JPH05505181A - 改善された免疫原性組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本願は、１９８８年８月１８日に出願した米国特許出願第２３３６７４号明細書 に一部係属している。

発明の技術分野 本発明は、免疫応答が望まれるハブテンが結晶性または準結晶性担体、殊に細菌 表面層または“８層”によって表わされるものに接合されているような改善され た免疫原性組成物に関する。

背景技術 特殊な抗原またはハブテンに対して免疫応答が望まれる場合には、Ｂ細胞仲介応 答またはＴ細胞仲介応答の何れかを引き出す能力を増大させる物質と一緒にノ１ ブテンの投与を補足することが必要とされる。１つの一般的種類のこのような補 足剤は、一般にアジｘｌ：＜トとして分級されている。これは、望ましい応答の 確保を補助すると思われるハブテンと一緒に投与される物質である。死菌および その生産物のかかるアジュバントとしての使用は、顕著な歴史をもち、かつフロ イント完全アジュバント（マイコバクテリア死菌）または他の細菌類およびその 成分、例えば免疫モジュレータ−としてのペプチドグリカンの使用は、例えばワ レン（Ｈ，Ｓ、ｆａｒｒｅｎ）他、　Ａｎｎ　Ｒｅｙ　ＩＩｌｍｕｎｏｌ　’（ １９８６）４：３６９によって検討された。

また、裸かまたは酸処理された細菌類は、ベルシュチット（Ｄ、　Ｕ、　Ｂｅ１ ｌｓｔｅｄｔ）他、　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈ　（１９８７）９８　：　 ２４９〜２５５：リビングストン（Ｐ。

：１５２４〜１５２９によって、大きい糖タンパク質上の炭水化物部分に対して 体液性免疫を誘導するためのアジュバントとして作用することが示された。、・ 欧州特許第１８０５６４号明細書には、“Ｉｓｃｏｍ”で表わされた細菌基質か らの複合体の製造が記載されている。この複合体は、細菌からの疎水性ペプチド を洗剤中に溶解し、溶解物質から洗剤を除去し、かつこの溶解物質をグリコシド 、例えばサポニンと置き換えることによって製造される。

また、小分子、殊に炭水化物中に含有されている）１ブテンは、担体、例えば牛 血清アルブミン、キーホールかさがい類のヘモシアニン、ジフテリアまたはテタ ニストキソイドおよび類似物との接合によっていっそう免疫原性になる。生じる ワクチン注射用複合抗原は、低分子量ハブテンに対して増大した免疫原性能力を 有する。

通常、経口投与される唯一のワクチンは、生きている弱毒化された生物を含有す るもの、例えば弱毒化されたポリオウィルスワクチンである。死亡した生物から なるワクチンまたはサブユニットワクチンは、一般的には経口投与されない。そ れというのも、この投与経路では、強い体系的な免疫応答は誘発されないからで ある。実際に、拡張された研究によれば、抗原の経口的摂取により、通常経口的 投与による耐性１と呼ばれる体系的低応答性の誘発された状態が生じる。サプレ ッサーＴ細胞による能動免疫抑制は、経口的投与による耐性の誘発に隠された機 構であると思われる。経口的投与による耐性の誘発における別の重要なフてフタ −は、粘膜性細網内皮系２による抗原の処理にあるものと思われる。コレラトキ シン（ＣＴ）および陽イオン化された牛血清アルブミン（ｃＢＳＡ）の双方とも 、経口的免疫感作３４の後に体系的応答を発生させ　−ることが示された。ＣＴ もｃＢｓＡもワクチン担体としてヒトに使用するには、不適当である。５最後に 、免疫原、例えば炭水化物抗原を弱体化させる免疫応答は、通常、Ｂリンパ系細 胞によって仲介された抗体応答であり、これに反してワクチン注射による効果的 保護は、一般に免疫応答の場合にＴリン、Ｇ系細胞の分割が必要とされる。Ｔリ ンパ系細胞により仲介された免疫性により炭水化物ハブテンに対して免疫応答を 変調させるために、何故、Ｂリンパ系細胞依存性ハプテンがタンパク質担体に結 合したのかという別の理由が存在する。

選択された化学結合方法の性質に依存して、担体へのハブテンのかかる結合は、 しばしば定義するのが困難であり、かつ再現性に乏しい。また、担体がトキソイ ド、例えばジフテリアまたはテタヌストキソイドである場合には、この担体の相 応するトキシンからの形成は、しばしば不完全なものであり、したがってトキソ イド調製物は、残留する毒性活性を示す。・本発明によれば、前記パラメーター の定義を可能にする二次元結晶担体が得られ、したがって免疫刺激物質または免 疫活性物質を有する秩序だった構造が得られ、毒性と関連する問題は最小になる 。また、本発明によれば、８層は経口的免疫感作の後に強い体系的免疫応答を発 生させることができることが証明される。

発明の開示 本発明によれば、低い免疫原性または免疫原性の欠如の問題、Ｔリンパ系細胞に より仲介された応答の欠如の問題、ハブテンまたは免疫活性物質の病気により定 義される（乏しい再現性の）結合の問題、ならびに抗原担体の残留毒性の問題は 、免疫活性物質が結合している担体としてタンパク質または糖タンパク質の二茨 元結晶アレーを使用することによって解決される。

また、この凝集体は、共有結合により架橋されていてもよい。二次元アレーの結 晶構造により、担体分子は、互いに一定の正確に定義された空間的配向を示し： したがって、結合の性質ならびに結合したハブテンの数および空間的配向もハブ テンまたは免疫活性物質を有することができる結合部位の間の距離も常に正確に 定義されている。

更に、本発明によれば、実際には、担体の形状、寸法、配置および表面の性質に より、有利に免疫的に活性の補助細胞によって摂取されるように構成された担体 を選択することができる。この補助細胞、例えばマクロファージ、樹状細胞また はランゲルハンス細胞にて達成することができる。

従って、本発明の１つの視点から、本発明は、免疫応答が望まれるエピトープ、 例えばハブテンを有する１つの部分にカップリングした二次元結晶担体を有する 医薬調剤に同けられている。二次元結晶アレーは、場合によっては共有結合によ る架橋によって安定化させることができる。特に好ましい結晶担体は、微生物細 胞壁の８層からの隔離により得られる。

別の視点から、本発明は、エピトープ含有部分を上記担体にカップリングさせる ことによりなる本発明の医薬調剤の製造法に同けられている。なお、別の視点か ら、本発明による方法は、重要なエピトープに対してＴ細胞により仲介された応 答またはＢ細胞により仲介された応答を引き出す方法に同けられており、この方 法は、望ましい応答を引き出すのに有効な量で、本発明の医薬調剤をを推動物の 対象に投与することからなる。医薬調剤の投与は、経口的免疫感作を得るために 経口的に行なうことができる。更に、本発明によれば、細胞により仲介された体 系的免疫応答が得られる図面の簡単な説明 第１図は、無傷の細菌類からの８層の３段階での精製を示す略図である◇ 第２図は、本発明の正確なカップリング方法を可能にする分析方法の１つを示す 線図である。

始させるのに必要とされるＴ−二糖結合Ｓ層の線量応答を示すグラフである。

第４図は、プライム細胞を有するマウスの場合にＤＴＨ応答を引き出すのに必要 とされるＴ−三糖類の量を示すグラフである。

効なアジュバントを示すグラフである。

第６図は、ＢＳＡに結合したハブテンと一緒に本発明の１つの担体に結合したハ ブテンを用いた免疫感作の結果としての遅延タイプ過敏症反応（ＤＴＨ）の比較 を示す。

第７図は、本発明による医薬調剤を用いての免疫感作によって刺激されたＴ細胞 がＤＴＨを示す能力を転移することができることを指摘するデータを示す。

第８図は、Ｓ層接合体を用いての経口的免疫感作と筋肉内免疫感作とを比較した ２つの棒グラフを示す。

第９図は、固定されていないＬｌｌｌ　Ｓ層に結合したＹハプテンに対する三次 抗体応答、Ｙハブテンの負の制御に対する抗体応答およびＹハプテンと結合した 固定されていないＬｌｌｌ　Ｓ層に対する三次抗体応答、ならびに固定されてい ないＬｌｌｌ、負の制御に対する抗体応答を示す２つの線図である。

第１０図は、固定されていないＹ−Ｌ　１１１／ＦＡに対する三次抗体応答、Ｙ ハブテンに対するイソタイプ抗体応答および固定されていないＬｌｌｌに対する イソタイプ抗体応答の免疫グロブリンイソタイプ化を示す１つの棒グラフである 。

第１１図は、固定されたＬｌｌｌＳ層にＥＤＣによ−って結合されたＴ−三糖類 に対する三次抗体応答と、異なるモル数のハブテン割合でＴ−二ｍＷｉに対する 抗体応答と、Ｌｌｌｌ　Ｓ層担体に対する抗体応答とを比較して示すグラフであ る。

第１２図は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉ ａｅ）莢膜多糖＊（ＣＰＳ）タイプ３−Ｌｌｌｌ接合体に対する三次抗体応答： 　ｃｐｓタイプ３に対する抗体応答＋ＬｌｌｌまたはＰＢＳを注射したマウスの 場合にｃｐｓタイプ３に対する負の制御応答を示す線図である。

第１３図は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉ ａｅ）莢膜多糖類（ＣＰＳ）タイプ３７Ｌ１１１Ｓ層に対する三次抗体応答：マ ウスを３　”−Ｌ　１．１．１接合体で免疫感作した場合にｃｐｓタイプ３に対 するイソタイプ抗体応答：マウスをｃｐｓタイプ３で免疫感作した場合にｃｐｓ タイプ３に対するイソタイプ抗体応答の免疫グロブリンイソタイプ化を示す１つ の棒グ第１４図は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｒ＋ｅｕ ｍｏｎｉａｅ）オリゴ糖類タイプ３に対する二次抗体応答を示す線図である。

発明の実施態様 本発明によれば、二次元結晶アレーである担体を使用することにより免疫応答を 増大させることができる医薬調剤が得られる。また、免疫活性物質を前記担体に 結合させる種々の方法を使用することができる。生じる医薬調剤は、Ｂ細胞応答 およびＴ細胞応答を刺激させる双方のために使用することができる。・担体およ び医薬調剤の性質 有利に、二次元結晶アレーは、タンパク質または糖タンパク質から構成させるこ とができ、この場合担体の構造は、細菌類の形状に類似することができる。適当 なアレーは、１つまたは幾つかの微生物細胞壁層から誘導させることができる。

従って、このアレーを有するタンパク質または糖タンパク質は、殊に簡単な方法 で得られる。このように適当なアレーは、他の付着細胞壁成分を含有することが できる。場合によっては、微生物細胞壁断片それ自体は、免疫活性物質を違−す るために使用することができる。このタイプの担体の源として特に適当なのは、 結晶表面層タンパク質からの代ねりにペプチドグリカンまたは偽ムレインから構 成されたもののような付加的な硬質層を含有する微生物である。

第１図は、典型的な細菌細胞壁の配置を精製する幾つかの段階を示す。切片ａは 、無傷の細菌細胞壁の一部分を示し、この場合Ｓは、Ｓ層を表わし：ＰＧは、ペ プチドグリカンを表わし、かつＣＭは、細胞質膜を表わす。図示されているよう に、Ｓ層は、層状構造体の場合にプロタオグリカンおよび細胞質膜と関連してい る。

切片すは、グルタルアルデヒド固定化後のエンプティペプチドグリカンサッカラ スを示す。細胞質膜は、除去され、固定化された断片は、ペプチドグリカンによ って分離された二重のＳ層を含有する。

切片Ｃは、ペプチドグリカンを除去するためのリゾ示す。ＩＳおよびＯ８の表示 は、内部Ｓ層および外部Ｓ層を表わす。サラ・アンド・スレータ−（Ｓａｒａ　 ＆　５ｌｅｙｔｒ）　、＾ｐｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌ、　（１９８９）３０・１８４参照。

本発明の１つの好ましい実施態様によれば、二次元結晶アレーは、付加的層を有 するかまたは有しないＳ層としての微生物細胞壁から誘導される。この凝集体を 製造するために、再菌類は、生物の細胞質および細胞質膜を崩壊させるのに適当 な時間で３０〜６０℃、有利に約５０℃の高められた温度で洗剤と一緒に恒温保 持される。適当な洗剤は、例えばトリトン（丁ｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、種々の アルキルポリオキシエチレンエーテル、種々のアシルポリオキシエチレンソルビ トールエステル、例えばトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）および類似物を包含する。無 傷の再菌類は、洗剤で処理することができるか、または培地は、生物の細胞形状 を保存することが不必要である場合に緩衝液の存在下に音波処理することができ るか、さもなければ破壊することができる。溶解されていない成分は、有利に遠 心分離によって回収され、ベレットは洗浄される。細胞質成分および核酸を、Ｄ Ｎアーゼ、ＲＮアーゼおよび類似物を包含する適当な酵素を用いての処理によっ てさらに除去することは、望ましいことである。次に、Ｓ層を含有する洗浄され ペレット化された凝集体は、有利にグルタルアルデヒドのような架橋剤での処理 後に担体として利用される。架橋剤は、Ｓ層の秩序だった檎ｉを安定化する量で 添加される。

また、場合によっては、残留ペプチドグリカンは、ペプチドグリカン崩壊酵素、 例えばリゾチームでの処理によって回収されたＳ層から除去することができる。

回収されたベレットは、ペプチドグリカンを除去するのに適当な時間で緩衝液中 で約３７℃で酵素を用いて処理される。

従って、細菌細胞から８層として得られる二次元結晶アレーは、一般に洗剤を使 用して秩序だってない成分を抽出することによって回収することができ、場合に よっては、ごの構造は、架橋することができ、かつ場合によってはペプチドグリ カンは、除去することができる。製造は、全細胞または破壊物質、例えば超音波 処理物に対して行なうことができる。

て保持するのに十分な寸法を有することができるので、有用な発熱物質、例えば リポ多糖類は、誘導担体の濾過によって除去することができる。

免疫活性物質を有する担体は、他の物質および組成物と組み合わせることができ る。従って、医薬調剤の種々の機能を達成することができる。例えば、強度に疎 水性の担体分子は、補助細胞によって製薬学的構造体の増大された摂取を引き起 こさせる免疫活性物質を有する凝集体と混合することができる。

種々の免疫活性物質を有する担体は、担体に架橋することができる補助マトリッ クスに結合することができる。それによって、異なる型の担体分子を組み合わせ た製薬学的調製物、例えば結晶構造の点で異なるものを発生させることができる 。

更に、１個よりも多いハブテンを有する担体凝集体は、医薬調剤の活性プロフィ ールを正確に制御するご２とができるように使用することができる。

この型の多価ワクチンを提供するための１つの方法の場合には、担体凝集体のサ ブユニットを分離させることができ、望ましいハブテンに別々に接合させ、次に 再構成させてハブテンの多重度を有する担体凝集体を得ることができる。例えば 、得られた８層を使用する好ましい実施態様の場合には、８層試料の分離された 部分は、以下に記載の条件下で個々のハブテンまたはエピトープ含有部分に接合 させることができ、さらにグアニジン塩酸塩または洗剤のような界面活性剤（ｃ ｈａｏｔｒｏｐｉｃ　ａｇｅｎｔ）の存在下に再構成させることができる。透析 による洗剤または界面活性剤の除去の際に、異なる部分に由来するプロモーター は、異なるハブテンまたは免疫活性物質で誘導されたＳ層中に自ら組合わされる 。

免疫活性分子の付着 担体は、免疫応答が望まれる抗原決定因子に付着されなければならない。本明細 書中で使用したように、“エピトープ含有部分“は、免疫応答が望まれる特異的 な決定因子を含有する１つの物質に帰因する。エピトープ含有部分は、それ自体 ハブテンであることができ、すなわち免疫原性にされる場合に抗原として挙動す る簡単な部分であることができるか、またはより複雑な部分であることができ、 これらの部分だけが、得られた抗体に関連して免疫特異性にとって重要である。

勿論、エピトープ含有部分がハブテンである場合に、適当な担体が必要であるこ とは、いっそう重要である。それというのも、この簡単で低分子量の物質は、弱 い免疫原性であるにすぎないからである。しかし、本発明の担体の使用は、免疫 応答が望まれる任意のエピトープ含有部分に適用することができる。

二次元結晶アレーは、しばしば糖タンパク質を含有し、したがっ〔ハブテンまた は免疫活性／免疫調整物質は、タンパク質または担体の炭水化物部分の何れか１ つかまたは双方に結合することができる。全体がタンパク質から構成されている 二次元結晶担体にとって、タンパク質それ自体に対する結合は、勿論、使用され なければならない。

結合態様の選択は、ハブテンおよび／または免疫活性物質の性質ならびに医薬調 剤の適用型の双方に依存免疫活性物質は、それぞれの担体分子に直接に付着させ ることができるかまたは積分子、例えばホモ申たはへテロ三官能性架橋剤または ペプチド鎖（例えば、ポリリジン）により付着させることができる。このような スペーサーまたは積分子の導入は、ハブテン等の放出のより正確な制御の利点、 ならびにマクロファージまたは他の補助細胞のエンドンーム（リソソーム）内で の酵素触媒による崩壊によって形成されるであろうような断片の性質の利点を提 供する。適当なスペーサー基を使用することにより、免疫原性凝集体の分割の好 ましい部位は、導入することもできる。商業的に入手できるホモニ官能性または へテロ三官能性リンカ−は、例えばＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｊｃａｌ　Ｃｏ、社 、ｌ？ｏｅｋｆｏｒｄ、　ＩＬから得ることができる。

本発明の医薬調剤を製造するのに有利な方法の場合、免疫活性物質を結合するで あろうような担体上の基は、免疫活性物質に付着さ、せシ以前に活性化させるこ とができる。それによって、それぞれの基へのハブテンの確実に正確で再現可能 で安定な付着は、保護される。

Ｓ層積タンパク質の炭水化物部分（グリカン）への免疫活性物質の付着のために は、糖タンパク質内での結合部位は、酸化によって、例えば過沃素酸ＩＴ塩を使 用することにより発生させることができる。°また、タンパク質部分上の結合部 位は、グルタルアルデヒドとの反応によって発生させることができ、この場合こ の試薬は、架橋および活性化に使用される。また、結合部位の形成は、活性基の 導入によって生じさせることができ、それによって、結合部位の数および種類の 正確な制御は、達成することができる。特に安定な結合のためには、ハブテンは 、担体のタンパク質部分のカルボキシル基へのアミド結合によって付着させるこ とができる。また、ハプテンの付着は、シッフ塩基の形基は、第二アミンに還元 させることができる。

免疫活性物質上の結合部位は、活性化させることができ、免疫活性物質は、この 活性化された結合部位により、担体に付着させることができる。また、このこと により、安定な結合が生じる。このことにより、免更に、１つまたはそれ以上の エピトープ含有部分と結合した担体を含有する生じる組成物は、免疫応答を引き 出すのに有用である。投与は、常法によって行な性の決定因子の使用を可能にす ることであるか、または一般的に云えば、このような免疫応答を引き出さない決 定因子に対してＴヘルパ一応答を誘発させることである。適当なエピトープ含有 部分は、ポリペプチド、炭水化物、核酸および脂質を包含する常用のものを含む 。タンパク質、糖タンパク質およびペプチドは、サイトカイン、ホルモン、グル カゴン、インシュリン様成長因子、チロイド刺激ホルモン、プロラクチン、イン ヒビン、コレシストキンまたはその断片、カルノトニン、ツマスタチン、チミン ホルモン、種々の放出因子、ならびにウィルスのタンパク質特性を有する抗原断 片および他の感染剤を包含することができる。種々の炭水化物および炭水化物複 合体は、血友病インフルエンザＢ１血液群抗原および類似物からの細菌莢膜また はエキソ多糖類を含めて十分に使用することができる。更に、脂質物質、例えば ステロイドまたはプロスタグランジン、ならびに糖脂質を使用することができる 。重要な他の分子は、アルカロイド、例えばビンドリン、サーペンチン（５ｅｒ ｐｅｎｔｉｎｅ）を包含するかまたは免疫応答が検素される任意の他のハブテン 含有物質を包含する。

本発明の免疫組成物は、抗体の耐性を向上させる能力以外にＴ細胞応答を引き出 すのに有用であるこ々ができ、この場合には、以下に記載したように、接種した 対象の場合に遅延型過敏症反応（ＤＴＨ）応答を引き出す能力によつて変性させ ることができる。更に、本発明の組成物で免疫感作された動物から得られたＴ細 胞は、他の動物対象に移植することができ、この動物対象に対して免疫性の転移 を生じる。

本発明の医薬調剤は、免疫抗原として高い抗体力価および保護イソタイプを達成 するのに適当であり、かつ免疫記憶に適当である。その抗体または断片をエピト ープ含有部分として使用する場合には、抗イデ４オタイプ抗体は、この方法によ って得ることができる。

医薬調剤は、１つおよび同じ免疫活性物質が２つの異なる細菌株から誘導された ８層に結合されている場合には、−次免疫および促進に有利に使用することがで きる。種々の養生方法は、本発明の組成物の投与に使用することができる。典型 的な免疫プロトコルの場合には、一連の注射が使用され、この場合には、その後 の注射により、最初に注射された組成物から得られた免疫応答が促進される。二 次元結晶担体の多重度の有用性により、類似のものではあるが異なる担体を連続 的に使用することができる。それによって、担体型の耐性を誘発する問題は、克 服される。場合によっては、殊に低分子量ハブテンが使用される場合には、同じ 担体に接合されたハプテンを用いて繰り返し注射することにより、この現象によ る変調された免疫応答が生じる。担体の性質を、例えば異なる微生物から調製さ れた８層を使用して変える場合には、この問題は回避することができる。従って 、まず、第１の微生物から調製された８層に接合されたエピトープ含有部分を注 射し、引続き第２の微生物から誘導された８層から構成された担体に結合された エピトープ含有部分を注射するようなプロトコールが明らかになる。

また、担体エピトープ部分複合体は、免疫吸着剤またはアフィニティマトリック スとして使用するのに適当であり、例えば診断キットに適当であるかまたはヒト の血液からの望ましくない抗体の体外欠乏に適当である。

更に、本発明は、次の例に関連して説明されるが、この例は、本発明を詳説する ものであり、本発明を限定するものではない。例中で、第２図〜第７図は、参考 のためのものである。これらの図面のさらに詳細な説明は、本明細書中の“図面 の凡例”と題された項に記載されている。

丘ユ Ａ、担体の調製 クロストリディウム・テルモヒドロスルフリクム（９の細胞（２，５ｇ）を５０ ミリモルのトリス（Ｔｒｉｓ）−ＭＣＩ緩衝液、ｐＨ７，１中に懸濁させ、かつ 短時間（約１分間）超音波処理する。次に、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　− １００の２％溶液（１２，５ｍ１）を添加し、この懸濁液を５０℃で１５分間恒 温保持する。

この処理の際に、生物の細胞質および細胞質膜は崩壊されるが、しかし二次元結 晶タンパク質含有細胞壁層（前記の“８層”）および下にあるペプチドグリカン 層は、断片として保存される。その後に、この混合物を２００００ｘｇで遠心分 離し、ベレットを３回洗浄し、洗剤を除去する。次に、ベレットを５ミリモルの 塩化マグネシウム溶液（２５ｍｌ）中に懸濁させる。

細胞質残分および核酸を除去するために、ＤＮａｓｅ（１２５μｇ）およびＲＮ アーゼ（５００μｍｇ）を−添加し、全部を３７℃で１５分間撹拌する。次に、 懸濁液を２００００Ｘｇで遠心分離し、かつ３回水で洗浄する。次に、ベレット を１．１モルのカコジル酸緩衝液（ｐＨ７，２＋　２０ｍ１）中に懸濁させ、グ ルタルアルデヒドの５０％水溶液を４℃で添加し、０．５％の最終濃度にする。

この懸濁液を４℃で数分間十分に撹拌し、遠心分離し、かつ水で洗浄する。次に 、ベレットを水（２５ｒｎｌ）中に懸濁させ、トリス（Ｔｒｉｓ）−ヒドロキシ メチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ“）を添加する。次に、室温で１０分間放放厘、 懸濁液を再び遠心分離しく２００００ｘｇ）　、かつ洗浄する。

微生物の細胞形状を保存することができかつ細胞質成分のみを除去することがで きた場合には、超音波処理を中断する。

上記方法を使用した場合には、下にあるペプチドグリカン層は、タンパク質含有 細胞壁層を一緒に残存す　−る。数多（の生物を用いた場合には、付加的な８層 の形成を生じうる。従って、８層およびペプチドグリカンのみからなる断片また は“ゴースト”は、今やペプチドグリカン層の内面上に８層を示しく第１図）： また、この付加的な８層は、ハブテンおよび／または免疫活性物質に結合されて いてもよい。

ペプチドグリカンの存在が望ましくない場合には、ペプチドグリカンは、ペプチ ドグリカン崩壊酵素、例えばリゾチームを用いて崩壊させることができ、かつ除 去させることができる。この終結時に、このセクションＡで生成された物質をリ ゾチーム（Ｔｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液、ｐＨ７，２の５０ミリモルの溶液１ｍｌ当 たりリゾチーム０．５ｍ１）の溶液を用いて３６℃で１時間処理する。この場合 、湿ったベレット０．５　ｇ当たりリゾチーム溶液１０ｍ１を添加する。使用し た微生物に応じて、得られたＳ要所片は、単独または二重の８層から構成されて いる。次に、細胞を超音波処理し、開いた断片を形成させるが、しかし超音波処 理なしの場合には、細胞形状、すなわち結晶二次元アレーは、無傷で保存される 。

Ｂ、結合部位の形成 Ａにより調製されたベレットを水（５ｍｌ）中に懸濁させ、過沃素酸ナトリウム （５ｍ　ｌ　）の０．１モルの溶液を添加する。この懸濁液を光の排除下に２４ 時間放置させ、酸化させ、かつ結合部位としてのアルデヒド官能基を形成させる 。その後に、この懸濁液を遠心分離し、ベレットを１０ミリモルの塩化ナトリウ ム溶液で洗浄し、沃素含有塩を除去する。

Ｃ９性された８層へのタンパク質の結合Ｂにより得られた酸化された物質のベレ ット（約０．２ｇ）を水（１ｍｌ）中に懸濁させ、この懸濁液を水（１０ｍｌ） 中の牛血清アルブミン（５０ｍｇ）の溶液（１ｍ　ｌ　）と混合する。この溶液 を室温で放置しく６０分間）、次いで遠心分離する。

担体に結合されたアルブミン量を測定するために、７５０ｎｍでの吸光係数を、 過沃素酸塩溶液が水によって代替されている調製物（非酸化対照）の場合と比較 して測定する。この測定結果は、第２図に示されている。担体への付着は、先に 過沃素酸塩で酸化された場合よりも明らかに著しく高い。

バシルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅ旺蜂ρ１吐駄灯 広ＰＶ７２の細胞（２，５ｇ）を５０ミリモルのトリス（Ｔｒｉｓ）　−ＨＣＩ 緩衝液、ｐＨ７゜２中に懸濁させ、かつ約１分間超音波処理する。次に、トリト ン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１００の２％溶液（１２゜５ｍ１）を添加し、この 懸濁液を５０℃で１５分間恒温保持する。この処理により、細胞の細胞質は崩壊 されるが、しかし８層およびペプチドグリカン層は、保存される。こうして、形 状が細菌細胞の元来の形状に多少とも相応する断片が形成される（所謂“ゴース ト”）。

その後に、この懸濁液を２００００Ｘｇで遠心分離し、ベレットを３回水で洗浄 し、洗剤を除去する。−茨に、ベレットを５ミリモルの塩化マグネシウム溶液（ ２５ｍｌ）中に懸濁させ、ＤＮアーゼ（デオキシリボヌクレアーゼ、１２５μｇ ）およびＲＮアーゼ（リボヌクレアーゼ、５００μｇ）を添加し、この混合物を ３７℃で１５分間撹拌する。その後に、ベレットを３回水で洗浄し、その間に遠 心分離を２００００Ｘｇで行なう。次に、ベレットを０．１モルのカコジル酸緩 衝液（ｐＨ７，２）中に懸濁させ、この懸濁液を水中のグルタルアルデヒドの５ ０％水溶液と４℃で混合し、０．５％の最終濃度にする。次に、この懸濁液を４ ℃で数分間十分に撹拌し、遠心分離し、ベレットを水で洗浄する。グルタルアル デヒド残分が２つのアルデヒド官能基の１つのみによって結合している場合には 、残留するアルデヒド官能基は、結合部位として役立ちうる。これにより、例Ｉ Ｂの記載された酸化生成物の場合と同様に結合に対してアルデヒド官能基が得ら 前項２Ａで調製された変性Ｓ層を例ＩＣの場合と同様に牛血清アルブミンに溶液 と混合し、結合されたタンパク質の量を例ＩＣの記載と同様に測定する。

９の細胞をグルタルアルデヒド（０，１モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液０５ ％、ｐＨ７，２）で２０℃で２０分間処理し、こうして最も外側の細胞壁層（８ 層）を安定化させる。反応を過剰のエタノールアミンの添加によって終結させる 。架橋の間、細胞壁断片は、懸濁中に存在することができるかまたは多孔質表面 （例えば、８層限外濾過膜）に付着させることができる。次に、細胞壁断片を蒸 留水で洗浄し、試薬混合物を除去する。

上記Ａと同様に架橋調製されたペレットを蒸留水（３０ｍｌ）中に懸濁させ、こ の懸濁液に１−エチル−３，３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ ＥＤＡＣ：　６０ｍｇ）を添加し、ｐＨを４．７５に維持する。この工程により ８層の晒されたカルボキシル基を活性化する。その後に、ヘキサメチレンジアミ ンの過剰量（０，５ｇ）を添加し、ｐＨを６０分間８゜０に維持する。その後に 、反応を酢酸の添加によって終結させる。懸濁液を２００００Ｘｇで遠心分離し 、−ペレットを３回蒸留水で遠心分離する。湿ったペレッ）　（１００ｍｇ）を ５０ミリモルの燐酸塩緩衝液、ｐＨ７（９ｍｌ）中に懸濁させ、メタ−マレイミ ドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの溶液（テトラヒドロフ ラン１ｍｌ当たり５０ｍｇ）過沃素酸ナトリウム（５ｍｌ）の０．１モルの溶液 を添加する。次に、この混合物を２０℃で３０分間恒温保持引続いて、２０００ ０Ｘｇで遠心分離し１、ペレットを５０ミリモルの燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，０） 中に懸濁させ、β−ガラクトシダーゼ（２０ｍｇ）を添加し、この混合物を２０ ℃で２時間恒温保持する。２００００×ｇでの遠心分離後、燐酸塩緩衝液での洗 浄を繰り返し、タンパク質マトリックスへ共有結合したβ−ガラクトシダーゼの 活性を測定する。

本例の反応は、次のように纏められる：（Ｎ−置換カルバメート） インベルターゼの結合のために、Ｓ層糖タンパク質の炭水化物部分（グリカン） のビシナルなジオール基を利用する。細胞壁断片を例３の項Ａの記載と同様にグ ルタルアルデヒドで処理し、最も外側の細胞表面を安定化する。

前項Ａからの細胞壁断片（１００ｍｇ）を無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中 に懸濁させ、２０℃で１０分間恒温保持し、２００００Ｘｇで遠心分離し、かつ 再び無水テトラヒドロフラン（１０ｍｌ）中の臭化シアンの２．５％溶液中に懸 濁させる。次に、２時間恒温保持し、細胞壁断片を２００００ｘｇで遠心分離し 、かつ残留試薬を除去するためにＴＨＦで洗浄するペレットをインベルターゼ（ ２０ｍｇ）を含有する５０ミリモルの燐酸塩緩衝液（ｐＨ８，０、ｌ　Ｑ　ｍ　 １）中に懸濁させ、かつ４℃で１８時間恒温保持する。

次に、２００００Ｘｇで遠心分離し、ペレットを２回燐酸塩緩衝液で洗浄し、タ ンパク質マトリックスへ結合したインベルターゼの酵素活性を測定する。

本例の反応は、次のように纏められる：６９の細胞壁断片を例３、セクションＡ の記載と同様にグルタルアルデヒドで架橋する。

Ｂ、結合部位の発生 細胞壁断片（０，１ｇ）を無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２０ｍ１）中に 懸濁させ、ＥＤＣ（６０ｍｇ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０，５ｇ ）を懸濁液に添加する。次に、１時間恒温保持し、懸濁液を２００００Ｘｇで遠 心分離し、かつ２回ＤＭＦで洗浄する。

Ｃ１こうして変性された８層へのタンパク　の結合５Ｂのようにして得られたペ レットを溶解デキストラナーゼ（２０ｍｇ）を含有する０　１モルの炭酸水素ナ トリウム（ｐＨ８，８）中に懸濁させ、この反応混合物を４℃で１８時間恒温保 持する。結合したデキストラナーゼを含有する細胞壁断片を２００００ｘｇでの 遠心分離によって得、かつ２回蒸留水モ洗浄する。次に、ペレットに含有される デキストラナーゼ活性を測定する。

本例の反応は、次のように纏められる：！Ｌ旦 酸化Ｓ層への合成炭水化物抗原のカップリングＡ、担体の調製および結合部位の 発生 酸化糖タンパク質Ｓ層の調製を例１、項ＡおよびＢの記載と同様に実施した。

Ｂ、担体への炭水化物抗原の結合 項Ａで得られたＳ層の酸化（ポリアルデヒド）誘導体を三糖類の３−（２−アミ ノエチル）チオプロピルグリコシドと一緒に恒温保持し、それによってシララ塩 基形成を生じさせる。この工程は、アミノ基を有するアグリコンへ結合した任意 の他のサツカリドを用いて実施することができる。

この反応は、次のように示される： α−ＫＤ０，２−４αＫＤ○−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３” ）〔２個の３−デオキシ−〇−マノー ２−オクツロビラノシロノ残分からなる三糖類の３−（２−アミノエチル）チオ プロピルグリコシド〕Ｃ町ｏｗ アリルグリコシダーゼからの３−（２−アミノエチルチオ）プロピルグリコンダ ーゼの調製のだめの一般的処方 システアミン塩酸塩（１０ｍｌ中のＳ層基の１５ミリ当量）の溶液中のアリルグ リコシダーゼ（５ミリモル）の溶液を室温で１．５時間放置させる。この反応時 間は、変動することができる。その後に、この反応混合物を陽イオン交換樹脂（ 例えば、Ｒｅｘｙｎ　１０１、アンモニア形、２００〜４００メツシユ）のカラ ム養分して分離する。このカラムを水、０．５モルのアンモニアおよび０１モル のアンモニアで溶出する。未反応のアリルグリコシドが水性溶出液中に現われ、 ３−（２−アミノエチルチオ）プロピルグリコシドを１．０モルのアンモニアに 相当する両分中に溶出する。

その後に、この両分を含有する生成物を蒸発させて乾燥する。

３−（２〜アミノエチルチオ）プロピルグリコシドの結合によって得られたよう にＳ層のシップ塩基誘導体は、抗体の結合に直接使用することができる。このシ ッフ塩基誘導体は、これがフェリチン、西洋わさびペルオキシダーゼ、１２１５ Ｉ（沃素−１２５）で標識化されるかまたは任意の他の適当な方法で標識化され る場合に直接に分析することができる。また、結合した抗体は、所謂“サンドイ ッチ”方法により１、第１のハブテン結合抗体に対して同けられた標識化抗体の 結合によって分析することもできる。

３−（２−アミノエチルチオ）プロピルグリコシドの結合によって得られたよう にＳ層のシッフ塩基誘導体は、Ｓ層と硼素水素化物または別の適当な還元剤との 反応によってＳ層の第二アミン誘導体に変換することができる。

Ｓ層の第二アミン誘導体は、シッフ塩基誘導体よりも酸に対して安定性である。

多糖類部分中の遊離アルデヒド基含量の測定、引続く過沃素酸塩での測定を、フ ェニルヒドラジンもしくは２，４−ジニトロフェニルヒドラジンまたは他の適当 な試薬を使用することにより実施する。

適当な炭水化物含有Ｓ層を例１、項ＡおよびＢの記載と同様にメタ過沃素酸ナト リウムで酸化する。沃素含有塩を水に対する透析によって除去する。その後に、 １０％の酢酸中の相応するヒドラジン試薬の溶液を添加し、この混合物を１時間 反応させる。次に、過剰量の試薬を透析によって除去し、ヒドラゾン基の量を比 色法によって測定する。また、この方法は、／％ブテン含有アミノ基または免疫 活性勧賞の結合後に残留す２００４／３Ａ　（以下、３Ａ）の細胞壁断片からの 架橋８層調製物を、例ＩＡに記載の方法を使用する９とにより調製した。これら の組成物の電子顕微鏡による研究から、“Ｌｌｌｌ”調製物および“３Ａ″調製 物の双方は、ペプチドグリカンサックラスのそれぞれの表面に対してＳ層格子を 示す（第１図）。

前記調製によるペプチドグリカンを例ＩＡの記載のようにリゾチームで消化する ことによって除去し、フルタルアルデヒド架橋から生じるベンタル１．５−ジイ リデン橋によって一緒に保持されたＳ層積タンパク質断片の二重層を得る。Ｓ層 格子のそれぞれの形態学的単位は、３ａの調製の場合の２つの同一のサブユニッ トから構成されている。また、例ＩＡの記載と同様にグルタルアルデヒドで架橋 されかつリゾチームで消化された、例３、Ａ項の記載と同様に全細胞壁から調製 された、バシルス・アルベイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｌｖｅｉ）ＣＣＭ２０５１ 　（以下、２０５１）からの付加的な８層調製物は、２つの同一のサブユニット を示した。

Ｌ１１１調製物のグリカン鎖が、Ｓ層着タンパク質約１０％を有する、４（−ａ −Ｄ−Ｍａｎβ−（１−３）−ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ−）１の約６０個の三糖類の繰 返し単位から構成されていることは、知られている。０．１モルの過沃素酸塩を 用いてｐ　Ｈ５，５で２〜５時間処理した場合には、マンノース残分は、フェノ ール−硫酸分析法によって評価されるように、完全に酸化されていた。ｐＨ値が ４．５に減少することにより酸化時間は短縮され、８層プロモーター１個当たり 第一アミノ官能基（例えば、Ａ−三糖類）中のスペイサ−末端基に結合した炭水 化物ハブテンの２３個までの分子が達成された。しかし、生じるシブフ塩基は、 例えば硼素水素化物での還元によって安定化されていなければならない。

ＳＡ　３層プロモーターは、２つの異なるグリカン鎖を有し、全炭水化物含量は 、約７５％である。このグリカンは、次の構造を有する： 約５０個の繰返し単位を有する−２）（−α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１−２）−ａ− Ｌ−Ｒｈａｐ（，１−３）−β−Ｌ−Ｒｈａｐ）ｌおよび 約１５個の繰返し単位を有する−４）（−β−Ｍ　ａ　ｎｐＵＡ２．３　（ＮＡ ｃ）２−α−Ｇ１ｃＮＡｃ−Ｃ１上記と同じ条件下での前記８層調製物の酸化に より、Ｓ層すブユニット１個当たりハブテン分子１７個までの結合部位が得られ た。固定されていない８層により接合体またはハブテン含量の低い収量が得られ た。

２、エピクロロヒドリンの活性化 グルタルアルデヒド固定されたＳ要所片（２〜３ｍｇ）を０．２モルの重炭酸ナ トリウム／炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９，１〜１０．０かまたは０．２モル、 の５炭酸ナトリウム溶液、ｐＨ１１，４，２，５ｍｌ中に懸濁させるか、または 硼水素化ナトリウム２５ｍｇを含有する０、４モルの水酸化ナトリウム溶液２　 、５　ｍ　Ｉ中に懸濁させた。エピクロロヒドリン（０，２ｍ１）の添加下に、 回転蒸発器で回転（１５０ｒｐｍ）させながら、反応混合物を室温または４０℃ で３０分間〜１６時間で恒温保持した。ブランクを同様にして調製したが、しか しエピクロロヒドリンかまたはハブテンを省略した。

遠心分離および活性化側全部を除去するための水（５ｘｌ、５ｍ１）での洗浄後 、第１の遠心分離物と全部の洗浄液との合わせた上澄み液を炭水化物物質に対し て分析し、強力なアルカリ反応条件下で８層からの上澄み液中に注入した。残り のペレットをハブテン溶液（０，２モルの重炭酸ナトリウム溶液１ｍｌ当たり１ ．０〜１．４ｍｌ、１〜２マイクロモル）中に警部させ、かつ室温で血液学用混 合装置上で振盪させながら２〜６時間恒温保持した。ハブテンの過剰量を室温で ４〜１８時間５０ミリモルの重炭酸ナトリウム溶液中の０．０２モルのエタノー ルアミンでの処理により未反応のエポキシ基の封鎖前に水（５Ｘ１．５ｍ１）で 洗浄することによって除去した。その後に、′この試料を水（５Ｘ１．５ｍ１） で洗浄し、凍結乾燥し、かつ過沃素酸塩酸化により調製されたＳ層接合体の記載 と同様に炭水化物に関して分析した。

３、ジビニルスルホン活性化 グルタルアルデヒドにより固定されたＳ要所片（２〜３ｍｇ）を適当な緩衝液２ ｍ１（エポキシ活性化、ｐＨ９，１−〜１１．４参照）中に懸濁させ、次にジビ ニルスルホン（０，２ｍ１）を懸濁液に添加した。ブランクの処理、注入された ８層グリカンの評価、ハブテン溶液の恒温保持時間、および未反応のビニル基の 封鎖を、エポキシ活性化の記載と全く同様に実施した。

４．１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−力ルポジイミド（ＥＤ ＡＣ）での活性化２つの真なる反応条件を使用した： ｌ）グルタルアルデヒドにより固定されたＳ要所片約３ｍｇを水３ｍｌ中に懸濁 させた。次に、ｐＨを希薄なＨＣＩを使用することにより約４．６に調節した。

ＥＤＡＣ１０ｍｇの添加後、この懸濁液を室温で１時間撹拌し、この間ｐＨは変 化しなかった。次に、Ｆ、、６ＡＣの過剰量を、水冷却した水（２Ｘ１０ｍｌ） で洗浄しかつ遠心分離する（１９０００ｒｐｍ、４℃）ことによって除去した。

ペレットをハプテン溶液（１゜０〜１．５ｍｌ、０．２モルのＮａＨＣＯｓ１ｍ ｌ当だ・り約２マイクロモル）と−緒に室温で２〜１８時間恒温保持した。水（ ５Ｘ１．５ｍ１）での洗浄に続いて、試料を凍結乾燥し、かつ分析した。

１ｉ）Ｓ層物質約３ｍｇを０１モルの燐酸塩緩衝液２ｍ　ｌ　（ｐＨ４，０〜４ ．７）中に懸濁させ、ＥＤＡ（’：１０ｍｇを直ちに懸濁液に添加した。回転蒸 発器を回転させながら１時間の活性化の後、ハプテン溶液１ｍｌを添加し、この 混合物を室温でＥＤＡＣの存在下に一晩中恒温保持した。水（５Ｘ　１．５ｍ　 ｌ）での洗浄後、活性化された遊離カルボキシル基を０．２モルのＮａＨＣＯ２ 中の１０％グリシンを用いて室温で１〜２時間封鎖した。次に、試料を洗浄し、 凍結乾燥し、かつ分析した。

ハプテン６０モルまでが菌株Ｌ　１１１−’６９上で見い出され、２つの方法の 間で観察された差は、最小であった。菌株ＮＲＳ　２００４／３ａを用いた場合 には、ＥＤＡＣの存在下での一晩中の恒温保持により、固定化されたハプテンの 量は、１モル当たり１４モルから３２モルに増大した。

県 Ｔ−三糖類抗原接合体の調製 Ｔ−三糖類は、式βＧａ１ｐ　（１−３）ａＧａｌＮＡｃの腫瘍標識物質である 。この三糖類をノ＼ブテンとして含有する組成物を、例７．Ｂ、４に記載の一般 的方法の何れかにより８層への式βＧａ１−（１−３）αＧａ　Ｉ　ＮＡ　ｃ　 Ｏ（ＣＨ２）８ＣＯＮＨＮＨ２のスペイサ−結合二糖類の結合によって調製した 。

Ａユ 固定されていない酸化Ｓ層上への合成炭水化物抗原の２つの同一の懸濁液を、水 （０，２５ｍ　］　；　０．２５ｇ　／　ｍ　＋　）中のクロストリディウム・ テルモヒドロスルフリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏ ｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ）Ｌｌｌｌ−６９の精製された未固定の細胞壁から調製す る。それぞれ懸濁液を冷たい（４℃）５０ミリモルノ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐ Ｈ＝５．０　（’０．２５ｍ１）と混合する。懸濁液の１つに５０ミリモルの酢 酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝５．０　（０，５ｍ　ｌ）中の過沃素酸ナトリウム の０２モルの冷たい溶液を添加し、生じる懸濁液を光の遮断下に４℃で３時間撹 拌する（５００ｒｐｍ）。他の懸濁液は、酸化されていないが、しかし５０ミリ モルの酢酸ナトリウム緩衝液（０゜５ｍ１）と混合され、かつ同様に後処理され る。酸化、１０ｍ１ｎ）　、１回酢酸ナトリウム緩衝液、ｐ）（＝５で洗浄し、 かつ２回０．２モルの硼酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝８．５で洗浄し、沃素含有 物質を除去する。

よるポリアルデヒド生成物をシアノ硼水素化ナトリウム（１０ｍｇ）と−緒に硼 酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝８．５　（２ｍｌ）中に懸濁させる。Ｔ−サッカリ ード（ヒドラジド形、５ｍｇ）を酸化試料の１つに添加し、１つの酸化試料およ び１つの未酸化試料を、ハプテンの添加なしに処理する。調製物を撹拌しながら （５００ｒｐｍ）３７℃で２４時間恒温保持する。その後に、８層を１回０．２ モルの硼酸塩緩衝液で洗浄し、１回０．２モルの塩化ナトリウム溶液で洗浄、し 、かつ２回蒸留水で洗浄する。次に、それぞれ試料の遠心分離ベレットを貯蔵の ために凍結させることができるかまたは後処理することができる。この方法の間 、１１ブテンの固定化は、酸化された未固定のＳ層上での還元アミノ化により起 こる。ペプチドグリカン層の存在により、８層タンパク質のグルタルアルデヒド の固定化によって発揮される場合と同様の影響を安定化させることが提供される 。

（？１１結）８層ペレット（Ｂにより得られた）を、電磁撹拌機および限外濾過 膜（例えば、バシルス・ステア０テルモフイルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａ ｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ）ＰＶ７２の８層から得られたＢ　Ｉ　ＯＦ　１ ．ＬＴ′）を装備した、１０ｍ１の限外濾過セル（ＡＭＩＣＯＮ）中で、５０ミ リモルのトリス−塩酸塩緩衝液、ｐｈ＝７２（５ｍｌ）中に懸濁させる。この懸 濁液をリゾチーム（５ｍｇ）と混合し、かつ撹拌しながら（５００ｒｐｍ）室温 で９層ｍｉｎ恒温保持する。その後に、このセルに圧力をかけ（０，２ＭＰ　ａ ）　、それによって高分子量の８層タンパク質（結合ハプテンを含有する）は、 上澄み液中で含量が増大する。混濁したり濁液を水（約６０ｍ１）で洗浄し、崩 壊したペプチドグリシンおよびリゾチームを除去する（吸光係数が２８０ｎｍで 検知できなくなるまで）。（）１ブテン化された）Ｓ層物質の予想される損失に 関して試験するために、全部の洗浄液を合わせ、水に対して徹底的に透析し、凍 結乾燥し、かつ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ）によって分析した。

この分析は、洗浄液からのＳ層物質が不在であることにより確認された。

Ｄ、Ｓ層ハプテン接合体の精製 限外濾過セル（約１ｍ１）中の含量が増大した懸濁液を５モルのグアニジン塩酸 塩（５ｍｌ）と混合し、かつ撹拌しながら室温で１時間恒温保持する。こめ処理 の場合、８層は、プロモーター（分子量約１００ｋＤａ）中に解離し、タンパク 質の不純物は溶解する。

この方法は、懸濁液の澄明化を伴なう。タンパク質含有溶液の含量を圧力を加え る（　０　、２　Ｍ　Ｐ　ａ　）ことに　−よって撹拌しながら（５００ｒｐｍ ）増大させ、グアニジン塩酸塩を、２８０ｎｍでの吸光係数がもはや検知できな くなるまで水で洗浄除去する。澄明な洗浄液を合わせ、透析し、かつ５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥによってＳ要所片に関して透析する。限外濾過セル中の澄明な溶液を洗浄 する間に、８層タンパク質は再凝集する。懸濁液をセルから除去し、凍結乾燥し 、かつ５ＤＳ−ＰＡＧＥによって検査する。凝集体は、Ｓ層タンパク質含有結合 ハプテンのみからなる。結合ハブテンの量を活性化試料と非活性化試料との間の フェノール硫酸反応性の差によって評価する。

未固定のＳ層上のハブテンの固定化に関する前記方法を使用して、引続きペプチ ドグリカンの除去および定義された孔径の限外濾過膜を介する濾過により、Ｓ層 ハプテン接合体は、滅菌反応容器中で無菌的に生成される。特殊な予防措置によ り、出発勧賞（８層含有細胞壁）は、実際にリポ多糖ｍｌ’　（Ｉ　Ｐ　Ｓ　： エンドトキシン）汚染なしであり；さらに、ＬＰＳ断片は、想像によれば、８層 タンパク質の解離後に濾過によって除去される。それ故に、こうして得られたＳ 層ハブテン接合体は、発熱物質不含であると考えることができるＴ−三糖類Ｓ層 調剤の効力 ５〜１０匹のマウスの群をシクロホスファミド（ＣＰ）で予め処置し、かつ２日 後に例８に記載のＴ−三糖類結合した３ａ−Ｓ層調製物で免疫処置した。後足匿 の筋肉に筋肉内注射した。７日後、例８の記載により調製されたＴ−三糖類結合 したＬｌｌｌ　Ｓ層調製物を用いてマウスの足踏による免疫性の試験を行なった 。足踏の厚みの変化をミツトヨ　エンジニアリング社（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ　Ｅｎ ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）のマイクロメーターを使用することにより２４時間後に測 定した。投与したＴ−三糖類−３ａ−３層の量を変えた場合には、Ｔ−三糖類− Ｌ１１１を用いて免疫性の試験を行なうために、その後のＤＴＨ応答に対してマ ウスに注入するのに必要とされるＴ−三糖類−３ａ−３層の最小濃度がマウス１ 匹当たり５μｇであり、かつマウス１匹当たり三糖類Ｔ−二塘類−３ａ−３層１ ０μｇで免疫処置を実施した場合には、最大応答が得られることが見い出された （第３図）。このレベルで、約５．５ｍｍ−”の足踏の膨張が生じた。２０μｇ への投与量の増加により、４ｍｍ−１への膨張の減少が生じた。

他の試験の場合、ＣＰで予め処置したマウスにＴ−二ｍｍ−ａａ−Ｓ層１０μｇ で免疫処置を行ない、７日後にＴ−三糖類Ｌｌｌｌ　８層の量を変えて足踏によ る免疫性の試験を行なった。Ｔ−三糖類Ｌ１１１Ｓ層２０μｇを使用することに より、最大応答（４゜５ｍｍ−１）が得られた（第４図）。

前記結果は、Ｔ−三糖類　Ｓ層調製物が炭水化物ノ１ブテンに対してハプテン特 異的細胞応答を誘発しかつ複合体ウィルス抗原のような強力な免疫原で見られる 応答と比較可能な結果を生じることを示す。

もう１つの対照により、ＤＴＨ応答はＴ−三糖類／１ブテンに対して特異的であ ることが確認された。この対照の場合には、ＣＹで予め処！したマウスにジメチ ル−ジオクタデシルアンモニウムプロミド（ＤＤＡ）１００μｇの存在下でＴ− 三糖類−３ａ−３層で免疫処置を行なった。次に、マウスにＰＢＳおよびＴ−二 １１１８層を用いて免疫性の試験を行なった。結果は、第１表に示されている。

Ｔ−三糖類−Ｌ１１１のみが著しい膨張を生じた。即ち、結果は、異なるＳ層調 製物の間の交差反応が不在であることを示し、同じハプテンを用いて多重免疫感 作のために異なる８層を利用することが可能である。

このことは、免疫治療に有用であるかまたは抗原を弱体化させるために免疫応答 の免疫相乗作用に有用であり、担体に典型的な抑制減少を回避することができる 。

第１表 Ｔ−３ａ　１０μｇ／７ウス　ＰＢＳ　Ｏ，８＋０．８Ｔ−３ａ　１０ｕｇ／マ ウス　ＥＤＡＣＬｌｌｌ　１０ｕｔ／マウス”０．３７±９．４ｒ−３ａ　１（ ｌμｇ／マウス　Ｔ−Ｌｌｌｌ　１０μｇ／マウス　３．８　±０８６ＰＢＳ＆ ＤＤＡ　Ｔ−Ｌｌｌｌ　１０μｇ／ｖウス　１．８９±０．６５訂　Ｔ−ＬＬｌ ｌ　１０μｍマウス　１．３３±０．４ａ　ＣＰで予め処置されたマウスにＤＤ Ａ１００μｇと混合した抗原で免疫処置した。

ｂ　ＥＤＡＣ試薬によってＬｌｌｌの変性が予想される対照に対してＬｌｌｌを ＥＤＡＣで虚偽の処置をした。

Ｃ他の全ての群との著しい差Ｐ＞０．００１例１２ 他の担体とアジュバント系との比較 例１０の免疫感作プロトコルを繰り返すが、マウスをＣＰ処置するまたは処置せ ず、次にＴ−三糖類−３ａ−８層で免疫感作する。ＤＤＡまたは不完全フロイン ドアジュバント（ＦＩＡ）をアジュバントとして使用する。免疫感作の７日後に 、ラットをＴ−三糖類−Ｌｌｌｌ　（例１０によるＳ層の製造と同様）で足踏攻 撃し、膨張するこの足踏を２４時間後に測定する。この結果は、Ｔ−三糖類−３ ａはＤＴＨに対する感作において有効であるが、最も強い応答はマウスがＣＰで 処置された場合に観察されたことを示した（第５図）。他の担体とＳ層の免疫強 化応答の比較のために、マ　。

ウスを、例１０に概略したように、Ｔ−三糖類−３ａ−８層、Ｔ−三糖類牛血清 アルブミン（Ｔ−三糖類ＢＳＡ）またはＢＳＡに結合した８−メチルオキシカル ボニルオクタツール（この結合アームはＴ−三糖類に接合する）を用いて免疫感 作する。免疫感作の７日後に、マウスを、例１０に従って、Ｔ−三糖類−Ｌｌ１ １を用いて足踏攻撃する。第６図のこの結果は、ＤＴＨ応答を生じない牛血清ア ルブミン（ＢＳＡ）とカプリングしたＴ−三糖類の投与の後のＳ層担体の免疫強 化特性を表わす。他の研究者もカルボヒトレート抗原についてのＤＴＨ応答を報 告していたが、このプロトコルは複雑で、ＤＴＨ応答はハブテン接合体だけを用 いた免疫感作により得ることができない。前記の結果は、Ｓ層と抱合したＴ−三 糖類を用いた単一の免疫感作において、Ｔ−三糖類に対抗するＤＴＨについての 証拠を提供する。

例１３ 試験管内リンパ球増殖活性応答の誘導 前記したように（ＣＰ処置の後、ＤＤＡを用いて）Ｔ−三糖類−３ａおよびＴ− 三糖類−Ｌ１１１の両方で免疫したマウスを殺し、この免疫リンパ球を単離し、 培養する。この単離したリンパ球を、次に異なる量の２０５１．Ｓ層、Ｔ−三糖 類−２０５１、Ｔ−三糖類−ＢＳＡ、またはＴ−三糖類−ＫＬＨと共に培養する 。第２表に示したように、トリチウム化したチミジン捕捉により測定して、Ｔ− ２０５１だけが応答を誘導することができる。この応答は投与量に依存し、１０ ａｇ　／　ｍ　＋でピークである。幼若化応答を誘導するＴ−三糖類−ＫＬＨま たはＴ−三糖類−ＢＳＡの減退は、Ｓ層が細菌の形態を取るため、抱合したＳ層 がマクロファージにより優先的に捕捉されることで概念的に説明することができ る。

第２表 Ｔ−三糖類−３ａおよびＴ−三糖類−Ｌ１１１の両方を用いて免疫感作したマウ スからのリンパ球の刺激 培養基中の抗原　ＣＰＭ３Ｈ−チミジン　統計的確率。

２０ａｇ／ｍｌ　捕捉 ＰＢＳ　２３０３±６９２　ｔＮＤ ２０５１″　２５４９±１２５８　Ｎ５ｃＴ−ＢＳＡ　１８４０±８６６　Ｎ５ Ｔ−ＫＨＬ　２０９１±４９８　Ｎ５ Ｔ−２０５１４６５４±１２９４　Ｐ＝０．００１ｂａ　全ての統計はＰＢＳ値 と比較された。

ｂ　２０５１はＢ、　ａｌｖｅｉから単離した結合されてないＳ層であり、Ｔ− 三糖類−結合２０５１に対する対照である。

ｃ　ＮＳは不明確を表わす。

ｄ　２０５１刺激だけど比較した場合Ｐ〈０゜０１゜Ｔ−三糖類接合体により引 き起こされたＤＴＨ応答が、実際に、ヘルパーＴ−細胞に原因があることが明ら かに示され、養子移入実験を行う。この一連の実験において、ＣＰ−前処置した マウスをＤＤＡ中のＴ−３ａ　】０ａｇで免疫感作し、７日後に殺し、その消耗 するリンパ節および膵臓を除去する。感作リンパ球を次に単離し、３日間Ｔ−Ｌ ｌｌｌおよび対照抗原と共に培養する。この刺激した細胞は、次に、単クローン 性抗体および補体を用いた処理によりＴ−細胞の特異的集団から奪われる。奪わ れた大量に刺激した細胞を、次に洗浄し、Ｔ−５層２０５１またはＰＢＳと混合 し、未処理のマウスの後ろの足踏に注射する。このＤＴＨ応答を次に２４時間後 に測定する。この実験の結果を第７図に示する。これは、強いＤＴＨ応答が、Ｔ −三糖類−Ｌ１１１で刺激したおよびＴ−三糖類一２０５１と混合した感作細胞 を用いて養子移入したマウスにおいて観察されたことを示すことができる。しか し、Ｌｌｌｌだけで刺激したおよび次いでＴ−三糖類−２０５１と混合した同じ 様に感作した細胞は、強いＤＴＨ応答を誘導しない。感作リンノく球が一つの点 で全ての３つの異なるＳ層にさらされるにしても、Ｓ層に直接向かった交差反応 ＤＴＨ応答は観察されなかった。３つのＳ層がＴ−三糖類でノ１ブテン化された 場合にのみ明らかなりＴＨ応答が観察される。さらに、感作リンパ球が特異的Ｔ −細胞集団から奪われた場合、ＤＴＨ応答に関係する感作細胞はヘルＩく二Ｔ− 細胞である。

本発明の実施態様を構成する調剤学的構造は、高い抗体価および感染保護イソタ イプについて免疫すや抗原として特に適している。抗体を免疫活性物質として使 用する場合、抗イデイオタ・イブ抗体はこの方法により製造することができる。

さらに、この調剤学的構造は、一つおよび同じ免疫活性物質が、２つの異なる系 から誘導された８層タンパク質または糖タンパク質と結合している場合、−次免 疫感作およびブースティングに対して有利に使用することができる。この構造は 、たとえば診断キットのためおよびヒトの血液からの望ましくない抗体を生体外 で取り除くための免疫吸収剤またはアフィニティーマトリックスとして適用する マウスのグループは、簡単に２０５１に結合したＴ−三糖類の調製剤１０μｇま たはＬｌｌｌに結合したｓ、　ｐｎｅｕｉ＋ｏｎｉａｔｅタイプ８ＣＰＳ抗原１ ０μｇを用いて、筋肉内または経口で擬似免疫感作または免疫感作する。経口免 疫感作はＳｍ１ｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｎ５ｕｎ−、３１： １２９　（１９８０）により記載されたように実施する。

７日後にそれぞれのマウスのグループに、Ｌｌｌｌに結合したＴ−三糖類または ＰＶ７２に接合した８ＣＰＳの調製剤１０μｇで足置攻撃を行う。膨張した足置 を、２４時間後に、Ｍｉｔｕｔｏｙｏ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇマイクロメータ ーで測定する。

Ｔ−５層接合体が経口免疫感作の後のＤＴＨ応答を生じさせることができること を表わすために、マウスのグループをＴ−８層２０５１だけを用いて、筋肉内ま たは経口で免疫感作する。免疫感作の７日後にマウスのグループをＴ−Ｓ層Ｌ１ １１で引き続き攻撃する。２４時間後にＤＴＨ膨張応答が測定される。この結果 は第８ａ図に示す。免疫感作の２つの経路は、抗原特異的ＤＴＨ応答の発達につ いて感作することができる。興味深いのは、経口免疫感作は、ＩＭ免疫感作での 投与よりもわずかに強いＤＴＨ応答を引き起こすことである。この結果は、経口 投与後の全身性免疫応答を誘導するためのＳ層接合体の効果を表わす。

マウスのグループをＳ層Ｌ１１１に結合したタイプ８多糖類を用いて、筋肉内ま たは経口で免疫感作する。免疫感作した７日後にマウスのこのグループを、Ｓ層 ＰＶ７２に結合したタイプ８の多糖類を用いて攻撃する。２４時間後、ＤＴＨ膨 張応答を測定する。この結果は、免疫感作の２つの経路が抗体特異的ＤＴＨ応答 の発達について感作できることを示する。さらに、経口免疫感作はＩＭ免疫感作 での投与よりもわずかに強いＤＴＨ応答を引き起こすことが明らかとなる。

接合体ワクチンに対する所望の特性は、高められた免疫原性（有力なＩｇＧクラ ス応答）および追加免疫予防接種に対する記憶性の応答が含められる。ここでは この基準に合ったＴおよびＹ炭水化物Ｓ層接合体および５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ ｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　Ｓ層接合体のい（つかの例を含む。

炭水化物ハプテンの効力−特異−的抗体応答を誘導す４５０％の完全フロインド アジュバント中のＹ−ハプテンＬ　１１１／ＳＡ　（ＳＡ＝自己集合または非固 定）接合体（例９に記載）を、０日月にマウスに腹膜腔内注射する（−次免疫感 作）。完全フロインドアジュバントだけを対照マウスに注射する。第２および第 ３の追加免疫注射は、前の例のように投与する。第９ａ図、ｂ図はハプテンＹお よび担体Ｌｌｌｌ／ＳＡに対する応答をそれぞれ表わする。イソタイプ応答は第 １０図に示する。ＹハプテンおよびＬｌｌｌ／ＳＡ担体に対する免疫保護１ｇＧ イソタイプはこの方法により誘導される。

異なるハプテンのモル比を、８層ペレットをハプテン溶液でインキュベートする 時間を替える巳とにより製造する。カプリングしたＴハブテンの３．６．１２． ７．２３．８または３７．６モルを有する固定ＬｌｌｌＳ層を、アジュバント（ アルファーベータ挟締）と−緒に２０μｇ／マウスで、腹膜腔内注射する。Ｔハ プテンおよびＬ　１１１担体に対する抗体応答は、ＥＬＩＳＡにより分析し、こ れを第１１表に示する。Ｔ三糖類に対する抗体応答は、ハプテン化の量に対して 正比例する。この結果は、通常の担体に優る３層の利点の一つが、ハプテンの量 を識別する正確でかつ再現可能に結合する能力であることを示している。

例１９ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタイプ３莢膜多糖類（ＣＰ Ｓ）に対する特異的抗体を誘導するＳ層担体の能力タイプ３　Ｓ、　ｐｎｅｕｍ ｏｎｉａｅ　ＣＰＳ　（ＡＴＣＣ＃１６９−Ｘ）をＥＤＣにより活性化させ、例 ７Ｂにおけるようにグルタルアルデヒド固定し１１１とカプリングさせる（ハプ テンの付着のための特別な方法）。ラットに、ＰＢＳ中のタイプ３−Ｌｌｌｌ接 合体（０゜６μｇ　３／２０μｇ　Ｌｌｌｌ）、ＰＢＳ中のタイプ３（２０μｇ ）、ＰＢＳ中のＬｌｌｌ（２０μｇ）およびＰＢＳだけを前記した例のように注 射する。獲得ＥＬ　Ｉ　ＳＡからの結果（第１２図）は、３−Ｌｌ１１接合体に 対する特異的抗−タイブ３の第３の応答を示している。Ｌｌｌｌで免疫感作した かまたはＰＢＳだけを注射した対照マウスからの血清は不利に反応する。この第 ３の応答のイソタイプＥＬＩＳＡの結果（第１３図）は、免疫保護ＩｇＧサブク ラスの存在を示する。ＣＰＳタイプ３単独に対する抗血清はＩｇＡおよび１ｇＭ イソタイプだけであることが判明する。

例２０ ＳｔｒｅｐｔＯＣＯＣＣｕＳｐｎｅｕ謙ｏｎｉａｅタイプ８ＣＰＳか虻然！リゴ 糖に対する抗体を誘導する非固定Ｓ層担体の能力オリゴ糖を、タイプ８Ｓ、　ｐ ｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ＣＰ　Ｓから、Ａｌｂｅｒｓｈｅｉｍ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃ ａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ａｒｃｈ　５；３４０゜１９６７からの変法を 用いて製造する。オリゴ糖調製剤は、前記した例に記載したように、非固定ＰＶ ７２、または２０５１Ｓ層およびテタヌストキンン（ＴＴ）とカプリングさせる 。実験の０日および１４日に、マウスを腹膜腔内で、ＰＢＳ中のオリゴ８−ＰＶ ７２　（８μｇ８／２０μｇＰＶ７２）　、ＰＢＳ中のオリゴ８−２０５１．（ １０μｇ８／２０μｇ２０５１）、オリゴ８−ＴＴ　（４μｇ８／２０μｇＴＴ ）　、ＰＢＳ中のオリゴ８（９μｇ）またはＰＢＳ単独を用いて免疫感作する。

マウスを２１日に採血し、異なる抗−オリゴ応答を比較するためにＥＬ　Ｉ　Ｓ Ａを実施する。第１４図かられかるように、ＥＬ　Ｉ　ＳＡにより測定したよう 　。

に、８オリゴについての抗体応答はＦ３−ＰＶ７２または８−２０５１が免疫原 である場合が、非カプリング８または８−ＴＴを注射した場合よりもより大きい 。

ＥＬ　Ｔ　ＳＡプロトコル ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレート（ｌｌａｘｉｓｏｒｂ、　ＮＵＮＣ＄４−３９４５０） を、１つのくぼみあたり１ａｇの炭酸塩−炭酸水素塩コーティング緩衝液（ｐＨ ９，６）０．０５Ｍ中に希釈した抗原で被覆する。このプレートを４℃で一晩中 インキユベートし、次いでＰＢＳ　（ｐＨ７，２）中の１％のＢ　Ｓ　Ａ　（Ｓ ｉｇｍａ　Ａ−７０３０）でブロックする。室温で１時間インキュベートした後 、プレートをＰＢＳおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ中０で３回洗浄する。

５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ＣＰ　Ｓ　（ｔｙｐｅ　 ５ｐｅｃｉｆｉｃ）（璽ｅｒｃｋ、　５ｈａｒｐ　＆　Ｄｏｈ菖ｅ）抗原プレー トが必要な場合、ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートをまずコーティング緩衝液中に希釈し た１／２５０ウサギ抗−ＣＰ　Ｓ　（ｔｙｐｅ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　；　５ｔａ ｔｅｎｓ　Ｓｅｒｕｍｉｎｓｔｉｔｕｔ）で被覆し、室温で２時間インキュベー トする。このプレートを次に、室温で１時間１％のＢＳＡでブ０ツクし、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。Ｓ、　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ＣＰ　Ｓ　（ｔｙｐ ｅ　５ｐｅｅｉｆｉｃ）を、次いでプレートに、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１μｇ／ ＜ぼみで添加し、４℃で一晩中インキユベートする。次に、このプレートをＰＢ Ｓ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。

マウス血清をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で希釈し、抗原プレートの複製カラムに入れ 、室温で２時間インキュベートさせる。Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔ　ｗ　ｅ　ｅ　ｎで３ 回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で希釈したヤギ抗−マウスＩｇＧおよびＩｇＭ −アルカリ性ホスファターゼ（Ｔａｇｏ　＃４６５３）を（ぼみに添加し、室温 で２時間インキュベートする。このプレートを再度ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗 浄する。１０％のジェタノールアミン基質緩衝竺中に希釈したｐ−ニトロフェニ ルリン酸二ナトリウム（Ｓｉｇｍａ　ＨＯ４−１０５）　（１ｍ　ｇ　／　ｍ　 １　）をくぼみに添加する。４０５層ｍ　（Ａ　４０５）での吸光度を、暗室で 室温で３０分間インキュベートした後、ＢｉｏＴｅｋＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ａ ｕｔｏＲｅａｄｅｒ（モデルＥＬ３０９）により測定する。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡがイソタイプの抗体応答であった場合、ＢｉｏＲａｄ　ｓｕｂ− ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ　ｐａｎｅ　Ｉ　（＃１７２−２０５５）を使用する。

本発明は前記の態様に関して記載しているが、本発明の範囲は次の請求の範囲に より定義されるものとする。

図　面　の　凡　例 第１図　グルタルアルデヒド固定８眉断片の調製図：（ａ）無傷の細菌細胞：　 （ｂ）グルタルアルデヒド固定後の空のペプチドグリカンサブクラス。第２のＳ 層は内側表面に形成される；　（ｃ）２つのＳ層からなるリゾチーム処理後のグ ルタルアルデヒド固定８眉断片。ＰＧ、ペプチドグリカン、ＣＭ、細胞質膜：８ ５８層−１ＳおよびＯ８１内側および外側Ｓ層（５ａｒａおよび５ｌｅｙｔｒか ら応用）　。Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ、　（１９８７）　１６９：４０９２− ４０９８゜ 第３図　Ｂ、　５ｔｅａｒｏｔｈｅｒ■ｏｐｈｉｌｕｓ　Ｓ層（Ｔ−３８）と結 合したＴ−三糖類の投与のＴ−ハブテンに対するＤＴＨについての免疫学的感作 に関する効果。マウスをシクロホスファミド（２００ｍｇ／ｋｇ）で処理し、２ 日後に、異なる濃度のＴ−３ａで免疫感作する。−７日後にマウスのすべてのグ ループを、Ｃ１ｔｈｅｒ醜ＯｈｙｄｒＯｓｕｌｆｕｒｉｃｕｗ＋　（Ｔ　−Ｌ　 １１１　）　Ｓ層と結合したＴ−三糖類を用いて足踏攻撃する。足置膨張を２４ 時間後に測定する。足置の厚さの増大をｍｍＸ１０−”で表わす。

第４図　Ｔハプテンに対するＤＴＨ応答の誘導に関する　Ｃ，ｔｈｅｒ＋＋ｏｈ ｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ　（Ｔ　−Ｌ　１１１　）と結合したＴ−三糖類 の濃度の効果。マウスをシクロホスファミド（２００ｍｇ／ｋ　ｇ）で処置し、 ２日後にＢ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　（Ｔ　−３ａ　）　Ｓ層 と結合したＴ−三糖類を含有する調剤１０μｇで免疫感作する。７日後にマウス のグループを、異なる量のＬｌｌｌＳ層と結合したＴ−三糖類で足踏攻撃する。

足踏の膨張を２４時間後に測定する。足踏の厚さの増大をｍｍＸＩＱ−１で表わ す。

第５図　マウスのグループを、シクロホスファミドで処理するか、または処理せ ず、引き続き、擬似免疫感作するか、またはＰＢＳ、ＤＤＡまたｈＦＩＡと混合 したＢ、　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　（Ｔ　−３ａ　）　Ｓ層と 結合したＴ三糖類の調剤１０μｇで免疫感作する。７日後に、マウスのそれぞれ のグループを、Ｃ，ｔｈ’ｅｒ■ｏｈｙｄｒ。

ｓｕｌｆｕｒｉｃｕｗ　（Ｔ　−Ｌ　１１１　）　Ｓ層と結合したＴ三糖類の調 剤１０μｇで足踏攻撃する。足踏の膨張を２４時間後に測定する。足踏の厚さの 増大をｍｍｘｌＱ−’で表わす。

第６図　１０匹のマウスのグループを、シクロホスファミドで処理するか、また は処理せず、引き続き、ＯＤＡを用いてまたは用いずに、Ｂ、　ｓｔｅａｒｏｔ ｈｅｒｗｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔ−３ａ）Ｓ層と結合したＴ−三糖類の調剤、１０層 ｇ１牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合したＴ−三糖類１０μｇまたはＢＳＡと 結合した８−メチロニカルポニアルオクタノールスペースアーム（８−１＋ｅｔ ｈｙｌａｎｙ　ｃａｒｂｏｎｙａｌ　ｏｃｔａｎｏｌ　５ｐａｃｅ　ａｒｍ）　 （これはＴ−三糖類をＳ層と結び付ける）（Ｇ−ＢＳＡ）１０層ｇで免疫感作す る６７日後に、マウスのそれぞれのグループをＣ，ｔｈｅｒｓｏｈｙｄｒｏｓｕ ｌｆｕｒｉｃｕｍ　（Ｔ−Ｌ　１　］、　１　）　Ｓ層と結合したＴ−三糖類の 調剤１０　ｕ　ｇまたはＢＳＡと結合した８−メチロ二カルボニアルアクトナル スペースアーム１０μｇで足踏攻撃する。足との膨張を２４時間後に測定する。

足踏の厚さの増大をｍｍＸ１０−１＋１標準偏差で表わす。

第７図　Ｔ−三糖類に対するリンパ球介在ＤＴＨ応答の移入。１０匹のマウスの グループをシクロホスファミドで前処理し、引き続きＴ−三糖類−３ａ−８層（ Ｔ−３ａ）１０層ｇで免疫感作する。７日後に、マウスを殺し、消耗するリンパ 節および膵臓を単離する。

次に精製したリンパ球を単離し、Ｕｌｔｒｏｓｅｒ　Ｈｙ　２％、およびペニシ リンおよびストレプトマイシン１％を補充したＲＰＭ１１６４０中で培養する。

Ｔ−三糖類一３ａで感作したリンパ球を、ＰＢＳ−Ｌｌｌｌ　Ｓ層、またはＴ− 三糖類−Ｌｌｌｌ−３層接合体（Ｌｌｌｌ）で大量に刺激する。４日後に、リン パ球を捕集し、ＰＢＳ中で洗浄した。Ｔ−三糖類−Ｌ１１１で刺激した感作リン パ球を、次に、４グループに分け、擬似処理するかまたは単クローン性抗体Ｌ３ Ｔ４　（ヘルパーＴ細胞に対して特異的）、Ｌｙ２．２　（サプレッサーＴ細胞 に対して特異的）およびＴｈｙｌ、２　（全てのＴ細胞に対して特異的）を用い て処理する。この４つのグループの細胞を、次に補体で処理し、次いで洗浄し、 数える。感作細胞（５Ｘ１０５）を次にＰＢＳまたはＴ−三糖類２０５ｉＳ層（ Ｔ−２０５１）と混合し、次いで未処理のマウスに注射した。足踏の膨張を２４ 時間後に測定する。足踏の厚さの増大をｍｒｌｌＸｌｏ−１で表わす。

第８図　Ｓ層接合体を用いた経口および筋肉的免疫感作の比較。

ａ）　マウスのグループをＬｌｌ、１８層と結合したＴ−三糖類（Ｔ−Ｌ　１１ １）の調剤１０μｇを用いて経口または筋肉内で免疫感作した。７日後に、マウ スのそれぞれのグループを２−５１　Ｓ層と結合したＴ三糖類（Ｔ−２０５１） の調剤１０μｇを用いて足踏攻撃した。足踏の膨張を２４時間後に測定する。足 踏の厚さの増大をｍｍ−１で表わす。

ｂ）　マウスのグループをＬｕ１ｌ　Ｓ層と結合したＳ、　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｅタイプ８莢膜多糖類（８ＣＰＳ−Ｌｌｌｌ）の調剤１０μｇを用いて、経口ま たは筋肉内で免疫感作する。７日後に、マウスのそれぞれのグループを、ＰＶ７ ２　８層と結合したＳ、　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタイプ８莢Ｉ！多１ｔｆｉ　（ ８ＣｐＳ−ｐｖ７２）　のｍ剤１０μｇを用いて足踏攻撃する。足踏の膨張を２ ４時間後に測定する。足踏の厚さの増大をｍｍ”で表わす。

第９図 ａ）　非固定Ｌ−１１１Ｓ層とカプリングしたＹハプテンに対する三次抗体応答 。（−・−）Ｙハプテンに対する抗体応答、（−〇−）負の対照。

ｂ）　Ｙハプテンとカプリングした非固定し１１１８層に対する三次抗体応答。

（−・−）非固定し１１１に対する抗体応答、（−０−）負の対照。

第１０図 非固定Ｙ−Ｌ　１１１／ＦＡに対する三次抗体応答の免疫グロブリンイソタイプ 、（■）Ｙハプテンに対するイソタイプ抗体応答、（ロ）非固定し１１１に対す るイソタイプ抗体応答。

第１１図 ＥＤＣにより固定Ｌｌｌｌ　Ｓ層とカプリングしたＴ−三糖類に対する三次抗体 応答、（■）異なるハプテンのモル比でのＴ−三糖類に対する抗体応答、（ロ） Ｌｌｌｌ　Ｓ層担体に対する抗体応答。

第１２図 Ｓ、　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ＣＰ　Ｓタイプ３−Ｌｌｌｌ接合体に対する三次 抗体応答、（−・−）ＣＰＳタイプ３に対する抗体応答、Ｌｌ、１１（−■−） またはＰＢＳ（−ム一）を用いて注射したマウス中でのＣＰＳタイプ３に対する 負の対照応答。

第１３図 Ｓ、　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ＣＰ　Ｓタイプ３−Ｌｌｌｌ　Ｓ層に対する三次 抗体応答の免疫グロブリンイソタイプ、ｒ■）マウスを３−Ｌｌｌｌ接合体を用 いて免疫感作した場合のＣＰＳタイプ３に対するイソタイプ抗体応答、マウスを ＣＰＳタイプ３を用いて免疫感作した場合のＣＰＳタイプ３に対するイソタイプ 抗体応答。

第１４図 Ｓ、　ｐｎｅｕ■ｏｎｉａｅオリゴ糖類タイプ３に対する二次抗体応答。８−Ｐ Ｖ７２　（−・−）　、８−２０５１　（−■−）、８−ＴＴ　（−ム−）、８ −オリゴ（−〇−）またはＰＢＳ　（−ロー）を注射した場合のＣＰＳタイプ８ に対する応答。

参　考　文　献 １　、１ｌｏｖａｔ、　Ａ、　Ｍ、　（１，９８７）　Ｉｍ＋１ｕｎｏ１．　Ｔ ｏｄａｙ　８．９３゜２、Ｂｒｕｃｅ、　Ｍ、　Ｇ、　Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、＾、 　（１９８６）　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　５７．６２７゜ ３、　Ｅｌｓｕｎ、　Ｃ，Ｏ，Ｅａｌｄｉｎｇ、　Ｗ、　（１９８４）　Ｊ、　 Ｉｍｍｕｎｏ。

１３２６．２７３６゜ ４、１ｌｕｃｋｅｒｈｅｉｄｅ、＾、、　Ａｐｐｌｅ　Ｒ，Ｊ、、　Ｐｅ５ｃｅ 、＾、Ｊ。

、　菖１ｃｈａｅ１．　Ｊ、Ｇ、（１９８７）　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ、１３ｇ　３ ．　８３３５、３＋＋ｉｔｈ、　Ｒ，ＩＴ、、　Ｚｉｏｌａ、Ｂ、、　（１９８ ４）　Ｃｅ１ｌ　ＩｍｍｕｎＯ，８９２０゜ ５、　Ｓｍ１ｔｈ、Ｒ，Ｈ，、Ｂａｂｉｕｋ、Ｌ、＾、、５ｔｏｃｋｄａｌｅ、 ＰＨ，Ｇ、　（１９８０）　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　３１１２９゜・・ ・・・・・・　・・９−　欅準牛血清アルブミンＯ□・−酸化されてないＳＪＩ に付着した牛血清アルブミン（、Ｉ［特異的吸光係数） ｙ−＝　＝−“−酸化されたＳ層に結合した牛血清アルブミン（リンン残分のε −アミノ基を有するノノフ塩基の形成）Ｔ−３，ｌの免疫投与量に対する応答 Ｔ−３層の免疫性試験投与量に対する応答Ｔ−二三糖ＤＴＨ応答に対する シクロホスファミドおよびアジュバントの効果足踵の膨張の増大＄（ｍｍ−Ｘ） ＣＰおよびＤＤＡ有りまたは無しの場合のＦｉｇ、６ Ｔ−三糖類ＤＴＨ応答の転移 ５，６　１．ｏ２．０　３．０　４．０足踏の膨張の増大率（ｍ　ｍ　−１） ＦＩＧＬＪＲε１１　７−二＠＠−３ｍ接合体を用も−での経口的免疫（ヒと、 ＩＩ−筋肉内免疫化との比較 足踏の膨張の増大率（ｍ　ｍ　”） タイプ８ＣＰＳ　ＳＭ接合体を用（１ての経ロｒＪ免疫イヒ足冨の膨張の増大率 （ｍ　ｍ　”） 「１らｗ：ｃ　Ｘ 固定されてないＬｌｌｌ　Ｓ層にカップリングされたＹハブテンに対する三次抗 体応答 Ｙハブテンとカップリングされた固定されてないＬｌｌｌ　３層に対する三次抗 体応答 血清希釈　Ｙ−ＢＳΔプレート Ｆｉ８ｕｒｅ　ＩＱ 固定されてないＹ−Ｌｌ　１１／Ｆ八に対する三次抗体応答の免疫グロブリノイ ソタイプ化 １りＡ＋ｇａ＋階Ｇ２＊Ｉｇｄ２ｂ１ＱＧコＩｇＭ１ｇクラスおよびサブクラス Ｆ中ｎｃｌｌ ＥＤＣによつて固定Ｌｌｌｌ　Ｓ層にカップリングされたＴ−二１１類に対する 三次抗体応答；アノ二バノトと一緒の腹膜腔内注射 ７ノ異バツト　３６モル　１２７モル　２３ｅモル３７．１１　モ／１゜″ｒ− 二糖百のモルｍでのノーブテン（ＩＺの？１合Ｆｉｇｅｒｅ　１２ 肺炎レンサ球ｍ　（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜 多糖類（ＣＰＳ）タイプ３−Ｌｌｌｌ接合体に対する三次抗体応答 血清の希釈率 ＣＰＳタイプ３プレート Ｆｉｇす＋ｃ１３ 肺炎レノサ球ＩＩＩ　（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ） 莢膜多糖類（ＣＰ　Ｓ）型３−Ｌｌｌｌ　Ｓ層に対する三次抗体応答の免疫グロ ブリンインタイブ化 １ｇ＾　１９０Ｉ　１９Ｑ２ａ　ＩｇＱ２ｂ　Ｉｇｏ３　４Ｍ１ｇクラスおよび サブクラス ＣＰＳタイプ３プレート Ｆｉｇｕｒｅ　１４ 肺炎レノサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｓｏｎｉａｅ）オリゴ 糖類タイプ３に対する二次抗体応答 血清の希釈率 ＣＰＳタイプ８プレート 要　約　書 エピトープ含有部分とカプリングした担体からなる優れた医薬調剤が記載されて いる。この担体は、エンベロープ細胞から誘導されたタンパク質または糖タンパ ク質の結晶性二次元アレイである。この接合体は、腸管外または経口投与により 、Ｔ−リンパ球が介在する免疫応答のような抗体の形成を誘導する巳とができる 。

国際調査報告 −・悄・＋＋ｅ＾・−＾ｐ１＋＋ｌ−１１１＋ｅ、ＰＣＴ／ＣＡ　９１１０００ ６３国際調査報告 Ｃ＾９１０００６３ Ｓ＾　４４９６４

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．エピトーブ含有部分とカブリングした二次元結晶アレイであるタンパク質ま たは糖タンパク質担体からなる医薬調剤。
2. ２．前記担体が徴生物細胞壁の秩序をもったＳ層からなる請求項１記載の調剤。
3. ３．前記Ｓ層が少なくとも１つの架橋を用いて固定されている請求項２記載の調 剤。
4. ４．エピトーブ含有部分が炭水化物である請求項１記載の調剤。
5. ５．前記炭水化物が βＧａ１（１−３）αＧａｌＮＡｃ； αＦｕｃ（１−２）βＧａｌ（１−４）［αＦｕｃ（１−３）］βＧｌｃＮＡｃ ； αＮＡＮＡ（２−３）βＧａｌ（１−３）［αＦｕｃ（１−４）］βＧｌｃＮＡ ｃ； αＮＡＮＡ（２−３）βＧａｌ（１−３）［αＦｕｃ（１−３）］（１１１−４ ）βＧｌｃＮＡｃ；および βＧａｌ（１−４）［αＦｕｃ（１−３）］βＧｌｃＮＡｃ； からなるグループから選択される調剤。
6. ６．前記Ｓ層が、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｈｖｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ．Ｂ．ｓｔ ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ．およびＢ．ａｌｖｅｉからなるグループか ら選択された細菌から誘導されている請求項１記載の調剤。
7. ７．エピトーブ含有部分を二次元結晶タンパク質または糖タンパク質アレイとカ プリングさせることからなる免疫原性調剤を製造する方法。
8. ８．前記抗体を産生させるための作用量で、前記エピトーブ含有部分が弱い免疫 決定因子を含有する請求項１記載の医薬調剤を、処置が必要な対象に投与するこ とよりなる弱い免疫原性決定因子に対して抗体を産生させる方法。
9. ９．請求項１記載の医薬調剤を投与する前に、前記土ピトーブ含有部分を有して いない前記の担体を前記の対象に投与することにより感作をさらに誘導する請求 項８記載の方法。
10. １０．第１の二次元結晶担体とカブリングしたエピトーブ含有部分を含有する調 剤を、処置が必要な対象に投与し、引き続き第２の異なる二次元結晶担体とカプ リングした前記エピトーブ含有部分を含有する調剤を投与することよりなる弱い 免疫原性決定因子に対して抗体を産生させる方法。
11. １１．応答を誘導するための作用量で、前記エピトーブ含有部分が前記の決定因 子を含有する請求項１記載の調剤を、処置が必要な対象に投与することよりなる 応答が通常誘導されない決定因子に対するＴ−リンパ球が介在する応答を誘導す る方法。
12. １２．前記の応答が全身的免疫応答である請求項１１記載の方法。
13. １３．請求項１記載の調剤を投与する前に、前記エピトーブ含有部分を有してい ない前記担体を前記対象に投与することにより感作をさらに誘導させる請求項１ １記載の方法。
14. １４．第１のエピトーブ含有部分とカプリングした二次元結晶アレイであるタン パク質または糖タンパク質からなる調剤の第１の部分を、第２のエピトープ含有 部分とカプリングした前記の二次元結晶アレイから誘導された調剤と、前記のア レイのサブユニットが形成されるような条件で混合し、この条件を、第１および 第２のエピトーブ含有部分とカプリングする二次元結晶アレイを提供するために このサブユニットが再構築されるように変成することよりなる多価ワクチンを製 造する方法。
15. １５．請求項１４の方法により製造された多価ワクチン。
16. １６．二次元結晶アレイが秩序をもったＳ層からなる請求項１５記載のワクチン 。
17. １７．少なくとも２つのエピトーブ含有部分とカブリングした二次元結晶アレイ であるタンパク質または糖タンパク質からなる多価ワクチン。
18. １８．二次元結晶アレイが秩序をもったＳ層からなる請求項１７記載のワクチン 。
19. １９．前記のエピトーブ含有部分が決定因子を含有する請求項１記載の調剤を、 前記の全身的免疫応答を誘導する作用量で、処置が必要な対象に経口投与するこ とよりなる、対象中で応答が通常誘導されない決定因子に対して全身的免疫応答 を誘導する方法。
20. ２０．前記エピトーブ含有部分が、オリゴ糖ハプテンと会合された小さな腫瘍細 胞である請求項１９記載の方法。
21. ２１．前記の全身的免疫応答が免疫保護抗体応答である請求項２０記載の方法。
22. ２２．前記のエピトーブ含有部分が、Ｓ層とカブリンクしたＳ．ｐｎｃｕｍｏｎ ｉａｅタイプ８莢膜多糖類である請求項１９記載の方法。
23. ２３．１個以上のエピトーブ含有部分を二次元結晶タンパク質または糖タンパク 質アレイとカプリングさせることよりなる多価ワクチンの製造方法。
24. ２４．二次元結晶タンパク質または糖タンパク質アレイとカプリングしたエピト ーブ含有部分からなる免疫学的成分を、発熱成分は通過するが、二次元結晶タン パク質または糖タンパク質アレイとカプリングした前記エピトーブ成分は通過さ せない限外濾過膜を用いて限外濾過にかけることよりなる前記成分を発熱性成分 不含にする方法。