CN111727053A - 非人动物用抗原表面结合型脂质体疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了可对家畜或家禽等非人动物有效地进行免疫诱导的非人动物用疫苗。本发明的非人动物用疫苗包含脂质体，所述脂质体在表面结合有源自非人动物所感染的病原体的抗原分子。非人动物例如为家畜或家禽。作为本发明的疫苗的最优选的例子之一的传染性支气管炎病毒(IBV)疫苗针对各种IBV分离株有效，在产生突变株的情况下也期待可充分地应对。作为本发明的疫苗的另一优选例的PRRSV疫苗也确认到减轻由感染引起的发热或肺的病变形成等的效果。根据本发明，可不仅以IBV还以PRRSV等各种非人动物病原体为对象，开发对预防感染症有效的脂质体疫苗。

Description

非人动物用抗原表面结合型脂质体疫苗
技术领域
本发明涉及非人动物用疫苗、特别是针对IBV的家禽用疫苗和针对PRRSV的猪用疫苗，所述疫苗包含表面结合有源自病原体的抗原分子的脂质体。
背景技术
鸡的传染性支气管炎(IB)是以冠状病毒属的传染性支气管炎病毒(IBV)为病原的疾病，除引起呼吸系统症状以外，还会引起产蛋异常或肾炎等。IB是养鸡界最迫切应对的疾病之一。为了预防IB，开发了各种活疫苗和灭活疫苗来使用。然而，除了IBV的抗原性多样化且复杂以外还频繁发生突变，因此即使使用疫苗也难以在农场中进行控制。
猪繁殖/呼吸障碍综合征(PRRS)是因感染PRRS病毒而引起的疾病，以母猪的繁殖障碍和幼猪的呼吸系统疾病为特征。1987年在美国确认发生、接着于1990年在欧州确认发生后，目前已蔓延至全球，导致流产/死产或幼猪的死亡，给养猪界带来巨大的经济损失。目前，在日本流行的PRRS病毒基本是北美型，国内有基于北美型PRRS病毒2型的疫苗在市售。在北美型PRRS病毒中也因ORF5的多样性而存在多个基因型(至少5个组)，据报道，在不同于疫苗株的基因型病毒的情况下，疫苗效果会减弱，因此仍然需要不管基因型有何差别而皆有效的疫苗。
作为用于预防人或动物的各种感染症的疫苗，已知有以脂质体作为抗原分子的载体的脂质体疫苗。在一直以来进行的脂质体疫苗的临床研究中，均为抗原内包在脂质体中的结构。之后，开发了将抗原结合在脂质体表面的技术，从而实现了免疫原性的进一步提高(非专利文献1～4)。已知通常灭活抗原只诱导体液免疫，但通过将抗原结合在脂质体表面，可诱导体液免疫和细胞性免疫这两者，疫苗的效果提高。关于抗原表面结合型脂质体疫苗，在针对人的病毒(流感病毒、丙型肝炎病毒、埃博拉病毒等)的疫苗或癌疫苗等方面进行了研究(专利文献1～3等)。
另一方面，动物用的脂质体疫苗仍然以抗原内包型的疫苗为主流，市售的动物用脂质体疫苗也是抗原内包型。针对IBV或PRRSV的脂质体疫苗尚未开发。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2004-043332号公报；
专利文献2：国际公开第2012/033142号公报；
专利文献3：日本特开2014-005205号公报；
非专利文献
非专利文献1：次世代ワクチンの産業応用技術(下一代疫苗的产业应用技术), 监修：神谷齐, CMC出版, 2010发行；
非专利文献2：Nakano等人, Int Arch Allergy Immunol. 1999, 第120卷, 第199-208页；
非专利文献3：Naito等人, Int Arch Allergy Immunol. 1996, 第109卷, 第223-228页；
非专利文献4：Tanaka等人, Bioconjugate Chem. 2004, 第15卷, 第35-40页。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于：提供可对家畜或家禽等非人动物有效地进行免疫诱导的非人动物用疫苗；特别是提供针对各种抗原性的IBV有效的IBV疫苗和针对各种基因型的PRRSV有效的PRRSV疫苗。
用于解决课题的手段
本申请发明人使用IBV的各种分离株对病毒蛋白的序列进行了深入分析，作为可网罗各式各样的突变株的抗原区域，着眼于在已知的株间保存性高的核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein，N蛋白)，制作了表面结合有抗原的脂质体疫苗。然后，对N蛋白的抗原区域、给药途径、给药次数等进行深入研究，成功开发了针对各种强毒IBV株也有效并且对免疫系统未发育成熟的孵化早期的雏也有效的IBV脂质体疫苗，进一步发现：利用同样的技术可开发针对各种非人动物的疫苗、例如PRRSV脂质体疫苗，从而完成了本申请发明。
即，本发明提供非人动物用疫苗，该疫苗包含表面结合有源自非人动物所感染的病原体的抗原分子的脂质体。
发明效果
通过本发明，提供对预防以家畜或家禽为首的非人动物的感染症有效的非人动物用疫苗。作为本发明的疫苗的最优选的一个例子的IBV疫苗针对各种IBV分离株有效，即使在产生突变株的情况下也期待可充分地应对。本发明的IBV疫苗确认对免疫系统未发育成熟的孵化早期的雏、特别是初生雏也有效，实用性非常高。另外，作为本发明的疫苗的另一优选例的PRRSV疫苗确认会减轻因感染引起的发热或肺的病变形成等。如果利用该技术，可不仅以IBV还以PRRSV等各种非人动物病原体为对象，开发对预防感染症有效的脂质体疫苗。
附图说明
[图1]是确认重组IBV N蛋白(IBV-rNp)的表达诱导和纯化的SDS-PAGE的结果。
[图2]是确认重组IBV M蛋白(IBV-rMp)的表达诱导和纯化的SDS-PAGE的结果。
[图3-1]是由给予了试验疫苗(IBV-rNp-DSS和IBV-rNp-GA)的试验鸡的脾脏采集淋巴细胞，通过鸡IFN-γ检测ELISPOT测定抗原特异性IFN-γ的产生诱导能力的结果。
[图3-2]是由给予了试验疫苗(IBV-rMp-DSS和IBV-rMp-GA)的试验鸡的脾脏采集淋巴细胞，通过鸡IFN-γ检测ELISPOT测定抗原特异性IFN-γ的产生诱导能力的结果。
[图3-3]是通过以IBV-rNp为抗原的ELISA测定接种了试验疫苗的试验鸡在免疫前后的血中抗体效价的结果。
[图3-4]是通过以IBV-rMp为抗原的ELISA测定接种了试验疫苗的试验鸡在免疫前后的血中抗体效价的结果。
[图4-1]是对按照表4-1和表4-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡根据气管纤毛运动分数评价疫苗给药效果的结果。
[图4-2]是对按照表4-1和表4-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡测定脏器中的病毒基因量的结果。
[图4-3]是对按照表4-1和表4-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡研究来自脏器的病毒分离率和分离阳性样品中的病毒效价的结果。
[图4-4]是对按照表4-1和表4-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡测定攻击时和剖检时的中和抗体效价的结果。
[图5-1]是对按照表5-1和表5-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡根据气管纤毛运动分数评价疫苗给药效果的结果。
[图5-2]是对按照表5-1和表5-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡测定脏器中的病毒基因量的结果。
[图5-3]是对按照表5-1和表5-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡研究来自脏器的病毒分离率的结果。
[图5-4]是对按照表5-1和表5-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡研究脏器中的病毒效价的结果。
[图6-1]是对按照表6-1和表6-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡根据气管纤毛运动分数评价疫苗给药效果的结果。
[图6-2]是对按照表6-1和表6-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡测定脏器中的病毒基因量的结果。
[图6-3]是对按照表6-1和表6-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡研究来自脏器的病毒分离率的结果。
[图6-4]是对按照表6-1和表6-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡研究脏器中的病毒效价的结果。
[图7-1]是对按照表7-1和表7-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡根据气管纤毛运动分数评价疫苗给药效果的结果。
[图7-2]是对按照表7-1和表7-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡测定脏器中的病毒基因量的结果。
[图7-3]是对按照表7-1和表7-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡研究来自脏器的病毒分离率的结果。
[图7-4]是对按照表7-1和表7-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡研究脏器中的病毒效价的结果。
[图8-1]是说明实施例中调制的重组IBV N蛋白片段的示意图。
[图8-2]是说明实施例中调制的IBV N蛋白和IBV M蛋白的嵌合蛋白的示意图。
[图8-3]是对按照表8-1和表8-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡根据气管纤毛运动分数评价疫苗给药效果的结果。
[图8-4]是对按照表8-1和表8-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡测定脏器中的病毒基因量的结果。
[图9-1]是对按照表9-1和表9-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡根据气管纤毛运动分数评价疫苗给药效果的结果。
[图9-2]是对按照表9-1和表9-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡测定脏器中的病毒基因量的结果。
[图10-1]是对按照表10-1和表10-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡根据气管纤毛运动分数评价疫苗给药效果的结果。
[图10-2]是对按照表10-1和表10-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡测定脏器中的病毒基因量的结果。
[图11-1]是对按照表11-1和表11-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡根据气管纤毛运动分数评价疫苗给药效果的结果。
[图11-2]是对按照表11-1和表11-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡测定脏器中的病毒基因量的结果。
[图12-1]是对按照表12-1和表12-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡根据气管纤毛运动分数评价疫苗给药效果的结果。
[图12-2]是对按照表12-1和表12-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡测定脏器中的病毒基因量的结果。
[图13-1]是按照表13-1和表13-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡在各试验区的产蛋率的变化。
[图13-2]是按照表13-1和表13-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡在各期间的产蛋率的变化。
[图13-3]是对按照表13-1和表13-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡测定口腔/泄殖腔拭子中的病毒基因量的结果。
[图13-4]是对按照表13-1和表13-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡测定脏器中的病毒基因量的结果。
[图13-5]是对按照表13-1和表13-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡根据气管纤毛运动分数评价疫苗给药效果的结果。
[图13-6]是对按照表13-1的表13-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和病毒攻击的鸡测定血清中ELISA抗体效价的结果。
[图14-1]是对按照表14-1和表14-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和各种病毒株的攻击的鸡根据气管纤毛运动分数评价疫苗给药效果的结果。
[图14-2]是对按照表14-1和表14-2所示的试验区设定和日程表进行了试验疫苗给药和各种病毒株的攻击的鸡测定脏器中的病毒基因量的结果。
[图15-1]是确认重组PRRSV N蛋白(PRRSV-rNp)的表达诱导和纯化的SDS-PAGE的结果。
[图16-1]是“16．使用小鼠的PRRS脂质体疫苗的免疫原性评价”中的动物试验的试验日程表。
[图16-2]是由给予了各免疫材料的小鼠的脾脏采集淋巴细胞，通过小鼠IFN-γ检测ELISPOT测定抗原特异性IFN-γ的产生诱导能力的结果。
[图16-3]是通过以PRRSV-rNp为抗原的ELISA测定接种了各免疫材料的小鼠的血中IgG抗体效价的结果。
[图16-4]是通过以PRRSV-rNp为抗原的ELISA测定接种了各免疫材料的小鼠的血中IgG1抗体效价的结果。
[图16-5]是通过以PRRSV-rNp为抗原的ELISA测定接种了各免疫材料的小鼠的血中IgG2a抗体效价的结果。
[图17-1]是“17．使用猪的PRRS脂质体疫苗的有效性评价”中的动物试验的试验日程表。
[图17-2]是给予了试验疫苗(PRRSV-rNp-DSS)的免疫区的猪和未给予疫苗的对照区的猪的体温分数的变化。
[图17-3]是对给予了试验疫苗(PRRSV-rNp-DSS)的免疫区的猪和未给予疫苗的对照区的猪测定血中病毒基因量的结果。
[图17-4]是由给予了试验疫苗(PRRSV-rNp-DSS)的免疫区的猪和未给予疫苗的对照区的猪的血液调制外周血单核细胞(PBMC)进行抗原刺激，通过猪IFN-γ检测ELISPOT测定抗原特异性IFN-γ的产生诱导能力的结果。
[图17-5]是由给予了试验疫苗(PRRSV-rNp-DSS)的免疫区的猪和未给予疫苗的对照区的猪的血液调制PBMC进行抗原刺激，通过使用抗猪IFN-γ的单克隆抗体的ELISA检测猪IFN-γ的结果。
[图17-6]是给予了试验疫苗(PRRSV-rNp-DSS)的免疫区的猪和未给予疫苗的对照区的猪的肺病变分数。对在20dPC取材的肺进行病理组织学检查，对病变程度进行打分。
[图17-7]是由给予了试验疫苗(PRRSV-rNp-DSS)的免疫区的猪和未给予疫苗的对照区的猪采集血清，通过以PRRSV-rNp为抗原的ELISA测定血中抗体效价的结果。
具体实施方式
在本发明中，非人动物是指除人以外的各种动物，包括家畜(牛、猪、马、绵羊、山羊、骆驼、兔等)、家禽(鸡、家鸭、鹌鹑、火鸡、鸵鸟、野鸡、珍珠鸡等)、宠物(狗、猫、仓鼠、豚鼠、兔、雪豹、长尾小鹦鹉、鹦鹉等)等。另外，鸟类这一术语除包括家禽以外，还包括法律上的“家禽”分类中不包括的各种鸟类(野鸭、企鹅、鸽、鸬鹚和鹰、雕、猎鹰、猫头鹰等各种猛禽类)。另外，家禽和鸟类的术语除包括孵化后的生物体以外，还包括发育卵。由于家畜或家禽是集体饲养，所以在发生感染症的情况下损失容易扩大，因此可作为感染症的预防特别重要的非人动物来列举。
对病原体没有特别限定，包括真菌、细菌、病毒、支原体等各种病原体。
作为家畜/家禽所感染的病原体的具体例子，例如可列举以下的病原体。由于基因组序列等信息均已知、或者均可由分离株获取，所以脂质体表面所结合的重组抗原蛋白等抗原分子可按照常规方法适当调制。
＜鸡所感染的病毒＞
传染性支气管炎病毒(IBV)；
禽流感病毒(Avian Influenza Virus ，AIV)；
新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)；
传染性喉气管炎病毒(ILTV)；
马立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)；
鸡白血病病毒(ALV)；
传染性腔上囊病病毒(IBDV)；
鸡痘病毒(FPV)；
鸡脑脊髓炎病毒(AEV)；
鸡腺病毒(FAV)；
产蛋下降综合征-1976病毒(EDS)；
禽呼肠孤病毒(Avian reovirus，ARV)；
鸡贫血病毒(CAV)；
鸡肾炎病毒(ANV)；
网状内皮组织增生症病毒(REV)；
禽偏肺病毒(Acian metapneumovirus，AMPV)；
＜鸡所感染的细菌/支原体＞
鸡毒支原体(Mycoplasma Galliscepticum，MG)；
鸡滑液囊支原体(Mycoplasma Synoviae，MS)；
鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum，SP)；
鸡沙门氏菌(Salmonella Gallinarum，SG)；
肠道沙门氏菌(Salmonella Enteritidis，SE)；
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium，ST)；
婴儿沙门氏菌(Salmonella Infantis，SI)；
大肠杆菌(E. coli)；
副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum，H. pg)；
艾美耳(Eimeria)属原虫；
卡氏住白细胞虫(Leucocytozoon caulleryi)；
＜猪所感染的病毒＞
奥耶斯基氏病病毒(ADV)；
传染性胃肠炎病毒(TGEV)；
猪繁殖/呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)；
猪流行性腹泻病毒(PEDV)；
猪流感病毒(SIV)；
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV2)；
猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)；
日本脑炎病毒(JEV)；
猪轮状病毒(Porcine Rotavirus，PRV)；
＜猪所感染的细菌/支原体＞
肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)；
猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis，Mhr)；
霍乱沙门氏菌(Salmonella Choleraesuis，SC)；
胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，App)；
猪丹毒(Ery)；
支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)；
多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)；
猪痢疾短螺旋体(Brachyspira hyodysenteriae，Bra-hyo)；
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)；
胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis，Li)；
＜牛所感染的病毒＞
赤羽病病毒(AKAV)；
中山病病毒(KASV)；
艾罗病毒(AINOV)；
茨城病病毒病毒(IBAV)；
牛病毒性腹泻/粘膜病病毒(BVDV)；
牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)；
牛流行热病毒(BEFV)；
牛白血病病毒(BLV)；
牛RS病毒(BRSV)；
牛副流感病毒3型(BPIV3)；
牛腺病毒7型(BAV3)；
＜牛所感染的细菌/支原体＞
牛支原体(M.bovis)；
牛鼻支原体(M.bovirhinis)；
牛生殖道支原体(M.bovigenitalium)；
殊异支原体(M.dispar)；
鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium spp.paratuberculosis，MAP)；
睡眠嗜组织菌(Histophilus somni，Hs)；
溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica，Mh)。
作为源自病原体的抗原分子的典型例子，可列举由病原体基因组编码的蛋白及其片段。本发明中的抗原分子优选为多肽。多肽这一术语包括：由病原体基因组编码的蛋白和由该蛋白的一部分区域构成的蛋白片段。为了制备对各种抗原性或基因型的病原体有效的疫苗，重要的是采用在病原体的株间突变少(序列保存性高)的结构蛋白或其一部分区域作为抗原分子。这样的保存性高的区域是否具有免疫原性，只要使用小鼠等动物进行免疫试验即可容易地确认。作为免疫试验的方法，可列举：通过ELISPOT测定等测定研究淋巴细胞的IFN-γ产生诱导能力的方法(细胞性免疫的诱导能力的评价)、通过ELISA等测定研究抗体诱导能力的方法(体液免疫的诱导能力的评价)等。
在病原体为病毒的情况下，存在具有包膜的病毒和不具有包膜的病毒。在具有包膜的病毒的情况下，由于包膜存在于病毒颗粒的最外面，所以核衣壳蛋白受到宿主体内的免疫功能的攻击等选择压力的频率非常低。因此，在具有包膜的病毒的情况下，与其他结构蛋白相比核衣壳蛋白的病毒株间的序列保存性高。因此，在针对具有包膜的病毒制作本发明的疫苗时，可优选采用核衣壳蛋白作为抗原分子。在上述例示的病原体中，IBV、PRRSV、AIV、NDV、ILTV、MDV、ALV、FPV、REV、AMPV、ADV、TGEV、PEDV、SIV、JEV、AKAV、AINOV、BVDV、IBRV、BEFV、BLV、BRSV、BPIV3相当于具有包膜的病毒。
多肽可以是通过基因重组技术调制的重组多肽，也可以是通过化学合成调制的多肽。在数十个残基左右以内的短的多肽的情况下，基于化学合成的调制也较容易。基因重组技术和多肽的化学合成均是众所周知的常规方法。
在利用基因重组技术进行重组多肽的调制中，只要调制编码所期望的抗原多肽的多核苷酸，将该多核苷酸克隆到适当的载体中，之后导入到适当的宿主细胞中，使多肽在该宿主细胞内表达，再将其进行回收/纯化即可。在病原体为细菌或支原体的情况下，可将由病原体细胞提取的总RNA作为模板，使用适当的引物进行RT-PCR，调制编码所期望的抗原多肽区域的cDNA。在病原体为病毒的情况下，只要由病毒感染细胞提取总RNA，以其为模板进行RT-PCR即可。克隆载体或宿主细胞已知有各种，由于还存在市售品，所以只要根据想要调制的抗原多肽的性质等选择适当的载体或宿主细胞即可。为了方便进行在宿主细胞内表达的多肽的回收/纯化，可添加His标签等适当的标签使抗原多肽表达。
作为化学合成法的具体例子，例如可列举：Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等。另外，还可利用各种市售的肽合成仪按照常规方法进行合成。在化学合成的情况下，仅根据氨基酸序列即可合成所期望的多肽。
在下述实施例中记载着作为本发明的最优选的疫苗的一个例子的、针对IBV的家禽用抗原表面结合型脂质体疫苗的具体例子。在本发明的IBV脂质体疫苗中，可优选使用核衣壳蛋白(N蛋白)作为抗原分子。IBV的N蛋白优选使用全长N蛋白而不是片段。N蛋白是在IBV的各种分离株间突变少的区域，但特别是可最优选使用SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的N蛋白作为IBV脂质体疫苗的抗原分子。另外，在SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列中有1～多个左右的极少数的氨基酸、例如1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个氨基酸被取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列的多肽(若以序列同源性来体现，则为与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有98%以上的同源性的氨基酸序列的多肽)也可期待与SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的N蛋白同样高的免疫原性，同样可优选使用。作为此时的取代的一个优选方案，可列举保守取代。将取代成化学性质类似的氨基酸的取代称为保守取代，其是不损及蛋白性质的取代。侧链类似的氨基酸其化学性质类似。若将氨基酸按侧链的类似性进行分组，则例如可分为：具有脂肪族侧链的氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸)、具有脂肪族羟基侧链的氨基酸组(丝氨酸、苏氨酸)、具有含酰胺的侧链的氨基酸组(天冬酰胺、谷氨酰胺)、具有芳族侧链的氨基酸组(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)、具有碱性侧链的氨基酸组(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸组(天冬氨酸、谷氨酸)、具有含硫侧链的氨基酸组(半胱氨酸、蛋氨酸)等。可列举上述各组内的取代作为保守取代的例子。
另外，在下述实施例中还记载着作为本发明的最优选的疫苗的另一个例子的、针对PRRSV的猪用抗原表面结合型脂质体疫苗的具体例子。即使是PRRSV脂质体疫苗，也可优选使用核苷酸衣壳蛋白(N蛋白)作为抗原分子。PRRSV的N蛋白也可优选使用全长N蛋白，但也可使用免疫原性高的1个或多个的部分区域的片段作为抗原分子。PRRSV的N蛋白的氨基酸序列和编码其的ORF7区域的核苷酸序列可由NCBI的GenBank等数据库获取。SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列是PRRSV的N蛋白的氨基酸序列的一个例子。除该氨基酸序列的蛋白以外，在SEQ ID NO: 28所示的氨基酸序列中有1～多个左右的极少数的氨基酸、例如1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个氨基酸被取代(例如，上述的保守取代)、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列的多肽(若以序列同源性来体现，则为与SEQ ID NO: 28的氨基酸序列具有93%以上、例如95%以上、或者98%以上的同源性的氨基酸序列的多肽)也可期待与SEQ IDNO: 28所示的氨基酸序列的N蛋白同样高的免疫原性，同样可优选使用。
需要说明的是，“序列同源性”是指，以应该比较的两个氨基酸序列的氨基酸残基尽可能多地一致(匹配)的方式使两个氨基酸序列比对，用一致的氨基酸残基数除以总氨基酸残基数而得到的值以百分率表示而得到的百分数。在上述比对时，根据需要在进行比较的两个序列的一方或双方中插入适当的间隙。这样的序列的比对例如可使用BLAST、FASTA、CLUSTAL W等众所周知的程序来进行。在插入间隙的情况下，上述总氨基酸残基数成为以1个间隙作为1个氨基酸残基而计数的残基数。在进行比较的两个序列间如此操作而计数的总氨基酸残基数不同的情况下，序列同源性(%)是用一致的氨基酸残基数除以较长序列的总氨基酸残基数来算出。
以下，以作为本发明的最优选的疫苗的一个例子的IBV脂质体疫苗为例，对本发明的脂质体疫苗的构成和调制方法进行具体说明。可是，下述的构成和方法并不受针对IBV的疫苗的限定，例如像上述例示的那样的针对各种家畜/家禽的病原体的脂质体疫苗也可遵照下述操作适当地调制。在下述实施例中，记载着利用与IBV脂质体疫苗同样的方法调制PRRSV脂质体疫苗。
构成本发明的疫苗的脂质体部分的磷脂膜包含下述的成分(A)和(B)。需要说明的是，在本说明书中，磷脂膜的各成分的摩尔%是指构成脂质体部分的磷脂膜相对于总构成成分的摩尔%。
(A) 含有具有1个不饱和键的碳原子数为14～24的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14～24的烃基的磷脂(以下，有时将上述酰基称为“不饱和酰基”、将上述烃基称为“不饱和烃基”。)；
(B) 脂质体的稳定化剂
成分(A)的含量为1～99.8摩尔%，从脂质体的稳定性的角度考虑，优选10～90摩尔%、更优选30～80摩尔%、进一步优选为50～70摩尔%。酰基和烃基的碳原子数优选为16～22、更优选为18～22或16～20、最优选为18。
磷脂可以是具有甘油骨架的甘油磷脂，也可以是具有鞘氨醇骨架的鞘氨醇磷脂。在本发明中，可更优选使用甘油磷脂。
在磷脂为甘油磷脂的情况下，甘油骨架的1位和2位所结合的不饱和酰基或不饱和烃基可以相同也可以不同。从工业上的产率的角度考虑，优选1位和2位的基团相同。
作为上述不饱和酰基的具体例子，可列举：棕榈油酰基、油酰基、瓢儿菜基(Erucoyl，エルコイル基)等。另外，作为上述不饱和烃基的具体例子，可列举：十四碳烯基、十六碳烯基、十八碳烯基、C20单烯基、C22单烯基、C24单烯基等。
作为成分(A)的磷脂，优选具有不饱和酰基的磷脂。特别优选的成分(A)的磷脂为含有具有1个不饱和键的碳原子数为18的酰基即油酰基的磷脂。
成分(A)可包含符合上述(A)的磷脂的定义的多种不同的磷脂。具体而言，可列举：酸性磷脂、中性磷脂、具有可结合抗原分子的官能团的反应性磷脂等，可包含其中的两种以上或三种以上。在包含多种不同的磷脂的情况下，这些磷脂所具有的不饱和酰基或不饱和烃基可完全相同也可在磷脂间有所不同，通常优选多种不同的磷脂具有相同的不饱和酰基或不饱和烃基。
另外，本发明的脂质体疫苗的脂质体部分除了包含如(A)中定义的磷脂以外，还可包含该定义所不包含的其他磷脂和磷脂以外的脂质。(A)的磷脂在脂质体部分的磷脂膜成分中只要是50%以上、优选60%以上、更优选75%以上、进一步优选90%以上、最优选95%以上、例如97%以上即可。(A)的定义所不包含的其他脂质的含量通常为40摩尔%以下、优选20摩尔%以下、更优选10摩尔%以下、进一步优选为5摩尔%以下。
用作成分(A)的磷脂的种类、比例可根据各种要求、目的而适当选择，通常以如下所述的含量进行使用。
中性磷脂的含量通常为0.01～80摩尔%、优选0.1～70摩尔%、更优选0.1～60摩尔%、进一步优选为0.1～50摩尔%。
酸性磷脂的含量通常为1～85摩尔%、优选2～80摩尔%、更优选4～60摩尔%、进一步优选为5～40摩尔%。
反应性磷脂的含量通常为0.2～80摩尔%、优选0.3～60摩尔%、更优选0.4～50摩尔%、进一步优选为0.5～25摩尔%。
作为酸性磷脂，可优选使用如(A)中定义的具有酰基的二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酰甘油、二酰基磷脂酸和二酰基磷脂酰肌醇等。因酸性磷脂会对脂质体的表面赋予阴离子性电离基团，所以会对脂质体表面赋予负的Zeta电位。因此，脂质体可获得电荷排斥力，在水性溶剂中可作为稳定的制剂而存在。如此，酸性磷脂是在确保水性溶剂中的抗原结合脂质体的稳定性方面担负重要作用的成分。
作为中性磷脂，可优选使用如(A)中定义的具有酰基的磷脂酰胆碱等。与酸性磷脂和结合有抗原分子的反应性磷脂相比，中性磷脂使脂质体稳定化的功能高，可提高膜的稳定性。从这个角度考虑，构成本发明的脂质体疫苗的脂质体部分的磷脂膜优选含有中性磷脂。
如上所述，反应性磷脂是具有可结合抗原分子的官能团的磷脂。作为官能团的代表例，可列举氨基。另外，反应性磷脂可以是通过使交联剂等与磷脂结合而导入了可结合抗原分子的末端结构(反应性末端结构)的磷脂。官能团这一术语还包括这样的导入到磷脂分子中的末端结构，这里所说的官能团还包括例如下述例示的二价反应性化合物所具有的醛基、琥珀酰亚胺(亚氨)基、马来酰亚胺(亚氨)基等。
作为反应性磷脂的具体例子，可优选使用如(A)中定义的具有酰基的磷脂酰乙醇胺和向磷脂酰乙醇胺中导入反应性末端结构而得到的磷脂酰乙醇胺修饰物。
作为磷脂酰乙醇胺修饰物，可列举：在二酰基磷脂酰乙醇胺的氨基上结合有二价反应性化合物的一个末端的二酰基磷脂酰乙醇胺修饰物。作为二价反应性化合物，可使用作为交联剂而已知的各种化合物，例如，对于二酰基磷脂酰乙醇胺，可利用在至少单个末端具有可与氨基反应的醛基或琥珀酰亚胺基的化合物。
作为具有醛基的二价反应性化合物，可列举：乙二醛、戊二醛、丁二醛、对苯二甲醛等，其中可优选使用戊二醛。需要说明的是，如后所述，通过戊二醛等向反应性磷脂的官能团(氨基)中导入醛基通常是在脂质体的调制后进行的。
作为具有琥珀酰亚胺基的二价反应性化合物，可列举：二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、乙二醇-双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)、二琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯或二琥珀酰亚胺基戊二酸酯等，其中可优选使用二琥珀酰亚胺基辛二酸酯。
另外，作为在一个末端具有琥珀酰亚胺基、而在另一个单末端具有马来酰亚胺基的二价反应性化合物，可列举：N-琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯、磺基琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯、N-琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺基苯基)乙酸酯、N-琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺基苯基)丙酸酯、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基乙基)-环己烷-1-甲酸酯、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基乙基)-环己烷-1-甲酸酯、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺、N-(ε-马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺等。若使用这样的二价反应性化合物，则可得到具有马来酰亚胺基作为官能团的二酰基磷脂酰乙醇胺修饰物。
作为结合有二价反应性化合物的二酰基磷脂酰乙醇胺修饰物的具体例子，可列举：琥珀酰亚胺基-二酰基磷脂酰乙醇胺、马来酰亚胺基-二酰基磷脂酰乙醇胺等。
成分(B)的含量为0.2～75摩尔%，从脂质体的稳定性的角度考虑，优选5～70摩尔%、更优选10～60摩尔%、进一步优选为20～50摩尔%。若稳定化剂的含量超过75摩尔%，则会损及脂质体的稳定性，因此不优选。
作为脂质体的稳定化剂，可使用固醇类或生育酚类。固醇类只要是通常作为固醇类而已知的物质即可，例如可列举：胆固醇、谷固醇、菜油甾醇、豆固醇、菜籽固醇等。从获取性等方面考虑，可特别优选使用胆固醇。另外，生育酚类只要是通常作为生育酚而已知的物质即可，例如从获取性等方面考虑，可优选使用市售的α-生育酚。
用作抗原多肽分子的N蛋白等源自IBV的多肽只要利用脂质体中的反应性磷脂的官能团进行结合即可。通过使抗原多肽分子与作为磷脂膜的一种成分的反应性磷脂的官能团进行共价键合，可使抗原多肽分子稳定地结合在脂质体表面。这样的技术本身是已知的，在非专利文献1、专利文献1～3等中也有记载。虽然也可如专利文献2、3所记载通过离子键或疏水键使抗原多肽分子结合在脂质体表面，但在本发明的IBV脂质体疫苗中，从保存中和生物体内的结合稳定性的角度考虑，更优选通过共价键使源自IBV的多肽结合在脂质体表面。
在IBV脂质体疫苗的调制中，只要在调制包含反应性磷脂的脂质体后，进行脂质体与源自IBV的多肽的结合反应即可。
脂质体的调制本身可按常规方法进行。例如可列举：挤压法、涡旋混合器法、超声波法、表面活性剂去除法、反相蒸发法、乙醇注入法、预制泡囊(Pre-vesicle)法、法压壶(French press)法、W/O/W乳化法、退火法、冻融法等制备方法。对脂质体的形态没有特别限定，通过适当选择上述已知的脂质体制备方法，可制备多层脂质体、小单层脂质体、大单层脂质体等具有各种大小或形态的脂质体。
对脂质体的粒径没有特别限定，从保存稳定性等方面考虑，平均粒径优选20～600nm，例如更优选设为30～500nm、40～400nm、50～300nm或70～230nm。脂质体的平均粒径可通过众所周知的动态光散射法来测定。
在本发明中，在脂质体调制过程中或调制后可在脂质体的内水相和外水相的至少任一种水相中添加糖类或多元醇类。由此，可进一步提高脂质体的物理化学稳定性。例如，在包含糖类或多元醇类的缓冲液中调制包含反应性磷脂和脂质体稳定化剂的脂质体的悬浮液，或者，在调制包含反应性磷脂和脂质体稳定化剂的脂质体的悬浮液后在其外水相中加入蔗糖等糖类或多元醇类使其溶解，然后，将含有糖类或多元醇类的脂质体悬浮液转移到10mL的玻璃制小瓶中进行冷冻干燥，从而可得到具有用于使抗原多肽分子结合在表面的官能团的脂质体的冷冻干燥物。通过将脂质体制成冷冻干燥物，可作为用于调制本发明的脂质体疫苗的中间材料而长期稳定地保存。
作为糖类，例如可列举：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、肌醇、核糖、木糖等单糖类；蔗糖、乳糖、纤维二糖、海藻糖、麦芽糖等二糖类；棉子糖、松三糖等三糖类；环糊精等寡糖；糊精等多糖类；木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇等糖醇等。在这些糖类中，优选单糖类或二糖类，其中，从获取性等方面考虑，可特别优选使用葡萄糖或蔗糖。
作为上述多元醇类，例如可列举：甘油、二聚甘油、三聚甘油、四聚甘油、五聚甘油、六聚甘油、七聚甘油、八聚甘油、九聚甘油、十聚甘油、聚甘油等甘油类化合物；山梨糖醇、甘露糖醇等糖醇类化合物；乙二醇、二甘醇、三甘醇、四甘醇、五甘醇、六甘醇、七甘醇、八甘醇、九甘醇等。其中，从获取性方面考虑，可特别优选使用甘油、二聚甘油、三聚甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、分子量为400～10,000的聚乙二醇。
脂质体的内水相和外水相的至少任一种水相中所含的糖类或多元醇类的浓度只要以相对于脂质体液的重量浓度计为1～20重量%左右、例如2～10重量%左右即可。
作为可用于与脂质体表面形成共价键的抗原多肽分子侧的官能团，可列举：氨基、巯基、羧基、羟基和二硫基。作为共价键所优选的官能团的组合，可列举：氨基与醛基或羧基、氨基与氨基、氨基与琥珀酰亚胺基、巯基与马来酰亚胺基等。另外，作为反应性磷脂的官能团与抗原多肽分子的官能团的共价键的具体例子，可列举：席夫碱键、酰胺键、硫醚键、酯键等。
在使二价反应性化合物与反应性磷脂结合以带有官能团的情况下，只要选择下述的任一种方法即可：根据二价反应性化合物的种类，在调制脂质体前使反应性磷脂的氨基等与二价反应性化合物结合，使用导入了二价反应性化合物的反应性磷脂来调制脂质体(方法1)；或者，在调制包含反应性磷脂的脂质体后，向磷脂膜中的反应性磷脂的氨基等中导入二价反应性化合物(方法2)。作为采用方法1的二价反应性化合物的代表例，可列举二琥珀酰亚胺基辛二酸酯，作为采用方法2的二价反应性化合物的代表例，可列举戊二醛。每种方法其本身均是已知的，记载在专利文献2～3、非专利文献2～3等中。
以下，以二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DDS)和戊二醛为例，来说明各方法的工序。
在方法1中，首先，使二琥珀酰亚胺基辛二酸酯与反应性磷脂的官能团结合。作为反应性磷脂，可优选使用如上述(A)定义的磷脂中、像二酰基磷脂酰乙醇胺这样的具有氨基作为官能团的磷脂。氨基与二琥珀酰亚胺基辛二酸酯的结合可按照专利文献2～3、非专利文献2等中记载的已知方法来进行，也具体地记载在下述实施例中。利用所述的方法，可得到在氨基上导入了辛二酸琥珀酰亚胺基(-CO-(CH2)6-COO-C4H4NO2)的反应性磷脂。具有琥珀酰亚胺基作为官能团的反应性磷脂包括这样的导入了辛二酸琥珀酰亚胺基的反应性磷脂。在本说明书中，在称为“二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DDS)结合二酰基磷脂酰乙醇胺”的情况下，是指在氨基上导入了辛二酸琥珀酰亚胺基的二酰基磷脂酰乙醇胺。
然后，将导入有辛二酸琥珀酰亚胺基的反应性磷脂与其他脂质体构成成分(即，相当于成分(A)的其他磷脂、例如酸性磷脂和中性磷脂、成分(B)的脂质体稳定化剂、以及使用情况下的其他脂质等)按照已知方法进行混合，调制脂质体。如果按照常规方法进行调制，则可得到导入到反应性磷脂中的官能团即琥珀酰亚胺基存在于表面的脂质体。
在所调制的脂质体的悬浮液中加入源自IBV的多肽，使该多肽中的氨基与脂质体表面的琥珀酰亚胺基反应。
通过凝胶过滤、透析、超滤、离心分离等已知的方法去除未反应的源自IBV的多肽和反应副产物等。由此，可得到经由辛二酸交联在表面共价键合有源自IBV的多肽的脂质体。
在方法2中，调制在表面具有作为戊二醛的醛基的结合对象(結合相手)的氨基的脂质体。作为反应性磷脂，只要使用像二酰基磷脂酰乙醇胺这样的、具有氨基作为官能团的磷脂即可。将具有氨基的反应性磷脂与其他脂质体构成成分(即，相当于成分(A)的其他磷脂、例如酸性磷脂和中性磷脂、成分(B)的脂质体稳定化剂、以及使用情况下的其他脂质等)按照已知的方法进行混合，调制脂质体。如果按照常规方法进行调制，则可得到反应性磷脂所具有的氨基存在于表面的脂质体。
然后，将脂质体悬浮液与源自IBV的多肽混合后，添加戊二醛，使之反应规定的时间，在脂质体与多肽之间形成席夫碱键。
然后，在脂质体悬浮液中添加甘氨酸等含氨基酸基团的水溶性化合物，使剩余的戊二醛的反应性失活。
通过凝胶过滤、透析、超滤、离心分离等方法去除未反应的源自IBV的多肽、戊二醛与甘氨酸的反应产物、剩余的甘氨酸等不需要的成分。由此，可得到经由戊二醛交联在表面共价键合有源自IBV的多肽的脂质体。
在本发明的IBV脂质体疫苗中，对源自IBV的多肽与脂质体之间的共价键的方案没有特别限定，与通过戊二醛交联而结合的脂质体疫苗相比，通过辛二酸交联而结合的脂质体疫苗确认到了疫苗效果高的趋势(参照下述实施例)。
在按照方法1 (事先向反应性磷脂中导入二价反应性化合物之后再与其他脂质混合来调制脂质体的方法)调制IBV脂质体疫苗的情况下，脂质体部分的成分的特别优选的组成(摩尔比)如下：相对于反应性磷脂1，中性磷脂为2～12左右、优选4～8左右，酸性磷脂为0.5～4左右、优选1～3左右，稳定化剂为2～14左右、优选5～10左右的组成。这里所说的反应性磷脂是指，结合有抗原分子的反应性磷脂和未结合抗原分子的反应性磷脂的总计。
在按照方法2 (在调制脂质体之后再导入二价反应性化合物的方法)调制IBV脂质体疫苗的情况下，脂质体部分的成分的特别优选的组成(摩尔比)如下：相对于反应性磷脂1，中性磷脂为0.5～3左右、优选1～2左右，酸性磷脂为0.1～2左右、优选0.3～1左右，稳定化剂为1～4左右、优选1.5～3左右的组成。这里所说的反应性磷脂也是结合有抗原分子的反应性磷脂和未结合抗原分子的反应性磷脂的总计。
作为特别优选的IBV脂质体疫苗的脂质体部分的组成，可列举：以上述的任一种摩尔比包含下述的反应性磷脂、中性磷脂、酸性磷脂和脂质体稳定化剂的脂质体。
反应性磷脂：二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)；
中性磷脂：二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)；
酸性磷脂：二油酰磷脂酰甘油(DOPG)；
脂质体稳定化剂：胆固醇。
表面结合有源自IBV的抗原分子的脂质体可与适用于所采用的给药途径的、药剂上可接受的载体、稀释剂、赋形剂等添加剂适当混合，以疫苗的形式制成制剂。例如，作为悬浮有脂质体的液体制剂，可对应该减轻因病原体感染而出现的症状的非人动物、例如应该减轻因IBV感染而出现的IB症状的鸟类(特别是鸡)、或应该减轻因PRRSV感染而出现的PRRS症状的家畜(具体是指猪)进行经口或胃肠外给药。只要不损及抗原分子的免疫诱导性即可，也可对抗原结合脂质体进行冷冻干燥或真空干燥，以脂质体粉末制剂的形式进行调制。
作为胃肠外给药的给药途径的具体例子，除静脉内给药、皮下给药、皮内给药、肌肉内给药、经鼻给药、经皮给药、经直肠给药、经呼吸道给药、滴眼给药等以外，在给药对象为鸟类的情况下，还可列举卵内给药。作为剂型的具体例子，在经口给药制剂的情况下，可列举：液体制剂、胶囊剂等，在胃肠外给药制剂的情况下，可列举：注射剂(肌肉注射剂、卵内给药制剂等)、喷雾剂、散雾剂、滴鼻剂、滴眼剂、栓剂等。作为本发明的脂质体疫苗的优选的给药方法或剂型，可列举：喷雾给药(制剂)、散雾给药(制剂)、滴鼻给药(制剂)、滴眼给药(制剂)、肌肉注射给药(制剂)、皮下给药(制剂)、皮内给药(制剂)和吸入给药(制剂)，作为其他优选的例子，在给药对象为鸟类的情况下，可列举卵内给药(制剂)。由于确认到本发明的IBV脂质体疫苗对免疫系统未发育成熟的0日龄的初生雏也有效，所以认为即使是卵内给药也可充分地诱导针对IBV的免疫。在本发明中，喷雾给药制剂是指液滴粒径为150μm以下且进行喷洒给药的制剂，散雾给药制剂是指液滴粒径为200μm以上且进行喷洒给药的制剂。吸入给药制剂通常是指液滴粒径为100μm～数十μm左右以下(其中，液滴粒径并不限于此，可适当设定)且进行吸入给药的制剂。在本发明中，喷洒给药主要是指汇集多个动物个体进行药剂处理的方法，是朝向多个个体的头部或全身喷上雾状药液使其吸入的给药方法，吸入给药是指对1个个体的呼吸系统(鼻或口)集中地喷上雾状药液使其吸入的给药方法。喷洒给药是适合于像鸡等家禽或家禽雏这样较小型的动物的给药方法，而吸入给药是适合于猪或牛等较大型的动物的给药方法。
在上文中，作为本发明的IBV脂质体疫苗的优选的剂型或给药方法，特别优选喷雾剂(喷雾给药)，作为给药途径，特别优选经鼻给药或经呼吸道给药。如下述实施例中所记载，IBV脂质体疫苗通过减小液滴的粒径进行喷洒给药(喷雾给药)，可提高疫苗的效果。因此，作为本发明的IBV脂质体疫苗的给药方法，特别优选喷雾给药，期望以液滴粒径为优选120μm以下、更优选100μm以下、例如50μm～100μm进行喷雾给药。液滴粒径使用已知的喷雾给药器可容易地进行调整。另外，作为本发明的PRRSV脂质体疫苗的剂型和给药途径，特别优选肌肉注射给药制剂和肌肉内给药。
本发明的IBV脂质体疫苗的给药量只要是对防止IBV感染或减轻因IBV感染而出现的IB症状有效的量即可。有效量可根据给药对象的非人动物(具体是指家禽、特别是鸡)的体重或年龄等适当选择。没有特别限定，作为源自IBV的多肽的量，只要给予每1次的给药单位为0.03125～2μg左右、例如0.25～1μg左右的疫苗即可。IB症状这一术语除了包括作为主要症状的呼吸系统症状以外，还包括肾炎、产蛋障碍(产蛋率下降、产出畸形卵等)、腹泻等作为IB症状而已知的各种症状。
关于针对IBV以外的病原体的疫苗的给药量也同样。例如，PRRSV脂质体疫苗的给药量只要是对防止PRRSV感染或减轻因PRRSV感染而出现的PRRS症状有效的量即可。有效量可根据作为给药对象的猪的体重或年龄等适当选择，没有特别限定，作为源自PRRSV的多肽的量，只要给予每1次的给药单位为0.1～500μg左右、例如10～200μg左右的疫苗即可。PRRS症状这一术语包括：咳嗽/呼吸困难等呼吸系统症状、母猪的流产死产等繁殖障碍、虚弱、食欲不振、眼睑浮肿、增重率减少等作为PRRS症状而已知的各种症状。
需要说明的是，脂质体表面所结合的抗原多肽分子的量可利用BCA法并按照常规方法进行测定。具体而言，可使用Pierce (商品名)还原剂兼容型BCA蛋白测定试剂盒(BCAProtein Assay Kit-Reducing Agent Compatible) (Thermo Fisher Scientific公司)，以调制后的结合有抗原多肽的脂质体作为测定样品，按照试剂盒的使用说明书，测定脂质体表面的抗原多肽量。
对IBV脂质体疫苗的给药次数没有特别限定，即使是1次给药也可得到某种程度的效果，但为了针对IBV得到高的发病减轻效果，期望给药2次以上，例如可给药2～5次、2～4次或2～3次。但对给药次数的上限没有特别限定，根据需要可对同一个体进行6次以上的给药。作为用于有效进行免疫诱导的疫苗的给药间隔，期望相隔至少1周以上的间隔，例如期望以10天以上、优选2周以上的给药间隔进行多次给药。
对PRRSV脂质体疫苗的给药次数也没有特别限定，只要给药1次以上即可，为了针对PRRSV得到高的效果，期望给药2次以上，例如可给药2～5次、2～4次或2～3次。但对给药次数的上限没有特别限定，根据需要可对同一个体进行6次以上的给药。作为用于有效进行免疫诱导的疫苗的给药间隔，期望相隔至少1周以上的间隔，例如期望以10天以上、优选2周以上的给药间隔进行多次给药。
对IBV脂质体疫苗的给药时期没有特别限定，可在任何日龄进行给药。例如，在有效防止集团内的IB蔓延的角度，本发明的IBV脂质体疫苗期望在孵化后早期(0日龄～21日龄左右)的期间给药至少1次，例如可在0日龄～14日龄的期间内(特别是0日龄时)给药1次，之后相隔上述的适当给药间隔进行第2次给药，进一步根据需要进行第3次或其以上的给药。在卵内接种的情况下，没有特别限定，只要在孵卵日龄、17～20日龄左右、例如18～19日龄的期间内进行至少1次接种即可，通常优选在卵内接种1次后、在孵化后进行1次以上的接种。另外，例如为了抑制由IBV感染引起的IB所导致的产蛋障碍，可对成熟雌鸟(在鸡的情况下是指120日龄以上的产蛋鸡)进行至少1次、优选以上述的适当给药间隔进行2次以上的给药。
对PRRSV脂质体疫苗的给药时期也没有特别限定，可在任何日龄或周龄进行给药。例如，可在2周龄～10周龄的期间给药至少1次。除了对幼龄猪进行给药以外，为了减轻母猪的繁殖障碍、改善繁殖成绩，可在交配的数周前(例如3～4周前)对母猪给药至少1次。
针对IBV、PRRSV以外的病原体的脂质体疫苗的给药次数和给药时期也没有特别限定，可根据病原体的种类、对象动物的种类或年龄等适当设定。
实施例
以下，根据实施例来更具体地说明本发明。但本发明并不限于下述实施例。
1．基因重组抗原的制作
＜目的＞
为了制作传染性支气管炎病毒(以下记作IBV)脂质体疫苗，使用基因重组大肠杆菌制作了在IBV株间保存性较高的核衣壳(N)蛋白和膜(M)蛋白的全长作为其抗原。
＜材料和方法＞
(1) 抗原区域的探索
以据报道保存性较高的IBV的N蛋白和M蛋白作为抗原候选区域。对于近年的11株IBV国内分离株，通过序列分析评价其同源性，确定了作为抗原的模板的IBV。
抗原区域的探索中使用的引物如下。
N蛋白正向引物：GCGTGTACCTCTCTAGTAT (SEQ ID NO: 15)；
N蛋白反向引物：GCTACATGCCTATCTBCCTTA (B=G/T/C) (SEQ ID NO: 16)；
M蛋白正向引物：GGTAGAAAACTTAACAATCC (SEQ ID NO: 17)；
M蛋白反向引物：AAGACTACTTCCTCCTGTTG (SEQ ID NO: 18)。
(2) 利用大肠杆菌表达系统进行的重组蛋白的制作
通过RT-PCR法扩增上述(1)中确定的抗原区域的全长后，将其插入到载体(N末端His标签标记质粒)中。将该质粒导入到克隆用大肠杆菌中进行转化。然后，由可通过PCR确认到目标基因插入的大肠杆菌提取质粒，将其导入到蛋白表达用大肠杆菌中进行转化。然后，对所培养的表达用大肠杆菌进行添加IPTG的表达诱导，使重组蛋白表达。通过超声波处理破坏菌体之后，进行基于His标签的亲和纯化。对纯化后的溶液测定总蛋白的浓度。进行SDS-PAGE，确认了蛋白在所设想的分子量的位置表达。
RT-PCR和确认目标基因插入的PCR中使用的引物如下。
[RT-PCR]
N蛋白正向引物: AAGGCCTCTGTCGACATGGCAAGCGGTAAGG (SEQ ID NO: 19，下划线为SalI识别位点)
N蛋白反向引物: AGAATTCGCAAGCTTTCAAAGTTCATTTTCACCAA (SEQ ID NO: 20、下划线为HindIII识别位点)
M蛋白正向引物: AAGGCCTCTGTCGACATGGAAAATTGCACACTTAAC (SEQ ID NO: 21、下划线为SalI识别位点)
M蛋白反向引物: AGAATTCGCAAGCTTTTATGTGTAAAGACTACCCCC (SEQ ID NO: 22、下划线为HindIII识别位点)
[目的基因插入的确认]
N蛋白正向引物：TAATACGACTCACTATAGGG (SEQ ID NO: 23)；
N蛋白反向引物：ATGCTAGTTATTGCTCAGCGG (SEQ ID NO: 24)；
M蛋白正向引物：CCCGAAAAGTGCCACCTG (SEQ ID NO: 25)；
M蛋白反向引物：GTTCTGAGGTCATTACTGG (SEQ ID NO: 26)。
使用的试剂/仪器类如下。
核酸提取：QIAamp Viral RNA Mini试剂盒(QIAGEN公司)
PCR装置：PCR Thermal Cycler Dice (注册商标) Gradient (TP600) (TaKaRa公司)；
DNA的凝胶纯化：QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)；
载体质粒：N蛋白使用pET-6xHN-N (Clontech公司)、M蛋白使用pQE-31 (Qiagen公司)。
感受态细胞：N蛋白使用BL21(DE3) pLySs株(Invitrogen公司)、M蛋白使用XL1-Blue株(Nippon Gene公司)。
连接：N蛋白使用In-Fusion (注册商标) HD克隆试剂盒(Clontech公司)、M蛋白使用DNA连接试剂盒(TaKaRa公司)。
蛋白表达诱导：IPTG (TaKaRa公司)
序列分析：外包委托给株式会社Fasmac或株式会社Bio Matrix研究所；
基于His标签的亲和纯化：Profinia蛋白纯化系统(Bio-Rad公司)。
＜结果＞
(1) 抗原区域的探索
对于近年的11株国内分离株(M蛋白为10株)，比较株间的N和M蛋白区域全长的氨基酸同源性，结果确认到：N蛋白为93～99%的一致率、M蛋白为90～99%的一致率，在株间均高度保存(表1-1、表1-2)。由此可期待：即使以任意一个源自IBV的N或M蛋白作为脂质体疫苗的抗原，也均可看到有效性，但已将在本所建立了感染试验系统的IBV Chiba (2004)确定为模板。表达区域的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1 (N蛋白)和SEQ ID NO: 3 (M蛋白)所示，所编码的N蛋白和M蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 4所示。
[表1-1]
Figure 49952DEST_PATH_IMAGE001
[表1-2]
Figure 437071DEST_PATH_IMAGE002
(2) 利用大肠杆菌表达系统进行的重组蛋白的制作
i．基因重组大肠杆菌的制作
以由IBV Chiba (2004)提取的总RNA为模板进行RT-PCR，确认目标基因片段的扩增。对于重组N蛋白(IBV-rNp)，将扩增子和质粒载体(pET6xHN-N)分别用相同的2种限制酶区域(SalI和HindIII)连接后，通过序列分析确认到了正常插入。将该质粒载体转化到克隆用大肠杆菌(DH5α)中，之后进行培养，回收已扩增的质粒。将其转化到表达用大肠杆菌BL21(DE3) pLySs株中，制作IBV-rNp表达用重组大肠杆菌。关于重组M蛋白(IBV-rMp)，由于其在上述质粒载体和表达用大肠杆菌的组合中没有表达，所以通过将pQE-31与质粒载体组合、将XL1-BLUE与表达用大肠杆菌组合，确认到了rMp的表达。
ii．重组蛋白的表达诱导和纯化
在TB培养基中添加1/100量的用添加有氨苄青霉素的液体LB培养基进行了预培养的菌液，在37℃下振荡培养3小时。培养规模在3L IBV-rNp、300ml IBV-rMp下实施。培养开始后在O.D.600达到0.5的时间点添加终浓度为1mM的IPTG(最终为1mM)，进行表达诱导，再振荡培养3小时。在4℃下以3000rpm离心30分钟后，回收菌体颗粒，添加超声处理缓冲液。对其进行超声波处理以将菌体破碎，对所回收的含有重组蛋白的粗蛋白溶液进行亲和纯化，回收目标重组蛋白。蛋白浓度测定的结果，这次制作的重组蛋白的总量推测如下：至少IBV-rNp为300mg以上、IBV-rMp为40mg以上。可知IBV-rNp和IBV-rMp的推算分子量分别为约49kDa、29kDa，由于标签修饰(His-tag)对抗原的影响，SDS-PAGE中的表观分子量增大数kDa，SDS-PAGE的结果，在接近推算分子量的位置均可确认到清晰的谱带(图1-1、图1-2)。
＜结论＞
使用基因重组大肠杆菌，制作了以IBV Chiba (2004)为模板的IBV-rNp和IBV-rMp。关于这些重组蛋白对IBV的免疫原性，通过以后的动物试验进行评价。
2．脂质体疫苗的制作
＜目的＞
对上述1.中制作的源自IBV的两种重组抗原(IBV-rNp和IBV-rMp)进行脂质体化处理，制作了脂质体疫苗。
＜材料和方法＞
(1) 重组抗原的脂质体化
通过二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DDS)法或戊二醛(GA)法将抗原与脂质体结合。按照下述操作规则制作了试验疫苗(IBV-rNp-GA和IBV-rMp-GA)。
(1-1) 基于DSS法的抗原的脂质体化
i．材料
(a)抗原：IBV-rNp和IBV-rMp。每1次偶联反应使用5mg (10mg/ml×0.5ml)；
(b) 脂质体：结合有DDS的油酸脂质体。每1次偶联反应使用90mg脂质；
(c) Sepharose TM CL-4B(4%交联琼脂糖)；
(d) 脂质体缓冲液：添加有8%蔗糖的PBS、pH7.2。
ii．方法(1次偶联反应)：对各抗原进行3次偶联反应。
(a) 将已冷冻干燥的结合有DDS的油酸脂质体用2ml的脂质体缓冲液溶解。
(b) 将2ml的脂质体悬浮液和0.5ml的抗原溶液混合。
(c) 使用搅拌器在室温下连续搅拌48小时。
(d) 通过CL-4B柱，利用分子筛效果回收已结合抗原的脂质体。
(e) 使用脂质体缓冲液将总容量调整至9ml。
(f) 用0.45μm的滤器过滤。
(g) 使用前冷藏保管。
结合有DDS的油酸脂质体如专利文献2、3所记载进行调制。具体的程序如下。
将2g二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和180μl三乙胺与50ml氯仿混合，装入300ml容量的四颈烧瓶中，在室温下、搅拌器的搅拌下用4小时滴加将3g DDS溶解于80ml氯仿而得到的溶液，从而使DDS的单末端与DOPE的氨基反应。将该粗反应溶液转移到茄形烧瓶中，使用蒸发仪馏去溶剂。接下来，在该烧瓶中加入尽可能溶解粗反应物的少量的氯仿，得到高浓度粗反应物溶液，使用经氯仿/甲醇/水(65/25/1、体积比)平衡的硅胶，按照常规方法进行柱层析，仅回收在目标DOPE的氨基上结合有DDS的单末端的组分，馏去溶剂，得到了作为目标反应性磷脂的结合有DDS(琥珀酰亚胺基辛二酸酯)的DOPE。
将通过上述得到的0.2886g (0.2831mmol)结合有DDS的DOPE、1.3354g(1.6987mmol)二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、0.7663g (1.9818mmol)胆固醇和0.4513g(0.5662mmol)二油酰磷脂酰甘油(DOPG) Na盐装入茄形烧瓶中，加入50ml氯仿/甲醇/水(65/25/4、体积比)混合溶剂，在40℃下溶解。接下来，使用旋转蒸发仪在减压下馏去溶剂，制作了脂质薄膜。进一步添加30ml注射用蒸馏水，进行搅拌，得到了均匀的浆液。将该浆液冷冻，使用冷冻干燥机干燥24小时，得到了脂质混合粉末。
接下来，将另外制作的60ml缓冲液(1.0mM的Na2HPO4/KH2PO4、0.25M的蔗糖、pH7.4)装入装有上述脂质混合粉末的茄形烧瓶内，在40℃下边搅拌边使脂质水化，得到了脂质体。接下来，使用挤压器调整脂质体的粒径。首先，使其通过8μm的聚碳酸酯滤器，然后依次通过5μm、3μm、1μm、0.65μm、0.4μm和0.2μm的滤器。由此，得到了平均粒径为206nm (基于动态光散射法的测定)的脂质体颗粒(DOPE:DOPC:胆固醇:DOPG=1:6:7:2 (摩尔比) )。将该脂质体颗粒的悬浮液冷冻干燥，以结合有DDS的油酸脂质体的形式用于上述的基于DSS法的抗原的脂质体化。
(1-2) 基于GA法的抗原的脂质体化
i．材料
(a) 抗原：IBV-rNp和IBV-rMp。每1次偶联反应使用5ml (2mg/ml×2.5ml)。
(b) 脂质体：油酸脂质体。每1次偶联反应使用90mg脂质。
(c) 2.5%的戊二醛溶液
(d) 饱和甘氨酸-NaOH溶液(pH7.2)
(e) Sepharose TM CL-4B (4%的交联琼脂糖)
(f) 脂质体缓冲液：添加有8%蔗糖的PBS、pH7.2
ii．方法(1 次偶联反应)：对各抗原进行3次偶联反应。
(a) 将2ml的脂质体悬浮液和2.5ml的抗原溶液混合。
(b) 添加0.5ml 2.5%的戊二醛溶液。
(c) 在水浴中、37℃下缓慢搅拌1小时。
(d) 添加0.5ml饱和甘氨酸-NaOH溶液，使剩余的GA失活。
(e) 在4℃下静置过夜。
(f) 通过CL-4B柱，回收已结合抗原的脂质体。
(g) 使用脂质体缓冲液将总容量调整至9ml。
(h) 用0.45μm的滤器过滤。
(i) 使用前冷藏保管。
GA法中使用的油酸脂质体是依据上述的结合有DDS的油酸脂质体的调制方法，以DOPE:DOPC:胆固醇:DOPG=3:4:7:2的摩尔比使用并调制的。使用聚碳酸酯滤器将脂质体整粒，将脂质体悬浮液冷冻干燥，之后溶解在缓冲液(1.0mM的Na2HPO4/KH2PO4、0.25M的蔗糖、pH7.4)中使达到90mg/2ml的浓度，以油酸脂质体悬浮液的形式用于上述的基于GA法的抗原的脂质体化。
(2) 抗原蛋白的定量
使用利用了BCA法的市售试剂盒(Pierce (商品名)还原剂兼容型BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司) )，对脂质体表面所结合的抗原蛋白进行定量。
＜结果＞
(1) 基于DSS法的抗原的脂质体化
每1次偶联反应，将已冷冻干燥的结合有DDS的油酸脂质体粉末(90mg脂质/小瓶)用蒸馏水复水(復水)，使总量为2ml，在其中加入0.5ml已调整至10mg/ml的抗原，之后使用搅拌器在室温下搅拌48小时。对各抗原实施3次偶联反应。在将填充有CL-4B (4%交联琼脂糖凝胶)的柱用PBS进行平衡后，加入抗原-脂质体混合液，利用分子筛效果回收已结合抗原的脂质体组分(9ml/偶联)。将其进行滤器过滤(0.45μm)而得到的物质作为试验疫苗(IBV-rNp-DSS和IBV-rMp-DSS)。最终回收的试验疫苗的液量均为25ml左右。
(2) 基于GA法的抗原的脂质体化
每1次偶联反应，在油酸脂质体悬浮液(90mg脂质/小瓶/2ml)中加入2.5ml已调整至2mg/ml的抗原。然后，加入0.5ml 2.5%的戊二醛溶液，紧接着在37℃的水浴中振荡1小时。添加0.5ml饱和甘氨酸-NaOH溶液(pH7.0)中和剩余的醛基，之后在4℃下静置过夜。纯化和滤器过滤的过程与上述DSS法相同。最终回收的试验疫苗(IBV-rNp-GA和IBV-rMp-GA)的液量均为25ml左右。
(3) 抗原蛋白的定量
定量结果见下述表2-1。
[表2-1]
Figure 806872DEST_PATH_IMAGE003
＜结论＞
以IBV-rNp或IBV-rMp为抗原，将其通过DSS法或GA法进行脂质体化，从而制作了共计4种试验疫苗。这些试验疫苗的性能通过以后的动物试验进行评价。
3．试验疫苗的免疫原性的评价
＜目的＞
使用上述2.中制作的4种试验疫苗分别对SPF鸡进行免疫，评价抗原特异性IFN-γ产生诱导能力和抗体产生诱导能力，选择用于以后的攻击试验的试验疫苗。
＜材料和方法＞
(1) 动物试验
试验区的设定和动物试验日程表如下述表3-1和表3-2所示。
[表3-1]
Figure 406391DEST_PATH_IMAGE004
[表3-2]
动物试验日程表
Figure 203446DEST_PATH_IMAGE005
(2) IFN-γ产生诱导能力的评价
使用由试验鸡的脾脏采集的淋巴细胞，通过鸡IFN-γ检测ELISPOT测定抗原特异性IFN-γ的产生诱导能力。
(3) 抗体诱导能力的评价
使用试验鸡的血清，通过ELISA测定抗原特异性的血中抗体效价。
＜结果＞
(1) 动物试验
在6周龄SPF鸡的脚部肌肉内以2周为间隔共计注射3次(1mL/次)试验疫苗进行免疫。免疫后，在注射部位未见肿胀或硬结等副反应。从最终免疫起1周后进行解剖，采集脾脏。另外，在试验开始时和解剖时采集ELISA用的血清。
(2) IFN-γ产生诱导能力的评价
在由供试鸡的脾脏调制的单个细胞悬浮液中以5～40μg/mL添加试验疫苗抗原(IBV-rNp或IBV-rMp)作为刺激抗原，在41℃的5%CO2培养箱中培养20小时。与刺激抗原反应而活化的淋巴细胞产生IFN-γ，并且其部位在孔上被识别为斑点。计量该斑点数，评价抗原特异性IFN-γ产生诱导能力。其结果，在所有的试验疫苗中，对于5μg/mL以上的抗原刺激均显著可见淋巴细胞的活性，斑点数与刺激抗原浓度存在正相关(图3-1, 图3-2)。任一种抗原在不同的结合方法的斑点数上均未见大的差别。另外，在同一刺激抗原浓度下，与IBV-rMp相比，IBV-rNp可见斑点数较多的趋势。在同一试验区的供试鸡之间未见大的差别。
(3) 抗体诱导能力的评价
通过以3μg/孔的IBV-rNp或IBV-rMp为抗原的ELISA测定免疫前后的血中抗体效价。其结果，通过试验疫苗的免疫，可见特异抗体的诱导(图3-3、图3-4)。
＜结论＞
在对6周龄SPF鸡的脚部肌肉内多次注射的免疫方法中，任一种试验疫苗均可见IFN-γ产生淋巴细胞的活化和抗体诱导。在基于抗原的种类和与脂质体的结合方法的IFN-γ产生淋巴细胞的活化中未见大的差别，因此在以后的使用强毒同型株的攻击试验中对所有的4种试验疫苗进行防御效果的比较。
4．试验疫苗的有效性评价(1)
＜目的＞
关于上述2.中制作的4种试验疫苗，在分别对SPF鸡进行免疫后，使用作为抗原蛋白的来源的IBV Chiba (2002)株(强毒同型株)进行攻击，评价试验疫苗的有效性。
＜材料和方法＞
(1) 动物试验
试验区的设定和动物试验日程表如表4-1、表4-2所示。在评价试验疫苗的有效性(防御效果)时，设定了将IBV Chiba (2002)株减毒而制作的IBV千叶株MSV用作活疫苗的试验区，将其作为阳性对照区(可见明显的防御效果的试验区)。此外，设定只进行攻击的试验区，将其作为攻击对照区。
[表4-1]
Figure 812282DEST_PATH_IMAGE006
[表4-2]
动物试验日程表
Figure 923457DEST_PATH_IMAGE007
(2) 评价项目
i．根据气管纤毛运动分数进行的评价
作为IBV感染后的呼吸系统症状的评价方法，通常是对气管纤毛运动的活性进行打分。具体而言，对于由剖检时的供试鸡采集的气管，在实验室内每1只制作5处气管环，分别在显微镜下观察气管纤毛运动的活性，按照以下的判定标准进行打分。
0=活跃地摆动、1=稍弱地摆动、2=非常弱地/一部分摆动、3=停止
算出不同个体的平均分数后，算出不同试验区的分数。
※判定如下：分数越高，则由IBV导致的呼吸系统损伤越强(疫苗所产生的防御效果越低)。
ii．脏器中的病毒基因的定量
制作在剖检时采集的气管和肾脏的10%(w/v)脏器乳剂，在3000rpm、4℃、20分钟的条件下离心后回收上清。
iii．从脏器中分离病毒
制作在剖检时采集的气管和肾脏的10%(w/v)脏器乳剂，在3000rpm、4℃、20分钟的条件下离心后回收上清。将用PBS进行了10倍系列稀释的乳剂上清接种在源自SPF鸡的初代肾脏细胞(以下，记作CK细胞)中，在接种后的第4天观察是否存在IBV的特征性细胞变性效果，进行病毒分离的确认和病毒效价测定。
iv．中和抗体效价的测定
使用源自SPF鸡的CK细胞，测定攻击时和剖检时的不同个体的血清针对IBV Chiba(2002)株的中和抗体效价。
＜结果＞
(1) 动物试验
共设定6个试验区，各试验区供试5只。在4种试验疫苗区于5周龄时、7周龄时和9周龄时向脚部肌肉内注射各0.5mL的各试验疫苗。在活疫苗区于8周龄时滴眼接种各30μL 1剂量(3.5 logEID50/只)的IBV千叶株MSV。在包括攻击对照区在内的所有试验区于10周龄时气管内接种各50μL的3.5 logEID50/只的Chiba (2002)株进行攻击。观察临床症状，同时在攻击后第1周进行剖检。对在攻击时或剖检时采集的脏器和血清进行气管纤毛运动的观察、病毒分离、病毒基因定量和中和抗体效价测定。
(2) 根据气管纤毛运动分数进行的评价
与攻击对照区相比，IBV-rNp-DSS区和IBV-rNp-GA区的气管纤毛运动的抑制降低(图4-1)。另一方面，IBV-rMp-DSS区和IBV-rMp-GA区与攻击对照区同等。
(3) 脏器中的病毒基因的定量
在所有试验区由剖检时的气管和肾脏检测到病毒基因(图4-2)。与攻击对照区相比，在IBV-rNp-DSS区和IBV-rNp-GA区可见脏器中的病毒基因量减少的趋势。
(4) 病毒分离和病毒效价测定
与攻击对照区相比，在IBV-rNp-DSS区和IBV-rNp-GA区来自脏器的病毒分离率和分离阳性样品中的平均病毒效价下降(图4-3)。另一方面，IBV-rMp-DSS区和IBV-rMp-GA区与攻击对照区同等。
(5) 中和抗体效价的测定
攻击时的中和抗体效价如下：活疫苗区为23倍，相对于此，在所有试验疫苗区均不足4倍。在攻击后的第1周，任意一个试验疫苗区均上升至16倍左右，这与攻击对照区同等(图4-4)。
＜结论＞
对4种试验疫苗评价其对相当于抗原同型株的IBV Chiba (2002)株的有效性，结果在以IBV-rNp为抗原的2种试验疫苗中可见发病减少效果。另一方面，在以IBV-rMp为抗原的试验疫苗中未见发病减少效果。
5．试验疫苗的有效性评价(2)
＜目的＞
对于使用上述2.中制作的4种试验疫苗中的在上述4.中可见一定有效性(发病减少效果)的IBV-rNp-DSS和IBV-rNp-GA进行了免疫的SPF鸡，使用与作为抗原蛋白来源的IBVChiba (2002)株相同或不同的基因型强毒异型株进行攻击，评价IBV-rNp-DSS和IBV-rNp-GA的有效性。
＜材料和方法＞
(1) 动物试验
试验区的设定和试验日程表如表5-1、表5-2所示。为了评价试验疫苗的有效性(防御效果)，使用3种野外强毒异型株分别进行攻击。此外，设定只进行攻击的试验区，将其作为攻击对照区。
[表5-1]
试验区的设定
Figure 934138DEST_PATH_IMAGE008
[表5-2]
动物试验日程表
Figure 902094DEST_PATH_IMAGE009
(2) 评价项目
进行与上述4.同样的操作，对下述项目进行评价。
i．根据气管纤毛运动分数进行的评价；
ii．脏器中的病毒基因的定量；
iii．从脏器中分离病毒。
＜结果＞
(1) 动物试验
共设定12个试验区，各试验区供试5只。在肌肉注射免疫区于5周龄时、7周龄时和9周龄时向脚部肌肉内注射各0.5mL的试验疫苗。在滴眼免疫区于5周龄时、7周龄时和9周龄时滴眼给予各0.1mL的试验疫苗。在包括攻击对照区在内的所有试验区于10周龄时气管内接种3.5 logEID50/只的攻击用病毒(50μL/只)进行攻击。观察临床症状，同时在攻击后第1周进行剖检，采集气管和肾脏。另外，在攻击时和剖检时进行采血。
(2) 根据气管纤毛运动分数进行的评价
与攻击对照区相比，在所有免疫区气管纤毛运动的抑制均有一定程度的下降，未见由攻击株导致的有效性的明显差别(图5-1)。另外，在按给药途径进行比较的情况下，与滴眼相比肌肉注射呈抑制降低效果高的趋势。然而，即使在同一试验区内在抑制降低效果上也未见偏差(表5-3)。
[表5-3]
气管纤毛运动分数的分布
Figure 185177DEST_PATH_IMAGE010
(3) 脏器中的病毒基因的定量
在所有试验区由剖检时的气管和肾脏均检测到了病毒基因(表5-4)。与攻击对照区相比，免疫区的脏器中的病毒基因量显著下降(图5-2)。
[表5-4]
不同试验区的实时PCR阳性率(%)
Figure 896781DEST_PATH_IMAGE011
(4) 病毒分离和病毒效价测定
与攻击对照区相比，在所有免疫区来自剖检时的气管和肾脏的病毒分离率和平均病毒效价均呈下降趋势(图5-3、图5-4)。在任一种攻击株或给药途径中病毒分离率和病毒效价均为同等程度。气管纤毛运动分数高(平均2.0以上)的个体和病毒分离阳性个体呈一致的趋势。
＜结论＞
以IBV-rNp为抗原的试验脂质体疫苗对3株强毒异型株可见一定程度的发病减少效果。滴眼区虽然是肌肉注射区的五分之一量的抗原量，但其发病减少效果止于较肌肉注射途径稍低的程度。在相同条件下使用IBV-rNp-DSS和IBV-rNp-GA的情况下，IBV-rNp-DSS的有效性呈较高的趋势，因此在以后的研究中会使用IBV-rNp-DSS。
6．试验疫苗的有效性评价(3)
＜目的＞
由于IBV在环境中广泛浸润，因此通常从初生时(0日龄)起就实施疫苗接种。迄今为止本研究的动物试验使用5周龄雏，在免疫系统更未发育成熟的初生雏中的有效性尚不明确。因此，使用IBV-rNp-DSS作为试验疫苗，设定给药途径、抗原浓度和给药次数的条件，评价在初生雏中的有效性。
＜材料和方法＞
(1) 动物试验
试验区的设定和试验日程表如表6-1、表6-2所示。为了评价IBV-rNp-DSS的有效性(防御效果)，对3种给药途径分别设定抗原浓度和免疫次数的条件进行免疫，之后使用强毒异型株进行攻击。此外，设定只进行攻击的试验区，将其作为攻击对照区。
[表6-1]
试验区的设定
Figure 761969DEST_PATH_IMAGE012
[表6-2]
试验日程表
Figure 900826DEST_PATH_IMAGE013
(2) 评价项目
进行与上述4.同样的操作，对下述项目进行评价。
i．根据气管纤毛运动分数进行的评价；
ii．脏器中的病毒基因的定量；
iii．从脏器中分离病毒。
＜结果＞
(1) 动物试验
共设定13个试验区，各试验区供试4只。设定滴眼、滴鼻、肌肉注射作为给药途径。使用IBV-rNp-DSS的原液或者将原液冷冻干燥后用1/4量的PBS复水而得到的4倍浓缩液作为免疫材料。在1次免疫区仅于初生时给予各50μL的试验疫苗，在3次免疫区于初生时、7日龄时和14日龄时给予各50μL的试验疫苗。在包括攻击对照区在内的所有试验区于21日龄时滴鼻接种3.5 logEID50/只的攻击株(50μL/只)进行攻击。观察临床症状，同时在攻击后第1周进行剖检，采集气管和肾脏。
(2) 根据气管纤毛运动分数进行的评价
在将4倍浓缩和原液的IBV-rNp-DSS通过滴鼻途径进行了3次免疫的试验区(6区和8区)和将4倍浓缩的IBV-rNp-DSS通过肌肉内途径进行了3次免疫的试验区(10区)气管纤毛运动的抑制呈下降趋势(图6-1)。然而，即使在同一试验区内个体间在分数上也可见偏差(表6-3)。
[表6-3]
气管纤毛运动分数的分布
Figure 421938DEST_PATH_IMAGE014
(3) 脏器中的病毒基因的定量
由所有免疫区的气管和肾脏均检测到了病毒基因，但在任意一种给药途径中，在进行了3次免疫的试验区气管或肾脏的病毒基因量均显著下降(图6-2、表6-4)。
[表6-4]
实时PCR阳性率(%)
Figure 671653DEST_PATH_IMAGE015
(4) 病毒分离和病毒效价测定
在通过滴鼻途径进行了3次免疫的试验区(6区和8区)来自脏器的病毒分离率下降(图6-3)。另外，在滴鼻途径中即使进行1次免疫，脏器中的病毒效价也显著降低，但3次免疫时病毒效价进一步降低(图6-4)。
＜结论＞
IBV-rNp-DSS对初生雏也可见一定的发病减少效果。在此次研究的免疫方法中，滴鼻途径中的3次给药最有效。另外，在滴鼻途径中，在基于抗原浓度的有效性上未见大的差别。
7．试验疫苗的给药方法的研究(1)
＜目的＞
在上述6.中，IBV-Np-DSS在滴鼻途径中可见高的有效性，由此设想现场应用，研究喷洒给药(散雾或喷雾)的有效性。
＜材料和方法＞
(1) 动物试验
试验区的设定和试验日程表如表7-1、表7-2所示。对3种给药途径分别设定抗原浓度和免疫次数的条件进行免疫后，使用强毒异型株进行攻击。此外，设定只进行攻击的试验区，将其作为攻击对照区。需要说明的是，液滴粒径使用活疫苗用动力喷雾器(NEWCON 607、木村农产)进行调整，散雾给药时设定为250～300μm，喷雾给药时设定为50～100μm。
[表7-1]
试验区的设定
Figure 656927DEST_PATH_IMAGE016
[表7-2]
动物试验日程表
Figure 655101DEST_PATH_IMAGE017
(2) 评价项目
进行与上述4.同样的操作，对下述项目进行评价。
i．根据气管纤毛运动分数进行的评价；
ii．脏器中的病毒基因的定量；
iii．从脏器中分离病毒。
＜结果＞
(1) 动物试验
共设定13个试验区，各试验区供试4只。在滴鼻途径中将试验疫苗用PBS稀释至最大100倍后进行给药，而在散雾和喷雾途径中将试验疫苗用PBS稀释至最大1000倍后进行给药。在1次免疫区仅于7日龄时给予试验疫苗，在2次免疫区于7日龄时和14日龄时给予试验疫苗。在滴鼻途径中按每只50μL/次进行给药。在散雾和喷雾途径中，将损失量考虑进去，按每只100μL/次进行给药。而且，在通过散雾和喷雾途径给药时，将供试鸡装入大型塑料袋内，从供试鸡的上空50cm左右起朝着面部给予规定量的试验疫苗，之后扎上塑料袋的袋口静置1分钟左右，从而设定了漂浮在空气中的试验疫苗颗粒被供试鸡有效吸引的环境。在包括攻击对照区在内的所有试验区于21日龄时气管内接种3.5 logEID50/只的攻击株(50μL/只)进行攻击。观察临床症状，同时在攻击后第1周进行剖检，采集气管和肾脏。
(2) 根据气管纤毛运动分数进行的评价
在滴鼻途径的2次免疫区，可见抗原浓度依赖性的抑制降低，但在1次免疫区未见抑制效果(图7-1)。在散雾途径的2次免疫区，直至100倍稀释为止可见一定的抑制降低，但在1000倍稀释下与攻击对照区同等。在喷雾途径的2次免疫区，直至1000倍稀释为止的平均分数为同等程度，即使是1000倍稀释，4只中也有2只为不足平均分数1 (表7-3)。另外，在同一试验区内个体间在分数上可见偏差。
[表7-3]
气管纤毛运动分数的分布
Figure 725825DEST_PATH_IMAGE018
(3) 脏器中的病毒基因的定量
由所有免疫区的脏器均检测到了病毒基因(表7-4)。在2次免疫区，在滴鼻途径中直至10倍稀释为止、在散雾途径中直至100倍稀释为止、在喷雾途径中直至1000倍稀释为止气管和/或肾脏的病毒基因量均显著下降(图7-2)。
[表7-4]
实时PCR阳性率(%)
Figure 779232DEST_PATH_IMAGE019
(4) 病毒分离和病毒效价测定
在喷雾途径的2次免疫区，即使在1000倍稀释下来自脏器的病毒分离阳性率也有所下降(图7-3)。气管的病毒效价可见显著差异的最大稀释倍数如下：在滴鼻途径中为10倍、在喷雾途径中为1000倍，但在同一试验区内个体间的偏差大(图7-4)。
＜结论＞
即使是喷洒给药也显示出一定的有效性，确认到在粒径更细的喷雾给药中即使提高稀释倍率也可维持有效性。然而，在喷洒给药中，个体间的偏差呈变大的趋势，因此尝试着改进免疫方法。
8．试验疫苗的抗原区域的研究
＜目的＞
表面结合型脂质体疫苗的特征在于强力诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，但迄今为止IBV的CTL表位区域尚不明确。目前正在推进研究的IBV-rNp-DSS使用IBV核衣壳(N)蛋白的全长作为抗原区域，但若假定在N蛋白的一部分区域局部存在表位，则通过特定该表位局部存在区域，可期待脂质体疫苗的有效性提高。因此，制作以结合有片段化的N蛋白或N蛋白和膜(M)蛋白的嵌合蛋白为抗原的脂质体疫苗，通过动物试验比较它们的有效性。
＜材料和方法＞
(1) 片段化/嵌合化蛋白的制作和脂质体化
使用基因重组大肠杆菌，将IBV Chiba (2002)株的N蛋白基因(1230bp、SEQ ID NO: 1)以前后有一部分区域重合的状态分割成4份，制作重组蛋白(图8-1)。N1～N4的核苷酸序列和所编码的氨基酸序列见SEQ ID NO: 5～12。
此外，制作了在IBV的N和M蛋白中结合有在IBV株间保存性特别高的区域的嵌合蛋白：Ch (N＋M) (图8-2)。Ch(N＋M)的核苷酸序列和氨基酸序列见SEQ ID NO: 13、14。在SEQID NO: 13的核苷酸序列中，1～450位为N蛋白区域：241-690 (450bp)，451～657位为M蛋白区域：454-660 (207bp)。
通过DSS法使它们与脂质体表面结合，制作了脂质体疫苗。
(2) 动物试验
试验区的设定和试验日程表如表8-1、表8-2所示。在7日龄时和14日龄时，将用PBS稀释了10倍的试验疫苗进行喷洒给药(喷雾)，之后使用强毒异型株进行攻击。此外，设定只进行攻击的试验区，将其作为攻击对照区。需要说明的是，液滴粒径使用活疫苗用动力喷雾器(NEWCON 607、木村农产)设定为喷雾给药的50～100μm。而且，为了减少个体间的偏差，设为与上述7.中实施的方法和试验疫苗的给药量相同，每个试验区的给药时间由4秒延长至6秒。
[表8-1]
试验区的设定
Figure 619012DEST_PATH_IMAGE020
[表8-2]
试验日程表
Figure 37355DEST_PATH_IMAGE021
(3) 评价项目
进行与上述4.同样的操作，对下述项目进行评价。
i．根据气管纤毛运动分数进行的评价；
ii．脏器中的病毒基因的定量。
＜结果＞
(1) 片段化/嵌合化蛋白的制作和脂质体化
使用基因重组大肠杆菌，将源自IBV Chiba (2002)株的N蛋白基因(1230bp)以前后有一部分区域重合的状态分割成4份，制作重组蛋白，从5’末端侧起为N1、N2、N3、N4。此外，制作了在IBV的N和M蛋白中结合有在病毒株间保存性特别高的区域的嵌合蛋白(N+M)。通过DSS法使它们与脂质体表面结合，共制作了5种脂质体疫苗。
(2) 动物试验
共设定7个试验区，使用脂质体疫苗进行免疫的1～6区的各区供试8只，攻击对照区的7区供试6只。在1～6区中，将上述(1)中制作的脂质体疫苗用PBS稀释10倍后，使用活疫苗用动力喷雾器在7日龄时和21日龄时每只喷雾给药(液滴粒径为50～100μm) 100μL。在包括攻击对照区在内的所有试验区于28日龄时气管内接种3.5 logEID50/只的强毒异型株(50μL/只)进行攻击。观察临床症状，同时在攻击后第1周进行剖检，采集气管和肾脏。
(3) 根据气管纤毛运动分数进行的评价
与攻击对照区相比，在所有试验区均存在气管纤毛运动的抑制降低的趋势(图8-3)。在可见最高抑制降低效果的6区(IBV-rNp)，个体间的偏差少，所有个体均为分数1以下(表8-3)。在其他试验区可见一部分超过分数1的个体，即使在同一试验区内个体间在分数上也存在偏差。在将N蛋白片段化的1～4区中，2区和3区的分数呈低的趋势。
[表8-3]
气管纤毛运动分数的分布
Figure 329796DEST_PATH_IMAGE022
(4) 脏器中的病毒基因的定量
与攻击对照区相比，在所有试验区的气管和肾脏中病毒基因量均显著下降(图8-4)。可见最高的基因量减少效果的是6区(IBV-rNp)，其次是5区(N＋M)。在将IBV N蛋白片段化的1～4区中，2区和3区的基因量呈低的趋势。
＜结论＞
进行了片段化或嵌合化的脂质体疫苗对于强毒异型株的攻击可见一定的发病减少效果，其有效性在N2和N3区域呈高的趋势，但无法确认表位区域的明确的局部存在，而且迄今为止研究的以全长(IBV-rNp)为抗原的试验区可见更高的发病减少效果。
另外，通过将喷雾给药方法进行部分变更，可见个体间的偏差的减少和发病减少效果的提高。
9．试验疫苗的给药方法的研究(2)
＜目的＞
研究了喷雾给药中的IBV-rNp的最小有效抗原量。
＜材料和方法＞
(1) 动物试验
试验区的设定和试验日程表如表9-1、表9-2所示。IBV-rNp抗原量以2μg/次/只为起点，将用PBS进行了2倍系列稀释的IBV-rNp-DSS在7日龄时和21日龄时进行喷雾给药以进行免疫，在28日龄时进行攻击，在35日龄时进行剖检。此外，设定只进行攻击的试验区，将其作为攻击对照区。
[表9-1]
试验区的设定
Figure 186893DEST_PATH_IMAGE023
[表9-2]
动物试验日程表
Figure 68131DEST_PATH_IMAGE024
(2) 评价项目
进行与上述4.同样的操作，对下述项目进行评价。
i．根据气管纤毛运动分数进行的评价；
ii．脏器中的病毒基因的定量。
＜结果＞
(1) 动物试验
共设定7个试验区，使用脂质体疫苗进行免疫的1～6区的各区供试8只，攻击对照区的7区供试6只。在1～6区中，将上述(1)中制作的脂质体疫苗用PBS稀释10倍后，使用活疫苗用动力喷雾器在7日龄时和21日龄时每只喷雾给药(液滴粒径为50～100μm) 100μL。在包括攻击对照区在内的所有试验区于28日龄时气管内接种3.5 logEID50/只的强毒异型株(50μL/只)进行攻击。观察临床症状，同时在攻击后第1周进行剖检，采集气管和肾脏。
(2) 根据气管纤毛运动分数进行的评价
与攻击对照区相比，在所有试验区均可见气管纤毛运动的抑制减少的趋势(图9-1)。试验区间的分数差小，任意一个试验区均不存在可见分数2以上的个体(表9-3)。即使在抗原量最少的试验区(7区)个体间的偏差也小。
[表9-3]
气管纤毛运动分数的分布
Figure 719692DEST_PATH_IMAGE025
(3) 脏器中的病毒基因的定量
与攻击对照区相比，在所有试验区的气管和肾脏中病毒基因量均显著下降(图9-2)。
＜结论＞
即使将IBV-rNp-DSS的原液(20μg/mL)稀释至最大640倍，也可见高的发病减少效果，由此暗示：IBV-rNp-DSS在2次喷雾给药中的最小有效抗原量是将原液稀释至640倍以上。
10．关于是否存在抗原与脂质体的结合和脂质体疫苗的有效性的研究
＜目的＞
在已报道的使用小鼠的文献(Taneichi等人, J Immunol. 2006, 177(4): 2324-2330)中暗示了：表面结合型脂质体疫苗通过形成在脂质体表面结合有抗原的状态而初次显示出有效性。然而，迄今为止关于鸡是否也是同样的情形还尚未进行研究。因此，与抗原或脂质体单独的情形或抗原与脂质体未结合的情形进行比较，明确了：为了显示出有效性，抗原与脂质体的结合是必须的。
＜材料和方法＞
(1) 动物试验
试验区的设定和试验日程表如表10-1、表10-2所示。以IBV-rNp-DSS作为阳性对照，将抗原/脂质体单独或者之前刚刚混合的非结合状态的脂质体抗原混合物分别进行喷雾给药。
[表10-1]
试验区的设定
Figure 765008DEST_PATH_IMAGE026
[表10-2]
动物试验日程表
Figure 160218DEST_PATH_IMAGE027
(2) 评价项目
进行与上述4.同样的操作，对下述项目进行评价。
i．根据气管纤毛运动分数进行的评价；
ii．脏器中的病毒基因的定量。
＜结果＞
(1) 动物试验
共设定4个试验区，各试验区供试5只。在1、2、3区使用PBS将rNp抗原量调整成2μg/次/只。4区的脂质体量与1区相同。使用活疫苗用动力喷雾器在7日龄时和21日龄时每只喷雾给药(液滴粒径为50～100μm) 100μL。在包括攻击对照区在内的所有试验区于28日龄时气管内接种各50μL的3.5 logEID50/只的香川/2012/1株(强毒异型株)进行攻击。观察临床症状，同时在攻击后第1周进行剖检，采集气管和肾脏。
(2) 根据气管纤毛运动分数进行的评价
与攻击对照区相比，1区存在着气管纤毛运动的抑制减少的趋势，但2、3、4区的气管纤毛运动分数与攻击对照区为同等程度，未见发病减少效果(图10-1、表10-3)。
[表10-3]
气管纤毛运动分数的分布
Figure 646694DEST_PATH_IMAGE028
(3) 脏器中的病毒基因的定量
与攻击对照区相比，1区的气管和肾脏的病毒基因量显著下降，但2、3、4区与攻击对照区为同等程度(图10-2)。
＜结论＞
确认到：为了使表面结合脂质体疫苗在鸡中也显示出有效性，抗原与脂质体的结合是必须的。
11．试验疫苗的给药方法的研究(3)
＜目的＞
对设想在野外农场使用的喷雾给药条件进行了研究。
＜材料和方法＞
(1) 动物试验
试验区的设定和试验日程表如表11-1、表11-2所示。1区(封闭空间)是将10只SPF雏收纳在厚实的塑料袋(W900×H1000：容量90L)内，从上方约50cm左右朝向鸡的头部进行rNp-DSS的喷雾给药。在2～6区(开放空间)将10只SPF雏收纳在鸡运输栏(内径W750×D500×H280)内(收纳密度为0.038m2/只)，从上方约50cm左右朝向鸡的头部进行IBV-rNp-DSS的喷雾给药。在喷雾给药中使用活疫苗用动力喷雾器(NEWCON 607)。喷雾给药后转移到鸡用隔离器中饲养。此外，设定只进行攻击的试验区，将其作为攻击对照区(7区)。
[表11-1]
试验区的设定
Figure 734735DEST_PATH_IMAGE029
[表11-2]
动物试验日程表
Figure 1769DEST_PATH_IMAGE030
在7日龄时和21日龄时按照上述方法进行免疫，在28日龄时气管内接种3.5 logEID50的强毒异型株(50μL/只)进行攻击。观察临床症状，同时在35日龄进行剖检，采集气管和肾脏。
(2) 评价项目
i．根据气管纤毛运动分数进行的评价
参照上述4.。显著差异检验按照Dunnett的多重比较检验法进行。
ii．脏器中的病毒基因的定量
参照上述4.。显著差异检验按照Student-t检验法进行。
＜结果＞
(1) 根据气管纤毛运动分数进行的评价
与攻击对照区(7区)相比，在所有试验区气管纤毛运动分数均显著降低(P<0.01) (图11-1)。抗原浓度、给药量和给药时间的条件设为相同，将封闭环境(1区)和开放环境(2区)进行比较的结果，虽然平均分数为同等程度，但在试验区间内的偏差是2区较大。另外，与2区相比，在增加了给药量的4区和延长了给药时间的5区虽然平均分数为同等程度，但在试验区内的偏差变小。在所有免疫区(1-6区) 10只中有7～9只个体的分数不足1，未见分数2以上的个体(表11-3)。
[表11-3]
气管纤毛运动分数的分数分布
Figure 200669DEST_PATH_IMAGE031
(2) 脏器中的病毒基因的定量
与攻击对照区(7区)相比，在所有免疫区(1-6区)气管和肾脏的病毒基因量均显著下降(P<0.01)，免疫区(1-6区)的病毒基因量为同等程度(图11-2)。
＜结论＞
IBV-rNp-DSS的喷雾给药在封闭环境和开放环境下可见同等程度的有效性。另外，还暗示：每1只的IBV-rNp-DSS给药量的增加和给药时间的延长对减小个体间的偏差有效。
12．试验疫苗的给药方法的研究(4)
＜目的＞
对IBV-rNp-DSS的喷雾给药中的给药时期、给药间隔和给药量的条件进行研究。
＜材料和方法＞
(1) 动物试验
试验区的设定和试验日程表如表12-1、表12-2所示。在免疫区将5只SPF雏收纳在鸡运输栏(内径W750×D500×H280)内(收纳密度为0.076m2/只)，从上方约50cm左右朝向鸡的头部进行IBV-rNp-DSS的喷雾给药。在喷雾给药中使用活疫苗用动力喷雾器(NEWCON 607)。喷雾给药后转移到鸡用隔离器内饲养。此外，设定只进行攻击的试验区，将其作为攻击对照区(4、8、12区)。在免疫区按表1的日龄进行2次免疫，在第2次免疫的7天后气管内接种3.5logEID50的强毒异型株(50μL/只)进行攻击。观察临床症状，同时在攻击7天后进行剖检，采集气管和肾脏。
[表12-1]
试验区的设定
Figure 289454DEST_PATH_IMAGE032
[表12-2]
动物试验日程表
Figure 548397DEST_PATH_IMAGE033
(2) 评价项目
i．根据气管纤毛运动分数进行的评价
参照上述4.。显著差异检验按照Dunnett的多重比较检验法进行。
ii．脏器中的病毒基因的定量
参照上述4.。显著差异检验按照Student-t检验法进行。
＜结果＞
(1) 根据气管纤毛运动分数进行的评价
与攻击对照区相比，在抗原量为100ng/剂量以上的0日龄-7日龄的免疫区(1-2区)、0日龄-14日龄的免疫区(5-6区)和7日龄-21日龄的免疫区(9-10区)气管纤毛运动分数均显著降低(P<0.01或P<0.05) (图12-1)。另一方面，在抗原量为25ng/剂量(3、7、11区)下，仅在给药间隔为14天的7区和11区气管纤毛运动分数显著降低(P<0.05)。同一试验区的气管纤毛运动分数的偏差在0日龄-7日龄的免疫区(1-3区)和与给药时期无关的抗原量为25ng/剂量的免疫区(3、7、11区)均可见稍大的趋势(表12-3)。
[表12-3]
气管纤毛运动分数的分布
Figure 302727DEST_PATH_IMAGE034
(2) 脏器中的病毒基因的定量
结果见图12-2。与攻击对照区相比，在抗原量为100ng/剂量以上的免疫区(1-2、5-6、9-10区)气管的病毒基因量显著下降(P<0.01或P<0.05)。另一方面，在除1区以外的抗原量为100ng/剂量以上的免疫区(2、5-6、9-10区)肾脏的病毒基因量显著下降(P<0.01或P<0.05)。
＜结论＞
作为IBV-rNp-DSS的喷雾给药时的最适条件如下：初次给药时期为0日龄或7日龄，给药间隔为14天，在抗原量为100ng/剂量以上可见高的发病减少效果。IBV是一种在环境中广泛浸润、对鸡雏赋予早期免疫较为重要的疾病，由此认为：作为IBV-rNp-DSS的给药模型，“0日龄和14日龄的2次给药、抗原量为100ng/剂量”的条件适当。
13．试验疫苗的有效性评价(4)
＜目的＞
评价IBV-rNp-DSS对IBV感染所引起的产蛋异常的有效性。
＜材料和方法＞
(1) 动物试验
试验区的设定和试验日程表如表13-1、表13-2所示。各区供试12只25周龄的SPF产蛋鸡，在单饲笼(H965×W393×D193mm)内饲养约11周。在疫苗试验区于25周龄时和27周龄时将IBV-rNp-DSS进行喷雾给药(0.5μg/100μL/只)。在从追加免疫起1周后的28周龄时对疫苗试验区和攻击对照区气管内接种3.5 logEID50的强毒异型株(50μL/只)进行攻击。观察临床症状和产蛋成绩，同时随时间采集口腔拭子、泄殖腔拭子和血清。另外，在攻击后第7天各区剖检2只，在攻击后第57天各区剖检10只，采集脏器(气管/肾脏、输卵管)。
[表13-1]
试验区的设定
Figure 977422DEST_PATH_IMAGE035
[表13-2]
试验日程表
Figure 500807DEST_PATH_IMAGE036
(2) 评价项目
i．产蛋成绩的评价
每天按个体记录产蛋成绩(-7～57dPI)。在看到异常蛋的情况下，确认外部蛋质和内部蛋质是否存在异常。
ii．病毒基因定量
通过实时PCR对7、14、35、57dPI的口腔和泄殖腔拭子以及7、57dPI的剖检时的气管、肾脏和输卵管(膨大部)按个体进行IBV基因定量。显著差异检验通过Student t-检验来进行。
iii．气管纤毛运动分数
在7dPI和57dPI的剖检时，对于每1只的5处的气管环，在显微镜下观察气管纤毛运动，根据以下指标进行打分(0=活跃地摆动、1=稍弱地摆动、2=非常弱地/一部分摆动、3=停止)。
iv．抗体检查(ELISA)
使用市售的IB ELISA试剂盒(IDEXX公司)，对0、7、57dPI时的不同个体的血清测定ELISA抗体效价(S/P比)，按试验区分算出平均值。显著差异检验通过Student t-检验来进行。
＜结果＞
(1) 产蛋成绩的评价
不同试验区的产蛋率的变化如图13-1所示。在以约1周的间隔划分的不同期间的产蛋率中，刚刚攻击后2区下降15%以上、3区下降30%以上，之后两区均逐渐恢复产蛋率(图13-2)。直至产蛋率恢复至90%以上所需的期间如下：2区需要4周、3区需要6周。攻击后，连续3天以上停止产蛋的个体如下：在2区12只中有3只、在3区12只中有6只，任一个体在产蛋开始后均可见异常蛋(小型蛋/蛋质下降)，之后产出正常蛋(表13-3)。
[表13-3]
可见产蛋异常的个体的详情
Figure 930651DEST_PATH_IMAGE037
(2) 病毒基因定量
i．拭子中的病毒基因量
在2区在7～14dPI、在3区在7～35dPI由口腔/泄殖腔拭子检测到病毒基因(图13-3)。在7～35dPI中，2区的基因量相对于3区显著下降(P<0.05或P<0.01)。在57dPI中，在所有试验区均未检测到病毒基因。
ii．脏器中的病毒基因量
在7dPI中，由2区和3区的气管、肾脏和输卵管检测到病毒基因(图13-4)。2区的病毒基因量显示出较3区少的趋势。在57dPI中，在所有试验区均未检测到病毒基因。
(3) 气管纤毛运动分数
在7dPI中，3区有2只均可见重度的气管纤毛运动抑制，但在2区未抑制和轻度抑制各为1只(图13-5)。
(4) 抗体检查(ELISA)
在7dPI和57dPI中，2区的ELISA抗体效价相对于3区显著上升(P<0.05) (图13-6)。
＜结论＞
由攻击后的产蛋障碍的发生频率、发生期间和显示出病毒的全身感染的各种检查成绩暗示了：与攻击对照区相比，疫苗试验区的产蛋障碍的程度为轻度，IB脂质体疫苗对产蛋障碍有效。
14．试验疫苗的有效性评价(5)
＜目的＞
根据上述12.中建立的免疫方法，评价IBV-rNp-DSS对近年来国内分离的各种基因型的IBV野外异型株(5株)的有效性。
＜材料和方法＞
(1) 动物试验
试验区的设定、试验日程表和供试的野外异型株分别如表14-1、表14-2、表14-3所示。在免疫区各区供试10只，在攻击对照区各区供试3只。根据上述12.中建立的免疫方法，在免疫区于0日龄时和14日龄时将IBV-rNp-DSS进行喷雾给药(100ng/剂量)。在21日龄时对免疫区和攻击对照区气管内接种3.0 logEID50各种野外异型株(50μL/只)进行攻击。观察临床症状和产蛋成绩，同时在攻击后第7天进行剖检，采集脏器(气管/肾脏)。
[表14-1]
试验区的设定
Figure 906697DEST_PATH_IMAGE038
[表14-2]
试验日程表
Figure 634351DEST_PATH_IMAGE039
[表14-3]
攻击中使用的野外异型株
Figure 277822DEST_PATH_IMAGE040
(2) 评价项目
i．根据气管纤毛运动分数进行的评价
参照上述4.。显著差异检验按照Dunnett的多重比较检验法进行。
ii．脏器中的病毒基因的定量
参照上述4.。显著差异检验按照Student-t检验法进行。
＜结果＞
(1) 气管纤毛运动分数
在所有的攻击对照区均可见重度的气管纤毛运动抑制，相对于此，在免疫区在大多数个体中未见抑制、或者停留在轻度的抑制，相对于攻击对照区，平均分数显著降低(P<0.05)(图14-1、表14-4)。
[表14-4]
气管纤毛运动分数的分数分布
Figure 612988DEST_PATH_IMAGE041
(2) 病毒基因定量
与攻击对照区相比，在所有攻击株中，免疫区的攻击7天后的气管和肾脏中的病毒基因量显著下降(P<0.05或P<0.01) (图14-2)。
＜结论＞
根据上述12.中建立的免疫方法，使用IBV-rNp-DSS的结果是：对各种基因型的野外异型株(5株)均可见高的发病减少效果。
15．PRRSV脂质体疫苗的制作
＜目的＞
为了制作猪繁殖/呼吸障碍综合征病毒(以下，记作PRRSV)脂质体疫苗，使用基因重组大肠杆菌制作在PRRSV株间保存性较高的核衣壳(N)蛋白的全长作为其抗原，制作了以其为抗原的PRRS脂质体疫苗。
＜材料和方法＞
(1) 抗原区域的确定
以据报道在PRRSV株间保存性较高的N蛋白(ORF7基因区域)作为抗原区域。
(2) 利用大肠杆菌表达系统进行的重组N蛋白的制作
由在全农家畜卫生研究所分离的PRRSV wt-7株进行基因组提取，通过PCR法扩增编码N蛋白(SEQ ID NO: 28)的ORF7区域的全长(SEQ ID NO: 27)，之后将其插入到包含His标签的载体质粒中。将该质粒导入到克隆用大肠杆菌中进行转化。然后，由可通过PCR确认目标基因的插入的大肠杆菌提取质粒，将其导入到蛋白表达用大肠杆菌中进行转化。对该基因重组大肠杆菌进行使用添加有氨苄青霉素的LB培养基和IPTG的表达诱导或者使用添加有10mM乳糖的TB培养基的表达诱导，使重组N蛋白(以下，记作PRRSV-rNp)表达。通过超声波处理破坏菌体后，进行基于His标签的亲和纯化。进行SDS-PAGE，确认了蛋白在所设想的分子量的位置表达。
RT-PCR和确认目标基因插入的PCR中使用的引物如下。
正向引物：CCCCATATGGCCATGCCAAATAACAACGGCAA (SEQ ID NO: 29、下划线为NdeI识别位点)；
反向引物：TTTGGATCCTCATGCTGAGGGTGATGATA (SEQ ID NO: 30、下划线为BamHI识别位点)。
使用的试剂类等如下所示。
核酸提取：QIAamp Viral RNA Mini试剂盒(QIAGEN公司)；
PCR装置：PCR Thermal Cycler Dice (注册商标) Gradient (TP600) (TaKaRa公司)；
DNA的凝胶纯化：QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)；
限制酶：Nde I和BamH I (Takara公司)；
载体质粒：pET-15b (Novagen)；
感受态细胞：克隆用的使用E.coli JM109株(TaKaRa公司)，蛋白表达用的使用E.coliBL21(DE3)株(Biodynamics研究所)。
连接：Ligation high (TOYOBO)；
序列分析：外包委托给株式会社Fasmac；
基于His标签的亲和纯化：Profinia蛋白纯化系统(Bio-Rad公司)。
(3) 脂质体化
通过与上述1. (2) ii. (基于DSS法的抗原的脂质体化)相同的方法使PRRSV-rNp与脂质体表面结合，制作了PRRS脂质体疫苗(以下，记作PRRSV-rNp-DSS)。
＜结果＞
(1) 抗原区域的探索
PRRSV wt-7株的ORF7区域全长的核苷酸序列如SEQ ID NO: 27所示。
(2) 利用大肠杆菌表达系统进行的重组蛋白的制作
i．基因重组大肠杆菌的制作
以由PRRSV wt-7株提取的总RNA为模板进行RT-PCR，确认目标基因片段的扩增。关于重组N蛋白(rNp)，将扩增子和质粒载体(pET-15b)分别用相同的2种限制酶区域(Nde I和BamHI)连接后，通过序列分析确认正常插入。将该质粒载体转化到克隆用大肠杆菌(JM109)中，之后进行培养，回收已扩增的质粒。将其转化到表达用大肠杆菌BL21(DE3)株中，制作了PRRSV-rNp表达用重组大肠杆菌。
ii．重组蛋白的表达诱导和纯化
在添加有氨苄青霉素的LB培养基中添加1/100量的用添加有氨苄青霉素的液体LB培养基进行了预培养的PRRSV-rNp表达用重组大肠杆菌，在37℃下振荡培养3小时。培养开始后在O.D.600达到0.5的时间点添加IPTG(终浓度为1mM)进行表达诱导，进一步振荡培养3小时。或者，在添加有10mM乳糖的TB培养基中加入约1/100量的用添加有氨苄青霉素的液体LB培养基培养了一夜的PRRSV-rNp表达用重组大肠杆菌，在25℃下振荡培养3天。将这些培养菌液在4℃下以3000rpm离心40分钟，回收菌体颗粒，用结合缓冲液(20mM的Tris、500mM的NaCl、20mM的咪唑、pH7.4)再悬浮后，将菌体进行超声波破碎。接着，以6,000rpm离心分离30分钟，回收可溶性组分(上清)，进行亲和纯化，回收目标PRRSV-rNp组分。已知由于标签修饰(His-tag)对抗原的影响，SDS-PAGE中的表观分子量增大了数kDa，但使用SDS-PAGE和小鼠抗PRRSV-rNp抗体的蛋白质印迹的结果，在推算分子量(约14kDa)附近均确认到清晰的谱带，PRRSV-rNp表达量在使用添加有10mM乳糖的TB培养基的情况下较多(图15-1)。
iii．脂质体疫苗化(与上述2.同样)
每1次偶联反应，将已冷冻干燥的结合有DDS的油酸脂质体粉末(90mg脂质/小瓶)用蒸馏水复水，使总量为2ml，在其中加入0.5ml已调整至10mg/ml的抗原，之后使用搅拌器在室温下搅拌48小时。实施3次偶联反应。在将填充有CL-4B(4%交联琼脂糖凝胶)的柱用PBS进行平衡后，加入抗原-脂质体混合液，利用分子筛效果回收已结合抗原的脂质体组分(9ml/偶联)。将其进行滤器过滤(0.45μm)而得到的物质作为试验疫苗(PRRSV-rNp-DSS)。最终回收的试验疫苗的液量为25ml左右。
＜结论＞
使用基因重组大肠杆菌制作以PRRSV wt-7株为模板的PRRSV-rNp，制作了以其为抗原的PRRSV-rNp-DSS。关于PRRSV-rNp-DSS的免疫原性，通过以后的动物试验进行评价。
16．使用小鼠的PRRS脂质体疫苗的免疫原性评价
＜目的＞
使用小鼠对上述15.中制作的PRRS脂质体疫苗PRRSV-rNp-DSS的免疫原性进行评价。
＜材料和方法＞
(1) 动物试验
试验区的设定和试验日程表分别如表16-1、图16-1所示。导入3周龄的BALB/cCrSlc小鼠(以下，记作BALB/c小鼠)和C57BL/6NCrSlc (以下，记作B6小鼠)两种不同系统的小鼠，从4周龄时开始免疫。以2周的间隔向小鼠的足垫内共给予3次各免疫材料，随时间进行采血和剖检。
[表15-1]
试验区的设定
Figure 341910DEST_PATH_IMAGE042
(2) 评价项目
i．通过ELISPOT进行的抗原特异性淋巴细胞活性评价
使用小鼠IFN-γ ELISPOT BASIC (MABTECH公司)。在3次免疫结束1周后(35dPI)对3只进行剖检，采集脾脏，向脾细胞悬浮液(5×105细胞/mL)中以2μg/孔添加PRRSV-rNp作为刺激抗原，在37℃的5%CO2培养箱中培养24小时。与刺激抗原反应而活化的淋巴细胞产生IFN-γ，并且其部位在孔上被识别为斑点。计量该斑点数，评价抗原特异性小鼠IFN-γ产生诱导能力。
ii．通过ELISA进行的抗体诱导能力的评价
使用随时间采集的小鼠血清和HRP标记山羊抗鸡IgG、IgG1和IgG2a (BETHYL公司)，通过以PRRSV-rNp为抗原的ELISA测定IgG、IgG1和IgG2a。
iii．中和抗体诱导能力的评价
对于通过上述的ELISA可见抗PRRSV-rNp的抗体效价上升的3、4、7、8区的血清，通过使用MARC145细胞和PRRSV wt-7株的中和试验测定中和抗体效价。
3．结果
(1) IFN-γ产生诱导能力的评价
通过ELISPOT测定评价脾脏中的淋巴细胞中的IFN-γ产生诱导能力，结果显示：在给予了PRRSV-rNp-DSS的4区和8区可见与刺激抗原(PRRSV-rNp)反应的斑点数的增加(图16-2、图16-3)。
(2) 抗体诱导能力的评价
对IgG、IgG1和IgG2a进行了以PRRSV-rNp为抗原的ELISA，结果在PRRSV-rNp给药区(3、7区)和PRRSV-rNp-DSS给药区(4、8区)确认到了抗PRRSV-rNp的抗体上升(图16-4、图16-5、图16-6)。BALB/c小鼠和B6小鼠在抗体效价的上升程度上发现了差别，认为这是由于：在BALB/c中IgG1是IgG的主要成分，而在B6中IgG2a是IgG的主要成分。
(3) 中和抗体诱导能力的评价
对于通过ELISA可见抗PRRSV-rNp的抗体效价上升的3、4、7、8区的血清样品实施中和抗体效价测定，在任一样品中均未见中和抗体效价上升(表16-2)。认为这是由于：PRRSV的N蛋白不是中和活性区域。
[表15-2]
血清中的中和抗体效价
Figure 358407DEST_PATH_IMAGE043
＜结论＞
在给予了PRRSV-rNp-DSS的小鼠中可见IFN-γ产生淋巴细胞的活化和抗体诱导，由此确认到：PRRSV-rNp-DSS具有一定的免疫原性。
17．使用猪的PRRS脂质体疫苗的有效性评价
＜目的＞
使用猪对上述15.中制作的PRRS脂质体疫苗PRRSV-rNp-DSS的有效性进行评价。
2．材料和方法
(1) 动物试验
试验区的设定和试验日程表分别如表17-1、图17-1所示。导入3周龄的SPF猪，从4周龄时开始免疫。在免疫区以2周的间隔向颈部肌肉内共注射3次PRRSV-rNp-DSS。从免疫开始后到试验结束时随时间实施采血。在第3次免疫1周后的9周龄时(35dPI)对每只经鼻给予2mL105.0TCID50/mL的PRRSV wt-7株(每个鼻孔1mL)进行攻击。在从攻击起20天后的12周龄时(55dPI)进行剖检，采集肺。
[表16-1]
试验区的设定
Figure 856385DEST_PATH_IMAGE044
(2) 评价项目
i．体温测定
从0dPC到20dPC每天测定体温。
ii．血中病毒基因量
对于从1dPC到12dPC随时间采集的血液，通过实时PCR测定病毒基因量。
iii．通过ELISPOT进行的抗原特异性淋巴细胞活性评价
使用猪IFN-γ ELISpot BASIC (HRP) (MABTECH公司)。由从0dPC到20dPC随时间采集的血液调整PBMC，向PBMC悬浮液(3.0×105细胞/孔)中以2μg/孔添加PRRSV-rNp作为刺激抗原，在37℃的5%CO2培养箱中培养24小时。与刺激抗原反应而活化的淋巴细胞产生IFN-γ，并且其部位在孔上被识别为斑点。计量该斑点数，对抗原特异性猪IFN-γ产生诱导能力进行评价。
iv．通过ELISA进行的抗原特异性淋巴细胞的活性评价
通过使用猪IFNγ Mab、克隆P2F6 (Thermo Scientific公司)和生物素小鼠抗-猪IFNγ克隆P2C11 (BD Biosciences公司)的夹层ELISA检测猪IFN-γ。由从0dPC到20dPC随时间采集的血液调整PBMC，在PBMC悬浮液(2.0×106细胞/孔)中以20μg/孔添加PRRSV-rNp作为刺激抗原，在37℃的5%CO2培养箱中培养72小时。之后，回收上清，通过夹层ELISA检测猪IFN-γ。
v．病理组织学检查
对在20dPC采集的肺进行病理组织学检查，对病变程度进行打分。打分依据P. G.HALBUR等人. Comparison of the Pathogenicity of Two US Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus Isolates with that of the Lelystad Virus.Veterynary Pathology 32: 648-660 (1995)实施。
vi．通过ELISA进行的抗体诱导能力的评价
对于随时间采集的血清，通过ELISA测定抗SV-rNp抗体。使用HRP标记兔抗猪IgG (MPBiomedicals公司)作为二次抗体。
＜结果＞
i．体温测定
虽然存在个体间的偏差，但在免疫区攻击后的体温显示出低的趋势，在11dPC和12dPC中显著下降(图17-2)。
ii．血中病毒基因量
与对照区相比，免疫区的血中病毒基因量在1dPC中显著下降，但在6dPC以后为同等程度(图17-3)。
iii．通过ELISPOT进行的抗原特异性淋巴细胞的活性评价
在免疫区可见从0dCP到20dPC特异性地与PRRSV-rNp反应的淋巴细胞的活性，其程度在免疫区可见高的趋势(图17-4)。
iv．通过ELISA进行的抗原特异性淋巴细胞的活性评价
在免疫区可见从0dCP到20dPC特异性地与PRRSV-rNp反应的淋巴细胞的活性，其程度在免疫区可见高的趋势(图17-5)。
v．病理组织学检查
在免疫区可见肺病变分数低的趋势(图17-6)。
vi．通过ELISA进行的抗体诱导能力的评价
在第2次免疫以后(28dPI)，在免疫区可见特异抗体的诱导(图17-7)。攻击后，在免疫区抗体效价显著上升。
＜结论＞
在用PRRSV-rNp-DSS免疫的猪中可见PRRSV-rNp特异性的免疫应答，可见攻击后的发热、血中病毒基因量和肺病变减轻的趋势。
<110> 全国农业协同组合连合会
内田哲也
<120> 非人动物用抗原表面结合型脂质体疫苗
<130> PF638-PCT
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1230
<212> DNA
<213> 禽传染性支气管炎病毒
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1230)
<400> 1
atg gca agc ggt aag gca act gga aag aca gat gcc cca gcg cca gtc 48
Met Ala Ser Gly Lys Ala Thr Gly Lys Thr Asp Ala Pro Ala Pro Val
1 5 10 15
atc aaa cta gga gga cca aag cca cct aaa gtt ggt tct tcc gga aat 96
Ile Lys Leu Gly Gly Pro Lys Pro Pro Lys Val Gly Ser Ser Gly Asn
20 25 30
gca tct tgg ttt caa gca ata aaa gcc aag aag cta aat tca cct caa 144
Ala Ser Trp Phe Gln Ala Ile Lys Ala Lys Lys Leu Asn Ser Pro Gln
35 40 45
cct aag ttt gaa ggt agc ggt gtt cct gat aat gaa aat cta aaa aca 192
Pro Lys Phe Glu Gly Ser Gly Val Pro Asp Asn Glu Asn Leu Lys Thr
50 55 60
agc cag caa cat gga tac tgg aga cgc caa gct agg ttt aag cca agt 240
Ser Gln Gln His Gly Tyr Trp Arg Arg Gln Ala Arg Phe Lys Pro Ser
65 70 75 80
aaa ggc gga aga aaa cca gtc cca gat gct tgg tac ttc tat tat act 288
Lys Gly Gly Arg Lys Pro Val Pro Asp Ala Trp Tyr Phe Tyr Tyr Thr
85 90 95
gga aca gga cca gcc gct gac ctg aat tgg ggt gat agc caa gat ggt 336
Gly Thr Gly Pro Ala Ala Asp Leu Asn Trp Gly Asp Ser Gln Asp Gly
100 105 110
ata gtg tgg gtt gct gca aag ggt gct gat gtt aaa tct aga tct aac 384
Ile Val Trp Val Ala Ala Lys Gly Ala Asp Val Lys Ser Arg Ser Asn
115 120 125
cag ggt aca agg gac cct gac aag ttt gac caa tat ccg cta cga ttc 432
Gln Gly Thr Arg Asp Pro Asp Lys Phe Asp Gln Tyr Pro Leu Arg Phe
130 135 140
tcg gac gga gga cct gat ggt aat ttc cgt tgg gac ttc att cct ctg 480
Ser Asp Gly Gly Pro Asp Gly Asn Phe Arg Trp Asp Phe Ile Pro Leu
145 150 155 160
aat cgc ggt agg agt gga aga tca aca gca gct tca tca gca gca tct 528
Asn Arg Gly Arg Ser Gly Arg Ser Thr Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ser
165 170 175
agt aga gca ccg tcg cgt gaa ggc tcg cgt ggt cgt aga agt ggt tct 576
Ser Arg Ala Pro Ser Arg Glu Gly Ser Arg Gly Arg Arg Ser Gly Ser
180 185 190
gaa gat gat ctt att gct cgt gca gca aag ata atc cag gat cag cag 624
Glu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Ala Ala Lys Ile Ile Gln Asp Gln Gln
195 200 205
aag aag ggt tct cgc att act aag gct aag gct gat gaa atg gct cat 672
Lys Lys Gly Ser Arg Ile Thr Lys Ala Lys Ala Asp Glu Met Ala His
210 215 220
cgc cgg tat tgc aag cgc act att cca cct ggt tat aag gtt gat caa 720
Arg Arg Tyr Cys Lys Arg Thr Ile Pro Pro Gly Tyr Lys Val Asp Gln
225 230 235 240
gtc ttt ggt ccc cgt act aaa ggt aag gag gga aat ttt ggt gat gac 768
Val Phe Gly Pro Arg Thr Lys Gly Lys Glu Gly Asn Phe Gly Asp Asp
245 250 255
aag atg aat gag gaa ggt att aag gat ggg cgt gtt aca gca atg ctc 816
Lys Met Asn Glu Glu Gly Ile Lys Asp Gly Arg Val Thr Ala Met Leu
260 265 270
aac cta gtc cca agc agc cat gct tgt ctt ttt gga agt aga gtg acg 864
Asn Leu Val Pro Ser Ser His Ala Cys Leu Phe Gly Ser Arg Val Thr
275 280 285
ccc aaa ctt caa cca gat ggg ctg cac ttg aaa ttt gaa ttt gtt act 912
Pro Lys Leu Gln Pro Asp Gly Leu His Leu Lys Phe Glu Phe Val Thr
290 295 300
gtg gtt tca cgt gat gat ccg cag ttt gat aat tat gtg aaa att tgt 960
Val Val Ser Arg Asp Asp Pro Gln Phe Asp Asn Tyr Val Lys Ile Cys
305 310 315 320
gat cag tgt gtc gat ggt gta gga acg cgt cca aaa gat gac gaa ccg 1008
Asp Gln Cys Val Asp Gly Val Gly Thr Arg Pro Lys Asp Asp Glu Pro
325 330 335
aga cca aag tca cgc tca agt tca aga cct gct aca aga aca agt tct 1056
Arg Pro Lys Ser Arg Ser Ser Ser Arg Pro Ala Thr Arg Thr Ser Ser
340 345 350
ccg gcg cca aaa caa cag cgc cct aag aag gag aaa aag tta aag aag 1104
Pro Ala Pro Lys Gln Gln Arg Pro Lys Lys Glu Lys Lys Leu Lys Lys
355 360 365
cag gat gat gaa gtg gat aaa gcg ttg acc tca gat gag gag agg aac 1152
Gln Asp Asp Glu Val Asp Lys Ala Leu Thr Ser Asp Glu Glu Arg Asn
370 375 380
aat gca cag ctg gag ttt gat gat gaa ccc aag gtg att aac tgg ggt 1200
Asn Ala Gln Leu Glu Phe Asp Asp Glu Pro Lys Val Ile Asn Trp Gly
385 390 395 400
gac tca gca ctt ggt gaa aat gaa ctt tga 1230
Asp Ser Ala Leu Gly Glu Asn Glu Leu
405
<210> 2
<211> 409
<212> PRT
<213> 禽传染性支气管炎病毒
<400> 2
Met Ala Ser Gly Lys Ala Thr Gly Lys Thr Asp Ala Pro Ala Pro Val
1 5 10 15
Ile Lys Leu Gly Gly Pro Lys Pro Pro Lys Val Gly Ser Ser Gly Asn
20 25 30
Ala Ser Trp Phe Gln Ala Ile Lys Ala Lys Lys Leu Asn Ser Pro Gln
35 40 45
Pro Lys Phe Glu Gly Ser Gly Val Pro Asp Asn Glu Asn Leu Lys Thr
50 55 60
Ser Gln Gln His Gly Tyr Trp Arg Arg Gln Ala Arg Phe Lys Pro Ser
65 70 75 80
Lys Gly Gly Arg Lys Pro Val Pro Asp Ala Trp Tyr Phe Tyr Tyr Thr
85 90 95
Gly Thr Gly Pro Ala Ala Asp Leu Asn Trp Gly Asp Ser Gln Asp Gly
100 105 110
Ile Val Trp Val Ala Ala Lys Gly Ala Asp Val Lys Ser Arg Ser Asn
115 120 125
Gln Gly Thr Arg Asp Pro Asp Lys Phe Asp Gln Tyr Pro Leu Arg Phe
130 135 140
Ser Asp Gly Gly Pro Asp Gly Asn Phe Arg Trp Asp Phe Ile Pro Leu
145 150 155 160
Asn Arg Gly Arg Ser Gly Arg Ser Thr Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ser
165 170 175
Ser Arg Ala Pro Ser Arg Glu Gly Ser Arg Gly Arg Arg Ser Gly Ser
180 185 190
Glu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Ala Ala Lys Ile Ile Gln Asp Gln Gln
195 200 205
Lys Lys Gly Ser Arg Ile Thr Lys Ala Lys Ala Asp Glu Met Ala His
210 215 220
Arg Arg Tyr Cys Lys Arg Thr Ile Pro Pro Gly Tyr Lys Val Asp Gln
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Val Phe Gly Pro Arg Thr Lys Gly Lys Glu Gly Asn Phe Gly Asp Asp
245 250 255
Lys Met Asn Glu Glu Gly Ile Lys Asp Gly Arg Val Thr Ala Met Leu
260 265 270
Asn Leu Val Pro Ser Ser His Ala Cys Leu Phe Gly Ser Arg Val Thr
275 280 285
Pro Lys Leu Gln Pro Asp Gly Leu His Leu Lys Phe Glu Phe Val Thr
290 295 300
Val Val Ser Arg Asp Asp Pro Gln Phe Asp Asn Tyr Val Lys Ile Cys
305 310 315 320
Asp Gln Cys Val Asp Gly Val Gly Thr Arg Pro Lys Asp Asp Glu Pro
325 330 335
Arg Pro Lys Ser Arg Ser Ser Ser Arg Pro Ala Thr Arg Thr Ser Ser
340 345 350
Pro Ala Pro Lys Gln Gln Arg Pro Lys Lys Glu Lys Lys Leu Lys Lys
355 360 365
Gln Asp Asp Glu Val Asp Lys Ala Leu Thr Ser Asp Glu Glu Arg Asn
370 375 380
Asn Ala Gln Leu Glu Phe Asp Asp Glu Pro Lys Val Ile Asn Trp Gly
385 390 395 400
Asp Ser Ala Leu Gly Glu Asn Glu Leu
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atg gaa aat tgc aca ctt aac tca gag cag gca att ctg ctt ttt aaa 48
Met Glu Asn Cys Thr Leu Asn Ser Glu Gln Ala Ile Leu Leu Phe Lys
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gag tat aat tta ttt ata acc gca ttc ctg ttg ttc cta acc ata cta 96
Glu Tyr Asn Leu Phe Ile Thr Ala Phe Leu Leu Phe Leu Thr Ile Leu
20 25 30
ctt cag tat gga tac gca act agg agc cgg gtt att tac ata ctg aaa 144
Leu Gln Tyr Gly Tyr Ala Thr Arg Ser Arg Val Ile Tyr Ile Leu Lys
35 40 45
atg ata gtg tta tgg tgc ttt tgg ccc ctc aac att gca gta ggt gta 192
Met Ile Val Leu Trp Cys Phe Trp Pro Leu Asn Ile Ala Val Gly Val
50 55 60
att tca tgt ata tac cca cca aac aca gga ggt ctt gtc gca gcg ata 240
Ile Ser Cys Ile Tyr Pro Pro Asn Thr Gly Gly Leu Val Ala Ala Ile
65 70 75 80
ata ctt aca gtg ttt gcg tgt ctt tct ttt gta ggt tat tgg att cag 288
Ile Leu Thr Val Phe Ala Cys Leu Ser Phe Val Gly Tyr Trp Ile Gln
85 90 95
agt ttt aga ctc ttt aaa agg tgt aga tct tgg tgg tcc ttt aac ccc 336
Ser Phe Arg Leu Phe Lys Arg Cys Arg Ser Trp Trp Ser Phe Asn Pro
100 105 110
gaa tcc aat gcc gta ggt tca ata ctt ctt aca aat ggt caa caa tgt 384
Glu Ser Asn Ala Val Gly Ser Ile Leu Leu Thr Asn Gly Gln Gln Cys
115 120 125
aat ttt gct ata gag agt gta cct atg gta cta tct cct att att aag 432
Asn Phe Ala Ile Glu Ser Val Pro Met Val Leu Ser Pro Ile Ile Lys
130 135 140
aat ggt gct ctt tat tgt gaa ggt cag tgg ctt gct aaa tgt gaa cca 480
Asn Gly Ala Leu Tyr Cys Glu Gly Gln Trp Leu Ala Lys Cys Glu Pro
145 150 155 160
gac cac ttg cct aga gat att ttt gtt tgc aca cct gat aga cgt aat 528
Asp His Leu Pro Arg Asp Ile Phe Val Cys Thr Pro Asp Arg Arg Asn
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atc tat cgt atg gtg cag aaa tac act ggt gac caa agc gga aat aag 576
Ile Tyr Arg Met Val Gln Lys Tyr Thr Gly Asp Gln Ser Gly Asn Lys
180 185 190
aaa agg ttt gct aca ttt gtc tat gca aag cag tca gta gac act ggc 624
Lys Arg Phe Ala Thr Phe Val Tyr Ala Lys Gln Ser Val Asp Thr Gly
195 200 205
gag cta gaa agt gta gca aca gga ggg ggt agt ctt tac aca taa 669
Glu Leu Glu Ser Val Ala Thr Gly Gly Gly Ser Leu Tyr Thr
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<213> 禽传染性支气管炎病毒
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Met Glu Asn Cys Thr Leu Asn Ser Glu Gln Ala Ile Leu Leu Phe Lys
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Glu Tyr Asn Leu Phe Ile Thr Ala Phe Leu Leu Phe Leu Thr Ile Leu
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Leu Gln Tyr Gly Tyr Ala Thr Arg Ser Arg Val Ile Tyr Ile Leu Lys
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Met Ile Val Leu Trp Cys Phe Trp Pro Leu Asn Ile Ala Val Gly Val
50 55 60
Ile Ser Cys Ile Tyr Pro Pro Asn Thr Gly Gly Leu Val Ala Ala Ile
65 70 75 80
Ile Leu Thr Val Phe Ala Cys Leu Ser Phe Val Gly Tyr Trp Ile Gln
85 90 95
Ser Phe Arg Leu Phe Lys Arg Cys Arg Ser Trp Trp Ser Phe Asn Pro
100 105 110
Glu Ser Asn Ala Val Gly Ser Ile Leu Leu Thr Asn Gly Gln Gln Cys
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Asn Gly Ala Leu Tyr Cys Glu Gly Gln Trp Leu Ala Lys Cys Glu Pro
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Asp His Leu Pro Arg Asp Ile Phe Val Cys Thr Pro Asp Arg Arg Asn
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Ile Tyr Arg Met Val Gln Lys Tyr Thr Gly Asp Gln Ser Gly Asn Lys
180 185 190
Lys Arg Phe Ala Thr Phe Val Tyr Ala Lys Gln Ser Val Asp Thr Gly
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atc aaa cta gga gga cca aag cca cct aaa gtt ggt tct tcc gga aat 96
Ile Lys Leu Gly Gly Pro Lys Pro Pro Lys Val Gly Ser Ser Gly Asn
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gca tct tgg ttt caa gca ata aaa gcc aag aag cta aat tca cct caa 144
Ala Ser Trp Phe Gln Ala Ile Lys Ala Lys Lys Leu Asn Ser Pro Gln
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cct aag ttt gaa ggt agc ggt gtt cct gat aat gaa aat cta aaa aca 192
Pro Lys Phe Glu Gly Ser Gly Val Pro Asp Asn Glu Asn Leu Lys Thr
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Ser Gln Gln His Gly Tyr Trp Arg Arg Gln Ala Arg Phe Lys Pro Ser
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aaa ggc gga aga aaa cca gtc cca gat gct tgg tac ttc tat tat act 288
Lys Gly Gly Arg Lys Pro Val Pro Asp Ala Trp Tyr Phe Tyr Tyr Thr
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gga aca gga cca gcc gct gac ctg aat tgg ggt gat agc caa gat ggt 336
Gly Thr Gly Pro Ala Ala Asp Leu Asn Trp Gly Asp Ser Gln Asp Gly
100 105 110
ata gtg tgg gtt gct gca aag ggt gct gat gtt aaa tct aga tct aac 384
Ile Val Trp Val Ala Ala Lys Gly Ala Asp Val Lys Ser Arg Ser Asn
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cag ggt aca agg gac cct gac aag ttt gac caa tat 420
Gln Gly Thr Arg Asp Pro Asp Lys Phe Asp Gln Tyr
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Met Ala Ser Gly Lys Ala Thr Gly Lys Thr Asp Ala Pro Ala Pro Val
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Ile Lys Leu Gly Gly Pro Lys Pro Pro Lys Val Gly Ser Ser Gly Asn
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Ala Ser Trp Phe Gln Ala Ile Lys Ala Lys Lys Leu Asn Ser Pro Gln
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Gln Gly Thr Arg Asp Pro Asp Lys Phe Asp Gln Tyr
130 135 140
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<211> 420
<212> DNA
<213> 禽传染性支气管炎病毒
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(420)
<400> 7
tgg tac ttc tat tat act gga aca gga cca gcc gct gac ctg aat tgg 48
Trp Tyr Phe Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Pro Ala Ala Asp Leu Asn Trp
1 5 10 15
ggt gat agc caa gat ggt ata gtg tgg gtt gct gca aag ggt gct gat 96
Gly Asp Ser Gln Asp Gly Ile Val Trp Val Ala Ala Lys Gly Ala Asp
20 25 30
gtt aaa tct aga tct aac cag ggt aca agg gac cct gac aag ttt gac 144
Val Lys Ser Arg Ser Asn Gln Gly Thr Arg Asp Pro Asp Lys Phe Asp
35 40 45
caa tat ccg cta cga ttc tcg gac gga gga cct gat ggt aat ttc cgt 192
Gln Tyr Pro Leu Arg Phe Ser Asp Gly Gly Pro Asp Gly Asn Phe Arg
50 55 60
tgg gac ttc att cct ctg aat cgc ggt agg agt gga aga tca aca gca 240
Trp Asp Phe Ile Pro Leu Asn Arg Gly Arg Ser Gly Arg Ser Thr Ala
65 70 75 80
gct tca tca gca gca tct agt aga gca ccg tcg cgt gaa ggc tcg cgt 288
Ala Ser Ser Ala Ala Ser Ser Arg Ala Pro Ser Arg Glu Gly Ser Arg
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ggt cgt aga agt ggt tct gaa gat gat ctt att gct cgt gca gca aag 336
Gly Arg Arg Ser Gly Ser Glu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Ala Ala Lys
100 105 110
ata atc cag gat cag cag aag aag ggt tct cgc att act aag gct aag 384
Ile Ile Gln Asp Gln Gln Lys Lys Gly Ser Arg Ile Thr Lys Ala Lys
115 120 125
gct gat gaa atg gct cat cgc cgg tat tgc aag cgc 420
Ala Asp Glu Met Ala His Arg Arg Tyr Cys Lys Arg
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Ile Ile Gln Asp Gln Gln Lys Lys Gly Ser Arg Ile Thr Lys Ala Lys
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Ser Arg Glu Gly Ser Arg Gly Arg Arg Ser Gly Ser Glu Asp Asp Leu
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att gct cgt gca gca aag ata atc cag gat cag cag aag aag ggt tct 96
Ile Ala Arg Ala Ala Lys Ile Ile Gln Asp Gln Gln Lys Lys Gly Ser
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cgc att act aag gct aag gct gat gaa atg gct cat cgc cgg tat tgc 144
Arg Ile Thr Lys Ala Lys Ala Asp Glu Met Ala His Arg Arg Tyr Cys
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aag cgc act att cca cct ggt tat aag gtt gat caa gtc ttt ggt ccc 192
Lys Arg Thr Ile Pro Pro Gly Tyr Lys Val Asp Gln Val Phe Gly Pro
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cgt act aaa ggt aag gag gga aat ttt ggt gat gac aag atg aat gag 240
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Glu Gly Ile Lys Asp Gly Arg Val Thr Ala Met Leu Asn Leu Val Pro
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<213> 禽传染性支气管炎病毒
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Ile Ala Arg Ala Ala Lys Ile Ile Gln Asp Gln Gln Lys Lys Gly Ser
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Lys Arg Thr Ile Pro Pro Gly Tyr Lys Val Asp Gln Val Phe Gly Pro
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Arg Thr Lys Gly Lys Glu Gly Asn Phe Gly Asp Asp Lys Met Asn Glu
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<212> DNA
<213> 禽传染性支气管炎病毒
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(420)
<400> 11
atg ctc aac cta gtc cca agc agc cat gct tgt ctt ttt gga agt aga 48
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gtt act gtg gtt tca cgt gat gat ccg cag ttt gat aat tat gtg aaa 144
Val Thr Val Val Ser Arg Asp Asp Pro Gln Phe Asp Asn Tyr Val Lys
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Trp Gly Asp Ser Ala Leu Gly Glu Asn Glu Leu
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<210> 12
<211> 139
<212> PRT
<213> 禽传染性支气管炎病毒
<400> 12
Met Leu Asn Leu Val Pro Ser Ser His Ala Cys Leu Phe Gly Ser Arg
1 5 10 15
Val Thr Pro Lys Leu Gln Pro Asp Gly Leu His Leu Lys Phe Glu Phe
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Val Thr Val Val Ser Arg Asp Asp Pro Gln Phe Asp Asn Tyr Val Lys
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130 135
<210> 13
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合蛋白 Ch(N+M)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(657)
<400> 13
aaa ggc gga aga aaa cca gtc cca gat gct tgg tac ttc tat tat act 48
Lys Gly Gly Arg Lys Pro Val Pro Asp Ala Trp Tyr Phe Tyr Tyr Thr
1 5 10 15
gga aca gga cca gcc gct gac ctg aat tgg ggt gat agc caa gat ggt 96
Gly Thr Gly Pro Ala Ala Asp Leu Asn Trp Gly Asp Ser Gln Asp Gly
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Gln Gly Thr Arg Asp Pro Asp Lys Phe Asp Gln Tyr Pro Leu Arg Phe
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Ser Asp Gly Gly Pro Asp Gly Asn Phe Arg Trp Asp Phe Ile Pro Leu
65 70 75 80
aat cgc ggt agg agt gga aga tca aca gca gct tca tca gca gca tct 288
Asn Arg Gly Arg Ser Gly Arg Ser Thr Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ser
85 90 95
agt aga gca ccg tcg cgt gaa ggc tcg cgt ggt cgt aga agt ggt tct 336
Ser Arg Ala Pro Ser Arg Glu Gly Ser Arg Gly Arg Arg Ser Gly Ser
100 105 110
gaa gat gat ctt att gct cgt gca gca aag ata atc cag gat cag cag 384
Glu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Ala Ala Lys Ile Ile Gln Asp Gln Gln
115 120 125
aag aag ggt tct cgc att act aag gct aag gct gat gaa atg gct cat 432
Lys Lys Gly Ser Arg Ile Thr Lys Ala Lys Ala Asp Glu Met Ala His
130 135 140
cgc cgg tat tgc aag cgc ggt cag tgg ctt gct aaa tgt gaa cca gac 480
Arg Arg Tyr Cys Lys Arg Gly Gln Trp Leu Ala Lys Cys Glu Pro Asp
145 150 155 160
cac ttg cct aga gat att ttt gtt tgc aca cct gat aga cgt aat atc 528
His Leu Pro Arg Asp Ile Phe Val Cys Thr Pro Asp Arg Arg Asn Ile
165 170 175
tat cgt atg gtg cag aaa tac act ggt gac caa agc gga aat aag aaa 576
Tyr Arg Met Val Gln Lys Tyr Thr Gly Asp Gln Ser Gly Asn Lys Lys
180 185 190
agg ttt gct aca ttt gtc tat gca aag cag tca gta gac act ggc gag 624
Arg Phe Ala Thr Phe Val Tyr Ala Lys Gln Ser Val Asp Thr Gly Glu
195 200 205
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Leu Glu Ser Val Ala Thr Gly Gly Gly Ser Leu
210 215
<210> 14
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Lys Gly Gly Arg Lys Pro Val Pro Asp Ala Trp Tyr Phe Tyr Tyr Thr
1 5 10 15
Gly Thr Gly Pro Ala Ala Asp Leu Asn Trp Gly Asp Ser Gln Asp Gly
20 25 30
Ile Val Trp Val Ala Ala Lys Gly Ala Asp Val Lys Ser Arg Ser Asn
35 40 45
Gln Gly Thr Arg Asp Pro Asp Lys Phe Asp Gln Tyr Pro Leu Arg Phe
50 55 60
Ser Asp Gly Gly Pro Asp Gly Asn Phe Arg Trp Asp Phe Ile Pro Leu
65 70 75 80
Asn Arg Gly Arg Ser Gly Arg Ser Thr Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ser
85 90 95
Ser Arg Ala Pro Ser Arg Glu Gly Ser Arg Gly Arg Arg Ser Gly Ser
100 105 110
Glu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Ala Ala Lys Ile Ile Gln Asp Gln Gln
115 120 125
Lys Lys Gly Ser Arg Ile Thr Lys Ala Lys Ala Asp Glu Met Ala His
130 135 140
Arg Arg Tyr Cys Lys Arg Gly Gln Trp Leu Ala Lys Cys Glu Pro Asp
145 150 155 160
His Leu Pro Arg Asp Ile Phe Val Cys Thr Pro Asp Arg Arg Asn Ile
165 170 175
Tyr Arg Met Val Gln Lys Tyr Thr Gly Asp Gln Ser Gly Asn Lys Lys
180 185 190
Arg Phe Ala Thr Phe Val Tyr Ala Lys Gln Ser Val Asp Thr Gly Glu
195 200 205
Leu Glu Ser Val Ala Thr Gly Gly Gly Ser Leu
210 215
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
gcgtgtacct ctctagtat 19
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
gctacatgcc tatctbcctt a 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
ggtagaaaac ttaacaatcc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
aagactactt cctcctgttg 20
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
aaggcctctg tcgacatggc aagcggtaag g 31
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
agaattcgca agctttcaaa gttcattttc accaa 35
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
aaggcctctg tcgacatgga aaattgcaca cttaac 36
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
agaattcgca agcttttatg tgtaaagact accccc 36
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
taatacgact cactataggg 20
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
atgctagtta ttgctcagcg g 21
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
cccgaaaagt gccacctg 18
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
gttctgaggt cattactgg 19
<210> 27
<211> 372
<212> DNA
<213> 猪繁殖与呼吸综合征病毒
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(372)
<400> 27
atg cca aat aac aac ggc aaa cag cag aag aaa agg aag ggg aac ggc 48
Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Lys Arg Lys Gly Asn Gly
1 5 10 15
cag cca gtc aat cag ctg tgc cag atg ctg ggt aag att atc gcc cag 96
Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln
20 25 30
cag aac cag tct aga ggt aag gga ccg gga aac aga aac aag aag aaa 144
Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Asn Arg Asn Lys Lys Lys
35 40 45
aac ccg gag aag ccc cat ttc cct cta gcg act gaa gat gac gtc aga 192
Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg
50 55 60
cac cac ttc acc cct agt gag cgg caa ttg tgt ttg tcg tca atc cat 240
His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile His
65 70 75 80
act gcc ttt aat cag ggc gct gga act tgt acc ctg tca gac tca ggg 288
Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly
85 90 95
aga ata agt tac act gtg gag ttt agt ttg cct acg cat cat acc gtg 336
Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val
100 105 110
cgc cta att cgc gtc ata tca tca ccc tca gca tga 372
Arg Leu Ile Arg Val Ile Ser Ser Pro Ser Ala
115 120
<210> 28
<211> 123
<212> PRT
<213> 猪繁殖与呼吸综合征病毒
<400> 28
Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Lys Arg Lys Gly Asn Gly
1 5 10 15
Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln
20 25 30
Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Asn Arg Asn Lys Lys Lys
35 40 45
Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg
50 55 60
His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile His
65 70 75 80
Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly
85 90 95
Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val
100 105 110
Arg Leu Ile Arg Val Ile Ser Ser Pro Ser Ala
115 120
<210> 29
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
ccccatatgg ccatgccaaa taacaacggc aa 32
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
tttggatcct catgctgagg gtgatgata 29

Claims (19)

1.非人动物用疫苗，该疫苗包含脂质体，所述脂质体在表面结合有源自非人动物所感染的病原体的抗原分子。
2.权利要求1所述的疫苗，其中，抗原分子为多肽。
3.权利要求2所述的疫苗，其中，病原体为具有包膜的病毒，抗原分子为核衣壳蛋白。
4.权利要求1～3中任一项所述的疫苗，其中，非人动物为家畜或家禽。
5.权利要求1～3中任一项所述的疫苗，其中，非人动物为鸟类。
6.权利要求4或5所述的疫苗，其中，病原体为传染性支气管炎病毒。
7.权利要求6所述的疫苗，其中，抗原分子为传染性支气管炎病毒的全长核衣壳蛋白。
8. 权利要求7所述的疫苗，其中，上述全长核衣壳蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列、或者是在该氨基酸序列中有1～多个氨基酸被取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列。
9.权利要求1～8中任一项所述的疫苗，该疫苗为喷雾给药制剂、散雾给药制剂、滴鼻给药制剂、滴眼给药制剂、肌肉注射给药制剂或卵内给药制剂。
10.权利要求9所述的疫苗，该疫苗为喷雾给药制剂。
11.权利要求10所述的疫苗，该疫苗以120μm以下的液滴粒径进行喷雾给药。
12.权利要求1～3中任一项所述的疫苗，其中，非人动物为猪。
13.权利要求12所述的疫苗，其中，病原体为猪繁殖/呼吸障碍综合征病毒。
14.权利要求13所述的疫苗，其中，抗原分子为猪繁殖/呼吸障碍综合征病毒的核衣壳蛋白。
15. 权利要求14所述的疫苗，其中，上述核衣壳蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO: 28所示的氨基酸序列、或者是在该氨基酸序列中有1～多个氨基酸被取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列。
16.权利要求1～4和12～15中任一项所述的疫苗，该疫苗通过静脉内给药、皮下给药、皮内给药、肌肉内给药、经鼻给药、经皮给药、经直肠给药、经呼吸道给药、吸入给药或滴眼给药来使用。
17.权利要求1～16中任一项所述的疫苗，其中，抗原分子通过共价键结合在脂质体表面。
18.权利要求17所述的疫苗，其中，抗原分子通过辛二酸交联结合在脂质体表面。
19.权利要求1～18中任一项所述的疫苗，该疫苗以相隔至少1周的间隔对非人动物个体给药2次以上。
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