JP2001523216A

JP2001523216A - 新規のアジュバント組成物と、それからなるワクチン製剤

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Publication number: JP2001523216A
Application number: JP50458697A
Authority: JP
Inventors: パリック．インデュ
Original assignee: リサーチ．トライアングル．ファーマシューティカルズ
Priority date: 1995-06-26
Filing date: 1996-06-26
Publication date: 2001-11-20
Also published as: KR19990028383A; CA2219904A1; EP0857059A1; WO1997001330A1; AU6400796A

Abstract

(57)【要約】多糖−リン脂質接合体からなり、その多糖成分が、例えばリン脂質に接合された変成グルカン、キトサンもしくはアルギン酸塩多糖からなることができる宿主動物に投薬して免疫反応を強化させるアジュバントに関する。前記アジュバントは抗原と適当に製剤調製して、種々の病状および／または生理学的条件に適する治療用ワクチンを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】新規のアジュバント組成物と、それからなるワクチン製剤発明の分野本発明はアジュバント組成物と、それからなるワクチン配合と同様に前記アジュバントとワクチンの製法ならびに使用法にも関するものである。関連技術の説明抗原の動物への注射は長い間、抗血清（すなわち血清抗体）の生産もしくは動物の抗血清レベルを上げて、宿主動物を保護（すなわちワクチン注射）するか、あるいは抗血清を生成させて他の動物中で隔離し、それに使用するかのいずれかの有効な方法として注目されてきた。ワクチンは大抵の治療と違って、健康人の病気の予防に投薬されるので診療情報にとって独特の位置を占めている。予防注射の使用は数多い小児の病気の管理では主要な要素であったので、ワクチン使用の拡大に大変な努力が払われてきた。ワクチンはコレラ、マラリヤ、ヘルペス、水痘ならびに肺炎を含む多数の病気に対し開発されている。特定のアジュバントの利用は外的抗原に対して生成された抗血清の力価（ｔｉｔｅｒ）を増大させ、抗原そのものの好ましくない影響もしくはこのような抗体を運ぶ病原体に対する長い防禦効果を与えることができることも知られてきた。アジュバントは抗体の力価、持続時間、副基準（ｉｓｏｔｙｐｅ）と結合活性に影響するのととともに、細胞性免疫にも影響することになる。研究と開発に投ぜられた努力は有効性が長時間持続するワクチンに対する人体の免疫学的反応を増進させるワクチン・アジュバントの開発に焦点を合わせてきた。フロインド（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全アジュバント（ＦＣＡ）もしくはフロインドの不完全アジュバント（ＦＩＡ）の形状の有効なアジュバント製剤は１９３０年代中項以来周知のもので、実験動物の非相同抗原に対する抗血清の生産の改良に用いられてきた。フロインドの完全アジュバントならびにフロインドの不完全アジュバントの主要特徴は注射部位において抗原を徐々に放出できるデポ（ｄｅｐｏｔ）を注射で確実に形成させる鉱物油中における抗原の乳化である。フロインドの完全アジャバントはミコバクテリヤの死菌を含み、抗体をエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）に対して変成蛋白質上で選択的に誘導することによって明らかに作用する。結果は抗原だけと比較すると、生成された抗血清の量が比較的高いことを示す。しかしながら、フロインドの完全ならびに不完全アジュバントは著しい毒性合併症を起すことで周知である。慢性の痛みの原因ともなり、また好ましくない副作用としての苦痛を与える上に、ＦＣＡは局部的肉芽腫と、悪性腫瘍を誘発させる恐れもある。これらの理由で、ＦＣＡは米国では人もしくは家畜のワクチンとしての使用は未だかつて承認されたことがない。ワクチン開発の領域での主要目標は効力を備え、ＦＣＡのようなアジュバントの心身に害を及ぼす副作用を追放するワクチン製剤をつくることである。毒性を還元する一方、フロインドのアジュバントのようなアジュバントの効力を保持する試みは、アジュバントの効力が関与する特定の生物学的仕組みの理解の部分的にではあるが、欠如による失敗が甚しかった。フロインドのアジュバントよりは効果性が著しく低いが、フロインドのアジュバントより安全ないくつかの市販のアジュバント製品が入手できる。例えば、短時間の保留性をもつ油相に吸着させた抗原を用いる油と水とのエマルジョンが市場で入手できる。水酸化アルミニウムも商品として用いられ、その水酸化アルミニウムに直接抗原を吸着させてある。人以外の実験用で「アジュヴァックス（Ａｊｕｖａｘ）」という商品名で入手できる商品では、抗原をグルカン多糖類の多糖類マトリックスに物理的に含浸させてある。最初のアジュバントは特定の抗体反応を強化した生物学的起源の物質であった。ミコバクテリウムがアジュバントとして有効に用いられてきたので、前述の生物学的に活性の成分を免疫刺戟に原因があるミコバクテリウム属の細胞壁から隔離する試みがなされてきた。ミクロバクテリウム属から抽出された脂質の画分はトレハローズ・ジミコレート（ＴＤＭ）を活性成分として含有するが、前記ミコバクテリウム属細胞壁はムラミル・ジペプチド（ＭＤＰ）としても周知のＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンを活性成分として含有する。これらのグラム陰性のバクテリヤの細胞壁から得られるリポ多糖は免疫刺戟を示すが、しかし、その脂質Ａ部分による毒性がその使用を妨げた。サッカロミセス・セレヴィシエイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのグルカン、β−１，３−ポリグルコースはイーストの１つとして、抗腫瘍効果を引出すことと、微生物病原体に対する抵抗を改良することならびに様々な抗原に対する抗体を刺戟することか報告された。微生物を起源とするアジュバントに関連する毒物学的争点は結果として非微生物物質の研究に絞られることになった。これらの非微生物物質は界面活性剤、塩、砂糖、ポリリボヌクレオチドならびに哺乳類起源の天然物質を含む。非イオン性ならびに陽イオン性の両界面活性剤はアジュバントとして成果を挙げたが、界面活性剤が親油性であればあるほど効果も大きい。サポニンは両親媒性界面活性を有し、そのためアジュバント活性を誘導するサポニンの仕組は界面活性剤の活性と同様である。サポニンは、毒物学的論点のため人のワクチンには使用されない。リンホカインとモノカインは極めて短い生物学的半減期を有し、そのため薬物動態学関心がアジュバントとしてのその使用を妨げる。抗原とビヒクル（キャリヤー）成分からなる典型的ワクチン製剤では、前記ビヒクルとアジュバントの間の明確な区別をつけることは多数のビヒクルが抗原の免疫刺戟効果および／または遅放出が起因となり得るアジュバント様の活性度を有するので必ずしもできない。例えばアルミニウム塩は人ならびに獣医用に許可されたワクチンに最も広汎に用いられるビヒクルである。抗原はアルミニウムゲルに存し、時間をかけて徐々に放出して免疫系に間断なく挑戦しかけるものと考えられている。この明確なビヒクル効果に加えて、アルミニウム塩が種々の免疫細胞の走過性特性により真正アジュバントとしておそらく作用する。アジュバント様の活性度を備えるビヒクルの他の例は、水／油エマルジョン、油／水エマルジョン、マイクロカプセルならびにリポソームを含む。２０年以上もの間、リポソームの抗体反応を刺戟させる能力は周知のことであるが、リポソームをワクチンのキャリヤーとしての適当な成分の開発での争点は今なお継続している。抗原はリポソームを中核とする水性空間に封入するか、あるいは脂質二重層の外面に取付けることができる。リポソームのアジュバント特性を特定の免疫刺戟物、例えば脂質Ａ、リポ多糖、もしくはＭＤＰを含有させてさらに強化できる。リポソームはマクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）により選択的に取上げられることで、そのアジュバント特性を発揮するものと考えられるが、リポソームの搬送は抗原の継続放出にはならない。ナノ粒子の、合成重合体、例えばポリメタクリル酸メチルの１０乃至１０００ｎｍの中実コロイド粒子は、抗原をナノ粒子内に封入するか、あるいは前記ナノ粒子面に吸着させるかのいずれにも関係なく有効なアジュバントであると報告されている。これらのワクチンのアジュバント効果は疎水性を増大させ、また粒度を減じながら向上する。前記ポリメタクリル酸メチルのナノ粒子が緩かに生物分解できるので、アジュバント効果は免疫系に対する間断のない抗原の挑戦が原因となり得る。種々のアジュバントのハツカネズミの抗体をＨＩＶ−２スプリット・ホール・ウイルスに誘導する能力評価の最近の研究はポリメタクリル酸ナノ粒子が免疫反応と注目すべき有毒副作用を考えた時、最上の総合的アジュバントであった。しかしながら、データも２つ以上の異なるアジュバントが物理的に異なる抗原に対して要求される免疫反応の誘導が必要となり得ることを示している。研究データの別の説明は、各々の抗原に対する免疫学的反応を独特のアジュバントにより最もよく増大させることである。いずれの場合でも、別のアジュバントの開発が効力のあるワクチン製剤の満足すべき開発にとって極めて重要である。技術文献ならびに特許文献は改良アジュバントの様々の他の試みを説明している。米国特許第５，２７３，９６５号はワクチンを鼻スプレーもしくは点眼による投薬に用いることができるサポニン系群の化合物を述べている。１９９１年刊「インフェクション．アンド．イミュニティ（ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ）」第２９７８乃至２９８６頁で、スタフ．エンテロトキシン．Ｂ．トキソイドのアジュバントとして有用なポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコイド）ミクロスフェアについて述べている。Ｊ．Ｋ．ゾップ（Ｃｚｏｐ）他の米国特許第５，０５７，５０３号はβ−グルカン受容体と哺乳類食細胞上で交互作用を有する少分子量の生物学的活性オリゴ糖を開示する。この単位配位子組成物であるヘプタグルコシドは２−アミノピリジンと誘導可能で、グルコシドの容量を増大させてβ−グルカン受容体を刺戟し、このような受容体により媒介された機能を増強させるものとして説明されている。前記ヘプタグルコシドは、ワクチンもしくは他の免疫調整剤製剤、例えばアジュバント療法に有用であると述べている。Ｌ．Ｈ．ニクル（Ｎｉｋｌｅ）他の米国特許第５，１８９，０２８号は魚の免疫系をβ−１，３−グルカン、詳しくはβ−１，６−結合単一グルコース側鎖とのβ−１，３−結合主鎖をもつβ−１，３−グルカンの投与による刺戟を説明している。Ｎ．Ｍ．マッケンジー（ＭａｃＫｅｎｚｉｅ）他の米国特許第４，９８１，６８４号は可溶化剤、例えば界面活性剤種、尿素もしくはグアニジンで可溶化し、その後グリコシド、ステロールと、そして任意にリン脂質と混合して、事実上可溶化剤を除去することなく免疫刺戟複合体を形成する水不溶性抗原からなる。Ｓ．ジェームズ（ｇａｍｅｓ）の米国特許第５，０３２，４０１号は全グルカン粒子と薬理学的活性物質、例えば前記全グルカン粒子で均一に拡散させるか、あるいはそれに化学的に結合して含まれる薬剤もしくは抗原からなる医薬組成物について述べている。Ｄ．Ｈ．ヘインズ（Ｈａｙｎｅｓ）の米国特許第５，０９１，１８７号ならびに第５，０９１，１８８号は、水不溶性薬剤を継続放出として哺乳類宿主に対する投薬用の注射放出を提供するリン脂質塗布微晶質もしくは微粒子組成物について述べている。この薬品として有効な薬剤は疎水性ならびに親水性相互作用により活性配合剤材料を安定化させる膜形状の脂質をコートした固体形状につくる。この活性固体配合剤含有粒子を音波処理もしくは高剪断応力を引出す他の方法により小形の微細分離した形状に形成する。米国特許第５，２４６，７０７号は水溶性生体分子と薬品のリン脂質コーティング微結晶、液体微粒子および高濃度リポソームを用いる継続放出について説明している。このリン脂質コーティング微結晶ならびにリン脂質コーティング液体微粒子をワクチン・アジュバントと同様に使用価値のあるものとして述べている。従って、本発明の目的は免疫刺戟特徴を毒性副作用なしに備える改良アジュバントを提供することである。本発明のもう１つ別の目的は使用中安全かつ効果的なアジュバントからなるワクチン組成物の提供にある。本発明の他の目的および利点は次の開示と請求の範囲からさらに十分明白になるであろう。発明の概要本発明は抗原もしくは抗原を基剤とするワクチンと有用に併用し、免疫刺戟反応を強化できるアジュバント組成物に関するものである。広範な組成物の実施態様では、本発明は多糖−リン脂質接合体からなるアジュバントに関するものである。本発明のアジュバントの特に好ましい多糖はβ−グルカン、キトサン、ガラクトマンナンおよび抗原を含む。他の実施態様では、本発明はアジュバントを多糖から合成する方法に関するものである。アジュバントは適当であれば二価性試薬もしくは多官能性試薬を含むどのような試薬を用いても多糖ならびにリン脂質から合成できる。アジュバントは、例えば次の工程：・多糖を酸化剤で反応させて多糖にアルデヒド官能性を形成させる工程と；・前記アルデヒド官能性多糖を適当な二価性試薬と反応させて、リン脂質と反応性のある結合官能価で官能化された多糖をつくり、多糖−リン脂質接合体をさらに生じさせる工程と；・前記官能化多糖をリン脂質と反応させて、前記多糖−リン脂質接合体を生じさせる工程と；により合成できる。さらに他の実施態様における本発明は、本発明のアジュバントと、動物の抗体をつくる抗原を含むワクチン組成物からなる。さらに、本発明は免疫学的反応を動物に起させ、その動物に抗体反応を起させるだけの十分な量のアジュバントを含むワクチンの投薬からなる方法に関するものである。本発明の他の実施態様と特徴は次の開示と請求の範囲からさらに十分に明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、液体微粒子の形でのＢＳＡ（ＢＳＡ −ＭＤ）、本発明の一実施例によるβ−グルカン接合体を用いる液体微粒子の形のＢＳＡ（ＢＳＡ−ＧＭＤ）ならびにフロインドの完全アジュバントを用いるＢＳＡ（ＦＣＡ）での予防接種のハツカネズミにおける抗体力値を示すグラフ図である。図２は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、液体微粒子の形のＢＳＡ（ＢＳＡ− ＭＤ）、本発明の一実施例によるβ−グルカン接合体を用いる液体微粒子の形でのＢＳＡ（ＢＳＡ−ＧＭＤ）ならびにフロインドの完全アジュバントを用いるＢＳＡ（フロイントのＢＳＡ）での予防接種の注射後１ヶ月、２ヶ月と３ヶ月目における１：４０９６の希釈度でのハツカネズミ血漿中のＩｇＧ力価を示すグラフ図である。本発明の詳細な説明とその実施の好ましい形態本発明は、リン脂質と共役すると多糖がアジュバントを形成し、それが（ｉ）宿主動物につくられる抗体の力価、接続時間、副基準ならびに結合活性を増大させることと、（ii）フロインドのアジュバントと比較した時、宿主動物には、低い毒性と、良好な効果性ならびに安全性特徴があるという驚くべきかつ予期しない発見に基いている。本発明のアジュバントの形成に用いられる多糖は適当なものであればどんな多糖、例えば免疫刺戟活性を有する多糖からなることができる。本発明の広範な実施でアジュバント組成物に用いることができる多糖は、１９８８年オックスフォードのクラーレンドンプレス社刊、ジョンＦ．ケネディ（ＪｏｈｎＦ．Ｋｅｎｎｅｄｙ）の編集による「カーボハイドレート．ケミストリー（ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）」と、１９７０年アカデミックプレス社刊のＷ．ピグマン（Ｐｉｇｍａｎ）とＤ．ホートン（Ｈｏｒｔｏｎ）の編集による「ザ．カーボハイドレーツ．ケミストリー．アンド．バイオケミストリー（ＴｈｅＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」と、および１９８４年アカデミックプレス社刊ジョンＰ．ジッカキス（Ｚｉｋａｋｉｓ）の編集による「キティン．キトサン．アンド．リレーテッド．エンザイム（ＣｈｉｔｉｎＣｈｉｔｏｓａｎａｎｄＲｅｌａｔｅｄＥｎｚｙｍｅｓ）」に述べられた種を含む。特に好ましい多糖種は、β−グルカン、キトサン、ガラクトマンナンおよびアルギナートを含み、β−グルカンが現在最も好まれている。上述で討議したように、本発明のアジュバントは適当であればどんな合成法によっても、また二価性もしくは他の多官能性試薬を含む適当であればどんな試薬を用いても多糖とリン脂質から合成できる。最も一般的には、多糖は、多糖の酸化もしくは他の官能化反応からなり、リン脂質と共役できる形になった官能性多糖を生成させる反応により、リン脂質と共役させて合成される。アジュバントは、例えば多糖を酸化剤と反応させて多糖にアルデヒド官能性を形成させ、続いてアルデヒド官能性多糖を適当な二価性試薬と反応させ結合官能性で官能化された多糖を生じさせる。結合官能性は選択ずみリン脂質と反応性であり、多糖−リン脂質接合体をさらに生じさせる。広範な発明の範囲内の一特定の合成法では、上述の合成法に用いられる二価性試薬は、チオール官能性多糖を生じる合成手順で用いられるチオール・ヒドラジド化合物からなる。前記チオール官能性多糖を続いてリン脂質と反応させて、多糖−リン脂質接合体を前述のアジュバントとして生じさせる。本発明によるアジュバントの合成のさらなる特異の実施例として、出発多糖を酸化試薬、例えば過ヨウ素酸化合物と反応させて、多糖の酸化性官能基を対応するアルデヒド官能価（−ＣＨＯ側基）に転化させる。生成アルデヒド官能性多糖をその後、メルカプトヒドラジド化合物、例えば２−アセトアミド−４−メルカプト−酪酸ヒドラジド（ＡＭＢＨ）もしくは他の適当な二価性試薬と反応させて、適切な反応成分（末端基）を官能性多糖上に施してリン脂質接合体をそれに結合させる。本発明のアジュバント接合体の合成では、前述した、例えば多糖の初期の酸化を必要としない試薬を含む二価性試薬以外の試薬を有利に用いることができる。リン脂質を前記多糖上で、適当な既存の官能基、例えばアミノもしくはヒドロキシル基に合成化学技術で周知の方法により共役できる。本発明の多糖−リン脂質アジュバントの形成に用いられるリン脂質接合体は、例えば共有、イオン、水素、連合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ）もしくはその他の共役結合により配位でき、多糖を宿主系で生物学的に利用できるようにして、所望の免疫刺戟反応を起す多糖との薬理学的に安定した錯体を形成する適当であればどんなリン脂質からでもなることができる。本発明の広範な実施内の多糖−リン脂質接合体のリン脂質成分は、適当な試薬、例えば適切な二価性試薬との反応により共役性形状にさせることができる。本発明の実施のいくつかの事例では、リン脂質をそれが多糖と直接共役できる。また多糖を関連させる中間反応は多糖のリン脂質との共役以前には必要でない。他の事例では、多糖だけを変成させて共役できる形状にすることができ、また他の事例では、多糖ならびにリン脂質両出発原料を変化させて互いに関して共役性にする。リン脂質を二価性試薬のリン脂質との反応により多糖との共役のため適切な形状にする１つの特定の実施例として、前記二価性試薬がＮ−スクシンイミジル− ３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオナートで、しばしばこの明細書ではＳＰＤＰと言われ、またリン脂質はジパルマトイルホスフォチジル−エタノールアミンで、しばしばこの明細書ではＤＰＰＥと称せられる。ＳＰＤＰとＤＰＰＥを互いに適当な溶剤、例えばクロロホルムと反応させる。クロロホルムの適量を窒素雰囲気の下でクロロホルムを蒸発させて、適当な水混和性溶剤、例えばアセトニトリルと置換えて、前記ＤＰＰＥ−ＳＰＤＰ接合体を変成多糖との次の反応のためリン脂質成分として生じさせる。例えばチオール官能性を有する変成多糖（メルカプトヒドラジド化合物との反応の結果）はその後、前記ＳＰＤＰ誘導リン脂質と反応させて多糖−リン脂質接合体をアジュバント生成物として形成する。本発明の広範な実施に適当であればどんなリン脂質成分でも用いることができるが、有利に利用できる特別の類のリン脂質化合物は脂肪酸ホスファチジルエタノールアミン化合物を含み、その脂肪酸成分は２つの脂肪酸を含み、その各々がラウロイル、パラマトイル、ミリスチル、オレイルならびにステアリル（これらは以下の説明ではそれぞれＬ、Ｐ、Ｍ、ＯとＳの文字で示し、またそこではホスファチジルエタノールアミン成分をＰＥで示す）からなる群より個々に選ばれる。従って、上述の脂肪酸官能基を基剤とし、本発明の実施に有用に使用できる実施例となるリン脂質種は下記の表１で確認されているものも含む。リン脂質の多糖への共役により、宿主動物に免疫学的反応を緩かにかつ制御して強化させる種々のどの投薬手段を用いても投薬できるアジュバントを形成する。生成アジュバントをその後、適当であればどんな抗原、キャリヤー、付形剤、安定剤、添加剤などで製剤のため配合でき、また製剤も最終用途もしくは投薬上の必要に応じて処理できる。例えば、アジュバント製剤を凍結乾燥して宿主動物の肺患部に霧状化することで投薬に敏感に反応する粉末製剤を形成する。別の例として、製剤を音波処理もしくは剪断処理にかけて投薬を便利にするために微粒子組成物を生じさせる。本発明のさらに種々の組成物として、適当な単数もしくは複数の抗原をリン脂質および／またはアジュバントの多糖成分に配位結合させて、宿主動物からの免疫刺戟反応を強化させる組込ワクチン製剤を提供する。本発明のアジュバントとアジュバント含有ワクチン製剤を有用に投薬する宿主動物は人と、人間外の哺乳類、魚、爬虫類なども含んでいる。本発明のアジュバントを製剤する際に、リン脂質および／または多糖−リン脂質接合体の多糖成分に供有結合する抗原を用いることが、いくつかの用途に有用であり得る。別の例として、抗原を本発明のアジュバントと混合して用いることもできる。本発明の治療上有効な組成物の特異な製剤の調製は、このようにしてアジュバントを、製剤を投薬する対象で生物学的に利用価値があり、安全かつ有効にするための適当であればどんな方法ででも実施できる。本発明は治療上のアジュバントを広く考えており、それが例えば、（ｉ）少くとも１つの治療上有効な抗原もしくはワクチンと；（ii）少くとも１つの本発明による多糖−リン脂質接合物と；からなることが可能である。このような治療上の組成物は、例えば：（Ａ）ウイルス、バクテリヤ、マイコプラズマ、真菌ならびに原生動物と；（Ｂ）（Ａ）の画分、抽出物、サブユニット、代謝生成物ならびに組替え構成物と；（Ｃ）哺乳類蛋白質と糖蛋白質の画分、サブユニット、代謝生成物ならびに組替え構成物と；および（Ｄ）腫瘍特異性抗原；とからなる群より選ばれる少くとも１つの抗原剤からなる。前記治療上の組成物は従って、適当であればどんな抗原もしくはワクチン成分とも、本発明の多糖−リン脂質接合体との組合せで、例えば病原性ならびに非病原性生物体、ウイルスおよび真菌からの抗原からなる群より選ばれる抗原剤との組合せで用いることができる。さらなる実施例として、このような治療上の組成物は、病状ならびに条件、例えば天然痘、黄熱病、ジステンパー、コレラ、禽痘、猩紅熱、ジフテリア、破傷風症、百日咳、インフルエンザ、狂犬病、流行性耳下腺炎、麻疹、口蹄疫ならびに灰白脊髄炎に対し薬理学的活性を有する蛋白質、ペプチド、抗原ならびワクチンから適切になることが可能である。（ｉ）抗原と、（ii）多糖−リン脂質接合体からなる生成ワクチン製剤では、抗原とアジュバントの各々が、製剤をそれで予防接種した宿主動物、胚もしくは卵子に投薬した時、免疫反応を起させる有効な量で存在する。（ｉ）抗原と、（ii）多糖−リン脂質を含む生成ワクチン製剤を有用に用いて動物に免疫学的反応を、このような動物の体内に抗体反応を起させるだけの十分な量で投薬することで起させる。投薬の薬量はアジュバントもしくはアジュバント含有ワクチンを、アジュバントと関連抗原が免疫刺戟的効果のある宿主動物の身体上の部位への放出に適当であればどんな手段および／または方法の使用からもなることが可能である。放出の様式は、制限なしに、腸管外投薬方法、例えば皮下（ＳＣ）注射、静脈（ＩＶ）注射、鼻、眼、経皮、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、腹腔内（ＩＰ）、腔内、肺ならびに直腸投薬と、および非腸管外方法、例えば経口投薬を含むことも可能である。本発明のアジュバントとワクチンの投与速度と適切な供与形態は当業者による過度の実験の必要もなく、従来の抗体価測定技術と生物学的効能／生物学的互換性の記録を用いて容易に決定できるが、アジュバントと共に用いられる特別の抗原もしくは治療剤によっては、所望の治療効果と対生物作用の時間間隔にも左右される。本発明のアジュバントは宿主動物に他の適当であればどんな薬理学的もしくは生理学的活性剤、例えは抗原および／または他の対生物作用物質と併用して有用に投薬できる。本発明の特徴と利点は次の制限のない、また特記ない限りすべてを重量部と重量比で示した次の実施例によりさらに詳しく例証されるであろう。実施例１：本発明による適当なβ−グルカン多糖接合体を下に説明する合成手順により製剤した。 β−グルカンの変成 β−グルカンをＡＭＢＨに下記のように共役した。 β−グルカンを過沃素酸化ナトリウムで処理して多糖にアルデヒドを誘導した。５０μl（５μモル）の０．２Ｍ過沃素酸化ナトリウムを１ｍｌの水の中のβ −グルカン（２０ｍｇ）の懸濁液に添加した。反応が室温で１５時間の間行われた。生成懸濁液に、アセトニトリル（モレキュラー．プローブス社のＡＭＢＨ）に溶解した５０μl（５μモル）の０．１Ｍ２−アセトアミド−４−メルカプト酪酸ヒドラジドを添加した。室温で２４時間撹拌の後、前記β−グルカン懸濁液と共役したＡＭＢＨをＳＰＤＰ誘導リン脂質との共役のためそれ自体を用いた。ＳＰＤＰ共役ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンの合成ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（１７３ｍｇ；２５０μモル）をクロロホルムに溶解した。トリエチルアミン（２０μl）とＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリイジオチオ）−プロピオナート（７８ｍｇ；２５０μモル）（イリノイ州ロックフォードのピアース．ケミカル社）−以下ＳＰＤＰという−を順序正しく添加した。混合物を２４時間の間室温で静かに撹拌した。クロロホルムを窒素を使って蒸発させた。残液を４ｍｌのアセトニトリルで溶解して、溶液１ｍｌ当り６２μモルのＳＰＤＰ共役ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンを含む溶液を供給した。 β−グルカン−リン脂質接合体の調製ＳＰＤＰ共役ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（６．２μモルを含む１００μl）をＡＭＢＨ共役β−グルカンの１ｍｌの懸濁液に添加した。混合物を２４時間の間室温で静かに撹拌して接合体生成物を調製した。実施例II： β−グルカン−接合体ＢＳＡ製剤（ＢＳＡ−ＧＬ）０．５ｍｌの実施例１のβ−グルカン−リン脂質接合体生成物懸濁液と、０．２ｍｌの液体ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）と、１４０ｍｇの卵レシチンと、７０ｍｇのビタミンＥと、７０ｇのスクアレンおよび０．７５ｍｌのリン酸緩衝塩類液を１５分間、４℃の温度でプローブ音波処理器にかけて音波処理し、前記β−グルカン−リン脂質接合体−ＢＳＡワクチン・エマルジョン製剤を形成した。実施例III：ＢＳＡ（ＢＳＡ−ＭＤ）の液体微粒子アジュバントの製剤前記ＢＳＡの液体微粒子エマルジョン製剤を前述のヘインズ（Ｈａｙｎｅｓ）の米国特許第５，２４６、７０７号の教示に従って調製した。このワクチン製剤を比較のために用いた。０．２ｍｌの水性ＢＳＡ（１ｍｌ当り１ｍｇ）と、１４０ｍｇの卵レシチンと、７０ｍｇのスクアレンおよび１．２５ｍｌのリン酸緩衝塩類液の混合物を１５分間、４℃の温度でプローブ音波処理器にかけて音波処理して、前記ＢＳＡ−ＭＤ液体微粒子ワクチン製剤を形成した。実施例IV：アジュバントのハツカネズミでの研究本発明のアジュバント組成物のアジュバント特性をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）抗原を含有するワクチン製剤で評価した。比較研究をハツカネズミで行い、その結果はそれぞれのワクチン製剤での予防接種で生成された抗体価の測定を含めた。試験はそれぞれの試験動物の次のワクチン製剤での予防接種：（ｉ）塩類液中のウシ血清アルブミンと、（ii）液体微粒子エマルジョン状で上述実施例IIIにより調製されたＢＳＡと；（iii）本発明の一実施例による、実施例II（ＢＳＡ −ＧＬ）の手順で合成されたＢ−グルカン−リン脂質接合体アジュバントを用いるＢＳＡと；（iv）フロインドの完全アジュバント（ＦＣＡ）を用いるＢＳＡを含んだ。以下にさらに詳細に討議される結果を図１のグラフで示す。実験設計重量が約２５ｇのＣＦ−１ハツカネズミ（チャールズリバー種）を用いた。複数のハツカネズミ（１グループ当りのｎ＝５）にゼロデーで同一量の抗原を含む各々の製剤の５０μlを腹膜内に注射すると、１４日目に最初の注射と同一の量の二次免疫性を与えることとなり、かつ各々のハツカネズミからの血清試料を２８日目に分析した。前記血清試料の選択９６溜めミクロカ値板の溜めに抗原（溜めに加えられ、フリーザーで乾燥できる５０μlのアリコート）として用いられるＢＳＡの１ｍｌ当り０．５ｍｇの溶液をコートした。前記溜めを洗浄緩衝液（トリス２０ｍＭ、ＮａＣｌ０．８Ｍ、０．０５％トウィーン−２０、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、その後、各々の溜めに１ｍｌ当り１ｍｇのゼラチンを含む水溶液を30分間充填させ、その後洗浄緩衝液で３回洗浄した。血清（１００μl）の連続希釈を溜めに加え、４０℃の温度で一晩保持した。溜めを３回洗浄緩衝液で洗浄し、１０μlのヤギ抗ハツカネズミＩｇＧ−アルカリ性ホスファターゼ接合体（ノースカロライナ州シャーロットのオルガノン．テクニカ社）を加えた。室温で１時間後、溜めを３回洗浄緩衝液で洗浄した。ジエタノールアミン緩衝液ｐＨ９．８（１ｌの水に９７ｍｌジエタノールアミン、０．２ｇＮａＮ₃、１００ｍｇＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ）中に新鮮に調製された溶液（２００μl）の基質（Ｐ−ニトロフェニル燐酸（水素二）ナトリウム）１ｍｇ／ｍｌを添加し、室温で光との共存なしに２時間後の間保持した。発色を４０５ナノメートルでミクロ力値板読取装置で正確に計量した。結果結果を図１に示す。ＢＳＡ（予期通り）として呼称された製剤なしの抗原は最小限の抗体力値をもったが、液体微粒子製剤抗原（ＢＳＡ−ＭＤ）は抗血清の様々な希釈度でも製剤なしの抗原よりも良好な反応を与える。本発明によるβ−グルカン−リン脂質接合体からなる前記ＢＳＡ−グルカン製剤（ＢＳＡ−ＧＬ）の免疫反応が前記ＢＳＡ−液体微粒子製剤（ＢＳＡ−ＭＤ）よりも一層良好で、しかも試験ずみ抗血清の全希釈度でのフロインドの完全アジュバントに製剤された抗体の免疫反応よりも良好であることがわかった。実施例Ｖ：（１）未変性β−グルカン（リン脂質との共役なし）のアジュバント特性を、（２）本発明による変性β−グルカン−リン脂質接合体と比較する別の試験では、アジュバント含有未変性β−グルカンは変性β−グルカン−リン脂質接合体により達成された抗体力値の同様な強化にはならなかった。実施例VI：本発明のアジュバントのアジュバント特性をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）抗原を含むワクチン製剤で評価した。比較研究をハツカネズミで行い、その結果はそれぞれのワクチン製剤を用いる予防接種により生成された抗体価の測定を含んでいた。結果は、次掲のワクチン製剤：（ｉ）ＢＳＡ、（ii）本発明の、実施例II（ＢＳＡ−ＭＤ）の、手順により合成されたそれぞれのＢＳＡ含有アジュバント製剤と、および（iv）フロインドの完全アジュバントを用いるＢＳＡ（フロイントのＢＳＡ）により分かった。下記により詳細に討議された結果を図２のグラフで示す。アジュバントのハツカネズミでの研究６週間たったＢＡＬＢ／Ｃ（チャールズリバー種）ハツカネズミに２００μl のアジュバント調製品を用いて腹膜内に注射した。投薬したアジュバントの調製品は２００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含有していた。さらに標準的塩類液を２００μ ｇ／ｍｌで合成した。１４日目で、各々の動物を、最初の調製品と同一の濃度でつくった新鮮に準備したアジュバント調製品で二次免疫した。二次免疫の標準実施で行われるように、ＦＩＡをＦＣＡの代りに用いた。初期処理後１ヶ月、２ヶ月もしくは３ヶ月で、ハツカネズミの採血を行った。血清試料の選択９６溜めミクロ力価板の溜めに１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの溶液（前記溜めに加えて終液４℃の温度で保持した５０μＬのアリコート）をコートした。溜めを３回ＰＢＳ／１％トウィーン２０で洗浄した。１０％のヤギ血清と１％のトウィーン２０を含む１００μＬのＰＢＳを、その後溜めで１時間の間３７℃の温度で温置した。試験血清を１００μＬのＰＢＳ／１０％のヤギ血清／１％トウィーン２０に連続希釈（１：３２乃至１：４０９６）して、各々の溜めに加えて、４℃の温度で終液もしくは３７℃の温度で２時間設置し；板を、その後６回ＰＢＳ／１％トウィーン２０を用いて洗浄した。ヤギ抗ハツカネズミＩｇＧもしくはＩｇＭ共役ＨＰＲ抗体をＰＢＳ／１％トウィーン２０で１：１０００に希釈し、前記板内で３７℃の温度で２時間の間温置し；板を、その後６回ＰＢＳ／１％トウィーン２０を用いて洗浄した。ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質とペルオキシダーゼ溶液をペルオキシダーゼ反応の展開に用いた。ＥＬＩＳＡ読取りをフィシャーバイオテック、ミクロキネティックスＢＴ２０００板読取装置（４０５ｎｍ波長）を用いて行った。結果結果を図２で、それぞれＢＳＡ、ＢＳＡ−ＭＤおよびＢＳＡ−フロイントの組成物を用いる予防接種の注射後１ヶ月、２ヶ月および３ヶ月における１：４０９６希釈でハツカネズミのＩｇＧ力価のグラフを示す。図示のように、製剤なしの抗原（ＢＳＡ）は最小限の力価を有していたが、本発明の代表的な液体微粒子製剤の抗原（ＢＳＡ−ＭＤ）が初期処理後３ヶ月に亘りＢＳＡ（フロイントのＢＳＡ）を用いるフロイントのアジュバントより良好な反応を付与した。産業上の利用可能性本発明のアジュバント組成物は抗原もしくは抗原基剤のワクチンと共に宿主動物、胚あるいは卵に投与して受容宿主の免疫刺戟反応の強化に有用に用いられる。このような治療組成物は、例えば１つ以上の抗原剤、例えば（Ａ）ウイルス、バクテリヤ、マイクロプラズマ、真菌および原生動物と；（Ｂ）（Ａ）の画分、抽出物、サブユニット、代謝生成物ならびに組替え構生物と；（Ｃ）哺乳類蛋白質と糖蛋白質の画分、サブユニット、代謝生成物ならびに組替え構成物と；および（Ｄ）腫瘍特異性抗原と；からなり、またこのような治療組成物は病状と条件、例えば天然痘、黄熱病、ジステンパー、コレラ、禽痘、猩紅熱、ジフテリア、破傷風症、百日咳、インフルエンザ、狂犬病、流行性耳下腺炎、麻疹、口蹄疫ならびに灰白脊髄炎に対し薬理学的活性を有するものであって、抗原とアジュバントが各々、製剤をそれを用いて予防注射した宿主動物、胚もしくは卵に投与する時、免疫学的反応を起させるに有効な量で存在する。

【手続補正書】特許法第１８４条の４第４項【提出日】平成８年１２月３日（１９９６．１２．３）【補正内容】補正書１．請求の範囲を下記の通り補正する。１．多糖−リン脂質接合体からなり、その接合体の成分が共有結合により結合されることを特徴とする宿主動物に投薬して免疫反応を刺戟させるのに有用なアジュバント。２．前記多糖−リン脂質接合体がグルカン、キトサン、ガラクトマナンおよび抗原からなる群より選ばれる多糖からなることを特徴とする請求項１記載のアジュバント。３．前記多糖−リン脂質接合体が適当なグルカン多糖からなることを特徴とする請求項１記載のアジュバント。４．前記多糖−リン脂質接合体が適当なβ−グルカン多糖からなることを特徴とする請求項１記載のアジュバント。５．前記多糖−リン脂質接合体が脂肪酸ホスファチジルエタノールアミン成分からなる多糖成分を含むことを特徴とする請求項１記載のアジュバント。６．前記脂肪酸ホスファチジルエタノールアミンが、・ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジラウロイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジミリストイルホスファチジルタノールアミンと、・ジオレイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルミリストリルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルオレイルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・パルミトイルミリストイルホスファチジルエタノールアミンと、・パルミトイルオレイルホスファチジルエタノールアミンと、・パルミトイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・オレイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・オレイルミリストイルホスファチジルエタノールアミンと、・ミリストイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１記載のアジュバント。７．前記多糖−リン脂質接合体が凍結乾燥させた形状のものであることを特徴とする請求項１記載のアジュバント。８．前記多糖−リン脂質接合体が微粒子の形状のものであることを特徴とする請求項１記載のアジュバント。９．前記アジュバントが前記多糖−リン脂質接合体のリン脂質および／または多糖成分に共有結合している抗原を有することを特徴とする請求項１記載のアジュバント。 10．（ｉ）治療上有効な抗原もしくはワクチンと、（ii）多糖−リン脂質接合体で、その成分が共有結合により結合される接合体と；からなることを特徴とする治療組成物。 11．前記抗原もしくはワクチンが：（Ａ）ウイルス、バクテリア、マイクロプラズマ、真菌ならびに原生動物と；（Ｂ）（Ａ）の画分、抽出物、サブユニット、代謝生成物ならびに組替え構成物と；（Ｃ）哺乳類蛋白質もしくは糖蛋白質の画分、サブユニット、代謝生成物ならびに組替え構成物と；（Ｄ）腫瘍特異性抗原と；（Ｅ）上記の組合せと；からなる群より選ばれる少くとも１つの抗原剤からなることを特徴とする請求項１０記載の治療組成物。 12．前記抗原もしくはワクチンが病原性と非病原性生物体、ウイルスおよび真菌からの抗原からなる群より選ばれる抗原剤からなることを特徴とする請求項１０記載の治療組成物。 13．前記抗原もしくはワクチンが天然痘、黄熱病、ジステンパー、コレラ、禽痘、猩紅熱、ジフテリア、破傷風症、百日咳、インフルエンザ、狂犬病、流行性耳下腺炎、麻疹、口蹄疫および灰白脊髄炎からなる群より選ばれる病状に対する抗原からなることを特徴とする請求項１０記載の治療組成物。 14．（ｉ）少くとも１つの抗原と；（ｉｉ）多糖−リン脂質接合体からなる少くとも１つのアジュバントと；からなり、前記接合体成分が共有結合により結合されることと、前記抗原とアジュバントが、それを用いて予防接種した宿主動物に投与した時、免疫反応を起させるのに有効な量で各々共存することを特徴とするワクチン製剤。 15．ビタミンＥ、スクアレンおよびレシチンからなる群より選ばれる少くとも１つの成分をさらに含むことを特徴とする請求項１４記載のワクチン製剤。 16．免疫学的反応を動物、胚もしくは卵に起させる方法であって、動物、胚もしくは卵に、多糖−リン脂質接合体でその成分が共有結合により結合される接合体からなるアジュバントを前記動物、胚もしくは卵に抗体反応を起させるだけの十分な量で投薬することを特徴とする上記方法。 17．前記アジュバントを、（ｉ）他のアジュバントと、（ｉｉ）抗原からなる群より選ばれる少くとも１つの治療成分と組合せる動物への投薬からなることを特徴とする請求項１６記載の方法。 18．皮下注射、静脈注射、経口、経鼻、経眼、経皮、筋肉内、皮内、腹膜内、腔内、肺および直腸投与からなる群より選ばれる投薬様式による動物への投薬からなることを特徴とする請求項１６記載の方法。 19．腸管外投与による動物への投薬からなることを特徴とする請求項１６記載の方法。 20．前記動物への経口投与による投薬からなることを特徴とする請求項１６記載の方法。 21．免疫学的反応を動物、胚もしくは卵に起させる方法であって、動物、胚もしくは卵に、（ｉ）少くとも１つの抗原と、（ｉｉ）少くとも１つの多糖−リン脂質接合体でその成分が共有結合により結合される接合体からなるアジュバントとを含むワクチン製剤を前記動物、胚もしくは卵に抗体反応を起させるだけの十分な量で投与することを特徴とする上記方法。 22．アジュバントを免疫刺戟に有効な多糖から合成する方法であって、前記多糖をリン脂質と共有結合的に共役して多糖−リン脂質接合体を形成させることを特徴とする上記方法。 23．前記多糖と前記リン脂質の少くとも１つが二価性試薬の反応により多糖− リン脂質接合体を形成させる多糖とリン脂質の共役に反応性のある官能性接合体成分を生じさせることを特徴とする請求項２２記載の方法。 24．前記リン脂質が二価性試薬で反応を受けることを特徴とする請求項２３記載の方法。 25．前記二価性試薬がＮ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピナートであることを特徴とする請求項２４記載の方法。 26．前記多糖−リン脂質接合体が脂肪酸ホスファチジルエタルノールアミンからなるリン脂質成分を含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。 27．前記脂肪酸ホスファチジルエタノールアミンが、・ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジラウロイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジミリストイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジオレイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルミリストイルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルオレイルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・パルミトイルミリストイルホスファチジルエタノールアミンと、・パルミトイルオレイルホスファチジルエタノールアミンと、・パルミトイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・オレイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・オレイルミリストイルホスファチジルエタノールアミンと、・ミリストイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、からなる群より選ばれることを特徴とする請求項２６記載の方法。 28．・多糖を酸化剤と反応させて前記多糖上にアルデヒド官能価を形成する工程と；・前記アルデヒド官能性多糖をチオールヒドラジド化合物と反応させてチオール官能性多糖を生じさせる工程と；・前記チオール官能性多糖を、ホスファチジルエタノールアミンからなるチオ反応性官能基を用いて誘導されたリン酸脂質と反応させて前記多糖リン脂質接合体を前記アジュバントとして生じさせる工程と；からなることを特徴とする請求項２２記載の方法。【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成９年８月２２日（１９９７．８．２２）【補正内容】補正書１．請求の範囲を下記の通り補正する。１．多糖−リン脂質接合体からなり、その接合体多糖およびリン脂質成分が二価性結合により結合されることを特徴とする宿主動物に投薬して免疫反応を刺戟させるのに有用なアジュバント。２．多糖−リン脂質接合体からなり、その接合体多糖およびリン脂質成分が二価性結合により結合され、宿主動物に投薬して免疫反応を刺戟させるのに有用であり、前記多糖−リン脂質接合体がグルカン、キトサン、ガラクトマンナンおよび抗原からなる群より選ばれる多糖からなることを特徴とするアジュバント。３．前記多糖−リン脂質接合体が適当なグルカン多糖からなることを特徴とする請求項１記載のアジュバント。４．前記多糖−リン脂質接合体が適当なβ−グルカン多糖からなることを特徴とする請求項１記載のアジュバント。５．前記多糖−リン脂質接合体が、ホスファチジルエタノールアミン成分からなるリン脂質成分を含むことを特徴とする請求項１記載のアジュバント。６．前記ホスファチジルエタノールアミンの脂肪酸成分が、・ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジラウロイルホスファチジルエタノールアミンと、・シミリストイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジオレイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルミリストリルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルオレイルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・パルミトイルミリストイルホスファチジルエタノールアミンと、・パルミトイルオレイルホスファチジルエタノールアミンと、・パルミトイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・オレイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・オレイルミリストイルホスファチジルエタノールアミンと、・ミリストイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、からなる群より選ばれることを特徴とする請求項５記載のアジュバント。７．前記多糖−リン脂質接合体が凍結乾燥させた形状のものであることを特徴とする請求項１記載のアジュバント。８．前記多糖−リン脂質接合体が微粒子形状のものであることを特徴とする請求項１記載のアジュバント。９．前記アジュバントが、リン脂質と多糖成分からなる群より選ばれる多糖− リン脂質接合体の成分に共有結合的に結合された抗原を有することを特徴とする請求項１記載のアジュバント。 10．（ｉ）治療上有効な抗原もしくはワクチンと；（ii）多糖−リン脂質接合体で、その接合体多糖およびリン脂質成分が二価性結合により結合された接合体と；の混合物からなることを特徴とする治療組成物。 11．前記抗原もしくはワクチンが、（Ａ）ウイルス、バクテリア、マイクロプラズマ、真菌ならびに原生動物と；（Ｂ）（Ａ）の画分、抽出物、サブユニット、代謝生成物ならびに組替えと構成物と；（Ｃ）哺乳類蛋白質もしくは糖蛋白質の画分、サブユニット、代謝生成物ならびに組替え構成物と；（Ｄ）腫瘍特異性抗原と；（Ｅ）病原性生物体と非病原性生物体と；（Ｆ）上記の組合せと；からなる群より選ばれる少くとも１つの抗原剤からなることを特徴とする請求項１０記載の治療組成物。 12．前記抗原もしくはワクチンが病原性と非病原性生物体、ウイルスおよび真菌からの抗原からなる群より選ばれる抗原剤からなることを特徴とする請求項１０記載の治療組成物。 13．前記抗原もしくはワクチンが天然痘、黄熱病、ジステンパー、コレラ、禽痘、猩紅熱、ジフテリア、破傷風症、百日咳、インフルエンザ、狂犬病、流行性耳下腺炎、麻疹、口蹄疫および灰白脊髄炎からなる群より選ばれる病状に対する抗原からなることを特徴とする請求項１０記載の治療組成物。 14．（ｉ）少くとも１つの抗原と、（ｉｉ）多糖−リン脂質接合体からなる少くとも１つのアジュバントとからなり、前記接合体多糖とリン脂質成分が二価性結合により結合されることと、前記抗原とアジュバントが各々、それで予防接種された宿主動物に投薬された時、免疫反応を起させるだけの十分な量で共存することを特徴とするワクチン製剤。 15．ビタミンＥ、スクアレンおよびレシチンからなる群より選ばれる少くとも１つの成分からさらになることを特徴とする請求項１４記載のワクチン製剤。 16．免疫学的反応を動物、胚もしくは卵に起させる方法であって、動物、胚もしくは卵に、多糖−リン脂質接合体でその接合体多糖と、リン脂質成分が二価性結合により結合されるアジュバントを、前記動物、胚もしくは卵に抗体反応を起させるだけの十分な量で投薬することを特徴とする上記方法。 17．前記アジュバントを、（ｉ）他のアジュバントと、（ｉｉ）抗原とからなる群より選ばれる少くとも１つの治療成分と組合せる動物への投薬からなることを特徴とする請求項１６記載の方法。 18．皮下注射、静脈注射、経口、経鼻、経眼、経皮、筋肉内、皮内、腹膜内、腔内、肺および直腸投与からなる群より選ばれる投薬様式による動物への投薬からなることを特徴とする請求項１６記載の方法。 19．腸管外投与による動物への投薬からなることを特徴とする請求項１６記載の方法。 20．前記動物への経口投与による投薬からなることを特徴とする請求項１６記載の方法。 21．免疫学的方法を動物、胚もしくは卵に起させる方法であって、動物、胚芽もしくは卵に、（ｉ）少くとも１つの抗原と、（ｉｉ）少くとも１つの多糖−リン脂質接合体でその接合体多糖とリン脂質成分が二価性結合で結合される接合体からなるアジュバントとを含むワクチン製剤を前記動物、胚もしくは卵に抗体反応を起させるだけの十分な量で投薬することを特徴とする上記方法。 22．アジュバントを免疫刺戟に有効な多糖から合成する方法であって、前記多糖をリン脂質と共役して多糖−リン脂質接合体を共役することと、前記接合体多糖ならびにリン脂質成分が二価性結合により結合されることを特徴とする方法。 23．前記多糖と前記リン脂質の少くとも１つが二価性試薬により反応をうけて官能性接合体成分を生じさせ、それが前記多糖とリン脂質の共役で反応性があって前記多糖−リン脂質接合体を形成させることを特徴とする請求項２２記載の方法。 24．前記リン脂質が二価性試薬で反応を受けることを特徴とする請求項２３記載の方法。 25．前記二価性試薬がＮ−スクシニミジル−３−（２ピリジルジチオ）−プロピナートであることを特徴とする請求項２４記載の方法。 26．前記多糖−リン脂質接合体がホスファチジルエタノールアミン成分であるリン脂質成分を含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。 27．前記ホスファチジルエタノールアミンが、・ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジラウロイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジミリストイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジオレイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルミリストイルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルオレイルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・パルミトイルミリストイルホスファチジルエタノールアミンと、・パルミトイルオレイルホスファチジルエタノールアミンと、・パルミトイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・オレイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・オレイルミリストイルホスファチジルエタノールアミンと、・ミリストイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、からなる群より選ばれることを特徴とする請求項２６記載の方法。 28．・多糖を酸化剤と反応させて前記多糖上にアルデヒド官能価を形成させる工程と；・前記アルデヒド官能性多糖をチオールヒドラジド化合物と反応させてチオール官能性多糖を生じさせる工程と；・前記チオール官能性多糖を、ホスファチジルエタノールアミン成分からなるチオ反応性官能基を用いて誘導されたリン脂質と反応させて多糖−リン脂質接合体をアジュバントとして生じさせる工程と；からなることを特徴とする請求項２２記載の方法。 29．前記アジュバントを少くとも１つの抗原と配合してワクチン製剤を形成させることからさらになることを特徴とする請求項２２記載の方法。 30．前記アジュバントの抗体との配合が前記抗原とアジュバントとの反応的に複合させて前記抗原が前記アジュバントに化学的に結合されるようにすることからなることを特徴とする請求項２９記載の方法。 31．前記ワクチン製剤が剪断条件に暴露されて微粒子組成物をそれから形成することを特徴とする請求項２９記載の方法。

Claims

【特許請求の範囲】１．多糖−リン脂質接合体からなることを特徴とする宿主動物に投薬して免疫反応を刺戟させるに有用なアジュバント。２．前記多糖−リン脂質接合体がグルカン、キトサン、ガラクトマナンおよび抗体からなる群より選ばれる多糖からなることを特徴とする請求項１記載のアジュバント。３．前記多糖−リン脂質接合体が適当なグルカン多糖からなることを特徴とする請求項１記載のアジュバント。４．前記多糖−リン脂質接合体が適当なβ−グルカン多糖からなることを特徴とする請求項１記載のアジュバント。５．前記多糖−リン脂質接合体が脂肪酸ホスファチジルエタノールアミン成分からなる多糖成分を含むことを特徴とする請求項１記載のアジュバント。６．前記脂肪酸ホスファチジルエタノールアミンが、・ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジラウロイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジミリストイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジオレイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルミリストリルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルオレイルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・パルミトイルミリストイルホスファチジルエタノールアミンと、・パルミトイルオレイルホスファチジルエタノールアミンと、・パルミトイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・オレイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・オレイルミリストイルホスファチジルエタノールアミンと、・ミリストイルステアリルホスファチジルエタノールアミン、からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１記載のアジュバント。７．前記多糖−リン脂質接合体が凍結乾燥させた形状のものであることを特徴とする請求項１記載のアジュバント。８．前記多糖−リン脂質接合体が微粒子の形状のものであることを特徴とする請求項１記載のアジュバント。９．前記アジュバントが前記多糖−リン脂質接合体のリン脂質および／または多糖成分に共有結合している抗原を有することを特徴とする請求項１記載のアジュバント。 10．（ｉ）治療上有効な抗原もしくはワクチンと；（ii）多糖−リン脂質接合体と；からなる治療組成物。 11．前記抗原もしくはワクチンが、（Ａ）ウイルス、バクテリア、マイクロプラズマ、真菌ならびに原生動物と；（Ｂ）（Ａ）の区分、抽出物、サブユニット、代謝生成物ならびに組替え構成物と；（Ｃ）哺乳類蛋白質もしくは糖蛋白質の画分、サブユニット、代謝生成物ならびに組替え構成物と；（Ｄ）腫瘍特異性抗原と；（Ｅ）上記の組合せと；からなる群より選ばれる少くとも１つの抗原剤からなることを特徴とする請求項１０記載の治療組成物。 12．前記抗原もしくはワクチンが病原性と非病原性生物体、ウイルスおよび真菌からの抗原からなる群より選ばれる抗原剤からなることを特徴とする請求項１０記載の治療組成物。 13．前記抗原もしくはワクチンが天然痘、黄熱病、ジステンパー、コレラ、禽痘、猩紅熱、ジフテリア、破傷風症、百日咳、インフルエンザ、狂犬病、流行性耳下腺炎、麻疹、口蹄疫ならびに灰白脊髄炎からなる群より選ばれる病状に対する抗原からなることを特徴とする請求項１０記載の治療組成物。 14．（ｉ）少くとも１つの抗原と；（ii）多糖−リン脂質接合体からなる少くとも１つのアジュバントと；からなり、前記抗原とアジュバントが、それを用いて予防接種した宿主動物に投与した時免疫反応を起させるのに有効な量で各々共存することを特徴とするワクチン製剤。 15．前記製剤が、ビタミンＥ、スクアレンとレシチンからなる群より選ばれる少くとも１つの成分からさらになることを特徴とする請求項１４記載のワクチン製剤。 16．免疫学的反応を動物、胚もしくは卵に起させる方法で、動物、胚もしくは卵に、多糖−リン脂質接合体からなるアジュバントを前記動物、胚もしくは卵に抗体反応を起させるだけの十分な量で投薬することからなる方法。 17．前記アジュバントを、（ｉ）他のアジュバントと、（ｉｉ）抗原からなる群より選ばれる少くとも１つの治療成分とを組合せる動物への投薬からなることを特徴とする請求項１６記載の方法。 18．皮下注射、静脈注射、経口、経鼻、経眼、経皮、筋肉内、皮内、腹膜内、腔内、肺および直腸投与からなる群より選ばれる投薬様式による動物への投薬からなることを特徴とする請求項１６記載の方法。 19．腸管外投与による動物への投薬からなることを特徴とする請求項１６記載の方法。 20．前記動物への経口投与による投薬からなることを特徴とする請求項１６記載の方法。 21．免疫学的反応を動物、胚もしくは卵に起させる方法であって、動物、胚もしくは卵に、（ｉ）少くとも１つの抗原と、（ii）少くとも１つの多糖−リン脂質接合体からなるアジュバントとを含むワクチン製剤を前記動物、胚もしくは卵に抗体反応を起させるだけの十分な量で投与することを特徴とする上記方法。 22．アジュバントを免疫刺戟に有効な多糖から合成する方法であって、前記多糖をリン脂質と共役させて多糖−リン脂質接合体を形成させることを特徴とする上記方法。 23．前記多糖と前記リン脂質の少くとも１つが二価性試薬の反応により多糖− リン脂質接合体を形成させる多糖とリン脂質の共役に反応性のある官能性接合体成分を生じさせることを特徴とする請求項２２記載の方法。 24．前記リン脂質が二価性試薬で反応を受けることを特徴とする請求項２３記載の方法。 25．前記二価性試薬がＮ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピナートであることを特徴とする請求項２４記載の方法。 26．前記多糖−リン脂質接合体が脂肪酸ホスファチジルエタノールアミンからなるリン脂質成分を含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。 27．前記脂肪酸ホスファチジルエタノールアミンが、・ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジラウロイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジミリストイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジオレイルホスファチジルエタノールアミンと、・ジステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルミリストイルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルオレイルホスファチジルエタノールアミンと、・ラウロイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・パルミトイルミリストイルホスファチジルエタノールアミンと、・パルミトイルオレイルホスファチジルエタノールアミントと、・パルミトイルステアリルホスファチジルエタノールアミントと、・オレイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、・オレイルミリストイルホスファチジルエタノールアミンと、・ミリストイルステアリルホスファチジルエタノールアミンと、からなる群より選ばれることを特徴とする請求項２６記載の方法。 28．・多糖を酸化剤と反応させて前記多糖上にアルデヒド官能価を形成する工程と；・前記アルデヒド官能性多糖をチオールヒドラジド化合物と反応させてチオール官能性多糖を生じさせる工程と；・前記チオール官能性多糖を、ホスファチジルエタノールアミンからなるチオ反応性官能基を用いて誘導されたリン脂質と反応させて前記多糖−リン脂質接合体を前記アジュバントとして生じさせる工程と；からなることを特徴とする請求項２２記載の方法。 29．前記アジュバントを少くとも１つの抗原と配合してワクチン製剤を形成させることからさらになることを特徴とする請求項２２記載の方法。 30．前記アジュバントの抗原との配合が前記抗原を前記アジュバントと反応的に複合させ、前記抗原が化学的に前記アジュバントに結合されるようにすることからなることを特徴とする請求項２９記載の方法。 31．前記ワクチン製剤が剪断条件に暴露されて微粒子組成物をそれから形成させることを特徴とする請求項２９記載の方法。