos isolados VR 2385, VR 2429, ISU-28, e ISU-79 têm um fenotipo de alta virulência (av) e produzem pneumonias severas. Os produtos isolados ISU-51, VR 2430, ISU-1894 e VR 2431 têm um fenotipo de baixa virulência (bv) (quadro 4) e produzem uma pneumonia de um grau baixo.

Os produtos isolados de VSRRP também produzem dois tipos de lesões microscópicas nos pulmões. 0 primeiro tipo encontrado geralmente em produtos isolados de bv é designado por SRRP-A, e é caracterizado por pneumonia intersticial com infiltração . do septo com células mononu-cleares típicas do SRRP (como descrito por Collins et al, Isolation of swine infertility and respiratory sindrome virus (isolate ATCC VR-2332) in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs. J. Vet. Diagn. Invest., 4: 117-126 (1992)). O segundo tipo de lesão, SRRP-B, encontra-se em produtos isolados av e é caracterizado por pneumonia intersticial proliferativa com uma marcada proliferação de pneumócitos do tipo II, exsudação alveolar e formação de células sinciciais, como descrito no pedido de patente dos E.U.A. da série No. 08/131.625 e por Halbur et al, An overview of porcine virai respiratory disease. Proc. Central Veterinary conference, pp. 50-59 (1993). Exemplos de lesões do tipo SRRP-A e SRRP-B tipo estão ilustrados nas figs. 28 (A) - (C) , em que a fig. 28 (A) mostra um pulmão normal, a fig. 28 (B) são as lesões produzidas pelo VSRRP do tipo A, e a fig. 28 (C) mostra as lesões produzidas pelo VSRRP do tipo B. O ensaio de imunoperoxidase da Experiência V utilizando anticorpos monoclonais de VSRRP foi utilizado para detectar antigénios virais em células epiteliais alveolares 119 e macrófagos (ver fig. 29 (A) ) . Este ensaio é agora utilizado por rotina no Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory para detectar antigénios de VSRRP antigénio em tecidos.

As figuras 29 (A) -(B), mostram a coloração imuno-histo-química com anticorpo monoclonal anti-VSRRP do pulmão de um porco infectado 9 dias antes com VR 2385. Utilizou-se uma técnica de imunoperoxidase do complexo de estreptavidina-biotina (ABC) acoplada com uma contra-coloração com hematoxilina. A coloração positiva dento do citoplasma de macrófagos e de células espalhadas nos espaços alveolares está claramente ilustrada nas fig. 29 (A) , e dentro dos fragmentos celulares no lúmen das vias aéreas terminais na fig. 29 (B) .

EXPERIÊNCIA XI

Para determinar se há uma correlação entre os fenotipos biológicos e as alterações genéticas nos produtos isolados de VSRRP, realizaram-se análises de manchas (Northern blot) em 6 produtos isolados de VSRRP.

Isolaram-se os ARNs intracelulares totais das células CRL 11171 infectadas com o virus VR 2386pp pelo processo do isotiocianato de guanidina, separou-se em gel de agarose com glioxal a l/DMSO e fez-se a análise das manchas em membranas de nylon. Gerou-se uma sonda de ADNc por RCP com a conjunto de iniciadores que flanqueiam a região extrema do terminal 3' do genoma virai. A sonda continha uma sequência de não codificação de 3' e a maior parte da sequência do QLA-7 (ver o pedido de patente dos E.U.A. da série No. 08/131.625). 120 A hibridação de "Northern blot" revelou um conjunto aninhado de 6 espécies de ARNm sub-genómico (fig. 30) . A dimensão do ARN genómico virai de VR 2386pp (14,7 kb) e dos 6 ARNm sub-genómicos, ARNm 2 (3,3 kb) , ARNm 3 (2,8 kb) , ARNm 4 (2,3 kb) , ARNm 5 (1,9 kb) , ARNm 6 (1,4 kb) e ARNm 7 (0,9 kb) , que se pareciam com a do VL, embora houvesse ligeiras diferenças nas dimensões estimadas do genoma e dos ARNm's sub-genómicos (Conzelmann et al, Virology, 193, 329-339 (1993), Meulenberg et al, Virology, 192, 62-72 (1993). 0 ARNm 7 do VR 23 86pp era o ARNm sub-genómico mais abundante (ver fig. 30 e experiência I anteriores). Também se comparou o número total de ARNm sub-genómico e as suas dimensões relativas. Os ARNm sub-genómicos de três produtos isolados tinham 6 ARNm sub-genómicos, similares ao descrito para o vírus Lelystad. Pelo contrário, os três produtos isolados tinham 8 ARNm sub-genómicos (fig. 30) . A origem exacta das duas espécies adicionais de ARNm's não é conhecida, mas estão localizados entre os ARNm sub-genómicos 3 e 6 e foram repetidamente observados em culturas infectadas com um MOI baixo. É interessante notar que se detectou um ARNm sub-genómico adicional nos produtos isolados de VLD propagados em culturas de macrófagos (Kuo et al, 1992). Os requerentes especulam que os ARNm’s adicionais em células infectadas com alguns produtos isolados de VSRRP isolates derivam do gene 4 e do gene 5 possivelmente transcritos de um sítio alternativo de início de transcrição. São necessários estudos adicionais para determinar a origem destes ARN1s e o seu significado na patogénese das infecções por VSRRP. A fig. 30 mostra as análises de manchas (Northern blots) dos produtos isolados de VSRRP VR 2386pp (designado por "12"), VR 2429 (ISU-22, designado por "22"), VR 2430, designado por "55"), ISU-79 (designado por "79"), ISU-1894 121 (designado por "1894"), e VR 2431, designado por "3927"). Estes dados representam resultados de quatro experiências separadas de hibridação de "Northern blot". O produto isolado VR 2386pp (12) passou por um gel, ISU-1894 e VR 2431 passaram num segundo gel, VR 2430 e ISU-79 foram passados num terceiro gel, e ISU-22 foi passado num quarto gel. Dois ARNm's adicionais são evidentes em produtos isolados de VR 2429, VR 2430, e ISU-79. O ARNm 4 sub-genómico de VR 2431 (ISU-3927) migra mais rapidamente do que o de outros produtos isolados na análise de mancha (Northern blotting), sugerindo a eliminação. É interessante notar que ò produto isolado de VR 2431 tem fenotipos de bv e de br e é o produto isolado de VSRRP menos virulento das estirpes de Iowa aqui descritas. Isto sugere que o gene 4 pode ser importante na virulência e na replicação. Tal como descrito antes, é menos provável que os genes 6 e 7 desempenhem um papel na expressão dos fenotipos de virulência e de replicação.

Em resumo, os produtos isolados de VSRRP variam na patogenicidade e no grau de replicação em culturas de células. 0 número de ARNm sub-genómicos e a quantidade de ARNm's também varia entre os produtos isolados norte-americanos de VSRRP. Mais significativamente, um dos produtos isolados, VR 2431, que replica com um título baixo (fenótipo br) e que é o produto isolado menos virulento (fenótipo bv) entre os produtos isolados da estirpe Iowa de VSRRP aqui descritos, parece ter uma migração mais rápida do ARNm 4 sub-genómico, sugerindo assim que existe uma eliminação no seu QLA 4. 122

EXPERIENCIA XII

COMPARAÇÃO DA PATOGENI CIDADE E DA DISTRIBUIÇÃO DOS ANTIGÉNIOS DE DOIS PRODUTOS ISOLADOS DO VÍRUS DO SINDTOMA REPRODUTIVO E RESPIRATÓRIO PORCINO DOS E.U.A. COM O VÍRUS DE LELYSTAD A doença respiratória induzida por VSRRP com pneumonia bacteriana secundária, septicemia e enterite são frequentemente observadas em porcos com 2-10 semanas de idade (Halbur et al. , "Virai contributions to the porcine respiratory disease complex," Proc. Am. Assoe. Swine Pract., pp. 343-350 (1993); Zeman et al., J. Vet. Diagn. Invest. (1993)). As epidemias podem durar de 1-4 meses ou tornar-se num problema crónico nalgumas explorações agrícolas em que os porcos circulam na unidade o que torna possível que os vírus se propaguem dos portadores mais velhos para os animais mais novos e vulneráveis que perderam a protecção passiva do anti-corpo. A severidade e a duração das epidemias são bastante variáveis. De facto, algumas varas de porcos são devastadas pelas elevadas perdas de produção (Poison et al., "Financial Impact of Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Sindrome (SRAPE)," Proc. 12th Inter. Pig Vet. Soc., p. 132 (1992); Poison et al, "An evaluation of the financial impact of porcine reprodutive and respiratory síndroma (PRRS) in nursery pigs," Proc. 13th Inter. Pig Vet. Soc., p. 436 (1994)), enquanto outras varas não têm perdas aparentes devidas à infecção com VSRRP. Isto pode ser devido a um certo número de possibilidades, incluindo diferenças das estirpes de vírus, diferenças de suscepti-bilidade genética dos porcos, diferenças ambientais ou de 123 alojamento, ou estilo de produção (fluxo dos porcos) na unidade.

Esta experiência compara a patogenicidade e a distribuição dos antigénios de duas estirpes dos E.U.A. (ISU-12 [VR 2385], ISU-3927 [VR 2431]) e uma estirpe europeia (virus de Lelystad, obtidas no National Veterinary Services Laboratory, P.O. Box 844, Ames, Iowa, 50010) num modelo comum de porco para documentar semelhanças e diferenças que podem explicar as diferenças na severidade das epidemias no campo devidas a VSRRP e ajudar a compreender melhor a patogénese da doença induzida pelo VSRRP. (Nas descrições experimentais que se seguem, "x/y" refere-se ao número de porcos "x" de um grupo particular de porcos com "y" elementos.)

Materiais e Processos

Projecto das experiências:

Cem porcos desprovidos de colostro e derivados de cesariana (PCNC) com 4 semanas de idade foram divididos aleatoriamente em 4 grandes grupos de 25 porcos cada um e foram distribuídos por cada um dos quatro edifícios isolados. Dentro de cada edifício, os porcos foram ainda divididos por 3 salas separadas (11 porcos, 11 porcos, e 3 porcos por sala) . Cada sala dentro dos edifícios tinha sistemas de ventilação automática separados. Os porcos foram alojados em deques aramados e foram alimentados com uma ração à base de milho completo com 18 % de proteína e uma refeição de soja. No seguimento da inoculação com um inoculo do vírus, os porcos sofreram necropsia conforme se detalha no quadro 6 a seguir, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 21 e 28 dias post inoculação (DPI). 124

Preparação dos inóculos de vírus:

Cada vírus foi purificado em placa três vezes. As doses de inoculação foram de IO5,8 para o VR 2385 e de 105'8 para o VR 2431. A dose de inoculação do vírus Lelystad foi de 105'8 .

Os porcos foram inoculados intranasalmente sentando-os sobre as respectivas nádegas perpendicularmente ao chão e puxando os respectivos pescoços completamente para trás. Os inóculos foram gotejando lentamente para dentro de ambas as narinas dos porcos, levando aproximadamente 2-3 minutos por cada porco. Aos porcos de controlo deu-se 5 mL de meio de cultura de células não infectadas, da mesma maneira.

Avaliação clinica

Mediram-se as temperaturas rectais e registaram-se diariamente desde o 2 DPI até ao 10 DPI. Atribuiu-se uma pontuação clínica da doença respiratória a cada porco, diariamente desde o dia 0 até 10 DPI, de acordo com o inter-valo de pontuação de 0-6 que se segue, similar à análise de insuficiência respiratória descrita antes: 0 = normal

Quadro 6: Programação da necropsia P. isolado Sala 1 DPI 2 DPI 3 DPI 5 DPI 7 DPI 10 DPI 15 DPI 21 DPI 2 8 DPI Total Lelystad 1 1 1 1 1 1 3 1 1 1 11 Lelystad 2 1 1 1 1 1 3 1 1 1 11 Lelystad 3 3 3 VR 2385 4 1 1 1 1 1 3 1 1 1 11 VR 2385 5 1 1 1 1 1 3 1 1 1 11 VR 2385 6 3 3 Controlo 7 1 1 1 1 1 3 1 1 1 11 125 P. isolado Sala 1 DPI 2 DPI 3 DPI 5 DPI 7 DPI 10 DPI 15 DPI 21 DPI 28 DPI Total Controlo 8 1 1 1 1 1 3 1 1 1 11 Controlo 9 3 3 VR 2431 10 1 1 1 1 1 3 1 1 1 11 VR 2431 11 1 1 1 1 1 3 1 1 1 11 VR 2431 12 3 3 1 = dispneia ligeira e/ou taquipneia quando pressionado 2 = dispneia ligeira e/ou taquipneia quando não pressionado 3 = dispneia moderada e/ou taquipneia quando pressionado 4 = dispneia moderada e/ou taquipneia quando não pressionado 5 = dispneia severa e/ou taquipneia quando pressionado 6 = dispneia severa e/ou taquipneia quando não pressionado

Considerou-se um porco "pressionado" pelo tratador do depois de aquele segurar o porco sob o seu braço e medir a temperatura rectal do porco durante aproximadamente 30-60 segundos. Outras observações clínicas relevantes como tosse, diarreia, inapetência ou letargia foram anotadas separadamente, e não estão reflectidas na pontuação da doença respiratória.

Exame patológico:

Realizaram-se necropsias completas em todos os porcos. Deu-se uma pontuação às lesões macroscópicas do pulmão para estimar a consolidação percentual do pulmão. Atribuiu-se um número ao lobo do pulmão para reflectir o volume aproximado de todo o pulmão representado por esse lóbulo. Atribuíram-se dez (10) pontos possíveis a cada um dos lóbulos anteriores direitos, lóbulos médios direitos, parte anterior do lóbulo esquerdo, e parte caudal do lóbulo anterior esquerdo do pulmão. Ao lóbulo acessório foram atribuídos cinco (5) pontos. Atribuíram-se vinte e sete pontos e meio (27,5) a cada um dos lóbulos caudais direito e esquerdo para atingir um total de 100 pontos. As pontuações das lesões grandes do pulmão foram estimadas, e atribuiu-se uma pontuação para reflectir a quantidade de consolidação em cada lóbulo. O total para todos os lóbulos 126 representava uma estimativa da percentagem de consolidação de todo o pulmão para cada porco.

Colheram-se secções de todos os lóbulos do pulmão, das conchas nasais, do cérebro, do tálamo, do hipotálamo, da glândula pituitária, do tronco do cérebro, do plexo coróide, do cerebelo, do coração, do pâncreas, do íleo, das amígdalas, dos nódulos linfáticos mediastínicos, dos nódulos linfáticos do ilíaco médio, dos nódulos linfáticos mesentéricos, do timo, do fígado, do rim, e das glândulas supra-renais para o exame histopatológico. Fixaram-se os tecidos em formalina com tampão neutro a 10 % durante 1-7 dias e fez-se um tratamento de rotina com blocos de parafina num processador automático de blocos. Cortaram-se as secções a 6pm e coraram-se com hematoxilina e eosina.

Imuno-histoquímica: A coloração imuno-histoquímica realizou-se como descrito na experiência VI anterior. Cortaram-se as secções a 3 μττι e montaram-se em lâminas revestidas com poli-L-lisina. Eliminou-se a peroxidase endógena por meio de três mudas, de 10 minutos, de peróxido de hidrogénio a 3 %. Seguiu-se um banho de TRIS, e depois a digestão com protease a 0,05 % (Protease XIV, Sigma Chemistry Company, St. Louis, Mo.) em tampão de TRIS durante 2 minutos a 37 °C. Depois de outro banho com tampão de TRIS, fez-se o bloqueio durante 2 0 minutos com uma solução a 5 % de soro normal de cabra. Adicionou-se o fluido de ascites de anticorpo monoclonal primário (SDOW-17, obtido do Dr. David Benfield, South Dakota State Univ.) diluído a 1:1000 em TRIS/SBF durante 16 horas a 4o C numa câmara húmida. Depois da incubação do anticorpo primário e um banho subsequente de TRIS contendo soro normal de cabra 1 %, durante 5 minutos, embeberam-se as lâminas com o anticorpo de ligação 127 anti-rato de cabra biotinilado (Dako Corporation, Carpintera, CA) durante 30 minutos. Lavaram-se as secções com TRIS e trataram-se estreptavidina conjugada com peroxi-dase (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) durante 40 minutos, depois incubaram-se com tetracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina (Vector Laboratories Inc . , Burlingame, CA.) durante 8-10 minutos. Coraram-se então as secções com hematoxilina.

Controlos de imuno-histoquímica substituindo TBS pelo anticorpo primário em todo o pulmão e secções de tecido linfõide. Fez-se ò mesmo noutras secções de outros tecidos interpretadas como possivelmente positivas. Os porcos de controlo não infectados também serviram como controlos negativos. Não se detectou nenhuma coloração em nenhum dos tecidos dos porcos de controlo. Estimou-se a quantidade de antigénio de acordo com a seguinte escala: (0) = negativo (sem células positivas), (1) = células coradas isoladas ou positivas raras (cerca de células 1-5 positivas por secção histológica) , (2) = um número relativamente baixo de células positivas, ainda mais abundantes do que as células isoladas (por exemplo, cerca de 10-20 células positivas por secção histológica), (3) = um número moderado de células positivas (por exemplo, cerca de 40-80 células positivas por secção histológica), e (4) = um número relativamente grande de células positivas (mais do que cerca de 100 células positivas por secção histológica).

Isolamento do virus:

Agruparam-se os mesmos tecidos de cada dois porcos ne-cropsiados de cada grupo inoculado aos 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, e 28 DPI. Aos 10 DPI, necropsiaram-se nove porcos de cada grupo, de tal modo que três conjuntos dos mesmos 128 tecidos dos três porcos eram constituídos por cada grupo de inoculados. 0 soro foi agrupado do mesmo modo.

Resultados

Doença clínica: A pontuação média da doença clínica respiratória para cada grupo está resumida no grupo 7. Os porcos de controlo permaneceram normais. A doença respiratória era mínima, e os sintomas e a histopatologia eram similares nos grupos de porcos infectados com o vírus de Lelystad e o VR 2431. Aos 2 DPI, alguns porcos em cada um destes grupos demonstraram uma dispneia e uma taquipneia ligeiras depois de terem sido pressionados pelo tratador. De 5-10 DPI, mais alguns dos porcos nestes grupos demonstraram uma doença respiratória ligeira e um par de porcos evidenciaram uma respiração abdominal forçada moderada mas transitória. Aos 14 DPI, todos os porcos nos grupos do vírus de Lelystad e do VR 2431 tinham recuperado. Outras doenças clínicas transientes notadas nalguns dos porcos nestes grupos incluíam quemose, conjuntiva avermelhada, orelhas descaídas e cianose desigual da pele quando pressionado pelo tratador. Não se observou tosses.

Quadro 7: Pontuação média da doença clínica respiratória

GRUPO 0 DPI 1 DPI 2 DPI 3 DPI 4 DPI 5 DPI 6 DPI 7 DPI 8 DPI 9 DPI 10 DPI Controlo 0 0 0 0 0 0 0 0,1 0 0,1 0 Lelystad 0 0,2 0,1 0,2 0,5 0,6 0,8 1,0 0,9 0,3 0,3 VR 2431 0 0 0,3 0,2 . 0,4 0,6 0,3 1,3 0,7 0,5 0,5 VR 2385 0 0,4 1,5 1,8 2,2 3,2 3,4 3,5 3,3 3,4 O fO

Ao 2° DPI, o grupo inoculado com VR 23 85 exibiu uma doença respiratória ligeira sem ter sido pressionado. Aos 5 DPI, todos os porcos neste grupo demonstraram uma doença respiratória moderada caracterizada por uma respiração 129 abdominal forçada e dispneia quando pressionado. Alguns destes porcos neste grupo receberam pontuações relativamente à insuficiência respiratória de 5 ou 6 durante um período de 2 a 5 dias, e a pontuação média da doença respiratória clínica teve o seu pico aos 3,5/6 aos 7 DPI. A doença respiratória foi caracterizada por uma taquipneia severa e uma respiração abdominal forçada, mas sem se observar tosse. Os porcos infectados com VR 2385 porcos geralmente estavam moderadamente letárgicos e anoréxicos aos 4-10 DPI. Outros sinais clínicos transientes incluíram quemose, pelos eriçados, letargia, e anorexia. Levou até 21 DPI para que a maioria dos porcos neste grupo recuperasse completamente.

Lesões macroscópicas O quadro 8 resume a percentagem estimada de consolidação dos pulmões para os porcos em cada grupo. As lesões do pulmão no grupo de Lelystad e no grupo do VR 2431 foram similares no tipo e na extensão. Observaram-se as primeiras lesões aos 5 DPI em ambos os grupos, e tiveram o seu pico aos 15 DPI para o grupo inoculado com Lelystad e aos 7 DPI para o grupo inoculado com VR 2431. As pontuações individuais variaram entre 0-31 por cento de consolidação para o grupo do Lelystad e entre 0-27 por cento para o grupo do VR 2431 grupo. A percentagem média de consolidação do pulmão estimada para os nove porcos necropsiados aos 10 DPI foi de 6,8 por cento para os porcos inoculados com o vírus de Lelystad e de 9,7 por cento para os porcos inoculados com o vírus VR 2431. As lesões foram predominantemente cranianas, nos lóbulos médios e acessórios e na porção ventral média dos lóbulos diafra-gmãticos. A consolidação foi caracterizada por áreas 130 multifocais, manchadas de castanho, com rebordos irregulares, indistintos.

Quadro 8: Percentagem de consolidação dos pulmões estimada (o-ioo %) GRUPO 1 DPI 2 DPI 3 DPI 5 DPI 7 DPI 10 DPI 15 DPI 21 DPI 28 DPI Controlo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Lelystad 0 0 0 4,8 2,3 6,8 8,8 1,8 0 VR 2431 0 0 0 2,5 8,5 9,7 7,5 0 0 VR 2385 0 4,3 10,5 15,3 46,5 54,2 12,5 6,0 0

As lesões linfóides macroscópicas foram mais comuns do que as lesões do pulmão tanto com VR 2431 como com VL. Observou-se consistentemente linfoadenopatia nos nódulos linfáticos mediastínicos e nos nódulos linfáticos do ilíaco. Estes nódulos linfáticos tinham uma cor acastanhada e, de 5-28 DPI, estavam aumentados de 2-10 vezes em relação â sua dimensão normal. Muitas vezes havia pelo menos um quisto cheio de fluido com 1-5 mm em cada um destes nódulos linfáticos. Não se observaram outras lesões graves nos grupos do VL ou do VR 2431. O grupo do VR 2385 tinha uma consolidação do pulmão consideravelmente mais severa. A distribuição da consolidação do pulmão era semelhante à dos porcos infectados com VR 2431 e VL, mas quer todo o lóbulo cranioventral quer as grandes porções de coalescência dos lóbulos cranianos, acessórios médios e diafragmáticos ventrais médios estavam consolidados. Não houve pleurite nem pus visível grosseiramente nas vias respiratórias. A percentagem estimada de consolidação do pulmão aos 7-10 DPI variou de 28 % a 71 b A pontuação média estimada dos nove porcos necropsiados aos 10 DPI foi de 54,2 % de consolidação. 131

As lesões linfóides no grupo do VR 2385 foram, no geral, similares às observadas nos outros grupos. Adicionalmente, os nódulos linfáticos ao longo da aorta torácica e na região cervical estavam muitas vezes 2-5 vezes a dimensão normal. Os baços estavam também ligeiramente aumentados e com uma textura semelhante a carne. Vários porcos no grupo do VR 2385 tinham os corações moderadamente aumentados e arredondados com 10-30 mL de um fluido claro no espaço pericárdico. Alguns destes porcos também tinham 50-200 mL de um fluido similar na cavidade abdominal. Não havia exsudado nem fibrina, visível no fluido.

Lesões microscópicas:

Coração: Os porcos de controlo necropsiados até aos 10 DPI não tinham evidências de inflamação do miocárdio. Vários porcos ao longo do estudo tinham focos discretos distribuídos aleatoriamente de células hematopoiéticas no endocárdio e no miocárdio. Estas células hematopoiéticas (i) foram observadas em conglomerados de 10-30 células, (ii) com uma dimensão variando de 8-20 microns, e (iii) tinham núcleos redondos-ovais grandes, com uma coloração escura, com nucléolos múltiplos, pequenos e densos, com conglomerados de cromatina, e citoplasma anfofílico reduzido. Aos 10 DPI, 2/9 porcos de controlo tinham uma ligeira miocardite linfo-histioquística perivascular multi-focal. Isto observou-se em 1/2 dos porcos necropsiados aos 15 e 21 DPI, respectivamente.

Os porcos inoculados com VR 2431 também tinham evidências de hematopoiese extramedular do miocárdio, similar à dos controlos. A primeira miocardite observou-se aos 7 132 DPI, e foi observada em 16/18 porcos necropsiados aos 7-28 DPI. A miocardite era ligeira, multifocal, normalmente perivascular e de peri-Purkinje, e linfo-histiocítica. Encontrou-se consistentemente inflamação no endocárdio, muitas vezes à volta ou envolvendo as fibras de Purkinje (fibras do músculo cardíaco). A inflamação no epicárdio e no miocárdio estava mais consistentemente quer à volta dos vasos ou distribuída aleatoriamente entre as fibras dos músculos. A degeneração do miocárdio, a necrose, ou a fibrose não eram evidentes. Observou-se um baixo número de eosinófilos nos infiltrados perivasculares em 4/9 porcos aos 9 DPI.

Nos porcos inoculados com VL, era evidente uma ligeira hematopoiese extramedular multifocal na maior parte dos porcos até aos 7 DPI. Observou-se a primeira miocardite ligeira aos 2 DPI e era inconsistente e uma miocardite ligeira nos porcos que passaram os 3-10 DPI. Os porcos necropsiados aos 15 e 21 DPI tinham uma miocardite multifocal moderada. Esta miocardite era menos severa aos 28 DPI. Em todos, os 13/17 porcos inoculados com VL necropsiados aos 7-28 DPI havia miocardite linfo-histo-cítica, que era ligeira-moderada, perivascular, peri-Purkinje ou aleatória na distribuição. Encontrou-se um número menor de células do plasma e eosinófilos nas áreas de inflamação aos 10-28 DPI.

Observou-se uma miocardite moderada, multifocal linfo-histocítica no início dos 10 DPI em todos os porcos inoculados com VR 2385. Observou-se uma miocardite severa em 2/9 porcos mortos aos 10 DPI e em 1/2 porcos mortos em cada dos 15, 21, e 28 DPI, respectivamente. O caso mais severo foi caracterizado por infiltrados multifocais â difusão, linfo-plasmacíticos e histiocíticos que eram os mais intensos nas 133 regiões perivascular, peri-Purkinje, e endocárdica. Observou-se um número menor de eosinõfilos e de células picnó-ticas não identificáveis em associação com a inflamação. A degeneração do miocárdio, a necrose e a fibrose não foram evidentes.

Pulmão: Observaram-se lesões muito ligeiras do pulmão em 2/25 dos porcos de controlo. Um porco necropsiado aos 5 DPI tinha um espessamento ligeiro multifocal do septo com linfócitos, macrófagos, e neutrófilos. Aos 10 DPI, um dos porcos tinha uma ligeira oclusão peribronquiolar e perivascular linfo-histocítica e um ligeiro aumento do número de macrófagos e de neutrófilos nos espaços alveolares.

Nos porcos inoculados com o VR 2431, detectaram-se as primeiras lesões microscópicas do pulmão aos 2 DPI e estavam presentes em 20/25 dos porcos. Todos os porcos necropsiados aos 7 DPI ou depois tinham lesões microscópicas do pulmão. As lesões, quando presentes, eram multifocais, ligeiras (12/25) a moderadas (8/25), geralmente as mais severas aos 10 DPI e praticamente resolvidas aos 28 DPI. A pneumonia multifocal intersticial foi caracterizada por três alterações prin-cipais: espessamento do septo com células mononucleares, hipertrofia e hiperplasia de pneumócitos do tipo 2 e acumulação de macrófagos normal e necróticos em espaços alveolares. Estas alterações estavam presentes por um período de 28 dias. Observou-se uma oclusão ligeira a moderada peribronquiolar e perivascular linfo-histocítica na maior parte dos porcos examinados aos 10-15 DPI mas tinham aparentemente resolvido ao 28° DPI. Observaram-se algumas vezes lesões do pulmão em secções retiradas do lóbulo caudal do pulmão. 134

Os porcos inoculados com VL tinham lesões microscópicas do pulmão muito similares às do VR 2431 na distribuição, tipo, e severidade. Observaram-se lesões microscópicas do pulmão em 21/25 dos porcos inoculados com YL. As primeiras lesões foram observadas aos 2 DPI and persistiram durante um período de 28 dias. As lesões mais severas foram observadas nalguns dos porcos necropsiados aos 10 DPI e na maior parte dos necropsiados aos 15 e 21 DPI. A pneumonia intersticial foi caracterizada principalmente por um espessamento do septo com células mononucleares, oclusão peribronquiolar e perivascular linfo-histocítica, e a acumulação de macrófagos e fragmentos necrõticos nos espaços alveolares. A hiperplasia e a hipertrofia pneumocítica do tipo 2 eram menos consistentes e menos severas do que a observada nos porcos inoculados com VR 2431. As lesões do pulmão foram várias vezes vistas em secções retiradas do lóbulo caudal do pulmão.

Cada porco que foi inoculado com VR 23 85 e necropsiados aos 5 DPI ou depois tinham pneumonia intersticial moderada a severa. Observaram-se lesões multifocais ligeiras no 2o DPI. As lesões tornaram-se moderadas e multifocais ao 5o DPI, severas e difusas de 7-10 DPI, e ainda moderadas mas com aspecto de carne aos 21 e 28 DPI. A pneumonia intersticial de todos os estádios foi também caracterizada por três alterações primárias (espessamento do septo com células mononucleares, hiperplasia e a hipertrofia pneumocítica. do tipo 2, e acumulação de macrófagos normais e necróticos em espaços alveolares). Destas três alterações, a hipertrofia pneumocítica foi a mais proeminente e característica da inoculação pelo VR 2385. A oclusão peribronquiolar e peri-vascular linfoma-croãgica oclusão eram ligeiras ao 5o DPI, moderada ao 10° DPI e estava praticamente resolvida no 28° DPI. 135

Imuno-histoqulmica

Examinaram-se ambas as glândulas supra-renais de todos os porcos. Não se observaram lesões das glândulas supra-renais em nenhum dos controlos, nem nos porcos inoculados com VR 2431 ou VL. Nos porcos inoculados com VR 2385, 9/25 porcos tinham uma adrenalite multifocal linfoplasmacítica e histiocítica ligeira. Normalmente observou-se inflamação na medula. As células picnóticas e os fragmentos de cariorrexia foram também observados entre as células inflamatórias. Também se observou vasculite e neurite linfoplasmocíticas na artéria e no nervo das supra-renais, respectivamente, em 3/28 dos porcos inoculados com VR.

As lesões da concha nasal eram similares no tipo mas diferiam na severidade e na frequência nos 4 grupos de porcos. Um número baixo (5/25) de porcos de controlo e inoculados com VL (5/25) tinham uma rinite ligeira, observada aos 1021 DPI. A rinite foi caracterizada por uma displasia desigual do epitélio, com perda dos cílios e uma inflamação multifocal sub-epitelial linfo-histocítica e superar.iva ligeira, com um ligeiro edema e congestão.

Mais porcos (17/25) inoculados com· VR 2431 tinham rinite. As lesões eram ligeiras aos 5 DPI mas moderadas aos 10 DPI. . Observou-se displasia epitelial com edema intercelular, uma aparência bolhosa ou de "lápide" de células epiteliais aumentadas de volume a tornar-se picnóticas e descartando-se aparentemente na cavidade nasal e uma perda completa ou parcial dos cílios em grandes pedaços de epitélio. Haviá um edema moderado, difuso sub-epitelial, veias dilatadas e congestionadas, e infiltrados multi-focais de, linfócitos, células do plasma, macrófagos e neutrófilos. A inflamação foi mais intensa próximo das 136 localizações em que os canais das glândulas mucosas da sub- . mucose se estendiam até à superfície. A exocitose leucocítica, especialmente de neutrófilos, foi frequentemente observada no epitélio da superfície displásica e ao longo dos canais da mucosa. Aos 21 DPI, as lesões tornaram-se ligeiras, e foram resolvidas aos 28 DPI.

Observou se a primeira rinite no 5 ° DPI nos porcos inoculados com VR 2385. Um total de 20/25 porcos, e todos os 17 porcos necropsiados aos 7 DPI ou depois, tinham uma rinite similar â observada no grupo do ISU-3927, excepto no facto de a lesão persistir ao longo de um período de 28 dias.

Os quadros 9, 10, e 11 resumem e comparam o número de tecidos diferentes em que o antigénio do VSRRP foi detectado para cada um dos grupos inoculados. Não se detectou nenhum antigénio nos porcos de controlo. 0 quadro 12 resume a quantidade estimada de antigénio nalguns dos tecidos que foram analisados.: / .

Isolamento do vírus 'í'· 0 isolamento: do vírus a partir de vários tecidos está resumido no quadro 13,. em que "Pl" refere-se aos pulmões, "NL" refere-se aos nódulos .linfáticos, "Cr" refere-se ao coração, "Ser" refere-se ao soro, "Amgs" refere-se às amígdalas, "Bç" refere-se ao baço, "ID" refere-se ao intestino delgado, e "Crb" refere-se ao cérebro. 137

Quadro 9: Imuno-histoquímica para o VR 2385

Tecido 1 DPI 2 DPI 3 DPI 5 DPI 7 DPI 10 DPI 15 DPI 21 DPI 28 DPI Pulmão 0/2 1/2 2/2 2/2 2/2 9/9 2/2 2/2 2/2 22/25 NL TB 1/2 2/2 2/2 2/2 2/2 3/9 0/2 1/2 0/213/25 NL Med 0/2 2/2 2/2 2/2 2/2 4/9 0/2 0/2 2/2 14/25 NL ilíaco 1/2 2/2 2/2 2/2 2/2 5/9 . 0/2 0/2 0/2 14/25 Amígdal. 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2 9/9 2/2 2/2 2/2 25/25 Timo 0/2 1/2 2/2 2/2 2/2 2/9 0/2 0/2 0/2 9/25 Baço 0/2 2/2 2/2 2/2 0/2 3/9 0/2 1/2 0/210/25 # pos 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2 9/9 2/2 2/2 2/2 25/25

Quadro 10: Imuno-histoquímica para VR 2431

Tecido 1 DPI 2 DPI 3 DPI 5 DPI 7 DPI 10 DPI 15 DPI 21 DPI 28 Total Pulmão 1/2 1/2 0/2 1/2. 0/2 7/9 2/2 0/2 2/214/25 NL TB 0/2 2/2 1/2 2/2 2/2 1/9 0/2 0/2 0/2 8/25 NL Med 0/2 2/2 2/2 2/2 1/2 1/9 0/2 . 0/2 2/2 10/25 NL 0/2 .. 2/2 . 2/2 2/2 1/2 1/9 0/2 . 0/2 0/2 8/25 Amígdal. 1/2 1/2 .1/2 2/2 1/2 9/9 2/2 2/2 2/2 21/25 Timo 0/2 0/2 ' 2/2 1/2 .1/2 0/9 . 0/2 2/2 0/2 6/25 Baço 0/2 0/2 0/2 .0/2 0/2 , 0/9 0/2 0/2 1/2 1/25 # pos 1/2 2/2 2/2 2/2 2/2 9/9 2/2 2/2 2/2 25/25

Quadro 11: Imuno-histoquímica para o vírus de Lelystad

Tecido :1 DPI 2 DPI 3 DPI. 5 DPI '7 DPI 10 DPI 15 DPI 21 DPI 28 Total . Pulmão 0/2 1/2 1/2 1/2 1/2 5/9 2/2 2/2 1/214/25 . NL TB 1/2 : 1/2 1/2 0/2 ' 1/2 ' 5/9 . 0/2 0/2 0/2 9/25 NL Med 1 /2 1 /2. 2/2 1 /2 1 /2 2/9 0/2 1 /2 1 /2 10/25. NL 0/2 ‘1/2 2/2 0/2 1/2: 0/9 0/2 0/2 0/2 4/25 Amígdal. 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2 7/9 2/2 . 2/2 2/2 23/25 .. Timo 0/2 0/2 0/2 2/2 0/2 0/9 . 0/2 . 0/2 0/2 2/25: Baço 1/2 1/2 0/2 . 0/2 0/2 4/9 0/2 0/2 1/2 7/25 # pos 2/2 . 2/2 2/2 2/2 2/2 8/9: ; 2/2 2/2 2/2 25/25

Serologia

Todos os porcos inoculados com o virus VL tiveram um pré-estímulo negativo e permaneceram < 1:20 ao longo de 7 DPI. Aos 10 DPI,. 6/9 dos porcos necropsiados eram sero-positivos. com títulos variando de 1:20 a 1:1280. Apenas . 138 2/10 porcos tiveram títulos > 1:20 (foram ambos 1:1280). Aos 15 DPI, todos os porcos foram positivos e 5/6 foram > 1:320. Aos 21 DPI, os títulos mais comuns foram de 1:1280 ou de 1:5120. Os títulos do anticorpo de VR 2431 foram similares aos. níveis verificados com o vírus VL. Contudo, com o VR 2385, 9/9 eram positivos aos 10 DPI e 7/9 eram 1:320. Não se detectou nenhum anticorpo de VSRRP no soro dos porcos de controlo..

Discussão

Esta experiência demonstra claramente .as' diferenças na patogenicidade entre os produtos isolados de VSRRP, as diferenças na distribuição do antigénio de VSRRP, e as diferenças na quantidade do antigénio de VSRRP antigénio em tecidos seleccionados. A baixa virulência da estirpe Iowa isolada de VR 2431. e a baixa virulência do vírus de Lelystad foram similares nestes critérios. O produto isolado da estirpe Iowa de VR 2385 foi consideravelmente mais virulento,; e· o antigénio de VSRRP foi detectado em mais tecidos e em quantidades maiores; quando', comparado com o VL e com o VR 2431. O modelo de distribuição do antigénio ao longo do tempo (quadro 12) sugere que quando os porcos são infectados : oro-nasalmente, a replicação inicial e continuada do vírus pode ser nas amígdalas e nos- tecidos linfóides do tracto respiratório superior, com subsequente virémia às 24 horas PI. Detecta-se uma pequena quantidade; de antigénio no pulmão 24 horas PI e os picos aos 5-7 DPI, mas persiste lã até 28 dias. O antigénio está presente em tecidos linfóides geralmente de 2-21 DPI. 139

Quadro 12: Pontuação média para a intensidade/quantidade de antigénio de VSRRP detectada por imuno-histoquímica DPI VR 2385 VR 2431 Pulmão Crvn Pulmão Med ' NLTB NL Med NL ilíaco Amígda. Pulmão CrVn Pulmão Med NLTB Med' . LN NL Med - NL Ilíaco 1 0 0 1,5 0 0,5 1, 0 0,5 0 0 0 0 0,5 2 0,5 1,0 2,0 1,5 2,0 1; 5 0,5 0 2,0 1,0 2,5 0,5 3 2,0 2,5 3,0 3,0 3 , 0 '3,0 0 0 .1,0 1,5 2,5 0,5 5 2,0 2, 0 3,0 3 0 2,5 3,0 0,5 1 2, 0 2,0 2, 0 1,0 7 2,5 1,5 1,0 1,5 2,0 1, ò 0 2 H o 1,0 0,5 0,5 10 2,0 1,6 0,5 0,6 0,7 1,2 1,1 0,9 0,1 0,1·. 0,1 1,1 15 1, 0 0 0 0 0 1,0 2,0 P, 5 0 0 0 1,0 21 2,0 0,5 - 0,5 0 0 2,5 0 0 0 0 0 1.0 28 1, 0 0 0 1 0 1,5 1,3 0. 0 1,3 0 2.° | A quantidade de antigénio quantidade foi estimada e pontuada como se segue: (0) = negativa, (1) = células isoladas ou raras de coloração positiva, (2) = número baixo de células positivas, (3) número moderado de células positivas, e (4) = grande número de células positivas.

CrVn = lóbulo cranioventral do pulmão; Med = lóbulo médio do pulmão; MLTB = nódulos linfáticos tfaqueobrônquicos; NL Med - nódulos linfáticos mediastinicos.

Quadro 12 Continuação DPI Vírus Lelystad ' . Pulmão CrVn Pulmão méd . NLTB NL Med NL Ilíaco Amígd. 1 . 0 0 0, 5 .0,5 0 . i'; o : 2 . .. 0,5 °/5 : 1, 0 :,1,0 1,0 .1,0 3 0,5 0 , 5 1,° 1,5 2 ,0 1, ° 5 1, ° 0,5 o 0,5 0 . 1,0 7 1,0 0 1,0 . 0,5 0,5 • 1,0 1 0. 0 ,' 3 0,4 0,6 0,2 0 CO O 15 0,5 0,5. 0 0 0 1, 0 21 1,0 0 0 0,5 0 1,5 ; 28 0,5 0 0 . 0 ., 5 0 1 , 0

EXPERIÊNCIA- XIII PATOGENICIDADE COMPARATIVA DE NOVE PRODUTOS ISOLADOS DO VSRRPDOS E.U.A. - NUM MODELO DE PORCOS. PCNC COM 5 -SEMANAS DÊ IDADE · A parte (A) desta experiência demonstra um modelo consistente para estudar a doença sistémica e respiratória induzida por VSRRP em leitões (por exemplo, com cerca de 5 semanas de idade) e para caracterizar lesões grandes e microscópicas associadas ao curso da doença; -induzida por VSRRP. A parte (B) desta' experiência utilize o modelo para Comparar, sob o ponto de vista estatístico', a virulência dos produtos isolados de VSRRP de varas com diferentes severidades da doença, e para determinar especificamente se estas diferenças podem ser devidas às características de virulência do vírus.

Materiais e Processos

Fonte de produtos isolados de VSRRP:

Receberam-se porcos vivos ou tecidos frescos de 61 Varas ao longo de um período de 3 anos de 1991-1993. Todos os casos foram submetidos para diagnóstico etiológico da doença respiratória em porcos com 1-16 semanas de idade. Algumas das varas tinham uma insuficiência reprodutiva simultânea, e outras não. As nove varas seleccionadas diferiam na dimensão, no estilo de produção, na idade dos porcos doentes, do tempo desde que se observou o início da doença e da severidade da epidemia corrente da doença. A informação clínica das explorações,'agrícolas .seleccionadas está resumida no quadro 1,4,. · \ 1'

Quadro.14: Perfis das varas com VSRRP

Produto isolado Dimensão da vara Estilo de produção idade da doença Tipo de doença VR 2385 180 porcas C-Fim/FÇ TODAS ^ SRRP severa ISU-79 ISU-28 40 porcas 150 porcas C-Fim/TDTF . C-Fim/FC TODAS TODAS SRR£ severa . SRRP sèverá ISU-1894 600 porcas C-ALM/FC . 3-8 semanas resp. severa VR 2428 900 porcas C-ALM/TDTF · 3-8 semanas resp. severa^ VR 2429 100 porcas C-Fim/FC 1-8 semanas - resp. moderada' ISU-984 600 porcas C-ALM/TDTF 3-6 semanas resp. moderada VR 2430 150 porcas C-Fim/FC 3-6 semanas 1 resp. ligeira . VR 2431 60 porcas C-Fim/TDTF 1-4 semanas resp. ligeira C-Fim - Criar, leitões. até ao fira C-ALM. = Criar leitões até aos porcos FC = Fluxo contínuo TDTE - TODAS- dentro-TODAS-fora se alimentarem

Preparação dos inóculos

Os produtos isolados do VSRRP foram purificados em . placas 3 vezes de acordo com o processo descrito na Experiência I,. secção (I) (A) anterior.

Porcos da experiência:

Alimentaram-se 'inicialmente porcos privados. de colostro e que nasceram '·,de cesariana (PCNC) , com quatro semanas de idade, com uma primeira refeição comercial para porcos com 22 % de proteína contendo proteína do plasma liof ilizada, durante 7 dia.s, depois passaram para um segundo estádio com uma . refeição com uma ração â Base de proteína de milho a 18 % - soja que se manteve durante a experiência. Os porcos foram aloj ados em compartimentos com o chão de cimento de 3,05 m x 3,66 m (10 pés x 12 pés) ventilados individualmente.

143

Parte (A): Modelo de porco PCNC:

Dividiu-se aleatoriamente noventa e oito porcos PCNC com 4 semanas de idade, em 7 compartimentos com 14 porcos em cada. Atribuiu-se. aleatoriamente aos compartimentos, um dos sete tratamentos como se mostra no quadro 15. 0 tratamento, consistiu na .inoculação intranasal de 105'7 TCID50 de um produto isolado de VSRRP (seleccionado de produtos isolados de VSRRP purificados em placas VR 2385, VR 242? [ISU-22], VR 2431 ou ISU-984, produtos isolados não purificados em placas ISU-12 [VR 2386]), inoculação intranasal de meio e cultura de células não infectadas, ou ‘sem tratamento. Dois porcos de cada grupo - foram necropsiados aos 3, 7, 20 e 21 DPI, e . 3 porcos de cada. grupo foram necropsiados. aos 28 e 36 DPI. Registaram-se as temperaturas rectais diariamente desde o -2 DPI até +14 DPI. A pontuação da doença clínica respiratória foi dada desde -2 DPI até 14 DPI. O intervalo de pontuações ê de 0-6, de acordo com a escala de insuficiência respiratória já citada na experiência XII. Um leitão é considerado "pressionado" pelo tratador do porco quando ele segura o porco . sob o seu braço e determina a temperatura rectal durante aproximadamente 30-60 segundos. Outras observações clínicas relevantes (por exemplo, tosse, diarreia, inépcia ou letargia) foram anotadas sepáradamente à medida, que foram observadas. As observações clínicas adicionais não tiveram impacto na pontuação clinica respiratória. Os pesos foram.registados aos 0, 7, 14, 21 e 28 DPI.

Quadro 15: Parte (A) Desenho da experiência

Inoculo 3 DPI 7 DPI 10 DPI 21 DPI 28 DPI 36 DPI Total VR 2385 2 2 2 2 3 . 3 14· ISU-984 2 2 2 2 3 3 14 VR 2429 .2 2 .2 2 3 . 3 .14 VR 2431 2 2 2 . 2 3 3 14 VR 2386 2 2 2 1 2 3 3 14 Controlo não inoculado 2 2 2 2 3 . 3. 14 Cultura de células PSP-36 2 2 2 2 3 3 14

Parte (B): Patogenicidade comparativa:

Os resultados da parte. (A) estabeleceram que as lesões grandes do pulmão eram as mais severas aos 10 DPI para 4 dos 5 produtos isolados de VSRRP. A parte (B) foi desenhada para recolher e comparar dados de um número maior dos porcos necropsiados aos 10 DPI. Nesta experiência, 105 porcos PCNC híbridos com 4 semana de idade foram divididos aleatoriamente· por sete compartimentos, cada um deles com 15 porcos. A cada compartimento foi assignado aleatoriamente um tratamento. Os tratamentos consistiram na inoculação intranasal. com ·. IO5,8 TCIDS0 de um dos seis produtos isolados· de VSRRP purificados em placas (VR 2428 [ISU-51], ISU-79, VR 2430 [ISU-55] , ISU-1894, ISU-28 cu VR 2385) ou meios e culturas de células não infectadas de PSP-36. Dez porcos de cada grupo foram necropsiados 'aos 10 DPI, e 5 porcos de cada grupo foram necropsiados aos 28 DPI. Registaram-se as temperaturas rectais desde -2 DPI a +10 DPI, e registaram-se os pesos aos 0, 10 e 2 8 DPI. As pontuações da doença clínica respiratória e outros sinais clínicos fõram.registados, tal como antes na parte (A). Sèrologia:

Parte (A): Fez-se uma colheita de sangue aos porcos aos 0, 10 e 28 DPI. A presença do anticorpo de VSRRP no soro foi. detectada pela técnica do 'anticorpo imunof luorescente (AFI) ' tal como descrito .por Benf.ield et al (J. Vet. Diagn. Invest4: 127-133 (1992)).

Parte (B) : Fez-se uma colheita de sangue aos porcos aos 0, 3, 10, 16 e 28 DPI e fez-se a análise pelo processo AFI da parte (A) quanto à presença do anticorpo de VSRRP no soro. isolamento do vírus:

Fez-se uma tentativa, de.isolamento. do vírus a partir de partes, homogeneizadas do pulmão de todos os porcos mortos nos 3, 7, 10 , 21 e 28 DPI (Parte (A) ) . Também se tentou isolar o vírus dó pulmão e do soro de todos os porcos separadamente em conjuntos de dois in porco Utilizando células CRL 11171 (PSP 36) (Parte (B)). macroscópica:

Realizaram-se necropsias completas de todos os porcos. Examinaram-se todos os sistemas de órgãos. Calculou-se uma percentagem estimada da consolidação do pulmão de cada porco com base no sistema de pontuação descrito na experiência XII anterior, em que a cada lóbulo do pulmão lóbulo foi atribuído um número para reflectir o volume aproximado de todo o pulmão representado por esse lóbulo. Anotaram-se outras lesões de acordo com isto.

Patologia microscópica:

Recolheram-se secções de todos os lóbulos de pulmão descritos antes, assim como das conchas nasais, do cérebro, do tálamo, do hipotãlamo, da glândula pituitária, do tronco do cérebro, do plexo coróide, do cerebelo, do coraçãõ ,. do pâncreas, do íleo., das amígdalas, dos nódulos linfáticos '.mediastínicos, dos nódulos linfáticos do ilíaco médio, dos nódulos linfáticos mesentéricos, do timo, do fígado, do rim, e das glândulas supra-renais para o exame histo-patológico. Fixaram-se os tecidos em formalina com tampão .neutro a 10 % durante 1-7 dias e fez-se um tratamento. de rotina com blocos de parafina num processador automático de blocos. Cortaram-se as secções a 6μτη e coraram-se com hematoxilina e eosina. As lesões . nos vários tecidos foram graduadas de acordo com a escala seguinte: (-) = normal, (+) = ligeira, (++) = moderada, (+++) = severa, e (++++) = muito severa (ver quadro 19).

Resultados

Doença clínica - Parte (A), modelo de porco PCNC:

Os porcos inoculados com VR 23 85 demonstraram que a doença clínica respiratória mais: severa, com pontuações acima de 2,5/6,0 aos 7-9 DPI. (quadro 16) . O início da doença respiratória foi anotado ao 3o DPI, e os sintomas e as lesões continuaram até ao 14° DPI. A doença respiratória foi caracterizada por respiração abdominal forçada e acentuada e taquipneia. Não houve tosse. Os porcos tornaram-se letárgicos ao 3o DPI, ficaram anoréxico ao 5o. DPI, e não voltaram a ter uma refeição nem uma actividade completas até depois do 14° DPI. Notou-se um edema da pálpebra em dois porcos no 6° e 7 ° DPI. 147 .Os porcos inoculados com VR 2429 tiveram um início da doença respiratória mais tardio (5o DPI), mas a doença respiratória severa ocorreu mais rapidamente e durante mais tempo do que nos porcos inoculados, com ISU-12. As pontuações da doença respiratória produzida, por VR' 2429 eram maiores do que 3,0/6,0 nos 7-13 DPI. Os porcos deixaram se alimentar e ficaram letárgicos. aos 6.-14 DPI. Não se notaram outros sinais clínicos.

Os porcos inoculados com ISU-984 produziram uma. doença respiratória moderada, a severa . com um início gradual no .4 DPI . Os porcos foram pontuados, com 2-2,5/6,0. para a doença respiratória de 7-10 DPI, e maior do que 3,.0/6,0 com algumas pontuações de 4-5/6,0 nos 11-14 DPI. Outros sinais clínicos incluíram letargia, edema da pálpebra, e uma descoloração temporária com· manchas de púrpura na pele.

Os porcos inoculados com VR.2431 produziram uma doença respiratória ligeira. 0 início dal doença ocorreu no 5 DPI com as pontuações mais severas da doença respiratória clínica com pontuações entre 2 e 2,5/6,0 nalguns porcos nos 7-8 DPI. Os porcos pareceram consideravelmente melhores no 10“ DPI e ' estavam completamente normais no 14° DPI. Observou-se letar-gia e anorexia aòs 7-8 DPI.

As temperaturas rectais médias foram .maiores do que 40 °C (104°F) para todos os grupos inoculados no 7o DPI, e permaneceram nos 40 °C até depois do 10° DPI..Isto coincide com. o período da mais Severa doença .respiratória’ clínica. Os porcos de controlo permaneceram clinicamente normais aó. longo da experiência. 148

Doença clínica - Parte (B), patogenicidade comparativa:

As pontuações da doença respiratória clínica e as temperaturas rectais estão resumidas no quadro 17. O VR 2428 produziu uma doença respiratória muito ligeira e os porcos aproximaram-se de uma situação normal próximo do 10° DPI. O VR 2430 induziu uma dispneia e uma taquipneia ligeiras a partir do 4-10 DPI, assim como letargia e anorexia a partir' do 4-6 DPI. Aos 5-8 DPI, o ISU-1894 produziu uma doença respiratória moderada de curta duração, e os porcos estavam’geralmente recuperados por volta do 10° DPI. Os porcos inoculados com ISU-1894 estiveram também transientemente letárgicos e anoréxicos a partis dos 4-7 DPI. O ISU-79 induziu uma doença respiratória severa com respiração forçada com uma frequência aumentada, acompanhada por letargia e anorexia a partir do 4° DPI até ao 15° DPI·. 0 ISU-12 induziu uma taquipneia e uma dispneia moderadas de longa duração :(4-28 DPI). Estes porcos ficaram também moderadamente letárgicos e ligeiramente anoréxicos durante esse período de tempo.

Os porcos nos três grupos (ISU-12, ISU-79, ISU-28) frequentemente exibiram uma descoloração transiente, azul-púrpura da pele quando pressionado pelo tratador.. O ISU-28 produziu uma doença respiratória severa similar à do ISU-79, mas teve um início mais tardio (ao 7° DPI) e teve apenas uma duração de 5 dias. Os controlos permaneceram normais por volta do 10° DPI.

Lesões macroscópicas - Parte (A), modelo de porco PCNC;

Pontuaram-se as lesões macroscópicas do pulmão e estimou· sc como uma percentagem de consolidação do pulmão. Os resultados estão resumidos no quadro 16. O grau de conso- lidação variou de 7,3 % (ISU-984) até 29 % (VR 2386) no 3° DPI, 20 % (VR 2431) até 56,3% (VR 2386) no 7° DPI, 10,5% (VR 2431) até 77,5 % (VR 2385) no 10° DPI, 0 % (VR 2431) até 37,3 % no 21° DPI, e 0 % (VR 2431, VR 2385) até 11 % (VR -2429) no 28° DPI. Não restaram nenhumas lesões macroscópicas detectáveis em qualquer um dos grupos nò 36° DPI.; Não se observaram lesões do pulmão em nenhum momento no grupo de controlo.

Os lóbulos de pulmão afectados estavam principalmente na .porção anterior, média, acessória, e ventromédia dos lóbulos caudais. As áreas consolidadas não estavam bem demarcadas. Estas áreas foram multifocais dentro de cada lóbulo e tem bordos irregulares e indistintos, dando, aos lóbulos afectados uma aparência acastanhada matizada. -

Quadro 16: Parte (A) Consolidação média das zonas macroscópicas do pulmão p.·. ; isolado- 3 DPI 7 DPI 10 DPI - 21 DPI 28 DPI' Pont. Clin. Pulmão macro ... Pont .·' Clin: Pulmão macro Pont'. . Clin. Pulmão .macro Pont. Clin. Pulmão macro Pont.. clin. Pulmão macro VR 2386 0,5 29 3,1 · 56,3 i 3,5..· '77,3 2,0 37,3 0,5 6,0 VR 2385 0,5 20,5"’ 2,3 '' ’ 35,5 ' 2,0 ' . 77,5 0,5 25,0 0 0,0 VR 2429 0 26,5·· '2,4 35,0 3,5 64,8 2,0 36,5 2,5 11,0 . ISU- 984 : 0,5 . 7,3 ‘ 2,3 21,8 ' 3,5 , 76,0 2,0 21,0',. 0 . 0,5 VR 2431 o 13,5 2,3 20,0 1,5 · 10,5 . o 0 0 0,0 PSP-36 · 0 0 ' 0 0 o 0 0 . 0 . ,0 0,0 Não inoCv o • · 0 0 0 • ' 0' 0 0 . : 0- 0 . 0,0

Lesões macroscópicas ; - Parte (B), Patogenicidade comparativa: 150

As lesões macroscópicas do pulmão foram estimadas pela percentagem de consolidação do pulmão e estão ilustradas no quadro 18.

Lesões.microscópicas - Parte (A), modelos de porcos PCNC:

Os resultados estão ilustrados no quadro 19. Os VR 2385, VR 2386, VR 2428 e. ISU-984 induziram todos lesões microscópicas similares no pulmão. Produziram uma pneumonia intersticial moderada a severa, caracterizada por: (i) proliferação pneumocítica do tipo II, (ii) espessarnento do septo cora células mononucleares, e (iii) acumulação de um misto de exsudados alveolares. O VR 2431 induziu apenas uma pneumonia intersticial ligeira com espessarnento do septo com células mononucleares. Observou-se miocardite apenas nos porcos inoculados com VR 2386.

Isolamento do virus - Parte (A) , Modelo de porcos PCNC:

Recuperou-se VSRRP. a partir dos pulmões dos 11 porcos inoculados com VR 2386, a partir de 9 dos 11 porcos inoculados com VR 23 85, a partir de 6 . dos 11 porcos inoculados com :'ISU· -984, a partir de 9 dos 11 porcos inoculados com VR 2431, a- partir.. de 0 dos 11 porcos inoculados com controlos de cultura. de'.. células e a partir de 0 de 11 porcos de controlo não inoculados até ao 28° DPI. i·'

Serologia - Parte (A),. Modelo de porcos PCNC:

Todos os porcos inoculados com. VSRRP tinham, um titulo de anticorpo de VSRRP detectável de 640 no 10“ DPI. Nenhum dos porcos de controlo tinha anticorpos de VSRRP detectá- 151 veis. A maior parte dos porcos inoculados com VSRRP tinham títulos de. 2560 ao 28° DPI.

Serologia - Parte (3), Patogenicidade comparativa:

Todos os porços inoculados com VSRRP tinham títulos de anticorpo de 64 no 10d DPI. Os porcos de controlo não tinham anticorpos de VSRRP detectáveis.

Discussão

Os porcos PCNC com 5 semanas de idade inoculados intra-nasalmente com IO5'8 TCID50 de VSRRP constituíram um excelente modelo para estudar e comparar a doença respiratória e sistémica induzida por VSRRP. Observaram-se diferenças significativas (p < 0,05) nos dados de pneumo-patogenicidade relatados no quadro 18. Com base nestes resultados e na experiência XI anterior, os produtos isolados puderam ser.agrupados em grupos de alta e baixa virulência tal como se segue: alta virulência: VR 23 85, VR 2386, VR 2429 (TSU-22) , . ISU-28, ISU-984, ISU-79 . baixa virulência: VR 2431, VR 2428 (ISU-51) , VR 2430,

ISU-1894, LV

Um produto isolado de VSRRP pode ser considerado como sendo um fenótipo de "alta virulência" se resultar em um ou mais do seguinte: , (a) uma consolidação média., macroscópica do pulmão consolidação no 10° DPI de pelo menos 30 %, e preferencialmente, de pelo menos 40 %; 152 (b) uma hipertrofia e hiperplasia de pneumócito do tipo II ; moderada a muito severa, um espessarnento intersticial moderado a muito severo, um exsudado alveolar moderado a muito severo, e a presença de sincicia; ou (c) uma pontuação média da insuficiência respiratória de pelo menos 2,0 nalgum momento no tempo do 10°-21° DPI. '

Quando um produto isolado não preenche nenhum dos critérios anteriores, pode ser considerado como um fenótipo de "baixa virulência".

Obviamente, são possíveis numerosas modificações e variações da presente invenção ã luz dos ensinamentos anteriores . Por isso deve entender-se que dentro do âmbito das reivindicações em anexo, a presente invenção pode ser praticada de uma forma diferente daquela que está especi-ficamente aqui descrita.

Quadro 17: Parte (B) Pontuações médias da insuficiência respiratória e temperatura rectal média : /·ν;; \ :

Isolado Pontuação média da.insuficiência respiratória Temperatura'rectal média ,3.DPI 5 DPI 7 DPI 10 DPI 15 DPI 21 DPI 28 DPI 3 DPi 5 DPI 7 DPI 10 DPI 15 DPI 21 DPI 28 DPI PSP-36 ; 'o ;0. c ' 0' '0 0 39,28 39,2C 39,61 39,83 39,50 39,72 39,89 VR. 2428 - ,o.1 o,i 0,7 0,2; 0.:, 0,2 0 39,2C 39,8: 40,11 39,56 40,28 39,78 40,11 VR 2430 o u 0,8 1,5 0 .... 0 ; 0 39,32 39,82 40,0É 39,89 39,72 40,33 40,06 ISU-1894 0 ' 2,5 1,5' i,! ; ·; 0,5 · 0, 0 39,28 40,22 40, r 39,61 39,94 40,20 39.,94 ISU-79 ,0 3'5 3,8 2,9. , 1,5’ 0,5 1,0 39,78 40,5C 40,32 3.9,83 . 39,67 39,72 39,89 VR 2385 0,2 1.,.5/ M·/ 3.,41-. 1,0 2,4 2,2 . 39,0C 40,2r 39,9^ 39,72 39,83 40,11 39,89 ISU-28 0 ; 1,0 1,3 3,1 0 0,v ; 0/V 1 39,2C ’ 40,1] 40,0( 40,44 40,00 39,89 39,94

Quadro 18: Parte (B)/Consolidação média macroscópica do pulmão e desvio padrão

Inóculos Número., de Porcos Pontuação média de 1. macro., do pulmão no 10p DPI' . DP PSP-36 io ... 0,0 " 0,0 ISU-28 10 52,4 ' 20,9 VR 2385 10 ' 54,3 3,8 ' ' ISU-79 10 51,9 13,5 ISU-1894 10 27,4 11,7 . VR 243 0 .. ,10 . 20,8 !5,1 VR 2428 10 16,7 9,0

Quadro 19: Experiência XIII, parte (A), modelo de porcos PCNC: Resumo das lesões microscópicas no 10° DPI . Lesão : VR 2386 VR 2385 VR 2428 ISU-984 VR 2431 PSP-36 controlo Proliferação de pneiimócitos do tipo II . + + + + + +.+ · + + + + + + . + ;Sincicia + + + + + + + + Espessarnento intersticial , ++++ ++ + ++ + ++ + + Exsudadc alveolar . + + + + + + + + + + + + . + Miocardi.te _+· - - ·. - . Encefalité. : +' ; - “ LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: PAUL, PREM S. MENG, XIANG-JIN HALBUR, PATRICK G.

MOROZOV, IGOR

LUM, MELISSA A. ;/V 155 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: ÁCIDO POLINUCLEICO ISOLADO DE UM VÍRUS DO SÍNDROMA REPRODUTIVO E RESPIRATÓRIO PORCINO (VSRRP), UMA PROTEÍNA CODIFICADA PELO ÁCIDO POLINUCLEICO, UMA· VACINA PREPARADA A PARTIR DE OU CONTENDO O ÁCIDO POLINUCLEICO OU A PROTEÍNA,. (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 77 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA:

(A) ENDEREÇO: NEUSTADT, P.C. (B) RUA: 1755 S OBLON, SPIVAK, MCCLELLAND, MAIER & Jefferson Davis Highway, Suite 4.00 (C) CIDADE: Ar1ington (D) .ESTADO: Virgínia' (E) PAIS:. U.S.A. (F) . CÓDIGO, 'POSTAL :, 22202 (v) FORMA LISIVEL EM COMPUTADOR:

(A) TIPO DE MEIO: Floppy disk (B.) COMPUTADOR: compatível com o PC da IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC- DOS/MS- DOS (D) SOFTWARE: Patentlr. Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO DE PATENTE:

(A) NUMERO DO PEDIDO DE,PATENTE: US (B) DATA DE REGISTO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS ANTERIORES DO PEDIDO DE PATENTE: (A) NÚMERO DO PEDIDO DE PATENTE: US 08/131.625 156 (B) DATA DE REGISTO: 05- OUT- 1993 (viii) ADVOGADO/ AGENTE DE INFORMAÇÃO: (A) NOME: Lavalleye, Jean- Paul M.P. (B) NUMERO DE REGISTO: 31.451

(C) REFERÊNCIA/ NÚMERO DA ETIQUETA: 4625-021-55X CIP (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (703) 413-3000 . (B) TELEFAX: (703) 413-2220 .

(C) TELEX: 248855 OPAT UR (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:. (A) LENGTH: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico : (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO: 1: CGGCCGTGTG GTTCTCGCCA AT 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 157 (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido : (D) TOPOLOGIA: linear; (ii) TIPO. DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: CCCCATTTCC CTCTAGCGAC TG . . 22 . (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido . (D) TOPOLOGIA: linear - (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: GCCGCGGAAC CATCAAGCAC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: CAACTTGACG CTATGTGAGC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear , (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5 GCGGTCTGGA TTGACGACAG. 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:. 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido ' ‘ (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6 GACTGCTAGG GCTTCTGCAC 20 . (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO :--7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) -TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear : ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7 GCCATTCAGC TCACATAGCG 2 0 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases -(B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear; . (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8 CTCGTCAAGT ATGGCCGGT 19 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9 GCCATTCGCC TGACTGTCA 19 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear . (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10 TTGACGAGGA CTTCGGCTG 19 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico), (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11 . GCTCTACCTG CAATTCTGTG 20 . (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico . ... (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12 20 GTGTATAGGA CCGGCAACCG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2062 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecido . (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc ' (vi) FONTE ORIGINAL:. (A) ORGANISMO: vírus do sindroma reprodutivo respiratório porcino, (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU- 12 (VR.2385/VR 2386) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: 60

GGCAGGCTTT GCTGTCCTCC AAGACATCAG TTGCCTTAGG CATCGCAACT CGGCCTCTGA GGCGATTCGC AAAGTCCCTC AGTGCCGCAC GGCGATAGGG ACACCCGTGT ATATCACTGT 120 CACAGCCAAT GTTACCGATG AGAATTATTT GCATTCCTCT GATCTTCTCA TGCTTTCTTC 180 TTGCCTTTTC TATGCTTCTG AGATGAGTGA AAAGGGATTT AAGGTGGTAT TTGGCAATGT 240 GTCAGGCATC GTGGCAGTGT GCGTCAACTT CACCAGTTAC GTCCAACATG TCAAGGAATT 300 TACCCAACGT TCCTTGGTAG TTGACCATGT GCGGCTGCTC CATTTCATGA CGCCCGAGAC 360 CATGAGGTGG GCAACTGTTT TAGCCTGTCT TTTTGGCATT CTGTTGGCAA TTTGAATGTT 420 TAAGTATGTT GGGGAAATGC TTGACCGCGG GCTGTTGCTC GCAATTGCTT TTTTTGTGGT 480 GTATCGTGCC GTCTTGTTTT GTTGCGCTCG TCAGCGCCAA CGGGAACAGC GGCTCAAATT 540 TACAGCTGAT TTACAACTTG ACGCTATGTG AGCTGAATGG CACAGATTGG CTAGCTAATA 600 AATTTGACTG GGCAGTGGAG TGTTTTGTCA TTTTTCCTGT GTTGACTCAC ATTGTCTCTT 660 ATGGTGCCCT CACTACTAGC CATTTCCTTG ACACAGTCGG TCTGGTCACT GTGTCTACCG 720 CTGGGTTTGT TCACGGGCGG TATGTTCTGA GTAGCATGTA CGCGGTCTGT GCCCTGGCTG 780 CGTTGATTTG CTTCGTCATT AGGCTTGCGA AGAATTGCAT GTCCTGGCGC TACTCATGTA 840 CCAGATATAC CAACT1TCTT CTGGACACTA AGGGCAGACT CTATCGTTGG CGGTCGCCTG 900 TCATCATAGA GAAAAGGGGC AAAGTTGAGG TCGAAGGTCA CCTGATCGAC CTCAAAAGAG 960 TTGTGCTTGA TGGTTCCGCG GCTACCCCTG TAACCAGAGT TTCAGCGGAA CAATGGAGTC 1020 GTCCTTAGAT GACTTCTGTC ATGATAGCAC GGCTCCACAA AAGGTGCTCT TGGCGTTTTC 1080 TATTACCTAC ACGCCAGTGA TGATATATGC CCTAAAGGTG AGTCGCGGCC GACTGCTAGG 1140 GCTTCTGCAC CTTTTGGTCT TCCTGAATTG TGCTTTCACC TTCGGGTACA tgacattcgt 1200 GCACTTTCAG AGTACAAATA AGGTCGCGCT CACTATGGGA GCAGTAGTTG CACTCCTTTG 1260 GGGGGTGTAC TCAGCCATAG AAACCTGGAA ATTCATCACC TCCAGATGCC GTTTGTGCTT 1320 GCTAGGCCGC AAGTACATTC TGGCCCCTGC CCACCACGTT GAAAGTGCCG CAGGCTTTCA 1380 TCCGATTGCG GCAAATGATA ACCACGCATT TGTCGTCCGG CGTCCCGGCT CCACTACGGT 1440 CAACGGCACA TTGGTGCCCG GGTTAAAAAG CCTCGTGTTG GGTGGCAGAA AAGCTGTTAA . 1500 ACAGGGAGTG GTAAACCTTG TTAAATATGC CAAATAACAC CGGCAAGCAG CAGAAGAGAA 1560 AGAAGGGGGA TGGCCAGCCA GTCAATCAGC TGTGCCAGAT GCTGGGTAAG ATCATCGCTC 1620 ACCAAAACCA GTCCAGAGGC AAGGGACCGG GAAAGAAAAA TAAGAAGAAA AACCCGGAGA 1680 AGCCCCATTT CCCTCTAGCG ACTGAAGATG ATGTCAGACA TCACTTTACC CCTAGTGAGC 1740 GTCAATTGTG TCTGXCGTCA ATCCAGACCG CCTTTAATCA AGGCGCTGGG ACTTGCACCC 1800 TGTCAGATXC AGGGAGGATA AGTTACACTG TGGAGTTTAG TTTGCCTACG CATCATACTG 1860 TGCGCCTGAT CCGCGTCACA GCATCACCCT CAGCATGATG GGCTGGCATT CTTGAGGCAT 1920. CCCAGTGTTT GAATTGGAAG AATGCGTGGT GAATGGCACT GATTGACATT GTGCCTCTAA 1980 GTCACCTATT CAATTAGGGC GACCGTGTGG GGGTAAGATT TAATTGGCGA GAACCACACG 2040 GCCGAAATTA AAAAAAAAAA AA 2062 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 603 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do síndroma reprodutivo respiratório porcino (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (VR 2385/VR 2386) (xi) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 600 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14: ATG TTG GGG AAA TGC TTG ACC GCG GGC TGT TGC TCG CAA TTG CTT TTT 46

Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gin Leu Leu Phe 1 5 10 15 TTG TGG TGT ATC GTG CCG TCT TGT TTT GTT GCG CTC GTC AGC GCC AAC 96

Leu Trp Cys Ile Vai Pro Ser Cys Phe Vai Ala Leu Vai Ser Ala Asn 20 25 30 GGG AAC AGC GGC TCA AAT TTA CAG CTG ATT TAC AAC TTG ACG CTA TGT 144

Gly Asn Ser Gly Ser Asn Leu Gin Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 35 40 45 GAG CTG AAT GGC ACA GAT TGG CTA GCT AAT AAA TTT GAC TGG GCA GTG 192

Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Vai 50 55 60 GAG TGT TTT GTC ATT TTT CCT GTG TTG ACT CAC ATT GTC TCT TAT GGT 240

Glu Cys Phe Vai Ile Phe Pro Vai Leu Thr His Ile Vai Ser Tyr Gly 65 70 75 80 GCC CTC ACT ACT AGC CAT TTC CTT GAC ACA GTC GGT CTG GTC ACT GTG 288

Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Vai Gly Leu Vai Thr Vai 85 90. 95 TCT ACC GCT GGG TTT GTT CAC GGG CGG TAT GTT CTG AGT AGC ATG TAC 33 6

Ser Thr Ala Gly Phe Vai His Gly Arg Tyr Vai Leu Ser Ser Met Tyr 100 105 110 GCG GTC TGT GCC CTG GCT GCG TTG ATT TGC TTC GTC ATT AGG CTT GCG 384

Ala Vai Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Vai Ile Arg Leu Ala 115 120 125 AAG AAT TGC ATG TCC TGG CGC TAC TCA TGT ACC AGA TAT ACC AAC TTT 432

Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140 CTT CTG GAC ACT AAG GGC AGA CTC TAT CGT TGG CGG TCG CCT GTC ATC 480

Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Vai Ile 145 150 155 160 ATA GAG AAA AGG GGC AAA GTT GAG GTC GAA GGT CAC CTG ATC GAC CTC 528

Ile Glu Lys Arg Gly Lys Vai Glu Vai Glu Gly His Leu Ile Asp Leu 165 170 175 AAA AGA GTT GTG CTT GAT GGT TCC GCG GCT ACC CCT GTA ACC AGA GTT 576

Lys Arg Vai Vai Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Vai Thr Arg Vai 180 185 190 TCA GCG GAA CAA TGG AGT CGT CCT TAG 603

Ser Ala Glu Gin Trp Ser Arg Pro 195 200 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 200 pares de bases (B) TIPO: aminoácido . (D) TOPOLOGIA: linear 165 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 154:

Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gin Leu Leu Phe 1 5 10 15

Leu Trp Cys Ile Vai Pro Ser Cys Phe Vai Ala Leu Vai Ser Ala Asn 20 25 30

Gly Asn Ser Gly Ser Asn Leu Gin Leu Ile Tyr Asn Le\i Thr Leu Cys 35 40 45

Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Vai 50 55 60

Glu Cys Phe Vai Ile Phe Pro Vai Leu Thr His Ile Vai Ser Tyr Gly 65 70 75 80

Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Vai Gly leu Vai Thr Vai 85 90 95

Ser Thr Ala Gly Phe Vai His Gly Arg Tyr Vai Leu Ser Ser Met Tyr 100 105 110

Ala Vai Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Vai Ile Arg Leu Ala 115 120 125

Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140

Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Vai Ile 145 150 155 160

Ile Glu Lys Arg Gly Lys Vai Glu Vai Glu Gly His Leu Ile Asp Leu 165 170 175

Lys Arg Vai Vai Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Vai Thr Arg Vai 180 185 190

Ser Ala Glu Gin Trp Ser Àrg Pro 195 200 (2) INFORMAÇÃO.PARA A SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 525 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecido 166 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 154:

Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gin Leu Leu Phe 1 5 . 10 15

Leu Trp Cys Ile Vai Pro Ser Cys Phe Vai Ala Leu Vai Ser Ala Asn 20 25 30

Gly Asn Ser Gly Ser Asn Leu Gin Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 35 40 45

Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Vai 50 55 60

Glu Cys Phe Vai Ile Phe Pro Vai Leu Thr His Ile Vai Ser Tyr Gly 65 70 75 80

Ala Leu Thr Thr ser His Phe Leu Asp Thr Vai Gly Leu Vai Thr Vai 85 90 95

Ser Thr Ala Gly Phe Vai His Gly Arg Tyr Vai Leu Ser Ser Met Tyr 100 105 110

Ala Vai Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Vai Ile Arg Leu Ala 115 120 125

Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140

Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Vai Ile 145 150 155 160

Ile Glu Lys Arg Gly Lys Vai Glu Vai Glu Gly His Leu Ile Asp Leu 165 170 175

Lys Arg Vai Vai Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Vai Thr Arg Vãl 180 185 190

Ser Ala Glu Gin Trp Ser Arg Pro 195 200 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 525 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecido 166 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNC (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do sindroma reprodutivo e respiratório porcino (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU- 12 (VR 2385/VR 2386) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: CDS , (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 522 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16: ATG GAG TCG TCC TTA GAT GAC TTC TGT CAT GAT AGC ACG GCT CCA CAA 48

Met Glu Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys His Asp Ser Thr Ala Pro Gin 1 5 10 15 AAG GTG CTC TTG GCG TTT TCT ATT ACC TAC ACG CCA GTG ATG ATA TAT 96

Lys Vai Leu Leu Alá Phe Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Vai Met Xle Tyr 20 25 30 GCC CTA AAG GTG AGT CGC GGC CGA CTG CTA GGG CTT CTG CAC CTT TTG 144

Ala Leu Lys Vai ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu Leu 35 40 45 GTC TTC CTG AAT TGT GCT TTC ACC TTC GGG TAC ATG ACA TTC GTG CAC 192

Vai Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Phe Vai His 50 55 60 TTT CAG AGT ACA AAT AAG GTC GCG CTC ACT ATG GGA GCA GTA GTT GCA 240

Phe Gin Ser Thr Asn Lys Vai Ala Leu Thr Met Gly Ala Vai Vai Ala 65 70 75 80 CTC CTT TGG GGG GTG TAC TCA GCC ATA GAA ACC TGG AAA TTC ATC ACC 288

Leu Leu Trp Gly Vai Tyr Ser Ala Ile Glu Thr Trp Lys Phe Ile Thr 85 90 95 TCC AGA TGC CGT TTG TGC TTG CTA GGC CGC AAG TAC ATT CTG GCC CCT 336

Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys Tyr Ile Leu Ala Pro 100 105 110 GCC CAC CAC GTT GAA AGT GCC GCA GGC TTT CAT CCG ATT GCG GCA AAT 384

Ala His His Vai Glu Ser Ala Ala Gly Phe His Pro Ile Ala Ala Asn 115 120 125 GAT AAC CAC GCA TTT GTC GTC CGG CGT CCC GGC TCC ACT ACG GTC AAC 432

Asp Asn His Ala Phe Vai Vai Arg Arg Pro Gly Ser Thr Thr Vai Asn 130 135 140 GGC ACA TTG GTG CCC GGG TTA AAA AGC CTC GTG TTG GGT GGC AGA AAA 480

Gly Thr Leu vai Pro Gly Leu Lys Ser Leu Vai Leu Gly Gly Arg Lys 167 145 150 155 160 GCT GTT AAA CAG GGA GTG GTA AAC CTT GTT AAA TAT GCC AAA 522

Ala Vai Lys Gin Gly Vai Vai Asn Leu Vai Lys Tyr Ala Lys 165 170 TAA 525 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) (B) (D) COMPRIMENTO: 174 aminoácidos TIPO: aminoácido TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17:

Met Glu Ser Ser Leu Asp Asp Phe 1 5

Lys Vai Leu Leu Ala Phe Ser Ile 20

Ala Leu Lys Vai Set Arg Gly Arg 35 40

Vai Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr 50 55

Phe Gin Ser Thr Asn Lys Vai Ala 65 70

Leu Leu Trp Gly Vai Tyr Ser Ala 85

Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu 100

Ala His His Vai Glu Ser Ala Ala 115 120

Asp Asn His Ala Phe Vai Vai Arg 130 135

Gly Thr Leu Vai Pro Gly Leu Lys 145 150

Ala Vai Lys Gin Gly Vai Vai Asn 165

Cys His Asp Ser Thr Ala Pro Gin 10 15

Thr Tyr Thr Pro Vai Met Ile Tyr 25 30

Leu Leu Gly Leu Leu His Leu Leu 45

Phe Gly Tyr Met Thr Phe Vai His 60

Leu Thr Met Gly Alá Vai Vai Ala 75 80

Ile Glu Thr Trp Lys Phe Ile Thr 90 95

Gly Arg Lys Tyr Ile Leu Ala Pro 105 110

Gly Phe His Pro Ile Ala Ala Asn \ 125

Arg Pro Gly Ser Thr Thr Vai Asn . 140

Ser Leu Vai Leu Gly Gly Arg Lys 155 160

Leu Vai Lys Tyr Ala Lys : i7o 168 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 372 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido . (D) TOPOLOGIA: desconhecido (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNC (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (B) ESTIRPE: lowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU- 12 (VR 2385/VR 2386) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 369 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18: 169 ATG CCA AAT AAC ACC GGC AAG CAG CAG AAG AGA AAG AAG GGG GAT GGC 46 Met Pro Asn Asn Thr Gly Lys Gin Gin Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly X 5 10 15 CAG CCA GTC AAT CAG CTG TGC CAG ATG CTG GGT AAG ATC ATC GCT CAC 96 Gin Pro Vai Asn Gin Leu Cys Gin Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala His 20 25 30 CAA AAC CAG TCC AGA GGC AAG GGA CCG GGA AAG ΆΑΑ AAT AAG AAG AAA 144 Gin Asn Gin Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 AAC CCG GAG AAG CCC CAT TTC CCT CTA GCG ACT GAA GAT GAT GTC AGA 192 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Vai Arg 50 55 60 CAT CAC TTT ACC CCT AGT GAG CGT CAA TTG TGT CTG TCG TCA ATC CAG 240 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gin Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gin 65 70 75 80 ACC GCC TTT AAT CAA GGC GCT GGG ACT TGC ACC CTG TCA GAT TCA GGG 288 Thr Ala Phe Asn Gin Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 AGG ATA AGT TAC ACT GTG GAG TTT AGT TTG CCT ACG CAT CAT ACT GTG 336 Arg Ile Ser Tyr Thr Vai Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Vai 100 105 110 CGC CTG ATC CGC GTC ACA GCA TCA CCC TCA GCA TGA 372 Arg Leu Ile Arg Vai Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 123 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 19:

Met 1 Pro Asn Asn Thr 5 Gly Lys Gin Gin Lys 10 Arg Lys Lys Gly Asp Gly . 15 Gin Pro Vai Asn 20 Gin Leu Cys Gin Met 25 Leu Gly Lys Ile Ile 30 Ala His Gin Asn Gin 35 Ser Arg Gly Lys Gly 40 Pro Gly Lys Lys Asn 45 Lys Lys Lys Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Vai Arg 170 50 55 60

His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gin Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gin 65 70 75 80

Thr Ala Phe Asn Gin Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95

Arg Xle Ser Tyr Thr Vai Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Vai 100 105 110

Arg Leu Ile Arg Vai Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 20: (i) GARACTERÍSTICÃS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 606 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecido (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do sindroma reprodutivo e respiratório porcino (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Lelystad (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 603 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 20: 171 48

ATG AGA TGT TCT CAC AAA TTG GGG CGT TTC TTG ACT CCG CAC TCT TGC

Met Arg cys Ser His Lys Leu Gly Arg Phe Leu Thr Pro His Ser Cys 15 10 15 TTC TGG TGG CTT TTT TTG CTG TGT ACC GGC TTG TCC TGG TCC TTT GCC 96

Phe Trp Trp Leu Phe Leu Leu Cys Thr Gly Leu Ser Trp Ser Phe Ala 20 25 30 GAT GGC AAC GGC GAC AGC TCG A CA TAC CAA TAC ATA TAT AAC TTG ACG 144

Asp Gly Asn Gly Asp Ser Ser Thr Tyr Gin Tyr Ile Tyr Asn Leu Thr 35 40 45 ATA TGC GAG CTG AAT GGG ACC GAC TGG TTG TCC AGC CAT TTT GGT TGG 192

Ile Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ser Ser His Phe Gly Trp 50 55 60 GCA GTC GAG ACC TTT GTG CTT TAC CCG GTT GCC ACT CAT ATC CTC TCA 240

Ala Vai Glu Thr Phe Vai Leu Tyr Pro Vai Ala Thr His Ile Leu Ser 65 70 75 80 CTG GGT TTT CTC ACA ACA AGC CAT TTT TTT GAC GCG CTC GGT CTC GGC 288

Leu Gly Phe Leu Thr Thr Ser His Phe Phe Asp Ala Leu Gly Leu Gly

85 90 9S GCT GTA TCC ACT GCA GGA TTT GTT GGC GGG CGG TAC GTA CTC TGC AGC 336

Ala Vai Ser Thr Ala Gly Phe Vai Gly Gly Arg Tyr Vai Leu Cys Ser 100 105 110 GTC TAC GGC GCT TGT GCT TTC GCA GCG TTC GTA TGT TTT GTC ATC CGT 304

Vai Tyr Gly Ala Cys Ala Phe Ala Ala Phe Vai Cys Phe Vai Ile Arg 115 120 125 GCT GCT AAA AAT TGC ATG GCC TGC CGC TAT GCC CGT ACC CGG TTT ACC 432

Ala Ala Lys Asn Cys Met Ala Cys Arg Tyr Ala Arg Thr Arg Phe Thr 130 135 140 AAC TTC ATT GTG GAC GAC CGG GGG AGA GTT CAT CGA TGG AAG TCT CCA 480

Asn Phe Ile Vai Asp Asp Arg Gly Arg Vai His Arg Trp Lys Ser Pro 145 150 155 160 ATA GTG GTA GAA AAA TTG GGC AAA GCC GAA GTC GAT GGC AAC CTC GTC 52 8

Ile Vai Vai -Glu Lys Leu Gly Lys Ala Glu Vai Asp Gly Asn Leu Vai 165 170 175 ACC ATC AAA CAT GTC GTC CTC GAA GGG GTT AAA GCT CAA CCC TTG ACG 57e

Thr Ile Lys His Vai Vai Leu Glu Gly Vai Lys Ala Gin Pro Leu Thr 180 185 190 AGG ACT TCG GCT GAG CAA TGG GAG GCC TAG 606

Arg Thr Ser Ala Glu Gin Trp Glu Ala 195 200 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 201 aminoácidos (B) TIPO: aminoãcido (D) TOPOLOGIA: linear 172 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 21: Met 1 Arg Cys Ser His 5 Lys Leu Gly Arg Phe 10 Leu Thr Pro His Ser 15 Cys Phe Trp Trp Leu 20 Phe Leu Leu Cys Thr Gly 25 Leu Ser Trp ser 30 Phe Ala Asp Gly Asn 35 Gly Asp Ser Ser Thr Tyr Gin 40 Tyr Ile Tyr 45 Asn Leu Thr Ile Cys Glu 50 Leu Asn Gly Thr 55 Asp Trp Leu Ser Ser 60 His Phe Gly Trp Ala 65 Val Glu Thr Phe Val 70 Leu Tyr Pro Val Ala 75 Thr His Ile Leu Ser éo Leu Gly Phe Leu Thr 85 Thr Ser His Phe Phe 90 Asp Ala Leu Gly Leu 95 Gly Ala Val Ser Thr 100 Ala Gly Phe Val Gly Gly 105 Arg Tyr Val Leu 110 Cys Ser val Tyr Gly 115 Ala Cys Ala Phe Ala Ala Phe 120 Val Cys Phe 125 Val Ile Arg Ala Ala Lys 130 Asn Cys Met Ala 135 Cys Arg Tyr Ala Arg 140 Thr Arg Phe Thr Asn 145 Phe Ile Val Asp Asp 150 Arg Gly Arg Val His 155 Arg Trp Lys Ser Pro 160

Ile Vai Vai Glu Lys Leu Gly Lys Ala Glu Vai Asp Gly Asn Leu Vai 165 170 175

Thr Ile Lys His Vai Vai Leu Glu Gly Vai Lys Ala Gin Pro Leu Thr 180 185 190

Arg Thr Ser Ala Glu Gin Trp Glu Ala 195 200 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 164 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecido (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 173 (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do sindroma reprodutivo e respiratório porcino (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU- 12 (VR 2385/VR 2386) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 22: TGGGCTGGCA TTCTTGAGGC ATCCCAGTGT TTGAATTGGA AGAATGCGTG GTGAATGGCA 60 CTGATTGACA TTGTGCCTCT AAGTCACCTA TTCAATTAGG GCGACCGTGT GGGGGTAAGA 120 TTTAATTGGC GAGAACCACA CGGCCGAAAT TAAAAAAAAA AAAA 164 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 522 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecido (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do sindroma reprodutivo e respiratório porcino (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Lelystad (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 519 174 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 23: ATG GGA GGC CTA GAC GAT TTT TGC AAC GAT CCT ATC GCC GCA CAA AAG 48 Met 1 Gly Gly Leu Asp 5 Asp Phe Cys Asn Asp 10 Pro Ile Ala Ala Gin 15 Lys CTC GTG CTA GCC TTT AGC ATC ACA TAC ACA CCT ATA ATG ATA TAC GCC 96 Leu Vai Leu Ala 20 Phe Ser Ile Thr Tyr 25 Thr Pro Ile Met Ile 30 Tyr Ala CTT AAG GTG TCA CGC GGC CGA CTC CTG GGG CTG TTG CAC ATC CTA ATA 144 Leu Lys Vai 35 Ser Arg Gly Arg Leu 40 Leu Gly Leu Leu His 45 Ile Leu Ile TTT CTG AAC TGT TCC TTT ACA TTC GGA TAC ATG ACA TAT GTG CAT TTT 192 Phe Leu Asn 50 Cys Ser Phe Thr 55 Phe Gly Tyr Met Thr Tyr 60 Vai His Phe CAA TCC ACC AAC CGT GTC GCA CTT ACC CTG GGG GCT GTT GTC GCC CTT 240 Gin 65 Ser Thr Asn Arg Vai 70 Ala Leu Thr Leu Gly Ala 75 Vai Vai Ala Leu 80 ctg' TGG GGT GTT TAC AGC TTC ACA GAG TCA TGG AAG TTT ATC ACT TCC 288 Leu Trp Gly Vai Tyr 85 Ser Phe Thr Glu Ser Trp Lys 90 Phe Ile Thr 95 Ser AGA TGC AGA TTG TGT TGC CTT GGC CGG CGA TAC ATT CTG GCC CCT GCC 336 Arg Cys Arg Leu Cys 100 Cys Leu Gly Arg 105 Arg Tyr Ile Leu Ala 110 Pro Ala CAT CAC GTA GAA AGT GCT GCA GGT CTC CAT TCA ATC TCA GCG TCT GGT 384 His His Vai 115 Glu Ser Ala Ala Gly Leu 120 His Ser Ile Ser 125 Ala Ser Gly AAC CGA GCA TAC GCT GTG AGA AAG ccc GGA CTA ACA TCA GTG AAC GGC· 432 Asn Arg Ala 13 0 Tyr Ala Vai Arg 135 Lys Pro Gly Leu Thr 140 Ser Vai Asn Gly ACT CTA GTA CCA GGA CTT CGG AGC CTC GTG CTG GGC GGC AAA CGA GCT 480 Thr 145 Leu Vai Pro Gly Leu Arg 150 Ser Leu Vai Leu Gly Gly Lys Arg Ala 155 160 GTT Vai AAA CGA Lys Arg GGA GTG GTT Gly Vai Vai AAC Asn CTC Leu GTC Vai AAG TAT GGC CGG Lys Tyr Gly Arg TAA 522 165 170 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 173 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 24: 175

Met 1 Gly Gly Leu Asp 5 Asp Phe Cys Asn Asp 10 Pro Ile Ala Ala Gin 15 Lys Leu Vai Leu Ala 20 Phe Ser Ile Thr Tyr 25 Thr Pro Ile Met Ile 30 Tyr Ala Leu Lys Vai 35 Ser Arg Gly Arg Leu 40 Leu Gly Leu Leu His 45 Ile Leu Ile Phe Leu 50 Asn Cys Ser Phe Thr 55 Phe Gly Tyr Met Thr 60 Tyr Vai His Phe Gin 65 Ser Thr Asn Arg Vai 70 Ala Leu Thr Leu Gly Ala 75 Vai Vai Ala Leu 80 Leu Trp Gly Vai Tyr 85 Ser Phe Thr Glu Ser 90 Trp Lys Phe Ile Thr 95 Ser

Arg Cys Arg Leu 100 Cys Cys Leu Gly Arg 105 Arg Tyr Ile Leu Ala 110 Pro Ala His His Vai 115 Glu Ser Ala Ala Gly 120 Leu His Ser Ile Ser 125 Ala Ser Gly Asn Arg Ala 130 Tyr Ala Vai Arg 135 Lys Pro Gly Leu Thr Ser 140 Vai Asn Gly Thr 145 Leu Vai Pro Gly Leu 150 Arg Ser Leu Vai Leu Gly Gly Lys Arg Ala 155 160 Vai Lys Arg Gly Vai 165 Vai Asn Leu Vai Lys Tyr Gly Arg 170 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 25: (i) . CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 387 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecido (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Lelystad 176 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 384 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 25: ATG GCC GGT AAA AAC CAG AGC CAG AAG AAA AAG AAA AGT ACA GCT CCG Met 1 Ala Gly Lys Asn 5 Gin Ser Gin Lys Lys 10 Lys Lys Ser Thr Ala 15 Pro ATG GGG AAT GGC CAG CCA GTC AAT CAA CTG TGC CAG TTG CTG GGT GCA Met Gly Asn Gly 20 Gin Pro Vai Asn Gin 25 Leu Cys Gin Leu Leu 30 Gly Ala ATG ATA AAG TCC CAG CGC CAG CAA CCT AGG GGA GGA CAG GCC AAA AAG Met Ile Lys 35 Ser Gin Arg Gin Gin 40 Pro Arg Gly Gly Gin 45 Ala Lys Lys AAA AAG CCT GAG AAG CCA CAT TTT CCC CTG GCT GCT GAA GAT GAC ATC Lys Lys 50 Pro Glu Lys Pro His 55 Phe Pro Leu Ala Ala 60 Glu Asp Asp Ile CGG CAC CAC CTC ACC CAG ACT GAA CGC TCC CTC TGC TTG CAA TCG ATC Arg 65 His His Leu Thr Gin 70 Thr Glu Arg Ser Leu 75 Cys Leu Gin Ser Ile 80 CAG ACG GCT TTC AAT CAA GGC GCA GGA ACT GCG TCG CTT TCA TCC AGC Gin Thr Ala Phe Asn 85 Gin Gly Ala Gly Thr 90 Ala Ser Leu Ser Ser 95 Ser GGG AAG GTC AGT TTT CAG GTT GAG TTT ATG CTG CCG GTT GCT CAT ACA Gly Lys Vai Ser 100 Phe Gin Vai Glu Phe 105 Met Leu Pro Vai Ala 110 His Thr GTG CGC CTG ATT CGC GTG ACT TCT ACA TCC GCC AGT CAG GGT GCA AGT Vai Arg Leu Ile Arg Vai Thr Ser Thr Ser Ala Ser Gin Gly Ala Ser 115 120 125

TAA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 128 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 26: 48 96 144 192 24 0 288 336 384 387 177

Met 1 Ala Gly Lys Asn 5 Gin Ser Gin Lys Lys 10 Lys Lys Ser Thr Ala 15 Pro Met Gly Asn Gly 20 Gin Pro Vai Asn Gin 25 Leu Cys Gin Leu Leu 30 Gly Ala Met Ile Lys 35 Ser Gin Arg Gin Gin 40 Pro Arg Gly Gly Gin 45 Ala Lys Lys Lys Lys 50 Pro Glu Lys Pro His 55 Phe Pro Leu Ala Ala 60 Glu Asp Asp Ile Arg 65 His His Leu Thr Gin 70 Thr Glu Arg Ser Leu Cys 75 Leu Gin Ser Ile 80 Gin Thr Ala Phe Asn 85 Gin Gly Ala Gly Thr 90 Ala Ser Leu Ser Ser 95 Ser Gly Lys Vai Ser 100 Phe Gin Vai Glu Phe 105 Met Leu Pro Vai Ala 110 His Thr Vai Arg Leu 115 Ile Arg Vai Thr Ser 120 Thr Ser Ala Ser Gin Gly Ala 125 Ser (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 127 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecido (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Lelystad (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 27: TTTGACAGTC 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ID NO: 30 GGGGATCCAG AGTTTCAGCG G 21 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 31 CAGTTAGTCG ACACGGTCTT AAGGG 25 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 32 GGGGATCCTT GTTAAATATG CC 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 33: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 33 CTTACGCACC ACTTAAGGG 19 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 34: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 34 AATGGGGCTT CTCCGG 16 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 35: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 886 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecido FONTE ORIGINAL: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) (A) ORGANISMO: vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (VR 2385/VR 2386) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 35: ATGGAGTCGT CCTTAGATGA CTTCTGTCAT GATAGCACGG CTCCACAAAA GGTGCTCTTG 60 GCGTTTTCTA TTACCTACAC GCCAGTGATG ATATATGCCC TAAAGGTGAG TCGCGGCCGA 120 CTGCTAGGGC TTCTGCACCT TTTGGTCTTC CTGAATTGTG CTTTCACCTT CGGGTACATG 180 ACATTC5TGC ACTTTCAGAG TACAAATAAG GTCGCGCTCA CTATGGGAGC AGTAGTTGCA 240 CTCCTTTGGG GGGTGTACTC AGCCATAGAA ACCTGGAAAT TCATCACCTC CAGATGCCGT 300 TTGTGCTTGC 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Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU- 1894 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 36: ATGGGGTCGT CCTTAGATGA CTTCTGCCAT GATAGTACGG CTCCACAAAA GGTGCTTTTG 60 GCGTTTTCTA TTACCTACAC GCCAGTGATG ATATATGCCC TAAAGGTGAG TCGCGGCCGA 120 CTGCTAGGGC TTCTGCACCT TTTGATCTTC CTGAATTGTG CTTTCACCTT CGGGTACATG 180 ACATTCGTGC ACTTTCAGAG TACAAATAAG GTCGCGCTCft CTATGGGAGC AGTAGTTGCA 240 CTCCTTTGGG GGGTGTACTC AGCCATAGAA ACCTGGAAAT TCATCACCTC CAGATGCCGT 300 TTGTGCTTGC TAGGCCGCAA GTACATTCTG GCCCCTGCCC ACCACGTTGA AAGTGCCGCA 360 GGCTTTCATC CGATTGCGGC AAATGATAAC CACGCATTTG TCGTCCGGCG TCCCGGCTCC 420 ACTACGGTCA ACGGCACATT GGTGCCCGGG TTGAAAAGCC TCGTGTTGGG TGGCAGAAAA 480 GCTGTTAAAC AGGGAGTGGT AAACCTTGTC AAATATGCCA AATAACAACG GCAAGCAGCA 540 GAAGAGAAAG AAGGGGGATG GCCAGCCAGT CAATCAGCTG TGCCAGATGC TGGGTAAGAT 600 CATCGCTCAG CAAAACCAGT CCAGAGGCAA GGGACCGGGA AAGAAAAACA AGAAGAAAAA 660 CCCGGAGAAG CCCCATTTTC CTCTAGCGAC TGAAGATGAT GTCAGACATC ACTTCACCCC 720 TAGTGAGCGG CAATTGTGTC TGTCGTCAAT CCAGACCGCC TTTAATCAAG GCGCTGGGAC 780 TTGCACCCTG TCAGATTCAG GGAGGATAAG TTACACTGTG GAGTTTAGTT TGCCAACGCA 840 TCATACTGTG CGCTTGATCC GCGTCACAGC ATCACCCTCA GCATGA 886 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N0: 37: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 886 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecido (iii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino 183 (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU- 22 (VR 2429) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 37: ATGGGGTCGT CCTTAGATGA CTTCTGTCAT GACAGCACGG CTCCACAAAA GGTGCTTTTG 60 GCGTTTTCTA TTACCTACAC GCCAGTGATG ATATATGCCC TGAAGGTGAG TCGGGGCCGA 120 CTGCTAGGGC TTCTGCACCT TTTGATCTTC CTGAATTGTG CTTTCACCTT CGGGTAGATG 180 ACATTCGTGC ACTTTCAGAG TACAAATAAG GTCGCACTCA CTATGGGAGC AGTAGTTGCA 240 CTCCTTTGGG GGGTGTACTC AGCCATAGAA ACCTGGAAAT TCATCACCTC CAGATGCCGT 300 TTGTGCTTGC TAGGCCGCAA GTACATTCTG GCCCCTGCCC ACCACGTTGA AAGTGCCGCA 360 GGCTTTCATC CGATTGCGGC AAATGATAAC 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GCTGTCAAAC AGGGAGTGGT AAACCTTGTT AAATATGCCA AATAACAACG GCAAGCAGCA 540 GAAGAAAAAG AAGGGGGATG GCCAGCCAGT CAATCAGCTG TGCCAGATGC TGGGTAAGAT 600 CATCGCTCAG CAAAACCAGT CCAGAGGCAA GGGACCGGGA AAGAAAAACA AGAAGAAAAA 660 CCCGGAGAAG CCCCATTTTC CTCTAGCGAC TGAAGATGAT GTCAGACATC ACTTCACCTC 720 TGGTGAGCGG CAATTGTGTC TGTCGTCAAT CCAGACAGCC TTTAATCAAG GCGCTGGAAC 780 TTGTACCCTG TCAGATTCAG GGAGGATAAG TTACACTGTG GAGTTTAGTT TGCCGACGCA 840 TCATACTGTG CGCTTGATCC GCGTCACAGC GTCACCCTCA GCATGA 886 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 40: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 886 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico . (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecido (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino 186 (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU- 3927 (VR 2431) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 40: ATGGGGTCGT CCCTAGACGA CTTTTGCAAT GATAGCACGG CTCCACAAAA GGTGCTTTTG 60 GCGTTTTCTA TTACCTACAC GCCGGTGATG ATATATGCTC TAAAGGTAAG TCGCGGCCGA 120 CTGCTAGGGC TTCTGCACCT TTTGATTTTT CTGAATTGTG CTTTTACTTT CGGGTACATG 180 ACATTCGTGC ACTTTGAGAG CACAAATAGG GTCGCGCTCA CTATGGGAGC AGTAGTCGCA 240 CTTCTCTGGG GGGTGTACTC AGCCATAGAA ACCTGGAAAT TCATCACCTC CAGATGCCGT 300 TTGTGCTTGC TAGGCCGCAA GTACATTCTG GCCCCTGCCC ACCACGTTGA GAGTGCCGCA 360 GGCTTTCATC CGATTGCGGC AAATGATAAC CACGCATTTG TCGTCCGGCG TCCCGGCTCC 420 ACTACGGTTA ACGGCACATT GGTGCCCGGG TTGAGAAGCC TCGTGTTGGG TGGCAAAAAA 480 GCTGTTAAGC AGGGAGTGGT AAACCTTGTT AAATATGCCA AATAACAACG GCAAGCAGCA 540 GAAGAAAAAG AAGGGGGATG GCCAGCCAGT CAATCAGCTC TGCCAAATGC TGGGTAAGAT 600 CATCGCCCAG CAAAACCAGT CCAGAGGTAA GGGACCGGGA AAGAAAAATA AGAAGAAAAA 660 CCCGGAGAAG CCCCATTTTC CTCTAGCGAC TGAAGATGAT GTCAGACATC ACTTCACCCC 720 CAGTGAGCGG CAATTGTGTC TGTCGTCAAT CCAGACTGCC TTTAATCAGG GCGCTGGGAC 780 CTGTATCCTA TCAGATTCAG GGAGGATAAG TTACACTGTG GAGTTTAGTT TGCCGACGCA 840 TCATACTGTG CGCCTGATTC GCGTCACGGC ACCACCCTCA GCATGA 886 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N0: 41: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 898 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecido (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino 187 (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Lelystad (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 41: ATGGGAGGCC TAGACGATTT TTGCAACGAT CCTATCGCCG CACAAAAGCT CGTGCTAGCC 60 TTTAGCATCA CATACACACC TATAATGATA TACGCCCTTA AGGTGTCACG CGGCCGACTC 120 CTGGGGCTGT TGCACATCCT AATATTTCTG AACTGTTCCT TTACATTCGG ATACATGACA 180 TATGTGCATT TTCAATCCAC CAACCGTGTC GCACTTACCC TGGGGGCTGT TGTCGCCCTT 240 CTGTGGGGTG TTTACAGCTT CACAGAGTCA TGGAAGTTTA TCACTTCCAG ATGCAGATTG 300 TGTTGCCTTG GCCGGCGATA CATTCTGGCC CCTGCCCATC ACGTAGAAAG TGCTGCAGGT 360 CTCCATTCAA TCTCAGCGTC TGGTAACCGA GCATACGCTG TGAGAAAGCC CGGACTAACA 420 TCAGTGAACG GCACTCTAGT ACCAGGACTT CGGAGCCTCG TGCTGGGCGG CAAACGAGCT 480 GTTAAACGAG GAGTGGTTAA CCTCGTCAAG TATGGCCGGT AAAAACCAGA GCCAGAAGAA 540 AAAGAAAAGT ACAGCTCCGA TGGGGAATGG CCAGCCAGTC AATCAACTGT GCCAGTTGCT 600 GGGTGCAATG ATAAAGTCCC AGCGCCAGCA ACCTAGGGGA GGACAGGCCA AAAAGAAAAA 660 GCCTGAGAAG CCACATTTTC CCCTGGCTGC TGAAGATGAC ATCCGGCACC ACCTCACCCA 720 GACTGAACGC TCCCTCTGCT TGCAATCGAT CCAGACGGCT TTCAATCAAG GCGCAGGAAC 780 TGCGTCGCTT TCATCCAGCG GGAAGGTCAG TTTTCAGGTT GAGTTTATGC TGCCGGTTGC 840 TCATACAGTG CGCCTGATTC GCGTGACTTC TACATCCGCC AGTCAGGGTG CAAGTTAA 898 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 42: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 525 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do sindroma reprodutivo e respiratório porcino (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU-1894 188 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 522 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 42: ATG GGG TCG TCC TTA GAT GAC TTC TGC CAT GAT AGT ACG GCT CCA CAA Met 1 Gly Ser Ser Leu 5 Asp Asp Phe Cys His Asp 10 Ser Thr Ala Pro Gin 15 AAG GTG CTT TTG GCG TTT TCT ATT ACC TAC ACG CCA GTG ATG ATA TAT Lys Vai Leu Leu 20 Ala Phe Ser Ile Thr 25 Tyr Thr Pro Vai Met Ile Tyr 30 GCC CTA AAG GTG AGT CGC GGC CGA CTG CTA GGG CTT CTG CAC CTT TTG Ala Leu Lys 35 Vai Ser Arg Gly Arg Leu 40 Leu Gly Leu Leu 45 His Leu Leu ATC TTC CTG AAT TGT GCT TTC ACC TTC GGG TAC ATG ACA TTC GTG CAC Ile Phe 50 Leu Asn Cys Ala Phe 55 Thr Phe Gly Tyr Met 60 Thr Phe Vai His TTT CAG AGT ACA AAT AAG GTC GCG CTC ACT ATG GGA GCA GTA GTT GCA Phe 65 Gin Ser Thr Asn Lys 70 Vai Ala Leu Thr Met 75 Gly Ala Vai Vai Ala 80 CTC CTT TGG GGG GTG TAC TCA GCC ATA GAA ACC TGG AAA TTC ATC ACC Leu Leu Trp Gly Vai 85 Tyr Ser Ala Ile Glu Thr 90 Trp Lys Phe Ile Thr 95 TCC AGA TGC CGT TTG TGC TTG CTA GGC CGC AAG TAC ATT CTG GCC CCT Ser Arg Cys Arg 100 Leu Cys Leu Leu Gly 105 Arg Lys Tyr Ile Leu Ala Pro 110 GCC CAC CAC GTT GAA AGT GCC GCA GGC TTT CAT CCG ATT GCG GCA AAT Ala His His 115 Vai Glu Ser Ala Ala Gly 120 Phe His Pro Ile 125 Ala Ala Asn GAT AAC CAC GCA TTT GTC GTC CGG CGT CCC GGC TCC ACT ACG GTC AAC Asp Asn 130 Kis Ala Phe Vai Vai 135 Arg Arg Pro Gly Ser 140 Thr Thr Vai Asn GGC ACA TTG GTG CCC GGG TTG AAA AGC CTC GTG TTG GGT GGC AGA AAA Gly Thr 145 Leu Vai Pro Gly 150 Leu Lys Ser Leu Vai 155 Leu Gly Gly Arg Lys 160

GCT GTT AAA CAG GGA GTG GTA AAC CTT GTC AAA TAT GCC AAA Ala Vai Lys Gin Gly Vai Vai Asn Leu Vai Lys Tyr Ala Lys 165 170 TAA 48 96 144 192 240 288 336 384 432 480 522 525 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:. 43: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 174 aminoácidos 189 (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 43:

Met 1 Gly Ser Ser Leu Asp Asp Phe 5 Cys His 10 Asp Ser Thr Ala Pro 15 Gin Lys Vai Leu Leu 20 Ala Phe Ser Ile Thr Tyr 25 Thr Pro Val Met 30 Ile Tyr Ala Leu Lys 35 Vai Ser Arg Gly Arg 40 Leu Leu Gly Leu Leu 45 His Leu Leu Ile Phe 50 Leu Asn Cys Ala Phe Thr 55 Phe Gly Tyr Met Thr 60 Phe Val His Phe 65 Gin Ser Thr Asn Lys Val Ala 70 Leu Thr Met Gly Ala 75 Val Val Ala 80 Leu Leu Trp Gly Val 85 Tyr Ser Ala Ile Glu 90 Thr Trp Lys Phe Ile 95 Thr Ser Arg Cys Arg 100 Leu Cys Leu Leu Gly Arg 105 Lys Tyr ile Leu 110 Ala Pro Ala His His 115 Val Glu Ser Ala Ala Gly 120 Phe His Pro Ile 125 Ala Ala Asn Asp Asn 130 His Ala Phe Val Val Arg Arg 135 Pro Gly Ser Thr 140 Thr Val Asn Gly Thr 145 Leu Val Pro Gly Leu Lys 150 Ser Leu Val Leu Gly Gly Arg Lys 155 160 Ala Vai Lys Gin Gly Val Val Asn Leu Val Lys Tyr Ala Lys 165 170 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 44: (i) CARAÇTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 525 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU-22 (VR 2429) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 522 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 44: ATG GGG TCG TCC TTA GAT GAC TTC TGT CAT GAC AGC ACG GCT CCA CAA 48 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys His Asp Ser Thr Ala Pro Gin 1 5 10 15 AAG GTG CTT TTG GCG TTT TCT ATT ACC TAC ACG CCA GTG ATG ATA TAT 96 Lys Vai Leu Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Vai Met Ile Tyr 20 25 30 GCC CTG AAG GTG AGT CGC GGC CGA CTG CTA GGG CTT CTG CAC CTT TTG 144 Ala Leu Lys Vai Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu Leu 35 40 45 AT C TTC CTG AAT TGT GCT TTC ACC TTC GGG TAC ATG ACA TTC GTG CAC 192 Ile Phe Leu Asn. Cys Ala Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Phe Vai His 50 55 60 TTT CAG AGT ACA AAT AAG GTC GCA CTC ACT ATG GGA GCA GTA GTT GCA 240 Phe Gin Ser Thr Asn Lys Vai Ala Leu Thr Met Gly Ala Vai Vai Ala 65 70 75 80 CTC CTT TGG GGG GTG TAC TCA GCC ATA GAA ACC TGG AAA TTC ATC ACC 288 Leu Leu Trp Gly Vai Tyr Ser Ala Ile Glu Thr Trp Lys Phe Ile Thr 85 90 95 TCC AGA TGC CGT TTG TGC TTG CTA GGC CGC AAG TAC ATT CTG GCC CCT 336 Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys Tyr Ile Leu Ala Pro 100 105 110 GCC CAC CAC GTT GAA AGT GCC GCA GGC TTT CAT CCG ATT GCG GCA AAT 384 Ala His His Vai Glu Ser Ala Ala Gly Phe His Pro lie Ala Ala Asn 115 120 125 GAT AAC CAC GCA TTT GTC GTT CGG CGT CCC GGC TCC ACT ACG GTC AAC 432 Asp Aan His Ala Phe Vai Vai Arg Arg Pro Gly Ser Thr Thr Vai Asn 130 135 140 GGC ACA TTG GTG CCC GGG TTG AAA AGC CTC GTG TTG GGT GGC AGA AAA 480 Gly Thr Leu Vai Pro Gly Leu Lys Ser Leu Vai Leu Gly Gly Arg Lys 145 150 155 160 GCT GTT AAA CAG GGA GTG GTA AAC CTT GTC AAA TAT GCC AAA 522 Ala Vai Lys Gin Gly Vai Vai Asn Leu Vai Lys Tyr Ala Lys 165 170 TAA S25 191 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 45: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 174 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 45:

Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys His Asp Ser Thr Ala Pro Gin 1 5 10 15

Lys Vai Leu Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Vai Met Ile Tyr 20 25 30

Ala Leu Lys Vai Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu Leu 35 40 45

Ile Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Phe Vai His 50 55 60

Phe Gin Ser Thr Asn Lys Vai Ala Leu Thr Met Gly Ala Vai Vai Ala 65 70 75 80

Leu Leu Trp Gly Vai Tyr Ser Ala Ile Glu Thr Trp Lys Phe Ile Thr 85 90 95

Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys Tyr Ile Leu Ala Pro 100 105 110

Ala His His Vai Glu Ser Ala Ala Gly Phe His Pro Ile Ala Ala Asn 115 120 125

Asp Asn His Ala Phe Vai Vai Arg Arg Pro Gly Ser Thr Thr Vai Asn 130 135 140

Gly Thr Leu Vai Pro Gly Leu Lys Ser Leu Vai Leu Gly Gly Arg Lys 145 ISO 155 160

Ala Vai Lys Gin Gly Vai Vai Asn Leu Vai Lys Tyr Ala Lys 165 170 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 46: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 192 (A) COMPRIMENTO: 525 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do sindroma reprodutivo e 'respiratório porcino (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU- 79 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 522 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 46: ATG GGG TCG TCC TTA GAT GAC TTC TGT TAT GAT AGT ACG GCT CCA CAA 48 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys Tyr Asp Ser Thr Ala Pro Gin 1 5 10 15 AAG GTG CTT TTG GCA TTT TCT ATT ACC TAC ACG CCA GTA ATG ATA TAT 96 Lys Vai Leu Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Val Met Ile Tyr 20 25 30 GCC CTA AAG GTG AGT CGC GGC CGA CTG CTA GGG CTT CTG CAC CTT TTG 144 Ala Leu Lys val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu Leu 35 40 45 ATT TTC CTG AAC TGT GCT TTC ACC TTC GGG TAC ATG ACA TTC ATG CAC 192 Ile Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Phe Met His 50 55 60 TTT CAG AGT ACA AAT AAG GTC GCG CTC ACT ATG GGA GCA GTA GTT GCA 240 Phe Gin Ser Thr Asn Lys Val Ala Leu Thr Met Gly Ala Val Val Ala 65 70 75 80 CTC CTT TGG GGG GTG TAC TCA GCC ATA GAA ACC TGG AAA TTC ATC ACC 288 Leu Leu Trp Gly Val Tyr Ser Ala Ile Glu Thr Trp Lys Phe Ile Thr 85 90 95 TCC AGA TGC CGT TTG TGC TTG CTA GGC CGC AAG TAC ATT CTG GCC CCT 336 Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys Tyr Ile Leu Ala Pro 100 105 110 GCC CA C CAC GTT GAA AGT GCC GCA GGC TTT CAT CCG ATT GCG GCA AAT 384 Ala His His Val Glu Ser Ala Ala Gly Phe His Pro Ile Ala Ala Asn 115 120 125 GAT AAC CAC GCA TTT GTC GTC CGG CGT CCC GGC TCC ACT ACG GTC AAC 432 Αερ Asn His Ala Phe Val Val Arg Arg Pro Gly Ser Thr Thr Val Asn 130 135 140 GGC ACA TTG GTG CCC GGG TTG AAA AGC CTC GTG TTG GGT GGC AGA AAA 480 Gly Thr Leu Val Pro Gly Leu Lys Ser Leu Val Leu Gly Gly Arg Lys 145 150 155 160 GCT GTT AAA CAG GGA GTG GTA AAC CTT GTC AAA TAT GCC AAA 522 Ala Vai Lys Gin Gly Val Val Asn Leu Val Lys Tyr Ala Lys 165 170

TAA 525 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 47: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 174 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi: ) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 47: Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys Tyr Asp Ser Thr Ala Pro Gin 1 5 10 15 Lys Vai Leu Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Val Met Ile Tyr 20 25 30 Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu Leu 35 40 45 Ile Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Phe Met His 50 55 60 Phe Gin Ser Thr Asn Lys Val Ala Leu Thr Met Gly Ala Val Val Ala 65 70 75 80

Leu Leu Trp Gly Vai Tyr Ser Ala Ile Glu Thr Trp Lys Phe Ile Thr 85 90 95

Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys Tyr Ile Leu Ala Pro 100 105 110

Ala His His Vai Glu Ser Ala Ala Gly Phe His Pro Ile Ala Ala Asn 115 120 125

Asp Asn His Ala Phe Vai Vai Arg Arg Pro Gly Ser Thr Thr Vai Asn 130 135 140

Gly Thr Leu Vai Pro Gly Leu Lys Ser Leu Vai Leu Gly Gly Arg Lys 145 150 155 160

Ala Vai Lys Gin Gly Vai Vai Asn Leu Vai Lys Tyr Ala Lys 165 170 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 48: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 194 (A) COMPRIMENTO: 525 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 45 (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do sindroma reprodutivo e respiratório porcino (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU- 55 (VR 2430) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 522 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 48: ATG GGG TCG TCC TTA GAT GAC TTC TGC CAT GAT AGC ACG GCT CCA CAA 48 Met 1 Gly Ser Ser Leu 5 Asp Asp Phe Cys His Asp 10 Ser Thr Ala Pro 15 Gin AAG GTG CTT TTG GCG TTC TCT ATT ACC TAC ACG CCA GTG ATG ATA TAT 96 Lys Vai Leu Leu 20 Ala Phe Ser Ile Thr 25 Tyr Thr Pro Vai Met 30 Ile Tyr GCC CTA AAA GTA AGT CGC GGC CGA CTG CTA GGG CTT CTG CAC ctt TTG 144 Ala Leu Lys 35 Vai Ser Arg Gly Arg 40 Leu Leu Gly Leu Leu 45 His Leu Leu ATC TTC CTA AAT TGT GCT TTC ACC TTC GGG TAC ATG ACA TTC GTG CAC 192 Ile Phe 50 Leu Asn Cys Ala Phe 55 Thr Phe Gly Tyr Met 60 Thr Phe Vai His TTT CAG AGC ACA AAC AAG GTC GCG CTC ACT ATG GGA GCA GTA GTT GCA 240 Phe 65 Gin Ser Thr Asn Lys 70 Vai Ala Leu Thr Met 75 Gly Ala Vai Vai Ala 80 CTC CTT TGG GGG GTG TAC TCA GCC ATA GAA ACC TGG AAA TTC ATC ACC 288

Leu Leu Trp Gly Val Tyr Ser Ala Ile Glu Thr Trp Lys Phe Ile Thr 8 5 90 95 TCC AGA TGC CGT TTG TGC TTG CTA GGC CGC AAG TAC ATT TTG GCC CCT 336 Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys Tyr Ile Leu Ala Pro 100 105 110 GCC CAC CAC GTT GAA AGT GCC GCA GGC TTT CAT CCG ATA GCG GCA AAT 384 Ala His His Val Glu Ser Ala. Ala Gly Phe His Pro Ile Ala Ala Asn 115 120 125 GAT AAC CAC GCA TTT GTC GTC CGG CGT CCC GGC TCC ACT ACG GTT AAC 432 Asp Asn His Ala Phe Val Val Arg Arg Pro Gly Ser Thr Thr Val Asn 130 135 140 GGC ACA TTG GTG CCC GGG TTG AAA AGC CTC GTG TTG GGT GGC AGA AAA 480 Gly Thr Leu Val Pro Gly Leu Lys Ser Leu Val Leu Gly Gly Arg Lys 145 150 155 160 GCT GTC AAA CAG GGA GTG GTA AAC CTT GTT AAA TAT GCC AAA 522 Ala val Lys Gin Gly Val Val Asn Leu Val Lys Tyr Ala Lys 165 170

TAA 525 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 49: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 174 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 49:

Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys His Asp Ser Thr Ala Pro Gin 1 5 10 IS

Lys Vai Leu Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Vai Met Ile Tyr 20 25 30

Ala Leu Lys Vai Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu Leu 35 40 45

Ile Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Phe Vai His 50 55 60

Phe Gin Ser Thr Asn Lys Vai Ala Leu Thr Met Gly Ala Vai Vai Ala 65 70 75 B0

Leu Leu Trp Gly Vai Tyr Ser Ala Ile Glu Thr Trp Lys Phe Ile Thr 85 90 95

Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys Tyr Ile Leu Ala Pro 100 105 lio

Ala His His Vai Glu Ser Ala Ala Gly Phe His Pro Ile Ala Ala Asn 115 120 125

Asp Asn His Ala Phe Vai Vai Arg Arg Pro Gly Ser Thr Thr Vai Asn 130 135 140

Gly Thr Leu Vai Pro Gly Leu Lys Ser Leu Vai Leu Gly Gly Arg Lys 145 150 155 160

Ala Vai Lys Gin Gly Vai Vai Asn Leu Vai Lys Tyr Ala Lys 165 170 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 50: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 525 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do sindroma reprodutivo e respiratório porcino (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU- 3927 (VR 2431) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 522 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ id : NO: 50 ATG GGG TCG TCC CTA GAC GAC TTT TGC AAT GAT AGC ACG GCT CCA CAA 48 Met 1 Gly Ser Ser Leu 5 Asp Asp Phe Cys Asn Asp Ser 10 Thr Ala Pro 15 Gin AAG GTG CTT TTG GCG TTT TCT ATT ACC TAC ACG CCG GTG ATG ATA TAT 96 Lys Vai Leu Leu 20 Ala Phe Ser Xle Thr 25 Tyr Thr Pro Vai Met 30 Ile Tyr GCT CTA AAG GTA AGT CGC GGC CGA CTG CTA GGG CTT CTG CAC CTT TTG 144 Ala Leu Lys 35 Vai ser Arg Gly Arg 40 Leu Leu Gly Leu Leu 45 His Leu Leu ATT TTT CTG AAT TGT GCT TTT ACT TTC GGG TAC ATG ACA TTC GTG CAC 192 Xle Phe 50 Leu Asn Cys Ala Phe 55 Thr Phe Gly Tyr Met 50 Thr Phe Vai His TTT GAG AGC ACA AAT AGG GTC GCG CTC ACT ATG GGA GCA GTA GTC GCA 240 Phe 65 Glu Ser Thr Asn Arg 70 Vai Ala Leu Thr Met Gly Ala 75 Vai Vai Ala 80 CTT CTC TGG GGG GTG TAC TCA GCC ATA GAA ACC TGG AAA TTC ATC ACC 288 Leu Leu Trp Gly Vai 85 Tyr Ser Ala Ile Glu Thr Trp Lys 90 Phe Ile 95 Thr TCC AGA TGC CGT TTG TGC TTG CTA GGC CGC AAG TAC ATT CTG GCC CCT 336 Ser Arg Cys Arg 100 Leu Cys Leu Leu Gly 105 Arg Lys Tyr Ile Leu 110 Ala Pro GCC CAC CAC GTT GAG AGT GCC GCA GGC TTT CAT CCG ATT GCG GCA AAT 384 Ala His His 115 Vai Glu Ser Ala Ala 12 0 Gly Phe His Pro Ile 125 Ala Ala Asn GAT AAC CAC GCA TTT GTC GTC CGG CGT CCC GGC TCC ACT ACG GTT AAC 432 Asp Asn 130 His Ala Phe Vai Vai 135 Arg Arg Pro Gly Ser 140 Thr Thr Vai Asn 480

GGC ACA TTG GTG CCC GGG TTG AGA AGC CTC GTG TTG GGT GGC AAA AAA

Gly Thr Leu Vai Pro Gly Leu Arg Ser Leu Vai Leu Gly Gly Lys Lys 145 150 155 160 GCT GTT AAG CAG GGA GTG GTA AAC CTT GTT AAA TAT GCC AAA 522

Ala Vai Lys Gin Gly Vai Vai Asn Leu Vai Lys Tyr Ala Lys 165 170 TAA 525 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 51: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 174 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 51:

Met Gly 1 Ser Ser Leu Asp 5 Asp Phe Cys Asn 10 Asp Ser Thr Ala Pro 15 Gin Lys Vai Leu Leu 20 Ala Phe Ser Ile Thr Tyr 25 Thr Pro Val Met 30 Ile Tyr Ala Leu Lys 35 Vai Ser Arg Gly Arg 40 Leu Leu Gly Leu Leu 45 His Leu Leu Ile Phe 50 Leu Asn Cys Ala Phe 55 Thr Phe Gly Tyr Met 60 Thr Phe Val His Phe Glu 65 Ser Thr Asn Arg 70 Vai Ala Leu Thr Met 75 Gly Ala Val Val Ala 80 Leu Leu Trp Gly Vai 85 Tyr Ser Ala Ile Glu 90 Thr Trp Lys Phe Ile 95 Thr Ser Arg Cys Arg 100 Leu Cys Leu Leu Gly Arg 105 Lys Tyr Ile Leu Ala 110 Pro Ala His His 115 Vai Glu Ser Ala Ala 120 Gly Phe His Pro Ile 125 Ala Ala Asn Asp Asn 130 His Ala Phe Vai Vai 135 Arg Arg Pro Gly Ser 140 Thr Thr Val Asn Gly Thr 145 Leu Vai Pro Gly 150 Leu Arg Ser Leu Val 155 Leu Gly Gly Lys Lys 160 Ala Vai Lys Gin Gly vai Vai Asn Leu Val Lys Tyr Ala Lys 165 170 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N0: 52: 198 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 372 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU- 1894 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 369 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 52: ATG CCA AAT AAC AAC GGC AAG CAG CAG AAG AGA AAG AAG GGG GAT GGC 48 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gin Gin Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 CAG CCA GTC AAT CAG CTG TGC CAG ATG CTG GGT AAG ATC ATC GCT CAG 96 Gin Pro val Asn Gin Leu Cys Gin Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gin 20 25 30 CAA AAC CAG TCC AGA GGC AAG GGA CCG GGA AAG AAA AAC AAG AAG AAA 144 Gin Asn Gin Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 AAC CCG GAG AAG CCC CAT TTT CCT CTA GCG ACT GAA GAT GAT GTC AGA 192 Asn Pro Glu Lvs Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 CAT CAC TTC ACC CCT AGT GAG CGG CAA TTG TGT CTG TCG TCA ATC CAG 240 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gin Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gin 65 70 75 80 ACC GCC TTT AAT CAA GGC GCT GGG ACT TGC ACC CTG TCA GAT TCA GGG 288 Thr Ala Phe Asn Gin Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 AGG ATA AGT TAC ACT GTG GAG TTT AGT TTG CCA ACG CAT CAT ACT GTG 336 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 CGC TTG ATC CGC GTC ACA GCA TCA CCC TCA GCA TGA 372 Arg Leu He Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 53: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 123 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 53:

Met 1 Pro Asn Asn Asn Gly 5 Lys Gin Gin Lys 10 Arg Lys Lys Gly Asp 15 Gly Gin Pro Vai Asn 20 Gin Leu Cys Gin Met 25 Leu Gly Lys Ile Ile 30 Ala Gin Gin Asn Gin Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 Asn Pro 50 Glu Lys Pro His Phe Pro 55 Leu Ala Thr Glu 60 Asp Asp Vai Arg His 65 His Phe Thr Pro Ser 70 Glu Arg Gin Leu Cys 75 Leu Ser Ser Ile Gin 80 Thr Ala Phe Asn Gin Gly 85 Ala Gly Thr Cys 90 Thr Leu Ser Asp Ser Gly 95 Arg Xle Ser Tyr 100 Thr Vai Glu Phe Ser 105 Leu Pro Thr His His 110 Thr Vai Arg Leu Ile Arg Vai Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 54: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 372 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU- 22 (VR 2429) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 369 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 54: ATG CCA AAT AAC AAC GGT AAG CAG CAG AAG AGA AAG AAG GGG GAT GGC 48 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gin Gin Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 CAG CCA GTC AAT CAG CTG TGC CAG ATG CTG GGC AAG ATC ATC GCT CAG 96 Gin Pro Vai Asn Gin Leu Cys Gin Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gin 20 25 30 CAA AAT CAG TCC AGA GGC AAG GGA CCG GGA AAG ΑΆΑ AAT AAG AAG AAA 144 Gin Asn Gin Ser Arg· Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 AAC CCG GAG AAG CCC CAT TTT CCT CTA GCG ACT GAA GAT GAT GTC AGA 192 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Vai Arg 50 55 60 CAT CAC TXT ACC CCT AGT GAG CGG CAA TTG TGT CTG TCG TCA ATC CAG 240 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gin Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gin 65 70 75 80 ACC GCC TTT AAT CAA GGC GCT GGG ACT TGC ACC CTG TCA GAT TCA GGG 2B8 Thr Ala Phe Asn Gin Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 AGG ATA AGT TAC ACT GTG GAG TTT AGT TTG CCT ACG CAT CAT ACT GTG 336 Arg lie Ser Tyr Thr Vai Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Vai 100 105 110 CGC CTG ATC CGC GTC ACA GCA TCA CCC TCA GCA TGA 372 Arg Leu Ile Arg Vai Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 55: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 201 (A) COMPRIMENTO: 123 aminoácidos ι (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 55:

Met 1 Pro Asn Asn Asn Gly Lys 5 Gin Gin Lys 10 Arg Lys Lys Gly Asp 15 Gly Gin Pro Val Asn 20 Gin Leu Cys Gin Met 25 Leu Gly Lys Ile Ile 30 Ala Gin Gin Asn Gin 35 Ser Arg Gly Lys Gly 40 Pro Gly Lys Lys Asn Lys 45 Lys Lys Asn Pro 50 Glu Lys Pro His Phe 55 Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val 60 Arg His 65 His Phe Thr Pro Ser Glu 70 Arg Gin Leu Cys 75 Leu Ser Ser Ile Gin 80 Thr Ala Phe Asn Gin Gly Ala 85 Gly Thr Cys 90 Thr Leu Ser Asp Ser Gly 95 Arg Ile Ser Tyr 100 Thr Val Glu Phe Ser 105 Leu Pro Thr His His 110 Thr Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 56: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 372 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE:,desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino 202 (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU- 79 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 369 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 56: ATG CCA AAT AAC AAC GGC AAG CAG CAG AAG AGA AAG AAG GGG GAT GGC 48 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gin Gin Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 CAG CCA GTC AAT CAG CTG TGC CAG ATG CTG GGT AAG ATC ATC GCC CAG 96 Gin Pro Vai Asn Gin Leu Cys Gin Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gin 20 25 30 CAA AAC CAG TCT AGA GGC AAG GGA CCG GGA AAG ΑΆΑ AAT AAG AAG AAA 144 Gin Asn Gin Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 AAC CCG GAG AAG CCC CAT TTT CCT CTA GCG ACT GAA GAT GAT GTC AGA 192 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Vai Arg 50 55 60 CAT CAC TTT ACC CCT AGT GAG CGG CAA TTG TGT CTG TCG TCA ATC CAA 240 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gin Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gin 65 70 75 80 ACT GCC TTT AAT CAA GGC GCT GGG ACT TGC ACC CTG TCA GAT TCA GGG 288 Thr Ala Phe Asn Gin Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 AGG ATA AGT TAC ACT GTG GAG TTT AGT TTG CCT ACG CAT CAT ACT GTG 336 Arg Ile Ser Tyr Thr Vai Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Vai 100 105 110 O Ω n TTG ATC CGC GTC ACA GCA TCA CCC TCA GCA TGA 372 Arg Leu Ile Arg Vai Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 57: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 123 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 203 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 57:

Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gin Gin Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15

Gin Pro Vai Asn Gin Leu Cys Gin Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gin 20 25 30

Gin Asn Gin Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45

Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Vai Arg 50 55 60

His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gin Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gin 65 70 75 80

Thr Ala Phe Asn Gin Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95

Arg Ile Ser Tyr Thr Vai Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Vai 100 105 110

Arg Leu Ile Arg Vai Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 58: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 372 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do sindroma reprodutivo e respiratório porcino (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU- 55 (VR 2430) (ix) CARACTERÍSTICA: 204 (Α) ΝΟΜΕ/CHAVE: CDS (Β) LOCALIZAÇÃO: 1.. 369 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 58: ATG CCA AAT AAC AAC GGC AAG CAG CAG AAG ΑΆΑ AAG AAG GGG GAT GGC 48 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gin Gin Lys Lys Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 CAG CCA GTC AAT CAG CTG TGC CAG ATG CTG GGT AAG ATC ATC GCT CAG 96 Gin Pro Vai Asn Gin Leu Cys Gin Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gin 20 25 30 CAA AAC CAG TCC AGA GGC AAG GGA CCG GGA AAG AAA AAC AAG AAG AAA 144 Gin Asn Gin Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 AAC CCG GAG AAG CCC CAT TTT CCT CTA GCG ACT GAA GAT GAT GTC AGA 192 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Vai Arg 50 55 60 CAT CAC TTC ACC TCT GGT GAG CGG CAA TTG TGT CTG TCG TCA ATC CAG 240 His His Phe Thr Ser Gly Glu Arg Gin Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gin 65 70 75 80 ACA GCC ITT AAT CAA GGC GCT GGA ACT TGT ACC CTG TCA GAT TCA GGG 288 Thr Ala Phe Asn Gin Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 AGG ATA AGT TAC ACT GTG GAG TTT AGT TTG CCG ACG CAT CAT ACT GTG 336 Arg Ile Ser Tyr Thr Vai Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Vai 100 105 110 CGC TTG ATC CGC GTC ACA GCG TCA CCC TCA GCA TGA 372 Arg Leu Ile Arg Vai Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 59: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 123 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 59: 205

Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gin Gin Lys Lys Lys Lys Gly Asp Gly 15 10 15

Gin Pro Vai Asn 20 Gin Leu Cys Gin Met 25 Leu Gly Lys Ile Ile 30 Ala Gin Gin Asn Gin 35 Ser Arg Gly Lys Gly 40 Pro Gly Lys Lys Asn 45 Lys Lys Lys Asn Pro 50 Glu Lys Pro His Phe Pro 55 Leu Ala Thr Glu 60 Asp Asp Vai Arg His His 65 Phe Thr Ser Gly Glu Arg 70 Gin Leu Cys 75 Leu Ser Ser Ile Gin 80 Thr Ala Phe Asn Gin Gly Ala Gly 85 Thr Cys 90 Thr Leu Ser Asp Ser Gly 95 Arg Ile Ser Tyr 100 Thr Vai Glu Phe Ser 105 Leu Pro Thr His His 110 Thr Vai Arg Leu Ile Arg Vai Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 60: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 372 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: e (A) ORGANISMO: vírus do síndroma reprodutivo respiratório porcino (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU- 3927 (VR 2431) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 369 206 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 60: ATG CCA AAT AAC AAC GGC AAG CAG CAG AAG AAA AAG AAG GGG GAT GGC 48 Met Pro Asn Asn Asn Gly LVS Gin Gin Lys Lys Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 CAG CCA GTC AAT CAG CTC TGC CAA ATG CTG GGT AAG ATC ATC GCC CAG 96 Gin Pro Vai Asn Gin Leu Cys Gin Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gin 20 25 30 CAA AAC CAG TCC AGA GGT AAG GGA CCG GGA AAG AAA AAT AAG AAG AAA 144 Gin Asn Gin Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 AAC CCG GAG AAG CCC CAT TTT CCT CTA GCG ACT GAA GAT GAT GTC AGA 192 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp As? Vai Arg 50 55 60 CAT CAC TTC ACC CCC AGT GAG CGG CAA TTG TGT CTG TCG TCA ATC CAG 240 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gin Leu Cys Leu Ser Ser lie Gin 65 70 75 80 ACT GCC TTT AAT CAG GGC GCT GGG ACC TGT ATC CTA TCA GAT TCA GGG 28B Thr Ala Phe Asn Gin Gly Ala Gly Thr Cys Ile Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 AGG ATA AGT TAC ACT GTG GAG TTT AGT TTG CCG ACG CAT CAT ACT GTG 336 Arg Ile Ser Tyr Thr Vai Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Vai 100 105 110 CGC CTG ATT CGC GTC ACG GCA CCA CCC TCA GCA TGA 372 Arg Leu ile Arg Vai Thr Ala Pro Pro Ser Ala 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 61: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 123 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 61: 207

Met 1 Pro Asn Asn Asn 5 Gly Lys Gin Gin Lys 10 Lys Lys Lys Gly Asp Gly 15 Gin Pro Vai Asn 20 Gin Leu Cys Gin Met 25 Leu Gly Lys Ile Ile 30 Ala Gin Gin Asn Gin 35 Ser Arg Gly Lys Gly 40 Pro Gly Lys Lys Asn Lys 45 Lys Lys Asn Pro 50 Glu Lys Pro His Phe 55 Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp 60 Vai Arg His €5 His Phe Thr Pro Ser 70 Glu Arg Gin Leu cys 75 Leu Ser Ser Ile Gin 80 Thr Ala Phe Asn Gin B5 Gly Ala Gly Thr Cys 90 Ile Leu Ser Asp Ser Gly 95 Arg Ile Ser Tyr 100 Thr Vai Glu Phe Ser 105 Leu Pro Thr His His 110 Thr Vai Arg Leu Ile 115 Arg vai Thr Ala Pro 120 Pro Ser Ala (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 62: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 62:

Lys Lys Ser Thr Ala Pro Met 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 63: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 208 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 63:

Ala Ser Gin Gly 1 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 64: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 240 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico; (A) DESCRIÇÃO: ADN (sintético) (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: virus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU- 12 (VR 2385/VR 2386) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 64: TCTTCTTGCC TTTTCTATGC TTCTGAGATG AGTGAAAAGG GATTTAAGGT GGTATTTGGC 60 AATGTGTCAG GCATCGTGGC AGTGTGCGTC AACTTCACCA GTTACGTCCA ACATGTCAAG 120 GAATTTACCC AACGTTCCTT GGTAGTTGAC CATGTGCGGC TGCTCCATTT CATGACGCCC 180 GAGACCATGA GGTGGGCAAC TGTTTTAGCC TGTCTTTTTA CCATTCTGTT GGCAATTTGA 240 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 65: 209 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1799 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecido (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: virus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU- 12 (VR 2385/VR 2386) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 65: 210 CCTGAATTGA GATGAAATGG GGTCTATGCA AAGCCTTTTT GACAAAATTG GCCAACTTTT €0 TGTGGATGCT TTCACGGAGT tcttggtgtc CATTGTTGAT ATCATTATAT TTTTGGCCAT X20 TTTGTTTGGC TTCACCATCG CAGGTTGGCT GGTGGTCTTT TGCATCAGAT TGGTTTGCTC ISO CGCGATACTC CGTGCGCGCC CTGCCATTCA CTCTGAGCAA TTACAGAAGA TCCTATGAGG 240 CCTTTCTCTC TCAGTGCCAG GTGGACATTC CCACCTGGGG AACTAAACAT CCTTTGGGGA 300 TGCTTTGGCA CCATAAGGTG TCAACCCTGA TTGATGAAAT GGTGTCGCGT CGAATGTACC 360 GCATCATGGA AAAAGCAGGA CAGGCTGCCT GGAAACAGGT AGTGAGCGAG GCTACGCTGT 420 CTCGCATTAG TAGTTTGGAT GTGGTGGCTC ATTTTCAGCA TCTTGCCGCC ATTGAAGCCG 480 AGACCTGTAA ATATCTGGCC TCTCGGCTGC CCATGCTACA CCACCTGCGC ATGACAGGGT 540 CAAATGTAAC CATAGTGTAT AATAGTACTT TGAATCAGGT GTTTGCTGTT TTCCCAACCC 600 CTGGTTCCCG GCCAAAGCTT CATGATTTCC AGCAATGGCT AATAGCTGTA CATTCCTCTA 660 TATTTTCCTC TGTTGCAGCT TCTTGTACTC TTTTTGTTGT GCTGTGGTTG CGGGTTCCAA 720 TGCTACGTAC TGTTTTTGGT TTCCGCTGGT TAGGGGCAAT TTTTCTTTCG AACTCACGGT 780 GAATTACACG GTGTGCCCGC CTTGCCTCAC CCGGCAAGCA GCCGCAGAGG CCTACGAACC Θ40 CGGCAGGTCC CTTTGGTGCA GGATAGGGCA TGATCGATGT GGGGAGGACG ATCATGATGA 900 ACTAGGGTTT GTGGTGCCGT CTGGCCTCTC CAGCGAAGGC CACTTGACCA GTGCTTACGC 960 CTGGTTGGCG TCCCTGTCCT TCAGCTATAC GGCCCAGTTC CATCCCGAGA TATTCGGGAT 1020 AGGGAATGTG AGTCGAGTCT ATGTTGACAT CAAGCACCAA TTCATTTGCG ctgttcatga 1080 TGGGCAGAAC ACCACCTTGC CCCACCATGA CAACATTTCA GCCGTGCTTC AGACCTATTA 1140 CCAGCATCAG GTCGACGGGG GCAATTGGTT TCACCTAGAA TGGGTGCGTC CCTTCTTTTC 1200 CTCTTGGTTG GTTTTAAATG TCTCTTGGTT TCTCAGGCGT TCGCCTGCAA GCCATGTTTC 1260 AGTTCGAGTC TTTCAGACAT CAAGACCAAC ACCACCGCAG CGGCAGGCTT TGCTGTCCTC 1320 CAAGACATCA GTTGCCTTAG GCATCGCAAC TCGGCCTCTG AGGCGATTCG caaagtccct 1380 CAGTGCCGCA CGGOGATAGG GACACCCGTG TATATCACTG TCACAGCCAA TGTTACCGAT 1440 GAGAATTATT TGCATTCCTC TGATCTTCTC ATGCTTTCTT CTTGCCTTTT CTATGCTTCT 1500 GAGATGAGTG AAAAGGGATT TAAGGTGGTA TTTGGCAATG TGTCAGGCAT CGTGGCAGTG 1560 TGCGTCAACT TCACCAGTTA CGTCCAACAT GTCAAGGAAT TTACCCAACG TTCCTTGGTA 1620 GTTGACCATG TGCGGCTGCT CCATTTCATG ACGCCCGAGA CCATGAGGTG GGCAACTGTT 1680 TTAGCCTGTC TTTTTACCAT TCTGTTGGCA ATTTGAATGT TTAAGTATGT TGGGGAAATG 1740 CTTGACCGCG GGCTGTTGCT CGCAATTGCT TTTTTTATGG TGTATCGTGC CGTCTTGTT 17 99 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 66: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 771 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 211 (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU- 12 (VR 2385/VR 2386) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 768 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 66: ATG AAA TGG GGT CTA TGC AAA GCC TTT TTG ACA AAA TTG GCC AAC TTT 4B Met 1 Lys Trp Gly Leu 5 Cys Lys Ala Phe Leu Thr 10 Lys Leu Ala Asn 15 Phe TTG TGG ATG CTT TCA CGG AGT TCT TGG TGT CCA TTG TTG ATA TCA TTA 96 Leu Trp Met Leu 20 Ser Arg Ser Ser Trp 25 Cys Pro Leu Leu Ile 30 Ser Leu TAT TTT TGG CCA TTT TGT TTG GCT TCA CCA TCG CAG GTT GGC TGG TGG 144 Tyr Phe Trp 35 Pro Phe Cys Leu Ala Ser 40 Pro Ser Gin Vai 45 Gly Trp Trp TCT TTT GCA TCA GAT TGG TTT GCT CCG CGA TAC TCC GTG CGC GCC CTG 192 Ser Phe 50 Ala Ser Asp Trp Phe SS Ala Pro Arg Tyr Ser Vai 60 Arg Ala Leu CCA TTC ACT CTG AGC AAT TAC AGA AGA TCC TAT GAG GCC TTT CTC TCT 240 Pro es Phe Thr Leu Ser Asn 70 Tyr Arg Arg Ser Tyr 75 Glu Ala Phe Leu Ser 80 CAG TGC CAG GTG GAC ATT CCC ACC TGG GGA ACT AAA CAT CCT TTG GGG 288 Gin Cys Gin Vai Asp 85 lie Pro Thr Trp Gly Thr 50 Lys His Pro Leu 95 Gly ATG CTT TGG CAC CAT AAG GTG TCA ACC CTG ATT GAT GAA ATG GTG TCG 336 Met Leu Trp His 100 His Lys Vai Ser Thr 105 Leu Ile Asp Glu Met 110 Vai Ser CGT CGA ATG TAC CGC ATC ATG GAA AAA GCA GGA CAG GCT GCC TGG AAA 384 Arg Arg Met 115 Tyr Arg Ile Met Glu Lys 120 Ala Gly Gin Ala 125 Ala Trp Lys CAG GTA GTG AGC GAG GCT ACG CTG TCT CGC ATT AGT AGT TTG GAT GTG 432 Gin Vai 130 Vai Ser Glu Ala Thr 135 Leu Ser Arg Ile Ser 140 Ser Leu Asp Vai 212 GTG GCT CAT TTT CAG CAT CTT GCC GCC ATT GAA GCC GAG ACC TGT AAA 480 Vai 145 Ala His Phe Gin His 150 Leu Ala Ala Ile Glu 155 Ala Glu Thr Cys Lys 160 TAT CTG GCC TCT CGG CTG ccc ATG CTA CAC CAC CTG CGC ATG ACA GGG 528 Tyr Leu Ala Ser Arg 165 Leu Pro Met Leu His 170 His Leu Arg Met Thr 175 Gly TCA AAT GTA ACC ATA GTG TAT AAT AGT ACT TTG AAT CAG GTG TTT GCT 576 Ser Asn Vai Thr 180 Ile Vai Tyr Asn Ser 185 Thr Leu Asn Gin Vai 190 Phe Ala GTT TTC CCA ACC CCT GGT TCC CGG CCA AAG CTT CAT GAT TTC CAG CAA 624 Vai Phe Pro 195 Thr Pro Gly Ser Arg 200 Pro Lys Leu His Asp 205 Phe Gin Gin TGG CTA ATA GCT GTA CAT TCC TCT ATA TTT TCC TCT GTT GCA GCT TCT 672 Trp Leu 210 Ile Ala Vai His Ser 215 Ser Ile Phe Ser Ser 220 Vai Ala Ala Ser TGT ACT CTT TTT GTT GTG CTG TGG TTG CGG GTT CCA ATG CTA CGT ACT 720 Cys 225 Thr Leu Phe Vai Vai 230 Leu Trp Leu Arg Vai 235 Pro Met Leu Arg Thr 240 GTT TTT GGT TTC CGC TGG TTA GGG GCA ATT TTT CTT TCG AAC TCA CGG 768 Vai TGA Phe Gly Phe Arg 245 Trp Leu Gly Ala Ile 250 Phe Leu Ser Asn Ser 255 Arg 771 (2). INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 67: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 256 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 67: 213

Met 1 Lys Trp Gly Leu 5 Cys Lys Ala Phe Leu 10 Thr Lys Leu Ala Asn 15 Phe Leu Trp Met Leu 20 Ser Arg Ser Ser Trp 25 Cys Pro Leu Leu Ile 30 Ser Leu Tyr Phe Trp 35 Pro Phe Cys Leu Ala 40 Ser Pro Ser Gin Val 45 Gly Trp Trp Ser Phe 50 Ala Ser Asp Trp Phe Ala 55 Pro Arg Tyr Ser 60 Val Arg Ala Leu Pro 65 Phe Thr Leu Ser Asn 70 Tyr Arg Arg Ser Tyr 75 Glu Ala Phe Leu Ser 80 Gin Cys Gin Val Asp 85 Ile Pro Thr Trp Gly 90 Thr Lys His Pro Leu 95 Gly Met Leu Trp His 100 His Lys Val Ser Thr 105 Leu Ile Asp Glu Met 110 Val Ser Arg Arg Met 115 Tyr Arg Ile Met Glu 120 Lys Ala Gly Gin Ala 125 Ala Trp Lys Gin Vai 130 Vai Ser Glu Ala Thr Leu 135 Ser Arg Ile Ser 140 Ser Leu Asp val Vai 145 Ala His Phe Gin His 150 Leu Ala Ala Ile Glu 155 Ala Glu Thr Cys Lys 160 Tyr Leu Ala Ser Arg 165 Leu Pro Met Leu His 170 His Leu Arg Met Thr Gly 175 Ser Asn Vai Thr 180 Ile Val Tyr Asn Ser 185 Thr Leu Asn Gin Val 190 Phe Ala Vai Phe Pro 195 Thr Pro Gly Ser Arg 200 Pro Lys Leu His Asp 205 Phe Gin Gin Trp Leu 210 Ile Ala Val His Ser Ser 215 Ile Phe Ser Ser 220 Val Ala Ala Ser Cys 225 Thr Leu Phe Val Val 230 Leu Trp Leu Arg Val 235 Pro Met Leu Arg Thr 240 Vai Phe Gly Phe Arg 245 Trp Leu Gly Ala Ile 250 Phe Leu Ser Asn Ser 255 Arg (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 68: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 765 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear 214 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (VR 2385/VR 2386) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 762 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 68: ATG GCT AAT AGC TGT ACA TTC CTC TAT ATT TTC CTC TGT TGC AGC TTC 48

Met Ala Asn Ser Cys Thr Phe Leu Tyr Ile Phe Leu Cys Cys Ser Phe 1 S 10 15 TTG TAC TCT TTT TGT TGT GCT GTG GTT GCG GGT TCC AAT GCT ACG TAC 96

Leu Tyr Ser Phe Cys Cys Ala Vai Vai Ala Gly Ser Asn Ala Thr Tyr 20 25 30 TGT TTT TGG TTT CCG CTG GTT AGG GGC AAT TTT TCT TTC GAA CTC ACG 144

Cys Phe Trp Phe Pro Leu Vai Arg Gly Asn Phe Ser Phe Glu Leu Thr 35 40 45 GTG AAT TAC ACG GTG TGC CCG CCT TGC CTC ACC CGG CAA GCA GCC GCA 192

Vai Asn Tyr Thr Vai Cys Pro Pro Cys Leu Thr Arg Gin Ala Ala Ala 50 55 60 GAG GCC TAC GAA CCC GGC AGG TCC CTT TGG TGC AGG ATA GGG CAT GAT 24 0 215 288 288 GTT TTA AAT GTC TCT TGG TTT CTC AGG CGT TCG CCT GCA AGC CAT GTT Vai Leu Asn Vai Ser Trp Phe Leu Arg Arg Ser Pro Ala Ser His Vai 195 200 205 TCA GTT CGA GTC TTT CAG A CA TCA AGA CCA ACA CCA CCG CAG CGG CAG Ser Vai Arg Vai Phe Gin Thr Ser Arg Pro Thr Pro Piro Gin Arg Gin 210 215 220 GCT TTG CTG TCC TCC AAG ACA TCA GTT GCC TTA GGC ATC GCA ACT CGG Ala Leu Leu Ser Ser Lys Thr Ser Vai Ala Leu Gly Ile Ala Thr Arg 225 230 235 240 CCT CTG AGG CGA TTC GCA AAG TCC CTC AGT GCC GCA CGG CGA Pro Leu Arg Arg Phe Ala Lys Ser Leu Ser Ala Ala Arg Arg 245 250

Glu Ala Tyr Glu Pro Gly Arg Ser £5 70 CGA TGT GGG GAG GAC GAT CAT GAT Arg Cys Gly Glu Asp Asp His Asp 85 GGC CTC TCC AGC GAA GGC CAC TTG Gly Leu Ser Ser Glu Gly His Leu 100 TCC CTG TCC TTC AGC TAT ACG GCC Ser Leu Ser Phe Ser Tyr Thr Ala 115 · 120 ATA GGG AAT GTG AGT CGA GTC TAT Ile Gly Asn Vai Ser Arg Vai Tyr 130 135 TGC GCT GTT CAT GAT GGG CAG AAC Cys Ala Vai His Asp Gly Gin Asn 145 150 ATT TCA GCC GTG CTT CAG ACC TAT Ile Ser Ala Vai Leu Gin Thr Tyr 165 AAT TGG TTT CAC CTA GAA TGG GTG Asn Txp Phe His Leu Glu Trp Vai 180

TAG

Leu Trp Cys Arg Ile Gly His Asp 75 80 GAA CTA GGG TTT GTG GTG CCG TCT Glu Leu Gly Phe Vai Vai Pro Ser 90 95 ACC AGT GCT TAC GCC TGG TTG GCG Thr Ser Ala Tyr Ala Trp Leu Ala 105 110 CAG TTC CAT CCC GAG ATA TTC GGG Gin Phe His Pro Glu Ile Phe Gly 125 GTT GAC ATC AAG CAC CAA TTC ATT Vai Asp Ile Lys His Gin Phe Ile 140 ACC ACC TTG CCC CAC CAT GAC AAC Thr Thr Leu Pro His His Asp Asn 155 160 TAC CAG CAT CAG GTC GAC GGG GGC Tyr Gin -His Gin Vai Asp Gly Gly 170 175 CGT CCC TTC TTT TCC TCT TGG TTG Arg Pro Phe Phe Ser Ser Trp Leu 185 190 336 3 84 432 480 528 57 6 624 672 720 762 765 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 69: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 254 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 216 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 69:

Met Ala Asn Ser Cys Thr Phe Leu Tyr Ile Phe Leu Cys Cys Ser Phe 15 10 is

Leu Tyr Ser Phe Cys Cys Ala Vai Vai Ala Gly Ser Asn Ala Thr Tyr 20 25 30

Cys Phe Trp Phe Pro Leu Vai Arg Gly Asn Phe Ser Phe Glu Leu Thr 35 40 45

Vai Asn Tyr Thr Vai Cys Pro Pro Cys Leu Thr Arg Gin Ala Ala Ala 50 55 60

Glu Ala Tyr Glu Pro Gly Arg Ser Leu Trp Cys Arg Ile Gly His Asp 65 70 75 80

Arg Cys Gly Glu Asp Asp His Asp Glu Leu Gly Phe Vai Vai Pro Ser 85 90 95

Gly Leu Ser Ser Glu Gly His Leu Thr Ser Ala Tyr Ala Trp Leu Ala 100 105 110

Ser Leu Ser Phe Ser Tyr Thr Ala Gin Phe His Pro Glu Ile Phe Gly 115 120 125

Ile Gly Asn Vai Ser Arg Vai Tyr Vai Asp Ile Lys His Gin Phe Ile 130 135 140

Cys Ala Vai His Asp Gly Gin Asn Thr Thr Leu Pro His His Asp Asn 145 150 155 160

Ile Ser Ala Vai Leu Gin Thr Tyr Tyr Gin His Gin Vai Asp Gly Gly 165 170 175

Asn Trp Phe His Leu Glu Trp Vai Arg Pro Phe Phe Ser Ser Trp Leu 180 185 190

Vai Leu Asn Vai Ser Trp Phe Leu Arg Arg Ser Pro Ala Ser His Vai 195 200 205

Ser Vai Arg Vai Phe Gin Thr Ser Arg Pro Thr Pro Pro Gin Arg Gin 210 215 220

Ala Leu Leu Ser Ser Lys Thr Ser Vai Ala Leu Gly Ile Ala Thr Arg 225 230 235 240

Pro Leu Arg Arg Phe Ala Lys Ser Leu Ser Ala Ala Arg Arg 245 250 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 70: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 537 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 217 (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: virus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (B) ESTIRPE: Iowa (C) ISOLADO INDIVIDUAL: ISU- 12 (VR 2385/VR 2386) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 534 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 70: 218 ATG GGT GCG TCC CTT CTT TTC CTC TTG GTT GGT TTT AAA TGT CTC TTG 48 Met 1 Gly Ala Ser Leu 5 Leu Phe Leu Leu Vai 10 Gly Phe Lys Cys Leu 15 Leu GTT TCT CAG GCG TTC GCC TGC AAG CCA TGT TTC AGT TCG AGT CTT TCA 96 Vai Ser Gin Ala 20 Phe Ala Cys Lys Pro Cys 25 Phe Ser Ser Ser 30 Leu Ser GAC ATC AAG ACC AAC ACC ACC GCA GCG GCA GGC TTT GCT GTC CTC CAA 144 Asp Ile Lys 35 Thr Asn Thr Thr Ala Ala Ala 40 Gly Phe Ala 45 Val Leu Gin GAC ATC AGT TGC CTT AGG CAT CGC AAC TCG GCC TCT GAG GCG ATT CGC 192 Asp Ile 50 Ser Cys Leu Arg His 55 Arg Asn Ser Ala Ser 60 Glu Ala Ile Arg AAA GTC CCT CAG TGC CGC ACG GCG ATA GGG ACA CCC GTG TAT ATC ACT 240 Lys 65 Vai Pro Gin Cys Arg 70 Thr Ala Ile Gly Thr 75 Pro Val Tyr Ile Thr 80 GTC ACA GCC AAT GTT ACC GAT GAG AAT TAT TTG CAT TCC TCT GAT CTT 288 Vai Thr Ala Asn Vai 85 Thr Asp Glu Asn Tyr 90 Leu His Ser Ser Asp 95 Leu CTC ATG CTT TCT TCT TGC CTT TTC TAT GCT TCT GAG- -ATG AGT GAA AAG 336 Leu Met Leu Ser 100 Ser Cys Leu Phe Tyr Ala 105 Ser Glu Met Ser 110 Glu Lys GGA TTT AAG GTG GTA TTT GGC AAT GTG TCA GGC ATC GTG GCA GTG TGC 384 Gly Phe Lys 115 Vai Vai Phe Gly Asn Vai 120 Ser Gly Ile Val 125 Ala Val Cys GTC AAC TTC ACC AGT TAC GTC CAA CAT GTC AAG GAA TTT ACC CAA CGT 432 Vai Asn 13 0 Phe Thr Ser Tyr Vai 135 Gin His val Lys Glu 140 Phe Thr Gin Arg TCC TTG GTA GTT GAC CAT GTG CGG CTG CTC CAT TTC ATG ACG CCC GAG 480 Ser 145 Leu Vai Vai Asp His 150 Vai Arg Leu Leu His 155 Phe Met Thr Pro Glu 160 AC C ATG AGG TGG GCA ACT GTT TTA GCC TGT CTT TTT ACC ATT CTG TTG 528 Thr Met Arg GCA ATT TGA Ala Ile Trp Ala 165 Thr Vai Leu Ala Cys 170 Leu Phe Thr Ile Leu 175 Leu 537 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 71: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 178 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 71:

Met Gly Ala Ser Leu Leu Phe Leu Leu Vai Gly Phe Lys Cys Leu Leu 1 5 10 15 219

Vai Ser Gin Ala 20 Phe Ala Cys Lys Pro 25 Cys Phe Ser Ser Ser 30 Leu Ser Asp Ile Lys 35 Thr Asn Thr Thr Ala 40 Ala Ala Gly Phe Ala 45 Val Leu Gin Asp Ile 50 Ser Cys Leu Arg His Arg 55 Asn Ser Ala Ser 60 Glu Ala Ile Arg Lys 65 Vai Pro Gin Cys Arg 70 Thr Ala Ile Gly Thr 75 Pro Val Tyr ile Thr 80 Vai Thr Ala Asn Val 85 Thr Asp Glu Asn Tyr Leu 90 His Ser Ser Asp 95 Leu Leu Met Leu Ser 100 Ser Cys Leu Phe Tyr Ala Ser 105 Glu Met Ser 110 Glu Lys Gly Phe Lys 115 val Val Phe Gly Asn 120 Val Ser Gly Ile Val 125 Ala Val Cys Vai Asn 13Ό Phe Thr Ser Tyr Val Gin 13-5 His Val Lys Glu 140 Phe Thr Gin Arg Ser 145 Leu Vai Val Asp His 150 Val Arg Leu Leu His 155 Phe Met Thr Pro Glu 160 Thr Met Arg Trp Ala 165 Thr Val Leu Ala Cys Leu 170 Phe Thr Ile Leu 175 Leu

Ala Ile (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 72: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 750 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Lelystad (ix) CARACTERÍSTICA: 220

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 747 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 72: ATG CAA TGG GGT CAC TGT GGA GTA AAA TCA GCC AGC TGT TGG TGG ACG 48

Met Gin Trp Gly His Cys Gly Vai Lys Ser Ala Ser Cys Ser Trp Thr 1 5 10 15 CCT TCA CTG AGT TCC TTG TTA GTG TGG TTG ATA TTG CCA TTT TCC TTG 96

Pro Ser Leu Ser Ser Leu Leu Vai Trp Leu Ile Leu Pro Phe Ser Leu 20 25 30 CCA TAC TGT TTG GGT TCA CCG TCG CAG GAT GGT TAC TGG TCT TTC TTC 144

Pro Tyr Cys Leu Gly Ser Pro Ser Gin Asp Gly Tyr Trp Ser Phe Phe 35 40 45 TCA GAG TGG TTT GCT CCG CGC TTC TCC GTT CGC GCT CTG CCA TTC ACT 192

Ser Glu Tip Phe Ala Pro Arg Phe Ser Vai Arg Ala Leu Pro Phe Thr 50 55 60 CTC CCG AAC TAT CGA AGG TCC TAT GAA GGC TTG TTG CCC AAC TGC AGA 240

Leu Pro Asn Tyr Arg Arg Ser Tyr Glu Gly Leu Leu Pro Asn Cys Arg 65 70 75 80 CCG GAT GTC CCA CAA TTT GCA GTC AAG CAC CCA TTG GGT ATG TTT TGG 288

Pro Asp Vai Pro Gin Phe Ala Vai Lys His Pro Leu Gly Met Phe Trp 85 90 95 CAC ATG CGA GTT TCC CAC TTG ATT GAT GAG ATG GTC TCT CGT CGC ATT 336

His Met Arg Vai Ser His Leu Ile Asp Glu Met Vai Ser Arg Arg Ile 100 105 110 TAC CAG ACC ATG GAA CAT TCA GGT CAA GCG GCC TGG AAG CAG GTG GTT 384

Tyr Gin Thr Met Glu His Ser Gly Gin Ala Ala Trp Lys Gin Vai Vai 11S 120 125 GGT GAG GCC ACT CTC ACG AAG CTG TCA GGG CTC GAT ATA GTT ACT CAT 432

Gly Glu Ala Thr Leu Thr Lys Leu Ser Gly Leu Asp Ile Vai Thr His 130 135 140 TTC CAA CAC CTG GCC GCA GTG GAG GCG GAT TCT TGC CGC TTT CTC AGC 4B0

Phe Gin His Leu Ala Ala Vai Glu Ala Asp Ser Cys Arg Phe Leu Ser 145 150 155 160 TCA CGA CTC GTG ATG CTA AAA AAT CTT GCC GTT GGC AAT GTG AGC CTA 528

Ser Arg Leu Vai Met Leu Lys Asn Leu Ala Vai Gly Asn Vai Ser Leu 165 170 175 CAG TAC AAC ACC ACG TTG GAC CGC GTT GAG CTC ATC TTC CCC ACG CCA 576

Gin Tyr Asn Thr Thr Leu Asp Arg Vai Glu Leu Ile Phe Pro Thr Pro 180 185 190 GGT ACG AGG CCC AAG TTG ACC GAT TTC AGA CAA TGG CTC ATC AGT GTG 624

Gly Thr Arg Pro Lys Leu Thr Asp Phe Arg Gin Trp Leu Ile Ser Vai 195 200 205 CAC GCT TCC ATT TTT TCC TCT GTG GCT TCA TCT GTT ACC TTG TTC ATA 672

His Ala Ser Ile Phe Ser Ser Vai Ala Ser Ser Vai Thr Leu Phe Ile 210 21S 220 GTG CTT TGG CTT CGA ATT CCA GCT CTA CGC TAT GTT TTT GGT TTC CAT 720

Vai Leu Trp Leu Arg Ile Pro Ala Leu Arg Tyr Vai phe Gly Phe His 225 230 235 240 TGG CCC ACG GCA ACA CAT CAT TCG AGC TGA 750

Trp Pro Thr Ala Thr His His Ser Ser 245 221 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 73: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 249 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 73:

Met Gin Trp Gly His Cys Gly Vai Lys Ser Ala Ser Cys Ser Trp Thr 15 10 15

Pro Ser Leu Ser Ser Leu Leu Vai Trp Leu Ile Leu Pro Phe Ser Leu 20 25 30

Pro Tyr Cys Leu Gly Ser Pro Ser Gin Asp Gly Tyr Trp Ser Phe Phe 35 40 45

Ser Glu Trp Phe Ala Pro Arg Phe Ser Vai Arg Ala Leu Pro Phe Thr 50 55 60

Leu Pro Asn Tyr Arg Arg Ser Tyr Glu Gly Leu Leu Pro Asn Cys Arg 65 70 75 80

Pro Asp Vai Pro Gin Phe Ala Vai Lys His Pro Leu Gly Met Phe Trp 85 90 95

His Met Arg Vai Ser His Leu Ile Asp Glu Met Vai Ser Arg Arg Ile 100 105 110

Tyr Gin Thr Met Glu His Ser Gly Gin Ala Ala Trp Lys Gin Vai Vai 115 120 125

Gly Glu Ala Thr Leu Thr Lys Leu Ser Gly Leu Asp Ile Vai Thr His 130 135 140

Phe Gin His Leu Ala Ala Vai Glu Ala Asp Ser Cys Arg Phe Leu Ser 145 ISO 155 160

Ser Arg Leu Vai Met Leu Lys Asn Leu Ala Vai Gly Asn Vai Ser Leu 165 170 175

Gin Tyr Asn Thr Thr Leu Asp Arg Vai Glu Leu Ile Phe Pro Thr Pro 180 185 190

Gly Thr Arg Pro Lys Leu Thr Asp Phe Arg Gin Trp Leu Ile Ser Vai 195 200 205

His Ala Ser Ile Phe Ser Ser Vai Ala Ser Ser Vai Thr Leu Phe Ile 210 215 220

Vai Leu Trp Leu Arg Ile Pro Ala Leu Arg Tyr Vai Phe Gly Phe His 225 230 235 240

Trp Pro Thr Ala Thr His His Ser Ser 245 222 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 798 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Lelystad (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 795 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 74: 223 48 48 ATG GCT CAT CAG TGT GCA CGC TTC CAT TTT TTC CTC TGT GGC TTC ATC Met 1 Ala His Gin Cys 5 Ala Arg Phe His Phe 10 Phe Leu Cys Gly Phe 15 Ile TGT TAC CTT GTT CAT AGT GCT TTG GCT TCG AAT TCC AGC TCT ACG CTA Cys Tyr Leu Vai His 20 Ser Ala Leu Ala 25 Ser Asn Ser Ser Ser 30 Thr Leu TGT TTT T,GG TTT CCA TTG GCC CAC GGC AAC ACA TCA TTC GAG CTG ACC Cys Phe Trp 35 Phe Pro Leu Ala His Gly Asn 40 Thr Ser Phe 45 Glu Leu Thr ATC AAC TAC ACC ATA TGC ATG CCC TGT TCT ACC AGT CAA GCG GCT CGC Ile Asn 50 Tyr Thr Ile Cys Met 55 Pro Cys Ser Thr Ser 60 Gin Ala Ala Arg CAA AGG CTC GAG CCC GGT CGT AAC ATG TGG TGC AAA ATA GGG CAT GAC Gin 65 Arg Leu Glu Pro Gly 70 Arg Asn Met Trp Cys 75 Lys Ile Gly His Asp 80 AGG TGT GAG GAG CGT GAC CAT GAT GAG TTG TTA ATG TCC ATC CCG TCC Arg Cys Glu Glu Arg 85 Asp His Asp Glu Leu 90 Leu Met Ser Ile Pro 95 Ser GGG TAC GAC AAC CTC AAA CTT GAG GGT TAT TAT GCT TGG CTG GCT TTT Gly Tyr-Asp- Asn Leu 100 Lys Leu Glu Gly Tyr 105 Tyr Ala Trp Leu 110 Ala Phe TTG TCC TTT TCC TAC GCG GCC CAA TTC CAT CCG GAG TTG TTC GGG ATA Leu Ser Phe 115 Ser Tyr Ala Ala Gin Phe 120 His Pro Glu Leu 125 Phe Gly Ile GGG AAT GTG TCG CGC GTC TTC GTG GAC AAG CGA CAC CAG TTC ATT TGT Gly Asn Vai 130 Ser Arg Vai Phe 135 Vai Asp Lys Arg His 140 Gin Phe Ile Cys GCC GAG CAT GAT GGA CAC AAT TCA ACC GTA TCT ACC GGA CAC AAC ATC Ala 145 Glu His Asp Gly His 150 Asn Ser Thr Vai Ser 1SS Thr Gly His Asn Ile 160 TCC GCA TTA TAT GCG GCA TAT TAC CAC CAC CAA ATA GAC GGG GGC AAT Ser Ala Leu Tyr Ala 165 Ala Tyr Tyr His His 170 Gin Ile Asp Gly Gly 175 Asn TGG TTC CAT TTG GAA TGG CTG CGG CCA CTC TTT TCT TCC TGG CTG GTG Trp Phe His Leu Glu 180 Trp Leu Arg Pro 185 Leu Phe Ser Ser Trp 190 Leu Vai CTC AAC ATA TCA TGG TTT CTG AGG CGT TCG CCT GTA AGC CCT GTT TCT Leu Asn Ile 195 Ser Trp Phe Leu Arg Arg 200 Ser Pro Vai Ser 205 Pro Vai Ser CGA CGC ATC TAT CAG ATA TTG AGA CCA ACA CGA CCG CGG CTG CCG GTT Arg Arg 210 Ile Tyr Gin Ile Leu Arg Pro 215 Thr Arg Pro 220 Arg Leu Pro Vai TCA TGG TCC TTC AGG ACA TCA ATT GTT TCC GAC CTC ACG GGG TCT CAG Ser 225 Trp Ser Phe Arg Thr 23 0 Ser Ile Vai Ser Asp 235 Leu Thr Gly Ser Gin 240 CAG CGC AAG AGA AAA TTT CCT TCG GAA AGT CGT CCC AAT GTC GTG AAG Gin Arg Lys Arg Lys Phe Pro Ser Glu Ser Arg Pro Asn Vai Vai Lys 245 250 255 CCG TCG GTA CTC CCC AGT ACA TCA CGA TAA Pro Ser Vai Leu Pro Ser Thr Ser Arg 260 265 96 144 192 240 288 336 384 432 480 528 576 624 672 720 768 798 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 75: 224 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 265 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 75:

Stet Ale Bis Gia Cya Ala Arg Phe His Phe Phe leu Cys <31y Shs lie 1 5 10 15

Cys Ijt Leu Vai Bis Ser Ala Leu Ala Ser Asn Ser ser Ser flr Leu m as ao

Cys Phe Trp Pie Pio Lau Ala His sly asm Thr Ser Phe Glu Leu. Tfax 35 40 45

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Gin Arg Leu Stta Pro Gly Ar® Asa Met Trp Cys Lys ile Gly His Αβρ S5 70 75 60

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Gly Tyr Asp Asn Leu Lys Leu Glu Sly Tyr Tyx Ala Trp leu Ala Pite 100' 105 110

Leu Ser Phe Ser Tyr Ala. .Ala Gin Pis.® Mi® Pro Glu Leu Phe Sly Ile lis 120 125

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Ala Leu Tyr Ala Ala tft Tyr His His oln lie Asp Gly sly Asn. IBS 17 C '" 17É Típ phe Sis Leu Slu Trp Leu Arg ke Leu phe Ser Ser Tr» Ley Vai ISO IAS iSo

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Ar® Ar® Ile Tyr Glrs Ile Leu .Ar® Pro Thr Arg Pre Arg Leu Pro Vai 210 215 220

Ser Trp Ser Phe &rg Thr Ser Ile Vai ser Asp Leu Thr Oly Ser Gin 223 230 235 240

Gin Arg Lys Arg Lys Phe Pro Ser Glu Ser Arg Pro Asn Vai Vai Lys 245 250 255

Pro Ser Vai Leu Pro Ser Thr Ser Arg 260 265 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 76: 225 (i) CARACTERISTICAS DA SEQUENCIA: (A) COMPRIMENTO: 552 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: desconhecido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Lelystad (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 549 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 76: m<5 SCT GCG GCC ACT CTT TTC TTC CTG GCT <SBT GCT CftA CAT AVC AtG 48

Mefc Ala Ala Ala !te leu Phe Pfce l*e« Ala Gly Ma Gin His 11 e Mefe 1 5' 10 15 0$r Ter ocas fis: see ter a&g ooc tct ttc tca Am cat cm sta ss

Vai Ser Òlu Ala Ktie Ala Cys Lys Pro Cys Phe Ser Thr Mie Lee Ser ao 25 30 SAT OT GSfi ACC AAC ACG AOC GCS GCT GOC GGT 1Ϊ0 ATG ©FC CTT CAG 144 &sp Hs Glu Thr Asa. Tfar Thr Ala Ala Ala Sly Fí» MeC Vai Leu Gin

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Pfae teu Thr Pro Ser Ala Met; Arg Trp Ala Thr Thr lie Ala Cys Leu 165 170 175 S52 TTC GCC ATT OTO TTG GCA ATA ®3&

Phe Ala Xle Lee. fceu Ala lie ieo (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 77: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 183 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 77:

Mefc Ala Ala Ala. Thr leu Pte Pte Leu Ala ely Ala Gin Eis lia wet 1 I 1® 15

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Siis Ala He isee teu Alá óe 150

Lisboa, 28 de Outubro de 2008

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Preparação purificada caracterizada pelo facto de conter um ácido polinucleico seleccionado do QLA (quadro de leitura aberta) 2 de uma estirpe de Iowa do virus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino (VSRRP) de qualquer um dos VR 2385 (ISU-12) , VR 2429 (ISU-22), VR 2431 (ISU-3927), VR 2474 (ISU-79) e VR 2475 (ISU-1894) e as suas combinações.
2. Preparação purificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o referido ácido polinucleico ter uma sequência seleccionada nas fórmulas (I) e (II): (I) (II) 5'-α-β-γ-3' 5'-α-β-γ-δ-ε-3' nas quais: α codifica pelo menos um polipéptido codificado pelo QLA 2 de uma estirpe de Iowa de VSRRP; β representa uma ligação covalente ou um ácido polinucleico de ligação; Y representa pelo menos um cópia de um QLA 5 proveniente de uma estirpe de Iowa do VSRRP; δ representa uma ligação covalente; e ε codifica pelo menos um polipéptido codificado quer por um polinucleótido seleccionado entre um QLA 6 e um QLA 7 de uma estirpe de Iowa de VSRRP; e Y pode ter uma extremidade 3' que exclui a região de sobreposição com a extremidade 5' de um QLA 6 correspondente. 1
3. Preparação purificada, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo facto de o QLA 5 ser de um fenotipo de alta replicação (ar).
4. Preparação purificada, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo facto de ε representar um polinu-cleótido que codifica uma região antigénica do QLA 6.
5. Preparação purificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o referido ácido polinu-cleico representar os nucleótidos 12 a 782 da SEQ ID NO: 65.
6. Polipéptido purificado caracterizada pelo facto de ser codificado pelo ácido polinucleico de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 5.
7. Vacina caracterizada pelo facto de conter uma quantidade efectiva do polipéptido de acordo com a reivindicação 6 para provocar uma resposta imunológica num porco contra um vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino e um veículo aceitável sob o ponto de vista fisiológico.
8. Vacina caracterizada pelo facto de conter uma quantidade efectiva de um ácido polinucleico de acordo com a reivindicação 1 ou 2 para provocar uma resposta imunológica num porco contra um vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino e um veículo aceitável sob o ponto de vista fisiológico.
9. Vacina, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, em que o referido vírus causa uma doença caracterizada por um ou mais dos sintomas e sinais clínicos que se seguem: insuficiência respiratória, febre e um estado clínico 2 relacionado com a reprodução, numa porca, seleccionado no grupo que consiste em aborto, mortinascimento, leitões que nascem debilitados, formação de pneumócitos do tipo II, miocardite, encefalite, formação de exsudado alveolar e formação de sincicia.
10. Anticorpo monoclonal caracterizado pelo facto de se ligar especificamente ao polipéptido codificado pelo ácido po-linucleico de acordo com a reivindicação 1.
11. Kit de diagnóstico para se fazer o ensaio de um virus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino caracterizado pelo facto de compreender o anticorpo de acordo com a reivindicação 10 e um agente de diagnóstico que indica uma reacção imunológica positiva com o referido anticorpo .
12. Kit de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo ser um anticorpo monoclonal biotinilado e o referido agente de diagnóstico compreender estreptavidina conjugada com peroxidase e uma peroxidase.
13. Kit de diagnóstico de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de compreender ainda peróxido de hidrogénio aquoso, uma protease que digere a amostra de tecido porcino, um corante fluorescente e um corante de tecido.
14. Processo de diagnóstico de uma infecção de um porco por meio da exposição de uma vara de porcos a um vírus do síndroma reprodutivo e respiratório porcino, renunciando a processos de diagnóstico praticados no corpo do ani- 3 mal, sendo o referido processo caracterizado pelo facto de compreender as etapas de: incubação do anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 10, com uma amostra de tecido durante um periodo de tempo suficiente e a uma temperatura apropriada para providenciar a ocorrência de uma ligação imunológica praticamente completa entre o referido anticorpo monoclonal e um ou mais antigénios na referida amostra de tecido; incubação de um anticorpo de ligação biotinilado com uma amostra de tecido tratada com o anticorpo monoclonal; incubação de uma estreptavidina conjugada com peroxi-dase com o tecido tratado com o anticorpo biotinilado ; e detecção dos referidos antigénios virais.
15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de compreender ainda, antes das referidas etapas de incubação, as etapas sequenciais de eliminação da peroxidase endógena a partir de uma amostra isolada de tecido porcino com peróxido de hidrogénio aquoso, e a digestão da referida amostra de tecido com uma quantidade suficiente de uma protease apropriada para expor os referidos antigénios virais; e depois da referida segunda etapa de incubação, as etapas sequenciais de incubação do tecido tratado com estreptavidina conjugada com peroxidase com cromagénio e um corante e detecção dos referidos antigénios virais, em que a observação do tecido corado tratado com cromagénio é indicativa da presença dos referidos antigénios virais. 4 16. Processo ex vivo de produção de uma vacina que confere protecção imunológica contra uma inoculação subsequente com. um virus do sindroma reprodutivo e respiratório porcino, sendo o referido processo caracterizado por compreender as etapas de infecção de uma célula hospedeira apropriada com o ácido polinucleico de acordo com a reivindicação 1 e de cultura da referida célula hospedeira. 11. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de compreender ainda a etapa de isolamento de pelo menos uma das referidas células hospedeiras da cultura e um polipéptido codificado pelo referido ácido polinucleico.
18. Processo ex vivo de produção da vacina de acordo com a reivindicação 8, sendo o referido processo caracterizado pelo facto de compreender as etapas de infecção de uma célula hospedeira apropriada com pelo menos um dos referidos ácidos polinucleicos e um vírus contendo o referido ácido polinucleico, de cultura da referida célula hospedeira e de isolamento do referido ácido polinucleico a partir da referida célula hospedeira em -cultura.
19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de a referida etapa de infecção utilizar o referido vírus e a referida etapa de isolamento etapa compreender: (A) a colheita de uma amostra suficientemente grande do referido vírus para isolar o referido ácido polinucleico, 5 (Β) ο isolamento do referido ácido polinucleico a partir do referido virus colhido, e (C) a combinação do referido ácido polinucleico com o referido veículo aceitável sob o ponto de vista fisiológico.
20. Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de o referido vírus ou agente infeccioso ser colhido de uma fonte seleccionada de um meio de cultura, células infectadas com o referido vírus e tanto o meio de cultura como as células infectadas com o referido vírus.
21. Utilização de uma preparação de um ácido polinucleico de acordo com a reivindicação 1 ou com a reivindicação 2 ou um polipéptido de acordo com a reivindicação 6, caracte-rizada pelo facto de se destinar à produção de uma vacina para a protecção de um porco de uma infecção pelo vírus do síndroma reprodutivo é respiratório porcino.
22. Utilização de acordo com a reivindicação 21, caracteriza- da pelo facto de a vacina ser apropriada para administração oral ou parentérica.
23. Utilização de acordo com a reivindicação 21, caracte-rizada pelo facto de a vacina ser administrada intramuscularmente, intradermicamente, intravenosamente, intrape-ritonealmente, subcutaneamente ou intranasalmente. Lisboa, 28 de Outubro de 2008 6