JPWO2019146716A1 - 非ヒト動物用抗原表面結合型リポソームワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
伝染性気管支炎ウイルス(IBV)
鳥インフルエンザウイルス(AIV)
ニューカッスル病ウイルス(NDV)
伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)
マレック病ウイルス(MDV)
鶏白血病ウイルス(ALV)
伝染性ファブリキウス嚢ウイルス(IBDV)
鶏痘ウイルス(FPV)
鶏脳脊髄炎ウイルス(AEV)
鶏アデノウイルス(FAV)
産卵低下症候群-1976ウイルス(EDS)
トリレオウイルス(ARV)
鶏貧血ウイルス(CAV)
鶏腎炎ウイルス(ANV)
細網内皮症ウイルス(REV)
トリメタニューモウイルス(AMPV)
マイコプラズマ・ガリセプティカム(MG)
マイコプラズマ・シノビエ(MS)
サルモネラ・プローラム(SP)
サルモネラ・ガリナーラム(SG)
サルモネラ・エンテリティディス(SE)
サルモネラ・ティフィムリウム(ST)
サルモネラ・インファンティス(SI)
大腸菌(E.coli)
アビバクテリウム・パラガリナルム(H.pg)
アイメリア属原虫
ロイコチトゾーン・カウレリー
オーエスキー病ウイルス(ADV)
伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)
豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス(PRRSV)
豚流行性下痢ウイルス(PEDV)
豚インフルエンザウイルス(SIV)
豚サーコウイルス2型(PCV2)
豚パルボウイルス(PPV)
日本脳炎ウイルス(JEV)
豚ロタウイルス(PRV)
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ(Mhp)
マイコプラズマ・ハイオライニス(Mhr)
サルモネラ・コレラスイス(SC)
アクチノバチラス・プルロニューモニエ(App)
豚丹毒(Ery)
ボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bb)
パスツレラ・マルトシダ(Pm)
ブラキスピラ・ハイオディセンテリアエ(Bra-hyo)
ヘモフィルス・パラスイス(Hps)
ローソニア・イントラセルラリス(Li)
アカバネ病ウイルス(AKAV)
チュウザン病ウイルス(KASV)
アイノウイルス(AINOV)
イバラキ病ウイルス(IBAV)
牛ウイルス性下痢・粘膜病ウイルス(BVDV)
牛伝染性鼻気管炎ウイルス(IBRV)
牛流行熱ウイルス(BEFV)
牛白血病ウイルス(BLV)
牛RSウイルス(BRSV)
牛パラインフルエンザウイルス3型(BPIV3)
牛アデノウイルス7型(BAV3)
マイコプラズマ・ボビス(M.bovis)
マイコプラズマ・ボビライニス(M.bovirhinis)
マイコプラズマ・ボビジェニタリウム(M.bovigenitalium)
マイコプラズマ・ディスパー(M.disper)
マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス(MAP)
ヒストフィルス・ソムニ(Hs)
マンヘミア・ヘモリチカ(Mh)
(A) 不飽和結合を1個有する炭素数14〜24のアシル基、又は不飽和結合を1個有する炭素数14〜24の炭化水素基を有するリン脂質(以下、上記アシル基を「不飽和アシル基」、上記炭化水素基を「不飽和炭化水素基」と呼ぶことがある。)
(B) リポソームの安定化剤
酸性リン脂質の含有量は、通常質1〜85モル%、好ましくは2〜80モル%、より好ましくは4〜60モル%、更に好ましくは5〜40モル%である。
反応性リン脂質の含有量は、通常0.2〜80モル%、好ましくは0.3〜60モル%、より好ましくは0.4〜50モル%、更に好ましくは0.5〜25モル%である。
反応性リン脂質:ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)
中性リン脂質:ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)
酸性リン脂質:ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)
リポソーム安定化剤:コレステロール
<目的>
伝染性気管支炎ウイルス(以下、IBV)リポソームワクチンを作製するため、その抗原としてIBV株間で比較的保存性の高いヌクレオカプシド(N)タンパク質およびメンブレン(M)タンパク質の全長を遺伝子組換え大腸菌を用いて作製した。
(1)抗原領域の探索
比較的保存性が高いことが報告されているIBVのNタンパク質およびMタンパク質を抗原候補領域とした。近年のIBV国内分離株11株について、シークエンス解析によって相同性を評価して、抗原のテンプレートとするIBVを決定した。
抗原領域の探索で使用したプライマーは下記の通りである。
Nタンパク質Fw: GCGTGTACCTCTCTAGTAT(配列番号15)
Nタンパク質Rv: GCTACATGCCTATCTBCCTTA(B=G/T/C)(配列番号16)
Mタンパク質Fw: GGTAGAAAACTTAACAATCC(配列番号17)
Mタンパク質Rv: AAGACTACTTCCTCCTGTTG(配列番号18)
上記(1)で決定した抗原領域の全長をRT-PCR法で増幅させた後、ベクター(N末端Hisタグ標識プラスミド)に挿入した。このプラスミドをクローニング用大腸菌に導入して形質転換させた。ついで、PCRで目的遺伝子の挿入を確認できた大腸菌からプラスミドを抽出し、これをタンパク質発現用大腸菌に導入して形質転換させた。ついで、培養した発現用大腸菌に対しIPTG添加による発現誘導を行い、組換えタンパク質を発現させた。超音波処理で菌体を破壊した後、Hisタグによるアフィニティー精製を行った。精製後の溶液について総タンパク質の濃度を測定した。SDS-PAGEを行い、想定される分子量の位置にタンパク質が発現していることを確認した。
RT-PCR及び目的遺伝子挿入の確認のPCRに使用したプライマーは下記の通りである。
[RT-PCR]
Nタンパク質Fw: AAGGCCTCTGTCGACATGGCAAGCGGTAAGG(配列番号19、下線はSalI認識部位)
Nタンパク質Rv: AGAATTCGCAAGCTTTCAAAGTTCATTTTCACCAA(配列番号20、下線はHindIII認識部位)
Mタンパク質Fw: AAGGCCTCTGTCGACATGGAAAATTGCACACTTAAC(配列番号21、下線はSalI認識部位)
Mタンパク質Rv: AGAATTCGCAAGCTTTTATGTGTAAAGACTACCCCC(配列番号22、下線はHindIII認識部位)
[目的遺伝子挿入の確認]
Nタンパク質Fw: TAATACGACTCACTATAGGG(配列番号23)
Nタンパク質Rv: ATGCTAGTTATTGCTCAGCGG(配列番号24)
Mタンパク質Fw: CCCGAAAAGTGCCACCTG(配列番号25)
Mタンパク質Rv: GTTCTGAGGTCATTACTGG(配列番号26)
使用した試薬・機器類は下記の通りである。
核酸抽出: QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN社)
PCR装置: PCR Thermal Cycler Dice(登録商標) Gradient(TP600) (TaKaRa社)
DNAのゲル精製: QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)
ベクタープラスミド: Nタンパク質にはpET-6xHN-N(Clontech社)を、Mタンパク質にはpQE-31(Qiagen社)を使用した。
コンピテントセル: Nタンパク質にはBL21(DE3)pLySs株(Invitrogen社)を、Mタンパク質にはXL1-Blue株(ニッポン・ジーン社)を使用した。
ライゲーション: Nタンパク質にはIn-Fusion(登録商標) HD Cloning Kit(Clontech社)を、Mタンパク質にはDNA Ligation Kit (TaKaRa社)を使用した。
タンパク質発現誘導: IPTG(TaKaRa社)
シークエンス解析: 株式会社ファスマック又は株式会社バイオマトリックス研究所に外注依頼
Hisタグによるアフィニティー精製: Profiniaタンパク質精製システム(バイオ・ラッド社)
(1)抗原領域の探索
近年の国内分離株11株(Mタンパク質は10株)について、株間におけるNおよびMタンパク質領域全長のアミノ酸相同性を比較した結果、Nタンパク質は93〜99%、Mタンパク質は90〜99%の一致率であり、いずれも株間で高度に保存されていることが確認された(表1−1、表1−2)。このことから、いずれのIBV由来のNあるいはMタンパク質をリポソームワクチンの抗原としても有効性を認めることが期待できたが、既に当所での感染試験系が確立しているIBV Chiba(2004)をテンプレートに決定した。発現領域の塩基配列は配列番号1(Nタンパク質)及び配列番号3(Mタンパク質)のとおりであり、コードされるNタンパク質及びMタンパク質のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号2及び配列番号4のとおりである。
ア.遺伝子組換え大腸菌の作製
IBV Chiba(2004)から抽出したtotal RNAを鋳型としてRT-PCRを行い、目的とする遺伝子断片の増幅を確認した。組換えNタンパク質(IBV-rNp)については、アンプリコンとプラスミドベクター(pET6xHN-N)をそれぞれ同じ2種類の制限酵素領域(SalIおよびHindIII)でライゲーションした後、シークエンス解析で正常に挿入されていることを確認した。このプラスミドベクターをクローニング用大腸菌(DH5α)に形質転換した後、培養して増幅したプラスミドを回収した。これを発現用大腸菌BL21(DE3)pLySs株に形質転換して、IBV-rNp発現用組換え大腸菌を作製した。組換えMタンパク質(IBV-rMp)については、上記のプラスミドベクターと発現用大腸菌の組み合わせでは発現しなかったため、プラスミドベクターにpQE-31、発現用大腸菌にXL1-BLUEの組み合わせとすることでrMpの発現を確認した。
アンピシリン添加液体LB培地で前培養した菌液をTB培地に1/100量添加し、37℃で3時間振盪培養した。培養スケールは、IBV-rNpは3L、IBV-rMpは300mlで実施した。培養開始後O.D.600が0.5に達した時点で、終濃度1mM IPTG(final 1mM)を添加して発現誘導を行い、さらに3時間振盪培養した。3000rpm,30min,4℃で遠心後、菌体ペレットを回収し、ソニケーションバッファーを添加した。これを超音波処理して菌体を破砕して回収した組換えタンパク質を含むクルードなタンパク質溶液についてアフィニティー精製を行い、目的とする組換えタンパク質を回収した。タンパク質濃度測定の結果、今回作製した組換えタンパク質の総量は、少なくともIBV-rNpは300mg以上、IBV-rMpは40mg以上であることが推測された。IBV-rNpとIBV-rMpの推定分子量はそれぞれ約49kDa、29kDaであり、抗原へのタグ修飾(His-tag)の影響から、SDS-PAGEにおける見かけの分子量は数kDa大きくなることが知られているが、SDS-PAGEの結果、いずれも推定分子量に近い位置に明瞭なバンドが確認できた(図1−1、図1−2)。
遺伝子組換え大腸菌を用いて、IBV Chiba(2004)を鋳型とするIBV-rNpおよびIBV-rMpを作製した。これらの組換えタンパク質のIBVに対する免疫原性については以降の動物試験で評価する。
<目的>
上記1.で作製したIBV由来の組換え抗原2種(IBV-rNpおよびIBV-rMp)についてリポソーム化処理を行いリポソームワクチンを作製した。
(1)組換え抗原のリポソーム化
ジスクシンイミジルスベレート(DDS)法あるいはグルタルアルデヒド(GA)法によって抗原とリポソームを結合した。下記のプロトコルにより試験ワクチン(IBV-rNp-GAおよびIBV-rMp-GA)を作製した。
ア.材料
(a) 抗原:IBV-rNpおよびIBV-rMp。1coupling反応あたり5mg(10mg/ml×0.5ml)使用。
(b) リポソーム:DDS結合オレイン酸リポソーム。1 coupling反応あたり90mg lipid使用。
(c) Sepharose TM CL-4B(4%架橋アガロース)
(d) リポソームバッファー:8%ショ糖加PBS、pH7.2
(a) 凍結乾燥されたDSS結合オレイン酸リポソームを2mlのリポソームバッファーで溶解した。
(b) 2mlのリポソーム懸濁液と0.5mlの抗原溶液を混合した。
(c) スターラーを用いて室温で48時間連続撹拌した。
(d) CL-4Bカラムに通して、分子ふるい効果で抗原結合済みリポソームを回収した。
(e) リポソームバッファーで総容量を9mlに調整した。
(f) 0.45μmのフィルターでろ過した。
(g) 使用時まで冷蔵で保管した。
ア.材料
(a) 抗原:IBV-rNpおよびIBV-rMp。1coupling反応あたり5ml(2mg/ml×2.5ml)使用。
(b) リポソーム:オレイン酸リポソーム。1coupling反応あたり90mg lipid使用。
(c) 2.5%グルタルアルデヒド溶液
(d) 飽和グリシン-NaOH溶液(pH7.2)
(e) Sepharose TM CL-4B(4%架橋アガロース)
(f) リポソームバッファー:8%ショ糖加PBS、pH7.2
(a) 2mlのリポソーム懸濁液と2.5mlの抗原溶液を混合した。
(b) 2.5%グルタルアルデヒド溶液を0.5ml添加した。
(c) ウォータバスで37℃、1時間緩やかに撹拌した。
(d) 飽和グリシン-NaOH溶液を0.5ml添加し、余剰のGAを失活させた。
(e) 4℃、オーバーナイトで静置した。
(f) CL-4Bカラムに通して、抗原結合済みリポソームを回収した。
(g) リポソームバッファーで総容量を9mlに調整した。
(h) 0.45μmのフィルターでろ過した。
(i) 使用時まで冷蔵で保管した。
BCA法を利用した市販キット(Pierce(商品名) BCA Protein Assay Kit - Reducing Agent Compatible(Thermo Fisher Scientific社))を使用して、リポソーム表面に結合している抗原タンパク質を定量した。
(1)DSS法による抗原のリポソーム化
1 coupling反応あたり、凍結乾燥されたDSS結合オレイン酸リポソーム粉末(90 mg lipid/vial)を 蒸留水で復水して総量2 mlとし、これに10 mg/mlに調整した抗原を0.5 ml加えた後、スターラーで室温にて48時間撹拌した。各抗原につき3 coupling反応を実施した。CL-4B(4%架橋アガロースゲル)を充填したカラムをPBSで平衡化した後に、抗原-リポソーム混合液を加えて、分子ふるい効果により抗原結合済みリポソーム画分を回収した(9 ml/coupling)。これをフィルター濾過(0.45μm)したものを試験ワクチン(IBV-rNp-DSSおよびIBV-rMp-DSS)とした。最終的に回収された試験ワクチンの液量はいずれも25 ml程度であった。
1 coupling反応あたり、オレイン酸リポソーム懸濁液(90 mg lipid/vial/2ml)に、2 mg/mlに調整した抗原を2.5 ml加えた。ついで、2.5%グルタルアルデヒド溶液を0.5 ml加え、直後に37℃のウォーターバスで1時間振盪させた。0.5 mlの飽和グリシン-NaOH溶液(pH7.0)を添加して残余のアルデヒド基を中和した後、4℃オーバーナイトで静置した。精製およびフィルター濾過の過程は上記DSS法と同じである。最終的に回収された試験ワクチン(IBV-rNp-GAおよびIBV-rMp-GA)の液量はいずれも25 ml程度であった。
定量結果を下記表2−1に示す。
IBV-rNpまたはIBV-rMpを抗原として、これをDSS法またはGA法でリポソーム化することで、計4種類の試験ワクチンを作製した。これらの試験ワクチンの性能は以降の動物試験で評価する。
<目的>
上記2.で作製した試験ワクチン4種をそれぞれSPF鶏に免疫して、抗原特異的なIFN-γ産生誘導能および抗体産生誘導能を評価して、以降の攻撃試験に用いる試験ワクチンを選抜した。
(1)動物試験
試験区の設定および動物試験スケジュールは下記表3−1及び表3−2の通りとした。
試験鶏の脾臓から採取したリンパ球を使用して、ニワトリIFN-γ検出ELISPOTにより抗原特異的なIFN-γの産生誘導能を測定した。
試験鶏の血清を使用して、ELISAにより抗原特異的な血中抗体価を測定した。
(1)動物試験
6週齢SPF鶏の脚部筋肉内に試験ワクチンを2週間間隔で計3回(1mL/回)注射して免疫した。免疫後、注射部位に腫脹や硬結などの副反応は認めなかった。最終免疫から1週間後に解剖して脾臓を採材した。また、試験開始時と解剖時にELISA用の血清を採材した。
供試鶏の脾臓から調製した単個細胞浮遊液に、刺激抗原として試験ワクチン抗原(IBV-rNpまたはIBV-rMp)を5〜40μg/mL添加して、41℃の5%CO2インキュベータで20時間培養した。刺激抗原に反応して活性化したリンパ球はIFN-γを産生し、その部位はwell上にスポットとして認められた。このスポット数を計測して抗原特異的IFN-γ産生誘導能を評価した。その結果、すべての試験ワクチンで、5μg/mL以上の抗原刺激に対して有意にリンパ球の活性を認め、スポット数と刺激抗原濃度には正の相関があった(図3−1, 図3−2)。いずれの抗原も、結合方法別のスポット数には大きな違いは認めなかった。また、同一刺激抗原濃度では、IBV-rNpの方がIBV-rMpと比較して、スポット数が多い傾向がみられた。同一試験区の供試鶏の間には大きな違いは認めなかった。
3μg/wellのIBV-rNpまたはIBV-rMpを抗原とするELISAで、免疫前後の血中抗体価を測定した。その結果、試験ワクチンの免疫により特異抗体の誘導を認めた(図3−3, 図3−4)。
いずれの試験ワクチンも、6週齢SPF鶏の脚部筋肉内に複数回注射する免疫方法では、IFN-γ産生リンパ球の活性化と抗体誘導を認めた。抗原の種類およびリポソームへの結合方法によるIFN-γ産生リンパ球の活性化には大きな違いは認めなかったことから、以降の強毒ホモ株を用いた攻撃試験には4種すべての試験ワクチンについて防御効果を比較する。
<目的>
上記2.で作製した試験ワクチン4種について、それぞれSPF鶏に免疫した後、抗原タンパク質の由来であるIBV Chiba(2002)株(強毒ホモ株)で攻撃を行い、試験ワクチンの有効性を評価した。
(1)動物試験
試験区の設定および動物試験スケジュールは表4−1、表4−2のとおり。試験ワクチンの有効性(防御効果)を評価するにあたり、IBV Chiba(2002)株を弱毒化して作出したIBV 千葉株MSVを生ワクチンとして使用する試験区を設定し、これを陽性対照区(明瞭な防御効果を認める試験区)とした。その他、攻撃のみを行う試験区を設定し、これを攻撃対照区とした。
ア.気管線毛運動スコアによる評価
IBV感染後の呼吸器症状の評価方法として一般的である気管線毛運動の活性をスコア化した。具体的には、剖検時の供試鶏から採材した気管について、実験室内において1 羽につき5 ヶ所の気管リングを作製し、それぞれ顕微鏡下で気管線毛運動の活性を観察して、以下の判定基準に基づきスコア化した。
0=活発に動く、1=やや弱い、2=非常に弱い/部分的に動く、3=停止
個体別の平均スコアを算出した後、試験区別のスコアを算出した。
※スコアが大きいほどIBVによる呼吸器傷害が強い(ワクチンによる防御効果が低い)と判定する。
剖検時に採材した気管および腎臓の10 % (w/v)臓器乳剤を作製し、3000rpm、4℃、20minの条件で遠心した後、上清を回収した。
剖検時に採材した気管および腎臓の10 % (w/v)臓器乳剤を作製し、3000rpm、4℃、20minの条件で遠心した後、上清を回収した。PBSで10倍段階希釈した乳剤上清をSPF鶏由来初代腎臓細胞(以下、CK細胞)に接種し、接種後4 日目にIBVに特徴的な細胞変性効果の有無を観察して、ウイルス分離の確認およびウイルス力価測定を行った。
攻撃時および剖検時の個体別の血清について、SPF鶏由来のCK細胞を用いて、IBV Chiba(2002)株に対する中和抗体価を測定した。
(1)動物試験
試験区を計6 区設定し、各試験区につき5 羽を供試した。4 種の試験ワクチン区では、5週齢時、7週齢時および9週齢時に各試験ワクチンを0.5 mLずつ脚部筋肉内に注射した。生ワクチン区では8 週齢時に1ドーズ(3.5 logEID50/羽)のIBV 千葉株MSVを30 μずつ点眼接種した。攻撃対照区を含むすべての試験区において、10 週齢時に3.5 logEID50/羽のChiba(2002)株を50 μLずつ気管内接種して攻撃した。臨床症状を観察しつつ、攻撃後1 週間目に剖検した。攻撃時あるいは剖検時に採材した臓器及び血清について、気管線毛運動の観察、ウイルス分離、ウイルス遺伝子定量および中和抗体価測定を行った。
攻撃対照区と比較して、IBV-rNp-DSS区およびIBV-rNp-GA区の気管線毛運動の抑制は低減した(図4−1)。一方、IBV-rMp-DSS区およびIBV-rMp-GA区は攻撃対照区と同等であった。
すべての試験区において、剖検時の気管および腎臓からウイルス遺伝子が検出された(図4−2)。攻撃対照区と比較して、IBV-rNp-DSS区およびIBV-rNp-GA区では、臓器中のウイルス遺伝子量が低減する傾向を認めた。
攻撃対照区と比較して、IBV-rNp-DSS区およびIBV-rNp-GA区において、臓器からのウイルス分離率および分離陽性サンプル中の平均ウイルス力価は低減した(図4−3)。一方、IBV-rMp-DSS区およびIBV-rMp-GA区は、攻撃対照区と同等であった。
攻撃時の中和抗体価は、生ワクチン区は23倍であったのに対し、すべての試験ワクチン区では4倍未満であった。攻撃後1週間目では、いずれの試験ワクチン区も16倍前後にまで上昇したが、これは攻撃対照区と同等であった(図4−4)。
4種類の試験ワクチンについて、抗原ホモ株にあたるIBV Chiba(2002)株に対する有効性を評価した結果、IBV-rNpを抗原とする2種類の試験ワクチンで発症低減効果を認めた。一方、IBV-rMpを抗原とする試験ワクチンでは発症低減効果を認めなかった。
<目的>
上記2.で作製した試験ワクチン4 種のうち、上記4.において一定の有効性(発症低減効果)を認めたIBV-rNp-DSSおよびIBV-rNp-GAを用いて免疫したSPF鶏に対して、抗原タンパク質の由来であるIBV Chiba(2002)株と同一あるいは異なる遺伝子型の強毒ヘテロ株で攻撃を行い、IBV-rNp-DSSおよびIBV-rNp-GAの有効性を評価した。
(1)動物試験
試験区の設定および試験スケジュールは表5−1、表5−2のとおり。試験ワクチンの有効性(防御効果)を評価するため、3種の野外強毒ヘテロ株でそれぞれ攻撃した。その他、攻撃のみを行う試験区を設定し、これを攻撃対照区とした。
上記4.と同様にして下記の項目を評価した。
ア.気管線毛運動スコアによる評価
イ.臓器中のウイルス遺伝子の定量
ウ.臓器からのウイルス分離
(1)動物試験
試験区を計12 区設定し、各試験区につき5 羽を供試した。筋注免疫区では、5週齢時、7週齢時および9週齢時に試験ワクチンを0.5 mLずつ脚部筋肉内に注射した。点眼免疫区では、5週齢時、7週齢時および9週齢時に試験ワクチンを0.1 mLずつ点眼した。攻撃対照区を含むすべての試験区において、10 週齢時に3.5 logEID50/羽の攻撃用ウイルスを気管内接種(50μL/羽)して攻撃した。臨床症状を観察しつつ、攻撃後1週間目に剖検して、気管と腎臓を採材した。また、攻撃時および剖検時に採血を行った。
攻撃対照区と比較して、すべての免疫区で気管線毛運動の抑制は一定程度低減され、攻撃株による明らかな有効性の違いは認めなかった(図5−1)。また、投与経路で比較した場合、筋注の方が点眼よりも抑制低減効果が高い傾向であった。しかし、同一試験区内でも抑制低減効果にばらつきを認めた(表5−3)。
すべての試験区において、剖検時の気管および腎臓からウイルス遺伝子が検出された(表5−4)。攻撃対照区と比較して、免疫区における臓器中のウイルス遺伝子量は有意に低下した(図5−2)。
攻撃対照区と比較して、すべての免疫区で剖検時の気管および腎臓からのウイルス分離率および平均ウイルス力価は低下する傾向であった(図5−3, 図5−4)。いずれの攻撃株あるいは投与経路でも、ウイルス分離率およびウイルス力価は同程度であった。気管線毛運動スコアが高い(平均2.0 以上)個体とウイルス分離陽性個体は一致する傾向であった。
IBV-rNpを抗原とする試験リポソームワクチンは、3株の強毒ヘテロ株に対して、一定程度の発症低減効果を認めた。点眼区は筋注区の5分の1量の抗原量であったが、その発症低減効果は筋注経路よりもやや低い程度にとどまった。IBV-rNp-DSSとIBV-rNp-GAを同条件で使用した場合、IBV-rNp-DSSの有効性が比較的高い傾向であったことから、以降の検討ではIBV-rNp-DSSを使用することとした。
<目的>
IBVは環境中に広く浸潤していることから、初生時(0日齢)からワクチン接種を実施することが一般的である。これまでの本研究の動物試験は5週齢雛を使用しており、免疫系の発達がより未成熟である初生雛における有効性は不明であった。そこで試験ワクチンとしてIBV-rNp-DSSを使用して、投与経路、抗原濃度および投与回数の条件を設定して、初生雛における有効性を評価した。
(1)動物試験
試験区の設定および試験スケジュールは表6−1, 表6−2のとおり。IBV-rNp-DSSの有効性(防御効果)を評価するため、3種の投与経路についてそれぞれ抗原濃度および免疫回数の条件を設定して免疫を行った後、強毒ヘテロ株で攻撃した。その他、攻撃のみを行う試験区を設定し、これを攻撃対照区とした。
上記4.と同様にして下記の項目を評価した。
ア.気管線毛運動スコアによる評価
イ.臓器中のウイルス遺伝子の定量
ウ.臓器からのウイルス分離
(1)動物試験
試験区を計13区設定して各試験区につき4 羽を供試した。投与経路として点眼、点鼻、筋注を設定した。免疫材料としてIBV-rNp-DSSの原液あるいは、原液を凍結乾燥した後に1/4量のPBSで復水した4倍濃縮液を使用した。1回免疫区では初生時のみ、3回免疫区では初生時、7日齢時および14日齢時に試験ワクチンを50μLずつ投与した。攻撃対照区を含むすべての試験区で21日齢時に3.5 logEID50/羽の攻撃株を点鼻接種(50μL/羽)して攻撃した。臨床症状を観察しつつ、攻撃後1週間目に剖検して、気管と腎臓を採材した。
4倍濃縮および原液のIBV-rNp-DSSを点鼻経路で3回免疫した試験区(6区および8区)と、4倍濃縮のIBV-rNp-DSSを筋肉内経路で3回免疫した試験区(10区)において気管線毛運動の抑制が低減される傾向であった(図6−1)。しかし、同一試験区内でも個体間でスコアにばらつきを認めた(表6−3)
すべての免疫区の気管および腎臓からウイルス遺伝子が検出されたが、いずれの投与経路においても、3回免疫した試験区では気管あるいは腎臓のウイルス遺伝子量は有意に低下した(図6−2, 表6−4)。
点鼻経路で3回免疫した試験区(6区および8区)で臓器からのウイルス分離率が低下した(図6−3)。また、点鼻経路では1回免疫でも臓器中のウイルス力価は有意に低下したが、3回免疫の方がさらにウイルス力価が低下した(図6−4)。
IBV-rNp-DSSは初生雛に対しても一定の発症低減効果を認めた。今回検討した免疫方法の中では、点鼻経路での3回投与が最も有効であった。また、点鼻経路では抗原濃度による有効性に大きな違いは認めなかった。
<目的>
上記6.において、IBV-Np-DSSは点鼻経路で高い有効性を認めたことから、現場応用を想定してスプレー投与(散霧あるいは噴霧)の有効性を検討した。
(1)動物試験
試験区の設定および試験スケジュールは表7−1, 表7−2のとおり。3種の投与経路について、それぞれ抗原濃度および免疫回数の条件を設定して免疫を行った後、強毒ヘテロ株で攻撃した。その他、攻撃のみを行う試験区を設定し、これを攻撃対照区とした。なお、液滴の粒子径は生ワクチン用動力噴霧器(ニューコン607、木村農産)を用いて調整し、散霧投与250〜300μm、噴霧投与50〜100μmに設定した。
上記4.と同様にして下記の項目を評価した。
ア.気管線毛運動スコアによる評価
イ.臓器中のウイルス遺伝子の定量
ウ.臓器からのウイルス分離
(1)動物試験
試験区を計13 区設定して各試験区につき4 羽を供試した。試験ワクチンは点鼻経路では最大100倍、散霧および噴霧経路では最大1000倍までPBSで希釈して投与した。1回免疫区では7 日齢時のみ、2 回免疫区では7 日齢時および14 日齢時に試験ワクチンを投与した。点鼻経路では1羽あたり50 μL/回投与した。散霧および噴霧経路ではロス分を加味して、1羽あたり100μL/回投与した。さらに、散霧および噴霧経路での投与時は、供試鶏を大型のビニール袋に入れ、供試鶏の上空50cm程度から顔面にめがけて試験ワクチンを規定量投与し、その後1分程度ビニール袋の口を結び静置することで、空気中に浮遊した試験ワクチンの粒子が供試鶏に効率的に吸引される環境を設定した。攻撃対照区を含むすべての試験区で21日齢時に3.5 logEID50/羽の攻撃株を気管内接種(50μL/羽)して攻撃した。臨床症状を観察しつつ、攻撃後1週間目に剖検して、気管と腎臓を採材した。
点鼻経路の2回免疫区では、抗原濃度依存性に抑制低減を認めたが、1回免疫区では抑制効果を認めなかった(図7−1)。散霧経路の2回免疫区では、100倍希釈までは一定の抑制低減を認めたが、1000倍希釈では攻撃対照区と同等であった。噴霧経路の2回免疫区では、1000倍希釈までの平均スコアは同程度であり、1000倍希釈でも4羽中2羽で平均スコア1未満であった(表7−3)。また、同一試験区内で個体間にスコアにばらつきを認めた。
すべての免疫区の臓器からウイルス遺伝子が検出された(表7−4)。2回免疫区において、点鼻経路では10倍希釈まで、散霧経路では100倍希釈まで、噴霧経路では1000倍希釈まで気管および/あるいは腎臓のウイルス遺伝子量が有意に低下した(図7−2)。
噴霧経路の2回免疫区では、1000倍希釈においても臓器からのウイルス分離陽性率は低下した(図7−3)。気管のウイルス力価で有意差を認めた最大希釈倍数は、点鼻経路では10倍、噴霧経路では1000倍であったが、同一試験区内での個体間のばらつきは大きかった(図7−4)。
スプレー投与でも一定の有効性を示し、粒子径のより細かい噴霧投与の方が希釈倍率を高くしても有効性が維持されることが確認された。しかし、スプレー投与では個体間のばらつきが大きくなる傾向であったことから、免疫方法の改良を試みる。
<目的>
表面結合型リポソームワクチンは細胞傷害性Tリンパ球(CTL)反応を強力に誘導することが特徴であるが、これまでIBVのCTLエピトープ領域は明らかとなっていない。現在検討をすすめているIBV-rNp-DSSは抗原領域としてIBVヌクレオカプシド(N)タンパク質の全長を使用しているが、Nタンパク質の一部の領域にエピトープが局在すると仮定すると、このエピトープ局在領域を特定することで、リポソームワクチンの有効性が向上することが期待できる。そこで断片化したNタンパク質やNタンパク質とメンブレン(M)タンパク質とを結合したキメラタンパク質を抗原とするリポソームワクチンを作製し、動物試験でそれらの有効性を比較した。
(1)断片化/キメラ化タンパク質の作製およびリポソーム化
遺伝子組換え大腸菌を用いて、IBV Chiba(2002)株のNタンパク遺伝子(1230bp、配列番号1)を、前後に一部領域が重なった状態で4分割した組換えタンパク質を作製した(図8−1)。N1〜N4の塩基配列及びコードされるアミノ酸配列を配列番号5〜12に示す。
その他、IBVのNおよびMタンパク質において、IBV株間でとくに保存性の高い領域を結合したキメラタンパク質:Ch(N+M)を作製した(図8−2)。Ch(N+M)の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号13、14に示す。配列番号13の塩基配列中、1〜450位までがNタンパク質領域:241-690(450bp)であり、451〜657位までがMタンパク質領域:454-660(207bp)である。
これらをDSS法でリポソーム表面に結合させてリポソームワクチンを作製した。
試験区の設定および試験スケジュールは表8−1, 表8−2のとおり。7日齢時と14日齢時に、PBSで10倍希釈した試験ワクチンをスプレー投与(噴霧)した後、強毒ヘテロ株で攻撃した。その他、攻撃のみを行う試験区を設定し、これを攻撃対照区とした。なお、液滴の粒子径は生ワクチン用動力噴霧器(ニューコン607、木村農産)を用いて噴霧投与50〜100μmに設定した。さらに、個体間のバラツキを低減する目的で、上記7.で実施した方法と試験ワクチンの投与量を同一として投与時間を1試験区あたり4秒から6秒に延長した。
上記4.と同様にして下記の項目を評価した。
ア.気管線毛運動スコアによる評価
イ.臓器中のウイルス遺伝子の定量
(1)断片化/キメラ化タンパク質の作製およびリポソーム化
遺伝子組換え大腸菌を用いて、IBV Chiba(2002)株由来のNタンパク質遺伝子(1230bp)を、前後に一部領域が重なった状態で4分割した組換えタンパク質を作製し、5'末端側からN1、N2、N3、N4とした。その他、IBVのNおよびMタンパク質において、ウイルス株間でとくに保存性の高い領域を結合したキメラタンパク質(N+M)を作製した。これらをDSS法でリポソーム表面に結合させて計5種類のリポソームワクチンを作製した。
試験区を計7 区設定して、リポソームワクチンで免疫を行う1〜6区は各区8 羽、攻撃対照区の7区は6羽を供試した。1〜6区では、上記(1)で作製したリポソームワクチンをPBSで10倍希釈した後、生ワクチン用動力噴霧器を用いて、7日齢時および21日齢時に1羽あたり100μLを噴霧投与(液滴粒子径50〜100μm)した。攻撃対照区を含むすべての試験区で28日齢時に3.5 logEID50/羽の強毒ヘテロ株を気管内接種(50μL/羽)して攻撃した。臨床症状を観察しつつ、攻撃後1 週間目に剖検して、気管と腎臓を採材した。
攻撃対照区と比較して、すべての試験区で気管線毛運動の抑制が低減される傾向があった(図8−3)。最も高い抑制低減効果を認めた6区(IBV-rNp)では、個体間のバラツキが少なく、全羽スコア1以下であった(表8−3)。その他の試験区では、スコア1を超える個体を一部認め、同一試験区内でも個体間でスコアにバラつきがあった。Nタンパク質を断片化した1〜4区の中では、2区と3区のスコアが低い傾向であった。
攻撃対照区と比較して、すべての試験区の気管と腎臓でウイルス遺伝子量が有意に低下した(図8−4)。最も高い遺伝子量の低減効果を認めたのは6区(IBV-rNp)であり、ついで5区(N+M)であった。IBV Nタンパク質を断片化した1〜4区の中では、2区と3区の遺伝子量が低い傾向であった。
断片化あるいはキメラ化したリポソームワクチンは、強毒ヘテロ株の攻撃に対して一定の発症低減効果を認め、その有効性はN2およびN3領域で高い傾向であったが、エピトープ領域の明瞭な局在は確認できず、さらにこれまで検討してきた全長(IBV-rNp)を抗原とする試験区の方がより高い発症低減効果を認めた。
<目的>
噴霧投与におけるIBV-rNpの最小有効抗原量を検討した。
(1)動物試験
試験区の設定および試験スケジュールは表9−1、表9−2のとおり。IBV-rNp抗原量2μg/回/羽を起点として、PBSで2倍階段希釈したIBV-rNp-DSSを7日齢時および21日齢時に噴霧投与して免疫を行い、28日齢時に攻撃、35日齢時に剖検した。その他、攻撃のみを行う試験区を設定し、これを攻撃対照区とした。
上記4.と同様にして下記の項目を評価した。
ア.気管線毛運動スコアによる評価
イ.臓器中のウイルス遺伝子の定量
(1)動物試験
試験区を計7 区設定して、リポソームワクチンで免疫を行う1〜6区は各区8 羽、攻撃対照区の7区は6羽を供試した。1〜6区では、上記(1)で作製したリポソームワクチンをPBSで10倍希釈した後、生ワクチン用動力噴霧器を用いて、7日齢時および21日齢時に1羽あたり100μLを噴霧投与(液滴粒子径50〜100μm)した。攻撃対照区を含むすべての試験区で28日齢時に3.5 logEID50/羽の強毒ヘテロ株を気管内接種(50μL/羽)して攻撃した。臨床症状を観察しつつ、攻撃後1 週間目に剖検して、気管と腎臓を採材した。
攻撃対照区と比較して、すべての試験区で気管線毛運動の抑制が低減される傾向を認めた(図9−1)。試験区間のスコア差は小さく、いずれの試験区でもスコア2以上を認める個体はなかった(表9−3)。最も抗原量の少ない試験区(7区)においても、個体間のバラつきは小さかった。
攻撃対照区と比較して、すべての試験区の気管と腎臓でウイルス遺伝子量は有意に低下した(図9−2)。
IBV-rNp-DSSの原液(20μg/mL)を最大640倍に希釈しても高い発症低減効果を認めたことから、IBV-rNp-DSSの2回噴霧投与における最小有効抗原量は、原液を640倍以上に希釈したところにあることが示唆された。
<目的>
既報のマウスを用いた文献(Taneichi et al., J Immunol. 2006, 177(4):2324-2330)では、表面結合型リポソームワクチンは、リポソーム表面に抗原が結合した状態となることで、はじめて有効性を示すことが示唆されている。しかし、鶏でも同様であるかについての検討はこれまで行われていない。そこで、抗原又はリポソーム単独の場合あるいは抗原とリポソームが非結合の場合と比較して、有効性を示すためには抗原とリポソームの結合が必須であることを明らかにする。
(1)動物試験
試験区の設定および試験スケジュールは表10−1, 表10−2のとおり。IBV-rNp-DSSを陽性対照として、抗原/リポソーム単独あるいは直前に混合して非結合状態のリポソーム抗原混合物をそれぞれ噴霧投与した。
上記4.と同様にして下記の項目を評価した。
ア.気管線毛運動スコアによる評価
イ.臓器中のウイルス遺伝子の定量
(1)動物試験
試験区を計4区設定して各試験区につき5羽を供試した。1,2,3区においては、PBSでrNp抗原量を2μg/回/羽に調整した。4区のリポソーム量は1区と同一とした。生ワクチン用動力噴霧器を用いて、7日齢時および21日齢時に1羽あたり100μLを噴霧投与(液滴粒子径50〜100μm)した。攻撃対照区を含むすべての試験区で28日齢時に3.5 logEID50/羽の香川/2012/1株(強毒ヘテロ株)を50μLずつ気管内接種して攻撃した。臨床症状を観察しつつ、攻撃後1 週間目に剖検して、気管と腎臓を採材した。
攻撃対照区と比較して、1区は気管線毛運動の抑制が低減される傾向があったが、2,3,4区の気管線毛運動スコアは攻撃対照区と同程度であり発症低減効果を認めなかった(図10−1, 表10−3)。
攻撃対照区と比較して、1区の気管と腎臓のウイルス遺伝子量は有意に低下したが、2,3,4区は攻撃対照区と同程度であった(図10−2)。
鶏においても表面結合リポソームワクチンが有効性を示すためには抗原とリポソームの結合が必須であることが確認された。
<目的>
野外農場での使用を想定した噴霧投与条件を検討した。
(1)動物試験
試験区の設定および試験スケジュールは表11-1、表11-2のとおり。1区(閉鎖空間)は厚手のビニール袋(W900×H1000:容量90L)にSPFひな10羽を収容して、上方約50cm程度から鶏の頭部に向けてrNp-DSSを噴霧投与した。2〜6区(開放空間)では、ニワトリ輸送カゴ(内径W750×D500×H280)にSPFひなを10羽収容して(収容密度0.038m2/羽)、上方約50cm程度から鶏の頭部に向けてIBV-rNp-DSSを噴霧投与した。噴霧投与には生ワクチン用動力噴霧器(ニューコン607)を用いた。噴霧投与後はニワトリ用アイソレーターに移して飼育した。その他、攻撃のみを行う試験区を設定し、これを攻撃対照区(7区)とした。
ア.気管線毛運動スコアによる評価
上記4.を参照。有意差検定はDunnettの多重比較検定法で行った。
イ.臓器中のウイルス遺伝子の定量
上記4.を参照。有意差検定はStudent-t検定法で行った。
(1)気管線毛運動スコアによる評価
攻撃対照区(7区)と比較して、すべての試験区で気管線毛運動スコアが有意に低下した(P<0.01)(図11-1)。抗原濃度、投与量および投与時間の条件は同一とし、閉鎖環境(1区)と開放環境(2区)を比較した結果、平均スコアは同程度であったが、試験区間内でのバラツキは2区の方が大きかった。また、2区と比較して、投与量を増加した4区と投与時間を延長した5区では、平均スコアは同程度であったが、試験区内でのバラツキが小さくなった。すべての免疫区(1-6区)で10羽中7〜9羽の個体別スコアは1未満であり、スコア2以上の個体は認めなかった(表11-3)。
攻撃対照区(7区)と比較して、すべての免疫区(1-6区)で気管と腎臓のウイルス遺伝子量は有意に低下し(P<0.01)、免疫区(1-6区)のウイルス遺伝子量は同程度であった(図11-2)。
IBV-rNp-DSSの噴霧投与は閉鎖環境と開放環境で同程度の有効性を認めた。また、1羽あたりのIBV-rNp-DSS投与量の増量と投与時間の延長は、個体間のバラツキを小さくすることに有効であることが示唆された。
<目的>
IBV-rNp-DSSの噴霧投与における投与時期、投与間隔および投与量の条件検討を行った。
(1)動物試験
試験区の設定および試験スケジュールは表12-1, 表12-2のとおり。免疫区では、ニワトリ輸送カゴ(内径W750×D500×H280)にSPFひなを5羽収容して(収容密度0.076m2/羽)、上方約50cm程度から鶏の頭部に向けてIBV-rNp-DSSを噴霧投与した。噴霧投与には生ワクチン用動力噴霧器(ニューコン607)を用いた。噴霧投与後はニワトリ用アイソレーターに移して飼育した。その他、攻撃のみを行う試験区を設定し、これを攻撃対照区(4,8,12区)とした。免疫区では表1の日齢で2回の免疫を行い、2回目免疫の7日後に3.5 logEID50の強毒ヘテロ株を気管内接種(50 μL/羽)して攻撃した。臨床症状を観察しつつ、攻撃7日後に剖検して気管と腎臓を採材した。
ア.気管線毛運動スコアによる評価
上記4.を参照。有意差検定はDunnettの多重比較検定法で行った。
イ.臓器中のウイルス遺伝子の定量
上記4.を参照。有意差検定はStudent-t検定法で行った。
(1)気管線毛運動スコアによる評価
攻撃対照区と比較して、抗原量100ng/dose以上である0日齢-7日齢の免疫区(1-2区)、0日齢-14日齢の免疫区(5-6区)および7日齢-21日齢の免疫区(9-10区)において気管線毛運動スコアが有意に低下した(P<0.01またはP<0.05)(図12-1)。一方、抗原量25ng/dose(3,7,11区)では、投与間隔が14日間である7区と11区でのみ気管線毛運動スコアが有意に低下した(P<0.05)。同一試験区における気管線毛運動スコアのバラツキは、0日齢-7日齢の免疫区(1-3区)および投与時期に関わらず抗原量25ng/doseの免疫区(3,7,11区)において、やや大きい傾向を認めた(表12-3)。
結果を図12-2に示す。攻撃対照区と比較して、気管のウイルス遺伝子量は抗原量100ng/dose以上の免疫区(1-2, 5-6, 9-10区)において有意に低下した(P<0.01またはP<0.05)。一方、腎臓のウイルス遺伝子量は1区を除く抗原量100ng/dose以上の免疫区(2, 5-6, 9-10区)において有意に低下した(P<0.01またはP<0.05)。
IBV-rNp-DSSの噴霧投与時の最適条件として、初回投与時期は0日齢あるいは7日齢、投与間隔は14日間、抗原量が100ng/dose以上で高い発症低減効果を認めた。IBVは環境中に広く浸潤しており、鶏ひなへの早期の免疫付与が重要な疾病であることから、IBV-rNp-DSSの投与モデルとして『0日齢および14日齢の2回投与で、抗原量100ng/dose』の条件が適当であると考えられた。
<目的>
IBV感染による産卵異常に対するIBV-rNp-DSSの有効性を評価した。
(1)動物試験
試験区の設定および試験スケジュールは表13-1, 表13-2のとおり。各区25週齢のSPF採卵鶏を12羽供試し、単飼ケージ(H965×W393×D193mm)で約11週間飼育した。ワクチン試験区では25週齢時および27週齢時にIBV-rNp-DSSを噴霧投与(0.5μg/100μL/羽)した。追加免疫から1週後の28週齢時にワクチン試験区および攻撃対照区に対して、3.5 logEID50の強毒ヘテロ株を気管内接種(50 μL/羽)して攻撃した。臨床症状および産卵成績を観察しつつ、経時的に口腔スワブおよびクロアカスワブおよび血清を採材した。また、攻撃後7日目に各区2羽、攻撃後57日目に各区10羽を剖検して臓器(気管・腎臓、卵管)を採材した。
ア.産卵成績の評価
個体別の産卵成績を毎日記録した(−7〜57dPI)。異常卵を認めた場合は、外部卵質および内部卵質の異常の有無を確認した。
個体別に7, 14, 35, 57dPIの口腔およびクロアカスワブと、7, 57dPIの剖検時の気管、腎臓および卵管(膨大部)中について、リアルタイムPCRでIBV遺伝子定量を行った。有意差検定はStudent t-testで行った。
7dPIおよび57dPIの剖検時に、1羽につき5ヶ所の気管リングについて顕微鏡下で気管線毛運動を観察して、以下の指標に基づきスコア化した(0=活発に動く、1=やや弱い、2=非常に弱い/部分的に動く、3=停止)。
市販のIBエリーザキット(IDEXX社)を使用して、0, 7, 57dPI時の個体別血清についてELISA抗体価(S/P比)を測定し、試験区別に平均値を算出した。有意差検定はStudent t-testで行った。
(1)産卵成績の評価
試験区別の産卵率の推移は図13-1のとおり。約1週間間隔で区切った期間別の産卵率では、攻撃直後は2区で15%以上、3区で30%以上低下し、その後は両区とも徐々に産卵率が回復した(図13-2)。産卵率が90%以上に復帰するまでに要した期間は、2区では4週間、3区では6週間であった。攻撃後、連続して3日間以上産卵が停止した個体は、2区で12羽中3羽、3区で12羽中6羽であり、いずれの個体も産卵開始後に異常卵(小型卵・卵質の低下)を認め、その後は正常卵を産出した(表13-3)。
ア.スワブ中のウイルス遺伝子量
2区では7〜14dPI、3区では7〜35dPIにかけて口腔/クロアカスワブからウイルス遺伝子が検出された(図13-3)。7〜35dPIにおいて、2区の遺伝子量は3区に対して有意に低下していた(P<0.05またはP<0.01)。57dPIでは、すべての試験区でウイルス遺伝子は検出されなかった。
7dPIにおいて、2区および3区の気管、腎臓および卵管からウイルス遺伝子が検出された(図13-4)。2区のウイルス遺伝子量は3区よりも少ない傾向を示した。57dPIでは、すべての試験区でウイルス遺伝子は検出されなかった。
7dPIにおいて、3区は2羽とも重度の気管線毛運動の抑制を認めたが、2区では抑制なしと軽度の抑制が各1羽であった(図13-5)。
7dPIおよび57dPIにおいて、2区のELISA抗体価は3区に対して有意に上昇した(P<0.05)(図13-6)。
攻撃後の産卵障害の発生頻度、発生期間およびウイルスの全身感染を示す各種検査成績から、ワクチン試験区は攻撃対照区よりも産卵障害の程度が軽度であり、IBリポソームワクチンは産卵障害に対して有効であることが示唆された。
<目的>
上記12.で確立した免疫方法に基づいて、近年国内で分離された種々の遺伝子型のIBV野外ヘテロ株(5株)に対するIBV-rNp-DSSの有効性を評価した。
(1)動物試験
試験区の設定、試験スケジュールおよび供試した野外ヘテロ株はそれぞれ表14-1、表14-2、表14-3のとおり。免疫区では各区10羽、攻撃対照区では各区3羽を供試した。上記12.で確立した免疫方法に基づいて、免疫区では0日齢時および14日齢時にIBV-rNp-DSSを噴霧投与(100ng/dose)した。21日齢時に免疫区および攻撃対照区に対して3.0 logEID50種々の野外ヘテロ株を気管内接種(50 μL/羽)して攻撃した。臨床症状および産卵成績を観察しつつ、攻撃後7日目に剖検して臓器(気管・腎臓)を採材した。
ア.気管線毛運動スコアによる評価
上記4.を参照。有意差検定はDunnettの多重比較検定法で行った。
イ.臓器中のウイルス遺伝子の定量
上記4.を参照。有意差検定はStudent-t検定法で行った。
(1)気管線毛運動スコア
すべての攻撃対照区で重度の気管線毛運動の抑制を認めたのに対して、免疫区では多くの個体で抑制を認めない、あるいは軽度の抑制に留まり、攻撃対照区に対して有意に平均スコアが低下した(P<0.05)(図14-1、表14-4)。
攻撃対照区と比較して、すべての攻撃株において、免疫区の攻撃7日後における気管および腎臓中のウイルス遺伝子量は有意に低下した(P<0.05あるいはP<0.01)(図14-2)。
上記12.で確立した免疫方法に基づいてIBV-rNp-DSSを使用した結果、種々の遺伝子型の野外ヘテロ株(5株)に対して、いずれも高い発症低減効果を認めた。
<目的>
豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス(以下、PRRSV)リポソームワクチンを作製するため、その抗原としてPRRSV株間で比較的保存性の高いヌクレオカプシド(N)タンパクの全長を遺伝子組換え大腸菌を用いて作製し、これを抗原とするPRRSリポソームワクチンを作製した。
(1)抗原領域の決定
PRRSV株間で比較的保存性が高いことが報告されているNタンパク質(ORF7遺伝子領域)を抗原領域とした。
全農家畜衛生研究所で分離したPRRSV wt-7株からゲノム抽出を行い、Nタンパク質(配列番号28)をコードするORF7領域の全長(配列番号27)をPCR法で増幅させた後、His-tagを含むベクタープラスミドに挿入した。このプラスミドをクローニング用大腸菌に導入して形質転換させた。ついで、PCRで目的遺伝子の挿入を確認できた大腸菌からプラスミドを抽出し、これをタンパク質発現用大腸菌に導入して形質転換させた。この遺伝子組換え大腸菌をアンピシリン添加LB培地とIPTGを用いた発現誘導あるいは10mMラクトース加TB培地を用いた発現誘導を行い、組換えNタンパク質(以下、PRRSV-rNp)を発現させた。超音波処理で菌体を破壊した後、Hisタグによるアフィニティー精製を行った。SDS-PAGEを行い、想定される分子量の位置にタンパク質が発現していることを確認した。
Fw: CCCCATATGGCCATGCCAAATAACAACGGCAA(配列番号29、下線はNdeI認識部位)
Rv: TTTGGATCCTCATGCTGAGGGTGATGATA(配列番号30、下線はBamHI認識部位)
核酸抽出: QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN社)
PCR装置: PCR Thermal Cycler Dice(登録商標) Gradient(TP600)(TaKaRa社)
DNAのゲル精製: QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)
制限酵素:NdeIおよびBamHI(Takara社)
ベクタープラスミド: pET-15b(Novagen)
コンピテントセル: クローニング用としてE.coli JM109株(TaKaRa社)、タンパク質発現用としてE.coli BL21(DE3)株(バイオダイナミクス研究所)を使用した。
ライゲーション: Ligation high (TOYOBO)
シークエンス解析: 株式会社ファスマックに外注依頼
Hisタグによるアフィニティー精製: Profiniaタンパク質精製システム(バイオ・ラッド社)
上記1.(2)イ.(DSS法による抗原のリポソーム化)と同じ方法でPRRSV-rNpをリポソーム表面に結合させてPRRSリポソームワクチン(以下、PRRSV-rNp-DSS)を作製した。
(1)抗原領域の探索
PRRSV wt-7株のORF7領域全長の塩基配列は配列番号27のとおり。
ア.遺伝子組換え大腸菌の作製
PRRSV wt-7株から抽出したtotal RNAを鋳型としてRT-PCRを行い、目的とする遺伝子断片の増幅を確認した。組換えNタンパク質(rNp)については、アンプリコンとプラスミドベクター(pET-15b)をそれぞれ同じ2種類の制限酵素領域(NdeIおよびBamHI)でライゲーションした後、シークエンス解析で正常に挿入されていることを確認した。このプラスミドベクターをクローニング用大腸菌(JM109)に形質転換した後、培養して増幅したプラスミドを回収した。これを発現用大腸菌BL21(DE3)株に形質転換して、PRRSV-rNp発現用組換え大腸菌を作製した。
アンピシリン添加液体LB培地で前培養したPRRSV-rNp発現用組換え大腸菌をアンピシリン添加LB培地に1/100量添加し、37℃で3時間振盪培養した。培養開始後O.D.600が0.5に達した時点で、IPTG(終濃度1mM)を添加して発現誘導を行い、さらに3時間振盪培養した。あるいは、アンピシリン添加液体LB培地で一晩培養したPRRSV-rNp発現用組換え大腸菌を10mMラクトース加TB培地に約1/100量加え、25℃で3日間振盪培養した。これらの培養菌液を3000rpm,40min,4℃で遠心して菌体ペレットを回収し、結合バッファー(20mMTris、500mM NaCl、20mMイミダゾール、pH7.4)で再懸濁した後、菌体を超音波破砕した。ついで、6,000rpm, 30分遠心分離をして可溶化画分(上清)を回収し、アフィニティー精製を行って目的とするPRRSV-rNp分画を回収した。抗原へのタグ修飾(His-tag)の影響から、SDS-PAGEにおける見かけの分子量は数kDa大きくなることが知られているが、SDS-PAGEおよびマウス抗PRRSV-rNp抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果、いずれも推定分子量(約14kDa)付近に明瞭なバンドが確認され、PRRSV-rNp発現量は10mMラクトース加TB培地を用いた場合の方が多かった(図15-1)。
1 coupling反応あたり、凍結乾燥されたDSS結合オレイン酸リポソーム粉末(90 mg lipid/vial)を 蒸留水で復水して総量2 mlとし、これに10 mg/mlに調整した抗原を0.5 ml加えた後、スターラーで室温にて48時間撹拌した。3 coupling反応を実施した。CL-4B(4%架橋アガロースゲル)を充填したカラムをPBSで平衡化した後に、抗原-リポソーム混合液を加えて、分子ふるい効果により抗原結合済みリポソーム画分を回収した(9 ml/coupling)。これをフィルター濾過(0.45μm)したものを試験ワクチン(PRRSV-rNp-DSS)とした。最終的に回収された試験ワクチンの液量は25 ml程度であった。
遺伝子組換え大腸菌を用いて、PRRSV wt-7株を鋳型とするPRRSV-rNpを作製し、これを抗原とするPRRSV-rNp-DSSを作製した。PRRSV-rNp-DSSの免疫原性については以降の動物試験で評価する。
<目的>
マウスを用いて上記15.で作製したPRRSリポソームワクチンPRRSV-rNp-DSSの免疫原性を評価した。
(1)動物試験
試験区の設定および試験スケジュールはそれぞれ表16-1、図16-1のとおり。3週齢のBALB/cCrSlcマウス(以下、BALB/cマウス)と、C57BL/6NCrSlc(以下、B6マウス)の異なる2系統のマウスを導入して、4週齢時から免疫を開始した。各免疫材料をマウスのフットパッドに2週間間隔で計3回投与し、経時的に採血と剖検を行った。
ア.ELISPOTによる抗原特異的リンパ球活性の評価
Mouse IFN-γ ELISPOT BASIC(MABTECH社)を使用した。3回免疫終了1週後(35dPI)に3匹を剖検して脾臓を採材し、脾細胞浮遊液(5×105cells/mL)に、刺激抗原としてPRRSV-rNpを2μg/well添加して、37℃の5%CO2インキュベータで24時間培養した。刺激抗原に反応して活性化したリンパ球はIFN-γを産生し、その部位はwell上にスポットとして認められた。このスポット数を計測して抗原特異的Mouse IFN-γ産生誘導能を評価した。
経時的に採材したマウス血清とHRP標識ヤギ抗ニワトリIgG, IgG1およびIgG2a(BETHYL社)を用いて、PRRSV-rNpを抗原としたELISAでIgG、IgG1およびIgG2aを測定した。
上記のELISAでPRRSV-rNpに対する抗体価の上昇を認めた3,4,7,8区の血清について、MARC145細胞とPRRSV wt-7株を用いた中和試験により中和抗体価を測定した。
(1)IFN-γ産生誘導能の評価
ELISPOTアッセイで脾臓中のリンパ球におけるIFN-γ産生誘導能を評価した結果、PRRSV-rNp-DSSを投与した4区と8区において、刺激抗原(PRRSV-rNp)に反応したスポット数の増加を認めた(図16-2, 図16-3)。
PRRSV-rNpを抗原としたIgG、IgG1およびIgG2a に対するELISAを行った結果、PRRSV-rNp投与区(3,7区)およびPRRSV-rNp-DSS投与区(4,8区)においてPRRSV-rNpに対する抗体上昇を確認した(図16-4, 図16-5, 図16-6)。BALB/cマウスとB6マウスで抗体価の上昇の程度に違いが見られたが、これは、BALB/cではIgG1が、B6ではIgG2aがIgGの主成分であるためと考えられた。
ELISAでPRRSV-rNpに対する抗体価の上昇が認めた3,4,7,8区の血清サンプルについて中和抗体価の測定を実施したが、いずれのサンプルにおいても中和抗体価の上昇は認められなかった(表16-2)。これはPRRSVのNタンパク質は中和活性領域ではないためと考えられた。
PRRSV-rNp-DSSを投与したマウスにおいてIFN-γ産生リンパ球の活性化と抗体誘導を認めたことから、PRRSV-rNp-DSSには一定の免疫原性があることが確認された。
<目的>
豚を用いて上記15.で作製したPRRSリポソームワクチンPRRSV-rNp-DSSの有効性を評価した。
(1)動物試験
試験区の設定および試験スケジュールはそれぞれ表17-1、図17-1のとおり。3週齢のSPF豚を導入して、4週齢時から免疫を開始した。免疫区ではPRRSV-rNp-DSSを2週間間隔で計3回頸部筋肉内に注射した。免疫開始後から試験終了時まで経時的に採血を実施した。3回目の免疫1週間後の9週齢時(35dPI)に105.0TCID50/mLのPRRSV wt-7株を1頭あたり2mL経鼻投与(片鼻1mLずつ)して攻撃した。攻撃から20日後の12週齢時(55dPI)に剖検して肺を採材した。
ア.体温測定
0dPCから20dPCにかけて毎日体温を測定した。
1dPCから12dPCにかけて経時的に採材した血液について、リアルタイムPCRでウイルス遺伝子量を測定した。
Porcine IFN-γ ELISpot BASIC (HRP)(MABTECH社)を使用した。0dPCから20dPCにかけて経時的に採材した血液からPBMCを調整して、PBMC浮遊液(3.0×105cell/well)に、刺激抗原としてPRRSV-rNpを2μg/well添加して、37℃の5%CO2インキュベータで24時間培養した。刺激抗原に反応して活性化したリンパ球はIFN-γを産生し、その部位はwell上にスポットとして認められた。このスポット数を計測して抗原特異的Porcine IFN-γ産生誘導能を評価した。
Porcine IFNγ Mab,cloneP2F6(Thermo Scientific社)とBiotin Mouse Anti-Pig IFNγ Clone P2C11(BD Biosciences社)を用いたサンドイッチ ELISAによってPorcine IFN-γを検出した。0dPCから20dPCにかけて経時的に採材した血液からPBMCを調整して、PBMC浮遊液(2.0×106cell/well)に刺激抗原としてPRRSV-rNpを20μg/well添加して、37℃の5%CO2インキュベータで72時間培養した。その後、上清を回収してサンドイッチELISAでPorcine IFN-γを検出した。
20dPCに採材した肺について病理組織学的検査を行い、病変の程度をスコア化した。スコア化はP. G. HALBUR,et.al. Comparison of the Pathogenicity of Two US Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Isolates with that of the Lelystad Virus.Veterynary Pathology 32:648-660(1995)に準じて実施した。
経時的に採材した血清について、ELISAでPRRSV-rNpに対する抗体を測定した。二次抗体としてHRP標識ウサギ抗ブタIgG(MP Biomedicals社)を用いた。
ア.体温測定
個体間のバラツキがあるものの、攻撃後の体温は免疫区の方が低い傾向を示し、11dPCおよび12dPCでは有意に低下した(図17-2)。
免疫区の血中ウイルス遺伝子量は、対照区と比較して1dPCにおいて有意に低下したが、6dPC以降は同程度であった(図17-3)。
免疫区において、0dCPから20dPCにかけてPRRSV-rNpに特異的に反応したリンパ球の活性を認め、その程度は免疫区において高い傾向を認めた(図17-4)。
免疫区において、0dCPから20dPCにかけてPRRSV-rNpに特異的に反応したリンパ球の活性を認め、その程度は免疫区において高い傾向を認めた(図17-5)。
免疫区において肺病変スコアが低い傾向を認めた(図17-6)。
2回目の免疫以降(28dPI)、免疫区で特異抗体の誘導を認めた(図17-7)。攻撃後は免疫区で抗体価が顕著に上昇した。
PRRSV-rNp-DSSで免疫した豚ではPRRSV-rNp特異的な免疫応答を認め、攻撃後の発熱、血中ウイルス遺伝子量および肺の病変が軽減する傾向を認めた。
Claims (19)
- 非ヒト動物に感染する病原体に由来する抗原分子が表面に結合されたリポソームを含む、非ヒト動物用ワクチン。
- 抗原分子がポリペプチドである、請求項1記載のワクチン。
- 病原体がエンベロープを有するウイルスであり、抗原分子がヌクレオカプシドタンパク質である、請求項2記載のワクチン。
- 非ヒト動物が家畜又は家禽である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のワクチン。
- 非ヒト動物が鳥類である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のワクチン。
- 病原体が伝染性気管支炎ウイルスである、請求項4又は5記載のワクチン。
- 抗原分子が伝染性気管支炎ウイルスの全長ヌクレオカプシドタンパク質である、請求項6記載のワクチン。
- 前記全長ヌクレオカプシドタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号2に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列である、請求項7記載のワクチン。
- 噴霧投与剤、散霧投与剤、点鼻投与剤、点眼投与剤、筋注投与剤、又は卵内投与剤である、請求項1〜8のいずれか1項に記載のワクチン。
- 噴霧投与剤である、請求項9記載のワクチン。
- 液滴粒子径120μm以下で噴霧投与される、請求項10記載のワクチン。
- 非ヒト動物が豚である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のワクチン。
- 病原体が豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルスである、請求項12記載のワクチン。
- 抗原分子が豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質である、請求項13記載のワクチン。
- 前記ヌクレオカプシドタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号28に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列である、請求項14記載のワクチン。
- 静脈内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、経鼻投与、経皮投与、経直腸投与、経気道投与、吸入投与又は点眼投与で用いられる、請求項1〜4及び12〜15のいずれか1項に記載のワクチン。
- 抗原分子が共有結合によりリポソーム表面に結合されている、請求項1〜16のいずれか1項に記載のワクチン。
- 抗原分子がスベリン酸架橋によりリポソーム表面に結合されている、請求項17記載のワクチン。
- 非ヒト動物個体に対し、少なくとも1週間の間隔をあけて2回以上投与される、請求項1〜18のいずれか1項に記載のワクチン。
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