TWI417385B - 以植物生產之豬生殖與呼吸道綜合症口服疫苗及其用途 - Google Patents

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以植物生產之豬生殖與呼吸道綜合症口服疫苗及其用途
本發明係關於新穎豬生殖與呼吸綜合症(PRRS)疫苗之製備，特別與以植物體製備該疾病疫苗之技術領域相關。
豬生殖與呼吸綜合症(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是近年來非常重要的豬病毒性疾病，造成歐美及世界各地嚴重的經濟損失。PRRS係為一種以母豬繁殖障礙及各年齡層豬隻呼吸道感染為主的豬隻傳染病，易併發二次性感染而死亡。而越年幼的豬其併發症越為嚴重，導致死亡率增加，因而造成經濟上很大的損失。
本病首先於1987年在美國大多數豬場爆發，因本病有時會造成豬隻四肢末端及耳朵的瘀血或發紫，故又稱為藍耳病(blue ear disease)。PRRS主要感染豬的肺臟而造成間質性肺炎，導致豬隻除了呼吸困難外，因肺及全身性的巨噬細胞及與單核球受感染破壞，因而導致豬的免疫功能缺損，因此易感染二次性病原如沙門桿菌、巴斯德桿菌或其他病毒性病原(Chiou et al.,2000)。
而在血清抗體陽性或肺臟及肺門淋巴結之病毒分離率發現，PRRSV已普遍感染國內豬場。本病之致病病毒，豬生殖與呼吸綜合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)，為一正向、單股、具有脂質封套的RNA病毒，可影響豬隻肺臟巨噬細胞的活性，使其偽足變短、減少或呈葉狀細胞破裂死亡，而肺臟巨噬細胞的吞噬和殺菌力亦明顯受到抑制(邱等，1998)。
近年報告顯示RNA活毒疫苗的病毒回變，已造成許多使用疫苗的豬場爆發疫情，顯示傳統的RNA活毒疫苗或許不可靠且有其危險性，以植物為基礎開發此病毒之多價次單位疫苗，為兼具經濟與方便之口服投與方式免疫的途徑，若能順利開發完成，將可降低豬生殖與呼吸道綜合症病毒之危害，並解除傳統疫苗在分裝、輸送、貯存、純化上的諸多顧慮。
因此，本發明係提供一種以植物生產之豬生殖與呼吸道綜合症(PPRS)口服疫苗及其用途，其特徵包含：一新穎之可大量表現PPRS ORF5之基因表現載體及其所含之新穎序列、以及藉由該載體及轉殖技術所產生之用以預防豬隻感染豬生殖與呼吸道綜合症(PPRS)之植物口服疫苗等用途。
另，本案之部分技術特徵，已公開於Veterinary Immunology and Immunopathology,2009年12月22日，其名稱為「Immunogenicity of recombinant GP5 protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus expressed in tobacco plant。」
本說明書中所述之所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。
本發明之目的即在於提供一種以植物生產之豬生殖與呼吸道綜合症(PPRS)口服疫苗。
本發明之次一目的係在於提供各種適用於植物生產豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)抗原之表現載體。
本發明之另一目的係在於提供該等可於植物體中表現豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)抗原之表現載體之用途，該用途包含以植物體生產病毒抗 原、轉殖基因植物、口服疫苗等。
可達成上述發明目的之種以植物生產之豬生殖與呼吸道綜合症(PPRS)口服疫苗及其用途，包括有：一種基因表現組合物(expression cassette)，包含：一啟動子；一編碼豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)ORF5胜肽之聚核苷酸；一NOS終結子；及一香蕉重泛素基因3’MAR之聚核苷酸，其具有如SEQ ID No：2之核苷酸序列；其中該編碼PRRSV ORF5胜肽之聚核苷酸的5’端係連接於該啟動子之3’端，而該編碼PRRSV ORF5胜肽之聚核苷酸的3’端係連接於該NOS終結子之5’端，該NOS終結子之3’端再與香蕉重泛素基因3’MAR之聚核苷酸的5’端連接之；該啟動子係可於一含有該基因表現組合物之生物體內，驅動下游編碼胜肽之聚核苷酸的轉錄作用(transcription)。
其中該編碼PRRSV ORF5胜肽之聚核苷酸，其3’端可進一步與一編碼內質網保留訊息(HDEL)胜肽之聚核苷酸的5’端連接之；該編碼HDEL胜肽之聚核苷酸的3’端係與前述之NOS終結子的5’端連接之，即可製得疫苗表現載體，如：本發明所提供之疫苗表現載體pGKU-35PRRSV、pGKU-79PRRSV。
其中該疫苗表現載體pGKU-35PRRSV、pGKU-79PRRSV可分別進一步包含一第二啟動子(與編碼PRRSV ORF5胜肽之聚核苷酸的5’端連接之啟動子，稱第一啟動子)、一編碼PPRSV ORF6胜肽之聚核苷酸、一第二NOS終結子；其中該第二啟動子之3’端係與該編碼PPRSV ORF6胜肽之聚核 苷酸的5’端連接之；該編碼PPRSV ORF6胜肽之聚核苷酸的3’端係與該第二NOS終結子的5’端連接之；即可製備一含有兩個或兩個以上啟動子之疫苗表現載體(如：本發明所提供之疫苗表現載體pGKU-5-6)，其中該等啟動子可為相同之啟動子或不同之啟動子。
其中該編碼PPRSV ORF5胜肽之聚核苷酸，其3’端可進一步與一編碼PPRSV ORF6胜肽之聚核苷酸的5’端連接之；該編碼PPRSV ORF6胜肽之聚核苷酸，其3’端可進一步與一編碼內質網保留訊息(HDEL)胜肽之聚核苷酸的5’端連接之；該編碼HDEL胜肽之聚核苷酸的3’端係與前述之NOS終結子的5’端連接之，即可製得疫苗表現載體，如：本發明所提供之疫苗表現載體pGKU-56Fusion。
其中該啟動子3’端可進一步與一編碼熱不穩定毒素B次單元(heat-labile toxin B subunit,LTB)胜肽之聚核苷酸的5’端連接之；其3’端係與一編碼L胜肽之聚核苷酸的5’端連接之；該編碼L胜肽之聚核苷酸的3’端係與前述之編碼PPRSV ORF5胜肽之聚核苷酸的5’端連接之；該編碼PPRSV ORF5胜肽之聚核苷酸的3’端係與一編碼內質網保留訊息(HDEL)胜肽之聚核苷酸的5’端連接之；該編碼HDEL胜肽之聚核苷酸的3’端係與前述之NOS終結子的5’端連接之，即可製得疫苗表現載體，如：本發明所提供之疫苗表現載體pLTB-L2-ORF5、pLTB-L4-ORF5及pLTB-L6-ORF5。
其中編碼PRRSV ORF5胜肽之聚核苷酸，其具有如SEQ ID No：1之核苷酸序列；該啟動子(第一啟動子或第二啟動子)包含但不限於：CaMV35S、香蕉重泛素基因啟動子，其具有如SEQ ID No：3之核苷酸序列、或其他可 於該生物體內表現目標基因之適用啟動子；該編碼HDEL胜肽之聚核苷酸，具有如SEQ ID No：4或SEQ ID No：5之核苷酸序列；該編碼LTB胜肽之聚核苷酸具有如SEQ ID No：6之核苷酸序列；該編碼L胜肽之聚核苷酸，其聚核苷酸序列係選自由SEQ ID No：7、SEQ ID No：8、SEQ ID No：9所組成群組中至少一者。
本發明亦提供藉由該等疫苗表現載體所表現出之重組融合蛋白，其包含：一熱不穩定毒素B次單元(heat-labile toxin B subunit,LTB)胜肽、一L胜肽、一豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)ORF5胜肽、一豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)ORF6胜肽及一內質網保留訊息(HDEL)胜肽。
其中該LTB胜肽係位於重組融合蛋白之N端；該L胜肽之N端係與LTB胜肽之C端連接之；該L胜肽之C端係與該PRRSV ORF5胜肽之N端連接之；該PRRSV ORF5胜肽之C端係與該HDEL胜肽之N端連接之；該HDEL胜肽係位於重組融合蛋白之C端。
其中該LTB胜肽具有如SEQ ID No：10之胺基酸序列；該L胜肽，其胺基酸序列係選自由SEQ ID No：11、SEQ ID No：12、SEQ ID No：13所組成群組中至少一者；該HDEL胜肽具有如SEQ ID No：14之胺基酸序列。
此外，本發明亦提供包含前述基因表現組合物之基因表現載體(vctor)，及利用該等基因表現組合物或其載體於基因轉殖方面之應用。該應用包含：一種以植物生產之豬生殖與呼吸道綜合症(PPRS)口服疫苗，及一種預防豬隻感染豬生殖與呼吸道綜合症(PPRS)之方法。
其中該口服疫苗之製備方法，包含：步驟1：構築一含前述基因表現組合物之基因表現轉殖載體(transfer vector)以得到一重組轉殖質體；步驟2：將步驟1之重組轉殖質體轉殖入植物細胞或組織，以得到一含有該重組轉殖質體之植物轉殖細胞或植物轉殖組織；步驟3：培養步驟2所得之植物轉殖細胞或植物轉殖組織，以產生含有前述基因表現組合物的轉殖植物或轉殖植物之部份器官、組織或細胞，其中該轉殖植物或轉殖植物之部份器官、組織或細胞即為直接供豬隻口服之疫苗。
其中該預防豬隻感染豬生殖與呼吸道綜合症(PPRS)之方法，包含：藉由轉殖該等基因表現載體於植物，以於植物體表現PRRSV ORF5或其他下述欲表現之蛋白，再將該等轉殖基因植株餵食豬隻，以使其對豬生殖與呼吸綜合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)產生抗體，以預防感染豬生殖與呼吸道綜合症(PPRS)。
進一步，本發明亦提供一種單離自香蕉重泛素基因(Mh-UBQ1 )的3’側區(3’Flanking region,3’MAR)之聚核苷酸序列，係具有如SEQ ID No：2之序列；該香蕉重泛素基因的GenBank accession number為AF502575(SEQ ID No：15)。基質結合區序列(matrix attachment region,MAR)為一段與細胞核基質具有專一性結合之DNA序列，其序列特性為富含AT鹼基且多半位於基因兩端的染色質邊緣區域。MAR與染色質之纏繞結構解開與否相關，因此推測MAR參與調控基因之表現(Gasser et al.,1989)。一般而言，MAR的存在有利於轉錄作用的進行，即表示此基因具有較高的表達量。
上述之核苷酸序列、胺基酸序列，包含但不限於：將本發明所提供之序列，經突變(mutation)、刪除(deletion)、插入(insertion)、或取代(replacement) 等習知方式，將1至複數個核苷酸或胺基酸改變，但仍適用本發明目的者。較佳者，其應至少具有80%的序列互補性(complementary)，或是至少90%的序列同一性(Identity)。
其中上述之基因轉殖表現載體，包括但不限於：pBI101、pBI121、pBIN 19(ClonTech)、pCAMBIA1301、pCAMBIA1305、pGREEN(GenBank Accession No：AJ007829)、pGREEN II(GenBank Accession No：EF590266)(www.pGreen.ac.uk)、pGreen0029(John Innes Centre)。
上述之轉殖基因的方式包括但不限於：農桿菌媒介法、基因重組病毒感染法、跳躍子載體轉殖法、基因槍轉殖法、電穿孔法、顯微注射法、花粉管法、脂質體媒介轉殖法、超音波媒介轉殖法、碳化矽纖維媒介轉殖法(silicon carbide fiber-mediated transformation)、電泳法(electrophoresis)、雷射微光束(laser microbeam)、聚乙烯二醇(polyethylene glycol,PEG)、磷酸鈣轉殖法、DEAE-dextran轉殖法等。
本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。
本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。本發明所用之藥物、生物材料皆市售易於取得。
實施例一 疫苗表現載體之構築 (一)材料及方法 A.質體材料
1.質體p35PGHT：全長8.1 kb，含有0.4 kb之CaMV 35S啟動子、GUS報導基因、NOS終結子及香蕉重泛素基因3’MAR。
2.質體p79PSGHT：全長9.1 kb，含有香蕉重泛素基因(Mh-UBQ1 )啟動子、GUS報導基因、NOS終結子及香蕉重泛素基因3’MAR。
3.質體pGKU：全長7.4 kb，含有left border和right border，以CaMV 35S啟動子分別驅動篩選基因nptII及報導基因GUS。
4.質體pBluescript II SK(-)：全長2.9 kb，具有multiple cloning site(MCS)。
其中質體pGKU及質體pBluescript II SK(-)皆為市售易於取得之質體；而質體p35PGHT及質體p79PSGHT則藉由下列構築策略以得： 請參閱台灣專利申請案(TW patent appl.No.097131520)。首先，籍由PCR及適用之引子對BMARR及BMARF，以選殖出香蕉重泛素基因(Mh-UBQ1 )的3’側區(3’Flanking region,3’MAR)之聚核苷酸片段，係具有如SEQ ID No：2之序列；該香蕉重泛素基因(Mh-UBQ1 )的GenBank accession number為AF502575(SEQ ID No：15)；該3’MAR係位於香蕉重泛素基因(Mh-UBQ1 )的3’端序列終止碼下游2968bp片段。將選殖出之3’MAR片段以EcoRI及SalI進行酶切後，構築於pMhUBQ1p-GUS(TW patent appl.No.097131520之中間質體)，以得到具有如圖一A所示之p35PGHT質體及如圖二A所示之p79PSGHT質體。其中該p35PGHT之啟動子為CaMY 35S啟動子；該p79PSGHT之啟動子為Mh-UBQ1 的啟動子，具有如SEQ ID No：3之聚核苷酸序列(TW patent appl.No.097131520)。
B.引子
本發明中所用之引子，如表一所示：
B.植物材料
本發明以菸草(Nicotiana tabacum L.cv Wisc.38)及北蕉(Musa spp .cv Pei-Chiao,AAA group)作為農桿菌基因轉殖之試驗材料，但任何適用於本發明之品種及轉殖方法皆包含於本發明可應用之範圍。
D.基因轉殖方法 菸草葉圓片之轉殖及篩選
本方法係修改自Horsch等(1985)，試驗材料為菸草(Nicotiana tabacum L.cv Wisc.38)。取無菌播種菸草植株之葉片，直接於農桿菌液下切取葉圓片 進行轉殖。葉圓片置於N01B1培養基上，於25℃、16小時光照環境下共培養三天。將葉圓片以含250 mg/L cefotaxime之N01B1清洗後，移置含250 mg/L cefotaxime及100 mg/L kanamycin之N01B1固體培養基上，於25℃、16小時光照環境下進行篩選約三星期。待葉圓片長出不定芽後，移至含有250 mg/L cefotaxime及200 mg/L kanamycin之N01B1固體培養基上，於25℃、16小時光照環境下進行次篩選培養。經篩選的不定芽分切後移入含有250 mg/L cefotaxime及200 mg/L kanamycin之N01固體培養基中，待其發根後可移出瓶，進行後續分析。
香蕉懸浮細胞之轉殖及篩選
本方法係依據林(1997)，香蕉懸浮培養細胞經自然沉降後，製備成50%(v/v)細胞液與農桿菌液均勻混合後，經共培養三天後將細胞移至含200 mg/L cefotaxime及50 mg/L G418之SHGC固體培養基上進行篩選，並待其發育為體胚。之後再將體胚移至發芽培養基於25℃、16小時光照環境下繼續篩選培養，待其發芽並成為植株後，進行後續分析。
(二)ORF5基因之構築
本發明欲表現PRRSV ORF所編碼之主要外套糖蛋白5(ORF5-encoded major envelop glycoprotein 5)於植物體內，進而將該等轉殖基因植物做為口服疫苗以餵食動物，以使其可產生對抗PRRSV之抗體，進而對抗PPRS。因此，進行下述構築：請參閱圖一A、圖一B、圖二A、圖二B所示，以豬生殖與呼吸道綜合症病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)之 ORF5基因片段作為模板，利用引子PRF和PRR進行PCR合成末端帶有內質網保留訊息HDEL片段之ORF5基因片段，以Nsi I酶切後以Klenow處理將3’端切平，再以Sac I酶切後回收0.6 kb之片段，接入經Nco I及Sac I酶切之載體p35PGHT及p79PSGHT，可得中間載體PRRSV-35PGHT及PRRSV-79PSGHT。中間載體PRRSV-35PGHT及PRRSV-79PSGHT經Pst I酶切後分別回收4.2 kb及5.2 kb片段，接入以Pst I酶切之pGKU，得到分別由CaMV 35S啟動子及香蕉重泛素基因(Mh-UBQ1 )啟動子驅動ORF5基因之疫苗表現載體pGKU-35PRRSV及pGKU-79PRRSV，且均具有含基質結合區之香蕉泛素基因3’端鄰近序列(Mh-UBQ1 flanking region,MAR)、報導基因GUS及NOS終結子。
(三)同時表現ORF5與ORF6基因之構築
請參閱圖三A至圖三B所示，以PRRSV ORF6基因作為模板，利用引子5ORF6和3ORF6進行PCR合成末端帶有內質網保留訊息HDEL片段之ORF6基因片段，以Nco I及Sac I酶切後回收0.5 kb之片段，接入經Nco I及Sac I酶切之載體p79PSGHT，可得中間載體ORF6-79PSGHT。中間載體ORF6-79PSGHT以Hin dIII及Eco RI酶切後接入載體pSK(-)中，於NOS終結子(T)後加上Pst I切位，且去除含基質結合區之香蕉泛素基因3’端鄰近序列(Mh-UBQ1 3’franking region)，即可得到中間載體P-ORF6-T；再以Pst I酶切後回收2.3 kb，與中間載體PRRSV-79PSGHT經Pst I酶切後回收之5.2 kb片段，同時接入以Pst I酶切之pGKU，即可得到分別由香蕉重泛素基因(Mh-UBQ1 )啟動子驅動ORF5及ORF6基因之疫苗表現載體pGKU-5-6(圖三C)。
請參閱圖三D所示，利用引子5ORF5Sc2和3ORF5N進行PCR，合成帶有Nco I切位之ORF5基因末段片段，經Nco I及Sac II酶切後回收50 bp片段，與經Hin dIII及Nco I酶切之中間載體ORF6-79PSGHT，及以Hin dIII及Sac II酶切pGKU-79PRRSV後所回收之0.7 kb片段進行三段接合反應，得到中間載體ORF56F-79PSGHT。請參閱圖三E所示，中間載體ORF56F-79PSGHT經Pst I酶切後回收5.7 kb片段，接入以Pst I酶切之pGKU，得到由香蕉重泛素基因(Mh-UBQ1 )啟動子驅動ORF5與ORF6融合基因之疫苗表現載體pGKU-56Fusion，且具有含基質結合區之香蕉泛素基因3’端鄰近序列、報導基因GUS及NOS終結子。
(四)表現ORF5與LTB融合基因之構築
請參閱圖四A至四B所示，以PCR方式將LTB基因及ORF5基因相接，並使二基因間具有甘胺酸(glycine,G)及脯胺酸(proline,P)。由於Apa I切位認定序列為gggCCC，轉譯之胺基酸為GP，故使用Apa I切位連接LTB與ORF5基因。利用引子5LTB和3LTB2合成帶有Bsp HI及Apa I切位之LTB基因片段，而利用引子5ORF52和PRR合成前端帶有GP(SEQ ID No：11)、末端帶有HDEL之ORF5基因片段。LTB基因片段以Bsp HI及Apa I酶切後回收0.4 kb之片段，與經Apa I及Sac I酶切後回收之ORF5基因片段，共同接入經Nco I及Sac I酶切之載體p79PSGHT，可得中間載體79LTB-L2-ORF5-PSGHT。之後中間載體79LTB-L2-ORF5-PSGHT經Pst I酶切後回收5.6 kb片段，接入以Pst I酶切之pGKU，得到由香蕉重泛素基因(Mh-UBQ1 )啟動子驅動LTB與ORF5融合基因之疫苗表現載體pLTB-L2-ORF5，且具有含基質結合區之香蕉泛素基因3’端鄰近序列、報導 基因GUS及NOS終結子；其中疫苗表現載體pLTB-L2-ORF5所含LTB-L2-ORF5核苷酸片段，具有如SEQ ID No：25之序列。
請參閱圖四C至四F所示，分別利用引子5ORF54和PRR、5ORF56和PRR合成前端帶有二重複GP(SEQ ID No：12)、三重複GP(SEQ ID No：13)，而末端帶有HDEL之ORF5基因片段。以上述之方式與LTB基因共同接入以Pst I酶切之pGKU，得到由香蕉重泛素基因(Mh-UBQ1 )啟動子驅動LTB與ORF5融合基因之疫苗表現載體pLTB-L4-ORF5及pLTB-L6-ORF5；其中疫苗表現載體pLTB-L4-ORF5所含LTB-L4-ORF5核苷酸片段，具有如SEQ ID No：26之序列；其中疫苗表現載體pLTB-L6-ORF5所含LTB-L6-ORF5核苷酸片段，具有如SEQ ID No：27之序列。
將前述製得之各疫苗表現載體分別於煙草、香蕉進行基因轉殖，以取得含有該些疫苗表現載體之基因轉殖植物。該基因轉殖方法可由該領域具有通常知識者，以習知技藝進行基因轉殖，亦可參閱台灣專利申請案(申請日：2008年12月26日、申請號：097150905)所揭露之方法。
實施例二 表現ORF5基因菸草轉殖植株之分析 (一)菸草轉殖植株之分子驗證
經抗生素篩選得到之菸草擬轉殖植株，其GUS活性組織化學染色分析結果呈現藍色正反應。抽取擬轉殖植株葉片之基因組DNA，以適用之引子進行PCR。PCR結果顯示，可於pGKU-35PRRSV擬轉殖植株(圖五A)及pGKU-79PRRSV擬轉殖植株(圖五B)中偵測到預期之合成片段；而南方氏雜交分析結果亦有預期之訊號片段，其中圖五C為pGKU-35PRRSV擬轉殖 植株分析結果、圖五D為pGKU-79PRRSV擬轉殖植株分析結果。
(二)菸草轉殖植株之基因表現分析
抽取表現PRRSV ORF5基因之菸草轉殖株葉片總量RNA，並於PRRSV ORF5基因片段5’端及3’端設計專一性序列作為引子，進行反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)，請參閱圖六A所示，第1道(lane)至第5道為pGKU-35PRRSV擬轉殖植株、第6道為pGKU-79PRRSV擬轉殖植株，皆有預期長度之0.6 kb片段合成；請參閱圖六B所示，第1道(lane)至第6道為pGKU-35PRRSV擬轉殖植株皆有預期長度之0.6 kb片段合成。
(三)菸草轉殖植株之PRRSV之GP5(ORF5-encoded major envelop glycoprotein 5)蛋白表現及定量分析
抽取表現PRRSV ORF5基因之菸草轉殖株葉片蛋白，經10%之十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺膠體電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)後轉漬於膜上，以相對應於PRRSV之專一性抗體(anti-PRRSV rabbit serum)進行免疫轉漬分析；結果顯示，無論於pGKU-35PRRSV轉殖植株(1,2,3,4,5)、或pGKU-79PRRSV(6)(如圖七A所示)、或pGKU-35PRRSV轉殖植株(1,2,3,6)(如圖七B所示)皆可偵測到GP5之表達。而以酵素連結免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)進行轉殖菸草之表現抗原定量分析；以適量大腸桿菌表達之GP5重組蛋白作為定量標準，各pGKU-35PRRSV(1,2,3,4,5,6)轉殖菸草之ELISA測量結果，如圖八A所示，將之定量後，pGKU-35PRRSV轉殖菸草所表達之GP5蛋白量約為112 ng/mg TSP(total soluble protein)，佔總水溶性蛋白之0.01%(如圖八B所示)。
(四)轉殖菸草於豬隻之口服免疫測試結果
剪取pGKU-35PRRSV轉殖菸草植株(GP5-T組)葉片或未轉殖菸草植株(WT)葉片50g分別餵食仔豬，共餵食四次(第0天、第14天、第28天、及第42天)，每次間隔兩周，並分別於第-1、6、13、20、27、34、41、48天收集血清、唾液樣本、及周邊血液單核球細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)以進行免疫能力之分析；其中係分別測定樣本中抗PRRSV之總IgG、總IgA量，及對PRRSV之特異性淋巴球增殖反應(PRRSV-specific lymphocyte blastogenic response)。該淋巴球增殖反應係以每分鐘之計量變化(difference in counts per minute,DCPM)代表之。
結果顯示，經餵食GP5-T(試驗組)或WT葉片(對照組)後，並無仔豬出現呼吸的或其他臨床徵兆，此即證實服用轉殖菸草植株或未轉殖菸草植株對於仔豬無安全之虞。將前述各時間點所收集之PBMC，將之以104 TCID50 PRRSV病毒株MD-001進行刺激。經72小時之刺激後，將[3 H]-thymidine加入其中，待培養18小時後即可測量每分鐘計量值(counts per minute,CPM)，進而計算DCPM。請參閱圖九A所示，專一對PRRSV所產生之淋巴球增殖反應最早可於第13天(經第1天GP5-T葉片之口服接種後)即可觀察到，並隨著第2次至第4次GP5-T葉片口服接種，該淋巴球增殖反應(DCPM)亦隨之明顯增加(P <0.05)。
另，請參閱圖九B所示，係為前述各時間點所收集之血清中對抗PRRSV GP5之IgG抗體的量。於第-1天及第13天(days post-initial oral vaccination, DPIOV)期間，該對抗PRRSV GP5之IgG抗體的量無明顯變化。然而，於第20天後(距第2次口服接種後6天)可觀察到餵食GP5-T葉片之豬隻，其對抗PRRSV GP5之IgG抗體明顯增加。隨著第第2次至第4次GP5-T葉片口服接種，該對抗PRRSV GP5之總IgG抗體量亦隨之逐漸增加。
請參閱圖九C所示，最早可於第20天後(DPIOV)可觀察到餵食GP5-T葉片之豬隻，其對抗PRRSV GP5之IgA抗體明顯增加。隨著第第2次至第4次GP5-T葉片口服接種，該對抗PRRSV GP5之總IgA抗體量亦隨之逐漸增加。
上述結果顯示，口服餵食(接種)可表現PRRSV GP5蛋白之轉殖植株予豬隻，可使其產生可對抗PRRSV之免疫反應，進而避免感染PRRS。
實施例三 表現ORF5基因香蕉轉殖植株之分析 (一)香蕉轉殖植株之染色分析
將實施例一中所製得之pGKU-35PRRSV、pGKU-79PRRSV質體轉殖入香蕉，如：北蕉(Pei Chiao)，並以GUS活性組織化學染色檢測該香蕉轉殖植株各部位以分析該是否香蕉轉殖植株表現PRRSV GP5蛋白。請參閱圖十A至圖十D，結果顯示，圖十A為對照組之根部；圖十B為pGKU-79PRRSV轉殖香蕉植株幼苗之根部；圖十C及圖十D分別代表pGKU-35PRRSV轉殖香蕉植株幼苗之根部及葉片；分別可於根部及葉片呈現藍色正反應。
(二)香蕉轉殖植株之分子驗證
另，抽取表現PRRSV ORF5基因之香蕉轉殖株基因組DNA，並於PRRSV ORF5基因片段5’端及3’端設計專一性序列作為引子，進行聚合酶連鎖反應。請參閱圖十一A為pGKU-35PRRSV香蕉轉殖植株之聚合酶連鎖反應分析結果，結果顯示，香蕉擬轉殖植株(1、2、3、4、5、6)皆有預期長度之0.6 kb片段被合成；請參閱圖十一B為pGKU-79PRRSV香蕉轉殖植株之聚合酶連鎖反應分析結果，結果顯示，香蕉擬轉殖植株(2、3、4)皆有預期長度之0.6 kb片段被合成，證實轉殖基因已確實插入植株基因組內。且南方氏雜交分析結果亦有預期之訊號片段(圖十二)。
(三)香蕉轉殖植株之基因表現分析
抽取香蕉轉殖植株pGKU-35PRRSV(1,2,3,4,5)之葉片總量RNA，並於PRRSV ORF5基因片段5’端及3’端設計專一性序列作為引子，進行反轉錄聚合酶連鎖反應，皆顯示有預期長度之0.6 kb片段合成(圖十三)。
(四)香蕉轉殖植株之PRRSV之GP5(ORF5-encoded major envelop glycoprotein 5)蛋白表現及定量分析
抽取香蕉轉殖植株pGKU-35PRRSV(1,2,3,4,5)之葉片蛋白，經10%之SDS-PAGE後轉漬於膜上，以相對應於PRRSV之專一性抗體進行免疫轉漬分析，亦可偵測到GP5之表達(圖十四)。而以ELISA進行轉殖香蕉之表現抗原定量分析，以適量大腸桿菌表達之GP5重組蛋白作為定量標準，各pGKU-35PRRSV(1,2,3,4,5,6)轉殖香蕉之ELISA測量結果，如圖十五A所示，將之定量後，pGKU-35PRRSV轉殖香蕉所表達之GP5蛋白量約 為285ng/mg TSP，約佔總水溶性蛋白之0.03%(圖十五B)。
(五)轉殖香蕉於豬隻之口服免疫測試結果
以MTS(Promega)方法檢測PRRSV特異性淋巴細胞增值反應。實驗中分別於第0、14、28天時以口服方式，將pGKU-35PRRSV轉殖香蕉植株(GP5-B)、或未轉殖香蕉植株(WT)葉片，給予5-6週齡豬隻(無豬生殖與呼吸綜合症病毒感染，PRRSV-free)，同時由第7天開始，每隔14天採集血液、唾液樣本，之後再以MTS方式檢測周邊血液單核球(PBMC)內特異性T cell的表現能力。檢測方式如下，以三重複的方式於96 wells平底盤內加入100 ul PBMCs(2x105 cells/well)，並以100 ul、104 TCTD50 PRRSV進行刺激，於37℃、5% CO2 下培養三天後，加入20 ul檢測試劑並於OD 490 nm下判讀其數值。Stimulation Index(SI)=有PRRSV刺激下所得之平均吸光值/無PRRSV刺激下所得之平均吸光值。
請參閱圖十六所示，結果顯示於第21天即可觀察到餵食GP5-B葉片之豬隻，其對抗PRRSV GP5之IgG抗體明顯增加。隨著第第2次至第3次GP5-B葉片口服接種，該對抗PRRSV GP5之總IgG抗體量亦隨之逐漸增加。將前述各時間點所收集之PBMC，將之以104 TCID50 PRRSV病毒株MD-001進行刺激。經72小時之刺激後，將MTS加入其中，並測量其吸光值(OD value)。請參閱圖十七所示，專一對PRRSV所產生之淋巴球增殖反應最早可於第21天(經第1次GP5-B葉片之口服接種後)即可觀察到，並隨著第2次至第3次GP5-B葉片口服接種，該淋巴球增殖反應亦隨之明顯增加(P <0.05)。
綜上所述，表現ORF5基因之轉殖菸草、香蕉經餵食豬隻後，可於豬隻血清及唾液內偵測到相對應之IgG及IgA產生。為進一步提高抗體產生效價及病毒中和能力，本發明亦進行新一批疫苗表現載體之構築。
新疫苗表現載體之特性
腸毒性大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichia coli ,ETEC)熱不穩定毒素B次單元(heat-labile toxin B subunit,LTB)為一五環狀結構之蛋白，因其可與小腸黏膜細胞結合，故可幫助抗原進入並進一步誘發腸道免疫反應，所以常被作為佐劑(adjuvant)使用。此外，研究指出PRRSV ORF6會利用半胱胺酸(cysteine)與ORF5形成異型雙元體(heterodimer)，若同時表現ORF5及ORF6，則產生之相對應抗體具有較佳的病毒中和能力(Jiang et al.,2006)。
因此，本發明係藉由LTB及ORF6之特性，選殖出LTB基因及ORF6基因，所得到之選殖系經序列比對，與NCBI資料庫之LTB基因(Accession No.M17873)及文獻相符(Chueh and Lee,2001)，將之構築於新一批之疫苗表現載體(請參閱實施例一(四)表現ORF5與LTB融合基因之構築)，並於實施例四及實施例五分別進行基因表現、分子驗證、免疫能力等分析。
實施例四 同時表現ORF5及ORF6基因之菸草轉殖植株之分析 (一)菸草轉殖植株之分子驗證
抗生素篩選得到之菸草擬轉殖植株，剪取其葉片進行GUS活性組織化學染色呈藍色正反應。進一步抽取下列植株之基因組DNA：1.表現ORF5 與ORF6融合基因之轉殖菸草(pGKU-56Fusion)，2.同時表現ORF5與ORF6融合基因之轉殖菸草(pGKU-5-6))；分別以ORF5及ORF6基因片段作為探針，其南方氏雜交分析結果皆有預期之訊號片段(分別如圖十八A、十八B、十九A、十九B所示)。其中圖十八A係以ORF5基因為探針(0.6 kb)之菸草轉殖質體pGKU-56Fusion轉殖植株之南方氏雜交分析結果；圖十八B係以ORF6基因為探針(0.5 kb)之菸草轉殖質體pGKU-56Fusion轉殖植株之南方氏雜交分析結果；圖十九A係以ORF5基因為探針(0.6 kb)之菸草轉殖質體pGKU-5-6轉殖植株之南方氏雜交分析結果；圖十九B係以ORF6基因為探針(0.5 kb)之菸草轉殖質體pGKU-5-6轉殖植株之南方氏雜交分析結果。
(二)菸草轉殖植株之基因表現分析
抽取菸草pGKU-56Fusion轉殖植株葉片總量RNA，並以ORF5及ORF6基因專一性引子進行反轉錄聚合酶連鎖反應以確認目標基因正常表現，可合成預期之1.1 kb片段(第1,2,3,4,7道)(圖二十A)；抽取菸草pGKU-5-6轉殖植株葉片總量RNA，分別以ORF5及ORF6基因之專一性引子進行反轉錄聚合酶連鎖反應均可合成預期長度之0.6及0.5 kb片段(圖二十B、圖二十C)。
實施例五 表現表現ORF5與LTB融合基因之菸草轉殖植株之分析 (一)菸草轉殖植株之分子驗證
請參閱圖二十一A至二十一C所示，將表現LTB與ORF5融合基因之 擬轉殖菸草之基因組DNA，以LTB及ORF5基因之專一性引子進行聚合酶連鎖反應。PCR結果顯示，可於表現LTB與ORF5融合基因之擬轉殖植株中偵測到預期之合成片段(1 kb)；其中圖二十一A為pLTB-L2-ORF5擬轉殖植株之PCR分析結果；其中圖二十一B為pLTB-L4-ORF5擬轉殖植株之PCR分析結果；其中圖二十一C為pLTB-L6-ORF5擬轉殖植株之PCR分析結果。
另，請參閱圖二十二A至二十二B所示，分別以LTB及ORF5基因片段作為探針，其南方氏雜交分析結果亦有預期之訊號片段；其中圖二十二A為pLTB-L6-ORF5擬轉殖植株以ORF基因為探針(0.6 kb)之南方氏雜交分析結果；其中圖二十二B為pLTB-L6-ORF5擬轉殖植株以LTB基因為探針(0.4 kb)之南方氏雜交分析結果。
(二)菸草轉殖植株之基因表現分析
請參閱圖二十三A至二十三C所示，分別抽取菸草pLTB-L2-ORF5(具編碼一重複甘胺酸及脯胺酸之聚核苷酸序列，簡稱編碼L胜肽之聚核苷酸序列)、pLTB-L4-ORF5(具編碼二重複甘胺酸及脯胺酸之聚核苷酸序列)、pLTB-L6-ORF5(具編碼三重複甘胺酸及脯胺酸之聚核苷酸序列)轉殖植株葉片總量RNA，並分別以LTB及ORF5基因專一性引子進行反轉錄聚合酶連鎖反應以確認目標基因正常表現，均可合成預期長度之1 kb片段(圖二十三A至二十三C)。
(三)菸草轉殖植株之PRRSV之GP5(ORF5-encoded major envelop glycoprotein 5)蛋白表現及定量分析
請參閱圖二十四A至二十四B所示，抽取表現LTB與ORF5融合基因之菸草轉殖株(pGKU-35PRRSV(ORF5)、pLTB-L2-ORF5(LTB-ORF5))葉片蛋白，以ELISA進行轉殖菸草之表現抗原定量分析，抗體為：anti-GP5單株抗體(圖二十四A)，使用大腸桿菌所表達之GP5重組蛋白作為定量標準，經定量後，轉殖菸草pLTB-L2-ORF5轉殖株所表達之GP5蛋白量為155 ng/mg TSP(total soluble protein)，佔總水溶性蛋白之0.015%(圖二十四B)。
(四)轉殖菸草於豬隻之口服免疫測試結果
剪取轉殖菸草植株葉片50g餵食仔豬，共餵食三次，每次間隔兩周。請參閱圖二十五A所示，實驗中分別於第0、14、28天時以口服方式，將50 g PRRSV-ORF5基因轉殖菸草(pGKU-PRRSV-ORF5-LTB、pGKU-PRRSV-ORF5)分別給予八週齡無豬生殖與呼吸綜合症病毒感染的豬隻(n=4)，同時由第七天開始，每隔十四天以EDTA抗凝管採集血液，之後再以blastogenesis方式檢測周邊血液單核球(PBMC)內特異性淋巴求的增殖能力(CPM)(檢測樣本之收集，如實施例二所述者)。結果顯示，相較於W-T(對照組)，無論是pGKU-PRRSV-ORF5-LTB或pGKU-PRRSV-ORF5轉殖菸草皆可於第一次口服接種後，約第3週可觀察到對PRRSV之特異性淋巴球增殖反應(CPM)明顯增加，且隨著第2次至第3次口服接種，該淋巴球增殖反應亦隨之明顯增加。
另，請參閱圖二十五B及圖二十五C所示，分別於第0、14、28天時 以口服方式，將50 g基因轉殖菸草(pGKU-PRRSV-ORF5-LTB、pGKU-PRRSV-ORF5)分別給予八週齡無豬生殖與呼吸綜合症病毒感染的豬隻(n=4)，同時由第七天開始，每隔十四天採集血液一次，之後再以ELISA方式檢測唾液內PRRSV特異性抗體(IgA)及特異性抗體(IgG)的力價。結果顯示，相較於W-T(對照組)，無論是pGKU-PRRSV-ORF5-LTB或pGKU-PRRSV-ORF5轉殖菸草皆可於第一次口服接種後，約第3週可觀察到對PRRSV之特異性抗體(IgA)量、特異性抗體(IgG)量明顯增加，且隨著第2次至第3次口服接種，該特異性抗體(IgA)量、特異性抗體(IgG)量亦隨之明顯增加。
本發明所提供之以植物生產之豬生殖與呼吸道綜合症口服疫苗及其用途，與其他習用技術相互比較時，更具有下列之優點：
1.本發明所提供之疫苗表現載體，除可於植物體內表現抗原外，且藉由轉殖基因技術可產生含其之基因轉殖植物，即可做為一口服疫苗。
2.本發明所提供之口服疫苗，相較於傳統製備者，除可避免活毒疫苗安全性的問題、亦可解除傳統製備疫苗上在分裝、輸送、貯存、純化上的諸多顧慮。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。
綜上所述，本案所揭露之技術特徵已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請 貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。
圖一A為中間載體PRRSV-35PGHT之構築策略圖，其中p35PGHT係經Nco I酶切後再以Sac I進行部分酶切；圖一B為疫苗表現載體pGKU-35PRRSV之構築策略圖。
圖二A為中間載體PRRSV-79PSGHT之構築策略圖，其中p79PSGHT係經Nco I酶切後再以Sac I進行部分酶切；圖二B為疫苗表現載體pGKU-79PRRSV之構築策略圖。
圖三A為中間載體ORF6-79PSGHT之構築策略圖，其中p79PSGHT係經Nco I酶切後再以Sac I進行部分酶切；圖三B為中間載體中間載體P-ORF6-T之構築策略圖；圖三C為疫苗表現載體pGKU-5-6之構築策略圖；圖三D為中間載體ORF56F-79PSGHT之構築策略圖；圖三E為疫苗表現載體pGKU-56Fusion之構築策略圖。
圖四A為中間載體79LTB-L2-ORF5-PSGHT之構築策略圖，其中p79PSGHT係經Sac I部分酶切後再以Nco I酶切；圖四B為疫苗表現載體pLTB-L2-ORF5之構築策略圖；圖四C為中間載體79LTB-L4-ORF5-PSGHT之構築策略圖，其中p79PSGHT係經Sac I部分酶切後再以Nco I酶切；圖四D為疫苗表現載體pLTB-L4-ORF5之構築策略圖；圖四E為中間載體79LTB-L6-ORF5-PSGHT之構築策略圖，其中p79PSGHT係經Sac I部分酶切後再以Nco I酶切；圖四F為疫苗表現載體pLTB-L6-ORF5之構築策略圖。
圖五A為轉殖疫苗表現載體pGKU-35PRRSV之菸草擬轉殖植株(1、2、3)之PCR分析結果，其中P為疫苗表現載體pGKU-35PRRSV之PCR分析結果；圖五B為轉殖疫苗表現載體pGKU-79PRRSV之菸草擬轉殖植株(1、 2)之PCR分析結果，其中P為疫苗表現載體pGKU-79PRRSV之PCR分析結果；圖五C為轉殖疫苗表現載體pGKU-35PRRSV之菸草擬轉殖植株(1、2、3、4、5、6)之南方氏雜交分析結果，其中P為疫苗表現載體pGKU-35PRRSV之南方氏雜交分析結果、WT表示未轉殖植株；圖五D為轉殖疫苗表現載體pGKU-79PRRSV之菸草擬轉殖植株(1、2)之南方氏雜交分析結果，其中P為疫苗表現載體pGKU-79PRRSV之南方氏雜交分析結果、WT表示未轉殖植株。
圖六A為PRRSV ORF5於菸草轉殖植株(pGKU-35PRRSV(1、2、3、4、5)、pGKU-79PRRSV(6))之RT-PCR分析結果；圖六B為PRRSV ORF5於菸草轉殖植株(pGKU-35PRRSV(1、2、3、4、5、6))之RT-PCR分析結果。
圖七A為PRRSV ORF5於菸草轉殖植株pGKU-35PRRSV轉殖植株(1、2、3、4、5)、或pGKU-79PRRSV(6)之免疫轉漬分析(Immunoblot analysis)結果；其中WT表示未轉殖植株；E.coli 表達之重組蛋白做為一陽性對照組，其大小約為42 kD；圖七B為PRRSV ORF5於菸草轉殖植株pGKU-35PRRSV轉殖植株(1、2、3、4、5、6)之免疫轉漬分析(Immunoblot analysis)結果。
圖八A為pGKU-35PRRSV菸草轉殖植株(1,2,3,4,5,6)之ELISA結果，其中WT為未轉殖植株；圖八B為圖八A定量後之結果，其中*表示具統計顯著意義(P <0.05)，WT為未轉殖植株。
圖九A為以pGKU-35PRRSV轉殖菸草植株(GP5-T組)餵食豬隻後，進行淋巴球增殖反應(DCPM)分析之結果；圖九B為以pGKU-35PRRSV轉殖菸草植株(GP5-T組)餵食豬隻後，於各時間點偵測IgG抗體量之結果；圖九 C為以pGKU-35PRRSV轉殖菸草植株(GP5-T組)餵食豬隻後，於各時間點偵測IgA抗體量之結果。
圖十A至圖十D分別為香蕉轉殖植株不同部位之GUS活性組織化學染色分析結果。
圖十一A為轉殖疫苗表現載體pGKU-35PRRSV之香蕉擬轉殖植株(1、2、3、4、5)之PCR分析結果，其中P為疫苗表現載體pGKU-35PRRSV之PCR分析結果；圖十一B為轉殖疫苗表現載體pGKU-79PRRSV之香蕉擬轉殖植株(1、2、3、4)之PCR分析結果，其中P為疫苗表現載體pGKU-79PRRSV之PCR分析結果。
圖十二為轉殖疫苗表現載體pGKU-35PRRSV之香蕉擬轉殖植株(1、2、3、4、5)之南方氏雜交分析結果，其中P為疫苗表現載體pGKU-35PRRSV之南方氏雜交分析結果、WT表示未轉殖植株。
圖十三A為PRRSV ORF5於香蕉轉殖植株(pGKU-35PRRSV(1、2、3、4、5))之RT-PCR分析結果。
圖十四為PRRSV ORF5於香蕉轉殖植株pGKU-35PRRSV轉殖植株(1、2、3、4、5)之免疫轉漬分析(Immunoblot analysis)結果；其中WT表示未轉殖植株；E.coli 表達之重組蛋白做為一陽性對照組。
圖十五A為pGKU-35PRRSV香蕉轉殖植株(1,2,3,4,5)之PRRSV ORF5(GP5)抗原表現的ELISA結果，其中WT為未轉殖植株；圖十五B為圖十五A定量後之結果，其中*表示具統計顯著意義(P <0.05)，WT為未轉殖植株。
圖十六為圖九B為以pGKU-35PRRSV轉殖香蕉植株(GP5-B組)餵食豬 隻後，於各時間點偵測IgG抗體量之結果。
圖十七為以pGKU-35PRRSV轉殖香蕉植株(GP5-B組)餵食豬隻後，進行淋巴球增殖反應(DCPM)分析之結果。
圖十八A為以ORF5基因為探針之疫苗表現載體體pGKU-56Fusion菸草擬轉殖植株(1至7)之南方氏雜交分析結果；圖十八B為以ORF6基因為探針之疫苗表現載體體pGKU-56Fusion菸草擬轉殖植株(1至7)之南方氏雜交分析結果，其中P為pGKU-56Fusion之南方氏雜交分析結果、WT為未轉殖植株。
圖十九A為以ORF5基因為探針之疫苗表現載體體pGKU-5-6菸草擬轉殖植株(1至5)之南方氏雜交分析結果；圖十九B為以ORF6基因為探針之疫苗表現載體體pGKU-5-6菸草擬轉殖植株(1至5)之南方氏雜交分析結果，其中P為pGKU-5-6之南方氏雜交分析結果、WT為未轉殖植株。
圖二十A為PRRSV ORF5-ORF6融合基因於菸草轉殖植株(pGKU-56Fusion(1至7))之RT-PCR分析結果；圖二十B為菸草轉殖植株(pGKU-5-6(1至5))之RT-PCR分析結果，其中係以ORF5基因之專一性引子進行RT-PCR；圖二十C為菸草轉殖植株(pGKU-5-6(1至5))之RT-PCR分析結果，其中係以ORF6基因之專一性引子進行RT-PCR。
圖二十一A為轉殖疫苗表現載體pLTB-L2-ORF5之菸草擬轉殖植株(1至4)之PCR分析結果，其中P為疫苗表現載體pLTB-L2-ORF5之PCR分析結果、WT為未轉殖植株；圖二十一B為轉殖疫苗表現載體pLTB-L4-ORF5之菸草擬轉殖植株(1至4)之PCR分析結果，其中P為疫苗表現載體pLTB-L4-ORF5之PCR分析結果、WT為未轉殖植株；圖二十一C為轉殖 疫苗表現載體pLTB-L6-ORF5之菸草擬轉殖植株(1至8)之PCR分析結果，其中P為疫苗表現載體pLTB-L6-ORF5之PCR分析結果、WT為未轉殖植株。
圖二十二A為轉殖疫苗表現載體pLTB-L6-ORF5之菸草擬轉殖植株(1至8)以ORF基因為探針(0.6 kb)之南方氏雜交分析結果，其中P為疫苗表現載體pLTB-L6-ORF5之南方氏雜交分析結果、WT表示未轉殖植株；圖二十二B為轉殖疫苗表現載體pLTB-L6-ORF5之菸草擬轉殖植株(1至8)以LTB基因為探針(0.4 kb)之南方氏雜交分析結果，其中P為疫苗表現載體pLTB-L6-ORF5之南方氏雜交分析結果、WT表示未轉殖植株。
圖二十三A為pLTB-L2-ORF5於菸草轉殖植株(1至4)之RT-PCR分析結果；圖二十三B為pLTB-L4-ORF5於菸草轉殖植株(1至4)之RT-PCR分析結果；圖二十三C為pLTB-L6-ORF5於菸草轉殖植株(1至4)之RT-PCR分析結果。
圖二十四A為菸草轉殖株(pGKU-35PRRSV(ORF5)、pLTB-L2-ORF5(LTB-ORF5))之PRRSV ORF5(GP5)抗原表現的ELISA結果，其中WT為未轉殖植株；圖二十四B為圖二十四A定量後之結果。
圖二十五A為分別以pGKU-PRRSV-ORF5-LTB、pGKU-PRRSV-ORF5轉殖菸草植株餵食豬隻後，進行淋巴球增殖反應(CPM)分析之結果；圖二十五B為分別以pGKU-PRRSV-ORF5-LTB、pGKU-PRRSV-ORF5轉殖菸草植株餵食豬隻後，於各時間點偵測IgA抗體量之結果；圖二十五B為分別以pGKU-PRRSV-ORF5-LTB、pGKU-PRRSV-ORF5轉殖菸草植株餵食豬隻後，於各時間點偵測IgG抗體量之結果；其中W-T為未轉殖植株。
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<212> DNA
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<400> 1
<210> 2
<211> 2968
<212> DNA
<213> 香蕉(Musa spp.cv.Hsien Jin Chiao(AAA group))
<400> 2
<210> 3
<211> 3093
<212> DNA
<213> 香蕉(Musa spp.cv.Hsien Jin Chiao(AAA group))
<400> 3
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成之HDEL胜肽的核苷酸序列
<400> 4
<210> 5
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成之HDEL胜肽的核苷酸序列
<400> 5
<210> 6
<211> 375
<212> DNA
<213> 腸毒性大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichia coli )
<220>
<223> 熱不穩定毒素B次單元(heat-labile toxin B subunit)之核苷酸序列
<400> 6
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成之L胜肽的核苷酸序列
<400> 7
<210> 8
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成之L胜肽的核苷酸序列
<400> 8
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成之L胜肽的核苷酸序列
<400> 9
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<212> PRT
<213> 腸毒性大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichia coli )
<220>
<223> LTB胜肽的胺基酸序列
<400> 10
<210> 11
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L胜肽的胺基酸序列
<400> 11
<210> 12
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L胜肽的胺基酸序列
<400> 12
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L胜肽的胺基酸序列
<400> 6
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 正向引子
<400> 16
<210> 17
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引子
<400> 17
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引子
<400> 18
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引子
<400> 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引子
<400> 20
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引子
<400> 21
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引子
<400> 22
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引子
<400> 23
<210> 24
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引子
<400> 24
<210> 25
<211> 993
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LTB-L2-ORF5融合胜肽之核苷酸序列
<400> 25
<210> 26
<211> 999
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LTB-L4-ORF5融合胜肽之核苷酸序列
<400> 26
<210> 27
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LTB-L6-ORF5融合胜肽之核苷酸序列
<400> 27
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引子
<400> 28
<210> 29
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引子
<400> 29

Claims (1)

  1. 一種重組融合蛋白，包含：一熱不穩定毒素B次單元(heat-labile toxin B subunit,LTB)胜肽、一L胜肽、一豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)ORF5胜肽、一豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)ORF6胜肽及一內質網保留訊息(HDEL)胜肽；其中該LTB胜肽係位於重組融合蛋白之N端；該L胜肽之N端係與LTB胜肽之C端連接之；該L胜肽之C端係與該PRRSV ORF5胜肽之N端連接之；該PRRSV ORF5胜肽之C端係與該HDEL胜肽之N端連接之；該HDEL胜肽係位於重組融合蛋白之C端；其中該LTB胜肽具有如SEQ ID No：10之胺基酸序列；該L胜肽，其胺基酸序列係選自由SEQ ID No：11、SEQ ID No：12、SEQ ID No：13所組成群組中至少一者；該HDEL胜肽具有如SEQ ID No：14之胺基酸序列。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5888513A (en) * 1994-05-13 1999-03-30 Cyanamid Iberica, S.A. Recombinant PRRSV proteins, diagnostic kits and vaccines containing such recombinant PRRSV proteins
US6592873B1 (en) * 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
EP1882478A1 (en) * 2006-07-29 2008-01-30 Healthbanks Biotech Co., Ltd. Fusion protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus as PRRS vaccine

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