JPH0912480A - 抗原結合リポソーム型ワクチン - Google Patents
抗原結合リポソーム型ワクチンInfo
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- JPH0912480A JPH0912480A JP7166444A JP16644495A JPH0912480A JP H0912480 A JPH0912480 A JP H0912480A JP 7166444 A JP7166444 A JP 7166444A JP 16644495 A JP16644495 A JP 16644495A JP H0912480 A JPH0912480 A JP H0912480A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 アレルギーを引起す免疫グロブリンＩｇＥの
産生を抑制してＩｇＧの産生を増大させ、これによりア
レルギー症状をほとんど引起さず、極めて安全性が高
く、しかも安定性に優れたワクチンを得る。 【構成】 アミノ基を有するリン脂質を膜構成成分とし
て含有し、粒径０．１〜３μｍのリポソームの外水相側
のみに抗原が固定化され、内外水相に糖を含む抗原結合
リポソームからなる抗原結合リポソーム型ワクチン。
産生を抑制してＩｇＧの産生を増大させ、これによりア
レルギー症状をほとんど引起さず、極めて安全性が高
く、しかも安定性に優れたワクチンを得る。 【構成】 アミノ基を有するリン脂質を膜構成成分とし
て含有し、粒径０．１〜３μｍのリポソームの外水相側
のみに抗原が固定化され、内外水相に糖を含む抗原結合
リポソームからなる抗原結合リポソーム型ワクチン。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、リポソームの外水相側
のみに抗原が固定化された抗原固定化リポソームからな
る抗原結合リポソーム型ワクチンに関する。
のみに抗原が固定化された抗原固定化リポソームからな
る抗原結合リポソーム型ワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】ウイルスまたは細菌による感染症の予防
または疾患の軽減のためワクチンが広く利用されてい
る。このようなワクチンとしては、抗原溶液に水酸化ア
ルミニウムを加えて抗原を不溶性とした水酸化アルミニ
ウム混合ワクチン、いわゆる沈降ワクチンが通常使用さ
れ、沈降ジフテリアトキソイド、沈降ジフテリア破傷風
混合トキソイド、沈降破傷風トキソイド、沈降はぶトキ
ソイド、沈降Ｂ型肝炎ワクチン、沈降精製百日せきワク
チン、沈降精製百日せきジフテリア破傷風混合ワクチン
等が実用化されている。これらの最終製品にはアジュバ
ントとして水酸化アルミニウム（アルミニウム含量０．
３ｍｇ／ｍｌ）が含まれている。しかし、ワクチン投与
部位の浮腫や赤斑さらには抗原やタンパク質に対する過
剰の生体反応が生じる結果、一般にアレルギー反応と呼
ばれるショック症状が観察されることがあり、安全かつ
有効なワクチンの開発が望まれている。
または疾患の軽減のためワクチンが広く利用されてい
る。このようなワクチンとしては、抗原溶液に水酸化ア
ルミニウムを加えて抗原を不溶性とした水酸化アルミニ
ウム混合ワクチン、いわゆる沈降ワクチンが通常使用さ
れ、沈降ジフテリアトキソイド、沈降ジフテリア破傷風
混合トキソイド、沈降破傷風トキソイド、沈降はぶトキ
ソイド、沈降Ｂ型肝炎ワクチン、沈降精製百日せきワク
チン、沈降精製百日せきジフテリア破傷風混合ワクチン
等が実用化されている。これらの最終製品にはアジュバ
ントとして水酸化アルミニウム（アルミニウム含量０．
３ｍｇ／ｍｌ）が含まれている。しかし、ワクチン投与
部位の浮腫や赤斑さらには抗原やタンパク質に対する過
剰の生体反応が生じる結果、一般にアレルギー反応と呼
ばれるショック症状が観察されることがあり、安全かつ
有効なワクチンの開発が望まれている。
【０００３】ワクチンにより獲得免疫をもたらすために
はＩｇＧ抗体の産生が必要であるが、一方アレルギー反
応は抗体の一種であるＩｇＥの産生に関連しているとさ
れており、アレルギー反応を抑制するにはＩｇＥの産生
を抑制する必要がある。このためＩｇＥの産生を制抑す
るための種々の試みが行われており、例えば抗原タンパ
ク質をポリエチレングリコールで修飾したり（Int. Arc
h. Allergy Appl. Immunol., 56, p159-170, 1978）、
抗原をグルタルアルデヒドで重合したり(Int. Arch. Al
lergy Appl. Immunol., 74, p332-340, 1984）、アルブ
ミンと多糖類のプルランとを反応させた(Int. Arch. Al
lergy Appl. Immunol., 102, p276-278,1993）ワクチン
が知られている。しかし、これらのワクチンは、ワクチ
ンの本来の目的である抗原に対するＩｇＧの産生が不充
分になるなどの問題点がある。
はＩｇＧ抗体の産生が必要であるが、一方アレルギー反
応は抗体の一種であるＩｇＥの産生に関連しているとさ
れており、アレルギー反応を抑制するにはＩｇＥの産生
を抑制する必要がある。このためＩｇＥの産生を制抑す
るための種々の試みが行われており、例えば抗原タンパ
ク質をポリエチレングリコールで修飾したり（Int. Arc
h. Allergy Appl. Immunol., 56, p159-170, 1978）、
抗原をグルタルアルデヒドで重合したり(Int. Arch. Al
lergy Appl. Immunol., 74, p332-340, 1984）、アルブ
ミンと多糖類のプルランとを反応させた(Int. Arch. Al
lergy Appl. Immunol., 102, p276-278,1993）ワクチン
が知られている。しかし、これらのワクチンは、ワクチ
ンの本来の目的である抗原に対するＩｇＧの産生が不充
分になるなどの問題点がある。
【０００４】また、血液から採取した赤血球とアルブミ
ンとをグルタルアルデヒドにより反応させて、赤血球表
面にアルブミンを結合させることにより、ＩｇＥ抗体を
産生させずに充分な量のＩｇＧを優先的に産生させる技
術が開発されている（Int. Arch. Allergy Immunol., 1
04, p405-408, 1994）。しかしながら赤血球表面の糖脂
質による血液型の違い、さらに生物材料をワクチンの原
料とすることによる二次感染の危険性から、この技術を
利用してワクチンを大量生産することは困難である。
ンとをグルタルアルデヒドにより反応させて、赤血球表
面にアルブミンを結合させることにより、ＩｇＥ抗体を
産生させずに充分な量のＩｇＧを優先的に産生させる技
術が開発されている（Int. Arch. Allergy Immunol., 1
04, p405-408, 1994）。しかしながら赤血球表面の糖脂
質による血液型の違い、さらに生物材料をワクチンの原
料とすることによる二次感染の危険性から、この技術を
利用してワクチンを大量生産することは困難である。
【０００５】また、リポソーム中に抗原を内包する方法
も試みられており（Clinical and Experimental Allerg
y, Vol. 22 p35-42, 1992）、抗原を内包しない場合と
比べて、ＩｇＥ産生を数分の一程度まで抑制させること
はできる。そしてこの技術を利用したアレルギー患者の
治療法が知られている（DE 3412793）。すなわち、DE34
12793はアレルギー症状を引起すことが分かっている吸
入抗原をリポソームに内包して経口投与する方法であ
り、腸のパイエル板から吸収され、リンパ管を経て血流
内に入るとしている。このような抗原内包リポソーム型
ワクチンを使用すると、ＩｇＥ産生量は水酸化アルミニ
ウム混合ワクチンの場合に比べて約３０分の１に低下す
る。しかしながら、この程度のＩｇＥ産生抑制では不十
分であり、またリポソーム組成次第で抗原がリポソーム
から漏洩する場合があり、漏洩した抗原がＩｇＥと結合
してアレルギー症状を引起すという問題点がある。
も試みられており（Clinical and Experimental Allerg
y, Vol. 22 p35-42, 1992）、抗原を内包しない場合と
比べて、ＩｇＥ産生を数分の一程度まで抑制させること
はできる。そしてこの技術を利用したアレルギー患者の
治療法が知られている（DE 3412793）。すなわち、DE34
12793はアレルギー症状を引起すことが分かっている吸
入抗原をリポソームに内包して経口投与する方法であ
り、腸のパイエル板から吸収され、リンパ管を経て血流
内に入るとしている。このような抗原内包リポソーム型
ワクチンを使用すると、ＩｇＥ産生量は水酸化アルミニ
ウム混合ワクチンの場合に比べて約３０分の１に低下す
る。しかしながら、この程度のＩｇＥ産生抑制では不十
分であり、またリポソーム組成次第で抗原がリポソーム
から漏洩する場合があり、漏洩した抗原がＩｇＥと結合
してアレルギー症状を引起すという問題点がある。
【０００６】またUSP5049390には、アレルゲンをリポソ
ームに結合させた免疫治療剤が記載され、この免疫治療
剤によればＩｇＥの産生を抑制してＩｇＧの産生を増加
させ得ることが記載されている。しかし上記公報にはＩ
ｇＧおよびＩｇＥの定量的な産生量は記載されておら
ず、in vitroにおけるＩｇＧおよびＩｇＥの産生が定性
的に示されているだけであり、アレルギー抑制効果は不
十分である。
ームに結合させた免疫治療剤が記載され、この免疫治療
剤によればＩｇＥの産生を抑制してＩｇＧの産生を増加
させ得ることが記載されている。しかし上記公報にはＩ
ｇＧおよびＩｇＥの定量的な産生量は記載されておら
ず、in vitroにおけるＩｇＧおよびＩｇＥの産生が定性
的に示されているだけであり、アレルギー抑制効果は不
十分である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、初回
免疫においてＩｇＥの産生を抑制してＩｇＧの産生を増
大させ、これによりアレルギー症状をほとんど引起さ
ず、極めて安全性が高く、しかも安定性に優れ、凍結乾
燥により長期間の安定保存が可能なワクチンを提供する
ことである。
免疫においてＩｇＥの産生を抑制してＩｇＧの産生を増
大させ、これによりアレルギー症状をほとんど引起さ
ず、極めて安全性が高く、しかも安定性に優れ、凍結乾
燥により長期間の安定保存が可能なワクチンを提供する
ことである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は次の抗原結合リ
ポソーム型ワクチンである。 （１）アミノ基を有するリン脂質を膜構成成分として含
有し、粒径が０．１〜３μｍのリポソームの外水相側の
みに抗原が固定化された抗原結合リポソームからなるワ
クチンであって、内外水相に糖を含むことを特徴とする
抗原結合リポソーム型ワクチン。 （２）ＩｇＥ産生量に対するＩｇＧ産生量のタイター比
が１００〜１０，０００であることを特徴とする上記
（１）記載の抗原結合リポソーム型ワクチン。
ポソーム型ワクチンである。 （１）アミノ基を有するリン脂質を膜構成成分として含
有し、粒径が０．１〜３μｍのリポソームの外水相側の
みに抗原が固定化された抗原結合リポソームからなるワ
クチンであって、内外水相に糖を含むことを特徴とする
抗原結合リポソーム型ワクチン。 （２）ＩｇＥ産生量に対するＩｇＧ産生量のタイター比
が１００〜１０，０００であることを特徴とする上記
（１）記載の抗原結合リポソーム型ワクチン。
【０００９】本発明で用いることができるアミノ基を有
するリン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミ
ン、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルスレオ
ニンなどがあげられ、一種単独で、または二種以上組合
せて使用できる。これらのリン脂質は１位、２位の２つ
の脂肪酸残基は任意に選択することができ、その脂肪酸
残基は天然物由来または合成品由来のいずれのものでも
よく、混合脂肪酸、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、重合性
脂肪酸などに由来する炭素数４〜３０の脂肪酸残基があ
げられる。
するリン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミ
ン、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルスレオ
ニンなどがあげられ、一種単独で、または二種以上組合
せて使用できる。これらのリン脂質は１位、２位の２つ
の脂肪酸残基は任意に選択することができ、その脂肪酸
残基は天然物由来または合成品由来のいずれのものでも
よく、混合脂肪酸、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、重合性
脂肪酸などに由来する炭素数４〜３０の脂肪酸残基があ
げられる。
【００１０】上記飽和脂肪酸としては炭素数１２〜２４
のものが好ましく、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、
パルミチン酸、ステアリン酸などがあげられる。また上
記不飽和脂肪酸としては炭素数１４〜２２、不飽和結合
１〜６のものが好ましく、例えばオレイン酸、リノール
酸、リノレン酸、アラキドン酸などがあげられる。この
ようなアミノ基を有するリン脂質の中では、天然物由来
のものとしては卵黄または大豆由来のリン脂質が好まし
い。
のものが好ましく、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、
パルミチン酸、ステアリン酸などがあげられる。また上
記不飽和脂肪酸としては炭素数１４〜２２、不飽和結合
１〜６のものが好ましく、例えばオレイン酸、リノール
酸、リノレン酸、アラキドン酸などがあげられる。この
ようなアミノ基を有するリン脂質の中では、天然物由来
のものとしては卵黄または大豆由来のリン脂質が好まし
い。
【００１１】リポソームの膜構成成分（膜形成成分）と
しては、アミノ基を有するリン脂質の他にもリポソーム
を形成しうる他の化合物も使用でき、例えば大豆レシチ
ン、卵黄レシチン、ホスファチジルグリセロール、その
他のリン脂質類、コレステロール、脂肪酸、脂肪酸塩な
ど、従来からリポソームの膜構成成分として用いられて
いるものが使用できる。
しては、アミノ基を有するリン脂質の他にもリポソーム
を形成しうる他の化合物も使用でき、例えば大豆レシチ
ン、卵黄レシチン、ホスファチジルグリセロール、その
他のリン脂質類、コレステロール、脂肪酸、脂肪酸塩な
ど、従来からリポソームの膜構成成分として用いられて
いるものが使用できる。
【００１２】膜構成成分全体に占めるアミノ基を有する
リン脂質の割合は０．０１〜１００モル％、好ましくは
０．１〜３０モル％とするのが望ましい。アミノ基を有
するリン脂質の割合を多くするほど、リポソームの外水
相側に固定化することができる抗原の量を多くすること
ができる。従って、アミノ基を有するリン脂質の割合を
調節することにより、外水相側に固定化する抗原の量を
調節することができる。
リン脂質の割合は０．０１〜１００モル％、好ましくは
０．１〜３０モル％とするのが望ましい。アミノ基を有
するリン脂質の割合を多くするほど、リポソームの外水
相側に固定化することができる抗原の量を多くすること
ができる。従って、アミノ基を有するリン脂質の割合を
調節することにより、外水相側に固定化する抗原の量を
調節することができる。
【００１３】リポソームの外水相側のみに固定化する抗
原としては、従来からワクチンの抗原として使用されて
いるものが使用できる。具体的には、各種トキソイド
（破傷風、ジフテリア、はぶ）、ウイルス（インフルエ
ンザ、ポリオ、日本脳炎、麻疹、おたふくかぜ、風疹、
狂犬病、黄熱、水痘、Ａ−型肝炎、Ｂ−型肝炎、Ｃ−型
肝炎、腎症候性出血熱、テング出血熱、ロタウイルス感
染症、エイズ）、コレラ、ウイルス病秋やみ、ＢＣＧ、
マラリアなどがあげられる。
原としては、従来からワクチンの抗原として使用されて
いるものが使用できる。具体的には、各種トキソイド
（破傷風、ジフテリア、はぶ）、ウイルス（インフルエ
ンザ、ポリオ、日本脳炎、麻疹、おたふくかぜ、風疹、
狂犬病、黄熱、水痘、Ａ−型肝炎、Ｂ−型肝炎、Ｃ−型
肝炎、腎症候性出血熱、テング出血熱、ロタウイルス感
染症、エイズ）、コレラ、ウイルス病秋やみ、ＢＣＧ、
マラリアなどがあげられる。
【００１４】抗原を固定化する前のリポソームは、エク
スツルージョン法、ボルテックスミキサー法、超音波
法、界面活性剤除去法、逆層蒸発法、エタノール注入
法、プレベシクル法、フレンチプレス法、Ｗ／Ｏ／Ｗエ
マルジョン法、アニーリング法、凍結融解法など、種々
の公知の方法により製造することができる。また、これ
らの製造法を選択することにより、多重層リポソーム、
小さな一枚膜リポソーム、大きな一枚膜リポソームな
ど、種々の大きさや形態を有するリポソームを製造する
ことができる。このような方法により、リポソームの内
外水相側（外表面、内側および内表面）にアミノ基が存
在するリポソームが得られる。リポソームの粒径は０．
１〜３μｍ、好ましくは０．２〜２．５μｍである。リ
ポソームの粒径が上記上限値を超えると、ゲル化してし
まい、ワクチンとして使用できない。
スツルージョン法、ボルテックスミキサー法、超音波
法、界面活性剤除去法、逆層蒸発法、エタノール注入
法、プレベシクル法、フレンチプレス法、Ｗ／Ｏ／Ｗエ
マルジョン法、アニーリング法、凍結融解法など、種々
の公知の方法により製造することができる。また、これ
らの製造法を選択することにより、多重層リポソーム、
小さな一枚膜リポソーム、大きな一枚膜リポソームな
ど、種々の大きさや形態を有するリポソームを製造する
ことができる。このような方法により、リポソームの内
外水相側（外表面、内側および内表面）にアミノ基が存
在するリポソームが得られる。リポソームの粒径は０．
１〜３μｍ、好ましくは０．２〜２．５μｍである。リ
ポソームの粒径が上記上限値を超えると、ゲル化してし
まい、ワクチンとして使用できない。
【００１５】上記のようにして得られたアミノ基が存在
するリポソームの外水相のみに抗原を固定化するには、
グルタルアルデヒドを用いてホスファチジルエタノール
アミン等のリン脂質のアミノ基と抗原のアミノ基とを直
接架橋させる方法、反応活性試薬を用いてホスファチジ
ルエタノールアミン等のリン脂質のアミノ基と抗原のア
ミノ基とを化学結合させる方法などの公知の方法が採用
できる。
するリポソームの外水相のみに抗原を固定化するには、
グルタルアルデヒドを用いてホスファチジルエタノール
アミン等のリン脂質のアミノ基と抗原のアミノ基とを直
接架橋させる方法、反応活性試薬を用いてホスファチジ
ルエタノールアミン等のリン脂質のアミノ基と抗原のア
ミノ基とを化学結合させる方法などの公知の方法が採用
できる。
【００１６】上記反応活性試薬としては、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミジル ３−（２−ピリジチオ）プロピオ
ネート（N-hydroxysuccinimidy1 3-(2-pyridythio)prop
ionate)、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル（m-maleimidobenzoyl-N-hydro
xysuccinimide ester）、ジチオビス（スクシンイミジ
ルプロピオネート）（Dithiobis(succinimidylpropiona
te）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（Bi
s(sulfosuccinimidyl) suberate）、ジスクシンイミジ
ルスベレート（Disuccinimidyl suberate）などがあげ
られる。
シスクシンイミジル ３−（２−ピリジチオ）プロピオ
ネート（N-hydroxysuccinimidy1 3-(2-pyridythio)prop
ionate)、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル（m-maleimidobenzoyl-N-hydro
xysuccinimide ester）、ジチオビス（スクシンイミジ
ルプロピオネート）（Dithiobis(succinimidylpropiona
te）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（Bi
s(sulfosuccinimidyl) suberate）、ジスクシンイミジ
ルスベレート（Disuccinimidyl suberate）などがあげ
られる。
【００１７】グルタルアルデヒドを用いた抗原の固定化
反応は次式（１）で示される。
反応は次式（１）で示される。
【化１】
【００１８】抗原の固定化反応は、水系溶媒、例えば蒸
留水；生理的食塩水；リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリ
ス緩衝液、酢酸緩衝液等の種々の緩衝液；これらの水系
溶媒と、エタノール、メタノール、１，４−ジオキサン
等の有機溶媒との混合溶媒中で、ｐＨ１〜１２、好まし
くはｐＨ７〜１０、反応温度０〜１００℃、好ましくは
０〜６０℃で、反応時間３０分間〜２００時間、好まし
くは１時間〜２４時間の条件で行うことができる。
留水；生理的食塩水；リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリ
ス緩衝液、酢酸緩衝液等の種々の緩衝液；これらの水系
溶媒と、エタノール、メタノール、１，４−ジオキサン
等の有機溶媒との混合溶媒中で、ｐＨ１〜１２、好まし
くはｐＨ７〜１０、反応温度０〜１００℃、好ましくは
０〜６０℃で、反応時間３０分間〜２００時間、好まし
くは１時間〜２４時間の条件で行うことができる。
【００１９】このようにして反応させることにより、リ
ポソームの外水相側のアミノ基と抗原のアミノ基等とが
グルタルアルデヒドまたは活性試薬の残基を介して共有
結合により結合し、リポソームの外水相のみに抗原が固
定化された抗原結合リポソームが得られる。反応終了後
は、グリシン等のアミノ基を有する化合物を加えて未反
応のグルタルアルデヒドまたは活性試薬を失活させた
後、ゲルろ過、透析、限外ろ過、遠心分離などの方法に
より容易に単離、精製することができる。また凍結乾燥
などの方法により乾燥して保存することができ、必要に
応じて再生することができる。
ポソームの外水相側のアミノ基と抗原のアミノ基等とが
グルタルアルデヒドまたは活性試薬の残基を介して共有
結合により結合し、リポソームの外水相のみに抗原が固
定化された抗原結合リポソームが得られる。反応終了後
は、グリシン等のアミノ基を有する化合物を加えて未反
応のグルタルアルデヒドまたは活性試薬を失活させた
後、ゲルろ過、透析、限外ろ過、遠心分離などの方法に
より容易に単離、精製することができる。また凍結乾燥
などの方法により乾燥して保存することができ、必要に
応じて再生することができる。
【００２０】本発明の抗原結合リポソーム型ワクチン
は、外水相側のみに抗原が固定化され、内水相および外
水相の水相に糖を含むリポソームからなるワクチンであ
る。リポソームの内外水相に含ませる糖としては、例え
ばグルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトー
ス、イノシトール、リボース、キシロース等の単糖類；
サッカロース、ラクトース、セロビオース、トレハロー
ス、マルトース等の二糖類；ラフィノース、メレジトー
ス等の三糖類；シクロデキストリン等のオリゴ糖；デキ
ストリン等の多糖類；キシリトール、ソルビトール、マ
ンニトール、マルチトール等の糖アルコールなどがあげ
られる。これらの中では単糖類または二糖類が好まし
く、最も好ましくはグルコースである。
は、外水相側のみに抗原が固定化され、内水相および外
水相の水相に糖を含むリポソームからなるワクチンであ
る。リポソームの内外水相に含ませる糖としては、例え
ばグルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトー
ス、イノシトール、リボース、キシロース等の単糖類；
サッカロース、ラクトース、セロビオース、トレハロー
ス、マルトース等の二糖類；ラフィノース、メレジトー
ス等の三糖類；シクロデキストリン等のオリゴ糖；デキ
ストリン等の多糖類；キシリトール、ソルビトール、マ
ンニトール、マルチトール等の糖アルコールなどがあげ
られる。これらの中では単糖類または二糖類が好まし
く、最も好ましくはグルコースである。
【００２１】リポソームの内外水相に含ませる糖の濃度
は０．０５〜０．５Ｍ、好ましくは０．１５〜０．３５
Ｍとするのが好ましい。この場合、糖を溶解する溶媒と
しては、水系溶媒、例えば蒸留水；生理的食塩水、リン
酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の
緩衝液などが使用できる。このような水系溶媒のｐＨは
５〜１０、好ましくは６〜８であるのが望ましい。
は０．０５〜０．５Ｍ、好ましくは０．１５〜０．３５
Ｍとするのが好ましい。この場合、糖を溶解する溶媒と
しては、水系溶媒、例えば蒸留水；生理的食塩水、リン
酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の
緩衝液などが使用できる。このような水系溶媒のｐＨは
５〜１０、好ましくは６〜８であるのが望ましい。
【００２２】糖をリポソームの水相に含ませる方法は特
に限定されず、公知の方法が採用でき、例えばリポソー
ム調製時に予め糖を溶解させた溶液を用いる方法、ある
いはリポソームに抗原を固定化して抗原結合リポソーム
を調整した後、浸透圧勾配法などを用いて外水相に添加
した糖を内水相にも内包させる方法などを採用すること
ができる。
に限定されず、公知の方法が採用でき、例えばリポソー
ム調製時に予め糖を溶解させた溶液を用いる方法、ある
いはリポソームに抗原を固定化して抗原結合リポソーム
を調整した後、浸透圧勾配法などを用いて外水相に添加
した糖を内水相にも内包させる方法などを採用すること
ができる。
【００２３】本発明のワクチンは、リポソームの外水相
側のみに抗原が結合しているので、このようなワクチン
を用いて免疫を行うと、ＩｇＥの産生が大幅に抑制さ
れ、しかもＩｇＧの産生が増強される。このためＩｇＥ
産生量に対するＩｇＧ産生量の比、すなわちＩｇＧ／Ｉ
ｇＥ産生比が大きく、例えばタイター（ｔｉｔｅｒ）比
で１００〜１０，０００のワクチンが得られる。この値
は従来のワクチン、例えば水酸化アルミニウム混合ワク
チン、抗原をリポソームの内水相に内包したワクチンな
どのＩｇＧ／ＩｇＥ産生比に比べて著しく大きい。従っ
て、本発明のワクチンは、投与した際アレルギー症状に
関連するＩｇＥはほとんど産生されず、ＩｇＧのみが産
生されるので、一般健常人はもちろん、アレルギー患者
にとっても症状の悪化を引起すことの無い安全性の高い
ワクチンである。また本発明のワクチンはリポソームの
内外水相に糖が含まれているので、安定性に優れてお
り、凍結乾燥したのち再び水系溶媒でリポソームを再生
しても凝集などは生じない。このため凍結乾燥により長
期間安定して保存することができる。
側のみに抗原が結合しているので、このようなワクチン
を用いて免疫を行うと、ＩｇＥの産生が大幅に抑制さ
れ、しかもＩｇＧの産生が増強される。このためＩｇＥ
産生量に対するＩｇＧ産生量の比、すなわちＩｇＧ／Ｉ
ｇＥ産生比が大きく、例えばタイター（ｔｉｔｅｒ）比
で１００〜１０，０００のワクチンが得られる。この値
は従来のワクチン、例えば水酸化アルミニウム混合ワク
チン、抗原をリポソームの内水相に内包したワクチンな
どのＩｇＧ／ＩｇＥ産生比に比べて著しく大きい。従っ
て、本発明のワクチンは、投与した際アレルギー症状に
関連するＩｇＥはほとんど産生されず、ＩｇＧのみが産
生されるので、一般健常人はもちろん、アレルギー患者
にとっても症状の悪化を引起すことの無い安全性の高い
ワクチンである。また本発明のワクチンはリポソームの
内外水相に糖が含まれているので、安定性に優れてお
り、凍結乾燥したのち再び水系溶媒でリポソームを再生
しても凝集などは生じない。このため凍結乾燥により長
期間安定して保存することができる。
【００２４】なお上記タイター比の値は、ＩｇＧを下記
ＥＬＩＳＡ法、ＩｇＥを下記受身皮膚アナフィラキシー
試験（ＰＣＡ）法で測定した場合の産生比である。 ＥＬＩＳＡ法： １）抗原によるプレートのコーティング 抗原を、１ｍｇ／ｍｌの濃度で０．０５Ｍ炭酸緩衝液
（ｐＨ９．０）に溶解し、９６穴のアッセイプレートに
５０μｌ／ウェルずつ分注し、室温に一時間放置する。 ２）プレートのブロッキング ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡという）を０．２Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．２：ＰＢＳ）に１ｍｇ／ｍｌの
濃度で溶解し、上記１）のプレートに１００μｌ／ウェ
ルずつ分注し、室温に一時間放置する。 ３）血清サンプル（１次抗体）の希釈、添加 １ｍｇ／ｍｌ濃度でＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳ
Ａという）中で、本発明のワクチンで免疫したマウス血
清を１０倍希釈から始めて２倍段階で１１回希釈を行
い、上記２）のプレートに５０μｌ／ウェルずつ分注
し、室温に一時間放置する。 ４）ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体溶
液（２次抗体）の添加 上記３）のプレートをＰＢＳにて３回洗った後、ペルオ
キシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体のＰＢＳＡ溶
液を５０μｌ／ウェルずつ分注し、室温に一時間放置す
る。 ５）酵素基質溶液の添加 上記４）のプレートをＰＢＳにて３回洗った後、クエン
酸緩衝液に溶解したｏ−フェニレンジアミンジヒドロク
ロリド（０．５ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ウェルずつ
分注し、室温に１５分間放置し、発色させる。発色後、
２Ｍ硫酸を５０μｌ／ウェルずつ分注して反応を停止す
る。 ６）吸光度計を用いた測定 ＥＬＩＳＡ用プレートリーダーを用いて４９０ｎｍの吸
光で測定を行い、発色のエンドポイントを求めて、その
ポイントでのサンプル血清の平均希釈倍率をもってＥＬ
ＩＳＡタイターとする（ＥＬＩＳＡタイターをＩｇＧの
定量値として用いる。）。
ＥＬＩＳＡ法、ＩｇＥを下記受身皮膚アナフィラキシー
試験（ＰＣＡ）法で測定した場合の産生比である。 ＥＬＩＳＡ法： １）抗原によるプレートのコーティング 抗原を、１ｍｇ／ｍｌの濃度で０．０５Ｍ炭酸緩衝液
（ｐＨ９．０）に溶解し、９６穴のアッセイプレートに
５０μｌ／ウェルずつ分注し、室温に一時間放置する。 ２）プレートのブロッキング ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡという）を０．２Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．２：ＰＢＳ）に１ｍｇ／ｍｌの
濃度で溶解し、上記１）のプレートに１００μｌ／ウェ
ルずつ分注し、室温に一時間放置する。 ３）血清サンプル（１次抗体）の希釈、添加 １ｍｇ／ｍｌ濃度でＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳ
Ａという）中で、本発明のワクチンで免疫したマウス血
清を１０倍希釈から始めて２倍段階で１１回希釈を行
い、上記２）のプレートに５０μｌ／ウェルずつ分注
し、室温に一時間放置する。 ４）ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体溶
液（２次抗体）の添加 上記３）のプレートをＰＢＳにて３回洗った後、ペルオ
キシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体のＰＢＳＡ溶
液を５０μｌ／ウェルずつ分注し、室温に一時間放置す
る。 ５）酵素基質溶液の添加 上記４）のプレートをＰＢＳにて３回洗った後、クエン
酸緩衝液に溶解したｏ−フェニレンジアミンジヒドロク
ロリド（０．５ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ウェルずつ
分注し、室温に１５分間放置し、発色させる。発色後、
２Ｍ硫酸を５０μｌ／ウェルずつ分注して反応を停止す
る。 ６）吸光度計を用いた測定 ＥＬＩＳＡ用プレートリーダーを用いて４９０ｎｍの吸
光で測定を行い、発色のエンドポイントを求めて、その
ポイントでのサンプル血清の平均希釈倍率をもってＥＬ
ＩＳＡタイターとする（ＥＬＩＳＡタイターをＩｇＧの
定量値として用いる。）。
【００２５】ＰＣＡ法：本発明のワクチンで免疫したマ
ウス血清の希釈液を２倍段階で１１回希釈したものを５
匹のラット皮内に１００μｌずつ注射する。２４時間
後、抗原１ｍｇを０．５％エバンスブルー溶液１．０ｍ
ｌとともに静脈注射する。３０分後にラットを屠殺し、
血清を皮内注射した箇所に１０ｍｍ×１０ｍｍ以上の大
きさのブルースポットが生じた場合陽性と判定し、この
ときの平均希釈倍率をもってＰＣＡタイターとする（Ｐ
ＣＡタイターをＩｇＥの定量値として用いる。）。
ウス血清の希釈液を２倍段階で１１回希釈したものを５
匹のラット皮内に１００μｌずつ注射する。２４時間
後、抗原１ｍｇを０．５％エバンスブルー溶液１．０ｍ
ｌとともに静脈注射する。３０分後にラットを屠殺し、
血清を皮内注射した箇所に１０ｍｍ×１０ｍｍ以上の大
きさのブルースポットが生じた場合陽性と判定し、この
ときの平均希釈倍率をもってＰＣＡタイターとする（Ｐ
ＣＡタイターをＩｇＥの定量値として用いる。）。
【００２６】
【発明の効果】本発明の抗原結合リポソーム型ワクチン
は、リポソームの外水相側のみに抗原が固定化されてい
るので、ＩｇＥの産生を抑制してＩｇＧの産生を増大さ
せることができ、このためアレルギー症状をほとんど引
起さないので極めて安全性が高い。また特定の粒径を有
し、内外水相に糖を含んでいるので、凍結乾燥によって
も安定性が高く、長期安定保存が可能である。
は、リポソームの外水相側のみに抗原が固定化されてい
るので、ＩｇＥの産生を抑制してＩｇＧの産生を増大さ
せることができ、このためアレルギー症状をほとんど引
起さないので極めて安全性が高い。また特定の粒径を有
し、内外水相に糖を含んでいるので、凍結乾燥によって
も安定性が高く、長期安定保存が可能である。
【００２７】
【実施例】次に本発明の実施例について説明する。 参考例１（リポソームの作製） ジパルミトイルホスファチジルコリン０．９１７５ｇ
（１．２５ｍｍｏｌ）、ジパルミトイルホスファチジル
エタノールアミン０．６４９０ｇ（０．９３８ｍｍｏ
ｌ）、コレステロール０．８４４５ｇ（２．１９ｍｍｏ
ｌ）およびジミリストイルホスファチジルグリセロール
Ｎａ塩０．４３０５ｇ（０．６２５ｍｍｏｌ）をナス型
フラスコに取り、クロロホルム／メタノール／水（６５
／２５／４、容量比）混合溶剤５０ｍｌを入れ、４０℃
にて溶解した。次にロータリーエバポレーターを使用し
て減圧下に溶剤を留去し、脂質の薄膜を作った。さらに
注射用蒸留水を３０ｍｌ添加し、攪拌して均一のスラリ
ーを得た。このスラリーを液体窒素にて凍結させ、凍結
乾燥機にて２４時間乾燥させた。
（１．２５ｍｍｏｌ）、ジパルミトイルホスファチジル
エタノールアミン０．６４９０ｇ（０．９３８ｍｍｏ
ｌ）、コレステロール０．８４４５ｇ（２．１９ｍｍｏ
ｌ）およびジミリストイルホスファチジルグリセロール
Ｎａ塩０．４３０５ｇ（０．６２５ｍｍｏｌ）をナス型
フラスコに取り、クロロホルム／メタノール／水（６５
／２５／４、容量比）混合溶剤５０ｍｌを入れ、４０℃
にて溶解した。次にロータリーエバポレーターを使用し
て減圧下に溶剤を留去し、脂質の薄膜を作った。さらに
注射用蒸留水を３０ｍｌ添加し、攪拌して均一のスラリ
ーを得た。このスラリーを液体窒素にて凍結させ、凍結
乾燥機にて２４時間乾燥させた。
【００２８】次に、別途作製した緩衝液（０．１２ｍＭ
Ｎａ2ＨＰＯ4、０．８８ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、０．２５
Ｍ サッカロース、ｐＨ６．５）６０ｍｌを上記ナス型
フラスコ内に入れ、４０℃にて攪拌しながら脂質を水和
させ、リポソームを得た。次にエクストルーダーを用い
てリポソームの粒径を調整した。まず８μｍのポリカー
ボネートフィルターを通過させ、続いて５μｍ、３μ
ｍ、１μｍ、０．６５μｍ、０．４μｍおよび０．２２
μｍの順にフィルターを通過させた。途中、３μｍ、１
μｍ、０．４μｍおよび０．２２μｍ通過時点のサンプ
ルを採取して実施例の試験に供した。
Ｎａ2ＨＰＯ4、０．８８ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、０．２５
Ｍ サッカロース、ｐＨ６．５）６０ｍｌを上記ナス型
フラスコ内に入れ、４０℃にて攪拌しながら脂質を水和
させ、リポソームを得た。次にエクストルーダーを用い
てリポソームの粒径を調整した。まず８μｍのポリカー
ボネートフィルターを通過させ、続いて５μｍ、３μ
ｍ、１μｍ、０．６５μｍ、０．４μｍおよび０．２２
μｍの順にフィルターを通過させた。途中、３μｍ、１
μｍ、０．４μｍおよび０．２２μｍ通過時点のサンプ
ルを採取して実施例の試験に供した。
【００２９】実施例１ １）ワクチンの調製 参考例１のリポソームで１μｍ通過品２ｍｌを試験管に
採取し、０．５ｍｌのオボアルブミン（以下、ＯＶＡと
いう場合がある）溶液（１２ｍｇ／ｍｌ）を加えた。次
に２．４％のグルタルアルデヒド溶液０．５ｍｌを滴下
したのち、３７℃の温浴上で１時間緩やかに混合し、リ
ポソームの外水相側にオボアルブミンを固定化した。次
に２Ｍのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．２）を
０．５ｍｌ加え、溶液を４℃で一晩放置し、未反応のグ
ルタルアルデヒドを失活させた。さらにSepharose CL-4
B(Pharmacia Biotech社、商標）を充填したカラムにこ
の溶液を通して、外水相側にグルタルアルデヒドを介し
てオボアルブミンが結合したリポソームを分画し、抗原
結合リポソーム型ワクチンを得た。
採取し、０．５ｍｌのオボアルブミン（以下、ＯＶＡと
いう場合がある）溶液（１２ｍｇ／ｍｌ）を加えた。次
に２．４％のグルタルアルデヒド溶液０．５ｍｌを滴下
したのち、３７℃の温浴上で１時間緩やかに混合し、リ
ポソームの外水相側にオボアルブミンを固定化した。次
に２Ｍのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．２）を
０．５ｍｌ加え、溶液を４℃で一晩放置し、未反応のグ
ルタルアルデヒドを失活させた。さらにSepharose CL-4
B(Pharmacia Biotech社、商標）を充填したカラムにこ
の溶液を通して、外水相側にグルタルアルデヒドを介し
てオボアルブミンが結合したリポソームを分画し、抗原
結合リポソーム型ワクチンを得た。
【００３０】放射化ラベルしたオボアルブミンを用いて
別途上記と同様の操作を行い、リポソームの脂質１０ｍ
ｇ当たりのオボアルブミンの結合量を測定した結果、
０．４７ｍｇであった。また参考例１のリポソームで
０．４μｍ通過品、０．２２μｍ通過品についても上記
と同様に調製し、抗原結合リポソーム型ワクチンを得
た。
別途上記と同様の操作を行い、リポソームの脂質１０ｍ
ｇ当たりのオボアルブミンの結合量を測定した結果、
０．４７ｍｇであった。また参考例１のリポソームで
０．４μｍ通過品、０．２２μｍ通過品についても上記
と同様に調製し、抗原結合リポソーム型ワクチンを得
た。
【００３１】２）抗体産生試験 ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、８週令）を使用し、腹腔内
に、リポソームの脂質量として０．５〜２．０ｍｇの範
囲で上記１）で得た抗原結合リポソーム型ワクチン（１
μｍ通過品）を１匹当たり２００μｌ注射して免疫し
た。２〜６週間後、マウス血清中の抗原特異的ＩｇＧ抗
体をＥＬＩＳＡ法、ＩｇＥ抗体を受身皮膚アナフィラキ
シー試験（ＰＣＡ）により次のようにして定量した。
０．４μｍまたは０．２２μｍ通過品を用いた抗原結合
リポソーム型ワクチンについても同様にして行った。結
果を表１および表２に示す。
に、リポソームの脂質量として０．５〜２．０ｍｇの範
囲で上記１）で得た抗原結合リポソーム型ワクチン（１
μｍ通過品）を１匹当たり２００μｌ注射して免疫し
た。２〜６週間後、マウス血清中の抗原特異的ＩｇＧ抗
体をＥＬＩＳＡ法、ＩｇＥ抗体を受身皮膚アナフィラキ
シー試験（ＰＣＡ）により次のようにして定量した。
０．４μｍまたは０．２２μｍ通過品を用いた抗原結合
リポソーム型ワクチンについても同様にして行った。結
果を表１および表２に示す。
【００３２】ＥＬＩＳＡ法： １）抗原によるプレートのコーティング オボアルブミンを、１ｍｇ／ｍｌの濃度で０．０５Ｍ炭
酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、９６穴のアッセイプ
レートに５０μｌ／ウェルずつ分注し、室温に一時間放
置した。 ２）プレートのブロッキング ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡという）を０．２Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．２：ＰＢＳ）に１ｍｇ／ｍｌの
濃度で溶解し、上記１）のプレートに１００μｌ／ウェ
ルずつ分注し、室温に一時間放置した。 ３）血清サンプル（１次抗体）の希釈、添加 １ｍｇ／ｍｌ濃度でＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳ
Ａという）中で、抗原結合リポソーム型ワクチンで免疫
したマウス血清を１０倍希釈から始めて２倍段階で１１
回希釈を行い、上記２）のプレートに５０μｌ／ウェル
ずつ分注し、室温に一時間放置した。
酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、９６穴のアッセイプ
レートに５０μｌ／ウェルずつ分注し、室温に一時間放
置した。 ２）プレートのブロッキング ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡという）を０．２Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．２：ＰＢＳ）に１ｍｇ／ｍｌの
濃度で溶解し、上記１）のプレートに１００μｌ／ウェ
ルずつ分注し、室温に一時間放置した。 ３）血清サンプル（１次抗体）の希釈、添加 １ｍｇ／ｍｌ濃度でＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳ
Ａという）中で、抗原結合リポソーム型ワクチンで免疫
したマウス血清を１０倍希釈から始めて２倍段階で１１
回希釈を行い、上記２）のプレートに５０μｌ／ウェル
ずつ分注し、室温に一時間放置した。
【００３３】４）ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウス
ＩｇＧ抗体溶液（２次抗体）の添加 上記３）のプレートをＰＢＳにて３回洗った後、ペルオ
キシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体のＰＢＳＡ溶
液を５０μｌ／ウェルずつ分注し、室温に一時間放置し
た。 ５）酵素基質溶液の添加 上記４）のプレートをＰＢＳにて３回洗った後、クエン
酸緩衝液に溶解したｏ−フェニレンジアミンジヒドロク
ロリド（０．５ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ウェルずつ
分注し、室温に１５分間放置し、発色させた。発色後、
２Ｍ硫酸を５０μｌ／ウェルずつ分注して反応を停止し
た。 ６）吸光度計を用いた測定 ＥＬＩＳＡ用プレートリーダーを用いて４９０ｎｍの吸
光で測定を行い、発色のエンドポイントを求めて、その
ポイントでのサンプル血清の希釈倍率をもってＥＬＩＳ
Ａタイターとした（ＥＬＩＳＡタイターをＩｇＧの定量
値として用いる。）。
ＩｇＧ抗体溶液（２次抗体）の添加 上記３）のプレートをＰＢＳにて３回洗った後、ペルオ
キシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体のＰＢＳＡ溶
液を５０μｌ／ウェルずつ分注し、室温に一時間放置し
た。 ５）酵素基質溶液の添加 上記４）のプレートをＰＢＳにて３回洗った後、クエン
酸緩衝液に溶解したｏ−フェニレンジアミンジヒドロク
ロリド（０．５ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ウェルずつ
分注し、室温に１５分間放置し、発色させた。発色後、
２Ｍ硫酸を５０μｌ／ウェルずつ分注して反応を停止し
た。 ６）吸光度計を用いた測定 ＥＬＩＳＡ用プレートリーダーを用いて４９０ｎｍの吸
光で測定を行い、発色のエンドポイントを求めて、その
ポイントでのサンプル血清の希釈倍率をもってＥＬＩＳ
Ａタイターとした（ＥＬＩＳＡタイターをＩｇＧの定量
値として用いる。）。
【００３４】ＰＣＡ法：sprague-Dawleyラット（メス、
８週令、５匹）の皮内に、抗原結合リポソーム型ワクチ
ンで免疫したマウス血清の希釈液を２倍段階で１１回希
釈したものを１００μｌずつ注射した。２４時間後、オ
ボアルブミン１ｍｇを０．５％エバンスブルー溶液１．
０ｍｌとともに静脈注射した。３０分後にラットを屠殺
し、血清を皮内注射した箇所に１０ｍｍ×１０ｍｍ以上
の大きさのブルースポットが生じた場合陽性と判定し、
このときの平均希釈倍率をもってＰＣＡタイターとした
（ＰＣＡタイターをＩｇＥの定量値として用いる。）。
８週令、５匹）の皮内に、抗原結合リポソーム型ワクチ
ンで免疫したマウス血清の希釈液を２倍段階で１１回希
釈したものを１００μｌずつ注射した。２４時間後、オ
ボアルブミン１ｍｇを０．５％エバンスブルー溶液１．
０ｍｌとともに静脈注射した。３０分後にラットを屠殺
し、血清を皮内注射した箇所に１０ｍｍ×１０ｍｍ以上
の大きさのブルースポットが生じた場合陽性と判定し、
このときの平均希釈倍率をもってＰＣＡタイターとした
（ＰＣＡタイターをＩｇＥの定量値として用いる。）。
【００３５】比較例１ 水酸化アルミニウム１５ｍｇ／ｍｌ ｉｎ ＰＢＳ（Ａ
ｌ（ＯＨ）3の沈澱をホモジナイザーにかけ、エマルジ
ョンとしたもの）に、オボアルブミンを最終濃度１０μ
ｇ／ｍｌとなるように混合し、水酸化アルミニウム混合
ワクチンを調製した。このワクチンを実施例１と同様に
してマウス当り２００μｌを腹腔注射して免疫した。そ
の後は実施例１と同様にして試験した。結果を表２に示
す。
ｌ（ＯＨ）3の沈澱をホモジナイザーにかけ、エマルジ
ョンとしたもの）に、オボアルブミンを最終濃度１０μ
ｇ／ｍｌとなるように混合し、水酸化アルミニウム混合
ワクチンを調製した。このワクチンを実施例１と同様に
してマウス当り２００μｌを腹腔注射して免疫した。そ
の後は実施例１と同様にして試験した。結果を表２に示
す。
【００３６】比較例２ 比較のため、リポソームの内水相にオボアルブミンを内
包させたワクチンの例を示す。ジパルミトイルホスファ
チジルコリン０．３２１１ｇ（０．４３７５ｍｍｏ
ｌ）、コレステロール０．１６８９ｇ（０．４３７５ｍ
ｍｏｌ）およびジミリストイルホスファチジルグリセロ
ールＮａ塩０．０８６１ｇ（０．１２４９ｍｍｏｌ）を
ナス型フラスコに取り、クロロホルム／メタノール（２
／１、容量比）混合溶剤３０ｍｌを入れ、４０℃にて溶
解した。次にロータリーエバポレーターを使用して減圧
下に溶剤を留去し、脂質の薄膜を作った。さらに注射用
蒸留水を３０ｍｌ添加し、攪拌して均一のスラリーを得
た。このスラリーを液体窒素にて凍結させ、凍結乾燥機
にて２４時間乾燥させ粉末を得た。
包させたワクチンの例を示す。ジパルミトイルホスファ
チジルコリン０．３２１１ｇ（０．４３７５ｍｍｏ
ｌ）、コレステロール０．１６８９ｇ（０．４３７５ｍ
ｍｏｌ）およびジミリストイルホスファチジルグリセロ
ールＮａ塩０．０８６１ｇ（０．１２４９ｍｍｏｌ）を
ナス型フラスコに取り、クロロホルム／メタノール（２
／１、容量比）混合溶剤３０ｍｌを入れ、４０℃にて溶
解した。次にロータリーエバポレーターを使用して減圧
下に溶剤を留去し、脂質の薄膜を作った。さらに注射用
蒸留水を３０ｍｌ添加し、攪拌して均一のスラリーを得
た。このスラリーを液体窒素にて凍結させ、凍結乾燥機
にて２４時間乾燥させ粉末を得た。
【００３７】この粉末０．１４４０ｇを丸底フラスコに
取り、オボアルブミンの水溶液（１２．５ｍｇ／ｍｌ）
５ｍｌを入れて、４０℃にて攪拌しながら脂質を水和さ
せ、オボアルブミン内包リポソームを得た。次にエクス
トルーダーを用いてリポソームの粒径を調製した。まず
８μｍのポリカーボネートフィルターを通過させ、続い
て５μｍ、３μｍ、１μｍの順に通過させた。こうして
得られたリポソームをSepharose CL-4B（Pharmacia Bio
tech社、商標）を充填したカラムに通して、オボアルブ
ミン内包リポソームからなる抗原内包リポソーム型ワク
チンを分割採取した。
取り、オボアルブミンの水溶液（１２．５ｍｇ／ｍｌ）
５ｍｌを入れて、４０℃にて攪拌しながら脂質を水和さ
せ、オボアルブミン内包リポソームを得た。次にエクス
トルーダーを用いてリポソームの粒径を調製した。まず
８μｍのポリカーボネートフィルターを通過させ、続い
て５μｍ、３μｍ、１μｍの順に通過させた。こうして
得られたリポソームをSepharose CL-4B（Pharmacia Bio
tech社、商標）を充填したカラムに通して、オボアルブ
ミン内包リポソームからなる抗原内包リポソーム型ワク
チンを分割採取した。
【００３８】放射化ラベルしたオボアルブミンを用いて
別途上記と同様の操作を行い、リポソームの脂質１０ｍ
ｇ当たりのオボアルブミンの内包量を測定した結果、
０．４３ｍｇであった。上記抗原内包リポソーム型ワク
チンを用いて、実施例１と同様にして試験した。結果を
表２に示す。
別途上記と同様の操作を行い、リポソームの脂質１０ｍ
ｇ当たりのオボアルブミンの内包量を測定した結果、
０．４３ｍｇであった。上記抗原内包リポソーム型ワク
チンを用いて、実施例１と同様にして試験した。結果を
表２に示す。
【００３９】
【表１】 単位 ＩｇＧ：ＥＬＩＳＡタイター ＩｇＥ：ＰＣＡタイター
【００４０】表１の結果から、外表面にのみ抗原が固定
化され、水相に糖を含む抗原結合リポソーム型ワクチン
では、０．２２〜１μｍ通過品についてはいずれの粒径
のものについても、ＩｇＥはほとんど産生されないが、
ＩｇＧは多量に産生されることがわかる。
化され、水相に糖を含む抗原結合リポソーム型ワクチン
では、０．２２〜１μｍ通過品についてはいずれの粒径
のものについても、ＩｇＥはほとんど産生されないが、
ＩｇＧは多量に産生されることがわかる。
【００４１】
【表２】
【００４２】表２の結果からわかるように、実施例１の
ワクチンは、免疫２週後のＩｇＧ産生量は１２４０ＥＬ
ＩＳＡタイターと大きく、水酸化アルミニウム混合ワク
チン（比較例１）の約２．３倍、抗原内包リポソーム型
ワクチン（比較例２）の約３．４倍であった。これに対
してＩｇＥの生産量は実施例１では１未満と小さく、比
較例１の２４０分の１以下、比較例２の２０分の１以下
に抑制されている。このため実施例１のＩｇＧ／ＩｇＥ
産生比は比較例１の５４０倍以上、比較例２の６９倍以
上であった。このようなＩｇＥ抑制効果は免疫後の経過
日数が長くなるに従ってより顕著なものになり、免疫後
４週、６週後でもＩｇＥの産生量は増加せず、免疫４週
後のＩｇＧ／ＩｇＥ産生比は比較例１の７３５倍以上、
比較例２の１０７倍以上にも達した。
ワクチンは、免疫２週後のＩｇＧ産生量は１２４０ＥＬ
ＩＳＡタイターと大きく、水酸化アルミニウム混合ワク
チン（比較例１）の約２．３倍、抗原内包リポソーム型
ワクチン（比較例２）の約３．４倍であった。これに対
してＩｇＥの生産量は実施例１では１未満と小さく、比
較例１の２４０分の１以下、比較例２の２０分の１以下
に抑制されている。このため実施例１のＩｇＧ／ＩｇＥ
産生比は比較例１の５４０倍以上、比較例２の６９倍以
上であった。このようなＩｇＥ抑制効果は免疫後の経過
日数が長くなるに従ってより顕著なものになり、免疫後
４週、６週後でもＩｇＥの産生量は増加せず、免疫４週
後のＩｇＧ／ＩｇＥ産生比は比較例１の７３５倍以上、
比較例２の１０７倍以上にも達した。
【００４３】実施例２（安定性試験） 実施例１の１）で得たワクチン５ｍｌを採取し、液体窒
素で凍結した後６時間凍結乾燥させた。次に注射用蒸留
水を５ｍｌ添加してリポソームを再生（復水）し、リポ
ソーム形状を観察した。結果を表３に示す。
素で凍結した後６時間凍結乾燥させた。次に注射用蒸留
水を５ｍｌ添加してリポソームを再生（復水）し、リポ
ソーム形状を観察した。結果を表３に示す。
【００４４】比較例３ 比較のため、リポソームを作製する際に、糖を含まない
リン酸緩衝液で調製した場合を比較例として示す。 １）リポソームの作製 ジパルミトイルホスファチジルコリン０．９１７５ｇ
（１．２５ｍｍｏｌ）、ジパルミトイルホスファチジル
エタノールアミン０．６４９０ｇ（０．９３８ｍｍｏ
ｌ）、コレステロール０．８４４５ｇ（２．１９ｍｍｏ
ｌ）およびジミリストイルホスファチジルグリセロール
Ｎａ塩０．４３０５ｇ（０．６２５ｍｍｏｌ）をナス型
フラスコに取り、クロロホルム／メタノール／水（６５
／２５／４、容量比）混合溶剤５０ｍｌを入れて４０℃
にて溶解した。次にリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍ
ｌを加え、ロータリーエバポレーターを使用して減圧下
に溶剤を留去させ、ゲルを作製した。ボルテックスミキ
サーにて１分間振とうさせたのちリン酸緩衝液５０ｍｌ
をフラスコ内に入れ、４０℃にて１０分間攪拌し、リポ
ソームを調製した。次にエクストルーダーを用いてリポ
ソームの粒径を調製した。まず８μｍのポリカーボネー
トフィルターを通過させ、続いて５μｍ、３μｍ、１μ
ｍ順に通過させた。
リン酸緩衝液で調製した場合を比較例として示す。 １）リポソームの作製 ジパルミトイルホスファチジルコリン０．９１７５ｇ
（１．２５ｍｍｏｌ）、ジパルミトイルホスファチジル
エタノールアミン０．６４９０ｇ（０．９３８ｍｍｏ
ｌ）、コレステロール０．８４４５ｇ（２．１９ｍｍｏ
ｌ）およびジミリストイルホスファチジルグリセロール
Ｎａ塩０．４３０５ｇ（０．６２５ｍｍｏｌ）をナス型
フラスコに取り、クロロホルム／メタノール／水（６５
／２５／４、容量比）混合溶剤５０ｍｌを入れて４０℃
にて溶解した。次にリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍ
ｌを加え、ロータリーエバポレーターを使用して減圧下
に溶剤を留去させ、ゲルを作製した。ボルテックスミキ
サーにて１分間振とうさせたのちリン酸緩衝液５０ｍｌ
をフラスコ内に入れ、４０℃にて１０分間攪拌し、リポ
ソームを調製した。次にエクストルーダーを用いてリポ
ソームの粒径を調製した。まず８μｍのポリカーボネー
トフィルターを通過させ、続いて５μｍ、３μｍ、１μ
ｍ順に通過させた。
【００４５】２）ワクチンの作製 上記１）のリポソームで１μｍ通過品２ｍｌを試験管に
採取し、０．５ｍｌのオボアルブミン溶液（１２ｍｇ／
ｍｌ）を加えた。次に２．４％のグルタルアルデヒド溶
液０．５ｍｌを滴下したのち、３７℃の温浴上で１時間
緩やかに混合し、リポソームの外水相側にオボアルブミ
ンを固定化した。次に２Ｍのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ７．２）を０．５ｍｌ加え、溶液を４℃で一晩放
置し、未反応のグルタルアルデヒドを失活させた。さら
にSepharose CL-4B (Pharmacia Biotech社、商標）を充
填したカラムにこの溶液を通して、外水相側にグルタル
アルデヒドを介してオボアルブミンが結合したリポソー
ムを分画し、ワクチンを得た。放射化ラベルしたオボア
ルブミンを用いて別途上記と同様の操作を行い、リポソ
ームの脂質１０ｍｇ当たりのオボアルブミンの結合量を
測定した結果、０．４０ｍｇであった。
採取し、０．５ｍｌのオボアルブミン溶液（１２ｍｇ／
ｍｌ）を加えた。次に２．４％のグルタルアルデヒド溶
液０．５ｍｌを滴下したのち、３７℃の温浴上で１時間
緩やかに混合し、リポソームの外水相側にオボアルブミ
ンを固定化した。次に２Ｍのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ７．２）を０．５ｍｌ加え、溶液を４℃で一晩放
置し、未反応のグルタルアルデヒドを失活させた。さら
にSepharose CL-4B (Pharmacia Biotech社、商標）を充
填したカラムにこの溶液を通して、外水相側にグルタル
アルデヒドを介してオボアルブミンが結合したリポソー
ムを分画し、ワクチンを得た。放射化ラベルしたオボア
ルブミンを用いて別途上記と同様の操作を行い、リポソ
ームの脂質１０ｍｇ当たりのオボアルブミンの結合量を
測定した結果、０．４０ｍｇであった。
【００４６】３）安定性試験 上記２）で得たワクチンを用いて、実施例２と同様にし
て安定性試験を行った。結果を表３に示す。
て安定性試験を行った。結果を表３に示す。
【００４７】
【表３】 評価基準 ○：リポソームの凝集はない ×：リポソームの凝集がかなりある
【００４８】表３の結果から、糖を含まない比較例３の
ワクチンは凍結乾燥処理したのち復水させるとタンパク
質の相互作用によりリポソームの凝集が生じるが、実施
例のものは凝集せず保存安定性に優れていることがわか
る。
ワクチンは凍結乾燥処理したのち復水させるとタンパク
質の相互作用によりリポソームの凝集が生じるが、実施
例のものは凝集せず保存安定性に優れていることがわか
る。
【００４９】比較例４ 参考例１で得た粒径８μｍおよび５μｍのリポソームを
用いて、実施例１の１）と同様にしてワクチンの調製を
試みたが、グルタルアルデヒドとオボアルブミンを反応
させた際リポソームの凝集が認められた。このため大き
な粒径のリポソームからはワクチンは作製できなかっ
た。
用いて、実施例１の１）と同様にしてワクチンの調製を
試みたが、グルタルアルデヒドとオボアルブミンを反応
させた際リポソームの凝集が認められた。このため大き
な粒径のリポソームからはワクチンは作製できなかっ
た。
Claims (2)
- 【請求項１】 アミノ基を有するリン脂質を膜構成成分
として含有し、粒径が０．１〜３μｍのリポソームの外
水相側のみに抗原が固定化された抗原結合リポソームか
らなるワクチンであって、内外水相に糖を含むことを特
徴とする抗原結合リポソーム型ワクチン。 - 【請求項２】 ＩｇＥ産生量に対するＩｇＧ産生量のタ
イター比が１００〜１０，０００であることを特徴とす
る請求項１記載の抗原結合リポソーム型ワクチン。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7166444A JPH0912480A (ja) | 1995-06-30 | 1995-06-30 | 抗原結合リポソーム型ワクチン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7166444A JPH0912480A (ja) | 1995-06-30 | 1995-06-30 | 抗原結合リポソーム型ワクチン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0912480A true JPH0912480A (ja) | 1997-01-14 |
Family
ID=15831526
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7166444A Pending JPH0912480A (ja) | 1995-06-30 | 1995-06-30 | 抗原結合リポソーム型ワクチン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0912480A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003517998A (ja) * | 1998-11-17 | 2003-06-03 | ノボソム アーゲー | ナノカプセル及びその製造方法 |
| JP2005145959A (ja) * | 2003-10-20 | 2005-06-09 | Nof Corp | リン脂質膜製剤 |
| US8765721B2 (en) | 2004-12-02 | 2014-07-01 | Vaccine Technology Limited | Composition comprising phosphatidyl serine and an antigen or allergen and the use thereof |
| WO2019146716A1 (ja) * | 2018-01-26 | 2019-08-01 | 全国農業協同組合連合会 | 非ヒト動物用抗原表面結合型リポソームワクチン |
-
1995
- 1995-06-30 JP JP7166444A patent/JPH0912480A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003517998A (ja) * | 1998-11-17 | 2003-06-03 | ノボソム アーゲー | ナノカプセル及びその製造方法 |
| JP2005145959A (ja) * | 2003-10-20 | 2005-06-09 | Nof Corp | リン脂質膜製剤 |
| US8765721B2 (en) | 2004-12-02 | 2014-07-01 | Vaccine Technology Limited | Composition comprising phosphatidyl serine and an antigen or allergen and the use thereof |
| WO2019146716A1 (ja) * | 2018-01-26 | 2019-08-01 | 全国農業協同組合連合会 | 非ヒト動物用抗原表面結合型リポソームワクチン |
| JPWO2019146716A1 (ja) * | 2018-01-26 | 2021-01-14 | 全国農業協同組合連合会 | 非ヒト動物用抗原表面結合型リポソームワクチン |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051101 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051228 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060131 |