PT89579B - Preparacao de uma vacina de subunidade recombinante contra infeccao provocada pelo virus da pseudo-raiva - Google Patents

Description

MEMORIA DESCRITIVA

Campo da invenção presente invento refere-se a um processo de preparação de uma V3cina de subunidade desactivada útil na imunização de ani mais contra o vírus da psetdo-raiva (PRV) e no desenvolvimento de um teste de diagnóstico capaz de distinguir os animais vacinados de animais naturalmente expostos.

Antecedentes da invenção

A pseudo-raiva (doença de Aujeszky) é uma doença altamente infecciosa dos animais domésticos, incluindo suínos, bovinos, ovinos, cães, gatos, martas e ratazanas, provocada pelo vírus da pseudo-raiva (PRV), um membro da família do vírus herpes (Roizman, et al. , I nterviroloqy 16'; 201 (1981)). Os suínos são o principal hojs pedeiro deste vírus e os leitães com menos de cinco semanas de idade são muito susceptíveis. Os porcos adultos ficam muitas vezes latentemente infectados, após exposição ao PRV, reactivando-se o vírus apenas após algum tempo.

A doença é caracterizada por doenças respiratórias graves, abortos, ninhadas mais pequenas, menor velocidade de crescimento e, frequentemente, encefalite fatal (Gustafson, em Diseases of Stuine , Dunn e Ledman, Eds., Iou/a State Press, 1975). As medidas correntes de controlo incluem a vacinação com PRV, quer desactiva do quer atenuado, ou testes e procedimentos de remoção (ver Gustafson, supra, (1975).

Têm-se usado extenslvamente vacinas de vírus vivos modifj. cados (MLV) e vacinas de virus inteiros inactivados, como fonte para induzir imunidade contra muitas doenças. As reservas de vírus vivos modificados, são geralmente produzidas por passagens múltiplas por linhas de células permissivas ou semi-permissivas. Um aspecto comum das reservas de vírus com muitas passagens reside no facto de eles serem usualmente menos virulentos ou atenuados.

Têm-se preparado vacinas de PRV por meio de vários processos. Contudo, as formas de vacinação MLV têm como resultado o

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-3facto de o vírus se manter no meio ambiente. Assim, a irradiação completa do vírus é impossível. Uma abordagem à vacinação alternativa consistiria na utilização de uma vacina recombinante inactj. vada exprimindo glicoproteínas de PRV imunogénicas seleccionadas.

desenvolvimento de uma tal vacina requer um conhecimento da organização do genoma do PRV e das glicoproteínas que ele codifica.

genoma do PRV consiste numa molécula de AON de cadeia dupla com um peso molecular de aproximadamente 90 kilodalton (Kd) (Rubenstein e Kaplan, Viroloqy 66.:385 (1975)). 0 genoma é separai do por sequências de repetição invertidas numa única região curta (U<,) e numa única região longa (U^) (Stevely, 0. Virol. 22:2 32 (1977); Ben-Porat, et al. , Viroloqy 95:285 (1979)). As glicoprci teínas virais têm mostrado ser codificadas por genes localizados em ambas as regiães e do genoma. Verificou-se que em pelo menos duas estirpes de PRV atenuado (estirpes Norden e Bartha; L.a boratórios Norden, Lincoln, Nebraska, E.U.A.), a atenuação parece estar directamente correlacionada com uma delecção genémica. (Petrovskis, et al♦, 0. Virol. 60:1166 (1986)). A delecção é usu almente de cerca de 2-4 mil pares de bases, em comprimento, e localiza-se na região Ug do genoma. Pelo menos uma proteína, a gl, é codificada por esta região deleccionada.

Hampl, et al, , 3. Virol. 52:583 (1984 /descreveram cinco glicoproteínas que estão incorporadas no envelope do PRV. Estas incluem a gl (130 Kd), a gll a,b,c (125 Kd, 74 Kd, 58 Kd), a glll (98 Kd) , a glV (98 Kd) e a gV (62 Kd). Outra proteína virai codj. ficada, designada por gX (98 Kd), tem mostrado acumular-se no meio de células inf ec tadas- .(Rea, et al. , 3. Virol 54.:21 (1985)). Identificaram-se duas outras glicoproteínas virais: a gp50 (Wathen e Wathen, 3. Virol, 51:57 (1984) e a gp 63 (Petrovskis, et al. , 3. Virol. 59:216 (1986)). Descreveram -se em mapa as loc_a lizaçoes de cinco das glicoproteínas. Tem-se mostrado que o complexo gll e a glll , se localizam no mapa na região Uj_ entre as p_o sições de mapa 0,105-0,130 e próximo da posição de mapa 0,40, re.s pectivamente (Mettenleiter, et al., Viroloqy 152:66 (1986); Robbins, et al. , 3. Virol. 58:339 (1986)). A gX , gp50, gl _e gp63 têm sido indicadas no mapa na região U_s do genoma. (Rea, et al. ,

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-4supra, (1985); Wathen e Wathen, supra, (1984); Mettenleiter, et al., 3. Virol. 53:52 (1935); Petrovskis, et al. , supra, (1986)). (Ver Figura 1.).

Nas estirpes Nordsn e Bartha, flanqueando a delecção gl, no lado de montante, i.e., no início do gene, estão as duas glic_o proteínas gp5O e gp63. No lado de jusante, i.e. no fim do gene, situa-se a região de AON envolvida com a replicação. Os soros de animais expostos a infecções naturais contêm anticorpos para a gp50, gp63 e gl. Os animais vacinados com vírus vivo modificado não contêm anticorpos para a gl.

Têm-se produzido vários anticorpos monoclonais que neutra lizam o PRV in vitro. Hampl, et al., supra, (1984) descreve que anticorpos monoclonais dirigidos contra a glll neutralizam efica_z mente o vírus. Os anticorpos monoclonais específicos para a gl e gll têm também actividade neutralizadora do vírus (0. Rziha, comu nicação pessoal; Mettenleiter, et al,, supra, (1986). Wathen e Wathen, supra, (1984), referiram que os anticorpos monoclonais d_e senvolvidos contra a gp50 têm actividade neutralizadora do vírus. Adicionalmente mostrou-se que os ratinhos imunizados passivamente com anticorpos monoclonais dirigidos contra a gp50 estão protegidos após desafio com o PRV.

Têm-se feito várias tentativas para desenvolver uma vacina útil para a imunização de animais contra a infecção provocada pelo PRV. D uso de glicoproteína do PRV, gp50, como um candidato potencial a vacina de subunidade, foi já descrito por Marchioli, et al., 3. Virol. 61:3977 (1987). Petrokovis, et al. , Patent Cooperation Treaty (PCT), pedido W0 87/02058 relata a produção de vacinas de subunidade para PRV usando um dos polipéptidos gl, gp50 e gp63. Shih, et al., PCT Pedido W0 87/01287, refere a produção de uma vacina de PRV atenuado, compreendendo AON do PRV. Produz-se uma vacina de PRV atenuado usando uma sequência de PRV essencial para a replicação do vírus atenuado, da qual uma porção da sequência de repetição foi deleccionada.

Refere-se também, Patente dos E.U.A. nS. 4 514 497, a modificação do PRV vivo pelo uso de uma estirpe de PRV sensivel à

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-5temperatura. Robbins, et al. , Pedido de Patente Europeia n2.

162 738, descreve a produção dos genes da glicoprotelna do PRV em sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos , e o seu uso como imunogénios.

Recentemente, numerosas comunicações demonstraram a utiM dade de se usarem, como vacinas, vírus vacina recombinantes exprj. mindo genes virais estranhos. Têm sido referidas a expressão e a imunização bem sucedidas com vírus vacina recombinantes infecciosos, incluindo os que contêm os genes do antigénio de superfície da hepatite B (Smith, et al., Nature 302:490 (1983); Paoletti, et al, , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:193 (1984), da hemaglutinina do vírus da gripe (Panicali, et al., Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 80:5364 (1983); da glicoproteína D do herpes simplex (Paoletti, et al., supra, (1984); Cremer, et al. , Science 22B:737 (1985); da glicoprotelna G da raiva (Wiktor, et a 1, , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:7194 (1984)), da glicoproteí na G da estomatite vesicular (Mackett, et al., Science 227:433 (1985), e da.glicoprotelna G do vírus sincicial respiratório humano (Bali, et al. 'í Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 83:246 (1986); Elango, et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:1906 (1986)).

Sumário da Invenção

Uma concretização da invenção consiste' numa vacina contra vírus da pseudo-raiva (PRV) recombinante, para administração a um animai, capaz de induzir imunidade contra a infecção provocada p_e lo PRV, sem efeitos laterais graves. Esta vacina compreende uma quantidade eficaz de antigénios da subunidade diualente do PRV re combinante, gp50:63.

Numa outra concretização da invenção, descreve-se um processo de preparação de uma vacina contra a infecção provocada pelo PRV, que compreende a expressão dos antigénios da subunidade do PRV, gp50:63, num sistema de cultura de tecido do vírus vacina; o tratamento do vírus recombinante com um agente químico desactiva_n te e a recolha do vírus recombinante desactivado e do extracto de células para formulação numa vacina.

Ainda numa outra concretização da invenção descreve-se um

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-6processo de imunização de animais contra a infecção provocada por PRV, que compreende a administração dos antigénios de subunidade do PRV recombinante, gp50:63, expressos num sistema de vírus vaci na recombinante, por via oral, intranasal, intraperitoneal, subcjj tânea ou intramuscular.

Numa outra concretização da invenção descreve-se um vírus vacina recombinante que exprime a gp50:63 do PRV, caracterizado por se terem desactivado a vacina recombinante e o extracto de c_é lulas.

Ainda numa outra concretização descreve-se uma unidade de dosagem de vacina para induzir imunidade contra a infecção provocada pelo PRV, que compreende 0,1 a 5,0 ml de um liquido adequado para administração intranasal, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea ou oral a um animal, contendo 1,0 a lOO^ug de vírus va cina recombinante, desactivado.

Noutra concretização da invenção descreve-se uma vacina de combinação para administração oral, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea ou intranasal, capaz de induzir imunidade, em animais, contra a infecção provocada pelo PRV e por um ou mais de o_u tros organismos ou vírus patogênicos, sem efeitos laterais graves. A vacina de combinação compreende uma quantidade eficaz de antigé. nios de subunidade do PRV, gp50:63 e quantidades eficazes de um ou mais outros antigénios, protectores contra infecçães provocadas por outros organismos ou vírus patogênicos.

Ainda numa outra concretização descreve-se um conjunto de diagnóstico para a detecção da infecção provocada pelo PRV em an_i mais, compreendendo o antigénio de subunidade do PRV recombinante, gi.

Breve descrição da figura

Figura 1: mapa genético da única região curta () do virus da pseudo-raiva (PRV). A barra a tracejado representa os transcritos de ARN-m tal como foram determinados por mapeamento Sl. A barra grossa a cheio representa a localização dos genes gX, gp50, gp63 e gi. As linhas a cheio na parte inferior da figura

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-7representam as regiões do genoma do PRV clonadas nos vectores de vacina recombinante.

Descrição detalhada da invenção controlo de qualquer doença infecciosa inclui preferivelmente meios para prevenir e para acompanhar o desenvolvimento da doença. Do estudo da infecção provocada pelo PRV tornou-se evidente que é também importante prevenir a disseminação do vírus e simultaneamente proporcionar a imunização dos animais. Até à data o problema tem consistido na obtenção de uma vacina eficaz, sem a introdução adicional do vírus no meio ambiente. 0 objectivo do presente invento consiste na produção de uma vacina que pr_o teja os animais, sem a introduzir adicionalmente no vírus PRV no meio ambiente.

Numa concretização do presente invento, descreve-se um processo de preparação de uma vacina de sutíunidade desactivada r_e combinante, ou de seus derivados, contra a infecção provocada peio vírus da pseudo-raiva. A vacina de subunidade.do PRV é construída de forma a que se estabeleça uma imunidade em animais uaci nados que se possa distinguir da dos animais expostos à infecção natural. Adicionalmente, a vacina não induz nos animais vacinados um estado de latência da infecção por PRV.

Pode preparar-SB uma vacina com estas propriedades usando as duas glicoproteínas da pseudo-raiva (gp50 e gp63), como componentes de subunidade da vacina, como uma única proteína antigénica aqui identificada como gp50:63.

A vacina da invenção inclui derivados do componente de subunidade antigénica. Estes derivados compreendem adições, delecções ou substituições, alterações estas que não afectam adversa e significativamente a sua capacidade de actuar como um imunoqé nio potente.

PRV exemplificado no presente invento é a estirpe Indi_a na Funkhauser (IND-F). Estão disponíveis outras estirpes de PRV, por exemplo, a estirpe Bucharest (BUK), e podem ser obtidas a pa_r tir de fontes tais como o National Veterinary Service Laboratory, Ames, Iouja (NVSL) E.U.A. ou o American Type Culture Collection

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-8(ATCC), Bethesda, Maryland, E.U.A.. Alternativamente podem obte_r -se estirpes de PRV úteis a partir de animais, infectados, por exemplo, por extracção dos gânglios do trigémeo, zaragatoadas vias respiratóriaqíiu tecido do cérebro. 0 AúN do PRV é isolado a partir do PRV por técnicas convencionais tais como as que se descrevem em Reed, et al., 3. Virol. 62:266 (1988).

São conhecidas as sequências do ADN da gp50, gp63 e gi (Petrovskis, et al., supra, (1986); Petrovskis, et al., 3. Virol. £0:185 (1986)). Tal facto permite uma identificação especifica e detalhada dos genes que codificam estas proteínas. 0 isolamento das regiões do genoma do PRV que codificam a gp50, gp63 e gi pode realizar-se usando técnicas de clonação convencional tal como as que se descrevem, por exemplo, em Maniatis, et al., Molecular Cloninq: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory,

1982. As regiões isoladas a partir do.genoma do PRV podem ser clonadas, por exemplo, em vectores do vírus vacina, em vectores de di-hidrofolato redutase (dhfr) (Marchioli, et al, , supra, (1987)) e em vectores da Escherichia coli (Petrovskis, etal. , supra, (1986)) , em vectores de levedura ou noutros vectores gram-positivos, p.e. , de Bacillus ou de S trep tomyces (em Cloninq Vectors, Poumels, Enger-Valk, Eds., 1985).

Os genes recombinantes assim produzidos podem exprimir-se em células hospedeiras tanto eucarióticas como procarióticas. Pode conseguir-se a expressão em células hospedeiras procarióticas usando, por exemplo, E. coli., B. subtilis., S trep tomyces ou S. typ himurium, Cyanobacteria ou S. aureus (em Cloning Vectors, supra, (1985)). A expressão em células hospedeiras eucarióticas pode realizar-se usando células de mamífero, por exemplo células de ovário de criceto chinês (CHO), células de rim de criceto R-1610, células de rim de porco, células testiculares de suíno; cjé lulas de levedura, por exemplo, de 5. cerevisiae e de Pichea; e células de insecto, por exemplo, de 5. fruqiperida e de Dros op hila.

Preferem-se os sistemas de expressão nos quais o antigénio do PRV se exprime na superfície de uma partícula imunogênica, p.e., o vírus vacina, o papova vírus, o adenovirus, o vírus herpes, o

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-9paruouírus, o vírus do papiloma e o vírus da varíola de galinhas ou de suínos.

Usando processos de ADN recombinante para exprimir proteínas em cultura de tecidos, usando um sistema de expressão do vírus vacina, podem incorporar-se os genes da gp50 e da gp63, como um gene colinear, no vírus vacina, para a produção de uma vac_i na de subunidade. Pode preparar-se o agente de diagnóstico, gl, usando técnicas de AON recombinante para exprimir o produto genético. Este produto genético gl pode ser utilizado como antigénio em ensaios serológicos, por exemplo, em EL IS A. ensaios radio-imuno lógicos (RIA) e manchas de proteínas.

Adicionalmente, pode preparar-se uma sonda do gene gl purificando o AON que codifica o gl a partir dos clones de ADN recombinante contendo o AON de gl. Assim podem usar-se as sondas de genes ou as proteínas codificadas na região do vírus da pseudo-raiva, como meios de diagnóstico da pseudo-raiva em infecções que ocorrem naturalmente versus respostas'devidas à vacinação, com uma vacina de subunidade de PRU ou de PRU vivo modificado. Os genes ou os produtos genéticos codificados a partir da r_e gião U„ do vírus da pseudo-raiva entre StuI e BamHI (ver Figura l) são a fonte do material de diagnóstico. As estirpes para vacinas atenuadas da pseudo-raiva contêm delecções nes.ta·· região. Deste modo, uma vez que a gl é totalmente codificada a partir desta região, nem o gene nem os produtos genéticos do gl podem ser encontrados em estirpes da pseudo-raiva altamente atenuadas.

Pode usar-se um conjunto de diagnóstico concebido para d_e tectar a gl , o anticorpo dà' gl ou a sequência de ADN da gl, para determinar se um animal foi vacinado ou se esteve exposto a uma e_s tirpe selvagem patogénica. Em virtude da vacina de subunidade da invenção não conter proteína gl ou a sua sequência de ADN, pode também ser usada em ensaios semelhantes. Por exemplo, o vírus va cina recombinante desactivado, contendo a gp50 e a gp63 do PRU, não é infeccioso e não pode iniciar uma resposta imunológica a proteínas do PRU que não sejam a gp50 e a gp63, em animais vacina dos com o vírus. Estes animais serão deste modo negativos para anticorpos em circulaçSo contra gl e não deverão conter qualquer

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-10ADN da pssudo-raiva (gene gl), em células normalmente atingidas por estirpes vivas, modificadas ou selvagens, do PRV.

Um exame ao mapa da enzima de restrição na região de codificação da gp50 indica a presença de um único centro BstX de 44 nucleótidos a montante do codão de iniciação da gp50 (Figura l). Usando métodos tais como os que se descrevem nos Exemplos, podem construir-se vectores de clonaçâo contendo os genes da gp50, gp63 e gl. Da digestão destes vectores de clonaçâo resultam Fragmentos codificando o gene apropriado, i.e., gp50, gp63 e gl, que se podem ligar a um vector de clonaçâo apropriado, por exemplo, por ligação a pGS20 digerido com BamHl/Smal, o vector de inserção no vírus vacina (Mackett, et al. , supra, (1984)). Os aspectos impo_r tantes do pGS20 que o tornam um vector útil incluem: o gene promotor de 7,5 Kd, que possui sinais reguladores de transcrição, prematura ou tardia do vírus vacina; centros BamHI e Smal únicos, localizados logo a jusante do gene promotor de 7,5 Kd, para inse_r ção de um gene estranho; e sequências do gene-da timidinoquinase (TK) do vírus vacina, flanqueando todas as sequências anteriores, para dirigir a recombinação homóloga para locus da TK do genoma do vírus vacina. Outros sistemas de vectores vacina que podem também utilizar-se incluem, por exemplo, os descritos por Paoletti, et al., supra, (1984).

A mistura de ligação anteriormente descrita pode ser trans formada, por exemplo, em E» coli DH5 (Maniatis, et al., supra, (1982)) e analisada em relação aos ciones recombinantes.

Isolou-se um clone possuindo o fragmento do PRV inserido com a orientação correcta (p50:63:gl) e ligou-se operacionalmente ao gene promotor de 7,5 Kd, tal como se descreve mais completamen te nos Exemplos. A sequenciação do ADN mostrou que o codão de iniciação da gp50 se localizava 83 nucleótidos a jusante do centro de iniciação de ARN-m principal para o polipéptido de 7,5 Kd do tipo selvagem.

Conseguiu-se a inserção do fragmento de ADN do PRV no vírus vacina infectando células hospedeiras, por exemplo, células CV—1 (Oensen, Proc. Natl. flcad. Sei. 53:53 (1964)) com vírus vac_i na e transfectando as células com um plasmideo de expressão compre

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-11endendo os genes de codificação das proteínas do PRV. Dois dias após a infecção, aplicaram-se diluições seriadas de vírus progén_i cos a monocamadas de células TK , preferivelmente células TK 143B humanas (dádiva de B. Moss, National Institute of Health), na presença de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BUdR) p3ra seleccionar as placas de TK com vírus recombinantes. ^ecolneram-se algumas placas de TK e cultivaram-se em placas de 24 cavidades em células TK’ na presença de BUdR. Filtraram-se porções alíquotas das culturas infectadas através de nitrocelulose e analisaram-se com 32 uma sonda radio-marcada, preferivelmente P, específica para a região gp50. Identificaram-se deste modo um certo número de recombinantes contendo o fragmento do PRV de 5,3 Kb. Um dos recombinantes foi purificado em placa, três vezes, em células TK^- na presença de BUdR, e preparou-se uma preparação de concentrado de vírus infectando células' do testículo suíno (ST). 0 vírus recombinante é designado por Vgp50:63:gI.

Prepararam-se as construções de vírus vacina recombinantes tal como anteriormente se descreveu, e tal como se descreve em mais pormenor nos Exemplos, as quais incluíram as regiões de codificação da gp50:63 (l/gp50:63) e da gl (l/gl). Usando técnicas de AON recombinante construiram-se os plasmideos p50:63:gI, p50: :63 e pgl. Os vírus vacina recombinantes resultantes, usando o p50:63 e o pgl foram designados por Vgp5D:63 e Vgl, respectivamen te.

Para caracterizar a expressão da .gp50, células CI/-1, infectadas com o recombinante de vacina, Vgp50:63:gp, foram incubadas com o anticorpo monoclonal, específico da gp50, MCA50-1 (dádi. va de M. Wathen). Lavaram-se as células e incubaram-se com IgG de cabra anti-ratinho conjugada com fluoresceína. A gp50 pôde ser detectada no citoplasma e na superfície celular das células infectadas com l/gp50, enquanto que, nas células infectadas com v_í rus vacina não recombinante não foi detectada qualquer fluorescência. Examinou-se também a expressão da gp50 por imunoprecipitação de extractos de células ST, infectadas com l/gp50 radiomarca “

do com C-glucosamina, com MCA50-1. A análise SDS-PAGE dos imunoprecipitados revelou uma banda difusa com um peso molecular de

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-1260 Kd e uma banda mais nítida com um peso molecular de 55 Kd. Não se detectaram proteínas após a imunoprecipitação das células infectadas com o vírus vacina. A análise dos imunoprecipitados de células infectadas com PRV mostrou um padrão de bandas idêntico ao obtido com células infectadas com Vgp50:63:gI. Assim, a gp50 sintetizada por células infectadas com vírus recombinantes pareceu similar à sintetizada por células infectadas com PRV.

A expressão de um vírus vacina recombinante Vgp50:63 foi caracterizada recolhendo primeiro o soro de ratinhos imunizados com células CV-1 infectadas com Vgp5Q:63. Usou-se então o soro de ratinho Vgp5Q:63 para imunoprecipitar extractos de células mar; 14 cadas com C-glucosamina, infectadas com vacina do tipo selvagem (estirpe Wyeth, Neuí York Board of Healttt) e com pseudo-raiva Bucharest (BUK) θ Indiana Funkhauser (IND-F) (Mengeling, et al. , Arch. Virol. 75:193 (1982)) e com vacina recombinante Vgp5D:63:gI, Vgp5D:63 e Vgl. Nos imunoprecipitados de células infectadas com PRV (BUK ou IND-F) estava presente uma banda difusa a cerca de 62 Kd e abrangendo uma região até um peso molecular inferior a aproximadamente 58 Kd. Nos imunoprecipitados de células ΞΤ infectadas com Vgp50:63:gI ou com Vgp50:63 observou-se uma banda mais confinada de 62 Kd.

Para caracterizar a expressão da gl in.fectaram-se células ST com vírus recombinante Vgl e imunoprecipítaram-se extractos de células, marcadas com ^C-glucosamina, com anticorpo monoclonal específico da gl. A proteína principal dos imunoprecipitados de células ST infectadas com PRV ou com Vgl era uma proteína de 105 Kd, indicando que o recombinante expressa uma proteína similar à das células infectadas com PRV. Quando se usa a estirpe BUK do vírus da pseudo-raiva, a gl está ausente nas células BUK.

Pode usar-se uma vacina de subunidade desactivada, produzida pela expressão de gp5Q:gp63 usando um sistema de vector vaci na, para imunizar com sucesso animais contra a infecção provocada pelo PRV. A vacina produzida usando este método não contém PRV intacto, i.e., não está presente PRV, nem atenuado nem desactivado.

Usando as duas glicoproteínas da pseudo-raiva como componente de subunidade, demonstrou-se que a vacina de subunidade in68 706

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-13duz uma imunidade protectora forte, quando administrada como uma preparação desactivada contendo os antigénios gp50:63, numa prepa. ração de vírus vacina recombinante na presença de extracto de células hospedeiras.

Os testes com a vacina recombinante gp50:63 em ratinhos indicam que o recombinante vivo é menos virulenta e mais protector quando os ratinhos são inoculados intracranianamente. A utilização de preparações de gp50:63 recombinante (Ugp50:63) desactivadas com uma solução de etileno-imina binária (8El), é mais segura e me nos dispendiosa do que a utilização das vacinas normalmente disp_o níveis, pois o vírus vacina pode crescer facilmente num grande nú mero de sistemas de culturas de tecidos, por exemplo, em células do rim porcino, células do testículo suíno, células de macaco CV-1 e células Vero (ATCC CCL81).

Numa prática preferida da invenção, um concentrado de vírus de gp50:63 recombinante, representando um titulo de 8,1 Log 10 TCIDç.g/ml, é desactivado com BEI durante 120 horas e usado para inocular porcos. Cada animal recebeu aproximadamente um ml de preparação de vírus inactivo (contendo 1-10 y.g de proteína PRV), intramuscularmente. Após três semanas administrou-se um reforço.

Usou-se óleo-leciti na como adjuvante. Podem usar-se outros adjuTM vantes, por exemplo, Quil A , al-hidrogel ou óleo mineral. A um grupo de animais administraram-se também vacinas comercial mente disponíveis, PR-Vac (vírus vivo modificado) e PR-Vac (morto) (Laboratórios Norden, Lincoln, Nebraska, E.U.A.), usando as dosagens de vacina normais recomendadas pelo fabricante.

Na Tabela 1 mostram-se os resultados mais significativos. Após duas doses o recombinante gp50:63 induziu níveis muito eleva dos de anticorpo neutralizador do vírus, enquanto que o recombinan te gp5O (não contem gp63) não mostrou seroconversão nem protecção contra a doença. Adicionalmente, conseguiu-se o mesmo nível de protecção contra o desafio virulento usando o recombinante gp50:63, quando comparado com as vacinas convencionais. 0 gp50: :63 exprime menos gp50 e gp63 do que o que é produzido em infecções com tipos selvagens. Contudo o gp50:63 produziu uma resposta de anticorpos muito elevada. Estes resultados indicam que se68 706

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-14rá de esperar que, sob condições óptimas de dose e de adjuvante, o gp50:63 recombinante estimule uma resposta ainda mais forte do qus a ilustrada pelos dados indicados na Tabela 1.

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-15Tabela 1. Resposta sorológica de porcos à vacinação com vacinas de PRVac, PRVac-morto ou PRV recombinante

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Média geométrica

706

SK8 Case 14411

-16^a Os animais foram inoculados intramuscularmente com 1 ml de gp50:63 recombinante adjuvado com 5/= de lecitina em óleo mineral (l ml). PRUac é um virús vivo modificado e o PRUac-morto é adjuvado com ai-hidrogei.

Os animais que receberam o recombinante gp50:63 receberam uma segunda inoculação três semanas depois.

^C Os animais foram desafiados com 3-4 TCID^g Log^Q de vírus PRU virulento (IND-F) (2208) na semana 6.

A Tabela 1 mostra os títulos de anticorpos de neutralização do vírus (UN) em porcos vacinados com várias preparações de vacina. Aos animais administraram-se inoculações contendo 5% de lecitina em óleo minerai como adjuvante, com extracto de culturas de tecidos desactivados de células de vacipa infectadas ou as vacinas de PRU licenciadas (viva modificada) ou (morta) distribuídas pelos Laboratórios Norden. As inoculações.' foram administradas intramuscularmente (IM) no pescoço e 3 semanas depois, administrou-se um reforço (com o PRU modificado vivo não se deu o reforço). Seis semanas após a vacinação desafiaram-se os porcos com uma forma virulenta do vírus da pseudo-raiva. Como se pode observar na Tabela 1, os titulos de UIM dos produ.tes divaientes f_o ram quase 10 vezes superiores ao título médio observado para os produtos licenciados.

Usando os processos da invenção pode também preparar-se uma vacina de combinação. Por exemplo, pode preparar-se a vacina de PRU recombinante em combinação com outras vacinas desactivadas ou com bacterinas múltiplas. As bacterinas que se podem utilizar incluem Pas teurella muitocida (tipo A e D), Hemophilus pleurooneumoniae (estirpes 1, 5, 7), Bordetella bronchiseptica e Erysipelothrix rhusiopathiae. Nos Exemplos descrevem-se métodos de preparação destas bacterinas.

Os resultados na Tabela 2 mostram que a vacina de subuni dade do PRU recombinante, produzida no vírus vacina, tinha o titu lo mais elevado de qualquer vacina de combinação e é favoravelmen te comparado com os resultados obtidos para a vacina de PRUac mor

786

SK8 Case 14411

-17to quando administrada sozinha. Uma preparação de vacina de subunidade da pseudo-raiva (SUVA) extraída quimicamente, descrita em mais pormenor nos Exemplos, não mostrou qualquer seroconversão e conferiu pouca protecção. Assim, em combinação com bacterinas, foi com a preparação desactivada da vacina recombinante (gp5C: :gp63) que se obtiveram melhores resultados.

Tabela 2. Resposta sorológica de porcos à vacinação com vacinas de combinação de PRVac-morto, SUVA ou PRV recombinante

Média geométrica do título de anticorpos VN em semanas após a vacinação

Vacina	NS. de animais	oa	1	2	3a	4	5	6b	7	8	Percentagem de protecção
l) PRvac-morto + vacina—morto	10	-	-	-	0	1	1	0	6	152	80
2) PRvac-morto	5	0	0	0	0	5	9	12	2 7	181	80
3) Combinação de PRvac-mo rto	5	0	0	0	0	1	2	1	21	128	80
4) Combinação de SUVA	10	0	0	0	0	0	0	0	0	5Ί	50
5) Combinação de vacina gp50:6 3	7	0	0	1	1	7	9	7	7	144	86
6) Não vacina dos	10	0	0	0	0	0	.0	0	0	45	40
Títulos ι ção. As	ie anticorpos VN preparações de	da pseudo-raiva vacina incluem:	para vacinas	de combina-

l) Vacina de pseudo-raiva morta (PRVac morto, Laboratórios Norden) combinado 1:1 com vírus vacina não recombinante do tipo selvagem (Wyeth); adjuvado com 5% de lecitina em óleo mineral. 2) PRVac morto convencional. 3) PRVac-morto misturado com uma bacte rina de combinação descrita nos Exemplos . Misturaram-se 2 ml de PRVac-morto com 2 ml de preparação de bacterina. 4) Misturaram68 706

SKB Case 14411

-18-se 2 ml de combinação de bacterina com 2 ml de antigánio de vacj. na de subunidade (SUVA) (ver Exemplos). 5) Misturaram-se 0,7 ml de vírus vacina recombinante desactivado gp50:63 com 2 ml de bacte rina de combinação.

θ

Aos animais administraram-se inoculações primárias intramuscularmente. Administrou-se uma segunda inoculação após 3 semanas.

Desafiaram-se os animais ao fim de 6 semanas com 3-4 TCID^g (Log^g) de vírus da pseudo-raiva virulento.

Pode administrar-se a vacina recombinante do presente invento ao animal para o proteger directamente contra a infecção provocada peio PRV. A dosagem deverá ser segura, i.e., não deverá provocar efeitos laterais graves nem deverá introduzir novos organismos patogênicos no meio ambiente. A, formulação da vacina envolve a realização de estudos sobre uma dose imunizante mínima (MID) e sobre um adjuvante óptimo (0A5) (no caso das preparações desactivadas) . 0 volume da dose mínima deverá ser mantido tão p_e queno quanto possível sem um passo de concentração. Deste modo, para um produto de vacina biológica, a biossíntese em cultura de células deverá realizar-se ao mais elevado nível possível.

A administração da vacina é importantee pode realizar-se por várias vias: intramuscularmente, (IM); intranasalmente (IN); oralmente (0); intraperitonealmente (IP); ou subcutaneamente (SC). Para a vacina adjuvada prefere-se a via intramuscular, e uma dose típica será de aproximadamente l-lOO^g e, p ref erivel meri te, de 5 ^g de gp50:63 de PRV num volume de 0,5-5 ml, preferivelmente 1 ml.

Preferivelmente, a vacina induz uma imunidade com uma única dose durante um período de 3-4 semanas. Os animais vacinados, desafiados com vírus virulento, deverão experimentar uma res posta febril baixa e curta e o alastramento do vírus deverá ser reduzido quando comparado com animais não vacinados. Os animais vacinados desafiados com vírus virulenta deverão experimentar pou ca ou nenhuma perda de peso. E desejável um ganho de peso de 569 706

SX3 Case 14411

-19-10$ durante um período de 14 dias após o desafio.

Um outro aspecto do presente invento consiste na preparação e utilização de vacinas de combinação consistindo em quantid_a des vacinantes de antigénios de subunidade PRV, ou seus derivados e um ou mais outros vírus animais conhecidos. Por exemplo, podem preparar-se vacinas de combinação compreendendo o componente ant_i génio de subunidade PRV e um, ou mais, componentes patogénicos das problemáticas viroses infecciosas dos suínos, p.e., o vírus da gas troentrite transmissível (TGEV), o parvovírus porcino, o v_£ rus da gripe suína, e o mycoplasma pneumonia.

A preparação e uso destas vacinas de combinação realizam-se de acordo com os procedimentos que aqui se descrevem ou de acordo com o conhecimento dos peritos na arte da produção e uso de vaci nas.

Numa concretização adicional dõ presente invento, incorpjo ra-se um agente de diagnóstico num conjunto de diagnóstico, para utilização na detecção e diagnóstico da presença do PRV numa popjj lação de animais e para distinguir animais vacinados de animais naturalmente expostos. 0 conjunto de diagnóstico é concebido para conter reagentes e materiais suficientes para realizar um painel de testes.

Investigou-se a proteína do PRV, gl, como candidato a a_n tigénio de diagnóstico, em virtude de ser eliminada em preparações de vírus PRV aitamente atenuado. Os animais vacinados com vírus PRV altamente atenuado são seronegativos em relação à gl. Verifica-se que os animais expostos à infecção natural são seropo sitivos em relação a gl.

Usando os processos do presente invento podem produzir-se niveis elevados de proteina gl, para uso como antigénio de diagnós. tico, através da expressão de ADÍ\I recombinante.

Pode usar-se uma variedade de sistemas de clonação e expressão para exprimir o antigénio de diagnóstico gl. Por exemplo, podem usar-se os vectores de E. coli, pASl ou pUC8 (em Cloninq Vectors, supra, (1985)) para exprimir a gl ou derivados da gl, usando sistemas de hospedeiro E. coli. Alternativamente, podem clonar-se os genes gl em vectores de Streptomyces e pode conseguir68 706

SK3 Case 14411

-20-se a sua expressão usando sistemas de células hospedeiras 5 treptomyces (Cray, et al., Gene 32:21 (1984)).

Numa prática preferida da invenção, isolou-se uma única proteína de vírus vacina recombinante, altamente purificada, a partir da região do genoma que codifica a proteína gl. Transferiu-se este gene gl para o vírus vacina usando protocolos convencionais (Mackett, el al. , 3. Virol. 49:857 (1983)). Para determi. nar se este recombinante estava de facto a produzir gl (105 Kd) imuno-precipitaram-se células ST, infectadas com recombinantes gl, com um anticorpo monoclonal para o gl. Apenas uma banda de 105 Kd precipitou, a partir das células infectadas com gl recombinante e a partir de células ST infectadas com PRV do tipo selvagem Funkhauser (estirpe Indiana-Funkhauser do PRV (PRV-1nd-FH) ; (Scherba, et al., 0. Am. Vst. Med. Assoe. 173:1490 (1978)). A partir de células infectadas com vírus Bucharest (8UK) modificado vivo, não precipitou uma banda similar. Deste modo, os recombinantes gl sintetizam uma proteina de 105 Kd idêntica, em dimensão, à produzida por infecções do tipo selvagem, indicando que o gl re combinante exprime a proteína correcta.

Nos resultados dos testes de virulência em ratinhos (Tab_e la 3) observou-se evidência adicional da gl biologicamente activa produzida pelo gl recombinante. Normalmente, quando se inserem genes no gene da timidinoquinase de vacina, o vírus recombinante é significativamente reduzido em virulência quando injectado no cérebro do ratinho (comparar o Vgp50:63 com o vírus vacina do ti po selvagem). Contudo, quando se inoculam, intracraneanamente, re combinantes de vacina contendo gl,'a virulência não diminui, mas é, na verdade, ligeiramente aumentada (comparar o Vgp50:63:gI e o Vgl com vacina do tipo selvagem). Além disso, a libertação do v_í rus de células infectadas pode ser restaurada a partir do PRV ate nuado (estirpe Bartha) quando a região U_s (especificamente gl) da pseudo-raiva é usada em experiências de salvamento marcador (Mettenleiter, et al. , 0. Virol. 61:2764 (1987). Estes resultados indicam que a gl está envolvida na virulência do PRV, bem como informação sobre as eliminações específicas da gl em vírus PRV modificado vivo atenuado.

706

3KB Case 14411

-21Tabela 3. Sobrevivência de ratinhos com inoculações IC antes e após desafio

Inoculação L°910 TCID5Q	% de sobrevi. vências antes do desafio	LD50 por dose	% de sobrevj. vências após o desafio	P050 por dose
Vacina Wyeth	6,1		0	4,9	0
	5,1		40		0	ND
	4,1		100		0
	5,1		100		0
Vgp5 0-6 3	5,8		100		100
	4,8		100	>5,8	100	<2,8
	5,8		100		100
	2,8		100		100
Vgp5 0-6 3-gI	6,1		0		o
	5,1		0	<5,1	0	ND
	4,1		20		0
	5,1		40		0
V g I	5,7		0		0
	4,7		40	4 ,4	0	ND
	5,7		80		0
	2,7		100		0

Inocularam-se os ratinhos intracranianamente com 0,03 ml e segui ram-se durante 2 semanas. Desafiaram-se os sobreviventes (IP) com aproximadamente 30 LD^g de Funkhauser tipo selvagem (2208)

ND - não determinada

Na prática preferida da invenção, pode usar-se a proteína gi recombinante, como antigénio primário em vez de vírus inteiros, para um conjunto de diagnóstico ELISA competitivo. Descreve-se em pormenor nos Exemplos o método preferido para a realização do ELISA competitivo.

706

3KB Case 14411

-22Descreve-se também um conjunto dg diagnástico usando uma sonda da gene gue permite seguir a eliminação do gene gl. Usando o método da sonda de gene, tal como se descreve em pormenor nos Exemplos, podem analisar-se amostras de tecido de animais para determinar a exposição ao vírus ou um estado de vacinação.

Exemplos

Ds Exemplos que se seguem são ilustrativos e não limitati. vos da invenção. Todas as enzimas foram usadas de acordo com as recomendações dos fabricantes. Os procedimentos de clonação convencionais foram realizados de acordo com os procedimentos descrj. tos por Maniatis, et al., Molecular Cloninq, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, 1982.

Exemplo 1: Purificação do vírus e isolamento do AON

I. Isolamento de ADN

Extraiu-se o ADN do vírus vacina a partir de vírus vaci na purificado, substâncialmente tal como anteriormente se descreveu (Garon, et al. , Proc. Natl. Açad. 5ci. USA 75:4863 (1978)). P_a ra a purificação do PRV infectaram-se células de testículo suíno (ST) (Laboratórios Norden, Lincoln, Nebraska, E.U.A.) com uma mu_l tiplicidade de 5 unidades de formação de placa (PFU) por célula e, 16 horas depois, recolheu-se o meio e concentrou-se usando um di.s positivo de ultra-filtração de laboratório. Colocou-se o vírus concentrado sobre uma almofada de 5 ml de 30% de sacarose em TBS (lDD mM Tris (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri), pK 7,2, 150 mM de NaCl) e centrifugou-se a 11 000 rpm durante 45 minutas a 42C. Recolheu-se a banda' d.e vírus'na interface, diluíu-se em TBS e sedimentou-se por centrifugação a 5D 000 rpm durante 30 minutos a 45C. Ressuspendeu-se o sedimento de vírus em TBS, colocou-se sobre um gradiente de 30% de glicerol-50% de tartarato em TBS e centrifugou-se a 40 000 rpm durante 3 horas a 42C. Recolheu-se a banda de vírus, diluiu-se 3 vezes com TBS, e seaimentou-se como anteriormente. Suspendeu-se o vírus em TBS e armazenou-se a -70°C.

Extraíu-se o AON suspendendo o vírus purificado em tampão de protease K (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1% de SDS, 10 mM de EDTA, ό 3 706

SKB Case 14411

-23750 mg/ml de protease K) e incubando a 3790 durante 2 horas. Incubou-se depois a amostra a 6590 durante 5 minutos e extractou-se com um volume igual de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:25 :l). 0 ADN precipitou pela adição de acetato de sódio até 0,3 M e de 2 volumes de etanol.

11. Clonação dos fragmentos de restrição do PRV

Digeriu-se o ADN do PRV com enzima de restrição BamHI (New England Biolabs, Beverly Massachusetts, E.U.A.) e resolueram-se os fragmentos num gel de agarose de baixo ponto de fusão a 6%. Excisou-se o fragmento 7 de restrição BamHI (aproximadamente 6,8 Kb), contendo a região de codificação gp50:63, do gel e ligo_u -se ao plasmídeo pBR322 (Sutcliffe, Nucleic Acids Res. 5.:2721 (1978)), usando o procedimento de clonação com agarose de baixo ponto de fusão descrito por Crouse, et al. (1983). Digeriu-se o plasmídeo resultante (pBAM7) com Sall e com BamHI, partindo-se o fragmento 7 BamHI em duas peças designadas por Sal 7A (4,8 Kb) e Sal 7B (2,0 Kb). Subclonaram-se estes fragmentos, Sal 7A s Sal 7B no pBR325 (em Oloninq Vectors, Pouuiels, Enger, Valk. Eds. , 1985), usando procedimentos de clonação convencionais, para gerar os plasmideos recombinantes pSal 7A e pSal 7B.

III. Isolamento do vírus vacina recombinante

Transfectaram-se células CV-1 (Oensen, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 5 3:53 (1964)) infectadas com a estirpe Wyeth do vírus vacina (Craigie, Brit. 0« Exp. Path. 13:259 (1932)) com ADN plasmideo precipitado com fosfato de cálcio tal como se descreveu (Mackett, et al,, supra, (1984)). .Seleccionaram-se os recombinan tes timidinoquinase-negativos (TK ) por ensaio em placa com células TK 143 humanas (dádiva de 8. Moss, National Institute of Health) cultivadas na presença de 5-bromo-2'-desoxiuridina (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) (BUdR) a 25^_lAg/ml. Recolherani -se as placas e usaram-se para infectar células TK~ 143 humanas cultivadas em placas de cultura de 24 cavidades. Quarenta e oito horas após a infecção, filtraram-se porções alíquotas de células infectadas através de papel de filtro de nitro celulose e hibrida —

ram-se com uma sonda P-marcada, específica para a região gp50: :63, usando técnicas convencionais (Maniatis, et al. , supra,

8 7 06

ΞΚ3 Case 14411

-24(1982)). Purificaram-se duas vezes em placa, em células TK 143 humanas, os vírus que se verificou serem positivos para a sequência do PRV e amplificaram-se por infecção de células CV-1 ou ST.

Digeriu-se o plasmideo pSAL7B com a enzima de restrição BstX I e tornou-se a extremidade romba usando o fragmento Klenouj da polimerase de ADN da E. coli T4, Ligaram-se os ligantes BamHI ao ADN, o que introduziu um centro de enzimas de restrição conveniente para inserção/excisão no plasmideo pG520 de vacina (Figura l). Uma segunda digestão com Sal I libertou um fragmento de PRV com cerca de 540 pb. 0 plasmideo pSAL7A foi duplamente digerido com BamHI e com Sall e isolou-se o fragmento PRV 7A com 4,8 Kb. Este fragmento contém a sequência de codificação da gp50 a jusante do centro Sall além de um adicional de 4,1 Kb (codificando a gp63 e a gl) da sequência do PRV. Ligaram-se os dois fragmentos ao pGS20 digerido com BamHI, o vector de inserção no vírus vacina (Mackett, et al., supra, (1984)).

Transformou-se a mistura de ligação anteriormente descrita, em E♦ coli DH5 e analisou-se em relação aos clones recombinan tes. Isolou-se um clone que tinha o fragmento PRV inserido com a orientação correcta (p5D:63:gl) em relação ao gene promotor de 7,5 Kd. Conseguiu-se a inserção do fragmento de ADN do PRV no v_i rus vacina, infectando células CV-1 com vírus vacina e transfectan do as células com pV50:63:gI. Dois dias após a infecção absorveram-se diluições seriadas do vírus original em monocamadas de células TK 143B, na presença de BUdR para seleccionar placas de v_í rus TK recombinante. Recolheu-se um certo número de placas TK~ e cultivaram-se, em placas de 24 cavidades, em células TK~ na pre sença de BUdR. Eiltratam-se porções alíquotas das culturas infeç:

tadas, através de nitrocelulose e analisaram-se com uma sonda mar ^— cada com P específica para a região gp50. Identificaram-se deq te modo um certo número de recombinantes contendo o fragmente do PRV de 5,3 Kb. Um dos recombinantes foi purificado três vezes em placa em células TK na presença de BUdR e preparou-se uma preparação de concentrado de vírus infectando células ST. D vírus recombinante é designado por Vgp50:63:gI.

Prepararam-se duas construções adicionais de vírus vacina

706

SK3 Case 14411 „ -»

-25recombinante que incluíram as regiões de codificação da gp50:63 (Vgp50:63) e da gl (Vgl). Digeriu-se o plasmideo p50:63:gI com BamHI e Oral para libertar um fragmento de 2,4 Kb (região de codi.

___X ficação da gp50:63, Figura l) e um fragmento de 2,3 Kb (região de codificação da ol, Figura l). Clonou-se direccionalmente o fragmen to de 2,4 Kb no centro BamHI para Smal do pCS20 para produzir o plasmideo p50:63. Tornou-se romba a extremidade do fragmento de 2,8 Kb por incubação com ADN polimerase do fragmento Klenou e com trifosfato de desoxinucleotido (dNTP) e inseriu-se no centro Smal do pGS20 (Figura l). Isolaram-se os clones contendo plasmídeos recombinantes na orientação adequada e designaram-se por pGI. Os virus vacina recombinantes resultantes, construídos usando os plasmídeos p50:63 e pgl foram designados, respectivamente, por Vgp50:63 e Vgl.

Exemplo 2: Caracterização e análise

I. Ensaio de imunofluorescência indirecta

Cultivaram-se células CV-1 até à confluência em lâminas de câmara (Lab Tex, Naperville, Illinois, E.U.A.). Infectaram-se as células com aproximadamente 5 PFU de vírus e incubaram-se a 37SC durante 6 horas. Para visualização da fluorescência citoplasmática, lavaram-se as células em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e fixaram-se em acetona fria. Para visualização da fluorescência de membrana eliminou-se o passo de fixação com acet.o na e aqueceram-se as células a 6520 durante 2 horas. Incubaram-se as células com uma diluição 1:50 de fluido ascítico em PBS djj rante 30 minutos a 372C, seguindo-se três lavagens, de 5 minutas cada, com PBS. Adicionou-sê anti-soro IgG de cabra anti-ratinho, conjugado com fluoresceína (Laboratórios Cappel, Cochranville, Pennsylvania) numa diluição 1:50 em PBS. Após 30 minutos a 379C, lavaram-se as células como anteriormente, secaram-se e observaram -se os padrões de fluorescência.

II. Imunoprecipitação e electroforese de poliacrilamida

Infectaram-se células ST (Laboratórios Norden, Lincoln, Nebraska, E.U.A.), cultivadas em caixas de 60 mm, quer com vírus vacina, Vgp50:63:gI, quer com PRV, com uma multiplicidade de 5

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SKB Case 14411

-26PFU/célula. Após un período de adsorção de uma hora, removeu-se o inóculo e substituiu-se por 2 ml de meio essencial mini mo (ME M) fresco, contendo 5 y*Ci/ml de giucosamina ^xZ*C_7 (Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois, E.U.A. ) e 2% de soro fetal de vitelo dialisado. Após 16 horas a 372C recolheram-se as células lavando duas vezes e depois recolhendo-as para PBS. Sedimentaram-se as células por centrifugação a 1000 g durante 5 minutos e ressuspenderam-se em 1 ml de RIPA (l% de triton X-100, 1% de desoxicolato, 0,1% de SDS, 0,15 M de NaCl, 0,01 M de Tris-HCl, pH 7,2). Após um breve tratamento por ultra-sons (sonication), clarificaram-se as células lisadas por centrifugação a 12 000 g durante 10 minutos .

A imunoprecipitação com anticorpos de ratinho foi realiza^ da essencialmente tal como se descreve em Kessler, 0. Immunol. 119:1617 (1975). Resumidamente, pré-adsorveram-se volumes de 50-100 de extractos de células radiomarcadas com 100 yd. de Staphylococcus aureus, da estirpe Cotuan, tratado com formalina (Kessler, 0. Immunol. 119:1617 (1975)) durante 1 hora a 4SC. Removeram-se as células, por centrifugação durante 2 minutos numa centrifugadora Eppendorf e, aos extractos clarificados, adicionaram-se, durante 1 hora em gelo, 10^1 de fluido ascltico. Adici_o naram-se 100 de 5. aureus durante 1 hora em gelo e sedimentaram-se as células como anteriormente. Lavaram-se os i mu nop recip_i tados três vezes com RIPA e ressuspenderam-se em óQ^ul de tampSo de amostra de electroforese, (2% de SDS, 0,2 M de ditiotreitol, 10% de glicerol, 0,2% de azul de bromofenol, 63 mM de Tris-HCl, pH 6,8), levaram-se à ebulição durante 5 minutos e centrifugaram-se numa centrifugadora Eppendorf. Analisou-se uma porção alíquo ta do sobrenadante em geles de 10% de SDS-poliacrilamida, usando o método de Laemmli, Nature 227:680 (1970). Conjuntamente, foram sujeitos a electrof orese em cada gel padrões de peso molecular rja diomarcado (Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois,

E.U.A.). Fixaram-se depois os geles de electroforese, fluorografaram-se, secaram-se e exposeram-se a filme Kodak X-Omat AR (Kodak, Rochester, Neu/ York, E.U.A.) a -702C. 0 anticorpo monoclonal específico da gp50 (MCA 50-1) foi uma dádiva generosa de M.

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SKB Case 14411

-27W. Wathen. As características deste anticorpo monoclonal já foram anteriormente descritas (Wathen, et al. , Virus Research 4.:19 (1985)). 0 anticorpo monoclonal para a gl foi uma oferta qensro sa de H. Rziha.

Exemplo 3: Localização da região de codificação coiinear da qp5 0:6 3

I . Mapa de nuclease SI

Um único centro Sall localizado na região de codificação dos genes gp50 e gp63 serviu como ponto de referência para determinar a localização dos terminais 5' e 3' do transcrito da gp50 e da gp63, de acordo com o procedimento de Berk e Sharp, supra, (1977). A sonda de ADN usada para localização do terminal 5' foi marcada no seu fim, no centro Sall com polinucleotidoquinase T4 3 2 (P-L Biochemicals Miluiaukee, Wisconsin) e com ^P-dATP (/~trifos32 r fato de P-desoxia cLenosina Amersham Corp., Arlington

Heights, Illinois), com mais do que 3 000 /Ci/mmole. Digeriu-se o fragmento marcado com BstX I (as enzimas de.restrição foram obtidas no New England Biolabs, Beveriy, Massachusetts, E.U.A.) e isolou-se o fragmento apropriado por electroforese através de um gel de 1,5$ de agarose. Localizou-se o terminal 3' usando um fragmento de restrição marcado no fim, no centro Sal, com o fragme_n to Klenow de polimerase de ADN de E. coli e com (X- P-dATP. Digeriu-se o ADN com BstE II e isolou-se o fragmento marcado apropriado tal como anteriormente.

Um único centro BstEII localizado na região de codificação da gl (Petrovskis, et-al., supra, (1986)) (Figura I) constituiu um ponto de referência para a localização do terminal 5' do

ARN-m da gl. Preparou-se a sonda 5' de AON digerindo com BstE II 32 e marcando no terminal com polinucleotido T4 na presença de X- P-ATP. Digeriu-se então a sonda marcada com Stu II e isolou-se a sonda 5' por electroforese através de um gel de 1,5$ de agarose. Preparou-se a sonda do terminal 3' para a gl marcando no fim o centro BamHI usando o fragmento Klenow da polimerase de AON e um ^tX-'⁵²P-GTP (/~trif osfato de o<-'⁵²P-guanidina_7, Neu England Biolabs). Usou-se depois um segundo centro Sall no fragmento BamHI 12 (Figu68 706

Κ 3 Case 14411

-28ra I) para gerar uma sonda de 1,7 Kb que foi isolada como anteriormente se descreveu.

Isolou-se ARN poli A ⁺ de células ST infectadas com PRU (8.^ horas) e de controlo, por extraeção de isotiocianato da guanidina (Chirguin, et al. , Biochemistry 18:5294 (1979)) e por cromatografia de oligo-dT-celulose (Aviv e Leder, Proc. Natl. Açad. Sei.

USA 69:1408 (1972)). Desnaturou -se uma pmole de sonda radiomarca da, em 80 yj. de formamida a 98% contendo 2 yd. de EDTA 0,5 M, por aquecimento a 8090 durante 10 minutos. Após a desnaturação adic_i onaram-se 5 yug de ARN poli A ⁺ em 2 0 de Pipes 200 mM (pH 6,4,

2,0 M de NaCl, 5 mM de EDTA) e incubou-se a mistura a 6590 durante 16 horas. Colocaram-se os tubos num banho de gelo e adicionaram-se 450 jnX de tampão de nuclease Sl, arrefecido em gelo (0,28 M de NaCl, 0,05 M de acetato de sódio, pH 4,6, 4,5 mM de ZnSO^).

Adicionaram-se 15 unidades de nuclease.Sl e incubaram-se as amostras a 3090 durante 2 horas. Extractaram-se as amostras com fenol:clorofórmio e precipitaram-se pela adição de 2 volumes de eta nol. Para a localização do terminal 5', fraccionaram-se as amostras num gel de sequenciação de 5% de poliacrilamida-ureia. 5ep.a raram-se as amostras do terminal 3' num gel de agarose alcalina a 1%, preparado como se descreve em McDonnel, et al., 0. Mol. Biol. 110:119 (1977)).

Estas experiências de localização demonstram a existência de dois transcritos de ARN-m. A gp50:gp63 é uma região de codifl cação de ARN-m colinear, com início a 0,56 Kb 5' do centro Sal I e terminando a 1,8 Kb 3' do centro Sal I. 0 transcrito da ARNm da gl tem início a 0,4 Kb'5? do centro BstE II e termina a 0,2 Kb 3' do centro BamHI (Figura I).

II. Análise da sequência de nucleótldos

Os fragmentos de AON gerados por digestão com endonucleases de restrição ou por eliminação de Bal 31 foram subclonados em vectores M13 para sequenciação pelo método de terminação da cadeia de didesoxinucleotido (Sanger, et al., Proc. Natl. Açad. Sei.

USA 74:5463 (1977); Messing, Methods Enzymol. 101:20 (1983)) com dATP ³⁵S-marcado (Biggin, et al., Proc. Natl. Açad. Sei. USA 80: :3963 (1983). Os geles de sequênciação foram conduzidos tal como

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SK3 Case 14411

-29ss dsscreve em Reed, et al. , Biotechniques 4.:306 (1986 ). A sequência de alguns fragmentos foi também determinada pelo método químico de Maxam e Gilbert, Methods Enzymol. 65:499 (1980). Os fragmentos foram marcados no terminal 5' usando polinucleotidoquinase T4 e com í P-dATP ou marcados no terminal 3' usando o fragmento Klenoiu da ADN polimerase 1 de E. coli e o dNTP marcado 32 com P apropriado. Determinou-se a sequência de ambas as cadeias de AON.

Os resultados indicaram um codão ATG de iniciação da tradução localizado entre os nucleótidos 16-19, 3' do centro de início da transcrição definido pel3 experiência de localização 51. Existe uma cadeia de leitura aberta de 1206 nucleotidos codifica_n do 402 aminoácidos. A sequência da gp50 aqui determinada para a estirpe Eunkhauser do PRU (Shuba, et al♦, 0. Am. Vet. Med. Assoe. 173:1490 (l978))é aproximadamente idêntica à publicada para a estirpe Rice (Petrovskis, et al., supra, (1986)). Ocorre apenas uma diferença de uma única base na posição 468; contudo este facto não resulta numa modificação de aminoácidos.'

Exemplo 4: Isolamento de um vírus vacina recombinante contendo a região de codificação da qp5D:63

Examinou-se a expressão da gp5D:63 por imunoprecipitação de extractos de células ST, infectadas com Ugp50':63, radiomarcada com '^Z,c_giucosamina, com anticorpos de ratinho contra extractos de células Ugp50:63 infecciosas. A análise por SD5-PAGE dos imunoprecipitados revelou uma banda difusa compreendida entre um peso molecular de 62 Kd e um peso molecular de 58 Kd. Não se detec; taram quaisquer proteínas após a imunoprecipitação de células infectadas com vírus vacina. A análise dos imunoprecipitados de c.é lulas infectadas com PRU mostrou um padrão de bandas idêntico ao que se observou com células infectadas com Vgp5G:63. Assim, a gp50:63 sintetizada pelas células infectadas com vírus recombinari te parece ser muito similar à sintetizada por células infectadas com PRU.

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SKB Case 14411

-30Exemplo 5: Preparação da vacina

I. Inactivação de células infectadas com vacina

Para preparar uma solução de etilimina binária (BEI), acfí cionaram-se 0,3 g de partículas de hidróxido de sódio a 100 ml de água desionizada e incubou-se durante 30 minutos a 3790. Adicionou-se 2-bromoetilamina (BEA), 2,05 g, e incubou-se a solução a 3790 durante mais uma hora. Adicionou-se a solução de BEI à cultura de tecido infectado com vírus e aos fluidos, até uma concentração final de 1%. Retiraram-se amostras em vários instantes e inocularam-se em monocamadas de células ST ou CV-1 para procurar efeitos citopáticos. Normalmente, 96 horas a 379C foi o suficie_n te para desactivar as preparações de vírus. 0s extractos foram, por rotina, desactivados 120 horas e testaram-se em três passagens de retorno em monocamadas de CV-1 com ensaios de imunofluorescência indirecta (Vogt, em Fundamental TeChniques in Viroloqy, p.

316 (1969)) para assegurar que a desactivação tinha sido conseguj^ da.

II. Imunização e protocolos de desafio

Adquiriram-se porcos isentos de patogénios específicos (SPF) e mantiveram-se em isolamento até se realizar a serologia para determinar se tinha ocorrido ou não exposição prévia ao vírus. Após a quarentena vacinaram-se os oorcos com 2 ml de uma preparação de vacina contendo 1 ml de extractos de células de vaci. na divalente (gp50:63) recombinante, desactivada com BEI, mais 1 ml de 10% de lecitina em óleo mineral. Inocularam-se os porcos (com peso entre 4,5 e 6 kg) intramuscularmente (IM) no pescoço e desafiaram-se inoculando 0,5 ml de vírus virulento da pseudo-raiva em cada narina. 0 vírus de desafio foi o vírus da pseudo-raiva Funkhauser (IND-F2208) e o título estava compreendido entre 10 e 10 TCID^q dependendo do peso do porco.

Aos porcos administraram-se bacterinas de combinação preparadas adicionando 2 ml das preparações anteriores a uma prepara ção de bacterina. A preparação de bacterina foi preparada como se segue:

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5KB Case 14411

-31para uma protecção alargada em porcos, são necessárias s_e te estirpes de bactérias. A bacterina pode ser preparada a partir das duas estirpes de Pas teurella muitcc i da do tipo A e D, de três estirpes de Hgmop hilus pleuropneomoniae (estirpe 1, 5, 7), da Bordetella brochiseptica e da E rysipelothrix rhusiopathiae. Cultivou-se a E. rhusiopathiae até um O.D. de 5-6 num meio contendo 920 ml de meio básico, 30 ml de dextrose a 50% filtrada, e 50 ml de soro de cavalo, estéril. Desactivou-se a cultura adici_o nando formaldeído até uma concentração de 0,34-0,45% e mertiolato até uma concentração final de 0,01%. Adicionou-se gel de hidróxi. dc de alumínio estéril (2%) a uma solução a 25% (v/v). Cultivaram-se a Pasteurella e a Bordetella, desactivaram e adicionou-se adjuvante de um modo similar. Cultivaram-se as estirpes Hemophi1 us de um modo similar com a excepção de se ter usado gluteralde_í T M do (0,1%) para desactivar e 5% de Drakeol (Penreco, Butler, Pen nsylvania, E.U.A.) como adjuvante. Pr’eparou-se a vacina de combi. nação, combinando as preparações de bacterina desactivadas s adjuvadas (2 ml), com i ml de preparação de subunidade do PRV recombinante desactivada.

Recolheu-se o soro de pré-desafia em cada semana. Recolheu-se o soro de pés-desafio 3 dias após o desafio; recolheu-se sangue no dia 7 e no dia 14. As medidas clínicas adicionais após o desafio foram a temperatura, o ganho de peso e raspagens das amígdalas para determinar o nível de disseminação do vírus. A dis. seminação do vírus foi contabilizada como sendo o número de porcos em cada grupo de vacinação mostrando efeitos citopáticos positivos durante o período de observação clínica. As raspas das amígdalas foram agitadas, num agitador de vórtice, em um mi de PBS e inoculou-se toda a mistura numa placa de 24 cavidades contendo monocamadas de células ST em meio 199E (Laboratórios Gibco, Grand Island, Nem York, E.U.A.) contendo 1 ml por litro de gentamicina.

III. Determinação do titulo de anticorpos neutralizadores do ν 1 rus

Usando uma placa de 96 cavidades adicionaram-se lOO^uJ- de soro de suíno desactivado por calor à primeira fila do lado esquer do da placa. Trataram-se amostras de suíno na neutralização do vírus PRV em duplicado. As cavidades restantes adicionaram-se 50

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SK8 Case 14411

-32yj. de meio 199E tratado com gentamicina (l ml por litro). Prepararam-se diluições seriadas 1:2 e adicionaram-se 50 yk-l de vírus PRV (estirpe 3ucharest diluída 1: 500), em meio 199E , às cavidades. Incubaram-se as placas durante 1 hora a 37QC. Após a incubação adicionaram-se 100 yxl de células ST diluídas 1:3 em soro de vitelo fetal a 5%. Incubaram-se as placas a 37?C e determinou-se a formação de placas 3 dias depois.

IV. Preparação de vacina de subunidade (5UVA)

Propagou-se a estirpe (IND-E) do vírus da pseudo-raiva, p_a ra uso na preparação da vacina de subunidade do PRV (SUVA), na l_i nhagem de células porcinas dos Laboratórios Norden, NL-ST 1. 0 meio de crescimento usado para propagar as células NL-ST 1 foi o meio 199 (Gibco Cat. ^400-1100, Grand Island, Neu/ York, E.U.A.) com sais de Earles (meio. 199E) suplementado com 5% de soro fetal de bovino (EBS) e com 0,025% de hidrolisado de lactalbumina (LAH). 0 meio de manutenção é o meio 199E sem EBS ou LAH.

As culturas podem ser propagadas em vasos cilíndricas ou em micro-transportadores. Os micro-transportadores podem ser man tidos em balões ou em fermentadores giratórios de micro-transportadores. 0 volume de meio de crescimento usado é de 500 ml/vaso

2 cilíndrico de 850 cm , 1000 ml/vaso cilíndrico de 2200 cm^Z ou 1000 ml/l,5 g de Cytodex 3^^ (Pharmaco, Piscatauíáy, Neu/ Oersey, E.U.A.) em cultura de microtransportador.

Cultivam-se as células para a produção de SUVA até à confluência de 85-90% em meio de crescimento’. Decanta-se o meio de crescimento e adiciona-se o vírus de semente até uma mui tipi ici dja de de infecção (M0I) de 5. Utiliza-se um M0I elevado para assequ rar uma replicação num único ciclo. Perfazem-se então as culturas em vaso cilíndrico, até l/5 do volume original de meio de crescimento, com meio de manutenção (não se decanta o inóculo de vírus) e incuba-se a 379C até 80-90% das células na monocamada es tarem inchadas e rodeadas de infecção virai, mas não separadas da monocamada de células. As culturas de microtransportador são tratadas de um modo similar com a excepção de se encherem as culturas, até metade do volume original do meio de cultura, com meio de manutenção.

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SKB Case 14411

-3 3Ouando 80-90% da monocamada de células fica infectada, co lhem-se as culturas por decantação do meio de manutenção/suspensão de vírus semente e congelamento da monocamada de células a -70°C. Descongelam-se as monocamadas e adiciona-se tampão de Tris-Tricina C,025 M, pH 8,6 numa proporção de 3 ml de tampão/850 cm de monocamada de células. Mantém-se esta suspensão a 4SC e submete-se a tratamento ultra-sónico ligeiramente para lisar as células. Adiciona-se agora detergente não-iónico Triton X-100 até uma concentração final de 1% e agita-se a suspensão a 49C de um dia para o outro. Centrifuga-se a suspensão 2 OOOxg durante 30 minutas para remover os restos não solubilizados das células e os microtransportadores, se se produziu a SUVA em cultura de microtransportador. Centrifuga-se o sobrenadante a 100 OOOxg duran te 1 hora para separar a fase lípida da fase aquosa e recolhe-se a fase aquosa (SUVA em btuto) para purificação por cromatografia líquida.

Carrega-se a SUVA em bruto numa coluna,de lectina de feijão de lentilha, que é depois lavada com tampão de Tris-Tricina 0,025 M, pH 8,6, até não haver eluição de proteína, tal como é d_e terminado por absorção a 280 nm. Após a lavagem elui-se a prote_í na especificamente ligada com metil-D-manosido 0,3 M em tampão de Tris-Tricina 0,025 M, pH 8,6. 0 material especificamente eluído é a SUVA. Determina-se a concentração em proteína, dilui-se a SUVA para conter 50 jug/ml e adiciona-se adjuvante.

Exemplo 6: Preparação de um conjunto de diagnóstico do PRV (ELISA)

Imunizaram-se subcutaneamente ratinhos BALB/c fêmeas (6 a 8 semanas de idade) com 0,2 ml de estirpe do PRV (IND-F) (indiana -Eunkhauser) (50 ^jg de proteína), desactivada por calor (60SC, d_u rante 1 hora), purificada em gradiente, emulsionada em Adjuvante Completo de Ereunds. 0s ratinhos foram reforçados quatro semanas mais tarde por inoculação intraperitoneal (i.p.) com vírus vivo (100 ysg de proteína) sem adjuvante. Três dias após a última in je_c ção de antigánio, sacrificaram-se os animais imunizados e fundiram-se as células do baço com células de plasmacitoma de ratinho NSl/Ag4 ( em Methods in Enzymoloqy, Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies, p. 3 (1986)).

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-34Seleccionaram-se cs hibridomas que segregam anticorpos contra as glicoproteinas do PRV, analisando os sobrenadantes da cultura por ELISA. Adicionaram-se os sobrenadantes da cultura às cavidades de placas de microtítulo de poliestireno que estavam re* vestidas com uma concentração óptima de preparações de vírus em bruto das estirpes IND-F ou Bucharest (BUK) do PRV. A estirpe BUK do PRV é a estirpe de vacina licenciada pela Norden e não pro duz a glicoproteína gl (Lumniczi, et al ♦ , 0. Virol. 61:796 (1987)) Cavidades revestidas com uma preparação similar de células não infectadas serviram como controlos. Cs anticorpos ligados foram detectados pela imunoglobulina de cabra anti-ratinho marcada com peroxidase (específica da cadeia /). Os hibridomas que produziram anticorpos que reagiram com IND-F e que reagiram pouco ou não reagiram com a BUK ou com as células de controlo, foram expandidas para concretização adicional. Os hibridomas positivos foram clonados duas vezes por diluição limitanté. Usou-se o hibridoma designado por 2-184 para a produção de ascite e desenvolvimento do ELISA de diagnóstico.

A estabilidade do hibridoma para produção de anticorpos, após passagem alargada em cultura de tecido, foi determinada por ELISA. Testaram-se diluições seriadas de 1:2 de sobrenadante da cultura ou de ascite, obtido antes ou após a produção do hibridoma de semente principal, em cavidades de microtítulo revestidas com antigénio de PRV-IND-F tal como anteriormente se descreveu.

Calculou-se o título dos fluidos contendo anticorpos como sendo o inverso da diluição com a qual se obtém um valor de absor vância de 0,300 (A^g^) após 15 minutos de incubação com substrato. Os resultados confirmaram que o título de anticorpos do sobrenadante da cultura permaneceu essencialmente o mesmo durante 20 pas. sagens do hibridoma. 0 título de anticorpo da ascite era aproximadamente idêntico quer fosse produzido a partir de semente pré-principal ou a partir das células hibridoma da semente principal.

11. Ascite

0s hibridomas obtidos da clonação foram injectados em ratinhos fêmea BALB/c (10-14 semanas de idade) para a produção de ascite. Trataram-se os ratinhos com 0,5 mi de pristano, i.p., se

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-35te a dez dias antes da inoculação i.p. com 1 x 10^ células hibridoma em solução salina. Colheu-se a ascite 10-12 dias após a injecção das células hibridoma. Removeram-se as células por csntri fugação a 2 500xg durante 30 minutos e congelou-se o fluido em porções alíquotas a -7020.

III. Conjunto de diagnóstico ELISA usando anticorpos moncclonais

Pode usar-se a proteína gl recombinante como antigénio principal em vez de vírus inteiro para um conjunto de diagnóstico de ELISA competitivo.

teste ELISA competitivo de diagnóstico foi realizado re vestindo as cavidades de uma placa de microtítulo de poliestireno com uma concentração óptima de 400 ^tg e 600 pug, preferivelmente de 500 ^tg de preparação de antigénio de vírus da estirpe IND-F do PRV.

Revestiram-se as cavidades com 100 JLxl de antigénio de vírus inteiro diluído em tampão de bicarbonato-carbonato, pH 9,6 (l,59 g de Na2C0^, 2,93 g de NaHCO^/litro de água desionizada). Incubaram-se as placas a 4SC durante IB horas antes do uso. Lava ram-se as placas revestidas com antigénio, três vezes com solução salina tamponada com fosfato contendo 0,05% de Tween 20 (PBS-Tuj). Todos os passos de lavagem subsequentes foram realizados deste m_o do. Os centros de ligação restantes foram bloqueados pela adição de 250 yUjL de PBS-1% de albumina de soro bovino (PBS-BSA) a ca da cavidade e incubaram-se as placas a 3720 durante 30 minutos. Lavaram-se as placas três vezes e às cavidades adicionaram-se po_r ções alíquotas de soro suíno. Após incubação a 3720 durante 1 ho ra, lavaram-se as placas e adicionaram-se às placas porções aliquotas de 50 pl de uma diluição óptima de anticorpos monoclonais (Mab) em PBS-BSA. Incubaram-se as placas a 3720 durante 1 hora. Detectou-se o Mab ligado nas placas lavadas, pela adição de 50y4de imunoglobulina de cabra anti-ratinho marcada com peroxidade (específica da cadeia ) diluída em PBS-BSA. Após incubação a 3720 durante 1 hora, lavaram-se as placas e adicionaram-se às pia cas 100 pl de substrato ABTS (2,2’-azino-di/~3-etil-benzotiazoli68 706

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-36no sulfonato(6)_75 Laboratórios Kirkguard e Perry, Gaithersdurg, Maryland, G.U.A.). Os valores de Absorvância (A _Q ) foram determinados após uma incubação de 10-15 minutas com substrato à temp_e ratura ambiente.

IU. Isolamento da sonda de gene ql

Como fonte de sondas de diagnóstico de genes usam-se clones de AON recombinante representando a região U do AON genómico do IND-F. As regiões usadas como sondas de gene incluem o AON c_o dificado entre o centro Dral-BamHI tal como se indica na Figura 1. 0 centro Dral-BamHI identificará um corpo de codificação principal da proteína gl. Uma segunda sonda representando um centro BamHI-SalI actua como uma sonda secundária para a região de termi nação do ARN-m da gl (Figura l). Ambos os fragmentos de gene são necessários para determinar se a região de codificação usada para fazer o transcripto de ARN-m do gl está presente no ADN genómico. Pode hibridar-se Dra HI-Bam HI ou Bam HI para o Sal I, radiomarca do, com ADN genómico digerida com Bam HI para confirmar a ausência ou a presença da região de ARN-m da gl. As técnicas para a síntese e análise para determinação das sondas de gene podem ser realizadas como anteriormente se descreveu (Maniatis et al., supra, (1982)).

□ teste de diagnóstico para determinara’ eliminação do qe ne gl realiza-se extractando o ADN de virús inteiros do PRU seguindo-se o isolamento e digestão de 1-2 ybug de ADN genómico de v_i rus inteiros com Bam HI. Resolve-se o ADN fragmentado num gel de 1% de agarose, desnatura-se e transfere-se para nitrocelulose usando métodos de laboratório convencionais. Sonda-se então o ADN genómico com ADN, marcado com enzima ou com um radioisótopo representando regiões seleccionadas do ADN da região U do PRU <Figura l). Podem detectar-se, por exposição a filme de raios-X, bandas individuais de ADN, por exemplo, as esoecificas do ADN Dra I-Bam HI (gl).

Exemplo 7: Preparação da vacina de combinação

Cultivam-se as culturas usadas para a produção de bacteri. nas até uma densidade óptica (OD) de 1-3 unidades, e depois desacti.

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-37vam-se adicionando beta-propiolactona (9PL) até uma concentração final de 0,2%. Agitam-se depois as culturas 12 horas a 2D?C e fixam-se com formalina (concentração final de C,4.o para a Bordetella, Pasteurella, Erysipelatrix e 0,1% de glutaraldeído para a Haemophilus). 0 volume necessário para uma dose imunizante eficaz é retirado de cada cultura e combinado num único volume. Nor malmente, a preparação desactivada combinada perfaz 2-4 ml. Para adicionar adjuvante às preparações, colocam-se estas num emulsionador (Emulsionador Ross, Long Island, NY, E.U.A.) a adiciona-se óleo mineral (Penreco, Bulter, PA) com lecitina (MRK5 Marketing Service, Omaha, NE, E.U.A.) (ou outro adjuvante desejado) até 5%. Agita-se a bacterina ou mistura-se até a preparação estar homogénea. Pode adicionar-se Tuieen BO¹^ (14 ml/l) e Span BD^lM (6 ml/l) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, E.U.A.) para auxiliar a emulsão na fase oleosa. ·

As preparações de vacina de subunidade de PRV recombinante desactivado com BEI (ver exemplos anteriores) podem ser emulsio nadas sozinhas tal como anteriormente se descreveu, ou podem combinar-se com bacterinas antes da emulsão. Combinações típicas contendo quatro patogénios ou mais, têm 3-5 ml/dose após a adição de adjuvante, enquanto que um volume de 0,1-1 ml/dose é representativo de cada preparação de patogénio individual.

Exemplo 8: Fusão de genes de ADN recombinante da qastroentrite transmissível com genes qp50:qp63 da Pseudo-rajya

Podem fundir-se os genes da gastroentrite transmissível (TGE) com clones recombinantes de gp50i63 do PRV-vacina, para construir uma vacina multivalente. Pode recombinar-se o gene da glicoproteína El ou do nucleocápsido (N) da TGE com a região gp50:63 a uma distância óptima para reiniciação da polimerase de ARN. Pode construir-se uma cassette de transcrição contendo um promotor de 7,5 Kd da vacina e os genes El ou N da TGE em vectores de vaivém de E. coli convencionais. Pode então transferir-se a cassette de transcrição para montante ou para jusante da região gp50:63 do PRV promotor de 7,5 Kd de vacina existente no plasmideo pGS20. Pode recombinar-se então o plasmideo p50:63:TGE multivalente em vacina-TK tal como se descreveu em exemplos ante

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-33riores. 0 vírus recombinante resultante contará componentes de subunidade muitivalentes para uso numa vacina desactivada contra as doenças induzidas pelo PRV ou TGE em suínos.

De um modo similar poder-se-iam incorporar outros genes de patoaénios problemáticos em suínos (tais como a desenteria su_í na, mycoplasma pneumoniae, parvovírus porcino, grioe suína), numa vacina multiualente usando o gp50:63 de vacina-PRV como vector principal para a produção de antigénios de subunidade em cultura de tecidos.

A descrição anterior e os exemplos descrevem exaus tivamejn te a invenção, incluindo as suas concretizações preferidas. Pres supõe-se que as modificações dos processos que aqui se descrevem, que são óbvios para os peritos na arte da produção de vacinas, são abrangidos nas reivindicações seguintes.

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Processo de preparação de uma vacina contra a infecção provocada pelo PRV vírus da pseudo-raiva, caracterizado por compreender:

   a) a expressão de antigénios de subunidade de PRV, gp50:63 num microrganismo ou célula hospedeira recombinante;

   b) a recolha dos antigénios para formulação numa vacina.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender:

   a) a expressão de antigénios de subunidade de PRV, gp50:63 num sistema de cultura de tecidos do vírus da vacina;

   b) o tratamento do vírus recombinante obtido no passo (a) com um agente químico de desactivação; e

   c) a recolha do vírus recombinante desactivado e do extracto de células para formulação numa vacina.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a desactivação química ser conseguida por tratamento do vírus da vacina recombinante com etileno-imina binária.
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por os antigénios de subunidade serem formulados numa vacina por combinação do vírus recombinante desactivado, com um adjuvante seleccionado entre óleo-lecitina, extracto de saponina, al-hidrogel ou óleo mineral.
5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o antigénio de subunidade ser formulado numa vacina por combinação do vírus recombinante desactivado, com um adjuvante de óleo-lecitina.