KR20210068602A - 감염성 기관지염에 대한 백신 - Google Patents

감염성 기관지염에 대한 백신 Download PDF

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산토스 마리아 카롤리나 페레이라 도스
폴 조셉 도미노우스키
하르멘 야코프 헤르리흐스
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조에티스 서비시즈 엘엘씨
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Abstract

감염성 기관지염 및 칠면조 비기관지염에 대한 가금 백신이 제공된다. 면역자극 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 오일 에멀션을 이용하여 백신을 면역보강하였다. 상기 백신을 이용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

감염성 기관지염에 대한 백신{VACCINE AGAINST INFECTIOUS BRONCHITIS}
칠면조 비기관지염(Turkey Rhinotracheitis: TRT)은 폐렴바이러스에 의해 야기되는 칠면조 및 닭의 상기도 감염이다. 이는 모든 연령의 칠면조에 피해를 입히는 고도로 전염성의, 급성 질환이다. TRT 감염의 임상 증상은 뚜렷하고, 빈번하게 거품이 생기는 콧물, 수포음, 훌쩍임, 재채기 및 머리 흔들기를 포함한다. 눈 분비물 또는 팽창된 안와하 부비동이 또한 감염된 칠면조에서 관찰될 수 있다. TRT 바이러스에 대한 항체(TRTV)는 두종 증후군(Swollen Head Syndrome: SHS)에 걸린 일부 닭 무리(영계와 육용종계 둘 다)에서 검출되었다. TRTV는 SHS의 병인론 및 관련된 호흡 곤란에서 어떤 역할을 한다는 것이 상정된다.
일부 다른 조류가 잠복성으로 감염될 수 있지만, 감염성 기관지염(Infectious bronchitis: IB)은 닭에서만 질환을 야기하는 코로나바이러스이다. 일부 혈청형은 지리적으로 제한되어 있지만, 다중 혈청형은 하나의 지리구에서 통상적으로 공동순환한다. 최근 몇 년에, 신규한 IBV 유전자형, QX 균주는 아시아 및 유럽에서 점점 더 흔하게 되었다. 사망률은 통상적으로 100%에 가깝다. 닭은 기침, 재채기를 할 수 있고, 10 내지 14일에 대해 기관수포음을 가진다. 결막염 및 호흡장애가, 때때로 얼굿 붓기, 특히 부비동의 동시 박테리아 감염과 함께 보일 수 있다. 병아리는 쇠약하게 되며, 온열 램프 하에 모이게 된다. 사료 섭취량 및 체중 증가는 감소된다. 신증 유전자 균주에 의한 감염은 초기 호흡 징후, 이후의 침체, 헝클어진 깃털, 습식 낙모, 더 큰 물 흡수 및 사망을 야기할 수 있다. 산란계에서, 산란은 70%만큼 떨어질 수 있으며, 알은 종종 얇고, 연질이며, 거칠고 그리고/또는 엷은 껍질을 갖는 기형이고, 더 작을 수 있으며, 물기가 많은 알부민을 가질 수 있다. 대부분의 경우에, 산란 및 난질은 정상으로 복귀되지만, 이는 8주까지 계속될 수 있다. 대부분의 발병에서, 사망률은 질환이 동시 발생하는 박테리아 감염에 의해 더 복잡하게 될 때 더 높지만, 사망률은 5%이다. 신증 유전자 균주는 영계에서 높은 사망률(60%까지)을 갖는 사이의 간질성 신염을 유도할 수 있다. 영계의 감염은 수란관에 대한 영구한 손상을 야기하여, 산란계 또는 육계가 정상 생산 수준에 결코 도달하지 못하게 할 수 있다.
IB 바이러스의 공지된 백신 균주는 IB-QX 및 IB-QX-유사 바이러스에 의해 야기되는 감염성 기관지염에 대한 보호에 불충분한 것으로 증명되었다. WO 2010/017440 참조.
감염성 훼브리셔스 낭병(IBD, 감보로병)은 전세계에서 발견되는 고도로 전염성 면역억제질환이며, 알 및 고기 생산에 대한 주된 경제적 영향을 야기한다. IBD 백신은 감보로 제어 전략의 중요한 부분을 형성한다. 투여될 백신의 선택은 백신접종되는 닭 유형 및 우세한 시험감염 상황에 의존한다.
일반적으로, 불활화 항원은 가금 백신에서 사용되었다. 그러나, 불활화 바이러스의 제조는 상대적으로 비싸며, 따라서 저수준의 항원을 함유하는 효과적인 백신이 바람직하다.
가금 백신접종에서의 다른 필요는 백신접종 그 자체의 비용과 밀접하게 관련되어 있다. 다중 질환을 예방하도록 설계된 다가 백신을 만드는 것이 경제적으로 유리하다. 이러한 다가 백신은 백신 투여 비용을 낮춘다. 그러나, 항원 간섭의 잘 공지된 현상에 기인하여, 동일한 투약 형태에서 항원을 단순히 혼합하는 것은 종종 다가 백신의 생산에 대한 효과적인 접근이 아니다.
따라서, 더 소량의 항원 및/또는 다가 백신을 갖는 가금 백신에 대한 필요가 있다.
본 발명은 일 양상에서 항원 성분 및 면역학적 유효량의 애주번트 성분을 포함하는 면역학적 조성물을 제공하되, 항원 성분은 적어도 1종의 TRT 항원 및 적어도 1종의 IB 항원을 포함하고, 애주번트 성분은 면역자극 올리고뉴클레오타이드, 오일 에멀션, 및 선택적으로, 스테롤을 포함한다.
특정 실시형태에서, 적어도 1종의 TRT 항원은 TRT 균주 K이다.
특정 실시형태에서, 적어도 1종의 IB 항원은 IB D1466 및 IB QX 항원 중 적어도 하나이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 비-리포좀 및/또는 본질적으로 무 사포닌이다.
특정 실시형태에서, 선택적으로 존재하는 스테롤은 면역자극 올리고뉴클레오타이드와 혼합된다.
본 발명은 또한 항원 성분 및 유효량의 애주번트 성분을 포함하는 백신을 제공하되, 애주번트 성분은 면역자극 올리고뉴클레오타이드 및 오일 에멀션을 포함하고, 항원 성분은 IBD 항원을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 IBD 항원은 불활화된 루커트(Lukert) 균주 항원인데, 이는 107.5 내지 108 TCID50의 양으로 존재할 수 있다.
특정 실시형태에서, 백신은 IBD의 비-루커트 균주로부터 유래된 항원; 감염성 기관지염 항원; 레트로바이러스 항원; 뉴캐슬병 항원; 칠면조 비기관염 항원 중 적어도 1종을 포함하는 다가 백신이다.
다른 양상에서, 본 발명은 항원 성분 및 유효량의 애주번트 성분을 포함하는 백신을 제공하되, 애주번트 성분은 면역자극 올리고뉴클레오타이드 및 오일 에멀션을 포함하고, 항원 성분은 TRT 항원; 뉴캐슬 항원; 산란 저하 증후군(Egg Drop Syndrome: EDS) 항원; IBK 항원; 및 코리자 항원을 포함한다.
특정 실시형태에서, TRT 항원은 불활화된 칠면조 비기관지염 바이러스를 포함하고, 뉴캐슬 항원은 불활화된 뉴캐슬 바이러스를 포함하며, EDS 항원은 불활화된 EDS 바이러스를 포함하고, IBK 항원은 불활화된 IBK 바이러스를 포함하며, 코리자 항원은 코리자 M, 코리자 221 및 코리자 S 박테리아 백신의 혼합물을 포함한다.
특정 실시형태에서, TRT 항원은 투약당 106.00 TCID50 내지 106.50 TCID50의 양으로 존재한다.
특정 실시형태에서, 상기 오일 에멀션은 W/O 에멀션이다.
정의
측정 가능한 수치 변수와 함께 사용될 때 용어 '약' 또는 '대략'은 약'이 몇 주 내 시간 간격에 대해 사용되지 않는 한, 변수의 표시된 값 및 표시된 값의 실험 오차 내인(예를 들어, 평균에 대해 95% 신뢰 구간 내인) 또는 표시된 값의 10% 내인 변수의 모든 값(어느 쪽이든 더 큰 것)을 지칭하며, "약 3주"는 17 내지 25일이고, 그리고 약 2 내지 약 4주는 10 내지 40일이다.
본 발명의 애주번트 제형에 적용되는 용어 '본질적으로 이루어진' 등은 상기 제제가 측정 가능한 애주번트 또는 면역 조절 효과를 발휘하는 양으로 추가적인 애주번트 또는 면역조절제를 함유하지 않는 조성물을 지칭한다.
용어 '본질적으로 무 사포닌', '실질적으로 무 사포닌' 등은 사포닌이 측정 가능한 애주번트 또는 면역조절 효과를 발휘하는 양으로 사포닌을 함유하지 않는 조성물을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 본질적으로 무 사포닌 조성물은 전신 면역 반응, 예컨대 발열을 야기하는데 불충분한 양으로 사포닌을 함유한다. 특정 실시형태에서, 본질적으로 무 사포닌 조성물은 검출 한계 이하에서 사포닌을 함유하지 않는다.
용어 '면역자극 분자'는 면역 반응을 생성하는 분자를 지칭한다.
용어 '비경구 투여'는 소화관을 통한 또는 소화관을 포함하지 않는 경로에 의한 물질, 예컨대 백신의 대상체 신체 내로의 도입을 지칭한다. 비경구 투여는 피하, 근육내, 경피, 피내, 복강내, 안구내 및 정맥내 투여를 포함한다.
면역자극 올리고뉴클레오타이드 제제에 적용되는 순도 백분율 또는 "X 백분율 순도"는 명명된 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 8 등)의 X%를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 분자의 집단을 지칭하고, 나머지(즉, 100% 내지 X%)는 명명된 서열의 제조 동안 불순물로서 존재하는 명명된 올리고뉴클레오타이드의 더 짧은 단편을 포함한다. 따라서, 서열이 3'-5' 서열분석에 의해 제조된다면, 5'-절단은 나머지를 포함한다. 비제한적 예로서, 100㎍의 80% 순도 서열번호 8의 제제는 80㎍의 서열번호 8을 포함하고, 남아있는 20㎍은 제제에 존재하는 서열번호 8의 더 짧은 단편이다.
용어 '치료적 유효량', '면역학적 유효량' 및 '유효량'은 병원균, 예컨대 바이러스 또는 박테리움에 의한 감염에 의해 야기되는 유해한 건강 효과 또는 합병증을 포함하는, 질환의 징후 또는 증상을 예방하거나 또는 감소시키기에 적절한 항원 또는 애주번트 또는 백신을 받는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 항원 또는 애주번트 또는 백신의 양을 지칭한다. 체액성 면역 또는 세포 매개 면역 또는 체액성과 세포 매개 면역 둘 다 유도될 수 있다. 동물에서 백신의 면역원성 및 효능은, 예를 들어, 항체 역가의 측정, 림프구 증식 분석을 통해 간접적으로, 또는 야생형 균주에 의한 시험감염 후 징후 및 증상의 모니터링을 통해 직접적으로 평가될 수 있다. 백신에 의해 부여되는 보호 면역은, 예를 들어, 사망률, 이환율, 온도 숫자, 전반적인 신체 조건 및 대상체의 전반적인 건강 및 수행과 같은 임상 징후의 감소를 측정함으로써 평가될 수 있다. 치료적으로 유효한 백신의 양은 사용되는 특정 애주번트, 사용되는 특정 항원 또는 대상체의 병태에 따라 다를 수 있으며, 당업자에 의해 결정될 수 있다.
상업적 산란계 및 육계는 그들의 생애 동안 매우 다양한 상이한 백신으로 백신접종된다. 이들 백신은 약독된 생백신이다. 닭은 산란을 시작할 준비가 될 시간까지, 그들이 이미 백신을 받은 감염제에 대한 면역을 촉진시키기 위해 그리고 산란 기간 동안 산란 또는 다른 손상의 감소를 야기할 수 있는 다른 제제에 대한 면역을 유도하기 위해 그들은 불활화된 조합 백신으로 백신접종된다. 이들 백신은 높은 항체 역가를 유도할 수 있다는 점 및 면역의 지속기간이 길다는 점에서 중요한데, 백신이 대략 20주령으로부터 70주령까지 지속되는 전체 산란 기간 동안 보호되어야 하기 때문이다. 면역의 긴 지속기간을 달성하기 위해, 애주번트, 예를 들어 유중수(W/O) 에멀션에서 항원을 제형화하는 것이 필요하다.
따라서, 일반적으로, 본 발명은 항원 성분 및 애주번트 성분을 포함하는 면역원성 조성물을 제공하되, 항원 성분은 적어도 1종의 TRT 항원 및 적어도 1종의 IB 항원을 포함하고, 애주번트 성분은 면역자극 올리고뉴클레오타이드, 오일 에멀션, 및 선택적으로, 스테롤을 포함한다(또는 일부 실시형태에서, 본질적으로 이루어지거나, 또는 다른 실시형태에서 이루어진다).
항원 성분
상이한 IB QX 항원은 본 발명에 적합하다. 특정 실시형태에서 IB QX 항원은 전체 불활화된 바이러스이다. 다른 실시형태에서, 바이러스는 변형된 생 바이러스이다. 또 다른 실시형태에서, 서브유닛 백신이 사용될 수 있다. 예를 들어, S 단백질, M 단백질 E-단백질 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 바이러스 표면에 존재하는 단백질이 적합할 수 있다. 불활화된 전체 바이러스의 사용을 수반하는 실시형태에서, 항원은 103 내지 1010개의 감염 단위/투약, 예를 들어, 104, 105, 106, 107개의 감염 단위/투약의 양으로 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 투약당 IB QX 불활화된 바이러스의 양은 약 105 내지 약 108개의 감염 단위/투약이다.
추가 실시형태에서, 항원 성분은 특정 실시형태에서, 불활화된 루커트 IBD 바이러스인 IBD 항원을 포함한다.
특정 실시형태에서, 불활화된 루커트 IBD 바이러스의 양은 107 내지 108 TCID50/용량, 예를 들어, 107.1, 107.2, 107.3, 107.4, 107.5, 107.6, 107.7, 107.8, 107.9 TCID50/용량이다.
특정 실시형태에서, 불활화된 루커트 IBD 바이러스에 추가로, 백신의 항원 성분은 다른 항원을 포함한다. 예를 들어, 상이한 균주의 감염성 기관지 바이러스, 예를 들어, IB M41 및/또는 IB D1466 및/또는 IB D274가 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 백신은 또한 TRT, 뉴캐슬병(예를 들어, LaSota 균주), EDS(산란저하증후군), 레오바이러스, 및 점염성 훼브리셔스 낭병 바이러스 항원, 조류 인플루엔자를 포함할 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 TRT 항원; 뉴캐슬 항원; 산란 저하 증후군(EDS) 항원; IBK 항원(감염성 기관지염 바이러스); 및 코리자 항원을 포함하는 다가 백신을 제공한다.
본 발명의 특정 실시형태에서, TRT 항원은 106.00 TCID50 내지 106.50 TCID50/용량, 예를 들어, 106.00 TCID50 또는 106.10 TCID50 또는 106.20 TCID50 또는 106.30 TCID50 또는 106.40 TCID50 또는 106.50 TCID50 의 양으로 존재한다.
본 발명의 백신에서 사용되는 바이러스는 약독되거나 또는 불활화될 수 있다. 바이러스 불활화 및 약독을 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 바이러스는 배양물 계대에 의해 불활화된될 수 있다. 불활화 방법은 포말린, 베타 프로피오락톤(BPL), 바이너리 에틸렌이민(BEI) 또는 페놀로부터 선택된 유효량의 불활화 화학물질에 대한 바이러스 노출을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
코리자는 헤모필루스 파라갈리나룸(Haemophilus paragallinarum)의 상이한 균주에 의해 야기된다. 따라서, 특정 실시형태에서, 코리자 항원은 1종 이상의 헤모필루스 파라갈리나룸 균주, 예를 들어, 균주 M, 균주 Z, 균주 221 등을 포함한다. 다른 실시형태에서, 혈청형 A, B 및 C를 제시하는 균주의 혼합물이 사용될 수 있다. 따라서, 균주 221(코리자 221)은 혈청형 A 균주로서 사용될 수 있고, 균주 스프로스(Spross)(코리자 S)는 혈청형 B 균주로서 사용될 수 있으며, 균주 모데스토(Modesto)(코리자 M)는 혈청형 C 균주로서 사용될 수 있다.
당업자는 바이러스 역가가 바이러스 적정 방법에 따라, 때때로 30%만큼 다를 수 있다는 것을 인식할 수 있다. 본 개시내용에서, 용량이 10의 지수로서 측정되는 경우, 지수는 0.2만큼 다를 수 있다. 따라서, 예를 들어 106.40 TCID50의 역가는 106.20 TCID50 내지 106.60 TCID50의 값을 포함할 수 있다. 역가의 범위에 동일한 생각이 적용된다. 예를 들어, 106.00 TCID50 내지 106.50TCTD50의 역가는 105.80 TCID50 내지 106.70TCTD50 범위를 포함한다.
다른 실시형태에서, 다른 항원은 상기 열거한 항원, 예를 들어, 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 마이코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 파스퇴렐라 물토시다(Pasteurella multocida)에 추가로 사용될 수 있다. 바이러스 불활화와 유사하게, 박테리아는, 예를 들어, 포말린, 베타 프로피오락톤(BPL), 바이너리 에틸렌이민(BEI), 또는 페놀로부터 선택된 유효량의 불활화 화학물질에 대한 노출에 의해 불활화될 수 있다.
애주번트 성분
일반적으로, 본 발명의 면역원성 조성물에서 사용되는 애주번트 성분은 면역자극 올리고뉴클레오타이드, 오일, 및 선택적으로, 계면활성제(들)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 애주번트 성분은 사포닌 및/또는 ISCOM이 없거나 또는 본질적으로 없다.
특정 실시형태에서, 애주번트 성분은 면역자극 올리고뉴클레오타이드, 오일, 및 선택적으로, 계면활성제(들)로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 애주번트 성분은 면역자극 올리고뉴클레오타이드, 오일, 및 선택적으로, 계면활성제(들)로 이루어진다.
적합한 면역자극 올리고뉴클레오타이드는 ODN(DNA-기반), ORN(RNA-기반) 올리고뉴클레오타이드 또는 키메라 ODN-ORN 구조를 포함하는데, 이는 포스포로티오에이트 변형, 할로겐화, 알킬화(예를 들어, 에틸- 또는 메틸- 변형), 및 포스포다이에스터 변형을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 변형된 골격을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리 이노신산 또는 이의 유도체(폴리 I:C)가 사용될 수 있다.
CpG 올리고뉴클레오타이드는 특정 염기-서열 맥락(CpG 모티프)에서 비메틸화된 CG 다이뉴클레오타이드의 존재를 특징으로 한다. (본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Hansel TT, Barnes PJ (eds): New Drugs for Asthma, Allergy and COPD. Prog Respir Res. Basel, Karger, 2001, vol 31, pp 229-232]). 이들 CpG 모티프는 CG 다이뉴클레오타이드가 억제된 진핵 DNA에서 보이지 않으며, 존재할 때, 보통 메틸화되지만, 그들이 면역자극 특성을 부여하는 박테리아 DNA에 존재한다.
선택된 실시형태에서, 본 발명의 애주번트는 소위 P-클래스 면역자극 올리고뉴클레오타이드, 더 바람직하게는, 변형된 P-클래스 면역자극 올리고뉴클레오타이드, 훨씬 더 바람직하게는, E-변형된 P-클래스 올리고뉴클레오타이드를 이용한다. P-클래스 면역자극 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 6 내지 20개 뉴클레오타이드 길이의 회문구조 존재를 특징으로 하는 CpG 올리고뉴클레오타이드이다. P-클래스 올리고뉴클레오타이드는 시험관내 및/또는 생체내 중 하나에서 연쇄체(concatamer)로 동시에 자기 조립하는 능력을 가진다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 엄격한 의미에서, 단일 가닥이지만, 회문구조의 존재는 연쇄체 또는 가능하게는 줄기-및 루프 구조의 형성을 허용한다. P- 클래스 면역자극 올리고뉴클레오타이드의 전체 길이는 19 내지 100개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 19 내지 30개의 뉴클레오타이드, 30 내지 40개의 뉴클레오타이드, 40 내지 50개의 뉴클레오타이드, 50 내지 60개의 뉴클레오타이드, 60 내지 70개의 뉴클레오타이드, 70 내지 80개의 뉴클레오타이드, 80 내지 90개의 뉴클레오타이드, 90 내지 100개의 뉴클레오타이드이다.
본 발명의 일 양상에서 면역자극 올리고뉴클레오타이드는 5' TLR 활성화 도메인 및 적어도 2개의 회문구조 영역을 함유하는데, 하나의 회문구조 영역은 길이가 적어도 6개의 뉴클레오타이드인 5' 회문구조 영역이며 직접적으로 또는 스페이서를 통해 길이가 적어도 8개의 뉴클레오타이드인 3' 회문구조 영역에 연결된다.
P-클래스 면역자극 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 기법에 따라 변형될 수 있다. 예를 들어, J-변형은 요오도-변형된 뉴클레오타이드를 지칭한다. E-변형은 에틸-변형된 뉴클레오타이드(들)를 지칭한다. 따라서, E-변형된 P-클래스 면역자극 올리고뉴클레오타이드는 P-클래스 면역자극 올리고뉴클레오타이드이되, 적어도 하나의 뉴클레오타이드(바람직하게는 5' 뉴클레오타이드)가 에틸화된다. 추가적인 변형은 6-나이트로-벤즈이미다졸의 부착, O-메틸화, 프로인일-dU에 의한 변형, 이노신 변형, 2-브로모비닐 부착(바람직하게는 유리딘)을 포함한다.
P-클래스 면역자극 올리고뉴클레오타이드는 또한 포스포다이에스터 결합 및 포스포로티오에이트 결합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 변형된 뉴클레오타이드간 결합을 함유할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 상업적 공급원으로부터 합성되거나 또는 얻을 수 있다.
P-클래스 올리고뉴클레오타이드 및 변형된 P-클래스 올리고뉴클레오타이드는 2008년 6월 12일에 공개된 국제특허출원 공개 WO 2008/068638에 추가로 개시되어 있다. 변형된 P-클래스 면역자극 올리고뉴클레오타이드의 적합한 비제한적 예는 이하에 제공된다(서열번호 1 내지 10에서, "*"는 포스포로티오에이트 결합을 지칭하고, "-"는 포스포다이에스터 결합을 지칭한다). 서열번호 11 내지 14에서, 모든 결합은 포스포다이에스터 결합이다.
Figure pat00001
본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오타이드는 화학적으로 합성될 수 있다. 추가로, 면역자극 올리고뉴클레오타이드는 약 60% 이상의 순도(균질성)(예를 들어, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 또는 100% 순도)로 사용될 수 있다.
애주번트 조성물에서 사용하기 위한 P-클래스 면역자극 올리고뉴클레오타이드의 양은 사용된 P-클래스 면역자극 올리고뉴클레오타이드의 특성 및 의도된 종에 의존한다.
스테롤은 보통 탄소-3에 부착된 하이드록실(OH) 기를 갖는 스테로이드 고리 구조[들]인 통상적인 화학적 코어를 공유한다. 지방산 치환체의 탄화수소 쇄는 길이가 보통 16 내지 20개의 탄소 원자로 다르며, 포화 또는 불포화일 수 있다. 스테롤은 통상적으로 고리 구조에서 하나 이상의 이중 결합 및 또한 고리에 부착된 다양한 치환체를 함유한다. 스테롤 및 그들의 지방산 에스터는 본질적으로 수불용성이다. 이들 화학적 유사성을 고려하여, 따라서 이 화학적 코어를 공유하는 스테롤은 본 발명의 백신 조성물에서 사용될 때 유사한 특성을 가질 가능성이 있다. 스테롤은 당업계에 잘 공지되어 있고, 상업적으로 구입될 수 있다. 예를 들어 콜레스테롤은 문헌[Merck Index, 12th Ed., p. 369]에 개시되어 있다. 적합한 스테롤은, β-시토스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤, 에르고칼시페롤, 콜레스테롤, 및 이들의 유도체, 예컨대 DC-콜레스테롤 (3β-[N-(다이메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다중 오일 및 이들의 조합은 본 발명의 용도에 적합하다. 이들 오일은 동물성 오일, 식물성 오일뿐만 아니라 비대사성 오일을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명에 적합한 식물성 오일의 비제한적 예는 옥수수유, 땅콩유, 대두유, 코코넛유, 올리브유 및 식물성 스쿠알란이다. 동물성 오일의 비제한적 예는 스쿠알란이다. 비대사성 오일의 적합한 비제한적 예는 경질 광유, 직쇄 또는 분지쇄 포화 오일, 분기된 오일 등을 포함한다.
실시형태의 세트에서, 본 발명의 애주번트 제형에서 사용되는 오일은 경질 광유이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "광유"는 증류 기법을 통해 석유로부터 얻어진 액체 탄화수소의 혼합물을 지칭한다. 상기 용어는 "액화 파라핀", "액체 페트롤라툼" 및 "백색 광유"와 동의어이다. 용어는 또한 "경질 광유", 즉, 페트롤라툼의 증류에 의해 유사하게 얻어지만, 백색 광유보다 약간 더 낮은 비중을 갖는 오일을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1990, 페이지 788 및 1323)] 참조. 광유는 다양한 상업적 공급원, 예를 들어, J. T. 베이커(J. T. Baker)(펜실베이니아 필립스버그에 소재), USB 코포레이션(USB Corporation)(오하이오주 클리브랜드에 소재)으로부터 얻을 수 있다. 바람직한 광유는 명칭 드라케올(DRAKEOL)(등록상표) 하에서 상업적으로 입수 가능한 경질광유이다. 다른 실시형태에서, 적합한 오일은 광유 마르코(MARCOL)(상표명) 52를 포함한다. 마르콜(MARCOL)(상표명) 52는 액체 포화 탄화수소의 정제된 혼합물이다. 이는 독성 불순물을 함유하지 않는 결정이 깨끗한, 백수(water-white) 제품이다. 이는 촉매적 수소화에 의한 궁극의 정제를 포함하는 후속적 정제 단계를 이용하여 진공 증류에 의해 석유로부터 얻어진다.
본 에멀션에서 사용하기에 적합한 유화제는 천연의 생물학적으로 적합한 유화제 및 비천연 합성 계면활성제를 포함한다. 생물학적으로 적합한 유화제는 인지질 화합물 또는 인지질의 혼합물을 포함한다. 바람직한 인지질은 포스파티딜콜린(레시틴), 예컨대 대두 또는 달걀 레시틴이다. 레시틴은 조질의 식물성 오일을 물 세척함으로써, 그리고 얻어진 수화된 검을 분리 및 건조시킴으로써 인지질 및 트라이글리세라이드의 혼합물로서 얻을 수 있다. 정제품은 아세톤 세척에 의한 트라이글리세라이드 및 식물성 오일의 제거 후에 남아있는 아세톤 불용성 인지질 및 당지질에 대한 혼합물을 분획화함으로써 얻을 수 있다. 대안적으로, 레시틴은 다양한 상업적 공급원으로부터 얻을 수 있다. 다른 적합한 인지질은 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티드산, 카디오리핀, 포스파티딜에탄올아민, 라이소포스파티딜콜린, 라이소포스파티딜세린, 라이소포스파티딜이노시톨 및 라이소포스파티딜에탄올아민을 포함한다. 인지질은 천연 공급원 또는 통상적으로 합성되는 공급원으로부터 단리될 수 있다.
추가적인 실시형태에서, 본 명세서에서 사용되는 유화제는 레시틴을 포함하지 않거나, 또는 면역학적으로 유효하지 않은 양으로 레시틴을 사용한다.
본 발명의 애주번트 제형에서 사용하기에 적합한 비천연, 합성 유화제는 솔비탄-계 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 지방산-치환된 솔비탄 계면활성제(명칭 스팬(SPAN)(등록상표) 또는 아르라셀(ARLACEL)(등록상표) 하에서 상업적으로 입수 가능), 폴리에톡실화된 솔비톨의 지방산 에스터(트윈(TWEEN)(등록상표)), 공급원으로부터의 지방산의 폴리에틸렌 글리콜 에스터, 예컨대 피마자유(에물포르(EMULFOR)(등록상표)); 폴리에톡실화된 지방산(예를 들어, 명칭 시뮬솔(SIMULSOL)(등록상표) M-53 하에서 입수 가능한 스테아르산), 폴리에톡실화된 아이소옥틸페놀/폼알데하이드 중합체(틸록사폴(TYLOXAPOL)(등록상표)), 폴리옥시에틸렌 알코올 에터(BRIJ(등록상표)); 폴리옥시에틸렌 비페닐 에터(트리톤(TRITON)(등록상표) N), 폴리옥시에틸렌 아이소옥틸페닐 에터(트리톤(등록상표) X)를 포함한다. 바람직한 합성 계면활성제는 명칭 스팬(등록상표) 및 트윈(등록상표), 예컨대 트윈(등록상표)-80(폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노올리에이트) 및 아르라셀(ARLACEL)(상표명) 83V(솔비탄 세스퀴올리에이트)) 하에 입수 가능한 계면활성제이다.
일반적으로 말해서, 유화제(들)는 0.01용적% 내지 40용적%, 바람직하게는, 0.1% 내지 15%, 더 바람직하게는 2% 내지 10%의 양으로 백신 조성물 중에 존재할 수 있다.
실시형태의 서브세트에서, 오일 및 유용성 유화제의 용적 백분율은 함께 백신 조성물의 적어도 50%, 예를 들어, 50용적% 내지 95용적%; 바람직하게는, 50용적% 내지 85% 초과의 양; 더 바람직하게는, 50% 내지 60%의 양, 그리고 더 바람직하게는 55 내지 65% v/v의 양이다. 따라서, 예를 들어 그리고 제한 없이, 오일은 45%의 양으로 존재할 수 있고, 지용성 유화제는 5% v/v 초과의 양으로 존재할 것이다. 따라서, 오일과 유용성 유화제의 용적 백분율은 함께 적어도 50%일 것이다.
또 다른 서브세트에서, 본 발명의 모든 백신에 적용 가능한, 오일의 용적 백분율은 40% 이상, 예를 들어, 40용적% 내지 90용적%; 40% 내지 85%; 43% 내지 60%, 44 내지 50% v/v의 백신 조성물이다. 특정 실시형태에서, 에멀션은 적어도 60% v/v 오일상 및 40% v/v 수성상을 함유한다.
때때로, 특히 상업적 용도로 규모를 확대함에 있어서 항원을 농축시키는 것이 불가능하거나 또는 실행 가능하지 않으며, 저농도의 항원 용액이 사용되어야 한다. 따라서 일부 실시형태에서, 본 발명의 백신 조성물은 상기 기재한 바와 같은 애주번트 제형을 포함하되, 이들 애주번트 제형에서 오일상의 내용물은 희석되고, 백신 조성물은 유중수 에멀션이다.
실제로, 유중수 에멀션을 만드는 것이 가능하되, 오일상은 50% v/v 미만이다.
간략하게, 처음에, 본 발명의 애주번트 제형은 상기 기재한 바와 같이 제조된다. 상기 애주번트 제형에서, 오일상은 애주번트 제형의 50% v/v을 포함한다. 오일 및 유화제(들) 이외의 성분의 양은 각각 최종 표적 농도 및 요망되는 희석에 기반하여 규모가 확대된다. 예를 들어, 애주번트 제형이 80% v/v를 포함하는 경우에 백신 조성물을 제조하는 것을 목적으로 한다면, 오일 이외의 성분의 양은 1.25(1/0.8)배로 규모가 확대된다. 만약에 있다면, 유화제(예를 들어, 트윈(등록상표)80 및/또는 스팬(등록상표)80)의 양은 반드시 규모가 확대될 필요는 없지만, 바람직하게는, 오일과 유화제(들) 사이의 용적비는 애주번트 제형에서 그리고 최종 백신 조성물에서 동일하게 유지된다.
이어서, 항원 용액이 애주번트 제형에 첨가된다.
유중수 에멀션의 온전함은 분산된 구체 물방울이 단분산 점적의 무작위 패킹을 위한 최대 패킹 분획(즉, 0.64)보다 더 농축된 형태로 존재하지 않는 한 유지될 수 있다. 문헌[Tadros, Emulsion Formation, Stability and Rheology, 1st ed. 2013, Wiley-VCH GmbH & Co KGaA] 참조. 수성 점적에 의해 점유되는 총 용적 분획이 0.64(즉, 64% v/v)를 초과하지 않는다면, 대조적으로, 이는 유성상이 36% v/v 미만으로 떨어지지 않아야 한다는 것을 나타낸다.
일부 실시형태에서 적합한, 1 용량의 애주번트는 약 0.1 내지 약 20㎍(예를 들어, 1 내지 20㎍, 또는 5 내지 15㎍ 또는 8 내지 12㎍ 또는 10㎍)의 면역자극 올리고뉴클레오타이드, 약 50㎍까지의(예를 들어, 0.5 내지 20㎍, 또는 1 내지 10㎍)의 스테롤, 예컨대 콜레스테롤을 함유할 것이다.
특정 실시형태에서, 애주번트 성분은 다음과 같이 제조된다:
a) 솔비탄 세스퀴올레이트, 및 콜레스테롤은, 만약에 있다면, 경질 광유 중에 용해된다. 얻어진 오일 용액은 멸균 여과된다;
b) 면역자극 올리고뉴클레오타이드 및 폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올리에이트는 수성상 중에 용해되며, 따라서 수성 용액을 형성한다;
c) 수성 용액은 지속적 균질화 하에 오일 용액에 첨가된다.
본 발명의 면역원성 조성물은 수성상을 오일상과 합함으로써 뒤따르는 수성상에 항원 성분을 첨가함으로써 제조될 수 있다. 다른 실시형태에서, 항원 성분은 애주번트 성분이 제조된 후에 애주번트 성분에 첨가될 수 있다.
면역원성 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 애주번트, 안정제, 희석제, 보존제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제, 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체(들)는 조성물의 다른 성분과 양립 가능하고 대상체에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용 가능"하여야 한다. 전형적으로, 담체는 멸균 및 무발열원이고, 사용될 투여 방식에 기반하여 선택될 것이다. 조성물을 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 담체에 대한 바람직한 제형은 미국(US) 농무부 또는 미국 식품 의약국, 또는 미국이 아닌 국가에서의 동등한 규제기관에 의해 공포된 적용 가능한 규제에서 승인된 해당 약제학적 담체라는 것은 당업자에 의해 잘 공지되어 있다. 따라서, 조성물의 상업적 생산을 위해 약제학적으로 허용되는 담체는 미국 또는 외국에서 적절한 정부 기관에 의해 이미 승인되었거나 또는 승인될 담체이다.
조성물의 다른 성분은 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 예컨대 담체, 용매 및 희석제, 등장제, 완충제, 안정제, 보존제, 혈관수축제, 항박테리아제 등을 포함할 수 있다. 전형적인 담체, 용매 및 희석제는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤, 오일 등을 포함한다. 대표적인 등장제는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 솔비톨, 락토스 등을 포함한다. 유용한 안정제는 젤라틴, 알부민 등을 포함한다.
백신의 투여
일반적으로, 본 발명의 백신은 다중 경로를 통해 투여될 수 있다. 이러한 경로는 당업자에게 공지되어 있고, 근육내 및 피하 주사를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 백신은 예상일의 약 3 내지 7주(예를 들어, 약 4 내지 6주) 전에 투여된다. 이 섭생은 IB QX에 대한 면역이 부화 시간에 의해 발생되고 백신접종된 암탉의 산란 기간 내내 지속된다는 것을 보장한다.
추가적인 실시형태에서, 본 발명의 백신은 프라이밍된 암탉에게 부스터 백신으로서 투여된다. 다중 IB 프라이머는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, POULVAC(등록상표) IB 프라이머는 냉동건조된, 매사추세츠(Massachusetts) 유형의 생 감염성 기관지염 바이러스를 포함한다. 노빌리스(Nobilis)(등록상표) IB H120은 감염성 기관지염에 대한 1차 백신접종으로서의 용도에 대해 표시된 생 냉동건조 백신이다. 이 백신은 균주 H120 유형 매사추세츠를 함유한다. 다른 IB 프라이머는 또한 본 발명의 백신과 함께 사용될 수 있다.
본 발명은 다음의 비제한적 실시예에 추가로 기재될 것이다.
실시예
실시예 1: 백신 제제
예시적인 유중수 에멀션을 표 1에 제공한다. 항원을 또한 CpG가 첨가되는 수상 중에서 희석시킨다. 수상은 항원, CpG 및 티메로살을 함유한다. 이를 오일상과 혼합한다. 철저한 혼합 후에, 안정한 W/O 에멀션이 형성된다.
Figure pat00002
실시예 2: IB 또는 TRT에 대한 효능 분석
본 발명자들은 불활화된 IB M41 항원(투약당 불활화 전에 107.2 EID50) 또는 불활화된 TRT 항원(투약당 불활화 전에 105.3 TCID50)을 함유하는 W/O 에멀션을 생산하였다. 이들 에멀션은 상이한 양의 CpG를 함유하거나 또는 CpG(서열번호 8, 65% 순도)를 함유하지 않았다. 닭에서의 효능 검사에서 에멀션을 시험하였다. 닭을 4주령에 백신접종하였다. 백신접종 후 5주에, 혈액 샘플을 수집하고, ELISA에 의해 항원에 대한 항체 역가에 대해 시험하였다.
효소-결합 면역흡착측정법(ELISA)을 이용하여 칠면조 비기관지염(TRT) 바이러스에 대한 항체 역가를 결정하였고, 이때 항원을 96웰 마이크로 ELISA 플레이트의 웰에 코팅하였다. 코팅 후에, 표준 음성 및 표준 양성 혈청을 시험할 웰 및 혈청에 첨가하였다. 모든 혈청을 2회 중복하여 시험하였다. 대조군으로서 모든 혈청을 또한 항원 없이 웰에서 2회 중복하여 시험하였다. 비결합 항체를 제거하고 나서, 페록시다제가 접합된 혈청 항체에 대해 항체를 첨가함으로써 항원에 대한 항체의 반응성을 시각화하였다. 비결합 접합 항체의 제거 후에, 페록시다제 기질 오쏘 페닐렌 다이아미노 + H2O2를 첨가하였다. 페록시다제의 존재는 색 반응의 진행에 의해 입증하였다.
TRT 항원의 효능 검사 결과를 표 2에 요약한다. 일반적 항체 역가는 만족스러웠고, 임의의 그룹에서 비반응자는 없었다. 항체 역가에 대한 CpG의 긍정적 효과가 있었다. 투약당 10㎍ CpG를 이용하여 최고의 결과를 얻었지만, 또한 투약당 1㎍ CpG는 긍정적 효과를 가졌다.
Figure pat00003
또한 IB M41에 대한 항체 반응에 대해 CpG의 긍정적 효과를 결정하였다, 표 3 참조. 투약당 1㎍ CpG의 용량은 이미 항체 반을 상당히 자극하기에 충분하였다. CpG 없이, 15마리 중 7마리는 역치 2.60 미만의 항체 반응을 가진 반면, 투약당 1㎍ CpG를 시험하였을 때 모든 닭이 반응하였다. 투약당 10㎍ CpG를 이용하여 추가적인 증가를 관찰하였다.
Figure pat00004
실시예 3: IB, ND, EDS에 대한 효능 분석
10마리의 SPF 닭 그룹을 4주령에 근육내로 투약당 0.5㎖로 백신접종하였다. 혈청학적 검사를 위한 혈액 샘플을 백신 접종 5주 후에 수집하였다. IB에 대한 항체 역가를 측정하기 위해, ND 및 EDS, ELISA(아이덱스 플록체크 IBV(Idexx FlockCheck IBV) 항체 키트; 미국 메인주에 소재한 아이덱스(Idexx)), 적혈구응집반응 저해 검사 및 ELISA(아이덱스 플록체크 NCD 항체 키트; 미국 메인주에 소재한 아이덱스)를 각각 사용하였다.
백신은 상이한 양의 CpG를 함유하는 유중수 에멀션 중에서 다음을 함유하였다:
IB M41: 106.9 EID50/투약,
뉴캐슬병(ND): 108,1 EID50/투약,
산란 저하 증후군(EDS): 256 HAu/투약.
10마리의 SPF 닭 그룹을 4주령에 근육내로 투약당 0.5㎖로 백신접종하였다. 혈청학적 검사를 위한 혈액 샘플을 백신 접종 5주 후에 수집하였다. IB에 대한 항체 역가를 측정하기 위해, ND 및 EDS, ELISA(아이덱스 플록체크 IBV(Idexx FlockCheck IBV) 항체 키트; 미국 메인주에 소재한 아이덱스(Idexx)), 적혈구응집반응 저해 검사 및 ELISA(아이덱스 플록체크 NCD 항체 키트; 미국 메인주에 소재한 아이덱스)를 각각 사용하였다.
IB, ND 및 EDS에 대한 결과를 표 4 내지 표 6에 각각 나타낸다.
백신접종 며칠 후의 ELISA IB 항체 역가
백신 배취 N 기하 평균 2log 반응자의 수
백신접종하지 않음 10 3.0 0 (0%)
CpG 없음 10 7.7 A* 4 (40%)
5㎍ CpG/투약 10 9.9 B 8 (80%)
2.5㎍ CpG/투약 10 7.3 A 3 (30%)
백신접종 35일 후에 ELISA NCD 항체 역가
백신 배취 N 기하 평균 반응자의 수
백신접종하지 않음 10 34 0 (0%)
CpG 없음 10 12532 A 10 (100%)
5㎍ CpG/투약 10 18421 B 10 (100%)
2.5㎍ CpG/투약 10 15689 B 10 (100%)
백신접종 35일 후에 EDS에 대한 HI 항체 역가
백신 배취 N 기하 평균 반응자의 수
백신접종하지 않음 10 0 0 (0%)
CpG 없음 10 7.7 A 10 (100%)
5㎍ CpG/투약 10 8.4 A 10 (100%)
2.5㎍ CpG/투약 10 7.8 A 10 (100%)
*위첨자에서 다른 글자는 통계적으로 유의한 차이가 있음을 의미한다.
결과 및 결론IB M41 및 ND에 대해 CpG이 없는 제형과 투약당 5㎍ CpG가 있는 제형 간에 유의한 차이가 있다. ND에 대해 투약당 2.5㎍ CpG는 또한 항체 역가를 상당히 개선시켰다. EDS에 대해 CpG가 없는 제형과 CpG가 있는 제형 간에 유의한 차이가 없었지만, 수치적으로 투약당 5㎍ CpG가 CpG 없음보다 더 양호하였다.
투약당 5㎍의 양으로 첨가된다면, CpG는 IB M41, ND 및 EDS의 항체 반응에 대한 자극 효과를 가졌다. 투약당 2.5㎍ CpG의 효과는 제한된다.
실시예 4: 효능 검사
CpG의 투약당 10㎍을 함유하는 W/O 에멀션 중에서 상이한 양의 불활화된 IB QX, 불활화된 IB D1466 및 불활화된 TRT 항원을 함유하는 조합 백신을 생산하였다. 이들 에멀션을 사용하여 SPF 산란계를 14주령에 백신접종하였다. 상이한 백신 그룹의 절반은 생 IV 백신을 이용하여 10주령에 백신접종하였다. 26주령에, 악성 QX-유사 IB 바이러스 또는 악성 IB D1466 바이러스를 이용하여 닭을 시험감염시켰다. 시험감염 2주 전과 시험감염 4주 후에, 산란을 측정하였다. 더 나아가, 혈청 중화 검사를 이용하는 백신접종 7주 후에 항체 역가를 측정하였다.
표 4에 제시한 데이터에서 알 수 있는 바와 같이, 생 프라이밍 후에 ELISA에 의해 분명한 항체 반응을 검출할 수 있었다. 불활화된 백신을 이용하는 백신접종 후에, IB에 대한 항체 역가를 SN 검사에 의해 결정하였다. SN 검사는 IB QX 및 IB D1466에 대한 항체를 특이적으로 검출한다. 교차 반응은 관찰되지 않은 반면, ELISA를 이용하여 IB QX와 IB D1466에 대한 항체 간에 차이는 없었다.
표 7의 데이터는 또한 시험감염 후에 백신접종하지 않은 닭에서 유독한 IB QX 시험감염 바이러스에 의해 산란의 매우 분명한 저하가 있다는 것을 나타낸다. 생백신 단독, 불활화 백신 단독 또는 둘 다에 의한 백신접종은 IB QX 시험감염 바이러스에 의해 야기된 산란 저하에 대해 보호 면역을 야기한다.
Figure pat00005
추가로, 비-QX 균주의 IB와 달리 불활화된 IB QX 항원은 신접종 후 닭에서 항체 역가를 거의 유발할 수 없다는 것이 이전에 생각되었다. 예를 들어, 감염성 기관지염의 다른, 비-QX 균주(예를 들어, IB M41, 또는 IB D274, 또는 IB D1466)로부터의 항원을 함유하는 현재 시판되는 제품은 CpG가 없는 오일 에멀션으로 면역보강하며, 또한 충분한 보호를 유발한다. 대조적으로, 표 8에서 입증하는 바와 같이, CpG가 없는 오일 에멀션은 중화 항체를 유발하는 데 불충분한 반면, CpG의 첨가는 강한 항체 반응을 야기한다.
Figure pat00006
동시에, 상기 기재한 바와 같은 IB 바이러스의 공지된 백신 균주는 IB-QX 및 IB-QX-유사 바이러스에 의해 야기되는 감염성 기관지염에 대한 보호에 불충분한 것으로 증명되었다. WO 2010/017440 참조. 놀랍게도, 본 발명의 백신은 불활화된 IB QX 항원에 대해 분명한 항체 반응을 유발하였다.
실시예 5: 감염성 기관지염, 뉴캐슬병, TRT, 감염성 훼브리셔스낭병 및 레오바이러스에 대한 백신
혼합된 성별의 신생 SPF 레그혼(Leghorn) 닭을 이 실험에서 사용하였다. 닭은 표준 식이요법을 공급받았고 물은 자유롭게 공급받았다.
제0일에, 조류에 안구 투여를 통해 매사추세츠 1 균주를 함유하는 백신을 이용하여 감염성 기관지염에 대해 백신접종하였다. 실험의 제28일에, 조류의 날개 및 눈에 각각 제조업자에 의해 권장되는 투약량으로 조류에 POULVAC(등록상표) REO 및 POULVAC(등록상표) TRT 백신을 투여하였다. 실험의 제49일에, 조류에 실험 백신을 투여하였다. 그룹 T01, T02, T04 및 T05는 그룹 당 32마리의 조류가 있었다. 그룹 T03, T06 및 T07은 그룹 당 13마리의 조류가 있었다.
실험 백신 조성
그룹 항원 성분 애주번트
T01 IB(106.9 EID(산란 감염량(egg infectious dose))50), 레오 1733 및 레오2408(106.9 TCID50 total), IBD 루커트(107.5 TCID50), IBD 28-1(102.95 TCID50) 뉴캐슬(108.1 EID50), TRT(106.40 TCID50) W/O 에멀션(광유 대략 49.9% v/v, 유화제(트윈(등록상표)80 및 알라셀(ARLACEL)(등록상표) 총 대략 9.1% v/v) + 10㎍ CpG(서열번호 8, 65% 순도)
T02 IB (106.9 EID50), 레오1733 및 레오2408(총 106.9 TCID50), IBD 루커트(108.0 TCID50), IBD 28-1(102.95 TCID50) 뉴캐슬(108.1 EID50), TRT(106.40 TCID50) T01에서와 같음
T03 음성 대조군(항원 없음) T01에서와 같은 W/O 에멀션 - CpG 없음
T04 T01에서와 같음 T01에서와 같은 W/O 에멀션 - CpG 없음
T05 T02에서와 같음 T01에서와 같은 W/O 에멀션 - CpG 없음
T06 마터나박(MATERNAVAC)(등록상표) DUO - IBDV + 레오 상업 제품
T07 MSD-노빌리스(Nobilis)(기준 TRT)(IB, 뉴캐슬, IBDV, TRT) 상업 제품
MSD 백신의 상업적 명칭: 노빌리스(등록상표) RT+IBmulti+G+ND
T01, T02, T04 및 T05에서 사용한 모든 항원을 폼알데하이드에서 불활화시켰다.그룹 T01 내지 T05는 유방 영역에서 0.5㎖ 근육내 주사를 받았다. 그룹 T06 및 T07을 제조업자의 프로토콜에 따라 처리하였다.
혈청 분석을 위해 제70일 및 제77일에 조류로부터 혈액을 취하였다. 혈청 중화 검사(IB, IBDV, Reo), HAI 검사(뉴캐슬) 및 ELISA(TRT)에 의해 분석을 수행하였다. 반복 측정을 하면서 일반적 선형 혼합 모델을 이용하여 T01, T02, T04 및 T05에 대한 혈청학 데이터를 분석하였다. 적절한 log 전환을 적용하였다. 모델은 고정된 치료 효과, 시점 및 시점 상호작용에 의한 치료 및 차단의 무작위 효과 및 차단과 치료(동물 기간) 내의 동물을 포함하였다.
원 데이터의 범위에 따라 (역전환된) 최소 제곱 평균 및 90% 신뢰 구간을 보고하였다. 주요 치료 효과 또는 시간 상호작용에 의한 치료가 유의하다면(P ≤ 0.10), 각각의 시점에 모든 처리군 간의 비교를 수행하고 보고하였다. 처리군 T03, T06 및 T07을 기하평균, 표준오차 및 범위에 따라 요약하였다.
결과를 표 10에 제공한다.
Figure pat00007
이들 결과는 W/O 에멀션에 대한 CpG의 첨가가 IBDV에 대해 거의 3배 증가된 면역 반응을 초래하였다는 것을 입증한다. 상이한 관점으로부터의 결과를 보면, 이들 결과는 108TCID50으로부터 107.5TCID50까지(약 3배 감소) IBD 루커트 용량의 감소 및 제형에 대한 CpG의 첨가(T01과 T05를 비교)가 IBD에 대한 증가된 반응을 초래하였다는 것을 입증한다. 뉴캐슬, 레오바이러스 및 TRT에 대한 반응은 또한 증가되었고, IB에 대한 반응은 통계적으로 감소되지 않았다.
추가로, 모든 바이러스에 대한 반응은 보호 역가를 초래하였다(IB에 대한 보호 역가는 20이고, 뉴캐슬에 대한 보호 역가는 16이며, IBD에 대한 보호 역가는 32이고, 레오바이러스에 대한 보호 역가는 16이다). TRT 백신의 효율은 혈청전환에 의해 측정된다. 70% 이상의 혈청전환은 백신이 유효하다는 것을 나타내었다.
상기 실험에서, CpG를 함유하는 제형(그룹 T01 및 T02)은 둘 다 TRT에 대해 효과적이었다(90% 이상의 혈청전환). 대조적으로, CpG가 없는 제형(그룹 T04 및 T05)은 TRT에 대해 효과적이지 않았다(62.5% 이하의 혈청전환).
그룹 T06은 IBDV에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. 표 10에 나타내는 바와 같이, 백신 T02에 의해 유발되는 역가는 양성 대조군에 의해 유발되는 역가와 비슷하였다. 그룹 T07은 TRT에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. 표 10에 나타내는 바와 같이, 실험 백신 T01 및 T02는 T07보다 더 높은 TRT 역가를 유발하였다.
종합하면, W/O 에멀션 내로 CpG의 첨가는 기관지염, 뉴캐슬병, TRT, 감염성 훼브리셔스낭병(IBD 또는 감보로) 및 레오바이러스에 대해 효과적인 5가 백신의 생성을 허용하였다. CpG가 없는 제형은 TRT에 대해 효과적이지 않았다. 추가로, 뉴캐슬, 레오바이러스 및 IBD에 대한 역가는 CpG에 의한 제형에서보다 CpG가 없는 제형에서 더 낮았다.
실시예 6: 감염성 기관지염, 코리자, 산란 저하 증후군, 뉴캐슬병 및 TRT에 대한 백신
혼합된 성별의 신생 SPF 레그혼 닭을 이 실험에서 사용하였다. 닭은 표준 식이요법을 공급받았고 물은 자유롭게 공급받았다.
제0일에, 조류에 안구 투여를 통해 매사추세츠 1 균주를 함유하는 백신을 이용하여 감염성 기관지염에 대해 백신접종하였다. 실험의 제14일에, 조류에 안구내로 제조업자에 의해 권장된 투약량으로 포올백(POULVAC)(등록상표) TRT 백신을 투여하였다. 실험의 제35일에, 근육내 주사를 통해 실험 백신을 투여하였다.
표 11은 이들 실험에서 사용되는 실험 및 대조군 백신 조성물을 설명한다. 각각의 그룹은 56마리의 조류를 수용하였다.
실험 백신 조성
그룹 항원 애주번트
T01 없음 없음(식염수)
T02 POULVAC(등록상표) 6가지 혼합(IBK (106.90 EID50), 코리자 M, 코리자 221, 코리자 S (총 106.88 EID50)), EDS* (80.00 HA 단위), 뉴캐슬 (108.45 EID50) 등록상표
T03 IBK(106.90 EID50), TRT(106.00 TCID50), 코리자 M, 코리자 221, 코리자 S (총 106.88 EID50), EDS (88.00 HA 단위), 뉴캐슬 (108.43 EID50) W/O 에멀션(광유 대략 51.6% v/v, 유화제(트윈(등록상표)80 및 알라셀(등록상표) 총 대략 8.4% v/v)
T04 IBK(106.90 EID50), TRT(106.00 TCID50), 코리자 M, 코리자 221, 코리자 S(총 106.88 EID50), EDS(88.00 HA 단위), 뉴캐슬(108.43 EID50) T03에서와 같음 + 10㎍ CpG (서열번호 8, 65% 순도)
T05 IBK(106.90 EID50), TRT(106.50 TCID50), 코리자 M, 코리자 221, 코리자 S(총 106.88 EID50), EDS(88.00 HA 단위), 뉴캐슬(108.43 EID50) T03에서와 같음
T06 IBK(106.90 EID50), TRT(106.50 TCID50), 코리자 M, 코리자 221, 코리자 S(총 106.88EID50), EDS(88.00 HA 단위), 뉴캐슬(108.43 EID50) T04에서와 같음
*EDS는 산란 저하 증후군을 지칭하고, IBK는 감염성 기관지염을 지칭한다.
T01, T02, T04 및 T05에서 사용한 모든 항원을 폼알데하이드에서 불활화시켰다.혈청 분석을 위해 제56일 및 제70일에 조류로부터 혈액을 취하였다. 분석에서 10%의 양측 유의 수준을 사용하였다.
반복 측정을 하면서 일반적 선형 혼합 모델을 이용하여 T01, T03, T04, T05 및 T06에 대한 혈청학 데이터를 분석하였다. 적절한 log 전환을 적용하였다. 모델은 고정된 치료 효과, 시점 및 시점 상호작용에 의한 치료 및 차단의 무작위 효과 및 차단과 치료(동물 기간) 내의 동물을 포함하였다.
원 데이터의 범위에 따라 (역전환된) 최소 제곱 평균 및 90% 신뢰 구간을 보고하였다. 주요 치료 효과 또는 시간 상호작용에 의한 치료가 유의하다면(P ≤ 0.10), 각각의 시점에 모든 처리군 간의 비교를 수행하고 보고하였다. T02에 대한 혈청학을 기하평균, 표준오차 및 범위에 따라 요약하였다.
실험군(T03 내지 T06)에 대한 결과를 표 12에 요약한다.
Figure pat00008
이들 결과는 W/O 에멀션에 대한 CpG의 첨가가 ELISA에 의해 측정한 TRT에 대해 2 내지 3배 증가된 면역 반응을 초래하였다는 것을 입증한다. 혈청전환 관점으로부터의 결과를 보면, CpG가 없는 제형으로 처리한 그룹(처리 T03 및 T05)은 효율적인 TRT 혈청전환 반응(57% 이하)을 입증하지 않았다. 대조적으로, CpG를 함유한 제형 T04 및 T06으로 처리한 그룹은 둘 다 효율적인 혈청전환(75% 이상)을 입증하였다. TRT 항원의 용량이 약 3배 감소되었지만, 더 많은 CpG의 첨가는 더 낮은 항원 용량을 보상하였다(T04와 T05를 비교).
추가로, 모든 바이러스에 대한 반응은 보호 역가를 초래하였다(IB에 대한 보호 역가는 20이고, 뉴캐슬에 대한 보호 역가는 16이며, 코리자에 대한 보호 역가는 5이고, EDS에 대한 보호 역가는 18이다). 제형 T04 및 T06(CpG를 함유)에 의해 유발되는 SN 역가 또는 HAI 역가는 일반적으로 제형 T03 및 T05(CpG가 없음)에 의해 유발된 역가보다 약 2배였다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물(특허 공보와 비특허 간행물을 둘 다 포함)은 각각의 개개 간행물이 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본 명헤서에 전문이 참고로 포함된다.
본 명세서의 발명은 특정 실시형태에 대해 기재하였지만, 이들 실시형태는 단지 본 발명의 원칙 및 적용의 예시라는 것이 이해되어야 한다. 따라서 예시적 실시형태에 대해 수많은 변형이 이루어질 수 있고, 다음의 청구범위에 의해 정해지는 본 발명의 정신과 범주로부터 벗어나는 일 없이 다른 배열이 고안될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> ZOETIS SERVICES LLC <120> Vaccine against infectious bronchitis <130> ZP000154A <140> PCT/US2017/035105 <141> 2017-05-31 <150> US 62/344,598 <151> 2016-06-02 <150> US 62/365,419 <151> 2016-07-22 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligonucleotide <400> 1 tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligonucleotide <400> 2 tcgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligonucleotide <400> 3 tcgacgtcga tcggcgcgcg ccgt 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 5'-Iodo-2'-deoxyuridine <400> 4 ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 5'-Iodo-2'-deoxyuridine <400> 5 ncgacgtcga tcggcgcgcg ccgt 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 5'-Iodo-2'-deoxyuridine <400> 6 ncgacgtcga tcggcgcgcg ccgt 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 5'-Ethyl-2'-deoxyuridine <400> 7 ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 5'-Iodo-2'-deoxyuridine <400> 8 ncgtcgacga tcggcggccg ccgt 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 5'-Iodo-2'-deoxyuridine <400> 9 ncgtcgacga tcggcggccg ccgt 24 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligonucleotide <400> 10 tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 11 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 11 uuguuguugu uguuguuguu 20 <210> 12 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 12 uuauuauuau uauuauuauu 20 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 13 aaacgcucag ccaaagcag 19 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA/RNA oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (11)..(17) <223> ribonucleotides <400> 14 tcgtcgtttt guuguguttt t 21

Claims (12)

  1. 항원 성분 및 애주번트 성분을 포함하는 백신으로서,
    애주번트 성분이 면역자극 올리고뉴클레오타이드, 오일 및 1종 이상의 유화제로 본질적으로 구성되고, 추가적인 애주번트 또는 면역 조절제를 측정가능한 애주번트 또는 면역 조절 효과를 발휘하는 양으로 포함하지 않고,
    항원 성분이 감염성 훼브리셔스 낭병(IBD) 병원체(pathogen) 또는 이로부터 유래된 항원을 포함하되, IBD 병원체 또는 이로부터 유래된 항원이 불활화된 IBD 바이러스이고 107.5 내지 108 TCID50의 양으로 존재하고,
    면역자극 올리고뉴클레오타이드가 CpG-함유 면역자극 올리고뉴클레오타이드이고,
    유중수(W/O) 에멀션인, 백신.
  2. 제1항에 있어서,
    IBD 병원체가 불활화된 루커트 균주 IBD 바이러스인, 백신.
  3. 제2항에 있어서,
    항원 성분이 하기 a) 내지 e) 중 1종 이상을 더 포함하는, 백신:
    a) IBD의 비-루커트 균주로부터 유래된 항원;
    b) 감염성 기관지염 병원체 또는 이로부터 유래된 항원;
    c) 레오바이러스 병원체 또는 이로부터 유래된 항원;
    d) 뉴캐슬병 병원체 또는 이로부터 유래된 항원;
    e) 칠면조 비기관지염 병원체 또는 이로부터 유래된 항원.
  4. 제3항에 있어서,
    감염성 기관지염 병원체가 불활화된 감염성 기관지염 바이러스를 포함하고,
    레오바이러스 병원체가 불활화된 레오바이러스를 포함하고,
    IBD의 비-루커트 균주로부터 유래된 항원이 비-루커트 균주의 불활화된 IBD 바이러스를 포함하고,
    뉴캐슬병 병원체가 불활화된 뉴캐슬 바이러스를 포함하고,
    칠면조 비기관지염 병원체가 불활화된 칠면조 비기관지염 바이러스를 포함하는, 백신.
  5. 제4항에 있어서,
    오일이 광유를 포함하는, 백신.
  6. 제4항에 있어서,
    면역자극 올리고뉴클레오타이드가 서열번호 8을 포함하는, 백신.
  7. 제6항에 있어서,
    면역자극 올리고뉴클레오타이드가 용량당 2.5 내지 20㎍의 양으로 존재하는, 백신.
  8. 제4항에 있어서,
    항원 성분이 하기 a) 내지 d)를 더 포함하는, 백신:
    a) 감염성 기관지염 병원체 또는 이로부터 유래된 항원;
    b) 레오바이러스 병원체 또는 이로부터 유래된 항원;
    c) 뉴캐슬병 병원체 또는 이로부터 유래된 항원; 및
    d) 칠면조 비기관지염 병원체 또는 이로부터 유래된 항원.
  9. 항원 성분 및 애주번트를 포함하는 백신으로서,
    항원 성분이 불활화된 감염성 기관지염 바이러스, 불활화된 뉴캐슬병 바이러스, 불활화된 칠면조 비기관지염(TRT) 바이러스, 불활화된 감염성 훼브리셔스 낭병(IBD 또는 감보로) 바이러스 및 불활화된 레오바이러스를 포함하고,
    애주번트가 유중수(W/O) 에멀션 및 CpG-함유 면역자극 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 백신.
  10. 제9항에 있어서,
    애주번트가 CpG-함유 면역자극 올리고뉴클레오타이드, 오일 및 1종 이상의 유화제로 본질적으로 구성되는, 백신.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    CpG-함유 면역자극 올리고뉴클레오타이드가 서열번호 8을 포함하는 백신.
  12. 제11항에 있어서,
    CpG-함유 면역자극 올리고뉴클레오타이드가 용량당 2.5 내지 20㎍의 양으로 존재하는, 백신.
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