ES2209052T3 - Vacuna recombinante del birnavirus. - Google Patents
Vacuna recombinante del birnavirus.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN MUTANTE DE BIRNAVIRUS, QUE ES ADECUADO COMO CANDIDATO PARA UNA VACUNA EN PROGRAMAS DE CONTROL DE ERRADICACION. DICHO MUTANTE NO ES CAPAZ DE PRODUCIR UNA PROTEINA VP5 NATIVA, Y DICHA CARACTERISTICA SE PUEDE UTILIZAR COMO MARCADOR, PARA DISTINGUIR ENTRE ANIMALES VACUNADOS CON EL MUTANTE VPS O INFECTADOS CON EL BIRNAVIRUS PRESENTE EN LA NATURALEZA.
Description
Vacuna recombinante del birnavirus.
La presente invención tiene que ver con un
birnavirus mutante, una vacuna que comprende este mutante, un método
para determinar la infección por birnavirus en un animal, así como a
un estuche de ensayo para llevar a cabo este método.
El virus de la enfermedad bursal infecciosa
(IBDV) y el virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) son
miembros de la familia Birnaviridae. Los virus de esta
familia tienen una organización genómica muy similar y un ciclo de
replicación similar. Los genomas de estos virus constan de 2
segmentos (A y B) de ARN de doble hebra (dh). El segmento más grande
A codifica una poliproteína que es escindida por autoproteolisis
para formar las proteínas virales maduras VP2, VP3 y VP4 (Hudson,
P.J. y col., Nucleic Acids Res., 14, 5001-50012,
1.986; Dobos P., Annual review of fish diseases 5,
25-54, 1.995). VP2 y VP3 son las principales
proteínas estructurales del virión. VP2 es el principal inmunógeno
protector del huésped de los birnavirus, y contiene las regiones
antigénicas responsables de la inducción de los anticuerpos
neutralizadores. La proteína VP4 parece ser una proteasa codificada
por el virus que está implicada en la maduración de una poliproteína
precursora de las proteínas VP2, VP3 y VP4. El segmento más grande A
posee también un segundo marco de lectura abierto (ORF), que precede
y se solapa parcialmente con el gen de la poliproteína. Este segundo
marco de lectura abierto codifica una proteína VP5 de función
desconocida que está presente en las células infectadas por IBDV
(Mundt, E. y col., J. Gen. Virol., 76,
437-443, 1.995).
El segmento más pequeño B codifica la VP1, una
proteína multifuncional de 90 kDa con actividades enzimáticas de
polimerasa y formación de caperuza (Spies, U. y col., Virus Res., 8,
127-140, 1987 y Spies, U. y col., J. Gen Virol., 71,
977-981, 1.990; Duncan R. y col., Virology
181, 541-552, 1.991).
Para IBDV, existen dos serotipos, el serotipo 1 y
2. Los 2 serotipos pueden ser diferenciados por ensayos de
neutralización de virus (VN). Además, se han aislado subtipos de
serotipo 1. Estos denominados virus "variantes" de serotipo 1
pueden ser identificados mediante ensayos de neutralización cruzada
(Diseases of Poultry, 9ª edición, 1.991, Wolfe Publishing Ltd. ISBN
0 7234 1706 7, Capítulo 28, P.D. Lukert e Y.M. Saif,
648-663), un panel de anticuerpos monoclonales
(Snyder, D.B. y col., Arch. Virol., 127, 89-101,
1.992) o RT-PCR (Jackwood, D.J., Proceedings of the
International symposium on infectious bursal disease and chicken
infectious anaemia, Rauischholzhausen, Germany,
155-161, 1.994). Algunos de estos subtipos de
serotipo 1 de IBDV han sido descritos en la literatura por ejemplo:
cepas Classical, Variant-E, GLS, RS593 y DS326 (Van
Loon, y col. Proceedings of the International symposium on
infectious bursal disease and chicken infectious anaemia,
Rauischholzhausen, Germany, 179-187 , 1.994).
La enfermedad Bursal Infecciosa (IBD), también
denominada enfermedad de Gumboro, es una infección viral aguda
altamente contagiosa en pollos que tiene el tejido linfoide como
diana principal con un tropismo selectivo por las células de la
bolsa de Fabricius. La tasa de morbidez en las agrupaciones
susceptibles es elevada, con una rápida pérdida de peso y tasas de
mortalidad moderadas. Los pollos que se recuperan de la enfermedad
pueden tener deficiencias inmunes debido a la destrucción de la
bolsa de Fabricius que es esencial para el mecanismo de
defensa del pollo. El virus IBD causa una inmunosupresión grave en
los pollos menores de 3 semanas de edad e induce lesiones bursales
en pollos de hasta 3 meses de edad.
Durante muchos años la enfermedad pudo ser
evitada induciendo elevados niveles de anticuerpos en agrupaciones
reproductoras mediante la aplicación de una vacuna inactivada, a
pollos que habían sido cebados con una vacuna de IBDV vivo atenuado.
Esto ha mantenido las pérdidas económicas debidas a IBD en un
mínimo. Los anticuerpos maternos en pollos derivados de
reproductores vacunados evitan la infección temprana con IBDV y
disminuyen los problemas asociados con la inmunosupresión. Además,
las vacunas vivas atenuadas también han sido utilizadas con éxito en
agrupaciones de pollos comerciales una vez que los anticuerpos
maternos habían disminuido.
Recientemente, cepas muy virulentas de IBV han
causado epidemias de la enfermedad con una elevada mortalidad en
Europa. Los programas de vacunación actuales no logran proteger
suficientemente a los pollos. Los fracasos de la vacunación se
debían principalmente a la incapacidad de las vacunas vivas para
infectar las aves antes de la sensibilización con virus de campo
virulentos.
La erradicación de la enfermedad mediante otras
medidas preventivas distintas de la vacunación no ha sido factible,
debido a que el virus está ampliamente disperso y debido a que con
las vacunas de IBDV atenuadas vivas o inactivadas administradas en
la actualidad no es posible determinar si un animal específico está
infectado con un virus de campo IBDV o si el animal estaba vacunado
con una vacuna de IBDV. Con el fin de poder iniciar un programa de
control de erradicación para IBDV es muy deseable que exista la
posibilidad de discriminar entre los animales vacunados con una
vacuna de IBDV y aquellos infectados con un virus de campo con el
fin de poder tomar medidas apropiadas, es decir, eliminar las
agrupaciones infectadas, para reducir la dispersión del virus de
campo virulento. La introducción, por ejemplo, de un marcador
identificable serológicamente se puede lograr introduciendo una
mutación en los genes que codifican (glico)proteínas no
esenciales del IBDV que todavía originan la producción de
anticuerpos en un animal huésped infectado. Se ha demostrado el
valor práctico de una vacuna marcadora para la enfermedad de
Aujeszky y los ensayos de diagnóstico acompañantes relacionados en
el control de esta enfermedad. Si bien están en desarrollo
semejantes programas para el control de las infecciones virales en
animales, hasta la presente invención no se ha descrito una cepa de
vacuna para IBDV que pueda ajustarse a los programas de control de
IBDV.
Mundt y Köllner (Annual Meeting of the German
Federal Research Institute for virus diseases in animals, Marzo
1.997) describen la construcción de un IBDV mutante que fracasa al
expresar una proteína VP5 como resultado de una mutación diseñada
genéticamente en el codón de iniciación del gen de VP5. Esta
mutación comprende la sustitución de un nucleótido en el codón de
iniciación del gen VP5.
La presente invención proporciona un birnavirus
mutante como se define en las reivindicaciones que no es capaz de
producir una proteína VP5 nativa como resultado de una mutación en
el gen VP5 del genoma del birnavirus.
Preferiblemente, el birnavirus mutante es un IBDV
mutante o un IPNV mutante, siendo el IBDV mutante el más preferido,
en particular se proporciona en la presente invención un IBDV
mutante derivado de un virus IBD de serotipo 1.
Se demuestra que un IBDV mutante que no es capaz
de producir una proteína VP5 todavía es capaz de infectar la
volatería y de replicar en los animales huésped infectados in
vivo, es decir, se proporciona la evidencia de que el gen que
codifica la proteína VP5 no es un gen esencial. En los Ejemplos 3 y
4 se muestra que el IBDV VP5^{-} puede ser aislado de nuevo a
partir de órganos de animales infectados con el IBDV mutante y que
el IBDV mutante induce una respuesta inmunoprotectora en los
animales infectados.
Por otra parte, se ha establecido aquí que parte
de la respuesta inmune anti-IBDV normal en la
volatería está dirigida a la región VP5. Esto es bastante
sorprendente ya que se considera que la proteína VP5 representa una
proteína viral no estructural (Mundt y col., J. Gen. Virol.
76, 437-443, 1.995) y la respuesta inmune en
un animal contra un patógeno viral es provocada contra las
(glico)proteínas estructurales del virus. Estos
descubrimientos hacen del IBDV mutante y de otros birnavirus
mutantes según la presente invención un candidato a vacuna adecuado
para una vacuna marcadora. Semejante vacuna marcadora proporciona la
posibilidad de determinar si los animales están infectados con un
birnavirus de tipo salvaje, v.g. IBDV, o con un virus vacuna.
Adicionalmente, se ha descubierto que la proteína
VP5 está implicada en la expresión de la virulencia de los
birnavirus, en particular de IBDV, y que la incapacidad de los virus
mutantes para producir la proteína VP5 nativa conduce a una
atenuación del virus.
Con el término "que no es capaz de producir una
proteína VP5 nativa" se quiere significar que el birnavirus
mutante produce un polipéptido que se puede distinguir mediante
ensayos serológicos de la proteína VP5 nativa, o no produce una
proteína VP5 en absoluto. Por ejemplo, en el primer caso, el
birnavirus mutante produce sólo un fragmento de la proteína VP5 de
birnavirus nativa que carece de uno o más epítopos
inmunogénicos.
Preferiblemente, el birnavirus mutante según la
invención no produce la proteína VP5 tras la infección de una célula
huésped.
Como se ha descrito antes, la organización
genómica de los birnavirus está bien establecida: el genoma de IBDV
o IPNV comprende un segmento grande A y un segmento más pequeño B.
El segmento A de IBDV comprende un marco de lectura abierto grande
(ORF) que codifica una poliproteína de aproximadamente 110 kDa
(VP2-VP4-VP3). El gen que codifica
la proteína VP5 está identificado en la técnica anterior, y definido
aquí, como el ORF pequeño del segmento A del genoma de birnavirus
que precede y se solapa parcialmente con la poliproteína que
codifica el ORF (Bayliss y col., J. Gen. Virol. 71,
1303-1312, 1.990; Spies y col., J. Gen. Virol.
71, 977-981, 1.990; Havarstein L.S. y col.,
J. Gen. Virology 71, 299-308; 1.990; Dobos y
col., 1.995, supra; Figuras 1-3 de la presente y SEC
ID Núms. 1-7). La mutación introducida en el gen VP5
es tal que no evita la expresión de la poliproteína.
La SEC ID Núm. 1 comprende la secuencia de
nucleótidos del ADNc en toda su longitud del segmento B de la cepa
P2 de IBDV, así como la secuencia de aminoácidos de la proteína VP1
codificada por el segmento B (ver también la SEC ID Núm. 2). Las SEC
ID Núms. 3 y 5 representan la secuencia de ADNc en toda su longitud
del segmento A de la cepa D78 de IBDV y la región codificadora de la
proteína VP5 y la poliproteína, respectivamente. Las SEC ID Núms. 3
y 4 también muestran la secuencia de aminoácidos de la proteína VP5
de D78. Las SEC ID Núms. 5 y 6 muestran la secuencia de aminoácidos
de la poliproteína VP2-VP4-VP3 de
D78. La SEC ID Núm. 7 muestra el extremo 5' del segmento A de la
cepa D78, incluyendo las mutaciones introducidas en la región
codificadora de VP5. La SEC ID Núm. 8 muestra la secuencia de
nucleótidos del segmento B de la cepa D78 y la secuencia de
aminoácidos de la proteína VP1 de D78. La organización genómica de
ambos segmentos también se muestra en la Figura 1.
El ORF que codifica VP5 se conserva en todas las
secuencias del segmento A publicadas hasta ahora. El ORF de IBDV
codifica 145 aminoácidos que dan como resultado una masa molecular
de 16,5 kDa. La secuencia de nucleótidos del ORF que codifica la
proteína VP5 de la cepa D78 de IBDV utilizada aquí se muestra en las
SEC ID Núms. 3 y 4. Pueden existir variaciones naturales entre los
productos aislados de IBDV individuales. Estas variaciones naturales
resultan de pequeñas diferencias en los genomas de estos virus. La
secuencia de nucleótidos del segmento A, incluyendo la secuencia de
nucleótidos del gen VP5 para muchos productos aislados de IBDV se ha
descrito en la técnica anterior (Vakharia y col., Avian Diseases
36, 736-742, 1.992; Bayliss y col., J. Gen.
Virol. 71, 1303-1314, 1.990; Hudson y col.,
Nuc. Acid Res. 14, 5001-5012, 1.986;
Schnitzler y col., J. Gen. Virol. 47,
1563-1571, 1.993; Kibenge y col., J. Gen. Virol.
71, 569-577, 1.990 y Virology 184,
437-440, 1.991; Mundt y col., Virology 209,
10-18, 1.995; Lana y col., Virus Genes 6,
247-259, 1.992; Vakharia y col.,Virus Res.
31, 265-273, 1.994; Brown y col., Virus Res.
40, 1-15, 1.996). La secuencia de aminoácidos
de la proteína VP5 de las cepas de IBDV de serotipo I muestran una
homología de al menos el 95% con la secuencia de aminoácidos de VP5
mostrada en las SEC ID Núms. 3 y 4, mientras la homología entre la
secuencia de VP5 del serotipo II y la secuencia de aminoácidos
mostrada en las SEC ID Núms. 3 y 4 es de al menos el 75%. Por lo
tanto, un IBDV mutante preferido según la presente invención es un
IBDV mutante en el que la mutación es introducida en el gen VP5 que
tiene una homología de al menos el 75%, en particular al menos el
95% a nivel de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de
aminoácidos de VP5 mostrada aquí.
Preferiblemente un IBDV mutante según la presente
invención deriva de cualquiera de las cepas de vacuna de IBDV
clásicas o variantes (v.g. variante E o GLS), tales como las
utilizadas actualmente en el campo. Entre semejantes cepas de IBDV
adecuadas se incluyen las cepas de vacuna de IBDV presentes en las
vacunas asequibles comercialmente: D78, PBG 98, LZ 228E,
89-03 (Intervet International B.V.), Bursine 2 (Fort
Dodge Animal Health) y S 706 (Rhône Mérieux).
Un IBDV mutante preferido concreto según la
invención deriva de la cepa D78 que comprende un gen VP5 que
codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada
en las SEC ID Núms. 3 y 4.
Alternativamente, la cepa de birnavirus de origen
para el virus mutante según la invención es una cepa de campo de
birnavirus virulenta. Aquí se encuentra que la proteína VP5 es un
factor asociado con la virulencia, y que la ausencia de la proteína
VP5 nativa en un birnavirus da como resultado una forma atenuada del
virus.
Preferiblemente la invención proporciona un
birnavirus mutante que no es capaz de producir una proteína VP5
nativa como resultado de una mutación en la parte del gen VP5 que no
se solapa con el ORF grande que codifica la poliproteína.
En particular, el birnavirus mutante según la
invención comprende una mutación en el extremo 5' del gen VP5 que
abarca los nucleótidos 1-30, preferiblemente
1-20, más preferiblemente 1-10. Es
muy preferido un birnavirus mutante que tiene una mutación en los
nucleótidos 1-3 del gen VP5.
Se entiende que una mutación es un cambio de la
información genética en el gen VP5 con respecto a la información
genética presente en esta región del genoma del birnavirus de origen
natural que produce la proteína VP5 nativa. La mutación es, por
ejemplo, una sustitución, deleción, inserción o inversión de un
ácido nucleico, o una combinación de las mismas.
En una realización preferida de la presente
invención se proporciona un birnavirus mutante donde la mutación es
una sustitución de uno o más nucleótidos. En particular, se
introduce una sustitución de ácido nucleico en el codón de
iniciación, como resultado de la cual el nuevo codón codifica un
aminoácido distinto de metionina o representa un codón de
terminación, preferiblemente la sustitución del ácido nucleico
comprende al menos dos de los nucleótidos del codón de
iniciación.
Un birnavirus mutante adicional según la
invención comprende una sustitución de uno o más nucleótidos en uno
o varios codones diferentes del codón de iniciación dando como
resultado uno o más codones de terminación, preferiblemente en el
extremo 5' del gen VP5 definido antes, si se desea además de una
sustitución en el codón de terminación descrito antes.
Preferiblemente, el birnavirus mutante comprende un codón de
terminación en esta región del gen VP5 en cada uno de los tres
marcos de lectura.
Semejante birnavirus mutante puede ser un IBDV
mutante que tenga una mutación en el codón de iniciación, el cuarto
y el sexto codón del gen VP5, dando como resultado preferiblemente
los codones mutados mostrados en la SEC ID Núm. 7 y la Figura 3.
Alternativamente, se proporciona un birnavirus
mutante donde la mutación es una deleción. En particular, la
deleción comprende menos de 20, menos de 10 o menos de 5
nucleótidos. Preferiblemente, la deleción comprende un número total
de nucleótidos no divisible por tres, dando como resultado un
desplazamiento del marco de lectura.
Preferiblemente la deleción comprende uno o más
nucleótidos del codón de iniciación del gen VP5.
En una realización alternativa de la presente
invención se proporciona un virus mutante en el que la mutación
comprende la inserción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga
en el genoma de birnavirus. Una secuencia de ácido nucleico
heteróloga es una secuencia de ácido nucleico no presente
normalmente en el sitio de inserción específico de la especie de
virus concreta.
La secuencia de ácido nucleico heteróloga que se
va a incorporar en el genoma de birnavirus es un fragmento de ácido
nucleico que o bien codifica un polipéptido o bien es una secuencia
no codificadora. El fragmento de ácido nucleico puede derivar de
cualquier fuente, v.g. viral, eucariota, procariota o sintética,
incluyendo oligonucleótidos adecuados para la interrupción de la
expresión del gen VP5.
Un oligonucleótido adecuado para la interrupción
de la expresión de VP5 puede comprender tres codones de terminación
traduccional en cada uno de los posibles marcos de lectura en ambas
direcciones, además de uno o más sitios de escisión para la enzima
de restricción apropiada útiles para la inserción de una segunda
secuencia de ácido nucleico heteróloga. La longitud y la secuencia
de nucleótidos de semejante secuencia de ácido nucleico heteróloga
no codificadora no es crítica, pero varía preferiblemente entre 8 y
50 nucleótidos.
En una realización adicional de la presente
invención se proporciona un birnavirus mutante que puede ser
utilizado no sólo para la preparación de una vacuna contra la
infección por un birnavirus específico, sino también contra otras
enfermedades infecciosas de la volatería o los peces. Por ejemplo,
una vacuna vectora basada en un IBDV mutante tal que ofrece la
posibilidad de inmunizar contra otros patógenos aviares mediante la
expresión de antígenos de estos patógenos aviares en células
infectadas del huésped inmunizado. Semejante IBDV vector según la
presente invención puede ser obtenido insertando una secuencia de
ácido nucleico heteróloga que codifica un polipéptido heterólogo
para IBDV en el gen VP5 identificado aquí.
La secuencia de ácido nucleico heteróloga puede
codificar un antígeno de un patógeno aviar tal como un virus de la
enfermedad de Newcastle, un virus de la bronquitis infecciosa, un
virus de la enfermedad de Marek, un virus de la encefalomielitis
aviar, un reovirus aviar, un virus de la influenza aviar, un virus
de la anemia de pollos, Salmonella spp., E. coli, y
Eimeria spp.
Además, un IBDV mutante según la invención
comprende además de la mutación en el gen VP5, una mutación en el
gen VP2, en la que este gen expresa una proteína quimérica que
comprende epítopos neutralizadores de más de un tipo antigénico de
IBDV (v.g., clásico, Variante-E y/o GLS).
Preferiblemente, semejante mutante comprende los epítopos de VP2
protectores relevantes de una cepa de la variante GLS y una cepa
clásica. En particular, el gen VP2 mutado es un gen VP2 de GLS que
comprende un fragmento de la secuencia de ácido nucleico que
codifica el epítopo B69. La construcción de semejantes genes VP2
mutados se describe en Snyder y col., Avian Diseases 38,
701-707, 1.994.
Además, se pueden incorporar al gen VP5
secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos para
aplicaciones farmacéuticas o de diagnóstico, en particular
inmunomoduladores tales como las linfoquinas, los interferones o las
citoquinas. La secuencia de ácido nucleico heteróloga también puede
codificar un marcador seleccionable, tal como
\beta-galactosidasa de E. coli o
\beta-glucuronidasa de E. coli.
La construcción de birnavirus mutantes, en
particular de IBDV mutantes según la presente invención puede ser
lograda por medio del sistema de ARNc infeccioso para IBDV recién
establecido (Mundt y Vakharia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93,
11131-11136, 1.996). Este sistema genético inverso
abre la posibilidad de introducir mutaciones en el genoma de ARN del
virus IBD, en particular en el gen VP5. La etapa más importante de
este sistema genético inverso es proporcionar clones de ADNc en toda
su longitud de los segmentos A y B del virus IBD. Los constructos de
ADNc que comprenden el segmento A o B, incluyendo los nucleótidos de
los extremos 5' y 3' de ambos segmentos pueden ser generados según
el método descrito por Mundt y Vakharia (1.996, supra).
Adicionalmente, estos constructos comprenden un promotor de la ARN
polimerasa conectado operablemente a cualquiera de los segmentos. El
promotor puede ser el promotor para la polimerasa T7, SP6 o T3,
siendo preferido el promotor para T7. Las mutaciones pueden ser
introducidas en el gen VP5 por medio de métodos generalmente
conocidos en la técnica para este fin. En particular, la mutación o
mutaciones son introducidas por medio de mutagénesis dirigida al
sitio.
Por ejemplo, en una primera etapa se proporciona
un fragmento de ADNc que comprende al menos una parte sustancial del
gen VP5. En la siguiente etapa se diseñan pares de cebadores
adecuados y se hibridan con la secuencia de VP5 que contiene el
fragmento. El cebador 5' comprende además de las secuencias
complementarias a la secuencia de VP5, nucleótidos que albergan la
mutación deseada, v.g. una mutación que cambia el codón de
iniciación ATG por un codón AGG (arginina). Por otra parte, el
cebador 5' es proporcionado con una secuencia de nucleótidos aguas
arriba que representa un sitio de escisión para la enzima de
restricción adecuada que permite la restauración de la secuencia no
codificadora del extremo 5' completa. Con posterioridad, el
fragmento recién mutado es amplificado utilizando la PCR y el nuevo
fragmento es introducido en la secuencia de partida remplazando la
secuencia de ácido nucleico nativa utilizando enzimas de restricción
apropiadas. En la siguiente etapa se generan in vitro
transcritos de sentido positivo del segmento A y B con ARN
polimerasa (T7), después de lo cual los transcritos sintéticos son
purificados utilizando mecanismos de purificación de ARN
convencionales. El IBDV mutante recombinante según la invención es
obtenido tras la transfección de células adecuadas (v.g. células
VERO, células QM-7 o células CEC) con los
transcritos de ARN sintéticos de ambos segmentos del genoma de IBDV,
si se desea en presencia de composiciones intensificadoras de la
transfección, tales como Lipofectina. Finalmente el IBDV
recombinante es cosechado del sobrenadante de las células
transformadas.
Los métodos para introducir una mutación en el
genoma del birnavirus se describen aquí, pero también son utilizados
generalmente en la técnica (Mundt y Vakharia, 1.996, supra; Current
Protocols in Molecular Biology, eds.: F.M. Ausubel y col., Wiley
N.Y., edición de 1.995, páginas 8.5.1-8.5.9).
Además del inesperado descubrimiento por los
autores de la presente invención de que el ORF de VP5 de IBDV es una
región no esencial del genoma de IBDV, también se ha descubierto que
un IBDV mutante según la presente invención es capaz de inducir una
respuesta inmune protectora, es decir los animales inmunizados con
una vacuna que comprende el IBDV mutante están protegidos de una
sensibilización virulenta. Por otra parte, se ha descubierto que los
antisueros de los animales infectados con IBDV de origen natural
comprenden anticuerpos dirigidos a la proteína VP5 no estructural y
que estos antisueros pueden ser distinguidos de los antisueros
derivados de animales infectados con IBDV mutante según la presente
invención. Además, se ha descubierto que el IBDV mutante descrito
antes está atenuado si se compara con el virus IBD de origen que es
capaz de producir la proteína VP5 nativa.
Por lo tanto, otro aspecto de esta invención es
una vacuna para su uso en la protección de animales frente a la
infección por birnavirus que comprende el birnavirus mutante
caracterizado antes, junto con un portador o diluyente
farmacéuticamente aceptable. En particular, la vacuna según la
invención es una vacuna para su uso en la protección de la volatería
frente a la enfermedad bursal infecciosa que comprende el IBDV
mutante descrito antes.
El birnavirus mutante según la presente invención
puede ser incorporado a la vacuna en forma de un virus vivo o
inactivado.
Una vacuna según la invención puede ser preparada
mediante métodos convencionales tales como por ejemplo los
comúnmente utilizados para vacuna de IBDV vivas e inactivadas
asequibles comercialmente. Brevemente, un sustrato susceptible es
inoculado con un IBDV mutante según la invención y propagado hasta
que el virus replica a un título infeccioso deseado después de lo
cual se cosecha el material que contiene el IBDV.
Cada sustrato que es capaz de soportar la
replicación de virus IBD puede ser utilizado en la presente
invención, incluyendo cultivos de células primarias (aviares), tales
como fibroblastos de embrión de pollo (CEF) o células de riñón de
pollo (CK), líneas celulares de mamífero tales como la línea celular
VERO o la línea celular BGM-70, o líneas celulares
aviares tales como QT-35, QM-7 o
LMH. Normalmente, tras la inoculación de las células, el virus es
propagado durante 3-10 días, después de lo cual el
sobrenadante del cultivo celular es cosechado, y si se desea
filtrado o centrifugado con el fin de eliminar los desechos
celulares.
Alternativamente, el IBDV mutante es propagado en
huevos de pollo con embriones. En particular, el sustrato sobre el
cual se propagan estos virus IBD son huevos con embriones SPF. Los
huevos con embriones pueden ser inoculados, por ejemplo, con 0,2 ml
de suspensión o producto homogeneizado conteniendo IBDV mutante
comprendiendo al menos 10^{2} TCID_{50} por huevo, y con
posterioridad se incubaron a 37ºC. Al cabo de aproximadamente
2-5 días el virus IBD producto puede ser cosechado
recogiendo los embriones y/o las membranas y/o el fluido alantóico
seguido de una homogeneización apropiada de este material. El
producto homogeneizado puede ser centrifugado después de esto
durante 10 minutos a 2.500 x g seguido de filtración del
sobrenadante a través de un filtro (100 \mum).
La vacuna según la invención que contiene el
virus vivo puede ser preparada y comercializada en forma de una
suspensión o en forma liofilizada y adicionalmente contiene un
portador o diluyente farmacéuticamente aceptable utilizado
comúnmente para semejantes composiciones. Entre los portadores se
incluyen estabilizadores, conservantes y tampones. Los
estabilizadores adecuados son, por ejemplo, SPGA, carbohidratos
(tales como sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrano,
glutamato o glucosa), proteínas (tales como suero lácteo desecado,
albúmina o caseína) o productos de degradación de los mismos. Los
tampones adecuados son por ejemplo fosfatos de metales alcalinos.
Los conservantes adecuados son timerosal, mertiolato y gentamicina.
Entre los diluyentes se incluyen agua, tampón acuoso (tal como
solución salina tamponada), alcoholes y polioles (tal como
glicerol).
Si se desea, las vacunas vivas según la invención
pueden contener un coadyuvante. Los ejemplos de los compuestos y las
composiciones adecuadas con actividad coadyuvante son los mismos
mencionados más abajo.
Aunque la administración mediante inyección, v.g.
intramuscular, subcutánea de la vacuna viva según la presente
invención es posible, la vacuna se administra preferiblemente
mediante mecanismos de aplicación en masa poco costosos utilizados
comúnmente para la vacunación con IBDV. Para la vacunación con IBDV
entre estas técnicas se incluye el agua de bebida y la vacunación
por pulverización.
Entre los métodos alternativos para la
administración de la vacuna viva se incluyen la administración in
ovo, las gotas oculares y la inmersión del pico.
En otro aspecto de la presente invención se
proporciona una vacuna que comprende el birnavirus mutante en una
forma inactivada. La principal ventaja de una vacuna inactivada son
los niveles extremadamente elevados de anticuerpos protectores de
larga duración que se pueden lograr.
El propósito de la inactivación de los virus
cosechados tras la etapa de propagación es eliminar la reproducción
de los virus. En general, esto puede ser logrado por medios químicos
o físicos. La inactivación química puede ser efectuada tratando los
virus, por ejemplo, con enzimas, formaldehído,
\beta-propiolactona, etilenimina o un derivado de
los mismos. Si es necesario, el compuesto inactivador es
neutralizado después de eso. El material inactivado con formaldehído
puede ser neutralizado, por ejemplo, con tiosulfato. La inactivación
física se puede llevar a cabo preferiblemente sometiendo los virus a
radiación rica en energía, tal como luz ultravioleta o rayos
\gamma. Si se desea, tras el tratamiento se puede ajustar el pH a
un valor de aproximadamente 7.
Una vacuna que contiene el birnavirus mutante
inactivado puede comprender, por ejemplo, uno o más de los
portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables anteriormente
mencionados adecuados para este fin.
Preferiblemente, una vacuna inactivada según la
invención comprende uno o más compuestos con actividad coadyuvante.
Entre los compuestos o composiciones adecuados para este fin se
incluyen hidróxido, fosfato u óxido de aluminio, emulsión de aceite
en agua o de agua en aceite con una base, por ejemplo de aceite
mineral, tal como Bayol F® o Marcol 52® o un aceite vegetal tal como
acetato de vitamina E, y saponinas.
La vacuna según la invención comprende una dosis
eficaz del birnavirus mutante como componente activo, es decir una
cantidad de material de birnavirus inmunizadora que induzca
inmunidad en las aves vacunadas frente a la sensibilización por un
virus virulento. La inmunidad se define aquí como la inducción de un
nivel de protección significativamente superior en una población de
aves tras la vacunación en comparación con un grupo no vacunado.
Típicamente, la vacuna viva según la invención
puede ser administrada en una dosis de 10^{2} - 10^{9}
TCID_{50} dosis infecciosa_{50} (TCID_{50}) por animal,
preferiblemente en una dosis que oscila entre 10^{5,0} -
10^{7,0} TCID_{50}, y una vacuna inactivada puede contener el
equivalente antigénico de 10^{5} - 10^{9} TCID_{50} por
animal.
Las vacunas inactivadas se administran
normalmente parenteralmente, v.g. intramuscularmente o
subcutáneamente.
Aunque la vacuna de IBDV según la presente
invención puede ser utilizada eficazmente en pollos, también otra
volatería tal como pavos, pintadas y perdices pueden ser vacunados
con éxito con la vacuna. Entre los pollos se incluyen los pollos de
engorde, razas reproductoras y razas ponedoras.
La edad de los animales que reciben una vacuna
viva o inactivada según la invención es la misma que la de los
animales que reciben las vacunas de IBDV vivas o inactivadas
convencionales. Por ejemplo, los pollos de engorde (libres de
anticuerpos MDA de origen materno) pueden ser vacunados con un día,
mientras los pollos de engorde con elevados niveles de MDA son
vacunados preferiblemente a las 2-3 semanas de edad.
Las razas ponedoras o las razas reproductoras con bajos niveles de
MDA pueden ser vacunadas a los 1-10 días de edad
seguido de vacunaciones de refuerzo con vacuna inactivada a las
6-8 y 16-20 semanas de edad.
En la invención también se incluyen vacunas
combinadas que comprenden, además del IBDV o el IPNV mutante según
la invención, uno o más inmunógenos derivados de otros patógenos
infecciosos para la volatería o los peces, respectivamente.
Preferiblemente, la vacuna combinada comprende
adicionalmente una o más cepas de vacuna del virus de la bronquitis
infecciosa (IBV), el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), el
virus del síndrome de la caída del huevo (EDS), el virus de la
rinotraqueítis del pavo (TRTV) o de reovirus.
Además de una vacuna marcadora para birnavirus,
la disponibilidad de un ensayo de diagnóstico apropiado es un
requerimiento esencial para la aplicación de un programa de control
para la erradicación de birnavirus. Semejante ensayo de diagnóstico
se proporciona aquí y comprende un método para determinar la
infección por IBDV en la volatería y la infección por IPNV en peces,
es decir, proporciona un método para distinguir un animal vacunado
en el campo con una vacuna como se ha descrito antes, de un animal
infectado con un IBDV o IPNV de origen natural.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
un método para la detección de la infección por birnavirus, en
particular para la detección de la infección por IBDV en un animal
que comprende la etapa de examinar la presencia en una muestra del
animal de anticuerpos o antígenos de VP5. El animal es un animal de
campo y es en particular una especie aviar, preferiblemente un
pollo. La muestra que procede del animal puede ser cualquier muestra
en la que se encuentren presentes anticuerpos o antígenos de IBDV,
v.g. un muestra de sangre, suero o tejido, siendo preferida la
muestra de suero.
Un método preferido para determinar la infección
por birnavirus en un animal es un método para la detección de
anticuerpos contra la proteína VP5, que comprende las etapas de:
(i) incubar una muestra que se sospecha que
contiene anticuerpos anti-birnavirus, con antígeno
de VP5,
(ii) permitir la formación de complejo
anticuerpo-antígeno, y
(iii) detectar la presencia del complejo
anticuerpo-antígeno.
El diseño de este inmunoanálisis puede variar.
Por ejemplo, el inmunoanálisis se puede basar en la competición o en
la reacción directa. Además, los protocolos pueden utilizar soportes
sólidos o pueden utilizar material celular. La detección del
complejo anticuerpo-antígeno puede implicar el uso
de anticuerpos marcados; las marcas pueden ser, por ejemplo,
enzimas, moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivas o
con color.
Entre los métodos adecuados para la detección de
los anticuerpos de VP5 en la muestra se incluyen el análisis de
inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA), el ensayo
inmunofluorescente (IFT) y el análisis de transferencia Western.
En un ELISA ilustrativo, los pocillos de una
placa de microtitulación de poliestireno son revestidos con antígeno
VP5. A continuación, los pocillos de las placas revestidas se
rellenan con suero de pollo y se realizan diluciones seriadas. Tras
la incubación, se determinan los anticuerpos
anti-proteína VP5 en suero de pollo detectando el
anticuerpo (monoclonal o policlonal) con la misma especificidad que
el revestido, pero que está marcado (v.g. con biotina). El
anticuerpo marcado ocupará los antígenos libres que no han sido
ocupados por anticuerpos anti-VP5 en el suero de
pollo. Por ejemplo, se puede añadir peroxidasa de rábano picante
acoplada con avidina y se mide la cantidad de peroxidasa mediante
una reacción enzimática. Si no se encuentran presentes anticuerpos
contra VP5 en la muestra de suero de pollo se obtiene una absorción
máxima. Si el suero contiene muchos anticuerpos contra VP5 se espera
una baja absorción. Alternativamente, tras la incubación con suero
de pollo, se puede determinar la cantidad de anticuerpos presentes
en el suero que se une al antígeno VP5 directamente utilizando un
producto conjugado anti-pollo seguido de reacción
enzimática.
En un ELISA sandwich los pocillos de una placa de
micro-titulación de poliestireno se pueden revestir
con un anticuerpo monoclonal dirigido contra la proteína VP5. A
continuación, los pocillos de estas placas revestidas se incuban con
antígeno VP5. Una vez que el antígeno es capturado, los pocillos se
llenan con suero de pollo y se realizan diluciones seriadas. Con
posterioridad, se puede seguir el protocolo descrito antes. Este
ensayo también se puede llevar a cabo utilizando suero policlonal
contra VP5 en lugar de anticuerpos monoclonales que se han aplicado
como revestimiento.
En otro ensayo de diagnóstico (análisis de
transferencia Western), el material (que contiene) antígeno VP5 se
somete a SDS-PAGE. A continuación, las proteínas
separadas son electrotransferidas sobre membranas de
nitro-celulosa. Después de eso, las membranas pueden
ser cortadas en calles y las calles son incubadas con el suero de
pollo. La presencia de anticuerpos para VP5 en la muestra puede ser
determinada examinando si los anticuerpos se han unido al antígeno
VP5, por ejemplo utilizando un producto conjugado
anti-pollo seguido de una reacción enzimática. Si se
encuentran presentes anticuerpos contra VP5 es identificable una
banda de aproximadamente 17 kDa.
El antígeno VP5 puede ser cualquier proteína VP5
(fragmento) que comprenda material que permita la formación del
complejo antígeno VP5-anticuerpo para VP5.
Preferiblemente, el antígeno VP5 comprende el producto de la
expresión de una célula o virus huésped recombinante convencional,
v.g. tal como VP5 expresada por E. coli
(Mundt y col., J. Gen. Virol. 76,
437-443, 1.995) o proteína expresada por baculovirus
(Vakharia y col., Vaccine 12, 452-456, 1.994;
Vakharia y col., J. Gen Virol. 74,
1201-1206, 1.993). En una realización adicional de
la presente invención se proporciona un estuche de ensayo de
diagnóstico que es adecuado para realizar el ensayo de diagnóstico
según la invención como se ha descrito antes.
En particular, se proporciona un estuche de
ensayo de diagnóstico que comprende además de los componentes
normalmente presentes, el antígeno VP5 (si se desea revestido sobre
una fase sólida) en forma de reactivo inmunológico. Entre otros
componentes normalmente presentes en semejante estuche de ensayo se
incluyen anticuerpos conjugados con biotina o peroxidasa de rábano
picante, sustrato de enzimas, tampón de lavado etc.
Para determinar el antígeno VP5 de birnavirus en
una muestra de ensayo de un animal en el campo, se utilizan
anticuerpos específicos para VP5 como reactivo inmunológico,
preferiblemente fijados a una fase sólida. Se añade la muestra de
ensayo, y tras un tiempo de incubación que permita la formación del
complejo anticuerpo-antígeno, se puede añadir un
segundo anticuerpo marcado para detectar el complejo.
Para construir un IBDV VP5 negativo, se suprimió
el sitio EcoRI inmediatamente posterior al extremo 3' del
ADNc en toda su longitud del segmento A de la cepa D78 (pUC19FLAD78;
Mundt y Vakharia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93,
11131-11136, 1.996). Se separó cortando un fragmento
EcoRI - KpnI que contenía el sitio de unión de la
polimerasa de T7 seguido de la secuencia del segmento A completa y
se insertó en el vector pUC18 escindido con EcoRI -
KpnI tras la inactivación del NdeI de la secuencia del
vector dando como resultado un plásmido pAD78/EK. Después de eso, la
región genómica que abarcaba el codón de iniciación para VP5 fue
amplificado en dos partes utilizando los cebadores A1F5' y VP5MutR,
y VP5MutF y A2R, respectivamente (ver la Tabla 1 para la secuencia y
localización de los cebadores). Los fragmentos de la PCR fueron
clonados por separado y fusionados con posterioridad por medio de un
sitio AflII único que había sido creado mediante mutaciones
en los respectivos cebadores (ver la Fig. 2). Se separó cortando un
fragmento EcoRI-NdeI que contenía el sitio de unión de
la polimerasa de T7, y la porción 5' del segmento A incluyendo las
mutaciones introducidas y se utilizó para sustituir el fragmento
EcoRI-NdeI de tipo salvaje en pAD78/EK para rendir el
plásmido pAD78/VP5^{-}. De estas tres mutaciones introducidas una
alteraba el codón de iniciación de metionina para VP5 a un codón de
arginina (Fig. 2).
- a)
- Los nucleótidos subrayados indican nucleótidos específicos de virus. Las secuencias del promotor de T7 se marcan en cursiva. Los nucleótidos mutados están en negrita y la orientación del cebador se muestra para el sentido (+) y para el antisentido (-). Las posiciones del cebador se dan según la secuencia publicada de la cepa P2 de serotipo I (Mundt y col., Virology 209, 209-218, 1.995).
Para la transcripción in vitro de
plásmidos de ARN pAD78/EK, se linealizaron pAD78/VP5^{-} y pBP2
(Fig. 2) mediante escisión con BsrGI y PstI,
respectivamente. El tratamiento del ADN linealizado, la
transcripción y la purificación de ARN, y la transfección se
llevaron a cabo como describen Mundt y Vakharia (1.996, supra) con
la excepción de que se utilizaron CEC secundarias para los
experimentos de transfección. Tres días después de la transfección
era visible un CPE en CEC. La células fueron
congeladas/descongeladas, centrifugadas a 700 x g para eliminar los
desechos celulares, y los sobrenadantes resultantes fueron filtrados
a través de filtros de 0,45 \mum y almacenados a -20ºC. Para los
experimentos de transfección se transcribieron clones de ADNc del
segmento A de la cepa D78 en toda su longitud capaces de expresar
(pAD78/EK) o incapaces de expresar VP5 (pAD78/VP5^{-}) a ARN
sintético y se transfectaron simultáneamente con ARNc del segmento B
en toda su longitud en CEC. La progenie de virus resultante IBDV/EK
e IBDV/VP5^{-} fue adicionalmente caracterizada.
VP5 fue expresada en E. coli como
describen Mundt y col. (J. Gen. Virol. 76,
437-443, 1.995). Se prepararon antisuero policlonal
monoespecífico de conejo y anticuerpos monoclonales de ratón contra
VP5 según los protocolos normalizados. Células Vero infectadas con
IBDV/VP5^{-}, IBDV/EK, y células no infectadas, respectivamente,
fueron incubadas con suero anti-IBDV de conejo,
suero anti-VP5 de conejo y con mAb
anti-VP5 DIE 7, y se tiñeron con anticuerpos
secundarios conjugados con fluoresceína. Tanto el antisuero como el
anticuerpo monoclonal reconocían los antígenos de IBDV del
citoplasma de las células infectadas con IBDV/EK. En contraste,
mientras el suero anti-IBDV detectaba fácilmente los
antígenos virales de las células infectadas con IBDV/VP5^{-}, ni
el suero anti-VP5 monoespecífico ni el anticuerpo
monoclonal anti-VP5 manifestaban una reactividad
específica. Ninguno de estos reactivos inmunológicos reaccionaba con
los controles no infectados.
Para analizar las proteínas virales expresadas
durante la replicación se sometieron a inmunoprecipitación los
productos lisados de CEC marcadas radiactivamente infectadas con
OBDV/VP5^{-} (Fig. 4, calles 1-3) e IBDV/EK (Fig.
4, calles 4-6) con suero anti-IBDV
de conejo, suero anti-VP5 de conejo y mAb DIE 7. Las
CEC no infectadas fueron utilizadas como control (Fig. 4, calles
7-9). Las CEC infectadas con IBDV/EK (calle 4) así
como IBDV/VP5^{-} (calle 1) mostraban las proteínas virales VP2,
VP3, y VP4 tras la precipitación con suero anti-IBDV
de conejo. El suero anti-VP5 de conejo (calle 5) y
mAb DIE 7 (calle 6) precipitaban VP5 con una masa molecular de 21
kDa sólo a partir de las células infectadas con IBDV/EK. La
reactividad no específica era detectable en CEC infectadas con
IBDV/VP5^{-} tras la precipitación con anti-VP5 de
conejo (calle 2) así como mAb DIE 7 específico de VP5 (calle 3).
Las CEC no infectadas no mostraban reactividad específica (calles
7-9).
\newpage
Para analizar la replicación de IBDV/VP5^{-}
con más detalle se analizó el crecimiento de una etapa (Fig. 5). Las
CEC secundarias confluentes fueron infectadas con IBDV/EK e
IBDV/VP5^{-} con 10^{72} TCID_{50}, respectivamente.
Inmediatamente después de cubrir las células infectadas con 5 ml de
medio de crecimiento, se eliminó el sobrenadante de una placa de
cultivo de tejido CEC infectado de cada virus y se almacenaron a
-20ºC (0 h
p.i.). Las placas de cultivo de tejidos restantes fueron incubadas
adicionalmente y los sobrenadantes de 4h, 8h, 16h, 24h, y 48h p.i.
fueron eliminados y almacenados a -20ºC. Los sobrenadantes fueron
centrifugados y titulados según los métodos convencionales. La
TCID_{50} en diferentes momentos después de la infección mostraba
que el virus que expresaba la VP5 (IBDV(EK) replicaba más
deprisa que el virus mutante que carecía de VP5 (IBDV/VP5^{-}). A
las 16 horas de la infección IBDV/EK mostraba un 100 veces superior
que el de IBDV/VP5^{-} (Fig. 5). Sin embargo, a las 48 h p.i.
IBDV/VP5^{-} alcanzaba un título de 10^{7,2} TCID_{50}/ml que
era similar al de IBDV/EK (10^{7,45}/ml).
El plásmido pAD78/VP5^{-}-2 fue
preparado mediante mecanismos similares a los descritos antes. La
secuencia de nucleótidos de parte del gen VP5 mutado se muestra en
la SEC ID Núm. 7 y en la Figura 3. Se utilizó un fragmento de una
enzima de restricción que albergaba las mutaciones para sustituir el
fragmento EcoRI
- NdeI de tipo salvaje de pAD78/EK. En la Figura 3 se muestra
un esbozo del protocolo para la preparación del plásmido
recombinante. La organización de pBD78 también se representa en la
Figura 3. El virus recombinante fue preparado como se ha descrito
antes, excepto por el hecho de que se utilizó el segmento B de la
cepa D78 (SEC ID Núm. 8) y se utilizaron células
QM-7 para el experimento de transfección.
Se investigaron diferentes cepas de IBDV para la
expresión del gen VP5. Esto se realizó haciendo uso de la técnica
de inmunofluorescencia (IFT). Se infectaron fibroblastos de embrión
de pollo desarrollados en placas de microtitulación con diferentes
cepas de IBDV. Tres a cinco días después de la incubación a 37ºC las
células fueron fijadas con etanol al 70%, tratadas después con
suero anti-IBDV de conejo policlonal (R1928), suero
anti-VP5 de conejo policlonal (R\alphaVP5) o
anticuerpo monoclonal dirigido contra VP5 (DIE7), respectivamente.
La unión de los anticuerpos poli- o monoclonales a las diferentes
cepas de IBDV fue visualizada haciendo uso de un producto conjugado
marcado con fluorescencia (anti-conejo de cabra o
anti-ratón de cabra). Los resultados se muestran en
la Tabla 2:
| Serotipo de IBDV | Subtipo de IBDV | Cepa de IBDV | R1928 | R\alphaVP5 | DIE7 |
| I | Clásico | D78 | + | + | + |
| I | Clásico | 228TC | + | + | + |
| I | Clásico | PBG98 | + | + | + |
| I | Clásico | Ram0404 | + | + | + |
| I | Clásico | IBDV/EK | + | + | + |
| I | Clásico | IBDV/VP5^{-} | + | - | - |
| I | GLS | GLS | + | + | + |
| I | Variante-E | 8903 | + | + | + |
| II | TY89 | TY89 | + | + | + |
A partir de estos datos se pudo concluir que las
diferentes cepas de IBDV pertenecientes a diferentes sero- y
subtipos expresan el gen VP5. Además, la cepa de vacuna IBDV
VP5^{-} recombinante puede ser diferenciada de los virus del campo
y vacuna, permitiendo de ese modo utilizar el virus VP5^{-}
recombinante como vacuna marcadora.
Se prepararon fibroblastos de embrión de pollo
primarios (CEC) a una concentración final de 2 x 10^{6}/ml. Las
células fueron cultivadas en medio esencial mínimo de Eagle
conteniendo suero de ternera fetal al 5%. A 25 ml de esta
suspensión se añadieron 0,1 ml de virus IBDV/EK o IBDV/VP5^{-}
(que tenía un título infeccioso de aproximadamente log10 3,0
TCID_{50}/ml). Tras incubar durante 5 días en una incubadora con
un elevado contenido de humedad a 37ºC, se utilizó la suspensión
total en el experimento animal sin purificación adicional. El título
infeccioso del sobrenadante era 10^{7,1} TCID50/ml.
En este estudio se investigó la potencia de
diferentes vacunas (cepa positiva para VP5 IBDV/EK y cepa negativa
para VP5 IBDV/VP5^{-}, y la vacuna de IBDV asequible comercial
Nobilis cepa D78, Intervet International B.V., NL). Se trataron
pollos SPF de 3 semanas de edad como se indica en el programa de
tratamiento.
Programa de
tratamiento
| Días después de | Grupos | |||
| la vacunación | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 00 | IBDV/EK | IBDV/VP5^{-} | x | - |
| 03 | x | x1 | x,b | x |
| 07 | x,bl | x1,bl | x,bl | x,bl |
| 14 | x,bl | x,bl | x,bl | x,bl |
| 20 | x,bl | x,bl | x,bl | x,bl |
| 21 | ch | ch | ch | ch |
| 24 | x | x | x | x |
| 31 | + | + | + | + |
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
VP5 ^{+} \+ \begin{minipage}[t]{125mm} Vacunación para la
enfermedad bursal con clon de vacuna VP5 positivo, ruta gota ocular,
dosis 10 ^{46} TCID50/animal, 0,1 ml/animal.
\end{minipage} \cr \+\cr VP5 ^{-} \+
\begin{minipage}[t]{125mm} Vacunación para la enfermedad
bursal con clon de vacuna VP5 negativo, ruta gota ocular, dosis
10 ^{59} TCID50/animal, 0,1 ml/animal. \end{minipage} \cr
\+\cr D78 \+ \begin{minipage}[t]{125mm} Vacunación
para la enfermedad bursal con IBDV VACCINE NOBILIS STRAIN D78, ruta
gota ocular, una dosis de campo. \end{minipage} \cr \+\cr ch
\+ \begin{minipage}[t]{125mm} Sensibilización con virus
de la enfermedad Bursal, cepa Farragher F52/70, ruta gota ocular,
dosis 10 ^{2,0} CID _{50} /animal, 0,1 ml/animal.
\end{minipage} \cr \+\cr bl \+
\begin{minipage}[t]{125mm} Examen serológico; ensayo VN y/o
transferencia Western. \end{minipage} \cr \+\cr x \+
\begin{minipage}[t]{125mm} Examen histológico (tinción H.E.) y
ELISA MCA-8 en la bolsa. \end{minipage} \cr
\+\cr x1 \+ \begin{minipage}[t]{125mm} Examen
histológico (tinción H.E.) y ELISA MCA-8 en la
bolsa y aislamiento de nuevo de virus de la bolsa de
Fabricius . \end{minipage} \cr \+\cr + \+
\begin{minipage}[t]{125mm} Examen clínico y al cabo de 10 días
examen histológico de la bolsa.
\end{minipage} \cr}
A los 3, 7, 14 y 20 días de la vacunación
mediante gotas oculares, los animales fueron sacrificados y se
obtuvieron la sangre y la bolsa. La presencia de virus en la bolsa
fue determinada con un análisis de inmunoabsorción con enzima ligada
(ELISA) haciendo uso del anticuerpo monoclonal 8
(MAB-8). MAB-8 está específicamente
dirigido contra IBDV. Los datos se representan en la Tabla 3.
Además, 3 y 7 días después de la vacunación, se
investigó la presencia del virus VP5^{-} recombinante en las
bolsas del grupo 2. Para ese fin se homogeneizaron y se cultivaron
sobre fibroblastos de embrión de pollo. La presencia del virus
VP5^{-} fue determinada mediante IFT utilizando suero de conejo
policlonal contra IBDV o VP5 o anticuerpos monoclonales contra VP5.
De 13 de las 15 (87%) bolsas investigadas, el virus VP5^{-} pudo
ser aislado de nuevo e identificado (positivo para R1928 y negativo
para R\alphaVP5 y DIE7). Esto indica que el virus tras el paso por
el animal es todavía VP5^{-}, indicando que el virus es estable y
no revierte a VP5^{+}. Además, utilizando los diferentes
anticuerpos poli- y monoclonales se puede discriminar el virus de la
vacuna VP5^{-} de todos los demás virus IBDV de vacuna y/o de
campo. Por lo tanto, se puede utilizar la vacuna VP5^{-} como
vacuna marcadora.
Tres días después de la sensibilización no se
pudo detectar ningún virus en los grupos 1, 2 y 3 con el ELISA de
MCA-8. En contraste, todos los animales del grupo 4
(grupo de control no vacunado) contenían virus de sensibilización en
la bolsa de Fabricius, 3 días después de la sensibilización.
Los resultados demuestran que los animales vacunados con VP5^{+}
recombinante (grupo 1), VP5^{-} recombinante (grupo 2) y vacuna
para IBDV Nobilis D78 (grupo 3) estaban protegidos de una
sensibilización grave.
- ^{\text{*}} Número de bolsas positivas por número total sometido a ensayo.
La puntuación de la lesión media microscópica
inducida por las diferentes vacunas de IBDV (recombinante) o el
virus de sensibilización se representan en la Tabla 4.
Antes de la sensibilización, los animales
vacunados con la vacuna de IBDV VP5^{+} recombinante (grupo 1) o
vacunados con la vacuna de IBDV Nobilis D78 (grupo 3) mostraban
lesiones suaves a moderadas en la bolsa. Tres días después de la
sensibilización sólo se observaban lesiones crónicas en la bolsa de
Fabricius, indicando que los animales de los grupos 1 y 3
estaban protegidos frente a la sensibilización. Además, 10 días
después de la sensibilización sólo se observaban lesiones muy suaves
(agotamiento linfocítico del 0-20%) en la bolsa de
los animales vacunados con la vacuna de IBDV recombinante VP5^{+}
o con la vacuna de Nobilis D78. En contraste los animales no
vacunados y sensibilizados mostraban lesiones graves 10 días
después de la sensibilización. En otras palabras, todos los
animales (100% de los grupos 1 y 3, vacunados con la vacuna de IBDV
recombinante VP5^{+} o con la vacuna de Nobilis D78 estaban
protegidos frente a la sensibilización grave.
Tres, 7, 14 y 20 días después de la vacunación y
3 y 10 días después de la sensibilización con la vacuna de IBDV
VP5^{-} recombinante, los animales del grupo 2 apenas mostraban
lesión alguna en la bolsa (agotamiento linfocítico del
0-20%) en la bolsa. Todos los animales del grupo 2,
vacunados con la vacuna de IBDV recombinante
VP5^{-}, estaban protegidos frente a la sensibilización
grave. Cuando los animales vacunados con la vacuna de IBDV
VP5^{-} recombinante se comparan con los animales de los grupos 1
o 3 (vacunados con Vacuna VP5^{+} recombinante o asequible
comercialmente) la vacuna VP5^{-}
recombinante induce menos lesiones y por lo tanto, es más segura,
más suave que las vacunas sometidas a ensayo en este
experimento.
Tres días después de la sensibilización, todos
los animales vacunados del grupo 4 mostraban lesiones agudas graves
en la bolsa (agotamiento de linfocitos total, puntuación 5,0). Diez
días después de la sensibilización, todos los animales (17 de 17
animales) mostraban un agotamiento de linfocitos total, indicando
que estos animales no estaban protegidos frente a la
sensibilización grave. Los animales que morían tras la
sensibilización, mostraban todos lesiones graves en la bolsa de
Fabricius. Se concluyó que el grupo de control 4 no estaba
protegido frente a la sensibilización grave indicando que las
condiciones del ensayo eran óptimas.
La puntuación de la lesión media se calcula como
sigue: se suman todas las puntuaciones de las lesiones de los
animales por grupo en cierto día. Este número se divide después por
el número total de animales investigados en ese grupo ese día. Las
puntuaciones individuales oscilan entre 1 y 5. Puntuación 0 = sin
agotamiento linfocítico, puntuación 1 = 0-20%;
puntuación 2 = 20-40%; puntuación 3 =
40-60%; puntuación 4 = 60-80% y
puntuación 5 = 80-100% de agotamiento linfocítico
(agotamiento linfocítico total).
- ^{a} Lesiones agudas
\hskip0.5cm
^{c} Lesiones crónicas
La respuesta serológica de los animales fue
determinada midiendo la capacidad del suero sanguíneo para
neutralizar una cepa de virus de enfermedad bursal infecciosa
clásica en un ensayo de neutralización del virus (VN). El suero fue
investigado 3, 7, 14 y 20 días después de la vacunación. Los
títulos neutralizadores medios se muestran en la Tabla 5.
Los resultados muestran que la vacuna de IBDV
VP5^{+} recombinante aplicada a los pollos del grupo 1 inducía
una respuesta serológica buena y elevada 20 días después de la
vacunación que es comparable con la respuesta serológica de los
pollos vacunados con la vacuna de IBDV comercial de cepa D78 de
Nobilis (grupo 3). La vacuna de IBDV VP5^{-} recombinante
aplicada a los pollos del grupo 2 también inducía una buena
respuesta serológica. Se observaba un título de log2 9,4 20 días
después de la vacunación. La respuesta serológica inducida por la
vacuna de IBDV VP5^{-} recombinante era retardada cuando se
comparaba con la respuesta serológica inducida por la vacuna de IBDV
VP5^{+} recombinante o la vacuna de IBDV comercial de la cepa D78
de Nobilis.
El grupo 4 no vacunado no mostraba respuesta
serológica a IBDV.
La respuesta serológica frente a VP5 fue
investigada haciendo uso del análisis de transferencia Western.
Para este fin la proteína VP5 fue expresada en el sistema de
expresión de E. coli o baculo. Las proteínas expresadas
fueron separadas mediante SDS PAGE. A continuación las proteínas
fueron electrotransferidas sobre una membrana de
nitro-celulosa. Después de eso, la membrana fue
cortada en calles y las calles fueron incubadas con suero
anti-VP5 de conejo, suero de pollo dirigido contra
la vacuna recombinante VP5^{+}, suero de pollo dirigido contra la
vacuna recombinante VP5^{-} o suero negativo de pollos SPF. Los
datos se resumen en la Tabla 6. Como se puede observar a partir de
la Tabla 6, el suero VP5^{-} no induce una respuesta serológica
contra VP5. En contraste el suero anti-VP5 de conejo
y el suero de pollo dirigido contra la vacuna recombinante
VP5^{+} no reconocen la proteína VP5 y de ese modo se induce una
respuesta serológica contra VP5. Esto indica que el suero de pollo
puede ser utilizado para investigar si los animales están expuestos
a un virus que expresa la proteína VP5 (v.g. virus de campo) o la
vacuna recombinante VP5^{-}.
Se investigaron suero de animales vacunados con
vacuna recombinante VP5^{+} o VP5^{-} así como suero de pollo
SPF y suero de conejo anti-VP5 en cuanto a su
reacción con la proteína VP5.
| Identificación de la muestra de suero | Inmunotransferencia |
| Animal vacunado con VP5^{+}, muestra de suero 20d después de la vacunación | positivo |
| Animal vacunado con VP5^{-}, muestra de suero 20d después de la vacunación | negativo |
| Control no vacunado, muestra de suero a los 20d | negativo |
| Suero anti-VP5 de conejo | positivo |
Ninguno de los animales vacunados con la vacuna
de IBDV VP5^{+} (grupo 1),
vacunados con la vacuna de IBDV VP5^{-} recombinante (grupo 2) o
vacunados con la vacuna de IBDV comercial de la cepa D78 de Nobilis
(grupo 3), moría o mostraba síntomas clínicos de enfermedad bursal
infecciosa tras la sensibilización, indicando que los animales
estaban protegidos contra la sensibilización grave. Ninguno de los
animales del grupo de control no vacunado estaba protegido frente a
la sensibilización grave.
Se prepararon fibroblastos de embrión de pollo
primarios (CEF) a una concentración final de 2 x 10^{6}/ml. Las
células fueron cultivadas en medio esencial mínimo de Eagle
conteniendo suero de ternera fetal al 5%. A 15 ml de esta
suspensión se añadieron 0,1 ml de virus
IBDV/VP5^{-}-2 (D78/D78/VP5^{-}). Tras una
incubación de 6 días en una incubadora con alto contenido de humedad
a 37ºC, se tituló el sobrenadante. El título infeccioso del
sobrenadante era de 10^{8,2} TCID_{50}/ml. Para el segundo
experimento con animales se diluyó el sobrenadante para dar como
resultado una dosis de vacuna de 10^{5,5} TCID_{50}/animal y
para el primer experimento el sobrenadante se diluyó para dar como
resultado una dosis de vacuna de 10^{4,0} TCID_{50}/animal o
10^{5,0} TCID_{50}/huevo.
Se evaluó el efecto de la vacuna midiendo la
respuesta serológica y la resistencia a la sensibilización obtenidas
a partir de la administración de un virus de sensibilización a la
edad de 14 días. La vacuna (10^{5,0} TCID_{50}/huevo o 10^{4}
TCID_{50}/animal de D78/D78/VP5^{-}) fue aplicada in ovo
o intramuscularmente con un día de edad. Se investigaron las
lesiones microscópicas de la bolsa, 3 y 10 días después de la
sensibilización. Se determinó la protección contra la
sensibilización y se determinó la respuesta serológica a la edad de
14 días con el ensayo de VN.
1. Puntuación de la lesión microscópica media
en la bolsa 3 y 10 días después de la
sensibilización
| Días después | Grupo | ||
| sensibilización | In ovo | Días de edad | No vacunado |
| 3 | 3,3 | 0,0 | 5,0 |
| 10 | 0,2 | 0,0 | 5,0 |
2. Protección tras la
sensibilización
| Grupo | |||
| In ovo | Días de edad | No vacunado | |
| % de Protección | 91,6 | 100 | 0 |
3. Respuesta serológica contra
IBDV
| Grupo | |||
| In ovo | Días de edad | No vacunado | |
| Título VN | 6,4\pm1,7 | 6,4\pm1,3 | <4,0\pm0,0 |
El título VN es expresado como log2 de la
dilución. Los animales con un título < log2 4,0 son considerados
negativos.
| 1 | La cepa D78/D78/VP5^{-} es un virus IBD muy atenuado |
| 2 | La cepa del virus es muy suave |
| 3 | El virus puede inducir una respuesta serológica |
| 4 | El virus puede inducir protección |
| 5 | La cepa del virus puede ser aplicada mediante inyección intramuscular a pollos SPF de 1 día de edad e |
| in ovo a huevos SPF con embrión de 18 días de edad. |
El efecto de la vacuna es evaluado midiendo la
respuesta serológica contra IBDV y la resistencia a la
sensibilización obtenidas a partir de la administración de un virus
de sensibilización, 21 días después de la administración de la
vacuna de Gumboro. La vacuna (10^{5,5} TCID_{50}/animal de
D78/D78/VP5^{-}) fue aplicada por vía intramuscular a pollos SPF
de 14 días de edad. Tres, 7, 14, y 20 días después de la vacunación
y 3 días después de la sensibilización se investigaron las lesiones
microscópicas de la Bolsa, el bazo, el timo, el hígado, el duodeno,
el páncreas, las tonsilas cecales y las glándulas de Harder. Diez
días después de la sensibilización se investigaron las bolsas en
cuanto a lesiones microscópicas. Se sometieron a ensayo los sueros
en el ensayo VN. Y se puntuó la mortalidad tras la
sensibilización.
1. Porcentaje de mortalidad tras la
sensibilización
| Mortalidad tras la sensibilización | |
| Grupo vacunado | 0% |
| Grupo de control | 50% |
2. Lesiones microscópicas del grupo vacunado
antes y después de la
sensibilización
| Días después | Bolsa | Bazo | Timo | Hígado | Duodeno | Páncreas | Tonsilas | Glándula de |
| de la vacuna | Cecales | Harder | ||||||
| 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 14 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 20 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 24 | 0,A | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 31 | 0,A | NR | NR | NR | NR | NR | NR | NR |
| A= Los animales no vacunados mostraban una puntuación de agotamiento linfocítico de 5,0 (100%) y | ||||||||
| \hskip4mm 4,25, 3 y 10 días después de la sensibilización, respectivamente. NR = no realizado. |
3. Respuesta serológica tras la
vacunación
| 1. | La cepa D78/D78/VP5^{-} es un virus IBD muy atenuado |
| 2. | La cepa del virus es muy suave y no induce lesiones en órganos |
| 3. | El virus puede inducir una respuesta serológica |
| 4. | El virus puede inducir protección |
Organización genómica del segmento A y el
segmento B de IBDV. Los números indican las posiciones de los
nucleótidos del inicio, el fin y la región codificadora de los
segmentos.
Construcción de clones de ADNc genómico para la
preparación de IBDV/VP5^{-}. El plásmido pAD78/EK contiene el ADNc
del segmento A completo de D78 que codifica la poliproteína
(VP2-VP4-VP3) y VP5. El plásmido
pBP2 contiene el segmento B de la cepa P2 completo que codifica VP1.
Las mutaciones fueron introducidas en el plásmido pAD78/VP5^{-}
alterando el codón de inciación de metionina para VP5 a arginina y
creando un sitio de escisión Afl II artificial. Los plásmidos
recombinantes fueron linealizados con las enzimas de restricción
subrayadas, seguido de transcripción con polimerasa de T7.
Construcción de clones de ADNc genómico para la
preparación de IBDV/VP5^{-}-2. El plásmido
pAD78/EK contiene el ADNc del segmento A completo de D78 que
codifica la poliproteína
(VP2-VP4-VP3) y VP5. El plásmido
pBD78 contiene el segmento B de la cepa D78 completo que codifica
VP1. Las mutaciones fueron introducidas en el plásmido
pAD78/VP5^{-} alterando el codón de iniciación de metionina para
VP5 a ácido glutámico y creando un sitio de escisión BstBI
artificial. Se introdujeron mutaciones adicionales en el codón de
arginina y glutamina. Los plásmidos recombinantes fueron
linealizados con las enzimas de restricción subrayadas, seguido de
transcripción con polimerasa de T7.
Radioinmunoprecipitación de proteínas a partir de
células CEC infectadas con IBDV recombinante. Las células CEC
infectadas con IBDV/VP5^{-} (calles 1-3), IBDV/EK
(calles 4-6) y los controles no infectados fueron
inmunoprecipitados con suero anti-IBDV de conejo
(calles 1, 4, 7), suero anti-VP5 de conejo (calles
2, 5, 8) y mAb DIE 7 (calles 3, 6, 9). Se indica la posición de los
marcadores de peso molecular (M). Se marca la localización de las
proteínas virales VP2, VP3, VP4 y VP5.
Cinética de replicación de IBDV/EK e
IBDV/VP5^{-}. Se determinan los títulos infecciosos (eje
vertical) en los momentos indicados
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Azko Nobel N.V.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Velperweg 76
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Arnhem
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Holanda
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 6824 BM
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 0412 666379
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 0412 650592
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacuna de birnavirus recombinante
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE CON ORDENADOR:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO MEDIO: Disco flexible
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 1
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A) LONGITUD: 2.827 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B) TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C) CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D) TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- RASGOS:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 112..2745
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(Secuencia pasa a página
siguiente)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 878 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3.261 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLéCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- RASGOS:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 97..531
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 145 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3.261 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- RASGOS:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 131..3166
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.012 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3.261 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- RASGOS:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 97..531
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.827 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- RASGOS:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 112..2745
\vskip1.000000\baselineskip
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- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 8:
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Claims (15)
1. Un birnavirus mutante que no es capaz de
producir una proteína VP5 nativa como resultado de una mutación en
el gen VP5 del genoma de birnavirus, caracterizado porque la
mutación comprende:
- (i) una sustitución de al menos dos nucleótidos del codón de iniciación del gen VP5, y
- (ii) un codón de terminación en cada uno de los tres marcos de lectura abiertos del extremo 5' del gen VP5.
2. Un birnavirus mutante según la reivindicación
2, caracterizado porque el birnavirus es un virus de la
enfermedad bursal infecciosa (IBDV).
3. Un birnavirus mutante según las
reivindicaciones 1-2, caracterizado porque la
mutación está en el genoma de un virus de campo virulento.
4. Un birnavirus mutante según la reivindicación
2, caracterizado porque la mutación está en el genoma de una
cepa de vacuna, preferiblemente en la cepa de vacuna D78.
5. Un birnavirus mutante según las
reivindicaciones 2-4, caracterizado porque el
mutante tiene un codón de iniciación mutado y tres codones de
terminación en el extremo 5' del gen VP5 como se muestra en la SEC
ID Núm. 7.
6. Un birnavirus mutante según las
reivindicaciones 2-5, caracterizado porque el
IBDV expresa una proteína VP2 quimérica que comprende epítopos
neutralizadores del virus de diferentes tipos de IBDV
antigénicos.
7. Una vacuna contra una infección por birnavirus
en animales, caracterizada porque comprende un birnavirus
mutante según las reivindicaciones 1-6 y un portador
farmacéuticamente aceptable.
8. Un método para la atenuación de la virulencia
de un birnavirus en un animal, que comprende la etapa de introducir
una mutación en el gen VP5 como resultado de lo cual el birnavirus
no es capaz de producir la proteína VP5.
9. Un método según la reivindicación 9, donde la
mutación es una sustitución.
10. Un método según las reivindicaciones
8-9, donde el birnavirus es el virus de la
enfermedad bursal infecciosa (IBDV).
11. Un método según las reivindicaciones
8-10, donde la mutación está en el genoma de un
virus de campo virulento.
12. Un método según las reivindicaciones
8-11, donde la mutación comprende una sustitución de
al menos dos nucleótidos del codón de iniciación del gen VP5.
13. Un método según la reivindicación 12, donde
la mutación comprende adicionalmente uno o más codones de
terminación en el extremo 5' del gen VP5.
14. Un método según la reivindicación 13, donde
la mutación comprende un codón de terminación en cada uno de los
tres marcos de lectura abiertos.
15. Un método según la reivindicación 14, donde
la mutación está en el codón de iniciación y comprende tres codones
de terminación en el extremo 5' del gen VP5 como se muestra en la
SEC ID Núm. 7.
Applications Claiming Priority (2)
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