JPH06510530A - 大腸菌 ｏ−多糖−タンパク質結合ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一つのあるいは複数の大腸菌［Ｅｓｃｂｓｒｉｃｂｉｓ　ｃｏｌｉ　 （Ｅ、ｃｏｌｉ）］株に対するワクチンの製造方法に関する。本発明はさらに非 発熱性、非毒性、かつ免疫原性がある血清型特異的ＬＰＳに基づく結合体から構 成される多価ワクチン及び該ワクチン中の結合体に関する。

技術背景 Ｅｓｃｂｅｒｉｃｂｉｇ　ｃｏｌｉ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）は生命を脅かす原因とな る主なグラム陰性菌種である。莢膜（Ｋ）抗原及びリポ多糖（ＬＰＳ）（０）抗 原はＣｒｏｓｓ、Ａ、Ｓ、、Ｋｉｍ、に、Ｓ。

、ｔｒｉ（ｈｌ、Ｄ、ｃ、、５ａｄｏｌｌ、Ｊ、Ｃ，、Ｇｔａｓｋｉ、Ｐ、”　 Ｅｓｃｈｔｒｉｃｈｉｘ　ｃｏｌｉ菌血症菌株の血清耐性におけるリポ多糖及び 莢膜の役割′Ｊ、１ｎｌｅｃ１．Ｄｉｓ、Ｉ５４：４９７−５０３（１９１６） 及びＰｌ＋＋５ｃｈｋｅ、Ｇ、、Ｍ畠ｙｄｓｅ、Ｊ、、Ａｃｈｌｍｎｏ、Ｍ、、 Ｌｅｖｉｎｅ、Ｒ，Ｐ、、”　０１８　：　Ｋ　Ｉ　Ｅｓｃｋｅｒｉｅｂｉａ@ ｃｏｌｉ の、補体媒介殺菌耐性における莢膜及びＯ抗原の役割”　Ｉｎ１ｅｃ１．Ｉｍｓ ＋ｖ、Ｈ：９０７−９１３（１９０）に記載されているように、重要な病毒性因 子である。Ｃｒｏｓｓ、Ａ、Ｓ、、Ｋｉｎ、Ｋ。

Ｓ、、ｆｒｉｇｈｔ、Ｄ、Ｃ，，５ａｄｏｌｆ、Ｊ、Ｃ，、Ｇｅｍ５ｋｉ、Ｐ、 、”　Ｅｓｃｂｓｒｉｃｂｉｓ　ｃｏｌｉ菌血症菌株の血清耐性におけるリポ多 糖及び莢膜の役割”Ｊ、Ｉｎ１ｅｃｔ、Ｄｉｓ、ｌＳ４：４９７−５０３（１９ ８６）及び、Ｐｌａｓｃｈｋｅ、Ｇ、、Ｍｓｙｄｕ＋、Ｊ、、Ａｃｂｊｍａｏ、 Ｍ、、Ｌｅｖｉｎｅ、Ｒ，Ｐ、、”　０　１　８　：　Ｋ　Ｉ　Ｅｓｃｈ■窒奄 モｂ奄■ ｃｏｌｉの、補体媒介殺菌耐性における莢膜及び０抗原の役割”　Ｉｎｊｅｃｔ 　Ｉ＋ａ＋ｏｕｎ、４２：９Ｇ？−９１３（１０３）に記載されているように、 莢膜抗原及びＬＰＳ抗原は共に正常なヒト血清の殺菌性に対して防御を行うこと ができ、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）を血液中へ侵入させ、残存させる性質をもつ。

Ｃｒｏｓｓ、Ａ、Ｓ、、　２ｏ　ｌ　ｌ　ｉｎｇｅｒ　、Ｗ、　、Ｍｘｏｄｒｅ 　ｌ　１．Ｒ，、Ｇｅｍ５ｋ　ｉ、Ｐ、　、　５ａｄｏｆｆAＪ、Ｃ，、”Ｋ１ 陽性Ｅｓ ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉによる感染の治療への免疫治療的アプローチの評 価”　Ｊ、Ｉｎ１ｅｃｔ。

ｉｔているように、莢膜抗原及びＬＰＳ抗原に対する血清特異的抗体は動物に対 する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の感染実験において感染を防御できる。０ｒｓｋｏ ｖ、Ｆ、０ｒｓｋｏｖ、！、。

”　Ｅｓｃｂｅｒｉｃｈｉｘ　ｃｏｌｉの腸管外感染”　Ｊ、［ｌｙ（，９５： ５５１−５７５（１９８５）、Ｃｒｏｓｓ、Ａ、Ｓ、、Ｇ５高Tｋｉ。

Ｐ、、５ａｄｏｌｆ、Ｊ、Ｃ，，０ｒｓｋｏｖ、Ｆ、０ｒｓｋｏｖ、１．、”　 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｌ＋ｉａ　ｃｏｌｉの侵略的感染におけるＫｌ莢膜の重要性” Ｊ、Ｉ山ｃ１．Ｄｉｓ−世：１ｇ４−１９３（…４）、及びＭｃＣ＊ｂｅ、Ｗ、 Ｒ，、Ｋａｉｊｓｅｒ、Ｂ、、０１１ｉｎ（，５，、Ｕｖｓｙｄｉｂ、Ｍ、、ｌ １ｉｎｓｏｎ、Ｌ、Ａ、、”菌血症のＥｓｃｈ！ｒｉｅｈｉａ　ｃｏｌｉ　：■ l 及び新生児からの菌株のに抗原、０抗原及び血清感受性”Ｊ、ＩＩＩｆｅｃＬ、 Ｄｉｓ、す１：３ト４１（＋９７１１）に記載されているように、敗血症などの 深刻な感染を引き起こす大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）が発現するＯ抗原及びに抗原の 数は限られているため、これらの抗原を用いたワクチンの製造が可能となる。

しかし、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の莢膜抗原をヒトへのワクチンとして用いるに は主に２つの障害がある。第一に、およそ４０％の大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）菌血 症単離集団は莢膜抗原に関する血清型分類をすることができない。加えて、２０ ％以上のに型分類可能血液巣離集団が発現しているＫｌ及びに５莢膜抗原は哺乳 類のグリコサミノグリカンと抗原としての交差反応性を持つため、ヒトにおいて 免疫原性に乏しい。従って、Ｋ抗原に基づく大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ワクチンは 適用範囲が限られており、従って有用性が低い。

上記の結果に基づき、血清特異的なＬＰＳに基づくワクチンは大腸菌（Ｅ、ｃａ ｌｉ）の腸性感染の防御に関し、最も高い可能性をもつと思われる。しかし、天 然のＬＰＳはヒトへのワクチンとして用いるには毒性及び発熱性が高い。他のグ ラム陰性細菌と同様に、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｏ血清型特異性はＬＰＳ分子 の〇−多糖（０−ＰＳ）部位に含まれる。希釈酢酸による切断とそれに続く遠心 操作により不溶性のリピドＡを沈澱させることで、ｏ−ｐｓ領領域ＬＰＳ分子の 有毒性リビドＡ部位と分けることができる。この方法により単離した０−ＰＳは 血清学的に反応性、非毒性、非発熱性であるが、Ｐｉｔｒ、Ｇ、Ｂ、、５ｉｄｂ ｅｒｒｙ、１１．Ｆ、、５ｓｄｏｌｌ、Ｊ、Ｃ，、”　Ｐｓｔｕｄｏｍｏｎｉｓ 　ｚｅｒｏ（ｉｎｏｓｉの高分子多糖による免疫によってマウスに誘導される免 疫性防御”Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｎｎ、２２：９１９−９２５（１９７０及び ＣｈｅｓＬｅｒ、　１．Ｒ，、Ｍｅｘｄｏｖ、Ｐ、Ｍ、、Ｐｉ撃戟B Ｔ、Ｌ、、”異なる〇−血清型Ｐｓｓｕｄｏｍｏｎｉｓ　１ｅｒＢｉｎｏｓｘ菌 種における〇−抗床厚性リボ多糖血清学的特異性との関係”Ｊ、ＧｅＩＩｅｒａ ＩＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｈ：３０５−３１１（１９７３）に記載されているよう に、低分子量であるため免疫原性がない。

単離した。−ｐｓに対して防御的な免疫反応をもたせる方法の一つはｏ−ｐｓを 担体タンパク質と共有結合し、結合ワクチンを生産することである。Ｃｒｙ＊、 Ｓ、Ｊ。

、Ｊｒ、、Ｃｒｏｓｓ、＾、Ｓ、、５１ｄｏｆｆ、Ｊ、Ｃ，，Ｆｌｌｒｅｒ、Ｅ 、、”　ＥｓｃｋＣｒｉｃｋｉａ　ｃｅｌｉ　ｅｌｌ　Ｏ−■恁牛■ 体ワクチンの合成と特性づけ”　Ｉｎ１ｅｃＬ、ｌｍｍ１ｉ、５１：！７３−３ ７７（１９！０）及びＣｒＢ、Ｓ、Ｊ、、Ｊｒ、、Ｃｒｏｓｓ、Ａ、Ｓ、、５ｓ ｄａ目、Ｊ、Ｃ，、Ｗｅ（ｍｓｎｉ、Ａ、、Ｑｗ＠、Ｊ、［１，、Ｆｌｌｒｅｒ 、Ｅｌ”　Ｅｓｃｂｅｒ奄モ汲奄刀@ｃｏｔ ｉ　０１１０−特異的ポリ多糖（０−Ｐ　Ｓ）−毒素Ａ及び０−ＰＳ−コレラ毒 素結合ワクチンのヒトにおける安全性と免疫原性”　Ｊ、ＩｔＩＣｃ１．Ｄｉｓ 、　１６ユ：１０４０−１０４５（１９９＋）に記載されているように、大腸菌 （Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＯｌＩ　Ｏ−Ｐ　Ｓはコレラ毒素及びＰｓｅｍｄａｍａｓＡ ｓ　ｕｒｎ（ｉｉｏｕ毒素Ａと共有結合され、安全な、免疫原性をもつ防御的単 価結合ワクチンとなった。

しかし、画面症感染の大多数（〜７０％）は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の、１０− １２の異なる血清型に起因するという観察結果に基づき、血清特異的ｏ−ｐｓ決 定基に基づく大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）に対するワクチンは総て、多価でなくては ならないと考えられる。０ｒｓｋ＋＋ｖ、Ｆ、、０ｒｓｋｏｖ、１．、、Ｅｓｃ ｂｅｒｉｃｋｉｓ　ｅｏｌｉの血清型分類”Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｍｉｅｒｏｂ ｉａｌｏ（Ｙｌｌ＋１３−ＩＮ（１９８１）に記載されているように、血清特異 性は０−ＰＳｔｔ糖組成及び単糖間の化学結合様式により与えられる。従って、 上記の０１８単価結合体合成に使用された条件は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の他の 血清型に対しては適切ではないかもしれない。

本発明により、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の１２の血清型から単離された０−ＰＳ を”担体タンパク質”としてのＰ、ｚｅｒＢｉａｏｓｓ毒素Ａと共有結合させｔ ；。毒素Ａと大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｏ−Ｐ　Ｓとの共有結合の合成に用いた 条件は効果的に毒素へ分子を無毒化し、かつ、ｏ−ｐｓ部位の免疫原性を保持さ せた。得られた多価結合体は非経口接種した場合、人体内において、安全で免疫 原性をもっていた。

発明の概要 本発明の目的は、異なる大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）血清型に対して有効である、多 価非毒性抗大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ワクチンの製造方法を提供することである。

本発明の別の目的は、多価ワクチンに使用される、多様な大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ ）血清型に特異的である、単価ｏ−ｐｓ−毒素Ａ結合体を提供することである。

一つの態様として、本発明は多価、非毒性かつ免疫原性をもつ大腸菌（Ｅ、ｃｏ ｌｉ）０−ＰＳ−毒素Ａ結合ワクチンの製造方法を提供する。その方法は、良い 水準で完全な０−ＰＳ領域をもつ滑らかなＬＰＳを生産することが示された、特 異的大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株からのｏ−ｐｓの単離；反応性アルデヒド基を作 成するための厳密に制御された条件下でのｏ−ｐｓの酸化；水溶性カルボジイミ ドを結合剤として用いた、毒素Ａへのスペーサー分子の共有結合による導入；そ して、単価、非毒性、かつ免疫原性をもつｏ−ｐｓ−毒素Ａ結合ワクチンを製造 するために毒素Ａ−スペーサー分子と酸化ポリ多糖とを結合させること、を含む 。

別の態様として、本発明は多価ワクチンをつくるために、多様な血清型の単価ｏ −ｐｓ−毒素Ａ結合ワクチンを結合させることにより生成された非毒性、かつ免 疫原性をもつ大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ワクチンに関する。

更に別の態様として、本発明は担体タンパク質と共有結合した大腸菌（Ｅ、ｅｏ ｌｉ）リポ多糖分子の、〇−多糖領域から成る結合体に関する。

本発明の他の多様な目的及び利点は下記の発明の記載により明らかとなる。

発明の詳細な説明 本発明は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）に対するワクチンに使用する大腸菌（Ｅ、ｃｅ ｌｉ）タンパク質結合体に関する。本発明は更にこのようなワクチンの製造方法 に関する。

本発明の新しい方法は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）に対する多価、非毒性、かつ免疫 原性をもつワクチンを製造する。本発明の方法の利用により、単価、血清型特異 的結合体が製造され、結合されて多価のワクチンとなる。免疫原性をもつワクチ ンは、液性免疫反応を誘導するのに十分な本発明の結合体、および薬学的に受容 できる担体から構成される。

本発明の方法においては、ワクチン結合体は良い水準で、完全なｏ−ｐｓ領領域 もつ滑らかなＬＰＳを生産することが示された特異的な大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） 株からｏ−ｐｓを単離することによって得られる。血清疫学的調査に基づいた適 切な大腸菌（Ｅ、　ｃ　ｏｌｉ）株は血清型０１，０２，０４，０６，０７，０ ８，０１２，０１５．０１６，０１８，０２５及び０７５を含むが、これらに限 定されるものではない。ｏ−ｐｓはリピドＡが実質的に存在しないように単離さ れ、反応性アルデヒド基をもつように酸化される。酸化され得るｏ−ｐｓの還元 糖のうち４０〜８０％はこの処理の過程で酸化される。例えば、０−ＰＳは、好 ましくは５分以下の、より好ましくは２〜５分のＮ　ｓ　１０　＊処理により酸 化され得る。

つづいて、リピドＡ非存在Ｏ−ポリ多糖が、少なくとも一つのヒドロキフル基あ るいはカルボキシル基により担体タンパク質と共有結合され、結合体が作成され る。本発明における利用に適した担体タンパク質は例えば、毒素Ａ、破傷風トキ ソイド、コレラ毒素、ジフテリアトキソイド、Ｃｏｒｙｆｉｅｂ＊ｃ（ｅｒ：ｒ ＩＩｌｄｉｐｈｌｈｅｒｉｓｓが生産するタンパク質ＣＲＭ　１９７、グラム陰 性細菌、特にグループＢ　Ｎｅ１ｓｓＣｒｉｓ　＋ｕ＋＋１ＢＩｉｄｉｓの外膜 タンパク質、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｘ　ｃｏｌｉの熱不安定性毒素、コレラ毒素 若しくは大腸菌（Ｅ、ｃｅｌｉ）の熱不安定性毒素のＢサブユニット、または細 菌性熱シヨツクタンパク質、を含む。担体タンパク質は０−ＰＳ分子と直接、あ るいはスペーサー分子を介して結合され得る。

好ましい担体タンパク質は、アジピン酸ジヒドラジドのようなスペーサー分子を 介して精製ｏ−ｐｓと結合する毒素Ａである。このスペーサー分子は非可逆的に 毒素Ａを無毒化し、かつ、ｏ−ｐｓと結合可能であるという二重機能スペーサー 分子としての機能をもつ。

多価ワクチンは、上記の様々な血清型のｏ−ｐｓから作成された２つ以上の単畢 結合体の結合によって製造される。例えば、本発明の多価ワクチンは血清型０２ ．０４．０６及び、０１１、あるいは０２．０４．０６．０７及び、０１８、あ るいは０１％０２．０４．０６．０フ、０８、及び０＋１．あるいは０１．０２ ．０４．０６．０７．０８．０１２、及びＯｌｌ、あるいは０１．０２．０４． ０６．０７．０８．０１２．０１５、及びＯＮ、あるいは０１．０２．０４．０ ６．０８．０１１２．０１５．０１６、及び０１８、あるいは０１．０２．０４ ．０６．０７．０８、ＯＢ、０１５．０１６．０１８、及び０１５、あるいは０ １．０２．０４．０６．０７．０８．０１２．０１５．０１６．０１１１０２５ 、及び０７５、由来のｏ−ｐｓから構成される結合体を含み得る。

上記のように作成された本発明の結合体は６１１０．０００より大きい分子量を 有する。

天然のＬＰＳや毒素Ａとは異なり、本発明の結合体は非毒性である。また、天然 のＬＰＳとは異なり、この結合体は非発熱性である。本発明の結合体はｏ−ｐｓ 部位及び毒素Ａ部位に対して抗体反応を誘導する免疫原性をもつ。

下記の非制限的な実施例は本発明についてさらに記述するために示される。本明 細書中に含まれるデータ作成の際、表３に示されている大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） 株をＬＰＳの抽出源として用いた。しかし、同じ血清型を発現する他の大腸菌（ Ｅ、ｃｏｌｌ）株も、完全なｏ−ｐｓを含む滑らかなＬＰＳ構造を合成する場合 には、必ずしも口し結果にはならないかも知れないが、用いることができよう。

ｏ−ｐｓ−毒素Ａ結合体の調製 本発明の非毒性、かつ免疫原性をもつ結合体は、加水分解された大腸菌（Ｅ、ｃ ｏｌｉ）ＬＰＳ由来の血清特異的決定基を含むｏ−ｐｓと毒素Ａとの共有結合に より合成された。アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）はスペーサー分子として用 いられた。ＡＤＨと毒素Ａとの共有結合によりアデノシンニリン酸リポース転移 酵素を完全に非活性化する。このことにより、Ｃｒｙ！、Ｓ、Ｊ、、Ｊｒ、、Ｆ ｌｌｒｅｒ、Ｅ、、Ｓｓ＋１ｏｆｌ、Ｊ、Ｃ，。

Ｇｅｒｆｆｌｕｉｕ、Ｒ，、”　Ｐｓ＊ｕｄｏｍｏｕｓ　ｕｒｕ（ｉｎｏｓｓ免 疫型５多糖−毒素Ａ結合ワクチン“Ｉｏｂｃｌ、ｌｍ５ｎｅ、５２：１６１−１ ６５（１９ｆｉ６）に記載されているように、毒素Ａは無毒化される。

敗血症と関連付けられる大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の、最も一般的な１２の血清型 のＬＰＳ由来のｏ−ｐｓからこの方法によって合成された結合体は分子量が６０ ０，０００より大きく、非毒性、非発熱性、かつ免疫原性を有するものであった 。このワクチンによってウサギ及びヒトで誘導される抗体をマウスへ受け身的に 注入した場合、、ｃｏｌｉ）　ＬＰＳ　ｒ　ｇＧ抗体反応及び、抗毒素ＡＩｇＧ 抗体反応の両方を引き起こす。

本発明の方法では、Ｃｒｙ！、Ｓｊ、ｊｒ、、Ｃｒｏｓｓ、Ａ、Ｓ、、５ｉｄｏ ｒｌ、Ｊ、Ｃ，、Ｆｉｌｒｅｒ、Ｅ、、”　Ｅｓｅｋｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ 　０１１０−多糖結合ワクチンの合成と特性づけＩｎｆｅｅＬＩｓｍａ＋＋、５ Ｌ３７３−３７７（１９９０）に記載されているようにして、ＬＰＳを単離、精 製した・このようにして生成されたＬＰＳは２％（ｖｌ／ｖｔ）以下のタンパク 質及び核酸を含んだ。血清特異的抗原決定基を含むｏ−ｐｓは、精製されたＬＰ Ｓから穏やかな酸加水分解により調製された。精製されたＬＰＳ（Ｉｔ）を２０ ０１の１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）酢酸水溶液に懸濁した。溶液を還流冷却器つき丸 底フラスコに入れ、半球フラスコヒーター中で９０分間煮沸した。冷却後、不溶 性であるリビドＡは遠心操作により沈澱させ、廃棄した。上清を０．２Ｎ　Ｎａ ０ＩＩで中和し、４５μ園フイルターを用いて濾過滅菌し、リピドＡを完全に取 り除いた。溶液を減圧下、ロータリーエバポレーションを用いて濃縮し、濃縮液 を蒸留水で平衡化したＳＸ４０ｃｍ　Ｇ−２５カラム（Ｐｂｚｒｍｓｃｉｚ　Ｆ ｉｎｓ　Ｃｈｅｍｉｃｘｌｓ、Ｕｐｐｓｘｌｘ、５ｖｅｄｓｏ）に通した。フラ クションを集め、各７ラクシヨンの炭水化物含量をＷｅｓｌｐｈｘｌ、０．、Ｌ ａｄ＊ｒｉＨ，Ｏ，、Ｂ１５ｌｓｒ、Ｆ、、”フェノール−水によるバクテリア の抽出について’　２．Ｎｘ１ａｒｌｏｒｓｅｔ　［Ｂ］７：１４８−１５５（ ＋９５２）に記載されているフェノール硫酸法により測定した。炭水化物含有フ ラクション（Ｍｒ≦７０，０００）を集め、ロータリーエバポレーションによっ て濃縮し０．１１Ｑフイルターを用いて濾過滅菌し、凍結乾燥した。凍結乾燥し た物質を体重ＩＫｇ当たりＩＯｊｇの静注量でウサギに接種し、発熱性を分析し た。発熱性をもたない物質のみを結合体の作成に使用しに。

毒素ＡはＣｒｙｒ、Ｓ、Ｊ、、Ｊｒ、Ｆｕｒ＊ｒ、Ｅ、、Ｇｃｒ＋＋ｕ＋ｉｅｒ 、Ｒ，、”抗毒素Ａ、抗エラスターゼ、及び抗リポ多糖の受け前約注入による、 やけど敗血症モデルネズミへのＰ、ｓｅｒａｌｉｍｏｓｓの感染に対する防御” 　Ｉａｌｓｅｌ、ｌＷＡ＋ｓｕｎ、３９：１０７２−１００（＋９１０に記載さ れている方法で精製された。ただし、生産株はＰ、ｏｒ＋＋（ｉｍｏｓ！ＰＡ１ ０３株から自然に単離された毒素Ａ高生産株、Ｐ＾１０３−ｂＲである。最終精 製産物は高圧液相クロマトグラフィーで解析したところ、９５％以上毒素Ａ蛋白 質で構成されていた。

次に、ｏ−ｐｓを反応性アルデヒド基をつくりだすために下記のように酸化した 。凍結乾燥したＯ−ＰＳ（６０−ｇ）を１２腸１の蒸留水に溶かした。固体Ｎ＊ ｌ０ａ（２５３■ｇ；Ｅ、Ｍｅｒｃｋ　ｉｎｄ　Ｃｏ、、Ｄａｒ＋ｍ５ｌｓｄＬ 、Ｇｅｒｍｓｎｙ）を加え、２分間反応させた。酸化反応をエチレングリコール （０，１２ｍ１）を加えて停止した。酸化過程において、０−ＰＳのＮａ１Ｏ， 処理時間は、毒素Ａと結合させたときの酸化ｏ−ｐｓの免疫原性に関して重要で あることがわかった。５分以上酸化した。−ｐｓで構成された結合体は下記の表 １に示されるように、免疫原性が低下していた。この傾向は研究された３つの血 清型のｏ−ｐｓ総てに一致しており、ｏ−ｐｓの酸化時間に関連しているようで あった。この結果は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｏ−Ｐ　Ｓが発現している決定エ ピトープは過度の酸化によって容易に破壊されることを意味している。これはＣ ｒｙｘ、Ｓ。

Ｊ、、Ｆｂｒｅｒ、Ｅ、Ｐ、、”非毒性Ｐｓｅａｄｏｍｏｎｉｓ　ａｅｒＢｉｍ ｏ口多糖−破傷風トキソイド及び多糖−毒素Ａ結合ワクチンパ米国特許第４．７ ７１．１２７号、１０／Ｈの、Ｐ、ｘｅｒｎ（ｉｍｏｓｓ由来のｏ−ｐｓはＮａ 　１０．存在下、２時間酸化後もなお、適切な担体タンパク質と結合させた場合 、高い免疫原性をもつ結合体となり得る、という記載からは意外な結果であった 。表１はｏ−ｐ　ｓ結合ワクチンの免疫原性に対する、様々な酸化時間の影響を 示している。

表１ ｏ−ｐｓ結合体の免疫原性に対する酸化時間の影響ｏ−ｐｓ　酸化時間　酸化度 　免疫原性１血清型　（分）　（％）　［ＩｒＧ　ＥＬＩＳＡ力価平均値（範囲 ）　１５　７８　４４　（１Ｂ−２０１） ０４　５　ＮＤ”　６７　（５１−９０）１０　ＮＤ　８．３　（０−４８） ０６　２　ＮＤ　６１　（３２−Ｚｏｏ）１０　ＮＤ　１０　（６−２４） ６０　ＮＤ　０ １　各グループ３羽のウサギに対し、Ｏ０目及び１４日０にＯ−ＰＳ５０ｇｇに 相当する結合体を免疫した。

”　ＮＤ−ｎｏｔ　ｄｏｎｅ 混合物を減圧下口−タリーエバポレーションを用いて濃縮し、５ｅｐｈｉｄｅ！ 　Ｇ−４５（Ｐｂｓｒ■ｓｃｉｍ　Ｆｉｎｒ　Ｃｈｕ＋１ｃａｌｓ、　Ｕｐｐｓ ＊ｌｓ、５ｖｅｄｅ＋＋）を用いて濾過することにより、酸化０−ＰＳを他の反 応物と分けた。カラムフラクションを集め、各７ラクシヨンの炭水化物含量をＤ ｕｂｏ　ｉ　ｓ　、Ｍ、　、Ｇｉ　１ｉｅｓ、に、Ａ、　、ｌｌａｍｉ　Ｉ　ｔ ａｎ　、Ｊ　、に、、Ｒｃｂｓｒｓ、　o、＾、、Ｓｍ１ｔｈ、Ｆ、。

“糖及び関連物質の決定のための比色定量法”　Ａ＋＋ｘ１．Ｃｂｅｔ２１：３ ５０−３５６（１９５６）に記載されているフェノール硫酸法により測定した。

酸化０−ＰＳ含有フラクションンを集め、凍結乾燥した。

アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）は２つの目的で利用された。（１）毒素Ａ分 子との共有結合後、毒素Ａを不可逆的に無毒化する：（ｉ）毒素Ａと結合する基 、及びｏ−ｐｓと結合し得る基、の２つの反応基によってスペーサー分子として 機能する。ＡＤＨは下記のように毒素Ａと共有結合させた。固体ＡＤＨ（３００ 寓Ｅ；Ｆｌｕｋｉ　ＡＧ、ＢＩＩｃｈｓ、５ｖｉＬｒｅｒｌａｏｄ）及び１−エ チル−３（−３−ジメチルアミノプロピル）−カルボ゛ジイミドＱｈ＋ｇ；５ｉ ｕｘ　Ｃｈｅ■１ｃｓｌ　Ｃｏ、、ＳＬ、Ｌｏａｉｓ、Ｎｏ）をｌｓＯ＋Ｂ（Ｓ 菖ｇ／ｍｌ　Ｏ，０５Ｍ　Ｎｕ２ＨＰＯ，−Ｎａ１１１２ＰＯ，、ｐ［！７．２ ）の毒素Ａに加えた。溶液を２２°Ｃにおいて２時間撹拌した。撹拌中、溶液の ｐＨはｐＨ−ｓｔＡｔ（ＭｅｔｈｒｏｐＨ−５ｔＡｔ（、Ｓｖｉ　ｔｘｅｒｌｓ ＋＋ｄ）を用い、０．３Ｎ塩酸を加えることにより４．８に保った。次に毒素Ａ −ＡＤＨ溶液を０．０５Ｍリン酸塩緩衝液ｐ［！７．２（ＰＢＳ）に対して十分 に透析した後、５．０００Ｘｇ、　１０分間の遠心操作より総ての不溶性物質を 取り除いた。

毒素Ａ−ＡＤＨを下記のように酸化ｏ−ｐｓと結合した。毒素Ａ−ＡＤＨ溶液を 最終濃度２Ｂ／ｍｌとなるようにＳｈＭリン酸バッファーｄ７−０で希釈した。

同量の酸化ｏ−ｐｓを加え、混合溶液を２２℃において１時間インキュベートし た。ＮＩＣＮＢ１１３を最終濃度２０關となるように加え、２２°Ｃにおいて７ ２−９６時間インキュベートした。この混合溶液をメルチオレイトを０．０２％ 含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｍ）に対し、十分に透析し、ＰＢＳ−Ｍで平衡化した５ｅ ｐｈｉｄｅｘ　Ｇ−１００カラムにのせた。カラムをＰＢＳ−Ｍで流出し、結合 体を含有するボイドフラクションを集め、４°Ｃで保存した。

最終的に、多価ワクチンは下記のように生産された。１２の単価結合体を、無菌 条件下、各血清型のポリ多糖の最終濃度が５０μ（／ｍｌとなるように混合した （６００μに、７ｍｌに等しい）。この混合液を５％（ｖｌ／ｖｏｌ）ラクトー ス及び０．Ｏ１％メルチオレイトを含む、１０倍量の半濃度ＰＢＳに対して透析 した。混合液を透析バッグから無菌的に吸い取り、１１を滅菌した３１１ガラス バイアルに入れた。バイアルの蓋を閉め、無菌条件で凍結乾燥した。蓋を閉めた 上からアルミニウム製キャップで封をし、バイアルにラベルを貼った。

ｏ−ｐｓ−毒素Ａ結合ワクチンの特性 ０−ＰＳ−毒素Ａ結合ワクチンの、様々な物理化学的特性及び安全性、免疫原性 に関する特性が表ｔ−Ｓに示されている。特に表１に関しては、結合体の免疫原 性は、次に続く結合体の形成に不可欠である反応性アルデヒド基をつくりだす酸 化過程において、ｏ−ｐｓをＮｈ　１０．処理する時間に依存していることが分 かった。ＮａＩＯ，処理時間はｏ−ｐｓの酸化度に影響を与える。３つの異なる 血清型のｏ−ｐｓについて、５分以上の室温でのＮａ１Ｏ，処理は８０％以上の 糖残基を酸化し、それらを担体タンパク質と結合した際、結合体の免疫原性は低 かった。２−５分間酸化した。−ｐｓで構成された結合体はより高い免疫原性を 示した。

ＬＰＳ、ｏ−ｐｓ、毒素Ａ、及びｏ−ｐｓ−毒素Ａ結合体の様々な特性（分子量 、毒性、発熱性、及び免疫原性）が表２に示されている。結合体は、各材料構成 成分の分子量、即ち、０−ＰＳ（≦７０．０００）及び毒素Ａ（〜６６．０００ ）よりも高い、６００．０００以上の分子量を有した。ＬＰＳ及び毒素Ａは天然 の形ではマウスに対し毒性をもった。例えば、天然の毒素Ａを腹腔内注射した場 合の平均致死量はマウス１匹当たり０．２μｇであった。しかし、毒素Ａをｏ− ｐｓと共有結合すると毒性は劇的に減少し、これは毒素Ａタンパク質２００１１ ｇに相当する結合体をマウスに注入しても毒性を示さなかったことで証明されて （・る。従って、結合ワクチンを作成する方法により、毒素Ａの毒性は少なくと も１０００分の１に減少し、毒素Ａトキソイドとなった。

天然のＬＰＳは体重ＩＫｇ当たり０．１μｇ、ウサギに静脈投与すると発熱性を 示す。

これに対し、精製ｏ−ｐｓ及びｏ−ｐｓ−毒素Ａ結合体は≧１０．ｉ＋１／Ｋｇ 投与しても発熱性を示さない。高い毒性のため、天然の毒素Ａについては発熱性 を解析することはしなかった。非結１−ＰＳはウサギに筋肉注射した場合非免疫 原性であった。これに対し、１２の単価ｏ−ｐｓ−毒素Ａ結合体は総て、１２価 結合ワクチンと同様、各ｏ−ｐｓ血清型及び毒素Ａに対する免疫反応を引き起こ すことができｔこ。

ＬＰＳ、０−ＰＳ、毒素Ａ１及びｏ−ｐｓ−毒素Ａ結合ワクチンの特性ＬＰＳ　 ０−ＰＳ　毒素Ａ　０−ＰＳ−毒素Ａ結合ワクチン 分子量’　）ＩＯＸＩＯ″　＜７０．０００　６Ｇ、０００　＞６１１０．００ ０毒性ｘ　＜ＩＵ　非毒性　Ｏ９！μｇ　非毒性（＞ｓｏｏ＃ｇ）　（＞ｓｏｏ ｊＩｇ）発熱性”　＜Ｏ，ｌｌ（＞ＩＱμｔ　ＮＤ’　＞ｌｏｎｇ免疫原性’　 ＮＤ　非免疫原性　免疫原性有　免疫原性有’　Ｄｉｐａｍｌ　２ｏｒｂｓｘ　 ＧＦ−２５０カラムを用いた高圧液相クロマトグラフィーにより決定しＩこ。

”　１１４Ｊのマウスに腹腔接種した時の平均致死量を示す。ＬＰＳに関しては あらかじめガラクトサミン感受性にしたマウスを用いた。

非毒性は最低５００＃ｌの抗原を腹腔接種しても死に至らなかったことを意味す る。

ｇ） ’　ＮＤ−ｎｏｔ　ｄｏｎｅ ５　各抗原１Ｇ−５０μｇで免疫したウサギにより決定した。血清はＥＬＩ　Ｓ Ａを　用い、特異的１ｔＧ抗原の存在を解析した。

まとめると、表１に示されたデータはｏ−ｐｓ−毒素Ａ結合ワクチンが高分子量 、非毒性、非発熱性でありｏ−ｐｓ及び毒素Ａ結合体構成要素の双方に対して特 異的抗体反応を引き起こすことができることを示している。

０−ＰＳを単離したＬＰＳを提供した菌株が表３に示される。これらの１２の血 清型は、これらの血清型を発現する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）がしばしば画面症と 関連していることを示した血清疫学研究に基づき選択された。これらの特定の菌 株は、完全な０−ＰＳ側鎖をもつ滑らかなＬＰＳを多量につくりだすことを指標 に選択された。その際、ＬＰＳはドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲ ル電気泳動の後、銀染色して得られるバンドにより解析した。これらの特性を示 す他の菌株も必ずしも同じ結果にはならないがもしれないが、使用できる可能性 がある。

ＬＰＳ及びｏ−ｐｓ単離に用いた大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株鼠へ炙　朔虎聚　世 ！ ２０４　０１　＾、Ｂｒｕｕｒ　Ｋｓｒｏｌｉａｓｋｓ■ｏｓｐｉｔ＊ＩＳｌｏ ｃｋｋｏ１ｍ、Ｓｗｅｄｅｎ ｌ　７１　０２　Ａ、Ｂｒａａｎｅｒ　Ｋｓｒｏｌｉｎｓｋｓ　Ｈｏ５ｐｉｔｉ ｌＳｌｏｃｋｌ＋ｏ１ｍ　Ｓｗｅｄｅｎ ４７　０４　Ｗｓｌｊｅｒ　Ｒｅｅｄ　Ａｒｍｙ　１ｏｓｔ目ａｔｅ　ｏｆ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈＷｓｓｂｉｎｇＬｏ＋＋、Ｄ−Ｃ・ ＋　３３　０６　Ａ、Ｂｒ５ａ＋＋ｅｒ　Ｋｓｒｏｌｉｎｓｋｉ　Ｈｏ５ｐｉｔ ｘｌＳｔｏｃｋｂｏｌｓ　Ｓｗｅｄｅｎ ＥＣ１００７Ｗａｉｔｅｒ　Ｒｅ５ｄ　Ａｒｍｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈＷｓｓｂｉｎ（ｌｏｌ、Ｄ、Ｃ。

２０８　０８　Ａ、Ｂｒｘｎｎｔｒ　Ｋａｒｏｌｉｎｓｋｓ　ＨｏｓｐｉＬｘｌ Ｓｊｏｃｋｂｏｌｍ　５ｖｅｄｅ＋＋ ２５３　０１２　Ｗｅｌｌｅｒ　Ｒｔｅｄ　Ａｒ＋＊ｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｃ　 ｏｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＷｓｓｂｉｎｇｌｏｔ、Ｄ、Ｃ。

１１　０１５　＾、Ｂｒｘａｎｅｒ　Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ　Ｈｏｓｐｉｊｓｌ Ｓｌｏｃｋｈｏｌｍ　Ｓｗｅｄｅｎ ｌ　０４　０１６　Ａ、Ｂｒ１ａ＋＋ｅｒ　Ｋａｒｏｌｉｎｓｋｓ　Ｈｏｓｐｉ ｔａｌＳｔｏｃｋｂｏｌｍ　Ｓｗｅｄｅｎ ２０５　０１８　ＷｘＨｓｒ　Ｒｔｅｄ　Ａｒｍｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ 　Ｒｅ５ｅｓｒｃｈＷａｓｌ＋１ｎｆｆｏｎ、Ｄ、Ｃ。

６０　０２５　＾、Ｂｒ５ｕｕｒ　Ｋｉｒｏｌｉｎｓｋ＆［１ｏｓｐｉｔｓｌＳ ｌｏｃｋｈｏ１ｍ　５ｖｅｄｕ＋ ３　０　７　５　Ａ、Ｂｒｘ＋＋＋＋ｅｒ　Ｋｘｒｏｌｉｎｓｋｓ　［Ｉｏｓｐ ｉｔｓｌＳｌｏｃｋｈｏｌ＋ｉ　Ｓｗｅｄｅｎ 異なる血清型のｏ−ｐｓからつくられた１２の単価０−ＰＳ−毒素Ａ結合ワグチ ンの組成（０−ＰＳと毒素Ａとの比）が表４に示された。これらの単価結合体は 多価ワクチン作成のために結合された。結合体は３３．４％から５４．７％の０ −ＰＳと４６．３％から６６．６％の毒素Ａから構成された。従って、毒素Ａに 対する。−ｐｓの比は血清型によって異なるが、各結合体は最低３０重量％の０ −ＰＳを含むことが好ましい。

表４ １２価大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｏ−Ｐ　Ｓ−毒素Ａ結合ワクチン作成に使用しｌ ；０１　４４．７　５５．３ ０２　４１．６　５８．４ ０６　４６、　２　５３．　８ ０７　３３．４　６６．６ ０８　４４．３　５６．７ ０１２　３８．２　６１．８ ０１６　５４．７　４６．３ ０２５　４５．５　５４．５ ０７５　４８．４　５１．６ 多価結合ワクチンの、１２のＬＰＳ血清型各々及び毒素Ａに対して免疫グロブリ ンＧ　（ＩｇＧ）抗体反応をウサギに引き起こす能力が表５に示される。免疫に より、１３のワクチン抗！（１２のＬＰＳ血清型及び毒素Ａ）総てに対しＥＬＩ ＳＡ平均ＩｓＧ力価は４倍上昇する。

表５ １２価大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｏ−Ｐ　Ｓ−毒素Ａ結合ワクチンの免疫により 引き起こされる免疫グロブリンＧ　（ｌｔＧ）抗体反応ＥＬＩ　ＳＡ平均ｌｔＧ 力価（範囲） 血清型　免疫前　免疫後 （第０日）　（第２８日） ０１　１．１（１，３−３，２）　＋５（Ｈ−１２９）Ｈ６１（４，４−ＩＱ） 　２５２（２０４−４０）０４　１．９（＋−３，６）　４６（３９−５３）０ ６　１．５（０，６−９，７）　ｌｌＩＣ１０２−１１７）０７　Ｇ、５（１− ｌ　１．１＞　Ｈａ（１７Ｇ−３ＳＤａｓ　９．＋（２，７−２４＞　０７０３ ５−０７）０１２　２４　（９−４５）　目３６（＋１１９−１７０）０１５　 １７（３−ｆｉ）　ＩＮ（＋０Ｏ−２７１）０１６　１１　（６，１−２５）　 ６Ｇ（５５−１５）０１芭　ｉ、９（４，１−９，７）　２５９（＋９２−３５ ２）ＵＳ　１．７Ｑ−６，９）　Ｎｏ（５９−１６６）０７５　２．５（］、ト ４．７）　２３（＋４−４２）毒素Ａ　Ｉ４　（１９−２４）　４１２（３５１ −５１２）ウサギ（３羽）は第０日及び第１４日に、１２の血清型由来のｏ−ｐ ｓ各々を２５Ｎに相当する量で含むワクチンで免疫された。

多価ｏ−ｐｓ−毒素Ａワクチンで免疫されたウサギの血清から単離されたＩ！Ｇ 抗体をマウスに受け身的に注入した際の、１２の血清型の大腸菌（Ｅ、ｅｏｌｉ ）の感染によっておこる、致死的大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）敗血症実験に対する防 御能力が表６に示される。受は身的に投与されたＩｇＧは、実験した菌株が発現 する８つの血清型線てに対し力価が上昇した抗体を含んでおり、バッファーのみ を接種したコントロール群に比べ、死亡率を有意に減少させた。

表６ ウサギ免疫＋ｇＧの受け前約注入による、大腸菌敗血症実験に対する防御０１　 ｔｏｏ　６０ ｏｓ　ｔｏｏ　。

１２価大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｏ−Ｐ　Ｓ−毒素Ａ結合ワクチンで免疫された ウサギ血清から精製されたおよそ３ｍ（のＩＩＧは大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の腹 腔内（ＩＰ）投与より３−５時間前にマウスにＩＰ接種されｔ；。

ヒトにおける多価ｏ−ｐｓ−毒素Ａワクチンの安全性及び免疫原性多価ワクチン は、表３に記載されている菌株から単離された１２の無菌単価結合体を毒素Ａに 結合させることによって作成された。無菌性、発熱性、及び一般的安全性テスト は［１ｍ１ｌＣｄ　５１ｓｔ＊ｓ　Ｃｏｄｓ　ｏｌ　Ｆｃｄ＊ｒｓｌ　ＲＣｔ＊ ｌ＊ｔｉｏｍｓ　！１．６１０．に詳細が記載されている手順に従って行われた 。この例に使用された多価結合ワクチンは４３％のｏ−ｐｓ及び５７％の毒素Ａ から構成されている。このワクチンは体重ＩＫｇ当たり１２７１ｇの量をウサギ に酔脈投与したところ非発熱性であった。再溶解したワクチンをマウス及びモル モットにそれぞれ０．５鳳Ｉ及びＳｓＬ腹腔内投与したところ致死性及び明らか な毒性は見られなかった。ワクチンは毒性の復帰に関して安定であった。従って 、再溶解し３７°Ｃで２８日間保存した後、結合体の形での毒素Ａタンパク質を マウス１匹当たりｌｏＯＪＩｇ腹膜内投与しても明白な毒性を示さなかった。

健康な成人志願者に合計６９８μｇの結合体（合計３００ＪＩｇの０−ＰＳ　［ ２５７１１／各血清型］及び３９８Ｎの毒素Ａ）を三角筋の筋肉中に０．５ｍｌ 接種した。ワクチン接種後の総ての反応は志願者によって、コントロールシート に記入された。

静脈血はワクチン接種の直前及びワクチン接種後２８日後にサンプル採取された 。

血清はＣｒｙｔ　、　５１　、　、　Ｊ　ｒ、　、　Ｃｒｏｓｓ　、Ａ、Ｓ、　 、　５ａｄｏｌｆ　、Ｊ　、Ｃ，ｊｔ　Ｈｍｓｉｎ、Ａ、　Aｈｓ　、Ｊ　、１ １１．　、ＦＭｒｔｒ　、　Ｅ、。

”Ｅｓｃｂｒｒｉｃｈｉ＊　ｃｏｌｉ　ＯＨＯ−特異的多糖（０−ＰＳ）−毒素 Ａ及び０−ＰＳ−コレラ毒素結合ワクチンのヒトにおける安全性及び免疫原性″ ″Ｊ、Ｉａｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１６３：１Ｇ１Ｇ−１０４５（１９９１）に記載 されている方法により集められた。

ワクチン接種に対する反応は下記の表７に詳細が記載されている。多くの（８５ ％）被ワクチン接種者が注入部位の軽い痛みを報告し、腫れおよび赤みをそれぞ れ３０％および２０％の被験者が報告した。３人の被験者だけが頭痛（１）と不 快感（２）からなる全身的な反応を報告した。正常な活動を妨げる反応は無く、 すべての反応は２４−７２時間以内に自然解消された。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｏ−Ｐ　Ｓ−毒素Ａ多価ワクチン接種後の反応局所的 反応（％）　全身的反応（％） ２０名の健康な成人志願者にワクチン各血清型につき２５μｇのｏ−ｐｓを含む ワクチンを、１回、筋肉中に接種した。

下記の表８に示されるように、多価ｏ−ｐｓ−毒素Ａ結合ワクチンでの免疫は１ ２血清型のうち、血清型０１６　（１，４倍の上昇）を除＜１１の血清型に対す る抗ＬＰＳ　ＩｇＧ価を実質的に増加させた。平均増加倍率は２．８倍（Ｏｌ　 ２）から２０ｍ　（０６）であった。抗ＬＰＳ　ＩｇＧレベルが（１０ｊ（／ａ ｔであった被験者ではさらに著しい増加を示したことは特筆すべきことである。

この種の高レベル（＞　１０１１ｇ／ｍｌ）の未刺激特異的抗体による”エピト ープ抑制”は文献に広く記載されている。

表８ 大腸菌（Ｅ、ｅｏｌｉ）　Ｏ−Ｐ　Ｓ−毒素Ａ多価ワクチンのヒトへの免疫後の ０１　１１　（１，４−５５）　３１　（目−１３７）　３．５Ｑ２　ＩＩ　Ｑ −５３）　３ｇ　（Ｉ５−４０４）　３．３０４　２２　（６−７１）　５０　 （１０−０４）　２．３０６　５　（０，５−７７）　９１　（１０−４８５） 　２００７　２．４　（０，６−２０）　２５　（トＩＨ）　１００８　２　（ ０，７−１５）　２０　（４−６９）　１００ＨＨ（２−１０）　３３　（６− １１７）　１１０１５　２．５（０，６−１９）　Ｈ（４−５５）　５０１６　 １Ｇ　（２，４−５８）　２２　（６−７１）　１．４０１８　１７　（２−７ Ｄ　Ｈ（１２３０４０２５３（０，４−５６）　ｌ　（１−７５）　１７０７５ 　１１　（０，５−６３）　４７　（４−２５４）　４．３毒素Ａ　Ｉ　（０， ４−３４）　Ｓ　（０，６−３９）　Ｓ被験者はワクチンの１２の血清型ｏ−ｐ ｓを各２５＃ｆｆ含む量を１回、第θ０目に接種された 本発明の好ましい様態はこの文書中に記載されているが、様々な、特に組み入れ られるｏ−ｐｓの血清型の数に関するワクチンの系統的論述に関して、変更及び 修飾か下記の請求の中に定義されている発明の範囲から外れる事なく、当事者に よってなされることは明らかである。

この文書中の総ての文献はここに参考文献として引用する。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．完全なＯ−多糖側鎖を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からリポ多糖を精製 し；希釈酢酸中で加水分解し、リピドＡを実質的に取り除いてリポ多糖分子のＯ −多糖領域を単離し；そして、 リビドＡを含まないＯ−多糖を、該多糖の、少なくとも１つのヒドロキシル基あ るいはカルボキシル基を介して担体タンパク質と共有結合させる：工程より成る 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ワクチンを製造する方法。
2. ２．担体タンパク質と共有結合した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポ多糖分子のＯ− 多糖領域から成る結合体。
3. ３．分子量が６００，０００より大きい請求項２に記載の結合体。
4. ４．さらに二官能性スペーサー分子を含み、Ｏ−多糖が該担体タンパク質に該ス ペーサー分子を介して共有結合している、請求項２に記載の結合体。
5. ５．該スペーサー分子がアジピン酸ジヒドラジドである請求項４に記載の結合体 。
6. ６．該担体タンパク質が下記のタンパク質：毒素Ａ、破傷風トキソイド、コレラ 毒素、ジフテリアトキソイド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｈ ｅｒｉａｅが生産するタンパク質ＣＲＭ１９７、グラム陰性菌、特にグループＢ 　Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、の外膜タンパク質、、Ｅｓ ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉの熱不安定性毒素、コレラ毒素若しくは大腸菌（ Ｅ．ｃｏｌｉ）の熱不安定毒素のＢサブユニット、または細菌熱ショックタンパ ク質、から選択される請求項２に記載の結合体。
7. ７．精製Ｏ−ＰＳ要素が、酸化可能である還元糖の４０％から８０％を酸化する のに十分な時間、酸化剤にさらされる、請求項１に記載の方法。
8. ８．酸化剤がＮａＩＯ４である請求項７に記載の方法。
9. ９．請求項２に記載の結合体及び、桑学的に受容できる担体から成り、該結合体 が液性抗体反応を引き起こすのに十分量存在する非毒性、非発熱性、免疫原性の 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ワクチン。
10. １０．請求項１に記載の方法により、異なる血清型のＯ−多糖から２つまたはそ れ以上の単価ワクチンをつくり；そして、少なくとも２つの異なる血清型の単価 ワクチンを一緒にする：工程からなる、多価大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ワクチンを 製造する方法。
11. １１．該単価ワクチンが血清型０２、０４、０６、及び０１８の多導から成る請 求項１０に記載の方法。
12. １２．該単価ワクチンが血清型０２、０４、０６、０７、及び０１８の多糖から 成る請求項１０に記載の方法。
13. １３．該単価ワクチンが血清型０１、０２、０４、０６、０７、０８、及び０１ ８の多糖から成る請求項１０に記載の方法。
14. １４．該単価ワクチンが血清型０１、０２、０４、０６、０７、０８、０１２、 及び０１８の多糖から成る請求項１０に記載の方法。
15. １５．該単価ワクチンが血清型０１、０２、０４、０６、０７、０８、０１２、 ０１５、及び０１８の多糖から成る請求項１０に記載の方法。
16. １６．該単価ワクチンが血清型０１、０２、０４、０６、０７、０８、０１２、 ０１５、０１６、及び０１８の多糖から成る請求項１０により記載の方法。
17. １７．該単価ワクチンが血清型０１、０２、０４、０６、０７、０８、０１２、 ０１５、０１６、０１８、及び０２５の多糖から成る請求項１０に記載の方法。
18. １８．該単価ワクチンが血清型０１、０２、０４、０６、０７、０８、０１２、 ０１５、０１６、０１８、０２５、０７５の多糖から成る請求項１０に記載の方 法。